JP2022137032A - 免疫腫瘍学のための組成物および方法 - Google Patents

免疫腫瘍学のための組成物および方法 Download PDF

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Mickanin Craig
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Lescarbeau Reynald
リチャードソン，セレスト
Richardson Celeste
スチュワート，モラグ
Stewart Morag
ヤン，イー
Yi Yang
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Abstract

【課題】宿主対移植片応答又は移植片対宿主応答などを低減するか、又は消失させることにより、同種異系細胞、例えば、同種異系Ｔ細胞（キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む等）、有効性、生存、機能、及び／又は生存率を改善しうるｇＲＮＡを提供する。【解決手段】ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、前記ｃｒＲＮＡが、Ｂ２Ｍ内の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含み、前記ターゲティングドメインが、特定の配列の１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む、ｇＲＮＡ分子である。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０１５年１２月４日に出願された、米国特許仮出願第６２／２６３１６９
号明細書、２０１６年４月１日に出願された、米国特許仮出願第６２／３１６７８４号明
細書、および２０１６年９月１４日に出願された、米国特許仮出願第６２／３９４２９０
号明細書に対する優先権を主張する。これらの出願の内容の全体は、参照により本明細書
に組み込まれる。
背景
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ
Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）は、細菌内で、ウイルスの攻撃
に対して防御する養子免疫系として進化した。ウイルスへの曝露時に、ウイルスＤＮＡの
短いセグメントが、細菌ゲノムのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座へと組み込まれる。ＲＮＡは、ウ
イルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の部分から転写される。ウイルスゲノムに相補的
な配列を含有する、このＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質の、ウイルスゲノム内の配列への
ターゲティングを媒介する。Ｃａｓ９タンパク質は、ウイルス標的を切断し、これにより
、ウイルス標的をサイレンシングする。
近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、真核細胞内のゲノム編集に適合している。部位特異
的一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入は、例えば、非相同末端結合
（ＮＨＥＪ）または相同性指向修復（ＨＤＲ）を介して、標的配列の変更を可能とする。
発明の概要
本明細書で記載される本発明は、免疫腫瘍学のための組成物および方法、例えば、それ
らのゲノム内の特異的標的配列において改変された細胞であって、前記標的配列をターゲ
ティングするｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系の導入により改変された細胞を含む細胞
と、それらを作製および使用する方法とに関する。例えば、本開示は、細胞、例えば、Ｔ
細胞、例えば、キメラ抗原受容体を発現するように、さらに操作されたＴ細胞のゲノム編
集に有用であり、がんなどの疾患を処置するために有用である、ｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳ
ＰＲ系、細胞、および方法に関する。
第１の態様では、本発明は、ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、
ｃｒＲＮＡが、Ｂ２Ｍ、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ
Ｃ１、ＴＲＢＣ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＦＫＢＰ
１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、またはＮＲ３Ｃ
１から選択される、同種異系Ｔ細胞標的の標的配列と相補的なターゲティングドメインを
含む、ｇＲＮＡ分子を提供する。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態では、
２（ａ）同種異系Ｔ細胞標的は、Ｂ２Ｍであり、ターゲティングドメインが、配列番号
１～配列番号８３、もしくは配列番号５４９２～配列番号５５２７のうちのいずれか１つ
を含むか；
２（ｂ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＴＲＡＣであり、ターゲティングドメインは、配列番
号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番号５８１６～配列番号５９６５のうちの
いずれか１つを含むか；
２（ｃ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＴＲＢＣ１であり、ターゲティングドメインは、配列
番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９７のうち
のいずれか１つを含むか；
２（ｄ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＴＲＢＣ２であり、ターゲティングドメインは、配列
番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列番号６０９８～配列番号６２２６のうち
のいずれか１つを含むか；
２（ｅ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＣＤ２４７であり、ターゲティングドメインは、配列
番号８４～配列番号３９２のうちのいずれか１つを含むか；
２（ｆ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＣＤ３Ｄであり、ターゲティングドメインは、配列番
号３９３～配列番号５３２、もしくは配列番号１０７８０～配列番号１０７９４のうちの
いずれか１つを含むか；
２（ｇ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＣＤ３Ｅであり、ターゲティングドメインは、配列番
号５３３～配列番号８３９、もしくは配列番号１０６７７～配列番号１０７６４のうちの
いずれか１つを含むか；
２（ｈ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＣＤ３Ｇであり、ターゲティングドメインは、配列番
号８４０～配列番号９６８、もしくは配列番号１０７６５～配列番号１０７７９のうちの
いずれか１つを含むか；
２（ｉ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＨＬＡ－Ａであり、ターゲティングドメインは、配列
番号９６９～配列番号１３４５のうちのいずれか１つを含むか；
２（ｊ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＨＬＡ－Ｂであり、ターゲティングドメインは、配列
番号１３４６～配列番号１６９８のうちのいずれか１つを含むか；
２（ｋ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＨＬＡ－Ｃであり、ターゲティングドメインは、配列
