JP2505873B2 - 散乱光による粒子分析装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の属する技術分野） 本発明は粒子分析装置、特に、個別の血液細胞の種
類、例えば、白血球の５つの基本種類を、細胞化学染色
法又は物質を用いることなくクールター技術によって選
択的に、識別し、個別的に分類する装置及び方法に関す
るものである。

（従来の技術） 細胞化学染色法を用いることなく、細胞化学流装置に
よって白血球を識別し、３つの主な種類、即ち、リンパ
球、単球及び顆粒球に分類し得ることは既知である。か
かる方法の一つでは小角光散乱と90゜、即ち、大角光散
乱とを組合わせて用いることである。ある方法では溶解
剤を用いて全血希釈液から不所望な赤血球を除去する。
その他の方法ではフィコール、デキストラン、“バフィ
ーコート”等のような密度又は遠心技術に依存してい
る。更に、ある方法では細胞化学染色法を用いて免疫機
能によりリンパ球サブセットを更に細分類し得るように
している。

クールター社に譲渡されたエス エル レディス及び
エッチ アール クリューによるPCT/US85/00868出願の
明細書には、試薬系を用いて赤血球をサンプルから有効
に除去し、溶解及び必要に応じ定着処理により、３つの
集団のみを可視状態にして好酸球を他の副集団から識別
し得ないようにする従来の技術と対比し、顆粒球副集
団、即ち、好酸球を分離し得るようにした４集団差分を
行うシステム及び技術が記載されている。

又、セルを染色して小角光散乱及び吸収の組合わせに
よって４つの個別の群を形成して４−部分白血球差分、
即ち、リンパ球、単球、好中球及び好酸球を得る方法及
び手段は既知である。この吸収は軸方向の光損失の成分
である。

更に、米国特許第3,502,974に示されるように電気的
“不透明度”をあるセル又はそのクラスタを検出する個
別のパラメータとしてプロットする技術では、３つの集
団を再び差分し、確実に定義し、分離するようにしてい
る。しかし、この場合には好中球、好酸球及び好塩基球
の顆粒球副集団が顆粒球クラスタデータ内にあり、従っ
て、これらの３つを識別するのが困難となる。

従来の文献“サイエンティフィック ペーパ アンド
レポート”には使用される光ビームの光路に対し種々
の角度位置で光散乱技術を用いてサンプルを照射及び質
問することが記載されている。しかし、従来用いられ、
かつ、考慮されている文献の材料の大部分は光交差角が
０゜〜23゜又は０゜〜90゜に制限され、又、光軸に対し
制限されている。

（発明の目的） 本発明は高速で正確な分析に使用され、生物学的セル
サンプル内で互いにセルの種類を分類するようにした新
規、有効で未知の生物学的セルを計数、測定、及び識別
する方法及び装置を提供せんとするにある。

（目的達成のための手段） 本発明は粒子の水力学的な収束流の形態の生物学的サ
ンプルを電磁放射エネルギー、即ち、レーザ光の点状収
束ビーム内に通過させるようにした構体を提供する。レ
ーザ光エネルギーの光軸に対し好適に位置決めされた光
応答手段によって各セルの通路を示す光出力パルスを発
生させるようにする。流体の流路内で導電接点を作動さ
せて各セルのクールター型のDCボリューム及びRF/DCク
ールター不透明度質問の結果追加の電気パルス出力を発
生させるようにする。

これら出力パルス又は出力を適宜の電子回路によって
組合わせて少なくとも５つの異なる型の白血球を規定
し、ある統計的に少ない共通セル副集団が、その基本的
なセルの種類によりマスクされている場合でも、一種類
のセルを有効に識別し得るようにする。

又、本発明は光散乱技術のみにより、かつクールター
型のDC及びRF技術の組合わせで一種以上の多重生物学的
セルを表わすデータを発生する装置及び方法に関するも
のである。更に、本発明によればレーザ光軸に対し10゜
〜70゜の角度範囲でマスクされたレーザビームの出力区
域に配列された光応答パルス発生構体から取出した信号
又はデータを用いる新規な装置及び方法を提供するもの
であり、これを以下中角光散乱、即ち、MALSと称する。

（関連文献） 本発明は以下に列挙する特許及び／又は出願にも関連
し、従って、必要と思われる詳細な記載内容はこれらを
も参照するものである。ステファン エル レディス等
により1987年３月13日に出願された米国特許願第07/02
5,303号明細書“全血サンプルから白血球を分離、識別
及び／又は分析する方法及び試薬系”。ウォーレス ヘ
ンリ クールター等により1987年３月13日に出願された
係属中の米国特許願第07/025,337号明細書“生物学的反
応を強める少量のサンプルを迅速に混合する方法及び装
置”。ウォーレス ヘンリ クールター等により1986年
10月21日に出願された米国特許願第06/921,654号明細書
“粒子の抵抗及びリアクタンスを測定する粒子分析
器”。

1950年台初期における概念では、粒子の計数及び分粒
の原理はウォーレスヘンリ クールターによって発明さ
れ、従って、流体懸濁液で操作される顕微鏡的粒子の電
子計数、分粒、研究及び分析方法及び装置が種々開発さ
れ、米国特許第2,656,508号にも示されている。かかる
従来の配置ではDC電流の流れは個別の本体又は懸濁流体
の空所で粒子を懸濁することによって２つの容器又は空
間に確立されるようになる。２つの本体間の流体接続は
孔を経てのみ行われ、従って、電流の流れ及び流体は孔
内に確立されるようになる。孔及びその中又は周囲の電
界によって感知領域を構成する。各粒子は感知領域を通
過するため、通過中に感知領域の内部のインピーダンス
が変化し、これにより感知領域内の電流の流れ及び電界
が変調され、かかる変化への応答に対し好適に配列され
た検出器に供給すべき信号を発生するようになる。

ウォーレス ヘンリ クールター及びダブリュウ ア
ール ホッグによる米国特許第3,502,974号明細書によ
る顕微鏡的に小寸法の通路を流体懸濁粒子が通過して信
号を発生し、これを検出する粒子分析装置が記載されて
いる。これらの信号は粒子の通過により通路内に生じる
電流の変化に関連し、従って、これらの変化には粒子の
物理的特性を反映する抵抗性及び容量性電流分が含まれ
るようになる。この通路の電流は少なくともある無線周
波数により好適には他の異なる周波数と組合せて電流励
起することによって発生する。しかし、任意の２つの異
なる周波数も好適であり、周波数スペクトル内の位置あ
るいはその位相関係によって、これらの信号を互いに分
離し得る。従ってある粒子に対し少なくとも２つの信号
が取出され、各粒子の１つ以上の物理的特性を確かめる
ために用いられるため、大きさが等しく物質が異なる粒
子でも個別に検出することができる。

ウォーレス ヘンリ クールター及びダブリュウ ア
ール ホッグによる米国特許第3,502,973号明細書（米
国特許第3,502,974号のCIP出願）にはクールター型の粒
子分析装置からのパルス列を受ける２つのチャネルを設
け、各パルスは通常同一の粒子によって粒子分析装置に
生じるコンパニオンパルスを有し、他にパルス間の関係
を表わす信号を発生する手段を設ける。数例では１つの
パルスを特定のファクタに従って減衰し、次いでスレシ
ホルド回路で他のパルスと比較するため、ある範囲のパ
ルスのみが出力信号を発生するようになる。他の例では
スレシホルド対によって電子窓を形成し、各対の一方の
信号を処理して２つの減衰器で減衰し所定範囲の２つの
信号を形成し得るようにする。この範囲内にある信号の
関係によって出力信号を発生し得るようにする。

ウォーレス ヘンリ クールターによる米国特許第4,
527,114には、個別の粒子を装填した液状懸濁流が所定
の通路に沿って進行するフロー室を有するフローセル
と、所定の通路の両側に配置され１方の端部の幅が所定
の粒子の長さよりも短い前記所定の通路に平行となり、
且つ前記端部が前記所定の通路に近接して位置決めされ
た１対の電極と、前記所定の通路を横切る電極対間に電
界を発生する附勢源と、この電界を通過する粒子により
発生する粒子パルスを検出する粒子パルス検出器とを具
える粒子分析装置が記載されている。

又、ミカエル アール グローブ及びウォーレス ヘ
ンリ クールターによる米国特許第4,298,836号明細書
には、液体流内の粒子を水力学的に収束してインピーダ
ンス感知オリフィスに通過させ、低周波電流源によって
前記オリフィスに電流を流して粒子の大きさを表わす信
号を発生し、高周波源によって前記オリフィスに電流を
流して粒子の大きさ及び内部抵抗を表わす信号を発生
し、検出器によって粒子の流さを測定し、デジタル計算
機によって各粒子に対する信号を相関すると共にその形
状ファクタ、偏形又は正常な形状の程度、真の値及び内
部抵抗値を計算するようにした装置及び方法が記載され
ている。

ウィリアム エイ ニュートン及びマーシャル ディ
グラハムによる米国特許第4,420,720号明細書には、
個別の粒子を有する液状懸濁流が所定の通路に沿って流
れ、中央対の電極を所定の通路の両側に位置させ、中央
電極を附勢してその間に感知電界を発生させ、２対の外
側電極を１対が前記中央電極の各側に来るように位置さ
せ、外側電極を適宜に配向し、及び／又は附勢してその
電界が中央電極の感知電界の方向に張出して所定通路に
沿う感知電界の幅を狭めるようにした粒子分析装置が記
載されている。更に中央電極間の電界は追加の方向に収
束することができ、且つ、感知電極配置は、孔を有して
も、有さなくても、又、基板の表面でフローセルに実現
することができる。

