FI106556B - Menetelmä puolisynteettisten glykosaminoglykaanien valmistamiseksi - Google Patents

Description

106556

Menetelmä puolisynteettisten glykosaminoglykaanien valmistamiseksi

Keksintö koskee sellaisten uusien puolisynteettis-5 ten glykosaminoglykaanien synteesi, joilla on 2-asemassa modifioidun a-L-iduroni-2-O-sulfaattihapon hepariini- tai heparaanirakenne, joissa glykaaneissa sulfaattiryhmä on kokonaan tai osittain substituoitu nukleofiilisellä radikaalilla .

10 Näillä uusilla puolisynteettisillä glykosaminogly-

kaaneilla, joilla on yleinen kaava IV

OR OR OR

-p-K?h / iA°w X _e_KjH / lK?h .A. _C_^°K / lKj·1 A_ »K50,‘ CSO.‘ XHSO,' OH HHCOCH, R, H, > —>?L Ji L J»

IV

on hyvät farmaseuttiset ominaisuudet sikäli, että ne voi-20 vat myös imeytyä oraalisesti ja niillä on hyvä antitrom-boottinen aktiivisuus yhdistettynä pieneen verenvuotovaa-raan ja vähentyneeseen antikoagulatiiviseen aktiivisuuteen.

' ' Julkaistussa EP-patenttihakemuksessa 0 347 588 esi- 25 tettiin kuvaus hepariini- ja heparaanirakenteen omaavien : glykosaminoglykaanien rakenteellisesta modifikaatiosta ·;··; emäksisessä väliaineessa ja sitä seuraavasta tekniikan j·.1. tasoon nähden uusien johdannaisten erotuksesta reaktio- • · seoksesta, osoitettuna selvästi kemiallisten ja fysikaa- » » · 30 listen ominaisuuksien ja erityisesti 13C-NMR-spektrin avul- ... la.

• · *··1 Seuraavassa julkaistussa EP-patenttihakemuksessa ···1 0 380 943 kuvattiin toinen rakenteellinen modifikaatio :1·.· emäksisessä tai neutraalissa väliaineessa, jolloin käy- • · • 35 tettiin lähtöaineina tuotteita, jotka olivat muodostuneet « « · • · · » · 1 ♦ • · » ♦ « 2 106556 reaktio-olosuhteissa, jotka on kuvattu EP-julkaisussa 0 347 588, ja glykosaminoglykaaneista, joilla on heparii-ni- tai heparaanirakenne ja joita käytettiin lähtöaineina EP-julkaisussa 0 347 588, jolloin saatiin aikaan useita 5 uusia tuotteita, jotka eroavat EP-julkaisussa 0 347 588 kuvatuista tuotteista ja ovat uusia tekniikan tasoon nähden, osoitettuna selvästi kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien ja erityisesti 13C-NMR-spektrin avulla.

EP-julkaisussa 0 347 588 kuvattujen tuotteiden ke-10 mialliset ja fysikaaliset ominaisuudet ja seuraavan rakenteellisen tutkimuksen tulokset, jonka tutkimuksen ovat kuvanneet Jaseia M., Rej R., Sauriol F., Periin A.S. julkaisussa Can. J. Chem. 67, 1449 - 1456 (1989), ja jossa on erityisesti pyritty selittämään rakenteellisen modifi-15 kaation reaktiomekanismi emäksisessä väliaineessa, ovat osoittaneet, että näillä johdannaisilla on modifikaatio, joka koskee vain yhtä sakkaridiyksiköistä, jotka ovat tunnusomaisia hepariini- tai heparaanirakenteen omaaville glykosaminoglykaaneille, tarkemmin sanottuna a-L-iduroni-20 hapon yksikköä, jonka hapon 2-asema on sulfatoitu, ja joka modifikaatio käsittää tämän yksikön transformaation 2,3-epoksiguloniyksiköksi.

Samoin on osoitettu, että puolisynteettisille glykosaminoglykaaneille, joissa on yksi 2,3-epoksiguloniyk- 25 sikkö, ja myös glykosaminoglykaaneille, joilla on heparii- • · • *·· ni- tai heparaanirakenne, tapahtuu samanlaisissa reaktio- *!**J olosuhteissa, kuin EP-julkaisussa 0 380 943 on kuvattu, rakenteellinen modifikaatio, joka myös koskee a-L-iduroni- • · hapon sakkaridiyksikköä, jonka hapon 2-asema on sulfatoi- 30 tu, ja joka käsittää tämän sakkaridiyksikön transformaa- .···, tion sulfatoimattoman α-L-iduronihapon tai a-L-galakturo- * · nihapon yksiköksi käytettyjen reaktio-olosuhteiden mukai-sesti.

·.'·· Sitten EP-julkaisussa 0 347 588 kuvataan puolisyn- 35 teettisiä glykosaminoglykaaneja, jotka sisältävät epoksi- • · l i a « « « « • · • · « · < 3 106556 funktionaalisuuden cc-L-iduroni-2-O-sulfaattihapon yksikön 2- ja 3-asemien välillä, käytettyinä alkutilanteessa ja niiden saamiseksi tarvittuja reaktio-olosuhteita, kun taas EP-julkaisussa 0 380 943 kuvataan tuotteita, jotka on saa-5 tu epoksidin jatkotransformaatiolla, jolloin on todistettu, että niissä on sulfatoimattoman «-L-iduroni- tai a-L-galakturonihapon yksi yksikkö, ja niiden saamiseksi tarvittuja reaktio-olosuhteita, kun käytettiin lähtöaineena epoksidia itseään tai vaihtoehtoisesti käyttäen lähtöai-10 neina itse glykosaminoglykaaneja, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne ja joita käytettiin lähtöaineina EP-julkaisussa 0 347 588.

Tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan hepariini- tai heparaanirakenteen omaavia uusia puolisynteet-15 tisiä glykosaminoglykaaneja, joille on tunnusomaista, että ne sisältävät α-L-iduronihapon yksikön, jonka hapon 2-asema on substituoitu nukleofiilisellä radikaalilla.

Nyt kuvatut uudet johdannaiset edustavat jatkokehitystä, mitä tulee tekniikan tasoon ja erityisesti mitä 20 tulee edellä mainittuihin julkaistuihin EP-patenttihake-muksiin. Edellä mainituissa patenteissa patenttivaatimusten kohteena olivat tuotteet, jotka oli saatu emäksisessä vesipitoisessa väliaineessa käyttäen vettä nukleofiilinä.

I M ( ' 1 Tässä patenttihakemuksessa uudet tuotteet saadaan reak- 25 tiolla useiden huolellisesti valittujen nukleof iilisten • · j reagenssien kanssa ja sellaisissa olosuhteissa, että ai- *:··· kaansaadaan vastaavan nukleofiilisen ryhmän liittyminen ·1·'· uronihapon 2-asemaan.

• ·

Keksinnön kohteena on menetelmä edellä mainittujen • · · 30 tuotteiden saamiseksi käyttäen lähtöaineina sopivaa nuk- ... leofiiliä ja EP-julkaisussa 0 347 588 kuvattuja epokside- :::1 ja.