番号１６９９～配列番号２０６８のうちのいずれか１つを含むか；
２（ｌ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＤＣＫであり、ターゲティングドメインは、配列番号
５２７８～配列番号５４９１のうちのいずれか１つを含むか；
２（ｍ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＣＤ５２であり、ターゲティングドメインは、配列番
号６２２７～配列番号６３２４のうちのいずれか１つを含むか；
２（ｎ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＦＫＢＰ１Ａであり、ターゲティングドメインは、配
列番号６３２５～配列番号６５８３、もしくは配列番号６６６２～配列番号６７４９のう
ちのいずれか１つを含むか；
２（ｏ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＮＲ３Ｃ１であり、ターゲティングドメインは、配列
番号２０６９～配列番号２９４１のうちのいずれか１つを含むか；
２（ｐ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＣＩＩＴＡであり、ターゲティングドメインは、配列
番号６７５０～配列番号７７１６、もしくは配列番号７７１７～配列番号７８０４のうち
のいずれか１つを含むか；または
２（ｑ）同種異系Ｔ細胞標的は、ＮＬＲＣ５であり、ターゲティングドメインは、配列
番号８６２２～配列番号１００８９のうちのいずれか１つを含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的は、ＴＲＡＣであり
、ターゲティングドメインは、配列番号５５６９、配列番号５５８５、配列番号５５８７
、配列番号５５９２、配列番号５６０１、配列番号５５８９、配列番号５６００、配列番
号５５９４、配列番号５５７１、配列番号５５９３、配列番号５５７４、配列番号５５９
８、配列番号５５８６、配列番号５５９９、配列番号５５９１、配列番号５６１０、配列
番号５６０８、配列番号５６１７、配列番号５６１９、または配列番号５６２０を含む、
例えば、ターゲティングドメインは、配列番号５５６９、配列番号５５８６、配列番号５
５８７、配列番号５５９２、配列番号５５９９、または配列番号５６００を含む、例えば
、ターゲティングドメインは、配列番号５５６９、配列番号５５８７、配列番号５５９２
、または配列番号５５８６を含む、例えば、ターゲティングドメインは、配列番号５５６
９を含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的は、ＴＲＢＣ２であ
り、ターゲティングドメインは、配列番号５７１９、配列番号５６９４、配列番号５７０
６、配列番号５６９６、配列番号５７１１、配列番号５７０８、配列番号５７０９、配列
番号５７１２、配列番号５７０３、配列番号５７０７、配列番号５６８７、配列番号５７
０５、配列番号５７１３、配列番号５７１５、または配列番号５７１０を含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的は、Ｂ２Ｍであり、
ターゲティングドメインは、配列番号５５１９、配列番号５４９７、配列番号５４９９、
配列番号５４９８、配列番号５５０３、配列番号５４９６、配列番号５５０７、配列番号
５５１５、配列番号５４９３、配列番号５５０６、配列番号５５０９、配列番号５５１７
、配列番号５５２１、配列番号５５２０、配列番号５５００、配列番号５４９４、配列番
号５５０８、配列番号５５１４、または配列番号５４９２を含む、例えば、ターゲティン
グドメインは、配列番号５４９６、配列番号５４９８、または配列番号５５０９を含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的は、ＣＩＩＴＡであ
り、ターゲティングドメインは、配列番号７７７１、配列番号７７６９、配列番号７７７
３、配列番号７７２６、配列番号７７５８、配列番号７７３９、配列番号７７７９、配列
番号７７７０、配列番号７７４９、配列番号７７５４、配列番号７７４５、配列番号７７
８５、配列番号７７３１、配列番号７７７２、配列番号７７４３、または配列番号７７５
０を含む、例えば、ターゲティングドメインは、配列番号７７６９、配列番号７７７１、
配列番号７７３９、または配列番号７７８５を含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的は、ＣＤ３Ｅであり
、ターゲティングドメインは、配列番号１０７２９、配列番号１０７１９、配列番号１０
７６４、配列番号１０７８９、配列番号１０７０１、配列番号１０７００、または配列番
号１０７２２を含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的は、ＦＫＢＰ１Ａで
あり、ターゲティングドメインは、配列番号６６９３、配列番号６７０５、配列番号６６
９４、配列番号６７０８、または配列番号６６９９を含む。
第２の態様では、本発明は、ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、
ｃｒＲＮＡが、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬ
Ａ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣ
ＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ
４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶ
ＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨ
ＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータ、またはＰＴＰＮ１１から選
択される阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの標
的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ分子を提供する。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態では、
１５（ａ）阻害性分子は、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）であり、ターゲティングドメイン
は、配列番号２９４２～配列番号３２７０のうちのいずれか１つを含むか；
１５（ｂ）阻害性分子は、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）であり、ターゲティングドメイン
は、配列番号３２７１～配列番号３５４１のうちのいずれか１つを含むか；
１５（ｃ）阻害性分子は、ＬＡＧ３であり、ターゲティングドメインは、配列番号３５
４２～配列番号４０３２のうちのいずれか１つを含むか；
１５（ｄ）阻害性分子は、ＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）であり、ターゲティングドメインは
、配列番号４０３３～配列番号４５８９、もしくは配列番号５７２０～配列番号５８１５
のうちのいずれか１つを含むか；または
１５（ｅ）阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターは、ＰＴＰＮ１であ
り、ターゲティングドメインは、配列番号４５９０～配列番号５２７７のうちのいずれか
１つを含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態では、阻害性分子は、ＰＤＣＤ１であり、ター
ゲティングドメインは、配列番号５７４３、配列番号５７９８、配列番号５７４８、配列
番号５７２２、配列番号５８００、配列番号５７３５、配列番号５７２４、配列番号５７
３１、配列番号５７２５、配列番号５７７５、配列番号５７６６、配列番号５７２７、配
列番号５７４４、配列番号５７５１、または配列番号５７３４を含む、例えば、ターゲテ
