JPS6035267A - 多項目免疫検査法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は比重差のあるマイクロカプセル試薬群を使用し
て簡便にかつ一回の操作で同時に多項目の免疫検査を行
なう方法に関する。

抗原性物質を免疫学的に検査する方法として従来から赤
血球凝集反応が行われている◇またポリスチレンラテッ
クスを担体とするラテックス凝集反応もすでに実用化さ
れている。しかしながらこれら従来法においては非特異
凝集が起りやすい。

感度が不充分である。長期保存性が悪い１判定までに長
時間を要する等の欠点がある。その上実際の操作におい
ては幾種類もの器具を使用する必要があるし又倍数希釈
列も作成しなければならない等操作上の煩雑さも避けら
れない。そこで特殊な器具を用いることなく少量の試薬
で免疫検査を行なう方法が性腺刺激ホルモンについて提
案された。

この方法によれば、被検液と感作担体とを混合しこれを
毛細管に加えた後ある傾斜角の判定台で凝集の有無を観
察するので倍数希釈列を作成する必要がなく、操作も比
較的簡単である。しかし担体として従来の赤血球やラテ
ックスが使用されているため、前記の欠点は改善されて
いない。また多項目の検査が必要な場合には同様に取扱
う器具の個数は増えるし項目に相当する回数分の操作を
反覆しなければならないので、結局被検液の必要量も増
えることになる。

このような赤血球やラテックスなどの代りに。

マイクロカプセルを担体として使用する方法が提案され
た（特開昭５５−９４６３６　、同５７−１９６６１、
同５７−１９６６２等）。

この方法においては、動物由来の担体（赤血球）に固有
の前記欠点やラテックス等の合成担体が有する不都合は
解消されており、このマイクロカプセル担体法を適用す
れば、感度上昇、簡便な操作。

オン・オフの確実な判別など、従来法に比べてより改善
された効果が得られると共に、従来法では実用上不可能
であった新しい検査も開拓されつつある。特にマイクロ
カプセルにおいては比重のコントロールが容易であシ、
この点が赤血球やラテックスを担体とする方法を凌駕す
る特性の一つでもあるが１本発明者等はこの特性を積極
的に活用することによって非常に簡便な多項目免疫検査
法を見出した。

すなわち本発明の多項目免疫検査法は比重差のあるマイ
クロカプセル群の各群に異種の抗原又は抗体を別々に感
作した後混合して得られる試薬を被検液と混合し、これ
を多段比重液層を有する毛細管に加えた後、前記毛細管
を傾斜して静置することを特徴とする。

本発明の系は比重液の比重ｄ　とマイクロカプセルの比
重ｄｍとの間に以下に示す関係式が成立するようにそれ
ぞれの比重を設定すれば容易に設計することができる。

０．０２≦Δｄ　≦０．２５　（１） ０．０２＜ｄ”−ｄ　≦０．１５　（２）１、０　＜　
ｄ”　＜　１．３５　（３）０、０２　≦Ａｄｍ　≦０
．２５　（４１ｄｌ−ｄ”　≧Ｏ，ＯＯ５（５１ ｎ−Ｈｎ 上記式において ｄ　、比重液層の比重 ΔｄＬ：相接する二元重液層間の比重差ｄｍ：マイクロ
カプセルの比重 Δｄｒｒｌ：比重順に並比重色きに隣接する二マイクロ
カグセル間の比重差 ｄＷ−ｄ呑：マイクロカプセルとこのマイクロカプセル
が止まる比重液層との比重差 標ヤ１”；’；”マイクロカプセル試薬とこの試薬が止
まる比重液層よシ大きい比重をも っている前記比重液層に隣接する比 重液との比重差 ｎ、比重液層の数、最上層を１とする０前記（１）　−
（５）式に関連して本発明の系をより詳細に説明するた
め、以下図面を参照する。なおマイクロカプセルの比重
は免疫活性成分を感作する前も感作後も実質的な変化が
ないので感作マイクロカプセルも単にマイクロカプセル
として言及することがある。