ジョン ディ ホリンガー及びロール アイ ペドロ
ソによる米国特許第4,515,274には、粒子が通過し分析
される粒子感知孔により流体結合された１対のチャネル
を有するフローセルと、下流チャネルの端部に装着され
てフロー室を画成するノズルと、このフロー室の底部に
導入されて粒子流を水力学的に収束すると共にこれを前
記ノズルから流体ジェットに噴流するシーズ液体と、前
記流体ジェットからの点滴を形成したのち、この点滴を
分類するシステムとを具え、粒子の流れで光学及び電気
インピーダンスを同時に測定する貫流型粒子分析及び分
類装置が記載されている。

更に、ロバート シィ ライフによる米国特許第4,34
8,107号明細書には、光学的に球体な素子の内側に位置
するオリフィスを通るフロー流に懸濁された粒子を光学
的且つ電気的に同時に測定する電気−光学変換器が記載
されている。

（明細書中の術語の説明） 本発明において云う“ヒストグラム”とは、変数をＸ
軸にプロットし、周波数をＹ軸に“＃”としてプロット
した２次元のグラフで示す単一変数に対する周波数分布
のグラフを意味するものとする。又、このヒストグラム
はコンピュータその他電気回路内に示されるグラフの要
約数値表をも意味するものである。

“マトリックス”とは、１つの変数をＸ軸にプロット
し、他の変数をＹ軸にプロットし、周波数又は計数値を
等一計数輪郭として示し、２つの変数に対する周波数分
布のグラフを意味するものとする。従って１つの等一計
数輪郭は集団のアウトラインを示す。又、マトリックス
は、コンピュータその他の電気回路内に示されるグラフ
の要約数値表をも意味するものである。

“パラメータ”とは、独立変数と同義語であり、従っ
てフロー細胞計測計で分析される粒子又はセルから得た
独立の測定値でもある。これがため、２つ以上のパラメ
ータを数学的に組合せて他のパラメータを形成する。

“ゲーティング”とは、１つ以上の他のパラメータを
質問しながら、多重パラメータデータから１つのパラメ
ータのヒストグラムを形成する際に用いるフィルタ処理
を意味するものとする。フローセルを通る単一白血球の
通路であり、パラメータ変換器によるセル測定である各
イベントに対し、ゲーティングに用いるべき各パラメー
タに相当する測定値を１つ又は２つの基準値又はスレシ
ホルド値と比較し、スレシホルド値以下、以上又は２つ
のスレシホルド値間に比較値がある場合“テストされ
た”と称する。このテストによって考察すべきゲーティ
ングパラメータの全部に対して真理値の結果が生じる場
合には、イベントはヒストグラム内に含まれるようにな
る。又、ゲーティングはマトリックスを構成するために
も用いられる。従ってゲーティングを用いることによ
り、多重パラメータデータの分析及びグラフ表示を簡単
化することができる。

“小角光散乱"LALSとは、レーザビーム軸に対し０゜
を含み、10゜以下で得られる光散乱信号を意味するもの
とする。又、“大角光散乱"HALSとは、レーザビーム軸
に対し90゜で得られる光散乱信号を意味し、“中角光散
乱"MALSとは10゜〜70゜の角度で得られる光散乱信号を
意味するものとする。

“ビームダンプ”とは、レーザビーム及びフローセル
間の交差により光検出器を横切る水平ラインとして一般
に現われ、検出した光散乱信号を劣化する不所望なレー
ザ光を除去するための障害物を意味するものとする。

“マスク”とは、不所望な小角光散乱信号、０゜、即
ち軸上レーザ光信号を除去し、光検出器にこの信号が受
光されるのを防止する円形又は楕円形障害物を意味する
ものとする。

又、光散乱角とは、孔又は感知領域内にセルが存在す
る光の角度を意味するものとする。光検出器構体に当る
散乱光の角度は、サンプル希釈流、及び／又は水力学的
シーズフロー流体、空気その他のパラメータの屈折率の
相違、及びスネルの法則によるフローセル10のアーキテ
クチュアにより、孔内の真の角度とは相違する。

（実施例） 第１図は本発明方法及び装置を用いる粒子分析装置の
一例を示す。第１図の装置は細長円筒形部材をフローセ
ル10として具える。このフローセル部材10は例えば熔融
シリカ、石英又はサファイヤのような任意の光学的に透
明な材料で造ることができる。フローセル部材10の内部
は、生物学的セルサンプルが既知の手段（図示せず）に
よって水力学的集束流14として通過又は流れる狭い頸部
状孔12を除き、その長さ全体に亘り円筒形状とする。フ
ローセル部材10の外壁表面15は円筒形とすると共に後に
詳細に示す光学的平坦面を設ける。レンズ系18によって
好適にはレーザ22からの電磁光エネルギーのビーム20を
前記孔12の箇所でスポットに集束する。好適な例ではこ
のレーザは632.8nmで発光するヘリウム−ネオンレーザ
とする。他の波長、例えば、488nmで発光するレーザを
用いても後述するように同様の結果を得ることができ
る。散乱放射リセプタとして作用する光検出器構体24は
レーザ放射光の光軸26に直角な面に前記光軸26を中心に
位置決めする。光検出器構体24は光検出器25で構成し、
これに前述したマスク28及びビームダンプ30を設ける。
光検出器25は任意の光感応電気装置、例えば、光電子増
倍管とすることができる。本例ではこの光検出器25をバ
クテック社製のVTS3081型のシリコン起電型検出器とす
る。

光検出器構体24の中央部分には前述したように光散乱
マスク28を設ける。この光散乱マスク28は円形、楕円
形、その他前述したように種々の異なる寸法・構造のフ
ローセル10から等価の光散乱信号を得るに必要な形とす
ることができる。光散乱マスク28はレーザ光ビーム20と
同軸的に配向する。いわゆるビームダンプ30は図示のレ
ーザビームと対向して光検出器構体24を水平方向に横切
って延在させるようにする。このビームダンプ30は後述
するように中心軸線から僅かに角度的に広げて雑音出力
に対しクリーナ信号を供給し得るようにする。

第1A図は頸部状孔を水平に切断した場合の第１図のフ
ローセル10の頂面を示す。光検出器構体24はレーザ光ビ
ーム軸線26に対し中心に位置決めしたマスク28と共に示
す。ビームダンプ30は第1A図には示さない。集束流14の
セルを質問した後又はセルに当たった後頸部状孔12の第
１図の左側背後から出る光は漏斗状に拡開して“光散
乱"32となる。マスク28及びビームダンプ30の角度的配
向を適宜定めて、光散乱出力32が一般にレーザ光軸に対
し60゜の角度範囲に亘って、即ち、40゜±30゜、又は、
ほぼ10゜から70゜の角度に亘って受光し得るようにす
る。これがため、第１図の左側で順方向に０゜を通りレ
ーザビーム光軸26からほぼ40゜を中心とする角度範囲を
得ることができる。この光学的な配置によって±30゜の
捕集範囲が得られ、これによりレーザビーム光軸からほ
ぼ10゜〜70゜の環状部分を得ることができる。

上述した所から明らかなように本発明によれば、図示
のようにフローセル、即ち、トランスデューサ10の前面
に位置するほぼ平坦なプレーナ光検出器構体24を用いる
ようにする。この光検出器構体24には丸い即ち、円形の
マスク28を設けて前述したように10゜よりも狭い小角光
散乱を除去又は防止し得るようにする。更に、実際的な
構成の目的に対しては水平ビームダンプ30をマスク28に
結合する。後者は中央よりも両端部が大きく、即ち、幅
広となる蝶ネクタイの形状とすることができる。水平ビ
ームダンプ30を用いて、セル又は粒子がセルチャンバ10
を流れるにつれて、システムがセル又は粒子位置に僅か
に感応する水平方向に伸長又は平坦化するようにレーザ
光ビームを整形する状態に対する光学手段を組込むよう
にする。これがため、この光学的整形によって、光散乱
信号出力を電気的に利用する際に用いる一層均一な光出
力信号を得ることもできる。

第1C図は第１図に示す光検出器構体24の正面図であ
る。第1C図には円形マスク28、ビームダンプ30及び光検
出器25の露出表面を示し、これにより中角光散乱（MAL
S）信号を発生させるようにする。第１図に示さない追
加の項は鎖線600であり、これにより中角光散乱信号を
角度信号の２領域602及び604に分割する。鎖線600は20
゜で散乱する光が光検出器25の表面に入射する位置を示
す。フローセル10の幾何学的形状及び前述した他のファ
クタに依存し円形又は放物線形として表わし得る鎖線60
0によって、中角光散乱信号を受ける方向に円筒形頸部
状孔12及び円筒形外面15を有する好適例として示すフロ
ーセル10を用いる場合には、第1C図に示すように光検出
器25の表面に放物線形を描き得るようにする。

