KR0171623B1 - 3-위치가 친핵성 래디칼로 치환된 알파-엘-갈락투론산을 함유하는 반-합성 글리코스아미노글리칸 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헤파란 구조를 갖는 글리코스아미노글리칸의 삭카라이드 단위 중 하나를 보다 특별하게는 α - L - 이두로닉 - 2 - 0 - 황산을 전체적 또는 부분적으로 구조적 수정을 겪게하여 3-위치가 친핵성 래디칼로 치환된 α- L - 갈락투론산으로 전환시켜 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸을 합성하는 것에 관한 것이다.
다음 일반식 IV의 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸은 경구용으로 흡수될 수도 있고 출혈의 위험을 수반하지 않으며 항-응고 활성을 감소시켜주는 양호한 항-혈전 활성을 갖는다.

Description

3-위치가 친핵성 래디칼로 치환된 α - L - 갈락투론산을 함유하는 반-합성 글리코스아미노글리칸
신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸의 합성은 헤파린 또는 헤파란 구조를 갖는 글리코스아미노글리칸의 삭카라이드 단위중 하나, 보다 특별하게는 α - L - 이두로닉 - 2 - 0 - 황산을 전체적 또는 부분적으로 구조적 수정을 겪게하여 3 - 위치가 친핵성 래치칼로 치환된 α - L - 갈락투론산으로 전환시키는 것이다.
다음 일반식 IV의 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸은 경구용으로 흡수될 수도 있고 출혈의 위험을 수반하지 않으며 항-응고 활성을 감소시켜주는 양호한 항-혈전 활성을 갖는다.
공고된 유럽특허 EP 0347588 명세서에는 그 출원당시에 기술적 수준에서 신규했던 새로운 유도체로부터 연속 분리하여 얻은 헤파린 또는 헤파란 구조를 갖는 글리코스아미노글리칸을 염기성 매개물내에서 구조적으로 수정시키는 방법이 기술된바 있으며, 이를 화학적, 물리적 특성에 의해, 특히13C - NMR 스펙트럼에 의해 명백하게 증명해 보인바 있다.
후속하여 공고된 유럽특허 EP 0380943 출원서에 있어서는, EP 0347588 에 기술된 반응 조건하에서 형성된 생성물 및 EP 0347588에서의 출발 생성물로서 사용된 헤파린 또는 헤파란 구조를 갖는 글리코스아미노글리칸으로부터 출발하여 염기성 또는 중성 매개물내에서 추가의 구조적 수정을 가하는 내용이 기술되어 있으며, 이는 화학적 특성 및 물리적 특성에 의해, 특히13C - NMR 스펙트럼에 의해 분명히 증명되는 바와같이, 그 출원 당시의 기술적 수준에서는 신규했고 상기 EP 0347588에 기술된 것들과 다른 신규한 생성물류를 파성시킨 기술이었다.
EP 0347588에 기술된 생성물의 화학적, 물리적 특성, 및 염기성 매개물내에서의 구조적 수정반응의 매카니즘을 설명하고자하는 특정 목적을 가진 Jaseia., Rej R., Sauriol F., Pertain 4. 5. in Can. J. Chem 67, 1449-56(1989)에 의해 기술된 후속적인 구조적 연구결과가 함께 다음과 같은 점을 증명해준 바 있다. 즉, 이들 유도체는 헤파린 또는 헤파란 구조를 지닌 글리코스아미노글리칸의 특징적인 하나의 삭카라이드 단위가 직접 수정된 것이며, 보다 특별하게는 2-위치가 설페이트화 된 α - L - 이두론산 단위가 2, 3 - 에폭시구로닉(2, 3 - epoxygulonic) 단위로 전환된 것이라는 점이다.
마찬가지로, EP 0380943에 기술된 것들과 유사한 반응조건하에서의 하나의 2, 3-에폭시 글로닉 단위를 갖는 반-합성 글리코스아미노글리칸, 및 또한 헤파린 포는 헤파란 구조를 갖는 글리코스아미노글리칸도 사용된 반응조건에 따라서는 그 위치가 설페이트화 된 α - L - 이두론산의 삭카라이드 단위에서 역시 구조적 수정이 일어나며, 상기 삭카라이드 단위가 비-설페이트와 α - L - 이두론산 또는 α - L - 갈락투론산 단위로 전환된다는 것이 증명된 바 있다.
EP 0347588에는, 출발점에서 얻어진 α - L - 이두로닉 - 2 - 0 - 황산의 2 및 3 위치 사이에 에폭시 작용기를 갖는 반-합성 글리코스아미노글리칸 및 그것을 얻기 위해 필요한 반응조건이 기술되어 있는 반면에, EP 0380943에는 한 단위의 비-설페이트화 α - L - 이두론산 또는 α - L -갈락투론산을 갖는 것으로 확증된, 에폭시드의 추가 전환으로부터 유도된 생성물이 기술되어 있으며, 또한 이들을 얻는데 필요한 반응조건, 즉 에폭시드 자체로부터 출발하거나, EP 0347588에서 출발 생성물로서 사용된 헤파린 또는 헤파란 그 자체를 지닌 글리코스아미노글리칸으로부터 출발하여 상기 생성물을 얻기 위해 필요한 반응조건이 기술되어 있다.
본 발명의 목적은 헤파린 또는 헤파란 구조를 갖는 천연 글리코스아미노글리칸의 특성인 α - L - 이두로닉 - 2 - 0 - 황산 대신에, 친핵성 잔기에 의해 3 위치가 치환된 α - L - 갈락트론산을 함유하는 것을 특징으로하는 신규한 반 - 합성 글리코스아미노글리칸에 관한 것이다. 헤파린 또는 헤파란을 갖는 글리코스아미노글리칸의 원자배열과 다른 우로닉 잔기의 원자 배열은 화학적 및 물리적 데이타, 특히13C - NMR 스펙트럼에 따라 판단되었다.
