JP2677548B2 - １ａ型乳頭腫ウイルスゲノムのＬ１及びＬ２領域由来のＤＮＡ断片 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、乳頭腫ウィルス（papillomavirus）特にHP
V1a型の抗原決定基の少なくとも１つを含有するポリペ
プチドをコードするDNA断片に係る。本発明はまた前記
の如きポリペプチドの形質転換産物（produits de tran
sformation）に係る。このような産物は、例えばポリペ
プチドを共有結合によって担体高分子（macromolecules
support）に結合させたものであり、免疫原性を有す
る。このような免疫原性を有するため、形質転換産物
は、生物サンプル中の乳頭腫ウィルスの存否についての
診断手段として、又は乳頭腫ウィルスに対する免疫を宿
主に与え得るワクチンの活性成分として使用され得る。 乳頭腫ウィルスが、ヒトも含めて多数の生物種に感染
し得ることは公知である。これらのウィルスは、良性腫
瘍の原因となる。特に上皮にコロニーを形成してイボに
なる。これらの腫瘍は殆んどの場合は退行性であるが、
ある場合には悪性変換が生じ得る。更に、形態学的見地
から乳頭腫ウィルスは、例えばSV40,BKV,等の名称で知
られるポリオーマウィルス群に属すると考えられてい
た。実際、これらの種々のタイプのウィルスは、ヒスト
ンと結合した二重らせんDNAを包む二十面体形カプシド
構造を共通に有している。組織培養では上皮細胞又は他
の細胞上での乳頭腫ウィルスの培養は不可能であるとさ
れていたが、最近O.DANOS等は1a型のヒト乳頭腫ウィル
スの完全ゲノムを大腸菌（Escherichia coli）株中で
クローニングすることに成功した（Eur.J.Biochem.,10
9,457−461（1980））。 本発明は、この乳頭腫ウィルスのゲノム内の、抗原決
定基を含み得るペプチド又はポリペプチドをコードし得
る或る種の配列を発見したことに基くものである。この
ため、前記ペプチド又はポリペプチドを、必要な場合に
は担体高分子と結合した後に、ワクチンの活性成分とし
て使用し得るようになる。少なくとも前記ペプチド又は
ポリペプチドが最小の場合には担体高分子との結合が行
なわれる。 この場合注目されるのは、前記配列が、前出のポリオ
ーマウィルスのゲノム内に含まれる全配列とは全く異な
ることである。乳頭腫ウィルスの完全ゲノムの配列解析
によれば、前記配列が乳頭腫ウィルスのゲノムのストラ
ンドのうちの唯１つのストランドに担われていることが
判明した。 最も普遍的な定義によれば、本発明のDNA断片は、適
当な微生物中での発現産物がヒト乳頭腫ウィルスの抗原
決定基の少なくとも１つを含むようなDNA断片から成
る。本発明のDNA断片の特徴は、このDNA断片に含まれる
ヌクレオチド配列が、乳頭腫ウィルス、例えば1a型の乳
頭腫ウィルス（HPV1a）のゲノムのストランドのうちの
該ヌクレオチドを含むストランドの領域L1内又は領域L2
内又は一部が領域L1及び一部が領域L2に含まれているか
又はこれら領域に含まれるヌクレオチド配列に類似（an
alogue）しており、該ヌクレオチド配列がHPV1aの構造
タンパクをコードし得ることである。 より詳細には、本発明のDNA断片の特徴は、DNA断片
が、ウィルスの１つ以上の構造タンパクをコードし得る
か、又は乳頭腫ウィルス特有の抗原決定基の少なくとも
１つを含む配列を該タンパクと共通して有する１つ以上
のポリペプチドをコードし得るヌクレオチド配列から構
成されており、このヌクレオチド配列は、乳頭腫ウィル
スのゲノムのストランドのうちでこれらのヌクレオチド
を含むストランドの、領域L1内又は領域L2内又は一部が
