JP2023171733A - 新規抗ｐｄ－ｌ１抗体 - Google Patents

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JP2023171733A JP2023143484A JP2023143484A JP2023171733A JP 2023171733 A JP2023171733 A JP 2023171733A JP 2023143484 A JP2023143484 A JP 2023143484A JP 2023143484 A JP2023143484 A JP 2023143484A JP 2023171733 A JP2023171733 A JP 2023171733A
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Xueming Qian
フェイ，テン
Teng Fei
リ，ゼン
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Suzhou Transcenta Therapeutics Co Ltd
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Abstract

【課題】現在の抗ＰＤ－Ｌ１抗体よりも大幅に良好な有効性を有する抗体を提供する。【解決手段】酸性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合が同一アッセイ設定で中性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１とのその結合よりも実質的に低い単離されたＰＤ－Ｌ１抗体、およびＰＤ－Ｌ１との結合においてｐＨ依存性ではない単離されたＰＤ－Ｌ１抗体が提供される。また、抗体の医薬組成物、コーディングポリヌクレオチドおよび発現ベクター、その単離された宿主細胞ならびにＰＤ－Ｌ１抗体を含むキットも提供される。また、ＰＤ－Ｌ１抗体を使用してＰＤ－Ｌ１関連状態を処置する方法も提供される。【選択図】図３

Description

本開示は、概して、ヒトＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する新規抗ＰＤ－Ｌ１抗体に関する
。
ＰＤ－１、ＣＤ２８ファミリーのメンバーは、Ｔ細胞の活性化および増殖を生理学的に
制限するように機能する、Ｔ細胞の表面で発現される阻害性受容体である。そのリガンド
、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１／ＣＤ２７４）は、抗原提示細胞および腫瘍細胞上で発現され
る。ＰＤ－Ｌ１のその受容体との結合は、Ｔ細胞の活性化を阻害し、Ｂ７のＣＤ２８との
結合などのＴ細胞刺激性シグナルを均衡する。
ＰＤ－Ｌ１は、正常な上皮組織によって発現されないが、幅広いヒト癌で異常に発現さ
れる。これに関連して、ＰＤ－Ｌ１は、宿主抗腫瘍反応を無効にすることによって癌の進
行を促進し得る。腫瘍細胞でのその発現は、腎細胞癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、尿
路上皮癌、胃癌、食道癌および肝細胞癌腫における予後不良と関連してきた。
ＰＤ－１を標的とする多重抗体が作製されており、腫瘍成長において有効であり、無作
為化比較対照試験において全生存を延長すると示された。いくつかのＰＤ－Ｌ１を標的と
する抗体が発見されており、腫瘍成長の阻害において活性が示された。これらの抗体は、
ＰＤ－Ｌ１発現細胞によって内部移行され、エンドソームおよびリソソームコンパートメ
ントにおいて迅速に分解されるので、これらの抗体は、ＰＤ－Ｌ１発現細胞によって迅速
に排除され、従って、これらの抗体の腫瘍成長を阻害する能力は、送達される抗体の量に
よって制限される。腫瘍成長の持続的阻害は、ＰＤ－Ｌ１の活性を遮断するのに十分に高
い腫瘍部位での抗体の濃度を維持するために、多量の抗体の連続的な注入を必要とする。
したがって、これらの物質を提供する費用は、患者への多量の抗体の注射を必要とするの
で極めて高いと予測される。より重要なことに、完全な応答を達成する能力も制限される
。したがって、現在の抗ＰＤ－Ｌ１抗体よりも大幅に良好な有効性を有する抗体の作製が
必要である。
本開示は、新規モノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体（特に、キメラおよびヒト化抗体）、
それをコードするポリヌクレオチド、それを使用する方法およびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク
質上のその結合エピトープを提供する。
特定の実施形態では、重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ならびに軽鎖ＬＣ
ＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３配列を含む単離されたＰＤ－Ｌ１抗体が本明細書に
おいて提供され、
ＨＣＤＲ１配列は、ＴＹＷＸ１Ｈ（配列番号１）またはその少なくとも８０％（例えば
、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のある相同体配列であり、
ＨＣＤＲ２配列は、ＭＩＱＰＮＳＧＧＴＫＹＮＸ２Ｘ３ＦＫＸ４（配列番号２）または
その少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、
９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のある相同体
配列であり、
ＨＣＤＲ３配列は、ＧＡＧＴＶＤＹＦＤＹ（配列番号３）またはその少なくとも８０％
（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のある相同体配列であり、
ＬＣＤＲ１配列は、ＲＡＳＥＳＶＤＩＹＧＮＳＦＭＨ（配列番号４）またはその少なく
とも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のある相同体配列であり
、
ＬＣＤＲ２配列は、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）またはその少なくとも８０％（例え
ば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のある相同体配列であり、
ＬＣＤＲ３配列は、Ｘ５ＱＳＸ６Ｘ７ＤＰＹＴ（配列番号６）またはその少なくとも８
０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のある相同体配列であり、
Ｘ１は、ＩまたはＭであり、Ｘ２は、ＤまたはＥであり、Ｘ３は、ＱまたはＫであり、
Ｘ４は、ＮまたはＫであり、Ｘ５は、ＱまたはＨであり、Ｘ６は、ＮまたはＴであり、Ｘ
７は、ＤまたはＥである。
特定の実施形態では、Ｘ１は、ＩまたはＭであり、Ｘ２は、ＤまたはＥであり、Ｘ３は
、ＱまたはＫであり、Ｘ４は、ＮまたはＫであり、Ｘ５は、Ｑであり、Ｘ６は、Ｎまたは
Ｔであり、Ｘ７は、ＤまたはＥである。特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｉであり、Ｘ２は
、Ｄであり、Ｘ３は、Ｑであり、Ｘ４は、Ｎであり、Ｘ５は、Ｑであり、Ｘ６は、Ｎであ
り、Ｘ７は、Ｄである。特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｍであり、Ｘ２は、Ｅであり、Ｘ
３は、Ｋであり、Ｘ４は、Ｋであり、Ｘ５は、Ｑであり、Ｘ６は、Ｔであり、Ｘ７は、Ｅ
である。特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｉであり、Ｘ２は、ＤでありＸ３は、Ｑであり、
Ｘ４は、Ｎであり、Ｘ５は、Ｈであり、Ｘ６は、Ｎであり、Ｘ７は、Ｄである。特定の実
施形態では、Ｘ１は、Ｍであり、Ｘ２は、Ｅであり、Ｘ３は、Ｋであり、Ｘ４は、Ｋであ
り、Ｘ５は、Ｈであり、Ｘ６は、Ｔであり、Ｘ７は、Ｅである。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号７～１
２またはその少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のあ
る相同体から選択される１、２、３、４、５または６種のＣＤＲを含む。特定の実施形態
では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号７～９から選択される３
種の重鎖ＣＤＲを含む。特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗
体は、配列番号１０～１２から選択される３種の軽鎖ＣＤＲを含む。特定の実施形態では
、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号７～１２から選択される６種
のＣＤＲを含む。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体は、ＨＦＲ１、ＨＦ
Ｒ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４の重鎖フレームワーク配列ならびにＬＦＲ１、ＬＦＲ２、
ＬＦＲ３およびＬＦＲ４の軽鎖フレームワーク配列を含み、重鎖可変領域の配列は、次式
：ＨＦＲ１－ＨＣＤＲ１－ＨＦＲ２－ＨＣＤＲ２－ＨＦＲ３－ＨＣＤＲ３－ＨＦＲ４に従
い、軽鎖可変領域の配列は、次式ＬＦＲ１－ＬＣＤＲ１－ＬＦＲ２－ＬＣＤＲ２－ＬＦＲ
３－ＬＣＤＲ３－ＬＦＲ４に従う。
特定の実施形態では、ＨＦＲ１配列は、Ｘａ１ＶＱＬＸａ２ＱＸａ３ＧＡＥＸａ４Ｘａ
５ＫＰＧＡＳＶＫＸａ６ＳＣＫＡＳＧＹＸａ７ＦＴ（配列番号１３）であり、
ＨＦＲ２配列は、ＷＶＸａ８ＱＸａ９ＰＧＱＧＬＥＷＩＧ（配列番号１４）であり、
ＨＦＲ３配列は、Ｘａ１０Ｘａ１１ＴＬＴＶＤＸａ１２ＳＸａ１３Ｘａ１４ＴＡＸａ１
５ＭＸａ１６ＬＳＸａ１７ＬＸａ１８ＳＸａ１９ＤＸａ２０ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１
５）であり、
ＨＦＲ４配列は、ＷＧＱＧＸａ２１ＴＬＸａ２２Ｘａ２３ＳＳ（配列番号１６）であり
、
ＬＦＲ１配列は、ＤＩＶＬＴＸａ２４ＳＰＸａ２５ＳＬＸａ２６ＶＳＸａ２７ＧＱＲＡ
ＴＩＸａ２８Ｃ（配列番号１７）であり、
ＬＦＲ２配列は、ＷＹＱＱＫＰＧＱＸａ２９ＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）であり、
ＬＦＲ３配列は、ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＸａ３０ＤＸａ
３１ＡＴＹＹＣ（配列番号１９）であり、
ＬＦＲ４配列は、ＦＧＧＧＴＫＬＥＸａ３２Ｋ（配列番号２０）であり、
Ｘａ１は、ＱまたはＬであり、Ｘａ２は、ＱまたはＶであり、Ｘａ３は、ＳまたはＰであ
り、Ｘａ４は、ＬまたはＶであり、Ｘａ５は、ＶまたはＫであり、Ｘａ６は、ＬまたはＶ
であり、Ｘａ７は、Ｔ、ＳまたはＩであり、Ｘａ８は、Ｗ、ＫまたはＲであり、Ｘａ９は
、ＲまたはＡであり、Ｘａ１０は、ＲまたはＫであり、Ｘａ１１は、ＶまたはＡであり、
Ｘａ１２は、ＫまたはＴであり、Ｘａ１３は、ＳまたはＩであり、Ｘａ１４は、Ｓまたは
Ｔであり、Ｘａ１５は、ＹまたはＳであり、Ｘａ１６は、ＱまたはＥであり、Ｘａ１７は
、Ｓ、ＧまたはＲであり、Ｘａ１８は、ＴまたはＲであり、Ｘａ１９は、ＥまたはＤであ
り、Ｘａ２０は、ＳまたはＴであり、Ｘａ２１は、ＴまたはＳであり、Ｘａ２２は、Ｓま
たはＴであり、Ｘａ２３は、ＶまたはＩであり、Ｘａ２４は、ＱまたはＨであり、Ｘａ２
５は、ＡまたはＶであり、Ｘａ２６は、ＡまたはＴであり、Ｘａ２７は、Ｌ、ＡまたはＶ
であり、Ｘａ２８は、ＳまたはＴであり、Ｘａ２９は、Ｓ、ＰまたはＡであり、Ｘａ３０
は、Ｄ、ＮまたはＱであり、Ｘａ３１は、ＶまたはＴであり、Ｘａ３２は、Ｌ、Ｔまたは
Ｉであり、Ｘａ３３は、ＦまたはＹであり、Ｘａ３４は、ＴまたはＱであり、Ｘａ３５は
、ＶまたはＬであり、Ｘａ３６は、ＤまたはＳであり、Ｘａ３７は、ＭまたはＬであり、
Ｘａ３８は、ＴまたはＳであり、Ｘａ３９は、ＦまたはＳであり、Ｘａ４０は、Ｄまたは
Ｑであり、Ｘａ４１は、ＶまたはＡであり、Ｘａ４２は、ＶまたはＩであり、Ｘａ４３は
、ＤまたはＡであり、Ｘａ４４は、ＴまたはＳであり、Ｘａ４５は、ＹまたはＳであり、
Ｘａ４６は、ＧまたはＲであり、Ｘａ４７は、ＦまたはＬであり、Ｘａ４８は、Ｓまたは
Ｎであり、Ｘａ４９は、ＴまたはＰであり、Ｘａ５０は、ＱまたはＥであり、Ｘａ５１は
、ＶまたはＴであり、Ｘａ５２は、ＦまたはＹであり、Ｘａ５３は、ＡまたはＧである。
特定の実施形態では、Ｘａ１は、Ｑであり、Ｘａ２は、Ｖであり、Ｘａ３は、Ｓであり
、Ｘａ４は、Ｖであり、Ｘａ５は、Ｋであり、Ｘａ６は、Ｌであり、Ｘａ７は、Ｉであり
、Ｘａ８は、Ｋであり、Ｘａ９は、Ｒであり、Ｘａ１０は、ＲまたはＫであり、Ｘａ１１
は、Ａであり、Ｘａ１２は、Ｋであり、Ｘａ１３は、Ｉであり、Ｘａ１４は、Ｓであり、
Ｘａ１５は、Ｙであり、Ｘａ１６は、Ｅであり、Ｘａ１７は、Ｒであり、Ｘａ１８は、Ｔ
であり、Ｘａ１９は、Ｄであり、Ｘａ２０は、Ｔであり、Ｘａ２１は、ＴまたはＳであり
、Ｘａ２２は、ＴまたはＳであり、Ｘａ２３は、ＩまたはＶであり、Ｘａ２４は、Ｑであ
り、Ｘａ２５は、Ａであり、Ｘａ２６は、Ａであり、Ｘａ２７は、Ｖであり、Ｘａ２８は
、Ｔであり、Ｘａ２９は、ＡまたはＰであり、Ｘａ３０は、Ｑであり、Ｘａ３１は、Ｔで
あり、Ｘａ３２は、ＴまたはＩであり、Ｘａ３３は、Ｙであり、Ｘａ３４は、Ｑであり、
Ｘａ３５は、Ｌであり、Ｘａ３６は、Ｄであり、Ｘａ３７は、Ｌであり、Ｘａ３８は、Ｓ
であり、Ｘａ３９は、Ｓであり、Ｘａ４０は、Ｑであり、Ｘａ４１は、Ａであり、Ｘａ４
２は、Ｉであり、Ｘａ４３は、Ａであり、Ｘａ４４は、Ｓであり、Ｘａ４５は、Ｓであり
、Ｘａ４６は、Ｒであり、Ｘａ４７は、Ｌであり、Ｘａ４８は、Ｎであり、Ｘａ４９は、
Ｐであり、Ｘａ５０は、Ｅであり、Ｘａ５１は、Ｔであり、Ｘａ５２は、Ｙであり、Ｘａ
５３は、Ｇである。
特定の実施形態では、Ｘａ１は、Ｑであり、Ｘａ２は、Ｖであり、Ｘａ３は、Ｓであり
、Ｘａ４は、Ｖであり、Ｘａ５は、Ｋであり、Ｘａ６は、Ｌであり、Ｘａ７は、Ｉであり
、Ｘａ８は、Ｋであり、Ｘａ９は、Ｒであり、Ｘａ１０は、Ｒであり、Ｘａ１１は、Ａで
あり、Ｘａ１２は、Ｋであり、Ｘａ１３は、Ｉであり、Ｘａ１４は、Ｓであり、Ｘａ１５
は、Ｙであり、Ｘａ１６は、Ｅであり、Ｘａ１７は、Ｒであり、Ｘａ１８は、Ｔであり、
Ｘａ１９は、Ｄであり、Ｘａ２０は、Ｔであり、Ｘａ２１は、Ｔであり、Ｘａ２２は、Ｓ
であり、Ｘａ２３は、Ｉであり、Ｘａ２４は、Ｑであり、Ｘａ２５は、Ａであり、Ｘａ２
６は、Ａであり、Ｘａ２７は、Ｖであり、Ｘａ２８は、Ｔであり、Ｘａ２９は、Ａであり
、Ｘａ３０は、Ｑであり、Ｘａ３１は、Ｔであり、Ｘａ３２は、Ｔであり、Ｘａ３３は、
Ｙであり、Ｘａ３４は、Ｑであり、Ｘａ３５は、Ｌであり、Ｘａ３６は、Ｄであり、Ｘａ
３７は、Ｌであり、Ｘａ３８は、Ｓであり、Ｘａ３９は、Ｓであり、Ｘａ４０は、Ｑであ
り、Ｘａ４１は、Ａであり、Ｘａ４２は、Ｉであり、Ｘａ４３は、Ａであり、Ｘａ４４は
、Ｓであり、Ｘａ４５は、Ｓであり、Ｘａ４６は、Ｒであり、Ｘａ４７は、Ｌであり、Ｘ
ａ４８は、Ｎであり、Ｘａ４９は、Ｐであり、Ｘａ５０は、Ｅであり、Ｘａ５１は、Ｔで
あり、Ｘａ５２は、Ｙであり、Ｘａ５３は、Ｇである。
特定の実施形態では、Ｘａ１は、Ｑであり、Ｘａ２は、Ｖであり、Ｘａ３は、Ｓであり
、Ｘａ４は、Ｖであり、Ｘａ５は、Ｋであり、Ｘａ６は、Ｌであり、Ｘａ７は、Ｉであり
、Ｘａ８は、Ｋであり、Ｘａ９は、Ｒであり、Ｘａ１０は、Ｋであり、Ｘａ１１は、Ａで
あり、Ｘａ１２は、Ｋであり、Ｘａ１３は、Ｉであり、Ｘａ１４は、Ｓであり、Ｘａ１５
は、Ｙであり、Ｘａ１６は、Ｅであり、Ｘａ１７は、Ｒであり、Ｘａ１８は、Ｔであり、
Ｘａ１９は、Ｄであり、Ｘａ２０は、Ｔであり、Ｘａ２１は、Ｓであり、Ｘａ２２は、Ｔ
であり、Ｘａ２３は、Ｖであり、Ｘａ２４は、Ｑであり、Ｘａ２５は、Ａであり、Ｘａ２
６は、Ａであり、Ｘａ２７は、Ｖであり、Ｘａ２８は、Ｔであり、Ｘａ２９は、Ｐであり
、Ｘａ３０は、Ｑであり、Ｘａ３１は、Ｔであり、Ｘａ３２は、Ｉであり、Ｘａ３３は、
Ｙであり、Ｘａ３４は、Ｑであり、Ｘａ３５は、Ｌであり、Ｘａ３６は、Ｄであり、Ｘａ
３７は、Ｌであり、Ｘａ３８は、Ｓであり、Ｘａ３９は、Ｓであり、Ｘａ４０は、Ｑであ
り、Ｘａ４１は、Ａであり、Ｘａ４２は、Ｉであり、Ｘａ４３は、Ａであり、Ｘａ４４は
、Ｓであり、Ｘａ４５は、Ｓであり、Ｘａ４６は、Ｒであり、Ｘａ４７は、Ｌであり、Ｘ
ａ４８は、Ｎであり、Ｘａ４９は、Ｐであり、Ｘａ５０は、Ｅであり、Ｘａ５１は、Ｔで
あり、Ｘａ５２は、Ｙであり、Ｘａ５３は、Ｇである。
特定の実施形態では、Ｘａ１は、ＬまたはＱであり、Ｘａ２は、Ｖであり、Ｘａ３は、
Ｓであり、Ｘａ４は、Ｖであり、Ｘａ５は、Ｋであり、Ｘａ６は、Ｌであり、Ｘａ７は、
Ｉであり、Ｘａ８は、Ｋであり、Ｘａ９は、Ｒであり、Ｘａ１０は、Ｒであり、Ｘａ１１
は、Ａであり、Ｘａ１２は、Ｋであり、Ｘａ１３は、Ｉであり、Ｘａ１４は、Ｓであり、
Ｘａ１５は、Ｙであり、Ｘａ１６は、Ｅであり、Ｘａ１７は、Ｒであり、Ｘａ１８は、Ｔ
であり、Ｘａ１９は、Ｄであり、Ｘａ２０は、Ｔであり、Ｘａ２１は、Ｔであり、Ｘａ２
２は、Ｓであり、Ｘａ２３は、Ｉであり、Ｘａ２４は、Ｑであり、Ｘａ２５は、Ａであり
、Ｘａ２６は、Ａであり、Ｘａ２７は、Ｖであり、Ｘａ２８は、Ｔであり、Ｘａ２９は、
Ｓであり、Ｘａ３０は、Ｎであり、Ｘａ３１は、Ｔであり、Ｘａ３２は、Ｔであり、Ｘａ
３３は、Ｙであり、Ｘａ３４は、Ｑであり、Ｘａ３５は、Ｌであり、Ｘａ３６は、Ｄであ
り、Ｘａ３７は、Ｌであり、Ｘａ３８は、Ｓであり、Ｘａ３９は、Ｓであり、Ｘａ４０は
、Ｑであり、Ｘａ４１は、Ａであり、Ｘａ４２は、Ｉであり、Ｘａ４３は、Ａであり、Ｘ
ａ４４は、Ｓであり、Ｘａ４５は、Ｓであり、Ｘａ４６は、Ｒであり、Ｘａ４７は、Ｌで
あり、Ｘａ４８は、Ｎであり、Ｘａ４９は、Ｐであり、Ｘａ５０は、Ｅであり、Ｘａ５１
は、Ｔであり、Ｘａ５２は、Ｙであり、Ｘａ５３は、Ｇである。
特定の実施形態では、Ｘａ１は、Ｌであり、Ｘａ２は、Ｖであり、Ｘａ３は、Ｓであり
、Ｘａ４は、Ｖであり、Ｘａ５は、Ｋであり、Ｘａ６は、Ｖであり、Ｘａ７は、Ｉであり
、Ｘａ８は、Ｒであり、Ｘａ９は、Ａであり、Ｘａ１０は、Ｒであり、Ｘａ１１は、Ｖで
あり、Ｘａ１２は、Ｔであり、Ｘａ１３は、Ｉであり、Ｘａ１４は、Ｓであり、Ｘａ１５
は、Ｙであり、Ｘａ１６は、Ｅであり、Ｘａ１７は、Ｒであり、Ｘａ１８は、Ｒであり、
Ｘａ１９は、Ｄであり、Ｘａ２０は、Ｔであり、Ｘａ２１は、Ｔであり、Ｘａ２２は、Ｓ
であり、Ｘａ２３は、Ｉであり、Ｘａ２４は、Ｑであり、Ｘａ２５は、Ａであり、Ｘａ２
６は、Ａであり、Ｘａ２７は、Ｖであり、Ｘａ２８は、Ｔであり、Ｘａ２９は、Ｓであり
、Ｘａ３０は、Ｎであり、Ｘａ３１は、Ｔであり、Ｘａ３２は、Ｔであり、Ｘａ３３は、
Ｙであり、Ｘａ３４は、Ｑであり、Ｘａ３５は、Ｌであり、Ｘａ３６は、Ｄであり、Ｘａ
３７は、Ｌであり、Ｘａ３８は、Ｓであり、Ｘａ３９は、Ｓであり、Ｘａ４０は、Ｑであ
り、Ｘａ４１は、Ａであり、Ｘａ４２は、Ｉであり、Ｘａ４３は、Ａであり、Ｘａ４４は
、Ｓであり、Ｘａ４５は、Ｓであり、Ｘａ４６は、Ｒであり、Ｘａ４７は、Ｌであり、Ｘ
ａ４８は、Ｎであり、Ｘａ４９は、Ｐであり、Ｘａ５０は、Ｅであり、Ｘａ５１は、Ｔで
あり、Ｘａ５２は、Ｙであり、Ｘａ５３は、Ｇである。
特定の実施形態では、Ｘａ１は、Ｌであり、Ｘａ２は、Ｖであり、Ｘａ３は、Ｓであり
、Ｘａ４は、Ｖであり、Ｘａ５は、Ｋであり、Ｘａ６は、Ｖであり、Ｘａ７は、Ｉであり
、Ｘａ８は、Ｒであり、Ｘａ９は、Ａであり、Ｘａ１０は、Ｒであり、Ｘａ１１は、Ｖで
あり、Ｘａ１２は、Ｔであり、Ｘａ１３は、Ｉであり、Ｘａ１４は、Ｓであり、Ｘａ１５
は、Ｙであり、Ｘａ１６は、Ｅであり、Ｘａ１７は、Ｒであり、Ｘａ１８は、Ｒであり、
Ｘａ１９は、Ｄであり、Ｘａ２０は、Ｔであり、Ｘａ２１は、Ｔであり、Ｘａ２２は、Ｓ
であり、Ｘａ２３は、Ｉであり、Ｘａ２４は、Ｑであり、Ｘａ２５は、Ａであり、Ｘａ２
６は、Ａであり、Ｘａ２７は、Ｖであり、Ｘａ２８は、Ｔであり、Ｘａ２９は、Ａであり
、Ｘａ３０は、ＱまたはＮであり、Ｘａ３１は、Ｔであり、Ｘａ３２は、Ｔであり、Ｘａ
３３は、Ｙであり、Ｘａ３４は、Ｑであり、Ｘａ３５は、Ｌであり、Ｘａ３６は、Ｄであ
り、Ｘａ３７は、Ｌであり、Ｘａ３８は、Ｓであり、Ｘａ３９は、Ｓであり、Ｘａ４０は
、Ｑであり、Ｘａ４１は、Ａであり、Ｘａ４２は、Ｉであり、Ｘａ４３は、Ａであり、Ｘ
ａ４４は、Ｓであり、Ｘａ４５は、Ｓであり、Ｘａ４６は、Ｒであり、Ｘａ４７は、Ｌで
あり、Ｘａ４８は、Ｎであり、Ｘａ４９は、Ｐであり、Ｘａ５０は、Ｅであり、Ｘａ５１
は、Ｔであり、Ｘａ５２は、Ｙであり、Ｘａ５３は、Ｇである。
特定の実施形態では、Ｘａ１は、Ｑであり、Ｘａ２は、Ｖであり、Ｘａ３は、Ｓであり
、Ｘａ４は、Ｖであり、Ｘａ５は、Ｋであり、Ｘａ６は、Ｖであり、Ｘａ７は、Ｉであり
、Ｘａ８は、Ｒであり、Ｘａ９は、Ａであり、Ｘａ１０は、Ｋであり、Ｘａ１１は、Ａで
あり、Ｘａ１２は、Ｔであり、Ｘａ１３は、Ｉであり、Ｘａ１４は、Ｓであり、Ｘａ１５
は、Ｙであり、Ｘａ１６は、Ｅであり、Ｘａ１７は、Ｒであり、Ｘａ１８は、Ｒであり、
Ｘａ１９は、Ｄであり、Ｘａ２０は、Ｔであり、Ｘａ２１は、Ｓであり、Ｘａ２２は、Ｔ
であり、Ｘａ２３は、Ｖであり、Ｘａ２４は、Ｑであり、Ｘａ２５は、Ａであり、Ｘａ２
６は、Ａであり、Ｘａ２７は、Ｖであり、Ｘａ２８は、Ｔであり、Ｘａ２９は、Ｐであり
、Ｘａ３０は、Ｎであり、Ｘａ３１は、Ｔであり、Ｘａ３２は、Ｉであり、Ｘａ３３は、
Ｙであり、Ｘａ３４は、Ｑであり、Ｘａ３５は、Ｌであり、Ｘａ３６は、Ｄであり、Ｘａ
３７は、Ｌであり、Ｘａ３８は、Ｓであり、Ｘａ３９は、Ｓであり、Ｘａ４０は、Ｑであ
り、Ｘａ４１は、Ａであり、Ｘａ４２は、Ｉであり、Ｘａ４３は、Ａであり、Ｘａ４４は
、Ｓであり、Ｘａ４５は、Ｓであり、Ｘａ４６は、Ｒであり、Ｘａ４７は、Ｌであり、Ｘ
ａ４８は、Ｎであり、Ｘａ４９は、Ｐであり、Ｘａ５０は、Ｅであり、Ｘａ５１は、Ｔで
あり、Ｘａ５２は、Ｙであり、Ｘａ５３は、Ｇである。
特定の実施形態では、Ｘａ１は、Ｑであり、Ｘａ２は、Ｖであり、Ｘａ３は、Ｓであり
、Ｘａ４は、Ｖであり、Ｘａ５は、Ｋであり、Ｘａ６は、Ｖであり、Ｘａ７は、Ｉであり
、Ｘａ８は、Ｒであり、Ｘａ９は、Ａであり、Ｘａ１０は、Ｋであり、Ｘａ１１は、Ａで
あり、Ｘａ１２は、Ｔであり、Ｘａ１３は、Ｉであり、Ｘａ１４は、Ｓであり、Ｘａ１５
は、Ｙであり、Ｘａ１６は、Ｅであり、Ｘａ１７は、Ｒであり、Ｘａ１８は、Ｒであり、
Ｘａ１９は、Ｄであり、Ｘａ２０は、Ｔであり、Ｘａ２１は、Ｓであり、Ｘａ２２は、Ｔ
であり、Ｘａ２３は、Ｖであり、Ｘａ２４は、Ｑであり、Ｘａ２５は、Ａであり、Ｘａ２
６は、Ａであり、Ｘａ２７は、Ｖであり、Ｘａ２８は、Ｔであり、Ｘａ２９は、Ｐであり
、Ｘａ３０は、ＮまたはＱであり、Ｘａ３１は、Ｔであり、Ｘａ３２は、Ｉであり、Ｘａ
３３は、Ｙであり、Ｘａ３４は、Ｑであり、Ｘａ３５は、Ｌであり、Ｘａ３６は、Ｄであ
り、Ｘａ３７は、Ｌであり、Ｘａ３８は、Ｓであり、Ｘａ３９は、Ｓであり、Ｘａ４０は
、Ｑであり、Ｘａ４１は、Ａであり、Ｘａ４２は、Ｉであり、Ｘａ４３は、Ａであり、Ｘ
ａ４４は、Ｓであり、Ｘａ４５は、Ｓであり、Ｘａ４６は、Ｒであり、Ｘａ４７は、Ｌで
あり、Ｘａ４８は、Ｎであり、Ｘａ４９は、Ｐであり、Ｘａ５０は、Ｅであり、Ｘａ５１
は、Ｔであり、Ｘａ５２は、Ｙであり、Ｘａ５３は、Ｇである。
特定の実施形態では、Ｘａ１は、Ｑであり、Ｘａ２は、Ｖであり、Ｘａ３は、Ｓであり
、Ｘａ４は、Ｖであり、Ｘａ５は、Ｋであり、Ｘａ６は、Ｌであり、Ｘａ７は、Ｉであり
、Ｘａ８は、Ｋであり、Ｘａ９は、Ｒであり、Ｘａ１０は、Ｋであり、Ｘａ１１は、Ａで
あり、Ｘａ１２は、Ｋであり、Ｘａ１３は、Ｉであり、Ｘａ１４は、Ｓであり、Ｘａ１５
は、Ｙであり、Ｘａ１６は、Ｅであり、Ｘａ１７は、Ｒであり、Ｘａ１８は、Ｔであり、
Ｘａ１９は、Ｄであり、Ｘａ２０は、Ｔであり、Ｘａ２１は、Ｓであり、Ｘａ２２は、Ｔ
であり、Ｘａ２３は、Ｖであり、Ｘａ２４は、Ｑであり、Ｘａ２５は、Ａであり、Ｘａ２
６は、Ａであり、Ｘａ２７は、Ｖであり、Ｘａ２８は、Ｔであり、Ｘａ２９は、Ｐであり
、Ｘａ３０は、Ｎであり、Ｘａ３１は、Ｔであり、Ｘａ３２は、Ｉであり、Ｘａ３３は、
Ｙであり、Ｘａ３４は、Ｑであり、Ｘａ３５は、Ｌであり、Ｘａ３６は、Ｄであり、Ｘａ
３７は、Ｌであり、Ｘａ３８は、Ｓであり、Ｘａ３９は、Ｓであり、Ｘａ４０は、Ｑであ
り、Ｘａ４１は、Ａであり、Ｘａ４２は、Ｉであり、Ｘａ４３は、Ａであり、Ｘａ４４は
、Ｓであり、Ｘａ４５は、Ｓであり、Ｘａ４６は、Ｒであり、Ｘａ４７は、Ｌであり、Ｘ
ａ４８は、Ｎであり、Ｘａ４９は、Ｐであり、Ｘａ５０は、Ｅであり、Ｘａ５１は、Ｔで
あり、Ｘａ５２は、Ｙであり、Ｘａ５３は、Ｇである。
特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号６１に示される重鎖可変領域および
配列番号６２に示される軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、
配列番号７１に示される重鎖可変領域および配列番号７２に示される軽鎖可変領域を含む
。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号７１に示される重鎖可変領域および
配列番号７０に示される軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、
配列番号６９に示される重鎖可変領域および配列番号７２に示される軽鎖可変領域を含む
。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号６９に示される重鎖可変領域および
配列番号７０に示される軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、
配列番号７３に示される重鎖可変領域および配列番号７４に示される軽鎖可変領域を含む
。
特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号６３に示される重鎖可変領域および
配列番号６４に示される軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、
配列番号７５に示される重鎖可変領域および配列番号７６に示される軽鎖可変領域を含む
。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号７７に示される重鎖可変領域および
配列番号７８に示される軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、
配列番号７５に示される重鎖可変領域および配列番号７８に示される軽鎖可変領域を含む
。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号７７に示される重鎖可変領域および
配列番号７６に示される軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、
配列番号７９に示される重鎖可変領域および配列番号８０に示される軽鎖可変領域を含む
。
本開示はまた、配列番号７～１２から選択される１、２、３、４、５または６種のＣＤ
Ｒを含むＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は、配列番号７～９から
選択される３種の重鎖ＣＤＲを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１０～１２
から選択される３種の軽鎖ＣＤＲを含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号２１に
示される重鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む。特定の実施形態では、抗体は
、配列番号２２に示される軽鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む。特定の実施
形態では、抗体は、配列番号２１に示される重鎖可変領域および配列番号２２に示される
軽鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む。
アッセイ試験によって測定される酸性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合およびアッセイ試験
によって測定される中性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合を有し、酸性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１と
の結合が中性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合よりも実質的に低い、単離されたＰＤ－Ｌ１抗
体。特定の実施形態では、酸性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－Ｌ１との結合は、同一ア
ッセイ設定で中性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合の８０％、７０％、６０％、５０％、４０
％、３０％、２０％、１０％または５％以下である。特定の実施形態では、中性ｐＨは、
７．４であり、酸性ｐＨは、６．０、５．５、５．０、４．５または４．０である。特定
の実施形態では、酸性のｐＨ６．０、ｐＨ５．５またはｐＨ５．０での本明細書において
提供されるＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－Ｌ１との結合は、同一アッセイ設定でのｐＨ７．４で
のＰＤ－Ｌ１との結合よりも実質的に低い。
特定の実施形態では、アッセイ設定は、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、表面プラズモン共鳴、
ＧＳＴプルダウン、エピトープ－タグ、免疫沈降、ファーウエスタン、蛍光共鳴エネルギ
ー移動、時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ－ＦＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
）、エンザイムイムノアッセイ、ラテックス凝集、ウエスタンブロットおよび免疫組織化
学およびそれらの組合せのいずれかによる、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合または遮断活性に
よって測定される。
特定の実施形態では、本開示はまた、ＰＤ－Ｌ１抗体と同一のエピトープと結合する、
またはＰＤ－Ｌ１抗体との競合結合を有する、単離されたＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。特
定の実施形態では、エピトープは、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基Ｅ５８、Ｋ６２、Ｎ
６３、Ｉ６４、Ｓ８０およびＹ８１のうち少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、３
個、４個または５個）を含む。特定の実施形態では、エピトープは、以下のＰＤ－Ｌ１の
アミノ酸残基：Ｒ１１３、Ｍ１１５、Ｙ１２３、Ｋ１２４およびＲ１２５のうち少なくと
も１個（例えば、少なくとも２個または３個）をさらに含む。特定の実施形態では、エピ
トープは、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８、Ｒ１１３、Ｍ１１５
、Ｙ１２３およびＫ１２４；２）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３およびＲ１２５のうち１種を
含む。特定の実施形態では、エピトープは、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｋ６２、
Ｎ６３、Ｉ６４、Ｙ８１およびＤ１２２のうち少なくとも１種（例えば、少なくとも２種
または３種）をさらに含む。特定の実施形態では、エピトープは、以下のＰＤ－Ｌ１のア
ミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８、Ｎ６３、Ｉ６４、Ｓ８０、Ｙ８１、Ｒ１１３およびＲ
１２５；２）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３、Ｍ１１５、Ｄ１２２、Ｙ１２３、Ｋ１２４およ
びＲ１２５；３）Ｅ５８、Ｋ６２、Ｎ６３、Ｓ８０、Ｙ８１、Ｒ１１３およびＲ１２５；
４）Ｅ５８、Ｎ６３、Ｉ６４、Ｓ８０、Ｙ８１、Ｒ１１３、Ｋ１２４およびＲ１２５のう
ち１種を含む。
酸性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合が同一アッセイ設定での中性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との
結合よりも実質的に低い単離されたＰＤ－Ｌ１抗体を対象に投与すること、およびそれに
よりＰＤ－Ｌ１関連状態を処置することを含む、それを必要とする対象においてＰＤ－Ｌ
１関連状態を処置する方法が本明細書において提供される。
特定の実施形態では、抗体は、参照投与量の８０％、７０％、６０％、５０％、４５％
、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％以下である投与量で投
与され、参照投与量は、同等のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を達成するように参照抗体によっ
て決定され、参照抗体は、酸性ｐＨおよび中性ｐＨの両方でＰＤ－Ｌ１との同様の結合を
示し、参照抗体および抗体は、中性ｐＨでＰＤ－Ｌ１との同様の結合を有する。
特定の実施形態では、抗体は、参照投与頻度のものより少ない投与頻度で投与され、参
照投与頻度は、同等のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を達成するように参照抗体によって決定さ
れ、参照抗体は、酸性ｐＨおよび中性ｐＨの両方でＰＤ－Ｌ１との同様の結合を示し、参
照抗体および抗体は、中性ｐＨでＰＤ－Ｌ１との同様の結合を有する。
特定の実施形態では、抗体は、参照ｉｎ ｖｉｖｏ半減期よりも長い、標的臓器におけ
るｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有し、参照ｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、参照抗体によって決定さ
れ、参照抗体は、酸性ｐＨおよび中性ｐＨの両方でＰＤ－Ｌ１との同様の結合を示し、参
照抗体および抗体は、中性ｐＨでＰＤ－Ｌ１との同様の結合を有する。特定の実施形態で
は、標的臓器は、血清、腎臓、肺、膵臓、肝臓、胆嚢、膀胱、皮膚、食道、卵巣、乳房、
結腸、直腸、胃、脾臓または脳のうち１種または複数を含む。
本開示は、重鎖ＨＣＤＲ１’、ＨＣＤＲ２’およびＨＣＤＲ３’ならびに軽鎖ＬＣＤＲ
１’、ＬＣＤＲ２’およびＬＣＤＲ３’配列を含む単離されたＰＤ－Ｌ１抗体を本明細書
においてさらに提供し、
ＨＣＤＲ１’配列は、ＤＹＹＭＮ（配列番号２３）、配列番号２９、３５、４１および
その少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、
９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のある相同体
配列からなる群から選択され、
ＨＣＤＲ２’配列は、ＤＩＮＰＮＮＧＧＴＳＹＮＸ’１ＫＦＸ’２Ｇ（配列番号２４）
、配列番号３０、３６、４２またはその少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、
８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％）の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
ＨＣＤＲ３’配列は、ＶＫＷＧＤＧＰＦＡＹ（配列番号２５）、配列番号３１、３７、
４３およびその少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性の
ある相同体配列からなる群から選択され、
ＬＣＤＲ１’配列は、Ｘ’３ＡＳＱＮＶＧＡＡＶＡ（配列番号２６）、配列番号３２、
３８、４４およびその少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同
一性のある相同体配列からなる群から選択され、
ＬＣＤＲ２’配列は、ＳＡＳＮＸ’４Ｘ’５Ｔ（配列番号２７）、配列番号３３、３９
、４５およびその少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性
のある相同体配列からなる群から選択され、
ＬＣＤＲ３’配列は、ＱＱＹＳＮＹＰＴ（配列番号２８）、配列番号３４、４０、４６
およびその少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のある
相同体配列からなる群から選択され、
Ｘ’１は、ＨまたはＱであり、Ｘ’２は、ＫまたはＱであり、Ｘ’３は、ＫまたはＱで
あり、Ｘ’４は、ＲまたはＬであり、Ｘ’５は、ＹまたはＥである。
特定の実施形態では、Ｘ’１は、Ｑであり、Ｘ’２は、Ｑであり、Ｘ’３は、Ｑであり
、Ｘ’４は、Ｒであり、Ｘ’５は、Ｙである。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体は、ＨＦＲ１’、Ｈ
ＦＲ２’、ＨＦＲ３’およびＨＦＲ４’の重鎖フレームワークならびにＬＦＲ１’、ＬＦ
Ｒ２’、ＬＦＲ３’およびＬＦＲ４’の軽鎖フレームワーク配列を含み、重鎖可変領域の
配列は、式：ＨＦＲ１’－ＨＣＤＲ１’－ＨＦＲ２’－ＨＣＤＲ１’－ＨＦＲ３’－ＨＣ
ＤＲ１’－ＨＦＲ４’に従い、軽鎖可変領域の配列は、式ＬＦＲ１’－ＬＣＤＲ１’－Ｌ
ＦＲ２’－ＬＣＤＲ１’－ＬＦＲ３’－ＬＣＤＲ１’－ＬＦＲ４’に従う。
特定の実施形態では、ＨＦＲ１’配列は、Ｘ’ａ１ＶＱＬＸ’ａ２ＱＳＧＸ’ａ３ＥＸ
’ａ４Ｘ’ａ５ＫＰＧＡＳＶＫＸ’ａ６ＳＣＫＡＳＧＹＶＦＴ（配列番号４７）であり、
ＨＦＲ２’配列は、ＷＶＸ’ａ７ＱＸ’ａ８Ｘ’ａ９ＧＸ’ａ１０Ｘ’ａ１１ＬＥＷＩ
Ｇ（配列番号４８）であり、
ＨＦＲ３’配列は、Ｘ’ａ１２Ｘ’ａ１３ＴＶＴＶＤＸ’ａ１４ＳＸ’ａ１５Ｘ’ａ１
６ＴＡＹＭＥＬＸ’ａ１７Ｘ’ａ１８ＬＸ’ａ１９ＳＸ’ａ２０ＤＸ’ａ２１ＡＶＹＹＣ
（配列番号４９）であり、
ＨＦＲ４’配列は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＸ’ａ２２（配列番号５０）であり、
ＬＦＲ１’配列は、ＤＩＸ’ａ２３ＭＴＱＳＸ’ａ２４Ｘ’ａ２５Ｘ’ａ２６Ｘ’ａ２
７ＳＸ’ａ２８ＳＶＧＤＲＶＸ’ａ２９ＩＴＣ（配列番号５１）であり、
ＬＦＲ２’配列は、ＷＹＱＱＫＰＧＸ’ａ３０Ｘ’ａ３１ＰＫＬＬＩＹ（配列番号５２
）であり、
ＬＦＲ３’配列は、ＧＶＰＸ’ａ３２ＲＦＸ’ａ３３ＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＸ’
ａ３４Ｘ’ａ３５ＱＸ’ａ３６ＥＤＸ’ａ３７ＡＸ’ａ３８ＹＦＣ（配列番号５３）であ
り、
ＬＦＲ４’配列は、ＦＧＳＧＴＫＬＧＩＫ（配列番号５４）であり、
ここで、Ｘ’ａ１は、ＱまたはＥであり、Ｘ’ａ２は、ＱまたはＶであり、Ｘ’ａ３は
、ＡまたはＰであり、Ｘ’ａ４は、ＬまたはＶであり、Ｘ’ａ５は、ＶまたはＫであり、
Ｘ’ａ６は、ＩまたはＶであり、Ｘ’ａ７は、ＫまたはＲであり、Ｘ’ａ８は、Ｓまたは
Ａであり、Ｘ’ａ９は、ＨまたはＰであり、Ｘ’ａ１０は、ＱまたはＫであり、Ｘ’ａ１
１は、ＳまたはＧであり、Ｘ’ａ１２は、ＫまたはＲであり、Ｘ’ａ１３は、ＡまたはＶ
であり、Ｘ’ａ１４は、ＫまたはＴであり、Ｘ’ａ１５は、Ｓ、ＴまたはＩであり、Ｘ’
ａ１６は、ＳまたはＲであり、Ｘ’ａ１７は、ＬまたはＳであり、Ｘ’ａ１８は、Ｓまた
はＲであり、Ｘ’ａ１９は、ＲまたはＴであり、Ｘ’ａ２０は、ＥまたはＤであり、Ｘ’
ａ２１は、ＳまたはＴであり、Ｘ’ａ２２は、ＡまたはＳであり、Ｘ’ａ２３は、Ｑまた
はＶであり、Ｘ’ａ２４は、ＱまたはＰであり、Ｘ’ａ２５は、ＫまたはＳであり、Ｘ’
ａ２６は、ＦまたはＳであり、Ｘ’ａ２７は、ＭまたはＬであり、Ｘ’ａ２８は、Ｔまた
はＡであり、Ｘ’ａ２９は、ＳまたはＴであり、Ｘ’ａ３０は、ＱまたはＫであり、Ｘ’
ａ３１は、ＳまたはＡであり、Ｘ’ａ３２は、ＳまたはＤであり、Ｘ’ａ３３は、Ｓまた
はＴであり、Ｘ’ａ３４は、ＳまたはＮであり、Ｘ’ａ３５は、ＭまたはＬであり、Ｘ’
ａ３６は、ＳまたはＰであり、Ｘ’ａ３７は、ＬまたはＩであり、Ｘ’ａ３８は、Ｄまた
はＴである。
特定の実施形態では、Ｘ’ａ１は、Ｑであり、Ｘ’ａ２は、Ｖであり、Ｘ’ａ３は、Ａ
であり、Ｘ’ａ４は、Ｖであり、Ｘ’ａ５は、Ｖであり、Ｘ’ａ６は、Ｉであり、Ｘ’ａ
７は、Ｋであり、Ｘ’ａ８は、Ａであり、Ｘ’ａ９は、Ｐであり、Ｘ’ａ１０は、Ｑであ
り、Ｘ’ａ１１は、Ｇであり、Ｘ’ａ１２は、Ｒであり、Ｘ’ａ１３は、Ａであり、Ｘ’
ａ１４は、Ｋであり、Ｘ’ａ１５は、Ｔであり、Ｘ’ａ１６は、Ｒであり、Ｘ’ａ１７は
、Ｓであり、Ｘ’ａ１８は、Ｒであり、Ｘ’ａ１９は、Ｒであり、Ｘ’ａ２０は、Ｄであ
り、Ｘ’ａ２１は、Ｔであり、Ｘ’ａ２２は、Ｓであり、Ｘ’ａ２３は、Ｑであり、Ｘ’
ａ２４は、Ｑであり、Ｘ’ａ２５は、Ｓであり、Ｘ’ａ２６は、Ｓであり、Ｘ’ａ２７は
、Ｌであり、Ｘ’ａ２８は、Ａであり、Ｘ’ａ２９は、Ｔであり、Ｘ’ａ３０は、Ｋであ
り、Ｘ’ａ３１は、Ａであり、Ｘ’ａ３２は、Ｓであり、Ｘ’ａ３３は、Ｓであり、Ｘ’
ａ３４は、Ｓであり、Ｘ’ａ３５は、Ｍであり、Ｘ’ａ３６は、Ｐであり、Ｘ’ａ３７は
、Ｉであり、Ｘ’ａ３８は、Ｔである。
特定の実施形態では、Ｘ’ａ１は、Ｑであり、Ｘ’ａ２は、Ｖであり、Ｘ’ａ３は、Ａ
であり、Ｘ’ａ４は、Ｖであり、Ｘ’ａ５は、Ｋであり、Ｘ’ａ６は、Ｖであり、Ｘ’ａ
７は、Ｒであり、Ｘ’ａ８は、Ａであり、Ｘ’ａ９は、Ｐであり、Ｘ’ａ１０は、Ｑであ
り、Ｘ’ａ１１は、Ｇであり、Ｘ’ａ１２は、Ｒであり、Ｘ’ａ１３は、Ｖであり、Ｘ’
ａ１４は、Ｔであり、Ｘ’ａ１５は、Ｉであり、Ｘ’ａ１６は、Ｒであり、Ｘ’ａ１７は
、Ｓであり、Ｘ’ａ１８は、Ｒであり、Ｘ’ａ１９は、Ｒであり、Ｘ’ａ２０は、Ｄであ
り、Ｘ’ａ２１は、Ｔであり、Ｘ’ａ２２は、Ｓであり、Ｘ’ａ２３は、Ｑであり、Ｘ’
ａ２４は、Ｑであり、Ｘ’ａ２５は、Ｓであり、Ｘ’ａ２６は、Ｓであり、Ｘ’ａ２７は
、Ｌであり、Ｘ’ａ２８は、Ａであり、Ｘ’ａ２９は、Ｔであり、Ｘ’ａ３０は、Ｋであ
り、Ｘ’ａ３１は、Ａであり、Ｘ’ａ３２は、Ｓであり、Ｘ’ａ３３は、Ｓであり、Ｘ’
ａ３４は、Ｓであり、Ｘ’ａ３５は、Ｍであり、Ｘ’ａ３６は、Ｐであり、Ｘ’ａ３７は
、Ｉであり、Ｘ’ａ３８は、Ｔである。
特定の実施形態では、Ｘ’ａ１は、Ｑであり、Ｘ’ａ２は、Ｖであり、Ｘ’ａ３は、Ａ
であり、Ｘ’ａ４は、Ｖであり、Ｘ’ａ５は、Ｖであり、Ｘ’ａ６は、Ｉであり、Ｘ’ａ
７は、Ｋであり、Ｘ’ａ８は、Ａであり、Ｘ’ａ９は、Ｐであり、Ｘ’ａ１０は、Ｑであ
り、Ｘ’ａ１１は、Ｇであり、Ｘ’ａ１２は、Ｒであり、Ｘ’ａ１３は、Ａであり、Ｘ’
ａ１４は、Ｋであり、Ｘ’ａ１５は、Ｔであり、Ｘ’ａ１６は、Ｒであり、Ｘ’ａ１７は
、Ｓであり、Ｘ’ａ１８は、Ｒであり、Ｘ’ａ１９は、Ｒであり、Ｘ’ａ２０は、Ｄであ
り、Ｘ’ａ２１は、Ｔであり、Ｘ’ａ２２は、Ｓであり、Ｘ’ａ２３は、Ｑであり、Ｘ’
ａ２４は、Ｐであり、Ｘ’ａ２５は、Ｓであり、Ｘ’ａ２６は、Ｓであり、Ｘ’ａ２７は
、Ｌであり、Ｘ’ａ２８は、Ａであり、Ｘ’ａ２９は、Ｔであり、Ｘ’ａ３０は、Ｋであ
り、Ｘ’ａ３１は、Ａであり、Ｘ’ａ３２は、Ｓであり、Ｘ’ａ３３は、Ｓであり、Ｘ’
ａ３４は、Ｓであり、Ｘ’ａ３５は、Ｌであり、Ｘ’ａ３６は、Ｐであり、Ｘ’ａ３７は
、Ｉであり、Ｘ’ａ３８は、Ｔである。
特定の実施形態では、Ｘ’ａ１は、Ｑであり、Ｘ’ａ２は、Ｖであり、Ｘ’ａ３は、Ａ
であり、Ｘ’ａ４は、Ｖであり、Ｘ’ａ５は、Ｋであり、Ｘ’ａ６は、Ｖであり、Ｘ’ａ
７は、Ｒであり、Ｘ’ａ８は、Ａであり、Ｘ’ａ９は、Ｐであり、Ｘ’ａ１０は、Ｑであ
り、Ｘ’ａ１１は、Ｇであり、Ｘ’ａ１２は、Ｒであり、Ｘ’ａ１３は、Ｖであり、Ｘ’
ａ１４は、Ｔであり、Ｘ’ａ１５は、Ｉであり、Ｘ’ａ１６は、Ｒであり、Ｘ’ａ１７は
、Ｓであり、Ｘ’ａ１８は、Ｒであり、Ｘ’ａ１９は、Ｒであり、Ｘ’ａ２０は、Ｄであ
り、Ｘ’ａ２１は、Ｔであり、Ｘ’ａ２２は、Ｓであり、Ｘ’ａ２３は、Ｑであり、Ｘ’
ａ２４は、Ｐであり、Ｘ’ａ２５は、Ｓであり、Ｘ’ａ２６は、Ｓであり、Ｘ’ａ２７は
、Ｌであり、Ｘ’ａ２８は、Ａであり、Ｘ’ａ２９は、Ｔであり、Ｘ’ａ３０は、Ｋであ
り、Ｘ’ａ３１は、Ａであり、Ｘ’ａ３２は、Ａであり、Ｘ’ａ３３は、Ｓであり、Ｘ’
ａ３４は、Ｓであり、Ｘ’ａ３５は、Ｌであり、Ｘ’ａ３６は、Ｐであり、Ｘ’ａ３７は
、Ｉであり、Ｘ’ａ３８は、Ｔである。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号６５に
示される重鎖可変領域および配列番号６６に示される軽鎖可変領域を含む。特定の実施形
態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号６７に示される重鎖可
変領域および配列番号６８に示される軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本明細
書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号６５に示される重鎖可変領域および配
列番号６８に示される軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本明細書において提供
されるＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号６７に示される重鎖可変領域および配列番号６６に示
される軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ
１抗体は、配列番号８５に示される重鎖可変領域および配列番号８６に示される軽鎖可変
領域を含む。
本開示は、配列番号２９～４６から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６
つのＣＤＲを含む別の単離されたＰＤ－Ｌ１抗体を本明細書においてさらに提供した。特
定の実施形態では、１）配列番号２９である重鎖ＨＣＤＲ１’、配列番号３０であるＨＣ
ＤＲ２’および配列番号３１であるＨＣＤＲ３’；２）配列番号３５である重鎖ＨＣＤＲ
１’、配列番号３６であるＨＣＤＲ２’および配列番号３７であるＨＣＤＲ３’；または
３）配列番号４１である重鎖ＨＣＤＲ１’、配列番号４２であるＨＣＤＲ２’、および配
列番号４３であるＨＣＤＲ３’を含む、単離されたＰＤ－Ｌ１抗体。特定の実施形態では
、ＰＤ－Ｌ１抗体は、１）配列番号３２である軽鎖ＬＣＤＲ１’、配列番号３３であるＬ
ＣＤＲ２’および配列番号３４であるＬＣＤＲ３’；２）配列番号３８である軽鎖ＬＣＤ
Ｒ１’、配列番号３９であるＬＣＤＲ２’および配列番号４０であるＬＣＤＲ３’；また
は３）配列番号４４である軽鎖ＬＣＤＲ１’、配列番号４５であるＬＣＤＲ２’および配
列番号４６であるＬＣＤＲ３’を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、１）配
列番号２９である重鎖ＨＣＤＲ１’、配列番号３０であるＨＣＤＲ２’および配列番号３
１であるＨＣＤＲ３’、配列番号３２である軽鎖ＬＣＤＲ１’、配列番号３３であるＬＣ
ＤＲ２’および配列番号３４であるＬＣＤＲ３’；２）配列番号３５である重鎖ＨＣＤＲ
１’、配列番号３６であるＨＣＤＲ２’および配列番号３７であるＨＣＤＲ３’、配列番
号３８である軽鎖ＬＣＤＲ１’、配列番号３９であるＬＣＤＲ２’および配列番号４０で
あるＬＣＤＲ３’；または３）配列番号４１である重鎖ＨＣＤＲ１’、配列番号４２であ
るＨＣＤＲ２’および配列番号４３であるＨＣＤＲ３’、配列番号４４である軽鎖ＬＣＤ
Ｒ１’、配列番号４５であるＬＣＤＲ２’および配列番号４６であるＬＣＤＲ３’を含む
。
特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号５５、５７および５９から選択され
る重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号５６、５８お
よび６０から選択される軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号５５の重鎖可変領域またはそのヒト
化バージョンおよび配列番号５６の軽鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む。特
定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号５７の重鎖可変領域またはそのヒト化バ
ージョンおよび配列番号５８の軽鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む。特定の
実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号５９の重鎖可変領域またはそのヒト化バージ
ョンおよび配列番号６０の軽鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む。
本開示はまた、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体と同一のエピトープと結合
する、または本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体との競合結合を有する別の単離
されたＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。特定の実施形態では、エピトープは、少なくともＥ５
８およびＳ８０のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、エピトープは、以下のＰＤ
－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｙ５６、Ｒ１１３、Ｄ１２２、Ｙ１２３およびＲ１２５のうち少
なくとも１個（例えば、少なくとも２個、３個または４個）をさらに含む。特定の実施形
態では、エピトープは、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８、Ｒ１１
３、Ｄ１２２、Ｙ１２３およびＲ１２５；２）Ｙ５６、Ｅ５８およびＲ１１３；３）Ｅ５
８、Ｒ１１３およびＲ１２５のうち１種を含む。特定の実施形態では、エピトープは、以
下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｓ８０およびＤ１２２のうち少なくとも１種（または少
なくとも２種）をさらに含む。特定の実施形態では、エピトープは、以下のＰＤ－Ｌ１の
アミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３、Ｄ１２２、Ｙ１２３およびＲ１
２５；２）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３およびＲ１２５のうち１種を含む。
本開示はまた、示差走査熱量測定によって測定される、摂氏７６℃超（例えば、８０℃
超、８５℃超または９０℃超）の熱転移中点（Ｔｍ）を有する、単離されたＰＤ－Ｌ１抗
体を本明細書において提供した。特定の実施形態では、本明細書における抗体は、二重特
異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、標識化抗体、二
価抗体または抗イディオタイプ抗体である。特定の実施形態では、抗体は、ラクダ化単一
ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓ
Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ
ダイアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、単離されたＣＤＲおよび二価ドメイン抗体か
らなる群から選択される抗原結合断片である。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体（４Ｂ６、２６Ｆ５
、２１Ｆ１１、２３Ａ１１、２３Ｆ１１および２２Ｃ９など）は、ヒトおよび非ヒト霊長
類ＰＤ－Ｌ１と結合するが、マウスＰＤ－Ｌ１と結合しない。特定の実施形態では、本明
細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体（１８Ｇ４など）は、ヒトおよびマウスＰＤ－Ｌ
１の両方と結合する。
本開示はまた、本明細書において提供される抗体を含む医薬組成物に関する。
本開示はまた、本明細書において提供される抗体をコードするポリヌクレオチドに関す
る。ポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書において提供される。ベクターを含む単
離された宿主細胞も、本明細書において提供される。特定の実施形態では、宿主細胞は、
ポリヌクレオチドによってコードされる抗体を産生する。
本開示はまた、本明細書において提供される抗体を含むキットに関する。
本開示はまた、本明細書において提供される抗体を産生する方法であって、宿主細胞を
ポリヌクレオチドが発現する条件下で培養することを含む方法に関する。
本開示はまた、それを必要とする対象においてＰＤ－Ｌ１関連状態を処置する方法であ
って、対象に、本明細書において提供される抗体の治療有効量を投与することを含む方法
に関する。特定の実施形態では、第２の治療剤は、放射線療法、化学療法、標的化療法、
遺伝子療法、免疫療法、ホルモン療法、血管新生阻害、緩和ケア、手術またはそれらの組
合せにおいて使用される薬剤である。特定の実施形態では、第２の治療剤は、ＶＥＧＦＲ
２抗体である。
本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体および第２の治療剤を含む医薬組成物も、
本開示において提供される。
それを必要とする対象においてＰＤ－Ｌ１関連状態を処置する方法であって、対象へ、
医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法が、本開示においてさらに提供される
。
本開示はまた、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む単離さ
れた非ヒト腫瘍細胞を提供した。特定の実施形態では、非ヒト腫瘍細胞は、げっ歯類（例
えば、マウス、ラットまたはハムスターなど）腫瘍細胞である。
本明細書においてまた、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含
む非ヒト腫瘍細胞を産生する方法であって、ヒトＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチ
ドを導入することを含む方法も提供される。特定の実施形態では、方法は、内因性非ヒト
ＰＤ－Ｌ１遺伝子を不活性化することをさらに含む。特定の実施形態では、不活性化は、
タンパク質コーディング領域の遺伝子破壊、変異、付加、遺伝子サイレンシングまたは遺
伝子欠失を含み、それによって、標的遺伝子の発現を排除または最小化するか、または機
能的に不活性な／末端切断型タンパク質を生成する。特定の実施形態では、ヒトＰＤ－Ｌ
１遺伝子セグメントは、内因性非ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子座中に作動可能に挿入される。特
定の実施形態では、ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子セグメントは、内因性非ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子
座以外の部位に挿入される。特定の実施形態では、ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子セグメントは、
エピソームＤＮＡセグメントの形態である。
ヒトＰＤ－Ｌ１に対する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性をスクリーニングまたは評価する
方法であって、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む非ヒト腫
瘍細胞を非ヒト動物に接種することと、非ヒト動物において抗体を非ヒト腫瘍細胞と接触
させることと、非ヒト腫瘍細胞の腫瘍量を決定することとを含む方法。腫瘍細胞は、固形
腫瘍細胞または非固形腫瘍細胞であり得る。特定の実施形態では、非ヒト細胞は、同質遺
伝子的腫瘍モデルを作製するために同質遺伝子的非ヒト動物に接種される。特定の実施形
態では、非ヒト動物は、げっ歯類（例えば、マウス、ラットまたはハムスターなど）であ
る。
一態様では、本開示は、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８および
Ｓ８０；２）Ｅ５８およびＲ１１３；３）Ｅ５８およびＤ１２２；４）Ｅ５８およびＲ１
２５のうち１種を含むエピトープと結合する、またはそれとの競合結合を有する、単離さ
れたＰＤ－Ｌ１抗体を本明細書において提供する。特定の実施形態では、エピトープは、
以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｙ５６およびＹ１２３のうち少なくとも１種をさらに
含む。特定の実施形態では、エピトープは、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：
１）Ｅ５８、Ｒ１１３、Ｍ１１５、Ｙ１２３およびＫ１２４；２）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１
１３およびＲ１２５；３）Ｅ５８、Ｒ１１３、Ｄ１２２、Ｙ１２３およびＲ１２５；４）
Ｙ５６、Ｅ５８およびＲ１１３、５）Ｅ５８、Ｒ１１３およびＲ１２５のうち１種を含む
。特定の実施形態では、エピトープは、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｋ６２、Ｎ６
３、Ｉ６４およびＹ８１のうち少なくとも１種をさらに含む。特定の実施形態では、エピ
トープは、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８、Ｎ６３、Ｉ６４、Ｓ
８０、Ｙ８１、Ｒ１１３およびＲ１２５；２）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３、Ｍ１１５、Ｄ
１２２、Ｙ１２３、Ｋ１２４およびＲ１２５；３）Ｅ５８、Ｋ６２、Ｎ６３、Ｓ８０、Ｙ
８１、Ｒ１１３およびＲ１２５；４）Ｅ５８、Ｎ６３、Ｉ６４、Ｓ８０、Ｙ８１、Ｒ１１
３、Ｋ１２４およびＲ１２５；５）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３、Ｄ１２２、Ｙ１２３およ
びＲ１２５のうち１種を含む。
一態様では、ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基Ｓ８０からなるエピトープと結合する、または
それとの競合結合を有する、単離されたＰＤ－Ｌ１抗体も本明細書において提供される。