본 발명에서 특허청구하고 있는 신규한 유도체는 당 분야에서, 특히 상기 언급된 유럽특허 출원서에서 고려한 것들 보다 더 향상된 것이다. 사실, 후자의 특허들에 있어서는 친핵성 시약으로서 물을 사용하여 염기성 수성 매개물내에서 얻어진 생성물을 특허청구하고 있다. 본 발명의 명세서에 있어서는, 헤파린 및 헤파란 구조를 갖는 글리코스아미노글리칸의 특성인 α -L - 이두로닉 - 2 - 0 - 황산의 단위를 전환시켜 3 - 위치가 친핵성 잔기로 치환된 α - L - 갈락투론산의 단위로 얻어지도록하는 그러한 조건하에서 조심스럽게 선택된 일련의 친핵성 시약으로 반응시킴에 따라 얻어지는 신규한 생성물을 기술하고 있다.
본 발명의 다른 목적은 적당한 친핵성 시약과 EP 0347588에 기술된 에폭사이드로부터 출발하여 상술된 생성물을 얻기 위한 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 분야를 보다 한정하기 위해서, 헤파린 또는 헤파란 구조를 지닌 글리코스아미노글리칸은 약 3,000 - 약 50,000 달톤의 분자량을 갖는 폴리삭카라이드이며, 이는 Lindnal U., Kjellen L. in Thrombosis and Haemostalis 66, 44-48 (1991), 및 Turnbull J. E., Gallagher J. t. in Biochem. J, 273, 553-559 (1991)에 기술된 바와같은 1, 4 - 글리코시드성 결합에 의해 교대 배열(alternate sequence)로서 연결된, 우론산(α - L - 이두론산 또는 β - D - 글루쿠론산) 및 α - D - 글루코스아민으로 구성된 디삭카라이드 단위를 함유하고 있다는 사실이 특징이라는 점을 지적하고 싶다.
α - L - 이두론산은 2 위치가 설페이트화 될 수 있는 까닭에, 글루코스아민은 치환체의 변경가능한 위치에 따라 N - 아세틸화, N - 설페이트화, 6 - 0 - 설페이드화, 3 - 0 - 설페이트화 될 수 있으며, 적어도 10개의 다른 디삭카라이드 단위가 가능하고, 이들의 배합물은 많은 수의 다른 배열을 발생시킬 수 있다. 대부분 표현되는 디삭카라이드 단위 및 아주 흔한 배열들에 유의하면서, 본 발명자들은 이상적인 접근방법으로서 일반식 I 이 헤파린 또는 헤파란 구조를 지닌 글리코스아미노글리칸에 기인한다고 말할 수 있다.
위식에서, R은 수소 또는 설페이트 잔기(SO3 -)이며, m 및 n은 1-100의 모든 수이다.
천연원의 헤파린 구조화 글리코스아미노글리칸에 있어서, m의 값은 크고 디삭카라이드 단위 A는 디삭카라이드 단위들의 약 80%를 나타내는 반면에, 천연원의 헤파린 구조화 글리코스아미노글리칸에 있어서 n 값은 크고 디삭카라이드 단위 B는 디삭카라이드 단위들의 약 80%를 나타낸다.
일반식 I 및 그 후속 일반식 III 및 IV는 주요 삭카라이드 단위들의 조성을 나타내고는 있지만 그 배열을 언급하고 있지는 않는다.
당 분야에 숙련된 기술자에게 공지되어 있는 바와같이, 천연원의 글리코스아미노글리칸의 화학적수정, 예를들면 N - 아세틸화 반응에 의해 일어나는 N - 탈설페이트화 N - desulfation) 반응을 통해 화학적으로 수정이 가능하며, 따라서 반-합성 N-탈 설페이트화 헤파린 또는 N - 탈설페이트화 -N - 아세틸화 헤파린도 얻어진다. 또한, 천연 글리코스 아미노글리칸이든 반-합성 글리코스아미노글리칸 이든간에 이들 글리코스아미노글리칸은 탈중합 반응공정을 거쳐서 분자량이 보통 3,000 - 10,000 달톤의 수준을 유지하게 된다.
반 - 합성 글리코스아미노글리칸을 얻기 위한 본 발명에 기술된 구조적 수정은, α - L - 이두로닉 - 2 - 0 - 황산의 삭카라이드 단위를 3 - 위치가 친핵성 래디칼로 부분적 또는 전체적으로 치환된 α - L - 갈락투론산의 삭카라이드 단위로 전환시키는 것을 포함하며, 이때 연속적으로 헤파린 또는 헤파란 구조가 소멸된다. 게다가, 선택적인 것 이외에 본 발명에 기술된 화학적 공정은 가능한 모든 배열이 존재하는 헤파린 또는 헤파란 구조를 지닌 글리코스아미노글리칸에 적용시킬 수 있다. 즉, 구조적 수정반응의 목적인 α - L - 이두로닉 - 2 - 0 - 황산 단위가 배열내에서 선행되거나 뒤에 놓여져 있는 삭카라이드 단위의 작용기화 수준 및 종류와 상관이 없다.
신규한 생성물의 구조는 일반식 IV 로 표현된다.
위식에서, p + q = m 이고, 이때 p 는 0 이외의 수이며, m, n 및 R은 상술한 바와같은 의미를 가지며, -Z(R2)R1은 본 발명에 기술된 공정을 통해 도입된 친핵성 기를 나타낸다. 상기 방법으로 얻어진 화합물은 -Z(R2)(R1)이 ‥‥‥ 에 대응하는 일반식 IV의 헤파린 또는 헤파란 구조를 지닌 반-합성글리코스아미노글리칸으로서 나타내어질 수 있다.