領域L1及び一部が領域L2に含まれており、この配列は、
必要な場合には、乳頭腫ウィルスのゲノムに由来し且つ
通常は乳頭腫ウィルス内でこのゲノムに結合しているDN
A断片により補完されており、約100以下のヌクレオチド
を含むことである。 説明し易いように、図面に関して以下に説明する。 −第1a,1b,1c図は、HPV1aのゲノムストランドの１つ、
特に５′末端から対応する３′末端までの配列が解読さ
れるストランドの一部の構造を示す説明図、 −第2a図及び第2b図は、HPV1のゲノムの各ストランド内
の、ポリペプチドとして発現され得る部分の概略説明
図、第2c図は、ウシ乳頭腫ウィルスBPV1のゲノムの概略
説明図、 −第３図は、HPV1a由来の本発明の好ましいDNA断片とBP
V1型ウシ乳頭腫ウィルスのゲノムの対応する断片との構
造の比較を示す概略説明図である。 一方で第1a図、他方で第1b図及び第1c図は、乳頭腫ウ
ィルスHPV1aに担われるゲノムのストランドのうちの１
つの領域L1及びL2の構造を示す。これらの図はまた、該
当するストランドのヌクレオチドが規定する連続トリプ
レットによってコードされるアミノアシル残基を示す。
これらのタンパクは、対応するヌクレオチド配列の別々
の解読フェーズ（phases de lecture）に対応する。こ
のことは特に第1a図、より詳細には（第１図に図示しな
い）５′末端から数えて1870番目から1881番目のヌクレ
オチドの処に明らかに示されている。このストランドの
５′末端から対向３′末端に伸びる解読方向でこのスト
ランドに於ける領域L1とL2との相対位置は第2a図を検討
することより理解されよう。第2a図は、特に、予めベク
ターに挿入された対応するDNA断片を用いて適当な微生
物の形質転換を行なうとき、発現が生起し得る領域の分
布を示す。 第2a図は、５′末端が左側で３′末端が右側にある対
応するストランドの可能な３つの解読フェーズを示す。
コドンは10個ずつのグループとして検査され、黒棒の各
々はこれらグループのうち該当解読フェーズで停止コド
ン（codon d′arrｔ）を含むグループに対応する。縦
の点線は、停止コドンを含まない後続の各配列中に存在
する第一コドンATGに対応する。4237位と5240位の２つ
のEcoRI部位は、図の左側に符号3,2,1で示す可能な３つ
の解読フェーズより得られた配列の配向を分り易くする
ために示した。上記の如く第2a図から領域L1とL2との相
対位置が理解される。 第2b図は、同じ条件下でHPV1aのゲノムのDNAの相補ス
トランド（brin complmentaire）が解読可能であるこ
とを示す。いかなる解読フェーズが予定されるかに関わ
り無く、対応するストランドのほぼ全体に亘ってかなり
の数の停止コドンが存在することが理解されよう。 前記の如く、本発明は特に領域L1及び領域L2に共通な
ゾーンを含み得るDNA断片に係る。このような状態は、
これらの領域の転写操作の際、形質転換細胞の内部に於
いても、２つの領域間で生じ得るスプライス（pissur
e）の際に現れる。 しかし乍ら、好ましくは本発明は、HPV1aの前記領域L
1と共に共通ヌクレオチド配列を有するDNA断片に係る。 前記領域L1とL2に含まれた配列のうち乳頭腫ウィルス
特にHPV1aに特有の抗原決定基を含み得る配列の位置を
より特定的に検出するために、それ自体公知の任意の方
法で処理し得る。特に、適当な制限酵素によって又は化
学的開裂によって対応するDNA配列を断片化し、得られ
た断片をベクター内に組込み、これにより得られた発現
を生じさせ得るベクターを用いて適当な微生物を形質転
換し、得られたペプチドを分離し、次いで必要な場合担
体高分子と結合させた後、ペプチドを用いて生体宿主中
