JP2023052471A - 糖タンパク質を作製するための細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本出願は、所望量の成分、例えば、オルニチンまたはプトレシンについてダイズ加水分解産物のバッチをスクリーニングし、所望量のそのような成分を有する、ダイズ加水分解産物のバッチのみを選択するための方法を提供する。【解決手段】本開示は、ダイズの選択されたバッチが補充された培地中で細胞を培養して、目的のタンパク質のより一貫した、高品質のロットを生成するための方法も説明する。さらに、本開示は、所望量のオルニチンまたはプトレシンを含むダイズ加水分解産物の別々のバッチが補充された培地中で細胞を培養することによって生成され、それによって、生成されたタンパク質の各バッチが、目的のタンパク質の品質または生成される高品質のタンパク質の量の向上を示す、複数のタンパク質調製物を提供する。【選択図】図６Ａ

Description

配列表の組み込み
２０１８年２月１日に作成され、１１．２ＫＢのサイズの、「ＲＥＧＥ００９Ｐ０２ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名前の提出されたテキストの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、細胞を培養するための方法及び組換えタンパク質を生成するための方法に関する。本発明は、特に、高品質の組換えタンパク質の一貫した生成を達成するためにダイズ加水分解産物含有培地において細胞を培養するための方法に関する。

タンパク質加水分解産物、例えばダイズ加水分解産物を含有する細胞培養培地は、培養細胞からの組換えタンパク質の生成において一般に使用される。しかし、タンパク質加水分解産物は、細胞増殖または組換えタンパク質生成に悪影響を及ぼす化合物を含む可能性がある。これらの欠点にもかかわらず、タンパク質加水分解産物は、細胞培養の補充物として広く使用されている。

ヒトの生物的治療剤（バイオ医薬品）は、一般に、哺乳類細胞培養で生成される。しかし、生物的治療剤の品質及性能は、製造方法に非常に依存する。Ｔｅｂｂｅｙ，Ｐ．ａｎｄ Ｄｅｃｌｅｒｃｋ，Ｐ．Ｇｅｎｅｒｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒｓ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１６）５：２，ｐｐ．７０－７３は、一貫したグリコシル化を有する生物学的薬物の製造のために、本明細書に組みこまれる。糖タンパク質の製造のための細胞培養方法に対する変更は、グリコシル化パターン、酸性種（例えば、シアル酸）の存在またはタンパク質上のグリカンの量を変動させる可能性がある（同上）。そのような変動は、生じるタンパク質生成においてタンパク質アイソフォームの不均一性を増大させ、これは、生物的治療剤の安定性、有効性または免疫原性を変化させ、最終的に、タンパク質のロットが拒否される可能性がある。

したがって、薬物製品の収量及び組成のロット間変動性を排除する細胞培養方法が非常に望ましい。本開示は、バッチ間で変動し、ダイズ加水分解産物を使用する培養において生成される高品質な糖タンパク質の組成及び収量を変化させる可能性がある、植物タンパク質加水分解産物（例えば、ダイズ加水分解産物）中のある種の成分を特定した。本開示は、数ある中でも、植物タンパク質加水分解産物のバッチをスクリーニングし、バイオ医薬品の生成で使用するための、植物タンパク質加水分解産物の望ましい濃度の成分を含むそうしたバッチを選択することによって、向上した細胞培養方法の必要性に対処する。

本開示は、ダイズ加水分解産物のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの濃度が、ダイズ加水分解産物を使用する細胞培養において生成されるタンパク質の品質及び組成に影響を及ぼすという発見に部分的に基づいている。本開示は、ある種の濃度のオルニチンまたはプトレシンを含むダイズ加水分解産物を含む培地中で培養された細胞が、ロット間でより一貫したグリコシル化パターン、グリカンの量及びシアル酸プロファイルを示す、より多くの量の高品質タンパク質を生成することも提供する。

一態様では、本発明は、組換え異種糖タンパク質を生成するために、ダイズ加水分解産物を含む細胞培養培地中で組換え異種糖タンパク質を発現する細胞の集団を培養する方法であって、ダイズ加水分解産物が、≦０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含む方法に関する。

いくつかの実施形態では、方法は、ダイズ１グラム（ｇ）あたり≦０．６７ミリグラム（ｍｇ）未満のオルニチン（ｗ／ｗ）、または約０．００３％～０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンを含むダイズ加水分解産物を含む細胞培養培地中で組換え異種糖タンパク質を発現する細胞の集団を培養するステップを含む。一実施形態では、培養培地は、≦５ｍｇ／Ｌのオルニチン、または約０．６～３ｍｇ／Ｌのオルニチンを含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、組換え異種糖タンパク質を発現する細胞のクローン性増殖によって得られる。

一態様では、本発明は、糖タンパク質を生成するための方法に関する。一実施形態では、方法は、ダイズ１グラム（ｇ）あたり≦０．６７ミリグラム（ｍｇ）未満のプトレシン（ｗ／ｗ）、または約０．００３％～０．０６７％（ｗ／ｗ）のプトレシンを含むダイズ加水分解産物を含む培養培地中で組換え異種糖タンパク質を発現する細胞の集団を培養するステップを含む。一実施形態では、培養培地は、≦５ｍｇ／Ｌのプトレシンまたは約０．６～３ｍｇ／Ｌのプトレシンを含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、組換え異種糖タンパク質を発現する細胞のクローン性増殖によって得られる。

一実施形態では、糖タンパク質は、トラップ分子、例えば、リロナセプト（例えば、米国特許第６，９２７，００４号に開示される、ＩＬ１－トラップ）、アフリベルセプト（例えば、米国特許第７，０８７，４１１号に開示されるＶＥＧＦ－トラップ）、コンバセプト（ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）（例えば、米国特許第７，７５０，１３８号及び第８，２１６，５７５号に開示される、ＶＥＧＦ－トラップ）ならびにエタネルセプト（例えば、米国特許第５，６１０，２７９号に開示される、ＴＮＦ－トラップ）である。一実施形態では、糖タンパク質の全Ｎ－グリカン種の総量の≧１０％（ｗ／ｗ）は、Ａ１ Ｎ－グリカンである。

一態様では、本発明は、糖タンパク質を生成する方法に関する。別の態様では、本発明は、糖タンパク質の生成においてダイズ加水分解産物を使用する方法に関する。別の態様では、本発明は、生成された糖タンパク質の品質を評価することによって、糖タンパク質を生成するのに使用するためのダイズ加水分解産物を選択する方法に関する。一実施形態では、方法は、グリコシル化タンパク質を発現する細胞を細胞培養培地中で培養して糖タンパク質を生成すること、グリコシル化タンパク質を精製すること、精製したグリコシル化タンパク質をオリゴ糖フィンガープリント解析にかけること、糖タンパク質のＮ－グリカン種の総量と比較して、Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量を決定すること、及び糖タンパク質のＮ－グリカン種の総量と比較して、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）のＡ１ Ｎ－グリカンを提供するダイズ加水分解産物を選択することを含む。

一実施形態では、方法は、ダイズ加水分解産物を含有する細胞培養培地を調製するステップ、細胞培養培地中で糖タンパク質を発現する細胞を培養するステップ、グリコシル化タンパク質を精製するステップ、精製したグリコシル化タンパク質をオリゴ糖フィンガープリント解析にかけるステップ、糖タンパク質のＮ－グリカン種の総量と比較して、Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量を決定するステップ、及び、次いで、糖タンパク質のＮ－グリカン種の総量と比較して、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）のＡ１ Ｎ－グリカンを有する糖タンパク質の生成をもたらすダイズ加水分解産物を選択するステップを含む。

一実施形態では、選択されたダイズ加水分解産物は、ダイズ１ｇあたり≦０．６７ｍｇのオルニチン（ｗ／ｗ）または約０．００３％～０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンを含む。一実施形態では、培養培地は、≦５ｍｇ／Ｌのオルニチンまたは約０．６～３ｍｇ／Ｌのオルニチンを含む。

一実施形態では、選択されたダイズ加水分解産物は、ダイズ１ｇあたり≦０．６７ｍｇのプトレシン（ｗ／ｗ）または約０．００３％～０．０６７％（ｗ／ｗ）のプトレシンを含む。一実施形態では、培養培地は、≦５ｍｇ／Ｌのプトレシンまたは約０．６～３ｍｇ／Ｌのプトレシンを含む。

一態様では、本発明は、ダイズ加水分解産物中のオルニチンまたはプトレシンの量を測定することによって、糖タンパク質を生成するのに使用するためのダイズ加水分解産物を選択する方法に関する。一実施形態では、方法は、ダイズ加水分解産物中のオルニチンの量を測定するステップ、ダイズ１ｇあたり≦０．６７ｍｇのオルニチンまたは約０．００３％～０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンを有するダイズ加水分解産物を選択するステップ、及び選択されたダイズ加水分解産物をさらなる成分と組み合わせて、≦５ｍｇ／Ｌのオルニチンまたは約０．６～３ｍｇ／Ｌのオルニチンを有する細胞培養培地を形成するステップを含む。一実施形態では、方法は、有用な可能性があるダイズ加水分解産物中のプトレシンの量を測定するステップ、ダイズ１ｇあたり≦０．６７ｍｇのプトレシンまたは約０．００３％～０．０６７％（ｗ／ｗ）のプトレシンを有するダイズ加水分解産物を選択するステップ、及び選択されたダイズ加水分解産物をさらなる成分と組み合わせて、≦５ｍｇ／Ｌのプトレシンまたは約０．６～３ｍｇ／Ｌのプトレシンを有する細胞培養培地を形成するステップを含む。

一態様では、本発明は、Ａ１ Ｎ－グリカン及び少なくとも１つの他のＮ－グリカン種を含み、Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量が糖タンパク質のＮ－グリカンの総量の少なくとも１０％（ｗ／ｗ）である、糖タンパク質に関する。一実施形態では、Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量は約１０％～１７％（ｗ／ｗ）である。

一実施形態では、糖タンパク質は、Ａ２ Ｎ－グリカン、Ａ２Ｆ Ｎ－グリカン、Ａ１Ｆ Ｎ－グリカン、ＮＧＡ２Ｆ Ｎ－グリカン、ＮＡ２Ｇ１Ｆ Ｎ－グリカン、ＮＡ２ Ｎ－グリカン及びＮＡ２Ｆ Ｎ－グリカンも有する。

一実施形態では、糖タンパク質は、糖タンパク質１モルあたり８～６５モルのシアル酸を含む。糖タンパク質がリロナセプトである一実施形態では、配列番号１のアスパラギン残基Ｎ３７、Ｎ９８、Ｎ４１８及びＮ５１１のうちのいずれか１つは、Ａ１ Ｎ－グリカンを含む。糖タンパク質がアフリベルセプトである一実施形態では、配列番号２のアスパラギン残基Ｎ１２３及びＮ１９６のうちのいずれか１つは、Ａ１ Ｎ－グリカンを含む。

一実施形態では、糖タンパク質のＡ１ Ｎ－グリカンの相対量は、キャピラリー電気泳動によって得られる糖タンパク質のオリゴ糖フィンガープリントから得られるＡ１ Ｎ－グリカンのピーク下の面積を全Ｎ－グリカンに対するピーク下の全面積と比較することによって、決定される。