第１図は、比重ｄ↑　ａｔ、及びｄｉ　２もつ三段比重
液層を有する毛細管に本発明のマイクロカプセル試薬と
被検液との混合物を内壁に沿って加えた状態を示す図面
である。ａＴ　、　ｄ：及び好けそれぞれ（１）式を満
足するのが望ましい。特に好ましい比重差Δｄｌは００
３以上００１５以下の範囲である。この範囲は、液−液
界面を乱さない、マイクロカプセル試薬と被検液との混
合物が内壁に沿って毛細管底部へ移動する際の比重差に
よる分離性等の条件を満すものとして設定される。第１
図の段階ではまだ抗原抗体反応は起っていない。

マイクロカプセル試薬はそれぞれｄＴ　、　ｄｒＥ及び
ｄＴの比重をもつ群からなシ、各群に異種の３例えば抗
体を感作しである。ｄＴ＋　ｄＴ及びｄＴは（４）式を
満足する比重差をもっており、さらに比重液の比重ｄＴ
　、　ｄ：及びｄｉとの関係において（２）式及び（５
）式を満足するように設計するのが望ましい。なおマイ
クロカプセル自体はｄｍとして（３）式の範囲、特に好
ましくは１０３〜１．３の範囲の比重をもっているのが
望ましい。特に好ましい範囲として。

（２）式テｉｄ　０．０３≦ｄ”−ｄＬ≦０．０８（ｎ
＝１．２又は３） （４）式テｌｄ、０．０３　≦ｌｄｍ≦０．１が一応の
目安である。

本発明の好ましい態様において前記の如く設計したマイ
クロカプセル試薬を被検液と共に毛細管内壁に沿って加
えた後毛細管全傾斜して静置する。

傾胴角度は通常水平面から約３０°乃公約６０°となる
ように設定するのが望ましい。毛細管を傾斜することに
よって沈降距離が短縮され判定所要時間が短縮されるが
、傾斜角度があまシ急であると沈降速度が大きすぎて各
比重液層に対する分離性がよくない。一方ゆるやかすぎ
ると沈降する筈のものが管壁の中途にひっかかるので凝
集（オン）か沈降（オフ）かの判定が困難となる。実用
上は４０°から５０°程度の傾斜角がよい。

第２図は抗原抗体反応後の毛細管内部をさらに横方向に
拡大して示した概念図である。結果は毛細管の上部或い
は下部から観察する。

被検液中に例えば第一の抗原が存在する場合。

この第一抗原と抗原抗体反応を起す抗体感作マイクロカ
プセルの比重ｄ１Ｐと（２）式に示す関係を有する比重
ｄ１の比重液層に凝集像１１を形成する。（４）式の如
き比重差をもってｄＴよシさらに重いｄＴのマイクロカ
プセルは、被検液中に例えば第二の抗原が存在しないと
抗原抗体反応を生じることなくａｉの比重液層底部に沈
降しそこに２１として止まる。同様にして、被検液中に
例えば第三の抗原が存在すると凝集像３１が形成される
。こうして比重の軽い層から重い層へ向かって、第一の
抗原は（＋）（陽性）、第二の抗原は（＝）（陰性）そ
して第三の抗原は（＋）（陽性）として唯一回の操作で
三項目の検査を簡単にかつ迅速に行なうことができる。

このような利点に加え９本発明の検査法においてはマイ
クロカプセル担体を使用するので。

非特異凝集はほとんどみられず、高感度特性その他マイ
クロカプセル担体の特性はすべて維持されている。

比重液は常法によシ１例えば「化学便覧」基礎編■、丸
善出版株式会社（昭和４１年９月）に記載されている化
合物の比重−容量関係を参照して簡単に調製することが
できる。比重液調製用化合物は、抗原抗体反応を干渉し
ない１幅広い溶ｆｖ１度をもつ等の条件を勘案して選択
する。食塩やショ糖が一般的に使用されるが、溶解度が
広範にわたっていることや電解質ではないという点から
ショ糖の方が有利である。