•y' Esillä oleva keksintö koskee menetelmää hepariini- tai heparaanirakenteen omaavien puolisynteettisten gly- • · ·;·· 35 kosaminoglykaanien syntetisoimiseksi, joiden kaava on • · · · • · · « • « 4 106556 OB m. ^. ,03 0_Κ?Η / lK°h /A. _cJ\oH / lK°w /Λ. -0-N°h / \Ι\2η A.

t MH50," CSO,' PHSO,’ OH HHCOCH, < *, 5 L J, L J, L -I.

JK

jossa p + q = m, jolloin p on muu kuin 0, ja m ja n ovat 10 kokonaislukuja 1 - 100, R merkitsee vetyä tai sulfaat-tiryhmää (S03~) ja -Z(R2)R1 merkitsee nukleofiilistä radikaalia, joka on peräisin nukleofiilisestä reagenssista, joka on valittu ryhmästä primaariset ja sekundaariset amiinit, sekundaariset heterosykliset amiinit, aminoalko-15 holit, aminotiolit, aminohapot, aminoesterit, peptidit, alkoholit, fenolit, merkaptaanit, ditiolit, tiofenolit, hydroksyyliamiinit, hydratsiinit, hydratsidit ja nat-riumatsidi.

Menetelmälle on tunnusomaista, että 2,3-epoksigu-20 lonirakenteen omaava puolisynteettinen glykosaminoglykaa-ni, jonka kaava on ' ' or ^OH HHCOCKj , , < 2 5 HHSO, oso> KH501 • · • · • · · _ «J n • L J? L u • · m • « • · jossa p, q, n ja R tarkoittavat samaa kuin edellä, ja joka 30 on saatu käsittelemällä hepariinimateriaalin vesipitoista ... liuosta alkalimetalli- tai maa-alkalimetalliemäksellä, • · ΓΙΙ jonka konsentraatio on 0,01 - 1 N, jolloin läsnä on aika- • · ··*’ limetallin tai maa-aikaiimetalIin suola, jonka konsent- : raatio on 0 - IN, ja jolloin mahdollisesti on läsnä kata- ·;··· 35 lyyttinen määrä natriumboorihydridipelkistintä, 0,5 - 24 • · » · · • · · • · · · • ♦ « • · 106556 tunnin ajan lämpötilassa 35 - 70 °C; saatetaan reagoimaan edellä mainitun nukleofiilisen reagenssin kanssa, jolloin läsnä on polaarinen liuotin ja sellainen määrä epäorgaanista tai orgaanista emästä, joka riittää muodostamaan 5 suolan mistä tahansa happoryhmistä, jotka ovat läsnä nukleof iilisissä reagensseissa ja/tai vapauttamaan nämä nuk-leofiiliset reagenssit mistä tahansa suoloista, joita niillä voi olla happoluonteisten aineiden kanssa, mahdollisesti inertissä kaasuatmosfäärissä; sekoittaen 24 - 96 10 tuntia lämpötilassa 10 - 30 °C, reaktioseos laimennetaan vedellä, kun reaktioliuos on muu kuin vesi, vesipitoisen liuoksen pH säädetään neutraaliksi lisäämällä vetyklori-dihapon vesiliuosta, ylimääräinen nukleofiilinen reagenssi mahdollisesti poistetaan uuttamalla liuottimena, joka ei 15 ole veden kanssa sekoittuva, tai suodattamalla, vesi- pi-toiselle liuokselle suoritetaan mahdollisesti dialyysi juoksevalla vedellä ja tislatulla vedellä ja tuote eristetään lyofilisoimalla sitä sisältävä vesipitoinen liuos tai saostamalla lisäämällä sopivaa liuotinta.

20 Ilmaisun "hepariini- tai heparaanirakenteen omaavat glykosaminoglykaanit" tarkoitetaan merkitsevän polysakkarideja, joiden moolimassa on välillä noin 3 000 - noin 50 000 Daltonia ja joille on tunnusomaista, että niissä on ·"· disakkaridiyksikkö, joka koostuu uronihaposta (joka voi i 25 olla a-L-iduroni-tai β-D-glukuronihappo) ja a-D-glu-! kosamiinista liittyneinä vaihtelevassa järjestyksessä 1,4- ·;··· glykosidisilla sidoksilla, kuten on kuvattu julkaisuissa

Lindhal U., Kjellen L., Thrombosis and Haemostasis 66. 44 - 48 (1991) ja Turnbull J.E., Gallagher J.T., Biochem.

• · · 30 J. 273, 553 - 559 (1991). Koska α-L-iduronihapon 2-asema voi olla sulfatoitu ja glukosamiini voi olla N-asetyloitu, • · *···’ N-sulfatoitu, 6-O-sulfatoitu, 3-0-sulfatoitu substituent- • · · ' ’ a « ···’ tien vaihtelevien asemien mukaan, on mahdollista olla vä- hintään 10 erilaista disakkaridiyksikköä, joiden yhdisty- • 35 minen voi aikaansaada suuren määrän erilaisia sekvenssejä.

• a • « « a a a «ta a a a a a · a a a · · 6 106556

Muistaen tyypillisimmät disakkaridiyksiköt ja tavallisimmat sekvenssit voidaan sanoa kohtuudella, että yleisen kaavan I voidaan katsoa kuuluvan glykosaminoglykaaneihin, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne 5

OR . .OR

_0_faiH _/ lN°H /L _0J\oh / lN°h /L

OSO,· SJHSO,' OH NHCOCHj 10 L J a L -> n

A B

joissa R merkitsee vetyä tai sulfaattiryhmää (S03") ja jos-15 sa m ja n ovat kokonaislukuja välillä 1 - 100.

Luonnollista alkuperää olevissa hepariinirakentei-sissa glykosaminoglykaaneissa m:n arvo on suuri ja disak-karidiyksikkö A edustaa noin 80 %:a disakkaridiyksiköistä: sitä vastoin luonnollista alkuperää olevissa heparaanira-20 kenteisissa glykosaminoglykaaneissa n:n arvo on suuri ja disakkaridiyksikkö B edustaa noin 80 %:a disakkaridiyksiköistä .

Yleisen kaavan I ja yleisten kaavojen III ja IV ' ' tarkoitetaan ilmaisevan tärkeimpien sakkaridiyksiköiden 25 koostumuksen, mutta niiden ei tarkoiteta viittaavan yksi- • · j köiden järjestykseen.

·:··· Kuten alan ammattimiehet tietävät, on mahdollista valmistaa luonnollista alkuperää olevien glykosaminogly- • · kaanien kemiallinen modifikaatio, esimerkiksi N-desulfa- • · · 30 toinnin reaktioilla, minkä jälkeen mahdollisesti suorite- ... taan N-asetylointireaktioita, jolloin saadaan myös puoli- • · ·” synteettisiä N-desulfatoituja hepariineja tai N-desulfa- ♦ · ···1 toitu-N-asetyloituja hepariineja. Lisäksi näille glykos- aminoglykaaneille, olivatpa ne luonnollisia tai puolisyn- ·;··♦ 35 teettisiä, voidaan suorittaa depolymerisointiprosesseja, • · • · « • « · • · · · • « 7 106556 joiden avulla moolimassa saadaan tasoille, jotka ovat yleensä välillä 3 000 - 10 000 Daltonia.