マスク28及び鎖線600間の領域602は10゜及び20゜の角
度内で散乱する光を受ける。この領域602は“15度LS"と
称され、以下“下側中角光散乱”（LMALS）と称する。
鎖線600及び光検出器25の外縁部によって画成された領
域604は20゜及び65゜の角度内で散乱された光を受け、
この領域604を以下“上側中角光散乱”（UMALS）と称す
る。

この記載において、血液細胞は第１図に示すフローセ
ル10の頸部状孔12を経て１つずつ通過するものとする。
血液細胞又は他の粒子がフローセル10内に導入される手
段及びこの血液細胞の多重パラメータデータを得ると共
に処理して分類を行う手段を詳細に示す完全なシステム
の説明を以下に行う。頸部状孔12を通るほぼ生の状態の
白血球は前述したように10゜〜70゜の中角度範囲で光を
散乱する。好酸球は上側中角光散乱（UMALS）、即ち、
第1C図の領域604の好中球よりも光を一層散乱する。好
中球は上側中角光散乱領域604のリンパ球、好塩基球及
び単球よりも光を一層散乱する。領域602として示され
る下側中角光散乱領域（LMALS）では好酸球及び好中球
は同程度の光を散乱し、領域604では好酸球を好中球か
ら区別することができるが領域602ではできない。リン
パ球、好塩基球及び単球によって散乱された光の量に対
する好中球によって散乱された光の量は上側中角光散乱
（UMALS）領域604よりも下側中角光散乱（LMALS）領域6
02のほうが著しく大きい。下側中角光散乱領域602及び
上側中角光散乱領域604を組合わせて単一の中角光散乱
（MALS）測定領域を形成することにより３つの群、即
ち、光散乱信号の振幅の降順に、好酸球；好中球；並び
にリンパ球、好塩基球及び単球間の最大差を測定するこ
とができる。

完全な中角光散乱の上側中角光散乱（UMALS）サブセ
ットにより生じる結果は以下同様であるため、中角光散
乱（MALS）に対する基準は完全な中角光散乱測定又はそ
の上側中角光散乱（UMALS）サブセットに対しても適用
することができる。同様に、後述する回転光散乱、RLS
は完全な中角光散乱又は上側中角光散乱信号を用いて計
算することができる。後述する溶解剤により白血球を処
理することによりその下側中角光散乱信号の振幅によっ
て好中球から好酸球を識別することができる。上側中角
光散乱信号の種々の上述したセルの種類間の関係は殆ど
不変である。

（発明の変形実施例） 本発明は多くの変形が可能である。本発明装置のかか
る変更例を第1B図に示す。本例では平坦な内面40及び42
を有する“正方形”の石英孔38を設ける。光検出器構体
24は第1B図に示すように位置決めすると共にその構成は
第１図の光検出器構体24と同様とする。石英、空気、及
びサンプル流体等の屈折率は種々異なっているため、光
はスネルの法則に従って屈曲する。この場合第1B図の左
側のフローセルの後部から出る光線48はフローセル10の
コーナの界面により小さな死点50でビーム光軸に対し大
きな角度で屈曲する。その他の角度は、光検出器構体24
の表面の角度十字が捕集されていても粒子及びセル計数
並びに分類に対し興味あるものとなる。

他の例では、前述した第１図に示すフローセル10の第
1A図と同様の頂面図を第２図に示す。本例では１個又は
２個の光検出器構体34、36を順方向にレーザ光軸26から
45゜のラインに直交しサンプル流14の軸に平行に位置決
めし得るようにする。光検出器構体34、36からの出力信
号は電子制御回路で加算して信号対雑音比を増大し得る
ようにする。

第2A図は第２図のフローセル10の側面並びに光検出器
構体34及び36の位置を示す。斜線で示す区域はビーム整
形光学装置18及びフローセル10の組合わせによって発生
したレーザ光の水平パターンに対するビームダンプ30に
よりマスクされた部分である。

第３図の例は本発明の更に他の例を示す。本例では第
1B図に示す“正方形”孔を有するフローセル10を第２図
の光検出器構体34、36の一方又は双方と組合わせる。こ
の光線は前述したように湾曲しているが、本例で得られ
る光散乱信号は第２図に示す例で得られる光散乱信号と
同程度に有効である。本発明の他の例を第４図に示す。
本例ではフォトダイオードセンサ52、54及び56は正方形
の孔38の側面及び前面に位置させる。前側のフォトダイ
オード54の前面には円形マスク58を位置させてレーザ光
の散乱の下側10゜をブロックすると共に暗い区域60を残
存させるようにする。第３図の構成の場合と同様に、ス
ネルの法則により暗い区域62及び64がレーザ光軸の各側
の隅部に存在するようになる。第４図には示さないが第
１及び２図に示すビームダンプ30をこれらフォトダイオ
ードセンサ52、54及び56の全部に対し用いるようにす
る。

（発明の作用） 本発明では、中角光散乱信号（MALS）の外に少なくと
も７つの他のパラメータ、即ち、DC,RF,不透明度、RLS,
NALS,ALL及びMALSのサブセットである15度LSを用い得る
ようにする。

DC及びRFは孔インピーダンスセル検知のクールターの
法則に関連するものである。DCは直流電流又は低周波電
流を供給して細胞膜が浸透せずセルに電流が流れないよ
うにして得られたパルスピーク信号として定義する。DC
パルスのピーク振幅はセルボリュームの関数である。RF
は高周波電流を供給して細胞膜が浸透しセルに電流が流
れるようにして得られたパルスピーク信号として定義す
る。RFはセルボリュウム及び内部導電度の関数である。
“不透明度”は個別のセル測定又はイベント毎にRF信号
データをDC信号データで除算して得た信号値、即ち、デ
ータとして定義し、大きさに無関係で内部導電度の関数
である新たな細胞パラメータを形成し得るようにする。

回転光散乱（RLS）は中角光散乱信号（MALS）の対数
から得たパルスピーク信号と定数との和を前述したDCと
定数との和で除算する関数として定義する。回転光散乱
（RLS）を形成する回路の詳細な例は後に説明する。こ
のRLS関数は大きさの成分を除去する効果を有し、これ
により内部構体に一層関する測定を行い得るようにす
る。RLSを得る他の方法はMALS信号データの対数をDC信
号データの対数で除算することにある。小角光散乱（LA
LS）のサブセットである狭角光散乱（NALS）は、順方向
にレーザビーム光軸から0.5゜〜２゜の角度範囲として
文献に定義されている。軸線方向の光損失（ALL）は、
フローセル10内に存在し、レーザビームのみを通過させ
る大きさの小孔を通過した後のレーザビームと整列して
光検出器を配置し、その後感知領域12を通る粒子又はセ
ル流による信号の振幅変化を増幅することにより得た信
号である。NALS及びALLの双方はセルの大きさに強く影
響され、従って、DCに対する置換として用いることがで
きる。15゜LSは、レーザビーム光軸から15゜、かつ、±
５゜の入射角の環状範囲でのみ光検出器に光をあてるこ
とによって得たMALSのサブセットとして定義し、これに
よりレーザビーム光軸を中心として10゜〜20゜の環状部
分を形成し得るようにする。NALS、ALL及び15度LSは後
に説明する。

“生の”染色されていない白血球を用いることによ
り、前述したハードウエアによって種々のセルクラスタ
又はポピュレーションが一般に図示の個別のクラスタと
して表示される第７〜27図のヒストグラムを得ることが
できる。この際、パラメータ１及び２の組合わせを用い
てRLSパラメータを形成する。図示のように、リンパ
球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球は個別のクラス
タとして表示される。８個のパラメータの各々は個別の
図により後に詳細に説明する。

本発明の流体及び電気制御回路を第５図のブロック図
に示す。このブロック図に示すサンプル容器70は試験
管、キュベット又は検査すべき物質、本例では所定量の
“生の”又は非細胞化学的に染色された白血球を保持す
る好適な同様の手段とすることができる。本例ではフロ
ーセル10を標準のクールターエレクトロニクス社のサン
プリング弁74によって一定量の全血と共にアスピレータ
ニードル72を介して供給する。サンプルのほぼ28μを試
薬パッケージ区分78から導管82を経て混合室80に溶解剤
76と共に押出し−混合する。混合室80では全血液細胞サ
ンプル及び溶解剤を、ウォーレス ヘンリー クールタ
ー等により1987年３月13日に出願された係属中の米国特
許願第07/025,337号明細書“生物学的反応を増強する少
量の血液の迅速混合方法及び装置”に記載され、示され
ている混合アクチュエータ84の制御の下に、ほぼ５〜６
秒に亘り攪拌−混合する。５〜６秒後、消光液86を混合
かつ溶解したサンプルに加えると共に混合を他の５〜６
秒に亘って更に継続する。かくして形成したサンプルを
用意するものとする。ここに言う“かくして形成した”
とは溶解剤76が赤血球及び血小板を溶血してほぼ“生
の”白血球サブポピュレーションが残存することを意味
するものとする。又、ここに言う“用意する”とは消光
液86が溶解活動を終了し、次の分析に対する白血球及び
その浮遊媒体を条件付けると言うことを意味する。溶解
及び消光の手法及び詳細は、ステファン エル レディ
ス等が1987年３月13日に出願し、本願人に譲渡された係
属中の米国特許願第07/025,303号明細書“全血サンプル
からの白血球の分離、識別及び／又は分析方法及び試薬
システム”に記載されている。或は又、第５図に示すよ
うに、作動のいわゆる“プレープレプ”モードを用いる
手段を設ける。