で抗体産生を誘発する。HPV1a完全体を中和し得る抗体
を産生し得る断片も本発明に含まれる。 本発明の好ましいヌクレオチド配列は、式 Leu−Asp−Gln−Phe−Pro−Leu−Gly−Arg−Lys−Phe−
Leu で示されるペプチド配列をコードするヌクレオチド配列
から成る。 このペプチド配列に限定されるペプチドは、特に、式 TTA GAC CAA TTT CCA CTA GGA AGG AAA TTT CTA で示されるヌクレオチド配列によりコードされる。 このヌクレオチド配列は、第1b図の3148位から3180位
まで伸びるヌクレオチドに対応する。 本発明による別の好ましい断片は、式 Ala−Lys−Arg−Arg−Arg−Lys で示されるペプチド配列をコードする断片を含む。 このペプチド配列に対応するペプチドは特に、式 GCC AAG CGC AGG CGT AAG で示されるヌクレオチド配列によりコードされる。 本発明は勿論、他の乳頭腫ウィルス例えば乳頭腫ウィ
ルスCRPV（ワタオウサギ乳頭腫ウィルスの略号）又はBP
V1（ウシの１型乳頭腫ウィルスの略号）の構造タンパク
をコードする全てのDNA断片に係る。また、これらのDNA
断片によりコードされるペプチドに係る。これらのペプ
チドとして特に、前記ウィルスCPRV及びBPV1が担うDNA
配列に対応するペプチドを挙げることができ、これらの
ペプチドの特徴はそれぞれ CPRV:Leu−Asp−Gln−Tyr−Pro−Leu−Gly−Arg−Lys−
Phe−Leu BPV1:Leu−Asp−Gln−Phe−Pro−Leu−Gly−Arg−Arg−
Phe−Leu なる配列を有することである。 また、前記に示したものとはヌクレオチド構造が異な
るトリプレットを有するDNA配列でも、同一アミノ酸又
は“均等の”アミノ酸をコードするならば、本発明の一
部を構成する。ここで“均等”なる用語は、基本構造の
アミノ酸の１つと置換され得、しかも対応するペプチド
の免疫原性を本質的に変化させない全てのアミノ酸を意
味する。換言すれば、均等アミノ酸とは、変成ペプチド
配列を形成することができ、得られたペプチド配列が、
必要な場合には適当な担体高分子に結合されてから、HP
V1aの対応する基本ペプチドを中和する能力又はより普
遍的には乳頭腫ウィルスを中和する能力を保持する抗体
を、インビボ（in vivo）誘発し得るようなアミノ酸を
意味する。 これらの均等アミノアシルは、構造の相同性（homolo
gie）に基くか、又は得られた種々のペプチド配列が関
与し得る免疫原性交差テスト（essais d′immunognic
its croises）の結果に基いて決定し得る。 対応する変成ペプチドの深刻な免疫原性の変化を生じ
ること無く、しばしば行なうことができる可能な置換の
例を挙げると、バリン又はイソロイシンによるロイシン
の置換，グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換，ア
スパラギンによるグルタミンの置換，リジンによるアル
ギニンの置換等があり、同じ条件下で逆の置換も勿論可
能である。 これに関して指摘すべきは、特に第３図の検討から明
らかな如く、BPV1型のウシ乳頭腫ウィルスゲノム内にHP
V1aの対応する配列と或る程度の相同性を有する配列が
存在することである。 実際第３図は、対応する解読コードによる領域L1の
（HPV1aゲノムの５′末端から3246番目のヌクレオチド
から3476番目のヌクレオチドまで伸びる）３′末端ゾー
ンと、BPV1ゲノムの対応する領域との間にみられる相同
性を明らかにする。後者の領域は、ROTHSTEIN及びWU（G
en.,15,1981,167−176）及び／又はJ.MESSING等（Nucl.
