JP2679945B2 - 血液試料の間接蛍光アッセイ - Google Patents

血液試料の間接蛍光アッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、結合性生物学的粒子
の１種以上の活性対の何れかの相手成分の存在または不
在について、また所望の場合、それらの全血、血漿また
は血清試料中の定量についての１工程同時測定に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】抗体または抗原の存在または不在につい
ての血液試料の分析は、ＨＩＶ感染、肝炎、ライム疾患
等の疾患、ＴＯＲＣＨ（「Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉ
ｓ、Ｒｕｂｅｌｌａ、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕ
ｓ、Ｈｅｒｐｅｓ」の頭文字）概要データを含む出生前
概要データ、ならびに他の感染性疾患概要データの診断
において使用されている。現在、このような血液学的診
断は、標準的間接蛍光免疫アッセイによりしばしば行わ
れている。標準的間接蛍光免疫アッセイにおいて、検出
されるべき結合相手である抗原が、最初にスライドグラ
ス、濾紙等の固体支持媒体に固定化される。次いで患者
からの血清試料が、該固定化抗原との接触下に、存在す
る場合に相手の抗体が該固定化抗原に結合するために充
分な時間をもってインキュベートされる。次いで該支持
体表面を洗浄して、全ての未結合抗体を除去する。次
に、ヒト免疫（抗体）グロブリンに対する標識抗体を含
有する試薬を支持体表面に接触させ、標識物質と固定化
抗原に結合したであろう痕跡量の患者抗体とを連結させ
るために充分な時間インキュベートする。次いで過剰量
の試薬を洗浄除去し、支持体表面を何れかの標識が存在
するか否か試験する。調製された試料の試験は、可視的
に、または分光測定的もしくは蛍光測定的に行われる。
前述の方法は、洗浄および分析技術を含む複数の試料操
作工程を必要とし、従って労力集約的であり、かつ時間
がかかるものであることが理解されるであろう。前述の
方法は、１試験あたり１種のみの抗原特異的抗体の存在
または不在を検出することができるが、更に試験するこ
となく特定のＩｇＧまたはＩｇＭを区別することができ
ず、また複数の抗原および／または抗体を同時に検出す
ることもできない。
【０００３】発明の開示 １９９１年１０月４日出願の同時係属中のＵＳＳＮ０７
／７７０，８７５は、異なるバンドの比重を有するマイ
クロビーズ（以下、密度マーカーと称す）の密度測定的
分配バンドを形成することによる、差分的血球計数を行
うための方法および用具を開示している。この発明は、
全血、血清または血漿試料中の、１種以上の結合性生物
学的粒子の活性対の何れかの相手成分の存在または不在
を、迅速かつ容易に行うための方法および用具に関する
ものである。そのような検出可能な対の例は：ＴＳＨ／
抗ＴＨＳ複合体；Ｔ４／抗Ｔ４複合体；Ｒｕｂｅｌｌａ
抗体／抗Ｒｕｂｅｌｌａ抗体；ＨＩＶ抗体／ＨＩＶ抗原
であり、これらの全ては、ＴＳＨ、Ｔ４、Ｒｕｂｅｌｌ
ａ抗体およびＨＩＶ抗体が標的分析対象物である場合で
ある。該方法は、試験管内に数種の試薬を含む血液試料
を遠心分離し、外苑新聞利口邸の結果を観測するのみで
遠心チューブ内にて行われる。測定は、医師または技術
者を血液試料に曝すことなく行われうる。
【０００４】全血試料を入れた試験管を遠心分離する
と、赤血球は試験管底部に連続的密度勾配層を形成し、
最も密度の高い赤血球が底面に赤血球層を形成する。血
液試料を、前述した異なる比重のビーズの群、または異
なる比重のリポソームを含む試験管内で遠心分離する
と、ビーズまたはリポソームは凝縮する赤血球層中に間
隔を置いて明らかに視認可能なマーカーリングを形成す
る。遠心用試験管は、試験管底部に固定されるか、また
は自由に動きうる円柱状のプラスチック挿入物を含んで
もよく、また該挿入物は、可動的な場合には遠心分離さ
れた血液試料中に赤血球層を通して沈降するような比重
を有する。該挿入物は、赤血球が占めうる試験管内の利
用可能な空間を制限し、従って、遠心分離された赤血球
層中に形成されるマーカーリング間の距離を増大させ、
またビーズまたはリポソームを、それらのシグナルが赤
血球により消去されることが無く、見ることができ容易
に検出可能な試験管周辺部に移動させる。
【０００５】本発明の方法の実施において、ビーズまた
はリポソームは、抗原もしくは抗体、または補体もしく
は結合相手（「標的分析対象物」と称されてもよい）が
患者の血液中に存在するであろう他の生物学的活性物質