一態様では、オルニチンまたはプトレシンの量が低減したダイズ加水分解産物を製造する方法が提供される。一実施形態では、方法は、残基を含まない反応器中でダイズ抽出物を酵素消化するステップ、ダイズ加水分解産物中のオルニチンの量を測定するステップ、及び細胞培養培地で使用するための、≦０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含むダイズ加水分解産物のロットを選択するステップを含む。一実施形態では、方法は、残基を含まない反応器中でダイズ抽出物を酵素消化するステップ、ダイズ加水分解産物中のプトレシンの量を測定するステップ、及び細胞培養培地で使用するための、≦０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを有するダイズ加水分解産物を選択するステップを含む。

用語「約」は、記載される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％内として理解され得る。文脈から特に明らかでない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、用語「約」で修飾される。

本明細書に記載のものと類似または等価の方法及び材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書で引用される参考文献は、請求される開示に対する先行技術であると認められない。矛盾がある場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。さらに、材料、方法及び実施例は例示に過ぎず、制限を意図したものではない。本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

上記の態様及び実施形態いずれかは、発明の概要及び／または発明を実施するための形態のセクションにおいて本明細書で開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。

本特許または出願ファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要請及び必要な料金の支払いに応じて、当局によって提供されるであろう。

本発明の様々な目的及び利点ならびにより完全な理解は、添付の図面と併せて、以下の発明を実施するための形態及び添付の特許請求の範囲を参照することにより、明らかであり、よりたやすく認識される。

ニンヒドリン由来アミノ酸のクロマトグラフィーの溶出プロファイルを示す図である。Ｘ軸はクロマトグラフィーカラムからの溶出時間（保持時間）を示し、Ｙ軸は５７０ｎｍの吸光度を示す。パネルＡは、ＦＤＡ標準によって許容されるＮ－グリカン混合物の生成に関する基準を満たさないバッチを示す。パネルＢは、ダイズタンパク質加水分解産物の許容されるアミノ酸解析を示す。オルニチンに相当するピークを両方のクロマトグラムにおいて丸で囲む。 ペプチド：Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）消化によって糖タンパク質から遊離したオリゴ糖のキャピラリー電気泳動図を示す。Ｘ軸はキャピラリーからの溶出時間を示し、Ｙ軸は吸光度または蛍光強度を示す。ピークは１～２１の番号が付けられる。ピーク１はＮ－グリカンＡ２を表し、ピーク４はＮ－グリカンＡ２Ｆを表し、ピーク１１はＮ－グリカンＡ１を表し、ピーク１４はＮ－グリカンＡ１Ｆを表し、ピーク１６はＮ－グリカンＮＧＡ２Ｆを表し、ピーク１９はＮ－グリカンＮＡ２Ｇ１Ｆを表し、ピーク２０はＮ－グリカンＮＡ２を表し、ピーク２１はＮ－グリカンＮＡ２Ｆを表す。 ダイズタンパク質加水分解産物におけるオルニチン及びシトルリン濃度の関数として、Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量のドットブロットを示す図である。Ｘ軸は、ｍｇ／Ｌでシトルリンまたはオルニチンの濃度を示す。Ｙ軸は、Ａ１ Ｎ－グリカンに相当するピーク１１の相対面積を示す。 ダイズ加水分解産物中のオルニチン濃度（右下四分円）とアフリベルセプトにおけるピーク１１の相対量（Ａ１ Ｎ－グリカン、左上四分円）との負の相関を示す相関プロットである。 （ｉ）ダイズ加水分解産物中のオルニチン濃度（左下四分円）とリロナセプトの最終力価（右上四分円）との負の相関、及び（ｉｉ）ダイズ加水分解産物中のオルニチン濃度（左下四分円）と培地中のラクテートの蓄積（左下四分円）との正の相関を示す相関プロットである。 ＣＨＯ細胞培養から合成されたポリアミンの量を示す１組のグラフである。これは、対照、高及び低オルニチン濃度、プトレシン、ＭＦＣ及びＩＰＣを含めた様々な条件下のバッチ日の関数として、ＩＶＣＤ×１０^６細胞－日／ｍｌとしてまたは力価（グラム／ｍｌ）のいずれかとして示される。 図６Ａに示される各研究群の実験条件を示す表である。

記載される特定の方法及び実験条件は変動し得るので、本開示の範囲がそのような方法及び条件に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される術語は特定の実施形態のみを説明することを目的とし、限定することを意図したものではないことも理解されたい。

別段規定されない限り、本出願で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本出願に記載されているものと同様または均等の任意の方法及び材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、ある種の特定の方法及び材料をこれから記載する。単位、接頭辞及び記号は、それらの標準的な、業界に認められる形で表示され得る。明細書に記載される数値範囲は、オープンブラケットであり、範囲を規定する数を含むこと意味する。特記しない限り、用語「ａ」または「ａｎ」は、「の少なくとも１つ」を意味すると解釈されるべきである。

本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためだけであり、記載される主題を制限するものとして解釈されるべきでない。本明細書に記載の方法及び技法は、一般に、当技術分野で既知の従来の方法に従って、及び本明細書全体を通して引用され議論される様々な一般的参考文献及びより特定の参考文献に記載されているように、実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）、及びＪｕｌｉｏ Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）、及びＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９５）を参照されたい。本開示全体にわたって言及されるすべての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

定義
別段規定されない限り、本出願で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

フレーズ「相対量」は、一般的なタイプのすべての分子種の総量に対するある分子種の量を意味する。例えば、Ａ１グリカン（すなわち、（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｇａｌ）２（ＳＡ）１）の相対量は、Ａ１の量／すべてのＮグリカンの量の合計として計算される。相対量は、絶対質量対質量量（すなわち、グラムあたりのグラム）またはパーセンテージ、すなわち、％（ｗ／ｗ）として表され得る。

「オルニチン」は、尿素回路、ポリアミン合成及びアルギニン代謝に関与する、タンパク質をコードしないアミノ酸である。オルニチンは、組換えタンパク質のグリコフォーム含量に影響することも知られている。ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９３７８を参照されたい。オルニチンは、いくつかの酵素の作用を受ける。例えば、オルニチンデカルボキシラーゼは、ポリアミン生合成経路においてオルニチンからプトレシンへの変換を触媒する。Ｐｅｇｇ Ａ，Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００６）２８１：２１ｐｐ．１４５３２を参照されたい。さらに、シトルリンへのオルニチンの変換は、尿素回路の一部として、オルニチントランスカルバミラーゼによって触媒される。オルニチンの代謝は、培養中の細胞のサイトゾルとミトコンドリアの両方で起こる。プトレシンの存在またはオルニチンの存在は、合成培地で培養される細胞の増殖及び生産性に重要であると考えられているが、そのような細胞によって生成されるタンパク質の重要な品質属性に対する影響は、説明されていない。

「プトレシン」は、尿素回路に関与する、タンパク質をコードしないアミノ酸、ポリアミンである。プトレシン（Ｃ_４Ｈ_１２Ｎ_２の化学式を有する、１，４－ジアミノブタンとしても知られる）はオルニチンの脱炭酸によって生成され、ガンマ－アミノ酪酸（γ－アミノ酪酸）に対する前駆物質として働く。

本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は全体にわたって互換的に使用され、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、修飾、例えば、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰリボシル化を含むこともできる。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、タンパク質ベースの薬物（生物治療剤）を含めた科学的または商業的に興味のあるものでもよい。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質としては、数ある中でも、抗体及びキメラタンパク質または融合タンパク質が挙げられる。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、細胞培養方法を使用して、哺乳動物細胞株などの組換え動物細胞株によって、生成することができる。

本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド配列」または「ペプチド配列」は、バイオ医薬品の原体として生成される目的のタンパク質、例えば、キメラタンパク質（トラップ分子など）、抗体または抗体の一部（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸ポリマーを指す。ポリヌクレオチド配列は、遺伝子工学技法によって製造することができ（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロンのない配列）、細胞中に導入することができ、ここで、これは、エピソームとして存在することができ、または細胞のゲノム中に組み込まれ得る。ポリヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノム内の異所に導入される天然に存在する配列でもよい。ペプチド配列は、異種性、例えば、別の生物由来の天然に存在する配列、組換え配列、遺伝子改変配列、または特に、野生型と異なるプロモーターの制御下で発現する配列、例えば、ヒトオルソログをコードするヌクレオチド配列（宿主（生成）細胞はＣＨＯ細胞である）でもよい。

フレーズ「抗原結合タンパク質」は、少なくとも１つのＣＤＲを有し、抗原を選択的に認識することができる、すなわち、少なくともマイクロモル範囲のＫＤで抗原に結合することができるタンパク質を含む。治療用抗原結合タンパク質（例えば、治療用抗体）は、ナノモルまたはピコモル範囲のＫＤを必要とすることが多い。典型的には、抗原結合タンパク質は、２つ以上のＣＤＲ、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲを含む。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体の抗原結合性断片、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を含むポリペプチド（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、ならびに抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を含み、重鎖及び／または軽鎖の定常領域由来の付加的なアミノ酸（例えば、１つまたは複数の定常ドメイン、すなわち、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの１つまたは複数）を含むタンパク質が挙げられる。

「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続した、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）及び重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在している。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に次の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。用語「抗体」は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化免疫グロブリンと非グリコシル化免疫グロブリンの両方を含む。用語「抗体」は、組換え手段によって、調製された、発現された、作出された、または単離された抗体分子、例えば、抗体を発現させるためにヌクレオチド配列がトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含む。用語「抗体」は、１つを超えるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む二重特異性抗体も含む。二重特異性抗体は、一般に、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

抗体（もしくは抗体断片）または目的のタンパク質の「抗原結合部分」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体または目的のタンパク質の１種または複数の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるタンパク質結合断片の非限定例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）２４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、ならびに（ｖｉｉ）ＶＬ及びＶＨ領域が対形成して一価の分子を形成する単一タンパク質鎖を形成するように合成リンカーによって結合したＦｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨからなる、ｓｃＦｖが挙げられる。単鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディも用語「抗体」の下に包含される。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９９３）９０：６４４４－６４４８、Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （１９９４）２：１１２１－１１２３を参照されたい。

さらにまた、抗体またはその抗原結合部分は、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの抗体または抗体の一部の共有結合性または非共有結合性の会合によって形成されるより大きな免疫接着分子の一部でもよい。そのような免疫接着分子の非限定例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９５）６：９３－１０１）ならびに二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を製造するためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）３１：１０４７－１０５８）が含まれる。抗体の一部、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、従来の技法を使用して、例えば、全抗体のパパインまたはペプシン消化によって、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体の一部及び免疫接着分子は、一般に当技術分野で既知の標準的な組換えＤＮＡ法を使用して得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。

用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムなまたは部位特異的な変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって、導入された変異）を、例えばＣＤＲ中に、特にＣＤＲ３中に含むことができる。本明細書で使用する場合、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製された、発現された、作出された、または単離されたすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換え体から単離された抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９２）２０：６２８７－６２９５を参照されたい）、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製された、発現された、作出された、もしくは単離された抗体を含むことが意図される。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。しかし、ある種の実施形態では、そのような組換えヒト抗体はインビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物が使用される場合は、インビトロ体細胞変異誘発）にかけられ、それにより、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、それと関係しているが、インビボで、ヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない可能性がある配列である。