Acids Res.（1981）9,309−321）により記載されたベク
ターM13と、（第2c図に概略的に示した）BPV1のHind II
I部位末端の約10ヌクレオチド手前から始まり且つBgl I
I両末端によって限定されるBPV1断片との間で得られた
組換体の配列解析によって定義された。図示のヌクレオ
チド配列の向い合った文字間に置かれた点は、該当する
ヌクレオチドの同一性を強調するためのものである。各
配列中に残された空白部分は、相同の存在を際立たせる
ためのものである。第３図で考察された断片の内部に含
まれる対応配列によってコードされた共通ペプチド配列
は、実線で囲まれた枠内に示されている。 式 Leu−Asp−Gln−Phe−Pro−Leu−Gly−Arg−Arg−Phe−
Leu及びAla−Lys−Lys−Lys−Lys−Lys で示されるペプチドをコードするDNA断片もまた本発明
の特定DNA断片に属する。 また、本発明の範囲に含まれる特定ヌクレオチド断片
として勿論、前記BPV1断片に含まれた断片、特に TTA GAT CAA TTT CCC TTG GGA AGA AGA TTT TTA, GCA AAA AAA AAA AAA AAA が挙げられる。 更に本発明は勿論、前記に定義した如き条件で均等な
全てのDNA断片に係る。 上記の如き種々のDNA配列を得るためにも、前記の如
きプロセスが使用され得る。特に、ゲノムを断片化し、
対応する適当な断片、即ち前記領域L1及びL2に含まれる
配列に対応するヌクレオチド鎖を含む断片、又はより小
さい領域に対応するが完全ウィルスの特異的抗原決定基
を含んだヌクレオチド鎖を含む断片を回収する。最小断
片、特に例に挙げた如き少数のアミノ酸をコードする断
片に関しては、これまでによく知られた方法によって対
応するヌクレオチドの化学合成を利用することも可能で
ある。この場合、得られた配列は、発現に適した微生物
を形質転換し得るベクター内にインサートとして組込ま
れるべく使用され得る。 ペプチド自体に関する場合、特に少数のアミノアシル
残基しか含まないペプチドに関する場合、それ自体公知
の化学合成技術を利用し得る。 この場合より詳細にはHOUBEN−WEYL“Methodemder Or
ganischen Chemie"（有機化学の方法）,E.Wnsch編,15
巻−Ｉ及びII,THIEME,シュツットガルト1974に記載の均
質溶液中の合成モードが利用される。 この合成方法によれば、連続するアミノアシルを所望
順序で２つずつ順次縮合するか、又は複数個のアミノア
シル残基を適正順序で含むように予め形成した断片とア
ミノアシルとを縮合するか、又は前記の如く予め形成さ
れた断片を複数個縮合する。但しこの場合には勿論、ア
ミノアシル又は断片が担持する反応性官能基のうちで、
ペプチド結合の形成に正常に関与すべき一方のアミン官
能基と他方のカルボキシル官能基、又は逆に一方のカル
ボキシル官能基と他方のアミン官能基とを除く全ての反
応性官能基を、特にカルボキシル官能基の活性化後に、
予め保護する必要がある。これは、タンパク合成に於い
て十分に公知の方法によって行なわれる。更に、カルボ
ジイミド型例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミドの如き従来の結合（カッ
プリング,couplage）試薬を用いた結合反応を利用する
ことも可能である。使用されるアミノアシルが付加的に
アミン官能基（例えばリジンの場合）、又は別の酸官能
基（例えばグルタミン酸の場合）を有するとき、これら
の官能基については、例えばアミン官能基はカルボベン
ゾキシ基又はｔ−ブチルオキシカルボニル基によって保