一態様では、本開示は、少なくとも７日（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５
、３０、３５または４０日）の持続したＰＤ－Ｌ１受容体占有期間を有する、単離された
ＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。
ＥＬＩＳＡによって測定される約０．０３μｇ／ｍｌの（例えば、ＥＬＩＳＡによって
測定される０．００１μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ（例えば、０．００１μｇ／ｍｌ～０．
５μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ～０．
１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～０．１μ
ｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～０．０５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～０．０３μ
ｇ／ｍｌまたは０．００１μｇ／ｍｌ～０．０１μｇ／ｍｌの）ＥＣ５０値、またはＦＡ
ＣＳによって測定される０．０１μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ（例えば、０．０１μｇ／ｍ
ｌ～０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ～
１μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ～０．５μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ～０．２μ
ｇ／ｍｌまたは０．０２μｇ／ｍｌ～０．１μｇ／ｍｌ）のＥＣ５０を有する、活性化さ
れたヒトＴ細胞と結合する、単離されたＰＤ－Ｌ１抗体。
図１Ａは、ＥＬＩＳＡ解析によって測定される、ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃの、プレート上にコーティングされたｈＰＤ－１－ｈｉｓとの結合を遮断する、ハイブリドーマ上清中のマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体の能力を提示する棒グラフである。図１Ｂは、ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃの、プレート上にコーティングされたｈＰＤ－１－ｈｉｓとの結合を遮断する、ハイブリドーマ上清中のマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体の能力を提示する棒グラフである。図１Ｃはまた、ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃの、プレート上にコーティングされたｈＰＤ－１－ｈｉｓとの結合を遮断する、ハイブリドーマ上清中のマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体の能力を提示する棒グラフである。 図２Ａは、ハイブリドーマ上清中のマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体２３Ａ１１の、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓとのｐＨ依存性結合を示す図示であり、ＥＬＩＳＡ解析によって測定されるようにｐＨ７．４でより高い結合を有し（三角）、ｐＨ６．０でより低い結合を有する（菱形）。図２Ｂは、ハイブリドーマ上清中のマウス抗体クローン２３Ｆ１１の、ｈＰＤ－Ｌ１とのｐＨ依存性結合を示し、ＥＬＩＳＡ解析によって測定されるようにｐＨ７．４でより高い結合を有し（三角）、ｐＨ６．０でより低い結合を有する（菱形）。 図３は、ＥＬＩＳＡ解析によって測定される、段階希釈した精製マウスモノクローナルＰＤ－Ｌ１抗体（２１Ｆ１１（×）、２３Ｆ１１（菱形）、２６Ｆ５（中白丸）、２２Ｃ９（中白三角）、４Ｂ６（中黒四角）、２３Ａ１１（中黒三角））の種々のクローンの、ｈＰＤ－Ｌ１との結合を示す図である。 図４Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定される、ｈＰＤ－１－ＦｃのｈＰＤ－１－Ｎ２９７Ａ－ビオチンとの結合の遮断における、段階希釈した精製マウスモノクローナルＰＤ－Ｌ１抗体（２３Ａ１１（淡い灰色の中黒四角）、２３Ｆ１１（中黒三角）、４Ｂ６（中黒丸）、２２Ｃ９（中黒菱形）、２６Ｆ５（濃い中黒四角）、２１Ｆ１１（逆三角）およびＢＭ－ＧＴ（中白丸））の活性を示す図である。図４Ｂは、ＦＡＣＳ解析によって測定される、ｈＰＤ－１－Ｆｃ Ｎ２９７Ａの、ＨＣＣ８２７上で発現されたｈＰＤ－Ｌ１との結合の遮断における、１０μｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１抗体の活性を示す図である。 図５Ａは、マウス精製ＰＤ－Ｌ１抗体の、ＨＣＣ８２７上で発現されたｈＰＤ－Ｌ１との用量依存性結合を示す図である。図５Ｂは、ｈＰＤ－１－Ｎ２９７Ａの、ＨＣＣ８２７上で発現されたｈＰＤ－Ｌ１との結合の遮断における、マウス精製ＰＤ－Ｌ１抗体の用量依存性結合を示す図である。２１Ｆ１１（丸）、２３Ａ１１（三角）、２３Ｆ１１（逆三角）、２２Ｃ９（菱形）および４Ｂ６（大きな丸）。 ［図６Ａおよび図６Ｂ］図６Ａ（４Ｂ６－Ｃ）、図６Ｂ（２３Ａ１１）、図６Ｃ（２３Ｆ１１）、図６Ｄ（２２Ｃ９）および図６Ｅ（２１Ｆ１１）は、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、マウスおよび／またはキメラＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒトおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓと同様に結合する一方、ヒトおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１と特異的に結合するものは、１８Ｇ４がヒトおよびマウスＰＤ－Ｌ１と結合することを除いて（図６Ｆ）、マウスＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓと結合しないことを示す図である。 ［図６Ｃおよび図６Ｄ］同上。 図６Ｇは、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、すべての抗体が、ｈＰＤ－Ｌ１と結合できるが、ｈＰＤ－Ｌ２と結合できないことを示す図である。 図７は、ＦＡＣＳによって測定される、キメラおよび／またはヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の、ＨＣＣ８２７上で発現されたｈＰＤ－Ｌ１との結合を例示する図である。 図８は、ＦＡＣＳによって測定される、ＰＤ－１の、ＨＣＣ８２７上で発現されたｈＰＤ－Ｌ１との結合の遮断における、キメラおよび／またはヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の活性を示す図である。 図９Ａ（１８Ｇ４）、図９Ｂ（４Ｂ６）および図９Ｃ（２３Ａ１１）は、それぞれ、競合ＥＬＩＳＡによって測定される、競合抗体４Ｂ６、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２２Ｃ９および２１Ｆ１１の存在下での、ＰＤ－Ｌ１抗体のｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃとのエピトープ結合の結果を示す棒グラフである。 図１０Ａ（２３Ｆ１１－Ｃ）、図１０Ｂ（２３Ａ１１－Ｃ）、図１０Ｃ（２２Ｃ９－Ｃ）、図１０Ｄ（２１Ｆ１１－Ｃ）、図１０Ｅ（４Ｂ６－Ｃ）および図１０Ｆ（２６Ｆ５－Ｃ）は、それぞれ、ＥＬＩＳＡ解析によって測定される、ｐＨ７．４およびｐＨ５．５での、キメラＰＤ－Ｌ１抗体のｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓとのｐＨ依存性結合を示すグラフである。 図１１Ａは、腫瘍の成長の阻害における、精製マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体（４Ｂ６（中黒菱形）、２３Ａ１１（中白逆三角）、２３Ｆ１１（中黒縞模様の菱形）および２６Ｆ５（中白菱形））および媒体（中黒丸）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す、ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおいて経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示す。図１１Ｂは、同一抗体の２９日目での平均化された腫瘍体積を示す。図１１Ｃは、同一抗体の経時的に測定された平均化された体重を示す。マウス（各群についてｎ＝８）に、１０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、ｍｐｋ）の抗体を３回／週で３週間ＩＰ注射し、その結果が、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されている。 図１２Ａは、腫瘍の成長の阻害における、精製マウス／キメラＰＤ－Ｌ１抗体（４Ｂ６－Ｃ（淡い灰色の中黒三角）、２３Ｆ１１（濃い中黒の逆三角））およびＢＭ－ＧＴのベンチマーク抗体（中白丸）およびＢＭ－ＭＥ（中白四角）または対照ＰＢＳ（中黒丸）を注射された、ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおいて、経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示す図であり、これは、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す。図１２Ｂは、それぞれ、１ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の前記抗体を３回／週で３週間ＩＰ注射されたマウス（各群についてｎ＝８）の、２０日目の平均化された腫瘍体積を示す。 図１２Ｃは、経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示す。図１２Ｄは、１ｍｐｋ（淡い灰色の中黒逆三角）または３ｍｐｋ（中黒菱形）マウス抗体１８Ｇ４をＩＶ注射されたマウス（各群についてｎ＝８）の、２５日目の平均化された腫瘍体積を示す。 図１２Ｅは、経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示す。図１２Ｆは、それぞれ、１ｍｐｋ（中白丸）または３ｍｐｋ（中白四角）マウス２２Ｃ９をＩＶ注射されたマウス（各群についてｎ＝８）の、２５日目の平均化された腫瘍体積を示す。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されている。 図１３Ａは、ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおいて経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示し、これは、腫瘍の成長の阻害における、精製ｐＨ依存性キメラＰＤ－Ｌ１抗体（中白丸での２３Ａ１１－Ｃ、中白三角での２３Ｆ１１－Ｃ）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す。図１３Ｂは、２９日目での平均化された腫瘍体積を示す。マウス（各群についてｎ＝８）は、１ｍｐｋ抗体を３回／週で３週間 ＩＰ注射され、結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表され、Ｐは、＜０．０５である。媒体は、中黒丸で表されており、ベンチマークＧＴは、中黒逆三角である。 図１４Ａは、４Ｂ６の生殖系列およびヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列（４Ｂ６－生殖系列、４Ｂ６－Ｈｚｄ－ＨＣ－Ｖ３および４Ｂ６－ＨＣ－Ｖ４）を示す。図１４Ｂは、４Ｂ６の生殖系列およびヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列（４Ｂ６ＬＣ生殖系列、４Ｂ６－Ｈｚｄ－ＬＣ－Ｖ３および４Ｂ６－ＬＣ－Ｖ４）を示す。 図１５Ａは、２３Ａ１１抗体の生殖系列およびヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列（２３Ａ１１－ＨＣ－生殖系列、２３Ａ１１－ＨＣ－Ｖ３および２３Ａ１１－ＨＣ－Ｖ５）を示す。図１５Ｂは、２３Ａ１１抗体の生殖系列およびヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列（２３Ａ１１－ＬＣ－生殖系列、２３Ａ１１－ＬＣ－Ｖ３および２３Ａ１１－ＬＣ－Ｖ５）を示す。 図１６Ａは、２３Ｆ１１抗体の生殖系列およびヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列（２３Ｆ１１生殖系列ＨＣ、２３Ｆ１１－ＨＣ－Ｖ４および２３Ｆ１１－ＨＣ－Ｖ６）を示す。図１６Ｂは、２３Ｆ１１抗体の生殖系列およびヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列（２３Ｆ１１生殖系列ＬＣ、２３Ｆ１１－ＬＣ－Ｖ４および２３Ｆ１１－ＬＣ－Ｖ６）を示す。 図１７Ａは、２３Ｆ１１抗体（Ｈ４Ｌ４、Ｈ４Ｌ６、Ｈ６Ｌ４、Ｈ６Ｌ６およびキメラ）の結合を示す棒グラフである。図１７Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定される、ヒト化２３Ａ１１抗体（Ｈ３Ｌ３、Ｈ３Ｌ５、Ｈ５Ｌ３およびＨ５Ｌ５）の、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓとの結合を示す図である。 ［図１８Ａおよび図１８Ｂ］図１８Ａ～図１８Ｄは、ＥＬＩＳＡによって測定される、ｈＰＤ－Ｌ１－ＦｃのｈＰＤ－１－Ｎ２９７Ａとの結合の遮断における、ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の活性を示す棒グラフである。ヒト化４Ｂ６（Ｈ３Ｌ３、Ｈ３Ｌ４、Ｈ４Ｌ３およびＨ４Ｌ４、図１８Ａ）、２３Ｆ１１（Ｈ４Ｌ４、Ｈ４Ｌ６、Ｈ６Ｌ４、Ｈ６Ｌ６およびキメラ（Ｃ）、図１８Ｂ）、ヒト化２３Ａ１１（Ｈ３Ｌ３、Ｈ３Ｌ５、Ｈ５Ｌ３およびＨ５Ｌ５、図１８Ｃ）およびヒト化２３Ａ１１（Ｈ３Ｌ３およびＨ３Ｌ５）およびヒト化２３Ｆ１１（Ｈ４Ｌ４）ならびにベンチマーク抗体（ＢＭ－ＧＴおよびＢＭ－ＭＥ、図１８Ｄを参照のこと）の結果が、それぞれ示された。 ［図１８Ｃおよび図１８Ｄ］同上。 図１９は、ＦＡＣＳによって測定される、ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体（ＢＭ－ＧＴ、ＢＭ－ＭＥ、４Ｂ６－Ｈ３Ｌ４、４Ｂ６－Ｈ４Ｌ３、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ６、２３Ｆ１１－Ｈ６Ｌ４、２３Ｆ１１－Ｈ６Ｌ６、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ３、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５、２３Ａ１１－Ｈ５Ｌ３および２３Ａ１１－Ｈ５Ｌ５）の、ＨＣＣ８２７上で発現されたｈＰＤ－Ｌ１との結合を示す図である。 図２０Ａは、ＦＡＣＳによって測定される、ｈＰＤ－１－Ｎ２９７Ａの、ＨＣＣ８２７上で発現されたｈＰＤ－Ｌ１との結合の遮断における、ヒト化４Ｂ６（Ｈ３Ｌ４およびＨ４Ｌ３）ならびにベンチマーク抗体（ＢＭ－ＧＴおよびＢＭ－ＭＥ）の活性を示す棒グラフである。図２０Ｂは、ＦＡＣＳによって測定される、ｈＰＤ－１－Ｎ２９７Ａの、ＨＣＣ８２７上で発現されたｈＰＤ－Ｌ１の結合に対する、ヒト化２３Ａ１１ Ｈ３Ｌ５（それぞれ、ＣＨＯおよび２９３において産生された）、ヒト化２３Ｆ１１ Ｈ４Ｌ４（それぞれ、ＣＨＯおよび２９３において産生された）ならびにベンチマーク抗体（ＢＭ－ＧＴおよびＢＭ－ＭＥ）の遮断活性を示す図である。 図２１Ａは、混合リンパ球反応物（ＭＬＲ）中においてヒト化４Ｂ６－Ｈ３Ｌ３抗体、ｈＩｇＧ１、ＢＭ－ＧＴおよびＢＭ－ＭＥによって刺激された、活性化されたドナー５のＣＤ４Ｔ細胞において産生されたＩＬ－２を例示する棒グラフである。図２１Ｂは、同一の試験における、ヒト化４Ｂ６－Ｈ３Ｌ３抗体、ｈＩｇＧ１、ＢＭ－ＧＴおよびＢＭ－ＭＥによって刺激された、活性化されたドナー５のＣＤ４Ｔ細胞において産生されたＩＦＮ－γを示す。 図２１Ｃは、同一の試験におけるヒト化 ２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ３、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４および２３Ｆ１１－Ｈ６Ｌ４、ｈＩｇＧ１、ＢＭ－ＧＴおよびＢＭ－ＭＥによって刺激された、活性化されたドナー６のＣＤ４Ｔ細胞において産生されたＩＬ－２を示す。図２１Ｄは、同一の試験における、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ３、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４および２３Ｆ１１－Ｈ６Ｌ４のヒト化抗体、ｈＩｇＧ１、ＢＭ－ＧＴおよびＢＭ－ＭＥによって刺激された活性化されたドナー６のＣＤ４Ｔ細胞において産生されたＩＦＮ－γを示す。 図２２Ａおよび２２Ｃは、ＥＬＩＳＡ解析によって測定された、ｐＨ７．４（三角）およびｐＨ５．５（菱形）それぞれでの、ＣＨＯ細胞および２９３細胞において産生されたヒト化２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５の、ＥＬＩＳＡ解析によって測定された、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓとのｐＨ依存性結合を示す図である。図２２Ｂおよび２２Ｄは、ｐＨ７．４（三角）およびｐＨ５．５（菱形）それぞれでの、ヒト化２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４の、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓとの同一物を示す図である。図２２Ｅは、ＥＬＩＳＡ解析によって測定された、ｐＨ７．４（三角）およびｐＨ５．５（菱形）それぞれでの、ベンチマーク抗体ＢＭ－ＧＴの、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓとの同一試験を示す図である。 図２３Ａは、ＥＬＩＳＡ解析によって測定された、中性ｐＨ（すなわち、７．４）および酸性ｐＨ（すなわち、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０）での、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５の、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓとのｐＨ依存性結合を示す。図２３Ｂは、ｐＨ７．４のものに対して正規化されたシグナルのパーセンテージによって表された同一結果を示す。 図２３Ｃは、ＥＬＩＳＡ解析によって測定された、中性ｐＨ（すなわち、７．４）および酸性ｐＨ（すなわち、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０）での、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４の、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓとのｐＨ依存性結合を示す。図２３Ｄは、ｐＨ７．４のものに対して正規化されたシグナルのパーセンテージによって表された同一結果を示す。図２３Ｅは、ＥＬＩＳＡ解析によって測定された、中性ｐＨ（すなわち、７．４）および酸性ｐＨ（すなわち、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０）での、２２Ｃ９－Ｃの、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓとのｐＨ依存性結合を示す。 図２３Ｆは、ｐＨ７．４のものに対して正規化されたシグナルのパーセンテージによって表された同一結果を示す。図２３のすべての図において、ｐＨ７．４（灰色丸）、ｐＨ６．０（濃い丸）、ｐＨ５．５（濃い四角）、ｐＨ５．０（灰色逆三角形）、ｐＨ４．５（灰色菱形）、ｐＨ４．０（灰色三角）。 ［図２４Ａ、図２４Ｂおよび図２４Ｃ］図２４Ａ～図２４Ｉは、ＥＬＩＳＡによって測定される、ＰＤ－Ｌ１抗体（２３Ｆ１１（図２４Ａ）、２３Ａ１１（図２４Ｂ）、２６Ｆ５（図２４Ｃ）、１８Ｇ４（図２４Ｄ）、４Ｂ６（図２４Ｅ）、２１Ｆ１１（図２４Ｆ）、２２Ｃ９（図２４Ｇ）、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４（図２４Ｈ）および２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５（図２４Ｉ））の、アラニン変異体ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃｓ（実施例１８において作製した）との結合を示す棒グラフである。 ［図２４Ｄ、図２４Ｅおよび図２４Ｆ］同上。 ［図２４Ｇ、図２４Ｈおよび図２４Ｉ］同上。 図２５は、経時的な平均化された腫瘍体積によって示される、ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおける腫瘍の成長の阻害における、ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体（中黒丸で媒体、中白四角でＢＴ－ＧＭおよび中白丸で４Ｂ６－Ｈ３Ｌ３－Ｎ２９７Ａ）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す図である。マウス（各群についてｎ＝８）に、３ｍｐｋ抗体を３回／週で３週間ＩＰ注射し、その結果が、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表されている。 図２６Ａは、媒体（中黒丸）、ＢＭ－ＭＥ（中白四角）、ＢＭ－ＧＴ（中白菱形）、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５（中白三角）および２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４（中白逆三角形）を投与された、ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおいて経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示し、これは、腫瘍の成長の阻害におけるヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示している。図２６Ｂは、１ｍｐｋの抗体を注射されたマウスを用いる２８日目の平均化された腫瘍体積を示す。 図２６Ｃは、図２６Ａと同一の試験を示すが、それぞれ、１０ｍｐｋの抗体を用いた試験を示す。図２６Ｄは、図２６Ｂと同一の試験を示すが、それぞれ、１０ｍｐｋ抗体を用いた試験を示す。 図２６Ｅは、種々の抗体および投与量を用いて注射されたマウスにおける腫瘍体積（中黒丸で媒体、中黒菱形で１ｍｐｋを用いるＢＭ－ＧＴ、中黒逆三角形で３ｍｐｋを用いるＢＭ－ＧＴ、中黒四角で１０ｍｐｋを用いるＢＭ－ＧＴおよび中白丸で１ｍｐｋを用いる２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４）を比較する。マウス（各群についてｎ＝８）に３回／週で３週間ＩＰ注射し、その結果が、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されている。 図２７Ａは、ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおいて経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示し、腫瘍の成長の阻害における抗体（中白丸で媒体、中白三角でＢＭ－ＧＴ、中白丸で２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５および点付き中白丸で２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す。図２７Ｂは、抗体（中黒丸で媒体、中黒三角でＢＭ－ＧＴ、中黒逆三角形で２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５および中白丸で２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４）を用いて投薬されたマウスを用いた、２６日目の平均化された腫瘍体積を示す。マウス（各群についてｎ＝１２）に、１ｍｐｋ抗体を０日目および１５日目にをＩＶ注射し、その結果が、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されている。 図２８Ａ～図２８Ｄは、１ｍｇ／ｋｇのＰＤ－Ｌ１抗体（媒体（図２８Ａ）、ＢＭ－ＧＴ（図２８Ｂ）、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５（図２８Ｃ）および２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４（図２８Ｄ）のＩＶ注射を用いて処置された出発点に対して正規化されたマウスにおける、腫瘍の大きさの変化を示す滝グラフである。 図２９Ａは、ＰＤ－Ｌ１抗体（中黒丸で媒体、中白四角でＢＭ－ＧＴ １ｍｐｋ、中黒四角でＢＭ－ＧＴ １０ｍｐｋ、中黒菱形で２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４ １ｍｐｋ、中黒逆三角形で２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４ １０ｍｐｋ、中白丸で２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５ １ｍｐｋ、中黒三角で２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５ １０ｍｐｋ）の種々の投与量を用いて投薬するＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルＩＶにおける、腫瘍の成長の阻害における、経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示す図であり、ｉｎ ｖｉｖｏ 抗腫瘍活性を示している。図２９Ｂは、種々の抗体（中黒丸で媒体、濃い中白四角でＢＭ－ＧＴ １ｍｐｋ、淡い中白四角でＢＭ－ＧＴ １０ｍｐｋ、淡い中白円で２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５ １ｍｐｋ、濃い中白三角で２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５ １０ｍｐｋ、濃い中白丸で２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４ １ｍｐｋおよび濃い中白逆三角で２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４ １０ｍｐｋ）を用いて投薬されたマウスを用いる、１５日目の平均化された腫瘍体積を示す。マウス（各群についてｎ＝１２）に、０日目に抗体をＩＶ注射し、結果が、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されている。 図３０は、３５日目に腫瘍細胞で再負荷されたＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおける、ヒト化 ＰＤ－Ｌ１抗体２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５（三角で）および２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４（丸で）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す図である。 図３１Ａは、静脈内の１ｍｇ／ｋｇでの投薬後の種々の時点での、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞中に浸透する、標識されたｐＨ依存性ＰＤ－Ｌ１抗体２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４およびＢＭ－ＧＴの放射シグナルの例示的画像を示す。図３１Ｂは、各マウスにおいて（ＢＭ－ＧＴについて、２－１（灰色逆三角）、２－２（中黒灰色菱形）、２－３（中白灰色丸）および２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４について、４－１（中白濃い菱形）、４－２（中黒濃い菱形）、４－３（濃い星））数時間にわたって測定された放射／腫瘍体積の比を示す。 図３１Ｃは、ＢＭ－ＧＴ（四角で）または２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４（逆三角で）を用いて投薬された各マウスにおいて数日にわたって測定された腫瘍体積を示し、線は、平均化された値を表す。 図３２Ａは、それぞれ、媒体（中黒丸）、ＤＣ１０１単独（中白四角で抗ＶＥＧＦＲ２抗体）、２３Ａ１１－Ｃ単独（中白逆三角）ならびに２３Ａ１１－ＣおよびＤＣ１０１の組合せ（中白丸）を用いて投薬されたｈＰＤ－Ｌ１／ＭＣ３８腫瘍モデルのマウスにおいて、経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示し、組合せのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示している。図３２Ｂは、それぞれ、媒体（中黒丸）、ＤＣ１０１単独（中黒四角で抗ＶＥＧＦＲ２抗体）、２３Ａ１１－Ｃ単独（中黒逆三角）ならびに２３Ａ１１－ＣおよびＤＣ１０１の組合せ（中黒菱形）を用いて注射したマウスを用いる、２９日目での平均化された腫瘍体積を示す。図３２Ｃは、それぞれ、媒体（中黒丸）、ＤＣ１０１単独（中黒四角で抗ＶＥＧＦＲ２抗体）、２３Ａ１１－Ｃ単独（中黒逆三角）ならびに２３Ａ１１－ＣおよびＤＣ１０１の組合せ（中黒菱形）を用いて投薬した、同一試験において経時的に測定された平均化されたマウス体重を示し、マウス（各群についてｎ＝８）に、２３Ａ１１－Ｃの０．３ｍｐｋおよび／またはＤＣ１０１の２０ｍｐｋを週に３回、３週間ＩＶ注射した。 図３２Ｄは、それぞれ、１０ｍｐｋの対照ＩｇＧ（中黒丸）、１ｍｐｋ ＤＣ１０１単独（中黒四角）、１ｍｐｋ ２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５単独（中黒菱形）ならびに１ｍｐｋ ２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５および１ｍｐｋのＤＣ１０１（中黒三角）の組合せを用いて投薬されたマウスを用いて、経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示す。図３２Ｅは、それぞれ、１０ｍｐｋ対照ＩｇＧ（中黒丸）、３ｍｐｋ ＤＣ１０１単独（中黒三角）、３ｍｐｋ ２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５単独（中白丸）ならびに３ｍｐｋ ２３Ａ１１－ Ｈ３Ｌ５および３ｍｐｋ ＤＣ１０１の組合せ（中白逆三角）を用いて投薬されたマウスを用いて、経時的に測定された平均化された腫瘍体積を示す。マウス（各群についてｎ＝８）に、抗体を、週に１回、２～３週間ＩＶ注射した。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されている。 図３３Ａおよび図３３Ｂは、それぞれ示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定された、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４の熱転移中点（Ｔｍ）を例示するグラフおよび２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５の熱転移中点（Ｔｍ）を示す。 図３４は、本開示において記載された配列のリストを示す。 ［リストのつづき］同上。 ［リストのつづき］同上。 ［リストのつづき］同上。 ［リストのつづき］同上。 図３５は、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４のＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１細胞への内部移行のグラフを示す。Ｙ軸は、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ Ｆｌａｓｈによって測定される、種々の抗体濃度での細胞における２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４の蛍光シグナルを示す。小さい灰色の丸は、２４時間後に試験された２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４を表し、大きな黒丸は、６時間後に試験された２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４を表す。 図３６Ａおよび３６Ｂは、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４の、活性化されたヒトＴ細胞との結合を例示する。図３６Ａは、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４の、ＣＤ３およびＣＤ２８陽性単球との結合を示すが、ＣＤ３およびＣＤ２８陰性単球では、極めてわずかな結合しか検出されなかった。 図３７Ａ～３７Ｃは、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を有するｈＰＤ－１ノックインマウスモデルにおけるＰＤ－Ｌ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究を例示する。図３７Ａは、それぞれ、ＰＢＳおよび２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４を用いて投与された、ヒトＰＤ－１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。図３７Ｂは、それぞれ、ＰＢＳまたは３ｍｇ／ｋｇ ＰＤ－Ｌ１抗体のＩＶ注射を用いて処置された出発点に対して正規化された個々のマウスにおける腫瘍の大きさの変化を示す。図３７Ｃは、それぞれ、ＰＢＳ（中黒丸）および２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４（中黒四角）を用いて投薬された同一試験において測定された、経時的な平均化されたマウス体重を示す。 図３８Ａ～３８Ｃは、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を有するｈＰＤ－１ノックインマウスモデルにおける ＰＤ－Ｌ１ 抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究を例示する。図３８Ａおよび３８Ｂは、それぞれ、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４（１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）、対照ｈＩｇＧ（ＡＢ１６０１６０、１０ｍｇ／ｋｇ）およびＢＭ－ＧＴ（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いて投与されたヒトＰＤ－１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスにおける経時的な腫瘍体積を示す。 図３７Ｃは、それぞれ、ＰＤ－Ｌ１抗体、対照ｈＩｇＧまたはＢＭ－ＧＴのＩＰ注射を用いて処置された出発点に対して正規化された個々のマウスにおける腫瘍の大きさの変化を示す。 図３９は、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍を有するマウスにおけるＩＶ投与の２、７および１４日後に測定された２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４およびＢＭ－ＧＴのＰＤ－Ｌ１受容体占有を示す。 図４０は、１０ｍｐｋでの投薬後７日目での凍結ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１ ＣＤｘ腫瘍切片での２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４浸透およびＴＩＬの代表的な像を示す。図Ａ：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（緑色）で染色された２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４；図Ｂ：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４抗マウスＣＤ８ｂ．２（赤色）を用いて染色されたＴＩＬ；図Ｃ：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４抗マウスＣＤ３１（赤色）を用いて染色された血管；図Ｄ：陰性対照。ＤＡＰＩ（青色）を用いて染色された核。
本開示の以下の説明は、単に、本開示の種々の実施形態を例示するよう意図されるもの
である。そのようなものとして、論じられる特定の改変は、本開示の範囲に対する制限と
解釈されてはならない。当業者には明らかであろうが、種々の等価物、変更および改変は
、本開示の範囲から逸脱することなく行うことができ、また、このような等価な実施形態
は、本明細書に含まれるべきであるということは理解される。刊行物、特許および特許出
願を含む本明細書に引用されるすべての参考文献は、参照によりその全文で本明細書に組
み込まれる。
定義
本明細書において、「ＰＤ－Ｌ１」（Ｂ７－Ｈ１／ＣＤ２７４としても知られる）とは
、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、例えば、Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．
（２０００） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９２：１０２７を参照のこと）を指す。胎
盤、脾臓、リンパ節、胸腺、心臓、胎児肝臓において発現され、多数の腫瘍または癌細胞
においてもみられる。「ＰＤ－Ｌ２」とは、プログラム細胞死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２、
例えば、Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．
２：２６１を参照のこと）を指す。「ＰＤ－１」（ＣＤ２７９としても知られる）とは
、プログラム細胞死１、ＣＤ２８ファミリーのメンバーを指し、ＰＤＣＤ１遺伝子によっ
てコードされ、Ｔ細胞の表面で発現され、Ｔ細胞の活性化および増殖を生理学的に制限す
るように機能する阻害性受容体である。ヒトＰＤ－１の代表的なアミノ酸配列は、ＮＣＢ
Ｉ受託番号：ＮＰ＿００５００９．２の下で開示されており、ヒトＰＤ－１をコードする
代表的な核酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿００５０１８．２の下で示されている。
「ＰＤ－１リガンド」は、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２のいずれかまたは両方ならびに細
胞によって天然に発現される任意のバリアントまたはアイソフォームおよび／または全長
ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を有するその断片を含む。ヒトＰＤ－Ｌ１の配
列は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿０５４８６２．１（代表的なアミノ酸配列）およびＮＣ
ＢＩ受託番号：ＮＭ＿０１４１４３．３（代表的な核酸配列）の下で開示されている。
本明細書において、用語「抗体」は、特異的抗原と結合する、任意の免疫グロブリン、
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体または二重特異性
（二価）抗体、またはそれらの機能的部分を含む。天然の無傷の抗体は、ジスルフィド結
合によって相互接続された２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む。各重鎖は、
可変領域（ＶＨ）ならびに第１、第２および第３の定常領域（それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２
およびＣＨ３）からなり、各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）からなる
。哺乳動物重鎖は、α、δ、ε、γおよびμとして分類され、哺乳動物軽鎖は、λまたは
κとして分類される。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与している。両鎖中の
可変領域は、一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の３つの領域にさら
に分割される（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖（Ｌ）ＣＤＲ、ＨＣ
ＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖（Ｈ）ＣＤＲ）。本明細書において開示され
る抗体および抗原結合断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｌ－Ｌ
ａｚｉｋａｎｉの慣習によって定義または同定され得る（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ， Ｂ
．， Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ
ｌ．， ２７３（４）， ９２７ （１９９７）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ． ｅｔ ａ
ｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． Ｄｅｃ ５；１８６（３）：６５１－６３ （１９８
５）；Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ． ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．， １９６，９０１ （１９８７）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ． Ｄｅｃ ２１－２８；３４２（６２５２）：８７７－８３ （１９８９
）；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））。３つのＣＤＲ
が、ＣＤＲよりも高度に保存されており、スキャフォールドを形成して超可変ループを支
持するフレームワーク領域（ＦＲ）として知られるそれぞれの両端に位置するストレッチ
の間に挿入される。したがって、各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序（アミノ酸残基Ｎ末端
からＣ末端）：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、３
つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与し
ていないが、種々のエフェクター機能を示す。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配
列に基づいて５つの主要なクラスに割り当てられる：それぞれ、α、δ、ε、γおよびμ
重鎖の存在によって特徴付けられる、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。主
要な抗体クラスのいくつかのサブクラスとして、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２
重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）またはＩ
ｇＡ２（α２重鎖）などがある。
本明細書において、用語「抗原結合断片」とは、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体の
断片から形成される抗体断片、または抗原と結合するが、無傷の天然抗体構造を含まない
任意のその他の抗体部分を指す。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体
は、抗原結合断片である。抗原結合断片の例として、限定するものではないが、ダイアボ
ディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄ
ｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィ
ド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二
量体（二価ダイアボディ）、多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、
ドメイン抗体、単離されたＣＤＲおよび二価ドメイン抗体が挙げられる。抗原結合断片は
、親抗体が結合する同一抗原と結合可能である。特定の実施形態では、抗原結合断片は、
特定のヒト抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲを含み得る。
抗体に関して「Ｆａｂ」とは、ジスルフィド結合によって単一重鎖の可変領域および第
１の定常領域に結合された、単一軽鎖（可変および定常領域の両方）からなる抗体の一価
の抗原結合断片を指す。Ｆａｂは、ヒンジ領域の重鎖の間のジスルフィド結合のＮ末端の
近位の残基での、抗体のパパイン消化によって得ることができる。
「Ｆａｂ’」とは、ヒンジ領域の重鎖の間のジスルフィド結合のＣ末端の近位の残基で
の、抗体のペプシン消化によって得ることができ、したがって、Ｆａｂとは、ヒンジ領域
中の少数の残基（１つまたは複数のシステインを含む）で異なっている、ヒンジ領域の一
部を含むＦａｂ断片を指す。
「Ｆ（ａｂ’）２」とは、２つの軽鎖および２つの重鎖の部分を含むＦａｂ’の二量体
を指す。
抗体に関して「Ｆｃ」とは、ジスルフィド結合によって、第２の重鎖の第２および第３
の定常領域と結合している、第１の重鎖の第２および第３の定常領域からなる抗体の一部
を指す。ＩｇＧおよびＩｇＭ Ｆｃ領域は、３つの重鎖定常領域（各鎖中の第２、第３お
よび第４の重鎖定常領域）を含有する。抗体のパパイン消化によって得ることができる。
抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどの種々のエフェクター機能に関与している
が、抗原結合においては機能しない。
抗体に関して「Ｆｖ」とは、完全抗原結合部位を保持するための抗体の最も小さい断片
を指す。Ｆｖ断片は、単一重鎖の可変領域と結合している単一軽鎖の可変領域からなる。
「ｄｓＦｖ」とは、単一軽鎖の可変領域および単一重鎖の可変領域の間の連結がジスルフ
ィド結合である、ジスルフィドによって安定化されたＦｖ断片を指す。
「一本鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、直接的にまたはペプチドリンカー配列を
介して互いに接続された軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる工学的に操作された抗
体を指す（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ， ８５：５８７９（１９８８））。「ｓｃＦｖ二量体」とは、２つの重鎖可変
領域および２つの軽鎖可変領域をリンカーとともに含む一本鎖を指す。特定の実施形態で
は、「ｓｃＦｖ二量体」は、一方の部分のＶＨが、もう一方の部分のＶＬと協調して、同
一抗原（またはエピトープ）または異なる抗原（またはエピトープ）を標的とし得る２つ
の結合部位を形成するように、別のＶＨ－ＶＬ部分と二量体化されたＶＨ－ＶＬを含む（
ペプチドリンカーによって連結された）二価ダイアボディまたは二価ＳｃＦｖ（ＢｓＦｖ
）である。その他の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、ＶＨ１およびＶＬ１が協調し
、ＶＨ２およびＶＬ２と協調して、各協調された対が、異なる抗原特異性を有するような
、ＶＬ１－ＶＨ２（同様に、ペプチドリンカーによって連結された）と会合しているＶＨ
１－ＶＬ２（ペプチドリンカーによって連結された）を含む二重特異性ダイアボディであ
る。
「一本鎖Ｆｖ－Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域に接続され
たｓｃＦｖからなる工学的に操作された抗体を指す。
「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、「ナノボディ」または「ＨＣＡｂ」と
は、２つのＶＨドメインを含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ
Ｌ． ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ
． Ｄｅｃ １０；２３１（１－２）：２５－３８ （１９９９）； Ｍｕｙｌｄｅｒｍ
ａｎｓ Ｓ．， Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊｕｎ；７４（４）：２７７－３０２
（２００１）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，
０７９号）。重鎖抗体は、元々、ラクダ科〔Camelidae〕（ラクダ、ヒトコブラクダおよ
びラマ）から得られた。軽鎖を欠いていても、ラクダ化抗体は、信頼のおける抗原結合レ
パートリーを有する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａ
ｔｕｒｅ． Ｊｕｎ ３；３６３（６４２８）：４４６－８ （１９９３）； Ｎｇｕｙ
ｅｎ ＶＫ． ｅｔ ａｌ． “Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ
Ｃａｍｅｌｉｄａｅ； ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｎｎｏｖ
ａｔｉｏｎ，” Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ａｐｒ；５４（１）：３９－４７
（２００２）； Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｍａ
ｙ；１０９（１）：９３－１０１ （２００３））。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨド
メイン）は、適応免疫応答によって生じた最小の既知抗原結合ユニットに相当する（Ｋｏ
ｃｈ－Ｎｏｌｔｅ Ｆ． ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． Ｎｏｖ；２１（１３）：
３４９０－８． Ｅｐｕｂ ２００７ Ｊｕｎ １５ （２００７））。「ダイアボディ
」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を含み、断片は、単一ポリペプチド鎖
中にＶＬドメインに接続されたＶＨドメインを含む（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）。（
例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． Ｊｕｌ １５；９０（１４）：６４４４－８ （１９９３）；ＥＰ
４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照のこと）。リンカーが短すぎるので同一鎖上
の２つのドメインは、対形成できず、したがって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメイン
と対形成し、それによって２つの抗原結合部位を生成せざるを得ない。抗原結合部位は、
同一の抗原（またはエピトープ）を標的とする場合も、異なる抗原（またはエピトープ）
を標的とする場合もある。
「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する抗体断片
を指す。特定の実施形態では、２以上のＶＨドメインが、ペプチドリンカーとともに共有
結合によって接合して、二価または多価ドメイン抗体を形成する。二価ドメイン抗体の２
つのＶＨドメインは、同一の抗原を標的とする場合も、異なる抗原を標的とする場合もあ
る。
特定の実施形態では、「（ｄｓＦｖ）２」は、３つのペプチド鎖：ペプチドリンカーに
よって連結され、ジスルフィド橋によって２つのＶＬ部分と結合された２つのＶＨ部分を
含む。
特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓダイアボディ」は、ＶＨ１およびＶＬ１の間で
ジスルフィド橋によってＶＬ１－ＶＨ２（同様にペプチドリンカーによって連結された）
に結合された、ＶＨ１－ＶＬ２（ペプチドリンカーによって連結された）を含む。
特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓＦｖ」または「ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’」は、３
つのペプチド鎖：重鎖が、ペプチドリンカー（例えば、長い可動性リンカー）によって結
合され、ジスルフィド橋を介して、それぞれ、ＶＬ１およびＶＬ２部分と対形成されてい
るＶＨ１－ＶＨ２部分を含む。ジスルフィドによって対形成された重鎖および軽鎖は各々
、異なる抗原特異性を有する。
本明細書において、用語「ヒト化」または「ヒト化型」とは、抗体または抗原結合断片
に関連して、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ヤギ、ウマまたはニワトリ
）由来のＣＤＲ、ヒト由来のＦＲ領域および適用できる場合には、ヒト由来の定常領域を
含む、抗体または抗原結合断片を指す。特定の実施形態では、ヒト抗体由来の定常領域は
、非ヒト可変領域に融合されている。ヒト化抗体または抗原結合断片は、ヒト処置薬とし
て有用である。特定の実施形態では、非ヒト種抗体と比較されるように、免疫原性が低減
されている、またはヒトにおいて免疫応答を誘導する可能性が低いからである。いくつか
の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒ
ツジ、モルモット、ハムスターまたは非ヒト霊長類（例えば、サル（例えば、カニクイザ
ルまたはアカゲザル）または類人猿（例えば、チンパンジー、ゴリラ、サル〔simian〕ま
たはサル〔affen〕）である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または抗原結合断片
は、非ヒトであるＣＤＲ配列を除く、実質的にすべてのヒト配列から構成される。いくつ
かの実施形態では、ヒト化抗体または抗原結合断片は、結合または結合親和性などの抗体
性能を改善するように修飾される。例えば、１つまたは複数の非ヒトＣＤＲ中の１個また
は複数のアミノ酸残基が、ヒトにおける潜在的免疫原性を低減するように変更され、そこ
では、変更されるアミノ酸残基が、免疫特異的結合にとって重大なものではないか、また
は変更が保存的変更であり、その結果、ヒト化抗体の抗原との結合は大幅に影響を受けな
い。いくつかの実施形態では、ヒトに由来するＦＲ領域は、それが由来するヒト抗体と同
一アミノ酸配列を含み得る、またはいくつかのアミノ酸変更、例えば、アミノ酸の１０、
９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下の変更を含み得る。いくつかの実施形態
では、アミノ酸におけるこのような変更は、重鎖ＦＲ領域中にのみ、軽鎖ＦＲ領域中にの
み、または両鎖中に存在し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト
ＦＲ１～３およびヒトＪＨおよびＪκを含む。
用語「キメラ」とは、本明細書において、ある種に由来する重鎖および／または軽鎖の
一部ならびに異なる種に由来する重鎖および／または軽鎖の残部を有する抗体または抗原
結合断片を指す。例示的実施例では、キメラ抗体は、ヒトに由来する定常領域およびマウ
スに由来するなどの非ヒト種に由来する可変領域を含み得る。
「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」とは、本明細書において、診断的使用および／または処置的使用
を提供するのに十分である親和性でＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類ＰＤ－
１）と特異的に結合可能である抗体を指す。
「実質的に」、「実質的に同一」とは、本明細書において、２つの数値間の高度の類似
性を指し、当業者ならば、値によって示される統計学および／または生物活性に関して、
２つの値間の有意差を認識しないもしくは考えない、またはほとんど差がないと認識する
もしくは考えるであろう。対照的に、「実質的に低い」とは、数値が、参照値の関数とし
て、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満であるこ
とを意味する。
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、本明細書において、２つの分子
間の、例えば、抗体および抗原間などの非ランダム結合反応を指す。特定の実施形態では
、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片は、ヒトおよび／または非ヒト霊
長類ＰＤ－１と、ｐＨ７．４で、約０．０１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０