「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質の一部またはすべてを含み、それらのうちの１つは免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、それらは、そうでなければ、天然に一緒に見られない。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合したある種の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９９１）８８：１０５３５、Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４４：６７７、及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９２）Ｓｕｐｐｌ．４，ｐｐ．１０．１９．１－１０．１９．１１によって記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、いくつかの実施形態では、ヒンジ領域、続いて、免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ部分に結合した受容体の１つまたは複数の細胞外ドメイン（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ－融合タンパク質は、１種または複数のリガンド（複数可）に結合する２つ以上の異なる受容体鎖を含む。

ある種の実施形態では、「Ｆｃ－融合タンパク質」は「トラップ」分子であり、これは、対応する内在性受容体の結合ドメインを模倣する２つの異なる受容体成分及び抗体のＦｃ部分を含むデコイ受容体分子である。トラップ分子の非限定例としては、ＩＬ－１トラップ（例えば、リロナセプト。これは、ＩＬ－１Ｒ１細胞外領域（次にこれがｈＩｇＧ１のＦｃに融合する）に融合したＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域）（例えば、配列番号１）を含む（米国特許第６，９２７，００４号を参照されたい）、またはＶＥＧＦトラップ（例えば、アフリベルセプト。これは、ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３（次にこれがｈＩｇＧ１のＦｃと融合する）に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含む。例えば、米国特許第７，０８７，４１１号、第７，２７９，１５９号を参照されたい。エタネルセプト（ＴＮＦトラップ）について米国特許第５，６１０，２７９も参照されたい）が挙げられる。

「「グリコシル化」は、オリゴ糖がタンパク質のアスパラギン（Ａｓｎ）残基（すなわち、Ｎ結合型）またはセリン（Ｓｅｒ）もしくはスレオニン（Ｔｈｒ）残基（すなわち、Ｏ結合型）の側鎖のいずれかに結合している糖タンパク質の形成を含む。「糖タンパク質」は、Ｏ結合型グリカンまたはＮ結合型グリカンを含む任意のタンパク質を含む。グリカンは、直鎖状でも分枝状でもよい、単糖残基のホモまたはヘテロポリマーでもよい。Ｎ結合型グリコシル化は、主として小胞体で開始することが知られているが、Ｏ結合型グリコシル化は、ＥＲまたはゴルジ装置のいずれかで開始することが示されている。用語「Ｎ－グリカン」は「Ｎ結合型オリゴ糖」と互換的に使用される。用語「Ｏ－グリカン」は「Ｏ結合型オリゴ糖」と互換的に使用される。

「Ｎ－グリカンタンパク質」は、Ｎ結合型オリゴ糖を含むか、受容することができるタンパク質を含む。Ｎ－グリカンは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、ノイラミン酸（ＮＡＮＡ）及び他の単糖類から構成され得るが、Ｎ－グリカンは、３つのマンノース及び２つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）糖を含む、共通のコア五糖構造を通常有する。連続したアミノ酸配列、Ａｓｎ－Ｘ－ＳｅｒまたはＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ（Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸である）を有するタンパク質は、Ｎ－グリカンに対する結合部位を提供し得る。

Ｎ－グリカンは、表１に列挙されるＮ結合型オリゴ糖を含む。列挙されるオリゴ糖の略称は、オリゴ糖を述べるための簡易化した名称として本明細書で使用される。したがって、例えば、Ａ１ Ｎ－グリカンは、（ＳＡ）（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）３からなるオリゴ糖に連結したアルギニンを含む。

スクリーニング
「加水分解産物」は、植物材料、動物材料、乳清、酵母などの加水分解に由来する複合材料である。用語「加水分解産物」は、「タンパク質加水分解産物」と互換的に使用される。「植物加水分解産物」（植物タンパク質加水分解産物）は、加水分解された植物材料、例えば、コメ粉、コムギ粉、トウモロコシ粉、ダイズ粉などである。タンパク質加水分解産物は、３つの一般的方法、すなわち、酸加水分解、アルカリ加水分解及び酵素的加水分解によって、製造することができる。生物治療剤の製造を含めた生物学的用途のために、タンパク質加水分解産物は、酵素的加水分解によってたいてい作製される。例えば、ペプシン消化によって作製されるダイズ加水分解産物は「ダイズペプトン」と呼ぶことができ、またはトリプシン消化によって作製される酵母加水分解産物は「酵母トリプトン」と呼ぶことができる。Ｆｒａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６（５）：６８８－９２（２０００）は、植物タンパク質加水分解産物及びその製造方法について、本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、対象の加水分解産物は植物加水分解産物である。具体的な実施形態では、対象のタンパク質加水分解産物はダイズ加水分解産物である。「ダイズ加水分解産物」は、ダイズ粗粒に由来する酵素的に消化されたダイズ生成物であり、ほとんど化学的に未決定である。一般に、ダイズ加水分解産物は、アミノ酸、タンパク質、炭水化物、ミネラル及びビタミンの集合体から構成される。ダイズ加水分解産物は、例えば、高濃度溶液（例えば、ＨｙＣｌｏｎｅ^（商標）ＨｙＱダイズ加水分解産物溶液）または粉末（例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）Ｓ１６７４（Ａｍｉｓｏｙ^（商標））、ダイズタンパク質加水分解産物）の形態で市販されている、植物由来のタンパク質加水分解産物である。ダイズ加水分解産物の「バッチ」または「ロット」は、本明細書で使用する場合、ダイズ粗粒の加水分解によって生じる、製造量のダイズ加水分解産物を指す。例えば、各加水分解方法は、様々な濃度の成分、例えば、ビタミン、アミノ酸、ペプチド及び糖を有する、ダイズ加水分解産物のユニークな「バッチ」または「ロット」をもたらすことができる。ダイズ加水分解産物は、市販の生物治療剤、例えば抗体の生成の間の哺乳動物細胞株の増殖のために、動物タンパク質を含まない細胞培養培地とともに一般に使用される。より具体的には、ダイズ加水分解産物は、細胞の接種より前かその間に、細胞培養培地に加えられる。次いで、細胞は、回収されるまで、加水分解産物含有培地中で培養される。ダイズ加水分解産物の未決定の性質のために、ダイズ加水分解産物のバッチはバッチ間（またはロット間）で変動し、これが、生物治療剤の商業的製造においてばらつきをもたらす可能性がある。

本開示は、ダイズ加水分解産物のバッチ中のある種の成分の濃度が、ダイズ加水分解産物を使用する細胞培養において生成されるタンパク質の品質及び組成に影響を及ぼすことを確認した。本開示は、望ましい量の成分、例えば、オルニチン、プトレシン、シトルリン、アルギニンまたはこれらの組み合わせなどを含む、ある種のダイズ加水分解産物のバッチを選択するために、ダイズ加水分解産物のバッチをスクリーニングするための方法を提供する。

ある種の実施形態では、スクリーニング方法は、ダイズ加水分解産物のバッチの少なくとも一部（すなわち、試料）において、オルニチンまたはプトレシンの量を測定することを含む。具体的な実施形態では、ダイズ加水分解産物試料は秤量され、その一部が所望の濃度まで溶解される。いくつかの実施形態では、次いで、ダイズ加水分解産物溶液は、第２の所望の濃度（例えば、１ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌ）まで溶媒中に希釈され、次いで、得られたダイズ加水分解産物溶液の組成が決定される。

いくつかの実施形態では、測定ステップは、例えば、ポストカラムニンヒドリン反応後に実施される比色検出、または溶出されるニンヒドリン陽性化合物のためのクロマトグラフィー、例えば、ＨＰＬＣまたはＵＰＬＣを含めた、ダイズ加水分解産物試料の分子組成を決定するための適切な方法を用い、各成分（例えば、オルニチンまたはプトレシン）の測定量を表すために使用される単位は、任意の適切な単位（例えば、マイクロモル／Ｌ、ｍｇ／Ｌまたはｇ／Ｌ）でもよい。いくつかの実施形態では、オルニチンまたはプトレシンの量の測定は、試料中のオルニチンの濃度の測定、またはダイズ加水分解産物試料中のオルニチンの総量の測定を含む。しかし、オルニチンまたはプトレシンの量は測定され、測定量を表すために、いかなる単位も使用され、ダイズ加水分解産物の選択されたバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの濃度は、ダイズ１ｇあたり０．６７ｍｇ以下のオルニチンまたはプトレシンである。

一実施形態では、ダイズ加水分解産物のバッチの試料が得られ、試料のオルニチンまたはプトレシンの含量が、ポストカラムニンヒドリン検出を用いて、イオン交換カラムによるアミノ酸のクロマトグラフィーによって測定される。より具体的には、具体的な実施形態において、スクリーニング方法は、ダイズ加水分解産物試料の酸加水分解及び試料緩衝液における再構成を含む。次いで、加水分解された試料は、例えば、スルホン化ポリスチレン樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０）のカラムによる高速陽イオン交換分離にかけられ、続いて、試料中の個々のアミノ酸の高感度な検出を可能にするポストカラム誘導体化が行われる。例えば、Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５４）Ｖｏｌ．２１１ ｐｐ．９０７－９１３、Ｎｅｍｋｏｖ ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ２０１５ Ｎｏｖ；４７（１１）：２３４５－２３５７、Ｗａｈｌ ａｎｄ Ｈｏｌｚｇｒａｂｅ，“Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａｌ ｐｕｒｐｏｓｅｓ，”Ｔａｌａｎｔａ １５４：１５０－１６３，１ Ｊｕｌｙ ２０１６を参照されたい。ニンヒドリン試薬によるポストカラム発色に続いて、吸光度がニンヒドリンの紫の範囲、例えば５７０ｎｍで測定される。データ取得は、アミノ酸あたりマイクロモル／Ｌ、アミノ酸あたりｍｇ／Ｌまたはアミノ酸あたりｇ／Ｌを示す定量的なクロマトグラム提供するためのクロマトグラフィーソフトウェア（例えば、Ｈｉｔａｃｈｉ用ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅバージョン３．１．５ｂクロマトグラフィーソフトウェア）を使用して達成される。

試料組成物中のアミノ酸を特定及び測定するための他の方法は、本開示の方法、例えば、液体クロマトグラフィー及びマススペクトロスコピーを使用する、プレカラム誘導体化クロマトグラフィーまたは逆相液体クロマトグラフィー方法に従って使用することができることを当業者は認識するであろう。

ある種の実施形態では、ダイズ加水分解産物試料をスクリーニングするために、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリーが使用される。例えば、ダイズ加水分解産物のバッチの試料を本明細書に記載されるように得ることができ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００またはＡｇｉｌｅｎｔ １２００ＳＬによるクロマトグラフィーのランまたは一連のクロマトグラフィーのランにかけることができる。マススペクトロメトリー解析は、測定されるダイズ加水分解産物試料の組成を説明する高分解能の定量的データを提供するために、行うことができる。