護され、カルボキシル官能基はｔ−ブチルエステル基に
よって保護されるであろう。他の全ての反応性官能基の
保護についても同様である。例えば、考察されるアミノ
アシルの１つがSH官能基（例えばシステイン）を含むと
きはアセトアミドメチル基又はホルムアミドメチル基を
利用し得るであろう。 アミノ酸を１つずつ結合していく漸進的合成の場合に
は、好ましくはＣ−末端アミノ酸と所望配列中の隣接ア
ミノアシルに対応するアミノ酸との縮合によって合成を
開始し、以後同様にして近い順に結合させてＮ−末端ア
ミノ酸に到達させる。本発明で利用し得る別の好ましい
技術としては、R.D.MERRIFIELD“Solid phase peptide
synthesis"（J.Am.Chem.Soc.,45,2149−2154）に記載の
ものがある。 MEERIFIELDの方法でペプチド鎖を製造するためには、
極めて多孔質のポリマー樹脂が利用される。鎖のＣ−末
端第一アミノ酸を該樹脂に固定する。このアミノ酸は、
カルボキシル基を介して樹脂に固定され、アミン官能基
は例えばｔ−ブチルオキシカルボニル基によって保護さ
れる。 Ｃ−末端第一アミノ酸を前記の如く樹脂に固定した
ら、樹脂を酸で洗浄してアミン官能基の保護基を除去す
る。 アミン官能基の保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル
基の場合、この保護基は樹脂をトリフルオロ酢酸で洗浄
することによって除去される。 次に、所望配列中でＣ−末端アミノアシル残基から２
番目のアミノアシルを供給する第２のアミノ酸を、鎖に
固定されたＣ−末端第一アミノ酸の脱保護アミン官能基
と反応させる。好ましくは、この第二アミノ酸のカルボ
キシル官能基を、例えばジシクロヘキシルカルボジイミ
ドで活性化し、アミン官能基を例えばｔ−ブチルオキシ
カルボニルで保護する。 このようにして、所望のペプチド鎖の第一部分、即ち
２つのアミノ酸を含んでおり、末端アミノ官能基が保護
された部分が得られる。前記同様にアミン官能基を脱保
護し、次に、Ｃ−末端第二アミノ酸の付加条件と同様の
条件下で第三アミノアシルの固定処理を行なう。 このように、ペプチド鎖を構成すべきアミノ酸を、樹
脂に結合された形成済のペプチド鎖部分のアミン基に順
次固定する。このアミノ基は毎回予め脱保護される。 所望のペプチド鎖全体が形成されると、ペプチド鎖を
構成する種々のアミノ酸の保護基を除去し、例えばフッ
化水素酸を用いてペプチドを樹脂から分離する。 本発明は更に、前記の如くペプチド間の（共有結合に
よる）結合（共役,conjugaison）により得られた産物、
及び免疫原性活性成分を構成すべく使用され得る種類の
高分子担体に係る。 このような担体は専門家に十分に公知である。例えば
天然担体としては、血清アルブミンがある。ワクチンが
ヒトを対象とするときは、ヒト血清アルブミンが好まし
く、獣医用に動物を対象とするときは動物血清アルブミ
ンが好ましい。更に天然高分子担体の例として、好まし
くは20,000を上回る分子量を有するオバルブミン，破傷
風毒素等がある。 更に、合成ポリペプチドの如き合成高分子担体も利用
し得る。例えば必要な場合、ポリアラニン側鎖（アラニ
ル基本単位は右旋性及び／又は左旋性）を担持するポリ
リジンが挙げられる。また、例えばフランス特許出願第
7900819号に記載の如き合成鎖をも利用し得る。 本発明の活性成分は特に、例えば免疫抑制処置の実施
に先立って被検者を乳頭腫ウィルスから保護するために
有用である。 重要な用途は、より純粋な血清又は抗体を産生し、こ
れらを用いてルーチンテスト、特に膣のスミアテスト
（examens de frottis vaginaux）又は他の婦人科検診
