CN102890040B

CN102890040B - 一种改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法

Info

Publication number: CN102890040B
Application number: CN201210394118.8A
Authority: CN
Inventors: 马文广; 姚恒; 牛永志; 郑昀晔; 索文龙; 宋碧清; 李元君
Original assignee: CHINA TOBACCO SEED YUXI Co Ltd; Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: CHINA TOBACCO SEED YUXI Co Ltd; Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2032-10-17
Also published as: CN102890040A

Abstract

本发明公开了一种改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法。首先将蔗糖溶于水中，配制成不同质量百分比的浓度梯度溶液，然后将待测花粉混入10%的蔗糖溶液中，注入离心管底。接着采用层铺法配制20~70%的蔗糖密度梯度离心液。在20℃下，以4000~10000rpm速度，离心5~15min，待花粉达到沉降平衡后静置，取花粉悬浮所在层相应浓度的蔗糖溶液，绘制待测花粉在该相应浓度蔗糖溶液中的吸光度标准曲线，以该曲线为参照，采用分光光度计在290nm波长下，测定花粉悬浮所在层蔗糖溶液的吸光度值，根据下列公式计算花粉密度：本发明适用于各种花粉密度的测定，结果准确，重复性好，操作简便、易行，需样品量少。

Description

一种改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法

技术领域

本发明属于植物生理学领域，具体涉及一种改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法。

背景技术

花粉为粉状物质，花粉的密度是花粉物理特性重要的指标之一。测定花粉的密度可以衡量花粉的内在品质，而花粉的品质直接影响植物种子的质量。所以测定花粉物理密度可应用于植物繁种的花粉质量的检测工作。测定花粉的密度也可为筛选花粉提供一个科学可行的方法。

常规的测定粉状物质密度的方法是将粉状物质装入到一定量的含液体介质的李氏瓶内，并使得液体介质充分的浸没粉状颗粒。根据阿基米德定律，粉状物体体积等于它所排开的液体体积，从而算出粉状物单位体积的质量即为密度。利用这种方法测定花粉的密度，首先操作不方便；需要专门的仪器。其次，这种方法需要相对较多的花粉，而花粉收集不易，成本高昂。

密度离心法的主要用途，主要用于物质的分离，在测定花粉密度方面未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测量结果准确、重复性好、简便易行的密度梯度离心法测定花粉密度的方法。

本发明的目的是这样实现的（除非另有说明外，本发明所采用的百分数均为质量百分数）：

一种改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法，包括蔗糖浓度梯度溶液配制、花粉样品处理、花粉样品铺放、密度梯度离心液配制、离心沉降、绘制吸光度标准曲线、测定吸光度及花粉密度计算，具体包括：

A、蔗糖浓度梯度溶液配制：将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比分别为20~70%的溶液；

B、花粉样品处理：将蔗糖溶于水中，配置成质量百分比为10%的溶液，称取0.001~0.01g待测花粉混合在100~1000μl 10%蔗糖溶液中；

C、花粉样品铺放：将含有花粉样品的10%蔗糖溶液注入离心管底部；

D、密度梯度离心液配制：采用层铺法将质量百分比20~70%的蔗糖溶液按质量百分比由低至高的顺序依次注入已含有待测花粉样品的10%蔗糖溶液的离心管底部，待高质量百分比的蔗糖溶液将低质量百分比的蔗糖溶液顶至上层，配置成密度梯度离心液；

E、离心沉降：在离心机中，20℃下，以4000~10000rpm速度，对含待测花粉样品的密度梯度离心液离心5~15min，待花粉达到沉降平衡后静置；

F、绘制吸光度标准曲线：选取花粉悬浮所在层相应浓度的蔗糖溶液，绘制待测花粉在该相应浓度的蔗糖溶液中的吸光度标准曲线；

G、测定吸光度值：取花粉沉降平衡后的密度梯度离心液，采用分光光度计在290 nm波长下，测定待测花粉悬浮层蔗糖溶液的吸光度值，利用标准曲线换算成该层浓度梯度下花粉的浓度值；