このモードでは、例えば、遠心、密度又はバフィコー
ティング技術を用いてサンプルから赤血球を除去するこ
とにより純粋な白血球サンプルを得るようにする。サン
プルは前述したように得られるが、プレープレプライン
87を経て混合室80に通過させ、その後セル流室10に導入
する。これから明らかなように、システムは溶解、消
光、その他所望の出力結果を得る任意の試薬を必要とし
ない。次いで、混合を停止して、混合室80を流体及び気
体供給ブロック88から加圧する。次いで混合サンプルを
小径導入管90を経てフローセル10の入口92に供給する。
このフローセル10には一対の電極94及び96を設け、これ
ら電極は後述するように孔即ち、オリフィス12の両側に
配設する。孔12及びフローセル10は第１図につき説明し
たものと同様とする。これがため、フローセル10は後述
するように電子的及び光学的なセルの分析を同時に行う
ことができる。これらセルはシースフリュイッド98によ
って水力学的に集束することができ、既知のように孔の
中央を通過させることができる。サンプル物質及びシー
スフリュイッドは出口部99を経てセル室から流出し、廃
棄容器100に導入する。

ヘリウム−ネオン（HeNe）レーザ22は比較的低出力、
例えば、0.8mであり，レンズ系18内に向けることができ
る。このレンズ系18は２つの交差−円筒形レンズを具え
る。レンズ系のレンズの焦点距離は、これを適宜選定し
て、前述したごとくビームを水平方向に伸張するように
偏球又は細長状態の光ビーム20を発生し得るように互い
に作動させる。この光学配置によって光学出力を妨害す
ることなく光路を僅かに変位させるようにする。

電気ソースユニット102によってRF及びDCの電流源、
検出手段及び増幅手段を形成する。発振−検出器101か
らの無線周波電流及びDC源103からの直流電流は結合回
路105内で加算すると共に孔12を流れる電流を確立する
ライン111を経て電極94及び96に供給する。孔12を流れ
る粒子又はセルによって孔12のインピーダンスを瞬間的
に変化し、孔を流れる電流のRF及びDC成分を変調する。
このインピーダンス変化によって生じるRF電流の変調を
フィルタ処理し、結合回路105を経て発振−検出器101に
供給し、これにより検出したパルスをRF前置増幅器107
に供給して、この前置増幅器によって“RF"パルス118を
出力する。これと同時に、インピーダンス変化によって
生じた直流電流の変調をフィルタ処理し、結合回路105
を経てDC前置増幅器109に供給し、これにより“DCパル
ス"116を出力する。電気ソースユニット102の上述した
記載はウォーレス ヘンリー クールター等により1986
年10月21日に出願され、本願人に譲渡された係属中の米
国特許第06/921,654号“粒子の抵抗及びリアクタンスを
測定する粒子分析装置”に記載されている。この電気ソ
ースユニット102は同一結果が得られるものであれば他
の任意の設計とすることができる。本発明の幾つかの例
ではDCのみを用いRFは用いない。従って、これらの場
合、電気ソースユニット102はDC源103及びDC前置増幅器
109のみを設けるようにする。

第５図では散乱光検出器構体24をレーザビーム光軸26
を中心としてマスク28及びビームダンプ30と共に位置決
めして第１〜４図につき説明したようにレーザ雑音及び
レーザ光軸に対し小角順方向光散乱、即ち、10゜以下の
散乱光を除去し得るようにする。光検出器構体24によっ
てMALS又は10゜〜70゜の環状光捕集範囲を捕集して、交
換し、孔12でレーザビーム20を通る粒子又はセルを表わ
すパルスの状態の信号を発生し得るようにし、これらパ
ルスを前置増幅器104の出力とする。

第5A図に示すように３つの電気出力は電気−光学シス
テム、即ち、DC,RF及びMALSによって電気パルス116、11
8及び120として発生する。これらパルスを個別の増幅器
124、122及び126に供給し、これら増幅器にはDC再生の
ようなフィルタ及びパルス整形回路を設ける。次いで、
増幅器の出力を個別のピーク検出回路130、128及び132
に供給し、ここで個別の信号のピーク検出を行い、その
後各ピークの電圧を個別のアナログ−デジタル変換器13
4、135及び138に夫々供給する。増幅器126によって対数
応答を行い、パルスピーク検出回路132の出力がMALSの
対数に比例し得るようにする。

アナログ−デジタル変換器からの出力を、後に説明す
るように、更に信号処理を行うためにデータ処理装置14
0、例えば、IBM PCに供給する。ストリップ又はチケッ
トプリンタ142をデータ処理出力144の一つに結合し得る
ようにすると共に、第２出力146によってホストデータ
処理装置140からの信号をグラフィックプリンタ148に供
給し得るようにする。例えば、CRTのような可視モニタ1
50を設けてホストデータ処理装置140により処理される
データの状態を瞬時的に見得るようにする。

市販されている除算回路154はDCピークパルス及びRF
ピークパルスを受けるように結合し、DC出力を除算回路
154の分母に供給し、RF出力を除算回路154の分子に供給
する。これがため除算回路154の出力ライン160によって
“不透明度”を表わす信号を発生し、これをA/D変換器1
72に供給する。

第5B図に詳細に示す機能回路161によって“回転光散
乱”又はRLS 170を発生する。第5B図においては、DCピ
ーク検出器出力152を減衰率Ｋの減衰器155に接続する。
次いで、この減衰されたDCを加算回路166の一方の接続
点に接続する。一定のオフセット電圧V2 153を加算回路
166の他方の接続点に供給し、その出力をアナログ除算
回路162の分母入力端子に供給する。光散乱の対数、LL
S,出力164を加算回路168の一方の入力端子に供給する。
一定のオフセット電圧V1 165を加算回路168の他方の入
力端子に供給し、その出力をアナログ除算回路162の分
子入力端子に供給する。機能回路161の出力170は次式で
示すように定義することができる。

RLS＝（LLS＋V1）／〔（DC/K）＋V2〕 例えばピーク検出器の出力範囲は０〜＋10Vであり、
Ｋは減衰率５に設定し、V1は−4.83Vに設定し、V2は＋
4.0Vに設定する。アナログ除算回路162の出力170は全ス
ケールとなるようにし、又、その２つの入力が比１を有
する場合には＋10Vとなるようにする。RLS出力170をア
ナログ−デジタル変換器174に供給する。或は又、RLSパ
ラメータをデジタル論理回路により取出すことができ
る。

第5,5A,及び5B図の回路配置によって３つの生のパラ
メータDC,RF及び光散乱並びに２つの計算され、回転さ
れ、又は取り出されたパラメータ、即ち、“不透明度”
及び“回転光散乱”を得ることができる。これにより好
適な例のシステムによって５つの個別の粒子集団を後述
するように検査することができる。

５つの主信号:RF,不透明度、DC,RLS及びMALSをオシロ
スコープ切換制御及び集団識別回路180に供給し、これ
により、信号をデータ表示オシロスコープ186のＸ及び
Ｙ軸182及び184に供給する。又、輝度パルス178も、セ
ルデータが存在する度毎にオシロスコープ186に供給す
る。データ表示オシロスコープによって実時間軸で任意
の２つのパラメータからデータを表示することができ
る。回路180ではアナログ比較器によって、これらパル
スの値により表わされるデータに対しゲート機能を呈
し、次いで、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球及び
単球として夫々識別される副集団を表わす５つのカウン
タ188、190、192、194及び196のうちの一つを増分す
る。これがため、セルの種類に応じ個別のカウンタを増
分するが、グラフプリンタ148又はチケットプリンタ142
によって可視研究及び／又は診断に対する実際のセル副
集団のヒストグラム及びマトリックスを形成することが
できる。

前述したように、本発明システムは、クールタ型の孔
を用いることなく、又、クールタDC又はRF信号処理を用
いることなく、生物学的セルの副集団に関する有効なデ
ータ及び信号を得ることもできる。

第６及び6A図に示すシステムは、第5,5A,及び5B図に
つき説明した所と同様のサンプル取入れ及び／又は準備
を用いる。フローセル10の左側の各部分は第5,5A,及び5
B図の構成部分と同一であるため、同一符号を付して示
す。

第6A及び6B図のシステムで光学的に異なる部分には、
鎖線により囲まれ、電気的パラメータDC及びRFの感知及
び処理に関連する構成部分を含む区分は示さない。第6C
図に分解斜視図で示す構体はフローセル199を示し、こ
のフローセルは、クールタ型の感知孔12及び関連する電
気的（DC及びRF）感知用電極94、96を必要とせず、250
μｍの内部断面を有する細長く、均一で、正方形の石英
チャネル（その一例はバイオハザードフローセルとして
クールタエピックスＣ（商品名）に用いられている）で
構成されてい。

第6C図の左側に示すフローチェンバ199の外側ボード
はMALSセンサ200とし、これを２部分の組立体として構
成するが、これを中央に軸方向の孔202を有する単一構
体に構成することもできる。