０ｎＭ、０．０１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、０．０１ｎＭ～約１ｎ
Ｍ、約０．１ｎＭ～約１ｎＭまたは約０．０１ｎＭ～約０．１ｎＭ）の結合親和性（ＫＤ
）で特異的に結合する。ＫＤとは、本明細書において、会合速度に対する解離速度の割合
（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅなどの機器を使用する表面プラズ
モン共鳴法を使用して決定できる。
「結合を遮断する」または「同一エピトープについて競合する」能力とは、本明細書に
おいて、抗体または抗原結合断片の、２つの分子（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１および抗ＰＤ
－Ｌ１抗体）間の結合相互作用を、任意の検出可能な程度に阻害する能力を指す。特定の
実施形態では、２つの分子間の結合を遮断する抗体または抗原結合断片は、２つの分子間
の結合相互作用を、少なくとも５０％阻害する。特定の実施形態では、この阻害は、６０
％超、７０％超、８０％超または９０％超であり得る。
用語「エピトープ」とは、本明細書において、抗体などの抗原結合タンパク質によって
結合される抗原上の、原子の特定の群（例えば、糖側鎖、ホスホリル基、スルホニル基）
またはアミノ酸を指す。エピトープは、立体構造的である場合も線形である場合もある。
立体構造エピトープは、非連続であるが、タンパク質の三次元的三次フォールディングの
ために空間的に並置されたアミノ酸残基を含み得、そこでは、それらの残基は、相互作用
の親和性に直接的に寄与し、変性溶媒に曝露された場合には相互作用の能力を失う。対照
的に、線形エピトープのすべての相互作用点は、タンパク質上の一次アミノ酸残基に沿っ
て直線的に配置されており、連続アミノ酸の小さいセグメントは、主要組織適合複合体（
ＭＨＣ）分子との抗原結合から消化され得る、または変性溶媒に対する曝露の際に保持さ
れ得る（Ｓａｌｍｅｒｏｎ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９１ Ｎ
ｏｖ １；１４７（９）：３０４７－５２； Ｇｏｌｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ（Ｆｉｆｔｈ ｅｄ．）． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ． ｐｐ． ５７－７５．ＩＳＢＮ０－７１６７－４９
４７－５）。本開示の一実施形態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体によ
って結合されるエピトープは、立体配置的である。本開示の別の実施形態では、本明細書
において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体によって結合されるエピトープは、線形である。２種
の抗体が、それらが抗原との競合結合を示す場合には、抗原内の同一エピトープと結合し
得る。例えば、抗体または抗原結合断片が、２１Ｆ１１、１８Ｇ４、４Ｂ６、２６Ｆ５、
２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２２Ｃ９、それらのキメラ抗体、ヒト化４Ｂ６、ヒト化２３Ａ
１１およびヒト化２３Ｆ１１などの本開示の例示的抗体の、ヒトＰＤ－１との結合を遮断
する場合には、抗体または抗原結合断片は、それらの例示的抗体と同一のエピトープと結
合すると考えられ得る。
エピトープ内の特定のアミノ酸残基を、例えば、アラニンスキャニング変異誘発によっ
て変異させることができ、タンパク質結合を低減するまたは妨げる変異が同定される。「
アラニンスキャニング変異誘発」は、エピトープの、それと結合する別の化合物またはタ
ンパク質との相互作用に影響を及ぼすタンパク質の特定の残基または領域を同定するため
に実施できる方法である。タンパク質内の残基または標的残基の群が、中性または負電荷
を有するアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニンまたは保存的アミノ酸
置換）によって置換される。タンパク質の結合を閾値よりも低減する、またはタンパク質
の結合をその他の変異よりも最大の程度に低減するものをコードするアミノ酸残基または
コドンの任意の変異は、タンパク質によって結合されるエピトープ内である可能性が高い
。本開示の特定の実施形態では、ｐＨ依存性ＰＤ－Ｌ１抗体にとって重大であるエピトー
プは、Ｅ５８、Ｎ６３、Ｓ８０、Ｙ８１およびＩ６４のアミノ酸残基のうち少なくとも１
つを含む。
以下に記載される配列は、図３４に見ることができる。
「１８Ｇ４」とは、本明細書において、配列番号５５の重鎖可変領域（配列番号９３の
コーディングＤＮＡ配列に対応する）、配列番号５６の軽鎖可変領域（配列番号９４のコ
ーディングＤＮＡ配列に対応する）を有するマウスモノクローナル抗体を指す。そのキメ
ラ抗体（すなわち、１８Ｇ４－Ｃ／１８Ｇ４－キメラ）は、マウス可変領域と融合してい
るＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常領域を含む。
「４Ｂ６」とは、本明細書において、配列番号８５の重鎖可変領域、配列番号８６の軽
鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。そのキメラ抗体（すなわち、４Ｂ
６－Ｃ／４Ｂ６－キメラ）は、マウス可変領域と融合しているＩｇＧ１アイソタイプのヒ
ト定常領域を含む。抗体の重鎖および軽鎖は、ヒト化重鎖（Ｈ１は、配列番号８１の配列
に対応し、Ｈ２は、配列番号８３の配列に対応し、Ｈ３は、配列番号６５である配列（配
列番号９９のコーディングＤＮＡ配列を有する）に対応し、Ｈ４は、配列番号６７の配列
に対応する）および軽鎖（Ｌ１は、配列番号８２の配列に対応し、Ｌ２は、配列番号８４
である配列に対応し、Ｌ３は、配列番号６６（配列番号１００のコーディングＤＮＡ配列
を有する）の配列に対応し、Ｌ４は、配列番号６８の配列に対応する）を生成するように
ヒト化され、それによって、４Ｂ６－Ｈ３Ｌ３、４Ｂ６－Ｈ３Ｌ４、４Ｂ６－Ｈ４Ｌ３お
よび４Ｂ６－Ｈ４Ｌ４などのヒト化抗体が生じる。ヒト化抗体はまた、Ｆｃ領域中の位置
２９７でのＮからＡへの変異を用いて、小／大規模産生のためにＣＨＯ細胞において産生
することができる。
「２６Ｆ５」とは、本明細書において、配列番号５９の重鎖可変領域（配列番号９７の
コーディングＤＮＡ配列を有する）、配列番号６０の軽鎖可変領域（配列番号９８のコー
ディングＤＮＡ配列を有する）を有するマウスモノクローナル抗体を指す。そのキメラ抗
体（すなわち、２６Ｆ５－Ｃ／２６Ｆ５－キメラ）は、マウス可変領域と融合しているＩ
ｇＧ１アイソタイプのヒト定常領域を含む。
「２１Ｆ１１」とは、本明細書において、配列番号５７の重鎖可変領域（配列番号９５
のコーディングＤＮＡ配列を有する）、配列番号５８の軽鎖可変領域（配列番号９６のコ
ーディングＤＮＡ配列を有する）を有するマウスモノクローナル抗体を指す。そのキメラ
抗体（（すなわち、２１Ｆ１１－Ｃ／２１Ｆ１１－キメラ）は、マウス可変領域と融合し
ているＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常領域を含む。
「２３Ａ１１」とは、本明細書において、配列番号７３の重鎖可変領域、配列番号７４
の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。そのキメラ抗体（すなわち、
２３Ａ１１－Ｃ／２３Ａ１１－キメラ）は、マウス可変領域と融合しているＩｇＧ１アイ
ソタイプのヒト定常領域を含む。抗体の重鎖および軽鎖は、ヒト化重鎖（Ｈ３は、配列番
号７１の配列（配列番号１０３のコーディングＤＮＡ配列を有する）に対応し、Ｈ５は、
配列番号６９の配列に対応する）および軽鎖（Ｌ３は、配列番号７２の配列に対応し、Ｌ
５は、配列番号７０の配列（配列番号１０４のコーディングＤＮＡ配列を有する）に対応
する）を生成するようにヒト化され、それによって、２９３細胞において、２３Ａ１１－
Ｈ３Ｌ５、２３Ａ１１－Ｈ５Ｌ３、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ３および２３Ａ１１－Ｈ５Ｌ５な
どのヒト化抗体が生じる。２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５（Ｈ３およびＬ５の対応する配列は、そ
れぞれ、配列番号６１および配列番号６２である）などの抗体はまた、Ｆｃ領域中の位置
２９７でのＮからＡへの変異を用いて、小／大規模産生のためにＣＨＯ細胞において産生
することができる。
「２３Ｆ１１」とは、本明細書において、配列番号７９の重鎖可変領域、配列番号８０
の軽鎖可変領域を有するマウスモノクローナル抗体を指す。そのキメラ抗体（すなわち、
２３Ｆ１１－Ｃ／２３Ｆ１１－キメラ）は、マウス可変領域と融合しているＩｇＧ１アイ
ソタイプのヒト定常領域を含む。抗体の重鎖および軽鎖は、ヒト化重鎖（Ｈ４は、配列番
号７５の配列（配列番号１０５のコーディングＤＮＡ配列を有する）に対応し、Ｈ６は、
配列番号７７の配列に対応する）および軽鎖（Ｌ４は、配列番号７６の配列（配列番号１
０６のコーディングＤＮＡ配列を有する）に対応し、Ｌ６は、配列番号７８に配列に対応
する）を生成するようにヒト化され、それによって、２９３細胞において、２３Ｆ１１－
Ｈ４Ｌ４、２３Ｆ１１－Ｈ６Ｌ４、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ６、２３Ｆ１１－Ｈ６Ｌ６などの
ヒト化抗体が生じる。２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４（Ｈ４およびＬ４の対応する配列は、それぞ
れ、配列番号６３および配列番号６４である）などの抗体はまた、Ｆｃ領域中の位置２９
７でのＮからＡへの変異を用いて、小／大規模産生のためにＣＨＯ細胞において産生する
ことができる。
「２２Ｃ９」とは、本明細書において、配列番号２１の重鎖可変領域（コーディングＤ
ＮＡ配列配列番号１０１を有する）、配列番号２２の軽鎖可変領域（コーディングＤＮＡ
配列配列番号１０２を有する）を有するマウスモノクローナル抗体を指す。そのキメラ抗
体（すなわち、２２Ｃ９－Ｃ／２２Ｃ９－キメラ）は、マウス可変領域と融合しているＩ
ｇＧ１アイソタイプのヒト定常領域を含む。
アミノ酸配列に関連して「保存的置換」とは、アミノ酸残基を、同様の生理化学的特性
を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基と置き換えることまたはポリペプチドの活性に
とって重大ではないアミノ酸の置換を指す。例えば、保存的置換は、非極性側鎖を有する
アミノ酸残基の中（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐ
ｈｅ、Ｔｒｐ）、非荷電極性側鎖を有する残基の中（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、
Ａｓｎ、ＧｌｙおよびＧｌｎ）、酸性側鎖を有する残基の中（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
、塩基性側鎖を有するアミノ酸の中（例えば、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）、β分枝側
鎖を有するアミノ酸の中（例えば、Ｔｈｒ、ＶａｌおよびＩｌｅ）、硫黄含有側鎖を有す
るアミノ酸の中（例えば、ＣｙｓおよびＭｅｔ）または芳香族側鎖を有する残基の中（例
えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓおよびＰｈｅ）で行うことができる。特定の実施形態では
、置換、欠失または付加も「保存的置換」として考えることができる。挿入または欠失さ
れるアミノ酸の数は、約１～５の範囲であり得る。当技術分野では公知であるように、保
存的置換は、通常、タンパク質コンホメーション構造において大幅な変化を引き起こさず
、従って、タンパク質の生物活性を保持し得る。
アミノ酸配列（または核酸配列）に関して「配列同一性パーセント（％）」は、配列を
アラインし、最大対応を達成するように、必要に応じて、ギャップを導入した後の、参照
配列中のアミノ酸（または核酸）残基と同一である、候補配列中のアミノ酸（または核酸
）残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基と考
えられる場合も、考えられない場合もある。アミノ酸（または核酸）配列同一性パーセン
トを決定することを目的とするアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ
（米国国立生物工学情報センター〔U.S. National Center for Biotechnology Informati
on〕（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで入手可能、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ
， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３－４１０ （１９９０）； Ｓｔｅ
ｐｈｅｎ Ｆ． ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３３
８９－３４０２ （１９９７）も参照のこと）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（欧州バイオインフ
ォマティクス研究所〔Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ〕のウェブサイトで入手可能、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ． ｅｔ ａｌ， Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６６：３８３－４０２ （１９９６）；
Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （Ｏｘｆｏｒ
ｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ）， ２３（２１）： ２９４７－８ （２００７）も参照のこと
）およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ （ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公
的に入手可能なツールを使用して達成できる。当業者はツールによって提供されるデフォ
ルトパラメータを使用してもよいし、または例えば、適したアルゴリズムを選択すること
などによって、アラインメントにとって適当であるようにカスタマイズしてもよい。
本明細書において、「相同体配列」および「相同配列」は、互換可能に使用され、任意
選択で、アラインされる場合に別の配列に対して少なくとも８０％（例えば少なくとも８
５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％）の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（またはその相補性鎖）また
はアミノ酸配列を指す。
「Ｔ細胞」は、本明細書において、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔヘル
パー１型Ｔ細胞、Ｔヘルパー２型Ｔ細胞、Ｔヘルパー３型Ｔ細胞、Ｔヘルパー１７型Ｔ細
胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、記憶Ｔ細胞（例えば、セントラル
記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ
細胞）およびＣＤ８＋またはＣＤ４＋のいずれかであるレジデントメモリーＴ細胞（ＴＲ
Ｍ））、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞および阻害性Ｔ細胞を含む、細胞性免疫にお
いて重大な役割を果たすリンパ球を指す。
「エフェクター機能」または「抗体エフェクター機能」とは、本明細書において、Ｃ１
複合体およびＦｃ受容体などの、抗体のＦｃ領域の、そのエフェクターとの結合に起因す
る生物活性を指す。例示的エフェクター機能として、抗体およびＣ１複合体上のＣ１ｑの
相互作用によって誘導される補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体のＦｃ領域の、エフェ
クター細胞上のＦｃ受容体との結合によって誘導される抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（
ＡＤＣＣ）および食作用が挙げられる。「エフェクター機能を低減または枯渇させる」と
は、抗体エフェクター機能が、親抗体から少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、
８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）低減されることを指す。特
定の実施形態では、エフェクター機能は、グリコシル化を排除するためのＦｃ領域におけ
る変異、例えば、Ｎ２９７ＡまたはＤ２６５Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６ （９）： ６５９１－６６０４ （２００１）を参
照のこと）、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａによって排除される。「Ｆｃ領域」と
は、本明細書において、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。
「癌」または「癌性状態」とは、本明細書において、悪性細胞成長または新生物、異常
な増殖、浸潤または転移によって特徴付けられる任意の医学的状態を指し、固形腫瘍癌お
よび白血病などの非固形癌（血液悪性腫瘍）の両方を含む。固形腫瘍は、肉腫および癌腫
を含む。肉腫は、血管、骨、脂肪組織、靭帯、リンパ管、筋肉または腱における非上皮腫
瘍であり、癌腫は、皮膚、腺および臓器の裏層における上皮腫瘍である。「腫瘍」とは、
本明細書において、新生物および／または悪性細胞の固体塊を指す。
本明細書において、状態を「処置すること」、「処置」または「療法」は、互換可能に
使用され得、状態を予防することまたは低減すること、状態の発症または発生の速度を減
速すること、状態の発生のリスクを低減すること、状態と関連する症状の発生を予防する
ことまたは遅延すること、状態と関連する症状を低減することまたは終了させること、状
態の完全または部分退縮を生成すること、状態を治癒することまたはそれらのいくつかの
組合せなどの、治療的処置、防止的または予防的手段を含む。癌に関して、「処置するこ
と」、「処置」または「療法」は、新生物もしくは悪性細胞成長（対照と比較して、腫瘍
体積を低減することなど）、増殖、他の臓器への浸潤もしくは転移を阻害することもしく
は減速すること、新生物もしくは悪性細胞成長、増殖もしくは転移の発生を予防すること
、遅延することもしくは停止すること、またはそれらのいくつかの組合せを指し得る。腫
瘍に関しては、「処置すること」または「処置」は、腫瘍のすべてはもしくは一部を根絶
すること、腫瘍成長および転移を阻害することもしくは減速すること、腫瘍の発生を予防
することもしくは遅延することまたはそれらのいくつかの組合せを含む。「単離された」
物質は、天然状態から人の手によって変更されている。「単離された」組成物または物質
が自然界に存在する場合には、それは、その元の環境から変更されているか、または取り
出されているまたはその両方である。例えば、「単離された」ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは、それぞれ、その他のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含まない、天
然状態ではポリヌクレオチドまたはポリペプチドに伴う天然の構成成分と会合していない
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。特定の実施形態では、「単離された」抗体
は、少なくとも１つのステップによって、電気泳動的方法（クーマシーブルーまたは銀染
色を使用するＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、毛細血管 電気泳動など）、クロマト
グラフィー法（イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣなど）またはローリー
法によって決定されるような少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％の純度に精製される。
用語「ベクター」とは、本明細書において、宿主細胞においてそのタンパク質を発現す
るように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に挿入され、輸送される
媒体を指す。ベクターは、宿主細胞内でそれが保持する遺伝要素の発現を引き起こすよう
に、宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために使用され得る。ベ
クターの例示的種類として、それだけには限らないが、プラスミド（例えば、ファージミ
ド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人
工染色体（ＰＡＣ））、ウイルスベクター（λファージもしくはＭ１３ファージなどのバ
クテリオファージまたは動物ウイルス）、細菌ベクターまたは非エピソーム哺乳動物ベク
ターが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスのカテゴリーとして、レトロ
ウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウ
イルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピ
ローマウイルスおよびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは
、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能要素およびリポーター
遺伝子を含む、発現を制御するための種々の要素を含有し得る。さらに、ベクター（例え
ば、細菌ベクターまたはエピソーム哺乳動物ベクター）は、複製起点を含有し得る。ベク
ターはまた、それだけには限らないが、ウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質コー
ティングを含む、細胞へのその侵入を補助する材料を含み得る。
「宿主細胞」とは、本明細書において、１種または複数の外因性タンパク質を発現する
ように、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入されている細胞を指す。
特定の対象細胞およびその後代の両方を指すものとする。宿主細胞は、原核生物、真核生
物、植物細胞、動物細胞またはハイブリドーマであり得る。調節作用物質が細胞中に導入
されない限り、または調節配列が、核酸と作動可能に連結されるように宿主細胞中に導入
されない限り、所望のレベルでタンパク質を発現しないが、核酸を含む細胞であり得る。
「ＰＤ－Ｌ１関連状態」とは、本明細書において、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ
１）の発現または活性の増大または減少によって引き起こされる、それによって増悪され
る、またはその他の形でそれと関連している任意の状態を指す。
用語「治療有効量」または「有効投与量」とは、本明細書において、ヒトＰＤ－Ｌ１と
関連する疾患または状態を処置するのに有効な薬物の投与量または濃度を指す。例えば、
癌を処置するための本明細書において開示される抗体または抗原結合断片の使用に関して
、治療有効量とは、腫瘍体積を低減可能な、腫瘍のすべてもしくは一部を根絶可能な、腫
瘍成長もしくは他の臓器への癌細胞浸潤を阻害または減速可能な、癌性状態を媒介する細
胞の成長もしくは増殖を阻害可能な、腫瘍細胞転移を阻害もしくは減速可能な、腫瘍もし
くは癌性状態と関連する任意の症状もしくはマーカーを回復可能な、腫瘍もしくは癌性状
態の発生を予防または遅延可能な、またはそれらのいくつかの組合せの抗体または抗原結
合断片の投与量または濃度である。
用語「医薬上許容される」は、担体、媒体、希釈剤、賦形剤および／または塩が、製剤
を含むその他の成分と一般に化学的および／または物理的に適合し、そのレシピエントと
生理学的に適合することを示す。
用語「受容体占有」とは、平衡状態でリガンドによって占有された受容体および利用可
能な受容体の総数の割合を指し、通常、受容体の総数のパーセンテージとして表される。
受容体占有期間は、種々の時点での受容体占有を測定し、比較することによって評価され
得る。ＦＡＣＳ、ポジトロン放出コンピューター断層撮影法（ＰＥＴ）、オートラジオグ
ラフィーなどといった受容体占有の測定は、当技術分野で公知である。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体
本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では
、本開示は、例示的モノクローナル抗体２１Ｆ１１、１８Ｇ４、４Ｂ６、２６Ｆ５、２３
Ａ１１、２３Ｆ１１、２２Ｃ９、そのキメラ抗体、ヒト化４Ｂ６、ヒト化２３Ａ１１およ
びヒト化２３Ｆ１１を提供する。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、抗原（例えば、ヒ
トＰＤ－Ｌ１）との結合においてｐＨ依存性である。生理学的に中性のｐＨ（すなわちｐ
Ｈ７．４）でｐＨ依存性抗体によって示される抗原結合は、酸性のｐＨ５．５または６．
０（例えば、エンドソームのｐＨの）よりも大きい。このようなｐＨ依存性抗体は、エン
ドソームにおいて抗原から優先的に解離する。ｐＨ依存性抗体は、エンドソームにおいて
抗原から解離し、細胞から再利用されることによって、リソソーム〔lysozome〕における
抗原媒介性分解を逃れ得るので、これは、抗原が抗原媒介性クリアランスを受ける場合に
、抗体半減期を増大し得る。ｐＨ依存性抗体の利点として、治療用ｐＨ依存性抗体のより
低い投与量（同等のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を達成するために参照ＰＤ－Ｌ１抗体につい
て、普通なら必要とされる投与量の８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、
２０％または１０％以下）または改善された再利用性および増強された血清半減期のため
に、参照ＰＤ－Ｌ１抗体と比較してより少ない投与頻度が挙げられ、その両方が同等のｉ
ｎ ｖｉｖｏ治療効果を達成する。参照抗体は、非ｐＨ依存性であり、その結果、ＰＤ－
Ｌ１と、酸性および中性ｐＨの両方で同様に結合し、ｐＨ依存性抗体と比較して中性ｐＨ
で同様の結合を有する。特定の実施形態では、ｐＨ依存性抗体は、ＰＤ－Ｌ１に対して同
じ結合を有するその非ｐＨ依存性型と比較した場合に、上記の利点を有する。
特定の実施形態では、ｐＨ依存性抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片の、ヒトＰ
Ｄ－Ｌ１との特異的結合は、その酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．０、５．５、５．０、４．
５または４．０）でよりも、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）でより多い。特定の実施形
態では、酸性のｐＨ５．５での、抗体の、ＰＤ－Ｌ１との結合は、同一アッセイ設定でｐ
Ｈ７．４でのＰＤ－Ｌ１とのその結合よりも実質的に低い。特定の実施形態では、酸性ｐ
Ｈでの本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片の結合は、Ｅ
ＬＩＳＡによって測定されるように、その中性ｐＨ（すなわち、７．４）での最大２％、
５％、１０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６
５％、７０％、７５％、８０％または８５％である。特定の実施形態では、酸性ｐＨ／中
性ｐＨでのｐＨ依存性抗ＰＤ－Ｌ１抗体のヒトＰＤ－Ｌ１に対するＫＤ比および／または
Ｋｏｆｆ比は、２、３、４、５、８、１０、１５、２０、３０、４０または１００または
それ以上である。特定の実施形態では、ｐＨ依存性抗ＰＤ－Ｌ１抗体のヒトＰＤ－Ｌ１に
対する解離性半減期（ｔ１／２）は、２５℃または３７℃で酸性ｐＨで５、４、３、２、
１、０．５、０．２または０．１分未満である。特定の実施形態では、本明細書において
記載されたｐＨ依存性抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、ヒトＰＤ－Ｌ１に対
して、中性ｐＨで参照ＰＤ－Ｌ１抗体のものと比較して、酸性ｐＨで、少なくとも約２、
３、５、８、１０、１５、２０、３０、５０または１００倍の解離性半減期（ｔ１／２）
の低減を有する。特定の実施形態では、ＰＤ－１タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ量の低減は
、中性ｐＨでＰＤ－Ｌ１との同様の結合を有する参照ＰＤ－Ｌ１抗体と比較して、ｐＨ依
存性抗ＰＤ－Ｌ１抗体に曝露された場合に延長される。特定の実施形態では、ヒトＰＤ－
Ｌ１と結合する、ｐＨ依存性抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、特定の用量の
投与の際に、同一用量の参照ＰＤ－Ｌ１抗体のものと比較して、増大した標的臓器半減期
を有する。特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、酸性ｐＨおよび中性ｐ
Ｈの両方でＰＤ－Ｌ１との同様の結合を示した場合に、抗体に対して普通ならより短いで
あろう、標的臓器におけるｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する。特定の実施形態では、標的臓
器として、それだけには限らないが、血液または血清、腎臓、肺、膵臓、肝臓、胆嚢、膀
胱、皮膚、食道、卵巣、乳房、結腸、直腸、胃、脾臓または脳が挙げられる。
当業者ならば理解するであろうが、本明細書において提供されるＣＤＲ配列は、得られ
た抗体が、１つまたは複数の特性（改善された結合または結合親和性、増大された薬物動
態半減期、ｐＨ感受性、コンジュゲーションに対する適合性によって低減されたＣＤＲ残
基でのグリコシル化および／または脱アミノ化のリスクおよび低減された免疫原性など）
において改善され、その他の点では親抗体（すなわち、上記の修飾または変更を除いてそ
の他の点では同一セットのＣＤＲ配列を有する抗体）と同等であり、または親抗体の抗原
結合特性を少なくとも実質的に保持するように、アミノ酸残基の１つまたは複数の置換（
または挿入または欠失）を含有するように修飾され得る。例えば、抗体バリアント（Ｆａ
ｂまたはｓｃＦｖバリアントなど）のライブラリーを作製し、ファージディスプレイ技術
を用いて発現させ、次いで、ヒトＰＤ－Ｌ１に対する結合または結合親和性についてスク
リーニングることができる。別の例のために、コンピュータソフトウェアを使用して、抗
体のヒトＰＤ－Ｌ１との結合を実質的にシミュレートし、結合界面を形成する抗体上のア
ミノ酸残基を同定できる。このような残基は、結合または結合親和性の低減を防ぐために
置換において避けられるか、またはより強力な結合を提供するために置換の標的とされ得
る。特定の実施形態では、ＣＤＲ配列中の置換の少なくとも１つの（またはすべて）は、
保存的置換である。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、本明細書において提供されるも
の（単数または複数）に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）
の配列同一性を有する、１つまたは複数のＣＤＲ配列を含み、一方で、ヒトＰＤ－Ｌ１に
対する結合活性または結合親和性を、本明細書において提供されるもの（単数または複数
）に対して１００％配列同一性にある対応するＣＤＲ配列を除いて、実質的に同一の配列
を有するその親抗体と同様のレベルで、またはさらに高く保持する。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、キメラである。キ
メラ抗体は、抗体由来の１つまたは複数の領域ならびにその他の抗体または種に由来する
１つまたは複数の領域を含有する。特定の実施形態では、キメラ抗ＰＤ－Ｌ１抗体の少な
くとも１つのＣＤＲは、１つの種に由来する。特定の実施形態では、ＣＤＲのすべては、
別の種に由来する。特定の実施形態では、キメラ抗ＰＤ－Ｌ１抗体の可変領域は、１つの
種に由来し、別の種の抗体の定常領域に連結されている。キメラ抗体は、親抗体の結合活
性または結合親和性を保持する。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、ヒト化される。特
定の実施形態では、ヒト化抗体は非ヒト種を起源とし、フレームワーク中のいくつかのア
ミノ酸残基ならびに重鎖および軽鎖の定常領域が、ヒトにおける免疫原性を低減または避
けるために変異されている。特定の実施形態では、非ヒト種の可変領域は、ヒト抗体の定
常領域と融合される。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフティング、すな
わち、ヒト抗体のＣＤＲを、非ヒト抗体の対応するＣＤＲと置き換えることによって作製
される。したがって、ヒトにおけるヒト化抗体の免疫原性は、低い。特定の実施形態では
、ヒトフレームワーク領域は、例えば、結合活性または結合親和性を改善または保持する
ために、ＣＤＲ配列が由来する非ヒト抗体（例えば、マウスフレームワーク領域）由来の
１個または複数のアミノ酸残基で置換される。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、親抗
体の結合活性または結合親和性を保持または増大する。
いくつかの実施形態では、キメラまたはヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断
片は、配列番号２１、４７、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、
７３、７５、７７、７９、８１、８３および８５からなる群から選択される重鎖可変領域
ならびに少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２
％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する
その相同配列；および／または配列番号２２、４８、５６、５８、６０、６２、６４、６
６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および８６からなる群から
選択される軽鎖可変領域ならびに少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
）の配列同一性を有するその相同配列を含む。これらのヒト化抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に
対する結合活性または結合親和性を、好ましくは、例示的抗体：４Ｂ６、１８Ｇ４、２６
Ｆ５、２１Ｆ１１、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２２Ｃ９ならびにそのキメラ抗体、ヒト化
４Ｂ６、ヒト化２３Ｆ１１およびヒト化２３Ａ１１のうちの１種と同様のレベルで保持す
る。
特定の実施形態では、４Ｂ６、２６Ｆ５、２１Ｆ１１、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２２
Ｃ９のＰＤ－Ｌ１抗体ならびにそのキメラ抗体、ヒト化４Ｂ６、ヒト化２３Ｆ１１および
ヒト化２３Ａ１１は、ヒトおよび非ヒト霊長類ＰＤ－Ｌ１と結合するが、マウスＰＤ－Ｌ
１とは結合しない。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、１８Ｇ４）、そのキ
メラ抗体およびその抗原結合断片は、ヒトおよびマウスＰＤ－Ｌ１の両方と結合できる。
結合活性または結合親和性は、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射リガンド競合結合アッセイなど
の競合アッセイおよびＦＡＣＳ解析に基づいて決定される。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗
原結合断片は、ヒトＰＤ－Ｌ１と、プラズモン共鳴結合アッセイによって測定される約１
０－７Ｍ以下（例えば、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、１０－
１２Ｍ）の結合親和性（Ｋｄ）で特異的に結合可能である。結合親和性は、ＫＤ値によっ
て表され得、これは、抗原および抗原結合分子間の結合が平衡に達する場合に、会合速度
に対する解離速度の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として算出される。抗原結合親和性（例えば
、ＫＤ）は、Ｂｉａｃｏｒｅなどの機器を使用するプラズモン共鳴結合アッセイを含む、
当技術分野で公知の適した方法を使用して適宜決定され得る（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，
Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ
ｃｉｅｎｃｅ， Ｃｈａｐｔｅｒ １９， ｕｎｉｔ １９．１４， ２００６）。
特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、ｈＰＤ－Ｌ１と、Ｅ
ＬＩＳＡによって測定される０．００１μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ（例えば、０．００１
μｇ／ｍｌ～０．５μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌ、０．００１
μｇ／ｍｌ～０．１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ
／ｍｌ～０．１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～０．０５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／
ｍｌ～０．０３μｇ／ｍｌまたは０．００１μｇ／ｍｌ～０．０１μｇ／ｍｌ）のＥＣ５
０（すなわち５０％結合濃度）で、またはＦＡＣＳによって測定される０．０１μｇ／ｍ
ｌ～１μｇ／ｍｌ（例えば、０．０１μｇ／ｍｌ～０．５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍ
ｌ～０．２μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ～０．
５μｇ／ｍｌまたは０．０５μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌ）のＥＣ５０で結合可能であ
る。抗体のヒトＰＤ－Ｌ１との結合は、当技術分野で公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、
ＦＡＣＳ、表面プラズモン共鳴、ＧＳＴプルダウン、エピトープ－タグ、免疫沈降、ファ
ーウエスタン、蛍光共鳴エネルギー移動、時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ－ＦＩＡ）
、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ、ラテックス凝集、ウエ
スタンブロットおよび免疫組織化学またはその他の結合アッセイによって測定することが
できる。例示的例では、試験抗体（すなわち、第１の抗体）は、固定化されたヒトＰＤ－
Ｌ１またはヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞と結合させられ、 結合していない抗体を洗浄
除去した後、結合することができ、結合された第１の抗体の検出を可能にする標識された
二次抗体が導入される。検出は、固定化されたＰＤ－Ｌ１が使用される場合には、マイク
ロプレートリーダーを用いて、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞が使用される場合にはＦＡ
ＣＳ解析を使用することによって実施され得る。
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその断片は、ヒトＰＤ－
１のヒトＰＤ－Ｌ１との結合を、ＦＡＣＳにおいて測定される０．０５μｇ／ｍｌ～１μ
ｇ／ｍｌ（例えば、０．０５μｇ／ｍｌ～０．８μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ～０．
５μｇ／ｍｌまたは０．０５μｇ／ｍｌ～０．３μｇ／ｍｌ）のＩＣ５０で、またはＥＬ
ＩＳＡにおいて測定される０．００１μｇ／ｍｌ～０．５μｇ／ｍｌ（例えば、０．００
１μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ～０．１μｇ／ｍｌ、０．００
１μｇ／ｍｌ～０．０５μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ～０．０２μｇ／ｍｌ、０．
００５μｇ／ｍｌ～０．０５μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ～０．０２μｇ／ｍｌま
たは０．００５μｇ／ｍｌ～０．０１μｇ／ｍｌ）のＩＣ５０で阻害する。
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその断片は、ヒトＰＤ－
Ｌ１のその受容体（すなわち、ヒトＰＤ－１）との結合を遮断し、それによって、例えば
、活性化されたＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞など）からのサイトカイン
産生を誘導すること、活性化されたＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞など）
の増殖を誘導することおよびＴ ｒｅｇの抑制機能を逆転させることを含む生物活性を提
供する。例示的サイトカインとして、ＩＬ－２およびＩＦＮγが挙げられる。用語「ＩＬ
－２」とは、インターロイキン２、白血球〔white blood cells〕（例えば、白血球〔leu
kocytes〕）の活性を調節する免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の１種を指
す。用語「インターフェロンγ（ＩＦＮγ）」とは、ナチュラルキラー（ＮＫ）、ＮＫＴ
細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生されるサイトカインであり、マクロフ
ァージの重大なアクチベーターであり、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子発現のインデ
ューサーである。サイトカイン産生は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、Ｅ
ＬＩＳＡによって決定できる。［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイおよび発光細胞生存ア
ッセイを含む方法はまた、Ｔ細胞の増殖を検出するためにも使用できる。
抗ＰＤ－Ｌ抗体およびその抗原結合断片は、ヒトＰＤ－Ｌ１および／または非ヒト霊長
類に対して特異的である。特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、ＰＤ－
Ｌ２（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ２）と結合しない。例えば、ＰＤ－Ｌ２との結合親和性は、
ヒトＰＤ－Ｌ１とのものの１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％
、２％または１％未満である。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、非ヒト霊長類ＰＤ－Ｌ１と、Ｅ
ＬＩＳＡにおいて測定される０．００１μｇ／ｍｌ～０．５μｇ／ｍｌ（例えば、０．０
０１μｇ／ｍｌ～０．２μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ～０．１μｇ／ｍｌ、０．０
０１μｇ／ｍｌ～０．０５μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ～０．０２μｇ／ｍｌ、０
．００５μｇ／ｍｌ～０．０５μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ～０．０２μｇ／ｍｌ
または０．００５μｇ／ｍｌ～０．０１μｇ／ｍｌ）のＥＣ５０で結合する。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、ヒトＰＤ－Ｌ１および／または非ヒト霊
長類ＰＤ－Ｌ１に対して特異的である。特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断
片は、マウスＰＤ－Ｌ１と結合しない。例えば、マウス ＰＤ－Ｌ１との結合親和性は、
ヒトＰＤ－Ｌ１とのものの１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％
、２％または１％未満である。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、マウスＰＤ－Ｌ１と結合しない
が、非ヒト霊長類ＰＤ－Ｌ１と、ヒトＰＤ－Ｌ１のものと同様の結合活性または結合親和
性で結合する。例えば、例示的抗体４Ｂ６、２６Ｆ５、２１Ｆ１１、２３Ａ１１、２３Ｆ
１１、２２Ｃ９およびそのキメラ抗体、ヒト化４Ｂ６、ヒト化２３Ｆ１１およびヒト化２
３Ａ１１の、マウスＰＤ－Ｌ１との結合は、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析などの従来の
結合アッセイでは極めて低いが、これらの抗体の、非ヒト霊長類ＰＤ－Ｌ１との結合は、
ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによって測定されるように、ヒトＰＤ－Ｌ１のものと同様であ
る。特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片（１８Ｇ４など）は、マウスＰＤ
－Ｌ１と、ならびに非ヒト霊長類ＰＤ－Ｌ１と、ヒトＰＤ－Ｌ１のものと同様の結合活性
または結合親和性で結合する。
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結
合断片は、腫瘍細胞、精製腫瘍抗原および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子で
トランスフェクトされた細胞、腫瘍ワクチンなどの免疫原性剤と組み合わせて使用できる
。さらに、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、標準化学および放射線療法（例
えば、放射線療法、Ｘ線療法）、標的ベースの小分子療法（例えば、チロシンキナーゼ阻
害剤イマチニブ、ゲフィチニブ；モノクローナル抗体、光線力学的療法）、免疫療法（例
えば、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ
（ｐ９７）、ｇｐ６８、タグ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、Ｍｕｃ
Ｂ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ Ｂおよびｐ１５５、ＤＬ
Ｌ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２／３、Ｆｚｄ７またはＷｎｔ、ｒ－スポンジン（ＲＳ
ＰＯ）１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３またはＲＳＰＯ４などの腫瘍マーカーに対する抗体）
、新興のその他の免疫チェックポイントモジュレーター療法（例えば、ワクチン）、ホル
モン療法、血管新生阻害（血管新生阻害剤）、遺伝子療法（細胞増殖のインデューサー、
細胞増殖の阻害剤またはプログラム細胞死の制御因子）、緩和ケア（すなわち、疼痛（例
えば、モルヒネおよびオキシコドン）、悪心、嘔吐（例えば、オンダンセトロンおよびア
プレピタント）、下痢および出血を低減するためのケアの質を改善することに向けられた
処置）および手術を含む、組合せ療法に含めることができる。特定の実施形態では、抗体
およびその抗原結合断片を、抗体－薬物コンジュゲート、二重特異性または多価抗体のベ
ースとして使用できる。
本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、モノクロー
ナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異性抗体
、標識化抗体、二価抗体または抗イディオタイプ抗体であり得る。組換え抗体は、動物に
おいてよりもむしろ、組換え技術を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製された抗体である。
二重特異性または二価抗体は、２種の異なるモノクローナル抗体の断片を有する人工抗体
であり、２種の異なる抗原と結合できる。「二価」である抗体またはその抗原結合断片は
、２つの抗原結合部位を含む。抗体または抗原結合断片が、「二重特異性」として特徴付
けられる場合には、２つの抗原結合部位は、同一抗原と結合し得る、またはそれらは各々
異なる抗原と結合し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗
原結合断片は、ヒト化またはキメラ抗体である。特定の実施形態では、ヒト化またはキメ
ラ抗体は、組換え法を使用して調製される。例えば、非ヒト動物は、ヒトＰＤ－Ｌ１タン
パク質などの適切な抗原を用いて免疫処置され得る。抗原と結合する抗体可変領域をコー
ドする遺伝子断片が、マウスのモノクローナル抗体の遺伝子から切り出され、この部分が
、ヒトＩｇＧ１に由来する抗体の定常領域の遺伝子に作動可能に連結される。キメラ抗体
の産生のために、組換え遺伝子断片は、発現ベクター中に組み込まれ、次いで、宿主細胞
中に導入される（米国特許第４，８１６，３９７号、同４，８１６，５６７号、同５，８
０７，７１５号を参照のこと）。
「ヒト化抗体」とは、可変領域フレームワークおよび定常領域が、存在する場合には、
完全にまたは実質的にヒト抗体配列に由来するよう、非ヒト由来抗体ＣＤＲ遺伝子の、ヒ
ト抗体遺伝子へのグラフティングによって得られた抗体である。ヒト化抗体を調製するた
めの方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、同５
，５３０，１０１号、同６，４０７，２１３号、同５，８５９，２０５号、同６，８８１
，５５７号、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１およびＷＯ９
６／０２５７６を参照のこと）。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖および
ヒト化軽鎖を含む。特定の実施形態では、ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体中のグラフトされたＣＤ
Ｒの配列は、対応するＣＤＲに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８２％、８５
％、８８％、９０％、９５％または１００％同一である。特定の実施形態では、ヒト化Ｐ
Ｄ－Ｌ１抗体のＣＤＲにおいて、３以下の保存的アミノ酸置換が起こる。特定の実施形態
では、配列最適化のために、ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の可変領域フレームワークのアミノ酸
残基が置換される。特定の実施形態では、ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体鎖の可変領域フレームワ
ーク配列は、対応するヒト可変領域フレームワーク配列に対して少なくとも６５％、７０
％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、ラクダ化単一
ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓ
Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ
ダイアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、単離されたＣＤＲまたは二価ドメイン抗体で
ある。
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、免疫グロブリ
ン定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖お
よび／または軽鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ１－ＣＨ２またはＣＨ
１－ＣＨ３領域を含む。いくつかの実施形態では、定常領域は、望ましい特性を付与する
ように１つまたは複数の修飾をさらに含み得る。例えば、定常領域は、１つもしくは複数
のエフェクター機能を低減もしくは枯渇するように、ＦｃＲｎ受容体結合を改善するよう
に、または１つもしくは複数のシステイン残基を導入するように修飾され得る。
特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ抗体およびその抗原結合断片は、熱安定的に改善され
る。用語「熱安定性」または「熱耐性」は、本明細書において、熱力学的特性の代わりに
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の機能的安定性を指し、それだけには限らないが、加熱、冷却、凍結、
凍結－解凍サイクル、振動、ボルテックス、超音波処置、化学的変性剤、ｐＨ、界面活性
剤、塩、添加物、プロテアーゼまたは温度を含む、熱的および／または物理的／化学的操
作によって引き起こされる不可逆的変性に対する抗体の抵抗性を指す。不可逆的変性は、
抗体の機能的コンホメーションの不可逆的アンフォールディング、生物活性の喪失および
変性されたタンパク質の凝集につながる。熱に対する安定性の増大は、リガンド結合を測
定することによって、または漸増温度でアンフォールディングに対して感受性である、蛍
光、円偏光二色性（ＣＤ）もしくは光散乱などの分光学的方法を使用することによって決
定することができる。本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体は、少なくとも２℃、
少なくとも５℃、少なくとも８℃、少なくとも１０℃、少なくとも１５℃、少なくとも２
０℃または少なくとも３０℃を用いる、機能的コンホメーション状態における熱安定性の
増大によって測定される安定性を増大可能である。本明細書において提供される抗体の熱
安定性は、例えば、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）または示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によ
って測定でき（Ｈｅ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２０１１ Ａｐｒ
；１００（４）：１３３０－４０を参照のこと）、そこでは熱転移中点（Ｔｍ）が測定さ
れ、液体中でのタンパク質の相対的安定性を示す。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体
のＴｍは、７４℃超、７６℃超、７８℃超、８０℃超、８２℃超、８４℃超、８６℃超、
８８℃超、９０℃超または９２℃超、９４℃超、９６℃超または９８℃超である。特定の
実施形態では、熱安定性が改善されたＰＤ－Ｌ１抗体は、２３Ｆ１１（例えば、２３Ｆ１
１－Ｈ４Ｌ４、２３Ａ１１－Ｈ６Ｌ４、２３Ａ１１－Ｈ４Ｌ６または２３Ａ１１－Ｈ６Ｌ
６）であり、９０℃超の熱転移中点（Ｔｍ）を有する。
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片は、抗体－薬物コ
ンジュゲート（ＡＤＣ）をさらに形成する。種々のペイロードが、本明細書において提供
される抗体または抗原結合断片に連結され得るということが考慮される（例えば、“Ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”， Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊ． Ｍ． Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ
Ｒ． Ｅ． Ｌｅｗｉｓ， Ｊｒ． （ｅｄｓ．）， Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８９）を参照のこと）。「ペイロード（単数または複数）」
の用語は、「薬物（単数または複数）」と互換可能に使用され、これらのペイロードは、
抗体または抗原結合断片に、中でも、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配
位結合、錯体形成、会合、ブレンディングまたは付加によって連結され得る。特定の実施
形態では、本明細書において開示される抗体および抗原結合断片は、エピトープ結合部分
の外側に、１つまたは複数のペイロード、例えば、ペプチド、核酸分子、薬物、細胞毒、
ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、ハプテン、小分子、模倣物質、合成
薬物、無機分子、有機分子、放射性同位元素およびリポーター基との結合に利用され得る
特定の部位を含有するように工学的に操作され得る。例えば、このような部位は、ペイロ
ードとの共有結合連結を促進するために１個または複数の反応性アミノ酸残基、例えば、
システインまたはヒスチジン残基などを含み得る。特定の実施形態では、抗体は、リンカ
ーを介して、または別のペイロードによって、ペイロードと間接的に連結され得る。例え
ば、抗体または抗原結合断片は、ビオチンにコンジュゲートされ、次いで、アビジンにコ
ンジュゲートされている第２のペイロードに間接的にコンジュベートされ得る。ペイロー
ドは、リポーター基または検出可能な標識、薬物動態修飾部分、精製部分または細胞傷害