と結合されるであろう。生物学的に活性な対の例は、酵
素およびそれらの基質；ヌクレオチドおよびそれらの相
補的ヌクレオチド；チロイド結合グロブリン（ＴＧＢ）
およびチロキシン等の天然に存在する蛋白質結合体；
「固有因子」およびビタミンＢ１２；ならびにＲＮＡ−
ＤＮＡハイブリッドに選択的に結合する特異的抗体等で
あって、ＳｔｏｌｌａｒおよびＲａｓｈｔｃｈｉａｎに
より文献「ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｐｐｒｏａ
ｃｈｅｓ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｖｅ Ａｓｓａｙ
ｓ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １９８７；１６１、３８７−３９４に記述されてい
る。
【０００６】１種のみであってもよい各密度マーカー群
は、血液または他の生物学的試料中に存在するであろう
標的分析対象物に特異的な結合粒子に固定化されるであ
ろう。該試料は、密度マーカー／結合粒子群を許容すべ
く試験管に添加され、試料中に存在するいずれの標的分
析対象物もが密度マーカー上のそれらの相補的相手と対
生成するために十分に混合される。
【０００７】本発明の方法を使用して結合対が生成され
る場合には、結合工程完了後に密度マーカー上の全てに
特異的な（かつ試料への添加前に試験管内にあってもよ
い）標識または目印を付けた「抗−抗原−抗体複合体」
抗体（ＡＡＡＣ抗体）が密度マーカー上に結合する。こ
のＡＡＡＣ抗体は、試験管内に乾燥被覆されていてもよ
く、または例えばＲｏｂｅｒｔ Ａ．およびＳｔｅｐｈ
ｅｎ Ｃ．Ｗａｒｄｌａｗに１９９２年２月１１日に認
められた米国特許第５，０８６，７８４号に記載されて
いるように脱気された試験管内に液体形態で存在しても
よい。
【０００８】この型の抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｊｏｓ
ｅ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＩｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅ
ｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｉｖｉｓｉｏｎによって作成
されている。全ての抗原／抗体対に特異的である代わり
に標識ＡＡＡＣ抗体は免疫グロブリン亜群（ＩｇＧまた
はＩｇＭ抗体／抗原複合体）に対して特異的であっても
よい。同様に、所望の場合分析対象物はＲＮＡまたはＤ
ＮＡであり、そして試験管は、ＳｔｏｌｌａｒおよびＲ
ａｓｈｔｃｈｉａｎにより記述されているようにＲＮＡ
−ＤＮＡ対に投句医的であるかまたは結合する標識抗体
を含んでもよい。
【０００９】標識は、リポソームにカプセル化された色
素、または蛍光色素であってよく、あるいは放射能エネ
ルギー放射物であってもよい。標識は検出可能でなけれ
ばならず、好ましくは定量可能なものである。標識抗体
は、その上に形成された対を有する全ての密度マーカー
に結合する。試料は遠心分離されて、密度マーカーが試
験管内で分離されたバンドまたはリングに密度測定的に
分離される。次いで、異なる密度マーカーが、存在する
場合にどのバンドが検出可能な量の標識を有するか測定
するために試験管内にて試験され、また、適切な場合に
は標識の量が測定される。主に使用される標識は、ＦＩ
ＴＣ等の蛍光分子であろう。
【００１０】所望により、異なる密度のビーズは、異な
る固有の色を持つことができ、これによって、（２つ以
上のバンドがある場合）異なる色のバンドは異なる標的
分析対象物を示す。異なる色の密度マーカーが使用され
る場合、試験管内の標識バンドの色がどの結合分析対象
物が試料中に存在するかを示し、また試験管内に入れた
密度マーカーのバンドが標識を伴わないことを示す場合
に、どの分析対象物が存在しないかを示すであろう。着
色密度マーカーを使用しない場合には、試験管内の標識
バンドの位置が、どの分析対象物が試料中に存在し、あ
るいは存在しないかを示すであろう。当然ではあるがこ
の情報は、試料提供者の健康についての診断を許容す
る。
【００１１】従って、本発明の目的は、試料中の特定の
分析対象物の存在または不在を測定するための改良され
た分析方法を提供することである。
【００１２】更なる目的は、分析が透明な試料用試験管
内にて密度測定的に行われるものとして記述される特徴
を有する改良技術を提供することである。
【００１３】本発明の更に他の目的は、分析が抗体およ
び／または抗原に結合される異なる比重のビーズを使用