センサ200の光学的に下流には消光手段即ちマスク204
を設け、これをハードウエアの単一体とすることがで
き、これに複数の光孔206、208、210及び212を設ける。
これら孔206及び212は15゜±５゜の角度に配置し、15゜
用とする。光線211は光検出器214及び216に入射する。
孔208はほぼ15゜〜２゜で軸外れに配置し、狭角光散乱
（NALS）信号を取出し得るようにする。光線226は光検
出器218に入射する。孔210をレーザビーム20に対し光軸
上に配置し、軸方向の光損失（ALL）信号を得るように
する。光線224は光検出器220に入射する。マスク204の
すぐ背後には光散乱信号光検出器214、216、218及び220
を配置して夫々15度光散乱、狭角光散乱、及び軸方向光
損失に関する信号を発生し得るようにする。光散乱セン
サ200、214、216、218及び220の各々によって発生した
電気信号出力は比較的低いため、各出力信号に対し個別
の前置増幅器222、264、266及び228を設け、検出器214
及び216の出力を前置増幅器228により加算する。従っ
て、前置増幅された信号は個別の増幅器230、232、234
及び236で増幅して、個別のピーク検出器238、240、242
及び244に供給する。ピーク検出器の出力側に存在する
各信号パルスの電圧値によって個別の出力信号を個別の
A/D変換器246、248、250、252に供給し、従って、第
５、5A及び5B図に示すようにデータ処理装置（CPU）140
に供給する。

オシロスコープ切換制御及び集団識別回路180は、前
述したように作動するが、MALS信号、ALL信号、NALS信
号及び15度LS信号のみを用いて後述するヒストグラム及
びマトリックスを形成する。

他の例では、第6,6A及び6B図の全部の区分を用いる。
電気的RF及びDC並びに光学的MALS、ALL、NALS及び15度L
Sパラメータは前述した通りである。この場合には追加
のアナログ除算器254を用い、ALL出力信号を除算器254
の分母入力側に供給し、DC出力信号を除算器の分子入力
側に供給する。従って、形成されたALL/DC信号をA/D変
換器に供給すると共に前述したようにオシロスコープ切
換制御及び集団識別回路180に供給する。

かかる装置で得られたALLデータによって、電子セル
ボリューム又はDCボリューム又は本発明におけるDCで得
られたものと近似する相対的セルサイズを測定すること
ができる。ALL/DCの除算を行うことによってあるセル集
団の分類の手助けとなる新たなパラメータを得ることが
できる。

第７〜27図は全血、生の白血球集団及び副集団を用い
る本発明システムの種々の例によって得られた信号のデ
ータを示す説明図である。

次のパラグラフは、セルをDC、RF及びMALSに対する応
答により分類した第５及び5A図に示すシステムブロック
図である。

第７図は第５図の電子−光学システムにより得られた
第１図の装置のMALS出力のヒストグラムである。同一の
データはMALSの対数のヒストグラムを表わす第８図にも
示す。第７及び８図の双方は白血球を３つの群：リンパ
球、単球及び好塩基球301;好中球302;好酸球303に分類
する３つの集団又はピークを示す。垂直実線304及び305
はこれら３つのピークを分離する谷部を示す。

第９図はMALSデータ対DCデータを表わすマトリックス
を示す。第10図は対数MALS対DCのマトリックスを示す。
双方の場合においてスケールが相違するだけでデータは
同一の信号を含んでいる。この場合、５つの白血球集
団、即ち、好中球302、好酸球303、単球306、リンパ球3
07及び好塩基球308が識別できる。２つの実線304及び30
5は第７及び８図の垂直実線に対応する。

第12図はMALSの対数をDCで除算して得たRLSのヒスト
グラムである。このデータは第７及び８図のデータに対
応する。第11図はRLS対DCのマトリックスを示し、その
データは第９及び10図のデータに対応する。MALSデータ
を回転することにより第12図に示すように３つのピーク
301、302及び303間を良好に分離する。第11及び12図に
示す鎖線315及び316は集団間の分離の改善された線を示
し、第10図にも示し比率機能を示す手助けとなる。

第13図は対数MALS対RFのマトリックスを示す。この場
合にも白血球の５つの集団を識別でき、これらは１つの
大きな相違、即ち、好塩基球308が第９、10及び11図に
示す場合よりもリンパ球307から良好に分離されている
ことを除き、第９、10及び11図に示すものと同一であ
る。

第14図はRF対DCのマトリックスを示す。この場合にも
４つの白血球集団、即ち、単球306、リンパ球307、好塩
基球308並びに好中球及び好酸球309より成るクラスタ又
は群を識別できる。DCによってセルボリュームを測定
し、RF測定がDCに対し著しく相関的であるため、RFをDC
で除算することによりボリュームに無関係に、かつ、セ
ルの内部導電度に関し、不透明となる。

第15図は第14図に示すものと同様の４つの集団を有
し、スケールを異にした不透明度対DCのマトリックスを
示す。集団を第15図にライン322で示すように不透明度
により２つの群に分割することができるが同様の分離を
第14図に示すように対角線にプロットした透−不透明ラ
イン322を有するRF又はDCのみによって行うことはでき
ない。ライン322の使用について説明する。

第12図にライン315で示されるものよりも値が少な
く、かつ、不透明度対角線DCのマトリックスを発生する
RLSをゲートすることにより第16図に示すデータを得る
ことができる。第12図にライン315の左側に示すこれら
の白血球集団、即ち、単球306、リンパ球307及び好塩基
球308を第16図に示す。水平鎖線314によって他の２つの
集団307−308から単球306を分離する。実線322によって
好塩基球308からリンパ球307を分離する。ライン314及
び322を得る方法を以下に示す。第17図では第16図のデ
ータに対するDCのヒストグラムによって２つの群、即
ち、単球306とリンパ球及び好塩基球のクラスタ310とを
含む２つのピークを示す。このデータは第12図のライン
315で示されるものよりも値が大きく不透明度対DCのマ
トリックスを発生するRLSをゲートすることによって得
ることができる。これら２つのピーク間の谷部を第17図
の鎖線314によって確認する。又、このライン314は第1
0、11及び16図にも示す。第17図には異常に低いボリュ
ームのリンパ球に対応するピーク315をリンパ球及び好
塩基球の和のピーク310の左側にライン334により分離し
て示す。

第11図においてライン315よりも値が低いRLSをゲート
し、ライン314よりも値が低いDCをゲートして不透明度
のヒストグラムを発生させる場合には第18図に示すよう
に２つのピーク、即ち、リンパ球307及び好塩基球308を
ライン322により分離する。異常に低い不透明なリンパ
球を表わす第３ピーク332は正常なリンパ球307の左側に
ライン340で分離して示す。

第19図は全部の白血球に対するRLS対DCのマトリック
スを示す。このマトリックスは第11図に示す集団の全部
を含むと共に異常の場合にのみ生じる余分の白血球集
団、即ち、好中球302と部分的に重畳する未熟の顆粒球3
12、ライン334により正常なリンパ球307から分離された
低ボリュームのリンパ球330及び高光散乱リンパ球、損
傷した好中球又はこれらの双方より成りライン336によ
って正常な好中球302から分離された集団又はクラスタ3
24を含む。

第19図に示すように、不透明度対DCのマトリックスを
発生し、ライン315及び316間のRLSをゲートすることに
よって第20図に示す次の集団、即ち、正常な成熟した好
中球302、未熟な顆粒球312、高光散乱リンパ球326及び
損傷した好中球328を得ることができる。双方ともライ
ン336により成熟した好中球302から分離され、ライン33
8により互いに分離された最後の２つの集団は第19図に
１つの集団として現れる。

第24図はライン315よりも値が低いLRSを第19図に示す
ようにゲートして得た不透明度対DCのマトリックスを示
す。実録は正常の集団、即ちリンパ球307、好塩基球308
及び単球306であり、これらは鎖線314により最初の２集
団から離間されている。このデータは第16図に示すデー
タと等価である。又、鎖線は、２つの異常な集団、即ち
他の集団の全部からライン334により分離されている低
ボリュームのリンパ球330及び第19図の正常のリンパ球3
07と完全に重複している低不透明なリンパ球322であ
る。

第５及び5A図に示した装置の実施例によって得られた
第７〜19図に示したデータの先の説明から、DC,RF及びM
ALSを用いることによって白血球を少なくとも５つの集
団に分類する方法を次に説明する。

1.第12図のRLSのヒストグラムを発生させ、分離ライン3
15及び316を求める。好中球302及び好酸球303を計算す
る。

2.ライン315より小さい値に対するRLSをゲートオンさ
せ、第17図のDCヒストグラムを発生させ、分離ライン31
4を求める。単球306を計算する。小容積分離ライン334
を求め、異常に小容積のリンパ球300が存在する場合に
これを計算する。

3.第12図においてライン315より小さい値に対しRLSをゲ
ートオンさせ、第17図に湿したごとくライン334及び314
の間の値に対しDCをゲートオンさせ、次で第18図の不透
明ヒストグラムを発生させる。分離ライン322を求め、
リンパ球307及び好塩基球308を計算する。ライン340を
求め異常な低不透明リンパ球が存在する場合これを計算
する。代案として、ガウス又は正規分布曲線をリンパ球
ピーク307に適合させ、ピーク307を除去し、リンパ球30
7、好塩基球308及び低不透明リンパ球332を計算する。

4.第19図の315及び316間の値に対するRLSをゲートオン
させ、DCヒストグラム（図示せず）を発生させ、第19図
に示すごとく、他の異常集団324から正常な好中球302を
分離するライン336を求める。