いくつかの実施形態では、本開示は、所望量の成分、例えば、オルニチン、プトレシン及び／またはシトルリンについてダイズ加水分解産物のバッチをスクリーニングすること、ならびに所望量のそのような成分を有するダイズ加水分解産物のバッチを選択することを含む方法を提供する。例えば、ダイズ加水分解産物の粉末のバッチの一部を含む試料を上記のようにスクリーニングすることができ、試料のランと同じ条件下で作成されたアミノ酸標準プロファイルと比較することができる。図１Ａ～１Ｂに示すように、得られたクロマトグラム（複数可）は、ダイズ加水分解産物試料中に存在する各アミノ酸成分の濃度（例えば、アミノ酸あたりマイクロモル／Ｌ、アミノ酸あたりｍｇ／Ｌまたはアミノ酸あたりｇ／Ｌ）を提供するであろう。クロマトグラムの解析によって、所望の濃度の成分、例えば、オルニチン、プトレシン及び／またはシトルリンを含むダイズ加水分解産物のバッチ（すなわち、試料）の特定が容易になる。次いで、本明細書に記載されるように、例えば細胞培養における、さらなる使用のために、所望量の特定の一成分または複数成分を含む各ダイズ加水分解産物のバッチが選択される。図１のパネルＡは、アミノ酸の特定後に不合格にされたバッチを示す。図１のパネルＢは、同一条件下での、許容されるダイズ加水分解産物バッチのランの例を示す。オルニチンに対応するアミノ酸ピークは、両方の図において丸で囲まれる。オルニチンまたはプトレシンの濃度は、検量線を作成し、試料のオルニチンまたはプトレシン濃度を内挿することによって決定することができる。あるいは、オルニチンまたはプトレシンの相対量を、オルニチンまたはプトレシンのピークに対する曲線下面積を決定し、すべてのアミノ酸に対するピーク下の面積の合計でそれを割ること、またはピーク面積を標準と比較することによって、決定することができる。

ある種の実施形態では、選択されたダイズ加水分解産物の成分（例えば、オルニチンまたはプトレシン）の所望の濃度は、５ｍｇ／Ｌ以下である。一実施形態では、選択されたダイズ加水分解産物のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、０．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ～２．０ｍｇ／Ｌの範囲にわたる。他の実施形態では、ダイズ加水分解産物の選択されたバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの濃度は、０．５ｍｇ／Ｌ～４．５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～４．０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～３．５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～３．０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～２．５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～２．０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～１．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ～１．０ｍｇ／Ｌの範囲にわたる。いくつかの実施形態では、ダイズ加水分解産物の選択されたバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの濃度は、１．０ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、４．０ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌまたは４．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌの範囲にわたる。

具体的な実施形態では、ダイズ加水分解産物のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ、０．６ｍｇ／Ｌ、０．７ｍｇ／Ｌ、０．８ｍｇ／Ｌ、０．９ｍｇ／Ｌ、１．１ｍｇ／Ｌ、１．２ｍｇ／Ｌ、１．３ｍｇ／Ｌ、１．４ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、１．６ｍｇ／Ｌ、１．７ｍｇ／Ｌ、１．８ｍｇ／Ｌ、１．９ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ、２．１ｍｇ／Ｌ、２．２ｍｇ／Ｌ、２．３ｍｇ／Ｌ、２．４ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、２．６ｍｇ／Ｌ、２．７ｍｇ／Ｌ、２．８ｍｇ／Ｌ、２．９ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、３．１ｍｇ／Ｌ、３．２ｍｇ／Ｌ、３．３ｍｇ／Ｌ、３．４ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ、３．６ｍｇ／Ｌ、３．７ｍｇ／Ｌ、３．８ｍｇ／Ｌ、３．９ｍｇ／Ｌ、４．０ｍｇ／Ｌ、４．１ｍｇ／Ｌ、４．２ｍｇ／Ｌ、４．３ｍｇ／Ｌ、４．４ｍｇ／Ｌ、４．５ｍｇ／Ｌ、４．６ｍｇ／Ｌ、４．７ｍｇ／Ｌ、４．８ｍｇ／Ｌ、４．９ｍｇ／Ｌであり、または５．０ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシンである。

他の実施形態では、ダイズ加水分解産物のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、ダイズ１ｇあたり０．６７ｍｇ以下のオルニチンである。さらに他の実施形態では、ダイズ加水分解産物のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、ダイズ１ｇあたり０．２７ｍｇ以下のオルニチンである。別の実施形態では、ダイズ加水分解産物のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、ダイズ１ｇあたり０．２４ｍｇ以下のオルニチンまたはプトレシンである。いくつかの実施形態では、ダイズのバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、ダイズ１ｇあたり０．０６７ｍｇ～０．６７ｍｇのオルニチンまたはプトレシンである。さらに他の実施形態では、ダイズ加水分解産物のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、ダイズ１ｇあたり０．０６７ｍｇ～０．２７ｍｇのオルニチンの範囲内に入る。さらに別の実施形態では、ダイズ加水分解産物のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、ダイズ１ｇあたり０．０６７ｍｇ～０．２４ｍｇのオルニチンまたはプトレシンの範囲内に入る。

一実施形態では、選択されたダイズ加水分解産物中におけるオルニチンまたはプトレシンの質量（％ｗ／ｗ）による相対量（ｗ／ｗ＝オルニチンまたはプトレシンの質量／加水分解産物の全質量）は、≦０．０６７％、例えば、０．０００１％、０．０００２％、０．０００３％、０．０００４％、０．０００５％、０．０００６％、０．０００７％、０．０００８％、０．０００９％、０．００１％、０．００１５％、０．００２％、０．００２５％、０．００３％、０．００３５％、０．００４％、０．００４５％、０．００５％、０．００５５％、０．００６％、０．００６１％、０．００６２％、０．００６３％、０．００６４％、０．００６５％、０．００６６％（すべて、ｗ／ｗ）である。

一実施形態では、植物タンパク質加水分解産物は、特定の品質属性を有する糖タンパク質の生成に基づいて選択される。糖タンパク質の品質は、糖タンパク質上の１種または複数の特定のＮ－グリカンのレベルを評価することによって、または糖タンパク質上の１種または複数の特定の糖のレベルまたは複数の属性の組み合わせを評価することによって、決定することができる。例えば、特定のフコースレベル、例えば、糖タンパク質１モルあたり５～１０モルのフコースを有する糖タンパク質は品質属性基準であり得、または特定のシアル酸レベル、例えば、糖タンパク質１モルあたり５～１５モルのシアル酸、もしくは全Ｎ－グリカンの合計あたりのＡ１ Ｎ－グリカンの特定の比、例えば、１０～１７％（ｗ／ｗ）は、必須の品質属性を有すると考えることができる。前記糖タンパク質の生成を可能にする植物タンパク質加水分解産物は、選択可能であると考えられるであろう。

一実施形態では、植物タンパク質加水分解産物は、潜在的な選択される（潜在的に選択可能な）植物タンパク質加水分解産物（例えば、ダイズ加水分解産物）を含む培地中で培養される細胞中で糖タンパク質を生成すること、糖タンパク質を精製すること、糖タンパク質をオリゴ糖フィンガープリンティングにかけること、及びＡ１ Ｎ－グリカンと関係があるピーク下の面積を計算し、その値を全Ｎ－グリカンのピーク下の全面積で割ることによって、Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量を決定すること、及び≧１０％、≧１０．５％、１０～１７％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％または１８％のＡ１ Ｎ－グリカンの相対量を有する糖タンパク質の生成を可能にした植物タンパク質加水分解産物を選択することによって、選択される。

細胞培養
本開示は、上記のダイズ加水分解産物の選択されたバッチを使用して、細胞培養培地中で目的のタンパク質を発現する細胞を培養するための方法を提供する。本開示は、細胞培養培地における、５．０ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはそれ以下を含むダイズ加水分解産物の選択されたバッチの使用が、ロット間の変動性を低減し、タンパク質生成物の品質を向上させることを初めて発見した。本開示は、細胞培養培地における、５．０ｍｇ／Ｌのプトレシンまたはそれ以下を含むダイズ加水分解産物の選択されたバッチの使用が、ロット間の変動性を低減し、タンパク質生成物の品質を向上させることを初めて発見した。

「細胞培養」または「培養」は、多細胞生物または組織の外側での細胞の増殖及び拡大を意味する。哺乳動物細胞の適切な培養条件は当技術分野で既知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照されたい。哺乳動物細胞は、懸濁液で、または固体基材に接着しながら培養することができる。マイクロキャリアの有無を問わず、バッチ、フェドバッチ、連続的、半連続的または灌流モードで操作される、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラボトル、振盪フラスコまたは撹拌槽バイオリアクターが、哺乳類細胞培養に利用可能である。細胞培養培地または高濃度フィード培地を、培養中に、連続的に、または間隔を置いて、培養に加えることができる。例えば、培養は、１日あたり１回、隔日、３日ごとフィードされ得、またはモニターされている特定の培地成分の濃度が所望の範囲から外れた場合にフィードされ得る。

本明細書で使用する場合、用語「細胞培養培地」、「培地」、「細胞培地」、「細胞培養培地」または「培養培地」は、細胞、例えば、動物または哺乳動物の細胞を増殖させるのに使用され、一般に、以下の少なくとも１つまたはそれ以上の成分を提供する、任意の栄養液を指す：エネルギー源（通常、グルコースなどの炭水化物の形態）；すべての必須アミノ酸の１つまたは複数、及び一般に２０種の基本アミノ酸、加えてシステイン；典型的には低濃度で必要とされるビタミン及び／または他の有機化合物；脂質または遊離脂肪酸；ならびに典型的には非常に低濃度で、通常マイクロモル範囲で必要とされる微量元素、例えば、無機化合物または天然に存在する元素。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ダイズまたは他の植物タンパク質加水分解産物をさらなる成分と組み合わせることによって形成される。

本明細書で使用する場合、「さらなる成分」は、限定されないが、水、エネルギー源、すべての必須アミノ酸の１つまたは複数、及び一般に２０種の基本アミノ酸、加えてシステイン；典型的には低濃度で必要とされるビタミン及び／または他の有機化合物、脂質または遊離脂肪酸ならびに微量元素を含めた細胞培養培地成分のいずれか１つまたは複数を含む。

具体的な実施形態では、細胞培養培地は、ある量の、ダイズ加水分解産物の選択されたバッチが補充される。ある種の実施形態では、細胞培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌの選択されたダイズ加水分解産物が補充される。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、９．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１０．５ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１１．５ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１２．５ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１３．５ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１４．５ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１５．５ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１６．５ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ、１７．５ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、１８．５ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、１９．５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２０．５ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、２１．５ｇ／Ｌ、２２ｇ／Ｌ、２２．５ｇ／Ｌ、２３ｇ／Ｌ、２３．５ｇ／Ｌ、２４ｇ／Ｌ、２４．５ｇ／Ｌまたは約２５ｇ／Ｌのダイズ加水分解産物の選択されたバッチが補充される。

一実施形態では、植物タンパク質加水分解産物を加えた後の細胞培養培地中のオルニチンまたはプトレシンの濃度は、≦５ｍｇ／Ｌ、０．６～３ｍｇ／Ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．０２ｍｇ／Ｌ、０．０３ｍｇ／Ｌ、０．０４ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌ、０．０６ｍｇ／Ｌ、０．０７ｍｇ／Ｌ、０．０８ｍｇ／Ｌ、０．０９ｍｇ／Ｌ、０．０１０ｍｇ／Ｌ、０．０１５ｍｇ／Ｌ、０．０２ｍｇ／Ｌ、０．０２５ｍｇ／Ｌ、０．０３ｍｇ／Ｌ、０．０３５ｍｇ／Ｌ、０．０４ｍｇ／Ｌ、０．０４５ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌ、０．０５５ｍｇ／Ｌ、０．０６ｍｇ／Ｌ、０．０６５ｍｇ／Ｌ、０．０７ｍｇ／Ｌ、０．０７５ｍｇ／Ｌ、０．０８ｍｇ／Ｌ、０．０８５ｍｇ／Ｌ、０．０９ｍｇ／Ｌ、０．０９５ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、０．１５ｍｇ／Ｌ、０．２ｍｇ／Ｌ、０．２５ｍｇ／Ｌ、０．３ｍｇ／Ｌ、０．３５ｍｇ／Ｌ、０．４ｍｇ／Ｌ、０．４５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、０．５５ｍｇ／Ｌ、０．６ｍｇ／Ｌ、０．６５ｍｇ／Ｌ、０．７ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、０．８ｍｇ／Ｌ、０．８５ｍｇ／Ｌ、０．９ｍｇ／Ｌ、０．９５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、４．５ｍｇ／Ｌまたは５ｍｇ／Ｌである。