Tässä keksinnössä kuvattu rakenteellinen modifiointi uusien hepariini- tai heparaanirakenteen omaavien puo-5 lisynteettisten glykosaminoglykaanien saamiseksi viittaa a-L-iduroni-2-O-sulfaattihapon yksikköön, jossa hapossa tapahtuu 0-sulfaattiryhmän osittainen tai täydellinen selektiivinen substituutio 2-asemassa nukleofiilisellä ryhmällä, mikä sitten onkaan haluttu yhdiste, jolla on hepa-10 riini- tai heparaanirakenne. Todellakin sen lisäksi, että tässä keksinnössä kuvattu kemiallinen menetelmä on selektiivinen, sitä voidaan käyttää hepariini- tai heparaanirakenteen omaaville glykosaminoglykaaneille, jotka edustavat kaikkia mahdollisia sekvenssejä; so. se riippuu sakkaridi-15 yksikön funktionalisaation tyypistä ja asteesta, joka yksikkö edeltää tai seuraa sekvenssissä a-L-iduroni-2-O-sul-faattihapon yksikköä, joka happo on rakenteellisen modi-fiointireaktioh kohteena.

Uusien tuotteiden rakenne kuvataan yleisellä kaa-20 valla IV

JZy^jL -0-/\°η fiu /i- «lii I t1HS0 " CSO,' WISO, OH KHCOCH, ' < Ns, 25 L L 1 • · • · * · ·

IV

• · ·1.1. jossa p + q = m, japon muu kuin 0, ja m, njaR ovat • · .·;·. edellä määritellyt, ja jossa -ZCR^R-l merkitsee nukleo- 30 fiilistä ryhmää, joka on liitetty tässä keksinnössä kuva- ... tulla menetelmällä. Tällä tavalla saatuihin yhdisteisiin • « *** viitataan "hepariini- tai heparaanirakenteen omaavina puo- • · ·;·' lisynteettisinä glykosamiiniglykaaneina, joilla on yleinen kaava IV, jossa -Z(R2)R·,^ vastaa ...".

« « · • « • tl • · · « • · · · « 8 106556

Rakenteellinen modifiointireaktio, joka käsittää nukleofiilisen radikaalin osittaisen tai täydellisen liittämisen α-L-iduronihapon 2-asemaan, ei johda glykosamino-glykaanien depolymerisaatioon tai niitä muodostavien poly-5 sakkaridiketjujen moolimassan jakauman muuttumiseen, ja tästä syystä tätä reaktiota voidaan käyttää minkä tahansa moolimassan omaaville glykosaminoglykaaneille, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne. Saaduille tuotteille voidaan kuitenkin suorittaa tunnettuja kemiallisia tai entsy-10 maattisia depolymerisointiprosesseja.

Erityisen edullisia tätä keksintöä toteutettaessa ovat radikaalit -Z{R2)R17 jotka ovat peräisin seuraavista nukleofiilisistä reagensseista: glysiini, glysyyliglysii-ni, L-kysteiini, asetyyli-L-kysteiini, L-kysteiinietyyli-15 esteri, 2-aminotiofenoli, 1,3-propaaniditioli, kysteamii- ni, natriumatsidi, 2-aminoetyylibisulfaatti, tauriini, tioglykolihappo, β-alaniinietyyliesteri, L-kystiini, hyd-roksyyliamiini, glysyylitauriini, kysteinyylitauriini, glysyylikysteiini, glysyylifenyylialaniini, glysyylityro-20 siini, 2-aminoetanoli, glysiiniesteri 2-aminoetanolin kanssa, glysiiniamidi 2-aminoetanolin kanssa, arginyyli-lysiini, arginiini, lysiini, 2-aminoetanoliesteri etikka-hapon kanssa, salisyylihappo, metioniini, glysyyliprolii-ni, gamma-aminovoihappo, lysyyliprolyyliarginiini, treo-25 nyylilysyyliproliini, treonyylilysiini, prolyyliarginiini, lysyyliproliini, koliini, 4-(3-aminopropyyli) -2-hydroksi-bentsoehappo ja 4- (2-aminoetyyli) -2-hydroksibentsoehappo.

Mahdollisen emäksen käyttö voi olla selvästi tar- • ♦ peetonta, kun nukleofiilinen reagenssi ei sisällä happo- • · · 30 luonteisia ryhmiä ja/tai ei muodosta suoloja happoluontei-sen aineen kanssa. Reaktio suoritetaan liuottamalla kaavan • · · • · *···1 III mukaisen 2,3-epoksigulonirakenteen omaava puolisyn- • · · ♦ · ...1 teettmen glykosaminoglykaani liuottimeen ja lisäämällä :’.J liuosta, joka sisältää nukleof iilisen reagenssin ja mah- • · 35 dollisen epäorgaanisen tai orgaanisen emäksen.

» · • · • « · • · · »JO · · • · • » o 9 106556

Reaktioseosta pidetään samalla sekoittaen mahdollisesti inertin kaasun, edullisesti typen, atmosfäärissä, kun nukleofiilinen reagenssi hapettuu helposti lämpötila-välillä 10 - 30 °C 24 - 96 tuntia.

5 Reaktion lopussa reaktioseos laimennetaan vedellä, kun käytetty liuotin ei ole vesi, sitten vesipitoisen liuoksen pH säädetään neutraaliksi lisäämällä vetykloridi-hapon vesiliuosta. Ylimääräinen nukleofiilinen reagenssi voidaan mahdollisesti poistaa, esimerkiksi uuttamalla 10 liuottimena, joka ei ole veteen sekoittuva, kloroformilla tai dietyylieetterillä, tai suodattamalla, kun se ei ole vesipitoiseen väliaineeseen liukoinen neutraalissa pH:ssa. Kirkasta vesipitoista liuosta voidaan edelleen puhdistaa myöhemmässä vaiheessa dialyysillä jakorajana 3 000 Dalto-15 nia ensin juoksevassa vedessä ja sitten tislatussa vedessä. Lopuksi yleisen kaavan IV mukaisen hepariini- tai he-paraanirakenteen omaava puolisynteettinen glykosaminogly-kaani eristetään lyofilisoimalla vesipitoinen liuos, joka sisältää sen, tai saostamalla lisäämällä sopivaa liuo-20 tinta.

Käytettävä nukleofiilisen aineen määrä on välillä 1 - 200 mooliekvivalenttia yleisen kaavan III mukaisen glykosaminoglykaanin dimeeriyksikköön nähden, joka gly-kaani sisältää epoksiryhmän, edullisesti käytetään 10 - *«c 25 100 ekvivalenttia. Liuotin valitaan ryhmästä, jonka ποιοι*·.. dostavat vesi ja polaariset liuottimet, kuten dimetyyli- ....j asetamidi, dimetyyli f ormamidi, asetonitriili, dioksaani, ;·,·. tetrahydrofuraani tai niiden seokset veden kanssa. Epäor- • · .·· gaanisista emäksistä edullisia ovat alkali- tai maa-alka- • · · • · · 30 limetallihydroksidit, edullisesti natrium- tai kaliumhyd-roksidi, kun taas edullisia orgaanisia emäksiä ovat ter- • ♦ *···* tiaariset amiinit, kuten trietyyliamiini.

