CN102879328A - 一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法 - Google Patents

一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，包括花粉密度测定、离心液配制、授粉柱头固定、差速离心洗脱、荧光显微镜观察、粘附力计算等步骤。首先用密度梯度离心法测定花粉密度，其次配置质量百分比为70%的蔗糖溶液作为离心液，然后将待测的授粉柱头固定在离心管底部，在4~30℃下，将经质量百分比0.01~1%的水溶性苯丙胺蓝染色的授粉柱头，在离心机中洗脱5~20min，显微镜下观察待测授粉柱头上花粉被洗脱时的离心加速度，根据下列公式计算花粉与柱头间的粘附力：本发明可用于各种花粉与柱头粘附力的测量，测量精度高，重复性好，简便易行。

Description

一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法
技术领域
本发明属于植物形态学领域，更具体地说，本发明涉及一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法。 
背景技术
在植物有性生殖过程中，花粉粘附在柱头的表面是一个关键的步骤。长期以来，对授粉后花粉与柱头之间的粘附力的研究是一个空白。现在还没有一种成熟的测定授粉后花粉与柱头之间的结合力的方法。但是，在实际的繁种过程中常常遇到阴雨天，这种天气常常被认为不适宜进行授粉操作。人们常常担心雨水会将刚授粉的柱头表面的花粉冲涮下来，造成授粉失败。建立测定植物花粉与柱头之间的粘附力的方法就是为了给在实际的繁种过程中提供一个可靠、准确的方法，为实际的授粉操作提供一个科学的依据。从而打消某些不利的授粉的天气的疑惑。不仅如此，在实际的杂交授粉过程中，常常会用到某些介质花粉，而建立这种测定方法也可以更好的检验其对花粉与柱头之间的粘附力是否有益？为今后开发更多更好的适用于不良天气下的介质花粉的开发提供一个可靠、科学的检测方法。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种测量结果准确、重复性好、简便易行的离心法测定花粉与柱头粘附力的方法。 
本发明的目的是这样实现的（除非另有说明外，本发明所采用的百分数均为质量百分数）： 
一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，包括花粉密度测定、离心液配制、授粉柱头固定、差速离心洗脱及荧光显微镜观察、粘附力计算等工序，具体有以下步骤：
A、花粉密度测定：用密度梯度离心法测定花粉密度；
B、离心液配制：将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比70%的溶液作为离心液，置于微量离心管中备用；
C、授粉柱头固定：将待测柱头切下10~15mm长一段，授粉后，将授粉柱头固定在盛有2/3体积离心液的微量离心管底部，静置3~5min；
D、差速离心洗脱及荧光显微镜观察：在4~30℃下，将经质量百分比0.01~1%的水溶性苯丙胺蓝染色的授粉柱头，在离心机中以不同的加速度g加速度，离心处理5~20min，用紫外荧光显微镜观察柱头表面花粉粒的附着情况，记录柱头表面观察不到花粉粒状态下的加速度g加速度；
D、粘附力计算：花粉与柱头间的粘附力，按照下列公式计算：
Figure 325710DEST_PATH_IMAGE001
其中：
d蔗糖——测定温度下蔗糖溶液的密度g/ml；
d花粉——花粉的密度g/ml；
V花粉——花粉的体积ml；
g加速度——花粉被离心洗脱时的重力加速度m/s2。
本发明所述的离心法用于测定花粉与柱头间的粘附力，具有以下优点： 
1、测量精度高；
2、重复性好；
3、简便易行；
4、检测快速。
附图说明
图1为本发明测定方法的流程框图； 
图2为质量百分比55%的蔗糖溶液中K326花粉的吸光度标准曲线；
图3为质量百分比60%的蔗糖溶液中K326花粉的吸光度标准曲线；
图4为质量百分比50%的蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度标准曲线；
图5 为质量百分比55%的蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度标准曲线；
图6为质量百分比60%的蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明做进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。 
一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，包括花粉密度测定、离心液配制、授粉柱头固定、差速离心洗脱及荧光显微镜观察、粘附力计算等工序，具体有以下步骤： 