5.ライン315及び316間の値に他のRLSをゲートオンさ
せ、かつ第19図のライン336より大きい値に対しDCをゲ
ートオンさせ、不透明ヒストグラム（図示せず）を発生
させ、正常な好中球ピーク302を識別し、第20図に示す
ごとく、正常な未熟の顆粒球を左へ計算する。

6.ライン315及び316間の間に対するRLSをゲートオンし
第19図のライン336より小さい値に対しDCをゲートオさ
せ、不透明ヒストグラム（図示せず）を発生させ、ライ
ン338を計算し、第20図に示すごとく、光散乱リンパ球3
26を左へ計算し、かつ損傷された好中球を右へ計算す
る。

第5,5A図及び5B図の他の実施例はMALS、DC及びRLSを
用いる。その場合電源ユニット102はDC電源103及びDC前
置増幅器109だけで構成する。発振器−検出器101、RF前
置増幅器、結合回路105、増幅器122ピーク検出器128、
除算路154、アナログ−デジタル．コンバータ136及び17
2はRFに関連し、従って使用されない。第11図は先に述
べたごとく、５つの白血球集団と共にDC対RFのマトリッ
クスを示す。DC及びMALSを用いて、前記白血球を少なく
とも５つの集団に分類する方法を次に述べる。

1.第12図のRLSのヒストグラムを発生させ、分離ライン3
15及び316を求める。好中球302及び好酸球303を計算す
る。

2.ライン315より小さい値に対RLSをゲートオンさせ、第
17図のDCヒストグラムを発生させ、分離ライン314を求
める。単球306を計算する。

3.ライン315より小さい値に対RLSをゲートオンさせ、か
つライン314より小さい値に対しDCをゲートオンさせ、R
LSヒストグラム（図示せず）を発生させる。リンパ球及
び好塩基球を識別しかつ計算する。

第５、5A及び5B図の他の実施例ではRF及びMALSのみ使
用する。その場合すべてのDC関連要素即ちDC電源103、D
C前置増幅器109、増幅器124、ピーク検出器130、除算回
路156、アナログ関数回路151アナログ−デジタルコンバ
ータ134,172,174は省略される。第13図のlogMALS対RFマ
トリックスは５つの白血球集団、即ちリンパ球307、好
塩基球308、単球306、好中球302及び好中球303を示す。

次に第６図の第１部分に記載したシステムブロック図
を参照しこれは光学的測定のみからなりかつDC又、RF測
定を必要としない細胞化学流システムに関連しクールタ
（Coulter）式開口、破線によって囲まれた要素は設け
ない。

狭い角度の光散乱及びMALSのlogを用いる第6,6A及び6
B図の実施例では４つの集団の白血球差分計算値を得る
ことは可能である。

第21図を参照するに、logMALS対狭い角度の光散乱MAL
Sのマトリックスは４つの集団即ちリンパ球307、単球30
6、好中球302及び好酸球303を明瞭に示し、第５の集
団、好塩基球308はリンパ球307及び単球306とオーバー
ラップする。

第22図に示したlogMALS対ALLのマトリックスを発生す
るMALS及び軸方向光損失のみを用いる第6,6A及び6B図の
他の実施例では５つの白血球集団即ちリンパ球307、好
塩基球308、単球306、好中球302及び好酸球303を識別出
できる。他の細胞形式から好中球302を区別するのにゲ
ーティングライン304及び317を使用できる。ライン317
はlogMALSをALLで除算しこれに基づくデータの回転によ
って見いだすことができる。

15度LS及びALLのみ使用する第6,6A及び6B図の実施例
では第23図が得られる。

第23図は15度LS対ALLのマトリックスを示す。５つの
白血球集団が検出され、第22図と類似のパターンが現
れ、唯一の例外事項は第23図における好中球302及び好
酸球303間の分離が第22図におけるほど良好でないこと
である。15度LS及びALL自体によっては好中球302及び好
酸球303を区別できない。双方の測定を組み合わせるこ
とが必要になる。ゲーティング又は分離の最良ライン31
8は15度LSをALLで除算することによって得られる対角線
である。ゲーティングライン319によって好中球302並び
に３つの細胞集団306、307及び308が分離されこのライ
ンはMALS又はlogMALSにおけるライン304に類似してい
る。

次に第６、6A及び6B図に示したシステ全体で得られる
データを説明する。

少なくともDC,MALS及びALLを用いる第6,6A及び6B図に
示したごときシステムにおいて白血球を５つの集団に分
類する方法を第11、25、26及び27図について説明する。

第25図はALL対DCのマトリックスを示す。ALLはDCと極
めて高い相関を有するから３つの血球集団のみ識別する
ことができ、即ちリンパ球307、好塩基球308並びに単
球、好中球及び好酸球320を識別できる。これら２つの
測定の比によって独立のパラメータが生ずる。

第26図はALL/DC対DCのマトリックスを示し上述したの
とちょうど同じ集団を示すが、回転により一層大きい分
離が特にリンパ球307と同じ好塩基球308間において見い
だされる。

先に述べたごとく、好中球302と好酸球303はRLS対DC
によって識別及び数えることができる。（第11図）。第
17図に示したDCヒストグラムは第11図に示したライン31
5より小さい値に対しRLSをゲートオンすることにより発
生する。このDCヒストグラムではライン314によってリ
ンパ球及び好塩基球を含むクラスタが単球306から分離
される。次いで単球が計算される。最後に第11図に示す
ごとく、ライン315により小さい値に対するRLS及びライ
ン314より小さい値に対するDCの双方につきゲートオン
することにより第27図に示した２つの集団、即ち好リン
パ球307及び好塩基球308が生ずる。

以上、少なくとも５つの生物細胞集団への分析を行
い、診断の目的のためのヒストグラム及びマトリックス
のごとき集団に対応するデータを表示するための純光学
式及び電気・光学式の双方が可能な新規で、従来技術か
ら容易に遂行できない技術及び装置について述べた。

さらに本発明の特許請求の範囲に記載した以外の、本
発明の方法及び装置について、以下に列挙する。

1.光線を選択的に吸収する前記消光手段は、ある角度を
もって配置された複数の開孔を有し、前記光線が集光手
段に入射する前に、所定角度の光線は、これら開孔を通
過する如くしたことを特徴とする請求項１記載の装置。

2.クールターDCボリュームの第１信号を発生する第１電
子回路手段を有し、本第１電子回路手段は、光捕捉手段
よりの10゜ないし70゜の範囲の中角出力信号を使用し
て、中角光散乱の対数（log of MALS）の第２信号を形
成し、該第１及び第２信号より回転光散乱（RLS）とな
る第１出力を形成する請求項１記載の装置。

3.クールターRF信号の第３信号を形成する第２電子回路
手段を有し、クールターDCボリュームの前記第１信号と
クールターRFの第３信号を用いて不透明度を表わす第２
出力を発生することを特徴とする請求項１記載の装置。

4.回転光散乱（RLS）の第１出力が好酸球とは別の好中
球の白血球副集団およびリンパ球、単球及び好塩基球の
３つの副集団群を特定するデータを発生させ、クールタ
ーDCボリュームの第１信号が該３つの副集団より単球を
分離するデータを発生させ、不透明度の第２出力が前記
３つの副集団群よりリンパ球及び好塩基球を分離するデ
ータを発生させ、このようにして好酸球、好中球、単
球、リンパ球及び好塩基球の５つの白血球副集団を識別
するようにしたことを特徴とする請求項１記載の装置。

5.クールターRF信号の第１信号を発生し、かつ第２信号
を発生する第１電子回路を有し、本回路は光捕捉手段よ
りの前記出力信号を用いて、中角光散乱の対数（log of
MALS）を形成し、さらにクールターRF信号の前記第１
信号と中角光散乱（MALS）の対数（log of MALS）の第
２信号とを比較し、白血球の５つの副集団を識別する請
求項１記載の装置。

6.前記血液サンプルを流すステップには、ボリューム液
体フロー室内に液体通路を形成し、前記フロー室流通時
前記血液サンプルを水力学的に収束し、クールターDCボ
リューム信号（DC）を発生し、この信号（DC）を前記光
散乱感知から得た信号と比較し、前記電気処理によって
５つの個別の白血球副集団：即ち、好酸球、好中球、単
球、リンパ球および好塩基球を個別のセル光散乱に基づ
き識別するデータを生ぜしめるステップを含めるように
したことを特徴とする請求項２に記載の血液サンプルの
少なくとも１種の白血球副集団を識別する方法。

7.前記中角光散乱（MALS）信号データから中角光散乱信
号の対数（log of MALS）を演算して白血球を３つの個
別の群、即ち、好酸球、好中球、単球、リンパ球および
好塩基球に分類する追加の処理ステップを具えることを
特徴とする請求項２に記載の血液サンプルの少なくとも
１種の白血球副集団を識別する方法。

8.クールターDCボリューム信号（DC）を発生し、この信
号（DC）により前記MALSの対数を除算して回転光散乱信
号（RLS）を発生させるステップを具えることを特徴と
する請求項２に記載の血液サンプルの少なくとも１種の
白血球副集団を識別する方法。

9.前記RLS信号と前記DC信号とを比較し、前記ステップ
によって少なくとも５つの白血球副集団、即ち、好酸
球、好中球、単球、リンパ球および好塩基球を識別する
データを発生させるステップをさらに含むことを特徴と
する請求項２に記載の血液サンプルの少なくとも１種の
白血球副集団を識別する方法。