ィングドメインは、配列番号５７７５を含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ターゲティングドメインは、列挙されたター
ゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、２０、２１（基準
配列内に存在する場合）、２２（基準配列内に存在する場合）、２３（基準配列内に存在
する場合）、２４（基準配列内に存在する場合）、または２５（基準配列内に存在する場
合）の連続核酸を含む。ｇＲＮＡ分子についての前述の複数の態様および複数の実施形態
のうちのいずれかを含む、他の実施形態では、ターゲティングドメインは、列挙されたタ
ーゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、２０、２１（基
準配列内に存在する場合）、２２（基準配列内に存在する場合）、２３（基準配列内に存
在する場合）、または２４（基準配列内に存在する場合）、または２５（基準配列内に存
在する場合）の連続核酸からなる。ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前
述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む実施形態では、列挙された
ターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、２０、２１（
基準配列内に存在する場合）、２２（基準配列内に存在する場合）、２３（基準配列内に
存在する場合）、または２４（基準配列内に存在する場合）、または２５（基準配列内に
存在する場合）の連続核酸は、列挙されたターゲティングドメイン配列の３’末端に配置
された、１７、１８、１９、２０、２１（基準配列内に存在する場合）、２２（基準配列
内に存在する場合）、２３（基準配列内に存在する場合）、または２４（基準配列内に存
在する場合）、または２５（基準配列内に存在する場合）の連続核酸である。ｇＲＮＡ分
子についての前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む、他の実施
形態では、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８
、１９、２０、２１（基準配列内に存在する場合）、２２（基準配列内に存在する場合）
、２３（基準配列内に存在する場合）、または２４（基準配列内に存在する場合）、また
は２５（基準配列内に存在する場合）の連続核酸は、列挙されたターゲティングドメイン
配列の５’末端に配置された、１７、１８、１９、２０、２１（基準配列内に存在する場
合）、２２（基準配列内に存在する場合）、２３（基準配列内に存在する場合）、または
２４（基準配列内に存在する場合）、または２５（基準配列内に存在する場合）の連続核
酸である。ｇＲＮＡ分子についての前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいず
れかを含む、他の実施形態では、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれ
か１つの、１７、１８、１９、２０、２１（基準配列内に存在する場合）、２２（基準配
列内に存在する場合）、２３（基準配列内に存在する場合）、または２４（基準配列内に
存在する場合）、または２５（基準配列内に存在する場合）の連続核酸は、列挙されたタ
ーゲティングドメイン配列の５’または３’核酸を含まない。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ターゲティングドメインは、列挙されたター
ゲティングドメイン配列からなる。
ｇＲＮＡ分子についての以下の一般的な態様は組み合わせてもよく、単独であってもよ
く、または本明細書で記載されるターゲティングドメイン、例えば、前述の複数の態様お
よび複数の実施形態のうちのいずれかに列挙されるターゲティングドメインを含むｇＲＮ
Ａのうちのいずれかとの組合せであってもよい。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｃｒＲＮＡの部分と、ｔｒａｃｒの部分とは
、ハイブリダイズして、配列番号６５８４または配列番号６５８５を含むフラッグポール
を形成する。他の実施形態では、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分に
対して３’側に位置する、第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッ
グポール伸長部は、配列番号６５８６を含む。他の実施形態では、フラッグポールは、フ
ラッグポールのｃｒＲＮＡ部分と、存在する場合、第１のフラッグポール伸長部とに対し
て３’側に位置する、第２のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第２のフラッグポ
ール伸長部は、配列番号６５８７を含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｔｒａｃｒは、
（ａ）任意選択で、３’末端において、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ
、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む配列番号７８２０；
（ｂ）配列番号６６６０；または
（ｃ）配列番号６６６１
を含む、例えば、これからなる。このような実施形態では、フラッグポールのｃｒＲＮＡ
部分は、配列番号６６０７または配列番号６６０８を含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｔｒａｃｒは、配列番号６５８９または配列
番号６５９０と、任意選択で、第１のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号６
５８９または配列番号６５９０に対して５’側に配置された、第１のｔｒａｃｒ伸長部と
を含み、前記第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号６５９１を含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒとは
、別個の核酸分子上に配置される。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’から３’へと、［ターゲ
ティングドメイン］－：
ａ）配列番号６５８４；
ｂ）配列番号６５８５；
ｃ）配列番号６６０５；
ｄ）配列番号６６０６；
ｅ）配列番号６６０７；
ｆ）配列番号６６０８；または
ｇ）配列番号７８０６
を含む（例えば、これからなる）。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｔｒａｃｒは、５’から３’へと：
ａ）配列番号６５８９；
ｂ）配列番号６５９０；
ｃ）配列番号６６０９；
ｄ）配列番号６６１０；
ｅ）配列番号６６６０；
ｆ）配列番号６６６１；
ｇ）配列番号７８２０；
ｈ）配列番号７８０７；
ｉ）配列番号７８０８；
ｊ）配列番号７８０９；
ｋ）３’末端において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７
つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もし
くは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）～ｊ）のうちのいずれ
か；
ｌ）３’末端において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７
つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もし
くは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）～ｋ）のうちのいずれ
か；または
ｍ）５’末端（end）（例えば、５’末端（terminus））において、少なくとも１つ、
２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、