することにより行われ、而して複数のアッセイが一つの
試験管内にて一度に行われうるものとして記述される特
徴を有する改良技術を提供することである。
【００１４】本発明の別の目的は、分析が試料中に目立
たされた抗体／抗原対を形成することによって行われる
ものとして記述される特徴を有する改良技術を提供する
ことである。
【００１５】これらの、および他の目的ならびに優位点
は、以下の本発明の好ましい実施態様の詳細な記述を、
添付した図面と組み合わせることにより更に明らかにな
るであろう。
【００１６】図面の記述 図１は、本発明の方法の実施に適用される遠心用試験管
の側面図である。図２は、遠心された全血試料が入った
図１の試験管の図であり、本発明の性質を特に示すため
に赤血球細胞層を誇張または拡大してある。図３は、本
発明の実施に適用される遠心用試験管の第２の実施態様
の縦断面図である。
【００１７】最良の態様の詳細な記述 図１および図２を参照すると、まず図１には試験管２が
示され、これはガラスのキャピラリーチューブまたは他
の透明試験管であってよく、これにはプラスチック製の
浮きまたは挿入物４が入れられてもよい。この挿入物４
は、試験管２を血液試料を入れて遠心分離した場合に、
赤血球細胞を通して試験管２の底部６に達するような比
重を有している。異なる比重を有する抗体および／また
は抗原−結合プラスチックビーズの同類群は、試験管２
内のクランプ５に配置されてよい。プラスチックキャッ
プ１０は、試験管２の底部６を封止している。ビーズの
各群の比重は、最も軽い赤血球、即ち最も若い赤血球の
比重よりも大きいであろう。
【００１８】血液試料は試験管２内に注入され、適当な
インキュベート期間の後、挿入物４およびビーズ５と共
にその中で遠心分離される。ビーズクランプ５は、イン
キュベート期間において血液試料中に分散し、遠心分離
工程の間に図２に示されるように赤血球層内に線状に形
成される明確なバンドを与え、一方浮き４は赤血球Ｒを
通して安定化する。試験管２は、前述したように標識Ａ
ＡＡＣ抗体も含むであろう。
【００１９】白血球細胞Ｗは、赤血球／白血球界面Ｉの
上方のバンドに層を形成する。密度マーカービーズのバ
ンドＢは、赤血球細胞層内に密度測定的に層を形成す
る。バンドＢの試験は、蛍光体標識が標識されたバンド
においてのみ検出可能であることから、どのバンドＢが
標識されているかを示すであろう。
【００２０】図３は、本発明の実施に使用され得る遠心
用試験管の別の形態を示す。試験管１２は、拡大された
開口端部１４を有する複合的漏斗状孔部および制限され
た封鎖端部１６を有する。孔部は、遠心分離された血液
試料中の赤血球細胞Ｒが孔部の制限部１６内に位置し、
白血球および血漿のほとんどの部分が拡大部１４に留ま
るような大きさをもっている。標識密度マーカーバンド
Ｂは、遠心分離された赤血球層に分散している。該試験
管１２は、透明のガラスまたはプラスチック材料から形
成されている。図３に示される実施態様は、浮き孔性物
を使用しないことが分かるであろう。
【００２１】図２および図３から、密度マーカーバンド
は、それぞれが他のバンドＢの妨害無しに蛍光について
アッセイされ得る程度に、また以下に示すように定量さ
え可能な程度に十分に間隔を置いて離れている。血液試
料をアッセイする場合に、赤血球細胞の性質、即ち遠心
分離されると血漿を排除して凝集するという事実は、試
験管内の実質的に全ての未結合標識ＡＡＡＣ抗体が最終
的に血漿層中にあり、そしてこの方法を妨害しないるこ
とを確実なものとする。
【００２２】試料中の標的分析対象物を定量するための
本発明の使用の一般例は、以下の通りである。医師は、
アッセイされる生物学的液体の既知体積試料中に見い出
されることが期待される標的分析対象物の分子数または
単位数のおよその範囲を、文献から特定するであろう。
例えば、ライム疾患に感染するかまたは曝露された患者
においては、血液１ミリリットルあたり多くとも５０ラ
イム分析対象物単位が予想されるとしよう。医師は、試
料とされる血液試料１ミリリットルあたり、少なくとも
１００単位の密度マーカー／抗原／抗体対、および少な
くともミリリットルあたりに１００の標識ＡＡＡＣ抗体
を容器中に加えるであろう。試料中には、それに見い出
されることが期待される分析対象物単位の最大数に比べ
過剰量の結合部位および標識粒子が存在するため、ライ
ムビーズバンド由来の放射の程度または強度は、試料中
に実際に存在するライム分析対象物の数に比例するであ
ろう。かくして、血液中のライム分析対象物が、放射強
度の測定によっておよそ定量される。該定量方法の重要
点は、試料中に見い出されることが期待される分析対象