10.前記RLS信号は３つの個別の集団：好酸球、好中球
と、単球、リンパ球および好塩基球を含む組合せ集団と
を発生する信号を提供するヒストグラムで解析すること
を特徴とする請求項２に記載の血液サンプルの少なくと
も１種の白血球副集団を識別する方法。

11.RF信号（RF）を発生し、このRF信号を前記DC信号で
除算して不透明度信号を発生するステップと、前記DC信
号でゲーティングを行って少なくとも３つの個別の集
団：即ち、好塩基球、リンパ球および低不透明度リンパ
球を提供するように分離された不透明度ヒストグラムを
発生するステップとをさらに含むことを特徴とする請求
項２に記載の血液サンプルの少なくとも１種の白血球副
集団を識別する方法。

12.RF信号（RF）を発生し、このRF信号を前記DC信号で
除算して不透明度信号を発生するステップと、前記DC信
号でゲーティングを行って損傷された好中球およびリン
パ球として分類された他の白血球型の不透明度ヒストグ
ラムを発生するステップとをさらに含むことを特徴とす
る請求項２に記載の血液サンプルの少なくとも１種の白
血球副集団を識別する方法。

13.クールターDCボリューム信号（DC）を発生すると共
に前記MALSの対数と前記DC信号とを比較し、前記処理ス
テップによって少なくとも５つの白血球副集団、即ち、
好酸球、好中球、単球、リンパ球および好塩基球を識別
するデータを発生させるようにしたことを特徴とする請
求項２に記載の血液サンプルの少なくとも１種の白血球
副集団を識別する方法。

14.クールターRF信号（RF）を発生すると共に前記MALS
の対数と前記RF信号とを比較し、前記処理ステップによ
って５つの白血球副集団、即ち、好酸球、好中球、単
球、リンパ球および好塩基球を識別するデータを発生さ
せるステップを含むことを特徴とする請求項２に記載の
血液サンプルの少なくとも１種の白血球副集団を識別す
る方法。

15.狭角光散乱信号（NALS）を得ると共に前記MALSの対
数と前記NALS信号とを比較し、前記処理ステップによっ
て４つの白血球副集団、即ち、リンパ球、単球、好中
球、好酸球を識別するデータを発生させる追加のステッ
プを含むようにしたことを特徴とする請求項２に記載の
血液サンプルの少なくとも１種の白血球副集団を識別す
る方法。

16.軸方向の光損失信号（ALL）を得ると共に前記MALSの
対数とALL信号とを比較し、前記処理ステップによって
５つの白血球副集団、即ち、好酸球、好中球、単球、リ
ンパ球および好塩基球を識別するデータを発生させる追
加のステップを含むようにしたことを特徴とする請求項
２に記載の血液サンプルの少なくとも１種の白血球副集
団を識別する方法。

17.15度光散乱信号（15゜LS）及び軸方向の光損失信号
（ALL）を得ると共にこれら信号（15゜LS）と光損失信
号ALLとを比較し、前記処理ステップによって５つの白
血球副集団、即ち、好酸球、好中球、単球、リンパ球お
よび好塩基球を識別するデータを発生させる追加のステ
ップを含むようにしたことを特徴とする請求項２に記載
の血液サンプルの少なくとも１種の白血球副集団を識別
する方法。

18.軸方向光損失信号（ALL）を得、クールターDCボリュ
ーム信号（DC）を発生し、信号ALLおよび信号DCを比較
して３つの白血球副集団、即ち、リンパ球、好塩基球お
よび好酸球、単球およひ好中球を識別するデータを発生
させる追加ステップを含むようにしたことを特徴とする
請求項２に記載の血液サンプルの少なくとも１種の白血
球副集団を識別する方法。

19.前記フローセル通路にクールターDCボリューム信号
（DC）及びクールター型RF信号（RF）を同時に供給し、
DC信号とRF信号とを比較し、前記処理によって４つの白
血球副集団，即ち、好中球、単球、リンパ球および好塩
基球を識別するデータを発生させるようにしたことを特
徴とする請求項２に記載の血液サンプルの少なくとも１
種の白血球副集団を識別する方法。

20.前記RF信号を前記DC信号により電子的に除算してセ
ルに無関係で、血球の内部導電率に関連する不透明信号
を発生させ、この不透明信号と前記DC信号とを比較し、
前記処理によって４つの白血球副集団の識別を増強する
データを発生させるステップを含むようにしたことを特
徴とする請求項２に記載の血液サンプルの少なくとも１
種の白血球副集団を識別する方法。

21.全血の固有の自然光散乱特性の結果としておよび全
血のこの特性を特に変更する処理の結果としてでなく白
血球を自然の状態に近似して白血球を前記液体通路に流
しながら好酸球を識別するように白血球を条件付けする
ステップをさらに含むことを特徴とする請求項２に記載
の血液サンプルの少なくとも１種の白血球副集団を識別
する方法。

22.光軸に沿い且つ液体通路に直角に光を通すと共にこ
の液体通路に血液サンプルを同時に流し；ビーム通過時
入射光に応答し白血球により散乱された光を前記光軸に
対し低い角度で消光し；光ビーム通過後前記光軸に対し
10゜−70゜の中角光散乱（MALS）で前記白血球により散
乱された光を捕捉し；血液サンプルの各セルにより散乱
された光を感知して中角出力信号データを発生し；前記
好酸球白血球副集団データは前記中角光散乱（MALS）中
20゜−70゜の範囲で前記散乱光から発生しかつ取出し、
白血球副集団を識別する白血球の前記固有の自然光散乱
特性を特に変更する処理を施すことなく前記感知ステッ
プによって前記白血球の固有の自然光散乱特性の結果と
しての信号データを発生し；前記出力信号データを処理
して中角光散乱（MALS）中20゜−70゜の範囲の部分を利
用して好酸球、好中球およびリンパ球、単球および好塩
基球から少なくとも３つの白血球副集団を個別のセル光
散乱に基づき識別するデータを得るようにしたことを特
徴とする血液サンプルの少なくとも１種の白血球副集団
を識別する方法。

23.光軸に沿い且つ液体通路に直角に光を通すと共にこ
の液体通路に血液サンプルを同時に流し；ビーム通過時
入射光に応答し白血球により散乱された光を前記光軸に
対し低い角度で消光し；光ビーム通過後前記光軸に対し
10゜−70゜の中角光散乱（MALS）で前記白血球により散
乱された光を捕捉し；血液サンプルの各セルにより散乱
された光を感知して中角出力信号データを発生し；白血
球副集団を識別する白血球の前記固有の自然光散乱特性
を特に変更する処理を施すことなく前記感知ステップに
よって前記白血球の固有の自然光散乱特性の結果として
の信号データを前記光軸に対し10゜−70゜の捕捉角度内
で発生し；前記出力信号データを電気的に処理して白血
球識別データを発生し；前記感知ステップは未処理白血
球とともに前記光軸に対し10゜−70゜の捕捉角度内で作
動させ；前記好酸球副集団は中角光散乱（MALS）中20゜
−70゜の範囲の散乱光により発生するとともにこれから
取出し；さらに軸方向光損失信号（ALL）を得、クール
ターDCボリューム信号（DC）を発生し、信号ALLおよび
信号DCを比較して、リンパ球、好塩基球および好酸球、
単球および好中球から少なくとも３つの白血球副集団を
個別のセル光散乱に基づき識別するデータを発生させる
追加のステップを含むようにしたことを特徴とする血液
サンプルの少なくとも１種の白血球副集団を識別する方
法。

24.前記信号ALLを信号DCで除算し、前記処理により少な
くとも３つの白血球副集団、即ち、リンパ球、好塩基球
および好酸球、単球および好中球を個別のセル光散乱に
基づき識別するデータを発生させる追加のステップを含
むようにしたことを特徴とする請求項25に記載の血液サ
ンプルの少なくとも１種の白血球副集団を識別する方
法。

25.光軸に沿い且つ液体通路に直角に光を通すと共にこ
の液体通路に血液サンプルを同時に流し；ビーム通過時
入射光に応答し白血球により散乱された光を前記光軸に
対し低い角度で消光し；光ビーム通過後前記光軸に対し
10゜−70゜の中角光散乱（MALS）で前記白血球により散
乱された光を捕捉し；血液サンプルの各セルにより散乱
された光を感知して中角出力信号データを発生し；白血
球副集団を識別する白血球の前記固有の自然光散乱特性
を特に変更する処理を施すことなく前記感知ステップに
よって前記白血球の固有の自然光散乱特性の結果として
の信号データを発生し；前記出力信号データを電気的に
処理して白血球識別データを発生し；前記感知ステップ
は未処理白血球とともに前記光軸に対し10゜−70゜の捕
捉角度内で作動させ；さらに直流（DC）およびある無線
周波数（RF）の電流を前記フローセル通路の孔に同時に
供給してクールターDCボリューム信号（DC）およびRF信
号（RF）を発生させ、且つ前記DC信号およびRF信号を比
較して前記処理により少なくとも４つの白血球副集団、
即ち、好中球、単球、リンパ球および好塩基球を個別の
セル光散乱に基づき識別するデータを得るようにしたこ
とを特徴とする血液サンプルの少なくとも１種の白血球
副集団を識別する方法。