１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさ
らに含む、上記のａ）～ｌ）のうちのいずれか
を含む（例えば、これからなる）。
ｇＲＮＡ分子についての好ましい実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実
施形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒと
は、別個の核酸分子上に配置され、ターゲティングドメインを含む核酸分子は、任意選択
で、ターゲティングドメインに対してすぐ３’側に配置された配列番号６６０７を含み、
ｔｒａｃｒを含む核酸分子は、配列番号６６６０を含む、例えば、これからなる。
ｇＲＮＡ分子についての前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含
む、他の実施形態では、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子上
に配置され、ｔｒａｃｒは、ターゲティングドメインに対して３’側に配置されている。
ｇＲＮＡ分子についてのこのような実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実
施形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、ターゲティングドメイン
に対して３’側に配置され、かつ、ｔｒａｃｒに対して５’側に配置されたループ、例え
ば、配列番号６５８８を含む（例えば、これからなる）ループをさらに含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’へと、［ター
ゲティングドメイン］－：
（ａ）配列番号６６０１；
（ｂ）配列番号６６０２；
（ｃ）配列番号６６０３；
（ｄ）配列番号６６０４；
（ｅ）配列番号７８１１；または
（ｆ）３’末端において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラ
シル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記の(ａ）～（ｅ）のうちのいずれか
を含む（例えば、これからなる）。
ｇＲＮＡ分子についての好ましい実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実
施形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒと
は、単一の核酸分子上に配置され、前記核酸分子は、前記ターゲティングドメインと、任
意選択で、前記ターゲティングドメインに対してすぐ３’側に配置された配列番号６６０
１とを含む、例えば、これからなる。
ｇＲＮＡ分子についての好ましい実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実
施形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒと
は、単一の核酸分子上に配置され、前記核酸分子は、前記ターゲティングドメインと、任
意選択で、前記ターゲティングドメインに対してすぐ３’側に配置された配列番号７８１
１とを含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、非修飾ＲＮＡヌクレオチドと、核酸結合とから
なる。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書で記載される、１または複
数の修飾を含有する。ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態
様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｇＲＮＡ分子の核酸分子
のうちの１つ、または、任意選択で、１つを超えるものは、
ａ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端における、ある、例えば３つのホスホロ
チオエート（phosphorothioate）修飾；
ｂ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端における、ある、例えば３つのホスホロ
チオエート（phosphorothioate）修飾；
ｃ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端における、ある、例えば３つの２’－Ｏ
－メチル修飾；
ｄ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端における、ある、例えば３つの２’－Ｏ
－メチル修飾；
ｅ）前記１つまたは複数の核酸分子の、末端に対して４つ目、末端に対して３つ目、お
よび末端に対して２つ目の３’残基の各々における２’－Ｏ－メチル修飾；または
ｆ）これらの任意の組合せ
を含む。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載され
る）を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ、例えば、例えば、本
明細書で記載されるＣａｓ９分子を含むＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、ｇＲＮＡ分子
のターゲティングドメインに相補的な標的配列またはこの近傍において、インデルが形成
される。複数の実施形態では、インデルは、フレームシフト突然変異である。複数の実施
形態では、インデルは、図３４Ａ、図３４Ｂ、図３６、図３８、図４１、図４４、図４８
、図４９、図５０、または図５３のうちのいずれかに列挙されるインデルである。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載され
る）を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ、例えば、例えば、本
明細書で記載されるＣａｓ９分子を含むＲＮＰ）を、細胞集団へと導入すると、集団の細
胞のうちの、少なくとも約４０％、例えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約
６０％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくと
も約９０％、例えば、少なくとも約９５％、例えば、少なくとも約９６％、例えば、少な
くとも約９７％、例えば、少なくとも約９８％、例えば、少なくとも約９９％の中の、ｇ
ＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な標的配列またはこの近傍において、イン
デルが形成される。複数の実施形態では、集団の細胞のうちの、少なくとも約２０％、例
えば、少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約３５％、例えば、少なくとも約４０％
、例えば、少なくとも約４５％、例えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約５
５％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約６５％、例えば、少なくとも
約７０％、例えば、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なく
とも約８５％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、例えば、少
なくとも約９９％の中の、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な標的配列ま
たはこの近傍において、フレームシフト突然変異であるインデルが形成される。複数の実
施形態では、集団の細胞のうちの、少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、
例えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０