一実施形態では、培養される細胞は、生物治療用タンパク質を生成することができる細胞株の細胞である。タンパク質生物治療剤を生成するのに使用される細胞株の非限定例としては、特に、初代細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞及びニワトリ胚細胞が挙げられる。一実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ細胞株または大規模タンパク質生成のために最適化されたいくつかの特定のＣＨＯ細胞変異体の１つもしくは複数、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１もしくはＣＨＯ－Ｋ１由来のＥＥＳＹＲ（登録商標）（増強された発現及び安定性領域（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎｓ））細胞（米国特許第７，７７１，９９７号）である。

一実施形態では、培養され、異種糖タンパク質を発現する細胞は、糖タンパク質または糖タンパク質のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを持ち、これを発現する細胞（すなわち、前駆細胞）のクローン性増殖によって得られた細胞の集団であり、この場合、糖タンパク質は抗体のような複合マルチサブユニットタンパク質である。いくつかの実施形態では、クローン性増殖によって前駆細胞から得られるか前駆細胞に由来する細胞の集団の構成細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または約１００％は、糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、糖タンパク質を発現する。

哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞は、小規模の細胞培養容器中で、例えば、約２５ｍｌの培地を有する１２５ｍｌ容器、約５０～１００ｍｌの培地を有する２５０ｍｌ容器、約１００～２００ｍｌの培地を有する５００ｍｌ容器中で培養することができる。あるいは、培養は、例えば約３００～１０００ｍｌの培地を有する１０００ｍｌ容器、約５００ｍｌ～３０００ｍｌの培地を有する３０００ｍｌ容器、約２０００ｍｌ～８０００ｍｌの培地を有する８０００ｍｌ容器及び約４０００ｍｌ～１５０００ｍｌの培地を有する１５０００ｍｌ容器のような大規模でもよい。製造のための培養（すなわち、生成細胞培養）は、１０，０００Ｌの培地またはそれ以上を含むことができる。タンパク質治療剤の臨床上の製造などのための大規模細胞培養または「生成細胞培養」は、細胞が所望のタンパク質（複数可）を生成する間、典型的には、数日またはさらに数週にわたって維持される。この期間の間、培養に、培養の過程で消費される成分、例えば、栄養素及びアミノ酸を含む高濃度フィード培地を補充することができる。

ある種の実施形態では、高濃度フィード培地が使用される。高濃度フィード培地は、任意の細胞培養培地配合物に基づき得る。そのような高濃度フィード培地は、本明細書に記載の細胞培養培地の成分の多くを、例えば、それらの通常の有用な量の約５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１２×、１４×、１６×、２０×、３０×、５０×、１００×、２００×、４００×、６００×、８００×、またはさらに約１０００×で含むことができる。高濃度フィード培地は、フェドバッチ培養方法で使用されることが多い。

いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、添加物、ポイントオブユース成分またはポイントオブユース化学物質としても知られる「ポイントオブユース添加物」が、細胞増殖またはタンパク質生成の過程で補充される。ポイントオブユース添加物は、増殖因子または他のタンパク質、緩衝液、エネルギー源、塩、アミノ酸、金属及びキレート剤のいずれか１つまたは複数を含む。他のタンパク質としては、トランスフェリン及びアルブミンが挙げられる。サイトカイン及びケモカインを含めた増殖因子は当技術分野で一般に既知であり、細胞増殖、またはある場合には細胞分化を刺激することが知られている。増殖因子は、通常、タンパク質（例えば、インスリン）、低分子ペプチド、またはステロイドホルモン、例えば、エストロゲン、ＤＨＥＡ、テストステロンなどである。ある場合には、増殖因子は、例えば、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）、メトトレキサートなどのような、細胞増殖またはタンパク質生成を促進する非天然化学物質でもよい。タンパク質及びペプチド増殖因子の非限定例としては、アンジオポエチン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘパトーム由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、神経成長因子（ＮＧＦ）及び他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因アルファ（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング増殖因ベータ（ＴＧＦ－β）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ｗｎｔシグナリング経路アゴニスト、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ウシ胎仔ソマトトロピン（ＦＢＳ）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７などが挙げられる。一実施形態では、細胞培養培地は、ポイントオブユース添加増殖因子のインスリンが補充される。一実施形態では、培地中のインスリンの濃度、すなわち、添加後の細胞培養培地中のインスリンの量は、約０．１μＭ～１０μＭである。１種または複数のポイントオブユース添加物をいくつかの実施形態の培地配合物中に含めることもできる。

緩衝液は一般に当技術分野で既知である。本発明は、任意の特定の緩衝液（複数可）に限定されず、いかなる当業者も、特定のタンパク質を生成する特定の細胞株とともに使用するための適切な緩衝液（複数可）を選択することができる。一実施形態では、ポイントオブユース添加緩衝液はＮａＨＣＯ３／ＣＯ２系である。一実施形態では、ポイントオブユース添加緩衝液はＮａＨＣＯ３を含む。別の実施形態では、緩衝液はＨＥＰＥＳである。

細胞培養におけるポイントオブユース添加物として使用するためのエネルギー源は、当技術分野で周知である。限定はされないが、一実施形態では、ポイントオブユース添加エネルギー源はグルコースである。特定の細胞株及び生成されるタンパク質の特定の及び具体的な要求を考慮して、一実施形態では、約１～２０ｍＭの濃度までグルコースを培地中に加えることができる。

キレート剤も同様に細胞培養及びタンパク質生成の分野で周知である。四ナトリウムＥＤＴＡ無水物及びクエン酸塩は、当技術分野で使用される２つの一般的なキレート剤であるが、他のキレート剤を本発明の実施で用いてもよい。一実施形態では、ポイントオブユース添加キレート剤は四ナトリウムＥＤＴＡ二水和物である。一実施形態では、ポイントオブユース添加キレート剤はクエン酸塩、例えばＮａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７である。

一実施形態では、細胞培養は、補充される１種または複数のポイントオブユース添加アミノ酸、例えばグルタミンが添加され得る。他のポイントオブユース添加物としては、様々な金属塩、例えば、鉄、ニッケル、亜鉛及び銅の塩の１つまたは複数が挙げられる。一実施形態では、細胞培養培地は、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化第２鉄及び硫酸ニッケルのいずれか１つまたは複数が補充される。

一実施形態では、培地は、フェドバッチ方法に従って、細胞培養の間に間隔を置いて補充される。フェドバッチ培養は一般に当技術分野で既知であり、最適化されたタンパク質生成に用いられる。例えば、Ｙ．Ｍ．Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．（２０１０）２６（５）ｐｐ．１４００－１４１０を参照されたい。

本開示の別の態様では、所望の濃度（すなわち、５．０ｍｇ／Ｌ以下、例えば、０．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ～２．０ｍｇ／Ｌ）のオルニチンまたはプトレシンを含むダイズ加水分解産物を含む培地中で培養される細胞は、５ｍｇ／Ｌを越える濃度のオルニチンまたはプトレシンを含むダイズ加水分解産物を含む培地中で培養される細胞と比べて、品質が向上した目的のタンパク質を生成する。ある種の実施形態では、タンパク質の品質の向上は、目的のタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸におけるグリコシル化の有無、目的のタンパク質におけるグリカンの量、目的のタンパク質の１つまたは複数のグリコシル化部位におけるシアル酸の存在、またはこられの組み合わせによって、測定される。本明細書で使用する場合、「品質が増強した」、「品質が向上した」または「高品質の」タンパク質生成物は、より一貫した品質、例えば、生物治療用タンパク質生成ロットで観察される翻訳後修飾も指すことができる。一貫した品質は、例えば、反復した生成ラインの後に反復することのできる所望のグリコシル化プロファイルを有することを含む。一貫性は、品質に関して、ある程度の均一性及び規格化を指すが、反復した生成バッチは本質的に変動がない。

ある種の実施形態では、タンパク質生成物（目的のタンパク質）は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディ、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体はＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。

いくつかの実施形態では、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０２０３５７９Ａ１号に記載されているような抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド－１（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０２０３５８０Ａ１号に記載されているような抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン－２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載されているような抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載されているような抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載されているような抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載されているような抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０３１３１９４Ａ１号に記載されているような抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮増殖因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載されているような抗ＥＧＦＲ抗体または米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０２５９４２３Ａ１号に記載されているような抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質転換酵素スブチリシンケキシン－９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号または米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／００４４７３０Ａ１号に記載されているような抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗成長分化因子－８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号または第９，２６０，５１５号に記載されているような、抗ミオスタチン抗体としても知られる抗ＧＤＦ８抗体）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０３３７０４５Ａ１号または第ＵＳ２０１６／００７５７７８Ａ１号に記載されているような、抗ＧＣＧＲ抗）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２７１６８１Ａ１号または米国特許第８，７３５，０９５号もしくは第８，９４５，５５９号に記載されているような抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、第８，０４３，６１７号または第９，１７３，８８０号に記載されているような抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２７１６５８Ａ１号または第ＵＳ２０１４／０２７１６４２Ａ１号に記載されているような抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸系発疹ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２７１６５３Ａ１号に記載されているような抗ＲＳＶ抗体）、抗表面抗原分類３（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１号及び第ＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号ならびに米国出願第６２／２２２，６０５号に記載されているような抗ＣＤ３抗体）、抗表面抗原分類２０（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１号及び第ＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載されているような抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗表面抗原分類－４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載されているような抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載されている）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０３３７０２９Ａ１号に記載されている抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／０２１５０４０号に記載されている）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体または抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／００１７０２９号ならびに米国特許第８，３０９，０８８号及び第９，３５３，１７６号に記載されているような抗ＮＧＦ抗体）ならびに抗アクチビンＡ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１号及び第ＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号に記載されている）、抗ＣＤ３×抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）及び抗ＣＤ３×抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ及びリヌクマブ（ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）からなる群から選択される。本開示全体にわたって言及されるすべての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