A、花粉密度测定：用密度梯度离心法测定花粉密度；
B、离心液配制：将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比70%的溶液作为离心液，置于微量离心管中备用；
C、授粉柱头固定：将待测柱头切下10~15mm长一段，授粉后，将授粉柱头固定在盛有2/3体积离心液的微量离心管底部，静置3~5min；
D、差速离心洗脱及荧光显微镜观察：在4~30℃下，将经质量百分比0.01~1%的水溶性苯丙胺蓝染色的授粉柱头，在离心机中以不同的加速度g加速度，离心处理5~20min，用紫外荧光显微镜观察柱头表面花粉粒的附着情况，记录柱头表面观察不到花粉粒状态下的加速度g加速度；
E、粘附力计算：花粉与柱头间的粘附力，按照下列公式计算：
其中：
d蔗糖——测定温度下蔗糖溶液的密度g/ml；
d花粉——花粉的密度g/ml；
V花粉——花粉的体积ml；
g加速度——花粉被离心洗脱时的重力加速度m/s2。
步骤A所述密度梯度离心法测定花粉密度，包括蔗糖浓度梯度溶液配制、花粉样品处理、花粉样品铺放、密度梯度离心液配制、离心沉降、绘制吸光度标准曲线、测定吸光度及花粉密度计算，具体包括： 
a、蔗糖浓度梯度溶液配制：将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比分别为20~70%的溶液；
b、花粉样品处理：将蔗糖溶于水中，配置成质量百分比为10%的溶液，称取0.001~0.01g待测花粉混合在100~1000μl 10%蔗糖溶液中；
c、花粉样品铺放：将含有花粉样品的10%蔗糖溶液注入离心管底部；
d、密度梯度离心液配制：采用层铺法将质量百分比20~70%的蔗糖溶液依次注入，已含有待测花粉样品的10%蔗糖溶液的离心管底部，配置成密度梯度离心液；
e、离心沉降：在离心机中，20℃下，以4000~10000rpm速度，对含待测花粉样品的密度梯度离心液离心5~15min，待花粉达到沉降平衡后静置；
f、绘制吸光度标准曲线：选取花粉悬浮所在层相应浓度的蔗糖溶液，绘制待测花粉在该相应浓度的蔗糖溶液中的吸光度标准曲线；
g、测定吸光度值：取花粉沉降平衡后的密度梯度离心液，采用分光光度计在290 nm波长下，测定待测花粉悬浮层蔗糖溶液的吸光度值，利用标准曲线换算成该层浓度梯度下花粉的浓度值；
h：花粉密度计算：花粉的密度按照下列公式计算：
Figure 320528DEST_PATH_IMAGE002
其中：
ρ——花粉的密度；
ODn——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值；
OD——所有含花粉的各蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和；
ρn——第n梯度蔗糖溶液密度。
步骤b所述的10%蔗糖溶液的用量优选100μl。 
步骤c、d所述的离心管容积为1.5~50ml。 
步骤d所述层铺法是将质量百分比分别为20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的蔗糖溶液中的几种，用注入器依次注入离心管，先将低浓度的蔗糖溶液注入已含有待测花粉的10%蔗糖溶液的离心管底部，然后吸取高浓度的蔗糖溶液，将注入器插入管底，加入高浓度的蔗糖溶液，待浓度高的蔗糖溶液将浓度低的蔗糖溶液顶至上层，将不同质量百分比的蔗糖溶液按质量百分比由低至高的顺序，用上述方法依次加入，每次各150μl，制成密度梯度离心液。 
步骤e所述的离心机为Microfuge 22R离心机。 
步骤e所述的离心转速优选6000rpm。 
步骤e所述的离心时间优选10min。 
步骤f所述吸光度标准曲线的绘制，是选取待测花粉悬浮所在层相应浓度的蔗糖溶液2ml，将0.01g待测花粉加入，待其悬浮稳定后，用分光光度计测定吸光度值，然后等比稀释，再次测定其吸光度值，根据所测得的吸光度值和花粉浓度，绘制吸光度标准曲线。 
所述分光光度计为UV-1800紫外分光光度计。 
所述吸光度标准曲线的绘制，含有待测花粉的蔗糖溶液，至少等比稀释1倍以上。 
步骤C所述固定方法为利用重金属丝缠绕在包裹有薄膜的授粉柱头上，使之能够沉入到盛有高密度蔗糖溶液的离心管的底部。 
所述的薄膜为宽1cm的parafilm封口膜。 
所述重金属丝的密度大于离心液的密度，直径50~200μm，缠绕长度10~50cm。 
所述的重金属丝可以为铜丝、铅丝、锌丝。 
所述的重金属丝直径优选100μm，缠绕长度优选30mm。 
所述微量离心管是一种小型离心管，又称为EP（eppendorf）管，与微量离心机配套使用，用于微量样本的分离离心。 
步骤B、C所述微量离心管的容积为1.5~50ml。 
步骤D所述的水溶性苯丙胺蓝的质量百分比为0.01~0.1%，优选0.05%。 
步骤D所述的离心温度为4~30℃，优选为20℃。 