α - L - 이두로닉 - 2 - 0 - 황산의 삭카라이드 단위로부터 α - L -갈락투론산의 삭카라이드 단위로의 수정, 즉 α - L - 갈락투론산의 3 - 위치에 친핵성 래디칼이 도입되는 수정을 포함하는 구조적 수정반응은 글리코스아미노글리칸의 탈중합반응을 일으키거나 이들을 형성하는 폴리삭카라이드 사슬의 분자량의 분포를 변경시키지 않는다. 이러한 이유로 본 발명은 어떠한 분자량을 갖는 헤파린 또는 헤파란 구조를 지닌 글리코스아미노글리칸이라도 적용시킬 수 있다. 그러나, 얻어진 생성물을 공지 방법의 화학적 또는 효소적 탈중합 반응시킬 수도 있다.
본 발명의 목적은 일반식 I :
(위식에서, R은 수소 또는 설페이자 잔기(SO3 -)를 나타내며, m 및 n은 1 - 100 사이의 값을 갖는 모든 수이다).
의 헤파린 또는 헤파란 구조를 갖는 글리코스아미노글리칸의 삭카라이드 단위의 특성중에 하나인 α - L - 이두로닉 - 2 - 0 - 황산을 부분적 또는 전체적으로 전환시켜 3 - 위치가 일반식 II
의 친핵성 래디칼로 치환된 α - L - 갈락투론산으로 구조적 변경을 겪게함으로써 일반식 IV :
(위식에서, p + q = m 이고, 이때 p 는 0 이외의 수이며, m, n 및 R은 상기 정의된 바와같음)
로 나타내어지는 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸을 얻게되는, 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸에 관한 것이다. 본 발명의 실시하는데 있어서 모든 친핵성 시약의 사용이 가능하며, -Z(R2)R1래디칼은 친핵성 시약의 임의의 종류를 포함한다.
보다 특별하게는, Z는 산소, 황 또는 질소를 나타내며, R1은 직쇄 또는 측쇄(C1-12) 알킬, 아민 래디칼, 방향족 래디칼, 디아조 또는 히드록실 래디칼로서 치환되거나 치환되지 않았으며, R2는 생략되거나 수소, 또는 직쇄 또는 측쇄(C1-6) 알킬 래디칼, 또는 R1과 함께 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 래디칼 R1의 치환체는 할로겐화물, 아민 래디칼, 방향족 래디칼, 카복실 래디칼, 구아니딘 래디칼, 니트르 래터칼, 히드록실 래디칼, 술폰 래디칼, 설포 래디칼, 티올 래디칼 또는 우레이드 래터칼로서, 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
1차 또는 2차 아민, 2차 헤테로시클릭형 아민, 아미노-알코올, 아미노티올, 아미노산, 아미노에스테르, 펩티드, 알코올, 페놀, 머캅탄, 디티올, 티오페놀, 히드록실아민, 히드라진, 히드라자이드 및 소디움 아자이드로부터 유도되는 래디칼은 본 발명에서 사용되기에 적합한 것들이다.
본 발명에 사용되기 특히 바람직한 것은 다음의 친핵성 시약으로부터 파생되는 -Z(R2)R1래디칼이다. 즉, 글리신, 글리실글리신, L - 시스테인, 아세틸 - L - 시스테인, L - 시스테인 에틸 에스테르, 2 - 아미노티오페놀, 1,3 - 프로판디티올, 시스테아민, 소디움 아자이드, 2-아미노에틸 비설페이트, 타우린, 티오글리콜산, β - 알라닌 에틸 에스테르, L - 시스틴, 히드록실아민, 글리실타우린, 시스테이닐타우린, 글리실시스테인, 글리실페닐알라닌, 글리실티로신, 2-아미노에탄올, 2-아미노에탄올을 지닌 글리신 에스테르, 2-아미노에탄올을 지닌 글리신 아미드, 아르기닌, 리신, 아세트산을 지닌 2-아미노에탄올, 살리실 산, 메티오닌, 글리실프롤린, r - 아미노부티르 산, 리실프롤릴 아르기닌, 트레오닐리실프롤린, 트레오닐리신, 프롤릴아르기닌, 리실프롤린, 콜린, 4-(3-아미노프로필) - 2 - 히드록시벤조산 및 4 - (2 - 아미노 에틸) - 2 - 히드록시벤조산 등이다.
본 발명의 다른 목적은, 공고된 유럽특허제 EP 0347588호 명세서에 기술된 제조방법에 따라 얻어진, 일반식 III의 2, 3 에폭시글로닉 구조를 사용하여, 반-합성 글리코스아미노글리칸으로부터 출발한 일반식 IV의 반-합성 글리코스아미노글리칸을 합성하는 방법에 관한 것이다.
(위식에서, p, q, n 및 R은 상술한 바와같음)
일반식 IV 인 반-합성 글리코스아미노글리칸을 얻기 위한 방법은, 용매의 존재하에, 그리고 친핵성 시약내에 존재하는 임의의 산기를 염화시킬 수 있거나 또는 산성의 물질을 가질 수 있는 임의의 염으로부터 동일한 친핵성 시약이 들어있지 않은 다량의 무기 또는 유기 염기, 즉 사용된 염기에 대하여 반응 혼합물의 과량의 알칼리도가 0.01 - 5N, 바람직하게는 1 - 3N이 되도록 하는 그러한 량의 무기 또는 유기 염기의 존재하에, 래디칼이 일반식 II 를 갖는 친핵성 시약을 사용하여 일반식 III의 2, 3 에폭시글로닉 구조를 지닌 반-합성 글리코스아미노글리칸을 반응시키는 것을 포함한다. 친핵성 시약 및 무기 또는 유기염기를 함유하는 용액에 일반식 III의 반-합성 글리코스아미노글리칸을 첨가함에 의해서 상기 반응이 종결된다. 동일한 친핵성 시약이 염기로서 작용할 수 있다. 즉, 예를들어 메틸아민이 친핵성 시약으로서 사용될 경우, 이것은 염기로서도 작용되기 때문에, 다른 염기를 첨가할 필요가 없게 된다.
