JP2023071774A - 多重特異性を有するキメラｔ細胞受容体タンパク質を用いた癌の治療 - Google Patents

多重特異性を有するキメラｔ細胞受容体タンパク質を用いた癌の治療 Download PDF

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Abstract

【課題】腫瘍抗原に結合する２つ以上のキメラポリペプチドを発現するように操作された系を提供する。【解決手段】一態様として、第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び第１の細胞内共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む第１のキメラ膜タンパク質と、第２の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び第２の細胞内共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む第２のキメラ膜タンパク質とを含む系であって、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとは、同一ではなく、ＣＤ３γ、δ又はεの前記細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの前記細胞外ドメインに由来する前記第２の細胞外ドメインとは、同一ではない、系である。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０１７年１月３１日に出願された米国特許出願第６２／４５２６０１号明細書に対する優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年１月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｎ２０６７－７１４７ＷＯ２＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが２３１，２２９バイトである。
本発明は、概して、腫瘍抗原の発現と関連する疾患を治療するための、キメラ膜タンパク質を発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の使用に関する。
オートロガスＴ細胞、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を形質導入したＴ細胞による養子細胞移入（ＡＣＴ）療法は、血液癌の治験において有望性が示されている。ＡＣＴに使用するための改善されたキメラ分子が当技術分野で求められている。
本発明は、少なくとも一部には、腫瘍抗原の発現と関連する癌を治療するための、本明細書に記載する通り前記腫瘍抗原に結合する２つ以上のキメラポリペプチドを発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の使用に関する。
第１の態様において、本発明は、
第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインとを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第１の細胞内共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む第１のキメラ膜タンパク質と；
第２の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインとを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び任意選択によりＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む第２のキメラ膜タンパク質と
を含む系であって、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとは、同一ではなく、ＣＤ３γ、δ又はεの第１の細胞外ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの第２の細胞外ドメインとは、同一ではない、系を提供する。
実施形態において、前記第１のＣＤ３γ、δ又はε細胞外ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はε細胞外ドメイン全体を含む。前述の実施形態を含む実施形態において、前記第２のＣＤ３γ、δ又はε細胞外ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はε細胞外ドメイン全体を含む。
前述の実施形態を含む実施形態において、ａ）第１のキメラタンパク質は、ＣＤ３ε細胞外ドメイン全体を含み、及び第２のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ細胞外ドメイン全体を含み；ｂ）第１のキメラタンパク質は、ＣＤ３ε細胞外ドメイン全体を含み、及び第２のキメラタンパク質は、ＣＤ３δ細胞外ドメイン全体を含み；又はｃ）第１のキメラタンパク質は、ＣＤ３δ細胞外ドメイン全体を含み、及び第２のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ細胞外ドメイン全体を含む。
前述の実施形態を含む実施形態において、第１のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質全体を含む。前述の実施形態を含む実施形態において、第２のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質全体を含む。前述の実施形態を含む他の実施形態において、第１のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質に由来するいかなる細胞内ドメインも含まない。前述の実施形態を含む実施形態において、第２のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質に由来するいかなる細胞内ドメインも含まない。
前述の実施形態を含む実施形態において、第１のキメラタンパク質及び／又は第２のキメラタンパク質の膜貫通ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの膜貫通ドメインを含まない。
前述の実施形態を含む実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεに由来する前記第１の細胞外ドメインに対してＮ末端に位置する。前述の実施形態を含む実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεに由来する前記第２の細胞外ドメインに対してＮ末端に位置する。
前述の実施形態を含む実施形態において、第１のキメラタンパク質、第２のキメラタンパク質又は第１及び第２のキメラタンパク質の両方は、前記第１及び／又は第２の抗原結合ドメインに対してＮ末端に位置する第３の抗原結合ドメインを含む。
前述の実施形態を含む実施形態において、第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεに由来する前記第１の細胞外ドメインとは、第１のリンカーによって結合され、且つ／又は第２の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεに由来する前記第２の細胞外ドメインとは、第２のリンカーによって結合される。実施形態において、前記第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、例えばそれからなり、例えば、ここで、ｎは、０～１０の整数であり（配列番号６８）、例えばｎ＝４である。
前述の実施形態を含む実施形態において、前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含む。前述の実施形態を含む他の実施形態では、前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含まない。前述の実施形態を含む実施形態において、系は、第２の細胞内共刺激ドメインを含まない。
前述の実施形態を含む実施形態において、系は、第１の細胞内共刺激ドメイン及び第２の細胞内共刺激ドメインの両方を含む。
前述の実施形態を含む実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、第１の細胞内共刺激ドメインに対してＣ末端に位置する、ＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第３の細胞内共刺激ドメインを含む。
前述の実施形態を含む実施形態において、前記細胞内共刺激ドメイン（例えば、第１の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第２の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第３の細胞内共刺激ドメイン）の１つ以上は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド又はそれらの機能的変異体からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインであり、例えば本明細書に記載の共刺激ドメインを含む。
前述の実施形態を含む実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に結合する。実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、５、７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ－７／４／３Ｒ又はＩＬ４Ｒ、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１又はＣＤ１３８に結合する。
前述の実施形態を含む実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に結合する。実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、Ｂ細胞抗原、例えば第１の抗原結合ドメインによって結合されるものと同じＢ細胞抗原であるが、抗原上の異なる結合エピトープ又は領域に結合する。他の実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、Ｂ細胞抗原、例えば第１の抗原結合ドメインによって結合されるものと異なるＢ細胞抗原に結合する。実施形態において、第２の抗原結合ドメインによって結合されるＢ細胞抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、５、７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ－７／４／３Ｒ又はＩＬ４Ｒであり、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１又はＣＤ１３８である。
実施形態において、ａ）第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合し；ｂ）第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し；又はｃ）第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合する。
実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、例えば、本明細書に記載のように、固形腫瘍抗原、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリン、ＧＤ２、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、Ｔｎ－Ｏ－糖ペプチド、ｓＴｎ－Ｏ－糖ペプチド、ＰＳＭＡ、ＣＤ９７、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、レグマン、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ（例えば、ＥＲＢＢ２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、エフリンＢ２、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｓＬｅ、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＦＡＰ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７、ＭＬ－ＩＡＰ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、Ｆｏｓ関連抗原、好中球エラスターゼ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、精子タンパク質１７、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、チログロブリン、ＰＬＡＣ１、ｇｌｏｂｏＨ、ＲＡＧＥ１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＮＡ－１７、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３，ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＧＰＲ２０、Ｌｙ６ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＧＦＲα４及びＭＨＣに提示されるこれらの抗原のいずれかのペプチド、例えばＣＬＤＮ６、メソテリン及びＥＧＦＲｖＩＩＩからなる群から選択される固形腫瘍抗原に結合する。
実施形態において、ａ）第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、メソテリンに結合し；ｂ）第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し；又はｃ）第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＬＤＮ６に結合する。
第２の態様において、本発明は、前述の態様及び実施形態のいずれかの系をコードする核酸構築物を提供する。実施形態において、核酸構築物は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡである。他の実施形態では、核酸構築物は、ＤＮＡである。
第３の態様において、本発明は、既述の態様の核酸構築物を含むベクターを提供する。実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルスである。実施形態において、前記第１及び第２のキメラ膜タンパク質の発現時、前記タンパク質は、単一のｍＲＮＡ転写物として発現され、例えば、前記第１及び第２のキメラ膜タンパク質をコードする核酸配列は、自己切断部位又は配列内リボソーム進入部位をコードする核酸によって分離される。
第４の態様において、本発明は、例えば、本明細書に記載のように既述の核酸構築物態様及び実施形態のいずれかの核酸構築物、前述したベクター態様及び実施形態のいずれかのベクター又は前述した態様及び実施形態のいずれかの系を含む細胞を提供する。実施形態において、前記細胞は、ＮＫ細胞又はＴ細胞から選択される。
第５の態様において、本発明は、増殖性疾患を有する対象を治療する方法であって、前述した細胞態様及び実施形態のいずれか１つの細胞を投与することを含む方法を提供する。実施形態において、前記対象は、腫瘍を有し、及び前記投与は、前記腫瘍に対する免疫を対象に提供する。実施形態において、前記細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり、且つ前記対象に対してオートロガスである。他の実施形態では、前記細胞は、同種異系Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。実施形態において、前記対象は、ヒトである。
系のキメラ膜タンパク質の特徴が上記に記載されているが、系のキメラ膜タンパク質のさらなる態様を以下に記載する。
従って、関連する態様では、本発明は、ＣＤ３γ、δ又はεドメインと、細胞内共刺激ドメインとを含むキメラ膜タンパク質を特徴とし、ＣＤ３ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する細胞外ドメインを含み、及び細胞内共刺激ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεに由来しない。
関連する態様では、本発明は、ＣＤ３γ、δ又はεドメインと、第１の細胞二量体化ドメインとを含むキメラ膜タンパク質を特徴とし、ＣＤ３γ、δ又はεドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する細胞外ドメインを含む。この態様では、タンパク質は、任意選択により、細胞内共刺激ドメインをさらに含み得る。
また別の態様では、本発明は、抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεドメインとを含むキメラ膜タンパク質を特徴とし、ＣＤ３γ、δ又はεドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する細胞外ドメインを含む。
前述した態様のいずれかにおいて、ＣＤ３γ、δ又はεドメインは、ＣＤ３γ、δ若しくはε細胞外ドメイン全体（例えば、全タンパク質）又はＣＤ３γ、δ若しくはεの一部を含む。上記ドメインが細胞外ドメインの一部のみである特定の態様では、切断型ドメインは、残るＴＣＲポリペプチドと結合する能力を保持する。特定の態様では、キメラタンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεに由来するいかなる細胞内及び／又は膜貫通ドメインも含まない。
前述した態様のいずれかにおいて、タンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεドメインに対してＮ末端に位置する抗原結合ドメインも含む。
別の態様では、本発明は、前述のキメラ膜タンパク質のいずれか１つを含む細胞（例えば、ＮＫ細胞又はＴ細胞）を特徴とする。
別の態様では、本発明は、前述したキメラ膜タンパク質のいずれか１つをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）を特徴とする。本発明は、こうした核酸を含むベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルス）ベクターも特徴とする。
前述した細胞の特定のいずれかにおいて、キメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεドメインと、細胞内二量体化ドメインとを含み、細胞は、第２のキメラタンパク質をさらに含み、及び第２のキメラタンパク質は、細胞内共刺激ドメインと第２の細胞内二量体化ドメインとを含む。特定の実施形態において、第１及び第２の二量体化ドメインは、細胞内で発現されると、ヘテロ二量体化ペアを形成してヘテロ二量体化する（例えば、ｐ５３及びＭＤＭ２、ｍＦｏｓ及びｍＪｕｎ Ｃｏｉｌｓ並びにＶＰＳ３６及びＶＰＳ２８）。他の実施形態では、第１及び第２の二量体化ドメインは、二量体化化合物の存在下においてのみ、細胞内で発現されたときにヘテロ二量体化ペアを形成してヘテロ二量体化する。例えば、第１及び第２の二量体化ドメインの一方は、ＦＫＢＰと少なくとも８５％の同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含み得、及び任意選択により、第１及び第２の二量体化ドメインの他方は、ＦＲＰと少なくとも８５％の同一性を有するラパマイシン類似体結合配列を含む。別の例では、第１及び第２の二量体化ドメインの一方は、ＦＫＢＰに由来するラパマイシン類似体結合配列を含む。ここで、第１及び第２の二量体化ドメインの他方は、任意選択により、ＦＲＰに由来するラパマイシン類似体結合配列を含み得る。特定の実施形態において、ラパマイシン類似体結合配列は、ＦＫＢＰ又はＦＲＰに由来するＡＰ２１９６７結合配列を含む。他の例示的なヘテロ二量体化ペアは、ＧｙｒＢ－ＧｙｒＢベースのスイッチ、ＧＡＩ－ＧＩＤ１ベースのスイッチ又はハロ－タグ／ＳＮＡＰ－タグベースのスイッチを含む。
第２のキメラタンパク質は、例えば、キメラ膜タンパク質であり得、例えば細胞外抗原結合ドメインをさらに含み得る。他の態様では、前述の細胞のいくつかは、例えば、ＣＤ３γ、δ又はεドメインと、細胞内二量体化ドメインとを含み得、細胞は、例えば、第２のキメラタンパク質（例えば、キメラ膜タンパク質）をさらに含み得、第２のキメラタンパク質は、細胞外抗原結合ドメインと、細胞内共刺激ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はε結合ドメイン（例えば、細胞内又は細胞外ＣＤ３ドメインに結合する）とを含む。こうした結合ドメインは、例えば、抗ＣＤ３γ、δ又はε抗体由来（例えば、ｓｃＦｖ又はＶｈｈドメイン）であり得る。これらの実施形態のいくつかでは、第２のキメラタンパク質の細胞外抗原結合ドメイン（例えば、抗体又はそのフラグメントの抗原結合ドメイン）は、第２のキメラタンパク質の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと異種であり、且つ／又は阻害分子の細胞外ドメインである。或いは、第２のキメラタンパク質の細胞外抗原結合ドメインは、第２のキメラタンパク質の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと天然に結合している。
上の態様のいくつかでは、第２のキメラタンパク質は、例えば、細胞内タンパク質として発現され得る。
前述の態様のいくつかでは、第１及び第２のキメラタンパク質は、いずれも同じ又は異なる内在性タンパク質に由来する細胞内共刺激ドメインを含む。
別の態様では、本発明は、前述した第１及び第２のキメラタンパク質のいずれかをコードする核酸と、そのような核酸とを含むベクターを特徴とする。そうしたベクターは、第１及び第２のキメラタンパク質の発現時、タンパク質が単一のｍＲＮＡ転写物として発現され、例えば、ここで、第１及び第２のキメラタンパク質が、自己切断部位又は配列内リボソーム進入部位をコードする核酸によって分離されるように構成され得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、細胞内共刺激ドメインの１つ以上は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド又はそれらの機能的変異体を含む群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。
また別の態様では、本発明は、前述の細胞のいずれかを用いた対象（例えば、ヒト）の治療を特徴とする（例えば、ここで、対象は、増殖性疾患（例えば、癌）を有する。特定の実施形態において、対象は、腫瘍を有し、及び投与は、腫瘍に対する免疫を対象に提供する。細胞は、例えば、対象に対してオートロガス又は同種異系のＴ細胞又はＮＫ細胞であり得る。
キメラタンパク質コード核酸
従って、一態様では、本発明は、本明細書に記載する腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体フラグメント、ＴＣＲ又はＴＣＲフラグメント）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載の共刺激ドメイン）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載の一次シグナル伝達ドメイン）の１つ以上を含むキメラ膜タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１とも呼ばれるＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９及び１９Ａ２４）；Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１又はＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；表皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（Ｔｎ Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスチシン又はＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）；ステージ特異的胎児性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体α；受容体チロシン－タンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面結合型（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（Ｐｒｏｓｏｍｅ，Ｍａｃｒｏｐａｉｎ）サブユニット、β型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂ１）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接合分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガンクリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体β；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７－関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨ六糖部分グリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ腫抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ選択的リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座－変異型遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポイエチン結合表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ－関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；生存；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１又はガレクチン８）、Ｔ細胞１により認識される黒色腫抗原（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）；Ｒａｔ肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ又はＢｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｓｉｔｅｓ）、Ｔ細胞３により認識される扁平上皮癌抗原（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ腫特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；キナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；及び免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）の１つ以上から選択される。
一部の実施形態では、コード化分子によって結合される腫瘍抗原は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５及びＩＧＬＬ１の１つ以上から選択される。
特定の実施形態では、コード化ＣＡＲ分子によって結合される腫瘍抗原は、ＴＳＨＲ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ及びＯＲ５１Ｅ２の１つ以上から選択される。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインの１つ以上は、Ｂ細胞抗原に結合し、例示的なＢ細胞抗原は、次の通りである：ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、５、７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ－７／４／３Ｒ及びＩＬ４Ｒ。特に好ましいＢ細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１及びＣＤ１３８を含む。実施形態において、Ｂ細胞抗原は、ＣＤ１９である。実施形態において、Ｂ細胞抗原は、ＣＤ２０である。実施形態において、Ｂ細胞抗原は、ＣＤ２２である。実施形態において、Ｂ細胞抗原は、ＢＣＭＡである。実施形態において、Ｂ細胞抗原は、ＦｃＲｎ５である。実施形態において、Ｂ細胞抗原は、ＦｃＲｎ２である。実施形態において、Ｂ細胞抗原は、ＣＳ－１である。実施形態において、Ｂ細胞抗原は、ＣＤ１３８である。
一部の実施形態では、コード化分子の抗原結合ドメインは、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨ若しくはＶＬドメイン又はラクダ科動物のＶＨＨドメインを含む。
一部の実施形態では、コード化分子の膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ及び／若しくはＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメイン又はそれらの機能的変異体から選択される膜貫通ドメインを含む。
他の実施形態では、核酸分子は、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインをコードする。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列と、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列とを含む。
特定の実施形態では、コード化一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、コード化一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能的シグナル伝達ドメインを含む。
特定の好ましい実施形態において、コード化細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列と、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列とを含み得る。一部の実施形態において、コード化共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６若しくはＮＫＧ２Ｄ又はそれらの機能的変異体の１つ以上から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態において、核酸分子は、リーダー配列をさらに含む。
特定の実施形態において、コード化抗原結合ドメインは、１０－４Ｍ～１０－８Ｍの結合親和性ＫＤを有する。
一実施形態において、コード化抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメイン、例えば上に挙げた標的に対する本明細書に記載の抗原結合ドメインである。
一実施形態において、コード化分子は、標的抗原に対して１０－４Ｍ～１０－８Ｍ、例えば１０－５Ｍ～１０－７Ｍ、例えば１０－６Ｍ又は１０－７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、参照抗体、例えば本明細書に記載の抗体より少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍又は１０００倍小さい結合親和性を有する。一実施形態において、コード化抗原結合ドメインは、参照抗体（例えば、抗原結合ドメインが由来する抗体）より少なくとも５倍小さい結合親和性を有する。
別の態様において、本明細書では、
第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインとを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第１の細胞内共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む第１のキメラ膜タンパク質と、
第２の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインとを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び任意選択によりＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む第２のキメラ膜タンパク質と
を含む系であって、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとは、同一ではなく、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインとは、同一ではない、系が提供される。
一実施形態において、第１の細胞外ドメインは、ＣＤ３γ、δ若しくはεの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、任意選択により、第１の細胞外ドメインは、配列番号８８、８３若しくは７８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１の細胞外ドメインは、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１の細胞外ドメインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１の細胞外ドメインは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第２の細胞外ドメインは、ＣＤ３γ、δ若しくはεの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、任意選択により、第２の細胞外ドメインは、配列番号８８、８３若しくは７８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第２の細胞外ドメインは、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第２の細胞外ドメインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第２の細胞外ドメインは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３のアミノ酸配列を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３のアミノ酸配列を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８のアミノ酸配列を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８のアミノ酸配列を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質の膜貫通ドメインは、ＣＤ３γ、δ若しくはεの膜貫通ドメイン又はその機能的変異体を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質の膜貫通ドメインは、配列番号８９、８４若しくは７９のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。
一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質の膜貫通ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの膜貫通ドメインを含まない。
一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質の膜貫通ドメインは、ＣＤ３γ、δ若しくはεの膜貫通ドメイン又はその機能的変異体を含む。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質の膜貫通ドメインは、配列番号８９、８４若しくは７９のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。
一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質の膜貫通ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの膜貫通ドメインを含まない。
一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ若しくはεタンパク質又はその機能的変異体を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号９０、８５若しくは８０のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８７、８２若しくは７７のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ若しくはεタンパク質又はその機能的変異体を含む。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号９０、８５若しくは８０のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ若しくはεタンパク質又はその機能的変異体を含み、任意選択により、第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８７、８２若しくは７７のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質に由来するいかなる細胞内ドメインも含まない。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質に由来するいかなる細胞内ドメインも含まない。
一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する前記第１の細胞外ドメインに対してＮ末端に位置する。一実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する前記第２の細胞外ドメインに対してＮ末端に位置する。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質、第２のキメラ膜タンパク質又は第１及び第２のキメラ膜タンパク質の両方は、前記第１及び／又は第２の抗原結合ドメインに対してＮ末端に位置する第３の抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する前記第１の細胞外ドメインとは、第１のリンカーによって結合され、且つ／又は第２の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する前記第２の細胞外ドメインとは、第２のリンカーによって結合される。一実施形態において、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、例えばそれからなり、例えば、ここで、ｎは、０～１０の整数であり、例えばｎ＝１、２又は４である。一実施形態では、ｎ＝１である。一実施形態では、ｎ＝２である。一実施形態では、ｎ＝４である。
一実施形態において、前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含む。一実施形態では、前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含まない。一実施形態において、系は、第２の細胞内共刺激ドメインを含まない。一実施形態において、系は、第１の細胞内共刺激ドメイン及び第２の細胞内共刺激ドメインの両方を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、第１の細胞内共刺激ドメインに対してＣ末端に位置する、ＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第３の細胞内共刺激ドメインを含む。
一実施形態において、前記細胞内共刺激ドメイン（例えば、第１の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第２の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第３の細胞内共刺激ドメイン）の１つ以上は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド又はそれらの機能的変異体からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。
一実施形態において、前記細胞内共刺激ドメイン（例えば、第１の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第２の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第３の細胞内共刺激ドメイン）の１つ以上は、４－１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン又はその機能的変異体であり、任意選択により、前記細胞内共刺激ドメイン（例えば、第１の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第２の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第３の細胞内共刺激ドメイン）の１つ以上は、配列番号５０のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、前記細胞内共刺激ドメイン（例えば、第１の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第２の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第３の細胞内共刺激ドメイン）の１つ以上は、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号９１、８６若しくは８１のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号９１、８６若しくは８１のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、Ｂ細胞抗原に結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインによって結合されるＢ細胞抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、５、７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ－７／４／３Ｒ又はＩＬ４Ｒである。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインによって結合されるＢ細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１又はＣＤ１３８である。
一実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に結合する。一実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、Ｂ細胞抗原に結合する。一実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインによって結合されるＢ細胞抗原と異なるＢ細胞抗原に結合する。一実施形態において、第２の抗原結合ドメインによって結合されるＢ細胞抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、５、７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ－７／４／３Ｒ又はＩＬ４Ｒである。一実施形態において、第２の抗原結合ドメインによって結合されるＢ細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１又はＣＤ１３８である。
一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合する。
一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し、任意選択により、
（ｉ）第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７０のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７５若しくは７６のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み；
（ｉｉ）第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７１のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７３、７４、７５若しくは７６のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み；又は
（ｉｉｉ）第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７２のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７３若しくは７４のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む。
一実施形態において、第１又は第２の抗原結合ドメインは、固形腫瘍抗原に結合する。一実施形態において、固形腫瘍抗原は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリン、ＧＤ２、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、Ｔｎ－Ｏ－糖ペプチド、ｓＴｎ－Ｏ－糖ペプチド、ＰＳＭＡ、ＣＤ９７、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、レグマン、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ（例えば、ＥＲＢＢ２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、エフリンＢ２、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｓＬｅ、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＦＡＰ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６若しくはＥ７、ＭＬ－ＩＡＰ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、Ｆｏｓ関連抗原、好中球エラスターゼ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、精子タンパク質１７、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、チログロブリン、ＰＬＡＣ１、ｇｌｏｂｏＨ、ＲＡＧＥ１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＮＡ－１７、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＧＰＲ２０、Ｌｙ６ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＧＦＲα４又はＭＨＣに提示されるこれらの抗原のいずれかのペプチドである。一実施形態において、前記固形腫瘍抗原は、ＣＬＤＮ６、メソテリン及びＥＧＦＲｖＩＩＩからなる群から選択される。
一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、メソテリンに結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＬＤＮ６に結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、メソテリンに結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合する。一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、ＣＬＤＮ６に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合する。
一態様において、本発明は、前述の態様及び実施形態のいずれかの系をコードする核酸構築物を提供する。実施形態において、核酸構築物は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡである。他の実施形態では、核酸構築物は、ＤＮＡである。一実施形態において、核酸構築物は、第１のキメラ膜タンパク質をコードする第１の核酸分子と、第２のキメラ膜タンパク質をコードする第２の核酸分子とを含む。一実施形態において、第１及び第２の核酸分子は、単一の核酸分子上に配置される。一実施形態において、第１及び第２の核酸分子は、個別の核酸分子上に配置される。
一態様において、本発明は、既述の態様の核酸構築物を含むベクターを提供する。実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルスベクターである。実施形態において、前記第１及び第２のキメラ膜タンパク質の発現時、前記タンパク質は、単一のｍＲＮＡ転写物として発現され、例えば、前記第１及び第２のキメラ膜タンパク質をコードする核酸配列は、自己切断部位又は配列内リボソーム進入部位をコードする核酸によって分離される。
一態様において、本発明は、前述した核酸構築物態様及び実施形態のいずれかの核酸構築物、前述したベクター態様及び実施形態のいずれかのベクター又は前述した態様及び実施形態のいずれかの系を含む細胞を提供する。実施形態において、細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。
一実施形態において、細胞は、第１の阻害剤をさらに含み、
（ｉ）第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び第１の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３γの発現を低減し；
（ｉｉ）第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び第１の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３δの発現を低減し；又は
（ｉｉｉ）第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び第１の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３εの発現を低減する。一実施形態において、第１の阻害剤は、細胞中の第１のキメラ膜タンパク質の発現を低減しないか又は実質的に低減しない（例えば、第１の阻害剤は、第１の阻害剤の非存在下での第１のキメラ膜タンパク質の発現と比較して２、５、１０、１５又は２０％以下のレベルで第１のキメラ膜タンパク質の発現を低減する）。
一実施形態において、細胞は、第２の阻害剤をさらに含み、
（ｉ）第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び第２の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３γの発現を低減し；
（ｉｉ）第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び第２の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３δの発現を低減し；又は
（ｉｉｉ）第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び第２の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３εの発現を低減する。一実施形態において、第２の阻害剤は、細胞中の第２のキメラ膜タンパク質の発現を低減しないか又は実質的に低減しない（例えば、第２の阻害剤は、第２の阻害剤の非存在下での第２のキメラ膜タンパク質の発現と比較して２、５、１０、１５又は２０％以下のレベルで第２のキメラ膜タンパク質の発現を低減する）。
一実施形態において、第１又は第２の阻害剤は、ＲＮＡ干渉を媒介する薬剤、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡをコードする核酸分子である。一実施形態において、第１又は第２の阻害剤は、遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系若しくはメガヌクレアーゼ系）又は遺伝子編集系の１つ以上の成分をコードする核酸分子である。
一態様において、本発明は、増殖性疾患を有する対象を治療する方法であって、前述した細胞態様及び実施形態のいずれか１つの細胞を対象に投与することを含む方法を提供する。実施形態において、前記対象は、腫瘍を有し、及び前記投与は、前記腫瘍に対する免疫を前記対象に提供する。
一態様において、本発明は、癌を有する対象において抗癌免疫応答を提供する方法であって、前述した細胞態様及び実施形態のいずれか１つの細胞を対象に投与することを含む方法を提供する。
一実施形態において、前記細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり、且つ前記対象に対してオートロガスである。他の実施形態では、前記細胞は、同種異系Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。実施形態において、前記対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、癌を有する。一実施形態において、癌は、例えば、少なくとも１つの過去の標準療法に際して進行している対象における中皮腫（例えば、悪性胸膜中皮腫）；肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌又は大細胞肺癌）；膵臓癌（例えば、少なくとも１つの過去の標準療法に際して進行している対象における例えば膵管腺癌若しくは転移性膵管腺癌（ＰＤＡ））；食道腺癌、卵巣癌（例えば、過去の標準療法の少なくとも１つのレジメン後に進行している対象における例えば漿液性上皮卵巣癌）、乳癌、大腸癌、膀胱癌又はそれらのいずれかの組み合わせから選択される。一実施形態において、癌は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性炎症を伴うＤＬＢＣＬ、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、嚢胞性リンパ腫、小児性嚢胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞若しくは大細胞性嚢胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫（粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯リンパ腫）、辺縁帯リンパ腫、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾臓リンパ腫／白血病、びまん性赤脾髄小型Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞性白血病亜型、リンパ形質細胞性リンパ腫、Ｈ鎖病、形質細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外形成細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児性節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は分類不能型リンパ腫から選択される。
一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原（例えば、第１の腫瘍抗原）に結合し、及び第２の抗原結合ドメインは、第２の抗原（例えば、第２の腫瘍抗原）に結合し、癌は、第１の抗原（例えば、第１の腫瘍抗原）及び／又は第２の抗原（例えば、第２の腫瘍抗原）の異種発現を呈し、例えば、癌における細胞の９０％、８０％、７０％、６０％又は５０％未満は、第１の抗原（例えば、第１の腫瘍抗原）を発現し、及び癌における細胞の９０％、８０％、７０％、６０％若しくは５０％未満は、第２の抗原（例えば、第２の腫瘍抗原）を発現する。
一態様において、本発明は、細胞を作製する方法であって、前述したベクター態様及び実施形態のベクターを細胞に導入することを含む方法を提供する。一実施形態において、この方法は、前述したベクター態様及び実施形態のベクターで細胞を形質導入することを含む。
一実施形態において、本方法は、第１の阻害剤を細胞に導入することをさらに含み、
（ｉ）第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び第１の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３γの発現を低減し；