他の実施形態では、目的のタンパク質は、Ｆｃ部分及び別のドメインを含む組換えタンパク質（例えば、Ｆｃ－融合タンパク質）である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ－融合タンパク質は、Ｆｃ部分に結合した受容体の１つまたは複数の細胞外ドメイン（複数可）を含む、受容体Ｆｃ－融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、ＩｇＧのヒンジ領域、それに続くＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、受容体Ｆｃ－融合タンパク質は、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかに結合する２つ以上の異なる受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ－融合タンパク質は、トラップタンパク質、例えば、ＩＬ－１トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩＬ－１Ｒ１細胞外領域に融合したＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含む、リロナセプ；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９２７，００４号を参照されたい）、ＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含む、アフリベルセプトもしくはｚｉｖ－アフリベルセプト；米国特許第７，０８７，４１１号及び第７，２７９，１５９号を参照されたい。または、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン４に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含む、コンバセプト；米国特許第８，２１６，５７５号を参照されたい）、あるいはＴＮＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＴＮＦ受容体を含む、エタネルセプト；米国特許第５，６１０，２７９号を参照されたい）などである。他の実施形態では、Ｆｃ－融合タンパク質は、Ｆｃ部分に結合した抗体の１種または複数の抗原結合ドメイン（複数可）、例えば、可変重鎖断片及び可変軽鎖断片の１つまたは複数を含む、ＳｃＦｖ－Ｆｃ－融合タンパク質である。

タンパク質生成
目的のタンパク質は、当業者に既知の方法を使用して、宿主細胞によって発現させることができる。一般に、哺乳動物細胞における発現に適した任意の目的のタンパク質を本方法によって生成することができるが、糖タンパク質は、本方法から特に恩恵を受けるであろう。例えば、具体的な実施形態では、目的のタンパク質は抗体もしくはその抗原結合性断片、二重特異性抗体もしくはその断片、キメラ抗体もしくはその断片、ＳｃＦｖもしくはその断片、Ｆｃタグ化タンパク質（例えば、トラップタンパク質）もしくはその断片、増殖因子もしくはその断片、サイトカインもしくはその断片、または細胞表面レセプターの細胞外ドメインまたはその断片である。

アスパラギン結合型（Ｎ結合型）グリカンを有する糖タンパク質は、真核細胞中に遍在している。これらのグリカンの生合成及びポリペプチドへのそれらの移行は、小胞体（ＥＲ）で起こる。Ｎ－グリカンの構造は、いくつかのグリコシダーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼによって、ＥＲ及びゴルジ複合体でさらに修飾される。本方法で使用するタンパク質生成は、免疫原性エピトープ（「グリコトープ」）を排除するために、所望のＮ－グリカン構造の一貫性を向上させることを対象とする。グリカン結合型タンパク質の詳細な構造解析は、タンパク質の機能的特色と関連づけされ得る。タンパク質のグリコシル化を特性評価するそのような解析は、典型的には以下のいくつかのステップを含む：ｉ）結合しているグリカンの酵素的または化学的遊離、ｉｉ）芳香族もしくは脂肪族アミンを用いる還元的アミノ化または完全メチル化による遊離したグリカンの誘導体化、ｉｉｉ）グリカンの解析。グリコシル化パターンを解析する多くの変形が当業者に既知である。糖タンパク質は、特定の量で様々な部位を占めるいくつかのタイプのグリコフォームを保有する場合があり、したがって、その複雑さによって、ある種の生成方法において再現することが困難になり得る。グリコフォームのタイプ及び量の一貫性は測定可能であり、治療用タンパク質生成についての望ましい結果に相当する。

本開示は、特定の濃度のオルニチンまたはプトレシンを有するダイズ加水分解産物を含む培地中で目的のタンパク質を発現する細胞を培養することによって、バッチまたは流加培養において目的のタンパク質の多数のバッチを生成することが、生成されるタンパク質の品質を高め、バッチ間の一貫性を向上させることを示す。したがって、本開示の別の態様は、所定量のオルニチンまたはプトレシンを含むダイズ加水分解産物の別々のバッチを含む培地中で細胞を培養することによって生成された、複数のタンパク質調製物を提供する。ある種の実施形態では、細胞培養で使用するために選択されるダイズ加水分解産物の各バッチは、ダイズ１ｇあたり０．６７ｍｇのオルニチンまたはプトレシンまたはそれ以下、特に、ダイズ１ｇあたり０．００６７ｍｇ～０．６７ｍｇのオルニチンもしくはプトレシン、またはダイズ１ｇあたり０．００６７～０．２７ｍｇのオルニチンもしくはプトレシンの濃度を有する。

他の実施形態では、ダイズ加水分解産物含有細胞培養培地中のオルニチンまたはプトレシンの濃度は、０．５ｍｇ／Ｌ～４．５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～４．０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～３．５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～３．０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～２．５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～２．０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ～１．５ｍｇ／Ｌまたは０．５ｍｇ／Ｌ～１．０ｍｇ／Ｌの範囲にわたる。いくつかの実施形態では、ダイズ加水分解産物含有細胞培養培地中のオルニチンまたはプトレシンの濃度は、１．０ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌ、４．０ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌまたは４．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌの範囲にわたる。

具体的な実施形態では、ダイズ加水分解産物を含有する細胞培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ、０．６ｍｇ／Ｌ、０．７ｍｇ／Ｌ、０．８ｍｇ／Ｌ、０．９ｍｇ／Ｌ、１．１ｍｇ／Ｌ、１．２ｍｇ／Ｌ、１．３ｍｇ／Ｌ、１．４ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、１．６ｍｇ／Ｌ、１．７ｍｇ／Ｌ、１．８ｍｇ／Ｌ、１．９ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ、２．１ｍｇ／Ｌ、２．２ｍｇ／Ｌ、２．３ｍｇ／Ｌ、２．４ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、２．６ｍｇ／Ｌ、２．７ｍｇ／Ｌ、２．８ｍｇ／Ｌ、２．９ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、３．１ｍｇ／Ｌ、３．２ｍｇ／Ｌ、３．３ｍｇ／Ｌ、３．４ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ、３．６ｍｇ／Ｌ、３．７ｍｇ／Ｌ、３．８ｍｇ／Ｌ、３．９ｍｇ／Ｌ、４．０ｍｇ／Ｌ、４．１ｍｇ／Ｌ、４．２ｍｇ／Ｌ、４．３ｍｇ／Ｌ、４．４ｍｇ／Ｌ、４．５ｍｇ／Ｌ、４．６ｍｇ／Ｌ、４．７ｍｇ／Ｌ、４．８ｍｇ／Ｌ、４．９ｍｇ／Ｌまたは５．０ｍｇ／Ｌの量のオルニチンまたはプトレシンを含む。

他の実施形態では、ダイズ加水分解産物を含む培地のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、５．０ｍｇ／Ｌ以下である。さらに他の実施形態では、ダイズ加水分解産物を含む培地のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、２．０ｍｇ／Ｌ以下である。別の実施形態では、ダイズ加水分解産物を含む培地のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、１．８ｍｇ／Ｌ以下である。いくつかの実施形態では、ダイズを含む培地のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、０．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌである。さらに他の実施形態では、ダイズ加水分解産物を含む培地のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、０．５ｍｇ／Ｌ～２．０ｍｇ／Ｌの範囲内に入る。さらに別の実施形態では、ダイズ加水分解産物を含む培地のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの所望の濃度は、０．５ｍｇ／Ｌ～１．８ｍｇ／Ｌの範囲内に入る。

ある種の実施形態では、複数のタンパク質調製物の各タンパク質調製物における、生成された目的のタンパク質の品質またはある種のグリカンの量は、５ｍｇ／Ｌを越える濃度のオルニチンまたはプトレシンを含むダイズ加水分解産物が補充された培地中で細胞を培養することを含む方法によって生成されたタンパク質調製物と比較して、向上される。ある種の実施形態では、各タンパク質調製物が示すタンパク質の品質の向上は、目的のタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸におけるグリコシル化の有無、目的のタンパク質におけるグリカンの量、目的のタンパク質の１つまたは複数のグリコシル化部位におけるシアル酸の存在、またはこられの組み合わせによって、測定される。一実施形態では、タンパク質の品質は、培養において生成されるタンパク質の集団の個々のメンバーのグリコシル化状態に対応する。ある種の実施形態では、品質は、５．０ｍｇ／Ｌ以下のオルニチンまたはプトレシン、０．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシン、または０．５ｍｇ／Ｌ～２．０ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシンの濃度を有するダイズ加水分解産物が補充された培地において細胞を培養することによる培養において生成されるタンパク質の集団の個々の糖タンパク質上に存在するグリコシル化置換を調節することによって、向上される。

一実施形態では、タンパク質の品質は、複数のタンパク質調製物由来のタンパク質の各バッチ中の少なくとも１つのグリカン分子の存在量を、タンパク質の別のバッチ中の同じグリカン分子（複数可）の存在量と比較することによって、決定される。本明細書で使用する場合、用語「存在量」は、特定の生成ロットにおける、特定のグリカン分子を有するタンパク質のパーセンテージ、または生成ロット中のすべてのタイプのグリカン分子の量に対する、特定のグリカン分子を有するタンパク質の量を指す。いくつかの実施形態では、グリカン分子は、Ａ１、Ａ１Ｆ、Ａ２、Ａ２Ｆ、Ｍａｎ５、ＮＡ２、ＮＡ２Ｆ、ＮＡ２Ｇ１、ＮＡ２Ｇ１Ｆ、ＮＧＡ２及びＮＧＡ２ＦＩからなる群から選択される。具体的な実施形態では、グリカン分子は、Ａ１（例えば、図２のピーク１１）である。

本開示の細胞培養方法によって生成される目的のタンパク質は、好ましい品質特性を示す。タンパク質の品質は、例えば、当業者に周知の方法、例えば、弱陽イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＥＬＩＳＡ及び／またはウエスタンブロット解析を使用して、測定することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質の品質は、マススペクトロメトリー、例えばキャピラリー電気泳動マススペクトロメトリー（ＣＥ－ＭＳ）によって、測定される。具体的な実施形態では、タンパク質の品質は、複数のタンパク質調製物由来のタンパク質の各バッチのマススペクトロメトリーの読み出し情報を比較することによって、決定される。

本明細書において、表２～４に例示されるように、例示的生成ロットの蛍光検出をともなう高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、０．５ｍｇ／Ｌ～５．０ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシンの濃度を有するダイズ加水分解産物を含む培地中で培養された細胞によって生成された目的のタンパク質（糖タンパク質）は、より一貫したグリカン発現及びグリコシル化パターンを有することを示す。

オリゴ糖プロファイリング
糖タンパク質上の特定のＮ結合型糖鎖の程度及び分布は、オリゴ糖プロファイリングによって確認することができる。一実施形態では、糖タンパク質はペプチド：Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）によって脱グリコシル化されて、アスパラギン側鎖からＮ結合型オリゴ糖が切断され、除去される。次いで、オリゴ糖が蛍光試薬、例えばアントラニル酸で誘導体化される。次いで、糖鎖が順相陰イオン交換ＨＰＬＣによって分離され、蛍光検出器で検出され、ＨＰＬＣクロマトグラムが生成される。

