FI105100B - Menetelmä puolisynteettisten glykosaminoglykaanien valmistamiseksi, jotka sisältävät nukleofiilisillä radikaaleilla 3-asemassa substituoitua alfa-L-galakturonihappoa - Google Patents

Description

, 105100

Menetelmä puolisynteettisten glykosaminoglykaanien valmistamiseksi, jotka sisältävät nukleofiilisillä radikaaleilla 3-asemassa substituoitua a-L-galakturonihappoa 5 Keksinnön kohteena on menetelmä puolisynteettisten

glykosaminoglykaanien valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava III

10 .o* o* /coo / \ /coo' \Xi / \ _o_f\ M®/ lN°« _0_Ν®" / Livo» HHSO|* OSO, NHSO, «I *> l- —* P L_ q 15

M

coo -o A?» / lN?" A.

20 0H HHCOCHj «Jo jossa menetelmässä yksi hepariini- tai heparaanirakenteen käsittäville glykosaminoglykaaneille ominaisista sakkari-25 diyksiköistä, erityisemmin o-L-iduroni-2-O-sulfaattihappo, on modifioitu rakenteellisesti kokonaan tai osittain muuttuen a-L-galakturonihapoksi, joka on substituoitu 3-asemassa nukleofiilisillä radikaaleilla, joilla on yleinen kaava II 30

• Rj-Z-R2 II

« Mainittu menetelmä toteutetaan käsittelemällä glykosamino- glykaaneja, joilla on hepariini- tai hepara-anirakenne, 35 nukleofiilisillä reagensseilla emäksisessä väliaineessa.

2 105100 US-patentti 5 OIO 063 kuvaa hepariini- tai heparaanirakenteen omaavien glykosaminoglykaanien rakenteellisia modifiointeja emäksisessä väliaineessa ja tämän-jälkeistä uusien johdannaisten eristämistä reaktios-5 eoksesta, kuten erehtymättömästä on osoitettu kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien ja erityisesti 13C-NMR spektrin perusteella.

Myöhemmässä US-patentissa 5 104 860 kuvataan edelleen rakenteellista modifiointia emäksisessä tai neutraa-10 lissa väliaineessa, mikä, lähtien tuotteista, jotka oli muodostettu US 5 010 063:ssa kuvatuissa reaktio-olosuhteissa, ja glykosaminoglykaaneista, joilla on hepariini-tai heparaanirakenne ja joita käytettiin lähtöaineina samassa patentissa, aikaansai monia uusia tuotteita, jotka 15 poikkeavat mainitussa patentissa kuvatuista ja olivat uusia verrattuna alan viimeiseen kehitykseen, kuten erehtymättömästä on osoitettu kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien ja erityisesti 13C-NMR spektrin perusteella.

US-patentissa 5 010 063 kuvattujen tuotteiden ke-20 mialliset ja fysikaaliset ominaisuudet ja myöhemmät rakenteellisen tutkimuksen tulokset, joita ovat kuvanneet Jaseia M., Rej R., Sauriol F., Periin A.S. julkaisussa Can. J. Chem .67., 1449 - 56 (1989) , joiden spesifisenä tarkoituksena on selittää rakenteellisten modifointien reak-. 25 tiomekanismi emäksisessä väliaineessa, ovat osoittaneet, että näissä johdannaisissa esiintyy modifiointia, joka koskee ainoastaan yhtä glykosaminoglykaaneille, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne, ominaisista sakkaridiyk-siköistä, erityisemmin α-L-iduronihappoyksikköä, joka on 30 sulfatoitu 2-asemassa ja pitää sisällään sen transformaa-*·. tion 2,3-epoksigulonihappoyksiköksi . Näin saatuja epoksi-