（ｉｉ）第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び第１の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３δの発現を低減し；又は
（ｉｉｉ）第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び第１の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３εの発現を低減する。一実施形態において、第１の阻害剤は、細胞中の第１のキメラ膜タンパク質の発現を低減しないか又は実質的に低減しない（例えば、第１の阻害剤は、第１の阻害剤の非存在下での第１のキメラ膜タンパク質の発現と比較して２、５、１０、１５又は２０％以下のレベルで第１のキメラ膜タンパク質の発現を低減する）。
一実施形態において、本方法は、第２の阻害剤を細胞に導入することをさらに含み、
（ｉ）第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び第２の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３γの発現を低減し；
（ｉｉ）第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び第２の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３δの発現を低減し；又は
（ｉｉｉ）第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び第２の阻害剤は、細胞中の内在性ＣＤ３εの発現を低減する。一実施形態において、第２の阻害剤は、細胞中の第２のキメラ膜タンパク質の発現を低減しないか又は実質的に低減しない（例えば、第２の阻害剤は、第２の阻害剤の非存在下での第２のキメラ膜タンパク質の発現と比較して２、５、１０、１５又は２０％以下のレベルで第２のキメラ膜タンパク質の発現を低減する）。
一実施形態において、第１又は第２の阻害剤は、ＲＮＡ干渉を媒介する薬剤、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡをコードする核酸分子である。一実施形態において、第１又は第２の阻害剤は、遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系若しくはメガヌクレアーゼ系）又は遺伝子編集系の１つ以上の成分をコードする核酸分子である。
一実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞である。
ベクター
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターに関する。一実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択される。一実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
実施形態では、ベクターは、例えば、本明細書に記載のキメラタンパク質をコードする核酸配列と、ｉｎｈＫＩＲ細胞質ドメインと、膜貫通ドメイン、例えばＫＩＲ膜貫通ドメイン及び阻害剤細胞質ドメイン、例えばＩＴＩＭドメイン（例えば、ｉｎｈＫＩＲ ＩＴＩＭドメイン）を含む抑制分子をコードする核酸配列とを含む。実施形態では、抑制分子は、天然型ｉｎｈＫＩＲであるか、或いは天然型ｉｎｈＫＩＲと少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５若しくは９９％の相同性を共有する配列又は天然型ｉｎｈＫＩＲと１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５若しくは２０以下の残基が異なる配列である。
実施形態では、抑制分子をコードする核酸配列は、ＳＬＡＭファミリー細胞質ドメインと、膜貫通ドメイン、例えばＳＬＡＭファミリー膜貫通ドメインと、阻害剤細胞質ドメイン、例えばＳＬＡＭファミリードメイン（例えば、ＳＬＡＭファミリーＩＴＩＭドメイン）とを含む。実施形態では、抑制分子は、天然型ＳＬＡＭファミリーメンバーであるか、或いは天然型ＳＬＡＭファミリーメンバーと少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５若しくは９９％の相同性を共有する配列又は天然型ＳＬＡＭファミリーメンバーと１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５若しくは２０以下の残基が異なる配列である。
一実施形態では、ベクターは、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＥＦ－１プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター又はホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターから選択される。一実施形態では、プロモーターは、ＥＦ－１プロモーターである。
一実施形態では、ベクターは、インビトロ転写ベクター、例えば本明細書に記載の核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。一実施形態では、ベクター中の核酸配列は、ポリ（Ａ）テール、例えば本明細書に記載のポリＡテール（例えば、約１５０のアデノシン塩基を含む）をさらに含む。一実施形態では、ベクター中の核酸配列は、３’ＵＴＲ、例えば本明細書に記載の３’ＵＴＲ（例えば、ヒトβ－グロブリンに由来する３’ＵＴＲの少なくとも１つの繰り返しを含む）をさらに含む。一実施形態では、ベクター中の核酸配列は、プロモーター、例えばＴ２Ａプロモーターをさらに含む。
ポリペプチド
別の態様では、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインの１つ以上を含む１つ以上の単離されたポリペプチド分子を特徴とし、前記抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＦＡＰ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチルＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン並びにテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５及びＩＧＬＬ１の１つ以上から選択される腫瘍抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５及びＩＧＬＬ１の１つ以上から選択される腫瘍抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ及びＯＲ５１Ｅ２の１つ以上から選択される腫瘍抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、シングルドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨ若しくはＶＬドメイン又はラクダ科動物ＶＨＨドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１，ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ及び／若しくはＮＫＧ２Ｃ又はそれらの機能的変異体から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。
他の実施形態では、ポリペプチド分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激シグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態では、ポリペプチド分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。他の好ましい実施形態では、ポリペプチド分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。さらに他の実施形態では、ポリペプチド分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
他の実施形態では、ＣＡＲポリペプチド分子の一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能的シグナル伝達ドメインを含む。
好ましい実施形態では、ＣＡＲポリペプチド分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列と、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列とを含むことができる。いくつかの実施形態では、コードされた共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６若しくはＮＫＧ２Ｄ又はそれらの機能的変異体の１つ以上から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチド分子は、リーダー配列をさらに含む。
特定の実施形態では、ポリペプチド分子の抗原結合ドメインは、１０－４Ｍ～１０－８Ｍの結合親和性ＫＤを有する。一実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメイン、例えば上記で提供された標的に対する本明細書に記載の抗原結合ドメインである。一実施形態では、ＣＡＲ分子は、標的抗原に対して１０－４Ｍ～１０－８Ｍ、例えば１０－５Ｍ～１０－７Ｍ、例えば１０－６Ｍ又は１０－７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗原結合ドメインを含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、参照抗体、例えば本明細書に記載の抗体の少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍又は１，０００倍小さい結合親和性を有する。一実施形態では、コードされた抗原結合ドメインは、参照抗体（例えば、抗原結合ドメインが由来する抗体）よりも少なくとも５倍小さい結合親和性を有する。
別の態様では、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたポリペプチド分子を特徴とし、前記抗原結合ドメインは、腫瘍担持抗原（例えば、本明細書に記載の腫瘍担持抗原）に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍担持抗原は、間質細胞又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上に存在する抗原である。
キメラタンパク質発現細胞及びキメラタンパク質系発現細胞
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子、１つ以上のキメラポリペプチド分子又はベクターを含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞（例えば、細胞の集団、例えば免疫エフェクター細胞の集団）に関する。
一実施形態では、細胞は、ヒトＴ細胞である。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載の細胞（例えば、ヒトＴ細胞、例えば本明細書に記載のヒトＴ細胞）又はヒトＮＫ細胞（例えば、本明細書に記載のヒトＮＫ細胞）である。一実施形態では、ヒトＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、このＴ細胞は、ジアグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損である。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、このＴ細胞は、イカロス欠損である。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、このＴ細胞は、ＤＧＫ及びイカロスの両方が欠損している。
別の実施形態では、本明細書に記載のキメラタンパク質発現免疫エフェクター細胞は、別の作用物質、例えば細胞の活性を増強する作用物質をさらに発現し得る。例えば、一実施形態では、この作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子の例としては、例えば、本明細書に記載されるようなＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦβが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する作用物質は、陽性シグナルを細胞、例えば第１のポリペプチド、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに提供する第２のポリペプチドと関連する抑制分子を含む。一実施形態では、作用物質は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４若しくはＴＧＦβ又はこれらのいずれかのフラグメントなどの抑制分子の第１のポリペプチドと、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインである（例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載されるように４１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）を含む第２のポリペプチドとを含む。一実施形態では、作用物質は、ＰＤ－１又はそのフラグメントの第１のポリペプチドと、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０若しくは４－ＩＢＢシグナル伝達ドメイン及び／又は本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）の第２のポリペプチドとを含む。
一実施形態では、細胞は、ｉｎｈＫＩＲ細胞質ドメインと、膜貫通ドメイン、例えばＫＩＲ膜貫通ドメインと、阻害剤細胞質ドメイン、例えばＩＴＩＭドメイン（例えば、ｉｎｈＫＩＲ ＩＴＩＭドメイン）とを含む抑制分子をさらに含む。実施形態では、抑制分子は、天然型ｉｎｈＫＩＲであるか、或いは天然型ｉｎｈＫＩＲと少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５若しくは９９％の相同性を共有する配列又は天然型ｉｎｈＫＩＲと１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５若しくは２０以下の残基が異なる配列である。
一実施形態では、細胞は、ＳＬＡＭファミリー細胞質ドメインと、膜貫通ドメイン、例えばＳＬＡＭファミリー膜貫通ドメインと、阻害剤細胞質ドメイン、例えばＳＬＡＭファミリードメイン（例えば、ＳＬＡＭファミリーＩＴＩＭドメイン）とを含む抑制分子をさらに含む。実施形態では、抑制分子は、天然型ＳＬＡＭファミリーメンバーであるか、或いは天然型ＳＬＡＭファミリーメンバーと少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５若しくは９９％の相同性を共有する配列又は天然型ＳＬＡＭファミリーメンバーと１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５若しくは２０以下の残基が異なる配列である。
一実施形態では、細胞中の第２のＣＡＲは、抑制ＣＡＲであり、抑制ＣＡＲは、抑制分子の抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含む。抑制分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦβ、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及びＣＥＡＣＡＭ－５の１つ以上から選択することができる。一実施形態では、第２のＣＡＲ分子は、ＰＤ１又はそのフラグメントの細胞外ドメインを含む。
実施形態では、細胞中の第２のＣＡＲ分子は、一次シグナル伝達ドメイン及び／又は細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
他の実施形態では、細胞中の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能的ドメイン又はその機能的変異体を含む一次シグナル伝達ドメインと、４－１ＢＢの機能的ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。
特定の実施形態では、第１のキメラ分子の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、第２のキメラ分子の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含まない。例えば、第１のキメラ分子の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、第２のキメラ分子の抗原結合ドメインは、ラクダ科動物のＶＨＨドメインを含む。
治療／併用療法の方法
別の態様では、本発明は、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の）又はポリペプチド（例えば、本明細書に記載の）をコードする１つ以上の核酸を含む細胞を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、対象は、本明細書に記載の障害を有し、例えば、対象は、癌を有し、例えば、対象は、本明細書に記載の標的抗原を発現する癌を有する。一実施形態では、対象は、ヒトである。
別の態様では、有効量の、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の）を含む細胞を対象に投与することを含む、本明細書に記載の癌関連抗原の発現に関連する疾患を有する対象を治療する方法に関する。
さらに別の態様では、対象に、有効量の、本明細書に記載のキメラ分子を含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）を投与することを含む、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を治療する方法を特徴とする。
関連する態様では、本発明は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を治療する方法を特徴とする。本方法は、免疫細胞の効力を増加させる作用物質と組み合わせて、有効量の、キメラ分子を含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）を対象に投与することを含む。別の態様では、本発明は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば本明細書に記載の障害を有する対象の治療で使用するための、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の）を含む免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）を含む組成物を特徴とする。
前述の方法又は使用のいずれかの特定の実施形態では、腫瘍抗原、例えば本明細書に記載の腫瘍抗原に関連する疾患は、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄異形成、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌状態から選択され、或いは本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する非癌性適応症である。一実施形態では、疾患は、本明細書に記載の癌、例えば本明細書に記載の標的に関連するような本明細書に記載の癌である。一実施形態では、疾患は、血液癌である。一実施形態では、血液癌は、白血病である。一実施形態では、癌は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）が挙げられるが、これらに限定されない１つ以上の急性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに限定されない１つ以上の慢性白血病、Ｂ細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞又は大細胞性濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症及び骨髄性血液細胞の無効な産生（又は異形成）によって合併された血液学的状態の多様な集合である「前白血病」が挙げられるが、これらに限定されない追加の血液癌若しくは血液学的状態及び本明細書に記載の腫瘍抗原を発現する異型並びに／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態若しくは増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する疾患並びにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、本明細書に記載の腫瘍抗原に関連する疾患は、固形腫瘍である。
前述の方法又は使用のいずれかの特定の実施形態では、疾患に関連する腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＦＡＰ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチルＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン並びにテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５及びＩＧＬＬ１の１つ以上から選択される。
前述の方法又は使用のいずれかの他の実施形態では、疾患に関連する腫瘍抗原は、ＴＳＨＲ、ＴＳＨＲ、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、ＦＬＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５及びＩＧＬＬ１の１つ以上から選択される。
前述の方法又は使用のいずれかの他の実施形態では、疾患に関連する腫瘍抗原は、ＴＳＨＲ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ及びＯＲ５１Ｅ２の１つ以上から選択される。
特定の実施形態では、本方法又は使用は、免疫エフェクター細胞の効力を増加させる作用物質、例えば本明細書に記載の作用物質と組み合わせて行われる。
前述の方法又は使用のいずれかにおいて、腫瘍抗原の発現に関連する疾患は、増殖性疾患、前癌状態、癌及び腫瘍抗原の発現に関連する非癌性適応症からなる群から選択される。
癌は、血液癌、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞又は大細胞性濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症又は前白血病の１つ以上から選択される癌であり得る。
癌は、大腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸癌、食道癌、黒色腫、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚又は眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発癌、前記癌の組み合わせ及び前記癌の転移性病巣から選択することもできる。
本明細書に記載の方法又は使用の特定の実施形態では、キメラ分子は、免疫エフェクター細胞の効力を増加させる作用物質、例えばタンパク質ホスファターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、サイトカイン、免疫抑制分子の阻害剤又はＴＲＥＧ細胞のレベル若しくは活性を減少させる作用物質の１つ以上と組み合わせて投与される。
本明細書に記載の方法又は使用の特定の実施形態では、タンパク質ホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ－１阻害剤及び／又はＳＨＰ－２阻害剤である。
本明細書に記載の方法又は使用の特定の実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）、ＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブ若しくはＲＮ－４８６）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン若しくはエベロリムス（ＲＡＤ００１））、ＭＮＫ阻害剤又は二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤の１つ以上から選択される。一実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、インターロイキン－２－誘導性キナーゼ（ＩＴＫ）のキナーゼ活性を低減又は阻害しない。
本明細書に記載の方法又は使用の他の実施形態では、免疫抑制分子を阻害する作用物質は、抑制分子の発現を阻害する抗体若しくは抗体フラグメント、抑制核酸、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。
本明細書に記載の方法又は使用の他の実施形態では、ＴＲＥＧ細胞のレベル又は活性を減少させる作用物質は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇型又はこれらの組み合わせから選択される。
本明細書に記載の方法又は使用の特定の実施形態では、免疫抑制分子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦβ、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及びＣＥＡＣＡＭ－５からなる群から選択される。
他の実施形態では、抑制分子を阻害する作用物質は、抑制分子又はそのフラグメントを含む第１のポリペプチドと、細胞に陽性シグナルを提供する第２のポリペプチドとを含み、第１及び第２のポリペプチドは、ＣＡＲ含有免疫細胞上で発現され、（ｉ）第１のポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦβ、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及びＣＥＡＣＡＭ－５又はこれらのフラグメントを含み、且つ／又は（ｉｉ）第２のポリペプチドは、一次シグナル伝達ドメイン及び／若しくは共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの機能的ドメインを含み、且つ／又は共刺激シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ、ＣＤ２７及びＣＤ２８から選択されるタンパク質の機能的ドメインを含む。
他の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－７、ＩＬ－１５若しくはＩＬ－２１又は両方から選択される。
他の実施形態では、免疫エフェクター細胞及び第２の例えば本明細書に記載の併用療法のいずれか（例えば、免疫エフェクター細胞の効力を増加させる作用物質）は、実質的に同時に又は逐次的に投与される。
一実施形態では、リンパ球輸注法、例えば同種異系リンパ球輸注法が癌の治療で使用され、リンパ球輸注法は、本発明の少なくとも１つの細胞を含む。一実施形態では、自己リンパ球輸注法が癌の治療で使用され、自己リンパ球輸注法は、本明細書に記載の少なくとも１つの細胞を含む。
一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、このＴ細胞は、ジアグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損である。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、このＴ細胞は、イカロス欠損である。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、このＴ細胞は、ＤＧＫ及びイカロスの両方が欠損している。
一実施形態では、本方法は、本明細書に記載の細胞を発現する細胞を、このような細胞の活性を増強する作用物質と組み合わせて投与することを含み、この作用物質は、サイトカイン、例えばＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１又はこれらの組み合わせである。サイトカインは、細胞と組み合わせて、例えば細胞の投与と同時に又は細胞の投与の直後に送達され得る。或いは、サイトカインは、細胞の投与から長期間後、例えば対象の細胞に対する応答の評価後に送達され得る。一実施形態では、サイトカインは、対象に対し、請求項６１～８０のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団と同時に投与される（例えば、同日に投与される）か、又は投与直後に投与される（例えば、投与後１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目又は７日目に投与される）。他の実施形態では、対象に対し、請求項６１～８０のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団の投与から長期間後（例えば、例として少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間又はそれを超えて後）或いは対象の細胞に対する応答の評価後に投与される。
他の実施形態では、細胞は、細胞の投与に関連する１つ以上の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。細胞に関連する副作用は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）又は血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）から選択することができる。
前述の方法又は使用のいずれかの実施形態では、分子を発現する細胞は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を治療する作用物質、例えば本明細書に開示される第２又は第３の療法のいずれかと組み合わせて投与される。追加の例示的な組み合わせは、下記の１つ以上を含む。
別の実施形態では、分子、例えば本明細書に記載されるような分子を発現する細胞は、別の作用物質、例えば本明細書に記載のキナーゼ阻害剤及び／又はチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することができる。実施形態では、細胞は、別の作用物質、例えばキメラタンパク質発現細胞の活性を増強する作用物質をさらに発現することができる。
例えば、一実施形態では、細胞の活性を増強する作用物質は、抑制分子（例えば、免疫抑制分子）を阻害する作用物質であり得る。抑制分子の例としては、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦβが挙げられる。
一実施形態では、抑制分子を阻害する作用物質は、抑制核酸であり、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。実施形態では、抑制核酸は、キメラ分子の構成成分をコードする核酸に結合している。例えば、抑制分子は、細胞上で発現され得る。
別の実施形態では、抑制分子を阻害する作用物質は、例えば、本明細書に記載の分子であり、例えば第１のポリペプチド、例えば陽性シグナルを細胞、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインに提供する第２のポリペプチドに関連する抑制分子を含む作用物質である。一実施形態では、作用物質は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４若しくはＴＧＦβなどの抑制分子又はこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）の第１のポリペプチドと、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインである（例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載されるような４１ＢＢ、ＣＤ２７若しくはＣＤ２８）及び／又は一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む。一実施形態では、作用物質は、ＰＤ１又はそのフラグメント（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）の第１のポリペプチドと、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び／又は本明細書に記載のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）の第２のポリペプチドとを含む。
一実施形態では、本発明の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、以前の幹細胞移植、例えば自己幹細胞移植を受けている対象に投与される。
一実施形態では、本発明の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、以前のメルファランの投与を受けた対象に投与される。
一実施形態では、本明細書に記載の細胞は、細胞の効力を増加させる作用物質、例えば本明細書に記載の作用物質と組み合わせて投与される。
一実施形態では、本明細書に記載の細胞は、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量と組み合わせて投与される。理論に束縛されることを望むものではないが、低い免疫増強用量（例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能を改善するのに十分である用量）による治療は、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の減少又はＰＤ－１陰性細胞の増加を伴うと考えられる。ＰＤ－１陰性Ｔ細胞ではなく、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞は、ＰＤ－１リガンド、例えばＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２を発現する細胞とのエンゲージメントによって枯渇する可能性がある。
実施形態では、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えばアロステリック型阻害剤、例えばＲＡＤ００１又は触媒的阻害剤の投与は、本明細書に記載の細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の投与前に開始される。実施形態では、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞のレベル又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比が少なくとも一時的に増加しているように、細胞は、ｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間又は十分な投与が行われた後に投与される。
一実施形態では、本明細書に記載の細胞は、本明細書に記載の投与量及び／又は投与スケジュールで投与される。
別の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のキメラタンパク質をコードする単離核酸分子、本発明の１つ以上のキメラタンパク質の単離ポリペプチド分子、本発明の１つ以上のキメラタンパク質をコードする核酸を含むベクター及び医薬品として使用するための、本発明の１つ以上のキメラタンパク質を含む細胞に関する。
前述の方法又は使用のいずれかにおいて、腫瘍担持抗原の発現に関連する疾患は、増殖性疾患、前癌状態、癌及び腫瘍担持抗原の発現に関連する非癌性関連適応症からなる群から選択される。実施形態では、本明細書に記載の腫瘍担持抗原に関連する疾患は、固形腫瘍である。
本明細書に記載の方法又は使用の一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、別の作用物質と組み合わせて投与される。一実施形態では、作用物質は、キナーゼ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＮＫ阻害剤又は二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤及びこれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば本明細書に記載のＣＤＫ４阻害剤、例えばＣＤ４／６阻害剤（例えば、６－アセチル－８－シクロペンチル－５－メチル－２－（５－ピペラジン－１－イル－ピリジン－２－イルアミノ）－８Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－オン、塩酸塩（パルボシクリブ又はＰＤ０３３２９９１とも称される）など）である。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブなど）である。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば本明細書に記載のｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ＯＳＩ－０２７など）である。このｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤及び／又はｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば本明細書に記載のｍＴＯＲＣ１阻害剤及び／又はｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば本明細書に記載のＭＮＫ阻害剤（例えば、４－アミノ－５－（４－フルオロアニリノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジンなど）である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａ及び／又はＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ＰＦ－０４６９５１０２であり得る。
本明細書に記載の方法又は使用の一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドール又はＨＭＲ－１２７５、２－（２－クロロフェニル）－５，７－ジヒドロキシ－８－［（３Ｓ，４Ｒ）－３－ヒドロキシ－１－メチル－４－ピペリジニル］－４－クロメノン；クリゾチニブ（ＰＦ－０２３４１０６６；２－（２－クロロフェニル）－５，７－ジヒドロキシ－８－［（２Ｒ，３Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）－１－メチル－３－ピロリジニル］－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン、塩酸塩（Ｐ２７６－００）；１－メチル－５－［［２－［５－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－４－ピリジニル］オキシ］－Ｎ－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－アミン（ＲＡＦ２６５）；インジスラム（Ｅ７０７０）；ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）；パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）；デイナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）；Ｎ－［５－［［（５－ｔｅｒｔ－ブチルオキサゾール－２－イル）メチル］チオ］チアゾール－２－イル］ピペリジン－４－カルボキサミド（ＢＭＳ３８７０３２）；４－［［９－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５Ｈ－ピリミド［５，４－ｄ］［２］ベンザゼピン－２－イル］アミノ］－安息香酸（ＭＬＮ８０５４）；５－［３－（４，６－ジフルオロ－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イル）－１Ｈ－インダゾール－５－イル］－Ｎ－エチル－４－メチル－３－ピリジンメタンアミン（ＡＧ－０２４３２２）；４－（２，６－ジクロロベンゾイルアミノ）－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボン酸Ｎ－（ピペリジン－４－イル）アミド（ＡＴ７５１９）；４－［２－メチル－１－（１－メチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－Ｎ－［４－（メチルスルホニル）フェニル］－２－ピリミジンアミン（ＡＺＤ５４３８）；及びＸＬ２８１（ＢＭＳ９０８６６２）から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
本明細書に記載の方法又は使用の一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；リダホロリムス（ＡＰ２３５７３及びＭＫ８６６９としても知られる）（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－［（２Ｒ）－２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ、２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３、２９，３５－ヘキサメチル－２，３，１０，１４，２０－ペンタオキソ－１１，３６－ジオキサ－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－１２－イル］プロピル］－２－メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィン酸エステル；エベロリムス（ＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９）；セマピモド（ｓｉｍａｐｉｍｏｄ）；（５－｛２，４－ビス［（３Ｓ）－３－メチルモルホリン－４－イル］ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル｝－２－メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２－アミノ－８－［トランス－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン（ＰＦ０４６９１５０２）；及びＮ２－［１，４－ジオキソ－４－［［４－（４－オキソ－８－フェニル－４Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）モルホリニウム－４－イル］メトキシ］ブチル］－Ｌ－アルギニルグリシル－Ｌ－α－アスパルチルＬ－セリン－（配列番号３９として開示される「ＲＧＤＳ」）；分子内塩（ＳＦ１１２６）；並びにＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
本明細書に記載の方法又は使用の一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８；４－アミノ－３－（ｐ－フルオロフェニルアミノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン（ＣＧＰ５７３８０）；セルコスポラミド；ＥＴＣ－１７８０４４５－２；及び４－アミノ－５－（４－フルオロアニリノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
本明細書に記載の方法又は使用の一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、２－アミノ－８－［トランス－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン（ＰＦ－０４６９１５０２）；Ｎ－［４－［［４－（ジメチルアミノ）－１－ピペリジニル］カルボニル］フェニル］－Ｎ’－［４－（４，６－ジ－４－モルホリニル－１，３，５－トリアジン－２－イル）フェニル］尿素（ＰＦ－０５２１２３８４、ＰＫＩ－５８７）；２－メチル－２－｛４－［３－メチル－２－オキソ－８－（キノリン－３－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］フェニル｝プロピオニトリル（ＢＥＺ－２３５）；アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０、ＲＧ７４２２）；２，４－ジフルオロ－Ｎ－｛２－（メチルオキシ）－５－［４－（４－ピリダジニル）－６－キノリニル］－３－ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド（ＧＳＫ２１２６４５８）；８－（６－メトキシピリジン－３－イル）－３－メチル－１－（４－（ピペラジン－１－イル）－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２（３Ｈ）－オンマレイン酸（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）；３－［４－（４－モルホリニルピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）フェノール（ＰＩ－１０３）；５－（９－イソプロピル－８－メチル－２－モルホリノ－９Ｈ－プリン－６－イル）ピリミジン－２－アミン（ＶＳ－５５８４、ＳＢ２３４３）；及びＮ－［２－［（３，５－ジメトキシフェニル）アミノ］キノキサリン－３－イル］－４－［（４－メチル－３－メトキシフェニル）カルボニル］アミノフェニルスルホンアミド（ＸＬ７６５）から選択される二重ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びｍＴＯＲ阻害剤である。
本明細書に記載の方法又は使用の一実施形態では、本明細書に記載の免疫エフェクター細胞は、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば本明細書に記載のタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて対象に投与される。一実施形態では、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ－１阻害剤、例えば本明細書に記載のＳＨＰ－１阻害剤（例えば、スチボグルコン酸ナトリウムなど）である。一実施形態では、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ－２阻害剤である。
本明細書に記載の方法又は使用の一実施形態では、キメラ分子は、別の作用物質と組み合わせて投与され、この作用物質は、サイトカインである。サイトカインは、例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１又はこれらの組み合わせであり得る。別の実施形態では、ＣＡＲ分子は、チェックポイント阻害剤、例えば本明細書に記載のチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。例えば、一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦβから選択される抑制分子を阻害する。
キメラタンパク質及びキメラタンパク質系発現細胞の作製方法
別の態様では、本発明は、細胞、例えば本明細書に記載のＴ細胞又はＮＫ細胞に、ポリペプチド又は系（例えば、本明細書に記載の）をコードする核酸を含むベクターを導入する（例えば、形質導入する）ことを含む、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞若しくはその集団）又はポリペプチド若しくは系（例えば、本明細書に記載の）をコードする核酸を作製する方法に関する。
本方法における細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞若しくはこれらの組み合わせ）である。いくつかの実施形態では、本方法における細胞は、ジアグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）及び／又はイカロス欠損である。
いくつかの実施形態では、核酸分子を導入することは、ポリペプチド若しくは系（例えば、本明細書に記載の）をコードする核酸分子を含むベクターを形質導入すること、又はポリペプチド若しくは系（例えば、本明細書に記載の）をコードする核酸分子をトランスフェクトすることを含み、この核酸分子は、インビトロ転写ＲＮＡである。
他の実施形態では、細胞の集団は、細胞の表面上の共刺激分子を刺激するシグナル及び／又はリガンドに関連するＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する作用物質の存在下で細胞を培養することによって増殖される。この作用物質は、抗ＣＤ３抗体若しくはそのフラグメント及び／又は抗ＣＤ２８抗体若しくはそのフラグメントと結合したビーズであり得る。
他の実施形態では、細胞の集団は、フローサイトメトリーによって測定したとき、１４日間の増殖期間にわたり、細胞において少なくとも２００倍、２５０倍、３００倍又は３５０倍の増加をもたらす、１つ以上のインターロイキンを含む適切な培地中で増殖される。
他の実施形態では、細胞の集団は、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－７の存在下で増殖される。
特定の実施形態では、本方法は、適切な増殖期間後に細胞の集団を凍結保存することをさらに含む。
さらに他の実施形態では、本明細書に開示される作製方法は、免疫エフェクター細胞の集団を、テロメラーゼサブユニット、例えばｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることをさらに含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡであり得る。
本発明は、ＲＮＡ操作細胞、例えば本明細書に記載の細胞、例えば免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の集団を生成し、外因性ＲＮＡを一過性発現させる方法も提供する。
別の態様では、本発明は、有効量の本明細書に記載されるような細胞を対象に投与することを含む、対象において抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。一実施形態では、細胞は、自己Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。一実施形態では、細胞は、同種異系Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。一実施形態では、対象は、ヒトである。
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるような核酸分子を含むベクターでトランスフェクト又は形質導入されている自己細胞の集団を含む。一実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターは、本明細書の他の箇所に記載されているような自己不活性化レンチウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターは、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に送達され（例えば、トランスフェクション又はエレクトロポレーションによって）、ベクターは、ｍＲＮＡ分子として転写されている、本明細書に記載されるようなポリペプチドをコードする核酸分子を含み、本発明のキメラタンパク質は、このＲＮＡ分子から翻訳され、細胞の表面上で発現される。
一実施形態では、本発明の分子の核酸分子（例えば、本明細書に記載されるような）は、ｍＲＮＡ分子として発現される。一実施形態では、本発明の発現細胞、例えば免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、所望のタンパク質をコードするＲＮＡ分子を細胞にトランスフェクション又はエレクトロポレーションする（例えば、ベクター配列なしに）ことによって生成することができる。一実施形態では、本発明の分子のキメラタンパク質は、このＲＮＡ分子が組み込まれ、組換え細胞の表面上で発現されると、ＲＮＡ分子から翻訳される。
特定の態様では、前述のキメラタンパク質（例えば、本明細書に記載の系の）は、同じフレーム内の単一の核酸分子により、単一のポリペプチド鎖としてコードされる。この態様では、タンパク質は、例えば、１つ以上のペプチド切断部位（例えば、自己切断部位又は細胞内プロテアーゼの基質）によって分離され得る。ペプチド切断部位の例としては、以下が挙げられ、ここで、ＧＳＧ残基は、任意選択である。
Ｔ２Ａ：（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号４０）
Ｐ２Ａ：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号４１）
Ｅ２Ａ：（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４２）
Ｆ２Ａ：（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４３）
関連する態様では、本発明は、２つのキメラポリペプチドをコードする、上述したような単一タンパク質を特徴とする。
他の態様では、前述のポリペプチド（例えば、系の）は、単一の又は複数の核酸分子によってコードされ、単一のポリペプチドとして発現されない。ここで、例えば、ポリペプチドは、共通のプロモーターによって制御されるか、又は配列内リボソーム進入部位によって分離され得る。或いは、２つのタンパク質の発現は、例えば、別個のプロモーターによって制御され得る。
さらに別の態様では、本発明は、異なるキメラタンパク質（例えば、系の）をコードする前述の核酸分子を含む１つ以上のベクター（例えば、上述のベクターのいずれか）を特徴とする。