別の実施形態では、全体的な炭水化物特性評価解析の一部として、還元されアルキル化された糖タンパク質のトリプシン消化に続いて、個々の糖ポリペプチドが単離される。個々のトリプシン性糖ポリペプチドは、必要に応じて、分解能を高めるためのその後のＣ１８カラムをともなった、逆相ＨＰＬＣによって分離される。オリゴ糖は、ＰＮＧａｓｅ Ｆ消化によって、分離された糖ポリペプチドのそれぞれから遊離され、アントラニル酸で誘導体化され、蛍光ＨＰＬＣによって解析され、糖タンパク質の部位特異的なオリゴ糖プロファイルが得られる。糖タンパク質がリロナセプト（配列番号１）である一実施形態では、Ｎ３７、Ｎ８７、Ｎ９１、Ｎ９８、場合により、Ｎ１７６、Ｎ１８９、Ｎ２７９、Ｎ４１８、Ｎ５１１、Ｎ５５１、Ｎ５６７、Ｎ５８１、Ｎ６１５及びＮ７３０のアスパラギン残基がグリコシル化される。一実施形態では、リロナセプトの残基Ｎ３７、Ｎ９８、Ｎ４１８及びＮ５１１（残基の位置は配列番号１に対応する）のいずれか１つまたは複数が、Ａ１オリゴ糖を含む。糖タンパク質がアフリベルセプト（配列番号２）である一実施形態では、Ｎ３６、Ｎ６８、Ｎ１２３、Ｎ１９６及びＮ２８２のアスパラギン残基がグリコシル化される。一実施形態では、アフリベルセプトの残基Ｎ１２３及びＮ１９６（残基の位置は配列番号２対応する）のいずれか１つまたは両方がＡ１オリゴ糖を含む。

別の実施形態では、糖タンパク質からのオリゴ糖プールが、ＰＮＧａｓｅ Ｆによるタンパク質の脱グリコシル化、それに続くアントラニル酸誘導体化、その後の固相抽出（ＳＰＥ）によって、生成される。次いで、マトリックスとして２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）を用いて、ネガティブリニアモードでＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用して、オリゴ糖の質量が測定される。

各観察された質量は、組換えタンパク質において一般に観察されるＮ結合型グリカンの質量に基づいて、ユニークなオリゴ糖構造に割り当てられる。すべてのピークの予想される質量割り当てを表１に概説する。予想される質量は、アントラニル酸残基の質量を加えた提案されるＮ結合型糖鎖構造に基づいて計算された平均質量である。単糖組成も提案されるＮ結合型糖鎖構造に基づいて列挙する。

別の実施形態では、キャピラリー電気泳動を使用する定量的オリゴ糖フィンガープリントアッセイを使用して、対象の糖タンパク質のＮ－グリカン（オリゴ糖）構造を特性評価する。糖タンパク質は変性させられ、次いで、ＰＮＧａｓｅ Ｆで処理することによって脱グリコシル化される。遊離したオリゴ糖は、次いで、タンパク質を除去した後の沈殿によって単離される。単離されたオリゴ糖プールは、フルオロフォア８－アミノピレン１，３，６－トリスルホネート（ＡＰＴＳ）で標識される。次いで、標識されたオリゴ糖はキャピラリー電気泳動によって分離され、４８８ｎｍの励起波長及び５２０ｎｍの発光波長を使用するレーザー誘起蛍光検出器でモニターされる。

アフリベルセプト糖タンパク質について図２に示すように、定量化可能なすべてのピーク番号付けされて（この実施例では合計で２１ピーク）、電気泳動図が生成される。オリゴ糖フィンガープリントに対する完全な統合ピーク面積（全ピーク面積）が決定される。各オリゴ糖の相対量は、その特定のオリゴ糖に対するピーク面積（例えば、Ａ１ピーク面積）を全ピーク面積で割ることによって、決定することができる。

いくつかの実施形態では、対象の糖タンパク質の品質は、シアリル化（糖タンパク質あたりのシアル酸残基の量）またはフコシル化（糖タンパク質あたりのフコース残基の量）のレベルを決定することによって、評価される。一実施形態では、糖タンパク質上のシアル酸の総数は、定量的ＨＰＬＣアッセイを使用して決定される。このアッセイでは、シアル酸は、穏やかな酸加水分解を使用して糖タンパク質から遊離され、次いで、ｏ－フェニレンジアミンで誘導体化され、ＨＰＬＣによって分離され、ＵＶまたは蛍光検出器のいずれかで検出される。シアル酸の定量化は、例えばシアリルラクトースを使用する検量線と比較して、評価され得る。シアル酸含量は、遊離したシアル酸のモル及び反応で使用された糖タンパク質のモルから計算される。

一実施形態では、リロナセプト糖タンパク質のシアル酸含量は、１モルの糖タンパク質あたり約３０～７０モルシアル酸（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、約３５～６５ｍｏｌ／ｍｏｌ、３０ｍｏｌ／ｍｏｌ、３１ｍｏｌ／ｍｏｌ、３２ｍｏｌ／ｍｏｌ、３３ｍｏｌ／ｍｏｌ、３４ｍｏｌ／ｍｏｌ、３５ｍｏｌ／ｍｏｌ、３６ｍｏｌ／ｍｏｌ、３７ｍｏｌ／ｍｏｌ、３８ｍｏｌ／ｍｏｌ、３９ｍｏｌ／ｍｏｌ、４０ｍｏｌ／ｍｏｌ、４１ｍｏｌ／ｍｏｌ、４２ｍｏｌ／ｍｏｌ、４３ｍｏｌ／ｍｏｌ、４４ｍｏｌ／ｍｏｌ、４５ｍｏｌ／ｍｏｌ、４６ｍｏｌ／ｍｏｌ、４７ｍｏｌ／ｍｏｌ、４８ｍｏｌ／ｍｏｌ、４９ｍｏｌ／ｍｏｌ、５０ｍｏｌ／ｍｏｌ、５１ｍｏｌ／ｍｏｌ、５２ｍｏｌ／ｍｏｌ、５３ｍｏｌ／ｍｏｌ、５４ｍｏｌ／ｍｏｌ、５５ｍｏｌ／ｍｏｌ、５６ｍｏｌ／ｍｏｌ、５７ｍｏｌ／ｍｏｌ、５８ｍｏｌ／ｍｏｌ、５９ｍｏｌ／ｍｏｌ、６０ｍｏｌ／ｍｏｌ、６１ｍｏｌ／ｍｏｌ、６２ｍｏｌ／ｍｏｌ、６３ｍｏｌ／ｍｏｌ、６４ｍｏｌ／ｍｏｌ、６５ｍｏｌ／ｍｏｌ、６６ｍｏｌ／ｍｏｌ、６７ｍｏｌ／ｍｏｌ、６８ｍｏｌ／ｍｏｌ、６９ｍｏｌ／ｍｏｌまたは７０ｍｏｌ／ｍｏｌである。

一実施形態では、アフリベルセプト糖タンパク質のシアル酸含量は、シアル酸１モルの糖タンパク質あたり約５～１５モル（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、約８～１２ｍｏｌ／ｍｏｌ、４ｍｏｌ／ｍｏｌ、５ｍｏｌ／ｍｏｌ、６ｍｏｌ／ｍｏｌ、７ｍｏｌ／ｍｏｌ、８ｍｏｌ／ｍｏｌ、９ｍｏｌ／ｍｏｌ、１０ｍｏｌ／ｍｏｌ、１１ｍｏｌ／ｍｏｌ、１２ｍｏｌ／ｍｏｌ、１３ｍｏｌ／ｍｏｌ、１４ｍｏｌ／ｍｏｌ、１５ｍｏｌ／ｍｏｌ、１６ｍｏｌ／ｍｏｌ、１７ｍｏｌ／ｍｏｌ、１８ｍｏｌ／ｍｏｌ、１９ｍｏｌ／ｍｏｌまたは２０ｍｏｌ／ｍｏｌである。

一実施形態では、オリゴ糖プロファイリングを用いて、糖タンパク質上のＮ結合型糖鎖のシアリル化の程度及び分布が決定される。糖タンパク質は、ＰＮＧａｓｅ Ｆで脱グリコシル化され、次いで蛍光試薬、すなわちアントラニル酸で誘導体化される。次いで、オリゴ糖は、順相陰イオン交換ＨＰＬＣによって分離され、蛍光検出器で検出されて、オリゴ糖プロファイルのＨＰＬＣクロマトグラムが生成される。糖タンパク質に対するＺ数（これは、平均シアリル化度を評価する）は、以下の式から計算される：

（ＯＳ Ａ＊Ｏ）＋（ＩＳＡ＊１１１－（２ＳＡ＊２）＋（３ＳＡ＊３）＋．．．（ｎＳＡ＊ｎ）１／（ＯＳＡ＋１５Ａ＋２ＳＡ＋３５Ａ＋．．．ｎ５Ａ）

Ｚ数を決定するために、オリゴ糖プロファイルからの各ピークの面積が統合される。全シアル酸は、０を乗じた、０シアル酸／鎖ピーク、１を乗じた、１シアル酸／鎖ピーク、２を乗じた、２シアル酸／鎖ピーク、及び３を乗じた３シアル酸／鎖ピークなどの面積の合計として計算される。糖鎖の総数は、すべてのピークの面積の合計として生成される。Ｚ数は、全糖鎖面積で割った全シアル酸面積である。

一実施形態では、リロナセプト糖タンパク質のシアル酸のＺ数は、約１．３～１．６、１．４～１．５、１．４１～１．４８、１．３、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４、１．４１、１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９または１．６０である。

一実施形態では、アフリベルセプト糖タンパク質のシアル酸のＺ数は、約０．５～２、１～１．５、１～１．２、０．５、０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、０．７、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、１、１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１、１．１１、１．１２、１．１３、１．１４、１．１５、１．１６、１．１７、１．１８、１．１９、１．２、１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６．、１．２７、１．２８、１．２９または１．３である。

以下の実施例は、本明細書に記載の方法及び組成物の作製及び使用の方法を当業者に提供するために述べられ、本発明者らが自身の発明であると見なすものの範囲を限定することを意図しない。使用される数（例えば、量、温度など）について正確性を確実にするように努力したが、いくらかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。

実施例１：アミノ酸濃度を決定するためのダイズ加水分解産物のスクリーニング
ダイズ加水分解産物試料を秤量し、その２０グラム部を１Ｌの水に溶解して、２０ｇ／Ｌの出発濃度にした。次いで、得られたダイズ加水分解産物溶液をさらに水に希釈して、細胞培養で使用するための所望の濃度にし、得られたダイズ加水分解産物溶液の分子組成を、クロマトグラフィーを使用することによって決定した。

ダイズ加水分解産物試料中のアミノ酸の濃度を、ポストカラムニンヒドリン検出とともに、イオン交換カラムによるクロマトグラフィーによって測定した。例えば、Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５４）Ｖｏｌ．２１１ ｐｐ．９０７－９１３を参照されたい。ＨＰＬＣカラムから溶出し、標準と比較した場合に、個々のピーク（アミノ酸）の高感度の分離及び分解能を可能にするために、ダイズ加水分解産物試料を希釈した。図１Ａ及び１Ｂに示すクロマトグラムの各ピーク面積を標準と比べて、各溶出液の濃度を決定した。

ダイズ加水分解産物の粉末のバッチが、ダイズ１グラムあたり０．６７ミリグラム未満のオルニチンまたはプトレシンを含むかどうかを決定するために、各代表試料のクロマトグラムを標準と比較する。例えば、図１Ａは、保持時間８９．０２でオルニチンを含む溶出液をともなうダイズ加水分解産物のバッチを示し、これは、標準と比べた場合に、オルニチンのダイズ１ｇあたり１．５７ｍｇオルニチンと等しいピーク面積を明らかにする。図１Ｂは、ダイズ１ｇあたり０．６７ｍｇ未満のオルニチンのオルニチン濃度を有するダイズ加水分解産物のバッチを図示する。ロット間でより一貫したタンパク質グリコシル化を有する生物治療用タンパク質を生成するために、ダイズ１ｇあたり０．０６７から０．６７ｍｇのオルニチンを有するダイズ加水分解産物のバッチを、細胞培養方法で使用するために選択した。しかし、タンパク質生成に対するダイズ加水分解産物のオルニチン濃度の影響を決定するために、以下に記載のように、ダイズ１ｇあたり０．６７ｍｇ未満のオルニチンを越える濃度のオルニチンを含むダイズ加水分解産物バッチをさらなる実験で用いた。