deja kuvaa seuraava yleinen kaava IV

< < 3 105100

o« /0R

5 HHSO,' 0S0> MM$0»

Jp L -·<

OR

10 coo * j _0J\M 7 OH y\_ OH NHCOCH, jy — —< n 15 Samalla tavalla on osoitettu, että puolisynteetti set glykosaminoglykaanit, joissa on 2,3-epoksigulonihappo-yksikkö, ja myös glykosaminoglykaanit, joilla on heparii-ni- tai heparaanirakenne, reaktio-olosuhteissa, jotka vastaavat US-patentissa 5 104 860 kuvattuja, läpikäyvät ra-20 kennemodifioinnin, joka myös koskee α-L-iduronihapon sak- karidiyksikköä, joka on sulfatoitu 2-asemassa ja käsittää sakkaridiyksikön muuttamisen ei-sulfatoiduksi a-L-iduroni-happo- tai α-L-galakturonihappoyksiköksi, käytetyissä reaktio-olosuhteissa.

25 Täten US-patentti .5 010 063 kuvaa puolisynteettisiä glykosaminoglykaaneja, joissa on funktionaalinen epoksi-ryhmä a-L-iduroni-2-O-sulfaattihapon yksikön asemien 2 ja 3 välissä, ja tarvittavia reaktio-olosuhteita niiden aikaansaamiseksi, kun taas US-patentti 5 104 860 kuvaa tuot-30 teitä, jotka on saatu edelleen muuntamalla epoksidia, jon-• ka on vahvistettu sisältävän yhden yksikön ei-sulfatoitua α-L-iduroni- tai α-L-galakturonihappoa, ja reaktio-olosuhteita, jotka ovat tarpeellisia näiden saamiseksi lähtien itse epoksidista tai vaihtoehtoisesti lähtien glykosami-35 noglykaaneista, joilla on hepariini- tai heparaaniraken-ne • 105100 ja joita käytettiin lähtötuotteina US-patentissa nro 5 010 063. Myöhemmin julkaistussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa EP 565 862 kuvataan puolisynteettisiä gly-kosaminoglykaaneja, joista yksi glykosaminoglykaaneille, 5 joilla on hepariini- tai heparaanirakenne, ominaisista sakkaridiyksiköistä, joka spesifisemmin sisältää a-L-idu-roni-2-O-sulfaattihapon, on läpikäynyt täydellisen tai osittaisen rakennemodifioinnin muuttuen a-L-galakturoni-hapoksi, joka on substituoitu nukleofiilisellä radikaalil-10 la 3-asemassa. Mainitussa julkaistussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa vaaditussa menetelmässä kuvataan puolisynteettisten glykosaminoglykaanien, joilla on yleinen kaava III, valmistusta 15 r Ί or o» Z NHSOj' oso, NHSO, R, R, 20 L Jp L Jq or C~o m

• 25 -o-KjU__/L

OM NHCOCM, käsittelemällä kaavan IV epoksideja, joita on kuvattu 30 US-patentissa 5 010 063, nukleofiilisellä reagenssilla.

·· Esillä oleva keksintö koskee menetelmää puoli- • # synteettisten glykosaminoglykaanien valmistamiseksi, joiden kaava on 35 5 105100 ' 5 ,,Ζ HHSO," OSOj' NHSO 3"

Rl BJ

_ -J P L J q

OR

COO' f q jV°H / l_K°H /4- OH KHCOCH, _ —J n 15 jossa p + q = m, jolloin p on muu kuin 0, ja m ja n ovat kokonaislukuja 1 - 100, R on vety tai sulfaattiryhmä S03‘, ja -Z(R2)R1 on nukleofiilinen radikaali, joka on peräisin nukleofiilisestä reagenssista, joka on valittu ryhmästä primaariset ja sekundaariset amiinit, sekundaariset he-20 terosykliset amiinit, aminoalkoholit, aminotiolit, aminohapot, aminoesterit, peptidit, alkoholit, fenolit, merkaptaanit, ditiolit, tiofenolit, hydroksyyliamiinit, hydratsiinit, hydratsidit ja natriumatsidi. Menetelmälle on tunnusomaista, että hepariini- tai heparaanirakenteen * 25 omaava glykosaminoglykaani, jonka kaava on