性部分であり得る。検出可能な標識の例として、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ロ
ーダミン、ダンシル、フィコエリトリンまたはテキサスレッド）、酵素基質標識（例えば
、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
ルシフェラーゼ〔luceriferases〕、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキ
シダーゼまたはβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、１２３Ｉ、１２
４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１４Ｃ、６４Ｃｕ
、６７Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒ
ｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉおよび３２Ｐ、その他のランタニド、発光標識）、発色団部
分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子または検出用の金が挙げられる。
特定の実施形態では、ペイロードは、抗体の半減期を増大するのに役立つＰＥＧなどの薬
物動態修飾部分であり得る。その他の適したポリマーとして、例えば、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレング
リコール／プロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられる。特定の実施形態では、
ペイロードは、磁性ビーズなどの精製部分であり得る。「細胞傷害性」部分のペイロード
は、細胞にとって有害であるか、または細胞に損傷を与え得るもしくは死滅させ得る任意
の薬剤であり得る。細胞傷害性部分の例として、制限するものではないが、化学療法剤、
抗腫瘍剤、成長阻害剤、薬物、毒素、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシ
ジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンク
リスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキ
シアントラセンジオン〔dihydroxy anthracin dione〕、ミトキサントロン、ミトラマイ
シン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカ
イン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似
体、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカププリン、６－チオグアニン、
シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタ
ミン、チオテパ〔thioepa〕クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）
およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド〔cyclothosphamide〕、ブスルファ
ン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス－ジクロ
ロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウ
ノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダ
クチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、白金
（例えば、シスプラチンおよびオキサリプラチン）、植物アルカロイド（例えば、トポイ
ソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、タキサンおよびエピポドフィロトキシン）およ
びアントラマイシン（ＡＭＣ））および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよび
ビンブラスチン）が挙げられる。用語「負荷」または「薬物負荷」または「ペイロード負
荷」とは、本明細書において、抗体あたりの薬物／ペイロードの平均数を指す。薬物負荷
は、質量分析、ＵＶ／可視分光法、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＨＰＬＣなどの当技術分野
における適した方法によって決定されるように、抗体あたり１～２０（例えば、１～１５
、１～１０、２～１０、１～８、２～８、２～６、２～５または２～４）薬物（薬物対抗
体比としても）の範囲内であり得る。特定の実施形態では、薬物負荷は、１、２、３、４
、５、６、７、８、９または１０である。
ポリヌクレオチドおよび組換え方法
本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌク
レオチドを提供する。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本開示にお
いて提供されるＣＤＲ配列をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。
モノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を産生する方法は、ヒトＰＤ
－Ｌ１タンパク質またはｈＰＤ－Ｌ１産生細胞を用いて、適した動物を免疫処置すること
を含む。動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギまたはモルモットであり得る。
脾臓またはリンパ節を使用して、または免疫処置された動物のＢ細胞を集め、ＰＤ－Ｌ１
抗体力価を測定してハイブリドーマを作製する。免疫処置された動物から得たハイブリド
ーマまたはＢ細胞クローンから適した力価を有する、ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合
断片をコードするポリヌクレオチドをクローニングする。クローニングされた、または修
飾された（例えば、キメラ、ヒト化）ポリヌクレオチドが適したベクター中に組み込まれ
、次いで、本開示の抗体を産生するために、これが、宿主細胞中に導入される。本明細書
において提供される抗体およびその抗原結合断片は、宿主細胞を培養し、続いて、宿主細
胞または培養液体（例えば、上清）を分離および精製することによって、実質的に純粋な
および均一な形態で得ることができる。抗体またはその抗原結合断片の分離および精製の
ために、ポリペプチド精製のために使用される通常の方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードし、
配列番号９３、９５、９７、９９、１０１、１０３および１０５からなる群から選択され
る配列ならびに少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を
有するその相同配列を含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、
軽鎖可変領域をコードし、配列番号９４、９６、９８、１００、１０２、１０４および１
０６からなる群から選択される配列ならびに少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５
％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％）の配列同一性を有するその相同配列を含む。特定の実施形態では、同一性パ
ーセンテージは、遺伝暗号縮重によるものであり、コードされるタンパク質配列は、変更
されないままである。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを
、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または発現のために、当技術分野で
公知の組換え技術を使用してベクター中に挿入できる。別の実施形態では、抗体は、当技
術分野で公知の相同組換えによって産生され得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮ
Ａは、従来手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的
に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離さ
れ、配列決定される。多数のベクターが利用可能である。ベクター構成成分は、それだけ
には限らないが、以下のうち１つまたは複数を一般に含む：シグナル配列（例えば、翻訳
シグナルまたはリーダー配列）、複製起点、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子、エン
ハンサー要素、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）および転写終結
配列。
いくつかの実施形態では、ベクター系として、哺乳動物、細菌、酵母系などが挙げられ
、それだけには限らないが、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐ
ＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２
、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐ
ＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐ
Ｐｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤ
ＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＥＦ－１、ｐＣＭＶ－ＳＣ
ＲＩＰＴ．ＲＴＭ．、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、
ｐＥＦ－Ｂｏｓなどといったプラスミドならびにその他の実験室および市販の発現ベクタ
ーを含む。適したベクターとして、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、複製欠
損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を挙げることができる。
ベクターは、単一コピーまたは複数コピーで維持され得る、または宿主細胞ゲノム中に組
み込まれ得る。抗体または抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクタ
ーを、複製または遺伝子発現のために、宿主細胞に導入できる。本明細書におけるベクタ
ーにおいてＤＮＡをクローニングし、発現させるための適した宿主細胞は、上記の原核生
物、酵母、昆虫細胞または高等真核生物細胞である。この目的のための適した原核生物と
して、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、エシェリキア属〔Esch
erichia〕、例えば、大腸菌〔E.coli〕、エンテロバクター属〔Enterobacter〕、エルウ
ィニア属〔Erwinia〕）、クレブシエラ属〔Klebsiella〕、プロテウス属〔Proteus〕、サ
ルモネラ属〔Salmonella〕、例えば、サルモネラ・チフィリウム〔Salmonella typhimuri
um〕）、セラチア属〔Serratia〕、例えば、セラチア・マルセカンス〔Serratia marcesc
ans〕および赤痢菌属〔Shigella〕ならびに枯草菌〔B.subtilis〕およびＢ．リケニフォ
ルミス〔licheniformis〕などのバチルス属〔Bacilli〕、緑膿菌〔P.aeruginosa〕などの
シュードモナス属〔Pseudomonas〕およびストレプトマイセス属〔Streptomyces〕、バチ
ルス属〔Bacillus〕、ストレプトコッカス属〔Streptococcus〕、ストレプトマイセス属
〔Streptomyces〕）、スタフィロコッカス属〔Staphylococcus〕、エンテロコッカス属〔
Enterococcus〕、ラクトバチルス属〔Lactobacillus〕、ラクトコッカス属〔Lactococcus
〕、クロストリジウム属〔Clostridium〕、ゲオバチルス属〔Geobacillus〕、オーシャン
バチルス属〔Oceanobacillus〕、シュードモナス属〔Pseudomonas〕、サルモネラ属〔Sal
monella〕、カンピロバクター属〔Campylobacter〕、ヘリコバクター属〔Helicobacter〕
、フラボバクテリウム属〔Flavobacterium〕、フソバクテリウム属〔Fusobacterium〕、
イリオバクター属〔Ilyobacter〕、ナイセリア属〔Neisseria〕およびウレアプラズマ属
〔Ureaplasma〕などの腸内細菌科が挙げられる。適した昆虫細胞として、ショウジョウバ
エシュナイダーＳ２細胞およびＳｆ９が挙げられる。適した酵母として、Ｐ．メタノリカ
〔methanolica〕、Ｐ．パストリス〔pastoris〕、Ｓ．セレビシエ〔cerevisiae〕または
一般的なパン酵母が挙げられる。好ましい哺乳動物細胞として、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９
３細胞、リンパ球および骨髄腫が挙げられる。特定の実施形態では、抗体のグリコシル化
およびＦｃエフェクター機能が必要ではない場合には、抗体は細菌において産生されても
よい。
上記の例に加えて、分裂酵母〔Schizosaccharomyces pombe〕、例えば、Ｋ．ラクチス
〔lactis〕、Ｋ．フラギリス〔fragilis〕（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス
〔bulgaricus〕（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィケラミー〔wickeramii〕（ＡＴＣＣ
２４，１７８）、Ｋ．ワルチー〔waltii〕（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラ
ルム〔drosophilarum〕（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス〔thermotoler
ans〕およびＫ．マルキシアヌス〔marxianus〕などのクリベロミセス属〔Kluyveromyces
〕宿主、ヤロウイア属〔yarrowia〕（ＥＰ４０２，２２６）、ピキア・パストリス〔Pich
ia pastoris〕（ＥＰ１８３，０７０）、カンジダ〔Candida〕、トリコデルマ・リーゼア
〔Trichoderma reesia〕（ＥＰ２４４，２３４）、アカパンカビ〔Neurospora crassa〕
、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス〔Schwanniomyces occidentalis〕などのシ
ュワンニオマイセス属〔Schwanniomyces〕および例えば、アカパンカビ属〔Neurospora〕
などの糸状菌、ペニシリウム属〔Penicillium〕、トリポクラジウム属〔Tolypocladium〕
ならびにＡ．ニジュランス〔nidulans〕およびＡ．ニガー〔niger]などのアスペルギルス
属〔Aspergillus〕宿主などのいくつかのその他の属、種および株が、本明細書において
一般的に利用可能である。
本明細書において提供されるグリコシル化された抗体または抗原断片の発現に適した宿
主細胞は、多細胞生物に由来する。脊椎動物細胞における例として、植物および昆虫細胞
が挙げられる。多数のバキュロウイルス株およびバリアントならびにヨトウガ〔Spodopte
ra frugiperda〕（イモムシ）、ネッタイシマカ〔Aedes aegypti〕（カ）、ヒトスジシマ
カ〔Aedes albopictus〕（カ）、キイロショウジョウバエ〔Drosophila melanogaster〕
（ショウジョウバエ〔fruiffly〕）およびカイコ〔Bombyx mori]などの対応する許容昆虫
宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、
オートグラファ・カリフォルニカ〔Autographa californica〕ＮＰＶのＬ－１バリアント
およびカイコ〔Bombyx mori〕ＮＰＶのＢｍ－５株は、公的に入手可能であり、このよう
なウイルスは、本発明に従って本明細書においてウイルスとして、特に、ヨトウガ〔Spod
optera frugiperda〕細胞のトランスフェクションのために使用され得る。ワタ、トウモ
ロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も宿主
として利用され得る。
しかし、脊椎動物細胞は、大いに興味を引いてきており、培養（組織培養）における脊
椎動物細胞の増殖は、ルーチンの手順となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例として、
ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
６５１）、ヒト胚性腎臓株（２９３または懸濁培養において成長のためにサブクローニン
グされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３
６：５９ （１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １
０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６ （
１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏ
ｄ． ２３：２４３－２５１ （１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８
７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ
、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞癌
腫細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４－６８ （１９８２））、ＭＲＣ ５細胞、Ｆ
Ｓ４細胞、ＰＣ１２、マウス胚線維芽細胞細胞株（３Ｔ３）、ＮＳＯ骨髄腫細胞（任意の
機能的免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞系統）がある。種々の宿
主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための種々の
特徴および機序を有する。したがって、適した細胞株は、発現された抗体の正しい修飾お
よびプロセシング（一次転写物、グリコシル化およびリン酸化など）を確実にするように
、宿主細胞として選択され得る。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ
２９３Ｔ細胞である。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である
。
宿主細胞は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体産生のために上記の発現またはクローニングベクターを
用いて形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列を
コードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地において培養
される。特定の実施形態では、ベクターは、形質転換、エレクトロポレーション、リン酸
カルシウム処置、リポフェクションなどの当技術分野で公知の方法によって宿主細胞中に
移すことができる。特定の実施形態では、真核生物へのベクターのトランスフェクション
は、リン酸カルシウム共沈殿、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リ
ポフェクションおよびウイルス感染を含む。真核細胞の宿主細胞を、抗体をコードする第
２のポリヌクレオチドを用いて同時形質転換してもよい。特定の実施形態では、移された
ベクターを含有する宿主細胞は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を一時的に発現し得る。
本明細書において提供された抗体または抗原結合断片を産生するために使用される宿主
細胞は、種々の培地で培養してもよい。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（
ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）および「ダルベッコ改変
イーグル培地」（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ルリアブロス（ＬＢ）およびテリフィック
ブロス（ＴＢ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａ
ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４ （１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ
ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５ （１９８０）、米
国特許第４，７６７，７０４号、同４，６５７，８６６号、同４，９２７，７６２号、同
４，５６０，６５５号または同５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７
／００１９５または米国再発行特許Ｒｅ．３０，９８５号に記載される培地のいずれも、
宿主細胞のための培養培地として使用してよい。これらの培地のいずれも、必要に応じて
、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮
成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸など）、
バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生
物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の
最終濃度で存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは同等のエネル
ギー供給源が補給され得る。任意のその他の必要な栄養補助食品も、当業者に公知であろ
う適当な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどといった培養条件は、発現のために選択され
た宿主細胞とともにこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかとなろう。
組換え技術を使用する場合には、抗体およびその抗原結合断片は、細胞膜周辺腔におい
て細胞内で産生され得る、または培地中に直接的に分泌され得る。第１のステップとして
抗体が細胞内に産生される場合には、粒状細片、宿主細胞または溶解した断片のいずれか
は、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．
， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７ （１９９２）には、大腸菌
〔E.coli〕の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。手
短に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニ
ルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分にわたって解凍する。細
胞細片は、遠心分離によって除去することができる。抗体およびその抗原結合断片が、培
地中に分泌される場合には、このような発現系から得られる上清を、一般に、市販のタン
パク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃ
ｏｎ限外濾過ユニットを使用してまず濃縮する。タンパク質分解を阻害するために前述の
ステップのいずれかにおいてＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含めてもよく、外来汚
染物質の成長を妨げるために抗生物質を含めてもよい。
細胞から調製された抗体を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎
水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー、濾過、限
外濾過、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、透析、
ＤＥＡＥ－セルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析、免
疫沈降、等電点電気泳動、再結晶化およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して
精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが、好ましい精製技術である。
親和性リガンドとしてのプロテインＡの安定性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリ
ンＦｃドメインの種およびアイソタイプに応じて変わる。プロテインＡを使用して、ヒト
．γ．１、．γ．２または．γ．４重鎖に基づいている抗体を精製できる（Ｌｉｎｄｍａ
ｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６２：１－１３ （１９
８３））。プロテインＡカラムの例として、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳおよびＳｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられ
る。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプに対して、およびヒト．γ．３に対し
て推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ５：１５６７ １５７５
（１９８６））。親和性リガンドが結合されるマトリックスは、最も多くはアガロースで
あるが、その他のマトリックスも利用可能である。コントロールドポアガラスまたはポリ
（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用い
て達成され得るものよりも迅速な流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体が、Ｃ
Ｈ３ドメインを含む場合には、精製のためにＢａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ．ＴＭ．樹脂（
Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が有用である。イオン交換
カラム、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、陰イオンま
たは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのヘパリンセファロース（商
標）クロマトグラフィーでのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥお
よび硫酸アンモニウム沈殿での分画などのタンパク質精製のためのその他の技術も、回収
されるべき抗体に応じて利用可能である。
任意の予備的精製ステップ（単数または複数）後に、対象の抗体および汚染物質を含む
混合物は、約２．５～４．５の間のｐＨで溶出バッファーを使用する、好ましくは、低塩
濃度（例えば、約０～０．２５Ｍ塩）で実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラ
フィーに付され得る。
キット
本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供さ
れる抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物を含むキットを提供す
る。いくつかの実施形態では、キットは、生物学的サンプルにおいてＰＤ－Ｌ１の存在ま
たはレベルを検出するため有用である。生物学的サンプルは、細胞または組織を含み得る
。
いくつかの実施形態では、キット中に含まれる抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断
片は、検出可能な標識（例えば、蛍光、放射活性または酵素標識）とコンジュゲートされ
る。特定のその他の実施形態では、キットは、非標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原
結合断片または非標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片を含有する医薬組成物
を含み、非標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体と結合可能である二次標識された抗体をさらに含む。キ
ットは、標識を検出する手段（例えば、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、酵
素的標識のための酵素基質など）をさらに含み得る。キットは、特定の方法の実施のため
に使用されるさらなる試薬およびバッファーを含み得る。キットは、使用の説明書および
キット中の構成成分の各々を分離するパッケージをさらに含み得る。特定の実施形態では
、キットは、ＰＤ－Ｌ１抗体を検出するためのイムノアッセイを含む。
特定の実施形態では、キット中に含まれる抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片は
、ＥＬＩＳＡなどのサンドイッチアッセイにおいて、またはイムノグラフィーアッセイに
おいて有用な基質またはデバイスと関連している。有用な基質またはデバイスは、例えば
、マイクロタイタープレートおよびテストストリップであり得る。
特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１タンパク質レベルを検出するためのキットが提供され
る。いくつかの実施形態では、キットは、ＰＤ－Ｌ１関連状態を予測する、診断する、予
防するまたは処置するために使用される。
医薬組成物および処置の方法
本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片および１種または複数の医薬上許
容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
本明細書において開示される医薬組成物において使用するための医薬上許容される担体
として、例えば、医薬上許容される液体、ゲルまたは固体担体、水性媒体、非水性媒体、
抗菌剤、等張性物質、バッファー、抗酸化物質、麻酔薬、懸濁剤／分注剤〔dispending a
gents〕、封鎖剤またはキレート化剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤または非毒性補助
物質、当技術分野で公知のその他の構成成分またはそれらの種々の組合せを挙げることが
できる。
適した構成成分として、例えば、抗酸化物質、保水剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、バッ
ファー、保存料、滑沢剤、矯味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤または糖およびシクロデキス
トリンなどの安定化剤を挙げることができる。適した抗酸化物質として、例えば、メチオ
ニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、
システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロ
キシアニソール〔hydroxanisol〕、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸
プロピルを挙げることができる。本明細書において開示されるように、抗体または抗原結
合断片および本明細書において提供されるようなコンジュゲートを含む組成物中に、メチ
オニンなどの１種または複数の抗酸化物質を含めることは、抗体または抗原結合断片の酸
化を低減する。この酸化の低減が、結合活性または結合親和性の喪失を予防または低減し
、それによって、抗体安定性を改善し、有効期間を最大化する。したがって、特定の実施
形態では、１種または複数の、本明細書において開示される抗体または抗原結合断片およ
び１種または複数の、メチオニンなどの抗酸化物質を含む組成物が、提供される。抗体ま
たは抗原結合断片を、メチオニンなどの１種または複数の抗酸化物質と混合することによ
って、本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片の酸化を予防する、有
効期間を延長する、および／または有効性を改善するための方法が、さらに提供される。
適した保水剤として、エチレングリコール、グリセリンまたはソルビトールが挙げられる
。適した滑沢剤として、例えば、セチルエステルワックス、硬化植物油、ステアリン酸マ
グネシウム、ステアリン酸メチル、鉱油、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコ
ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウムま
たは白蝋またはそれらの２種以上の混合物が挙げられる。適した乳化剤として、カルボマ
ー、ポリオキシエチレン－２０－ステアリルエーテル、セトステアリルアルコール、セチ
ルアルコール、コレステロール、ステアリン酸ジグリコール、ステアリン酸グリセリル、
ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラノリン、ポリ
オキシエチレンラウリルエーテル、メチルセルロース、ステアリン酸ポリオキシエチレン
、ポリソルベート、モノステアリン酸プロピレングリコール、ソルビタンエステルまたは
ステアリン酸が挙げられる。
さらに例示するために、医薬上許容される担体として、例えば、塩化ナトリウム注射剤
、リンゲル注射剤、等張性デキストロース注射剤、滅菌水注射剤またはデキストロースお
よび乳酸リンゲル注射剤などの水性媒体、植物起源の硬化油、綿実油、コーンオイル、ゴ
マ油またはピーナッツオイルなどの非水性媒体、静菌性または静真菌性濃度の抗菌剤、塩
化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性物質、リン酸またはクエン酸バッファー
などのバッファー、重硫酸ナトリウムなどの抗酸化物質、塩酸プロカインなどの局所麻酔
、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたは
ポリビニルピロリドンなどの懸濁剤および分散剤、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ－８
０）などの乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリ
コール四酢酸）などの封鎖剤またはキレート化剤、エチルアルコール、ポリエチレングリ
コール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を挙げる
ことができる。担体として利用される抗菌剤は、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベ
ンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エ
ステル、チメロサール、塩化ベンズアルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含有する複
数回用量容器中で医薬組成物に添加してもよい。適した賦形剤として、例えば、水、生理
食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールを挙げることができる。適した
非毒性補助物質として、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解度増
強剤または酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミ
ンまたはシクロデキストリンなどの薬剤を挙げることができる。
医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、ローション、泡沫、丸剤、カプセル
剤、錠剤、徐放性製剤、軟膏、クリーム、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたは
散剤であり得る。経口製剤は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステア
リン酸マグネシウム、ピロリドンポリビニル、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸
マグネシウムなどといった標準担体を含み得る。
特定の実施形態では、医薬組成物は、注射可能物質組成物に製剤化される。注射用物質
医薬組成物は、例えば、液体溶液、懸濁液、エマルジョンまたは液体溶液、懸濁液もしく
はエマルジョンを作製するのに適した固体形態などの任意の従来の形態で調製され得る。
注射用調製物として、注射のための準備の整った滅菌および／または非発熱性溶液、皮下
錠剤を含む使用の直前に溶媒と混合される準備の整った凍結乾燥した散剤などの滅菌無水
可溶性製剤、注射の準備の整った滅菌懸濁液、使用の直前に媒体と混合される準備の整っ
た滅菌無水不溶性製剤ならびに滅菌および／または非発熱性エマルジョンをあげることが
できる。溶液は、水性または非水性のいずれかであり得る。
特定の実施形態では、単位用量非経口調製物が、アンプル、バイアルまたはニードルを
有するシリンジ中にパッケージングされる。非経口投与用のすべての調製物は、当技術分
野で公知であり、実施されるように、滅菌されており、非発熱性でなければならない。
特定の実施形態では、本明細書において開示される抗体または抗原結合断片を適した溶
媒に溶解することによって、滅菌凍結乾燥散剤が調製される。溶媒は、散剤または散剤か
ら調製される再構成された溶液の安定性またはその他の薬理学的構成成分を改善する賦形
剤を含有し得る。使用され得る賦形剤として、それだけには限らないが、水、デキストロ
ース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グル
コース、スクロースまたはその他の適した薬剤が挙げられる。溶媒は、一実施形態では、
およそ中性ｐＨの、当業者に公知のクエン酸、リン酸ナトリウムまたはカリウムまたはそ
の他のこのようなバッファーなどのバッファーを含有し得る。当業者に公知の標準条件下
での溶液のその後の滅菌濾過と、それに続く凍結乾燥は、望ましい製剤を提供する。一実
施形態では、得られた溶液は、凍結乾燥のためにバイアル中に配分される。各バイアルは
、抗ＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片またはその組成物の単一投与量または複数
回投与量を含有し得る。用量または用量のセットに必要なものを少量（例えば、約１０％
）上回る過剰充填バイアルは、正確なサンプル引き出しおよび正確な投薬を容易にするた
めに許容される。凍結乾燥散剤は、約４℃～室温でなどの適当な条件下で保存され得る。
注射水を用いる凍結乾燥散剤の再構成は、非経口投与において使用するための製剤を提
供する。一実施形態では、再構成のために、滅菌および／または非発熱性水またはその他
の液体の適した担体が、凍結乾燥散剤に添加される。正確な量は、与えられている選択さ
れた療法に応じて変わり、経験的に決定され得る。
対象に、本明細書において提供されるようなＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片の
治療有効量を投与し、それによって、ＰＤ－Ｌ１と関連する付随する状態または障害を処
置または予防することを含む、ＰＤ－Ｌ１関連状態を処置するための治療法も提供される
。別の実施形態では、それを必要とする対象に本明細書において提供されるようなＰＤ－
Ｌ１抗体の治療有効量を投与することを含む、免疫応答の上方制御から恩恵を受けるであ
ろう対象において状態を処置するための方法が提供される。
本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片の治療有効量（単独でまた
は化学療法剤などのその他の薬剤と組み合わせて使用される場合）は、当技術分野で公知
の種々の因子、例えば、処置されるべき疾患の種類、抗体の種類、体重、年齢、過去の病
歴、現在の薬物適用、対象の健康状態、免疫状態および交差反応の可能性、アレルギー、
感受性および有害な副作用ならびに投与経路および種類、疾患の重症度および発生ならび
に主治医または獣医師の思慮などに応じて変わる。特定の実施形態では、本明細書におい
て提供されるような抗体または抗原結合断片は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／
ｋｇ、１日あたり１回または複数回（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋ
ｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍ
ｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ
、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５
ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋ
ｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇまたは
約１００ｍｇ／ｋｇ、１日あたり１回または複数回）の治療有効投与量で投与され得る。
特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の投与量で投与
され、特定では、投与量は、２０ｍｇ／ｋｇ以下、１０ｍｇ／ｋｇ以下、３ｍｇ／ｋｇ以
下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．３ｍｇ／ｋｇ以下または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。特定
の実施形態では、投与の投与量は、処置の経過にわたって変わり得る。例えば、特定の実
施形態では、初期投与の投与量は、その後の投与の投与量よりも高いものであり得る。特
定の実施形態では、投与の投与量は、対象の反応に応じて処置の経過にわたって変わり得
る。
投与計画は、最適の所望の応答（例えば、処置応答）を提供するよう調整され得る。特
定の実施形態では、本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片は、１回
または一連の処置にわたって対象に投与される。特定の実施形態では、本明細書において
提供されるような抗体または抗原結合断片は、疾患の種類および重症度に応じて、１回ま
たは複数回の別個の投与によって、または連続注入によって対象に投与される。ガイダン
スは、例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、同５，２０６，３４４号、同５，２２
５，２１２号に見出すことができる。
本明細書において開示される抗体および抗原結合断片は、当技術分野で公知の任意の経
路、例えば、非経口（例えば、皮下、腹腔内、静脈内注入を含む静脈内、筋肉内または皮
内注射）または非経口でない（例えば、経口、鼻腔内、眼球内、舌下、直腸または局所）
経路などによって投与され得る。
特定の実施形態では、本明細書において開示される抗体および抗原結合断片は、徐放性
に投与され得る。徐放非経口調製物は、インプラント、油性注射剤または粒状系（例えば
、ミクロスフェア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノ球体およびナノ粒子
）として製造され得る（Ｂａｎｇａ， Ａ． Ｊ．， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐ
ｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃｅｓｓ
ｉｎｇ， ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｐａ．， （
１９９５）；Ｋｒｅｕｔｅｒ， Ｊ．， Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｋｒｅｕｔｅｒ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋ
ｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ． ２１９－３４２ （１
９９４）；Ｔｉｃｅ ＆ Ｔａｂｉｂｉ、Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅ
ｄ Ｄｒｕｇ 送達、Ａ． Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ、ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ
、Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｐｐ． ３１５－３３９、（１９９２））。
特定の実施形態では、本明細書において開示されるＰＤ－Ｌ１抗体および抗原結合断片は
、分解性または非分解性ポリマーマトリックス中で投与され得る（Ｌａｎｇｅｒ， Ａｃ
ｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２６：５３７－５４２， １９９３を参照のこと
）。
ＰＤ－Ｌ１と関連する状態は、免疫関連疾患または障害であり得る。特定の実施形態で
は、状態は、固形腫瘍、血液学的障害、感染性疾患、自己免疫疾患または線維性疾患であ
り得る。特定の実施形態では、固形腫瘍として、例えば、非小細胞肺癌（扁平上皮／非扁
平上皮）、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、卵巣癌、乳癌（基底乳癌、乳管
癌腫および小葉性乳癌を含む）、膵臓癌、胃癌腫、膀胱癌、食道癌、中皮腫、黒色腫、頭
頸部癌、甲状腺癌、肉腫、前立腺癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、胸腺癌腫、黒色腫、骨髄腫
、菌状息肉症〔mycoses fungoids〕、メルケル細胞癌、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）、線維肉腫
、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫およびその他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイ
ング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、リンパ系腫瘍、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌腫、甲状
腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性
肺癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマが
挙げられる。血液障害は、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞
型リンパ腫、Ｔ－細胞／組織球リッチＢ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄球
性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および
赤白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、
真性赤血球増加症、肥満細胞由来腫瘍、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにびまん性
大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽細胞性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ－細胞
リンパ腫、上咽頭癌およびＨＨＶ８関連原発性体液性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多
発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、
ヘアリー細胞白血病および脊髄形成異常症、原発性ＣＮＳリンパ腫などの中枢神経系（Ｃ
ＮＳ）の新生物、脊髄の軸の腫瘍、脳幹神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫〔cr
aniopharyogioma〕、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜
腫〔menangioma〕、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫などを含む。特定の実施形
態では、腫瘍および癌は、転移性、特に、ＰＤ－Ｌ１を発現する転移性腫瘍である。特定
の実施形態では、腫瘍は、黒色腫または結腸癌である。
特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１関連状態および障害として、全身性エリテマトーデス
（ＳＬＥ）、腸管粘膜性炎症、大腸炎を伴う消耗性疾患、多発性硬化症、ウイルス感染症
、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病〔Cohn's disease〕および炎症性腸疾患、乾
癬、全身性強皮症、自己免疫性糖尿病などといった自己免疫または炎症性疾患が挙げられ
る。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１関連状態および障害として、真菌感染などの感染性
疾患、寄生生物／原生生物感染または慢性ウイルス感染、例えば、コクシジオイデマイコ
シス・イミティス〔coccidioiodmycosis immitis〕、ヒストプラスマ症、爪真菌症、アス
ペルギルス症〔aspergilosis〕、ブラストミセス症、カンジジアシス・アルビカンス〔ca
ndidiasis albicans〕、パラコクシジオイデス症〔paracoccidioiomycosis〕、微胞子虫
症、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、ア
ライグマ回虫症〔Baylisascariasis〕、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイア属〔Co
chliomyia〕、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、
象皮症、腸蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様
条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症
、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線中症、
条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、鞭虫症、トリパノソーマ症、蠕虫
感染、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタイン－バ
ーウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、Ｉ型単純ヘル
ペスウイルスＩ、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ、
ヒト免疫不全ウイルスＩＩ、カポジウエスト肉腫関連ヘルペスウイルス伝染病、シンリン
グウイルス〔thin ring virus〕（トルクテノウイルス〔Torquetenovirus〕）、ヒトＴリ
ンパ増殖性ウイルスＩ、ヒトＴリンパ増殖性ウイルスＩＩ、水痘帯状疱疹、ＪＣウイルス
またはＢＫウイルスのウイルス感染が挙げられる。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１関連
状態として、糸球体腎炎、神経瘢痕〔neural scarring〕、皮膚瘢痕、肺線維症〔pulmona
ry fibrosis〕、肺線維症〔lung fibrosis〕、照射誘導性線維症、肝線維症、骨髄線維症
などの線維性疾患が挙げられる。
使用の方法
本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を使用する方法をさらに提供する
。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象においてＰＤ－Ｌ１関連状態を処置する方法
であって、対象に、抗体またはその抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む方法
を提供する。特定の実施形態では、対象は、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストに応答する可能性
が高い障害または状態を有すると同定されている。特定の実施形態では、本開示は、ＰＤ
－Ｌ１関連状態を予防する、検出する、または診断する方法であって、本明細書において
提供されるＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片を、ＰＤ－Ｌ１関連状態を有すると疑
われる、または有している、または有するリスクにある対象から得られた生物学的サンプ
ルと接触させることと、生物学的サンプルにおいてＰＤ－Ｌ１と結合するＰＤ－Ｌ１抗体
またはその抗原結合断片のレベルを決定することとを含む方法を提供する。
ＰＤ－Ｌ１関連状態の処置のために、対象は、ＰＤ－Ｌ１発現について陽性として試験
され、またはＰＤ－Ｌ１発現の上昇したレベルを有すると試験される。種々の方法を使用
して、個体から得た試験生物学的サンプル中のＰＤ－Ｌ１の存在またはレベルを決定でき
る。例えば、試験生物学的サンプルを、発現されたＰＤ－Ｌ１タンパク質と結合し、これ
を検出する抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片に対して曝露することができる。あ
るいは、ＰＤ－Ｌ１はまた、ｑＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、
ＦＩＳＨなどといった方法を使用して核酸発現レベルで検出できる。いくつかの実施形態
では、試験サンプルは、癌細胞または組織（例えば、臓器から得た生検組織）、腫瘍浸潤
免疫細胞または体液（例えば、血液または血清）に由来する。特定の実施形態では、試験
生物学的サンプル中のＰＤ－Ｌ１の存在または上方制御されたレベルは、応答性の尤度を
示す。用語「上方制御された」とは、本明細書において、同一抗体を使用して検出される
ような参照サンプルにおけるＰＤ－Ｌ１タンパク質レベルと比較した、本明細書において
提供される抗体または抗原結合断片を使用して検出されるような、試験サンプル中のＰＤ
－Ｌ１のタンパク質レベルにおける１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、
４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％以上または
それを超える全体的な増大を指す。参照サンプルは、健常もしくは非罹患個体から得た対
照サンプルまたは試験サンプルが得られた同一個体から得られた健常もしくは非罹患サン
プル、または状態の処置の間のより早期の時間で同一個体から得たサンプルであり得る。
例えば、参照サンプルは、試験サンプル（例えば、腫瘍）に隣接する、または試験サンプ
ルの近隣にある非罹患サンプルであり得る。
本明細書において開示される抗体または抗原結合断片は、単独で、または１種または複
数のさらなる治療手段または薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書におい
て開示される抗体または抗原結合断片は、放射線療法、化学療法、標的化療法、遺伝子療
法、免疫療法、ホルモン療法、血管新生阻害、緩和ケア、癌の処置のための手術（例えば
、腫瘍摘出）などの第２の療法、化学療法に起因する合併症のための１種もしくは複数の
制吐剤もしくはその他の処置または癌もしくはＰＤ－Ｌ１によって媒介される任意の医学
的障害の処置において使用するための第２の治療剤、例えば、別の抗体、治療用ポリヌク
レオチド、化学療法剤（単数または複数）、血管新生抑制剤、サイトカイン、その他の細
胞傷害性薬剤（単数または複数）、成長阻害剤（単数または複数）と組み合わせて投与さ
れ得る。特定のこれらの実施形態では、１種または複数のさらなる治療剤と組み合わせて
投与される本明細書において開示される抗体または抗原結合断片は、１種または複数のさ
らなる治療剤と同時に投与され得、特定のこれらの実施形態では、抗体または抗原結合断
片およびさらなる治療剤（単数または複数）は、同一医薬組成物の一部として投与され得
る。しかし、別の治療剤と「組み合わせて」投与される抗体または抗原結合断片は、その
薬剤と同時に、または同一組成物中で投与されなくてもよい。別の薬剤の前にまたは後に
投与される抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片および第２の薬剤が異な
る経路によって投与される場合であっても、その語句が本明細書において使用されるよう
に、その薬剤と「組み合わせて」投与されると考えられる。可能であれば、本明細書にお
いて開示される抗体または抗原結合断片と組み合わせて投与されるさらなる治療剤は、さ