毛細管としては、直径２−８叫程度のものが実用的であ
る。

本発明の方法においてはマイクロカプセルの比重ｄＩｎ
と比重液のｄ′とを好ましくは（１）〜（５）式の関係
ｋ１４すように設計すれば、同時に唯一回の操作・で多
項目検査全行なうことができる。さらにマイクロカプセ
ル試薬を異なる比重群毎にそれぞれ異なる色の染料で着
色すれば、オン・オフの判定をさらに簡便に高精度で行
なうことができる。

本発明において担体として使用するマイクロカプセルは
油性物質の芯とこれを包囲する壁材とからなる。その一
般的な製法は例えば近藤朝士著「マイクロカプセル」日
刊工業新聞社刊（昭和４５年）に詳説されている。また
具体的な油性物質や壁材、各種添加剤等については特開
昭５７−１９６６２１、同５７−１９６６２等に詳細な
記載がある。

抗原又は抗体をマイクロカプセルに感作するには周知の
方法が用いられ、特に架橋剤を用いる方法が好都合であ
る（千畑一部著「固定化酵素」講談社（昭和５０年）等
参照）。

マイクロカフ０セル担体は固型分として通常１〜３重量
多程度の範囲内で使用するのが望ましい。

本発明において、マイクロカプセルの壁表面に結合して
抗原抗体反応を起させることの可能な抗原又は抗体とし
ては、ホルモン、薬物代謝産物および特異蛋白質の他、
ビールス、細菌、細胞および人起源の抗原および抗体を
含む種々の物質を挙げることができる。具体的には例え
ば、梅毒トレポネーマ抗原、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢ８
抗原）。

ＨＢ８抗原に対する抗体（抗ＨＢｓ抗体）、トキソプラ
ズマ抗原、マイコプラズマ抗原、ヒト絨毛性コゝナトト
ロピン（ＨＣＧ　）　、抗ＨＣＧ抗体、核蛋白、デオキ
シ核酸、血漿蛋白成分の抗体（例えば、ＩｇＧ。

ＩｇＭ　、　ＩｇＡ　、アルブミン、α−フェトプロテ
ィン。

Ｃ反応性蛋白、α２マクログロズリン、トランスフェリ
ン、フィプリノーケ９７などの抗体）、補体成分（Ｃ１
ｑ　、　Ｃ１ｒ　、　Ｃ１ａ　、　Ｃ３、Ｃ４）に対す
る抗体などがある。

本発明の多項目検査法は特に複数の血清型をもつ赤痢菌
やコレラ菌、レプトスピラ菌の感染症の診断に効果的で
ある。

以下実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ 高比重マイクロカプセルＡの作成： ジイソノロビルナフタレン５．１ｇと塩素化ノぐラフイ
ン（塩素化度５０％、トヨパラックス１５０）１９．９
ｇとの混合油（比重綿］１８）に油溶性赤色染料オレオ
ゾール・レッドＢＢ（住友化学製）０、２５９　を溶解
した。得られた油性物質液を、無水マレイン酸−メチル
ビニルエーテル共重合体（ＧＡＮＴＲＥＺ　ＡＮ　−１
４９、ゼネラルアニリンアンドフィルム社製）２．５ｇ
ｅ水７５ｍ１に溶解した溶液に加えた。攪拌、乳化し、
コールタ−カウンターＴ　Ａ　−ＩＩ型で油滴のサイズ
を測定し平均サイズが約５μｍとなるように調製した。

これに尿素２．５Ｓとレゾルシン０．２５　ｇと塩化ア
ンモニウム０．３７とｔ水２５ｍ１に溶解した溶液を加
えた。さらに水５℃ｍｌ＋加ぐて希釈し、３７％ホルム
アルデヒドてマイクロカプセル化を行なった。その後Ｉ
Ｎ水酸化す）　ＩＪウム水溶液を加えｐＨ＜　９．０に
調整してマイクロカプセルを作成した。