H：花粉密度计算：花粉的密度按照下列公式计算：

ρ =∑（OD_n/OD×ρ_n）

其中：

ρ——花粉的密度；

OD_n——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值；

OD——所有含花粉的各蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和；

ρ_n——第n梯度蔗糖溶液密度。

本发明所述的密度梯度离心法用于测定花粉密度，具有以下优点：

1、对经典的密度梯度离心法进行改良，更适合于花粉密度的测定，且不需要继续做细分梯度的重复测定，操作简便、易行，重复性好；

2、采用科学的公式进行花粉密度的计算，结果准确；

3、测试需样品量少。

附图说明

图1为本发明测定方法的流程框图；

图2为质量百分比55%的蔗糖溶液中N.alata花粉的吸光度标准曲线；

图3为质量百分比55%的蔗糖溶液中N.rustica花粉的吸光度标准曲线；

图4为质量百分比50%的蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度标准曲线；

图5为质量百分比55%的蔗糖溶液中K326花粉的吸光度标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

D、密度梯度离心液配制：采用层铺法将质量百分比20~70%的蔗糖溶液依次注入，已含有待测花粉样品的10%蔗糖溶液的离心管底部，配置成密度梯度离心液；

G、测定吸光度值：取花粉沉降平衡后的密度梯度离心液，采用分光光度计在290 nm波长下，测定待测花粉悬浮层蔗糖溶液的吸光度值，利用标准曲线换算成该层浓度梯度下花粉的浓度值

H：花粉密度计算：花粉的密度按照下列公式计算：

ρ =∑（OD_n/OD×ρ_n）

其中：

ρ——花粉的密度

OD_n——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值

OD——所有含花粉的各蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和

ρ_n——第n梯度蔗糖溶液密度

步骤B所述的10%蔗糖溶液的用量优选100μl。

步骤C、D所述的离心管容积为1.5~50ml。

步骤D所述层铺法是将质量百分比分别为20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的蔗糖溶液中的几种，用注入器依次注入离心管，先将低浓度的蔗糖溶液注入已含有待测花粉的10%蔗糖溶液的离心管底部，然后吸取高浓度的蔗糖溶液，将注入器插入管底，加入高浓度的蔗糖溶液，待浓度高的蔗糖溶液将浓度低的蔗糖溶液顶至上层，将不同质量百分比的蔗糖溶液按质量百分比由低至高的顺序，用上述方法依次加入，每次各50~200μl，优选为150μl制成密度梯度离心液。

步骤E所述的离心机为Microfuge 22R离心机。

步骤E所述的离心转速为4000~10000 rpm优选6000rpm。

步骤E所述的离心时间5~20min，优选为10min。

步骤F所述吸光度标准曲线的绘制，是选取待测花粉悬浮所在层相应浓度的蔗糖溶液2ml，将0.01g待测花粉加入，待其悬浮稳定后，用分光光度计测定吸光度值，然后等比稀释，再次测定其吸光度值，根据所测得的吸光度值和花粉浓度，绘制吸光度标准曲线。

所述分光光度计为UV-1800紫外分光光度计。

所述吸光度标准曲线的绘制，含有待测花粉的蔗糖溶液，至少等比稀释1倍以上。

实施例1

测定烟草N.alata的花粉密度。

首先，配制质量百分比分别为10%、20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的蔗糖溶液，置于烧杯中备用。其次，称取0.001g N.alata花粉混合在100μl 10%的蔗糖溶液中。再次，先用注射器将含有花粉样品的10%蔗糖溶液100μl加入到1.5ml离心管的底部，然后吸取高浓度蔗糖溶液，将注射器插入管底，加入高浓度蔗糖溶液，待浓度高的溶液将浓度低的溶液顶至上层，按上述方法依次加入20%、30%、40%、50%、55%、60%和65%的蔗糖溶液各150μl，制成10%~65%的密度梯度离心液。在Microfuge 22R离心机中，20℃下，以6000rpm速度，离心10min后静置，待花粉达到沉降平衡后，观察到花粉悬浮在55%、60%以及65%这三层蔗糖浓度梯度层中，抽取这3层浓度梯度蔗糖溶液。制作55%、60%、65%蔗糖浓度下，N.alata花粉在相应浓度蔗糖溶液中的标准曲线。