OR OR

Λ-0 J--O \-O J-0

3 0 _ 0 _J\oh y' _0_Γ\0Η / L-Ny?H

* OSO,· KHSO,' OH HHCOCH, * -J ™ -J n

A B

6 105100 jossa m, n ja R tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan 10 - 100 mooliekvivalentin kanssa, suhteessa hepariini- tai heparaanirakenteen omaavan kaavan I mukaiseen glykosaminoglykaanin dimeeriyksikköön, edellä mai-5 nittua nukleofiilistä reagenssia vesipitoisessa liuoksessa, jolloin läsnä on riittävä määrä epäorgaanista tai orgaanista emästä muodostamaan suola mistä tahansa nukleo-fiilisessä reagenssissa läsnäolevasta happoryhmästä ja/tai vapauttamaan kyseinen nukleofiilinen reagenssi mistä talo hansa suoloista, joita ne ovat voineet muodostaa happojen kanssa ja muodostamaan emäksisyysylimäärä niin, että reak-tioseoksen normaalisuus on 1 - 3 N käytetyn emäksen suhteen, ja mahdollisesti inertissä kaasuilmakehässä sekoittaen 2-6 tuntia lämpötilassa 50 - 70 °C, neutraloi-15 daan kylmän vesipitoisen liuoksen pH lisäämällä vesipitoista vetykloridihappoliuosta, poistetaan mahdollisesti ylimäärä nukleofiilistä reagenssia uuttamalla liuottimel-la, joka ei ole veden kanssa sekoittuva, tai suodattamalla, tai suorittamalla vesipitoiselle liuokselle dialyysi 20 juoksevalla vedellä ja tislatulla vedellä ja eristetään tuote lyofilisoimalla vesipitoinen liuos tai saostamalla lisäämällä sopivaa liuotinta.

Uronihappojäännöksen konfiguraatio, joka poikkeaa glykosaminoglykaaneista, joilla on hepariini- tai \ 25 heparaanirakenne, määritettiin kemiallis-fysikaalisten tulosten perusteella, erityisesti 13C-NMR spektrin perusteella.

Käyttäen keksinnön mukaista menetelmää vältytään menetelmästä, jota on kuvattu julkaistussa EP-patenttiha-30 kemuksessa 565 862, koska tässä käytetään lähtöaineena *' kaavan I glykosaminoglykaaneja kun taas mainitussa euroop palaisessa patenttihakemuksessa lähtöainetuote on kaavan IV epoksidijohdannainen, joka vuorostaan on saatu kaavan I glykosaminoglykaanista menetelmän mukaisesti, jota on ku-35 vattu US-patentissa 5 010 063. Hyöty kaavan III tuotteen 7 105100 saamisesta suoraan ainoastaan yhdestä reaktiosta lähtien kaavan I glykosaminoglykaanista sensijaan että käytettäisiin kahta peräkkäistä reaktiota, joista ensimmäinen käsittää kaavan IV epoksidin valmistusmenetelmän, eristämi-5 sen ja puhdistamisen lähtien kaavan I glykosaminoglykaanista, on ilmeinen ottaen huomioon kokonaissaannon ja teollisuuskustannukset.

Ilmaisulla glykosaminoglykaanit, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne, tarkoitetaan polysak-10 karideja, joiden molekyylipaino on n. 3 000 - n. 50 000 Daltonia ja niille on tunnusomaista se tosiasia, että niissä on disakkaridiyksikkö, joka koostuu uronihaposta (joka voi olla α-L-iduroni- tai β-D-glukuronihappo) ja a-D-glukosamiinista, liitettyinä vuorottain 1,4-glyko-15 sidisidoksilla, kuten Gallagher J. T. ja Walker A. ovat kuvanneet julkaisussa Biochem. J., 230, 665- 674 (1985),