構成的活性化ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティング及び共刺激ドメインは、細胞内ヘテロ二量体化ドメインとの融合、及び第２のヘテロ二量体化ドメインと融合したＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバーによる同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。 細胞内ヘテロ二量体化ドメインを含む抗原活性化ＴＣＡＲのＪＮＬシグナル伝達及びＩＬ２発現を示すグラフの対である。 表示の構築物でトランスフェクトした細胞における表示細胞殺傷のパーセンテージをトランスフェクションの関数として示すグラフの対である。 表示の構築物におけるトランスフェクションの関数としてＩＬ－２発現の濃度を示すグラフである。 増殖増大を伴う構成的活性化ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティング及び共刺激ドメインは、細胞内ヘテロ二量体化ドメインとの融合、及び第２の共刺激ドメインと、第２のヘテロ二量体化ドメインとに融合したＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバーの細胞外及び膜貫通ドメインによる同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。第３世代ＣＡＲと異なり、この配向は、両方の共刺激メンバーを膜近位にし、増殖能力をさらに増強するはずである。 構成的活性化ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。天然の細胞外ドメインを含むか又は含まない共刺激受容体は、細胞内ヘテロ二量体化ドメインとの融合、及び第２の細胞内ヘテロ二量体化ドメインと融合したＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバーに融合したターゲティングドメインによる同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。 構成的活性化ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。細胞質ゾル共刺激ドメインは、細胞内ヘテロ二量体化ドメインとの融合、及び第２の細胞内ヘテロ二量体化ドメインと融合したＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバーに融合したターゲティングドメインによる同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。 構成的活性化ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティング及び共刺激ドメインは、ＴＣＲ複合体のメンバーに結合する細胞内ドメインとの融合によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。 構成的活性化ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティング及び共刺激ドメインは、ＴＣＲ複合体のメンバーに結合する細胞外ドメインとの融合によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。 構成的活性化キメラ抗原受容体ＴＣＲ融合物（ｆｕｓＴＣＡＲ）を示す概略図である。抗体に由来するターゲティングドメインのＶＬ及びＶｈは、内在性切断型α及びβＴＣＲとの直接融合によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。 構成的活性化キメラ抗原受容体ＴＣＲ融合物（ｆｕＴＣＡＲ）を示す概略図である。抗体に由来するターゲティングドメインのＶＬ及びＶｈは、内在性切断型α及びβＴＣＲとの直接融合、続いて１つ以上の共刺激ドメインの細胞内融合によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。 構成的活性化キメラ抗原受容体ＴＣＲ融合物（ｆｕｓＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティングドメインは、ＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバーとの直接融合によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。 構成的活性化キメラ抗原受容体ＴＣＲ融合物（ｆｕｓＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティングドメインは、ＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバー、続いて４－１ＢＢなどの１つ以上の細胞内共刺激ドメイン又はその機能的変異体との直接融合によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。 構成的活性化キメラ抗原受容体ＴＣＲ融合物（ｆｕｓＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティングドメインは、ＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバーの細胞外及び膜貫通ドメイン、続いて４－１ＢＢなどの１つ以上の細胞内共刺激ドメイン又はその機能的変異体との直接融合によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。 活性化ｆｕｓＴＣＡＲのＪＮＬシグナル伝達及びＩＬ２発現を示すグラフである。 表示の構築物でトランスフェクトした細胞による表示細胞の特異的殺傷のパーセンテージをトランスフェクションの関数として示す一連のグラフである。 表示の構築物によるトランスフェクションの関数としてＩＬ－２発現を示すグラフである。 表示の構築物でトランスフェクトした細胞における表示細胞殺傷のパーセンテージをトランスフェクションの関数として示すグラフの対である。 表示の構築物におけるトランスフェクションの関数としてＩＬ－２発現の濃度を示すグラフである。 増殖増大を伴う調節可能なＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ｒＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティング及び共刺激ドメインは、細胞内ヘテロ二量体化スイッチドメインとの融合、及び第２の共刺激ドメインと、第２のヘテロ二量体化スイッチドメインとに融合したＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバーの細胞外及び膜貫通ドメインによる同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。シグナル伝達は、ラパログなどのスイッチ分子の添加時に誘導される。 調節可能なＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ｒＴＣＡＲ）を示す概略図である。天然の細胞外ドメインを含むか又は含まない共刺激受容体は、細胞内ヘテロ二量体化スイッチドメインとの融合、及び第２の細胞内ヘテロ二量体化スイッチドメインと融合したＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバーに融合したターゲティングドメインによる同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。増殖は、ラパログなどのスイッチ分子の添加時に誘導される。 構成的活性化ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティング及び共刺激ドメインは、細胞内ヘテロ二量体化スイッチドメインとの融合、及び共刺激受容体の膜貫通及び細胞内ドメインと、第２のヘテロ二量体化スイッチドメインとに融合した、ＴＣＲ複合体のメンバーに結合する細胞外ドメインによる同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。シグナル伝達は、ラパログなどのスイッチ分子の添加時に誘導される。 構成的活性化ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティング及び共刺激ドメインは、細胞内ヘテロ二量体化スイッチドメインとの融合、及び第２のヘテロ二量体化スイッチドメインと、ＴＣＲ複合体のメンバーに結合する細胞内ドメインとに融合した、その天然の細胞外ドメインを含むか又は含まない共刺激受容体による同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。シグナル伝達は、ラパログなどのスイッチ分子の添加時に誘導される。 構成的活性化ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティング及び共刺激ドメインは、細胞内ヘテロ二量体化スイッチドメインとの融合、及び第２のヘテロ二量体化スイッチドメインと、ＴＣＲ複合体のメンバーに結合する細胞内ドメインとに融合した、細胞質ゾル共刺激ドメインによる同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。シグナル伝達は、ラパログなどのスイッチ分子の添加時に誘導される。 調節可能なＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティング及び共刺激ドメインは、細胞内ヘテロ二量体化スイッチドメインとの融合、及び第２のヘテロ二量体化スイッチドメインと融合したＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバーによる同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。シグナル伝達は、ラパログなどのスイッチ分子の添加時に誘導される。 調節可能なＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ｒＴＣＡＲ）を示す概略図である。ターゲティング及び共刺激ドメインは、細胞内ヘテロ二量体化スイッチドメインとの融合、及び第２のヘテロ二量体化スイッチドメインと融合したＣＤ３εなどの内在性ＴＣＲ複合体メンバーによる同時トランスフェクション／同時形質導入によってＴＣＲ複合体内に埋め込まれる。シグナル伝達は、ラパログなどのスイッチ分子の添加時に誘導される。シグナル伝達がＴＣＲ複合体の他のメンバーによって誘導されることを実証するために、ＣＤ３ε融合物からのＩＴＡＭドメインをフェニルアラニンに変異させた。 ＲＡＤ００１で誘導した抗原活性化ＦＫＢＰ／ＦＲＰｒＴＣＡＲのＪＮＬシグナル伝達及びＩＬ２発現を示す一連のグラフである。 ＣＤ３ｅＩＴＡＭシグナル伝達のノックアウトを含む及び含まないラパログ媒介抗原活性化ＦＫＢＰ／ＦＲＰｒＴＣＡＲについてのＪＮＬシグナル伝達及びＩＬ２発現の比較を示す一連のグラフである。 表示の構築物でトランスフェクトした細胞における表示細胞殺傷のパーセンテージをトランスフェクションの関数として示すグラフの対である。 表示の構築物におけるトランスフェクションの関数としてのＩＬ－２発現の濃度を示すグラフである。 表示の構築物でトランスフェクトした細胞における表示細胞殺傷のパーセンテージをトランスフェクションの関数として示すグラフの対である。 表示の構築物におけるトランスフェクションの関数としてのＩＬ－２発現の濃度を示すグラフである。 ＮＦＡＴリポータ遺伝子系により生成される光強度を示すグラフである。抗イディオタイプ抗体は、発現されたｓｃＦｖに結合する。 表示の構築物でトランスフェクトした細胞における表示細胞殺傷のパーセンテージをトランスフェクションの関数として示すグラフの対である。 表示の構築物におけるトランスフェクションの関数としてのＩＬ－２発現の濃度を示すグラフである。 左側パネルは、表示の構築物でトランスフェクトした細胞における表示細胞殺傷のパーセンテージをトランスフェクションの関数として示すグラフである。右側パネルは、表示の発現条件下において表示の構築物を発現する細胞の数を示す一連のグラフである。 表示の構築物でトランスフェクトした細胞における表示細胞殺傷のパーセンテージをトランスフェクションの関数として示すグラフである。 表示の構築物におけるトランスフェクションの関数としてのＩＬ－２発現の濃度を示すグラフである。 表示の構築物でトランスフェクトした細胞における表示細胞殺傷のパーセンテージをトランスフェクションの関数として示すグラフである。 表示の構築物におけるトランスフェクションの関数としてのＩＬ－２発現の濃度を示すグラフである。 本発明の様々な態様で使用するキメラ膜タンパク質の種々の例を示す。本発明の系態様において、２つ以上のキメラ膜タンパク質を一緒に使用し、例えば細胞内で一緒に発現させる。 本発明の系からアセンブリングしたＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ＴＣＡＲは、第１及び第２の抗原結合ドメイン（ここでは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインとして描かれる）と、ＣＤ３εタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質及びＣＤ３γタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質との融合によって２つの抗原に対する特異性を有する。共刺激シグナル伝達ドメインは、１つ以上のキメラ膜分子の細胞内部分にさらに融合している。例えば、Ｔ細胞への両方のキメラ膜タンパク質の同時トランスフェクション／同時形質導入により、２つの異種キメラタンパク質を含むＴＣＲが形成され、これによりＴＣＲ／細胞に対する二重抗原特異性及び抗原結合時のＣＤ３ζシグナル伝達と共刺激シグナル伝達との両方がもたらされる。 本発明の系からアセンブリングしたＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ＴＣＡＲは、第１及び第２の抗原結合ドメイン（ここでは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインとして描かれる）と、ＣＤ３εタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質及びＣＤ３δタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質との融合によって２つの抗原に対する特異性を有する。共刺激シグナル伝達ドメインは、１つ以上のキメラ膜分子の細胞内部分にさらに融合している。例えば、Ｔ細胞への両方のキメラ膜タンパク質の同時トランスフェクション／同時形質導入により、２つの異種キメラタンパク質を含むＴＣＲが形成され、これによりＴＣＲ／細胞に対する二重抗原特異性及び抗原結合時のＣＤ３ζシグナル伝達と共刺激シグナル伝達との両方がもたらされる。 本発明の系からアセンブリングしたＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ＴＣＡＲは、第１及び第２の抗原結合ドメイン（ここでは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインとして描かれる）と、ＣＤ３δタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質及びＣＤ３γタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質との融合によって２つの抗原に対する特異性を有する。共刺激シグナル伝達ドメインは、１つ以上のキメラ膜分子の細胞内部分にさらに融合している。例えば、Ｔ細胞への両方のキメラ膜タンパク質の同時トランスフェクション／同時形質導入により、２つの異種キメラタンパク質を含むＴＣＲが形成され、これによりＴＣＲ／細胞に対する二重抗原特異性及び抗原結合時のＣＤ３ζシグナル伝達と共刺激シグナル伝達との両方がもたらされる。 本発明の系からアセンブリングしたＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ＴＣＡＲは、第１、第２及び第３の抗原結合ドメイン（ここでは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインとして描かれる）と、ＣＤ３δタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質、ＣＤ３εタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質、及びＣＤ３γタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質との融合によって３つの抗原に対する特異性を有する。共刺激シグナル伝達ドメインは、１つ以上のキメラ膜分子の細胞内部分にさらに融合している。例えば、Ｔ細胞への両方のキメラ膜タンパク質の同時トランスフェクション／同時形質導入によって２つの異種キメラタンパク質を含むＴＣＲが形成され、これによりＴＣＲ／細胞に対する二重抗原特異性及び抗原結合時のＣＤ３ζシグナル伝達と共刺激シグナル伝達との両方がもたらされる。 本発明の系からアセンブリングしたＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）を示す概略図である。ＴＣＡＲは、第１及び第２の抗原結合ドメイン（ここでは、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインとして描かれる）と、ＣＤ３γタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質（ここでは、タンデムｓｃＦｖ融合として示される）との融合、及びＣＤ３δタンパク質の細胞外部分を含むタンパク質と融合した第３の抗原結合ドメインによって３つの抗原に対する特異性を有する。共刺激シグナル伝達ドメインは、１つ以上のキメラ膜分子の細胞内部分にさらに融合している。例えば、Ｔ細胞への両方のキメラ膜タンパク質の同時トランスフェクション／同時形質導入によって２つの異種キメラタンパク質を含むＴＣＲが形成され、これによりＴＣＲ／細胞に対する二重抗原特異性及び抗原結合時のＣＤ３ζシグナル伝達と共刺激シグナル伝達との両方がもたらされる。 図４７Ａ－４７ＤはＪＮＬ細胞上のＴＣＡＲの発現を示すフローサイトメトリープロットのパネルである。非形質導入ＪＮＬ（ＵＴＤ）、ＣＤ１９－ＴＣＡＲ、ＣＤ２２－ＴＣＡＲ又はＣＤ１９－ＴＣＡＲ及びＣＤ２２－ＴＣＡＲ（ＣＤ１９／２２二重ＴＣＡＲ）形質導入細胞をＣＤ１９－ＣＡＲ抗イディオタイプＡｂ及びＣＤ２２－Ｆｖで染色してから、フローサイトメトリーによりアッセイした。左上象限内の数は、ＣＤ２２－ＴＣＡＲの発現レベルを表し、右下象限内の数は、ＣＤ１９－ＴＣＡＲの発現レベルを表す（幾何平均）。 図４８Ａ－４８ＣはＴＣＡＲの機能を試験する、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴルシフェラーゼ（ＪＮＬ）リポータアッセイからの結果を示す棒グラフのパネルである。非形質導入ＪＮＬ（ＵＴＤ）、ＣＤ１９－ＴＣＡＲ、ＣＤ２２－ＴＣＡＲ又はＣＤ１９－ＴＣＡＲ及びＣＤ２２－ＴＣＡＲ（ＣＤ１９／２２二重ＴＣＡＲ）形質導入細胞を慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＷＴ）又はＣＤ１９（Ｋ５６２－ＣＤ１９）若しくはＣＤ２０（Ｋ５６２－ＣＤ２０）を過剰発現するように操作されたＫ５６２細胞と共培養した。表示の腫瘍：ＪＮＬ細胞比の各ＪＮＬ細胞株についてルミネッセンス（ＲＬＵ）を示す。
本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を調節するためのキメラＣＤ３タンパク質の使用を特徴とする。具体的には、本発明は、一部には、それらの細胞外ドメインのすべて又は大部分を抗原結合ドメインに融合させたキメラＣＤ３タンパク質（例えば、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ及びＣＤ３ε）が同族抗原の存在下でＴＣＲを活性化できるという発見に基づいている。本発明は、上記キメラタンパク質がキメラ分子の細胞内部分における共刺激ドメインの組み入れを通して増強され得るという観察にさらに基づいている。従って、本発明の操作されたシグナル伝達複合体の好ましい要素は、抗原結合ドメイン、上記ＣＤ３タンパク質の１つに由来する細胞外ドメイン及び細胞内共刺激ドメインを含む。興味深いことに、本発明は、これらの要素が、抗原ベースのＴＣＲシグナル伝達を達成するために単一のポリペプチド中に存在する必要がないという発見にさらに基づいている。実際には、抗原結合ドメイン及び／又は共刺激ドメインのいずれかは、第２のキメラ分子に操作され、第２のキメラ分子及びＣＤ３分子が、本明細書に記載されるように、誘導型又は構成型二量体又はドメインのいずれかを介して結合されることを条件として、依然としてシグナル伝達を達成することができる。
ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（ＴＣＡＲ）は、従来のキメラ抗原受容体に対して固有の有益性を提供することができる。従来のキメラ抗原受容体は、標的ドメイン、それに続くヒンジ、膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン及びＣＤ３ζなどのシグナル伝達ドメインを含む単一の連続鎖分子である。標的ドメインをＴＣＲ複合体の一部として作製することにより、ＴＣＡＲによって誘導されるシグナル伝達は、ＴＣＲ複合体内の補助タンパク質の経路全体を利用し、例えばＣＡＲ鎖上のＣＤ３ζからの従来のＣＡＲによって提供される排他的なシグナル伝達に限定されない。Ｔ細胞活性化及び増殖のための天然の経路では、関与する細胞内経路のメンバーは、膜の近位にあるが、これは、従来のＣＡＲフォーマットでは共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインの両方にとって不可能であり、ＴＣＡＲは、Ｔ細胞に操作されるのに最適な配向を可能にする。
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つ又は１つより多い（即ち少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
用語「約」は、量、時間的な継続期間などの計測可能な値を参照するとき、指定される値から±２０％又は一部の例では±１０％、又は一部の例では±５％、又は一部の例では±１％、又は一部の例では±０．１％の変動が、かかる変動が本開示の方法の実施に適切であるものとして包含されることを意味する。
用語「自己」は、同じ個体に由来する任意の材料であって、後にその個体に再導入されることになる材料を指す。
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系であると言われる。一部の態様において、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。
用語「異種」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
用語「癌」は、異常細胞の無制御の成長によって特徴付けられる疾患を指す。癌細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を通じて体の他の部位に広がり得る。様々な癌の例が本明細書に記載され、限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられる。用語「腫瘍」及び「癌」は、本明細書では同義的に使用され、例えば、両方の用語とも固形及び液性、例えばびまん性又は循環性腫瘍を包含する。本明細書で使用されるとき、用語「癌」又は「腫瘍」は、前癌性並びに悪性の癌及び腫瘍を含む。
語句「本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する疾患」は、限定されないが、例えば癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態を含めた、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する疾患又は本明細書に記載の腫瘍抗原を発現する細胞に関連する病状又は本明細書に記載の腫瘍抗原を発現する細胞に関連する非癌関連の適応症を含む。一態様において、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現と関連する癌は、血液癌である。一態様において、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現と関連する癌は、固形癌である。さらに、本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する疾患には、限定されないが、例えば本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する非定型の及び／又は非古典的な癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患が含まれる。本明細書に記載の腫瘍抗原の発現に関連する非癌関連徴候には、限定されないが、例えば自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）及び移植が含まれる。一部の実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、又はいずれかの時点で発現した。実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型又は突然変異体）を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常レベル又は低下したレベルで存在し得る。実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、一時的に検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生したが、続いて検出可能な腫瘍抗原タンパク質を実質的に産生しなくなった。
用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含む抗体又は抗体断片の結合特性が大きい影響又は変化を被ることのないアミノ酸改変を指す。かかる保存的改変には、アミノ酸置換、付加及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発など、当技術分野において公知の標準技法によって本発明の抗体又は抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、本発明のＣＡＲ内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換えることができ、及び変化したＣＡＲは、本明細書に記載される機能アッセイを用いて試験することができる。
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族のリガンド（又はＣＡＲの場合には腫瘍抗原）との結合によって誘導される一次応答を指し、それにより、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達、又は適切なＮＫ受容体若しくはシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介する。刺激は、ある分子の発現変化を媒介することができる。
用語「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」は、その表面上に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞などの免疫系細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）を指す。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこうした複合体を認識し得る。ＡＰＣは、抗原をプロセシングしてそれをＴ細胞に提示する。
「免疫エフェクター細胞」は、この用語が本明細書で使用されるとき、免疫応答、例えば免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えばα／β Ｔ細胞及びγ／δ Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞及び骨髄由来食細胞が挙げられる。
「免疫エフェクター機能又は免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書で使用されるとき、標的細胞の免疫攻撃を亢進させる又は促進する例えば免疫エフェクター細胞の機能又は応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能又は応答は、標的細胞の死滅又は成長若しくは増殖阻害を促進するＴ細胞又はＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激及び共刺激が免疫エフェクター機能又は応答の例である。
用語「コードする」は、定義付けられたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は定義付けられたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的過程における他のポリマー及び巨大分子の合成の鋳型としての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチド内の特異的ヌクレオチド配列の固有の特性及びそれによってもたらされる生物学的特性を指す。従って、遺伝子、ｃＤＮＡ又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞又は他の生体系のタンパク質が産生される場合にタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一の且つ通常配列表に提供されるものであるコード鎖、及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写鋳型として使用される非コード鎖の両方は、その遺伝子のｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると称することができる。
特記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の全てを含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句には、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかのバージョンで１つ又は複数のイントロンを含み得る限りにおいて、イントロンも含まれ得る。
用語「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書では同義的に使用され、本明細書に記載されるとおりの化合物、製剤、材料又は組成物が特定の生物学的結果を達成するのに有効な量を指す。
用語「内因性」は、生物、細胞、組織又は系由来の、又はその内部で産生される任意の材料を指す。
用語「外因性」は、生物、細胞、組織又は系の外側から導入されるか又はその外側で産生される任意の材料を指す。
用語「発現」は、プロモーターによってドライブされる特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指す。
用語「トランスファーベクター」は、単離核酸を含む組成物であって、細胞内部への単離核酸の送達に使用し得る組成物を指す。当技術分野では、限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含め、多くのベクターが公知である。従って、用語「トランスファーベクター」には自己複製プラスミド又はウイルスが含まれる。この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸のトランスファーを促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物もさらに含むものと解釈されなければならない。ウイルストランスファーベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
用語「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、他の発現用エレメントは、宿主細胞によって供給されるか、又はインビトロ発現系に供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド又はリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含め、当技術分野において公知のもの全てが含まれる。
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させることができる点でレトロウイルスの中でユニークであり、レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡに多量の遺伝情報を送達することができ、そのため、遺伝子デリバリーベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
用語「レンチウイルスベクター」は、特に、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）に提供されるとおりの自己不活性化レンチウイルスベクターを含め、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例としては、限定されないが、例えばＯｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子デリバリー技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが挙げられる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に公知であろう。
用語「相同」又は「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子間又は２つのポリペプチド分子間におけるサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占有されるとき、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占有される場合、それらは、その位置で相同又は同一である。２つの配列間の相同性は、一致する位置又は相同な位置の数の直接の関数である。例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５個の位置）が相同である場合、それらの２つの配列は、５０％相同である。位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致するか又は相同である場合、それらの２つの配列は、９０％相同である。
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗原結合部分配列など）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体及びその抗体断片は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体又は抗体断片）においてレシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置き換えられているものである。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体／抗体断片は、レシピエント抗体にも、移入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。これらの改変は抗体又は抗体断片の性能をさらに精緻化及び最適化し得る。一般に、ヒト化抗体又はその抗体断片は、少なくとも１つ及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、及びＦＲ領域の全て又は大部分がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体又は抗体断片は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含むことができる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６，１９９２を参照されたい。
「完全にヒト」は、分子全体がヒト起源であるか、又はヒト形態の抗体又は免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなる抗体又は抗体断片などの免疫グロブリンを指す。
用語「単離されている」は、自然状態から改変されているか又は取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸又はペプチドは、「単離されている」のではないが、その自然状態の共存する材料から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは、「単離されている」。単離核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、又は例えば宿主細胞など、非天然環境中に存在することができる。
本発明に関連して、一般的に存在する核酸塩基について以下の略記が使用される。「Ａ」は、アデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、及び「Ｕ」は、ウリジンを指す。
用語「作動可能に連結された」又は「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列との間における後者の発現をもたらす機能的な連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係した状態に置かれているとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、互いに連続し得、例えば２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、又は胸骨内注射、腫瘍内、又は輸注技法を含む。
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、且つ天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸が包含される。特に指示されない限り、ある詳細な核酸配列は、黙示的に、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ及び相補配列並びに明示的に指示される配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択の（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合によってつなぎ合わされた２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、この用語は、当技術分野では一般に例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短鎖と、当技術分野では概してタンパク質と称される、多数の種類があるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド又はこれらの組み合わせが含まれる。
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要である、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
用語「プロモーター／調節配列」は、そのプロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の例では、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の例では、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであり得る。
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんど又は全ての生理条件下で細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘発物質が細胞に存在する場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするか又はそれによって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
用語「癌関連抗原」又は「腫瘍抗原」は、同義的に、癌細胞の表面上に、完全に又は代わりに断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現する分子（典型的にはタンパク質、炭水化物又は脂質）であって、癌細胞への薬理学的薬剤の優先的なターゲティングに有用な分子を指す。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞及び癌細胞の両方が発現するマーカー、例えば系列マーカー、例えばＢ細胞上のＣＤ１９である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過剰発現する（例えば、正常細胞と比較して１倍の過剰発現、２倍の過剰発現、３倍の過剰発現又はそれを超える）細胞表面分子である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、癌細胞で不適切に合成される細胞表面分子、例えば正常細胞に発現する分子と比較して欠失、付加又は突然変異を含む分子である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は癌細胞の細胞表面にのみ、完全に又は代わりに断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現することになり、正常細胞の表面に合成されず、又は発現しない。一部の実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体断片）を含むＣＡＲを含む。通常、内因性タンパク質に由来するペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケットに嵌まり、ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、あらゆる有核細胞によって構成的に発現される。癌では、ウイルス特異的及び／又は腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体が免疫療法用のユニークなクラスの細胞表面標的となる。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－Ａ１又はＨＬＡ－Ａ２のコンテクストでウイルス又は腫瘍抗原由来のペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体が記載されている（例えば、Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１１ ８５（５）：１９３５－１９４２；Ｓｅｒｇｅｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１ １１７（１６）：４２６２－４２７２；Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１０ １８４（４）：２１５６－２１６５；Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００１ ８（２１）：１６０１－１６０８；Ｄａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１３ ５（１７６）：１７６ｒａ３３；Ｔａｓｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１２ １９（２）：８４－１００を参照されたい）。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリなど、ライブラリのスクリーニングによって同定することができる。
用語「腫瘍支持抗原」又は「癌支持抗原」は、互換的に、それ自体癌性ではないが、例えば増殖又は生存、例えば免疫細胞に対する抵抗性を促進することにより癌細胞を支持する、細胞の表面に発現される分子（典型的には、タンパク質、炭水化物又は脂質）を指す。この型の例示的な細胞は、間質細胞及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。腫瘍支持抗原自体は、抗原が癌細胞を支持する細胞上に存在する限り、腫瘍細胞を支持する役割を果たさなくてもよい。
「Ｂ細胞抗原」又は「Ｂ－細胞抗原」という用語は、互換的に使用され、Ｂ細胞に結合する作用物質を用いて標的化され得るＢ細胞の表面上で優先的且つ特異的に発現される分子（典型的には、タンパク質、炭水化物又は脂質）を指す。特に注目されるＢ細胞抗原は、哺乳動物の他の非Ｂ細胞組織と比べてＢ細胞上で優先的に発現される。Ｂ細胞抗原は、１つの特定のＢ細胞集団、例えばＢ前駆細胞又は成熟Ｂ細胞上で発現され得、或いは２つ以上の特定のＢ細胞集団、例えば前駆Ｂ細胞及び成熟Ｂ細胞の両方の上で発現され得る。例示的なＢ細胞表面マーカーとしては、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、５、７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ７／４／３Ｒ及びＩＬ４Ｒが挙げられる。特に好ましいＢ－細胞抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１及びＣＤ１３８が挙げられる。実施形態では、Ｂ－細胞抗原は、ＣＤ１９である。実施形態では、Ｂ－細胞抗原は、ＣＤ２０である。実施形態では、Ｂ－細胞抗原は、ＣＤ２２である。実施形態では、Ｂ－細胞抗原は、ＢＣＭＡである。実施形態では、Ｂ－細胞抗原は、ＦｃＲｎ５である。実施形態では、Ｂ－細胞抗原は、ＦｃＲｎ２である。実施形態では、Ｂ－細胞抗原は、ＣＳ－１である。実施形態では、Ｂ－細胞抗原は、ＣＤ１３８である。
「固形腫瘍抗原」又は「固形腫瘍細胞抗原」という用語は、固形腫瘍細胞に結合する作用物質を用いて標的化され得る固形腫瘍細胞の表面上で優先的且つ特異的に発現される分子（典型的には、タンパク質、炭水化物又は脂質）を指す。特に注目される固形腫瘍抗原は、哺乳動物の他の非腫瘍組織と比べて固形腫瘍細胞上で優先的に発現される。固形腫瘍抗原は、１つの特定の固形腫瘍細胞集団、例えば中皮腫腫瘍細胞上で発現され得、或いは２つ以上の特定の固形腫瘍細胞集団、例えば中皮腫腫瘍細胞及び卵巣癌細胞の両方の上で発現され得る。例示的な固形腫瘍抗原としては、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリン、ＧＤ２、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、レグマン、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ（例えば、ＥＲＢＢ２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、エフリンＢ２、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｓＬｅ、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチルＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＦＡＰ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７、ＭＬ－ＩＡＰ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、Ｆｏｓ関連抗原、好中球エラスターゼ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、精子タンパク質１７、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、チログロブリン、ＰＬＡＣ１、ｇｌｏｂｏＨ、ＲＡＧＥ１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＮＡ－１７、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、Ｌｙ６ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＧＦＲα４及びＭＨＣ上に存在するこれらの抗原のいずれかのペプチドが挙げられる。特に好ましい固形腫瘍抗原としては、ＣＬＤＮ６、メソテリン及びＥＧＦＲｖＩＩＩが挙げられる。
「骨髄性腫瘍抗原」又は「骨髄性腫瘍細胞抗原」は、骨髄性腫瘍細胞に結合する作用物質を用いて標的化され得る骨髄性腫瘍細胞の表面上で優先的且つ特異的に発現される分子（典型的には、タンパク質、炭水化物又は脂質）を指す。特に注目される骨髄性腫瘍抗原は、哺乳動物の他の非腫瘍組織と比べて骨髄性腫瘍細胞上で優先的に発現される。骨髄性腫瘍抗原は、１つの特定の骨髄性腫瘍細胞集団、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）腫瘍細胞上で発現され得、或いは２つ以上の特定の骨髄性腫瘍細胞集団上で発現され得る。例示的な骨髄性腫瘍抗原としては、ＣＤ１２３、ＣＤ３３及びＣＬＬ－１が挙げられる。
用語「可動性ポリペプチドリンカー」又は「リンカー」は、ｓｃＦｖとの関連で使用されるとき、可変重鎖領域と可変軽鎖領域とを共に連結するために単独又は組み合わせで使用されるグリシン及び／又はセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１以上の正の整数である）（配列番号４４）。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５及びｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０である。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーには、限定されないが、（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）４（配列番号４５）又は（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号４６）が含まれる。別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）又は（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）（配列番号４４）の複数の繰り返しを含む。また、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１３８４７５号パンフレットに記載されるリンカーも本発明の範囲内に含まれる）。
本明細書で使用されるとき、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７－メチルグアノシンキャップ又はＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも称される）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「前」又は５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、１番目の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びＲＮアーゼからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結び付いており、それぞれが他方に影響を与えるようにして同時転写的に起こる。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端に、ＲＮＡポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡのその安定性又は翻訳効率などの機能を調整するために改変することができる。
本明細書で使用されるとき、「インビトロ転写ＲＮＡ」は、インビトロ合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから作成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの作成に使用される鋳型を含む。
本明細書で使用されるとき、「一過性」は、数時間、数日間又は数週間の期間にわたる組み込まれないトランス遺伝子の発現を指し、この発現期間は、宿主細胞においてゲノムに組み込まれた場合又は安定プラスミドレプリコン中に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、１つ以上の療法の投与によってもたらされる増殖性障害の進行、重症度及び／又は持続期間の低減又は改善又は増殖性障害の１つ以上の症状（好ましくは１つ以上の認識し得る症状）の改善を指す。具体的な実施形態において、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、患者には必ずしも認識できない、腫瘍の成長などの増殖性障害の少なくとも１つの計測可能な理学的パラメータの改善を指す。他の実施形態において用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、増殖性障害の進行の物理的な、例えば認識し得る症状の安定化による阻害、生理学的な、例えば理学的パラメータの安定化による阻害のいずれか又は両方を指す。他の実施形態において用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、腫瘍サイズ又は癌性細胞数の低減又は安定化を指す。
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。語句「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、且つ細胞の膜を越えてシグナルを伝える能力を有する分子及び分子複合体を含む。
用語「対象」は、免疫応答を生じさせることのできる生きている生物（例えば、哺乳類、ヒト）を含むことが意図される。
用語の「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞とは、その天然に存在する状態でそれが通常結び付いている他の細胞型と分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞集団とは、均質な細胞集団を指す。他の例では、この用語は、単に、その自然状態でそれが天然に結び付いている細胞から分離されている細胞を指す。一部の態様において、これらの細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、これら細胞は、インビトロで培養されない。
用語「療法的」とは、本明細書で使用されるとき、治療を意味する。療法的効果は疾患状態の低減、抑制、寛解又は根絶によって達成される。
用語「予防」は、本明細書で使用されるとき、疾患又は疾患状態の予防又はそれに対する予防的治療を意味する。
本発明に関連して、「腫瘍抗原」又は「過剰増殖性障害抗原」若しくは「過剰増殖性障害に関連する抗原」とは、特定の過剰増殖性障害に共通である抗原を指す。特定の態様では、本発明の過剰増殖性障害抗原は、原発性又は転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌及び乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの腺癌が挙げられるが、これらに限定されない癌に由来する。
用語「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」は、外因性核酸を宿主細胞に移入させるか又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換又は形質導入されたものである。細胞には初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在する結合パートナー（例えば、腫瘍抗原）タンパク質を認識し、結合する抗体又はリガンドであって、しかし、試料中の他の分子は、実質的に認識又は結合しない、抗体又はリガンドを指す。
「膜アンカー」又は「膜繋留ドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、細胞外又は細胞内ドメインを細胞膜にアンカリングするのに十分なポリペプチド又は部分、例えばミリストイル基を指す。
「膜タンパク質」とは、膜貫通ドメインを含むタンパク質を意味し、標的細胞において発現されると細胞膜内に固定されるか、又は細胞膜を通過する。
「ＣＤ３ε」という用語は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ε鎖を指す。Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０７７６６は、例示的なヒトＣＤ３εアミノ酸配列を提供する。例示的なヒトＣＤ３εアミノ酸配列は、配列番号７７として提供されている。実施形態では、ＣＤ３εは、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０７７６６で提供される配列又は配列番号７７の配列の機能的変異体若しくはフラグメントである。ＣＤ３εは、本明細書ではＣＤ３Ｅとも称することができる。
「ＣＤ３δ」という用語は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３δ鎖を指す。Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０４２３４は、例示的なヒトＣＤ３δアミノ酸配列を提供する。例示的なヒトＣＤ３δアミノ酸配列は、配列番号８２として提供されている。実施形態では、ＣＤ３δは、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０４２３４で提供される配列又は配列番号８２の配列の機能的変異体若しくはフラグメントである。ＣＤ３δは、本明細書ではＣＤ３Ｄとも称することができる。
「ＣＤ３γ」という用語は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３γ鎖を指す。Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０９６９３は、例示的なヒトＣＤ３γアミノ酸配列を提供する。例示的なヒトＣＤ３γアミノ酸配列は、配列番号８７として提供されている。実施形態では、ＣＤ３γは、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０９６９３で提供される配列又は配列番号８７の配列の機能的変異体若しくはフラグメントである。ＣＤ３γは、本明細書ではＣＤ３Ｇとも称することができる。
「ＣＤ３δ、γ又はεドメイン」とは、ＣＤ３δ、γ又はεに由来し、且つＣＤ３δ、γ又はεの少なくとも１つの内因性活性を保持するドメインを意味する。
本明細書で使用される場合、「系」とは、キメラ膜タンパク質、例えば２つのキメラ膜タンパク質の組を指す。いくつかの実施形態では、キメラ膜タンパク質のそれぞれは、抗原結合ドメイン、ＴＣＲの構成要素に由来するドメイン（例えば、ＣＤ３γ、δ又はεに由来するドメイン）及び膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ膜タンパク質の１つ以上は、共刺激ドメインをさらに含む。
本発明の組成物及び方法は、特定された配列又はそれに実質的に同一であるか若しくは類似する配列、例えば特定された配列と少なくとも８５％、９０％若しくは９５％以上同一の配列を有するポリペプチド及び核酸を包含する。アミノ酸配列に関連して、「実質的に同一」という用語は、本明細書において、第１及び第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメイン及び／又は共通の機能活性を有することができるように、例えば共通構造ドメインを含有するアミノ酸配列が参照配列、例えば本明細書に提供される配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するように、ｉ）第２のアミノ酸配列中の整列アミノ酸残基と同一であるか、又はｉｉ）第２のアミノ酸配列中の整列アミノ酸残基の保存的置換である、十分な又は最小数のアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸配列を指すように使用される。