らなる治療剤の製剤情報シートに列挙されるスケジュールに従って、またはＰｈｙｓｉｃ
ｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３ （Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄ
ｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ５７ｔｈ Ｅｄ； Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ
ｓ Ｃｏｍｐａｎｙ； ＩＳＢＮ： １５６３６３４４５７； ５７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏ
ｎ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００２））もしくは当技術分野で周知のプロトコールに従っ
て投与される。特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体と組み
合わせて投与される血管新生抑制剤は、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ抗体）、ＩＭＣ－１Ｃ１
１またはＤＣ１０１（ＶＥＧＦＲ－２抗体）、ｍＦ４－３１Ｃ１（ＶＥＧＦＲ－３ 抗体
）およびビタキシン（インテグリンαｖβ３抗体）などの抗血管性療法のためのモノクロ
ーナル抗体である。
特定の実施形態では、治療剤は、癌に対する免疫応答を誘導またはブーストし得る。例
えば、腫瘍ワクチンを使用して、特定の腫瘍または癌に対する免疫応答を誘導できる。ま
た、サイトカイン療法を使用して、免疫系に対する腫瘍抗原提示を増強できる。サイトカ
イン療法の例として、制限するものではないが、インターフェロン－α、－βおよび－γ
などのインターフェロン、マクロファージ－ＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦおよび
顆粒球－ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、インスリン増殖因子（ＩＧＦ－１）、血管内皮
細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖
因子（ＦＧＦ）、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、Ｉ
Ｌ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１およびＩＬ－１２のよ
うなインターロイキン、ＴＮＦ－αおよびＴＮＦ－βなどの腫瘍壊死因子またはそれらの
任意の組合せが挙げられる。免疫抑制標的を不活性化する薬剤、例えば、ＩＬ－１－アン
タゴニスト（ＩＬ－１Ａ）、ＶＥＧＦＲ２アンタゴニスト（例えば、バタラニブ、スニチ
ニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ）、ＴＧＦ－β阻害剤、ＦＧＦＲアンタゴニスト、血小
板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、イマチニブ、スニチニブ
、ソラフェニブ、パゾパニブ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ）アンタゴニ
スト（例えば、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ）、ＩＬ－１０阻害剤およびＦ
ａｓリガンド阻害剤またはそれらの任意の組合せも使用され得る。別の群の薬剤として、
腫瘍または癌細胞に対する免疫応答性を活性化するもの、例えば、Ｔ細胞活性化を増強す
るもの（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳおよびＯＸ－４０などのＴ細胞共刺激分子のア
ゴニスト）および樹状細胞機能および抗原提示を増強するものが挙げられる。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性のスクリーニングおよび評価
ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ有効性（例えば、結合活性ま
たは結合親和性）をスクリーニングおよび／または評価するために、非ヒト動物に接種さ
れるヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する非ヒト腫瘍細胞を作製する。特定の実施形態で
は、非ヒト腫瘍細胞は、げっ歯類（例えば、マウス、ラットまたはハムスターなど）細胞
である。特定の実施形態では、非ヒト腫瘍細胞は、黒色腫細胞株（Ｂ１６）またはマウス
結腸癌細胞株（ＭＣ３８）である。非ヒト腫瘍細胞は、内因性非ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子セ
グメントが不活性化されたヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含
み得る。標的遺伝子の不活性化は、タンパク質コード配列の遺伝子破壊、変異、付加、遺
伝子サイレンシング（例えば、ＲＮＡｉ遺伝子アンチセンス）または内因性遺伝子座での
遺伝子欠失（例えば、コード配列またはそれぞれの両端に位置する領域を含むコード配列
の部分的もしくは完全欠失）によって引き起こされ得、それによって、非ヒト標的遺伝子
の発現を排除もしくは最小化するか、またはそのリガンドによって結合されない機能的に
不活性の／末端切断ポリペプチドを作製する。コーディング配列のそれぞれの両端に位置
する領域は、５’および３’末端の両方で約１ｂｐ～約５００ｂｐの範囲内であり得る、
またはそれぞれの両端に位置する領域は、５００ｂｐより長いものであり得るが、本開示
に従うその他の遺伝子の不活性化を含まない。「遺伝子破壊」とは、本明細書において、
天然に存在する配列への１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の付加を指す。遺
伝子破壊は、マーカー／リポーター遺伝子の、タンパク質コード配列への付加または挿入
であり得る。特定の実施形態では、不活性化は、不可逆的である。特定の実施形態では、
不活性化は、標的遺伝子または遺伝子産物について検出可能な活性を有さない細胞をもた
らす。標的遺伝子の不活性化は、当技術分野における適した手段、例えば、相同組換え、
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して実施される。
特定の実施形態では、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質をコードするヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子セグ
メントは、内因性非ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子座中に作動可能に挿入される（遺伝子置き換え
）。特定の実施形態では、ヒトＰＤ－Ｌ１をコードする挿入されたポリヌクレオチドは、
無作為に非特異的位置に組み込まれる（遺伝子増大）。なおさらなる実施形態では、ヒト
ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、エピソームとして、例えば、ＤＮＡの別個
のエピソームセグメントの形態で細胞中で安定に維持され、エピソームＤＮＡの複製は、
宿主細胞周期と独立している、またはそれと同期している。
標的遺伝子の完全不活性化を有する非ヒト腫瘍細胞は、細胞表面発現のＦＡＣＳ解析に
よって、または標的遺伝子転写を検出することによって同定され得る。ヒトＰＤ－Ｌ１タ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本開示に記載の任意の適した発現ベクター（
レンチウイルスベクターなど）を介して、相同組換えおよびトランスジェニック法などの
当技術分野で公知の任意の適した方法によって、腫瘍細胞中に導入され得る。標的遺伝子
の完全な不活性化および／または導入された対象の遺伝子の発現を有する腫瘍細胞は、細
胞表面発現のＦＡＣＳ解析によって、または当技術分野における任意の適した方法によっ
て標的遺伝子転写を検出することによって同定され得る。
ヒトＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ有効性をスクリ
ーニングまたは評価する方法であって、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質をコードするポリヌク
レオチドを含む腫瘍細胞を、非ヒト動物中に接種することと、非ヒト動物において抗体を
腫瘍細胞と接触させることと、腫瘍細胞の腫瘍量を決定することとを含む方法。本明細書
において、「腫瘍量」は、腫瘍体積、数または重量によって測定され得る個体中の腫瘍細
胞の量である。腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞または非固形腫瘍細胞（血液学的細胞など）で
あり得る。腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞または非ヒト腫瘍細胞であり得る。特定の実施形態
では、腫瘍細胞は、同質遺伝子的腫瘍モデルを作製するために同質遺伝子的非ヒト動物に
接種される。特定の実施形態では、腫瘍細胞は、数回継代培養され、その後、非ヒト動物
中に接種される。特定の実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫系を有する。特定の実施
形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合断片のｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、対照と比
較して、ＰＤ－Ｌ１抗体を投薬された非ヒト動物における腫瘍体積の成長阻害によって決
定される。
以下の実施例は、特許請求される本発明をより良好に例示するために提供されるもので
あって、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。以下に記載されるすべての特
定の組成物、材料および方法は、全体でまたは一部で、本発明の範囲内に入る。これらの
特定の組成物、材料および方法は、本発明を制限するよう意図されるのではなく、単に、
本発明の範囲内に入る特定の実施形態を例示するよう意図される。当業者は、本発明能力
の演習を行うことなく、本発明の趣旨から逸脱することなく、同等の組成物、材料および
方法を開発し得る。本発明の範囲内に依然としてありながら、記載される本明細書におけ
る手順において多数の変更を行うことができるということは理解されるであろう。このよ
うな変更が本発明の範囲内に含まれることは、本発明者の意図するところである。
［実施例１］ＰＤ－Ｌ１タンパク質の調製および特徴付け
ヒトＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４タンパク質：組換えヒトＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４タンパク
質（受託番号ＮＰ＿０５４８６２．１）（ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ）を、ヒト２９３細胞（
ＨＥＫ２９３）において発現させた。手短に述べると、Ｃ末端に６×ｈｉｓタグを有する
、Ｐｈｅ１９－Ａｒｇ２３８に由来するヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子のコーディング領域をトラ
ンスフェクションに使用した。Ｈｉｓ－タグ親和性カラムを使用して上清を精製した。得
られた精製タンパク質をＳＤＳ ｐａｇｅゲルを使用して特徴付けた。このタンパク質を
、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入した（ＰＤ１－Ｈ５２２９）。
Ｃ－Ｆｃタグを有するヒトＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４：Ｃ－Ｆｃタグを有する組換えヒト
ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４（受託番号ＮＰ＿０５４８６２．１）（ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）を
、ヒト２９３細胞（ＨＥＫ２９３）において発現させた。手短に述べると、Ｃ末端でヒト
ＩｇＧ１のＦｃ断片と融合しているＰｈｅ１９－Ａｒｇ２３８に由来するヒトＰＤ－Ｌ１
遺伝子のコーディング領域をトランスフェクションに使用した。Ｆｃ－タグ親和性カラム
を使用して上清を精製した。得られた精製タンパク質をＳＤＳ ｐａｇｅゲルを使用して
特徴付けた。このタンパク質をＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入した（ＰＤ１－Ｈ
５２５８）。
マウスＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４タンパク質：組換えマウスＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４タン
パク質（ｍＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ）Ｐｈｅ１９－Ａｒｇ２３８（受託番号ＮＰ＿０６８６９
３）を、Ｃ末端で６×ｈｉｓタグと融合し、ヒト２９３細胞（ＨＥＫ２９３）において産
生させた。ＨＥＫ２９３細胞から得たトランスフェクション上清を、Ｈｉｓ－タグ親和性
カラムを使用して精製した。得られた精製タンパク質をＳＤＳ ｐａｇｅゲルを使用して
特徴付けた。このタンパク質をＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入した（ＰＤ１－Ｍ
５２２０）。
Ｃ－Ｆｃタグを有するマウスＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４：Ｃ－Ｆｃタグを有する組換えマ
ウスＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４タンパク質（ｍＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）Ｐｈｅ１９－Ａｒｇ２３
８（受託番号ＮＰ＿０６８６９３）を、Ｃ末端でヒトＩｇＧ１のＦｃ断片と融合し、ヒト
２９３細胞（ＨＥＫ２９３）において産生させた。ＨＥＫ２９３細胞から得たトランスフ
ェクション上清を、Ｆｃ－タグ親和性カラムを使用して精製した。得られた精製タンパク
質をＳＤＳ ｐａｇｅゲルを使用して特徴付けた。このタンパク質をＡＣＲＯ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍから購入した（ＰＤ１－Ｍ５２５１）。
Ｈｉｓタグを有するカニクイザルＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４：組換えカニクイザルＰＤ－
Ｌ１／ＣＤ２７４タンパク質（ｃＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ）Ｐｈｅ１９－Ａｒｇ２３８（受託
番号Ｆ６ＶＥＷ６）を、Ｃ末端でポリヒスチジンタグと融合し、ヒト２９３細胞（ＨＥＫ
２９３）において産生させた。ＨＥＫ２９３細胞から得たトランスフェクション上清を、
Ｈｉｓ－タグ親和性カラムを使用して精製した。得られた精製タンパク質をＳＤＳ ｐａ
ｇｅゲルを使用して特徴付けた。このタンパク質をＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購
入した（ＰＤ１－Ｃ５２Ｈ４）。
Ｃ－Ｆｃタグを有するカニクイザルＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４： Ｃ－Ｆｃタグを有する
組換えカニクイザルＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４タンパク質（ｃｙｎｏ ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）
Ｐｈｅ１９－Ａｒｇ２３８（受託番号Ｆ６ＶＥＷ６）を、Ｃ末端でヒトＩｇＧ１のＦｃ断
片と融合し、ヒト２９３細胞（ＨＥＫ２９３）において産生させた。ＨＥＫ２９３細胞か
ら得たトランスフェクション上清をＦｃ－タグ親和性カラムを使用して精製した。得られ
た精製タンパク質をＳＤＳ ｐａｇｅゲルを使用して特徴付けた。このタンパク質をＡＣ
ＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入した（ＰＤ１－Ｃ５２５３）。
上記のＰＤ－Ｌ１タンパク質を、以下の実験において使用した。
［実施例２］抗体作製
１．抗原コンジュゲーションおよび免疫処置
免疫処置のために、組換えｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（またはｍＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ）タンパク
質を、種々のＭａｂＳｐａｃｅ免疫増強ペプチドとコンジュゲートした。手短に述べると
、２～８倍モル過剰のペプチドをスルホ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４－［Ｎ－
マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボキシレート、Ｐｅｉｒｃｅ番号２２３２
２）活性化ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質と混合し、室温で１時間インキュベートした。
反応を停止させ、コンジュゲートされたタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して
解析し、品質管理した。
上記のコンジュゲートされたｈＰＤ－Ｌ１－ＦｃおよびｍＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質
を、それぞれ、フロイントの完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、１：１比で
乳化し、次いで、Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスに皮下および腹膜内に免疫処置した。タンパク質
の天然コンホメーションを保つために、ＣｐＧおよびＡｌｕｍを使用してさらなる免疫処
置を実施した。免疫処置は、少なくとも２週間毎に行い、ＥＬＩＳＡアッセイによる抗Ｐ
Ｄ－Ｌ１力価解析のために第１の免疫処置後にマウスから抗血清を採取した。血清力価を
決定するために、各免疫処置マウスから２０μｌのマウス血清を調製した。高結合透明ポ
リスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、高ｐＨコーティングバッファー（０．１
６％ Ｎａ２ＣＯ３、０．３％ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．８）中のマウスまたはヒトＰＤ
－Ｌ１－ｈｉｓからなる、１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌ溶液を用いてコーティング
した。プレートを４°Ｃで一晩インキュベートし、次いで、洗浄バッファーＰＢＳ＋０．
１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）を使用して自動プレート洗浄機で１回洗浄した。
各ウェルに２００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％ヤギ血清
＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）を添加し、室温で２時間インキュベートした。次いで
、ブロッキングバッファーを吸引し、１００μｌの、希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％ Ｂ
ＳＡ＋１％ヤギ血清＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中の段階希釈した血清を、ＥＬＩ
ＳＡプレートの各ウェルに移し、室温で６０分間インキュベートさせた。次いで、プレー
トを上記の方法を使用して３回洗浄した。次いで、１００μｌ／ウェルの希釈バッファー
で希釈された、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ａｂｃａｍ）の溶
液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間イ
ンキュベートさせ、プレートを２５０μｌ／ウェル洗浄バッファーを用いて３回洗浄した
。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを各ウェルに添加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を
使用して反応を終結させた。プレートを、４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａ
ｎ ＦＣで読み取った。
２．融合
融合の４日前、各マウスに、ＰＢＳ中のコンジュゲートされていないｈＰＤ－Ｌ１－Ｆ
ｃおよびｍＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質を用いて腹膜内に追加免疫した。融合日に、脾臓
を無菌的に採取し、臓器を単細胞懸濁液に加工した。赤血球が溶解し、脾臓細胞をＤＭＥ
Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。生存可能な、対数期成長骨髄腫細胞（ＳＰ２／０）を、マ
ウス脾臓細胞と、１：４比で混合した。次いで、細胞を２回洗浄し、その後、ＰＥＧで融
合した。融合後細胞をＤＭＥＭで洗浄し、１０％ＦＢＳ＋ＨＦＣＳ＋ＯＰＩ＋１Ｘ ＨＡ
Ｔを補給した細胞成長培地に懸濁した。ウェルあたり２００μｌのこの細胞懸濁液を、９
６ウェル細胞培養プレートにプレーティングし、３７℃の加湿１０％ ＣＯ２インキュベ
ーター中で一晩インキュベートした。培養物を７日間インキュベートし、次いで、成長培
地をウェルから吸引除去し、新鮮な成長培地と交換した。ハイブリドーマ上清のスクリー
ニングは、培地交換の２～３日後に開始した。
［実施例２］抗体スクリーニング
１．ＥＬＩＳＡアッセイによるＰＤ－Ｌ１結合剤についてのスクリーニング
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの、
高ｐＨコーティングバッファー中の０．５μｇ／ｍｌ ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓまたはｍＰ
Ｄ－Ｌ１－ｈｉｓを用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プ
レートを洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ））を使用
して自動プレート洗浄機で１回洗浄した。各ウェルに２００μｌのブロッキングバッファ
ー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を添加
し、室温で２時間インキュベートした。１００μｌのハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡ
プレートの各ウェルに移し、室温で６０分間インキュベートさせた。次いで、上記の方法
を使用してプレートを３回洗浄した。１００μｌ／ウェルの、ブロッキング溶液で希釈し
た、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ａｂｃａｍ）の溶液を、プレ
ートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間インキュベー
トさせ、次いで、プレートを２５０μｌ／ウェルの洗浄バッファーを用いて３回洗浄した
。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを各ウェルに添加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を
使用して反応を停止させた。プレートを４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ
ＦＣで読み取った。ＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマウェルから得た細胞を、続いて、さ
らなる特徴付け研究のために細胞培養において拡大した。
２．ＥＬＩＳＡにおいてＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との結合を阻害するハイブリドーマ上清
の遮断活性の評価
高結合透明ポリスチレン９６－ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの
、高ｐＨコーティングバッファー中の２μｇ／ｍｌ ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（Ａｃｒｏｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１－Ｈ５２５８）を用いてコーティングし、４℃で
一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔ
ｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ））を使用して自動プレート洗浄機で１回洗浄した。２００
μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０５％
Ｔｗｅｅｎ－２０）を、各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。１００
μｌのハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに移し、室温で６０分間イン
キュベートさせた。次いで、プレートを上記の方法を使用して３回洗浄した。８０μｌの
１μｇ／ｍｌ ｈＰＤ－１－ｈｉｓ（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｐ
Ｄ１－Ｈ５２２１）を、希釈バッファーとともに各ウェルに添加した。次いで、１００μ
ｌ／ウェルの、ブロッキング溶液で希釈した抗ｈｉｓ－ＨＲＰ（１：４０００希釈、ＣＷ
ＢＩＯ、カタログ番号ＣＷ０２８５）抗体の溶液をプレートの各ウェルに添加した。その
後、ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間インキュベートさせ、次いで、プレートを２５
０μｌ／ウェルの洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルの
ＴＭＢを各ウェルに添加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を終結させた。プレ
ートを４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った。ＥＬＩＳＡ
陽性ハイブリドーマウェルから得た細胞を、続いて、さらなる特徴付け研究のために細胞
培養において拡大した（図１Ａ～Ｃを参照のこと）。
３．ＦＡＣＳによる、ＰＤ－１の、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１との結合を阻害するハイブ
リドーマ上清の遮断活性の評価
対数期ＩＦＮ－ｒ刺激された（５００Ｕ／ｍｌ、２日間）ＨＣＣ８２７細胞を集め、ブ
ロッキングバッファー（５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ）に再懸濁した。２×１０＾５個細胞を、各
チューブに添加し、次いで、ＰＢＳ（１５００ｒｐｍ、５分、室温）を用いて１回洗浄し
た。１００μｌ／チューブのハイブリドーマ上清およびブロッキングバッファーを、対応
するチューブ中に添加し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、１ｍｌ
ＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、１００μｌ／チューブの３μｇ／ｍｌのビオチン化
ｈＰＤ－１－Ｆｃ－Ｎ２９７Ａ（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、４℃で１時
間インキュベートした。ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、１００μｌ／チューブのストレ
プトアビジン－ＰＥ（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ブロッキングバッファー中１：２０
０を、各チューブに添加した。細胞を４℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳを
用いて２回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルについて１５０μｌのＰＢＳに再懸濁し
た。次いで、細胞をＦＡＣＳチューブに移し、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）を使用して、抗体の細胞との結合を検出した。
４．ＥＬＩＳＡによるｐＨ依存性 ＰＤ－Ｌ１結合についてのスクリーニング
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの、
０．５μｇ／ｍｌの高ｐＨコーティングバッファー中のｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓを用いてコ
ーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファーＰ
ＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）を使用して自動プレート洗浄機で１回
洗浄した。２００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ
血清＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベー
トした。１００μｌのハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに移し、ｐ
Ｈ７．４またはｐＨ６．０のいずれかで、室温で６０分間インキュベートさせた。次いで
、ｐＨ７．４またはｐＨ６．０のいずれかのバッファーを用い、上記の方法を使用してプ
レートを３回洗浄した。その後、１００μｌ／ウェルの溶液の、ｐＨ７．４のブロッキン
グ溶液で希釈された、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ａｂｃａｍ
）を、次いで、プレートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡプレートを、室温で
６０分間インキュベートさせ、次いで、プレートを、２００μｌ／ウェルｐＨ７．４また
はｐＨ６．０洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭ
Ｂを各ウェルに添加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を終結させた。プレート
を４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った。ＥＬＩＳＡ陽性
ハイブリドーマウェルから得た細胞を、続いて、さらなる特徴付け研究のために細胞培養
において拡大した。クローン２３Ａ１１（図２Ａ）およびクローン２３Ｆ１１（図２Ｂ）
の結果が示されている。
［実施例３］陽性ハイブリドーマクローンのサブクローニングおよび小規模抗体産生
１．陽性ハイブリドーマクローンのサブクローニング
所望の結合プロフィールおよび遮断活性を有するＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマウェル
から得た細胞を、選択し、９６ウェルプレートにおいて制限希釈を使用して各々プレーテ
ィングした。これらの細胞を７日間成長させた。適切な細胞量に到達したら、各ウェルか
ら上清を集め、抗原結合能について再スクリーニングした（実施例２におけるスクリーニ
ングを参照のこと）。
各９６ウェルプレートから、最高の抗原結合活性を有するクローンを同定し、制限希釈
を用いて、さらに、ウェルあたり２００μｌのハイブリドーマ成長培地を有する９６－ウ
ェルプレートで拡大した。７日後、９６ウェルプレートから得た細胞を、抗原結合につい
て試験した。サブクローニングを２回超行った。ウェルのうち９０超が、陽性結合シグナ
ルを示した場合には、最高の抗原結合活性を有する２つのクローンを同定し、培地を有す
る２４ウェルプレートに移し、さらに２日間成長させた。２４ウェルプレートがコンフル
エントになると、細胞を６ウェルプレートに移した。５日インキュベートした後、細胞の
一部を凍結した。細胞の残部をフラスコに移し、拡大させた。フラスコがコンフルエント
になると、さらなるバックアップのために細胞の半量を凍結した（クローンあたり３バイ
アル）。その他の半量は、抗体産生のための培地を有するフラスコ中でさらに拡大させた
。標準方法論を使用してアイソタイプを決定した。
２．小規模抗体産生
ハイブリドーマ細胞をローラーボトルに接種し、２００～３００ｍｌのハイブリドーマ
培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１４日間培養した。ハイブリドーマ細胞培養
物から以下のとおりにＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を精製した。すべての精
製プロセスを、室温で実施した。１つの精製スキームを使用して、種々のｍＡｂを精製し
、アフィニティークロマトグラフィーを使用した。
宿主細胞培養液（ＣＣＦ）を遠心分離して細胞細片を除去した。次いで、ＣＣＦ上清を
濾過し、希釈し、次いで、プロテインＧ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｂｉｏ－
Ｒａｄ）というカラムの形態のプロテインＧクロマトグラフィー培地上にロードし平衡化
した。
ローディング後、プロテインＧカラムを、フロースルーの２８０ｎｍでの吸光度がベー
スラインに戻るまで洗浄した。次いで、グリシン、ｐＨ２．５を使用して、ＰＤ－Ｌ１
ｍＡｂをカラムから溶出し、１ｍＬの溶出体積あたり５０μＬの、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基の
保存溶液を添加することによって直ちに中和した。溶出液の２８０ｎｍでの吸光度をモニ
タリングし、タンパク質を含有する画分を集めて、プロテインＡプールを作製した。
精製後、１０，０００ ＭＷＣＯメンブラン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚ
ｅｒまたは透析チューブ）を使用する透析によって、ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂをＰＢＳ中で製
剤化した。製剤化後、ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂを濾過した。
［実施例４］精製ＰＤ－Ｌ１結合抗体の解析
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの、
高ｐＨコーティングバッファー 中の０．５μｇ／ｍｌ ｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓを用いて
コーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー
（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ））を使用して自動プレート洗浄機
で１回洗浄した。洗浄した。２００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳ
Ａ＋１％正常ヤギ血清＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を、各ウェルに添加し、室温で
２時間インキュベートした。次いで、希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１％正常ヤ
ギ血清＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を用いて段階希釈した精製抗体を添加し、室温
で１時間インキュベートした。次いで、プレートを上記の方法を使用して３回洗浄した。
１００μｌ／ウェルの、希釈バッファー中のＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウス
Ｆｃ抗体（Ａｂｃａｍ）の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡ
プレートを、室温で６０分間インキュベートさせ、次いで、プレートを２５０μｌ／ウェ
ルの洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを各ウ
ェルに添加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して終結させた。プレートを４５０ｎＭで
Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った（図３を参照のこと）。
［実施例５］ＰＤ－１の、ＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する精製抗体の遮断活性の評価
１．ＥＬＩＳＡにおける評価
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの、
０．５μｇ／ｍｌ ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃからなるコーティング溶液を用いて４℃で一晩コ
ーティングした。次いで、洗浄バッファーＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇ
ｍａ）を使用して自動プレート洗浄機で１回洗浄した。各ウェルに、２００μｌのブロッ
キングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ
－２０）を添加し、室温で２時間インキュベートした。次いで、希釈バッファー（ＰＢＳ
＋１％ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を用いて段階希釈し
た抗体（１０μｇ／ｍｌ～０．０００６μｇ／ｍｌ）を添加し、室温で１時間インキュベ
ートした。次いで、プレートを上記の方法を使用して３回洗浄した。１μｇ／ｍｌのビオ
チン化ｈＰＤ－１－Ｆｃ－Ｎ２９７Ａ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を添加し、室温で
１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄した後、次いで、１００μｌ／ウェルの
、希釈バッファーで希釈した、ＨＲＰがコンジュゲートされたニュートラアビジン抗体（
Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡプレート
を、室温で６０分間インキュベートさせ、次いで、プレートを２５０μｌ／ウェルの洗浄
バッファーを用いて３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを各ウェルに添
加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を終結させた。プレートを４５０ｎＭでＴ
ｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った（図４Ａを参照のこと）。ＢＭ－Ｇ
Ｔは、米国特許第８２１７８４９号に開示されるベンチマーク抗体（ＭＰＤＬ－３２８０
Ａ）である。
２．ＦＡＣＳによる腫瘍細胞での評価
対数期ＩＦＮ－ｒ刺激された（５００Ｕ／ｍｌ、２日間）ＨＣＣ８２７細胞を集め、ブ
ロッキングバッファー（５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ）に再懸濁した。２×１０＾５個細胞を、各
チューブに添加し、次いで、ＰＢＳ（１５００ｒｐｍ、５分、室温）を用いて１回洗浄し
た。１００μｌ／チューブの、ブロッキングバッファーで希釈された抗体を、１０μｇ／
ｍｌの最終濃度を含有するように対応するチューブ中に添加し、４℃で１時間インキュベ
ートした。次いで、細胞を、１ｍｌ ＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、１００μｌ／
チューブの３μｇ／ｍｌのビオチン化ｈＰＤ－１－Ｆｃ－Ｎ２９７Ａ（Ａｃｒｏｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍ）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳを用いて３回洗浄した
後、１００μｌ／チューブの、ブロッキングバッファーで１：２００希釈したストレプト
アビジン－ＰＥ（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を各チューブに添加した。細胞を４℃で１
時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプ
ルに対して１５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。次いで、細胞をＦＡＣＳチューブに移し、
フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）を使用し
て抗体の細胞との結合を検出した（図４Ｂを参照のこと）。
［実施例６］精製ＰＤ－Ｌ１抗体の用量依存性応答
１．ＦＡＣＳによって測定される、精製ＰＤ－Ｌ１抗体のＨＣＣ８２７との結合の用量
依存性応答
対数期ＩＦＮ－γ刺激された（５００Ｕ／ｍｌ、２日間）ＨＣＣ８２７細胞を集め、ブ
ロッキングバッファー（５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ）に再懸濁した。２×１０＾５個細胞を、各
チューブに添加し、次いで、ＰＢＳ（１５００ｒｐｍ、５分、室温）を用いて１回洗浄し
た。１００μｌ／チューブの、ブロッキングバッファーで段階希釈した、ハイブリドーマ
上清から精製したＰＤ－Ｌ１抗体を、対応するチューブ中に添加し、４℃で１時間インキ
ュベートした。次いで、細胞を１ｍｌ ＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、１００μｌ
／チューブのブロッキングバッファー中の二次抗体（１：４００抗ｍＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）
－ＰＥ、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を添加した。細胞を４℃で１時間インキュベー
トし、次いで、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルに対して１５０
μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、細胞をＦＡＣＳチューブに移し、抗体の細胞との
結合を、フローサイトメトリー（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６）を使用して検出した（図５
Ａを参照のこと）。
２．ＦＡＣＳによって測定される、ＨＣＣ８２７上のｈＰＤ－Ｌ１とのｈＰＤ－１結合
を遮断する、精製ＰＤ－Ｌ１抗体の用量依存性活性
対数期ＩＦＮ－γ刺激された（５００Ｕ／ｍｌ、２日間）ＨＣＣ８２７細胞を集め、ブ
ロッキングバッファー（５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ）に再懸濁した。２×１０＾５個細胞を、各
チューブに添加し、次いで、ＰＢＳ（１５００ｒｐｍ、５分、室温）を用いて１回洗浄し
た。１００μｌ／チューブの、ブロッキングバッファーを用いて段階希釈した、ハイブリ
ドーマ上清から精製したＰＤ－Ｌ１抗体を、対応するチューブ中に添加し、４℃で１時間
インキュベートした。次いで、細胞を１ｍｌ ＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、１０
０μｌ／チューブの３μｇ／ｍｌのビオチン化ｈＰＤ－１－Ｎ２９７Ａを添加し、４℃で
１時間インキュベートした。ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、１００μｌ／チューブの、
ブロッキングバッファーで１：２００希釈した（ウサギ抗ｈＩｇＧ－ＰＥ、Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ）を各チューブに添加した。細胞を４℃で１時間インキュベートし、次いで、Ｐ
ＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルに対して１５０μｌのＰＢＳに再
懸濁した。次いで、細胞をＦＡＣＳチューブ中に移し、フローサイトメトリー（ＢＤ Ａ
ｃｃｕｒｉ Ｃ６）を使用して、抗体の細胞との結合を検出した（図５Ｂを参照のこと）
。
［実施例７］ハイブリドーマ抗体のクローニングおよび配列
マウス抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体軽鎖および重鎖可変領域の配列は、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮ
Ａ末端の迅速増幅）としても知られるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術によって
得た。４Ｂ６／２３Ａ１１／２３Ｆ１１／２２Ｃ９／２６Ｆ５／２１Ｆ１１／１８Ｇ４抗
体産生ハイブリドーマ細胞からＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮ
Ａを単離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ第一鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およ
びオリゴ（ＤＴ）１２～１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを
合成した。マウスＩｇＧ遺伝子の可変領域を、重鎖可変領域のためにＭｕＩｇＧ ＶＨ３
’－２およびＭｕＩｇ－５’リーダープライマーを、軽鎖可変領域のためにＭｕＩｇＫ
ＶＬ３’－１およびＭｕＩｇ－５”リーダープライマーを用いて（ＮＯＶＡＧＥＮ）、Ｐ
ＣＲによってクローニングした。各抗体の得られたバンドを、ＴＯＰＯ ＴＡクローニン
グベクターにクローニングし、１０種超のクローンから得たＤＮＡを、配列決定に付し、
ＡＢＩ ＤＮＡ塩基配列決定法機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して決定した。
Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １０ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を
使用してコンセンサス配列を決定した。
キメラ抗体の作製：配列決定解析および確認後、抗体産生および精製のために、上記の
遺伝子各々の可変領域を、組換え発現ベクターにクローニングした、例えば、それぞれ、
軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列をｐＣＰ－ｈＩｇＧ１にクローニングし、重鎖可変領域（Ｖ
Ｈ）の配列をｐＣＰ－ｈＩｇＧ１にクローニングした。
［実施例８］組換えキメラ抗体発現および精製
上記で産生された組換えキメラ抗体タンパク質の発現および精製を、以下の方法によっ
て実施した：１ｘ１０６個細胞／ｍｌで、１０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を有する
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地で培養したＨＥＫ２９３Ｅ細胞を、０．５μｇ／ｍ
ｌの最終濃度を有する、等量の、重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターＤＮＡおよび１．０μ
ｇ／ｍｌのＰＥＩ（ポリエチレンイミン－線形、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてトラ
ンスフェクトした。ＤＮＡ対ＰＥＩ比は、１：２であった。最適ＭＥＭを用いて、ＤＮＡ
およびＰＥＩ複合体が形成される期間は、室温で１５分でなくてはならない。トランスフ
ェクトされた細胞を、５％ ＣＯ２を用い、３７℃および１２５ｒｐｍの振盪速度でフラ
スコ中で培養した。トランスフェクションの２２～２６時間後に１％ペプトン培地を添加
した。６日目にコンディショニング培地を回収し、上清を３０００ｒｐｍで３０分間遠心
分離した。次いで、清澄化されたコンディショニング培地を、プロテインＡカラム（Ｇ．
Ｅ． Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードし、ＰＢＳおよび０．１％ ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ
１００を用いて洗浄し、最後に結合しているＩｇＧを、ｐＨ３．５の０．１Ｍグリシンを
含有する溶液を用いて溶出した。溶出された抗体タンパク質を、ＰＢＳに対して透析し、
－８０℃で保存した。内毒素を除去するために、精製したタンパク質を、Ｈｉｔｒａｐ
ＤＥＡＥセファロースＦ．Ｆ．カラムを通すことによってさらに処理し、得られた抗体を
、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０ ＧＬ、Ｇ．
Ｅ． Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して解析して、純度のレベルを決定した。
［実施例９］精製ＰＤ－Ｌ１抗体の、カニクイザルおよびげっ歯類ＰＤ－Ｌ１タンパク質
に対する交差反応性およびｈＰＤ－Ｌ１のｈＰＤ－Ｌ２に対する結合選択性
１．カニクイザルＰＤ－Ｌ１タンパク質との異種間結合
高結合透明ポリスチレン９６－ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの
、高ｐＨコーティングバッファー中、５μｇ／ｍｌヒトまたはカニクイザル（ｃｙｎｏ）
ＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓを用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、
プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ））を
使用して自動プレート洗浄機で１回洗浄した。２００μｌのブロッキングバッファー（Ｐ
ＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を、各ウェル
に添加し、室温で２時間インキュベートした。次いで、希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％
ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を用いて段階希釈した抗体
を添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを、上記の方法を使用し
て３回洗浄した。次いで、１００μｌ／ウェルの、希釈バッファー中の、マウスハイブリ
ドーマ抗体のための、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ａｂｃａｍ
）または４Ｂ６キメラ抗体のためのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ吸着処理済み（Ａｂ
ｃａｍ）の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡプレートを室温
で６０分間インキュベートさせ、次いで、プレートを、２５０μｌ／ウェル洗浄バッファ
ーを用いて３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルの、ＴＭＢを各ウェルに添加し、
０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を終結させた。プレートを、４５０ｎＭでＴｈｅ
ｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った（図６Ａ～６Ｅを参照のこと）。
キメラ抗体４Ｂ６－Ｃは、その親抗体４Ｂ６と同様の結合親和性を有する。４Ｂ６の、
ヒトおよびサル抗原に対する結合親和性は、図６Ａにおけるように、４Ｂ６－Ｃのものと
同様であり、マウスにおける４Ｂ６－Ｃの結合親和性は、図６Ｅにおけるように、４Ｂ６
のものと同様である。
２．マウスＰＤ－Ｌ１タンパク質との異種間結合
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの、
高ｐＨコーティングバッファー中の１μｇ／ｍｌのマウスＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓを用いてコ
ーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー（
ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ））を使用して自動プレート洗浄機で
１回洗浄した。２００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常
ヤギ血清＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を、各ウェルに添加し、室温で２時間インキ
ュベートした。次いで、希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０
．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）中、２０μｇ／ｍｌの精製ハイブリドーママウス抗体を添
加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを、２５０μｌ／ウェルの洗
浄バッファーを用いて３回洗浄した。次いで、１００μｌ／ウェルの、希釈バッファー中
の、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ａｂｃａｍ）の溶液を、プレ
ートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡプレートを、室温で６０分間インキュベ
ートさせ、次いで、プレートを２５０μｌ／ウェルの洗浄バッファーを用いて３回洗浄し
た。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを各ウェルに添加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４
を使用して反応を終結させた。プレートを、４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃ
ａｎ ＦＣで読み取った（図６Ｆを参照のこと）。
３．ｈＰＤ－Ｌ２タンパク質との異科間結合
精製抗体（４Ｂ６、２３Ａ１１、２６Ｆ５、２３Ｆ１１および２２Ｃ９）のヒトＰＤ－
Ｌ２タンパク質との結合を、異種間結合について上記で記載されたものと同様にＥＬＩＳ
Ａによって評価した。手短に述べると、高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎ
ｕｎｃ）を、それぞれ、高ｐＨコーティングバッファー（０．１６％ Ｎａ２ＣＯ３＋０
．３％ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９．８）中の、１００μｌ／ウェルの、０．５μｇ／ｍｌ
のヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１－Ｈ５２
５８）または１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌ ｈＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ（Ａｃｒｏｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ２－Ｈ５２５１）を用いてコーティングし、４℃で一
晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗ
ｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ））を使用して自動プレート洗浄機で１回洗浄した。２００μ
ｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０５％
Ｔｗｅｅｎ－２０）を、各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。１００μ
ｌの、希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０１％ Ｔｗｅ
ｅｎ－２０）を有する２μｇ／ｍｌの精製ＰＤ－Ｌ１抗体を添加し、室温で１時間インキ
ュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。次いで、１
００μｌ／ウェルの、希釈バッファー中のＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩ
ｇＧ抗体（１：２００００、Ａｂｃａｍ）の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。そ
の後、ＥＬＩＳＡプレートを、室温で６０分間インキュベートさせ、次いで、プレートを
、２５０μｌ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルの
ＴＭＢを、各ウェルに１５分間添加し、５０μｌ／ウェルの０．１６Ｍ／Ｌ硫酸を使用し
て反応を終結させた。プレートを、４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ Ｆ