Lindhal U., Kjellen L. ovat kuvanneet julkaisussa Thrombosis and Haemostasis 66, 44 - 48 (1991) ja Turnbull J.E., Gallagher J.T. julkaisussa Biochem. J. 273, 553 - 559 20 (1991) . Koska cc-L-iduronihappo voidaan sulfatoida 2-ase- massa ja glukosamiini voidaan N-asetyloida, N-sulfatoida, 6-O-sulfatoida, 3-O-sulfatoida muutettavien substituent-tiasemien mukaisesti, vähintäin kymmenen erilaista disak-karidiyksikköä, joiden yhdistäminen aikaansaa suuren mää-25 rän erilaisia sekvenssejä, ovat mahdollisia. Pitäen mielessä tavallisimmat disakkaridiyksiköt ja yleisimmät sekvenssit, voidaan todeta kohtuullisella todennäköisyydellä, että yleinen kaava I voi kuvata glykosaminoglykaaneja, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne 30

.. or ( . OK

OS O,' HHSO, OH HHCOCH, 35

— — n L — n J

A B

8 105100 jossa R on vety tai sulfaattijäännös (SOj'1 ja jossa m ja n ovat kokonaislukuja 1 - 100.

Luonnollista alkuperää olevien hepariinirakenteis-ten glykosaminoglykaanien m-arvo on korkea ja disakkari-5 diyksikkö A muodostaa n. 80 % disakkaridiyksiköistä; toisaalta, luonnollista alkuperää olevien hepariinirakenteis-ten glykosaminoglykaanien n-arvo on korkea ja disakkari-diyksikkö B muodostaa n. 80 % disakkaridiyksiköistä.

Yleisten kaavojen I ja III tarkoituksena on esittää pää-10 sakkaridiyksiköiden koostumus, mutta ne eivät viittaa niiden sekvenssiin.

Kuten alan asiantuntijat tietävät, on mahdollista tehdä luonnollista alkuperää olevien glykosaminoglykaanien kemiallisia modifiointeja esimerkiksi N-desulfatoimalla, 15 mitä mahdollisesti seuraa N-asetylointi, näin aikaansaaden puolisynteettisiä N-desulfatoituja hepariineja tai N-de-sulfatoituja-N-asetyloituja hepariineja. Lisäksi nämä gly-kosaminoglykaanit, riippumatta siitä, ovatko ne luonnollisia tai puolisynteettisiä, voidaan altistaa depolymeroin-20 timenetelmille, joissa molekyylipaino on yleisesti tasolla 3 000 - 10 000 Daltonia.

Tässä keksinnössä kuvattu rakennemodifiointi uusien puolisynteettisten glykosaminoglykaanien aikaansaamiseksi koskee a-L-iduroni-2-0-sulfaattihapon sakkaridiyksikön ; 25 muuttamista α-L-galakturonihapon sakkaridiyksiköksi, joka on substituoitu nukleofiilisella radikaalilla 3-asemassa, mistä seuraa hepariini- tai heparaanirakenteen katoaminen. Tämä rakennemodifiointi voidaan tehdä mille tahansa yhdisteelle, jolla on hepariini- tai heparaanirakenne. Todella-30 kin, selektiivisyyden lisäksi tässä keksinnössä kuvattua kemiallista menetelmää voidaan soveltaa glykosaminoglykaa-neille, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne, kaikilla mahdollisilla sekvensseillä; ts. se on riippumaton sakkaridiyksikön funktionaalisuuden tasosta ja tyypistä, mikä 9 105100

edeltää tai seuraa a-L-iduroni-2-O-sulfaattihappoyksikön sekvenssiä, joka on rakennemodifiointireaktion kohde. Uusien tuotteiden rakennetta kuvaa yleinen kaava III

5 f 1 Γ

OB .OR

Λ-°v /-0 Λ-°v )-°.

/coo" γΙ / \ /coo* VJ / \ O-K U°/ U\OH Ä- -o-N?” / LJ\gH yA- .I. HHSO,* OSO, MHSO." R, ", io L J, L J, 0« CO0

_o Koh / Ll\°H A

^ OH NHCOCH, - —In jossa p + q = m, p on muu kuin Ojam, n ja R ovat kuten edellä ja jossa -Z(R2)R1 on nukleofiilinen ryhmä, joka on 20 lisätty tämän keksinnön menetelmän avulla. Tällä tavalla saatuja yhdisteitä kutsutaan "puolisynteettisiksi glykos-aminoglykaaneiksi".