以制作质量百分比55%的蔗糖溶液中N.alata花粉的吸光度标准曲线为例，称取0.01gN.alata花粉，加入2ml的55%蔗糖溶液，充分震荡悬浮后，测定吸光度值；然后等比稀释1~32倍后测定其吸光度值，然后绘制吸光度标准曲线如附图2所示：

表1 55%蔗糖溶液中N.alata花粉的吸光度值

改变蔗糖溶液浓度，制作质量百分比分别为60%、65%的蔗糖溶液中N.alata花粉的吸光度标准曲线。

利用UV-1800紫外分光光度计中测定以上三层中N.alata花粉的吸收光值分别为0.46、0.58、0.48。根据相应的标准曲线换算出N.alata花粉在55%、60%、65%蔗糖溶液中的浓度分别为0.25g/ml、0.25g/ml、0.08g/ml。由此查表1可知55%、60%、65%蔗糖溶液的密度分别为1.25753、1.28646、1.31633。

N．alata花粉的密度按照下列公式计算：

ρ——花粉的密度

OD_n——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值

OD——各层含花粉蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和

ρ_n——第n梯度蔗糖溶液密度

代入公式可知N.alata花粉密度ρ=1.26576。

实施例2

测定烟草品种N.rustica的花粉密度。

首先，配制质量百分比分别为10%、20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的蔗糖溶液，置于烧杯中备用。其次，称取0.01g N.rustica花粉混合在1000μl 10%的蔗糖溶液中。再次，先用注射器将含有花粉样品的10%蔗糖溶液100μl加入到2.0ml离心管的底部，然后吸取高浓度蔗糖溶液，将注射器插入管底，加入高浓度蔗糖溶液，待浓度高的溶液将浓度低的溶液顶至上层，按上述方法依次加入20%、30%、40%、50%、55%、60%和65%的蔗糖溶液各200μl，制成10%~65%的密度梯度离心液。在Microfuge 22R离心机中，20℃下，以4000rpm速度，离心15min后静置，待花粉达到沉降平衡后，观察到花粉悬浮在55%、60%以及65%这三层蔗糖浓度梯度层中，抽取这3层浓度梯度蔗糖溶液。制作55%、60%、65%蔗糖浓度下，N.rustica花粉在相应浓度蔗糖溶液中的标准曲线。

以制作质量百分比55%的蔗糖溶液中N.rustica花粉的吸光度标准曲线为例，称取0.01gN.rustica花粉，加入2ml的55%蔗糖溶液，充分震荡悬浮后，测定吸光度值；然后等比稀释1~32倍后测定其吸光度值，然后绘制吸光度标准曲线如附图3所示：

表2 55%蔗糖溶液中N.rustica花粉的吸光度值

改变蔗糖溶液浓度，制作质量百分比分别为60%、65%的蔗糖溶液中N.rustica花粉的吸光度标准曲线。

利用UV-1800紫外分光光度计中测定以上三层中N.rustica花粉的吸收光值分别为0.58、0.53、0.40。根据相应的标准曲线换算出N.rustica花粉在55%、60%、65%蔗糖溶液中的浓度分别为0.47g/ml、0.35g/ml、0.13g/ml。由此查表1可知55%、60%、65%蔗糖溶液的密度分别为1.25753、1.28646、1.31633。