ヌクレオチド配列に関連して、「実質的に同一」という用語は、本明細書において、第１及び第２のヌクレオチド配列が、共通機能活性を有するポリペプチドをコードするか、又は共通の構造ポリペプチドドメイン若しくは共通の機能ポリペプチド活性をコードするように、例えばヌクレオチド配列が参照配列、例えば本明細書に提供される配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するように、第２の核酸配列中の整列ヌクレオチドと同一である、十分な又は最小数のヌクレオチドを含有する第１の核酸配列を指すように使用される。
「変異体」という用語は、参照アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、又は実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、変異体は、機能的変異体である。
「機能的変異体」という用語は、参照アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、又は実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされ、参照アミノ酸配列の１つ以上の活性を有することができるポリペプチドを指す。
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、第２のメッセンジャーを生成するか、又はこのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために、細胞内で情報を伝えることにより作用するタンパク質の機能的部分を指す。
「細胞内共刺激ドメイン」とは、共刺激分子の細胞内部分を意味する。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリーで表すことができる：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）及び活性化ＮＫ細胞受容体。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、又は固有の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はその機能的フラグメント若しくは誘導体を含むことができる。
本明細書で使用されるような「由来する」は、第１の分子と第２の分子との間の関係を示す。これは、一般的には、第１の分子と第２の分子との間の構造的類似性を指し、第２の分子に由来する第１の分子に対するプロセス又は供給源の限定を暗示又は含むものではない。例えば、ＣＤ３ε分子に由来する細胞外ドメインの場合、細胞外ドメインは、それが要求される機能、すなわち適切な条件下でシグナルを発生するための能力を有するように十分なＣＤ３ε構造を保持する。これは、細胞外ドメインを生成する特定のプロセスへの限定を暗示又は含むものではなく、例えば、これは、細胞外ドメインを提供するために、ＣＤ３ε配列から始めて、不必要な配列を欠失させるか、又は突然変異を強要して、細胞外ドメインに達することを意味するものではない。
「細胞外ドメイン」とは、細胞の外側で発現される膜貫通タンパク質のドメインを意味する。
「二量体化ドメイン」とは、構成的又は誘導的のいずれかで同族二量体化ドメインに結合するドメインを意味する。このような同族二量体ドメインは、初期二量体化ドメインと同一であるか若しくは類似し得（「ホモ二量体化ドメイン」）、又は初期二量体化ドメインと異種であり得る（「ヘテロ二量体化ドメイン」）。ドメインが構成的に二量体化する場合、このような二量体化は、典型的には、両方のドメインが同じ細胞コンパートメントで発現されることを条件として生じるであろう。ドメインが誘導的に二量体化する場合、このような二量体化は、「二量体化分子」の存在下でのみ生じるであろう。
「二量化分子」は、この用語が本明細書で使用されるとき、第１の二量化ドメインと第２の二量化ドメインとの会合を促進する分子を指す。実施形態において、二量化分子は、対象に天然に存在しないか、又は有意な二量化をもたらし得る濃度で存在しない。実施形態において、二量化分子は、小分子、例えばラパマイシン又はラパログ、例えばＲＡＤ００１である。
本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」という用語は、第２のポリペプチドに結合することができるポリペプチドを指す。このような抗原結合ドメインは、抗体分子を含む。さらに、「抗原結合ドメイン」という用語は、抗体分子に由来しないポリペプチド（例えば、受容体タンパク質の細胞外ドメインを含む、同族ポリペプチド又は分子に元々結合するポリペプチド）も含む。
本明細書で使用される場合、「抗体分子」という用語は、免疫グロブリン鎖又は少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むそのフラグメントを指す。「抗体分子」という用語は、抗体及び抗体フラグメントを包含する。実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、これは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、この中で、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第２のエピトープに対する結合特異性を有する。実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対する特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。
抗体又はその抗体フラグメントを含む本発明のキメラタンパク質の一部は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体又は二重特異性抗体を含む連続ポリペプチド鎖の一部として発現される様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹにおいて；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。一態様では、本発明の組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる態様では、本タンパク質は、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
抗体又はその抗体フラグメントは、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体又は二重特異性抗体を含む連続ポリペプチド鎖の一部として発現される様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹにおいて；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。一態様では、本発明の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる態様では、本タンパク質は、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）に記載されるもの又はこれらの組み合わせを含む多数の周知のスキームのいずれかを使用して決定することができる。
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントとを含む融合タンパク質を指し、この軽鎖及び重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば短いフレキシブルポリペプチドリンカーを介して連続的に連結されており、一本鎖ポリペプチドとして発現されることができ、このｓｃＦｖは、これが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。特に規定がない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域を例えばポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に対していずれの順序でも有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含み得、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。
「４－１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列又は非ヒト種、例えばマウス、齧歯類、サル、類人猿などからの同等の残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５又は非ヒト種、例えばマウス、齧歯類、サル、類人猿などからの同等の残基として定義される。一態様では、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、本明細書に提供されるような配列又は非ヒト種、例えばマウス、齧歯類、サル、類人猿などからの同等の残基である。
「生物学的に同等」という用語は、参照用量又は参照量の参照化合物（例えば、ＲＡＤ００１）によって生じた作用に同等な作用を生じさせるのに必要である、参照化合物（例えば、ＲＡＤ００１）以外の作用物質の量を指す。実施形態では、この作用は、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害によって測定されるような、例えばインビボ又はインビトロアッセイで評価されるような、例えば本明細書に記載のアッセイ（例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイ）によって測定されるようなｍＴＯＲ阻害のレベルである。実施形態では、この作用は、細胞選別によって測定されるようなＰＤ－１陽性／ＰＤ－１陰性Ｔ細胞の比の変更である。実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等な量又は用量は、参照用量又は参照量の参照化合物が阻害するのと同じレベルのＰ７０ Ｓ６キナーゼの阻害を達成する量又は用量である。実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等な量又は用量は、参照用量又は参照量の参照化合物が変更するのと同じレベルのＰＤ－１陽性／ＰＤ－１陰性Ｔ細胞の比の変更を達成する量又は用量である。
「低い免疫増強用量」という用語は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばアロステリック型ｍＴＯＲ阻害剤、例えばＲＡＤ００１若しくはラパマイシン又は触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と併せて使用されるとき、例えばＰ７０ Ｄ６キナーゼ活性の阻害によって測定されるようなｍＴＯＲ活性を完全にではなく部分的に阻害するｍＴＯＲ阻害剤の用量を指す。例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼの阻害により、ｍＴＯＲ活性を評価するための方法が本明細書で論議される。この用量は、完全な免疫抑制をもたらすには不十分であるが、免疫応答を増強させるには十分なものである。実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の数の減少及び／又はＰＤ－１陰性Ｔ細胞の数の増加をもたらすか、或いはＰＤ－１陰性Ｔ細胞／ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の比の増加をもたらす。実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、ナイーブＴ細胞の数の増加をもたらす。実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の低い免疫増強用量は、以下の１つ以上をもたらす：例えば、メモリーＴ細胞、例えばメモリーＴ細胞前駆細胞上の以下のマーカーの１つ以上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋及びＢＣＬ２；例えば、メモリーＴ細胞、例えばメモリーＴ細胞前駆細胞上のＫＬＲＧ１の発現の減少；及びメモリーＴ細胞前駆細胞、例えば以下の特徴：増加したＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、増加したＣＤ１２７ｈｉｇｈ、増加したＣＤ２７＋、減少したＫＬＲＧ１及び増加したＢＣＬ２のいずれか１つ又は組み合わせを有する細胞の数の増加。上記変化のいずれかは、例えば、未処置対照と比べて例えば少なくとも一過性に生じる。
「不応性」は、本明細書で使用されるとき、治療に応答しない疾患、例えば癌を指す。実施形態において、不応性癌は、治療の開始前又は開始時点で治療に抵抗性であり得る。他の実施形態において、不応性癌は、治療中に抵抗性になり得る。不応性癌は、抵抗性癌とも称される。
「再発した」は、本明細書で使用されるとき、改善期間後、例えば療法、例えば癌療法の前治療後における疾患（例えば、癌）又は癌などの疾患の徴候及び症状の再来を指す。
範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な態様が範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での記載は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解釈されてはならないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値を有すると考えられなければならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示される部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６を有すると考えられなければならない。別の例として、９５～９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するものを含み、及び９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％及び９８～９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関わらず適用される。
記述
本発明のキメラタンパク質で操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を使用して、癌などの疾患の治療に使用するための物質の組成物及び方法が本明細書で提供される。
本発明の様々な構成要素のいくつかの例の配列を表１に列挙し、ここで、ａａは、アミノ酸を表し、ｎａは、対応するペプチドをコードする核酸を表す。
Figure 2023071774000001
Figure 2023071774000002
癌関連抗原
本発明は、免疫エフェクター細胞を癌に向かわせる１つ以上のキメラタンパク質を含有するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を提供する。これは、癌関連抗原に特異的であるタンパク質上の抗原結合ドメインを通して達成される。本発明のタンパク質によって標的化することができる癌関連抗原（腫瘍抗原）の２つの部類があり、これらは（１）癌細胞の表面上で発現される癌関連抗原、及び（２）それ自体細胞内にあるが、このような抗原（ペプチド）のフラグメントがＭＨＣ（主要組織適合性複合体）により癌細胞の表面上に存在する癌関連抗原である。
従って、本発明は、以下の癌関連抗原（腫瘍抗原）：ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチルＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン並びにテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５及びＩＧＬＬ１を標的とするタンパク質を提供する。
実施形態では、本発明は、以下のＢ－細胞抗原：ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、５、７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ７／４／３Ｒ及びＩＬ４Ｒを標的とするタンパク質を提供する。特に好ましいＢ－細胞抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１及びＣＤ１３８が挙げられる。
実施形態では、本発明は、以下の固形腫瘍抗原：ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリン、ＧＤ２、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、レグマン、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ（例えば、ＥＲＢＢ２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、エフリンＢ２、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｓＬｅ、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチルＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＦＡＰ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７、ＭＬ－ＩＡＰ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、Ｆｏｓ関連抗原、好中球エラスターゼ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、精子タンパク質１７、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、チログロブリン、ＰＬＡＣ１、ｇｌｏｂｏＨ、ＲＡＧＥ１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＮＡ－１７、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、Ｌｙ６ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＧＦＲα４及びＭＨＣ上に存在するこれらの抗原のいずれかのペプチドを標的とするタンパク質を提供する。特に好ましい固形腫瘍抗原としては、ＣＬＤＮ６、メソテリン及びＥＧＦＲｖＩＩＩが挙げられる。
本明細書に記載のキメラタンパク質は、腫瘍支持抗原（例えば、本明細書に記載の腫瘍支持抗原）に結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体フラグメント、ＴＣＲ又はＴＣＲフラグメント）を含み得る。一部の実施形態において、腫瘍支持抗原は、間質細胞又は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上に存在する抗原である。間質細胞は、微小環境における細胞分裂を促進するために成長因子を分泌し得る。ＭＤＳＣ細胞は、Ｔ細胞の増殖及び活性化を阻害することができる。
一実施形態において、間質細胞抗原は、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びテネイシンの１つ以上から選択される。一実施形態において、ＦＡＰ特異的抗体は、シブロツズマブとの結合について競合するか、又はそれと同じＣＤＲを有する。実施形態において、ＭＤＳＣ抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５及びＣＤ６６ｂの１つ以上から選択される。従って、一部の実施形態において、腫瘍支持抗原は、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又はテネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５及びＣＤ６６ｂの１つ以上から選択される。
本開示から理解されるように、本発明の系、細胞及び他の態様は、２つ以上の抗原が標的化されるように２つ以上の抗原結合ドメインを含む。本明細書に記載の抗原のいずれかの組み合わせは、２つ以上の抗原の前記組み合わせを標的とする抗原結合ドメインを含む系を利用することによって標的化され得る。
本発明のキメラタンパク質
本発明は、１つ以上のキメラタンパク質を特徴とする。一般的に、本発明は、ＣＤδ、γ又はεの細胞外ドメインのすべて又は機能的部分を含む第１のキメラ膜タンパク質を特徴とする。これらのキメラタンパク質は、以下：抗原結合ドメイン、細胞内共刺激ドメイン及び／又は二量体化ドメインの１つ以上をさらに含む。例えば、第１のキメラ分子が抗原結合ドメインを含まない特定の実施形態では、本発明は、第２のキメラ膜タンパク質を特徴とし、このタンパク質は、細胞外抗原結合ドメイン及び二量体化ドメイン有する。任意選択により、この第２のタンパク質は、細胞内共刺激ドメインをさらに含むことができる（第１のキメラタンパク質がこのようなドメインを有するかどうかに関わりなく）。或いは、第２のキメラタンパク質は、第１のキメラタンパク質のドメイン（例えば、細胞外又は細胞内ドメイン）に結合するドメイン及び共刺激ドメイン、抗原結合ドメイン又は両方を含むことができる。
抗原結合ドメイン
一態様では、本発明の特定のキメラタンパク質は、抗原結合ドメインと別途称される標的特異的結合エレメントを含む。部分の選択は、標的細胞の表面を画定するリガンドの種類及び数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上で細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。従って、本発明のタンパク質中の抗原結合ドメインに対してリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌並びに病原体感染症、自己免疫疾患及び癌細胞に関連するものが挙げられる。
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びその機能的フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない抗原に結合する任意のドメインであり得、限定されるものではないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）並びにラクダ科動物由来のナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）などのシングルドメイン抗体及び組換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はそのフラグメント、例えば一本鎖ＴＣＲなどのような抗原結合ドメインとして機能することが当技術分野において既知の代替的な足場が挙げられる。
一実施形態において、ＣＤ２２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈａｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２１（７）：１１６５－１１７４（２０１３）；Ｗａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６（６）：１８９４－１９０３（２０１０）；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ ３７（１）：８３－８８（２０１３）；Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ（ｃｒｅａｔｉｖｅｂｉｏｍａｒｔ．ｎｅｔ）：ＭＯＭ－１８０４７－Ｓ（Ｐ）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＳ－１に対する抗原結合ドメインは、エロツズマブ（ＢＭＳ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲであり、例えばＴａｉ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ １１２（４）：１３２９－３７；Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｌｏｏｄ．１１０（５）：１６５６－６３を参照されたい。
一実施形態において、ＣＬＬ－１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍから入手可能な抗体、例えばＰＥ－ＣＬＬ１－ｈｕ Ｃａｔ＃３５３６０４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；及びＰＥ－ＣＬＬ１（ＣＬＥＣ１２Ａ）Ｃａｔ＃５６２５６６（ＢＤ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｂｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７（６）：１４９０－１４９６（２００１）（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ Ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ，ｈＰ６７．６）、Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２（２４）：６７６１－６７６７（１９９２）（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ，ＨｕＭ１９５）、Ｌａｐｕｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ３０（３）：１１２１－１１３１（２０１２）（ＡＶＥ９６３３）、Ａｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２７（５）：１１０７－１１１５（２０１３）（ＡＭＧ３３０，ＣＤ３３ ＢｉＴＥ）、Ｄｕｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ ｈｅｍａｔｏｌ ２０１２：６８３０６５（２０１２）及びＰｉｚｚｉｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｌｕｅ．２０１４．６２（２０１４）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍｕｊｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７（４）：１０９８－１１０４（１９８７）；Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４５（６）：２６４２－２６４９（１９８５），Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ５（９）：１４３０－１４４０（１９８７），Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １６（９）：３０５３－３０６０（１９９８），Ｈａｎｄｇｒｅｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３５（３）：１９９－２０４（１９９２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。一部の実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、ｍＡｂ １４．１８、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕ１４．１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６０Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６．１及び８Ｈ９（例えば、国際公開第２０１２０３３８８５号パンフレット、国際公開第２０１３０４０３７１号パンフレット、国際公開第２０１３１９２２９４号パンフレット、国際公開第２０１３０６１２７３号パンフレット、国際公開第２０１３１２３０６１号パンフレット、国際公開第２０１３０７４９１６号パンフレット及び国際公開第２０１３８５５５２号パンフレットを参照されたい）から選択される抗体の抗原結合部分である。一部の実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１００１５０９１０号明細書又は国際公開第２０１１１６０１１９号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合部分である。
一実施形態では、ＢＣＭＡに対する抗原結合ドメインは、抗原結合部分、例えば国際公開第２０１２１６３８０５号パンフレット、同第２００１１２８１２号パンフレット及び同第２００３０６２４０１号パンフレットに記載される抗体のＣＤＲである。
一実施形態において、Ｔｎ抗原に対する抗原結合ドメインは、米国特許第８，４４０，７９８号明細書、Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０７（２２）：１００５６－１００６１（２０１０）及びＳｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（６）：８６３－８７３（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＳＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ８９（２）：１３６－１４５（２０１３），米国特許出願公開第２０１１０２６８６５６号明細書（Ｊ５９１ ＳｃＦｖ）；Ｆｒｉｇｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４９（９）：２２２３－２２３２（２０１３）（ｓｃＦｖＤ２Ｂ）；国際公開第２００６１２５４８１号パンフレット（ｍＡｂ ３／Ａ１２、３／Ｅ７及び３／Ｆ１１）に記載されている抗体及び単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ Ａ５及びＤ７）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＲＯＲ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９（１２）：３１５３－３１６４（２０１３）；国際公開第２０１１１５９８４７号パンフレット；及び米国特許出願公開第２０１３０１０１６０７号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＦＬＴ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２０１１０７６９２２号パンフレット、米国特許第５７７７０８４号明細書、欧州特許第０７５４２３０号明細書、米国特許出願公開第２００９０２９７５２９号明細書及びいくつかの市販カタログ抗体（Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍ）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＴＡＧ７２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１３（４）：１１６３－１１７０（１９９７）に記載されている抗体；及びＡｂｃａｍ ａｂ６９１の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＦＡＰに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｏｓｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：４５８４－４５９２（２００８）（ＦＡＰ５）、米国特許出願公開第２００９／０３０４７１８号明細書；シブロツズマブ（例えば、Ｈｏｆｈｅｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ２６（１），２００３を参照されたい）；及びＴｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１０（６）：１１２５－１１３５（２０１３）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ３８に対する抗原結合ドメインは、ダラツムマブ（例えば、Ｇｒｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６（２１）：１２６１－１２６２（２０１０）；ＭＯＲ２０２（例えば、米国特許第８，２６３，７４６号明細書を参照されたい）；又は米国特許第８，３６２，２１１号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ４４ｖ６に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｃａｓｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２２（２０）：３４６１－３４７２（２０１３）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＥＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４３（４）：１０９５－１１０７（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＰＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、例えば、ＭＴ１１０、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３二特異性Ａｂ（例えば、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００６３５５９６を参照されたい）；エドレコロマブ；３６２２Ｗ９４；ＩＮＧ－１；及びアデカツムマブ（ＭＴ２０１）から選択される抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＲＳＳ２１に対する抗原結合ドメインは、米国特許第８，０８０，６５０号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、Ｂ７Ｈ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、抗体ＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＫＩＴに対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７９１５３９１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２８８５０６号明細書に記載されている抗体及びいくつかの市販のカタログ抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＬ－１３Ｒａ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２００８／１４６９１１号パンフレット、国際公開第２００４０８７７５８号パンフレット、いくつかの市販カタログ抗体及び国際公開第２００４０８７７５８号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ３０に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７０９０８４３Ｂ１号明細書及び欧州特許第０８０５８７１号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７２５３２６３号明細書；米国特許第８，２０７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２７６０４６号明細書；欧州特許第１０１３７６１号明細書；国際公開第２００５０３５５７７号パンフレット；及び米国特許第６４３７０９８号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ１７１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３７（２）：９３－１０４（２０１４）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＬ－１１Ｒａに対する抗原結合ドメインは、Ａｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ５５２６２）又はＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（カタログ番号ＥＰＲ５４４６）から入手可能な抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。別の実施形態において、ＩＬ－１１Ｒａに対する抗原結合ドメインは、ペプチドであり、例えばＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７２（１）：２７１－２８１（２０１２）を参照されたい。
一実施形態において、ＰＳＣＡに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍｏｒｇｅｎｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６７（１０）：１１２１－１１３１（２００７）（ｓｃＦｖ ７Ｆ５）；Ｎｅｊａｔｏｌｌａｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１３（２０１３），ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ８３９８３１（ｓｃＦｖ Ｃ５－ＩＩ）；及び米国特許出願公開第２００９０３１１１８１号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＶＥＧＦＲ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０（１１）：３９５３－３９６８（２０１０）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ルイスＹに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ ２３（４）：４１１－４２３（２００８）（ｈｕ３Ｓ１９３ Ａｂ（ｓｃＦｖｓ））；Ｄｏｌｅｚａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（１）：４７－５６（２００３）（ＮＣ１０ ｓｃＦｖ）に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ２４に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍａｌｉａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４３（５）：１３７５－１３８４（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＤＧＦＲβに対する抗原結合ドメインは、抗体Ａｂｃａｍ ａｂ３２５７０の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＳＳＥＡ－４に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＣ８１３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又は他の市販の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ２０に対する抗原結合ドメインは、抗体リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ又はＧＡ１０１の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、葉酸受容体αに対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＧＮ８５３又は米国特許出願公開第２０１２０００９１８１号明細書；米国特許第４８５１３３２号明細書、ＬＫ２６：米国特許第５９５２４８４号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＲＢＢ２に対する抗原結合ドメイン（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）は、抗体トラスツズマブ又はペルツズマブの抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＭＵＣ１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＳＡＲ５６６６５８の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合ドメインは、抗体セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ又はマツズマブの抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＮＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン２－２Ｂ：ＭＡＢ５３２４（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、エフリンＢ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ａｂｅｎｇｏｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１９（１９）：４５６５－４５７６（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＧＦ－Ｉ受容体に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第８３４４１１２Ｂ２号明細書；欧州特許出願公開第２３２２５５０Ａ１号明細書；国際公開第２００６／１３８３１５号パンフレット又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２００６／０２２９９５号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＡＩＸに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン３０３１２３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＭＰ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７，４１０，６４０号明細書又は米国特許出願公開第２００５０１２９７０１号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ｇｐ１００に対する抗原結合ドメインは、抗体ＨＭＢ４５、ＮＫＩｂｅｔａＢ、又は国際公開第２０１３１６５９４０号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１３０２９５００７号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、チロシナーゼに対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第５８４３６７４号明細書；又は米国特許出願公開第１９９５０５０４０４８号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＥｐｈＡ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２（１）：１０２－１１１（２０１４）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＤ３に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７２５３２６３号明細書；米国特許第８，２０７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２７６０４６号明細書；欧州特許出願公開第１０１３７６１Ａ３号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２７６０４６号明細書；国際公開第２００５０３５５７７号パンフレット；又は米国特許第６４３７０９８号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、フコシルＧＭ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許出願公開第２０１００２９７１３８号明細書；又は国際公開第２００７／０６７９９２号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ｓＬｅに対する抗原結合ドメインは、抗体Ｇ１９３（ルイスＹについて）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。Ｓｃｏｔｔ ＡＭ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：３２５４－６１（２０００）を参照されたく、Ｎｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍａｙ ２０１３ １９０（Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）１７７．１０にも記載される。
一実施形態において、ＧＭ３に対する抗原結合ドメインは、抗体ＣＡ２５２３４４９（ｍＡｂ １４Ｆ７）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＨＭＷＭＡＡに対する抗原結合ドメインは、Ｋｍｉｅｃｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３（１）：ｅ２７１８５（２０１４）（ＰＭＩＤ：２４５７５３８２）（ｍＡｂ９．２．２７）；米国特許第６５２８４８１号明細書；国際公開第２０１００３３８６６号パンフレット；又は米国特許出願公開第２０１４０００４１２４号明細書に記載の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ｏ－アセチル－ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、抗体８Ｂ６の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２３５（２）：２９８－３０８（２００６）；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６３（２）：２２１－２３２（２０１１）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＡＢ０２７（Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。例えば、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２０５４３５１を参照されたい。
一実施形態において、ＴＳＨＲに対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第８，６０３，４６６号明細書；米国特許第８，５０１，４１５号明細書；又は米国特許第８，３０９，６９３号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合ドメインは、抗体ＦＡＢ６３００Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；又はＬＳ－Ａ４１８０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ９７に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第６，８４６，９１１号明細書；ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３（６）：４１２７－４１３４（２００９）に記載されている抗体；又はＲ＆Ｄ：ＭＡＢ３７３４からの抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＡＬＫに対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍｉｎｏ－Ｋｅｎｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６（５）：１５６１－１５７１（２０１０）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ポリシアル酸に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｎａｇａｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８（４７）：３３７８４－３３７９６（２０１３）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＰＬＡＣ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｇｈｏｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１３ ｄｏｉ：１０．１００２／ｂａｂ．１１７７に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧｌｏｂｏＨに対する抗原結合ドメインは、抗体ＶＫ９；又は例えば、Ｋｕｄｒｙａｓｈｏｖ Ｖ ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ．１５（３）：２４３－９（１９９８），Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（７）：２４８２－２４８７（２０１４）；ＭＢｒ１：Ｂｒｅｍｅｒ Ｅ－Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５９：１４７７３-１４７７７（１９８４）に記載されている抗体の抗原結合部分である。
一実施形態において、ＮＹ－ＢＲ－１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｍｏｒｐｈｏｌ １５（１）：７７－８３（２００７）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＷＴ－１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｄａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５（１７６）：１７６ｒａ３３（２０１３）；又は国際公開第２０１２／１３５８５４号パンフレットに記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＭＡＧＥ－Ａ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４（１２）：７８５３－７８５８（２００５）（ＴＣＲ様ｓｃＦｖ）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、精子タンパク質１７に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔ Ｏｎｃｏｌ ２０１３ Ａｕｇ １４（ＰＭＩＤ：２３９４３３１３）；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ ２９（４）：２９２３－２９３１（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、Ｔｉｅ２に対する抗原結合ドメインは、抗体ＡＢ３３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＭＡＤ－ＣＴ－２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＭＩＤ：２４５０９５２；米国特許第７６３５７５３号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、Ｆｏｓ関連抗原１に対する抗原結合ドメインは、抗体１２Ｆ９（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１に対する抗原結合ドメインは、欧州特許第２５１４７６６Ａ２号明細書；又は米国特許第７，７４９，７１９号明細書に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、肉腫転座切断点に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４（６）：４５３－４６１（２０１２）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＴＲＰ－２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８４（６）：２２０７－１６（１９９６）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＹＰ１Ｂ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Ｍａｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ １０２（９）：３２８７－３２９４（２００３）に記載されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＲＡＧＥ－１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＡＢ５３２８（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素に対する抗原結合ドメインは、抗体カタログ番号：ＬＳ－Ｂ９５－１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、腸カルボキシルエステラーゼに対する抗原結合ドメインは、抗体４Ｆ１２：カタログ番号：ＬＳ－Ｂ６１９０－５０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２に対する抗原結合ドメインは、抗体Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：モノクローナル：カタログ番号：ＬＳ－Ｃ１３３２６１－１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ７９ａに対する抗原結合ドメインは、Ａｂｃａｍから入手可能な抗体抗ＣＤ７９ａ抗体［ＨＭ４７／Ａ９］（ａｂ３１２１）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な抗体ＣＤ７９Ａ抗体番号３３５１；又はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なウサギにおいて産生した抗ＣＤ７９Ａ抗体である抗体ＨＰＡ０１７７４８の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ７９ｂに対する抗原結合ドメインは、抗体ポラツズマブベドチン、Ｄｏｒｎａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ７９ｂ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ａｎｔｉ－ＣＤ７９ｂ－ｖｃ－ＭＭＡＥ，ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ”Ｂｌｏｏｄ．２００９ Ｓｅｐ ２４；１１４（１３）：２７２１－９．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００９－０２－２０５５００．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｌ ２４に記載の抗ＣＤ７９ｂ又は“４５０７ Ｐｒｅ－Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｎｔｉ－ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３ Ａｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ”Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ５６ｔｈＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ６－９ ２０１４に記載の二特異性抗体抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ７２に対する抗原結合ドメインは、Ｍｙｅｒｓ及びＵｃｋｕｎ，“Ａｎ ａｎｔｉ－ＣＤ７２ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｂ－ｌｉｎｅａｇｅ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．”Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１９９５ Ｊｕｎ；１８（１－２）：１１９－２２に記載の抗体Ｊ３－１０９又はＰｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ：Ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ Ｌｉｎｋｅｒ－Ｄｒｕｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｍａｒｃｈ １５，２００９ ６９；２３５８に記載の抗ＣＤ７２（１０Ｄ６．８．１，ｍＩｇＧ１）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＡＩＲ１に対する抗原結合ドメインは、ＰｒｏＳｐｅｃから入手可能な抗体ＡＮＴ－３０１ ＬＡＩＲ１抗体；又はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能な抗ヒトＣＤ３０５（ＬＡＩＲ１）抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＦＣＡＲに対する抗原結合ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から入手可能な抗体ＣＤ８９／ＦＣＡＲＡｎｔｉｂｏｄｙ（カタログ番号１０４１４－Ｈ０８Ｈ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＩＬＲＡ２に対する抗原結合ドメインは、Ａｂｎｏｖａから入手可能な抗体ＬＩＬＲＡ２モノクローナル抗体（Ｍ１７）、クローン３Ｃ７又はＬｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なマウス抗ＬＩＬＲＡ２抗体、モノクローナル（２Ｄ７）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＤ３００ＬＦに対する抗原結合ドメインは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能な抗体マウス抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル［ＵＰ－Ｄ２］又はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なラット抗ＣＭＲＦ３５様分子１抗体、モノクローナル［２３４９０３］の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＣＬＥＣ１２Ａに対する抗原結合ドメインは、抗体二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）ｓｃＦｖ抗体及びＮｏｏｒｄｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＣＬＥＣ１２Ａ Ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｂｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＬＬ－１ｘＣＤ３ ＢｉＴＥ Ａｎｔｉｂｏｄｙ”５３ｒｄＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １０－１３，２０１１に記載のＡＤＣ及びＭＣＬＡ－１１７（Ｍｅｒｕｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＢＳＴ２（ＣＤ３１７とも称される）に対する抗原結合ドメインは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｏｎｌｉｎｅから入手可能な抗体マウス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル［３Ｈ４］又はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なマウス抗ＣＤ３１７抗体、モノクローナル［６９６７３９］の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＥＭＲ２（ＣＤ３１２とも称される）に対する抗原結合ドメインは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な抗体マウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル［ＬＳ－Ｂ８０３３］又はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なマウス抗ＣＤ３１２抗体、モノクローナル［４９４０２５］の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＬＹ７５に対する抗原結合ドメインは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能な抗体マウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル［ＨＤ３０］又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なマウス抗リンパ球抗原７５抗体、モノクローナル［Ａ１５７９７］の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＧＰＣ３に対する抗原結合ドメインは、Ｎａｋａｎｏ Ｋ，Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ，Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ｇｌｙｐｉｃａｎ ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ．２０１０ Ｎｏｖ；２１（１０）：９０７－９１６に記載の抗体ｈＧＣ３３、又はＭＤＸ－１４１４、ＨＮ３、又はＹＰ７の抗原結合部分、例えばＣＤＲであり、これら３つは、全てＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ．”ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１４ Ｊａｎ ２１；５８８（２）：３７７－８２に記載される。