このようにして作成したマイクロカプセルを生理食塩水
で遠沈洗浄することにより、未反応残存物を除去した。

マイクロカプセル粒子濃度が１０係になるように生理食
塩水に分散し、これをマイクロカプセルＡとした。

中比重マイクロカプセルＢの作成ニ ジインプロピルナフタレン８．４ｇと塩Ｘ化パラフィン
（塩素化度５０％、トヨ・ぐラックス１５０）１６．６
ｇとの混合油（比重１．１４）ｔ−用いる他はマイクロ
カプセルＡを作成する場合と同じ条件でマイクロカプセ
ルＢを作成した。

低比重マイクロカプセルＣの作成 ジイソノロビルナフタレン１１８ｇと塩素化パラフィン
（塩素化度５０％□トヨパラックス１５０）１３．２９
との混合油（比重綿１．１０）を用いる他はマイクロカ
プセルＡを作成する場合と同じ条件でマイクロカシセル
Ｃ″ｆ：作成した。

感作マイクロカプセル試薬の作成： レゾトスビラ菌イクテロへモラギエＲＧＡ株、オータム
ナリス欲皮Ａ株及びオーストラリス秋疫Ｃ株全それぞれ
コルトヨ培地（１０％正常ウサつ血清金含む）で増殖さ
せ、培養６〜１０日目の培養菌液ｋ　９，００　Ｏｒｐ
ｍで２０分（５℃）遠心分離し。

沈渣を生理食塩水で２回洗浄後、生理食塩水に再分散し
、２０　ｋＨｚの音波破砕器（犬岳製作所製）で１０分
破砕処理を行ない１分光光度計で２８０ｎｍの波長の光
学濃度が０．２になるように調製し抗原液とした。

上記の如く作成したマイクロカプセルＡ、Ｂ及びＣをそ
れぞれ１５ｇとり、別々に生理食塩水１０　ｍｌに分散
した。次に２５％グルタルアルデヒド水溶液全生理食塩
水で１００倍に希釈した液をそれぞれ１０ｍ１づつ加え
、３７℃４５分反応後。

遠沈洗浄しそれぞれ１０ｍ１の生理食塩水に再分散した
。

アルデヒド処理したマイクロカプセルＡ、Ｂ及びＣ各２
ｒｎｌに次の組み合わせで抗原液をそれぞれ２　ｍｌづ
つ加えた。

マイクロカプセルＡ　十ＲＧＡ株 マイクロカプセルＢ十欲皮Ａ株 マイクロカプセルＣ十欲皮Ｃ株 ３７℃で９０分間インキュベートした後、４℃で１８時
間冷蔵庫に静置した。次に０２チグリシン含有生理食塩
水で２回洗浄後、２ｍｌの１％ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ　）含有０．１５　Ｍ　ｌ）ン酸緩衝生理水（ＰＢ
Ｓ　、　ｐＨ７，２）にそれぞれ再分散し、試薬とした
。これらの試薬全各１部づつとり出し混合して、試薬甲
とした。

実施例２ 一方を封じた内径３簡のガラス管の内壁を伝わらせてシ
ョ糖の３５重量％（比重綿１．１５）。

２７重量％（比重綿１．１１）、１８重量％（比重綿１
．０７）の水溶液を順次０．５　ｍｌづつ流下させ。

ガラス管内に三層の比重液層を設けた。

実施例１で作成した試薬甲５０μｌとレゾトスビラ症の
疑いのある患者血清５０１ＩＡ［ｒよく混和した。

これを上記三層の比重液層を設けた管の内壁を伝わらせ
て加えた後、管ヲ４５°に傾は静置した。

１８時間静置後観察すると、中間層の管下側の内壁に赤
色沈渣の広がシがみられ、上層、下層下側の内壁には赤
色のスノ状沈渣、上層と中間層との境界および管底には
赤色の沈渣がみられた。

この結果から、この患者は欲皮Ａ症に感染していること
がただ一回のテストで判定された。

実施例３ 実施例１のマイクロカプセルＡ、Ｂ及びＣにおいて油溶
性赤色染料オレオゾール・レッドＢＢの代わシに次の組
み合わせの螢光染料を含むマイクロカプセルＤ、Ｅ及び
Ｆｉ作成した。