％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約
９５％、例えば、少なくとも約９６％、例えば、少なくとも約９７％、例えば、少なくと
も約９８％、例えば、少なくとも約９９％の中で、インデルは、図３４Ａ、図３４Ｂ、図
３６、図３８、図４１、図４４、図４８、図４９、図５０、または図５３のうちのいずれ
かに列挙されるインデルである。複数の実施形態では、前記細胞集団内で最も高頻度で検
出される５つのインデルは、図３４Ａ、図３４Ｂ、図３６、図３８、図４１、図４４、図
４８、図４９、図５０、または図５３のうちのいずれかに列挙される任意のｇＲＮＡと関
連するインデルのうちの３つ以上、例えば、４つ、例えば、５つを含む。インデルまたは
インデルのパターンは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により、測定および／または例
えば定量化される通りである。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載され
る）を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ、例えば、例えば、本
明細書で記載されるＣａｓ９分子を含むＲＮＰ）を、本明細書で記載される細胞（または
細胞集団）へと導入すると、前記細胞内で、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相
補的な標的配列を含む遺伝子の発現は、低減されるか、または消失する。複数の実施形態
では、集団の細胞のうちの、少なくとも約４０％、例えば、少なくとも約５０％、例えば
、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例
えば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、例えば、少なくとも約９６％
、例えば、少なくとも約９７％、例えば、少なくとも約９８％、例えば、少なくとも約９
９％の中で、前記遺伝子の発現は、低減されるか、または消失する。複数の実施形態では
、低減されるか、または消失する発現は、フローサイトメトリーにより測定される。他の
実施形態では、例えば、ＦＫＢＰ１Ａの場合、発現の低減または消失は、例えば、本明細
書で記載される、機能アッセイにより測定される。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載され
る）を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ、例えば、例えば、本
明細書で記載されるＣａｓ９分子を含むＲＮＰ）を、本明細書で記載される細胞へと導入
すると、前記細胞内で、例えば、本明細書で記載される、例えば、次世代シーケンシング
および／またはヌクレオチド挿入アッセイにより検出可能なオフターゲットインデルは形
成されない。
ｇＲＮＡ分子についての複数の実施形態であって、前述の複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかを含む実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載され
る）を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ、例えば、例えば、本
明細書で記載されるＣａｓ９分子を含むＲＮＰ）を、本明細書で記載される細胞集団へと
導入すると、例えば、次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイに
より検出可能なオフターゲットインデルは、細胞集団の細胞のうちの約５％以下、例えば
、約１％以下、例えば、約０．１％以下、例えば、約０．０１％以下の中で検出される。
細胞についての前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、細胞は
、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞であり、例えば、ヒト細胞である（または細胞集団
は、これらを含む）。細胞についての前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのい
ずれかでは、細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり、例
えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合せで
ある（または細胞集団は、これらを含む）。
細胞についての前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、細胞（
または細胞集団）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されているか、
または操作されることになる。複数の実施形態では、ＣＡＲは、
（ａ）ＣＤ１９ ＣＡＲ；または
（ｂ）ＢＣＭＡ ＣＡＲ
である。複数の実施形態では、
（ａ）ＣＡＲは、配列番号７８８３～配列番号７８９８のうちのいずれか１つを含む抗
原結合性ドメインを含むＣＤ１９ ＣＡＲであるか；
（ｂ）ＣＡＲは、配列番号７９０９または配列番号７９２０を含むＣＤ１９ ＣＡＲで
あるか；
（ｃ）ＣＡＲは、配列番号７９３９～配列番号８１１２のうちのいずれか１つを含む抗
原結合性ドメインを含む、例えば、配列番号７９４９の抗原結合性ドメインを含むＢＣＭ
Ａ ＣＡＲであるか；または
（ｄ）ＣＡＲは、配列番号８５４９～配列番号８６２１のうちのいずれか１つを含む、
例えば、配列番号８５５９を含むＢＣＭＡ ＣＡＲである。
細胞についての前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、細胞は
、前記細胞を投与される患者に関して同種異系である。他の実施形態では、細胞は、前記
細胞を投与される患者に関して自家である。
別の態様では、本発明は、Ｃａｓ９分子をさらに含む、前出の複数の態様および複数の
実施形態のうちのいずれかの、第１のｇＲＮＡ分子を含む組成物を提供する。複数の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１、または配列番号７８２１～配列番号７８
３１のうちのいずれか１つを含む、例えば、これからなる。複数の実施形態では、Ｃａｓ
９分子は、活性または不活性の化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９である。好ましい
実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（Ｒ
ＮＰ）内に存在する。
複数の態様では、組成物は、１つを超えるｇＲＮＡ分子、例えば、それらの各々を、本
明細書で記載されるＣａｓ９分子と複合体化させた、１つを超えるｇＲＮＡ分子を含みう
る。例えば、複数の実施形態では、組成物は、第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子
および第３のｇＲＮＡ分子；または第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子、および第
４のｇＲＮＡ分子をさらに含み、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場
合）、および第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）は、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分
子、例えば、前出の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子で
あり、組成物の各ｇＲＮＡ分子は、異なる標的配列に相補的である（すなわち、異なるタ
ーゲティングドメインを含む）。複数の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲ
ＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および第４のｇＲＮＡ分子（存在する
場合）は、同じ遺伝子内の標的配列に相補的である。このような実施形態では、第１のｇ
ＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および第４の
ｇＲＮＡ分子（存在する場合）は、２００００ヌクレオチド以下、１００００ヌクレオチ
ド以下、６０００以下、５０００ヌクレオチド以下、４０００以下、１０００ヌクレオチ
ド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、
２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレ
オチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４
０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、または１０ヌクレ
オチド以下だけ隔たった標的配列に相補的である。他の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分
子、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および第４のｇＲＮＡ
分子（存在する場合）は、異なる遺伝子内または異なる遺伝子座内の標的配列、例えば、
本明細書で記載される異なる遺伝子内の標的配列に相補的である。
複数の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、２（ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｄ
）、２（ｅ）、２（ｆ）、２（ｇ）、または２（ｈ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子で
あり；第２のｇＲＮＡ分子は、２（ａ）、２（ｉ）、２（ｊ）、２（ｋ）、または２（ｑ
）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子であり；第３のｇＲＮＡ分子は、１５（ａ）、１５（
ｂ）、１５（ｃ）、１５（ｄ）、または１５（ｅ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子であ
る。他の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、２（ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｄ
）、２（ｅ）、２（ｆ）、２（ｇ）、または２（ｈ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子で
あり；第２のｇＲＮＡ分子は、２（ｌ）、２（ｍ）、２（ｎ）、または２（ｏ）のうちの
いずれかのｇＲＮＡ分子であり；第３のｇＲＮＡ分子は、１５（ａ）、１５（ｂ）、１５
（ｃ）、１５（ｄ）、または１５（ｅ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子である。他の実
施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、２（ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｄ）、２（ｅ
）、２（ｆ）、２（ｇ）、または２（ｈ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子であり；第２
のｇＲＮＡ分子は、２（ｌ）、２（ｍ）、２（ｎ）、または２（ｏ）のうちのいずれかの
ｇＲＮＡ分子である。他の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、２（ｂ）、２（ｃ）、
２（ｄ）、２（ｄ）、２（ｅ）、２（ｆ）、２（ｇ）、または２（ｈ）のうちのいずれか
のｇＲＮＡ分子であり；第２のｇＲＮＡ分子は、２（ａ）、２（ｉ）、２（ｊ）、または
２（ｋ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子である。他の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分
子は、２（ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｄ）、２（ｅ）、２（ｆ）、２（ｇ）、また
は２（ｈ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子であり；第２のｇＲＮＡ分子は、１５（ａ）
、１５（ｂ）、１５（ｃ）、１５（ｄ）、または１５（ｅ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ
分子である。他の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、１５（ａ）、１５（ｂ）、１５
（ｃ）、１５（ｄ）、または７（ｅ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子であり；第２のｇ
ＲＮＡ分子は、１５（ａ）、１５（ｂ）、１５（ｃ）、１５（ｄ）、または１５（ｅ）の
うちのいずれかのｇＲＮＡ分子である。前述の複数の実施形態のうちのいずれかの、複数
の実施形態では、第３のｇＲＮＡが、存在し、第３のｇＲＮＡ分子は、１５（ａ）、１５
（ｂ）、１５（ｃ）、１５（ｄ）、または１５（ｅ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子で
ある。複数の実施形態では、組成物は、前述のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様およ
び複数の実施形態のうちのいずれかの、２つのｇＲＮＡ分子からなる。複数の実施形態で
は、組成物は、前述のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうち
のいずれかの、３つのｇＲＮＡ分子からなる。複数の実施形態では、組成物は、前述の複
数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの、第１のｇＲＮＡ分子であって、前記
第１のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインが、２（ａ）、２（ｉ）、２（ｊ）、また
は２（ｋ）のうちのいずれかのターゲティングドメインである第１のｇＲＮＡ分子と；前
述のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの、第
２のｇＲＮＡ分子であって、前記第２のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインが、２（
ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｆ）、２（ｇ）、２（ｈ）、または２（ｉ）のうちのい
ずれかのターゲティングドメインである第２のｇＲＮＡ分子とからなる。
複数の実施形態では、組成物は、２つのｇＲＮＡ分子を含み、前記第１のｇＲＮＡ分子
のターゲティングドメインは、配列番号５５１９、配列番号５４９７、配列番号５４９９
、配列番号５４９８、配列番号５５０３、配列番号５４９６、配列番号５５０７、配列番
号５５１５、配列番号５４９３、配列番号５５０６、配列番号５５０９、配列番号５５１
７、配列番号５５２１、配列番号５５２０、配列番号５５００、配列番号５４９４、配列
番号５５０８、配列番号５５１４、または配列番号５４９２を含み、例えば、これからな
り；前記第２のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、配列番号５５６９、配列番号
５５８５、配列番号５５８７、配列番号５５９２、配列番号５６０１、配列番号５５８９
、配列番号５６００、配列番号５５９４、配列番号５５７１、配列番号５５９３、配列番
号５５７４、配列番号５５９８、配列番号５５８６、配列番号５５９９、配列番号５５９
１、配列番号５６１０、配列番号５６０８、配列番号５６１７、配列番号５６１９、また