物単位の最大数に比べて、試料中に機能的の過剰量の結
合部位および標識抗体を与えることにある。存在する分
析対象物の量と、密度マーカー−ＡＡＡＣ抗体対に最終
的に結合する分析対象物の量との間に数学的関係が存在
する場合には、分析対象物より少ないモル量の結合−Ａ
ＡＡＣ抗体が存在する場合でも分析対象物の定量が可能
であろう。
【００２３】実験室において血清または血漿試料の使用
が望まれる場合、あるいは多くの密度のものが分離され
なければならない場合のように更に予測可能な密度勾配
が要求される場合には、図３に示す試験管の小径部分
に、所望の密度勾配を有するゲル化フィコール等の安定
な物質をあらかじめ充填しておくことができる。この密
度勾配物質は、固有のバンドを分離することに加え、遠
心分離工程の間に未結合ＡＡＡＣ抗体を結合層から洗浄
除去する作用をする。
【００２４】本発明を血液診断と関連させて記述した
が、本発明が、他の生物学的液体中に見い出される高度
に特異的な相補対の存在または不在についての他の生物
学的液体の診断にも適用可能であることは認識されるで
あろう。血漿を分析する場合のように、全血以外の生物
学的液体をアッセイする場合には、遠心分離工程は上述
したようにフィコールゲル等の生物学的液体の水性相と
混合せず、バンドの密度分析的分離を可能とする密度勾
配液体中で行われ、密度マーカーの該勾配液体による同
時的洗浄にて、全ての未結合標識のバンドからの分離を
確実なものとする。このことは、標識バンドの定量につ
いて未結合標識の妨害を除去する。全血が試験される場
合、および非細胞液体がゲル化フィコール中で試験され
る場合に、遠心分離工程の間に起こる標識細胞からの未
結合標識の固有の洗浄は、先行技術において必要とされ
た別途の洗浄工程を除去し、また未結合標識が該方法の
精度を阻害することを防ぐ。この特徴的な洗浄は、本発
明の操作性に対して重要な寄与をするものである。
【００２５】本発明の開示された実施態様の多くの変更
および改変が、本発明の概念を離れることなく行われ得
ることから、添付される特許請求の範囲により要求され
ること以外に本発明を限定することを意図するものでは
ない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の方法の実施に適用される遠
心用試験管の側面図である。
【図２】 図２は、遠心された全血試料が入った図１の
試験管の図であり、本発明の性質を特に示すために赤血
球細胞層を誇張または拡大してある。
【図３】 図３は、本発明の実施に適用される遠心用試
験管の第２の実施態様の縦断面図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 591007332 ベクトン・ディッキンソン・アンド・カ ンパニー ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ Ａ ＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ アメリカ合衆国ニュージャージー州 07417−1880，フランクリン・レイクス, ワン・ベクトン・ドライブ （番地な し) (72)発明者 ロバート エイ． レビン アメリカ合衆国 コネチカット州，ギル フォード，ピルグリム レーン 31 (72)発明者 スチーブン シー． ワードロウ アメリカ合衆国 コネチカット州，オー ルド セイブルック，ノース コウブ ロード 191 (72)発明者 レオン ダブリュ． エム． エム． タースタッペン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 パ ロ アルト，コロラド プレース 1048 (72)発明者 ディーサー ジェイ． レックテンウォ ルド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ク パーチノ，アルカザー アベニュー 21910 (72)発明者 トーマス メルコリノ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 ストックトン，ランバートビル ヘッド クォーターズ ロード 121 (56)参考文献 特開 昭60−35267（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−265571（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−311761（ＪＰ，Ａ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 透明試験管内の生物学的液体試料中の１