• · * ...* Keksinnön edullisessa aspektissa reaktio suorite- ;\· taan liuottamalla yleisen kaavan III mukaisen hepariini- « · 35 tai heparaanirakenteen omaava puolisynteettinen glykosami- • · • · · • « « • » » · » » * » · • · • » · 10 106556 noglykaani veteen ja lisäämällä sekoittaen vesipitoinen liuos, joka sisältää 10 - 100 mooliekvivalenttia nukleo-fiilistä reagenssia yleisen kaavan III mukaisen glykosami-noglykaanin dimeeriyksikköön nähden, joka glykaani sisäl-5 tää epoksiryhmän, ja sellainen määrä natriumhydroksidia, joka riittää muodostamaan suolan mistä tahansa happoryh-mistä, jotka ovat nukleofiilisessä reagenssissa läsnä, ja/tai vapauttamaan tämän nukleofiilisen reagenssin mahdollisesta suolasta happoluonteisten aineiden kanssa. 10 Reaktioseosta, jossa puolisynteettisen glykosaminoglykaa-nin pitoisuus on edullisesti välillä 1 - 5 %, pidetään samalla sekoittaen mahdollisesti inertin kaasun atmosfäärissä huoneenlämpötilassa 24 - 96 tuntia. Reaktion lopussa seoksen pH saatetaan neutraaliksi vesipitoisella vetyklo-15 ridihapolla, ylimääräinen nukleofiilinen reagenssi voidaan poistaa passiivisen uuton avulla liuottimena, joka ei ole veden kanssa sekoittuva, tai suodattamalla, ja sitten reaktioliuokselle voidaan suorittaa dialyysi jakorajana 3 000 Daltonia ensin juoksevalla vedellä ja sitten tisla-20 tulla vedellä 6-24 tunnin aikana. Lopuksi liuokselle suoritetaan lyofilisointi tai siihen lisätään sopivaa liuotinta, jolloin saadaan yleisen kaavan IV mukaisen he-pariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisynteettinen '· ’ *: glykosaminoglykaani .

·;· 25 Tällä tavalla saatujen puolisynteettisten glykos- • · · · ·*·., aminoglykaanien piirteenä on, että niistä puuttuu a-L- • iduronihapon 2-O-sulfaattiryhmä, joka on substituoitu he-teroatomilla, typellä, rikillä tai hapella, joka on osa • · *..I nukleofiilisiä reagensseja, kuten amiineja, aminohappoja, • · · * 30 aminoestereitä, peptidejä, alkoholeja, merkaptaaneja, fe noleja, tiofenoleja. Tällä tavalla liitetään kovalenttinen • « sidos hepariini- tai heparaanirakenteen omaavien gly- *·· kosaminoglykaanien molekyylin ja nukleof iilisen ryhmän .·. : väliin, mikä edellä mainittujen glykosaminoglykaanien ra- • « 35 kenteellisia ominaisuuksia modifioimalla parantaa niiden • · • · • · · • · · t t» « « · o • · • · 11 106556 mahdollisuuksia imeytyä oraalisesti ja säilyttää niiden luonteenomaiset antitromboottiset ominaisuudet sillä tavalla edullisesti, että ne vähentävät merkittävästi ve-renvuotoaikaa ja antikoagulatiivista aktiivisuutta. Vas-5 taaviin hepariini- tai heparaanirakenteen omaaviin luonnon glykosaminoglykaaneihin nähden tässä keksinnössä kuvatuilla hepariini- tai heparaanirakenteen omaavilla puolisynteettisillä glykosaminoglykaaneilla on siten se etu, että niillä on antitromboottinen ja trombolyyttinen ak-10 tiivisuus, joka on pohjimmiltaan yhtä suuri, yhdistettynä alhaisempaan verenvuodon vaaraan, kuten eläimillä in vivo toteutetuilla farmakologisilla verenvuotokokeilla on selvästi osoitettu, ja se, että ne imeytyvät oraalisesti.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen uusien 15 puolisynteettisten glykosaminoglykaanien biologinen aktiivisuus määritettiin joillakin tavallisilla hepariiniko-keilla; tarkemmin sanottuna suoritettiin kokeita, jotka koskivat APTT:tä, verenvuotoaikaa ja antitromboottista aktiivisuutta.

20 APTT-aktiivisuus määritettiin julkaisun Larrieu M.J. ja Weiland G., Rev. Hematol., 12, 199 (1957) mene telmän mukaisesti.

Jokainen tuote tutkimuksessa liuotettiin plasmaan, joka oli otettu talteen rotista, joita oli pidetty paas-·;· 25 tolia, sen jälkeen tehtiin skalaarilaimennokset menetel-

MM

·*·,. mään tarvittavien pitoisuuksien aikaansaamiseksi. Kullekin • tuotteelle tehtiin 10 määritystä ja kunkin tuotteen ak-tiivisuus ilmaistiin pitoisuustermeinä μg/ml, mikä kaksin- • * kertaistaa APTT:n ajan.

• · · • · * * 30 Saadut arvot vahvistavat, että uusilla puolisyn teettisillä glykosaminoglykaaneilla on vähentynyt antikoa- • · gulatiivinen tehokkuus tavanomaiseen hepariiniin verrat- • · · *.a.: tuna.

: Verenvuotoaika määritettiin rotassa julkaisussa 35 Dejana E. et ai, Thromb. Haemost., 48., 108 (1982) kuvatun « « • · « • « · • - c « » « 12 106556 menetelmän mukaisesti ja tulos ilmoitettiin laskemalla uusilla puolisynteettisillä glykosaminoglykaaneilla käsiteltyjen rottien verenvuodon lisääntymisen ajan prosentuaalinen osuus verrattuna kontrollirottiin.

5 Uusilla puolisynteettisillä glykosaminoglykaaneilla oli vähentynyt verenvuotoaika tavanomaiseen hepariiniin verrattuna. Antitromboottinen aktiivisuus määritettiin rotassa laskimon veren virtauksen pysähtymisen tromboosi-kokeen avulla, joka on kuvattu julkaisussa Reyers S. et 10 ai, Thromb. Res., 18, 669 - 674 (1980). Veritulpan muodostuksen ehkäisykyvyn arvioimiseksi tuotteet injektoitiin laskimonsisäisesti reisilaskimoon 10 minuuttia ennen alaonttolaskimon suonen sitomista. 2 tunnin kuluttua veritulpat poistettiin, kuivattiin ja punnittiin.

15 Antitromboottinen aktiivisuus ilmaistiin sekä esiintymistiheyden prosentuaalisena osuutena (prosentuaalinen osuus rotista, joilla oli veritulppa) että veritulpan painon vähenemisenä verrattuna kontrolliveritulppaan.

Molemmissa tapauksissa tulokset ilmaistiin ED50:nä 20 mg/kg:na.