Ｃで読み取った（図６Ｇを参照のこと）。
図６Ｇに示されるように、試験した抗体のすべてが、ｈＰＤ－Ｌ１と結合できるが、ｈ
ＰＤ－Ｌ２とは結合できない。
［実施例１０］精製抗ＰＤ－Ｌ１抗体の、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１との結合の特徴付け：
ＦＡＣＳ結合アッセイ（ＨＣＣ８２７細胞）
対数期ＩＦＮ－γ刺激された（５００Ｕ／ｍｌ、２日間）ＨＣＣ８２７細胞を集め、ブ
ロッキングバッファー（５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ）に再懸濁した。２×１０＾５個細胞を、各
チューブに添加し、次いで、ＰＢＳ（１５００ｒｐｍ、５分、室温）を用いて１回洗浄し
た。１００μｌ／チューブの、ブロッキングバッファーを用いて段階希釈したビオチン化
ＰＤ－Ｌ１抗体を、対応するチューブ中に添加し、４℃で１時間インキュベートした。次
いで、細胞を、１ｍｌ ＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、１００μｌ／チューブの、
ブロッキングバッファー中の二次抗体（または１：２００ウサギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ（Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を添加した。細胞を、４℃で１時間インキュベートし、次いで、Ｐ
ＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルについて１５０μｌのＰＢＳに再
懸濁した。次いで、細胞をＦＡＣＳチューブに移し、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）を使用して、抗体の細胞との結合を検出した
（図７を参照のこと）。「Ｃ」が付された抗体は、キメラ抗体を表し、抗体「４Ｂ６－Ｈ
３Ｌ３」とは、実施例１５において産生されたような、重鎖Ｈ３および軽鎖Ｌ３の組合せ
を有するヒト化４Ｂ６を指す。
［実施例１１］ＰＤ－１の、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する、精製抗ＰＤ－
Ｌ１抗体の遮断活性の評価
対数期ＩＦＮ－γ刺激された（５００Ｕ／ｍｌ、２日間）ＨＣＣ８２７細胞を集め、ブ
ロッキングバッファー（５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ）に再懸濁した。２×１０＾５個細胞を、各
チューブに添加し、次いで、ＰＢＳ（１５００ｒｐｍ、５分、室温）を用いて１回洗浄し
た。１００μｌ／チューブの、ブロッキングバッファーを用いて段階希釈したＰＤ－Ｌ１
抗体（図８を参照のこと）を、対応するチューブに添加し、４℃で１時間インキュベート
した。次いで、細胞を、１ｍｌ ＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、１００μｌ／チュ
ーブの３μｇ／ｍｌのビオチン化ｈＰＤ－１－Ｆｃ－Ｎ２９７Ａを添加し、４℃で１時間
インキュベートした。ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、１００μｌ／チューブの、ブロッ
キングバッファー中のストレプトアビジン－ＰＥ １：２００（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ）を各チューブに添加した。細胞を４℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳを
用いて２回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルについて１５０μｌのＰＢＳに再懸濁し
た。次いで、細胞をＦＡＣＳチューブに移し、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ Ｂｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）を用いて、抗体の細胞との結合を検出した。
図８に示されるように、ＦＡＣＳ結果は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ｈＰＤ－１の、腫瘍細
胞ＨＣＣ８２７上のｈＰＤ－Ｌ１との結合を阻害する濃度依存性活性を示すということを
示した。
［実施例１２］競合ＥＬＩＳＡによる選択された抗ＰＤ－Ｌ１のエピトープビニング
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの、
０．５μｇ／ｍｌ ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃからなるコーティング溶液を用いて、４℃で一晩
コーティングした。次いで、プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅ
ｎ ２０（Ｓｉｇｍａ））を使用して自動プレート洗浄機で１回洗浄し、続いて、２００
μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０５％
Ｔｗｅｅｎ－２０）を各ウェルに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートし
た。次いで、希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０１％
Ｔｗｅｅｎ－２０）中、２０μｇ／ｍｌの、段階希釈した競合抗体４Ｂ６、２３Ａ１１、
２３Ｆ１１、２２Ｃ９および２１Ｆ１１を添加し、プレートを室温で１時間インキュベー
トした。次いで、プレートを、洗浄バッファーを使用して３回洗浄した。最大結合シグナ
ルの８０％をもたらす種々の濃度のビオチン化抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、１８Ｇ４、２
３Ａ１１、４Ｂ６）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し
、次いで、１００μｌ／ウェルの、希釈バッファーで希釈したＨＲＰがコンジュゲートさ
れたニュートラアビジン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液を、プレートの各ウェルに添加した
。その後、ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間インキュベートし、次いで、２５０μｌ
／ウェルの洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ
を、各ウェルに添加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を終結させた。プレート
を４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った（図９Ａ～図９Ｃ
を参照のこと）。
［実施例１３］組換えキメラ抗体のｐＨ依存性結合の特徴付け
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレートを、１００μｌ／ウェルの、高ｐＨコーテ
ィングバッファー中の０．５μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ）を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、コーティ
ングされたプレートを、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）を使用して
自動プレート洗浄機で１回洗浄した。次いで、２００μｌのブロッキングバッファーを、
各ウェルに添加し、次いで、プレートを室温で２時間インキュベートした。ブロッキング
バッファーを吸引した後、ｐＨ７．４の希釈バッファーで段階希釈したキメラ抗体を添加
し、プレートを室温で４０分間インキュベートした。次いで、プレートを、２５０μｌ／
ウェルの、７．４または５．５のｐＨを有する洗浄バッファーを用いて１回洗浄し、次い
で、１００μｌの、ｐＨ７．４またはｐＨ５．５の抗体希釈バッファーを添加し、インキ
ュベーションを室温で２時間継続した。その後、プレートを、２５０μｌの洗浄バッファ
ーを用いて３回洗浄し（洗浄毎に１０秒の振盪）、次いで、１００μｌ／ウェルの、ｐＨ
７．４希釈バッファー中の１：２００００希釈されたＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ
抗ヒトＦｃ抗体（Ａｂｃａｍ）の溶液を、プレートの各ウェルに添加し、室温で１時間イ
ンキュベートした。次いで、プレートを、２５０μｌの洗浄バッファーを用いて３回洗浄
した（洗浄毎に１０秒の振盪）。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを、各ウェルに添
加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を終結させた。プレートを４５０ｎＭでＴ
ｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った（図１０Ａ～Ｆを参照のこと）。
図１０Ａ～１０Ｆに示されるように、キメラ抗体２３Ｆ１１、２３Ａ１１および２２Ｃ
９（図１０Ａ～１０Ｃ）は、ｈＰＤ－Ｌ１とのｐＨ依存性結合を示し（例えば、ｐＨ５．
５でよりも、ｐＨ７．４でより高い結合）、一方、キメラ抗体２１Ｆ１１、４Ｂ６、２６
Ｆ５（図１０Ｄ～１０Ｆ）は、ｈＰＤ－Ｌ１とのｐＨ依存性結合を示さなかった（ｐＨ５
．５／ｐＨ７．４で同様の結合親和性）。
［実施例１４］抗ＰＤ－Ｌ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ評価
上記で得られた抗ＰＤ－Ｌ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ活性を、修飾された同系マウス異種
移植片腫瘍モデルを使用して評価した。マウスに、マウス結腸癌細胞株ＭＣ３８および黒
色腫細胞株Ｂ１６を含む、マウスＰＤ－Ｌ１遺伝子がヒトＰＤ－Ｌ１と置き換えられてい
るマウス腫瘍細胞を用いて皮下に接種した。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を、３ｍｇ／ｋｇ、１
０ｍｇ／ｋｇおよび／もしくは３０ｍｇ／ｋｇを、週に３回、腹腔内に（ＩＰ）、または
１、３もしくは１０ｍｇ／ｋｇの用量で、週に１回静脈内に注射した。参照ＰＤ－Ｌ１抗
体ＢＭ－ＧＴ（すなわち、米国特許第８２１７１４９号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）において
開示されたＹＷ２４３．５５．Ｓ７０またはＭＰＤＬ３２８０Ａ）およびＢＭ－ＭＥ（す
なわち、米国特許第８７７９１０８号の２．１４Ｈ９ＯＰ）を、陽性対照として使用した
。媒体群の腫瘍が、１０００ｍｍ３の体積に達した時点で、腫瘍成長に対する抗体の効果
を評価した。腫瘍体積および体重を、以下に記載されるように週に２回測定し、腫瘍成長
に対する抗体の効果を、媒体群に対する腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）として算出した。
１．ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するマウス腫瘍細胞株の作製
本発明者らが最近開発した高効率ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、マウス腫瘍細
胞株（Ｂ１６およびＭＣ３８は、それぞれＡＴＣＣから購入した）において内因性ＣＤ２
７４／ＰＤ－Ｌ１をノックアウトした。手短に述べると、マウスＣＤ２７４／ＰＤ－Ｌ１
遺伝子の第１のコーディングエキソンを標的とするｓｇＲＮＡを設計し、ヒットエンドラ
ン型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ構築物によって細胞をトランスフェクトし、ノ
ックアウト細胞について選択した。内因性ＣＤ２７４／ＰＤ－Ｌ１が完全ノックアウトさ
れた細胞を、定常状態におけるＣＤ２７４／ＰＤ－Ｌ１の細胞表面発現についてのＦＡＣ
Ｓ解析によって同定するか、またはインターフェロンγによって刺激し、続いて、標的と
されるゲノム領域のＴＡクローニングおよび配列決定によって確認した。ヒトＣＤ２７４
／ＰＤ－Ｌ１置き換え細胞株を作製するために、ヒトＣＤ２７４／ＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ
のコード配列を、ＦＧ１２由来のレンチウイルスベクターにクローニングした。次いで、
マウスＣＤ２７４／ＰＤ－Ｌ１ノックアウト細胞に、ヒトＣＤ２７４／ＰＤ－Ｌ１を発現
するレンチウイルスを感染させ、確立された細胞株におけるヒトＣＤ２７４／ＰＤ－Ｌ１
の高レベルの安定な発現を、ＦＡＣＳ解析によって確認した。Ｂ１６およびＭＣ３８の工
学的に操作された細胞は、それぞれ、Ｂ１６－ｈＰＤ－Ｌ１ ＫＩ、ＭＣ３８－ｈＰＤ－
Ｌ１ ＫＩと名付けた。
２．Ｂ１６／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおけるＰＤ－Ｌ１抗体の抗腫瘍
活性
Ｂ１６細胞を、マウスＰＤ－Ｌ１遺伝子を、ヒトＰＤ－Ｌ１と置き換えるように工学的
に操作し、Ｂ１６－ｈＰＤ－Ｌ１ ＫＩと名付けた。研究に先立って、Ｂ１６－ｈＰＤ－
Ｌ１ ＫＩ細胞を継代５回以内で継代培養し、その後、マウスに接種した。２×１０＾６
個細胞／０．２ｍＬを、１０匹の雌のＳＰＦ等級Ｃ５７ＢＬ／６マウスの各々にＳ．Ｃ．
によって注射した。抗体（例えば、ＢＭ－ＧＴ、４Ｂ６－Ｃおよび２３Ａ１１）の第１の
用量（３ｍｐｋまたは１０ｍｐｋ）を、腫瘍細胞が注射された１日後に注射した。腫瘍の
大きさを、ノギス（ＩＮＳＩＺＥ）を使用して二次元で週に２回測定した。腫瘍成長阻害
（ＴＧＩ）％を、２９日目に測定した値に基づいて算出した。結果をＰｒｉｓｍ Ｇｒａ
ｐｈＰａｄを使用して解析し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。Ｔ検定によって２群間
の比較を行い、Ｐが＜０．０５である場合に、差違は、有意であると考えられる（表１を
参照のこと）。

Figure 2023171733000002
３．ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン（ＫＩ）腫瘍モデルにおけるＰＤ－Ｌ１抗
体の抗腫瘍活性
マウスＰＤ－Ｌ１遺伝子を、ヒトＰＤ－Ｌ１と置き換えるように工学的に操作されたＭ
Ｃ－３８細胞は、ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１ ＫＩと名付けられる。ＭＣ３８／ｈＰＤＬ１
－ＫＩ腫瘍細胞を、大気中、５％ ＣＯ２を有する雰囲気下、３７℃で、１０％加熱不活
性化ウシ胎児血清（ＥｘＣｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび
１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補給したＲＰＭＩ１６４０培
地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で単層培養としてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。腫瘍
細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡ処置（Ｈｙｃｌｏｎｅ）によって週に２回ルーチンで継代
培養した。対数増殖相で成長している細胞を回収し、腫瘍接種についてカウントした。雌
のＳＰＦ等級Ｃ５７ＢＬ／６マウス各々に、２×１０＾６個細胞を右側腹部でＳ．Ｃ．注
射によって接種した。接種のおよそ１０日後、およそ１００ｍｍ＾３の腫瘍体積を有する
４０匹のマウスを選択し、５群に無作為化した（表２中のスキームを参照のこと）。次い
で、マウスを、ＰＢＳ、１ｍｇ／ｍｌでＰＢＳで製剤化された、精製抗体ハイブリドーマ
由来のマウス抗体４Ｂ６、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２６Ｆ５各々のＩＰ注射による１０
ｍｇ／体重１ｋｇを用いて処置した。処置は、第１の注射から、週に３回、４週間継続し
た。動物を、ＣＯ２吸入を用いて研究の最後に犠死させた。腫瘍の大きさを、ノギス（Ｉ
ＮＳＩＺＥ）を使用して２次元で週に２回測定し、体積を、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式
中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である）を使用してｍｍ３
で表した。結果を、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを使用して解析し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ
．として表した。Ｔ検定によって２群間の比較を行い、Ｐが＊＜０．０５および＊＊＜０
．０１である場合に差違は有意であると考えられる。（表３を参照のこと）。
Figure 2023171733000003
Figure 2023171733000004
表３および図１１Ａ～１１Ｃに示されるように、研究の最後に、対照群における平均腫
瘍体積は、出発点での体積よりも６．７倍大きい。それぞれ、抗体４Ｂ６、２３Ａ１１、
２５Ｆ５および２３Ｆ１１で処置されたマウスの４／８、６／８、７／８および７／８が
、検出可能な腫瘍を有しておらず、したがって、完全奏功と考えられ得る。４Ｂ６処置群
中のマウスの２／８は、＞７０％腫瘍低減を有していた（図１１Ｂを参照のこと）。これ
らのデータは、これらの抗体が、定着腫瘍の成長の極めて強力な阻害剤であり、マウスの
大部分において腫瘍を排除する能力を有することを示した。
４．ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおけるＰＨ依存性ＰＤ－Ｌ１
抗体の抗腫瘍活性
ｐＨ依存性抗体が、腫瘍阻害においてｉｎ ｖｉｖｏで任意の利点を有するか否かを評
価するために、本発明者らは、ｐＨ依存性抗体２３Ｆ１１の１種および非ｐＨ依存性結合
抗体４Ｂ６－Ｃの１種の活性を比較した（図１２Ａおよび１２Ｂを参照のこと）。これら
の抗体は、強力な中和活性を有し、また、高用量で腫瘍を阻害し得る。ｐＨ依存性抗体の
潜在的利点を明らかにするために、本発明者らは、抗体を低用量：ＩＰ注射による１ｍｇ
／ｋｇで試験する。手短に述べると、雌のＳＰＦ等級Ｃ５７ＢＬ／６マウス各々に、２×
１０＾６個細胞（すなわち、ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１ ＫＩ）を右側腹部でＳ．Ｃ．注射
によって接種した。接種のおよそ１０日後、およそ２００ｍｍ＾３の腫瘍体積を有する４
０匹のマウスを選択し、５群に無作為化した。次いで、マウスを１ｍｇ／ｍｌでＰＢＳで
製剤化された精製抗体各々の１ｍｇ／体重１ｋｇでのＩＰ注射によって、ＰＢＳ、４Ｂ６
－キメラ（４Ｂ６－Ｃ）、２３Ｆ１１、ベンチマーク抗体ＢＭ－ＧＴ（米国特許第８２１
７１４９号においてＹＷ２４３．５５．Ｓ７０またはＭＰＤＬ３２８０Ａとも名付けられ
た）およびＢＭ－ＭＥ（米国特許第８７７９１０８号において２．１４Ｈ９ＯＰＴとも名
付けられた）を用いて処置した。処置は、各週３回施し、第１の注射後３週間継続した。
動物を、ＣＯ２吸入によって研究の最後に犠死させた。腫瘍の大きさを、ノギス（ＩＮＳ
ＩＺＥ）を使用して２次元で週に２回測定し、体積を、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、
ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である）を使用してｍｍ３で表
した。結果を、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを使用して解析し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．と
して表した。Ｔ検定によって２群間の比較を行い、Ｐが＜０．０５である場合に差違は有
意であると考えられる。
図１２Ａおよび１２Ｂにおけるデータは、ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、ｐＨ依
存性結合特性を有さない抗体よりも腫瘍成長をかなりより強力に阻害することを示した。
１ｍｇ／ｋｇ用量の抗体２３Ｆ１１を用いる処置は、８匹のマウスのうち３匹において腫
瘍の完全消失をもたらし、８匹のうち１匹は、ＰＢＳ処置群と比較して腫瘍体積の７０％
超の低減を有していた。非ｐＨ依存性結合抗体４Ｂ６－Ｃを用いる処置は、腫瘍体積の有
意ではない低減をもたらし、どのマウスも、出発点でのその体積よりも大きい腫瘍を有し
ていた。したがって、ｐＨ依存性結合を有する抗体は、腫瘍成長の阻害において非ｐＨ依
存性結合抗体よりも低い用量で働き得る。
ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ ＫＩ腫瘍モデルにおける抗体１８Ｇ４（図１２Ｃおよび
１２Ｄを参照のこと）および２２Ｃ９（図１２Ｅおよび１２Ｆを参照のこと）の腫瘍成長
の阻害も、静脈から送達した場合に試験した。手短に述べると、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１
腫瘍細胞を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにこれまでのように接種し、６日間成長させた。その
時点で、およそ１２０ｍｍ３の平均腫瘍体積を有するマウスを選択し、各８匹のマウスの
群に無作為化した。各試験抗体を、１または３ｍｇ／ｋｇの、等体積中のハイブリドーマ
培養物から精製された精製抗体１８Ｇ４および２２Ｃ９で、０日目および続いて最大２５
日目に個々のマウスにＩＶ投薬した。動物を、ＣＯ２吸入を用いて研究の最後に犠死させ
た。腫瘍の大きさを、ノギス（ＩＮＳＩＺＥ）を使用して２次元で週に２回測定し、体積
を、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短
い直径である）を使用してｍｍ３で表した（表４および図１２Ｃ～１２Ｆを参照のこと）
。腫瘍体積が、測定可能な大きさ未満に低下することなく、処置の開始時の腫瘍体積の＜
５０％に低減した場合には、部分（ＰＲ）として、腫瘍量が、触知できなくなった場合に
は完全（ＣＲ）として腫瘍退縮を記録する（表５を参照のこと）。図１２Ｃ～１２Ｆにお
ける結果を、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを使用して解析し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．とし
て表した。Ｔ検定によって２群間の比較を行い、Ｐが＜０．０５である場合に差違は有意
であると考えられる。データは、１または３ｍｇ／ｋｇ用量で、１８Ｇ４（表４および５
ならびに図１２Ｃおよび１２Ｄを参照のこと）および２２Ｃ９（表４および５ならびに図
１２Ｅおよび１２Ｆを参照のこと）は、同一条件下で腫瘍成長の阻害において極めて活性
であることを示した。
Figure 2023171733000005
Figure 2023171733000006
５． ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおけるキメラｐＨ依存性Ｐ
Ｄ－Ｌ１抗体の抗腫瘍活性
ｐＨ依存性抗原結合特性を有する抗体が、ｉｎ ｖｉｖｏでｐＨ依存性結合を有さない
ものよりも良好に腫瘍成長を阻害し、Ｆｃドメインの潜在的影響を排除し得ることをさら
に検証するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞（すなわち、ＢＭ－ＧＴ）において
ベンチマーク抗体と同一のＩｇＧアイソタイプ（すなわち、ヒトＩｇＧ１）を用いて産生
したキメラ抗体（すなわち、２３Ａ１１－Ｃおよび２３Ｆ１１－Ｃ）を再試験した。
手短に述べると、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１ ＫＩ細胞を接種し、腫瘍体積が１００ｍｍ
３であった時点で、１ｍｇ／ｋｇでのＩＰ注射による抗体の処置を開始し、抗体を週に３
回のＩＰ注射で投与した。結果をＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを使用して解析し、平均
±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。Ｔ検定によって２群間の比較（試験対媒体）を行い、Ｐが
＜０．０５である場合に差違は有意であると考えられる。
図１３Ａおよび１３Ｂに示されるように、１ｍｐｋのキメラｐＨ依存性抗体（すなわち
、２３Ａ１１－Ｃおよび２３Ｆ１１－Ｃ）を注射されたＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１マウ
ス腫瘍モデルにおける腫瘍体積は、１ｍｐｋのベンチマーク抗体（すなわち、ＢＭ－ＧＴ
）のものよりも小さかった。
［実施例１５］ヒト化抗体の作製および特徴付け
１．ヒト化抗体の作製、発現および精製
マウス抗体４Ｂ６、２３Ａ１１および２３Ｆ１１の可変ドメインの配列を使用して、マ
ウスフレームワークに対して最高の相同性を有する生殖系列配列を同定した。コンピュー
タモデリングを使用して、ＣＤＲグラフティングおよび逆変異を用いてヒト化バリアント
を設計した。
４Ｂ６
ＣＤＲグラフティングのために、それぞれ、軽鎖についてヒト生殖系列フレームワーク
配列ＶＫ／１Ｄ－１３および重鎖についてＶＨ／１－２を使用した。
３つのＣＤＲを生殖系列配列（配列番号８７）に直接グラフトすることならびにそれぞ
れ、ＨＣバリアント３（配列番号６５）のＫ１２Ｖ、Ｔ２８Ｖ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ｖ、Ｔ
７４Ｋ、Ｓ７７ＲおよびＨＣバリアント４（配列番号６７）のＴ２８Ｖ、Ｒ７２Ｖ、Ｓ７
７Ｒの逆変異によって、重鎖（ＨＣ）バリアント３および４を得た（図１４Ａを参照のこ
と）。
４Ｂ６ ＨＣの生殖系列配列：
ＶＨ／１－２（４Ｂ６－生殖系列、配列番号８７）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ＶＨ／１－２バリアント３（４Ｂ６－Ｈｚｄ－ＨＣ－Ｖ３、配列番号６５）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＶＦＴＤＹＹＭＮＷＶＫＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＮＮＧＧＴＳＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＶＴＶＤＫＳＴＲＴＡＹ
ＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＶＫＷＧＤＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＨ／１－２バリアント４（４Ｂ６－ＨＣ－Ｖ４、配列番号６７）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＶＦＴＤＹＹＭＮＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＮＮＧＧＴＳＹＮＱＫＦＱＧＲＶＴＶＴＶＤＴＳＩＲＴＡＹ
ＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＶＫＷＧＤＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
３つのＣＤＲを生殖系列配列（配列番号８８）に直接グラフトすることならびにそれぞ
れ、ＬＣバリアント３（配列番号６６）のＬ４Ｍ、Ｐ８Ｑ、Ｌ７８Ｍ、Ｙ８７ＦおよびＬ
Ｃバリアント４（配列番号６８）のＬ４Ｍ、Ｙ８７Ｆの逆変異によって、軽鎖（ＬＣ）バ
リアント３および４を得た（図１４Ｂを参照のこと）。
４Ｂ６ ＬＣの生殖系列配列：
ＶＫ／１Ｄ－１３（４Ｂ６ ＬＣ生殖系列、配列番号８８）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡＷＹＱＱＫＰ
ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ
ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＮＹＰ
ＶＫ／１Ｄ－１３バリアント３（４Ｂ６－Ｈｚｄ－ＬＣ－Ｖ３、配列番号６６）
ＤＩＱＭＴＱＳＱＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＮＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰ
ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＭＱＰ
ＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＹＳＮＹＰＴＦＧＳＧＴＫＬＧＩＫ
ＶＫ／１Ｄ－１３バリアント４（４Ｂ６－ＬＣ－Ｖ４、配列番号６８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＮＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰ
ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＬＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ
ＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＹＳＮＹＰＴＦＧＳＧＴＫＬＧＩＫ
２３Ａ１１
ＣＤＲグラフティングのために、それぞれ、重鎖についてヒト生殖系列フレームワーク
配列ＶＨ／１－２および軽鎖についてＶＫ／７－３を使用した。
３つのＣＤＲを生殖系列配列（配列番号８９）に直接グラフトすることならびにそれぞ
れ、ＨＣバリアント３（配列番号７１）のＶ２０Ｌ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ
７２Ｖ、Ｔ７５Ｋ、Ｒ８７ＴおよびＨＣバリアント５（配列番号１８９、配列番号６９中
の第１のアミノ酸ＬがＱに変換されている）のＭ４８Ｉ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ｖの逆変異に
よって、重鎖（ＨＣ）バリアント３および５を得た（図１５Ａを参照のこと）。
２３Ａ１１ ＨＣの生殖系列配列：
ＶＨ／１－２（２３Ａ１１－ＨＣ－生殖系列、配列番号８９）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ＶＨ／１－２バリアント３（２３Ａ１１－ＨＣ－Ｖ３、配列番号６１）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＴＹＷＩＨＷＶＫＱＲ
ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＱＰＮＳＧＧＴＫＹＮＤＱＦＫＮＲＡＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＧＴＶＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＳＩＳＳ
ＶＨ／１－２バリアント５（２３Ａ１１－ＨＣ－Ｖ５、配列番号１８９）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＴＹＷＩＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＱＰＮＳＧＧＴＫＹＮＤＱＦＫＮＲＶＴＬＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＧＴＶＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＳＩＳＳ
３つのＣＤＲを生殖系列配列（配列番号９０）に直接グラフトすることならびにそれぞ
れ、ＨＣバリアント３（配列番号７２）のＰ１５Ｖ、Ｐ４７Ｓ、Ｑ５４Ｒ、Ｖ６２Ｉ、Ｇ
７２Ｒ、Ｎ８９Ｔ、Ｌ９３ＨおよびＨＣバリアント５（配列番号７０）のＰ１５Ｖ、Ｐ４
７Ａ、Ｑ５４Ｒ、Ｖ６２Ｉ、Ｇ７２Ｒ、Ｎ８９Ｔ、Ｌ９３Ｑの逆変異によって、軽鎖バリ
アント３および５を得た（図１５Ｂ）。
２３Ａ１１ ＬＣの生殖系列配列
ＶＫ／７－３（２３Ａ１１－ＬＣ－生殖系列、配列番号９０）：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＳＥＬＧＩＮＬＩＨＷＹ
ＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＫＤＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮ
ＰＶＥＡＮＤＴＡＮＹＹＣＬＱＳＫＮＦＰ
ＶＫ／７－３バリアント３（２３Ａ１１－ＬＣ－Ｖ３、配列番号７２）：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＶＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＩＹＧＮＳＦＭＨＷＹ
ＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮ
ＰＶＥＡＮＤＴＡＴＹＹＣＨＱＳＮＤＤＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＴＫ
ＶＫ／７－３バリアント５（２３Ａ１１－ＬＣ－Ｖ５、配列番号７０）：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＶＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＩＹＧＮＳＦＭＨＷＹ
ＱＱＫＰＧＱＡＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮ
ＰＶＥＡＮＤＴＡＴＹＹＣＱＱＳＮＤＤＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＴＫ
２３Ｆ１１
ＣＤＲグラフティングのために、それぞれ、重鎖についてヒト生殖系列フレームワーク
配列ＶＨ／１－２および軽鎖についてＶＫ／７－３を使用した。
３つのＣＤＲを生殖系列配列（配列番号９１）に直接グラフトすることならびにそれぞ
れ、ＨＣバリアント４（配列番号７５）のＶ２０Ｌ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｍ
７０Ｌ、Ｒ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋ、Ｒ８７ＴおよびＨＣバリアント６（配列番号７７）のＭ４
８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ｖの逆変異によって、重鎖（ＨＣ）バリア
ント４および６を得た（図１６Ａを参照のこと）。
２３Ｆ１１ ＨＣの生殖系列配列：
ＶＨ／１－２（２３Ｆ１１生殖系列ＨＣ、配列番号９１）：
ＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰ
ＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭ
ＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ＶＨ／１－２バリアント４（２３Ｆ１１－ＨＣ－Ｖ４、配列番号７５）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＴＹＷＭＨＷＶＫＱＲ
ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＱＰＮＳＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＫＫＡＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＧＴＶＤＹＦＤＹＷＧＱＧＳＴＬＴＶＳＳ
ＶＨ／１－２バリアント６（２３Ｆ１１－ＨＣ－Ｖ６、配列番号７７）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＴＹＷＭＨＷＶＲＱＡ
ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＱＰＮＳＧＧＴＫＹＮＥＫＦＫＫＫＡＴＬＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹ
ＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＧＴＶＤＹＦＤＹＷＧＱＧＳＴＬＴＶＳＳ
３つのＣＤＲを生殖系列配列（配列番号９２）に直接グラフトすることならびにそれぞ
れ、ＬＣバリアント４（配列番号７６）のＰ１５Ｖ、Ｑ５４Ｒ、Ｖ６２Ｉ、Ｎ８９Ｔ、Ｌ
９３ＱおよびＬＣバリアント６（配列番号７８）のＰ１５Ｖ、Ｑ５４Ｒ、Ｖ６２Ｉ、Ｎ８
９Ｔ、Ｌ９３Ｈの逆変異によって、軽鎖バリアント４および６を得た（図１６Ｂを参照の
こと）。
２３Ｆ１１ ＬＣの生殖系列配列
ＶＫ／７－３（２３Ｆ１１生殖系列ＬＣ、配列番号９２）：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＳＥＬＧＩＮＬＩＨＷＹ
ＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＫＤＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮ
ＰＶＥＡＮＤＴＡＮＹＹＣＬＱＳＫＮＦＰ
ＶＫ／７－３バリアント４（２３Ｆ１１－ＬＣ－Ｖ４、配列番号７６）：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＶＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＩＹＧＮＳＦＭＨＷＹ
ＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮ
ＰＶＥＡＮＤＴＡＴＹＹＣＱＱＳＴＥＤＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＶＫ／７－３バリアント６（２３Ｆ１１－ＬＣ－Ｖ６、配列番号７８）：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＶＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＩＹＧＮＳＦＭＨＷＹ
ＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮ
ＰＶＥＡＮＤＴＡＴＹＹＣＨＱＳＴＥＤＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
上記の重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを合成し、当技術分野で周知のようにＦｃ領域のエフェ
クター機能を低減または最小化するために、Ｆｃ領域中にＮ２９７Ａ変異を有するヒトＩ
ｇＧ１の定常領域と融合した（本明細書において記載される重鎖残基の番号付けは、カバ
ットのＥＵインデックスに従う（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏ
ｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， ＵＳ Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈ
ｅａｌｔｈ ＆ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９８３）を参照のこと））。選択
した抗体遺伝子の重鎖および軽鎖の可変領域を合成し、発現ベクター中にクローニングし
、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ系
を使用して大規模ＤＮＡを調製した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉ
ｎｅ（商標）２９３試薬を、製造業者のプロトコールに従って使用してトランスフェクシ
ョンを実施した。細胞生存がおよそ５０％であった時点で上清を回収した。プロテインＡ
ビーズおよびクリーンな上清を、振盪しながら４℃で２時間インキュベートし、その後、
カラムを通した。カラムの内側のプロテインＡビーズをＰＢＳを用いて洗浄し、１００ｍ
Ｍグリシンバッファー（ｐＨ３．０）を使用して、抗体を溶出し、これをＰＢＳバッファ
ー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ １０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した。最後に、Ｐｉｅｒｃｅ Ｈｉ
ｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｒｅｓｉｎ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号８８２７１）を使用して内毒素を除去した。ＳＤＳ－ＰＡＧ
ＥおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣによって精製抗体を特徴付けた。
２．ＥＬＩＳＡにおけるヒト化抗体の、ｈＰＤ－Ｌ１との結合
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの、
高ｐＨコーティングバッファー中の０．５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ（Ａｃｒ
ｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＤ１－Ｈ５２２９）を用いてコーティングし、
４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．１
％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ））を使用して自動プレート洗浄機で１回洗浄した。
２００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．
０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を、各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。
希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－
２０）を用いて段階希釈したヒト化抗体（２９３細胞において産生された）を添加し、室
温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを、洗浄バッファーを用いて３回洗浄
した。１００μｌ／ウェルの、希釈バッファー中のＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗
ヒトＦｃ抗体（Ａｂｃａｍ）の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩ
ＳＡプレートを、室温で６０分間インキュベートさせ、次いで、プレートを、２００μｌ
／ウェルのｐＨ７．４洗浄バッファーを使用して３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウ
ェルのＴＭＢを、各ウェルに添加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を終結させ
た。プレートを、４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った（
図１７Ａおよび１７Ｂを参照のこと）。
３． ＥＬＩＳＡにおけるｈＰＤ－Ｌ１とのｈＰＤ－１結合の遮断
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの、
１μｇ／ｍｌ ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃからなるコーティング溶液を用いて、４℃で一晩コー
ティングした。次いで、プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ
２０（Ｓｉｇｍａ））を使用して自動プレート洗浄機で１回洗浄した。２００μｌのブロ
ッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ－２０）を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。次いで、希釈バッフ
ァー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤギ血清＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を用
いて段階希釈した抗体（すなわち、２９３細胞において産生されたヒト化４Ｂ６、２３Ｆ
１１、２３Ａ１１ならびに同様に２９３細胞において産生されたベンチマーク抗体ＢＭ－
ＧＴおよびＢＭ－ＭＥ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレート
を上記の方法を使用して３回洗浄した。１μｇ／ｍｌのビオチン化ｈＰＤ－１－Ｎ２９７
Ａ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレー
トを３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルの、希釈バッファー中の１：５０００希釈した
ＨＲＰがコンジュゲートされたニュートラアビジン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液を、プレ
ートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡプレートを、室温で６０分間インキュベ
ートさせ、次いで、プレートを、２５０μｌ／ウェルの洗浄バッファーを用いて３回洗浄
した。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを各ウェルに添加し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ
４を使用して反応を終結させた。プレートを４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃ
ａｎ ＦＣで読み取った（図１８Ａ～１８Ｄ参照のこと）。
図１６中のデータは、ヒト化抗体の一部は、ヒトＰＤ－１とのヒトＰＤ－Ｌ１結合の阻
害において、他のものよりも有意により強力であることを示した。
４．ＦＡＣＳによって測定されるＨＣＣ８２７上のｈＰＤ－Ｌ１とのｈＰＤ－Ｌ１抗体
の結合
対数期ＩＦＮ－γ刺激された（５００Ｕ／ｍｌ、２日間）ＨＣＣ８２７細胞を集め、ブ
ロッキングバッファー（５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ）に再懸濁した。２×１０＾５個細胞を、各
チューブに添加し、次いで、ＰＢＳ（１５００ｒｐｍ、５分、室温）を用いて１回洗浄し
た。１００μｌ／チューブの、ブロッキングバッファーで段階希釈したヒト化ＰＤ－Ｌ１
抗体（２９３細胞において産生された）を、対応するチューブに添加し４℃で１時間イン
キュベートした。次いで、細胞を、１ｍｌ ＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、１００
μｌ／チューブの、ブロッキングバッファー中の二次抗体（１：２００ウサギ抗ヒトＩｇ
Ｇ－ＰＥ）を添加した。細胞を４℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳを用いて
２回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルに対して１５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。次
いで、細胞をＦＡＣＳチューブに移し、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）を用いて抗体の細胞との結合を検出した（図１９を参照の
こと）。
５． ＦＡＣＳによって測定されるＨＣＣ８２７上のｈＰＤ－Ｌ１との、ｈＰＤ－１結
合の遮断
対数期ＩＦＮ－γ刺激された（５００Ｕ／ｍｌ、２日間）ＨＣＣ８２７細胞を集め、ブ
ロッキングバッファー（５％ＢＳＡ＋ＰＢＳ）に再懸濁した。２×１０＾５個細胞を、各
チューブに添加し、次いで、ＰＢＳ（１５００ｒｐｍ、５分、室温）を用いて１回洗浄し
た。以下の実験における小規模産生のための、１００μｌ／チューブの、ブロッキングバ
ッファーで段階希釈されたヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体（２９３細胞において発現された抗体は
、「旧」と名付け、ＣＨＯ細胞において産生されたものは、「新」と名付けた。すなわち
、４Ｂ６－Ｈ３Ｌ４、４Ｂ６－Ｈ４Ｌ３、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５ ２９３および２３Ｆ１
１ Ｈ４Ｌ４ ２９３は、２９３細胞において産生され、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５ ＣＨＯ
および２３Ｆ１１ Ｈ４Ｌ４ ＣＨＯは、ＣＨＯ細胞において産生された）を、対応する
チューブに添加し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、１ｍｌのＰＢＳ
を用いて２回洗浄し、続いて、１００μｌ／チューブの、３μｇ／ｍｌのビオチン化ｈＰ
Ｄ－１－Ｎ２９７Ａを添加し、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳを用いて３回洗
浄した後、１００μｌ／チューブの、ブロッキングバッファー中のストレプトアビジン－
ＰＥ １：２００を各チューブに添加した。次いで、細胞を４℃で１時間インキュベート
し、次いで、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、続いて、細胞を、各サンプルに対して１５０μ
ｌのＰＢＳに再懸濁した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳチューブに移し、フローサイトメト
リー（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ）を用いて抗体の細胞との結
合を検出した（図２０Ａおよび２０Ｂを参照のこと）。
［実施例１６］混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＴ細胞活性化を刺激する精製ヒト化
抗体の能力の評価
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１媒介性Ｔ細胞活性化の阻害の軽減における、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の
能力を評価するために、本発明者らは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを実施した
。第１の実験では、ＤＣは、新鮮ヒト血液から単離された接着末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ
）に由来した。ＰＢＭＣを、血清不含培地を用いて２×１０＾６個／ｍｌの密度で６ウェ
ルプレート中にプレーティングした。２時間後、懸濁液細胞を廃棄し、接着細胞を、１０
ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４を用いて処置した。培地を３
日毎に交換し、６日目に２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを添加して、ＤＣ細胞を成熟させた。
７日目に、抗ＣＤ１１ｃ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ＨＬＡ－ＤＲ－ＡＰＣ（
Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用するＦＡＣＳによって、ＤＣの表現型を検出した。ＣＤ４＋
Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｃ．）を使用して、別のドナーの新鮮な血
液からＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。ＤＣがマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌで２時間）
によって処置された後、ＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞およびＰＤ－Ｌ１抗体を、ＤＣ １：
ＣＤ４＋ Ｔ １０の比で２００μｌ／ウェルに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュ
ベーターで５日間インキュベートした。次いで、上清のＩＬ－２およびＩＦＮ－γを、Ｉ
Ｌ－２デュオセット〔duo-set〕（Ｒ＆Ｄ）およびＩＦＮ－γ検出キット（Ｐｅｐｒｏｔ
ｅｃｈ）を使用して検出した（図２１Ａおよび２１Ｂを参照のこと）。Ｔ細胞の増殖を、
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測
定した。
第２の実験では、１：１体積のフィコール溶液を添加し、続いて、３０分間遠心分離し
た後に、末梢血を回収し、ＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを使用し、ＣＤ１４コーティン
グした磁性ビーズおよびＣＤ４陰性磁性ビーズを使用して、単球およびＴ細胞を単離した
。上記で得た単球を、５００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ）および２５０Ｕ／ｍｌのＧＭ
－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）の存在下で７日間培養し、続いて、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Ｒ
＆Ｄ）を添加し、培養をさらに３日間継続することによって分化させた。上記で得られた
ＤＣ細胞をカウントし、ウェルあたり１００μｌの体積中の１０，０００個のＤＣ細胞を
、５０μｌ体積中の１００，０００個のＴ細胞と混合し、次いで、５０μｌ体積の得られ
た抗体または対照ＩｇＧを添加し、ヒトＰＤ－Ｌ１（１μｇ／ｍｌの最終濃度）をさらに
添加して、または添加せずに２連で５日間培養した。上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ
）を使用してＩＬ－２およびＩＦＮγの濃度を定量した（図２１Ｃおよび２１Ｄを参照の
こと）。
［実施例１７］Ｂｉａｃｏｒｅによる選択ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和性の評価
ＣＭ５センサーチップを、新たに調製した１：１ ５０ｍＭ Ｎ－ヒドロキシスクシン
イミド（ＮＨＳ）：２００ｍＭ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カ
ルボジイミド（ＥＤＣ）の７分注射（１０μｌ／分）によって各フローセル中で活性化し
た。次いで、１０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファーＰＨ５．０中、１０μｇ／ｍｌの濃度
の抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、１０μｌ／分で活性化されたチッ
プ上に注入した（ＨＢＳ－ＥＰランニングバッファー：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）。
残存する活性カップリング部位を、１０μｌ／分で１Ｍエタノールアミンの７分注射によ
ってブロックした。各フローセルの固定化レベルは、約９０００ＲＵである。ＦＣ２にお
いて、抗ヒトＦｃ ＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって抗体を２００～３０
０ＲＵに捕獲した。ＦＣ１を参照細胞として使用した。抗体の捕獲後、抗原を種々の濃度
で注入した。抗体結合抗原の会合時間は、１８０秒である。表面再生条件は、Ｇｌｙ ｐ
Ｈ１．５において１０μｌ／分で１２０秒である。捕獲された抗体を有さないものから差
し引かれた捕獲された抗体のシグナルを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアバ
ージョン２．０（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて算出した。
Figure 2023171733000007
ヒトＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１間の相互作用は弱く、約７５００＋／－２２００ｎＭのＫ
Ｄを有することが知られている（Ｎ＝６、Ｃｈｅｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｇｒ
ａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ
． ２０１３；２８８（１７）：１１７７１－８５）。したがって、表６に示される本発
明者らの抗体は、ｈＰＤ－Ｌ１と結合する先行技術のＰＤ－１よりも約１００倍高い親和
性を有する。
［実施例１８］選択ＰＤ－Ｌ１中和ヒト化抗体のｐＨ依存性結合の評価
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレートを、１００μｌ／ウェルの、高ｐＨコーテ
ィングバッファー中、０．５μｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ を用いてコーティングし
、４℃で一晩インキュベートした。次いで、コーティングしたプレートを、ＰＢＳ＋０．
１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）を用いて自動プレート洗浄機で１回洗浄した。次
いで、２００μｌのブロッキングバッファーを、各ウェルに添加し、次いで、プレートを
室温で２時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを吸引した後、ｐＨ７．４の
希釈バッファーで段階希釈した抗体（すなわち、ＣＨＯまたは２９３細胞によって産生さ
れた２３Ａ１１ Ｈ３Ｌ５、２３Ｆ１１ Ｈ４Ｌ４）を添加し、プレートを室温で４０分