步骤D所述的离心时间为5~20min，优选为10min。 
步骤D所述的离心机为Microfuge 22R台式微量冷冻离心机。 
步骤D所述的显微镜为Carl Zeiss  Axioimager A1紫外荧光显微镜。 
本发明所述离心法可用于各种花粉与柱头间粘附力的测定，下面通过实施例加以说明： 
实施例1
K326花粉与柱头粘附力测定
    首先，配制质量百分比分别为10%、20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的蔗糖溶液，置于烧杯中备用。其次，称取0.006g K326花粉混合在500μl 10%的蔗糖溶液中。再次，先用注射器将含有花粉样品的10%蔗糖溶液100μl加入到1.5ml离心管的底部，然后吸取高浓度蔗糖溶液，将注射器插入管底，加入高浓度蔗糖溶液，待浓度高的溶液将浓度低的溶液顶至上层，按上述方法依次加入20%、30%、40%、50%、55%、60%和65%的蔗糖溶液各150μl，制成10%~65%的密度梯度离心液。在Microfuge 22R离心机中，20℃下，以8000rpm速度，离心8min后静置，待花粉达到沉降平衡后，观察到花粉悬浮在55%、60%这两层蔗糖浓度梯度层中，抽取这2层浓度梯度蔗糖溶液。制作55%、60%蔗糖浓度下，K326花粉在相应浓度蔗糖溶液中的标准曲线。
以制作质量百分比55%的蔗糖溶液中K326花粉的吸光度标准曲线为例，称取0.01gK326花粉，加入2ml的55%蔗糖溶液，充分震荡悬浮后，测定吸光度值；然后等比稀释1~32倍后测定其吸光度值，然后绘制吸光度标准曲线如附图2所示： 
表1 55%蔗糖溶液中K326花粉的吸光度值
Figure 2012103985383100002DEST_PATH_IMAGE001
改变蔗糖溶液浓度，制作60%蔗糖溶液中K326花粉的吸光度标准曲线，如附图3所示。
表2 60%蔗糖溶液中K326花粉的吸光度值 
Figure 2012103985383100002DEST_PATH_IMAGE002
利用UV-1800紫外分光光度计测定以上两层中K326花粉的吸收光值分别为0.579、0.532。根据相应的标准曲线换算出K326花粉在55%、60%、65%蔗糖溶液中的浓度分别为0.07mg/ml、0.15mg/ml。由此查表1可知55%、60%、蔗糖溶液的密度分别为1.25753、1.28646。
K326花粉的密度按照下列公式计算： 
Figure 860597DEST_PATH_IMAGE005
ρ——花粉的密度
ODn——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值
OD——各层含花粉蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和
ρn——第n梯度蔗糖溶液密度
由公式可知K326花粉密度ρ=1.27726
将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比为70%的溶液作为离心液，置于1.5ml微量离心管中备用。将待测柱头切下10mm长一段，用宽1cm的parafilm封口膜紧密缠绕包裹住花柱，露出柱头。再在封口膜上缠上直径50μm的铜丝50cm。授粉后，将柱头放入到盛1.0ml离心液的1.5ml微量离心管底部，静置3min。在4℃下，将经质量百分比0.01%的苯丙胺蓝水溶液染色的授粉柱头，在Microfuge 22R台式微量冷冻离心机中离心处理20min，用Carl Zeiss Axioimager A1紫外荧光显微镜观察柱头表面花粉粒的附着情况，记录柱头表面观察不到花粉粒状态下的加速度g加速度。花粉与柱头间的粘附力，按照下列公式计算：
Figure 308076DEST_PATH_IMAGE007
其中：
d蔗糖=1.34717g/ml（质量百分比70%的蔗糖溶液的密度）
d花粉=1.27726g/ml（利用密度离心法测定的K326花粉的密度）
V花粉通过下列公式计算：
Figure 771418DEST_PATH_IMAGE008
其中：r=20μm（利用Car Zeiss Axioimager A1紫外荧光显微镜测量）
g加速度=13000g（m/s2）
g=9.80(m/s2)
因此花粉与柱头间的粘附力：
F粘附力=4/3π(20×10-4㎝)3×（1.34-1.28）g/ml×10-3×13000g
        ≈2.98×10-7 (N)
实施例2
N.repanda花粉与柱头粘附力测定