一実施形態において、ＦＣＲＬ５に対する抗原結合ドメインは、Ｅｌｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“ＦｃＲＬ５ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ”Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｏｃｔ；１１（１０）：２２２２－３２に記載の抗ＦｃＲＬ５抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、ＩＧＬＬ１に対する抗原結合ドメインは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な抗体マウス抗免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル［ＡＴ１Ｇ４］、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能なマウス抗免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１抗体、モノクローナル［ＨＳＬ１１］の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
一実施形態において、抗原結合ドメインは、上記に挙げた抗体からの１つ、２つ、３つの（例えば、３つ全ての）重鎖ＣＤＲ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３及び／又は上記に挙げた抗体からの１つ、２つ、３つの（例えば、３つ全ての）軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上記に挙げた抗体の重鎖可変領域及び／又は可変軽鎖領域を含む。
別の態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体又は抗体断片を含む。一部の態様において、非ヒト抗体は、ヒト化であり、抗体の特定の配列又は領域は、ヒトで天然に産生される抗体又はその断片との類似性が増すように改変される。一態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化である。
ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植（例えば、欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；及び米国特許第５，２２５，５３９号明細書、同第５，５３０，１０１号明細書及び同第５，５８５，０８９号明細書を参照されたい（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ベニアリング又はリサーフェシング（例えば、欧州特許第５９２，１０６号明細書及び欧州特許第５１９，５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９－４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５－８１４；及びＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９－９７３を参照されたい（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、鎖シャフリング（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）を含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られている様々な技術、及び例えば米国特許出願公開第２００５／００４２６６４号明細書、米国特許出願公開第２００５／００４８６１７号明細書、米国特許第６，４０７，２１３号明細書、米国特許第５，７６６，８８６号明細書、国際公開第９３１７１０５号パンフレット、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９－２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３－６０（２０００）、Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７－７９（２０００）、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８－８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（１０）：８９５－９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（８）：１７１７－２２（１９９５）、Ｓａｎｄｈｕ Ｊ Ｓ，Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９－１０（１９９４）並びにＰｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５（３）：９５９－７３（１９９４）（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている技術を使用して生成することができる。多くの場合、抗原結合を変更するために、例えば改善するために、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法により、例えば抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング及び特定の位置における異常なフレームワーク残基を特定するための配列比較によって特定される（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号明細書；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３を参照されたい）。
ヒト化抗体又は抗体フラグメントは、非ヒトである供給源からのものがその中に残っている１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合に「インポート」残基と称され、これらは、通常、「インポート」可変ドメインから採取される。本明細書に提供されるように、ヒト化抗体又は抗体フラグメントは、非ヒト免疫グロブリン分子からの１つ以上のＣＤＲと、フレームワークを構成するアミノ酸残基がヒト生殖細胞系に完全に又はほとんど由来するフレームワーク領域とを含む。抗体又は抗体フラグメントのヒト化のための多くの技術が当技術分野において周知であり、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置き換えることにより、すなわちＣＤＲ移植により（欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；及び米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第６，３３１，４１５号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第６，５４８，６４０号明細書（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従って本質的に実施することができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６（１９８８））。このようなヒト化抗体及び抗体フラグメントでは、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満のものが非ヒト種からの対応する配列によって置き換えられている。ヒト化抗体は、多くの場合、いくつかのＣＤＲ残基及び可能であればいくつかのフレームワーク（ＦＲ）残基が、齧歯類抗体中の類似した部位からの残基によって置き換えられているヒト抗体である。抗体又は抗体フラグメントのヒト化は、ベニアリング若しくはリサーフェシング（欧州特許第５９２，１０６号明細書及び欧州特許第５１９，５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９－４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５－８１４（１９９４）；及びＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１：９６９－９７３（１９９４））又は鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によっても達成され得る。
ヒト化抗体の作製で使用されるためのヒト可変ドメイン、軽鎖及び重鎖の両方の選択は、抗原性を低減させるためのものである。いわゆる「最良適合」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列がヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容される（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）、これらの内容は、その全体が本明細書における参照により本明細書に組み込まれる）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい（これらの内容は、その全体が本明細書における参照により本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えばすべての４つのフレームワーク領域は、ＶＨ４＿４－５９生殖細胞系配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、例えば、対応するネズミ配列でのアミノ酸からの１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの修飾、例えば置換を含むことができる。一実施形態では、軽鎖可変領域のフレームワーク領域、例えばすべての４つのフレームワーク領域は、ＶＫ３＿１．２５生殖細胞系配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、例えば、対応するネズミ配列でのアミノ酸からの１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの修飾、例えば置換を含むことができる。
いくつかの態様では、抗体フラグメントは、標的抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持する状態でヒト化される。本発明の一態様によれば、ヒト化抗体及び抗体フラグメントは、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列及び様々な概念ヒト化産物の解析のプロセスによって調製される。三次元演繹グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を例示且つ表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示の精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の解析、例えば候補免疫グロブリンの標的抗原に結合する能力に影響を与える残基の解析を可能にする。このようにして、標的抗原に対する増加した親和性などの所望の抗体又は抗体フラグメントの特性が達成されるように、ＦＲ残基は、レシピエント及びインポート配列から選択且つ組み合わされ得る。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに直接的且つ最も実質的に関与する。
ヒト化抗体又は抗体フラグメントは、元々の抗体と同様の抗原特異性、例えば本発明では本明細書に記載のヒト癌関連抗原に結合する能力を保持することができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体又は抗体フラグメントは、本明細書に記載されるようなヒト癌関連抗原に結合する改善された親和性及び／又は特異性を有することができる。
一態様では、本発明の抗原結合ドメインは、抗体又は抗体フラグメントの特定の機能的特徴又は特性によって特徴付けられる。例えば、一態様では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるような腫瘍抗原に特異的に結合する。
一態様では、本明細書に記載されるような抗癌関連抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一態様では、本明細書に記載されるような抗癌関連抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２又は二重機能性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））である。一態様では、本発明の抗体及びそのフラグメントは、本明細書に記載されるような癌関連抗原タンパク質に野生型又は増強された親和性で結合する。
ある場合には、ｓｃＦｖは、当技術分野において既知の方法に従って調製することができる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。ＳｃＦｖ分子は、フレキシブルポリマーリンカーを使用してＶＨ及びＶＬ領域を一緒に連結することによって生成することができる。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さ及び／又はアミノ酸組成を有するリンカー（例えば、Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。このリンカー長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折り畳み且つ相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短い（例えば、５～１０個のアミノ酸の）ポリペプチドリンカーが使用される場合、鎖内折り畳みは妨げられる。鎖内折り畳みは、２つの可変領域を一緒にして、機能的エピトープ結合部位を形成することも必要である。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号明細書、同第２００５／０１７５６０６号明細書、同第２００７／００１４７９４号明細書並びに国際公開第２００６／０２０２５８号パンフレット及び同第２００７／０２４７１５号パンフレットを参照されたい。
ｓｃＦｖは、そのＶＬとＶＨ領域との間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個又はそれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含むことができる。リンカー配列は、任意の天然型アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸のグリシン及びセリンを含む。別の実施形態では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなどのグリシンとセリンとの繰り返しの組を含み、式中、ｎは、１以上の正の整数である（配列番号５２）。一実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号４５）又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号４６）であり得る。リンカー長さにおける変動は、活性を保持又は向上させることができ、活性研究において優れた有効性をもたらす。
別の態様では、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）又はそのフラグメント、例えば一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。このようなＴＣＲを作製するための方法は、当技術分野において既知である。例えば、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ ＲＡ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１３６９－１３７７（２０００）；Ｚｈａｎｇ Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １１：４８７－４９６（２００４）；Ａｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９（４）：３６５－７４（２０１２）を参照されたい（参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、ｓｃＴＣＲは、リンカー（例えば、フレキシブルペプチド）によって連結されたＴ細胞クローンからのＶα及びＶβ遺伝子を含有するように操作することができる。このアプローチは、それ自体細胞内にあるが、このような抗原（ペプチド）のフラグメントがＭＨＣによって癌細胞の表面上に提示されている癌関連標的に非常に有用である。
ＣＤ１９抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗原結合ドメインは、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合する（「ＣＤ１９抗原結合ドメイン」）。
一実施形態では、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）に記載されるＦＭＣ６３ ｓｃＦｖフラグメントと同一又は同様の結合特異性を有する。一実施形態では、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれるＮｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）に記載されるｓｃＦｖフラグメントを含む。
一実施形態では、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットに記載される抗原結合ドメイン（例えば、ＣＡＲ１９構築物の抗原結合ドメイン）又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であり、及び／又は１つ、２つ、３つ以上の置換、挿入若しくは欠失、例えば保存置換を有する配列を含む。
一実施形態では、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットの表３による抗原結合ドメイン（例えば、ヒト化抗原結合ドメイン）又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であり、及び／又は１つ、２つ、３つ以上の置換、挿入若しくは欠失、例えば保存置換を有する配列を含む。臨床状況では、ネズミＣＤ１９抗体のヒト化が望ましく、ここで、マウス特異的残基がＣＡＲＴ１９治療、すなわちＣＡＲ１９構築物で形質導入されたＴ細胞による治療を受けた患者において、ヒト抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘発させ得る。ヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ配列の産生、特性評価及び有効性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット（実施例１～５（１１５～１５９頁）を含む）に記載されている。国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットは、様々なＣＤ１９抗原結合ドメイン構築物の結合及び有効性をアッセイする方法も記載している。
一実施形態では、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、配列番号１０４のアミノ酸配列（又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であり、及び／又は１つ、２つ、３つ以上の置換、挿入若しくは欠失、例えば保存置換を有する配列）を含む。
Figure 2023071774000003
ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合する（「ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン」）。
例示的なＢＣＭＡ抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットの表１又は１６に開示される配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であり、及び／又は１つ、２つ、３つ以上の置換、挿入若しくは欠失、例えば保存置換を有する配列を含むことができる。一実施形態では、ＢＣＭＡ抗原結合ドメインは、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットに開示されるＢＣＭＡ－１、ＢＣＭＡ－２、ＢＣＭＡ－３、ＢＣＭＡ－４、ＢＣＭＡ－５、ＢＣＭＡ－６、ＢＣＭＡ－７、ＢＣＭＡ－８、ＢＣＭＡ－９、ＢＣＭＡ－１０、ＢＣＭＡ－１１、ＢＣＭＡ－１２、ＢＣＭＡ－１３、ＢＣＭＡ－１４、ＢＣＭＡ－１５、１４９３６２、１４９３６３、１４９３６４、１４９３６５、１４９３６６、１４９３６７、１４９３６８、１４９３６９、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ａ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｇ１、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７９－Ｃ１、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｃ７、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｄ１０、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７９－Ｃ１２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８０－Ｇ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８０－Ｄ２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ａ１０、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｄ４、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８０－Ａ２、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９８１－Ｃ３、ＢＣＭＡ＿ＥＢＢ－Ｃ１９７８－Ｇ４、Ａ７Ｄ１２．２、Ｃ１１Ｄ５．３、Ｃ１２Ａ３．２又はＣ１３Ｆ１２．１の１つ以上のＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ若しくはｓｃＦｖ又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であり、及び／又は１つ、２つ、３つ以上の置換、挿入若しくは欠失、例えば保存置換を有する配列を含む。
追加の例示的なＢＣＭＡ抗原結合ドメインは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０２１４５０号パンフレット、国際公開第２０１７／０１１８０４号パンフレット、国際公開第２０１７／０２５０３８号パンフレット、国際公開第２０１６／０９０３２７号パンフレット、国際公開第２０１６／１３０５９８号パンフレット、国際公開第２０１６／２１０２９３号パンフレット、国際公開第２０１６／０９０３２０号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４７８９号パンフレット、国際公開第２０１６／０９４３０４号パンフレット、国際公開第２０１６／１５４０５５号パンフレット、国際公開第２０１５／１６６０７３号パンフレット、国際公開第２０１５／１８８１１９号パンフレット、国際公開第２０１５／１５８６７１号パンフレット、米国特許第９，２４３，０５８号明細書、米国特許第８，９２０，７７６号明細書、米国特許第９，２７３，１４１号明細書、米国特許第７，０８３，７８５号明細書、米国特許第９，０３４，３２４号明細書、米国特許出願公開第２００７／００４９７３５号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０２８４４６７号明細書、米国特許出願公開第２０１５／００５１２６６号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０３４４８４４号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１３１６５５号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０２９７８８４号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０２９７８８５号明細書、米国特許出願公開第２０１７／００５１３０８号明細書、米国特許出願公開第２０１７／００５１２５２号明細書、米国特許出願公開第２０１７／００５１２５２号明細書、国際公開第２０１６／０２０３３２号パンフレット、国際公開第２０１６／０８７５３１号公開、国際公開第２０１６／０７９１７７号公開、国際公開第２０１５／１７２８００号公開、国際公開第２０１７／００８１６９号公開、米国特許第９，３４０，６２１号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０２７３０５５号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１７６９７３号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０３６８３５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７／００５１０６８号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３６８９８８号明細書及び米国特許出願公開第２０１５／０２３２５５７号明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、追加の例示的なＢＣＭＡ抗原結合ドメインは、国際公開第２０１２／０１６３８０５号パンフレット（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）からのＶＨ及びＶＬ配列を使用して生成される。
ＣＤ２０抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗原結合ドメインは、ＣＤ２０（例えば、ヒトＣＤ２０）に結合する（「ＣＤ２０抗原結合ドメイン」）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０抗原結合ドメインは、参照により組み込まれる国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレット及びＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５５６２７号明細書による抗原結合ドメインを含む。例示的なＣＤ２０抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５５６２７号明細書の表１～５に開示されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ２０抗原結合ドメインは、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５５６２７号明細書又は国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレットに開示されているＣＤ２０抗原結合ドメインのＣＤＲ、可変領域若しくはｓｃＦｖ配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であり、及び／又は１つ、２つ、３つ以上の置換、挿入若しくは欠失、例えば保存置換を有する配列を含む。
ＣＤ２２抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗原結合ドメインは、ＣＤ２２（例えば、ヒトＣＤ２２）に結合する（「ＣＤ２２抗原結合ドメイン」）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレット及びＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５５６２７号明細書による抗原結合ドメインを含む。例示的なＣＤ２２抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレットの表６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０Ａ及び１０Ｂ並びにＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５５６２７号明細書の表６～１０に開示されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５５６２７号明細書又は国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレットに開示されているＣＤ２２抗原結合ドメインのＣＤＲ、可変領域若しくはｓｃＦｖ配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であり、及び／又は１つ、２つ、３つ以上の置換、挿入若しくは欠失、例えば保存置換を有する配列を含む。
ＥＧＦＲ抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲ（例えば、ヒトＥＧＦＲ、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩ）に結合する（「ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原結合ドメイン」）。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットによる抗原結合ドメインを含む。例示的なＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットの表２に開示されている。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原結合ドメインは、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットに開示されているＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原結合ドメインのＣＤＲ、可変領域若しくはｓｃＦｖ配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であり、及び／又は１つ、２つ、３つ以上の置換、挿入若しくは欠失、例えば保存置換を有する配列を含む。
メソテリン抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗原結合ドメインは、メソテリン（例えば、ヒトメソテリン）に結合する（「メソテリン抗原結合ドメイン」）。いくつかの実施形態では、メソテリン抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５０９０２３０号パンフレット及び国際公開第２０１７１１２７４１号パンフレットによる抗原結合ドメインを含む。例示的なメソテリン抗原結合ドメインは、例えば、国際公開第２０１７１１２７４１号パンフレットの表２、３、４及び５に開示されている。いくつかの実施形態では、メソテリン抗原結合ドメインは、国際公開第２０１５０９０２３０号パンフレット及び国際公開第２０１７１１２７４１号パンフレットに開示されているメソテリン抗原結合ドメインのＣＤＲ、可変領域若しくはｓｃＦｖ配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であり、及び／又は１つ、２つ、３つ以上の置換、挿入若しくは欠失、例えば保存置換を有する配列を含む。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の実施形態において、キメラタンパク質は、キメラタンパク質の細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１つ以上のさらなるアミノ酸、例えば膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域と関連する１つ以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～最大１５アミノ酸）及び／又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関連する１つ以上のさらなるアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～最大１５アミノ酸）を含み得る。一態様において、膜貫通ドメインは、キメラ分子の他のドメインの１つと関連するものであり、例えば、一実施形態において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、ヒンジドメイン又は細胞外ドメインが由来するのと同じタンパク質由来であり得る。別の態様において、膜貫通ドメインは、キメラタンパク質の任意の別のドメインが由来するものと同じタンパク質に由来しない。
一態様において、膜貫通ドメインは、組換えであり得、その場合、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。一態様において、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットを、組換え膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。
細胞質ドメイン
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性方向又は阻害性方向のいずれかで制御する。刺激性方向で作用する初代細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有初代細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２のものを含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、修飾型ＩＴＡＭドメイン、例えば天然ＩＴＡＭドメインと比べて変更された（例えば、増加した又は減少した）活性を有する変異型ＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、修飾型ＩＴＡＭを含有する一時細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば最適化された及び／又は短縮されたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
共刺激シグナル伝達ドメインとは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、リンパ球の抗原に対する効率的な応答に必要である、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。例えば、ＣＤ２７共刺激は、増殖、エフェクター機能及びインビトロでのヒトＣＡＲＴ細胞の生存を増強することが証明されており、インビボでのヒトＴ細胞の持続性及び抗腫瘍活性を増強させる（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（３）：６９６－７０６）。このような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ及びＣＤ１９ａが挙げられる。
調節可能なキメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ活性が制御され得る調節可能なＣＡＲ（ＲＣＡＲ）は、ＣＡＲ療法の安全性及び有効性を最適化するために望ましい。ＣＡＲ活性が制御され得る多くの方法がある。例えば、二量体化ドメインに融合されたカスパーゼを使用する例えば誘導性アポトーシス（例えば、Ｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｇｎｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１１ Ｎｏｖ．３；３６５（１８）：１６７３－１６８３を参照されたい）は、本発明のＣＡＲ療法において安全スイッチとして使用することができる。一態様では、ＲＣＡＲは、ポリペプチドの組、典型的には、最も簡単な実施形態では２つのポリペプチドの組を含み、この中で、本明細書に記載の標準ＣＡＲの構成要素、例えば抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインが別々のポリペプチド又はメンバー上に分割されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの組は、二量体化分子の存在時、ポリペプチドを互いに結合することができる、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合することができる二量体化スイッチを含む。
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは、非共有結合性又は共有結合性であり得る。非共有結合性二量体化スイッチでは、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有結合性相互作用を促進する。共有結合性二量体化スイッチでは、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有結合性相互作用を促進する。
実施形態では、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰベースの又はＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含み、ＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ又はＦＫ５０６結合タンパク質）は、天然物免疫抑制剤のラパマイシンに対する初期細胞内標的として機能する豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰに結合し、且つ大型のＰＩ３Ｋ総胴体ＦＲＡＰ（ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ）に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ－ラパマイシン複合体に結合するのに十分であるＦＲＡＰの９３個のアミノ酸部分である（Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｆ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｊ．＆Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．（１９９５）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ １１－ｋＤａ ＦＫＢＰ１２－ｒａｐａｍｙｃｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ２８９－ｋＤａ ＦＫＢＰ１２－ｒａｐａｍｙｃｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｅｒｉｎｅ ｒｅｓｈｉｄｕｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２：４９４７－５１）。
実施形態では、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰベース、例えばＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えばラパマイシン又はラパマイシン類似体を使用することができる。
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure 2023071774000004
実施形態では、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシン又はラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の存在下において、ＦＲＢ又はそのフラグメント若しくは類似体に結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメントを含むことができ、例えば、これは、下記の下線を施した部分である。
Figure 2023071774000005
ＦＲＢのアミノ酸配列は、以下の通りである。
Figure 2023071774000006
実施形態では、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢベースのスイッチドメイン、例えば修飾型ＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインと、二量体化分子、例えばラパマイシン又はラパログ、例えばＲＡＤ００１との間の変更された、例えば増強された複合体形成を示す修飾型ＦＲＢスイッチドメインを含む。実施形態では、修飾型ＦＲＢスイッチドメインは、１つ以上の突然変異、例えばアミノ酸位置における突然変異Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５及びＦ２１０８から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の突然変異を含み、ここで、野生型アミノ酸は、任意の他の天然型アミノ酸に突然変異されている。実施形態では、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２において突然変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は、フェニルアラニン（Ｅ２０３２Ｆ）、メチオニン（Ｅ２０３２Ｍ）、アルギニン（Ｅ２０３２Ｒ）、バリン（Ｅ２０３２Ｖ）、チロシン（Ｅ２０３２Ｙ）、イソロイシン（Ｅ２０３２Ｉ）又はロイシン（Ｅ２０３２Ｌ）に突然変異されている。実施形態では、変異体ＦＲＢは、Ｔ２０９８において突然変異を含み、ここで、Ｔ２０９８は、フェニルアラニン（Ｔ２０９８Ｆ）又はロイシン（Ｔ２０９８Ｌ）に突然変異されている。実施形態では、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２及びＴ２０９８において突然変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は、任意のアミノ酸に突然変異され、且つＴ２０９８は、任意のアミノ酸に突然変異されている。実施形態では、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２Ｉ及びＴ２０９８Ｌの突然変異を含む。実施形態では、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２Ｌ及びＴ２０９８Ｌの突然変異を含む。
Figure 2023071774000007
他の好適な二量体化スイッチとしては、ＧｙｒＢ－ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／バインダー二量体化スイッチ及びｈａｌｏ－ｔａｇ／ｓｎａｐ－ｔａｇ二量体化スイッチが挙げられる。本明細書に提供される指針に従えば、このようなスイッチ及び関連する二量体化分子は、当業者に明らかであろう。
二量体化分子
スイッチドメイン間の会合は、二量体化分子によって促進される。二量体化分子の存在下では、スイッチドメイン間の相互作用又は会合は、第１のスイッチドメインと関連する、例えば第１のスイッチドメインに融合されたポリペプチドと、第２のスイッチドメインと関連する、例えば第２のスイッチドメインに融合されたポリペプチドとの間のシグナル伝達を可能にする。非限定レベルの二量体化分子の存在下では、シグナル伝達は、例えば、本明細書に記載の系で測定されるとき、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、５、１０、５０、１００倍まで増加される。
ラパマイシン及びラパマイシン類似体（ときにラパログとも称される）、例えばＲＡＤ００１は、本明細書に記載のＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用することができる。実施形態では、二量体化分子は、ラパマイシン（シロリムス）、ＲＡＤ００１（エベロリムス）、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ－２３５７３（リダホロリムス）、バイオリムス及びＡＰ２１９６７から選択することができる。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチと使用するのに好適な追加のラパマイシン類似体は、「併用療法」と題されたセクション又は「例示的なｍＴＯＲ阻害剤」と題されたサブセクションでさらに記載されている。
２つ以上のキメラ膜タンパク質を含む系
一態様では、本発明は、細胞中で発現されると、例えば２つ以上の抗原、例えば腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載される）に対して特性を有するＴＣＲの形成をもたらすキメラ膜タンパク質の系を提供する。このような系は、これらが本明細書に記載の二量体化ドメインを必要としないが（これらが含む場合があるが）、抗原結合ドメインがＴＣＲの２つ以上の構成要素に連結するため、ＴＣＲが組み立てられると、ＴＣＲは、抗原結合ドメインの抗原に対して変更された特異性を有するという点で有利である。この系は、１つ以上の細胞内共刺激ドメインをさらに含む。理論に束縛されるものではないが、１つ以上の細胞内共刺激ドメインの封入は、抗原認識時のＴＣＲのＣＤ３ζドメイン及び１つ又は複数の共刺激ドメインを通る両方のシグナル伝達を可能にする。
従って、本発明は、
第１の抗原結合ドメイン及びＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第１の細胞内共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む第１のキメラ膜タンパク質、及び
第２の抗原結合ドメイン及びＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、任意選択によりＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含む第２のキメラ膜タンパク質
を含む系を提供し、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとは、同一ではなく、ＣＤ３γ、δ又はεの第１の細胞外ドメインとＣＤ３γ、δ又はεの第２の細胞外ドメインとは、同一ではない。
キメラ膜タンパク質の例示的な実施形態は、図４１に示されている。
実施形態では、第１のＣＤ３γ、δ又はε細胞外ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はε細胞外ドメイン全体を含む。
実施形態では、第２のＣＤ３γ、δ又はε細胞外ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はε細胞外ドメイン全体である。
実施形態では、ａ）第１のキメラタンパク質は、ＣＤ３ε細胞外ドメイン全体を含み、及び第２のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ細胞外ドメイン全体を含み；ｂ）第１のキメラタンパク質は、ＣＤ３ε細胞外ドメイン全体を含み、及び第２のキメラタンパク質は、ＣＤ３δ細胞外ドメイン全体を含み；又はｃ）第１のキメラタンパク質は、ＣＤ３δ細胞外ドメイン全体を含み、及び第２のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ細胞外ドメイン全体を含む。
実施形態では、第１のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質の全体、例えばＣＤ３γ、δ又はεタンパク質の細胞外、膜貫通及び細胞内ドメインを含む。
実施形態では、第２のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質の全体、例えばＣＤ３γ、δ又はεタンパク質の細胞外、膜貫通及び細胞内ドメインを含む。
他の実施形態では、第１のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質に由来するいかなる細胞内ドメインも含まない。実施形態では、第２のキメラタンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質に由来するいかなる細胞内ドメインも含まない。
実施形態では、第１のキメラタンパク質及び／又は第２のキメラタンパク質の膜貫通ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの膜貫通ドメインを含まない。
実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεに由来する前記第１の細胞外ドメインに対してＮ末端に位置する。実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεに由来する前記第２の細胞外ドメインに対してＮ末端に位置する。実施形態では、第１のキメラタンパク質、第２のキメラタンパク質又は第１及び第２のキメラタンパク質の両方は、前記第１及び／又は第２の抗原結合ドメインに対してＮ末端に位置する第３の抗原結合ドメインを含む。
実施形態では、第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεに由来する前記第１の細胞外ドメインとは、第１のリンカー、例えば本明細書に記載のリンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカー（配列番号６８）（式中、ｎは、０～１０の整数であり、例えば、ｎは、４に等しい）によって結合され、及び／又は第２の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεに由来する前記第２の細胞外ドメインとは、第２のリンカー、例えば本明細書に記載のリンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカー（配列番号６８）又は（ＧＧＧＳ）ｎリンカー（配列番号６９）（式中、ｎは、０～１０の整数であり、例えば、ｎは、４に等しい）によって結合されている。或いは、当技術分野において既知であるように、剛直なリンカー（例えば、プロリンリッチリンカー）が使用され得る。