マイクロカッセルＤ、Ｅ及びＦに実施例２に従って９次
の組み合わせでレプトスピラ菌株を感作した。得られた
３つの試薬を各１部づつとり出して混合し、試薬乙とし
た。

マイクロカプセルＤ　＋　ＲＧＡ株 マイクロカプセルＥ十秋疫欲皮 マイクロカプセルＦ十欲皮Ｃ株 試薬乙を用いて実施例２と同様の操作で同じ患者血清を
テストした。１８時間静置後、アトー社の紫外線検出器
５Ｊ−１０３３Ａ型の長波紫外線で管を照明し観察した
。中間層の管下側の内壁の沈渣の広がりが黄緑色に輝き
、上層の管下１１１１の内壁のスノ状沈渣と上層と中間
層の境界面の沈渣はマゼンタ色に輝いた。

また、下層の管下側の内壁と管底とが紫色に輝き、３つ
の層の状況が極めて明瞭に識別して観察できた。この結
果から患者は欲皮Ａ症に感染していることが一回のテス
トで極めて容易に判定された。

実施例４ 実施例１で得られたレゾトスピラ症の３つの菌株の抗原
液をそれぞれＱ、　７　ｍｌづつと９部３者を混合した
。この混合抗原液２　ｍｌ　２実施例３で作成したマイ
クロカプセルＤに実施例１の方法で感作し。

得られた試薬を丙とした。

次ニトレホネーマ・・％６　リタムにコルス株）（’ｌ
ｌ’ｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ　（Ｎ１ｃｈ
ｏｌｓ　５ｔｒａｉｎ　）　ｆ家兎猜巣内に接種し、精
巣内で増殖させた。接種してから８〜１２日後精巣を採
取し、細切して２２φクエン酸ナトリウム溶液に浸して
菌体を浸出させ２分画遠心法により、１０８匹／　ｍｌ
になるように集菌した。集菌した菌体について、２０　
ｋＨｚの音波破砕器（犬岳製作所製）で、１０分間破砕
処理を行ない、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。沈
渣全生理食塩水で原料の１０倍に希釈した。これを抗原
液とする。

トレポネーマ・パリダムの抗原液２ｍ１２用いて実施例
３で作成したマイクロカプセルＥに実施例１の方法で感
作し、得られた試薬を丁とした。

一方を封じた内径３ｍのガラス管に内管壁を伝わらせて
ショ糖の３５重量係と２７重量係との水溶液を順次０．
５　ｍｌづつ流下させ、ガラス管内に二層の比重液層を
設けた。

必。

試薬内及び丁の各２５μつつをとり混合したものに患者
血清５０μＡｎよく混和した。これを上記二層の比重液
層管に内管壁を伝わらせて加え、管ヲ４５°に傾は静置
した。１８時間静置後、アト−社紫外線検出器５Ｊ−１
０３３Ａ型の長波紫外光で管を照明し観察した所、下層
の管下側内壁に沈渣の紫色の輝きがみられ、上層の管下
側内壁にはスノ状の沈渣の黄色の輝きがみられた。従っ
てこの患者はレプトスピラ症に感染していると判定され
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は三段比重液層を有する毛細管に比重差のあるマ
イクロカプセル群と被検液との混合液を毛細管内壁に滴
下した直後であって抗原抗体反応が開始する前の状態の
概念図を、第２図は抗原抗体反応後の毛細管を横方向に
拡大した概念図を示す。 図中の主な符号は次のとおりである。 １　１　１゜ ｄ、　、　ｄ２．　ｄ３．比重液の比重］、　１　、３
１　凝集像 ２１：沈降像 Ｓ：試薬＋被検液 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）比重差のあるマイクロカプセル群の各群に異種の
   抗原又は抗体を別々に感作した後混合して得られる試薬
   を被検液と混合し、これを多段比重液層を有する毛細管
   に加えた後、前記毛細管を傾斜して静置することを特徴
   とする多項１］免疫検査法。