首先，配制质量百分比分别为10%、20%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的蔗糖溶液，置于烧杯中备用。其次，称取0.005g N.repanda花粉混合在500μl 10%的蔗糖溶液中。再次，先用注射器将含有花粉样品的10%蔗糖溶液100μl加入到1.5ml离心管的底部，然后吸取高浓度蔗糖溶液，将注射器插入管底，加入高浓度蔗糖溶液，待浓度高的溶液将浓度低的溶液顶至上层，按上述方法依次加入20%、30%、40%、50%、55%、60%和65%的蔗糖溶液各150μl，制成10%~65%的密度梯度离心液。在Microfuge 22R离心机中，20℃下，以10000rpm速度，离心5min后静置，待花粉达到沉降平衡后，观察到花粉悬浮在55%、60%以及65%这三层蔗糖浓度梯度层中，抽取这3层浓度梯度蔗糖溶液。制作55%、60%、65%蔗糖浓度下，N.repanda花粉在相应浓度蔗糖溶液中的标准曲线。
以制作质量百分比50%的蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度标准曲线为例，称取0.01gN.repanda花粉，加入2ml的50%蔗糖溶液，充分震荡悬浮后，测定吸光度值；然后等比稀释1~32倍后测定其吸光度值，然后绘制吸光度标准曲线如附图4所示： 
表3 50%蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度值
Figure 2012103985383100002DEST_PATH_IMAGE003
改变蔗糖溶液浓度，制作55%蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度标准曲线，如附图5所示。
表4 55%蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度值 
Figure 2012103985383100002DEST_PATH_IMAGE004
改变蔗糖溶液浓度，制作60%蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度标准曲线，如附图6所示。
表5 60%蔗糖溶液中N.repanda花粉的吸光度值 
Figure 2012103985383100002DEST_PATH_IMAGE005
利用UV-1800紫外分光光度计中测定以上三层中N.repanda花粉的吸收光值分别为0.604、0.555、0.543。根据相应的标准曲线换算出N.repanda花粉在50%、55%、60%蔗糖溶液中的浓度分别为0.64mg/ml、0.35mg/ml、0.33mg/ml。由此查表1可知50%、55%、60%蔗糖溶液的密度分别为1.22957、1.25753、1.28646。
N.repanda花粉的密度按照下列公式计算： 
Figure 929550DEST_PATH_IMAGE012
ρ——花粉的密度
ODn——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值
OD——各层含花粉蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和
ρn——第n梯度蔗糖溶液密度
Figure 280897DEST_PATH_IMAGE013
公式可知N.repanda花粉密度ρ=1.25121
将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比为70%的溶液作为离心液，置于1.5ml微量离心管中备用。将待测柱头切下15mm长一段，用宽1cm的parafilm封口膜紧密缠绕包裹住花柱，露出柱头。再在封口膜上缠上直径200μm的铅丝10cm。授粉后，将花柱放入到盛1.0ml离心液的1.5ml微量离心管底部，静置5min。在30℃下，将经质量百分比1%的苯丙胺蓝水溶液染色的授粉柱头，在Microfuge 22R台式微量冷冻离心机中离心处理5min，用Carl Zeiss Axioimager A1紫外荧光显微镜观察柱头表面花粉粒的附着情况，记录柱头表面观察不到花粉粒状态下的加速度g加速度。花粉与柱头间的粘附力，按照下列公式计算：
Figure 633381DEST_PATH_IMAGE014
其中：
d蔗糖=1.34717g/ml（质量百分比70%的蔗糖溶液的密度）
d花粉=1.25121g/ml（利用密度离心法测定的K326花粉的密度）
V花粉通过下列公式计算：
Figure 310350DEST_PATH_IMAGE008
其中：r=20μm（利用Car Zeiss Axioimager A1紫外荧光显微镜测量）
g加速度=9000gm/s2
g=9.80(m/s2)
因此花粉与柱头间的粘附力：
F粘附力=4/3π(20×10-4㎝)3×（1.34-1.25）g/ml×10-3×9000g
        ≈2.83×10-7（N）
表6 不同温度下蔗糖溶液浓度与密度对照表
蔗糖溶液的密度 (g/mL)
Figure 2012103985383100002DEST_PATH_IMAGE006
 

Claims (10)