実施形態では、系の２つのキメラ膜タンパク質の１つのみが、細胞内共刺激ドメイン、例えば本明細書に記載の細胞内共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。実施形態では、前記キメラ膜タンパク質は、１つのみの細胞内共刺激ドメインからなる。他の実施形態では、前記膜タンパク質は、２つ以上の（例えば、２つの）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態では、両方の第１のキメラ膜タンパク質及び第２のキメラ膜タンパク質は、それぞれＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する細胞内共刺激ドメインを含む。実施形態では、細胞内共刺激ドメインは、同一のものである（例えば、両方が４－１ＢＢ共刺激ドメインである）。他の実施形態では、これらは、異なる（例えば、一方が４－１ＢＢ共刺激ドメインであり、他方がＣＤ２８共刺激ドメインである）。これらの共刺激ドメインは、本明細書に記載の共刺激ドメインから選択される。実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通ドメインに直接隣接して（例えば、Ｃ末端の直近に）配置される。他の実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεドメインの細胞内部分に対して、例えばＣＤ３γ、δ若しくはεの細胞内部分全体又はＣＤ３γ、δ若しくはε切断部分に対してＣ末端に配置される。
実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載される通りである。実施形態では、１つ以上の抗原結合ドメインは、抗体又は抗体様分子である。実施形態では、抗原結合ドメインの１つ以上（例えば、系に存在する抗原結合ドメインのそれぞれ）は、ｓｃＦｖである。実施形態では、両方の第１及び第２の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に結合する。実施形態では、両方の第１及び第２の抗原結合ドメインは、Ｂ－細胞抗原（例えば、本明細書に記載されるような）に結合する。好ましい実施形態では、Ｂ－細胞抗原は、ＣＤ１９及びＣＤ２０、ＣＤ２０及びＣＤ２２又はＣＤ１９及びＣＤ２２である。他の実施形態では、１つの抗原結合ドメインは、Ｂ－細胞抗原（例えば、本明細書に記載されるような）、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０又はＣＤ２２に結合し、他方は、固形腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載されるような）、例えばメソテリン又はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。
実施形態では、キメラ膜タンパク質の１つ以上は、２つ以上、例えば２つの抗原結合ドメインを含む。例として、このような抗原結合ドメインは、任意選択によりそれらの間に配置されたリンカーを伴うタンデムｓｃＦｖ抗原結合ドメインとして表示され得る。このようなタンデムｓｃＦｖ配置は、図４１に示されている。
本明細書に企図される系を用いて組み立てられたＴＣＲの特定の例は、図４２、図４３、図４４、図４５又は図４６に示されている。
実施形態では、本発明のキメラ膜タンパク質の１つ以上の天然の相同体（例えば、天然のＣＤ３ε、δ又はγ相同体）の発現を低減又は排除することが有益であり得る。従って、本発明は、本明細書に記載の系を含む細胞を提供し、この細胞は、系がタンパク質のキメラ変形を含む場合の低減又は排除された内因性ＣＤ３ε、δ及び／又はγタンパク質の発現をさらに有する。従って、例えば、実施形態において系がＣＤ３δの細胞外ドメインのすべて又は一部を含む第１のキメラ膜タンパク質と、ＣＤ３γの細胞外ドメインのすべて又は一部を含む第２のキメラ膜タンパク質とを含む場合、前記系を含む細胞も、低減又は排除された内因性ＣＤ３γ及び／又はＣＤ３δの発現を有する。理論に束縛されるものではないが、キメラ膜タンパク質の内因性対応物のこのような低減又は排除された発現は、キメラタンパク質によるＴＣＲ形成を好み、系の１つのみのキメラ膜タンパク質によるか又はキメラ膜タンパク質を含まずに形成される細胞表面上のＴＣＲを低減又は排除することになると考えられる。このようなＴＣＲの１つ以上の内因性構成要素の発現を低減又は排除するのに有用な分子及び系としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及び本明細書に記載の遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮ遺伝子編集）系が挙げられる。
Figure 2023071774000008
Figure 2023071774000009
Figure 2023071774000010
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明は、本明細書に記載の１つ以上のキメラタンパク質構築物をコードする核酸分子も提供する。一態様では、この核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一態様では、この核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。
所望の分子をコードする核酸配列は、例えば、標準的技術を使用して、遺伝子を発現する細胞からライブラリをスクリーニングすることによって、遺伝子を、それを含むことが知られているベクターから誘導することによって、又は遺伝子を含有する細胞及び組織から直接単離することによってなど、当技術分野において既知の組換え法を使用して得ることができる。或いは、目的の遺伝子は、クローニングよりむしろ合成的に生成することができる。
本発明は、本発明のＤＮＡが挿入されているベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスから誘導されるベクターは、これらが導入遺伝子の長期の安定した組み込み及び娘細胞中のその増殖を可能にするために、長期の遺伝子移入を達成するのに適切なツールである。レンチウイルスベクターは、これらが肝細胞などの非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターを超える追加の利点を有する。これらは、低免疫原性という追加の利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、γレトロウイルスベクターであり得る。γレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル（ψ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、１つ以上の（例えば、２つの）長い末端反復（ＬＴＲ）及び目的の導入遺伝子、例えばキメラタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。γレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖなどのウイルス構造遺伝子を欠如し得る。例示的なγレトロウイルスベクターとしては、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）及び骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）並びにこれらから誘導されたベクターが挙げられる。他のγレトロウイルスは、例えば、Ｔｏｂｉａｓ Ｍａｅｔｚｉｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１１ Ｊｕｎ；３（６）：６７７－７１３に記載されている。
別の実施形態では、本発明の所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、キメラタンパク質をコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー（ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ）、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成することができる。以下のＪｕｎｅ ｅｔ ａｌ．２００９Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９．１０：７０４－７１６（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
細胞の供給源
増殖及び遺伝子改変又は他の改変に先立って、細胞、例えばＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の供給源を対象から得ることができる。「対象」という用語は、免疫応答が誘発され得る生存生物（例えば、哺乳動物）を含むように意図される。対象の例としては、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びこれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織及び腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。
本発明の特定の態様において、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離など、当業者に知られるあらゆる技術を使用して、対象から採取した血液の単位から得ることができる。ある好ましい態様において、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、典型的にはＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球及び血小板を含む。一態様において、アフェレーシスにより採取した細胞は、血漿画分を除去するために洗浄し、任意選択により細胞を続くプロセシング過程のために適切な緩衝液又は媒体に入れる。本発明の一態様において、細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。別の実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、又は全てではないにしても多くの二価カチオンを欠き得る。
カルシウム非存在下の初期活性化過程は、活性化の増強に至り得る。当業者に容易に認識されるように、洗浄工程は、製造業者の指示に従う半自動化「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）により達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ又は他の緩衝剤を含む又は含まない食塩水溶液など、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。代わりに、アフェレーシス試料の望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
本出願の方法は、５％以下、例えば２％の、ヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、既知培養培地条件及び組成物、例えばＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ Ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１５）４，ｅ３１；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．３１に記載のものを用い得ることが認識される。
一態様において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離又は向流遠心溶出法により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。
本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載される、例えば陰性選択技術を使用する、例えばＴ制御性細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞の特異的亜集団、例えばＴ細胞の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御性枯渇細胞集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
一実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ－２を使用して集団から除去する。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンドを基質、例えばビーズにコンジュゲートするか又は他に基質、例えばビーズ上に被覆させる。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメントを本明細書に記載の基質にコンジュゲートさせる。
一実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除去する。一実施形態において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比は、１ｅ７細胞対２０μＬ、又は１ｅ７細胞対１５μＬ、又は１ｅ７細胞対１０μＬ、又は１ｅ７細胞対５μＬ、又は１ｅ７細胞対２．５μＬ、又は１ｅ７細胞対１．２５μＬである。一実施形態において、例えばＴ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋枯渇のために５億細胞／ｍｌを使用する。さらなる態様において、６億、７億、８億又は９億細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。
一実施形態において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞集団は、約６×１０９ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。他の態様において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞集団は、約１×１０９～１×１０１０（及びその間の任意の整数値）ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。一実施形態において、得られたＴ制御性枯渇細胞集団は、２×１０９Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞又はそれ未満（例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７又はそれ未満のＣＤ２５＋細胞）を含む。
一実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞を、例えばチュービング１６２－０１など、枯渇チュービングセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して集団から除去する。一実施形態において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を例えばＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１などの枯渇設定において動かす。
特定の理論に拘束されることを望まないが、アフェレーシス前又はキメラタンパク質発現細胞産物の製造中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少（例えば、望まない免疫細胞、例えばＴＲＥＧ細胞の数の減少）は、対象の再発リスクを減らし得る。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇する方法は、当技術分野で知られている。例えば、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体（抗ＧＩＴＲ本明細書に記載の抗体）、ＣＤ２５枯渇及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、製造方法は、キメラタンパク質発現細胞製造前のＴＲＥＧ細胞の数の減少（例えば、枯渇）を含む。例えば、製造方法は、例えば、試料、例えばアフェレーシス試料を抗ＧＩＴＲ抗体及び／又は抗ＣＤ２５抗体（又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド）と接触させ、キメラタンパク質発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）産物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させることを含む。
一実施形態において、対象は、細胞採取前にＴＲＥＧ細胞を減らす１つ以上の治療で前処置されており、それにより対象が細胞処置を再び必要とするリスクを軽減する。一実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を低減する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇又はこれらの組み合わせの１つ以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇又はこれらの組み合わせの１つ以上の投与は、細胞産物注入前、注入中又は注入後に行われ得る。
一実施形態において、除去すべき細胞集団は、制御性Ｔ細胞又は腫瘍細胞ではなく、細胞の増殖及び／又は機能に他に負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５又は潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。一実施形態において、このような細胞は、制御性Ｔ細胞及び／又は腫瘍細胞と同時に、又は前記枯渇後に、又は別の順番で除去することが意図される。
本明細書に記載の方法は、２つ以上の選択工程、例えば２つ以上の枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。１つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫粘着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含み得る。
本明細書に記載の方法は、腫瘍抗原、例えばＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４又はＣＤ１１ｂを発現する細胞集団からの除去をさらに含み、それによりキメラタンパク質の発現に適するＴ制御性枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇及び腫瘍抗原枯渇細胞集団を提供する。一実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御性、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗腫瘍抗原抗体又はそのフラグメントを同じ基質、例えばビーズに結合でき、これを細胞の除去に使用でき、又は抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗腫瘍抗原抗体又はそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去及び腫瘍抗原発現細胞の除去は、逐次的であり、例えばいずれの順番でも生じ得る。
チェックポイント阻害剤、例えば本明細書に記載のチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えばＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞及びＴＩＭ３＋細胞の１つ以上の集団からの除去を含み、それによりＴ制御性枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇細胞及びチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えばＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋及び／又はＴＩＭ３＋枯渇細胞集団を提供する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤は、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ及びＬＡＩＲ１を含む。一実施形態において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御性、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はそのフラグメントを同じビーズに結合でき、それを細胞の除去に使用でき、又は抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去及びチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は、逐次的であり、例えばいずれ順序の順番でも生じ得る。
本明細書に記載の方法は、陽性選択工程を含み得る。例えば、Ｔ細胞を、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な時間にわたり、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）コンジュゲートビーズとインキュベーションすることにより単離することができる。一実施形態において、時間は、約３０分である。さらなる実施形態において、時間は、３０分～３６時間又はそれより長い範囲及びその間の任意の整数値である。さらなる実施形態において、時間は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間又は６時間である。さらに別の実施形態において、時間は、１０～２４時間、例えば２４時間である。腫瘍組織又は免疫不全状態個体から腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を単離するような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕獲効率を高め得る。そのため、単にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合させる時間を短くするか若しくは長くし、及び／又はビーズ対Ｔ細胞比を増加若しくは減少させる（さらに本明細書に記載のとおり）ことにより、Ｔ細胞の亜集団は、培養開始時のために若しくはそれに対して又は過程中の他の時点で優先的に選択され得る。さらに、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体比を増加又は減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団は、培養開始時のために若しくはそれに対して又は他の所望の時点で優先的に選択され得る。
一実施形態において、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ及びパーフォリン又は他の適切な分子、例えば他のサイトカインの１つ以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、国際公開第２０１３／１２６７１２号パンフレットに記載する方法により決定できる。
陽性又は陰性選択により所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は、変わり得る。一態様において、細胞とビーズとの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞とを一緒に混合する体積を有意に低下させる（例えば、細胞濃度を増加させる）ことが望まれ得る。例えば、一態様において、１００億細胞／ｍｌ、９０億細胞／ｍｌ、８０億細胞／ｍｌ、７０億細胞／ｍｌ、６０億細胞／ｍｌ又は５０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。一態様において、１０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。さらなる態様において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。
高濃度を使用して細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞の、又は多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病性血液、腫瘍組織など）からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有し得、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
関連する態様において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞で選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕獲される。一態様において、使用する細胞の濃度は５×１０６／ｍｌである。他の態様において、使用する濃度は約１×１０５／ｍｌ～１×１０６／ｍｌ及びその間の任意の整数値であり得る。
他の態様において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で２～１０℃又は室温においてローテータでインキュベートし得る。
刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄工程後凍結させ得る。理論に拘束されることを望まないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団から顆粒球及びある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液及びパラメータが当技術分野で知られ、これに関連して有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ又は１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ又は３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯを含む培養培地、又は例えばＨｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１°／分の速度で－８０℃に凍結し、気相の液体窒素貯蔵タンクに保存する。制御凍結の他の方法並びに直接－２０℃又は液体窒素の非制御凍結も使用できる。
特定の態様において、凍結保存細胞を本明細書に記載のように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化前に室温で１時間休息させる。
本発明に関連して、本明細書に記載の増殖細胞が必要となり得る時点の前の期間における対象からの血液試料又はアフェレーシス産物の収集も企図されている。従って、増殖する細胞の供給源を必要な任意の時点で採取でき、Ｔ細胞などの所望の細胞を、本明細書に記載のものなどの免疫エフェクター細胞療法からの利益があるであろう任意の数の疾患及び状態について、免疫エフェクター細胞治療におけるその後の使用のために単離及び凍結できる。一態様において、血液試料又はアフェレーシスを一般に健常対象から採取する。一態様において、血液試料又はアフェレーシスを、一般に、疾患を発症するリスクにあるが、依然として疾患を発症していない健常対象から採取し、目的の細胞をその後の使用のために単離及び凍結する。一態様において、Ｔ細胞をその後の時点で増殖、凍結及び使用し得る。一態様において、試料を、本明細書に記載の特定の疾患の診断の直後に、しかし、何らかの処置前に患者から採取する。さらなる態様において、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８及び照射などの抗体又は他の免疫除去剤による処置を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連する処置モダリティの前に対象からの血液試料又はアフェレーシスから細胞を単離する。
本発明のさらなる態様において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、患者から直接得る。ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直後、患者が、通常、その処置から回復するまでの間、得られるＴ細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適であり得るか又は改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着及びインビボ増殖増強について好ましい状態であり得る。そのため、本発明に関連して、Ｔ細胞、樹状細胞又は造血細胞系統の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。さらに、一態様において、可動化（例えば、ＧＭ－ＣＳＦでの可動化）及びコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び／又は増殖に好都合である条件を、特に治療後の定められた時間枠中に対象に形成できる。細胞型の例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び免疫系の他の細胞を含む。
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書に記載のＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得る。一実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作される免疫エフェクター細胞集団、例えばＴ細胞を、対象又は対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベル又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比が少なくとも一過性に増加するように、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬から十分な時間後又は十分な用量の後に採取する。
他の実施形態において、免疫エフェクター細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増やすか又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比を増やす量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理できる。
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ ＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか、又はＤＧＫ活性が低下した又は阻害された細胞である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減又は阻止するための遺伝的方法、例えばＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。代わりに、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書に記載のＤＧＫ阻害剤での処置により産生できる。
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか、又はイカロス活性が低下した又は阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減又は阻止するための遺伝的方法、例えばＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。代わりに、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えばレナリドマイドでの処置により産生できる。
実施形態において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損及びイカロス欠損であり、例えばＤＧＫ及びイカロスを発現せず、又はＤＧＫ及びイカロス活性が低下又は阻害されている。このようなＤＧＫ及びイカロス欠損細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかにより産生できる。
一実施形態において、ＮＫ細胞を対象から得る。別の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えばＮＫ－９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
同種細胞
本明細書に記載の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩの発現を欠く同種Ｔ細胞である。
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように操作され、機能的ＴＣＲを含む１つ以上のサブユニットを発現しないように操作され、又はその表面に微少の機能的ＴＣＲを産生するように操作され得る。代わりに、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１つ以上の変異した又は切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現し得る。用語「実質的に障害されたＴＣＲ」は、このＴＣＲが宿主で有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。
本明細書に記載のＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作され得る。例えば、本明細書に記載のＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラス１及び／又はＨＬＡクラスＩＩが下方制御されるように操作され得る。
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲ及び機能的ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩを欠き得る。
機能的ＴＣＲ及び／又はＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲ又はＨＬＡの１つ以上のサブユニットのノックアウト又はノックダウンを含む任意の適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用したＴＣＲ及び／又はＨＬＡのノックダウンを含み得る。
一部の実施形態において、同種細胞は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにより、阻害性分子を発現しないか又は低レベルで発現する細胞であり得る。例えば、細胞は、阻害分子を発現しないか又は阻害分子を低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦβを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、細胞性能を最適化できる。実施形態において、例えば本明細書に記載の阻害性核酸、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）、転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用できる。
ＴＣＲ又はＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ
一部の実施形態において、ＴＣＲ発現及び／又はＨＬＡ発現を、Ｔ細胞におけるＴＣＲ及び／又はＨＬＡをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して阻害できる。
Ｔ細胞中のｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系などの任意の従来の発現系を使用して達成することができる。
ＴＣＲの構成要素の発現をダウンレギュレートする例示的なｓｈＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２１６６７号明細書に記載されている。ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現をダウンレギュレートする例示的なｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７７３号明細書に記載されている。
ＴＣＲ又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ」若しくは「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ」は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの組又はこのようなリピートの組を含む系を指す。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系は、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子を発現停止させるか又は変異させるために使用することができる、ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓから誘導された系を指す。
天然型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムのおよそ４０％及び配列決定された古細菌のおよそ９０％で見出されている。Ｇｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８：１７２。この系は、プラスミド及びファージなどの外来遺伝子エレメントに耐性を与えて、後天的免疫の一形態を提供する１種の原核生物免疫系である。Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１７０９－１７１２；Ｍａｒｒａｇｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１８４３－１８４５。
従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子を編集する（塩基対を付加するか又は欠失させる）ために、或いはＴＣＲ及び／又はＨＬＡの発現を結果として減少させる未成熟終止を導入するために使用することができる。或いは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＲＮＡ干渉のように使用することができ、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子を可逆的な方法で遮断する。例えば、哺乳動物細胞では、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＴＣＲ及び／又はＨＬＡプロモーターまで導き、ＲＮＡポリメラーゼを立体的にブロックすることができる。
当技術分野で知られる技術、例えば米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号明細書及びＣｏｎｇ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３に記載のものを使用して、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を産生できる。例えば、Ｔｓａｉ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：６ ５６９－５７６、米国特許第８，８７１，４４５号明細書；同第８，８６５，４０６号明細書；同第８，７９５，９６５号明細書；同第８，７７１，９４５号明細書；及び同第８，６９７，３５９号明細書に記載されるもののような、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害する当技術分野で知られる他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系も産生できる。
ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ」は、ＨＬＡ及び／又はＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼを指す。
ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
「ＺＦＮ」、又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲに対するＺＦＮ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ」は、ＨＬＡ及び／又はＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上の亜鉛フィンガーを含む。Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １８８：７７３－７８２；及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１５６－１１６０を参照されたい。
テロメラーゼ発現
何らかの特定の理論に拘束されることを望まないが、一実施形態において、治療的Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短縮されたテロメアのために患者における残留性が短く、従って、テロメラーゼ遺伝子を用いるトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善し得る。Ｃａｒｌ Ｊｕｎｅ，“Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１７：１４６６－１４７６（２００７）を参照されたい。そのため、一実施形態において、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞、異所性にテロメラーゼサブユニット、例えばテロメラーゼの触媒的サブユニット、例えばＴＥＲＴ、例えばｈＴＥＲＴを発現する。いくつかの態様において、本開示は、細胞をテロメラーゼサブユニット、例えばテロメラーゼの触媒的サブユニット、例えばＴＥＲＴ、例えばｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることを含む、細胞を産生する方法を提供する。細胞を、キメラタンパク質をコードする構築物と接触させる前に、同時に又は後に核酸と接触させ得る。
免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化及び増殖
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載する方法を使用して一般的に活性化及び増殖できる。
一般に、免疫エフェクター細胞、例えばＴ制御性細胞枯渇細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤が結合したその表面とＴ細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドを接触させることにより増殖できる。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は抗ＣＤ２抗体との接触又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベータ（例えば、ブリオスタチン）との接触により、本明細書に記載のように刺激し得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞集団を、Ｔ細胞の増殖刺激に適する条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用できる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８を含み（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、当技術分野で一般に知られる他の方法のように使用できる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）。
特定の態様において、Ｔ細胞のための一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中でも表面と結合し得る。表面に結合しているとき、薬剤は、同じ表面（即ち「シス」形態）又は別の表面（即ち「トランス」形態）に結合し得る。代わりに、一方の薬剤が表面に結合し、他方が溶液にあり得る。一態様において、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中であるか又は表面と結合する。一態様において、両剤は、溶液中にあり得る。一態様において、薬剤は、不溶性形態であり、Ｆｃ受容体又は抗体又は薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面に架橋され得る。この点に関して、例えば本発明におけるＴ細胞の活性化及び増殖のために意図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書及び同第２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
一態様において、２剤は、ビーズに、同じビーズ、即ち「シス」又は別のビーズ、即ち「トランス」で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合フラグメントであり、両剤は、均等な分子量で同じビーズに共固定化される。一態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びＴ細胞増殖のためのビーズに結合した１：１比の各抗体を使用する。本発明の一態様において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増殖が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を使用する。特定の一態様において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して約１～約３倍増加が観察される。一態様において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体比は、１００：１～１：１００及びその間の全ての整数値の範囲である。一態様において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合しており、即ちＣＤ３：ＣＤ２８比が１未満である。一態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体比は、２：１より大きい。特定の一態様において、ビーズに結合した１：１００ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：７５ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる態様において、ビーズに結合した１：５０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：３０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある好ましい態様において、ビーズに結合した１：１０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：３ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる態様において、ビーズに結合した３：１ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。
１：５００～５００：１及びその間の任意の整数値の粒子対細胞比をＴ細胞又は他の標的細胞の刺激のために使用し得る。当業者に容易に認識され得るように、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、少ない細胞にのみ結合でき、大きいビーズは、多く結合できる。一態様において、細胞対粒子比は、１：１００～１００：１及びその間の任意の整数値の範囲であり、さらなる態様において１：９～９：１及びその間の任意の整数値からなる比をＴ細胞刺激に使用し得る。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は、上記のように変わり得るが、しかしながら、ある好ましい値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１及び１５：１を含み、１つの好ましい比は少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。一態様において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。特定の一態様において、好ましい粒子：細胞比は、１：５である。さらなる態様において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、一態様において、粒子対細胞比は、１日目は１：１～１０：１であり、さらなる粒子をその後１０日目まで連日又は隔日で細胞に添加し、最終比１：１～１：１０である（添加の比の細胞数に基づく）。特定の一態様において、粒子対細胞比は、刺激１日目に１：１であり、刺激３日目及び５日目に１：５に調節する。一態様において、粒子を、１日目の１：１及び刺激３日目及び５日目の１：５の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。一態様において、粒子対細胞比は、刺激１日目は２：１であり、刺激３日目及び５日目に１：１０に調節する。一態様において、粒子を、１日目の１：１及び３日目及び５日目の１：１０の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径並びに細胞サイズ及びタイプによる。一態様において、使用するための最も典型的な比は、１日目の１：１、２：１及び３：１付近である。
さらなる態様において、Ｔ細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズ及び細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。異なる態様において、培養前に薬剤被覆ビーズ及び細胞を分離するが、一緒に培養する。さらなる態様において、ビーズ及び細胞を磁気力などの力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ（３ｘ２８ビーズ）とＴ細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。一態様において、細胞（例えば、１０４～１０９Ｔ細胞）及びビーズ（例えば、ＤＹＮＡビーズＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズを１：１比）を緩衝液、例えばＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価カチオンなし）中で合わせる。再び、任意の細胞濃度を使用し得ることが当業者に容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、試料中で極めて稀であり、試料の０．０１％のみが含まれるか又は試料全体（即ち１００％）が目的の標的細胞で構成され得る。従って、あらゆる細胞数が本発明に関連して一体となる。一態様において、細胞と粒子との最大接触を確実にするために、粒子及び細胞を混合する体積を有意に減少させる（即ち細胞の濃度を高める）ことが望ましいことがある。例えば、一態様において、約１００億細胞／ｍｌ、９０億／ｍｌ、８０億／ｍｌ、７０億／ｍｌ、６０億／ｍｌ、５０億／ｍｌ又は２０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。一態様において、１億細胞／ｍｌ超を使用する。さらなる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万又は５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらなる態様において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度を使用する。さらなる態様において、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有し得、及び特定の態様では得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度細胞の使用は、通常、ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
一実施形態において、本明細書に記載の核酸が形質導入された細胞を例えば本明細書に記載の方法により増殖する。一実施形態において、細胞を数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間）～約１４日（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日）の期間の培養により増殖する。
Ｔ細胞の培養期間が６０日以上となり得るような数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清（例えば、胎児ウシ又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ－α又は当業者に知られる細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート、及びＮ－アセチル－システイン、及び２－メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、無血清又は適切な量の血清（又は血漿）が添加されたか、又は規定された組のホルモン及び／又はＴ細胞の増殖及び拡大に十分な量のサイトカインが添加されたＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５及びＸ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンは、実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養に含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。
一実施形態において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーなどの本明細書に記載の方法により測定して、１４日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）増加をもたらす１つ以上のインターロイキンを含む適切な培地（例えば、本明細書に記載の培地）で増殖させる。一実施形態において、細胞は、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－７（例えば、ＩＬ－１５及びＩＬ－７）の存在下で増殖させる。
実施形態において、本明細書に記載の方法は、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞を、例えば抗ＣＤ２５抗体又はそのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ－２を使用して細胞集団から除去することを含む。細胞集団からＴ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞を除去する方法は、本明細書に記載される。実施形態において、方法、例えば製造方法は、細胞集団（例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞などのＴ制御性細胞が枯渇されている細胞集団；又は抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンドと前に接触された細胞集団）とＩＬ－１５及び／又はＩＬ－７との接触をさらに含む。例えば、細胞集団（例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント又はＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている）をＩＬ－１５及び／又はＩＬ－７の存在下で増殖させる。
一部の実施形態において、本明細書に記載の細胞を、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド、インターロイキン－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒａ）ポリペプチド又はＩＬ－１５ポリペプチドとＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの組み合わせ、例えばｈｅｔＩＬ－１５を含む組成物と細胞の製造中に例えばエクスビボで接触させることを含む。実施形態において、本明細書に記載の細胞を細胞の製造中に例えばエクスビボで、ＩＬ－１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書に記載の細胞を細胞の製造中に例えばエクスビボで、ＩＬ－１５ポリペプチド及びＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方の組み合わせを含む組成物と接触させる。