Saadut tulokset osoittivat, että uusien puolisynteettisten glykosaminoglykaanien antitromboottinen aktiivisuus on samanlainen kuin tavanomaisella hepariinilla.

Vapaiden aminoryhmien määritys suoritettiin UV-sä-..*·* 25 teilyn/näkyvän valon spektrofotometrian avulla 358 nm:n aallonpituudella tuotteella, joka oli saatu reaktiolla ·;··· trinitrobentseenisulfonihapon (TNBSm) kanssa julkaisussa

Satake K. et ai, J. Biochem. , 47., 654 (1960) kuvatun me- • · ♦ · .·;·. netelmän mukaisesti, kun taas rikin määritys suoritettiin • · · 30 potentiometrian avulla. Spesifinen kiertovoima mitattiin ... vesipitoisessa liuoksessa 1 %:n pitoisuudessa.

• ♦ *···* 13C-NMR-spektrit toteutettiin 50,3 MHz:n taajuudella • · ·..* Varian Gemini 200 -spektrometrillä käyttäen 3-(trimetyyli- ;*·.· silyyli) propionihapon natriumsuolaa, jonka hapon 2,2- ja * · • » * * · • · « • « • « · • ♦ · • ·· <- · • 6 < • · • · 13 106556 3,3-asemat oli deuteroitu (D4), sisäisenä vertailustandar-dina.

Tavanomaisella hepariinilla, joka on otettu vertailuksi tässä keksinnössä kuvattujen uusien glykosaminogly-5 kaanien biologisen aktiivisuuden arvioimiseksi, on seuraa- vat farmakologisen aktiivisuuden arvot edellä kuvattujen kokeiden mukaisesti: APTT (2T) =2,5 jtig/ml

Verenvuotoaika: 111 % 0,5 mg/kg:n pitoisuudessa 10 Antitromboottinen aktiivisuus (ED50) :

Painohäviö = 0,20 mg/kg Esiintymistiheys-% = 0,40 mg/kg Tavanomaiseen hepariiniin liittyvät kemialliset ja fysikaaliset tulokset vertailuna ja määritettynä edellä mai-15 nituilla menetelmillä ovat:

Vapaita aminoryhmiä =0,3 % S = 10,9 % 13C-NMR (ppm) : 177,5; 105,1; 102,1; 99,5; 80,1; 78,7; 73,9; 72,4; 72,0; 69,2; 62,6; 60,8; 56,7; 24,8.

20 [Λ] 546 = +60° [a] §89 = +49°

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1 ί’“ Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisyn- *;· 2 5 teettinen glykosaminogly kaani, jolla on yleinen ·«·« ·1·<# kaava IV, jossa -Z on N-glysyyli

Liuos, joka sisältää 3 760 mg glysiiniä ja 2 000 mg ··.·. natriumhydroksidia 22,5 ml :ssa vettä, lisätään huoneenläm- ♦ ♦

Potilassa liuokseen, joka sisältää 2,5 ml:ssa vettä 500 mg * · · * 30 EP-julkaisun 0 347 588 esimerkissä 3 kuvatun 2,3-epoksigu- lonirakenteen omaavaa puolisynteettistä glykosaminoglykaa- » « *··.1 nia.

* -» ♦

Reaktioseosta pidetään sekoittumassa huoneenlämpö- : tilassa 48 tuntia, sitten pH säädetään neutraaliksi lisää- • · 35 mällä vetykloridihappoa ja sen jälkeen liuokselle suorite- • · · • · · • te t » « • » 14 106556 taan dialyysi jakorajana 3 000 Daltonia 12 tunnin aikana juoksevassa vedessä ja 6 tunnin aikana tislatussa vedessä ja lopuksi lyofilisoidaan. Saadaan 520 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat analyyttiset ja farmakologiset 5 ominaisuudet:

Vapaita aminoryhmiä = 1,35 % 13C-NMR (ppm): 178,1; 104,8; 102,0; 98,7; 80,3; 79,2; 77,3; 71,8; 69,2; 62,9; 60,8; 53,6.

[a] 546 = +4 8° 10 [a]|°9 = +39° APTT (2T) = 18,0 μς/ml Antitromboottinen aktiivisuus (EDS0) :

Painohäviö = 0,23 mg/kg Esiintymistiheys-% = 0,75 mg/kg 15 Esimerkki 2

Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa -Z(R2)R1 on N-glysyyli-N-glysyyli

Reaktio suoritetaan samoissa olosuhteissa kuin esi-20 merkissä 1 on kuvattu käyttäen 6 600 mg:aa glysyyliglysii-niä 3 760 mg:n sijasta glysiiniä ja lisäämällä reaktioai-kaa 96 tunniksi.

Saadaan 630 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat * analyyttiset ominaisuudet: ··· 25 Vapaita aminoryhmiä = 4,9 % * * « · 13C-NMR (ppm): 180,0; 178,6; 176,6; 104,8; 103,4; 98,7; 80,0; 79,2; 77,0; 72,4; 71,8; 69,8; 69,2; 62,9; 61,0; • · 53,1; 46,2; 43,9.

[..f [a] 5°6 = +56° V * 30 [a] 589 = +46° M· • 9 9 9 999 9 9 9 • · 9 • * • · · • M t « * • I t > « • « f • • « « « * » • - 6 9 *l>i> 9 9 9 · * 0 15 106556

Esimerkki 3

Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa — Z (R2) Rx on L-p-amino-p-karbetok-5 sietyylitio

Reaktio suoritetaan samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1 on kuvattu käyttäen 8 780 mg:aa L-kysteiinimo-nohydraattivetykloridia 3 76 0 mg:n sijasta glysiiniä ja 4 000 mg:aa natriumhydroksidia 2 000 mg:n sijasta.

10 Saadaan 570 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat analyyttiset ja farmakologiset ominaisuudet:

Vapaita aminoryhmiä = 10,4 % 13C-NMR (ppm) : 177,0; 175,2; 104,2; 97,2; 78,1; 77,5; 72,2; 71,2; 69,0; 62,2; 60,3; 56,1; 50,1; 36,5.

15 [a]2sl6 = +37° [Ct]l°85 = +30° APTT (2T) = 16,6 μg/ml Antitromboottinen aktiivisuus (ED50) :

Painohäviö = 0,40 mg/kg 20 Esiintymistiheys-% = 0,72 mg/kg

Verenvuotoaika: 63 % 0,5 mg/kg:n pitoisuudella 114 % 1 mg/kg:n pitoisuudella Esimerkki 4 f

Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisyn-•j' 25 teettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa -ZfRj)!^ on L-p-amino-p-karbetok-sietyylitio JV. Reaktio suoritetaan samoissa olosuhteissa kuin esi- • · ]···, merkissä 1 on kuvattu käyttäen 9 280 mg:aa L-kysteiini- • · · 30 etyyliesterivetykloridia 3 760 mg:n sijasta glysiiniä.

Saadaan 550 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat ana- • · *···* lyyttiset ja farmakologiset ominaisuudet: * * *

Vapaita aminoryhmiä = 11,4 % 9 13C-NMR (ppm): 177,8; 175,4; 104,5; 98,4; 78,6; 77,8; 72,6; 35 71,8; 69,1; 66,5; 60,3; 56,2; 55,9; 50,2; 36,9; 15,9.