Rakennemodifiointireaktio, missä modifioitiin a-L-iduroni-2-O-sulfaattihapon sakkaridiyksikkö a-L-galaktu-25 ronihapon sakkaridiyksiköksi lisäämällä a-L-galakturoniha- * · < pon 3-asemaan nukleofiilinen radikaali, ei johda glykos- aminoglykaanien depolymeroitumiseen tai polysakkaridiket- jujen, joista ne muodostuvat, molekyylipainojakaantuman muutoksiin ja tästä syystä tätä reaktiota voidaan soveltaa 30 glykosaminoglykaaneille, joilla on hepariini- tai heparaa- ” nirakenne, riippumatta molekyylipainosta. Saadut tuotteet « · voidaan kuitenkin altistaa tunnetuille kemiallisille tai entsymaattisille depolymerointimenetelmiile.

Nukleofiilisessa radikaalissa -Z (R2) Rx · (kaava IT) Z 35 on erityisesti happi, rikki tai typpi, R2 on haarautumaton 10 105100 tai haarautunut (C^^)alkyyli-, amiini-, aromaattinen, diatso-tai hydroksyyliradikaali, joka on substituoitu tai sub-stituoimaton ja R2 on ei mitään tai vety tai haarautumaton tai haarautunut (C1.6) alkyyliradikaali tai muodostaa Rx:n 5 kanssa heterosyklisen renkaan.

Erityisen edullisia tämän keksinnön toteuttamisessa ovat radikaalit -Z(R2)R1, jotka on johdettu seuraavista nukleofiilisistä reagensseista: glysiini, glysyyligly- siini, L-systeiini, asetyyli-L-systeiini, L-systeiinie-10 tyyliesteri, 2-aminotiofenoli, 1,3-propaaniditioli, syste-amiini, natriumatsidi, 2-aminoetyylibisulfaatti , tauriini, tioglykolihappo, β-alaniinietyyliesteri, L-systiini, hyd-roksyyliamiini, glysyylitauriini, systeinyylitauriini, glysyylisysteiini, glysyylifenyylialaniini, glysyylityro-15 siini, 2-aminoetanoli, glysiiniesteri 2-aminoetanolilla, glysiiniamidi 2-aminoetanolilla, arginyylilysiini, argi-niini, lysiini, 2-aminoetanoliesteri etikkahapolla, salisyylihappo, metioniini, glysyyliproliini, gamma- aminobutyyrihappo, lysyyliprolyyliarginiini, treonyylily-20 syyliproliini, treonyylilysiini, prolyyliarginiini, lysyy- liproliini, koliini, 4-(3-aminopropyyli)-2-hydroksi-bentsoehappo ja 4 -(2-aminoetyyli)-2-hydroksibentsoehappo.

Valmistusmenetelmässä puolisynteettisten glykosami-noglykaanien, joilla on hepariini- tai heparaanirakenne ja * 25 joilla on yleinen kaava III, valmistamiseksi saatetaan glykosaminoglykaani, jolla on hepariini- tai heparaanirakenne ja jolla on yleinen kaava I, reagoimaan kaavan II nukleofiilisen reagenssin kanssa vesipitoisessa liuoksessa jolloin läsnä on epäorgaaninen tai orgaaninen emäs, joka 30 pystyy muodostamaan suolaksi minkä tahansa nukleofiilisis- sä reagenssissa olevan happoryhmän ja/tai vapauttamaan • * kyseiset nukleofiiliset reagenssit mistä tahansa suolasta, joita niillä voi olla hapon kaltaisten aineiden kanssa, ja muodostamaan voimakkaan emäksisyyden reaktioseoksessa 35 alueella 1 - 3 N riippuen käytetystä emäksestä. Reaktio • 11 105100 toteutetaan lisäämällä kaavan I glykosaminoglykaania 1 -5 %:n määränä suhteessa liuoksen lopputilavuuteen, vesipitoiseen liuokseen, joka sisältää nukleofiilistä reagenssia ja epäorgaanista tai orgaanista emästä; sama 5 nukleofiilinen reagenssi voi toimia emäksenä, kun se on voimakas emäs.