一実施形態において、本明細書に記載の細胞を、エクスビボ増殖中、ｈｅｔＩＬ－１５を含む組成物と接触させる。一実施形態において、本明細書に記載の細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ－１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。一実施形態において、本明細書に記載の細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ－１５ポリペプチド及びＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。一実施形態において、接触は、リンパ球亜集団、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞の生存及び増殖をもたらす。
種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液又はアフェレーシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性又はサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８～９日目前まで主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を産生するが、約８～９日目後、Ｔ細胞集団は、徐々に大きくなるＴＣ細胞集団を含む。従って、処置の目的により、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットを大きい程度まで増殖させることが有利であり得る。
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中、有意に、しかし、主に再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物をもたらす能力を可能とする。
治療適用
別の態様において、対象を処置する、例えば対象における過増殖性状態又は障害（例えば、癌）、例えば固形腫瘍、軟部組織腫瘍又は転移性病変を軽減又は緩和する方法が提供される。本明細書で使用される用語「癌」は、病理組織学的型又は侵襲性のステージとは無関係に、全ての型の癌性増殖又は発癌過程、転移性組織又は悪性形質転換細胞、組織又は臓器を含むことを意味する。固形腫瘍の例は、肝臓、肺、乳房、リンパ系、消化管（例えば、結腸）、尿生殖路（例えば腎細胞、尿路上皮細胞）、前立腺及び咽頭に影響を及ぼすものなどの種々の臓器系の悪性腫瘍、例えば肉腫、腺癌及び癌腫を含む。腺癌は、大部分の結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌及び食道の癌などの悪性腫瘍を含む。一実施形態において、癌は、黒色腫、例えば進行したステージの黒色腫である。前述の癌の転移性病変も本発明の方法及び組成物を使用して処置又は予防することができる。処置され得る他の癌の例としては、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣の癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性又は急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌又は尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発された癌を含む環境的に誘発された癌及び前記癌の組み合わせが挙げられる。転移性癌、例えばＰＤ－Ｌ１を発現する転移性癌（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３－１４４）の処置は、本明細書に記載の抗体分子を使用して達成され得る。
増殖が阻害され得る例示的な癌は、典型的には免疫療法に応答性の癌を含む。処置のための癌の非限定的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺腺癌）、乳癌、結腸癌及び肺癌（例えば、非小細胞性肺癌）を含む。さらに、難治性又は再発性悪性腫瘍は、本明細書に記載の分子を使用して処置することができる。
一態様において、本発明は、対象における癌を処置する方法に関する。この方法は、癌が対象において処置されるように、対象に本発明の細胞を投与することを含む。一態様において、本明細書に記載の癌関連抗原の発現と関連する癌は、血液癌である。一態様において、血液癌は、白血病又はリンパ腫である。一態様において、本明細書に記載の癌関連抗原の発現に関連する癌は、限定されないが、例えばＢ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を例えば含むがそれに限定されない１つ以上の急性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を例えば含むがそれに限定されない１つ以上の慢性白血病を含めた癌及び悪性腫瘍を含む。本明細書に記載の癌関連抗原の発現に関連するさらなる癌又は血液学的病態は、限定されないが、例えばＢ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症及び骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）によってまとめられる様々な血液学的病態の群である「前白血病」などを含む。さらに、本明細書に記載の癌関連抗原に関連する疾患としては、これらに限定されないが、例えば、本明細書に記載の癌関連抗原の発現に関連する、非定型的及び／又は非典型的な癌、悪性腫瘍、前癌状態又は増殖性疾患が挙げられる。
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載する造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ増殖のための方法を本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法は、当技術分野で知られ、従って、本発明は、細胞のエクスビボ増殖の特定の方法に限定されない。簡潔には、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）のエクスビボ培養及び増殖は、（１）哺乳動物からの採取した末梢血又は髄外植体からのＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞回収、及び（２）エクスビボでのこのような細胞の増殖を含む。米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載される細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３及びｃ－ｋｉｔリガンドなどの他の因子を細胞の培養及び増殖に使用できる。
エクスビボ免疫化の点で細胞ベースのワクチンを使用するのに加えて、本発明は、患者における抗原に対する免疫応答を惹起するための、インビボ免疫化のための組成物及び方法も提供する。
血液癌
血液癌状態は、白血病、リンパ腫並びに血液、骨髄及びリンパ系に影響する悪性リンパ増殖状態などの癌の型である。
白血病は、急性白血病及び慢性白血病に分類できる。急性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）としてさらに分類され得る。慢性白血病は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び慢性リンパ系白血病（ＣＬＬ）を含む。他の関連する状態は、骨髄球性血液細胞の産生不良（又は異形成）によりまとめられる血液学的状態の多様な集合であり、ＡＭＬに形質転換するリスクがある骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、以前は「前白血病状態」として知られる）を含む。
リンパ腫は、リンパ球から生じる血液細胞腫瘍の群である。例示的なリンパ腫は、非ホジキンリンパ腫及びホジキンリンパ腫を含む。
本発明は、癌を治療するための組成物及び方法を提供する。一態様では、癌は、白血病又はリンパ腫である血液癌が挙げられるが、これらに限定されない血液癌である。一態様では、本発明の細胞は、例えば、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）が挙げられるが、これらに限定されない例えば急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに限定されない１つ以上の慢性白血病；例えば、Ｂ細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞又は大細胞性濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症及び骨髄性血液細胞の無効な産生（又は異形成）によって合併された血液学的状態の多様な集合である「前白血病」などが挙げられるが、これらに限定されない追加の血液癌又は血液学的状態などであるが、これらに限定されない癌及び悪性腫瘍を治療するために使用することができる。さらなる本明細書に記載されるような癌関連抗原の発現に関連する疾患としては、本明細書に記載されるような癌関連抗原を発現する例えば異型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態又は増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、本明細書に記載の癌関連抗原を発現する細胞（例えば、本明細書に記載の癌関連抗原を発現する血液癌又は非定型癌）と関連する疾患を予防、処置及び／又は管理する方法も提供し、本方法は、本明細書に記載の癌関連抗原を発現する細胞に結合する本発明のＴ細胞又はＮＫ細胞を、必要とする対象に投与することを含む。一態様において、対象は、ヒトである。本明細書に記載の癌関連抗原を発現する細胞と関係する障害の非限定的な例は、自己免疫性障害（狼瘡など）、炎症性障害（アレルギー及び喘息など）及び癌（本明細書に記載の癌関連抗原を発現する血液癌又は非定型癌など）を含む。
本発明は、本明細書に記載の癌関連抗原を発現する細胞と関連する疾患を予防、処置及び／又は管理する方法も提供し、本方法は、本明細書に記載の癌関連抗原を発現する細胞に結合する本発明のＴ細胞又はＮＫ細胞を、必要とする対象に投与することを含む。一態様において、対象は、ヒトである。
本発明は、本明細書に記載の癌関連抗原を発現する細胞と関連する癌の再発を予防する方法を提供し、本方法は、本明細書に記載の癌関連抗原を発現する細胞に結合する本発明のＴ細胞又はＮＫ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。一態様において、方法は、処置を必要とする対象に、本明細書に記載の癌関連抗原を発現する細胞と結合する有効量の本明細書に記載のＴ細胞又はＮＫ細胞を有効量の別の治療と組み合わせて投与することを含む。
医薬組成物及び処置
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のように、キメラタンパク質発現細胞、例えば複数のキメラタンパク質発現細胞を１つ以上の薬学的に又は生理学的に許容される担体、希釈剤又は添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチド又はアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、１つの態様において静脈内投与用に製剤される。
本発明の医薬組成物を、処置する（又は予防する）疾患に適する方法で投与し得る。投与の量及び頻度は、患者の状態及び患者の疾患のタイプ及び重症度などの因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定され得る。
一実施形態において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ－Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞又はプラスミド成分、細菌及び真菌からなる群から選択される汚染物が実質的になく、例えば検出可能なレベルで存在しない。一実施形態において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
「免疫学的に有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」又は「治療量」が示されるとき、本発明の組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染の程度又は転移及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して医師が決定できる。本明細書に記載の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を含む医薬組成物を、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重、いくつかの例において１０５～１０６細胞／ｋｇ体重の範囲の用量（これらの範囲内の全整数値を含む）で投与し得ると一般に述べることができる。Ｔ細胞組成物をまたこの用量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用して投与できる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
特定の態様において、活性化免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を対象に投与し、次いで血液を採り（又はアフェレーシスを実施し）、本発明に従ってそれからの免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化し、これらの活性化し、且つ増殖させた免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を患者に再注入することが望ましいことがある。この過程を数週間ごとに複数回実施できる。一態様において、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を１０ｃｃ～４００ｃｃの採血した血液から活性化できる。一態様において、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ又は１００ｃｃの採血した血液から活性化する。
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、留置又は移植を含む任意の簡便な方法により実施し得る。本明細書に記載の組成物を患者に経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により又は腹腔内に投与し得る。１つの態様において、本発明のＴ細胞組成物を患者に皮内又は皮下注射により投与する。１つの態様において、本発明のＴ細胞組成物をｉ．ｖ．注射により投与する。免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の組成物を腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注射し得る。
特定の例示的態様において、対象は、白血球を採取し、エクスビボで富化又は枯渇させて、目的の細胞、例えばＴ細胞を選択及び／又は単離する白血球除去を受け得る。これらのＴ細胞単離体を当技術分野で知られる方法により増殖させ、１つ以上の本発明の構築物が導入され、それにより本発明のＴ細胞が創製されるように処理し得る。処置を必要とする対象を、その後、高用量の化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付し得る。一態様において、移植後又は移植と同時に、対象は、増殖させた本発明のＴ細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖細胞を手術前又は後に投与する。
患者に投与すべき上記の処置の用量は、処置する状態の正確な性質及び処置のレシピエントにより変わる。ヒト投与のためのスケーリングは、当技術分野で認識されている習慣に従って実施できる。ＣＡＭＰＡＴＨの用量は、例えば、概して成人患者に１～約１００ｍｇの範囲であり、通常、連日で１～３０日の期間にわたって投与する。好ましい１日用量は、１～１０ｍｇ／日であるが、いくつかの例において最大までの高用量である。
本発明は、以下の実験例を参照することによって詳細にさらに説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、特に指定のない限り、限定することを意図するものではない。従って、本発明は、以下の実施例に決して限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆるすべての変更形態を包含するように解釈されるべきである。
実施例１：細胞内ヘテロ二量体化ドメインを使用する構成的活性型ＴＣＡＲ
一過性発現及び活性化アッセイ
材料及び方法
構成的活性型ＴＣＡＲ構築物の合成
プラスミドＤＮＡの対をＤＮＡ２．０によって外部的に合成した。名目上調節不可能なＣＡＲ構築物、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ、配列番号１を対照として使用した。ＴＣＡＲについて、様々な細胞内ヘテロ二量体化ドメインを、図１に示されるようなＴＣＡＲ構築物の異なるドメインに連結させることができる。
「ＴＣＡＲ１」は、構築物の対を含む。第１の構築物では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、続いて共刺激ドメイン４－１ＢＢ及びＣ末端におけるヘテロ二量体化ドメインＶＰＳ２８でクローン化した（配列番号２）。対応する第２の構築物を、ヘテロ二量体化ドメインＶＰＳ３６をＣＤ３εのＣ末端においてリンカーに融合させることによって設計した（配列番号３）。「ＴＣＡＲ２」は、構築物の対を含む。第１の構築物では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、続いて共刺激ドメイン４－１ＢＢ及びＣ末端におけるヘテロ二量体化ドメインｍＪＵＮでクローン化した（配列番号４）。対応する第２の構築物を、ヘテロ二量体化ドメインｍＦｏｓをＣＤ３εのＣ末端においてリンカーに融合させることによって設計した（配列番号５）。
ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ（配列番号１）
Figure 2023071774000011
 ＣＤ１９ｓｃＦＶ－ＢＢ－ＶＰＳ２８（配列番号２）
Figure 2023071774000012
 ＣＤ３ｅ－ＶＰＳ３６（配列番号３）
Figure 2023071774000013
 ＣＤ１９ｓｃＦＶ－ＢＢ－ｍＪＵＮ（配列番号４）
Figure 2023071774000014
 ＣＤ３ｅ－ｍＦｏｓ（配列番号５）
Figure 2023071774000015
ＣＡＲ機能の初期特性評価のためのジャーカットレポーター細胞株の生成
一次Ｔ細胞形質導入及び活性化の代わりとして、ジャーカット－ＮＦＡＴレポーター細胞株を用いてＣＡＲ構築物の機能活性を評価することができる。ジャーカットＴ細胞株（Ｅ６－１）をＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクトし、ＮＦＡＴ－ＬＵＣレポーターを有する安定なクローン細胞株ジャーカット細胞（ＪＮＬ）をＰＭＡ及びイオノマイシン刺激後のＮＦＡＴレポーターの強い誘導に基づいてさらなる特性評価のために選択した。
ジャーカットレポーター細胞株のトランスフェクション及びＮＦＡＴの活性化
ＮＦＡＴ－ＬＵＣレポーターを有するジャーカット細胞（ＪＮＬ）を、２ｍＭのグルタミン及び１０％のウシ胎児血清を０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンと共に含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中で０．５～１．０×１０６／ｍｌの密度まで増殖させた。各トランスフェクションについて、２．０×１０６個細胞を１００ｇで１０分間遠心分離した。対照ＣＡＲの共トランスフェクションには１μｇのＤＮＡを、又は単一のトランスフェクションには２μｇをトランスフェクションごとに使用した。Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ及びサプリメントＩを混合して、１００μｌを、ＤＮＡ構築物を入れたチューブに添加した。次いで、混合物を細胞に添加し、エレクトロポレーションキュベットに移した。Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ装置を使用してＸ－００１の設定下でエレクトロポレーションを行った。２ｍＭのグルタミン及び１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地０．４ｍｌをエレクトロポレーションの直後に添加し、混合物を６ウェルプレートの１つのウェル中の０．２５ｍｌの増殖培地に移し、少なくとも３時間回復させた。細胞回復中、白色ソリッドボトム組織培養処理プレートを抗ＣＤ１９イディオタイプ抗体又は無関係なヒトＩｇＧ１－Ｆｃ陰性対照のいずれかで２時間コーティングし、続いてＦＢＳ中の５％のＢＳＡで３７℃、５％のＣＯ２において３０分間ブロックした。次いで、ブロッキングバッファーを吸引した。トランスフェクトされたジャーカット構築物のそれぞれ１００μＬを３通りで播種した。一晩のインキュベーション後、Ｏｎｅ－Ｇｌｏルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬１００μＬを各ウェルに添加した。陰性対照ウェルに対する抗イディオタイプウェルの相対的な活性化倍率を決定するために、次いでプレートを５分間インキュベートして、ルシフェラーゼシグナルを平衡化させてＥｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルリーダーを用いて読み取った。
トランスフェクトされたジャーカット（ＪＮＬ）細胞中のＩＬ－２発現
ＪＮＬ細胞のトランスフェクション及び活性化を、３７℃、５％のＣＯ２において４０～４８時間であるインキュベーションを除いてＪＮＬ ＲＧＡアッセイで上記記載の通りに行った。３００×ｇで１０分間の遠心分離によって上清を細胞から採取した。ＩＬ－２発現のレベルを、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２キット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ）を使用して測定した。すべての提供された試薬を製造業者の指示通りに調製した。採取した上清（ニートな）及び調製した標準物５０μＬをプレコートＭＳＤプレートに添加し、振蕩しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを３００μＬのＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、２５μＬの検出抗体溶液を各ウェルに添加した。プレートを振蕩しながら室温で２時間再度インキュベートし、上記条件で洗浄し、１５０μＬの２×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを各ウェルに添加した。プレートをヒトＩＬ－２レベルについてＭＳＤ機器上で即時読み取った。
一過性発現の結果
ＴＣＡＲ１及びＴＣＡＲ２のＪＮＬ細胞のエレクトロポレーションを介した一過性トランスフェクションは、図２に示されるようなレポーター遺伝子アッセイにおける抗原依存性シグナル伝達を証明した。ＴＣＡＲ１、ＶＰＳ２８／ＶＰＳ３６ベースの二量体は、ＲＧＡアッセイにおいて、陽性対照ＣＡＲ、ＣＤ１９ｓｃＦＶ－ＢＢＺと比べてバックグラウンド活性化を超える同様の倍率を証明した。活性化から４０時間後のＩＬ２の発現も評価した。抗原依存性ＩＬ２発現は、ＴＣＡＲ１についても観察したが、ＪＮＬ ＲＧＡアッセイにおける低い固有のシグナルのため、ＴＣＡＲ２は評価されなかった。リンカー長さを介してヘテロ二量体化ドメインの配向を最適化し、ヘテロ二量体化ドメインの互いに対する親和性を向上させ、及び／又はＣＤ３ε界面のＴＣＲ複合体の残部に対する親和性を向上させることにより、シグナル伝達及びＩＬ２発現におけるさらなる増強が期待されるであろう。
レンチウイルス形質導入一次ヒトＴ細胞の産生
ＴＣＡＲ１は、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺと比べて、レンチウイルス形質導入を介して産生された一次ヒトＴ細胞を使用してインビトロでも評価した。
レンチウイルスの産生
１０％のＦＢＳ及び非必須アミノ酸で補充したＤＭＥＭで増殖させたＬｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を使用して、ｐＲＳＶ．ｒｅｖ、ｐＭＤＬ．ｇ／ｐ．ｒｒｅ及びｐＶＳＶｇパッケージングプラスミドと共にレンチウイルスベクタープラスミドで共トランスフェクトした。上清を含有するレンチウイルスベクターをトランスフェクションから４８時間後に採取し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して濃縮させ、１，５００×ｇで４５分間遠心分離した。濃縮させたベクターを後に使用するまで－８０℃で保存した。
レンチウイルスベクター力価を、１０％のＦＢＳで補充したＲＰＭＩ－１６４０中で培養したＳｕｐ－Ｔ１細胞（ＡＴＣＣ）での限界希釈を用いて決定した。ベクターを３倍系列希釈し、次いで５０μＬの希釈したベクターを、Ｓｕｐ－Ｔ１細胞を含有する平底マイクロタイタープレートに添加した。７２時間後に細胞を採取し、タンパク質－Ｌを使用して、ＦＡＣＳを介してｓｃＦｖ発現について分析した。１ｍＬ当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍＬ）での力価を、以下の等式を用いて、Ｓｕｐ－Ｔ１細胞における陽性発現の％が２０％未満であるが、５％超であるベクター希釈物から算出した。
ＴＵ／ｍＬ＝（陽性％／１００）×２Ｅ４×希釈倍率×２０
Ｔ細胞の単離及び一次Ｔ細胞へのウイルス形質導入
正常ドナーＴ細胞を、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄから得たヒトＰＢＭＣからのＭＡＣＳ陰性選択（ＭｉｌｔｅｎｙｉパンＴ細胞単離キット）により単離した。精製Ｔ細胞を、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１ｍＭの非必須アミノ酸を補充したＲＰＭＩ中で培養し、ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ－アクティベータＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、３：１のビーズ対細胞の比で活性化した。活性化から１８～２４時間後にＴ細胞をレンチウイルスベクターにより５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。形質導入Ｔ細胞を、１ｍＬ当たりおよそ７５万個の細胞密度を維持しながら、２～３日ごとに１０日間増殖させた。細胞を等分して低温凍結した。
細胞傷害性及びＩＬ２アッセイ
形質導入Ｔ細胞を、標的発現細胞株を殺傷するそれらの能力及び増殖のための代理として使用されるサイトカインＩＬ２の分泌について分析した。１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で培養した標的発現細胞株Ｎａｌｍ６（ＣＤ１９）及び１０％のＦＢＳを含むＩＭＤＭ中で培養したＫ５６２（陰性対照）を、すべてピューロマイシンの選択下でホタルルシフェラーゼを安定して発現するように操作した。簡単に言うと、解凍させた形質導入Ｔ細胞を、ＣＡＲ発現のパーセントについてＦＡＣＳを介して分析した。単離し、増殖させた凍結／解凍非形質導入Ｔ細胞で希釈することにより、すべての構築物を１０％のＣＡＲ陽性発現に正規化した。次いで、形質導入正規化Ｔ細胞を様々なエフェクター対標的の比において２００μＬの培地中で培養し、標的細胞を２．５Ｅ４細胞／ウェルで一定に保持した。標的細胞をエフェクター細胞の存在なしに単独で播種して、最大ルミネセンスを決定した。１８～２０時間後に１００μＬの培養物上清を後のＩＬ２分析のために取り出し、１００μＬのＯｎｅＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ルシフェラーゼ基質を残りの上清及び細胞に添加した。インキュベーションから１０分後にルミネセンスをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで測定した。特異的溶解パーセントを、以下の等式を用いて算出した。
特異的溶解（％）＝（１－（試料のルミネセンス／平均最大ルミネセンス））＊１００
採取した上清をＭＳＤ ＥＬＩＳＡにより製造業者の指示通りにＩＬ２の量について分析した。
一次ヒトＴ細胞の結果
図３及び図４は、対照ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺに対する「ＴＣＡＲ１」の機能活性を示す。再指示溶解アッセイ及びＩＬ２発現結果の両方から観察されたように、ＴＣＡＲ１は、機能性の低下を示した。両方の構築物が形質導入条件下においてＴ細胞中で発現される場合、両方のヘテロ二量体化ドメインを含有する両方の構築物の同じ細胞中での同時発現を確実にするためにさらなる最適化が必要とされ得ることは、明らかではない。さらに、リンカー長さを介してヘテロ二量体化ドメインの配向を最適化させるか、又はヘテロ二量体化ドメインの互いに対する親和性を向上させることにより、さらなる増強が必要になり得る。しかしながら、一過性シグナル伝達の結果は、これらのタイプのキメラ抗原受容体の可能性を証明した。
実施例２：細胞内ヘテロ二量体化ドメインを使用する増殖が向上した構成的活性型ＴＣＡＲ（図５～９）
複数の共刺激ドメインを有する構成的活性型ＴＣＡＲ構築物の合成
プラスミドＤＮＡの対をＤＮＡ２．０によって外部的に合成した。名目上調節不可能なＣＡＲ構築物、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ、配列番号１を対照として使用する。
「ＴＣＡＲ１」は、構築物の対を含む。第１の構築物では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、続いて共刺激ドメイン４－１ＢＢ及びＣ末端におけるヘテロ二量体化ドメインＶＰＳ２８でクローン化した（配列番号２）。対応する第２の構築物を、ヘテロ二量体化ドメインＶＰＳ３６をＣＤ３εのＣ末端においてリンカーに融合させることによって上記のように設計した（配列番号３）。「ＴＣＡＲ３」（図５）は、構築物の対を含む。第１の構築物では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、続いて共刺激ドメイン４－１ＢＢ及びＣ末端におけるヘテロ二量体化ドメインＶＰＳ２８でクローン化する（配列番号２）。対応する第２の構築物は、ＣＤ２８の細胞内共刺激ドメイン、続いてＶＰＳ３６をＣＤ３ε細胞外及び膜貫通ドメインのＣ末端に融合させることによって設計されるであろう（配列番号６）。
ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－ＣＤ２８－ＶＰＳ３６（配列番号６）
Figure 2023071774000016
ジャーカットレポーター細胞株のトランスフェクション及びＮＦＡＴの活性化
抗原結合ドメインの標的抗原エンゲージメント後の活性化は、ＮＦＡＴ－ＬＵＣレポーターを有するジャーカット細胞（ＪＮＬ）レポーター細胞株を用いて、実施例１に記載されるように測定される。トランスフェクトされた細胞を標的プレートに１ウェル当たり１００μｌで添加する。ルシフェラーゼＯｎｅ Ｇｌｏ試薬１００μｌをウェルごとに添加する。試料を５分間インキュベートし、次いでルミネセンスを記載のように測定する。
トランスフェクトされたジャーカット（ＪＮＬ）細胞中のＩＬ－２発現
ＪＮＬ細胞のトランスフェクション及び活性化を、３７℃、５％のＣＯ２において４０～４８時間であるインキュベーションを除いてＪＮＬ ＲＧＡアッセイで上記記載の通りに実施する。分泌されたＩＬ２の測定を実施例１に記載の通りに実施する。
実施例３：ＣＤ３εを介してＴＣＲ複合体中に融合された構成的活性型ＴＣＡＲ（ｆｕｓＴＣＡＲ）（図１０～１１）
一過性発現及び活性化アッセイ
ｆｕｓＴＣＡＲ構築物の合成
プラスミドＤＮＡをＤＮＡ２．０によって外部的に合成した。名目上調節不可能なＣＡＲ構築物、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ、配列番号１を対照として使用した。ｆｕｓＴＣＡＲについて、標的化ドメインは、追加の細胞内共刺激及びシグナル伝達ドメインを含むか又は含まないＴＣＲ複合体の異なるメンバーに直接融合することができる。
「ｆｕｓＴＣＡＲ１」（図１２）では、ＣＤ１９ｓｃＦｖを完全ＣＤ３εタンパク質にＮ末端融合体としてクローン化した（配列番号７）。「ｆｕｓＴＣＡＲ２」（図１３）を完全ＣＤ３εタンパク質へのＮ末端融合体として、続いて４－１ＢＢの細胞内共刺激ドメインへのＣ末端融合体としてクローン化した（配列番号８）。「ｆｕｓＴＣＡＲ３」（図１４）は、内部内因性ＩＴＡＭドメインを欠如する。ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ３細胞外及び膜貫通ドメインのＮ末端上に、続いて細胞内共刺激ドメイン４－１ＢＢ上にクローン化した（配列番号９）。
ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅ（配列番号７）
Figure 2023071774000017
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅ－４１ＢＢ（配列番号８）
Figure 2023071774000018
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号９）
Figure 2023071774000019
ジャーカットレポーター細胞株のトランスフェクション及びＮＦＡＴの活性化
抗原結合ドメインの標的抗原エンゲージメント後の活性化を、実施例１に記載されたようにＮＦＡＴ－ＬＵＣレポーターを含むジャーカット細胞（ＪＮＬ）レポーター細胞株を用いて測定した。トランスフェクトされた細胞を標的プレートに１ウェル当たり１００μｌで添加した。ルシフェラーゼＯｎｅ Ｇｌｏ試薬１００μｌをウェルごとに添加した。試料を５分間インキュベートし、次いでルミネセンスを記載されたように測定した。
トランスフェクトされたジャーカット（ＪＮＬ）細胞中のＩＬ－２発現
ＪＮＬ細胞のトランスフェクション及び活性化を、３７℃、５％のＣＯ２において４０～４８時間であるインキュベーションを除いてＪＮＬ ＲＧＡアッセイで上記記載の通りに行った。抗原依存性ＩＬ２発現の測定を実施例１に記載の通りに実施した。
一過性発現の結果
ＪＮＬ細胞への一過性トランスフェクションを介したｆｕｓＴＣＡＲ１、ｆｕｓＴＣＡＲ２及びｆｕｓＴＣＡＲ３の初期スクリーニングは、図１５に示されるように、抗原依存性シグナル伝達を証明した。重要なことに、シグナル伝達は、切断され且つＣＤ３εのＩＴＡＭシグナル伝達ドメインを欠如したｆｕｓＴＣＡＲ３でなお観察された。ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインを含有する構築物のトランスフェクションは、従って、ｆｕｓＴＣＡＲの活性にとって前提条件ではない。標的化ドメインをＴＣＲ複合体と関連付けることにより、シグナル伝達は、複合体のすべてのメンバーを通して仲介され、標的化ドメインに融合されたシグナル伝達ドメインに由来するものに排他的に限定されるものではない。
レンチウイルス形質導入一次ヒトＴ細胞の産生
ｆｕｓＴＣＡＲは、それらの活性について一次ヒトＴ細胞中でも試験された。レンチウイルスの産生前に、追加の構築物を、従来のＣＡＲ構築物のインビトロ活性に対する機能的ＩＴＡＭＳの依存性及び機能的ＩＴＡＭＳの存在又は非存在に無関係なＴＣＡＲと無関係な活性を確認するためにも設計した。プラスミドＤＮＡをＤＮＡ２．０によって外部的に合成した。初代のＣＡＲ設計構築物、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ζ、配列番号１０を合成し、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ８ａリンカー及び膜貫通ドメインへの、続いて細胞内シグナル伝達ドメインＣＤ３ζへのＮ末端融合体としてクローン化した。第２の構築物（配列番号１１）を、リン酸化されていると注釈付けされたＣＤ３ζ内のすべての細胞内チロシン残基が細胞内ホスホチロシンシグナル伝達を無効にするためにフェニルアラニンに切り替えられていることを除いて同様にクローン化した。細胞内共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの組み合わせは、典型的なＣＡＲ構築物に有益であることが以前に証明されているため、最終構築物を、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ８ａリンカー及び膜貫通ドメインに、続いて４－１ＢＢにＮ末端融合させることによってクローン化し、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、この構築物に含まれなかった（配列番号１２）。最後に、類似のｆｕｓＴＣＡＲを合成してＣＤ１９ｓｃＦＶ－ζ＿７ＹｔｏＦとした。「ｆｕｓＴＣＡＲ４」は、内部内因性ＩＴＡＭドメインを欠如する。ＣＤ１９ｓｃＦｖ、配列番号１３を、リン酸化されていると注釈付けされたこれらのチロシンがフェニルアラニンに変異され、ＣＤ３εＩＴＡＭに関連する固有のシグナル伝達経路を不活性にさせたことを除いて、完全ＣＤ３εタンパク質へのＮ末端融合体としてクローン化した。
ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ζ（配列番号１０）
Figure 2023071774000020
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ζ＿７ＹｔｏＦ（配列番号１１）
Figure 2023071774000021
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢ（配列番号１２）
Figure 2023071774000022
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅ＿２ＹｔｏＦ（配列番号１３）
Figure 2023071774000023
レンチウイルス産生及び一次Ｔ細胞へのウイルス形質導入
実施例１に記載されるようにレンチウイルスを産生し、単離された一次ヒトＴ細胞中に形質導入した。形質導入Ｔ細胞及び非形質導入対照Ｔ細胞を増殖させて後の分析のために凍結した。
細胞傷害性及びＩＬ２アッセイ
一次ヒトＴ細胞を標的腫瘍細胞に架橋することによって誘導された細胞傷害性及びＩＬ２産生を実施例１に記載された通りに評価した。
一次ヒトＴ細胞の結果
図１６及び図１７で観察することができるように、従来のＣＡＲは、標的細胞及びＩＬ２の産生の最大のＴ細胞に再指示された溶解を引き出すために機能的内因性ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインを必要とする。ＣＤ３ζが４１ＢＢで置き換えられているか、又はＣＤ３ζ中のＩＴＡＭＳを不活性化するために変異された構築物は、両方の要素を欠いていた。対照的に、図１８及び図１９は、ｆｕｓＴＣＡＲ活性が内因性機能的ＩＴＡＭに特異的且つ無関係の両方であることを証明している。再指示された溶解の活性及びＩＬ２分泌は、共刺激ドメインの存在若しくは非存在又は順番に無関係に観察された。さらに、シグナル伝達に関与する重要なチロシンの突然変異又はＣＤ３εの細胞内ドメインの完全な除去のいずれもＴＣＡＲの機能的インビトロ活性における明らかな損失をもたらさなかった。
実施例４：ラパログスイッチを使用する調節可能なＴＣＡＲ（ｒＴＣＡＲ）（図２０～２４）
ラパログスイッチ仲介ｒＴＣＡＲ構築物の合成
プラスミドＤＮＡの対をＤＮＡ２．０によって外部的に合成した。名目上調節不可能なＣＡＲ構築物、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ、配列番号１を対照として使用した。ｒＴＣＡＲについて、様々なヘテロ二量体化ドメインをｒＴＣＡＲ構築物の異なるドメインに連結することができる。
「ｒＴＣＡＲ１」（図２５）は、構築物の対を含む。第１の構築物では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、続いて共刺激ドメイン４－１ＢＢ及びＣ末端におけるＦＫＢＰでクローン化した（配列番号１４）。対応する第２の構築物を、ＲＡＤ００１に対する向上した親和性を有する変異型ＦＲＢドメインをＣＤ３εのＣ末端においてリンカーに融合させることによって設計した（配列番号１５）。「ｒＴＣＡＲ２」（図２６）は、構築物の対を含む。第１の構築物では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン、続いて共刺激ドメイン４－１ＢＢ及びＣ末端におけるＦＫＢＰでクローン化した（配列番号１４）。対応する第２の構築物を、ＲＡＤ００１に対する向上した親和性を有する変異型ＦＲＢドメインをＣＤ３εのＣ末端においてリンカーに融合させることによって設計した。さらに、ＣＤ３εのＩＴＡＭドメイン内の２つのチロシンをフェニルアラニンに変異させて、ＣＤ３εから固有のシグナル伝達経路を除去し、シグナル伝達がＴＣＲ複合体全体から仲介されることを証明した（配列番号１６）。
ＣＤ１９ｓｃＦＶ－ＢＢ－ＦＫＢＰ（配列番号１４）
Figure 2023071774000024
 ＣＤ３ｅ－ＦＲＢｍｕｔａｎｔ（配列番号１５）
Figure 2023071774000025
 ＣＤ３ｅ－ＹｔｏＦｄｏｕｂｌｅ－ＦＲＢｍｕｔａｎｔ（配列番号１６）
Figure 2023071774000026
ＮＦＡＴ活性化に対するラパログの用量応答
抗原結合ドメインの標的抗原エンゲージメント後のラパログ依存性シグナル活性化を証明するためのＲＣＡＲ構築物の能力を、実施例１に記載したようにＮＦＡＴ－ＬＵＣレポーターを有するジャーカット細胞（ＪＮＬ）レポーター細胞株を用いて測定した。トランスフェクトされた細胞を標的プレートに１ウェル当たり１００μｌで添加し、様々な濃度のＲＡＤ００１と共に１８時間共インキュベートした。ルシフェラーゼＯｎｅ Ｇｌｏ試薬１００μｌをウェルごとに添加した。試料を５分間インキュベートし、次いでルミネセンスを記載の通りに測定した。
トランスフェクトされたジャーカット（ＪＮＬ）細胞中のＩＬ－２発現
ＪＮＬ細胞のトランスフェクション及び活性化を、３７℃、５％のＣＯ２において４０時間であるインキュベーションを除いてＪＮＬ ＲＧＡアッセイで上記記載の通りに行った。分泌されたＩＬ２の測定を実施例１に記載の通りに実施した。
結果
ＪＮＬ細胞への一過性トランスフェクションを介したｒＴＣＡＲ１の初期スクリーニングは、図２７に示されるように、ＲＡＤ００１に仲介され、且つ抗原依存性のシグナル伝達及びＩＬ２発現を証明した。後続の実験では、ｒＴＣＡＲ１を、一過性にトランスフェクトされたＣＤ３εのＩＴＡＭシグナル伝達が対応するチロシンのフェニルアラニンへの突然変異によって無効にされているｒＴＣＡＲ２と比較した。ｒＴＣＡＲ２についての低減したシグナル及び発現が予想されていたにも関わらず、ＲＡＤ００１による用量応答がレポーター遺伝子アッセイ及び抗原誘導ＩＬ２発現の両方においてｒＴＣＡＲ１及びｒＴＣＡＲ２について観察された（図２８）。ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインを含有する構築物のトランスフェクションは、従って、ｒＴＣＡＲの活性にとって前提条件ではない。標的化ドメインをＴＣＲ複合体と関連付けることにより、シグナル伝達は、複合体のすべてのメンバーを通して仲介され、標的化ドメインに融合されたシグナル伝達ドメインに由来することに排他的に限定されるものではない。
実施例６：切断型ＣＤ３ε細胞外ドメインを介してＴＣＲ複合体に融合された構成的活性型ＴＣＡＲ（ｆｕｓＴＣＡＲ）
抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３のＦａｂフラグメントと複合体を形成するＣＤ３ε及びγの結晶構造（Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ． ａｌ．，２００４）並びに抗ＣＤ３モノクローナルＡｂ ＵＣＨＴ１のｓｃＦｖと複合体を形成するＣＤ３ε及びδの結晶構造（Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ．ａｌ．，２００４）が報告されている。これらの構造は、εと他の付属タンパク質との相互作用が、膜に近接するβシートを通して仲介されることを証明している。従って、βシートを含有する配列から構成される標的化ドメインのＣＤ３ε細胞外ドメインの切断型への融合は、ｆｕｓＴＣＡＲ活性のための唯一の前提条件であり得る。
一過性発現
ｆｕｓＴＣＡＲ構築物の合成
プラスミドＤＮＡをＤＮＡ２．０によって外部的に合成した。名目上調節不可能なＣＡＲ構築物、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ、配列番号１を対照として使用した。
「ｆｕｓＴＣＡＲ５」において、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ３ε細胞外及び膜貫通ドメインのＮ末端切断型、続いて細胞内共刺激ドメイン４－１ＢＢへのＮ末端融合体としてクローン化した（配列番号１７）。「ｆｕｓＴＣＡＲ６」、「ｆｕｓＴＣＡＲ７」及び「ｆｕｓＴＣＡＲ８」を「ｆｕｓＴＣＡＲ５」と同様にクローン化し、他のＴＣＲ複合体メンバーとの相互作用の仲介において分子内ジスルフィド結合に関与すると思われないＣＤ３ε中の２つの膜近位システインの役割を明らかにした。「ｆｕｓＴＣＡＲ６」（配列番号１８）について、第１のシステインをセリンに変異させた。「ｆｕｓＴＣＡＲ７」（配列番号１９）について、第２のシステインをセリンに変異させた。最後に、「ｆｕｓＴＣＡＲ８」（配列番号２０）について、両方のシステインをセリンに変異させた。この実施例でのすべての４つの構築物は、固有の細胞内ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインを欠いている。
ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅ＿ｍｉｎｉｍａｌＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号１７）
Figure 2023071774000027
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅ＿ｍｉｎｉｍａｌＥＣＤ－１ｓｔＣｙｓｔｏＳｅｒ－ＴＭ－４１ＢＢ（配列番号１８）
Figure 2023071774000028
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅ＿ｍｉｎｉｍａｌＥＣＤＴＭ－２ｎｄＣｙｓｔｏＳｅｒ－ＴＭ－４１ＢＢ（配列番号１９）
Figure 2023071774000029
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅ＿ｍｉｎｉｍａｌＥＣＤＴＭ－２ｘＣｙｓｔｏＳｅｒ－ＴＭ－４１ＢＢ（配列番号２０）
Figure 2023071774000030
ジャーカットレポーター細胞株のトランスフェクション及びＮＦＡＴの活性化
抗原結合ドメインの標的抗原エンゲージメント後の活性化を、実施例１に記載されたようにＮＦＡＴ－ＬＵＣレポーターを含むジャーカット細胞（ＪＮＬ）レポーター細胞株を用いて測定した。トランスフェクトされた細胞を標的プレートに１ウェル当たり１００μｌで添加した。ルシフェラーゼＯｎｅ Ｇｌｏ試薬１００μｌをウェルごとに添加した。試料を５分間インキュベートし、次いでルミネセンスを記載されたように測定した。
一過性発現の結果
標的依存性シグナル伝達は、切断型細胞外ドメインを使用する一過性発現されたｆｕｓＴＣＡＲで観察されなかった。その後のＦＡＣ分析は、構築物の細胞表面上での検出可能な発現がないことを証明した。
レンチウイルス形質導入一次ヒトＴ細胞の産生
低い発現がレポーター細胞株に特有であるかどうかを決定するために、単一の代表的な切断型融合構築物、ｆｕｓＴＣＡＲ６もＣｄ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺに対する活性について一次ヒトＴ細胞中で試験した。
レンチウイルス産生及び一次Ｔ細胞へのウイルス形質導入
実施例１に記載されるようにレンチウイルスを産生し、単離された一次ヒトＴ細胞中に形質導入した。形質導入Ｔ細胞及び非形質導入対照Ｔ細胞を増殖させて後の分析のために凍結した。
細胞傷害性及びＩＬ２アッセイ
一次ヒトＴ細胞を標的腫瘍細胞に架橋することによって誘導された細胞傷害性及びＩＬ２産生を実施例１に記載された通りに評価した。
一次ヒトＴ細胞の結果
図２９で観察することができるように、ｆｕｓＴＣＡＲ６は、対照ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ ＣＡＲに対して匹敵する細胞溶解活性を証明した。ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインの非存在にも関わらず、再指示された溶解の活性が観察されたことに留意することが重要である。対照的に、図３０に示すように、ｆｕｓＴＣＡＲ６は、ＩＬ２発現の低減をもたらした。構築物のさらなる最適化が、βシートを安定化させるため又は切断型ＣＤ３εとＴＣＲの残りの内因性構成要素との相互作用を改善するためのいずれかに必要である。それにも関わらず、この結果は、ＣＤ３εの細胞外領域の細胞外ドメイン全体が細胞溶解活性を維持するために必要とされるわけではないことを証明した。
実施例７：代替的共刺激ドメインを有するＣＤ３εを介してＴＣＲ複合体に融合された構成的活性型ＴＣＡＲ
従来のＣＡＲは、４－１ＢＢ以外の代替的共刺激ドメインで機能的であることが証明されている。
レンチウイルス形質導入一次ヒトＴ細胞の産生
ｆｕｓＴＣＡＲ構築物の合成
プラスミドＤＮＡをＤＮＡ２．０によって外部的に合成する。名目上調節不可能なＣＡＲ構築物、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ、配列番号１を対照として使用し、「ｆｕｓＣＡＲ３」をＴＣＡＲ対照として使用する（配列番号９）。
以下の表に列挙されたｆｕｓＴＣＡＲにおいて、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ３ε細胞外及び膜貫通ドメイン、続いて細胞内共刺激ドメインへのＮ末端融合体として指定通りにクローン化する。「ｆｕｓＴＣＡＲ９」～「ｆｕｓＴＣＡＲ１３」は、固有の細胞内ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインを欠いている。
Figure 2023071774000031
ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－ＣＤ２７（配列番号２１）
Figure 2023071774000032
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－ＣＤ２８（配列番号２２）
Figure 2023071774000033
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－ＯＸ４０（配列番号２３）
Figure 2023071774000034
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－ＩＣＯＳ（配列番号２４）
Figure 2023071774000035
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－ＣＤ２（配列番号２５）
Figure 2023071774000036
レンチウイルス産生及び一次Ｔ細胞へのウイルス形質導入
実施例１に記載されるようにレンチウイルスを産生し、単離された一次ヒトＴ細胞中に形質導入した。形質導入Ｔ細胞及び非形質導入対照Ｔ細胞を増殖させて後の分析のために凍結した。
細胞傷害性及びＩＬ２アッセイ
一次ヒトＴ細胞を標的腫瘍細胞に架橋することによって誘導された細胞傷害性及びＩＬ２産生を実施例１に記載された通りに評価した。
一次ヒトＴ細胞の結果
図３１及び図３２は、ｆｕｓＴＣＡＲが任意の共刺激ドメインと共に使用され得、構築物内のＩＴＡＭドメインの欠如にも関わらず、標的依存性細胞溶解活性をなお維持し、且つＩＬ２発現を誘導することができることを証明している。
実施例８：ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζを介してＴＣＲ複合体に融合された構成的活性型ＴＣＡＲ（ｆｕｓＴＣＡＲ）
ＴＣＲ複合体の複雑な多タンパク質構造を考慮に入れると、ＴＣＡＲについての活性は、ＣＤ３εとの共有結合及び非共有結合融合に限定されるものではなく、例えばＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζなどの複合体中の他の付属タンパク質との非共有結合及び共有結合融合も活性ＴＣＡＲを産生することができる。さらに、免疫シナプスは、標的細胞とＴ細胞との間の距離によって仲介され得るため、腫瘍標的化アームと、これらの付属タンパク質との融合体との間の異なる長さのリンカーを使用することにより、最適な長さを仲介することが必要となり得る。
一過性発現及び活性化アッセイ
ｆｕｓＴＣＡＲ構築物の合成
プラスミドＤＮＡをＤＮＡ２．０によって外部的に合成する。名目上調節不可能なＣＡＲ構築物、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ、配列番号１を対照として使用する。
「ｆｕｓＴＣＡＲ１４」では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ３δ細胞外及び膜貫通ドメイン、続いて細胞内共刺激ドメイン４－１ＢＢへの２ｘＧ４Ｓリンカー（配列番号６２）とのＮ末端融合体としてクローン化する（配列番号２６）。「ｆｕｓＴＣＡＲ１５」（配列番号２７）を、ｓｃＦｖとＣＤ３ε細胞外ドメインとの間のリンカーが４ｘＧ４Ｓリンカー（配列番号４５）であることを除いて、同様にクローン化する。
「ｆｕｓＴＣＡＲ１６」では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ３δ細胞外及び膜貫通ドメイン、続いて細胞内共刺激ドメイン４－１ＢＢへのＮ末端融合体としてクローン化した（配列番号２８）。「ｆｕｓＴＣＡＲ１７」（配列番号２９）及び「ｆｕｓＣＡＲ１８」（配列番号３０）を、ｓｃＦｖとＣＤ３δ細胞外ドメインとの間でそれぞれ２ｘＧ４Ｓ（配列番号６２）及び４ｘＧ４Ｓ（配列番号４５）リンカーを用いたことを除いて同様にクローン化した。
「ｆｕｓＴＣＡＲ１９」では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ３γ細胞外及び膜貫通ドメイン、続いて細胞内共刺激ドメイン４－１ＢＢへのＮ末端融合体としてクローン化した（配列番号３１）。「ｆｕｓＴＣＡＲ２０」（配列番号３２）及び「ｆｕｓＴＣＡＲ２１」（配列番号３３）を、ｓｃＦｖとＣＤ３γ細胞外ドメインとの間でそれぞれ２ｘＧ４Ｓ（配列番号６２）及び４ｘＧ４Ｓ（配列番号４５）リンカーを用いたことを除いて同様にクローン化した。
ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅ＿２Ｇ４Ｓ＿ＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号２６／配列番号６２として開示された「２Ｇ４Ｓ」）
Figure 2023071774000037
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅ＿４Ｇ４Ｓ＿ＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号２７／配列番号４５として開示された「４Ｇ４Ｓ」）
Figure 2023071774000038
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｄ＿ＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号２８）
Figure 2023071774000039
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｄ＿２Ｇ４Ｓ＿ＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号２９／配列番号６２として開示された「２Ｇ４Ｓ」）
Figure 2023071774000040
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｄ＿４Ｇ４Ｓ＿ＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号３０／配列番号４５として開示された「４Ｇ４Ｓ」）
Figure 2023071774000041
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｇＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号３１）
Figure 2023071774000042
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－２Ｇ４Ｓ＿ＣＤ３ｇＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号３２／配列番号６２として開示された「２Ｇ４Ｓ」）
Figure 2023071774000043
 ＣＤ１９ｓｃＦｖ－４Ｇ４Ｓ＿ＣＤ３ｇＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号３３／配列番号４５として開示された「４Ｇ４Ｓ」）
Figure 2023071774000044
ジャーカットレポーター細胞株のトランスフェクション及びＮＦＡＴの活性化
抗原結合ドメインの標的抗原エンゲージメント後の活性化を、実施例１に記載されたようにＮＦＡＴ－ＬＵＣレポーターを含むジャーカット細胞（ＪＮＬ）レポーター細胞株を用いて測定した。トランスフェクトされた細胞を標的プレートに１ウェル当たり１００μｌで添加した。ルシフェラーゼＯｎｅ Ｇｌｏ試薬１００μｌをウェルごとに添加した。試料を５分間インキュベートし、次いでルミネセンスを記載されたように測定した。
一過性トランスフェクションの結果