間インキュベートした。次いで、プレートを２５０μｌ／ウェルの、ｐＨ７．４の洗浄バ
ッファーを用いて１回洗浄し、次いで、１００μｌ／ウェルの、ｐＨ７．４またはｐＨ５
．５洗浄バッファーを添加し、インキュベーションを、振盪しながら室温で２時間継続し
た。その後、プレートを、ｐＨ７．４の洗浄バッファーを使用して３回洗浄し、１００μ
ｌ／ウェルの、ｐＨ７．４希釈バッファー中の ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗ヒ
トＦｃ抗体（Ａｂｃａｍ）の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、プレート
を室温で６０分間インキュベートさせ、続いて、２００μｌ／ウェルのｐＨ７．４洗浄バ
ッファーを用いて３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを各ウェルに添加
し、０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を終結させた。プレートを４５０ｎＭでＴｈ
ｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った（図２２Ａ～図２２Ｅを参照のこと）
。
広範囲のｐＨにわたるｐＨ依存性ｈＰＤ－Ｌ１結合の特徴付け
ｐＨ依存性結合親和性を、ｐＨ４、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０
、ｐＨ７．４などの種々のｐＨでさらに測定した。ＥＬＩＳＡによる測定を、上記の方法
と同様に実施した。高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレートを、１００μｌ／ウェル
の、高ｐＨコーティングバッファー中０．５μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓを用いて
コーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、コーティングしたプレートを
、ＰＢＳ ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ）を用いて自動プレート洗浄
機で１０秒間振盪しながら３回洗浄した。次いで、２００μｌのブロッキングバッファー
（１％ ＢＳＡ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）＋１％正常ヤギ血清（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）＋０．０
５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ））を、各ウェルに添加し、次いで、プレート
を室温で２時間インキュベートし、上記のように３回洗浄した。ブロッキングバッファー
を吸引した後、１００μｌの、ｐＨ７．４の希釈バッファー（１％ ＢＳＡ （Ｓｏｌａ
ｒｂｉｏ）＋１％正常ヤギ血清（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０
（Ａｍｒｅｓｃｏ））で段階希釈した抗体（すなわち、２９３細胞によって産生された２
３Ａ１１ Ｈ３Ｌ５、２３Ｆ１１ Ｈ４Ｌ４および２２Ｃ９－Ｃ）を添加し、プレートを
室温で４０分間インキュベートした。次いで、プレートを２５０μｌ／ウェルの、ｐＨ７
．４、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０、ｐＨ４．５またはｐＨ４．０の洗浄バッフ
ァーを用いて１回洗浄し、次いで、１００μｌ／ウェルｐＨ７．４またはｐＨ５．５の洗
浄バッファーを添加し、インキュベーションを振盪しながら室温で２時間継続した。その
後、プレートをｐＨ７．４の洗浄バッファーで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの、ｐＨ
７．４希釈バッファー中のＨＲＰコンジュゲートされたヤギ抗ｈＩｇＧ ＨＲＰ抗体（１
：２００００、Ａｂｃａｍ）の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、プレー
トを、室温で６０分間インキュベートさせ、続いて、２５０μｌ／ウェルの、ｐＨ７．４
洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを各ウェル
に１５分間添加し、５０μｌ／ウェルの０．１６Ｍ／Ｌ硫酸を使用して反応を終結させた
。プレートを、４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った（図
２３Ａ～２３Ｆを参照のこと）。測定は３連で実施した。
各抗体について、低ｐＨでの結合シグナルは、ｐＨ７．４でのものに対して低かった。
ｐＨが低いほど、結合シグナルは、特定の濃度の抗体でより低い。ｐＨ５で、高濃度、例
えば、０．１、０．３または１μｇ／ｍｌで試験した３種の抗体の結合シグナルは、ｐＨ
７．４でのそのシグナルの５０％よりも低く、ｐＨ５．５では、３種の試験した抗体のシ
グナルは、ｐＨ７．４のものの７５％未満である。
［実施例１８］アラニンスキャンによる選択抗ＰＤ－Ｌ１のエピトープビニング
１． 変異体ヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質の作製
細胞外ヒトＰＤ－Ｌ１（アミノ酸１９～２３８）およびヒトＩｇＧ１のＦｃ断片のｃＤ
ＮＡコーディングを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成した（配列番号１０７は、アミノ酸配列で
あり、配列番号１０８は、対応するＤＮＡ配列である）。以下に列挙される、指定された
位置での単一アミノ酸変更を有するヒトＰＤ－Ｌ１のバリアントを、以下に記載されるよ
うなオーバーラップＰＣＲによって、（表７）に示されるプライマー（Ｄｒ．Ｏｌｉｇｏ
ＢＬＰ－１９２、Ｂｉｏｌｙｔｉｃ）を使用して増幅した。得られた断片を、それぞれ
、５’および３’末端でＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨ Ｉについて制限酵素を用いて
消化した。次いで、ＰＣＲ産物を、Ｓｙｎｏアセンブリーミックス試薬（Ｓｙｎｂｉｏ）
を、製造業者の説明書に従って使用する相同組換えの方法によってｐｃＤＮＡ３．１（＋
）ベクターにクローニングした。プラスミドは、精製したＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ
Ｍｅｇａキット（ＱＩＡＧＥＮ）であった。
アミノ酸配列（配列番号１０７）：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩ
ＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨ
ＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹ
ＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥ
ＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲ
ＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲ
ＥＮＬＹＦＱＧＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶ
ＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶ
ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰ
ＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳ
ＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦ
ＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＤＮＡ配列（配列番号１０８）：
ＡＡＧＣＴＴｇｃｃｇｃｃａｃｃＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＣＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴ
ＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＧＴＴＣＡＣ
ＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＴＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣ
ＡＧＣＡＡＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＧＴＧＣＡＡＧＴＴＣＣＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣ
ＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＡＴＴＧＧＧＡＧＡＴＧＧＡ
ＧＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣ
ＣＴＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧＡＣ
ＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧＣＴＣＴＧＣＡ
ＧＡＴＣＡＣＣＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＡＣＣＧＣ
ＴＧＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＡＧＧＡＴＣＡ
ＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＧ
ＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＡＧＣＴＧ
ＡＣＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＴＴＴ
ＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣ
ＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＡＡＣＧＴＧ
ＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＧＡＧＡＴＣＴ
ＴＣＴＡＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡ
ＣＡＣＡＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＴＣＡＣ
ＣＣＴＣＣＴＡＡＣＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣ
ＣＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣ
ＣＡＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＡ
ＧＴＣＡＣＴＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧ
ＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡ
ＴＡＡＴＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣ
ＡＣＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧ
ＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡ
ＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＧＴＡＡＡ
ＧＣＴＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣ
ＣＴＣＣＡＴＣＣＣＧＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴ
ＧＡＣＴＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＴＡＴＣＣＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＧＣＡ
ＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡ
ＡＧＡＣＴＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＴ
ＴＣＴＧＴＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＡＧＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧ
ＣＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＴＴＣＡＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣ
ＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＣ
ＴＧＧＡＡＡＧｔａｇＧＧＡＴＣＣ
上記で作製した野生型ＰＤ－Ｌ１プラスミド（配列番号１０７および１０８）を鋳型と
して使用して、メガプライマー（表７）を用いて組み込まれた配列の２つのセグメントを
作製し、相同組換えによって連結を達成した。次いで、バリアントを同定するための配列
決定によって個々の陽性コロニーをスクリーニングした後、産物をｐｃＤＮＡ３．１（＋
）ベクターにクローニングし、ＰＤ－Ｌ１変異体は、成功裏に作製されているとわかった
。ＰＣＲ手順および条件は、以下のとおりとした：
ステップ１：バリアントの２つのメガ断片を作製するために
μｌ
ｄｄＨ２Ｏ ３５
５×Ｓ１５ ＰＣＲバッファー １０
１０ｍＭ ｄＮＴＰ １
Ｆプライマー １
Ｒプライマー １
ＰＣＲ産物 １
Ｓ１５ポリメラーゼ １
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
５０
最初の変性： ９８℃ １分
変性： ９８℃ １５秒
アニーリング： ５８℃ ３０秒
伸長： ７２℃ Ｋｂあたり３０秒
最終的な伸長： ７２℃ ３分 ３０サイクル
ステップ２：２つの小片を一緒に接合するために
以下の反応を氷上で設定する（相同組換え）：
Ｓｙｎｏアセンブリーミックス １０μｌ
配列産物１ ２μｌ
配列産物２ ２μｌ
脱イオンＨ２Ｏ ６μｌ
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
総体積 ２０μｌ
Figure 2023171733000008
Figure 2023171733000009
その他の２０種のバリアントが別の企業、Ｇｅｎｅｗｉｚ （Ｓｕｚｈｏｕ、Ｃｈｉｎ
ａ）によって構築されている。ＰＤ－Ｌ１バリアントを合成するために、Ｓｙｎｂｉｏ
Ｔｅｃｈを用いる同様の方法が実施される。また、変異体部位に使用されるメガプライマ
ーが、表８に記載されている。
Figure 2023171733000010
Figure 2023171733000011
その後、変異体および野生型ＰＤ－Ｌ１のこれらのプラスミドを、２９３Ｔ（ＡＴＣＣ
（登録商標）ＣＲＬ３２１６）細胞株にトランスフェクトした。第１に、５×１０６個の
２９３Ｔ細胞を、６０ｍｍディッシュに播種することで、一次比が、トランスフェクショ
ンのために６０％～８０％であることを確実にする。次いで、１０μｇ ＤＮＡを４００
μｌの１×ＨＢＳで希釈し、約５分インキュベートする。上記の混合物に１０μｌの２５
ｋＤａの線形ＰＥＩトランスフェクション試薬（１×ＨＢＳに溶解した、１ｍｇ／ｍｌの
保存溶液）を添加し、ＤＮＡ／ＰＥＩ比が１：２．５であることを確実にする。次いで、
混合物を、２９３Ｔディッシュに１滴ずつ添加した。約６～８時間後に培地を変更し、完
全ＤＭＥＭと置き換える。７２時間後、それぞれ、０．２２μｍフィルターを用いて細胞
培養上清を集め、次いで、使用のために－８０℃で保存した。
２．ＥＬＩＳＡによるＰＤ－Ｌ１抗体の結合
上清を使用して、以下に記載されるようにＥＬＩＳＡによってＰＤ－Ｌ１抗体の結合を
検出した。
２．１マウスＡｂについて：
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの、
高ｐＨバッファー中の０．５μｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃ抗体（Ａｂｃａｍ）からなるコーテ
ィング溶液を用いて、室温で１時間コーティングした。次いで、プレートを、洗浄バッフ
ァー（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ））を使用して自動プレート洗
浄機で１回洗浄し、続いて、２００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳ
Ａ＋１％正常ヤギ血清＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を、各ウェルに添加した。プレ
ートを４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを洗浄バッファーを用いて１回
洗浄し、１６０μｌの、種々の変異体ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質またはＤＭＥＭ中
の５００ｎｇ／ｍｌの野生型ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質を含有するＤＭＥＭ上清を
、各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを上記の方法
を使用して３回洗浄した。０．５μｇ／ｍｌのマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体を添加し、室温で
１時間インキュベートした。プレートを、２００μｌ／ウェルのｐＨ７．４の洗浄バッフ
ァーを使用して３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルの、希釈バッファーで希釈したＨＲ
ＰがコンジュゲートされたマウスＩｇＧ抗体（１：２００００、Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液を
、プレートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡプレートを、室温で６０分間イン
キュベートし、次いで、２００μｌ／ウェルのｐＨ７．４の洗浄バッファーを用いて３回
洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを、各ウェルに添加し、０．６４Ｍ Ｈ
２ＳＯ４を使用して反応を終結させた。プレートを、４５０ｎＭでＴｈｅｒｍｏ Ｍｕｌ
ｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った（図２４を参照のこと）。
２．２ヒトＦｃを有するＡｂ（キメラまたはヒト化抗体）について：
高結合透明ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの、
高ｐＨバッファー中の０．５μｇ／ｍｌの、その他のＰＤ－Ｌ１抗体と対を形成し得る抗
ヒトＦｃ（マウス抗体について）または抗ｈＰＤ－Ｌ１抗体からなるコーティング溶液を
用いて、室温で１時間コーティングした。次いで、プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ＋
０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ））を使用して自動プレート洗浄機で１回洗浄
し、続いて、２００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１％正常ヤ
ギ血清＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を各ウェルに添加した。プレートを４℃で一晩
インキュベートした。次いで、プレートを洗浄バッファーを用いて１回洗浄し、１６０μ
ｌの、種々の変異体ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質またはＤＭＥＭ中の５００ｎｇ／ｍ
ｌの野生型ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質を含有するＤＭＥＭ上清を、各ウェルに添加
し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを上記の方法を使用して３回洗
浄した。０．５μｇ／ｍｌの、上記で作製したビオチン化ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体（２３
Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４－ｂｉｏおよび２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５－ｂｉｏ）またはＰＤ－１タンパ
ク質を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、２００μｌ／ウェルのｐ
Ｈ７．４の洗浄バッファーを使用して３回洗浄した後、次いで、１００μｌ／ウェルの、
希釈バッファーで希釈したＨＲＰがコンジュゲートされた抗マウスＦｃ抗体（Ａｂｃａｍ
）またはＨＲＰがコンジュゲートされたニュートラアビジン（１：５０００、Ｐｉｅｒｃ
ｅ）の溶液を、プレートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡプレートを、室温で
６０分間インキュベートし、次いで、２００μｌ／ウェルのｐＨ７．４の洗浄バッファー
を用いて３回洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルの、ＴＭＢを、各ウェルに添加し、
０．６４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して反応を終結させた。プレートを、４５０ｎＭでＴｈｅ
ｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＦＣで読み取った（図２４を参照のこと）。
表９には、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒトＰＤ－Ｌ１に対して試験された個々の抗体
各々に必要である、ｈＰＤ－Ｌ１上の重要な残基が要約されている。野生型タンパク質の
ものに対して有意に低減された結合シグナルにつながるヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質上のア
ミノ酸残基変異が記されている。
Figure 2023171733000012
表９中のデータは、ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１とのその結合
について、以下のアミノ酸のうち多くを利用することを示した。
Ｒ１２５およびＳ８０は、ＰＤ－Ｌ１抗体の両方の種類（例えば、ｐＨ依存性および非
ｐＨ依存性）とのＰＤ－１結合にとって重要であり、本明細書において提供される本ＰＤ
－Ｌ１抗体の結合にとってのＳ８０の重要性は、以前に報告されなかった。
Ｅ５８およびＲ１１３は、２２Ｃ９、２３Ａ１１、２３Ｆ１１およびそれらのヒト化バ
ージョンにとって、非ｐＨ依存性結合ａｂ（ＢＭ－ＭＥなどのベンチマーク抗体を含む）
に対してより重要であり、Ｅ５８は、抗体２２Ｃ９、２３Ａ１１、２３Ｆ１１についての
本発明者らの解析によって見出された新規部位であり、ＰＤ－Ｌ１とのＰＤ－１結合にと
って重要ではないので、先行技術によって示されない）。
Ｍ１１５およびＫ１２４は、２２Ｃ９に特有であるが、これら２つの残基は、ＰＤ－Ｌ
１とのＰＤ－１結合にとって重要であると知られている。
Ｎ６３およびＹ８１は、２３Ｆ１１およびそのヒト化２３Ｆ１１およびヒト化２３Ａ１
１に特有であり（しかし、２３Ａ１１ではない）、一方、それらはＰＤ－Ｌ１とのＰＤ－
１結合にとって重要ではなく、また、ｈＰＤ－Ｌ１と結合するベンチマーク抗体にとって
重要ではなく、したがって、新規部位である。
Ｉ６４は、２３Ｆ１１およびそのヒト化バージョンに特有であり、先行技術においては
ＰＤ－Ｌ１とのＰＤ－１結合にとって重要であると知られていない。
Ｋ６２は、２３Ａ１１ヒト化バージョンに特有であり、先行技術においては、ＰＤ－Ｌ
１とのＰＤ－１結合にとって重要であると知られていない。
Ｙ１２３は、４Ｂ６およびベンチマーク抗体にとって最も重大であるが、ｐＨ依存性抗
体を含むその他の抗体にはあまり重大ではない（２２Ｃ９、別のｐＨ依存性結合抗体にと
っても重要である）。
Ｙ５６は、２１Ｆ１１に特有であり、先行技術においてＰＤ－Ｌ１とのＰＤ－１結合に
とって重要であると知られていない。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体における、Ｒ１１３およびＲ１２５のいずれかのＡへの変異は、ヒト
ＰＤ－Ｌ１とのその結合能の喪失につながると報告されているが（米国特許第８７７９１
０８号を参照のこと）、Ｌｉｎ ＤＹ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００８ Ｆｅｂ． ２６；１０５（８）：３０１１－６に記
載されるように、それらは、ＰＤ－Ｌ１とのＰＤ－１結合にとって重要であると知られて
いる。
［実施例１９］ｉｎ ｖｉｖｏ研究のための抗ＰＤ－Ｌ１抗体の大規模産生
ＣＨＯ－Ｋ１細胞における一過性の発現を使用して抗体を産生した。プロテインＡ親和
性カラムを使用して産生された抗体を精製し、脱塩すると、抗体が、ＰＢＳ中に５ｍｇ／
ｍｌで、＜３ユニット／ｍｇの内毒素レベルを有して製剤化された。得られた抗体を、Ｓ
ＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して純度について特徴付けた。
ＣＨＯ－Ｋ１細胞を使用する組換え抗体の一過性の発現および精製
選択された抗体遺伝子の重鎖および軽鎖の可変領域を合成し、発現ベクター中にクロー
ニングした。得られた発現構築物を使用して、血清不含培地において成長するように適応
しているＣＨＯ－Ｋ１細胞をトランスフェクトした。１０ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリ
アクター中で１０日成長させた後、培養培地を回収し、限外濾過膜を使用して細胞および
細胞細片を除去し。清澄化した上清を限外濾過によって濃縮し、調製されたプロテインＡ
（ヒトＩｇＧ）またはＧ－セファロース（マウスＩｇＧ）カラム上にアップロードした。
ＵＶモニターによるモニタリング下で、平衡バッファーを用いてベースラインまで洗浄し
た後、０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．５を用いてカラムを次いで溶出し、溶出した抗体を
１．０ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０を用いて直ちに中和し、ＰＢＳ、ｐ
Ｈ７．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して２～８℃で一晩、２回のバッファー交換を用
いて透析した。精製抗体を、０．２２μｍ滅菌シリンジフィルターを通して濾過し、－８
０℃以下でアリコートにして保存した。
［実施例２０］抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化抗体のｉｎ ｖｉｖｏ評価
ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ活性を、実施例１４に記載されたように評価
した。
１． ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおけるヒト化ＰＤ－Ｌ１抗
体の抗腫瘍活性
ＭＣ３８／ヒト－ＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍モデルにおけるヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体４Ｂ
６－Ｈ３Ｌ３－Ｎ２９７Ａの抗腫瘍活性の試験を、実施例１４に記載されたように実施し
、結果は表１０および図２５に示された（ＰＢＳ、ＢＭ－ＧＴおよび４Ｂ６－Ｈ３Ｌ３－
Ｎ２９７Ａを使用する処置の結果が示された）。
Figure 2023171733000013
２．ヒト化抗体のＩＰ注射を用いるＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１ ＫＩ腫瘍成長の阻害
この研究は、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかで腹腔内に
送達された場合に、腫瘍成長の阻害におけるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の効果を評価するた
めに設計されている。手短に述べると、２×１０＾６個のＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細
胞を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてこれまでに行ったように接種し、６日間成長させた
。その時点で、８０～１００ｍｍ＾３の平均腫瘍体積を有するマウスを選択し、各群に８
匹のマウスを有する群に無作為化した。各試験抗体を、個々のマウスに、１ｍｇ／ｋｇ、
３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（ＢＭ－ＧＴについて）で、または等体積の２３Ｆ１
１－Ｈ４Ｌ４（１ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内に、６日目に出発して、週に３回投薬した。動物
を、ＣＯ２吸入を用いて研究の最後（２５日目）に犠死させた。腫瘍の大きさを、ノギス
（ＩＮＳＩＺＥ）を使用して２次元で週に２回測定し、体積を、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２
（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である）を使用してｍ
ｍ３で表した。腫瘍体積が、測定可能な大きさ未満に低下することなく、処置の開始時の
腫瘍体積の＜５０％に低減した場合には、部分（ＰＲ）として、腫瘍量が、触知できなく
なった場合には完全（ＣＲ）として腫瘍退縮を記録する（表１１を参照のこと）。結果を
、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを使用して解析し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。
Ｔ検定によって２群間の比較を行い、Ｐが＜０．０５である場合に差違は有意であると考
えられる。図２６Ｅは、種々の抗体（ＢＭ－ＧＴ、ＢＭ－ＭＥ、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５お
よび２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４）を用いて投薬された個々のマウスにおいて測定された腫瘍体
積を示す。ＲＴＶは、同一マウスにおける１日目に測定された腫瘍体積と比較された相対
腫瘍体積を表し、ＴＶは、研究の最後の日（すなわち、２５日目）に測定された腫瘍体積
を表す。
Figure 2023171733000014
３．ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の静脈内注射を用いるＭＣ３８／ＨＰＤ－Ｌ１ ＫＩ腫瘍成
長の阻害
この研究は、患者にヒト化抗体を使用するために期待する方法として静脈内に送達され
た場合に、腫瘍成長の阻害におけるヒト化抗体の効果を評価するために設計されている。
手短に述べると、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてこ
れまでに行ったように接種し、１０日間成長させた。その時点で、１８０～２２０ｍｍ３
の平均腫瘍体積を有するマウスを選択し、各群に１２匹のマウスを有する群に無作為化し
た。各試験抗体を、個々のマウスに、等体積の１ｍｇ／ｋｇでＩＶで、０日目および１５
日目に投薬した。動物を、ＣＯ２吸入によって研究の最後に犠死させた。腫瘍の大きさを
、ノギス（ＩＮＳＩＺＥ）を使用して２次元で週に２回測定し、体積を、式：Ｖ＝０．５
ａ×ｂ２（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である）を使
用してｍｍ３で表した。腫瘍体積が、測定可能な大きさ未満に低下することなく、処置の
開始時の腫瘍体積の＜５０％に低減した場合には、部分（ＰＲ）として、腫瘍量が、触知
できなくなった場合には完全（ＣＲ）として腫瘍退縮を記録する（表１２を参照のこと）
。結果を、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを使用して解析し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として
表した。Ｔ検定によって２群間の比較を行い、Ｐが＜０．０５である場合に差違は有意で
あると考えられる。
図２９中のデータは、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５および２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４が、１ｍｇ／
ｋｇ用量で、腫瘍成長の阻害において、同一条件下で、その他の用量でよりも有意により
有効であるということを示した。図２７Ａは、１ｍｇ／ｋｇの２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４また
は２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５が、それぞれ、９１％および８２％の腫瘍成長阻害をもたらし、
一方で、１ｍｇ／ｋｇのベンチマーク抗体が、媒体対照に対して４１．６％の腫瘍成長阻
害をもたらしたことを示す。図２９Ａは、１ｍｇ／ｋｇの２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４または２
３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５が、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１ノックイン腫瘍成長を、１０ｍｇ／ｋｇ
のＢＭ－ＧＴと同様のレベルに阻害し、それらが同一条件下での腫瘍阻害活性においては
統計的に有意な差違を示さなかったことを示す。したがって、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４およ
び２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５によって例示される抗体は、ｐＨ依存性に抗原と結合しないベン
チマーク抗体ＢＭ－ＧＴよりも（ＭＰＤＬ－３２８０Ａとも名付けられる）、約１０倍高
いｉｎ ｖｉｖｏ活性を有する（図２９Ａおよび２９Ｂを参照のこと）。
Figure 2023171733000015
研究エンドポイントでの各マウスにおける腫瘍の大きさの変化を、滝グラフに示し、出
発点からの変化として表した（図２８Ａ～２８Ｄを参照のこと）。腫瘍の大きさが、１０
０％超増大したマウスは、１００％と表し、腫瘍の大きさが１００％未満増大した、また
は出発点から低減したものは、パーセンテージでの正確な変化として表した。
上記の結果は、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４および２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５は、腫瘍成長の阻害
において１ｍｇ／ｋｇのベンチマーク抗体ＢＭ－ＧＴよりも有意により強力であることを
示した（図２７および図２８）。さらに、腫瘍成長の阻害における、１ｍｇ／ｋｇでの２
３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５および２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４の能力は、１０ｍｇ／ｋｇでのＢＭ－Ｇ
Ｔのものと同等である（図２９Ａおよび２９Ｂを参照のこと）。さらに、１０ｍｇ／ｋｇ
で投薬された場合に、１ｍｇ／ｋｇで投薬されたものと比較して、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５
または２３Ｈ１１－Ｈ４Ｌ４について腫瘍成長阻害活性のさらなる増大はなく、一方で、
ＢＭ－ＧＴについては活性の有意な増大がある。したがって、ｐＨ依存性抗原結合を有す
る抗体は、極めて低用量で腫瘍成長を阻害可能な新規クラスの抗体のものであり得る。
４．腫瘍再負荷研究
ＰＤ－Ｌ１抗体を用いるＩＶ処置で完全腫瘍クリアランスを達成したマウスが、持続的
免疫応答を開始し、新規腫瘍が現れることを管理できるか否かを理解するために、本発明
者らは、１ｍｇ／ｋｇの２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５または２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４のいずれかを
用いて１０～３５日目まで投薬した場合に完全奏功を達成したマウスのサブセットにおい
て、マウスに新鮮な腫瘍細胞を再負荷した。手短に述べると、これらのマウスの各々に、
接種後３５日に２×１０＾６個の新鮮な腫瘍細胞を注射した。新たに注入された腫瘍細胞
は、注入の際に最初の５～１０日間は成長できたが、次いで、腫瘍は、大きさが減少し始
め、５０日目（再負荷の１５日後）まで、任意の測定可能な腫瘍を有するマウスはなかっ
た。これは、これらのマウスが、同一腫瘍細胞に対するメモリーを発達させ、抗体がそれ
らによって提示されなかったとしても、腫瘍阻害応答は、耐久性があることを実証する（
図３０を参照のこと）。
［実施例２１］選択依存性中和抗体の腫瘍浸透の評価
抗体は、その効果を発揮するために腫瘍中に浸透する必要がある。ｐＨ依存性抗体が、
腫瘍中への浸透において利点を有するか否かおよび腫瘍におけるその残留時間の間に任意
の差違があるか否かを評価するために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ画像処理研究を使
用した。
手短に述べると、試験抗体ＢＭ－ＧＴおよび２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４を、近赤外〔near-i
nferred〕蛍光標識色素（ＣＦ７５０、カタログ：９９９５２、Ｌｏｔ：１２Ｍ０４１３
、ＢＩＯＴＩＵＭ）を使用し、以下の方法を用いて標識した：抗体をＰＢＳで０．１ｍｇ
／ｍｌに希釈し、次いで、０．８ｍｌの各抗体溶液を、１：９の割合で予温した１０×反
応バッファーバイアル中にピペットで入れ、その結果、抗体溶液は、１×反応バッファー
の最終濃度を含有していた。ピペットによって数回上下することによって溶液を混合した
後、全溶液を、各バイアルから、ＣＦ色素を含有するバイアルに移し、バイアルを数秒間
ボルテックス処理し、バイアルを暗所で３０分間インキュベートする。その後、およそ０
．２ｍｌの抗体－色素溶液を、各マウスに静脈内注射した。
ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１同系腫瘍モデル
２×１０＾６個ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下
移植し、１２匹のマウスを選択し、４群に無作為化した。腫瘍がおよそ２２０ｍｍ＾３に
成長した時点で、動物に０．２ｍｌの抗体－色素溶液を静脈内に注射した。
投薬後１時間、４時間、２４時間、４８時間、９６時間、７日、１１日、１５日、１８
日および２１日の時点で麻酔後に、各マウスの腫瘍の部位を、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ
ＩＩを用いて画像化した。手短に述べると、各時点でのＩＶＩＳ画像処理の前に、各マウ
スに、５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムを用いて麻酔した。動物が移動を
停止した時点で、動物を観察ボックス中に入れ（腫瘍側を上にして）、ドアを閉じ、次い
で、Ｌｉｖｉｎｇイメージソフトウェアを使用して、各マウスを画像処理した。
放射シグナルの例を示したＢＭ－ＧＴおよびヒト化２３Ｆ１１（すなわち、２３Ｆ１１
－Ｈ４Ｌ４）（図３１Ａを参照のこと）。各時点について各マウスから得た平均放射シグ
ナルを定量化し、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍを用いて解析し、図３１Ｂに示した。結
果は、抗体２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４は、ベンチマーク抗体よりも有意に高い放射シグナルを
有しており、従って、かなり多くの抗体が、ベンチマーク抗体よりも腫瘍中に保持されて
いることを示した。経時的な腫瘍中のより多くの抗体に対応して、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４
を用いて処置された３匹のマウスのうち２匹の腫瘍が有意に低減したが、ＢＭ－ＧＴを用
いて処置されたマウスのうち腫瘍が有意に低減したものはなかった（図３１Ｃを参照のこ
と）。したがって、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４、ｐＨ依存性特性を有する抗体は、特有の利点
を有し得、腫瘍成長の阻害においてより効果的である。図３１Ｂの説明文中の２－１、２
－２、２－３、４－１、４－２および４－３は、それぞれ、群２および群４中の個々のマ
ウス１、２または３を示す。
［実施例２２］その他の腫瘍調節剤を用いる選択ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体の併用療法
チェックポイント阻害剤抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗ＶＥＧＦＲ２抗体（抗血管新生）の
組合せが、腫瘍成長をより良好に制御し得るか否かを評価するために、ｈＰＤ－Ｌ１／Ｍ
Ｃ３８腫瘍を、ＤＣ１０１、マウスＶＥＧＦＲ２の中和活性を有する抗体を２０ｍｇ／ｋ
ｇで、またはＰＤ－Ｌ１抗体－２３Ａ１１－キメラを最適下用量０．３ｍｇ／ｋｇで、ま
たは両方を用いて処置した。手短に述べると、２×１０＾６個ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫
瘍細胞を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいてこれまでに行ったように接種し、３日間成長さ
せた。その時点で、各群に８匹のマウスを有する群に無作為化した。各試験抗体を、個々
のマウスに、０．３ｍｇ／ｋｇの２３Ａ１１－キメラまたは２０ｍｇ／ｋｇのＤＣ１０１
または両方で腹腔内に、３日目に開始して、週に３回で３週間投薬した。動物を、ＣＯ２
吸入を用いて研究の最後に犠死させた。腫瘍の大きさを、ノギス（ＩＮＳＩＺＥ）を使用
して２次元で週に２回測定し、体積を、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａおよびｂは、
それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である）を使用してｍｍ３で表した。結果を、
Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを使用して解析し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。Ｔ
検定によって２群間の比較を行い、Ｐが＜０．０５である場合に差違は有意であると考え
られる。データは、組合せ処置は、腫瘍細胞の成長の阻害において、かなりより有効であ
ることを示した（図３２Ａ～図３２Ｃを参照のこと）。
併用療法が、単剤療法より有効であることをさらに実証するために、本発明者らは、腫
瘍体積がおよそ１８０ｍｍ３であるときに処置を開始した。本発明者らは、２種の抗体を
、ヒト化ＰＤ－Ｌ１またはＶＥＧＦＲ２抗体ＤＣ１０１に対して極めて感受性が高くはな
いマウス株において、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのいずれかの対で投薬した。処置
は、ＩＶで、週に１回、２～３週間行った。データは、組み合わせた両処置が、腫瘍成長
の阻害において単一抗体よりも有意により有効であることを示した（図３２Ｄおよび図３
２Ｅを参照のこと）。
したがって、本発明者らは、ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の、ＶＥＧＦＲ２抗体などの血管新
生阻害剤との組合せが、定着腫瘍成長または新規に形成された腫瘍の進行の処置のための
有効なアプローチであり得ることを実証した。
［実施例２３］ＰＤ－Ｌ１抗体の熱安定性
キャピラリーセル示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を利用して、温度増大の際のサンプルお
よび参照間の熱分化を検出することによって、タンパク質の熱安定性を評価する。具体的
には、液体中のタンパク質の相対的安定性の指標である熱転移中点（Ｔｍ）を測定するた
めに使用される。抗体２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４または２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５（ＣＨＯ細胞に
おいて産生される）を、バッファー（２０ｍＭ Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－ＨＣｌ、５％スクロー
ス、ｐＨ＝６．０）を用いて１ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＤＳＣ９６ウェルトレイに添加した
。１０～１１０°Ｃの温度範囲および２００℃／時間のスキャン速度を用いるＭｉｃｒｏ
Ｃａｌ ＶＰ－ＤＳＣキャピラリーセルマイクロカロリメーター（ＧＥ）を用いてサンプ
ルを流し、結果をＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰキャピラリーＤＳＣ自動解析ソフトウェアを用
いて解析した。キャピラリーセルＤＳＣ試験結果を、以下の表１３に、ならびに図３３Ａ
および３３Ｂに示した。
表１３に示されるように、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４抗体は、有意な上昇したＴｍ値を示し
た（すなわち、Ｆａｂ断片のＴｍに相当するＴｍ２、一方、Ｔｍ１は、ＣＨ２断片のＴｍ
に相当する）。
Figure 2023171733000016
［実施例２４］抗ＰＤ－Ｌ１抗体についてＥ５８のエピトープマッピング
本明細書において記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合にとってのＥ５８の残基の重要性
を、実施例１８に記載したようにＥＬＩＳＡベースの結合アッセイを使用して抗体につい
て解析した。野生型抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質またはＥ５８Ａを有する変異体のいずれかを
産生し、同一プレート上で抗体の２種のタンパク質との相対結合を実施し、結果を、以下
の表１４に示す。
Figure 2023171733000017
データは、残基Ｅ５８が、２３Ｆ１１および２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４にとって重大であり
、ヒトＰＤ－Ｌ１において、この残基がアラニンに変異される場合には、その結合が、９
０％超低減されることを示した。同様に、２３Ａ１１－Ｈ３Ｌ５、２２Ｃ９の結合も、Ｗ
Ｔ ＰＤ－Ｌ１タンパク質との結合シグナルの８．３％、１７．２％に低減した。他方、
ＢＭ－ＧＴまたはＢＭ－ＭＥの結合は、Ｅ５８がＡｌａに変異された場合に、野生型ＰＤ
－Ｌ１との抗体の結合の５１％または６９．８％に低減した。同様に、２３Ａ１１、２６
Ｆ５および４Ｂ６の結合も、野生型ＰＤ－Ｌ１タンパク質の５１．７％、６０．６％およ
び６９．６％に低減された。最も異なることに、１８Ｇ４のＰＤ－Ｌ１との結合は、Ｅ５
８がＡｌａに変異された場合に、全く低減しなかった。したがって、Ｅ５８は、種々の抗
体のＰＤ－Ｌ１タンパク質との結合にとって異なって必要とされ、２３Ｆ１１、２３Ｆ１
１－Ｈ４Ｌ４および２２Ｃ９の重大な残基であった。
また、１８Ｇ４は、アラニンスキャンによって解析された３９個の異なるアミノ酸の中
でＳ８０の結合のみを必要とする、本明細書において開示されるその他の抗ＰＤ－Ｌ１抗
体に対して極めて異なるエピトープ結合プロフィールを有する抗体である。この抗体も、
ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害において極めて強力であるということが注記された。
［実施例２５］ヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の内部移行
２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４（ＣＨＯ細胞由来）が、内部移行され得るか否かを評価するため
に、本発明者らは、以下の実験を実施した。二次抗体ヤギ抗ヒトＦｃを、ｐＨＡｂアミン
反応性色素（Ｓｉｇｍａ、Ｇ９８４５）、ｐＨ感受性色素を用いてまず標識した。この色
素は、中性ｐＨで蛍光ではないが、酸性ｐＨで高度に蛍光になる。この色素で標識された
抗体が、細胞内エンドソーム（ｐＨ６．０～６．５）およびリソソーム（４．５～５．５
）中に内部移行されると、高度の蛍光シグナルが検出され得る。具体的には、ＭＣ３８－
ｈＰＤ－Ｌ１細胞（ＭａｂＳｐａｃｅ）を、１０％ ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を
含有するＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。遠心分離することによって対数期成長細胞を
集め、細胞を、９６－ウェルプレート中、２×１０＾４個／ウェル（５０μｌ／ウェル）
の密度で播種し、細胞を一晩接着させた。次いで、２μｇ／ｍｌの、ｐＨＡｂアミン反応
性色素を用いて標識したヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃ
ｈ、カタログ番号１０９－００５－０９８）（２５μｌ／ウェル）を、各ウェルに添加し
、続いて、段階希釈した２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４またはｈＩｇＧ１（２５μｌ／ウェル）を
各ウェル中に添加した。抗体を細胞とともに３７℃で６時間または２４時間インキュベー
トさせた。インキュベーションの最後に培養培地を除去した後に、１００μｌのＰＢＳを
各ウェルに添加した。プレートの各ウェルにおける抗体のシグナルを、Ｖａｒｉｏｓｋａ
ｎ Ｆｌａｓｈ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、Ｅｘ ５３２ｎｍ
／Ｅｍ ５６０ｎｍのスペクトルで読み取ることによって決定した。グラフ中のデータは
、６または２４時間後に細胞において濃度依存的に、蛍光シグナルの有意な増大があるこ
とを示した。これらの結果は、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４は、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１細胞の
表面上のｈＰＤ－Ｌ１との結合の際に効率的に内部移行され得るということを実証した（
図３５を参照のこと）。
［実施例２６］ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体の、活性化Ｔ細胞との結合
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を使用して白血球搬出パックから末梢血単
球を単離し、２％ ＦＢＳを含むＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を、培養培地で０．５×１
０＾７個細胞／ｍｌの密度に希釈し、次いで、抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ｅｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－００３７）でコーティングされたプレートに添加した
（１μｇ／ｍｌ、１ｍｌ／ウェル）。抗ヒトＣＤ２８（ＢＤ、カタログ番号５５５７２５
）を各ウェルに添加し、次いで、細胞を、ＲＰＭＩ１６４０および１０％ＦＢＳを有する
６－ウェルプレート中で、３７℃で３日間培養した。その後、細胞を集め、９６ウェル丸
底プレート中、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）に入れた。遠心分離後、上清
を廃棄し、段階希釈した２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４抗体またはＮ２９７Ａ変異を有するｈＩｇ
Ｇ１を陰性対照として添加した。プレートを４℃で１時間インキュベートし、次いで、細
胞を、ＰＢＳを使用して３回洗浄した。その後、２．５μ次いで細胞を、ＰＢＳを使用し
て３回洗浄した。その後、２．５Ｃｈｕｍａｎ ＩｇＧ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、
カタログ番号４０９３０６）を各ウェルに添加し、プレートを４℃で１時間インキュベー
トし、３回洗浄し、その後、フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｙｔｏｆｌｅｘ
）によって解析した。
図３６Ａおよび３６Ｂにおけるデータは、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４が、活性化Ｔ細胞上で
発現されたＰＤ－Ｌ１と用量依存性に結合し得る一方、非活性化Ｔ細胞とは極めてわずか
な結合しか示さないことを示した。
［実施例２７］ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を用いるｈＰＤ－１ノックインマウスモデル
におけるＰＤ－Ｌ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
これまでの実験（例えば、実施例１４および２０）では、同系マウスにおけるＰＤ－１
タンパク質は、マウス起源であり、免疫抑制は、ｈＰＤ－Ｌ１のマウスＰＤ－１との結合
によって媒介されている。マウスＰＤ－１がｈＰＤ－１に変更される場合に、ヒト患者に
おいて存在する状況に、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１同系モデルにおける抗体処置に何らかの
差違があるか否かをさらに評価するために、本発明者らは、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍
細胞をＰＤ－１ノックインマウスに移植した。具体的には、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍
細胞を、大気中、５％ ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｅ
ｘＣｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌスト
レプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補給したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆ
ｉｓｈｅｒ）で単層培養としてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。腫瘍細胞を、トリプシン－
ＥＤＴＡ処置（Ｈｙｃｌｏｎｅ）によって週に２回ルーチンで継代培養した。対数増殖相
で成長している細胞を回収し、ｈＰＤ－Ｌ１ 発現確認のＦＡＣＳ解析および腫瘍接種の
ためにカウントした。５～６週齢の各ＰＤ－１ノックイン雌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｐ
ｄｃｄ／ｔｍ１ （ｈＰＤＣＤ１）、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏ．、
Ｌｔｄ）を、腫瘍発生のために、０．１ｍｌのＰＢＳ中のＰＤ－Ｌ１発現（２×１０６）
が確認されたＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞を用いて右側腹部で皮下に接種した。処置
は、腫瘍の大きさがおよそ１００ｍｍ３に到達した、接種のおよそ７日後に開始した。各
群は、１０匹の腫瘍を有するマウスからなっていた（図３７Ａを参照のこと）。試験品（
すなわち、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４）は、３ｍｇ／ｍｌ濃度の２００μｌの保存溶液を吸引
し、１．８ｍｌの調剤バッファー〔formulation buffer〕（ヒスチジン２０ｍＭ、スクロ
ース２５０ｍＭ、ポリソルベート８０ ０．０２％、ｐＨ６．０±０．２）に希釈して、
０．３ ｍｇ／ｍｌの作業溶液を得ることによって調製し、静脈内注射によってマウスに
投与した。腫瘍の大きさを、ノギス（ＩＮＳＩＺＥ）を使用して２次元で週に２回測定し
、体積を、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長い直径お
よび短い直径である）を使用してｍｍ３で表した。腫瘍体積が、測定可能な大きさ未満に
低下することなく、処置の開始時の腫瘍体積の＜５０％に低減した場合には、部分（ＰＲ
）として、腫瘍量が、触知できなくなった場合には完全（ＣＲ）として腫瘍退縮を記録す
る。各処置群における腫瘍の大きさを、表１５および図３７Ｂおよび３７Ｃに示す。これ
らのデータは、抗体２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４を用いる処置は、有意な腫瘍成長阻害につなが
ることを実証し、処置された１０匹のマウスのうち５匹において腫瘍根絶〔eradiation〕
または完全奏功し、一方で、生理食塩水を用いて処置したものは、すべて成長し、マウス