Nukleofiilisen aineen määrä on 10 - 100 mooli- ekvivalenttia, suhteessa kaavan I glykosaminoglykaa- nin dimeeriseen yksikköön.

10 Alkali- tai maa-alkalimetallihydroksideja, edulli sesti natrium- tai kaliumhydroksidia käytetään epäorgaanisina emäksinä, kun taas tertiaarisia amiineja, kuten tri-etyyliamiinia käytetään edullisesti orgaanisina emäksinä. Reaktioseosta sekoitetaan mahdollisesti inertin kaasun 15 ilmakehässä, edullisesti typen ilmakehässä, kun nukleo-fiilinen reagenssi hapettuu helposti, lämpötilassa 50 °C -70 °C 2-6 tuntia.

Reaktion lopulla jäähdyttämisen jälkeen reaktioseos tehdään neutraaliksi lisäämällä vesipitoista vetykloridi-20 happoa. Ylimäärä nukleofiilistä reagenssia voidaan valinnaisesti poistaa esimerkiksi uuttamalla liuottimena, joka ei sekoitu veden kanssa, kloroformilla tai dietyylieette-rillä tai suodattamalla, kun se ei ole liukoinen vesipitoiseen väliaineeseen, jolla on neutraali pH. Kirkasta * 25 vesipitoista liuosta voidaan edelleen puhdistaa myöhemmäs sä vaiheesa dialyysillä, rajana 3000 Daltonia, ensin vesijohtovedessä ja sitten tislatussa vedessä. Lopuksi puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava III, eristetään lyofilisoimalla vesipitoinen liuos, joka 30 sisältää sitä, tai saostamalla lisäämällä sopivaa liuotinta .

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen tätä keksintöä .

12 105100

Esimerkki 1

Puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava III, jossa -Z(R2)Ri. on N-glysyyli 400 mg hepariini natriumsuolaa lisättiin 20 ml:aan 5 vesipitoista liuosta, jossa oli 4 500 mg glysiiniä ja 4 000 mg natriumhydroksidia, 60 °C:ssa. Reaktioseosta sekoitettiin 60 °C:ssa kolme tuntia ja jäähdytettiin sitten huoneenlämpötilaan ja neutraloitiin lisäämällä laimeaa vesipitoista vetykloridihappoliuosta. Sitten liuos altis-10 tettiin dialyysille, rajana 3 000 Daltonia, 12 tunniksi vesijohtovedessä vedessä ja kuudeksi tunniksi tislatussa vedessä ja lopuksi lyofilisoitiin antamaan 380 mg tuotetta .

Esimerkki 2 15 Puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava III, jossa -Z(Rz)R1 on etaanisul-fonihappo, 2-amino

Reaktio toteutettiin samoissa olosuhteissa kuten esimerkissä 1 on kuvattu käyttäen 3 750 mg tauriinia 20 4 500 mg:n asemesta glysiiniä ja saatiin 400 mg tuotetta.

Esimerkki 3

Puolisynteettinen glykosaminoglykaani, jolla on yleinen kaava III, jossa -Z(R2)R1 on M-butyyrihappo, 4-amino . 25 Reaktio toteutettiin samoissa olosuhteissa kuten esimerkissä 1 on kuvattu käyttäen 6200 mg 4-aminobutano-iinihappoa 4500 mg:n asemesta glysiiniä ja 3200 mg natriumhydroksidia 4000 mg:n asemesta ja pidentäen reaktioaika neljäksi tunniksi. Saatiin 390 mg tuotetta.