이 반응 혼합물을 가능하면 불활성 기체, 바람직하게는 질소 분위기하에서 30 - 24시간동안, 바람직하게는 2 - 6시간 동안 35℃ - 95℃, 바람직하게는 50℃ - 70℃의 온도에서 교반해주면, 친핵성 시약이 용이하게 산화될 수 있다.
반응이 끝나면, 사용된 용매가 물이 아닌 경우, 이 반응 혼합물을 물로 희석한 다음, 이 수용액에 염산 수용액을 가하여 pH를 중성으로 만든다. 과량의 친핵성 시약은 예를들면 물에 혼화되지 않는 용매, 즉 클로로포름이나 디에틸 에테르를 사용하여 추출하거나 중성 pH를 갖는 수성 매개물 내에 용해되지 않는 경우 여과시켜서 선택적으로 제거시킬 수 있다. 추가로, 이 투명한 수용액을 먼저 수돗물 내에서, 그 다음에는 증류수 내에서, 3,000 달톤을 차단시키는 투석을 통해 최종적으로 정제한다. 마지막으로, 이 수용액을 동결건조시키거나 또는 적당한 용매를 가하여 침전시킴으로서 일반식 IV의 헤파린 또는 헤파란 구조를 지닌 반-합성 글리코스아미노글리칸을 분리해낸다.
사용된 친핵성 시약의 량은 에폭시기를 포함하는 일반식 III의 글리코스아미노글리칸의 다이머(dimer) 단위에 대하여 1 - 200 몰딩이며, 10 - 100 당량을 사용하는 것이 바람직하다. 용매는 물이나, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디옥산, 테트라히드로푸란, 또는 물과 이들의 혼합물중에서 선택된다. 바람직한 무기염기는 알칼리성이나 알칼리토금속 수산화물이며, 보다 바람직한 것은 수산화 나트륨이나 수산화칼륨이다. 반면에 바람직한 유기 염기는 트리에틸아민과 같은 3차 아민이다.
본 발명의 바람직한 견해로서, 에폭시를 함유하는 일반식 III의 글리코스아미노글리칸의 다이머 단위에 대해 친핵성 시약 10 - 100 당량 몰 및 이 친핵성 시약에 존재하는 임의의 산기를 염화시키거나 또는 산성의 물질을 갖는 가능한 염으로부터 동일한 친핵성 시약을 방출시키기에 충분한 다량의 수산화나트륨, 즉 사용된 염기에 대해 반응혼합물이 0.01 - 5N의 과량의 알칼리도를 갖게하는 다량의 수산화나트륨이 함유되어 있는 수용액에, 일반식 III의 2, 3 에폭시글로닉 구조를 지닌 반-합성 글리코스아미노글리칸을 교반하에 첨가함에 의해 반응이 수행된다.
반-합성 글리코스아미노글리칸의 농도가 1% - 5%인 반응 혼합물을 50℃ - 70℃에서 2 - 6시간 동안, 경우에 따라서는 불활성 기체의 분위기 동안, 경우에 따라서는 불활성 기체의 분위기 하에 교반시킨다. 반응이 끝나면, 염산 수용액을 사용하여 혼합물의 pH를 중화시키고, 과량의 친핵성 시약은 물과 혼화되지 않는 용매로 추출하거나 여과시켜 제거한 다음, 이 반응용액을 먼저 수돗물에서 그리고 증류수에서 6 - 24시간 동안 3,000 달톤을 차단시키는 투석을 실시한다. 마지막으로, 이 용액을 동결건조시키건, 적당한 용매를 첨가시킴에 의해 일반식 IV 의 반-합성 글리코스아미노글리칸을 얻는다.
상기 방법으로 얻어진 반-합성 글리코스아미노글리칸의 특징은 아민, 아미노산, 아미노 에스테르, 펩티드 알코올, 머캅탄, 페놀, 티오페놀과 같은 친핵성 시약의 부분인 혜테로원자, 질소, 황 또는 산소에 의해 3 - 위치가 치환된 것으로 발견되어진 α - L - 갈락투론산의 삭카라이드 단위를 함유하면서 α - L - 이두로닉 - 2,- 0 - 황산이 전부이든지 부분적이든지 결핍되어 있다는 점이다. 상기 방법에 있어서는, 상기 언급된 글리코스아미노글리칸의 구조적 특성은 수정함에 의해, 글리코스아미노글리칸 분자 및 친핵성 잔기의 분자 사이에 공유결합이 도입되어서, 이들이 경구용으로 흡수될 수 있게 하며, 출혈시 중요한 환원의 이점을 갖는 특징적인 항-혈전활성 및 항 응고활성을 유지해준다. 따라서, 헤파린 또는 헤파란 구조를 지닌 대응천연 글리코스아미노글리칸에 대하여, 본 발명에 기술된 반-합성 글리코스아미노글리칸은 동물의 생체내에서 수행된 약리학적 출혈 테스트에 의해 분명히 증명된 바와같이, 출혈의 위험을 별로 수반하지 않고서도 기본적으로 대등한 항-혈전활성 및 혈전 용해성의 이점과 경구용 흡수되는 이점을 갖는다.