N.rustica花粉的密度按照下列公式计算：

ρ——花粉的密度

OD_n——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值

OD——各层含花粉蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和

ρ_n——第n梯度蔗糖溶液密度

代入公式可知N.rustica花粉密度ρ=1.27623。

实施例3

测定烟草品种N.repanda的花粉密度。

首先，配制质量百分比分别为10%、20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的蔗糖溶液，置于烧杯中备用。其次，称取0.005g N.repanda花粉混合在500μl 10%的蔗糖溶液中。再次，先用注射器将含有花粉样品的10%蔗糖溶液50μl加入到1.5ml离心管的底部，然后吸取高浓度蔗糖溶液，将注射器插入管底，加入高浓度蔗糖溶液，待浓度高的溶液将浓度低的溶液顶至上层，按上述方法依次加入20%、30%、40%、50%、55%、60%和65%的蔗糖溶液各50μl，制成10%~65%的密度梯度离心液。在Microfuge 22R离心机中，20℃下，以10000rpm速度，离心5min后静置，待花粉达到沉降平衡后，观察到花粉悬浮在55%、60%以及65%这三层蔗糖浓度梯度层中，抽取这3层浓度梯度蔗糖溶液。制作55%、60%、65%蔗糖浓度下，N.repanda花粉在相应浓度蔗糖溶液中的标准曲线。

以制作质量百分比50%的蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度标准曲线为例，称取0.01gN.repanda花粉，加入2ml的50%蔗糖溶液，充分震荡悬浮后，测定吸光度值；然后等比稀释1~32倍后测定其吸光度值，然后绘制吸光度标准曲线如附图4所示：

表3 50%蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度值

改变蔗糖溶液浓度，制作质量百分比分别为55%、60%的蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度标准曲线。

利用UV-1800紫外分光光度计中测定以上三层中N.repanda花粉的吸收光值分别为0.604、0.555、0.543。根据相应的标准曲线换算出N.repanda花粉在50%、55%、60%蔗糖溶液中的浓度分别为0.64mg/ml、0.35mg/ml、0.33mg/ml。由此查表1可知50%、55%、60%蔗糖溶液的密度分别为1.22957、1.25753、1.28646。

N.repanda花粉的密度按照下列公式计算：

ρ——花粉的密度

OD_n——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值

OD——各层含花粉蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和

ρ_n——第n梯度蔗糖溶液密度

代入公式可知N.repanda花粉密度ρ=1.25121。

实施例4

测定烟草品种K326的花粉密度。

首先，配制质量百分比分别为10%、20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的蔗糖溶液，置于烧杯中备用。其次，称取0.006g K326花粉混合在500μl 10%的蔗糖溶液中。再次，先用注射器将含有花粉样品的10%蔗糖溶液100μl加入到1.5ml离心管的底部，然后吸取高浓度蔗糖溶液，将注射器插入管底，加入高浓度蔗糖溶液，待浓度高的溶液将浓度低的溶液顶至上层，按上述方法依次加入20%、30%、40%、50%、55%、60%和65%的蔗糖溶液各150μl，制成10%~65%的密度梯度离心液。在Microfuge 22R离心机中，20℃下，以8000rpm速度，离心8min后静置，待花粉达到沉降平衡后，观察到花粉悬浮在55%、60%这两层蔗糖浓度梯度层中，抽取这2层浓度梯度蔗糖溶液。制作55%、60%蔗糖浓度下，K326花粉在相应浓度蔗糖溶液中的标准曲线。

以制作质量百分比55%的蔗糖溶液中K326花粉的吸光度标准曲线为例，称取0.01gK326花粉，加入2ml的55%蔗糖溶液，充分震荡悬浮后，测定吸光度值；然后等比稀释1~32倍后测定其吸光度值，然后绘制吸光度标准曲线如附图5所示：

表4 55%蔗糖溶液中K326花粉的吸光度值

改变蔗糖溶液浓度，制作质量百分比60%的蔗糖溶液中K326花粉的吸光度标准曲线。

利用UV-1800紫外分光光度计测定以上两层中K326花粉的吸收光值分别为0.579、0.532。根据相应的标准曲线换算出K326花粉在55%、60%、65%蔗糖溶液中的浓度分别为0.07mg/ml、0.15mg/ml。由此查表1可知55%、60%、蔗糖溶液的密度分别为1.25753、1.28646。