« · * ·

Claims (3)

13 105100

1. Menetelmä puolisynteettisten glykosaminoglykaa-nien valmistamiseksi, joiden kaava on 5 Z MHSOj" OSO,' NHSO, R, R, 10 _ Jp L jq OR COO * f 15 _Q_^yOH / jA— OH HHCOCHj III — —J Λ jossa p + q = m, jolloin p on muu kuin 0, ja m ja n ovat 20 kokonaislukuja 1 - 100, R on vety tai sulfaattiryhmä S03", ja -Z(R2)R1 on nukleofiilinen radikaali, joka on peräisin nukleofiilisestä reagenssista, joka on valittu ryhmästä primaariset ja sekundaariset amiinit, sekundaariset he-terosykliset amiinit, aminoalkoholit, aminotiolit, 25 aminohapot, aminoesterit, peptidit, alkoholit, fenolit, merkaptaanit, ditiolit, tiofenolit, hydroksyyliamiinit, hydratsiinit, hydratsidit ja natriumatsidi, tunnet-t u siitä, että hepariini- tai heparaanirakenteen omaava glykosaminoglykaani, jonka kaava on 30 °« OR -oJ\°H / l/\o» _0_r^H / l^oh /\_ 0S0J KHSO, OH HHCOCH, —' w —I n A B !4 105100 jossa m, n ja R tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan 10 - 100 mooliekvivalentin kanssa, suhteessa hepariini- tai heparaanirakenteen omaavan kaavan I mukaiseen glykosaminoglykaanin dimeeriyksikköön, edellä mai-5 nittua nukleofiilistä reagenssia vesipitoisessa liuoksessa, jolloin läsnä on riittävä määrä epäorgaanista tai orgaanista emästä muodostamaan suola mistä tahansa nukleo-fiilisessä reagenssissa läsnäolevasta happoryhmästä ja/tai vapauttamaan kyseinen nukleofiilinen reagenssi mistä talo hansa suoloista, joita ne ovat voineet muodostaa happojen kanssa ja muodostamaan emäksisyysylimäärä niin, että reak-tioseoksen normaalisuus on 1 - 3 N käytetyn emäksen suhteen, ja mahdollisesti inertissä kaasuilmakehässä sekoittaen 2-6 tuntia lämpötilassa 50 - 70 °C, neutraloi-15 daan kylmän vesipitoisen liuoksen pH lisäämällä vesipitoista vetykloridihappoliuosta, poistetaan mahdollisesti ylimäärä nukleofiilistä reagenssia uuttamalla liuottimel-la, joka ei ole veden kanssa sekoittuva, tai suodattamalla, tai suorittamalla vesipitoiselle liuokselle dialyysi 20 juoksevalla vedellä ja tislatulla vedellä ja eristetään tuote lyofilisoimalla vesipitoinen liuos tai saostamalla lisäämällä sopivaa liuotinta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty emäs on natriumhydroksidi, ! 25 kaliumhydroksidi tai trietyyliamiini.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että radikaali -Z(R2)R1 on johdettu ryhmästä glysiini , glysyyliglysiini, L-kysteiini, asetyyli-L-kysteiini, L-kysteiinietyyliesteri, 2-aminotiofenoli, 1,3- 30 propaaniditioli, kysteamiini, natriumatsidi, 2-aminoetyy-:1 libisulfaatti, tauriini, tioglykolihappo, β-alaniinietyy- liesteri, L-kystiini, hydroksyyliamiini, glysyylitauriini, kysteinyylitauriini, glysyylikysteiini , glysyylifenyyli-alaniini, glysyylityrosiini , 2-aminoetanoli, glysiinieste-35 ri 2 -aminoetanoli11a, glysiiniamidi 2-aminoetanolilla, 15 105100 arginyylilysiini, arginiini, lysiini, 2-aminoetanoliesteri etikkahapolla, salisyylihappo, metioniini, glysyyliprolii-ni, γ-aminobutyyrihappo, lysyyliprolyyliarginiini, treo-nyylilysyyliproliini, treonyylilysiini, prolyyliarginiini, 5 lysyyliproliini, koliini, 4-(3-aminopropyyli)-2-hydroksi-bentsoehappo ja 4-(2-aminoetyyli)-2-hydroksibentsoehappo. 1 · 105100 1 6