본 발명의 목적인 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸의 생물학적 활성은 몇가지 대표적인 헤파린 테스트를 통해 정의되었다. 즉, 보다 특별한 테스트는 출혈시에 대한 APTT에 관한 것이며, 항 - 혈전활성에 대한 테스트도 수행되었다.
APTT 활성은 Larrieu M. J. 및 Weiland G. in Rev. Hematol., 12. 199,(1957)의 방법에 따라 정의되었다.
시험에 있어서 각 생성물을 단식한 쥐로부터 수집한 플라스마에 용해시킨다음 상기 방법에 요구되는 농도를 얻기 위해 스칼라 희석액을 만들었다.
각 생성물에 대해 10번 실시하였고 각 생성물의 활성은 APTT 시간의 제곱인 mcg/ml 내의 농도로서 표현하였다. 얻어진 값은 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸이 표준 헤파린에 비해 감소된 항-응고력을 보여준다는 점을 확증해준다.
출혈시간은 Dejaana E. et al in Thromb. Haemost., 48, 108, (1982)에 기술된 방법에 따라 쥐에서 측정되며, 그 결과는 대조용 쥐에 대해 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸으로 처리된 쥐에서의 출혈의 연장시간의 퍼센트를 계산한 것으로 나타내어졌다.
신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸은 표준 헤파린에 비해 출혈시간이 감소됨을 보여주었다. 항-혈전성은 Reyers S. et la in Thromb, Res., 18, 669 - 674 (1980)에 의해 기술된 혈행정지 정맥 혈전중 테스트(the stasis venous thrombosis test)에 의해 쥐에서 측정되었다. 혈전의 형성을 방지해주는 능력을 평가하기 위해, 인페리어 베나 카바. (inferior vena cava.)를 결찰 봉합하기 10분전에 대퇴골 정맥으로 생성물을 정맥주사 하였다. 2시간후, 트롬빈을 제거하고 건조시킨다음 중량을 측정하였다. 항 혈전 활성은 퍼센트 빈도(혈전이 존재하는 쥐의 퍼센트) 및 대조용 혈전에 대한 혈전 중량의 감소, 이 두가지로서 표현된다.
이 두가지 경우에 있어서, 그 결과는 mg/kg 으로서의 ED50으로 표현된다.
얻어진 결과는 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸의 항-혈전활성이 표준 헤파린과 비슷하다는 것을 증명해주었다.
자유 아미노기의 측정은 Satake K. et al in J. Biochem., 47, 654, (1960)에 기술된 방법에 따라 트리니트로벤젠술폰 산(TNBS)과의 반응을 통해 얻어진 생성물에 대해 350nm에서 자외선 가시 분광 광도계로 측정하여 수행하였으며, 반면에 황의 측정은 전위차계법(potentiometry)으로 측정하였다.
특정 회전력은 1% 농도로 수용액 내에서 측정되었다.
13C-NMR 스펙트럼은 배리안 제미니 200 분광계를 사용하여 50.3MHz 에서 수행하였으며, 이때 인터날 레퍼런스 스탠다드(internal reference standard)로서 2, 2위치 및 3, 3 위치에서 중수소화(D4)된 3 -(트리메틸실릴) 프로피온산의 나트륨 염을 사용하였다.
본 발명에서 기술된 신규한 글리코스아미노글리칸의 생물학적 활성을 평가하기 위해 대조용으로서 얻어진 표준 헤파린은 상기 기술된 테스트에 따른 약리학적 활성의 값을 다음과 같이 나타낸다 :
APTT(2T) = 2.5 mcg/ml
출혈시간 : 0.5 mg/kg 에서 111 %
항 - 혈전활성(ED50) :
중량손실 = 0.20 mg/kg
빈도 % = 0.40 mg/kg
대조용으로서 얻어진 표준 헤파린에 관하여 상기 언급된 방법으로 측정된 화학적, 물리적 데이타는 다음과 같다.
자유아미노 기 = 0.3%
S = 10.9%
13C - NMR (p.p.m.) : 177.5 ; 105.1 ; 102.1 ; 99.5 ; 80.1 : 78.7 ; 73.9 ; 72.0 ; 69.2 ; 62.6 ; 60.8 ; 56.7 ; 24.8
이하의 실시예는 본 발명을 예증하지만 한정적인 것은 아니다.
[실시예 1]
[-Z(R2)R1이 글리실에 해당되는 일반식 IV의 반-합성 글리코스아미노글리칸]
글리신 4500mg과 수산화나트륨 4000mg을 함유하는 수용액 20m1에 EP 347588의 실시예 3에 기술되어 있는 2,3 엑폭시글로닉 구조를 지닌 반-합성 글리코스아미노글리칸 400mg을 60℃에서 첨가하였다.
이 반응 혼합물을 2시간 동안 60℃에서 교반한 후 실온으로 냉각시키고 물은 염산 용액을 사용하여 pH를 중화시켰다. 그런다음, 이 용액을 수돗물에서 12시간 동안, 그리고 증류수에서 6시간 동안 3000 달톤을 차단시키는 투석을 실시하고 최종적으로 동결시켰다.
목적물인 생성물 420mg을 얻었으며, 다음과 같은 분석적 및 약리학적 특성을 나타내었다 ;
자유아미노 기 = 1.5%
13C - NMR (p.p.m.) : 178.1 ; 174.9 ; 105.1 ; 99.3 ; 80.1 ; 77.1 ; 72.2 ; 69.0 ; 68.1 : 62.0 : 60.3 : 59.1 ; 52.2.