実施例２：目的のタンパク質の発現及びグリコシル化プロファイル
生成されるタンパク質の品質にどのアミノ酸成分が影響を及ぼすかを決定するために、トラップタンパク質（受容体－Ｆｃ融合タンパク質、ＶＥＧＦ－トラップ）を発現するＣＨＯ細胞を、様々な量のオルニチン、プトレシン及びシトルリンまたはこれらの組み合わせを含むダイズ加水分解産物を含む独自開発の培地中で培養した。表２は、シトルリン濃度と関係なく、５．０ｍｇ／Ｌ未満の濃度のオルニチンを含むダイズ加水分解産物が補充された培地におけるＣＨＯ細胞の培養の結果として生成されたタンパク質ロットについて、重要なＮ－グリカンに対する曲線下面積の増大として示されるように、加水分解産物中のオルニチンのレベルがタンパク質生成ロットの品質と負に相関することを示す。

表２に示し、図３に描写するように、２．０ｍｇ／Ｌ以下のオルニチン濃度を有するダイズ加水分解産物を含む培地中で培養された細胞によって生成されたＶＥＧＦ－トラップタンパク質生成物のロットは、５．０ｍｇ／Ｌを超えるオルニチン、シトルリンまたはプトレシンを含む培地中で培養された細胞と比較して、より高品質のタンパク質生成物を生成する。

オルニチンがタンパク質グリコシル化プロファイルに対して影響があったかどうかを決定するために、ＨＰＬＣ及び蛍光アントラニル酸（ＡＡ）タグのための周知の方法（Ａｎｕｍｕｌａ，ａｎｄ Ｄｈｕｍｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）８（７）ｐｐ．６８５－６９４）に基づくクロマトグラフィーを使用して、糖タンパク質の各ロットについて詳細なグリカン解析を行った。表３に示すように、ダイズ１ｇあたり０．６７ｍｇ以下のオルニチンを含むダイズ加水分解産物を含む培地における細胞の培養は、ロット間でより一貫したタンパク質生成をもたらす。より具体的には、選択されたダイズ加水分解産物を含む培地中で培養された生成ロットの約９０％が、ＦＤＡ生成基準を満たす。これに対して、５ｍｇ／Ｌを超えるオルニチンを有するダイズ加水分解産物を含む培地で培養された生成ロットの５７％しか、ＦＤＡ生成基準を満たさなかった（特定のＮ－グリカンピークに対する曲線下面積）。表３に示すように、ダイズ１ｇあたり０．６７ｍｇのオルニチンまたはそれ以下のオルニチン濃度を有するダイズ加水分解産物を含む培地中で培養される細胞によって生成されたＶＥＧＦ－トラップタンパク質生成物のロットは、生成物の品質の高まり、及びロット間でより一貫した品質を示す。

例示的ＶＥＧＦ－トラップタンパク質についての、タンパク質の治療的に許容されるバッチに相当する参照標準とも、各生成ロットを（グリカンプロファイルに関して）比較した。０．５ｍｇ／Ｌから２．０ｍｇ／Ｌの間のオルニチンの終濃度をもたらすダイズ加水分解産物が補充された培地中で培養される細胞から生成されたタンパク質ロットについて、代表的なグリカン解析を表４に示す。参照と比較して、各生成されたトラップタンパク質は、許容範囲内にピークを有する一貫したグリカンプロファイルを含む（解析したロットの７５％）。これに対して、５．０ｍｇ／Ｌを超えるオルニチンを含むダイズ加水分解産物が補充された培地中で培養される細胞によって生成された各ロットは、ＦＤＡ認容基準を満たすことができなかった。表４に示すように、０．５ｍｇ／Ｌ～２．０ｍｇ／Ｌ以下のオルニチン濃度を有するダイズ加水分解産物を含む培地中で培養された細胞によって生成されたタンパク質生成ロットは、生成物許容基準を下回るＡ１ Ｎ－グリカンレベルによって示されるように、５．０ｍｇ／Ｌを越えるオルニチン濃度を有するより多くのダイズ加水分解産物を含む培地中で培養された細胞よりも高品質のロットを生成する。

図４は、Ａ１ Ｎ－グリカンレベルによって示されるように、ダイズ加水分解産物中のオルニチンのレベルと糖タンパク質（アフリベルセプト）の品質の間の強い負の相関を示す。

実施例３：糖タンパク質生成力価
１６個のダイズ加水分解産物ロットを、リロナセプトのＣＨＯ細胞生成のメタボロミクスに影響を及ぼすそれらの能力について試験した。およそ４２６個のダイズ加水分解産物分析物を測定し、最終的な糖タンパク質力価及びラクテート代謝と比較した。図５は、ダイズ加水分解産物分析物と最大ラクテート及び最終的な糖タンパク質力価との間の相関のローディングプロットを示す。ラクテート及び糖タンパク質力価の決定は、ダイズ加水分解産物中のオルニチンの負の相関を示す。

実施例４：スパイキング研究によるマーカー確認
図６Ａ及び６Ｂは、それぞれ細胞増殖及びグリコシル化に対するオルニチン及びプトレシンの影響を実証するためにオルニチンまたはプトレシンのいずれかがスパイクされた、対照培地及びフィード条件の下での、ＣＨＯ細胞培養を示す。表６Ｂは、特に著しいピーク１１における影響を強調表示する。

添付の図面を参照して本発明の実施形態を説明してきたが、本発明は正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲または趣旨を逸脱することなく、当業者が、その中で様々な変更及び修飾を行うことができることを理解されたい。

Claims (32)

1. ダイズ加水分解産物を含む細胞培養培地中で組換え異種糖タンパク質を発現する細胞の集団を培養して、前記組換え異種糖タンパク質を生成することを含む方法であって、前記ダイズ加水分解産物が、≦０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含む、前記方法。
2. 前記細胞の集団が、組換え異種糖タンパク質を発現する細胞のクローン性増殖によって得られる、請求項１に記載の方法。
3. 前記ダイズ加水分解産物が０．００３％～０．０２７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記培養培地が≦５ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記培養培地が０．６～３ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記糖タンパク質がトラップ分子である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記トラップ分子がエタネルセプト、リロナセプト及びアフリベルセプトからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記糖タンパク質がＡ１ Ｎ－グリカン及び少なくとも１つの他のＮ－グリカン種を含み、Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量が前記糖タンパク質の全Ｎ－グリカン種の総量の≧１０％（ｗ／ｗ）である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. ａ．グリコシル化タンパク質を発現する細胞を細胞培養培地中で培養して、前記糖タンパク質を生成すること、
   ｂ．前記グリコシル化タンパク質を精製すること、
   ｃ．前記精製したグリコシル化タンパク質をオリゴ糖フィンガープリント解析にかけること、
   ｄ．前記糖タンパク質のＮ－グリカン種の総量と比較して、Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量を決定すること、及び
   ｅ．前記糖タンパク質のＮ－グリカン種の総量と比較して、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）のＡ１ Ｎ－グリカンを提供するダイズ加水分解産物を選択すること
   を含む方法。
10. 前記選択されたダイズ加水分解産物が≦０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記選択されたダイズ加水分解産物が０．００３％～０．０２７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記培養培地が０．６～３ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記糖タンパク質がトラップ分子である、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記トラップ分子がエタネルセプト、リロナセプト及びアフリベルセプトからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記糖タンパク質が、糖タンパク質１モルあたり８～１２モルのシアル酸、または糖タンパク質１モルあたり３５～６５モルのシアル酸を含む、請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 糖タンパク質の製造で使用するためのダイズ加水分解産物を選択する方法であって、
    ａ．ダイズ加水分解産物中のオルニチンまたはプトレシンの量を測定すること、
    ｂ．≦０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを有するダイズ加水分解産物を選択すること、及び
    ｃ．前記選択されたダイズ加水分解産物をさらなる成分と組み合わせて、≦５ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシンを有する細胞培養培地を形成すること
    を含む、前記方法。
17. 前記選択されたダイズ加水分解産物が０．００３％～０．０２７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記培養培地が０．６～３ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記糖タンパク質がトラップ分子である、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記トラップ分子がエタネルセプト、リロナセプト及びアフリベルセプトからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記糖タンパク質がＡ１ Ｎ－グリカン及び少なくとも１つの他のＮ－グリカン種を含み、Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量が前記糖タンパク質の全Ｎ－グリカン種の総量の≧１０％（ｗ／ｗ）である、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. Ａ１ Ｎ－グリカン及び少なくとも１つの他のＮ－グリカン種を含む糖タンパク質であって、前記Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量が前記糖タンパク質のＮ－グリカンの総量の少なくとも１０％（ｗ／ｗ）である、前記糖タンパク質。
23. 前記糖タンパク質がトラップ分子である、請求項２２に記載の糖タンパク質。
24. 前記トラップ分子がエタネルセプト、リロナセプト及びアフリベルセプトからなる群から選択される、請求項２３に記載の糖タンパク質。
25. 前記糖タンパク質がＡ２ Ｎ－グリカン、Ａ２Ｆ Ｎ－グリカン、Ａ１Ｆ Ｎ－グリカン、ＮＧＡ２Ｆ Ｎ－グリカン、ＮＡ２Ｇ１Ｆ Ｎ－グリカン、ＮＡ２ Ｎ－グリカン及びＮＡ２Ｆ Ｎ－グリカンをさらに含む、請求項２２に記載の糖タンパク質。
26. 前記Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量が、キャピラリー電気泳動によって得られるオリゴ糖フィンガープリントの前記Ａ１ Ｎ－グリカンのピーク下の面積を全Ｎ－グリカンに対するピーク下の全面積と比較することによって決定される、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の糖タンパク質。
27. 前記Ａ１ Ｎ－グリカンの相対量が１０％～１７％（ｗ／ｗ）である、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の糖タンパク質。
28. 前記糖タンパク質が、糖タンパク質１モルあたり３５～６５モルのシアル酸を有するリロナセプトである、請求項２４に記載の糖タンパク質。
29. 前記リロナセプトが配列番号１の残基Ｎ３７、Ｎ９８、Ｎ４１８及びＮ５１１のいずれか１つまたは複数にＡ１ Ｎ－グリカンを含む、請求項２８に記載の糖タンパク質。
30. 前記糖タンパク質が、糖タンパク質１モルあたり８～１２モルのシアル酸を有するアフリベルセプトである、請求項２４に記載の糖タンパク質。
31. 前記アフリベルセプトが配列番号２の残基Ｎ１２３及びＮ１９６のいずれか１つまたは複数にＡ１ Ｎ－グリカンを含む、請求項３０に記載の糖タンパク質。
32. ａ．残基を含まない反応器中でダイズ抽出物を酵素消化して、ダイズ加水分解産物を製造すること、
    ｂ．前記ダイズ加水分解産物中のオルニチンまたはプトレシンの量を測定すること、及び
    ｃ．細胞培養培地で使用するための、≦０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを有するダイズ加水分解産物を選択すること
    を含む方法。

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