K326花粉的密度按照下列公式计算：

ρ——花粉的密度

OD_n——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值

OD——各层含花粉蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和

ρ_n——第n梯度蔗糖溶液密度

代入公式可知K326花粉密度ρ=1.27726。

本发明的工作原理

将蔗糖溶于水中，配制成不同质量百分比的蔗糖溶液，然后将待测花粉与质量百分比10%的蔗糖溶液混合，将其缓慢注入离心管底部，随后将不同质量百分比的蔗糖溶液采用层铺法，按照质量百分比由低至高的顺序，依次注入离心管底部，待高质量百分比的蔗糖溶液将低质量百分比的蔗糖溶液顶至上层，完成密度梯度离心液的配制，然后进行离心处理。由于离心力的作用，花粉产生沉降。若花粉密度大于相应浓度层的蔗糖溶液密度则沉降，若相等，则悬浮于相应的浓度层。不同密度的花粉将各自以一定的速度沉降，并在离心介质的不同密度梯度区域达到沉降平衡，形成区带，从而分离。

但是由于花粉本身并不是一个均一的物质，这是由于花粉的成熟度和生理状态所决定的。所以利用密度梯度离心法来分离花粉，会出现分布在几层的情况（由密度梯度之间的间隔所决定，梯度间隔越小，花粉分散的层数就越多）。分别抽取花粉悬浮所在层的蔗糖溶液，利用分光光度法测定待测花粉在相应蔗糖溶液中的浓度，根据公式算出一个综合平均的密度。

表5 不同温度下蔗糖溶液浓度与密度对照表

蔗糖溶液的密度 (g/mL)

Claims

1.一种改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法，包括蔗糖浓度梯度溶液配制、花粉样品处理、花粉样品铺放、密度梯度离心液配制、离心沉降、绘制吸光度标准曲线、测定吸光度及花粉密度计算，具体包括：

H：花粉密度计算：花粉的密度按照下列公式计算：

ρ =∑（OD_n/OD×ρ_n）

其中：

ρ——花粉的密度；

OD_n——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值；

OD——所有含花粉的各蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和；

ρ_n——第n梯度蔗糖溶液密度。

2.如权利要求1所述改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法，其特征在于：步骤B所述的10%蔗糖溶液的用量100μl。

3.如权利要求1所述改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法，其特征在于：步骤C、D所述的离心管容积为1.5~50ml。

4.如权利要求1所述改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法，其特征在于：步骤D所述层铺法是将质量百分比分别为20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的蔗糖溶液中的几种，用注入器依次注入离心管，先将低浓度的蔗糖溶液注入已含有待测花粉的10%蔗糖溶液的离心管底部，然后吸取高浓度的蔗糖溶液，将注入器插入管底，加入高浓度的蔗糖溶液，待浓度高的蔗糖溶液将浓度低的蔗糖溶液顶至上层，将不同质量百分比的蔗糖溶液按质量百分比由低至高的顺序，用上述方法依次加入，每次各50~200μl，制成密度梯度离心液。

5.如权利要求1所述改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法，其特征在于：步骤E所述的离心机为Microfuge 22R离心机。

6.如权利要求1所述改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法，其特征在于：步骤F所述吸光度标准曲线的绘制，是选取待测花粉悬浮所在层相应浓度的蔗糖溶液2ml，将0.01g待测花粉加入，待其悬浮稳定后，用分光光度计测定吸光度值，然后等比稀释，再次测定其吸光度值，根据所测得的吸光度值和花粉浓度，绘制吸光度标准曲线。

7.如权利要求1或6所述改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法，其特征在于：所述分光光度计为UV-1800紫外分光光度计。

8.如权利要求6所述改良密度梯度离心法测定花粉密度的方法，其特征在于：所述吸光度标准曲线的绘制，含有待测花粉的蔗糖溶液，至少等比稀释1倍以上。