1.一种离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，包括花粉密度测定、离心液配制、授粉柱头固定、差速离心洗脱及荧光显微镜观察、粘附力计算等工序，具体有以下步骤：
A、花粉密度测定：用密度梯度离心法测定花粉密度；
B、离心液配制：将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比70%的溶液作为离心液，置于微量离心管中备用；
C、授粉柱头固定：将待测柱头切下10~15mm长的一段，授粉后，将授粉柱头固定在盛有2/3体积离心液的微量离心管底部，静置3~5min；
D、差速离心洗脱及荧光显微镜观察：在4~30℃下，将经质量百分比0.01~1%的水溶性苯丙胺蓝染色的授粉柱头，在离心机中以不同的加速度g加速度，离心处理5~20min，用紫外荧光显微镜观察柱头表面花粉粒的附着情况，记录柱头表面观察不到花粉粒状态下的加速度g加速度；
D、粘附力计算：花粉与柱头间的粘附力，按照下列公式计算：
Figure 2012103985383100001DEST_PATH_IMAGE001
其中：
d蔗糖——测定温度下蔗糖溶液的密度g/ml；
d花粉——花粉的密度g/ml；
V花粉——花粉的体积ml；
g加速度——花粉被离心洗脱时的重力加速度m/s2。
2.如权利要求1所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于：步骤A所述密度梯度离心法测定花粉密度，包括蔗糖浓度梯度溶液配制、花粉样品处理、花粉样品铺放、密度梯度离心液配制、离心沉降、绘制吸光度标准曲线、测定吸光度及花粉密度计算，具体包括：
a、蔗糖浓度梯度溶液配制：将蔗糖溶于水中，配制成质量百分比分别为20~70%的溶液；
b、花粉样品处理：将蔗糖溶于水中，配置成质量百分比为10%的溶液，称取0.001~0.01g待测花粉混合在100~1000μl 10%蔗糖溶液中；
c、花粉样品铺放：将含有花粉样品的10%蔗糖溶液注入离心管底部；
d、密度梯度离心液配制：采用层铺法将质量百分比20~70%的蔗糖溶液依次注入，已含有待测花粉样品的10%蔗糖溶液的离心管底部，配置成密度梯度离心液；
e、离心沉降：在离心机中20℃下以4000~10000rpm速度，对含待测花粉样品的密度梯度离心液离心5~15min，待花粉达到沉降平衡后静置；
f、绘制吸光度标准曲线：选取花粉悬浮所在层相应浓度的蔗糖溶液，绘制待测花粉在该相应浓度的蔗糖溶液中的吸光度标准曲线；
g、测定吸光度值：取花粉沉降平衡后的密度梯度离心液，采用分光光度计在290 nm波长下，测定待测花粉悬浮层蔗糖溶液的吸光度值，利用标准曲线换算成该层浓度梯度下花粉的浓度值；
h：花粉密度计算：花粉的密度按照下列公式计算：
 
Figure 780013DEST_PATH_IMAGE002
其中：
ρ——花粉的密度；
ODn——第n层蔗糖梯度溶液中花粉浓度值；
OD——所有含花粉的各蔗糖梯度溶液中花粉浓度值总和；
ρn——第n梯度蔗糖溶液密度。
3.如权利要求1所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于：步骤C所述固定方法为利用重金属丝缠绕在包裹有薄膜的授粉柱头上，使之能够沉入到盛有高密度蔗糖溶液的离心管的底部。
4.如权利要求3所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于：所述重金属丝的密度大于离心液的密度，直径50~200μm，缠绕长度10~50cm。
5.如权利要求1所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于：步骤B、C所述离心管可根据离心机转子要求选用1.5ml~50ml的离心管。
6.如权利要求1所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于：步骤D所述的水溶性苯丙胺蓝的质量百分比0.01%~0.1%。
7.如权利要求1所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于：步骤D所述的离心温度为4℃~30℃。
8.如权利要求1所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于：步骤D所述的离心时间为5min~20min。
9.如权利要求1所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于：步骤D所述的离心机为Microfuge 22R台式微量冷冻离心机。
10.如权利要求1所述离心法测定花粉与柱头粘附力的方法，其特征在于：步骤D所述的显微镜为Carl Zeiss  Axioimager A1紫外荧光显微镜。
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