APTT(2T) = 16.0 mcg/ml
항 - 혈전활성 (ED50) :
중량손실 = 0.40 mg/kg
빈도 % = 0.65 mg/kg
[실시예 2]
[-Z(R2)R1이 타우리닐에 해당되는 일반식 IV의 반-합성 글리코스아미노글리칸]
글리신 4500mg과 대신에 타우린 3750mg을 사용한 것 이외에는 실시예 1에 기술된 바와 동일한 조건하에서 이 반응을 실시하였다.
목적물인 생성물 430mg을 얻었으며, 다음과 같은 분석적 및 약리학적 특성을 나타내었다;
자유아미노 기 = 1.3%
13C - NMR (p.p.m.) : 177.4 : 105.2 ; 98.1 ; 80.1 ; 79.2 ; 75.7 ; 72.1 ; 71.4 ; 70.2 ; 68.4 ; 61.2 : 60.4 ; 57.3 ; 48.7 ; 47,1.
APTT(2T) = 14.0 mcg/ml
항 - 혈전활성(ED50) :
중량손실 = 0.61 mg/kg
빈도 % = 1.22 mg/kg
[실시예 3]
[-Z(R2)R1이 글리실글리신에 해당되는 일반식 IV의 반 합성 글리코스아미노글리칸]
글리신 4500mg과 때신에 글리실글리신 3960mg을 사용한 것 이외에는 실시예 1에 기술된 바와 동일한 조건하에서 이 반응을 실시하였다.
목적물인 생성물 390mg을 얻었으며, 다음과 같은 분석적 및 약리학적 특성을 나타내었다 ;
자유아미노 기 = 3.5%
13C - NMR (p.p.m.) : 178.4 ; 173.4 ; 105. 1 ; 98.9 ; 97.8 ; 80.0; 78.2 ; 76.4 : 69.8 ; 68.9 ; 67.2 ; 60.3 ; 58.7 ; 56.9 ; 52.0 ; 44.1.
APTT(2T) = 16.8 mcg/ml
[실시예 4]
[-Z(R2)R1이 1,4- 디아미노부탄-1- 일에 해당되는 일반식 IV의 반 -합성 글리코스아미노글리칸]
글리신 4500mg 대신에 1,4 - 다이미노부탄 2630mg을 사용하고 수산화나트륨 4000mg 대신에 1600mg을 사용한 것 이외에는 실시예 1에 기술된 바와 동일한 조건하에서 이 반응을 실시하였다.
목적물인 생성물 380mg을 얻었으며, 다음과 같은 분석적 및 약리학적 특성을 나타내었다 ;
자유아미노 기 = 10.4%
13C - NMR (p.p.m.) : 178.1 ; 99.2 ; 80.8 ; 75.9 ; 72.0 ; 69.1 ; 67.2 ; 61.4 ; 60.3 ; 56.7 ; 51.2 ; 42.0 ; 27.3 ; 26.2.
[실시예 5]
[-Z(R2)R1이 1-아미노-3-카복시프로판에 해당되는 일반식 IV의 반-합성 글리코스아미노글리칸]
글리신 4500mg 대신에 4 - 아미노부타노산 6200mg을 사용하고 수산화나트륨 4000mg 대신에 3200mg을 사용하며, 반응시간을 3시간으로 연장한 것 이외에는 실시예 1에 기술된 바와 동일한 조건하에서 이 반응을 실시하였다.
목적물인 생성물 410mg을 얻었으며, 다음과 같은 분석적 및 약리학적 특성을 나타내었다 ;
자유아미노 기 = 1.5%
13C - NMR (p.p.m.) : 177.8 ; 105.1 ; 99.2 ; 98.7 ; 80.9 ; 76.7 ; 72.1 , 71.0; 70.3 ; 69.2: 67.4 ; 60.9: 57.2 : 50.8; 34.0; 74.8 ; 24.2.
APTT(2T) = 19.2 mcg/ml
[실시예 6]
[-Z(R2)R1이 글리실에 해당되는 일반식 IV의 반-합성 글리코스아미노글리칸]
EP 0347588의 실시예 5에 기술된 2, 3 - 에폭시글로닉 구조를 지닌 반-합성 글리코스아미노글리칸을 사용하는 것만을 제외하고는 실시예 1에 기술된 바와 동일한 조건하에서 이 반응을 실시하였다.
목적물인 생성물 430mg을 얻었으며, 다음과 같은 분석적 및 약리학적 특성을 나타내었다 ;
자유아미노 기 = 1.2%
13C - NMR (p.p.m.) : 178.2 ; 174.8 ; 104.8 ; 99.1 , 80.1 ; 76.8; 72.2 ; 69.2 ; 68.2 ; 62.1 ; 60.2 ; 58.7 ; 52.4.
APTT(2T) = 22.2 mcg/ml
항 - 혈전활성 (ED50) :
중량손실 = 0.95 mg/kg
빈도 % = 1.1 mg/kg
[실시예 7]
[-Z(R2)R1이 아지도에 해당되는 일반식 IV의 반 합성 글리코스아미노글리칸]
글리신 4500mg 대신에 소디움 아자이드 5200mg 을 사용하고 수산화나트륨 4000mg 대신에 1600mg을 사용하며, 반응시간을 3시간으로 연장한 것 이외에는 실시예 1에 기술된 바와 동일한 조건하에서 이 반응을 실시하였다.
목적물인 생성물 420mg을 얻었으며, 다음과 같은 분석적 및 약리학적 특성을 나타내었다 ;
자유아미노 기 = 1.6%
13C - NMR (p.p.m.) : 178.1 ; 100.8 : 99.7 ; 80.1 ; 79.2 : 76.2 ; 72.4 ; 71.9 ; 69.9 ; 67.8 ; 64.6 ; 62.4 ; 59.9.