• * « · • · * t 4 · • - * · ♦ · • · 16 106556 [a] 1°6 = +49° [CC] gag = +43° ÄPTT (2T) =10,3 pg/ml Antitromboottinen aktiivisuus (ED50) : 5 Painohäviö = 0,15 mg/kg

Esiintymistiheys-% = 0,53 mg/kg Verenvuotoaika: 70 % o,5 mg/kg:n pitoisuudella 100 % 1 mg/kg:n pitoisuudella Esimerkki 5 10 Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisyn teettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa -Z on 2-aminofenyylitio

Reaktio suoritetaan, samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1 on kuvattu käyttäen 6 300 mg:aa 2-aminotiofeno-15 lia 3 760 mg:n sijasta glysiiniä ja lisäämällä reaktioai-kaa 72 tunniksi. Reaktion lopussa, sen jälkeen kun pH on säädetty neutraaliksi lisäämällä vetykloridihappoa, ylimääräinen aminotiofenoli poistetaan uuttamalla se kloroformilla. Sitten vesipitoiselle liuoksella suoritetaan 20 dialyysi ja lyofilisointi, kuten esimerkissä 1 on kuvattu, jolloin saadaan 690 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraani vat analyyttiset ja farmakologiset ominaisuudet: , Vapaita aminoryhmiä =4,7% 13C-NMR (pprn) : 151,0; 139,2; 133,9; 122,8; 120,6; 119,8; 25 104,8; 103,6; 98,6; 79,2; 75,8; 72,8; 71,9; 69,3; 62,8; 60,6; 54,2; 52,6.

Tv C«]L°6 = +53° :T: [oc]l8°9 = +42° APTT (2T) =8,3 μς/πιΐ .*··. 3 0 Antitromboottinen aktiivisuus (ED50) : • ♦ · .·♦·. Painohäviö = 1,12 mg/kg *** Esiintymistiheys-% = 1,72 mg/kg • · • » # • «· « • · • · • · · aa* « «aa 17 106556

Esimerkki 6

Hepariini- -tai heparaanirakenteen omaava puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa -ZiRjJR! on l-propaanitioli-3-tio 5 Reaktio suoritetaan samoissa olosuhteissa kuin esi merkissä 1 on kuvattu typpiatmosfäärissä käyttäen 5 390 mg:aa 1,3-propaaniditiolia 3 760 mg:n sijasta glysiiniä ja lisäämällä reaktioaikaa 90 tunniksi.

Saadaan 630 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat 10 analyyttiset ominaisuudet:

Vapaita aminoryhmiä = 2,6 % S = 6,1 % 13C-NMR (ppm) : 178,4; 104,9; 99,3; 80,2; 79,2; 77,9; 75,7; 73,0; 71,8; 69,2; 62,9; 60,8; 49,4; 40,1; 35,1; 34,2; 15 25,3.

[a] 546 = +55° [cc] Us = +47°

Esimerkki 7

Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisyn-20 teettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa -ZiR^jRx on 1,l-etaanidisulfaatti-2-, amino

Reaktio suoritetaan samoissa olosuhteissa kuin esi- ( < « 4 <·! merkissä 1 on kuvattu käyttäen 7 050 mg:aa 2-aminoetyyli- < « : " 25 disulfaattia 3 760 mg:n sijasta glysiiniä ja suodattamalla reaktioseos ennen kuin sille suoritetaan dialyysi.

s Saadaan 510 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat analyyttiset ja farmakologiset ominaisuudet:

Vapaita aminoryhmiä = 1,1 % .···. 30 S = 6,2 % • · 13C-NMR (ppm): 178,9; 104,8; 102,8; 98,8; 80,5; 79,2; 77,1; T* 71,8; 70,4; 69,2; 62,4; 60,9; 49,6.

•'N [a] |°6 - +52° [a] 589 = +43° : !·. 35 APTT (2T) = 6,1 /xg/ml « · · * « · · • « 18 106556

Antitromboottinen aktiivisuus (ED50) :

Painohäviö = 0,66 mg/kg Esiintymistiheys-% = 1,77 mg/kg Esimerkki 8 5 Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisyn teettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa -Z^)!^ vastaa taurinyyliä

Reaktio suoritetaan samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1 on kuvattu käyttäen 6 260 mg:aa tauriinia 3 760 10 mg:n sijasta glysiiniä ja lisäämällä reaktioaikaa 72 tunniksi .

Saadaan 560 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat analyyttiset ja farmakologiset ominaisuudet:

Vapaita aminoryhmiä = 1,2 % 15 S = 7,19 % 13C-NMR (ppm): 178,7; 104,9; 102,3; 99,0; 80,8; 79,3; 77,4; 71,8; 69,3; 62,9; 60,8; 52,4; 46,4.

[a]^6 = +62° [a] 589 = +50° 20 APTT (2T) = 12 μg/ml

Antitromboottinen aktiivisuus (ED50) : , Painohäviö = 0,52 mg/kg ((El

Esiintymistiheys-% = 1,31 mg/kg

I I I

Esimerkki 9 ( i « t ; " 25 Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisyn- ”·**· teettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen «· · • kaava IV, jossa -Z vastaa (S) -karboksimetyyli- ·*·*· tioa

Reaktio suoritetaan typpiatmosfäärissä samoissa .···. 30 olosuhteissa kuin esimerkissä 1 on kuvattu käyttäen 7 416 • · mg:aa tioglykolihappoa ja 6 450 mg:aa natriumhydroksidia *!* 20 ml:ssa vettä ja lisäämällä reaktioaikaa 72 tunniksi.

4 « ·.**: Saadaan 450 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat analyyttiset ja farmakologiset ominaisuudet: : .·. 35 Vapaita aminoryhmiä = 1,2 % • · » ♦ · « · · 19 106556 13C-NMR (ppm): 180,8; 178,1; 104,1; 99,2; 79,0; 72,7; 71,8; 69,2; 62,5; 60,6; 50,5; 40,1.

[a] \l6 = +59° [a]i°9 = +50° 5 Antitromboottinen aktiivisuus (ED50) :

Painohäviö = 0,40 mg/kg Esiintymistiheys-% = 1,22 mg/kg Esimerkki 10

Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisyn-10 teettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa -Z vastaa (S) -2-aminoetyyli- tioa

Reaktio suoritetaan typpiatmosfäärissä samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1 on kuvattu käyttäen 5 700 15 mg:aa kysteamiinivetykloridia 3 760 mg:n sijasta glysiiniä ja lisäämällä reaktioaikaa 72 tunniksi.

Saadaan 490 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat analyyttiset ominaisuudet:

Vapaita aminoryhmiä = 34 % 20 13C-NMR (ppm) : 178,1; 104,6; 98,4; 79,1; 77,7; 72,7; 71,8; 69,1; 62,8; 60,5; 50,4; 41,5; 40,6; 36,0; 33,0.