26.光軸に沿い且つクールター型の孔を含む液体通路に
直角に光を通すと共にこの液体通路に血液サンプルを同
時に流し；血液サンプルの各セルにより散乱された光の
一部分を感知し；この光感知結果を電気的に処理して白
血球識別データを発生するようにし；前記感知ステップ
によってほぼ10゜−70゜の中角光散乱（MALS）信号デー
タを発生し、且つ前記処理ステップによって中角光散乱
信号の対数（MALSの対数）を発生し；さらに直流電流は
クールターDCボリューム信号DCを発生する前記フローセ
ル通路の孔に同時に供給し、回転光散乱（RLS）信号を
発生する前記ボリューム信号DCにより前記MALSの対数を
除算し、前記ボリューム信号DCと前記回転光散乱（RL
S）信号とを比較し、かかる処理によって少なくとも４
つの白血球副集団、即ち、好中球、単球、リンパ球およ
び好塩基球を個別のセル光散乱に基づき識別し、確認す
るデータを得るようにしたことを特徴とする血液サンプ
ルの少なくとも１種の白血球副集団を識別する方法。

27.光軸に沿い且つ孔を含む液体通路に直角に光を通す
と共にこの液体通路に血液サンプルを同時に流し；血液
サンプルの各セルにより散乱された光の一部分を感知
し；この光感知結果を電気的に処理して白血球識別デー
タを発生するようにし；前記感知ステップによってほぼ
10゜−70゜の中角光散乱（MALS）信号データを発生し、
且つ前記処理ステップによって中角光散乱信号の対数
（MALSの対数）を発生し；さらに直流（DC）およびある
無線周波数（RF）電流は前記フローセル通路の孔に同時
に供給してクールターDCボリューム信号DCを発生させ、
前記ボリューム信号DCにより前記MALSの対数を除算して
回転光散乱（RLS）信号を発生し、前記ボリューム信号D
Cと前記回転光散乱信号RLSとを比較し、かかる処理によ
って少なくとも４つの白血球副集団、即ち、好中球、単
球、リンパ球および好塩基球を個別のセル光散乱に基づ
き識別し、確認するデータを得るようにし、前記クール
ターRF信号を前記ボリュームDC信号で除算して不透明度
信号（OP）を発生し、且つ前記回転光散乱信号RLSをフ
ィルタ操作しながら前記ボリュームDC信号と不透明度信
号とを比較し、この処理によって４つの白血球副集団の
うちの１つを少なくとも２つの白血球副集団、即ち、リ
ンパ球および好塩基球で個別のセル光散乱に基づき識別
し、確認するデータを得るようにしたことを特徴とする
血液サンプルの少なくとも１種の白血球副集団を識別す
る方法。

28.光軸に沿い且つ孔を含む液体通路に直角に光を通す
と共にこの液体通路に血液サンプルを同時に流し；血液
サンプルの各セルにより散乱された光の一部分を感知
し；この光感知結果を電気的に処理して白血球識別デー
タを発生するようにし；前記感知ステップによってほぼ
10゜−70゜の中角光散乱（MALS）信号データを発生し、
且つ前記処理ステップによって中角光散乱信号の対数
（MALSの対数）を発生し；さらに直流（DC）およびある
無線周波数（RF）電流は前記フローセル通路の孔に同時
に供給してクールターDCボリューム信号DCを発生し、前
記ボリューム信号DCにより前記MALSの対数を除算して回
転光散乱信号（RLS）を発生し、前記RF信号を前記ボリ
ュームDC信号で除算して不透明度信号（OP）を発生し、
且つ前記ボリュームDC信号と前記回転光散乱信号RLSお
よび不透明度信号とを比較し、この処理によって少なく
とも５つの白血球副集団、即ち、リンパ球、好塩基球、
好中球、単球および好酸球を個別のセル光散乱に基づき
識別し、確認するデータを得るようにしたことを特徴と
する血液サンプルの少なくとも１種の白血球副集団を識
別する方法。

なお本願を図示の実施例につき詳細に説明したが本願
はかかる実施例に限定されるものではなく、本願の範囲
内では種々の変更が可能であることは当業者には明らか
である。

（発明の効果） 上述したように、本発明によれば、白血球の流れに細
胞化学染色法を用いることなく光学的および電子的測定
により白血球の諸成分を識別する粒子分析方法および装
置を提供することができる。これがため、自然状態にお
ける白血球の流体力学的に収束された流れをフローセル
の放射エネルギービーム内に通過させてこのビームが白
血球の副集団の種々のものによって散乱させる。この散
乱されたビームはフローセルに隣接して配設された光捕
捉手段に入射する。好酸球検出のためには、特に散乱光
をビームの光軸に対し10゜−70゜の中程度角度位置で捕
集する。白血球の他の成分はクールター式粒子分析原理
を用いた光学的および／または電子的測定により好酸球
に対し識別することができる。

4.図面の簡単な説明 第１図は本発明粒子分析装置の光検出器構体をフロー
セルと共に示す原理的構成図、 第1A図は第１図のフローセルの孔の箇所で水平に断面
して示す平面図、 第1B図は正方形の孔及び平坦な内外面を有する第１図
のフローセルの平面図 第1C図は光検出器構体の信号受信区域を示す正面図、 第２図は２個の45゜傾斜した光検出器構体を有し、孔
の箇所で水平に断面した第１図のフローセルを示す平面
図、 第2A図は第２図の装置の孔の部分を示す拡大平面図、 第３図は第1B図の装置の変形例を示す平面図、 第４図は第1B図の装置の変形例を示す平面図、 第5,5A及び5B図はクールター型ボリューム孔を用いる
本発明装置の構成を示すブロック図、 第6,6A及び6B図は光学フロー室を用いる本発明装置の
変形例の構成を示すブロック図、 第6C図はクールター型感知孔を用いないフローセルの
変形例を示す分解斜視図、 第７〜27図は本発明方法及び装置による測定結果を表
示するヒストグラム及びスキャッタグラムを示す説明図
である。

5.符号の説明 10……フローセル 15……フローセルの孔 24,214,216……光捕捉手段 20……光ビーム 26……光軸 28,30……消光手段（マスク部材） 92……入口 99……出口 140,142,148,150……利用手段 148,150……表示手段 200,204……遮断手段 202,206,208,210,212……散乱光通過孔 218,220……散乱光応答構体 226……光損失応答構体 600……鎖線 602……下側中角光散乱領域 604……上側中角光散乱領域

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クールター・ウォーレス・エイチ アメリカ合衆国フロリダ州 33166 マ イアミ スプリングス クウェイル ア ベニュー 910 (56)参考文献 特開 昭60−36960（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502277（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】個別の血球の光散乱に基づいて識別を行
   い、血液サンプル中の少なくとも１つの白血球副集団を
   選択的に識別する粒子分析装置において、 流体懸濁液内に血液サンプルを導入及び排出する入口手
   段及び出口手段を有する細胞化学フローセルと、 白血球サンプルを前記フローセルの入口手段に導入し、
   フローセル内を流通させる血球サンプル導入手段と、 光軸が白血球の流れに対して直角になるようにしてフロ
   ーセルを通過するように配置した光ビームと、 軸が前記光ビームの軸と整列するように配置され、前記
   光ビームがフローセルを通過する際、光ビームの射突に
   応答して白血球により散乱した光のうち、前記ビーム軸
   に関し小角度のものを消光する消光手段と、 前記ビームの通過後に、光軸より見て10゜以上で70゜以
   下の中角光散乱（MALS）に前記血球によって散乱された
   光に応答して、中角出力信号を形成し、前記中角光散乱
   （MALS）中の20゜ないし70゜の範囲に散乱する上側中角
   光散乱（UMALS）光線より好酸球副集団データを形成す
   る光捕捉手段と、 前記光捕捉手段よりの出力信号を利用し、とくに中角光
   散乱中20゜ないし70゜の上側中角光散乱（UMALS）を利
   用して好酸球の副集団を分離識別する利用手段とを具
   え、 白血球、とくに好酸球を含む白血球を分離して識別する
   よう動作し、とくに好酸球を分離識別するため白血球に
   固有の自然の特性を何等変化させるような処理を加える
   ことなしに白血球に固有の自然の特性を識別するように
   動作することを特徴とする散乱光による分析装置。
2. 【請求項２】光軸に沿い且つ液体通路に直角に光ビーム
   を通すと共にこの液体通路に血液サンプルを同時に流
   し、 ビーム通過時入射光に応答し白血球により散乱された光
   を前記光軸に対し低い角度で消光し、 光ビーム通過後前記光軸に対し10゜〜70゜の中角光散乱
   （MALS）で前記白血球により散乱された光を捕捉し、 血液サンプルの各セルにより散乱された光を感知して中
   角出力信号データを発生し;10゜〜70゜の中角光散乱（M
   ALS）の部分に寄与する好酸球を識別する白血球の前記
   固有の自然光散乱特性を特に変更する処理を施すことな
   く前記感知ステップによって前記白血球の固有の自然光
   散乱特性の結果である信号データを発生し、 この中角光散乱信号データの部分を利用して好酸球副副
   集団を個別のセル光散乱に基づき識別することを特徴と
   する血液サンプルの少なくとも１種の白血球副集団を識
   別する方法。