APTT(2T) = 13.4 mcg/ml
항 - 혈전활성 (ED50) :
중량손실 = 0.24 mg/kg
빈도 % = 0.69 mg/kg
[실시예 8]
[-Z(R2)R1이 (N)-히드록실아민에 해당되는 일반식 IV의 반-합성글리코스아미노글리칸]
글리신 4500mg 대신에 히드록실아민 염화수소화물 2800mg을 사용한 것 이외에는 실시예 1에 기술된 바와 동일한 조건하에서 이 반응을 실시하였다.
목적물인 생성물 400mg을 얻었으며, 다음과 같은 분석적 및 약리학적 특성을 나타내었다 ;
자유아미노 기 = 1.9%
13C - NMR (p.p.m.) : 178.4 ; 178.2 ; 104.8 ; 100.8 ; 99.4 ; 80.2 ; 99.1 ; 75.7 ; 72.1 ; 71.8 : 69.2 , 66.6 , 62.3 ; 59.2.
APTT(2T) = 20.5 mcg/ml
항 - 혈전활성(ED50) :
중량손실 = 0.85 mg/kg
빈도 % = 1.54 mg/kg
출혈시간 0.5 mg/kg 에서 46.2%
1 mg/kg 에서 79.1%
2 mg/kg 에서 151.8%
[실시예 9]
[-Z(R2)R1이 메틸아미노에 해당되는 일반식 IV의 반-합성 글리코스아미노글리칸]
EP 0347588의 실시예 3에 기술되어 있는 2, 3 - 에폭시글로닉 구조를 지닌 반-합성 글리코스아미노글리칸 500mg을 메틸아민 1750mg 을 함유하는 수용액 15ml 에 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반해주고 실온으로 냉각시켜준 다음, 묽은 염산 수용액을 사용하여 pH를 중화시켰다. 그런다음, 수돗물에서 16시간, 증류수에서 6시간 동안 3000 달톤을 차단시키는 투석을 실시하고, 최종적으로 동결 건조시켰다.
목적물인 생성물 460ml을 얻었으며, 다음과 같은 분석적 및 약리학적 특성을 나타내었다 ;
자유아미노 기 = 3.4%
13C - NMR (p.p.m.) : 178.3 ; 104.8 ; 99.3 ; 98.0 ; 80.62 ; 79.1; 74.9 ; 71.6 ; 69.0 ; 66.6 ; 61.5 ; 60.6 ; 36.6.
APTT(2T) = 48.8 mcg/ml
항 - 혈전활성 (ED50) :
중량손실 = 0.27 mg/kg
빈도 % = 0.95 mg/kg
출혈시간 0.5 mg/kg 에서 36.5%
1 mg/kg 에서 57.7%
2 mg/kg 에서 100%
[실시예 10]
[-Z(R2)R1이 글리실에 해당되는 일반식 IV의 반-합성 글리코스아미노글리칸]
소의 비장으로부터 얻어진 시중구입 가능한 헤파란(OPOCRIN)에 대해 EP 0347588의 실시예 3에 기술된 방법에 따라 실시하여, 일반식 III의 2,3 -에폭시글로닉 구조를 지닌 반-합성 글리코스아미노글리칸이 얻어졌다. 이는 다음과 같은 분석적 특성을 나타낸다 :
자유아미노 기 = 2.5%
13C - NMR (p.p.m.) : 178.0 ; 177.4 ; 105.1 ; 99,.6 ; 98.1 ; 97.1 ; 81.0 ; 78.8 ; 76.2 ; 73.3 ; 71.8 ; 70.9 ; 62.1 ; 60.3 ; 56.6 ; 55.9 ; 54.1 : 53.1 ; 24.5.
일반식 III 의 2,3 - 에폭시글로닉 구조를 지닌 반-합성 글리코스아미노글리칸 400mg을 실시예 1에 기술된 바와 동일한 조건하에서 반응시켰다.
목적물인 생성물 390mg을 얻었으며 다음과 같은 분석적 특성을 나타내었다.
자유아미노 기 = 2.5%
13C - NMR (p.p.m.) : 178.0 ; 176.8 , 105.0 ; 99.6 ; 99.4 ; 81.0; 80.1 ; 79.1 ; 77,1 ; 76.3; 73.5; 71.8; 68.0; 62.1 ; 60.4; 59.1 ; 56.0 ; 52.1 ; 24.4.

Claims (10)

  1. 다음의 IV 의 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸.
    (위식에서, p +q = m이며, p 는 0 이외의 수이고, m 및 n은 1 - 100사이의 값인 모든 수이며, R은 수소 또는 설페이트(SP3 -) 잔기이고, -Z(R2)R1은 친핵성 래디칼을 나타낸다).
  2. 제1항에 있어서, 2는 산소, 황 또는 질소를 나타내고, R1은 직쇄 또는 측쇄(C1-12) 알킬 래디칼, 아민 래디칼, 방향족 래디칼, 디아조 래디칼 또는 히드록실 래디칼을 나타내며 치환되거나 또는 치환되지 않았으며, R2는 생략 또는 수소, 또는 직쇄 또는 측쇄(C1-6) 알킬 래디칼, 또는 R1과 함께 헤테로 시클릭 고리를 형성하는 것을 특징으로 하는 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸.
  3. 제2항에 있어서, R1의 치환체는 할로겐화물, 아민 래디칼, 방향족 래디칼, 카복실 래디칼, 구아니딘 래디칼, 니트르 래디칼, 히드록실 래디칼, 술폰 래디칼, 설퍼 래디칼, 티올 래디칼, 또는 우레이드 래디칼로부터 선택되며, 치환되거나 치환되지 않을 수 있는 것을 특징으로하는 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸.