; [CC]|4°6 = +54° [a]"9 = +46°

I I I

Esimerkki 11 < “ 25 Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisyn- • · teettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen • kaava IV, jossa -ZfRjJRi vastaa B-alaniinietyylies- : : : teriä

Reaktio suoritetaan samoissa olosuhteissa kuin esi- .··1. 30 merkissä 1 on kuvattu käyttäen 7 680 mg:aa β-alaniinietyy- * · · · ,···, liesterivetykloridia 3 760 mg:n sijasta glysiiniä ja li- *11 säämällä reaktioaikaa 72 tunniksi.

• ·

Saadaan 480 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat ""· analyyttiset ominaisuudet: ; 35 Vapaita aminoryhmiä = 8,1 % III · I · · · · 20 106556 13C-NMR (ppm): 178,1; 104,8; 102,1; 100,5; 98,6; 97,3; 79,5; 75,5; 72,2; 71,6; 68,8; 65,2; 64,6; 62,4; 60,5; 39,2; 38,2; 36,1; 34,6; 15,9.

[a] He = +60° 5 [a] lag = +49°

Esimerkki 12

Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa vastaa atsidoa 10 500 mg julkaistun EP-patenttihakemuksen 0 347 588 esimerkissä 3 kuvattua 2,3-epoksigulonirakenteen omaavaa puolisynteettistä glykosaminoglykaania ja 6 500 mg nat- riumatsidia 20 ml:ssa vettä solubilisoidaan typpiatmos-fäärissä. Reaktioseosta pidetään sekoittumassa huoneen-15 lämpötilassa 96 tuntia ja sitten liuokselle suoritetaan dialyysi 12 tunnin aikana juoksevassa vedessä ja 6 tunnin aikana tislatussa vedessä sen jälkeen kun se on neutraloitu vetykloridihapon vesipitoisella liuoksella. Saatu liuos lyofilisoidaan, jolloin saadaan 410 mg otsikon tuotetta, 20 jolla on seuraavat analyyttiset ja farmakologiset ominaisuudet :

Vapaita aminoryhmiä = 1,8 % 13C-NMR (ppm): 178,1; 102,9; 98,1; 80,2; 79,1; 76,4; 72,8; 71,8; 69,8; 68,9; 63,8; 62,6; 60,5.

: ' 25 [a] 546 = +72 ° [a] las = +60° : * : Antitromboottinen aktiivisuus (ED50) :

Painohäviö = 0,2 0 mg/kg Esiintymistiheys-% = 0,64 mg/kg • · · • · • · • · · • · ·· · •

( 4 I

< 4 · < « « I « < « « 4 « « « • 44 21 106556

Esimerkki 13

Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa vastaa (N) -hydroksyyliami- 5 noa

Reaktio suoritetaan samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1 on kuvattu käyttäen 3 470 mg:aa hydroksyyli-amiinivetykloridia 3 760 mg:n sijasta glysiiniä. Reaktion lopussa liuoksen pH muuttuu neutraaliksi ja siten vesipi-10 toisen vetykloridihapon lisääminen liuoksen neutraloimi-seksi on tarpeetonta.

Saadaan 500 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat analyyttiset ja farmakologiset ominaisuudet:

Vapaita aminoryhmiä =1,7% 15 13C-NMR (ppm) : 178,6; 178,1; 104,8; 101,5; 98,0; 80,1; 79,2; 76,2; 72,2; 71,7; 69,1; 67,1; 65,7; 62,6; 60,7.

[α]^°6 = + 66° ia]l°B9 = +57° APTT (2T) =19,3 ^g/ml 20 Verenvuotoaika: 40,8 % 0,5 mg/kg:n pitoisuudella 74,2 % 1 mg/kg:n pitoisuudella , 135,8 % 2 mg/kg:n pitoisuudella

' ; < C

Antitromboottinen aktiivisuus (ED50) : r i i <<: Painohäviö = 0,74 mg/kg • '· 25 Esiintymistiheys-% = 1,44 mg/kg ·:**: Esimerkki 14 :*·*: Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisyn- •*;*j teettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa -ZtRjjRj vastaa L-kystinyyliä .···, 30 4 000 mg natriumhydroksidia ja 12 010 mg L-kystii- • · niä liuotetaan 70 ml:aan vettä ja lisätään liuos, joka *;* sisältää 500 mg julkaistun EP-patenttihakemuksen 0 347 588 < « esimerkissä 3 kuvattua 2,3-epoksigulonirakenteen omaavaa puolisynteettistä glykosaminoglykaania 2,5 ml:ssa vettä.

: 35 Reaktioseosta pidetään sekoittumassa 48 tuntia huoneen- 4 « « · 4 · « 22 106556 lämpötilassa ja sitten neutraloidaan lisäämällä vesipitoista vetykloridihappoa. Kiinteä jäännös, joka muodostuu, suodatetaan sitten pois ja kirkkaalle liuokselle suoritetaan dialyysi 12 tunnin aikana juoksevalla vedellä 5 ja 6 tunnin aikana tislatulla vedellä ja lopuksi lyofili-soidaan.

Saadaan 730 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat analyyttiset ja farmakologiset ominaisuudet:

Vapaita aminoryhmiä = 10,5 % 10 13C-NMR (ppm): 178,1; 104,8; 102,1; 98,7; 97,4; 79,7; 75,7; 72,0; 69,0; 62,6; 60,5; 56,3; 41,3.

[<X]|406 = +42° [a]s89 = +32° APTT (2T) = 18,4 μg/ml 15 Esimerkki 15

Hepariini- tai heparaanirakenteen omaava puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa -Z(R2)R! on N-glysyyli

Reaktio suoritetaan samoissa olosuhteissa kuin esi-20 merkissä 1 on kuvattu käyttäen 500 mg:aa EP-julkaisun 0 347 588 esimerkissä 5 kuvattua 2,3-epoksigulonirakenteen omaavaa puolisynteettistä glykosaminoglykaania.

Saadaan 510 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat .·; analyyttiset ominaisuudet: ί 25 Vapaita aminoryhmiä = 1,2 % :*·: 13C-NMR (ppm): 178,3; 104,8; 102,1; 98,6; 80,1; 79,1; 77,3; :*·*: 71,7; 69,0; 62,6; 60,7; 53,6.

•.T: [«] S46 = +42° ta] = +36° ·♦· 30 Esimerkki 16 • · • · V,'.' Heparaanirakenteen omaava puolisynteettinen glykos- *Γ aminoglykaani, jolla on yleinen kaava IV, jossa -Z(R2)R1 on N-glysyyli ·:·*: Käsittelemällä naudan pernasta saatua kaupallista . 35 heparaania (OPOCRIN) EP-julkaisussa 0 347 588 kuvatun me- • t · • i · « 23 106556 netelmän mukaisesti on valmistettu yleisen kaavan III mukainen 2,3-epoksigulonirakenteen omaava puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on seuraavat analyyttiset ominaisuudet : 5 Vapaita aminoryhmiä = 2,5 % 13C-NMR (ppm): 178,0; 177,4; 105,1; 99,6; 98,1; 97,1; 81,0; 78,8; 76,2; 73,3; 71,8; 70,9; 62,1; 60,3; 56,6; 55,9; 54,1; 53,1; 24,5.