    種以上の異なる標的抗原または抗体の検出方法であっ
    て、工程、 ａ）密度マーカーの少なくとも一つの群を入れた透明試
    験管を準備し、ここで該試料中に予想される各々の標的
    抗原または抗体に対して密度マーカーの一つの群が存在
    し、一つ以上の群が存在する場合には密度マーカーの各
    群は、他の密度マーカーの群とは互いに異なる比重を有
    し、各群中の各密度マーカーは、密度マーカー対を形成
    すべく標的抗原または抗体の一つに対して特異的な抗体
    または抗原と結合され、これにより各密度マーカー対群
    は、予想される標的抗原または抗体の一つに対して特異
    的であり、かつ前記試験管は、標識抗−抗原−抗体複合
    体（ＡＡＡＣ）対−特異的抗体を含み； ｂ）液体試料を該透明試験管に添加し； ｃ）該密度マーカー対を、該標識抗−抗原−抗体複合体
    （ＡＡＡＣ）対−特異的抗体および試料と共にインキュ
    ベートし； ｄ）該密度マーカー対を密度測定的に一つ以上の別々の
    バンドに凝集させ；並びに ｅ）何れかのバンドが標識抗−抗原−抗体複合体（ＡＡ
    ＡＣ）対−特異的抗体の存在を示す場合に、１種以上の
    標的分析対象物の存在を測定すること、を含んでなる透
    明試験管内の生物学的液体試料中の１種以上の異なる標
    的抗原または抗体の検出方法。
  2. 【請求項２】 非結合標識抗−抗原−抗体複合体（ＡＡ
    ＡＣ）対−特異的抗体を、密度測定的分離工程の間に密
    度マーカー対から除去する工程を更に含む、請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 液体試料が全血であり、密度マーカーが
    試料中の最も軽量の何れかの赤血球細胞の比重より大き
    い比重を有する請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記除去工程が、該全血試料中の赤血球
    により行われる請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 該液体試料が水性を基本とする生物学的
    試料である請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 非結合標識抗−抗原−抗体複合体（ＡＡ
    ＡＣ）対−特異的抗体を密度測定的分離工程の間に密度
    マーカー対から除去する工程を更に含む、請求項５に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 前記除去工程が、試験管内に、密度マー
    カー対が沈下する試料−非混和性密度勾配物質を備える
    ことにより行われる請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 密度マーカー対が、試験管の残部の断面
    積よりも小さい断面積を有する内部試料−占有部分を持
    った試験管の一部分内に密度測定的に分離される請求項
    １に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記試験管の一部分が、試験管の孔部内
    に軸方向挿入物を設置することにより形成される請求項
    ８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記試験管の一部分が、該試験管孔部
    の局所的締め付けにより形成される請求項９に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 生物学的液体試料の免疫グロブリン
    サブグループの存在もしくは不存在についての遠心分離
    的分析に使用される用具であって、 ａ）液体試料を受容するための孔部を有する透明試験
    管； ｂ）前記試験管孔部にて局所的締め付けをする手段； ｃ）前記試験管内の免疫グロブリン−特異的抗体および
    ／または抗原−結合密度マーカーの一定量； ｄ）前記試験管内の、操作可能な量の標識抗−抗原−抗
    体複合体（ＡＡＡＣ）抗体であって、前記ＡＡＡＣ抗体
    が前記密度マーカー上に形成される免疫グロブリン抗体
    −抗原複合体に特異的であり、かつ前記複合体を検出可
    能に目立たせるように操作することができ；並びに ｅ）前記試験管内に、遠心分離の間に該密度マーカーが
    沈降する密度勾配層を形成する手段、を有してなる分析
    用具。
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