  4. 제1 또는 2항중 어느 한 항에 있어서, -Z(R2)R1래디칼은 1차 또는 2차 아민, 2차 헤테로시클릭아민, 아미노알코올, 아미노티올, 아미노산, 아미노에스테르, 펩티드, 알코올, 페놀, 머캅탄, 디티올, 티오페놀, 히드록실아민, 히드라진, 히드라자이드 및 소디움아자이드로부터 유도되는 것을 특징으로하는 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸.
  5. 제4항에 있어서, -Z(R2)R1래디칼은 글리신, 글리실글리신, L-시스테인, 아세틸-L-시스테인, L-시스테인 에틸 에스테르, 2-아미노티오페놀, 1,3-프로판디티올, 시스테아민, 소디움 아자이드, 2-아미노에틸 비설페이트, 타우린, 티오글리콜 산, β-알라닌 에틸 에스테르, L-시스틴, 히드록실아민, 글리실타우린, 시스테닐타우린, 글리실시스테인, 글리실페닐알라닌, 글리실티로신, 2-아미노에탄올, 2-아미노에탄올을 갖는 글리신 아미드, 아르기닐리신, 아르기닌, 리신, 아세트산을 갖는 2-아미노에탄올 에스테르, 살리실 산, 메티오닌, 글리실프롤린, r-아미노부티르 산, 리실프롤리릴아르기닌, 트레오닐리실프롤린, 트레오닐리신, 프롤릴아르기닌, 리실프롤린, 콜린, 4-(3-아미노프로필) -2-히드록시벤조산 및 4-(2-아미노에틸)-f-히드록시벤조 산 으로부터 유도되는 것을 특징으로하는 신규한 반-합성 글리코스아미노글리칸.
  6. 다음 일반식 IV,
    (위식에서, p, q, n, R, R1, R2및 Z는 상기 정의된 바와같음).
    의 반-합성 글리코스아미노글리칸을 합성하는 방법으로서, 이 방법은 공고된 유럽 특허제EP 0347588호 명세서에 기술된 제조방법에 따라 얻어진 일반식 III,
    (위식에서, p, q, n 및 R은 상기 정의된 바와같음).
    의 2,3 에폭시글로닉 구조를 갖는 반-합성 글리코스아미노글리칸과 래디칼이 일반식 II
    35℃ - 95℃의 온도에서 30분 - 24시간 동안 교반하에, 경우에 따라서는 불활성 기체의 분위기하에서, 친핵성 시약내에 존재하는 임의의 산(acid)기를 염화시키거나 또는 산성의 물질을 가질 수도 있는 임의의 염으로부터 동일한 친핵성 시약을 방출시키거나 또는 산성의 물질을 가질 수도 있는 임의의 염으로부터 동일한 친핵성 시약을 방출시키기에 충분한, 그리고 사용된 염기에 대하여 반응혼합물이 0.01 - 5 N 이 되도록 과량의 알칼리성을 방출하기에 충분한 무기 또는 유기 염기 및 용매의 존재하에, 수용액중에서 반응시키는 공정과, 반응용액이 물 이외의 것인 경우에는 상기 반응 혼합물을 물로 희석하고 묽은 염산수용액을 첨가하여 수용액의 pH를 중성으로 만든다음, 경우에 따라서는 과량의 친핵성 시약을 제거하기 위해 물과 혼화되지 않는 용매로 추출하거나 또는 여과하며, 경우에 따라서는 이 수용액을 수돗물 및 증류수에서 투석시킨다음 이 수용액을 동결 건조시키거나 적당한 용매를 가하여 침전시킴에 의해서 생성물을 분리시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 반-합성 글리코스아미노글리칸의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 친핵성 시약의 량은 에폭시 기를 포함하는 일반식 III 의 반-합성 글리코스아미노글리칸의 다이머(dimer) 단위에 대하여 1 - 200 몰 당량인 것을 특징으로하는 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 용매는 물, 및 디메틸 아세트아미드, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 디옥산, 테트라히드로푸란, 또는 물과 이들의 혼합물로부터 선택된 극성 용매로부터 선택될 수 있는 것을 특징으로하는 제조방법.
  9. 제6항에 있어서, 사용된 염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 트리에틸아민으로부터 선택되는 것을 특징으로하는 제조방법.
  10. 제6항에 있어서, 일반식 III의 2,3 에폭시글로닉 구조를 갖는 반-합성 글리코스아미노글리칸을, 경우에 따라서는 불활성 기체의 분위기 하에서, 에폭시기를 포함하는 일반식 III의 글리코스아미노글리칸의 다이머 단위에 대하여 친핵성 시약 10 - 100 몰당량 및 이 친핵성 시약 내에 존재하는 임의의 산 기를 염화시키거나 산성의 물질과 함께 가능한 염으로부터 친핵성 시약을 방출시키기에 충분한 그리고 사용된 염기에 대하여 반응 혼합물이 0.01 - 5N이 되도록 과량의 알칼리성을 방출시키기에 충분한 량의 수산화나트륨이 함유된 수용액에 교반하면서 첨가한다음, 이 반응 혼합물을 50 - 70℃에서 2 - 6시간 동안 정지시켜준 후 이 반응 혼합물의 pH를 염산 수용액을 사용하여 중화시켜주고, 경우에 따라서는 물에 혼화되지 않는 용매로 추출하거나 여과시켜서 과량의 친핵성 시약을 제거시켜주고, 경우에 따라서는 6 - 24시간 동안 수돗물 및 증류수를 사용하여 이 반응 용액을 투석시켜준 다음, 이 용액을 동결건조 시키거나 또는 적당한 용매를 첨가함에 의하여 생성물을 분리해내는 것을 특징으로하는 제조방법.
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