[a] 1°6 = +102° 10 [a] 1°9 = +87° 500 mg tätä yleisen kaavan III mukaista 2,3-epoksigulonirakenteen omaavaa puolisynteettistä glykosaminogly-kaania saatetaan reagoimaan glysiinin kanssa samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 1 on kuvattu.

15 Saadaan 480 mg otsikon tuotetta, jolla on seuraavat analyyttiset ominaisuudet:

Vapaita aminoryhmiä = 3,0 % 13C-NMR (ppm): 178,0; 177,5; 105,2; 102,0; 99,6; 98,7; 81,1; 80,3; 79,1; 76,3; 73,4; 71,9; 69,2; 62,5; 60,5; 20 56,0; 53,6; 24,5.

[a]|°6 = +80° , [a] 589 = +68° t iiii a « a • ♦ • · · • · · • · • · ··· • · · • · · • · · • · • · * «aa • · · • # • · « . « « aa· a a · • · • a · • · · a 1 a · aa • · • ·

»M

Claims (5)

106556

1. Menetelmä hepariini- tai heparaanirakenteen omaavien puolisynteettisten glykosaminoglykaanien synteti-5 soimiseksi, joiden kaava on -.j&O- ° -f N--< US0- OH KHCOCH, I MHSO, OSO HfliU, Λ/1\„ 5

10. L J, L Jo IV jossa p + q = m, jolloin p on muu kuin 0, ja m ja n ovat kokonaisulukuja 1 - 100, R merkitsee vetyä tai sulfaat-15 tiryhmää (S03~) ja -Z(R2)R1 merkitsee nukleof iilistä radikaalia, joka on peräisin nukleofiilisestä reagenssis-ta, joka on valittu ryhmästä primaariset ja sekundaariset amiinit, sekundaariset heterosykliset amiinit, ami-noalkoholit, aminotiolit, aminohapot, aminoesterit, 20 peptidit, alkoholit, fenolit, merkaptaanit, ditiolit, tiofenolit, hydroksyyliamiinit, hydratsiinit, hydratsidit ja natriumatsidi, tunnettu siitä, että 2,3-epok-, sigulonirakenteen omaava puolisynteettinen glykos- aminoglykaani, jonka kaava on ί ‘ 25 ~ c cH ° A V * 0 HHSO,* OSO,' HHSO," 0« NHCOCH, J? L Jq L J" .·*. 30 $ · • · · .···. III *·’ jossa p, q, n ja R tarkoittavat samaa kuin edellä, ja joka li on saatu käsittelemällä hepariinimateriaalin vesipitoista liuosta alkalimetalli- tai maa-alkalimetalliemäksellä, « ; 3 5 jonka konsentraatio on 0,01 - IN, jolloin läsnä on aika- ι i « iti · II· • · • · M I 106556 limetallin tai maa-alkalimetallin suola, jonka konsent-raatio on 0 - 1 N, ja jolloin mahdollisesti on läsnä katalyyttinen määrä natriumboorihydridipelkistintä, 0,5 - 24 tunnin ajan lämpötilassa 35 - 70 °C; saatetaan reagoimaan 5 edellä mainitun nukleofiilisen reagenssin kanssa, jolloin läsnä on polaarinen liuotin ja sellainen määrä epäorgaanista tai orgaanista emästä, joka riittää muodostamaan suolan mistä tahansa happoryhmistä, jotka ovat läsnä nukleof iilisissä reagensseissa ja/tai vapauttamaan nämä nuk-10 leofiiliset reagenssit mistä tahansa suoloista, joita niillä voi olla happoluonteisten aineiden kanssa, mahdollisesti inertissä kaasuatmosfäärissä; sekoittaen 24 - 96 tuntia lämpötilassa 10 - 30 °C, reaktioseos laimennetaan vedellä, kun reaktioliuos on muu kuin vesi, vesipitoisen 15 liuoksen pH säädetään neutraaliksi lisäämällä vetyklori-dihapon vesiliuosta, ylimääräinen nukleofiilinen reagenssi mahdollisesti poistetaan uuttamalla liuottimena, joka ei ole veden kanssa sekoittuva, tai suodattamalla, vesipitoiselle liuokselle suoritetaan mahdollisesti dialyysi juok-20 sevalla vedellä ja tislatulla vedellä ja tuote eristetään lyofilisoimalla sitä sisältävä vesipitoinen liuos tai saostamalla lisäämällä sopivaa liuotinta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-n e t t u siitä, että nukleof iilisen reagenssin määrä on 4 « ; 1·« 25 1 - 200 mooliekvivalenttia kaavan III mukaisen epoksiryh- ·:2! män sisältävän puolisynteettisen glykosaminoglykaanin di- ·1·1: meeriyksikköön nähden. • · .1J‘.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- • 1 · n e t t u siitä, että polaarinen liuotin on dimetyy- #...# 30 liasetamidi, dimetyyliformamidi, asetonitriili, dioksaani, IV. tetrahydrofuraani tai niiden seos veden kanssa. • · *;1

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- • · :.1·· net t u siitä, että käytettävä emäs on natrium- *:2: hydroksidi, kaliumhydroksidi tai trietyyliamiini. • · • « » • » · • · » · 2 • · • 1 1 106556

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan III mukainen 2,3-epok-sigulonirakenteen omaava puolisynteettinen glykosamino-glykaani liuotetaan veteen, lisätään sekoittaen mahdol-5 lisesti inertissä kaasuatmosfäärissä vesipitoiseen liuokseen, joka sisältää 10 - 100 mooliekvivalenttia nukleo-fiilistä reagenssiä kaavan III mukaisen glykosamino-glykaanin dimeeriyksikköön nähden, joka glykaani sisältää epoksiryhmän, ja sellaisen määrän natriumhydroksidia, joka 10 riittää muodostamaan suolan mistä tahansa happoryhmistä, jotka ovat läsnä nukleofiilisessä reagenssissä, ja/tai vapauttamaan nukleofiilisen reagenssin mahdollisesta suolasta happoluonteisen aineen kanssa, sitten reaktioseosta pidetään huoneenlämpötilassa 24 - 96 tuntia, että tämän 15 jälkeen reaktioseoksen pH säädetään neutraaliksi vesi pitoisella vetykloridihapolla, kun reaktioseoksen pH ei ole neutraali, että ylimääräinen nukleofiilinen reagenssi voidaan mahdollisesti poistaa passiivisella uutolla liuottimen kanssa, joka ei ole veden kanssa sekoittuva, tai 20 suodattamalla, että reaktioliuokselle voidaan mahdollisesti suorittaa dialyysi juoksevalla vedellä ja tislatulla . vedellä 6-24 tunnin aikana ja että tuote eristetään 4 4 4 « liuoksesta lyofilisoinnin avulla tai lisäämällä sopivaa t « · ·«<'< liuotinta. • 1 • « « 1 < • · ·· ♦ ♦ 1 ♦ • · • · ♦ ♦ · • · · ♦ ··· • · • · ♦ · · ·«« • · • ♦ • · · « · 0 • · « • · • · · • · · • !' I · 1 1 • · • · « I < 106556