のいずれにおいても腫瘍退縮を有さなかった。
Figure 2023171733000018
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長阻害有効性に対してさらに比較するために、本発明者らは、別
の実験を実施した。同様に、５～６週齢のＰＤ－１ノックイン雌マウス各々（Ｃ５７ＢＬ
／６－Ｐｄｃｄ／ｔｍ１ （ｈＰＤＣＤ１）、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ
Ｃｏ．、Ｌｔｄ）を、腫瘍発生のために、０．１ｍｌのＰＢＳ中のＰＤ－Ｌ１発現（２×
１０６）が確認されたＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞を用いて右側腹部で皮下に接種し
た。処置は、腫瘍の大きさがおよそ１００ｍｍ３に到達した、接種のおよそ７日後に開始
した。各群は、８匹の腫瘍を有するマウスからなっていた。試験品は、３ｍｇ／ｍｌ濃度
の０．１２８ｍｌ、０．３８４ｍｌおよび１．２８ｍｌの保存溶液を吸引し、３．７１２
、３．４５６および２．５８ｍｌの滅菌ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号 ＳＨ３
０２５６．０１）に希釈して、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌ
の作業溶液を得ることによって調製し、各マウスに２００μｌを週に２回の腹膜内注射に
よって投与して、投薬１、３、１０ｍｇ／ｋｇを達成した。同様に、ＢＭ－ＧＴ（ＭＡＢ
ＳＰＡＣＥ、ＣＨＯ細胞において産生された）およびＮ２９７Ａ変異体を有する対照Ｉｇ
Ｇ（ＣｒｏｗｎＢｉｏ、ＣＨＯ細胞由来のＡＢ１６０１６０）を、１．２８０ｍＬの３ｍ
ｇ／ｍｌのＣＨＯ細胞由来ＢＭ－ＧＴを吸引して、２．５６０ｍＬのＰＢＳに入れること
、または０．６６２ｍｌの５．８ｍｇ／ｍｌのストックを吸引して３．１７８ｍｌの滅菌
ＰＢＳに入れることによって調製し、２００μｌの最終希釈溶液を各マウスに、週に２回
の腹膜内注射によって投与して、週に２回の１０ｍｇ／ｋｇ ＩＰで投薬を達成した。腫
瘍の大きさを、ノギス（ＩＮＳＩＺＥ）を使用して２次元で週に２回測定し、体積を、式
：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径
である）を使用してｍｍ３で表した。腫瘍体積が、測定可能な大きさ未満に低下すること
なく、処置の開始時の腫瘍体積の＜５０％に低減した場合には、部分（ＰＲ）として、腫
瘍量が、触知できなくなった場合には完全（ＣＲ）として腫瘍退縮を記録する（表１６お
よび図３８Ａ～３８Ｃを参照のこと）。
Figure 2023171733000019
上記の実験から得たデータは、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８を移植されたＰＤ－
１ノックインマウスにおいて、１）２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４は、強力な用量依存性腫瘍成長
阻害活性を示し、それぞれ、１、３および１０ｍｇ／ｋｇで１２．５％、６２．５％およ
び１００％の全奏功（ＰＲ＋ＣＲ）率を有し（図３８Ａを参照のこと）、２）３ｍｇ／ｋ
ｇの２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４は、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇのＢＭ－ＧＴと同程度に強力で
あり（図３８Ｂおよび３８Ｃを参照のこと）、４）ＩＰまたはＩＶによって投薬された３
ｍｇ／ｋｇの２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４は、同様の活性を示し、完全腫瘍退縮（５０％）を達
成し（図３７Ａ～３７Ｂおよび３８Ａ～３８Ｃを参照のこと）、３）１０ｍｇ／ｋｇ用量
の２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４は、全体的な腫瘍の大きさの低減だけでなく、完全腫瘍退縮を達
成したマウスの数においても（６／８対３／８）、１０ｍｇ／ｋｇのＢＭ－ＧＴよりも有
意により強力であり（図３８Ｃを参照のこと）、したがって、ｐＨ依存性抗原結合および
関連する再利用特性および従って、より長い腫瘍における薬物滞留時間が、特に、ＢＭ－
ＧＴの最大に有効な用量で、より良好な腫瘍管理および腫瘍退縮に変わり得ることを示し
た。
［実施例２８］受容体占有およびマウス薬物動態／薬動力学
抗体の単回静脈内注射の際のＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍における標的タンパク質ヒト
ＰＤ－Ｌ１との抗体結合の期間を測定するために、本発明者らは、ＦＡＣＳを使用して、
抗体注射後種々の時点で腫瘍から調製された単細胞における利用可能な標的タンパク質結
合部位の量を測定した。具体的には、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞を、大気中、５％
ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＥｘＣｅｌｌ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｈｙ
ｃｌｏｎｅ）を補給したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で単層培
養としてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。腫瘍細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡ処置（Ｈｙｃ
ｌｏｎｅ）によって週に２回ルーチンで継代培養した。対数増殖相で成長している細胞を
回収し、ｈＰＤ－Ｌ１発現確認のＦＡＣＳ解析および腫瘍接種のためにカウントした。５
～６週齢の雌のＣ５７Ｂ／Ｌ６マウス各々を、腫瘍発生のために、０．１ｍｌのＰＢＳ中
のＰＤ－Ｌ１発現（２×１０６）が確認されたＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞を用いて
右側腹部で皮下に接種した。処置は、腫瘍の大きさがおよそ２００～３００ｍｍ３に到達
した、接種のおよそ１２日後に開始し、３ｍｐｋで２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４を用いて投薬し
た（表１７を参照のこと）。受容体占有評価のために、投与後２日目、７日目および１４
日目に腫瘍を採取した。腫瘍を回収し、小断片に刻み、次いで、ＡＣＣＵＭＡＸ（商標）
細胞剥離溶液（ＳＴＥＭＣＥＬＬカタログ番号０７９２１）を、１０ｍｌ／０．５ｇの組
織の濃度で添加した。次いで、腫瘍塊懸濁液を室温で１～２時間穏やかに振盪し、インキ
ュベーションの間、ピペットで反復的に上下させて、細胞をさらに解離させた。インキュ
ベーションの最後に、細胞懸濁液を、４０μｍのナイロンメッシュに通した。次いで、細
胞を、冷ＰＢＳを用いて３回洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、集
められた細胞を１～２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、総細胞数をカウントした。この後、５０
μｌの細胞懸濁液（約１００００００個細胞）を、各９６ウェルプレートに添加した。細
胞を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中、１％ ＢＳＡ）を用いて２回洗浄した。次いで、
細胞を、２μｇ／ｍｌの２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４抗体またはＰＢＳまたはアイソタイプ対照
とともにインキュベートした。混合物を、２～８℃で、または氷上で少なくとも３０分間
インキュベートし、光から保護した。細胞を、ＦＡＣＳバッファーを用いて３回洗浄し、
その後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。抗ヒトＩｇＧ ＦＣ－ＦＩＴＣ二次抗体
を添加し、２～８℃、暗所で３０分間インキュベートし、続いて、細胞を、ＦＡＣＳバッ
ファーを用いて３回洗浄した。最後に、細胞を、０．５ｍｌのＦＡＣＳバッファーに再懸
濁し、フローサイトメーターを使用して解析した。フローサイトメーターデータ解析ソフ
トウェア（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用し、アイソタ
イプ対応対照抗体染色細胞との比較で、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞のパーセンテージおよび平均
蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４のＰＤ－Ｌ１との）または２３Ｆ
１１－Ｈ４Ｌ４またはＢＭ－ＧＴ（利用可能なＰＤ－Ｌ１結合部位を検出するため）のｉ
ｎ ｖｉｖｏ結合を検出するための、アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１－Ｎ１９７Ａ（Ｃｒｏ
ｗｎＢｉｏ、ＡＢ１６０１６０）の飽和量とともに ｉｎ ｖｉｔｒｏでプレインキュベ
ートされた細胞間の相対平均蛍光強度（ＲＭＦＩ）の変化の割合を使用して、受容体占有
（ＲＯ）を推定した。値は、適当なアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１－Ｎ２９７Ａに対して正
規化した。データ（表１８を参照のこと）は、３ｍｇ／ｋｇの２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４の単
回注射は、少なくとも７日間の持続した腫瘍ＰＤ－Ｌ１占有につながり得ることを示した
。他方、３ｍｇ／ｋｇのＢＭ－ＧＴは、２日超の腫瘍ＰＤ－Ｌ１占有を示したが、最初の
より高い占有率にもかかわらず７日未満であり、これは、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４のｐＨ依
存性ＰＤ－Ｌ１結合特性が、抗体が、腫瘍中に長期間留まることおよび腫瘍細胞上のＰＤ
－Ｌ１と結合することを可能にすることを実証する。
Figure 2023171733000020
Figure 2023171733000021
［実施例２９］腫瘍浸透結果
正常同系Ｃ５７Ｂ／Ｌ６マウスにおいて成長したＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍を有する
３匹のマウスを、腫瘍が２００～３００ｍｍ３に到達した時点で、１０ｍｇ／ｋｇの２３
Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４単回静脈内注射を用いて処置した。腫瘍浸透および腫瘍浸潤リンパ球（
ＴＩＬ）解析のために、抗体投与後７日目に腫瘍を採取した。具体的には、Ｏｐｔｉｍａ
ｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ
）を、製造業者の説明書に従って使用して、腫瘍塊を調製した。６μｍ厚の組織切片を調
製し、組織スライドをメタノールで固定化し、続いて、ＰＢＳを用いて洗浄し、次いで、
０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を用いて５分間透過処理した。次いで、スライドをＰ
ＢＳを用いて洗浄し、ブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ中、３．０％ ＢＳＡ）を用
いて、３０～６０分間、室温でブロッキングし、続いて、スライドをＰＢＳ－Ｔを用いて
３回、各５分間洗浄した。次いで、ＰＢＳで希釈した、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ａ１１０１３、２３
Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４を検出するため）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４抗マウ
スＣＤ３１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０２５２０、脈管構造を検出する
ため）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４抗マウスＣＤ８ａ抗体（Ｂｉｏ
ｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７５８、ＣＤ８Ｔ細胞を検出するため）を切片に適用
し、暗所、４℃で一晩インキュベートさせた。二次抗体を排水し、ＰＢＳ－Ｔを用いてス
ライドを３回（各５分）洗浄した後、スライドをＤＡＰＩを用いて対比染色し、ガラスカ
バースリップで覆い、暗所、４℃で保存した。蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｎｉ－Ｕ）を使
用して、対照凍結組織切片との比較で、２３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４およびＴＩＬの遺伝子座お
よび分布を解析した。
１０ｍｐｋでの投薬後７日目の、凍結ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１ ＣＤｘ腫瘍切片での２
３Ｆ１１－Ｈ４Ｌ４浸透およびＴＩＬの代表的な画像が、図４０に示されている。
本開示を、特定の実施形態（そのうちいくつかは、好ましい実施形態である）に関連し
て特に示し、説明してきたが、当業者には、形態および詳細における種々の変更が、本明
細書において開示される本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、そこで行われ得
るということは理解されなければならない。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１抗体は、ＨＦＲ１’、ＨＦＲ２’、ＨＦＲ３’およびＨＦＲ４’の重鎖フレームワークならびにＬＦＲ１’、ＬＦＲ２’、ＬＦＲ３’およびＬＦＲ４’の軽鎖フレームワーク配列を含み、重鎖可変領域の配列は、式：ＨＦＲ１’－ＨＣＤＲ１’－ＨＦＲ２’－ＨＣＤＲ２’－ＨＦＲ３’－ＨＣＤＲ３’－ＨＦＲ４’に従い、軽鎖可変領域の配列は、式ＬＦＲ１’－ＬＣＤＲ１’－ＬＦＲ２’－ＬＣＤＲ２’－ＬＦＲ３’－ＬＣＤＲ３’－ＬＦＲ４’に従う。

Claims (74)

  1. 重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ならびに軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２お
    よびＬＣＤＲ３配列を含む単離されたＰＤ－Ｌ１抗体であって、
    ＨＣＤＲ１配列は、ＴＹＷＸ１Ｈ（配列番号１）またはその少なくとも８０％の配列同
    一性のある相同体配列であり、
    ＨＣＤＲ２配列は、ＭＩＱＰＮＳＧＧＴＫＹＮＸ２Ｘ３ＦＫＸ４（配列番号２）または
    その少なくとも８０％の配列同一性のある相同体配列であり、
    ＨＣＤＲ３配列は、ＧＡＧＴＶＤＹＦＤＹ（配列番号３）またはその少なくとも８０％
    の配列同一性のある相同体配列であり、
    ＬＣＤＲ１配列は、ＲＡＳＥＳＶＤＩＹＧＮＳＦＭＨ（配列番号４）またはその少なく
    とも８０％の配列同一性のある相同体配列であり、
    ＬＣＤＲ２配列は、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）またはその少なくとも８０％の配列
    同一性のある相同体配列であり、
    ＬＣＤＲ３配列は、Ｘ５ＱＳＸ６Ｘ７ＤＰＹＴ（配列番号６）またはその少なくとも８
    ０％の配列同一性のある相同体配列であり、
    Ｘ１は、ＩまたはＭであり、Ｘ２は、ＤまたはＥであり、Ｘ３は、ＱまたはＫであり、
    Ｘ４は、ＮまたはＫであり、Ｘ５は、ＱまたはＨであり、Ｘ６は、ＮまたはＴであり、Ｘ
    ７は、ＤまたはＥである、単離されたＰＤ－Ｌ１抗体。
  2. Ｘ１が、Ｉであり、Ｘ２が、Ｄであり、Ｘ３が、Ｑであり、Ｘ４が、Ｎであり、Ｘ５が
    、Ｑであり、Ｘ６が、Ｎであり、Ｘ７が、Ｄである、請求項２に記載の抗体。
  3. Ｘ１が、Ｍであり、Ｘ２が、Ｅであり、Ｘ３が、Ｋであり、Ｘ４が、Ｋであり、Ｘ５が
    、Ｑであり、Ｘ６が、Ｔであり、Ｘ７が、Ｅである、請求項２に記載の抗体。
  4. 配列番号７～１２またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同体から選択され
    る１、２、３、４、５または６種のＣＤＲを含む、単離されたＰＤ－Ｌ１抗体。
  5. ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４の重鎖フレームワーク配列ならびにＬＦ
    Ｒ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４の軽鎖フレームワーク配列を含み、重鎖可変領
    域の配列が、式：ＨＦＲ１－ＨＣＤＲ１－ＨＦＲ２－ＨＣＤＲ２－ＨＦＲ３－ＨＣＤＲ３
    －ＨＦＲ４に従い、軽鎖可変領域の配列が、式ＬＦＲ１－ＬＣＤＲ１－ＬＦＲ２－ＬＣＤ
    Ｒ２－ＬＦＲ３－ＬＣＤＲ３－ＬＦＲ４に従う、請求項１から４のいずれか一項に記載の
    抗体。
  6. ＨＦＲ１配列が、Ｘａ１ＶＱＬＸａ２ＱＸａ３ＧＡＥＸａ４Ｘａ５ＫＰＧＡＳＶＫＸａ
    ６ＳＣＫＡＳＧＹＸａ７ＦＴ（配列番号１３）であり、
    ＨＦＲ２配列が、ＷＶＸａ８ＱＸａ９ＰＧＱＧＬＥＷＩＧ（配列番号１４）であり、
    ＨＦＲ３配列が、Ｘａ１０Ｘａ１１ＴＬＴＶＤＸａ１２ＳＸａ１３Ｘａ１４ＴＡＸａ１
    ５ＭＸａ１６ＬＳＸａ１７ＬＸａ１８ＳＸａ１９ＤＸａ２０ＡＶＸａ３３ＹＣＡＲ（配列
    番号１５）であり、
    ＨＦＲ４配列が、ＷＧＸａ３４ＧＸａ２１ＴＸａ３５Ｘａ２２Ｘａ２３ＳＳ（配列番号
    １６）であり、
    ＬＦＲ１配列が、Ｘａ３６ＩＶＸａ３７ＴＸａ２４Ｘａ３８ＰＸａ２５Ｘａ３９ＬＸａ
    ２６ＶＳＸａ２７ＧＸａ４０ＲＸａ４１ＴＩＸａ２８Ｃ（配列番号１７）であり、
    ＬＦＲ２配列が、ＷＹＱＱＫＰＧＱＸａ２９ＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）であり、
    ＬＦＲ３配列が、ＧＸａ４２ＰＸａ４３ＲＦＸａ４４ＧＳＧＸａ４５Ｘａ４６ＲＴＤＦ
    ＴＸａ４７ＴＩＸａ４８Ｘａ４９Ｖ Ｘａ５０ＡＸａ３０ＤＸａ３１ＡＸａ５１ＹＸａ５
    ２Ｃ（配列番号１９）であり、
    ＬＦＲ４配列が、ＦＧＸａ５３ＧＴＫＬＥＸａ３２Ｋ（配列番号２０）であり、
    Ｘａ１が、ＱまたはＬであり、Ｘａ２が、ＱまたはＶであり、Ｘａ３が、ＳまたはＰで
    あり、Ｘａ４が、ＬまたはＶであり、Ｘａ５が、ＶまたはＫであり、Ｘａ６が、Ｌまたは
    Ｖであり、Ｘａ７が、Ｔ、ＳまたはＩであり、Ｘａ８が、Ｗ、ＫまたはＲであり、Ｘａ９
    が、ＲまたはＡであり、Ｘａ１０が、Ｒ、ＫまたはＴであり、Ｘａ１１が、ＶまたはＡで
    あり、Ｘａ１２が、ＫまたはＴであり、Ｘａ１３が、ＳまたはＩであり、Ｘａ１４が、Ｓ
    またはＴであり、Ｘａ１５が、ＹまたはＳであり、Ｘａ１６が、ＱまたはＥであり、Ｘａ
    １７が、Ｓ、ＧまたはＲであり、Ｘａ１８が、ＴまたはＲであり、Ｘａ１９が、Ｅまたは
    Ｄであり、Ｘａ２０が、ＳまたはＴであり、Ｘａ２１が、ＴまたはＳであり、Ｘａ２２が
    、ＳまたはＴであり、Ｘａ２３が、ＶまたはＩであり、Ｘａ２４が、ＱまたはＨであり、
    Ｘａ２５が、Ａ、ＫまたはＶであり、Ｘａ２６が、Ａ、ＳまたはＴであり、Ｘａ２７が、
    Ｌ、ＡまたはＶであり、Ｘａ２８が、ＳまたはＴであり、Ｘａ２９が、Ｓ、ＰまたはＡで
    あり、Ｘａ３０が、Ｄ、Ｅ、ＮまたはＱであり、Ｘａ３１が、Ｖ、ＬまたはＴであり、Ｘ
    ａ３２が、Ｌ、ＴまたはＩであり、Ｘａ３３が、ＦまたはＹであり、Ｘａ３４が、Ｔまた
    はＱであり、Ｘａ３５が、ＶまたはＬであり、Ｘａ３６が、ＤまたはＳであり、Ｘａ３７
    が、ＭまたはＬであり、Ｘａ３８が、ＴまたはＳであり、Ｘａ３９が、ＦまたはＳであり
    、Ｘａ４０が、ＤまたはＱであり、Ｘａ４１が、ＶまたはＡであり、Ｘａ４２が、Ｖまた
    はＩであり、Ｘａ４３が、ＤまたはＡであり、Ｘａ４４が、ＴまたはＳであり、Ｘａ４５
    が、ＹまたはＳであり、Ｘａ４６が、ＧまたはＲであり、Ｘａ４７が、ＦまたはＬであり
    、Ｘａ４８が、ＳまたはＮであり、Ｘａ４９が、ＴまたはＰであり、Ｘａ５０が、Ｑまた
    はＥであり、Ｘａ５１が、ＶまたはＴであり、Ｘａ５２が、ＦまたはＹであり、Ｘａ５３
    が、ＡまたはＧである、請求項５に記載の抗体。
  7. Ｘａ１が、Ｑであり、Ｘａ２が、Ｖであり、Ｘａ３が、Ｓであり、Ｘａ４が、Ｖであり
    、Ｘａ５が、Ｋであり、Ｘａ６が、Ｌであり、Ｘａ７が、Ｉであり、Ｘａ８が、Ｋであり
    、Ｘａ９が、Ｒであり、Ｘａ１０が、ＲまたはＫであり、Ｘａ１１が、Ａであり、Ｘａ１
    ２が、Ｋであり、Ｘａ１３が、Ｉであり、Ｘａ１４が、Ｓであり、Ｘａ１５が、Ｙであり
    、Ｘａ１６が、Ｅであり、Ｘａ１７が、Ｒであり、Ｘａ１８が、Ｔであり、Ｘａ１９が、
    Ｄであり、Ｘａ２０が、Ｔであり、Ｘａ２１が、ＴまたはＳであり、Ｘａ２２が、Ｔまた
    はＳであり、Ｘａ２３が、ＩまたはＶであり、Ｘａ２４が、Ｑであり、Ｘａ２５が、Ａで
    あり、Ｘａ２６が、Ａであり、Ｘａ２７が、Ｖであり、Ｘａ２８が、Ｔであり、Ｘａ２９
    が、ＡまたはＰであり、Ｘａ３０が、Ｑであり、Ｘａ３１が、Ｔであり、Ｘａ３２が、Ｔ
    またはＩであり、Ｘａ３３が、Ｙであり、Ｘａ３４が、Ｑであり、Ｘａ３５が、Ｌであり
    、Ｘａ３６が、Ｄであり、Ｘａ３７が、Ｌであり、Ｘａ３８が、Ｓであり、Ｘａ３９が、
    Ｓであり、Ｘａ４０が、Ｑであり、Ｘａ４１が、Ａであり、Ｘａ４２が、Ｉであり、Ｘａ
    ４３が、Ａであり、Ｘａ４４が、Ｓであり、Ｘａ４５が、Ｓであり、Ｘａ４６が、Ｒであ
    り、Ｘａ４７が、Ｌであり、Ｘａ４８が、Ｎであり、Ｘａ４９が、Ｐであり、Ｘａ５０が
    、Ｅであり、Ｘａ５１が、Ｔであり、Ｘａ５２が、Ｙであり、Ｘａ５３が、Ｇである、請
    求項６に記載の抗体。
  8. Ｘａ１が、Ｑであり、Ｘａ２が、Ｖであり、Ｘａ３が、Ｓであり、Ｘａ４が、Ｖであり
    、Ｘａ５が、Ｋであり、Ｘａ６が、Ｌであり、Ｘａ７が、Ｉであり、Ｘａ８が、Ｋであり
    、Ｘａ９が、Ｒであり、Ｘａ１０が、Ｒであり、Ｘａ１１が、Ａであり、Ｘａ１２が、Ｋ
    であり、Ｘａ１３が、Ｉであり、Ｘａ１４が、Ｓであり、Ｘａ１５が、Ｙであり、Ｘａ１
    ６が、Ｅであり、Ｘａ１７が、Ｒであり、Ｘａ１８が、Ｔであり、Ｘａ１９が、Ｄであり
    、Ｘａ２０が、Ｔであり、Ｘａ２１が、Ｔであり、Ｘａ２２が、Ｓであり、Ｘａ２３が、
    Ｉであり、Ｘａ２４が、Ｑであり、Ｘａ２５が、Ａであり、Ｘａ２６が、Ａであり、Ｘａ
    ２７が、Ｖであり、Ｘａ２８が、Ｔであり、Ｘａ２９が、Ａであり、Ｘａ３０が、Ｑであ
    り、Ｘａ３１が、Ｔであり、Ｘａ３２が、Ｔであり、Ｘａ３３が、Ｙであり、Ｘａ３４が
    、Ｑであり、Ｘａ３５が、Ｌであり、Ｘａ３６が、Ｄであり、Ｘａ３７が、Ｌであり、Ｘ
    ａ３８が、Ｓであり、Ｘａ３９が、Ｓであり、Ｘａ４０が、Ｑであり、Ｘａ４１が、Ａで
    あり、Ｘａ４２が、Ｉであり、Ｘａ４３が、Ａであり、Ｘａ４４が、Ｓであり、Ｘａ４５
    が、Ｓであり、Ｘａ４６が、Ｒであり、Ｘａ４７が、Ｌであり、Ｘａ４８が、Ｎであり、
    Ｘａ４９が、Ｐであり、Ｘａ５０が、Ｅであり、Ｘａ５１が、Ｔであり、Ｘａ５２が、Ｙ
    であり、Ｘａ５３が、Ｇである、請求項６に記載の抗体。
  9. Ｘａ１が、Ｑであり、Ｘａ２が、Ｖであり、Ｘａ３が、Ｓであり、Ｘａ４が、Ｖであり
    、Ｘａ５が、Ｋであり、Ｘａ６が、Ｌであり、Ｘａ７が、Ｉであり、Ｘａ８が、Ｋであり
    、Ｘａ９が、Ｒであり、Ｘａ１０が、Ｋであり、Ｘａ１１が、Ａであり、Ｘａ１２が、Ｋ
    であり、Ｘａ１３が、Ｉであり、Ｘａ１４が、Ｓであり、Ｘａ１５が、Ｙであり、Ｘａ１
    ６が、Ｅであり、Ｘａ１７が、Ｒであり、Ｘａ１８が、Ｔであり、Ｘａ１９が、Ｄであり
    、Ｘａ２０が、Ｔであり、Ｘａ２１が、Ｓであり、Ｘａ２２が、Ｔであり、Ｘａ２３が、
    Ｖであり、Ｘａ２４が、Ｑであり、Ｘａ２５が、Ａであり、Ｘａ２６が、Ａであり、Ｘａ
    ２７が、Ｖであり、Ｘａ２８が、Ｔであり、Ｘａ２９が、Ｐであり、Ｘａ３０が、Ｑであ
    り、Ｘａ３１が、Ｔであり、Ｘａ３２が、Ｉであり、Ｘａ３３が、Ｙであり、Ｘａ３４が
    、Ｑであり、Ｘａ３５が、Ｌであり、Ｘａ３６が、Ｄであり、Ｘａ３７が、Ｌであり、Ｘ
    ａ３８が、Ｓであり、Ｘａ３９が、Ｓであり、Ｘａ４０が、Ｑであり、Ｘａ４１が、Ａで
    あり、Ｘａ４２が、Ｉであり、Ｘａ４３が、Ａであり、Ｘａ４４が、Ｓであり、Ｘａ４５
    が、Ｓであり、Ｘａ４６が、Ｒであり、Ｘａ４７が、Ｌであり、Ｘａ４８が、Ｎであり、
    Ｘａ４９が、Ｐであり、Ｘａ５０が、Ｅであり、Ｘａ５１が、Ｔであり、Ｘａ５２が、Ｙ
    であり、Ｘａ５３が、Ｇである、請求項６に記載の抗体。
  10. 配列番号６１に示される重鎖可変領域および配列番号６２に示される軽鎖可変領域を含
    む、請求項１から３および５から９のいずれか一項に記載の抗体。
  11. 配列番号６３に示される重鎖可変領域および配列番号６４に示される軽鎖可変領域を含
    む、請求項１から３および５から９のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 配列番号２１に示される重鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む、請求項４か
    ら９のいずれか一項に記載の抗体。
  13. 配列番号２２に示される軽鎖可変領域またはそのヒト化バージョンを含む、請求項４か
    ら９および１２のいずれか一項に記載の抗体。
  14. アッセイ試験によって測定される酸性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合およびアッセイ試験
    によって測定される中性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合を有し、酸性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１と
    の結合が、中性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合よりも実質的に低い、単離されたＰＤ－Ｌ１
    抗体。
  15. 酸性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合が、中性ｐＨでのＰＤ－Ｌ１との結合の８０％以下で
    ある、請求項１４に記載の抗体。
  16. 中性ｐＨが、７．４であり、酸性ｐＨが、６．０、５．５、５．０、４．５または４．
    ０である、請求項１４または１５に記載の抗体。
  17. 酸性ｐＨがｐＨ６．０、ｐＨ５．５またはｐＨ５．０であり、中性ｐＨがｐＨ７．４で
    ある、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の抗体。
  18. アッセイ試験が、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、表面プラズモン共鳴、ＧＳＴプルダウン、エ
    ピトープ－タグ、免疫沈降、ファーウエスタン、蛍光共鳴エネルギー移動、時間分解蛍光
    イムノアッセイ（ＴＲ－ＦＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノ
    アッセイ、ラテックス凝集、ウエスタンブロット、免疫組織化学またはそれらの組合せの
    いずれかによって結合または遮断活性を測定する、請求項１４から１７のいずれか一項に
    記載の抗体。
  19. 先行する請求項のいずれか一項に記載の抗体と同一のエピトープと結合する、または先
    行する請求項のいずれか一項に記載の抗体との競合結合を有する、単離されたＰＤ－Ｌ１
    抗体。
  20. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｅ５８、Ｋ６２、Ｎ６３、Ｉ６４、
    Ｓ８０およびＹ８１のうち少なくとも１個を含む、請求項１９に記載の抗体。
  21. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｒ１１３、Ｍ１１５、Ｙ１２３、Ｋ
    １２４およびＲ１２５のうち少なくとも１個をさらに含む、請求項１９または２０に記載
    の抗体。
  22. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８、Ｒ１１３、Ｍ
    １１５、Ｙ１２３およびＫ１２４、２）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３およびＲ１２５のうち
    １種を含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の抗体。
  23. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｋ６２、Ｎ６３、Ｉ６４、Ｙ８１お
    よびＤ１２２のうち少なくとも１個をさらに含む、請求項１９から２２のいずれか一項に
    記載の抗体。
  24. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８、Ｎ６３、Ｉ６
    ４、Ｓ８０、Ｙ８１、Ｒ１１３およびＲ１２５、２）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３、Ｍ１１
    ５、Ｄ１２２、Ｙ１２３、Ｋ１２４およびＲ１２５、３）Ｅ５８、Ｋ６２、Ｎ６３、Ｓ８
    ０、Ｙ８１、Ｒ１１３およびＲ１２５、４）Ｅ５８、Ｎ６３、Ｉ６４、Ｓ８０、Ｙ８１、
    Ｒ１１３、Ｋ１２４およびＲ１２５のうち１種を含む、請求項１９から２３のいずれか一
    項に記載の抗体。
  25. 対象においてＰＤ－Ｌ１関連状態を処置するための方法であって、対象に、請求項１か
    ら２４のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１抗体を投与し、それによって状態を処置するこ
    とを含む、方法。
  26. 抗体が、参照投与量の５０％以下である投与量で投与され、参照投与量が、同等のｉｎ
    ｖｉｖｏ治療効果を達成するように参照抗体によって決定され、参照抗体が、酸性ｐＨ
    および中性ｐＨの両方でＰＤ－Ｌ１との同様の結合を示し、参照抗体および抗体が、中性
    ｐＨでＰＤ－Ｌ１との同様の結合を有する、請求項２５に記載の方法。
  27. 抗体が、参照投与頻度のものより少ない投与頻度で投与され、参照投与頻度が、同等の
    ｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を達成するように参照抗体によって決定され、参照抗体が、酸性
    ｐＨおよび中性ｐＨの両方でＰＤ－Ｌ１との同様の結合を示し、参照抗体および抗体が、
    中性ｐＨでＰＤ－Ｌ１との同様の結合を有する、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 抗体が、参照ｉｎ ｖｉｖｏ半減期よりも長い、標的臓器におけるｉｎ ｖｉｖｏ半減
    期を有し、参照ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が、参照抗体によって決定され、参照抗体が、酸性
    ｐＨおよび中性ｐＨの両方でＰＤ－Ｌ１との同様の結合を示し、参照抗体および抗体が、
    中性ｐＨでＰＤ－Ｌ１との同様の結合を有する、請求項２５から２７のいずれか一項に記
    載の方法。
  29. 標的臓器が、血清、腎臓、肺、膵臓、肝臓、胆嚢、膀胱、皮膚、食道、卵巣、乳房、結
    腸、直腸、胃、脾臓または脳のうち１種または複数を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 重鎖ＨＣＤＲ１’、ＨＣＤＲ２’およびＨＣＤＲ３’ならびに軽鎖ＬＣＤＲ１’、ＬＣ
    ＤＲ２’およびＬＣＤＲ３’配列を含む単離されたＰＤ－Ｌ１抗体であって、
    ＨＣＤＲ１’配列は、ＤＹＹＭＮ（配列番号２３）、配列番号２９、３５、４１および
    その少なくとも８０％の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
    ＨＣＤＲ２’配列は、ＤＩＮＰＮＮＧＧＴＳＹＮＸ’１ＫＦＸ’２Ｇ（配列番号２４）
    、配列番号３０、３６、４２およびその少なくとも８０％の配列同一性のある相同体配列
    からなる群から選択され、
    ＨＣＤＲ３’配列は、ＶＫＷＧＤＧＰＦＡＹ（配列番号２５）、配列番号３１、３７、
    ４３およびその少なくとも８０％の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され
    、
    ＬＣＤＲ１’配列は、Ｘ’３ＡＳＱＮＶＧＡＡＶＡ（配列番号２６）、配列番号３２、
    ３８、４４およびその少なくとも８０％の配列同一性のある相同体配列からなる群から選
    択され、
    ＬＣＤＲ２’配列は、ＳＡＳＮＸ’４Ｘ’５Ｔ（配列番号２７）、配列番号３３、３９
    、４５およびその少なくとも８０％の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択さ
    れ、
    ＬＣＤＲ３’配列は、ＱＱＹＳＮＹＰＴ（配列番号２８）、配列番号３４、４０、４６
    およびその少なくとも８０％の配列同一性のある相同体配列からなる群から選択され、
    Ｘ’１は、ＨまたはＱであり、Ｘ’２は、ＫまたはＱであり、Ｘ’３は、ＫまたはＱで
    あり、Ｘ’４は、ＲまたはＬであり、Ｘ’５は、ＹまたはＥである、単離されたＰＤ－Ｌ
    １抗体。
  31. Ｘ’１が、Ｑであり、Ｘ’２が、Ｑであり、Ｘ’３が、Ｑであり、Ｘ’４が、Ｒであり
    、Ｘ’５が、Ｙである、請求項３０に記載の抗体。
  32. 配列番号６５に示される重鎖可変領域および配列番号６６に示される軽鎖可変領域を含
    む、請求項３０から３１のいずれか一項に記載の抗体。
  33. １）ＨＣＤＲ１’が配列番号２９であり、ＨＣＤＲ２’が配列番号３０であり、ＨＣＤ
    Ｒ３’が配列番号３１である重鎖、
    ２）ＨＣＤＲ１’が配列番号３５であり、ＨＣＤＲ２’が配列番号３６であり、ＨＣＤ
    Ｒ３’が配列番号３７である重鎖または
    ３）ＨＣＤＲ１’が配列番号４１であり、ＨＣＤＲ２’が配列番号４２であり、ＨＣＤ
    Ｒ３’が配列番号４３である重鎖を含む、請求項３０に記載の抗体。
  34. １）ＬＣＤＲ１’が配列番号３２であり、ＬＣＤＲ２’が配列番号３３であり、ＬＣＤ
    Ｒ３’が配列番号３４である軽鎖、
    ２）ＬＣＤＲ１’が配列番号３８であり、ＬＣＤＲ２’が配列番号３９であり、ＬＣＤ
    Ｒ３’が配列番号４０である軽鎖または
    ３）ＬＣＤＲ１’が配列番号４４であり、ＬＣＤＲ２’が配列番号４５であり、ＬＣＤ
    Ｒ３’が配列番号４６である軽鎖を含む、請求項３０または３３に記載の抗体。
  35. １）重鎖ＨＣＤＲ１’が配列番号２９であり、ＨＣＤＲ２’が配列番号３０であり、Ｈ
    ＣＤＲ３’が配列番号３１であり、軽鎖ＬＣＤＲ１’が配列番号３２であり、ＬＣＤＲ２
    ’が配列番号３３であり、ＬＣＤＲ３’が配列番号３４である、
    ２）重鎖ＨＣＤＲ１’が配列番号３５であり、ＨＣＤＲ２’が配列番号３６であり、Ｈ
    ＣＤＲ３’が配列番号３７であり、軽鎖ＬＣＤＲ１’が配列番号３８であり、ＬＣＤＲ２
    ’が配列番号３９であり、ＬＣＤＲ３’が配列番号４０である、または
    ３）重鎖ＨＣＤＲ１’が配列番号４１であり、ＨＣＤＲ２’が配列番号４２であり、Ｈ
    ＣＤＲ３’が配列番号４３であり、軽鎖ＬＣＤＲ１’が配列番号４４であり、ＬＣＤＲ２
    ’が配列番号４５であり、ＬＣＤＲ３’が配列番号４６である、請求項３０および３３か
    ら３４のいずれか一項に記載の抗体。
  36. 配列番号５５、５７および５９からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、請求項
    ３０および３３から３５のいずれか一項に記載の抗体。
  37. 配列番号５６、５８および６０からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項
    ３０および３３から４６のいずれか一項に記載の抗体。
  38. 配列番号５５の重鎖可変領域またはそのヒト化バージョンおよび配列番号５６の軽鎖可
    変領域またはそのヒト化バージョンを含む、請求項３０および３３から３７のいずれか一
    項に記載の抗体。
  39. 配列番号５７の重鎖可変領域またはそのヒト化バージョンおよび配列番号５８の軽鎖可
    変領域またはそのヒト化バージョンを含む、請求項３０および３３から３７のいずれか一
    項に記載の抗体。
  40. 配列番号５９の重鎖可変領域またはそのヒト化バージョンおよび配列番号６０の軽鎖可
    変領域またはそのヒト化バージョンを含む、請求項３０および３３から３７のいずれか一
    項に記載の抗体。
  41. 請求項３０から４０のいずれか一項に記載の抗体と同一のエピトープと結合する、また
    は請求項３０から４０のいずれか一項に記載の抗体との競合結合を有する、単離されたＰ
    Ｄ－Ｌ１抗体。
  42. エピトープが、ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｅ５８およびＳ８０のうち少なくとも１個
    を含む、請求項４１に記載の抗体。
  43. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｙ５６、Ｒ１１３、Ｄ１２２、Ｙ１
    ２３およびＲ１２５のうち少なくとも１個をさらに含む、請求項４１または４２に記載の
    抗体。
  44. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８、Ｒ１１３、Ｄ
    １２２、Ｙ１２３およびＲ１２５、２）Ｙ５６、Ｅ５８およびＲ１１３、３）Ｅ５８、Ｒ
    １１３およびＲ１２５のうち１種を含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の抗
    体。
  45. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｓ８０およびＤ１２２のうち少なく
    とも１個をさらに含む、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の抗体。
  46. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１
    １３、Ｄ１２２、Ｙ１２３およびＲ１２５、２）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３およびＲ１２
    ５のうち１種を含む、請求項４１から４５のいずれか一項に記載の抗体。
  47. 示差走査熱量測定によって測定される、摂氏７６℃超の熱転移中点（Ｔｍ）を有する、
    単離されたＰＤ－Ｌ１抗体。
  48. 熱転移中点が、摂氏９０℃超である、請求項４７に記載の抗体。
  49. 二重特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、標識化
    抗体、二価抗体または抗イディオタイプ抗体である、請求項１から２４および３０から４
    ８のいずれか一項に記載の抗体。
  50. ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄ
    ｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
    ｂ’）２、ｄｓダイアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体、単離されたＣＤＲおよび二価
    ドメイン抗体からなる群から選択される抗原結合断片である、請求項１から２４および３
    ０から４９のいずれか一項に記載の抗体。
  51. 請求項１から２４および３０から５０のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
  52. 請求項１から２４および３０から５０のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌ
    クレオチド。
  53. 請求項５２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  54. 請求項５３に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
  55. ポリヌクレオチドによってコードされる抗体を産生する、請求項５４に記載の宿主細胞
    。
  56. 請求項１から２４および３０から５０のいずれか一項に記載の抗体または請求項５１に
    記載の医薬組成物を含むキット。
  57. ＰＤ－Ｌ１抗体を産生する方法であって、ポリヌクレオチドが発現される条件下で、請
    求項５４または請求項５５に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  58. 請求項１から２４および３０から５０のいずれか一項に記載のＰＤ－Ｌ１抗体ならびに
    第２の治療剤を含む医薬組成物。
  59. 第２の治療剤が、放射線療法、化学療法、標的化療法、遺伝子療法、免疫療法、ホルモ
    ン療法、血管新生阻害、緩和ケア、手術またはそれらの組合せにおいて使用される薬剤で
    ある、請求項５８に記載の医薬組成物。
  60. 第２の治療剤が、ＶＥＧＦＲ２抗体である、請求項５９に記載の医薬組成物。
  61. 対象においてＰＤ－Ｌ１関連状態を処置する方法であって、対象に、請求項３０から５
    ０のいずれか一項に記載の抗体の治療有効量を投与することを含む、方法。
  62. 対象においてＰＤ－Ｌ１関連状態を処置する方法であって、対象に、請求項５９から６
    １のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
  63. ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された非ヒト腫
    瘍細胞。
  64. ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む非ヒト腫瘍細胞を産生
    する方法であって、ヒトＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドを導入することを含む
    、方法。
  65. 内因性非ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子を不活性化することをさらに含む、請求項６５に記載の
    方法。
  66. ヒトＰＤ－Ｌ１に対する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性をスクリーニングまたは評価する
    方法であって、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む非ヒト腫
    瘍細胞を非ヒト動物に接種することと、非ヒト動物において抗体を非ヒト腫瘍細胞と接触
    させることと、非ヒト腫瘍細胞の腫瘍量を決定することとを含む、方法。
  67. 以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８およびＳ８０、２）Ｅ５８およ
    びＲ１１３、３）Ｅ５８およびＤ１２２、４）Ｅ５８およびＲ１２５のうち１種を含むエ
    ピトープと結合する、またはそれとの競合結合を有する、単離されたＰＤ－Ｌ１抗体。
  68. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｙ５６およびＹ１２３のうち少なく
    とも１種をさらに含む、請求項６７に記載の抗体。
  69. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１）Ｅ５８、Ｒ１１３、Ｍ
    １１５、Ｙ１２３およびＫ１２４、２）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３およびＲ１２５、３）
    Ｅ５８、Ｒ１１３、Ｄ１２２、Ｙ１２３およびＲ１２５、４）Ｙ５６、Ｅ５８およびＲ１
    １３、５）Ｅ５８、Ｒ１１３およびＲ１２５のうち１種を含む、請求項６７または６８に
    記載の抗体。
  70. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基：Ｋ６２、Ｎ６３、Ｉ６４およびＹ８
    １のうち少なくとも１個をさらに含む、請求項６７から６９のいずれか一項に記載の抗体
    。
  71. エピトープが、以下のＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基の組合せ：１） Ｅ５８、Ｎ６３、Ｉ
    ６４、Ｓ８０、Ｙ８１、Ｒ１１３およびＲ１２５、２）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３、Ｍ１
    １５、Ｄ１２２、Ｙ１２３、Ｋ１２４およびＲ１２５、３）Ｅ５８、Ｋ６２、Ｎ６３、Ｓ
    ８０、Ｙ８１、Ｒ１１３およびＲ１２５、４）Ｅ５８、Ｎ６３、Ｉ６４、Ｓ８０、Ｙ８１
    、Ｒ１１３、Ｋ１２４およびＲ１２５、５）Ｅ５８、Ｓ８０、Ｒ１１３、Ｄ１２２、Ｙ１
    ２３およびＲ１２５のうち１種を含む、請求項６７から７０のいずれか一項に記載の抗体
    。
  72. ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸残基Ｓ８０からなるエピトープと結合する、またはそれとの競合
    結合を有する、単離されたＰＤ－Ｌ１抗体。
  73. 少なくとも７日の持続したＰＤ－Ｌ１受容体占有期間を有する、単離されたＰＤ－Ｌ１
    抗体。
  74. ＥＬＩＳＡによって測定される約０．０３μｇ／ｍｌのＥＣ５０値で活性化されたヒト
    Ｔ細胞と結合する、単離されたＰＤ－Ｌ１抗体。
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106243225B (zh) * 2015-06-11 2021-01-19 智翔（上海）医药科技有限公司 新型抗-pd-l1抗体
CA3007135A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Mabspace Biosciences (Suzhou) Co., Ltd Novel anti-pd-l1 antibodies
US10894823B2 (en) 2016-03-24 2021-01-19 Gensun Biopharma Inc. Trispecific inhibitors for cancer treatment
EP3565839A4 (en) 2017-01-05 2021-04-21 Gensun Biopharma Inc. CHECKPOINT REGULATOR ANTAGONISTS
AU2018278327B2 (en) 2017-06-01 2023-03-16 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-pdl1 antibodies and methods of use thereof
KR20200090823A (ko) * 2017-11-30 2020-07-29 제넨테크, 인크. 항-pd-l1 항체 및 pd-l1 탐지를 위하여 동일한 항체를 이용하는 방법
CN109970857B (zh) * 2017-12-27 2022-09-30 信达生物制药(苏州)有限公司 抗pd-l1抗体及其用途
TW201930350A (zh) * 2017-12-28 2019-08-01 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對ｐｄ－ｌ１之抗體及其變異體
US10597453B2 (en) 2018-06-29 2020-03-24 Gensun Biopharma, Inc. Antitumor immune checkpoint regulator antagonists
BR112021000383A2 (pt) * 2018-07-11 2021-04-06 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Composições e métodos relacionados a construtos do domínio de ligação fc-antígeno manipulado direcionado a pd-l1
WO2020151572A1 (en) * 2019-01-23 2020-07-30 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Anti-pd-l1 diabodies and the use thereof
AU2020212767A1 (en) * 2019-01-25 2021-09-02 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Combined pharmaceutical composition for treating tumor
CN109929037B (zh) * 2019-04-01 2023-03-17 华博生物医药技术（上海）有限公司 针对程序性死亡配体的结合物及其应用
AU2020281535A1 (en) 2019-05-24 2022-01-27 Merck Patent Gmbh Combination therapies using CDK inhibitors
JP2022534982A (ja) * 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在化シグネチャーおよびその使用
CN110194798A (zh) * 2019-05-31 2019-09-03 杭州科兴生物科技有限公司 抗pd-l1单克隆抗体、片段及其医药用途
CN114340735A (zh) 2019-06-28 2022-04-12 璟尚生物制药公司 突变的TGFβ1-RII胞外域和免疫球蛋白支架组成的抗肿瘤拮抗剂
US20220356255A1 (en) * 2019-07-15 2022-11-10 Capella Bioscience Ltd Anti-pd-l1 antibodies
EP4056592A4 (en) * 2019-11-08 2024-03-20 Jiangsu Simcere Pharm Co Ltd ANTIBODY AGAINST HUMAN PROGRAMMED CELL DEATH LIGAND 1 (PD-L1) AND USE THEREOF
CN111929447B (zh) * 2020-09-24 2021-02-26 菁良基因科技(深圳)有限公司 一种pd-l1免疫组织化学参考品及其制备方法和应用
CA3201518A1 (en) * 2020-11-18 2022-05-27 Suzhou Transcenta Therapeutics Co., Ltd. Bi-functional molecules
CN112285366B (zh) * 2020-12-25 2021-06-08 南京广祺医药科技有限公司 一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用
CA3226397A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Ignacio Moraga GONZALEZ Therapeutic muteins
CN115521378B (zh) * 2021-07-23 2023-12-22 南京吉盛澳玛生物医药有限公司 Pd-l1抗体及其用途
TW202327595A (zh) 2021-10-05 2023-07-16 美商輝瑞大藥廠 用於治療癌症之氮雜內醯胺化合物的組合
WO2023079428A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Pfizer Inc. Combination therapies using tlr7/8 agonist
TW202333785A (zh) * 2021-11-16 2023-09-01 中國大陸商蘇州創勝醫藥集團有限公司 Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２拮抗劑和ｐｄ－１／ｐｄ－ｌ１軸抑制劑的組合療法
WO2023221936A1 (zh) * 2022-05-17 2023-11-23 苏州创胜医药集团有限公司 双功能蛋白质及其制剂和用途
CN114939161B (zh) * 2022-06-24 2023-02-28 南方医科大学南方医院 Pd-1抗体在制备治疗肌腱损伤的药物中的应用

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
PT1498427E (pt) 1992-08-21 2010-03-22 Univ Bruxelles Imunoglobulinas desprovidas de cadeias leves
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US6838254B1 (en) 1993-04-29 2005-01-04 Conopco, Inc. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
ATE340590T1 (de) 1994-07-13 2006-10-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Gegen menschliches interleukin-8 gerichteter, rekonstituierter menschlicher antikörper
EP1539233B1 (en) 2001-07-12 2011-04-27 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
RS54271B1 (en) * 2005-07-01 2016-02-29 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. HUMAN MONOCLONIC ANTIBODIES FOR LIGAND PROGRAMMED DEATH 1 (PD-L1)
US8217849B2 (en) 2008-04-07 2012-07-10 Intelleflex Corporation Small profile antenna and RFID device having same
CN114835812A (zh) 2008-12-09 2022-08-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
ES2629337T3 (es) * 2009-02-09 2017-08-08 Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale Anticuerpos contra PD-1 y anticuerpos contra PD-L1 y usos de los mismos
RU2416645C2 (ru) * 2009-05-04 2011-04-20 Общество с ограниченной ответственностью "Промоген-МАТ" Одноцепочечное антитело, связывающее фактор некроза опухоли альфа, днк, плазмидная днк и способ получения одноцепочечного антитела
LT3279215T (lt) * 2009-11-24 2020-04-10 Medimmune Limited Tiksliniai surišantys agentai prieš b7-h1
SG11201401411TA (en) * 2011-10-10 2014-08-28 Hope City Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
CN103987405B (zh) 2011-11-28 2017-03-29 默克专利股份公司 抗pd‑l1抗体及其用途
SG11201407190TA (en) * 2012-05-15 2014-12-30 Bristol Myers Squibb Co Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
EP3553086A1 (en) * 2012-05-31 2019-10-16 Sorrento Therapeutics Inc. Antigen binding proteins that bind pd-l1
CA3139031A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human monoclonal anti-pd-l1 antibodies and methods of use
AR093984A1 (es) * 2012-12-21 2015-07-01 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos que se unen a ligando 1 de muerte programada (pd-l1) humano
WO2014165082A2 (en) * 2013-03-13 2014-10-09 Medimmune, Llc Antibodies and methods of detection
CN105209919B (zh) * 2013-03-15 2019-03-05 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗pd-1和pd-l1相关疾患的生物标志物和方法
CA3007135A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Mabspace Biosciences (Suzhou) Co., Ltd Novel anti-pd-l1 antibodies

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