例えば或る種の子宮頸癌の検診の際に使用され得る乳頭
腫ウィルスの診断試薬を製造することである。更に、皮
膚科の予防診断テストにも使用され得る。 また本発明は勿論、前記活性成分が非経口的，経口的
又はべつの経路で投与され得るべく薬剤ベヒクルと組み
合わされる全てのワクチン組成物に係る。必要な場合こ
れらの組成物は、ワクチン成分に対する免疫反応を強化
し得るムラミル（muramyl）−ペプチド型の免疫アジュ
バントを同時に含有する。 これらの組成物はヒト医薬又は獣医薬として使用され
得る。この場合使用される乳頭腫ウィルスの免疫原性配
列は、特に多数のアミノアシル残基を含む配列の場合に
は、ワクチンの対象たる種の組織中で優先的にコロニー
形成する乳頭腫ウィルスに由来している。 要約すれば本発明は勿論、適当な微生物中での発現産
物がヒト又は動物の乳頭腫ウィルスの抗原決定基の少な
くとも１つを含むような全てのDNA断片に係る。本発明
のDNA断片の特徴は、この断片に含まれるヌクレオチド
配列が、乳頭腫ウィルスゲノムのストランドのうちこれ
らのヌクレオチドを含む１つのストランド内の、領域L1
に含まれるか又は領域L2に含まれるか又は領域L1に一部
及び領域L2に一部含まれているか、又はこれらの領域に
含まれるヌクレオチド配列に類似しており、これらのヌ
クレオチド配列が、ウィルスの構造タンパクをコードし
得るか又は乳頭腫ウィルス特有の抗原決定基の少なくと
も１つを含む配列を前記タンパクと共通して有するポリ
ペプチドをコードし得ることである。 以下の特許請求の範囲は勿論、DNA断片と対応するペ
プチド断片のみでなく、製造可能な全ての均等物をカバ
ーするものであり、特に本文中に記載された方針に準拠
するが限定はされない。 本発明はまた、前記に挙げた配列以外の、乳頭腫ウィ
ルスのゲノムから抽出された全てのDNA配列にも係る。
特に配列E1（ヌクレオチド 5473−6919）及びE2（ヌク
レオチド 6863−16）（第2a図の解読フェーズ1,2）に
係る。これらの配列によって発現されるペプチドは、従
来の免疫螢光反応又は免疫酵素反応等により追跡（検
診）可能な従来の抗原抗体反応に於いて、乳頭腫ウィル
ス（タンパク断片とウィルスDNAとを含む）によって生
じた病巣を検出するために役立つ抗体形成をインビボ誘
発し得る。

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．1a型ヒト乳頭腫ウイルス（HPV1a）ゲノムの下記のL
   2領域、又は下記のL1領域、又はヌクレオチド配列： TTA GAC CAA TTT CCA CTA GGA AGG AAA TTT CTA もしくはヌクレオチド配列： GCC AAG CGC AGG CGT AAG を含有するL1領域の一部、からなるヌクレオチド配列で
   示されるDNA断片。 ２．前記DNA断片の発現産物が、1a型ヒト乳頭腫ウイル
   スの検出を可能にする抗体のイン ビボ産生を誘発しう
   ることを特徴とする、請求の範囲１に記載のDNA断片。 ３．1a型ヒト乳頭腫ウイルス（HPV1a）の全L1領域から
   なることを特徴とする、請求の範囲１又は２に記載のDN
   A断片。 ４．前記L1領域の一部が少なくとも100個のヌクレオチ
   ドからなることを特徴とする、請求の範囲１又は２に記
   載のDNA断片。 ５．ヌクレオチド配列： TTA GAC CAA TTT CCA CTA GGA AGG AAA TTT CTA で示されることを特徴とする、請求の範囲１に記載のDN
   A断片。 ６．ヌクレオチド配列： GCC AAG CGC AGG CGT AAG で示されることを特徴とする、請求の範囲１に記載のDN
   A断片。