図３３は、ＴＣＡＲが機能的であり、ＣＤ３ε又はＣＤ３γのいずれかが構築物中の融合体に使用されるかに無関係にＮＦＡＴ経路を介するシグナル伝達をもたらすことを証明している。さらに、所望の結果を得るために、様々な長さのリンカーを用いて結合ドメインをＴＣＡＲの残部に融合させ得る。ＣＤ３δに融合させた構築物は、ＦＡＣＳに基づくとレポーター細胞の細胞表面上で一過性発現せず、このアプローチに基づくこれらの好適性に関する決定を行うことができず、評価を一次ヒトＴ細胞に代えて行った。
レンチウイルス形質導入一次ヒトＴ細胞の産生
ｆｕｓＴＣＡＲは、それらの活性について一次ヒトＴ細胞中でも試験した。レンチウイルスの産生前に、追加の構築物を、ＣＤ３ζの細胞外及び膜貫通ドメインをその細胞内ドメインの非存在下で使用することができるかを試験するためにも設計した。プラスミドＤＮＡをＤＮＡ２．０によって外部的に合成した。「ｆｕｓＴＣＡＲ２２」では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ３ζ細胞外及び膜貫通ドメイン、続いて細胞内共刺激ドメイン４－１ＢＢへのＮ末端融合体としてクローン化した（配列番号３４）。
ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｚＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号３４）
Figure 2023071774000045
レンチウイルス産生及び一次Ｔ細胞へのウイルス形質導入
実施例１に記載されるようにレンチウイルスをｆｕｓＴＣＡＲ３、ｆｕｓＴＣＡＲ１６、ｆｕｓＴＣＡＲ１９及びｆｕｓＴＣＡＲ２２に対して産生し、単離された一次ヒトＴ細胞中に形質導入した。形質導入Ｔ細胞及び非形質導入対照Ｔ細胞を増殖させて後の分析のために凍結した。
細胞傷害性及びＩＬ２アッセイ
一次ヒトＴ細胞を標的腫瘍細胞に架橋することによって誘導された細胞傷害性及びＩＬ２産生を実施例１に記載された通りに評価した。
一次ヒトＴ細胞の結果
図３４及び図３５で観察することができるように、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ及びＣＤ３δ上のｆｕｓＴＣＡＲは、対照ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ ＣＡＲに対して明らかな活性を証明した。ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインの非存在にも関わらず、再指示された溶解活性及びＩＬ２分泌が観察されたことに留意することが重要である。対照的に、図３６に示されるように、ＣＤ３ζ上のｆｕｓＴＣＡＲは、低減された溶解活性をもたらした。ＦＡＣＳ分析は、この構築物に関する低い細胞表面発現がＴＣＲの構造及び腫瘍標的化ドメインの付加による可能性が高く、構築物設計の追加の最適化が発現を改善し、且つ活性を最大化するために必要であることを証明した。
実施例９：代替的結合ドメインを有するＣＤ３εを介してＴＣＲ複合体に融合された構成的活性型ＴＣＡＲ
ＴＣＡＲは、様々な結合ドメイン及び標的抗原を使用して、固形腫瘍及び血液腫瘍に対する幅広い適用性を証明するべきである。メソテリンは、広範囲の腫瘍型で発現される興味深い１つの抗原である。
ｆｕｓＴＣＡＲ構築物の合成
プラスミドＤＮＡをＤＮＡ２．０によって外部的に合成する。名目上調節不可能なＣＡＲ構築物、ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＢＢＺ、配列番号３５を対照として使用する。
「ｆｕｓＴＣＡＲ２３」では、ＣＤ１９ｓｃＦｖをＣＤ３ε細胞外及び膜貫通ドメイン、続いて細胞内共刺激ドメイン４－１ＢＢへのＧ４Ｓリンカー（配列番号５２）とのＮ末端融合体としてクローン化する（配列番号３６）。「ｆｕｓＴＣＡＲ２５」を、ＣＤ８ａリンカーがＣＤ３ε細胞外及び膜貫通ドメイン、続いて４－１ＢＢのＮ末端に融合するために使用されたことを除いて同様にクローン化した（配列番号３７）。
「ｆｕｓＴＣＡＲ２５」をＣＤ３ε細胞外及び膜貫通ドメイン、続いて細胞内共刺激ドメインＣＤ２７のＧ４Ｓリンカー（配列番号５２）とのＮ末端融合体としてクローン化した（配列番号３８）。「ｆｕｓＴＣＡＲ２３」、「ｆｕｓＴＣＡＲ２４」及び「ｆｕｓＴＣＡＲ２５」は、固有の細胞内ＩＴＡＭシグナル伝達ドメインを欠いている。
ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＢＢＺ（配列番号３５）
Figure 2023071774000046
 ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号３６）
Figure 2023071774000047
 ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＣＤ８ｈｉｎｇｅ－ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号３７）
Figure 2023071774000048
 ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－ＣＤ２７（配列番号３８）
Figure 2023071774000049
レンチウイルス産生及び一次Ｔ細胞へのウイルス形質導入
実施例１に記載されるようにレンチウイルスを産生し、単離された一次ヒトＴ細胞中に形質導入した。形質導入Ｔ細胞及び非形質導入対照Ｔ細胞を増殖させて後の分析のために凍結した。
細胞傷害性及びＩＬ２アッセイ
一次ヒトＴ細胞を標的腫瘍細胞に架橋することによって誘導された細胞傷害性及びＩＬ２産生を実施例１に記載された通りに評価した。天然にメソテリンを過剰発現し、ホタルルシフェラーゼで形質導入されたＯＶＣＡＲ８を、標的細胞株として代用した。
一次ヒトＴ細胞の結果
ＣＤ１９標的化ＴＣＡＲを利用する他の実施例と同様に、メソテリン抗原を標的とするＴＣＡＲは、強力な細胞傷害性分子である。エンゲージメント時の細胞傷害性活性及びＩＬ２発現（それぞれ図３７及び３８）は、ＩＴＡＭを活性のための前提条件として必要とせず、両方のＣＤ２７及び４－１ＢＢ細胞内共刺激ドメインは、良好な機能活性を証明した。図３９及び４０に示されるように、腫瘍標的化ドメインとＴＣＲ付属タンパク質との間のリンカーは、ＴＣＡＲの機能活性を調節することができ、且つ所望の特性を得るために調整され得る。
実施例１０：メソテリン及びＣＤ１９を標的とするＴＣＡＲ
キメラ膜タンパク質構築物の合成
プラスミドＤＮＡをＤＮＡ２．０によって外部的に合成する。名目上調節不可能なＣＡＲ構築物、ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＢＢＺ、配列番号３５及び／又は名目上調節不可能なＣＡＲ構築物、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＢＢＺ、配列番号１を対照として使用する。前の実施例で記載されたキメラ膜タンパク質に加えて、以下のキメラ膜タンパク質も使用される。
ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｄＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号６３）
Figure 2023071774000050
 ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｇＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ（配列番号６４）
Figure 2023071774000051
 ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｇ（全体）（配列番号６５）
Figure 2023071774000052
 ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｇ（全体）－４１ＢＢ（配列番号６６）
Figure 2023071774000053
 ＭＳＬＮ５ｓｃＦｖ－ＣＤ３ｅ（全体）－４１ＢＢ（配列番号６７）
Figure 2023071774000054
レンチウイルス産生及び一次Ｔ細胞へのウイルス形質導入
実施例１に記載されるようにレンチウイルスを産生し、単離された一次ヒトＴ細胞中に形質導入した。形質導入Ｔ細胞及び非形質導入対照Ｔ細胞を増殖させて後の分析のために凍結する。細胞を、下記のようにＣＤ１９標的化キメラ分子と、メソテリン標的化キメラ分子とをコードするレンチウイルスで形質導入し、ＣＤ１９標的化キメラ分子のみ若しくはメソテリン標的化キメラ分子のみをコードするレンチウイルスで形質導入された細胞又は非形質導入細胞と比較した。以下の構築物をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞を生成し、以下に記載のアッセイで試験する。
Figure 2023071774000055
細胞傷害性及びＩＬ２アッセイ
標的腫瘍細胞に応答して、この実施例のように操作されたヒトＴ細胞によって誘導された細胞傷害性及びＩＬ２産生を実施例１に記載された通りに評価する。ホタルルシフェラーゼで形質導入されたＮａｌｍ６（ＣＤ１９＋）、ＯＶＣＡＲ８（メソテリン＋）又はＮａｌｍ６とＯＶＣＡＲ８との組み合わせを標的細胞株として使用し、Ｋ５６２（ホタルルシフェラーゼで形質導入されたＣＤ１９－及びメソテリン－（陰性対照））と比較する。
実施例１１：２つの異なるＴＣＡＲを発現するＴ細胞は、二重特異性を示す
ＣＤ２２に対する特異性を有するＴＣＡＲ（ＣＤ２２－６５ｓｃＦｖ－Ｇ４Ｓ－ＣＤ３ｅＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ、「ＣＤ２２ ＴＣＡＲ」、配列番号７３）及びＣＤ１９に対する特異性を有するＴＣＡＲ（ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇ４Ｓ－ＣＤ３ｇＥＣＤＴＭ－４１ＢＢ、「ＣＤ１９－ＴＣＡＲ」、配列番号７２）をレンチウイルスＣＡＲ発現ベクター中にクローン化した。２つの異なる特異性を有するＴＣＡＲを発現するＴ細胞が、標的タンパク質のいずれか又は両方を発現する標的細胞にも特異的応答を及ぼしたかどうかを試験した。
ＴＣＡＲレンチウイルスの生成
ＴＣＡＲをコードするレンチウイルス輸送ベクターを用いて、ＶＳＶｇシュードタイプ化レンチウイルス粒子中にパッケージされたゲノム物質を生成した。ＴＣＡＲをコードするレンチウイルス輸送ベクターＤＮＡを、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトするためのリポフェクタミン２０００試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と組み合わせて、３つのパッケージング構成要素ＶＡＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖと混合し、続いて１２～１８時間後に培地交換した。培地交換から３０時間後に培地を採集し、濾過し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ濃縮器（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて濃縮し、小分けにして－８０℃で保存した。
ＴＣＡＲ ＪＮＬ細胞の生成
ジャーカットＮＦＡＴルシフェラーゼ（ＪＮＬ）レポーター細胞株は、急性Ｔ細胞白血病ジャーカット細胞株に基づいている。この細胞株を、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントの制御下でルシフェラーゼを発現するように改変した。ＴＣＡＲによる形質導入について、１２ウェルプレートの４００，０００個のＪＮＬ細胞／ウェルを１．５の多重感染度（ＭＯＩ）で形質導入した。凍結したウイルス含有上清を室温で解凍し、それぞれのウェルに添加した。それぞれ１つのウェルにそれぞれＭＯＩ＝１．５で、ＣＤ１９－ＴＣＡＲ、ＣＤ２２－ＴＣＡＲ又はＣＤ１９－ＴＣＡＲ＋ＣＤ２２－ＴＣＡＲ（「ＣＤ１９／２２二重ＴＣＡＲ」）を導入した。プレートを６日間培養した。
単一Ｔ細胞上の２つのＴＣＡＲの機能発現の評価
ＴＣＡＲ発現Ｔ細胞をそれらの標的結合能力についてフローサイトメトリーにより試験した。非形質導入（ＵＴＤ）ＪＮＬ細胞、ＣＤ１９－ＴＣＡＲ、ＣＤ２２－ＴＣＡＲ及びＣＤ１９／２２二重ＴＣＡＲを発現するＪＮＬ細胞を試験し、細胞をＣＤ２２－Ｆｃで４℃において３０分間染色した。洗浄後、細胞を抗Ｆｃ二次抗体で４℃において３０分間染色した。２回目の洗浄後、細胞をＣＤ１９－ＣＡＲ抗イディオタイプ抗体（Ａｂ）で４℃において３０分間染色した。次いで、最後の洗浄後にＦＡＣＳ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａで細胞を分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを使用して分析した。ＵＴＤ ＪＮＬ細胞は、染色試薬のいずれにも結合せず、ＣＤ２２－Ｆｃの低い結合をバックグラウンド結合として解釈した（図４７Ａ）。ＣＤ１９－ＴＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１９－ＣＡＲ抗イディオタイプＡｂ染色によって検出されたようにＴＣＡＲの正確な折り畳み及び発現を示した一方、ＣＤ２２－Ｆｃに結合しなかった（図４７Ｂ）。ＣＤ２２－ＴＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ２２－Ｆｃに結合したが、ＣＤ１９－ＣＡＲ抗イディオタイプＡｂで染色されなかった（図４７Ｃ）。対照的に、両方のウイルス、ＣＤ１９／２２二重ＴＣＡＲで形質導入されたＪＮＬ細胞は、ＣＤ２２に結合し、且つＣＤ１９－ＣＡＲ抗イディオタイプの結合を示した（図４７Ｄ）。
ＴＣＡＲに再指示されたＪＮＬ細胞の有効性
ＴＣＡＲの機能的能力を評価するために、非形質導入ＪＮＬ細胞及び１つ又は両方のＴＣＡＲコードウイルスで形質導入された細胞を標的癌細胞と共培養し、ルシフェラーゼ発現を定量化することにより、それらの活性化を読み出した。ＪＮＬ ＣＡＲＴ細胞を、ＣＤ１９又はＣＤ２２を過剰発現する慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株Ｋ５６２と共培養した。親Ｋ５６２細胞株は、陰性対照として機能した。共培養を３８４ウェルプレートにおいて１：３、１：１及び１：０．３のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で設定し、２４時間インキュベートし、その後、活性化ＪＮＬ ＴＣＡＲ Ｔ細胞によるルシフェラーゼの発現をｂｒｉｔｅｌｉｔｅ ｐｌｕｓ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって定量化した。各ウェルからの発光の量（ルミネセンス）は、それぞれのＴＣＡＲによるＪＮＬ活性化の直接読み出しであった。ＣＤ１９／２２二重ＴＣＡＲ細胞は、両方のＣＤ１９発現及びＣＤ２２発現Ｋ５６２細胞によって活性化され、それらの二重特異性を証明した（図４８Ａ及び４８Ｂ）。二重ＴＣＡＲ Ｔ細胞の活性化の程度は、それぞれの抗原による単一ＴＣＡＲ細胞の活性化に非常に類似しており、すなわち、ＣＤ１９ ＴＣＡＲ細胞は、Ｋ５６２－ＣＤ１９によって活性化され、且つＣＤ２２ ＴＣＡＲは、Ｋ５６２－ＣＤ２２によって活性化された。単一ＴＣＡＲ細胞は、非同族抗原によって活性化されなかった（図４８Ａ及び４８Ｂ）。また、親Ｋ５６２細胞株は、ＴＣＡＲのいずれの活性ももたらさず、それらの特異性を証明した（図４８Ｃ）。
結論
２つの異なるＴＣＡＲをコードするウイルスで形質導入されたＪＮＬ細胞は、２つの正確に折りたたまれたＴＣＡＲを細胞表面上で同時に発現することができた。これは、ＣＤ１９／２２二重ＴＣＡＲ細胞のＣＤ２２－Ｆｃに結合する能力及びＣＤ１９－ＣＡＲ抗イディオタイプ抗体による染色によって証明された（図４７Ｄ）。細胞表面上の発現に加えて、ＴＣＡＲは、ＪＮＬの標的依存性活性化を仲介した（図４８Ａ及び４８Ｂ）。ＣＤ１９／２２二重ＴＣＡＲ細胞のみが両方のＫ５６２－ＣＤ１９及びＣＤ２２によって活性化され、これらの細胞の二重特異性を証明した（４８Ａ及び４８Ｂ）。
実施例１２：２つの異なるＴＣＡＲを発現するＴ細胞のインビトロ及びインビボでの検討
ヒトＴリンパ球を対象から採取し、生体外に提供し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して刺激し、ＥＦ１プロモーターの制御下でＴＣＡＲをコードする１つ又は２つのレンチウイルスベクターで形質導入した。異なる特異性を有する２つのＴＣＡＲをこの実験で使用し、一方は、ＣＤ１９に対して特異的なＴＣＡＲであり、他方は、ＣＤ２２に対して特異的なＴＣＡＲであった。Ｔ細胞は、これらのＴＣＡＲのいずれかをコードする１つのベクター又は両方のベクターで同時に形質導入される。加えて、単一のビシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）レンチウイルスベクターを構築し、これは、すべてＥＦ１プロモーターの制御下において、介在するＰ２Ａ部位を伴うＣＤ１９ ＴＣＡＲ及びＣＤ２２ ＴＣＡＲの両方をコードし、単一のウイルスによる形質導入で二重ＴＣＡＲ細胞の生成を可能にするものである。ＴＣＡＲ Ｔ細胞の増殖、サイトカイン放出及び細胞傷害性を、本明細書に開示された方法を使用して（例えば、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットに記載されるように）、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２－細胞、ＣＤ１９－／ＣＤ２２＋細胞、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋細胞及びＣＤ１９－／ＣＤ２２＋細胞とＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋細胞とを含む細胞の集団に対してアッセイする。定着腫瘍を有する免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／共通γ鎖－／－マウスに細胞を静脈内投与することにより、細胞をインビボでさらにアッセイする（増殖、長期持続性及び腫瘍毒性、例えば国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットに記載された方法によって）。インビトロでのアッセイについて、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２－細胞、ＣＤ１９－／ＣＤ２２＋細胞、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋細胞及びＣＤ１９－／ＣＤ２２＋細胞とＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋細胞とを含む細胞の集団を試験する。ＣＡＲＴ細胞の持続性、増殖／拡大及び抗腫瘍効果を監視する。二重ＴＣＡＲが、それぞれの抗原の１つのみ又は両方を発現する癌細胞の混合集団からなる腫瘍を拒絶することができるかどうかを検討する。
均等物
本明細書に引用するそれぞれの及び全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、具体的態様を参照して開示しているが、本発明の他の態様及び変形形態は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の当業者によって考案され得ることが明らかである。下記の特許請求の範囲は、全てのこのような態様及び均等な変形形態を含むと解釈されることを意図する。

Claims (71)

  1. 第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインとを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第１の細胞内共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む第１のキメラ膜タンパク質と；
    第２の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインとを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び任意選択によりＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む第２のキメラ膜タンパク質と
    を含む系であって、前記第１の抗原結合ドメインと前記第２の抗原結合ドメインとは、同一ではなく、ＣＤ３γ、δ又はεの前記細胞外ドメインに由来する前記第１の細胞外ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの前記細胞外ドメインに由来する前記第２の細胞外ドメインとは、同一ではない、系。
  2. 前記第１の細胞外ドメインは、ＣＤ３γ、δ若しくはεの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、任意選択により、前記第１の細胞外ドメインは、配列番号８８、８３若しくは７８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、任意選択により、前記第１の細胞外ドメインは、配列番号８８、８３又は７８の前記アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の系。
  3. 前記第２の細胞外ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、任意選択により、前記第２の細胞外ドメインは、配列番号８８、８３若しくは７８のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、任意選択により、前記第２の細胞外ドメインは、配列番号８８、８３又は７８の前記アミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の系。
  4. （ｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み；
    （ｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み；
    （ｉｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８の前記アミノ酸配列を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３の前記アミノ酸配列を含み；
    （ｉｖ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み；
    （ｖ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み；
    （ｖｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８の前記アミノ酸配列を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８の前記アミノ酸配列を含み；
    （ｖｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み；
    （ｖｉｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み；
    （ｉｘ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３の前記アミノ酸配列を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８の前記アミノ酸配列を含み；
    （ｘ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み；
    （ｘｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み；
    （ｘｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３の前記アミノ酸配列を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８の前記アミノ酸配列を含み；
    （ｘｉｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み；
    （ｘｉｖ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み；
    （ｘｖ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８の前記アミノ酸配列を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８８の前記アミノ酸配列を含み；
    （ｘｖｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの前記細胞外ドメイン又はその機能的変異体を含み；
    （ｘｖｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み；又は
    （ｘｖｉｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７８の前記アミノ酸配列を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８３の前記アミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の系。
  5. 前記第１のキメラ膜タンパク質の前記膜貫通ドメインは、ＣＤ３γ、δ若しくはεの膜貫通ドメイン又はその機能的変異体を含み、任意選択により、前記第１のキメラ膜タンパク質の前記膜貫通ドメインは、配列番号８９、８４若しくは７９のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の系。
  6. 前記第１のキメラ膜タンパク質の前記膜貫通ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの膜貫通ドメインを含まない、請求項１～４のいずれか一項に記載の系。
  7. 前記第２のキメラ膜タンパク質の前記膜貫通ドメインは、ＣＤ３γ、δ若しくはεの膜貫通ドメイン又はその機能的変異体を含み、任意選択により、前記第２のキメラ膜タンパク質の前記膜貫通ドメインは、配列番号８９、８４若しくは７９の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の系。
  8. 前記第２のキメラ膜タンパク質の前記膜貫通ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの膜貫通ドメインを含まない、請求項１～６のいずれか一項に記載の系。
  9. 前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ若しくはεタンパク質又はその機能的変異体を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の系。
  10. （ｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号９０、８５若しくは８０のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、任意選択により、前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号９０、８５又は８０の前記アミノ酸配列を含み；又は
    （ｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８７、８２若しくは７７のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、任意選択により、前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号８７、８２又は７７の前記アミノ酸配列を含む、請求項９に記載の系。
  11. 前記第２のキメラ膜タンパク質は、前記ＣＤ３γ、δ若しくはεタンパク質又はその機能的変異体を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の系。
  12. （ｉ）前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号９０、８５若しくは８０の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、任意選択により、前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号９０、８５又は８０の前記アミノ酸配列を含み；又は
    （ｉｉ）前記第２のキメラ膜タンパク質は、前記ＣＤ３γ、δ若しくはεタンパク質又はその機能的変異体を含み、任意選択により、前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８７、８２若しくは７７の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、任意選択により、前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号８７、８２又は７７の前記アミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の系。
  13. 前記第１のキメラ膜タンパク質は、前記ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質に由来するいかなる細胞内ドメインも含まない、請求項１～９、１１又は１２のいずれか一項に記載の系。
  14. 前記第２のキメラ膜タンパク質は、前記ＣＤ３γ、δ又はεタンパク質に由来するいかなる細胞内ドメインも含まない、請求項１～１１又は１３のいずれか一項に記載の系。
  15. 前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの前記細胞外ドメインに由来する前記第１の細胞外ドメインに対してＮ末端に位置する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の系。
  16. 前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３γ、δ又はεの前記細胞外ドメインに由来する前記第２の細胞外ドメインに対してＮ末端に位置する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の系。
  17. 前記第１のキメラ膜タンパク質、前記第２のキメラ膜タンパク質又は前記第１及び第２のキメラ膜タンパク質の両方は、前記第１及び／又は第２の抗原結合ドメインに対してＮ末端に位置する第３の抗原結合ドメインを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の系。
  18. 前記第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの前記細胞外ドメインに由来する前記第１の細胞外ドメインとは、第１のリンカーによって結合され、且つ／又は前記第２の抗原結合ドメインと、ＣＤ３γ、δ又はεの前記細胞外ドメインに由来する前記第２の細胞外ドメインとは、第２のリンカーによって結合される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の系。
  19. 前記第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、例えばそれからなり、例えば、ここで、ｎは、０～１０の整数であり、例えばｎ＝１、２又は４である、請求項１８に記載の系。
  20. 前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の系。
  21. 前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第２の細胞内共刺激ドメインを含まない、請求項１～１９のいずれか一項に記載の系。
  22. 第２の細胞内共刺激ドメインを含まない、請求項１～１９又は２１のいずれか一項に記載の系。
  23. 前記第１の細胞内共刺激ドメイン及び前記第２の細胞内共刺激ドメインの両方を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の系。
  24. 前記第１のキメラ膜タンパク質は、前記第１の細胞内共刺激ドメインに対してＣ末端に位置する、ＣＤ３γ、δ又はε以外のタンパク質に由来する第３の細胞内共刺激ドメインを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の系。
  25. 前記細胞内共刺激ドメイン（例えば、前記第１の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第２の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第３の細胞内共刺激ドメイン）の１つ以上は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンド又はそれらの機能的変異体からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の系。
  26. 前記細胞内共刺激ドメイン（例えば、前記第１の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第２の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第３の細胞内共刺激ドメイン）の１つ以上は、４－１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン又はその機能的変異体であり、任意選択により、前記細胞内共刺激ドメイン（例えば、前記第１の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第２の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第３の細胞内共刺激ドメイン）の１つ以上は、配列番号５０のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、任意選択により、前記細胞内共刺激ドメイン（例えば、前記第１の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第２の細胞内共刺激ドメイン、及び／又は存在する場合には第３の細胞内共刺激ドメイン）の１つ以上は、配列番号５０の前記アミノ酸配列を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の系。
  27. （ｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号９１、８６若しくは８１のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、任意選択により、前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号９１、８６又は８１の前記アミノ酸配列を含み；又は
    （ｉｉ）前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号９１、８６若しくは８１の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、任意選択により、前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号９１、８６又は８１の前記アミノ酸配列を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の系。
  28. 前記第１の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に結合する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の系。
  29. 前記第１の抗原結合ドメインは、Ｂ細胞抗原に結合する、請求項１～２８のいずれか一項に記載の系。
  30. 前記第１の抗原結合ドメインによって結合される前記Ｂ細胞抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、５、７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ－７／４／３Ｒ又はＩＬ４Ｒである、請求項２９に記載の系。
  31. 前記第１の抗原結合ドメインによって結合される前記Ｂ細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１又はＣＤ１３８である、請求項３０に記載の系。
  32. 前記第２の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に結合する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の系。
  33. 前記第２の抗原結合ドメインは、Ｂ細胞抗原に結合する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の系。
  34. 前記第２の抗原結合ドメインは、前記第１の抗原結合ドメインによって結合される前記Ｂ細胞抗原と異なるＢ細胞抗原に結合する、請求項２９～３１又は３３のいずれか一項に記載の系。
  35. 前記第２の抗原結合ドメインによって結合される前記Ｂ細胞抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、５、７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ－７／４／３Ｒ又はＩＬ４Ｒである、請求項３３又は３４に記載の系。
  36. 前記第２の抗原結合ドメインによって結合される前記Ｂ細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＢＣＭＡ、ＣＳ－１又はＣＤ１３８である、請求項３５に記載の系。
  37. （ｉ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合し；
    （ｉｉ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し；
    （ｉｉｉ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し；
    （ｉｖ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し；
    （ｖ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し；又は
    （ｖｉ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２０に結合する、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の系。
  38. 前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合し、任意選択により、
    （ｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７０のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７５若しくは７６のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み；
    （ｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７１のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７３のアミノ酸配列、配列番号７４のアミノ酸配列、配列番号７５の前記アミノ酸配列若しくは配列番号７６の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み；又は
    （ｉｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、配列番号７２のアミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含み、及び前記第２のキメラ膜タンパク質は、配列番号７３若しくは７４の前記アミノ酸配列（又はそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％若しくはそれを超えて同一であり、且つ／又は１つ、２つ、３つ若しくはそれを超える置換、挿入若しくは欠失、例えば保存的置換を有する配列）を含む、請求項３７に記載の系。
  39. 前記第１又は第２の抗原結合ドメインは、固形腫瘍抗原に結合する、請求項１～３８のいずれか一項に記載の系。
  40. 前記固形腫瘍抗原は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリン、ＧＤ２、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、Ｔｎ－Ｏ－糖ペプチド、ｓＴｎ－Ｏ－糖ペプチド、ＰＳＭＡ、ＣＤ９７、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、レグマン、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ（例えば、ＥＲＢＢ２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、エフリンＢ２、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｓＬｅ、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＦＡＰ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６若しくはＥ７、ＭＬ－ＩＡＰ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、Ｆｏｓ関連抗原、好中球エラスターゼ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、精子タンパク質１７、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、チログロブリン、ＰＬＡＣ１、ｇｌｏｂｏＨ、ＲＡＧＥ１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＮＡ－１７、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＧＰＲ２０、Ｌｙ６ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＧＦＲα４又はＭＨＣに提示される前記抗原のいずれかのペプチドである、請求項３９に記載の系。
  41. 前記固形腫瘍抗原は、ＣＬＤＮ６、メソテリン及びＥＧＦＲｖＩＩＩからなる群から選択される、請求項４０に記載の系。
  42. （ｉ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、メソテリンに結合し；
    （ｉｉ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し；
    （ｉｉｉ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＬＤＮ６に結合し；
    （ｉｖ）前記第１の抗原結合ドメインは、メソテリンに結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し；
    （ｖ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合し；又は
    （ｖｉ）前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＬＤＮ６に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合する、請求項４１に記載の系。
  43. 請求項１～４２のいずれか一項に記載の系をコードする核酸構築物。
  44. ｍＲＮＡである、請求項４３に記載の核酸構築物。
  45. 前記第１のキメラ膜タンパク質をコードする第１の核酸分子と、前記第２のキメラ膜タンパク質をコードする第２の核酸分子とを含み、任意選択により、
    （ｉ）前記第１及び第２の核酸分子は、単一の核酸分子上に配置されるか、又は
    （ｉｉ）前記第１及び第２の核酸分子は、個別の核酸分子上に配置される、請求項４３又は４４に記載の核酸構築物。
  46. 請求項４３～４５のいずれか一項に記載の核酸構築物を含むベクター。
  47. レンチウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルスベクターである、請求項４６に記載のベクター。
  48. 前記第１及び第２のキメラ膜タンパク質の発現時、前記タンパク質は、単一のｍＲＮＡ転写物として発現される、請求項４６又は４７に記載のベクター。
  49. 前記第１及び第２のキメラ膜タンパク質をコードする核酸配列は、自己切断部位又は配列内リボソーム進入部位をコードする核酸によって分離される、請求項４８に記載のベクター。
  50. 請求項４３～４５のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項４６～４９のいずれか一項に記載のベクター又は請求項１～４２のいずれか一項に記載の系を含む細胞。
  51. ＮＫ細胞又はＴ細胞である、請求項５０に記載の細胞。
  52. 第１の阻害剤をさらに含み、
    （ｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの前記細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び前記第１の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３γの発現を低減し；
    （ｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの前記細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び前記第１の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３δの発現を低減し；又は
    （ｉｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの前記細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び前記第１の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３εの発現を低減し、任意選択により、
    前記第１の阻害剤は、前記細胞中の前記第１のキメラ膜タンパク質の発現を低減しないか又は実質的に低減しない（例えば、前記第１の阻害剤は、前記第１の阻害剤の非存在下での前記第１のキメラ膜タンパク質の発現と比較して２、５、１０、１５又は２０％以下のレベルで前記第１のキメラ膜タンパク質の発現を低減する）、請求項５０又は５１に記載の細胞。
  53. 第２の阻害剤をさらに含み、
    （ｉ）前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの前記細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び前記第２の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３γの発現を低減し；
    （ｉｉ）前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの前記細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び前記第２の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３δの発現を低減し；又は
    （ｉｉｉ）前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの前記細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び前記第２の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３εの発現を低減し、任意選択により、
    前記第２の阻害剤は、前記細胞中の前記第２のキメラ膜タンパク質の発現を低減しないか又は実質的に低減しない（例えば、前記第２の阻害剤は、前記第２の阻害剤の非存在下での前記第２のキメラ膜タンパク質の発現と比較して２、５、１０、１５又は２０％以下のレベルで前記第２のキメラ膜タンパク質の発現を低減する）、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の細胞。
  54. 前記第１又は第２の阻害剤は、ＲＮＡ干渉を媒介する薬剤、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡをコードする核酸分子である、請求項５２又は５３に記載の細胞。
  55. 前記第１又は第２の阻害剤は、遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系若しくはメガヌクレアーゼ系）又は前記遺伝子編集系の１つ以上の成分をコードする核酸分子である、請求項５２又は５３に記載の細胞。
  56. 増殖性疾患を有する対象を治療する方法であって、請求項５０～５５のいずれか一項に記載の細胞を前記対象に投与することを含む方法。
  57. 前記対象は、腫瘍を有し、及び前記投与は、前記腫瘍に対する免疫を前記対象に提供する、請求項５６に記載の方法。
  58. 癌を有する対象において抗癌免疫応答を提供する方法であって、請求項５０～５５のいずれか一項に記載の細胞を前記対象に投与することを含む方法。
  59. 前記細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり、且つ前記対象に対してオートロガスである、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記細胞は、同種異系Ｔ細胞又はＮＫ細胞である、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記対象は、ヒトである、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記対象は、癌を有する、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記癌は、例えば、少なくとも１つの過去の標準療法に際して進行している対象における中皮腫（例えば、悪性胸膜中皮腫）；肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌又は大細胞肺癌）；膵臓癌（例えば、少なくとも１つの過去の標準療法に際して進行している対象における例えば膵管腺癌若しくは転移性膵管腺癌（ＰＤＡ））；食道腺癌、卵巣癌（例えば、標準療法の少なくとも１つの過去のレジメン後に進行している対象における例えば漿液性上皮卵巣癌）、乳癌、大腸癌、膀胱癌又はそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記癌は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性炎症を伴うＤＬＢＣＬ、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、嚢胞性リンパ腫、小児性嚢胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、小細胞若しくは大細胞性嚢胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫（粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯リンパ腫）、辺縁帯リンパ腫、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾臓リンパ腫／白血病、びまん性赤脾髄小型Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞性白血病亜型、リンパ形質細胞性リンパ腫、Ｈ鎖病、形質細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外形成細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児性節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は分類不能型リンパ腫から選択される、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原（例えば、第１の腫瘍抗原）に結合し、及び前記第２の抗原結合ドメインは、第２の抗原（例えば、第２の腫瘍抗原）に結合し、前記癌は、前記第１の抗原（例えば、第１の腫瘍抗原）及び／又は前記第２の抗原（例えば、第２の腫瘍抗原）の異種発現を呈し、例えば、前記癌における細胞の９０％、８０％、７０％、６０％又は５０％未満は、前記第１の抗原（例えば、第１の腫瘍抗原）を発現し、及び前記癌における細胞の９０％、８０％、７０％、６０％又は５０％未満は、前記第２の抗原（例えば、第２の腫瘍抗原）を発現する、請求項６２に記載の方法。
  66. 細胞を作製する方法であって、請求項４６～４９のいずれか一項に記載のベクターを細胞に導入すること、例えば請求項４６～４９のいずれか一項に記載のベクターで細胞を形質導入することを含む方法。
  67. 第１の阻害剤を前記細胞に導入することをさらに含み、
    （ｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの前記細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び前記第１の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３γの発現を低減し；
    （ｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの前記細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び前記第１の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３δの発現を低減し；又は
    （ｉｉｉ）前記第１のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの前記細胞外ドメインに由来する第１の細胞外ドメインを含み、及び前記第１の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３εの発現を低減し、任意選択により、
    前記第１の阻害剤は、前記細胞中の前記第１のキメラ膜タンパク質の発現を低減しないか又は実質的に低減しない（例えば、前記第１の阻害剤は、前記第１の阻害剤の非存在下での前記第１のキメラ膜タンパク質の発現と比較して２、５、１０、１５又は２０％以下のレベルで前記第１のキメラ膜タンパク質の発現を低減する）、請求項６６に記載の方法。
  68. 第２の阻害剤を細胞に導入することをさらに含み、
    （ｉ）前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３γの前記細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び前記第２の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３γの発現を低減し；
    （ｉｉ）前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３δの前記細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び前記第２の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３δの発現を低減し；又は
    （ｉｉｉ）前記第２のキメラ膜タンパク質は、ＣＤ３εの前記細胞外ドメインに由来する第２の細胞外ドメインを含み、及び前記第２の阻害剤は、前記細胞中の内在性ＣＤ３εの発現を低減し、任意選択により、
    前記第２の阻害剤は、前記細胞中の前記第２のキメラ膜タンパク質の発現を低減しないか又は実質的に低減しない（例えば、前記第２の阻害剤は、前記第２の阻害剤の非存在下での前記第２のキメラ膜タンパク質の発現と比較して２、５、１０、１５又は２０％以下のレベルで前記第２のキメラ膜タンパク質の発現を低減する）、請求項６６又は６７に記載の方法。
  69. 前記第１又は第２の阻害剤は、ＲＮＡ干渉を媒介する薬剤、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡをコードする核酸分子である、請求項６７又は６８に記載の方法。
  70. 前記第１又は第２の阻害剤は、遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系若しくはメガヌクレアーゼ系）又は前記遺伝子編集系の１つ以上の成分をコードする核酸分子である、請求項６７又は６８に記載の方法。
  71. 前記細胞は、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞である、請求項６６～７０のいずれか一項に記載の方法。
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