は配列番号５６２０を含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、組成物は、２つのｇＲＮＡ分子を含み、前記第１のｇＲＮＡ分子
のターゲティングドメインは、配列番号５４９６、配列番号５４９８、または配列番号５
５０９を含み、例えば、これからなり；前記第２のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイ
ンは、配列番号５５６９、配列番号５５８６、配列番号５５８７、配列番号５５９２、配
列番号５５９９、または配列番号５６００を含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、組成物は、２つのｇＲＮＡ分子を含み、前記第１のｇＲＮＡ分子
のターゲティングドメインは、配列番号５４９６、配列番号５４９８、または配列番号５
５０９を含み、例えば、これからなり；前記第２のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイ
ンは、配列番号５５６９を含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、組成物は、２つのｇＲＮＡ分子を含み、前記第１のｇＲＮＡ分子
のターゲティングドメインは、配列番号５４９６、配列番号５４９８、または配列番号５
５０９を含み、例えば、これからなり；前記第２のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイ
ンは、配列番号１０７２９、配列番号１０７１９、配列番号１０７６４、配列番号１０７
８９、配列番号１０７０１、配列番号１０７００、または配列番号１０７２２を含む、例
えば、これからなる。
前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では
、組成物は、本明細書で、例えば、前述のｇＲＮＡ分子についての複数の態様および複数
の実施形態のうちのいずれかで記載される、第３のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記第３
のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、２（ｎ）または２（ｑ）のうちのいずれか
のターゲティングドメインである。複数の実施形態では、前記第３のｇＲＮＡ分子のター
ゲティングドメインは、配列番号７７７１、配列番号７７６９、配列番号７７７３、配列
番号７７２６、配列番号７７５８、配列番号７７３９、配列番号７７７９、配列番号７７
７０、配列番号７７４９、配列番号７７５４、配列番号７７４５、配列番号７７８５、配
列番号７７３１、配列番号７７７２、配列番号７７４３、または配列番号７７５０を含む
、例えば、これからなる；例えば、配列番号７７６９、配列番号７７７１、配列番号７７
３９、または配列番号７７８５を含む（例えば、これからなる）。
前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では
、組成物は、本明細書で、例えば、前述のｇＲＮＡ分子についての複数の態様および複数
の実施形態のうちのいずれかで記載される、第４のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記第４
のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、ＮＫ阻害性分子の標的、例えば、ＬＩＬＲ
Ｂ１の標的配列に相補的である。複数の実施形態では、前記第４のｇＲＮＡ分子のターゲ
ティングドメインは、
ａ）配列番号１００９０～配列番号１０６７３のうちのいずれか１つ；
ｂ）配列番号１００９０～配列番号１０６７３のうちのいずれか１つの、１７、１８、
１９、２０、２１、２２、２３、または２４の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続
ヌクレオチド；
ｃ）配列番号１００９０～配列番号１０６７３のうちのいずれか１つの、５’側の１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレ
オチド；または
ｄ）配列番号１００９０～配列番号１０６７３のうちのいずれか１つの、３’側の１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレ
オチド
を含む、例えば、これからなる。
組成物についての複数の実施形態（前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのい
ずれかを含む）では、第１のｇＲＮＡ分子（本明細書で記載される）のターゲティングド
メインと、第２のｇＲＮＡ分子（本明細書で記載される）のターゲティングドメインと、
存在する場合、第３のｇＲＮＡ分子（本明細書で記載される）のターゲティングドメイン
とは、
ａ）表３３の組合せＡ１～組合せＡ７２；
ｂ）表３４の組合せＢ１～組合せＢ８４；
ｃ）表３５の組合せＣ１～組合せＣ４２；
ｄ）表３６の組合せＤ１～組合せＤ３６；
ｅ）表３７の組合せＥ１～組合せＥ３０；または
ｆ）表３８の組合せＦ１～組合せＦ６０
のうちのいずれかの配列
を含む、例えば、これからなる。
前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、前記ｇＲＮＡ分子の各
々は、本明細書で記載されるＣａｓ９分子と共に、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）内
にある。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子または組成物を、電気穿孔に適する培地中で製剤化
する。
前記ｇＲＮＡ分子の各々が、本明細書で記載されるＣａｓ９分子と共に、ＲＮＰ内にあ
る、複数の実施形態では、前記ＲＮＰ複合体の各々は、約１０ｕＭ未満、例えば、約３ｕ
Ｍ未満、例えば、約１ｕＭ未満、例えば、約０．５ｕＭ未満、例えば、約０．３ｕＭ未満
、例えば、約０．１ｕＭ未満の濃度である。
複数の実施形態では、組成物は、細胞、例えば、細胞集団、例えば、免疫エフェクター
細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞
をさらに含む。
別の態様では、本発明は、前出のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実
施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子、または前述の組成物についての、複数の態様お
よび複数の実施形態のうちのいずれかの組成物の（例えば、全ての）構成要素をコードす
る核酸を提供する。複数の実施形態では、核酸は、ｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動
可能に連結したプロモーターを含む。複数の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリ
メラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより認識されるプロモーターである。他
の実施形態では、プロモーターは、Ｕ６プロモーターまたはＨＩプロモーターである。複
数の実施形態では、核酸は、Ｃａｓ９分子をさらにコードする。複数の実施形態では、核
酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列に作動可能に連結したプロモーター、例えば、ＥＦ
－１プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ユビキ
チンＣプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む
。
別の態様では、本発明は、前述の核酸についての、複数の態様および複数の実施形態の
うちのいずれかの核酸を含むベクターを提供する。複数の実施形態では、ベクターは、レ
ンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクタ
ー、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラス
ミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、前述のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実
施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子と、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子
をコードする核酸とを含む組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、前述のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実
施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子と、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子
とをコードする核酸を含む組成物を提供する。
本発明の組成物のうちのいずれかについての複数の実施形態では、組成物は、鋳型核酸
をさらに含む。複数の実施形態では、鋳型核酸は、ｇＲＮＡ分子の標的配列のヌクレオチ
ドに対応するヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、鋳型核酸は、例えば、本明細書
で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む。複数の実施形態では
、ＣＡＲは、（ａ）例えば、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットもしくは
国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットにおいて記載されているＣＤ１９ Ｃ
ＡＲ；または（ｂ）例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ ＣＡＲ、例えば、配列番号
８５５９を含むＢＣＭＡ ＣＡＲである。複数の実施形態では、鋳型核酸は、例えば、本
明細書で記載される、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸を含む。
別の態様では、本発明は、細胞の標的配列を変更する、例えば、その構造、例えば配列
を変更する方法であって、前記細胞を、ａ）前出のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様
および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ
分子、ならびに、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子；ｂ）前出のｇＲＮＡ分子
についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば
、１つを超えるｇＲＮＡ分子、ならびに、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を
コードする核酸；ｃ）前出のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態
のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子をコードする核酸
、ならびに、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子；ｄ）前出のｇＲＮＡ分子につ
いての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば、１
つを超えるｇＲＮＡ分子をコードする核酸、ならびに、例えば、本明細書で記載されるＣ
ａｓ９分子をコードする核酸；ｅ）上記のａ）～ｄ）のうちのいずれか、および鋳型核酸
；ｆ）上記のａ）～ｄ）のうちのいずれか、および鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
；ｇ）前出の組成物についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの組
成物；またはｈ）前出のベクターについての、複数の態様および複数の実施形態のうちの
いずれかのベクターと接触させるステップを含む方法を提供する。複数の実施形態では、
ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子
をコードする核酸とを、単一の組成物中に製剤化する。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子
またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする
核酸とを、１つを超える組成物中に製剤化する。複数の実施形態では、１つを超える組成
物を、同時に、または逐次的に送達する、例えば、本明細書で記載される細胞へと、同時
に、または逐次的に送達する。複数の実施形態では、細胞は、動物細胞、例えば、哺乳動
物、霊長類、またはヒト細胞である。複数の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細
胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、
Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合せである。
複数の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ
）を発現するように操作されているか、または操作されることになる。複数の実施形態で
は、細胞は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むか、また
はこれらを含むことになる。複数の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書で記載され
るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むか、またはこれらを含むことにな
る。複数の実施形態では、ＣＡＲは、（ａ）ＣＤ１９ ＣＡＲ；または（ｂ）ＢＣＭＡ
ＣＡＲである。複数の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７８８３～配列番号７８９８の
うちのいずれか１つを含む抗原結合性ドメインを含むＣＤ１９ ＣＡＲである。複数の実
施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲであり、配列番号７９０８～配列番号７９２０
のうちのいずれか１つを含む。複数の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７９３９～配列
番号８１１２のうちのいずれか１つを含む抗原結合性ドメインを含むＢＣＭＡ ＣＡＲで
ある。複数の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ ＣＡＲであり、配列番号８５４９～配
列番号８６２１のうちのいずれか１つを含み、例えば、配列番号８５５９を含む。複数の
実施形態では、細胞は、前記細胞を投与される患者に関して同種異系である。複数の実施
形態では、細胞を、健常ヒトドナーから単離する。複数の実施形態では、細胞は、前記細
胞を投与される患者に関して自家である。
別の態様では、本発明は、前述の方法についての、複数の態様および複数の実施形態の
うちのいずれかの方法により変更された例えば、本明細書で記載される方法により変更さ
れた細胞を提供する。別の態様では、本発明は、前述のｇＲＮＡ分子についての、複数の
態様および複数の実施形態のうちのいずれかの、第１のｇＲＮＡ分子、または前述の組成
物についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの組成物、前述の核酸
についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの核酸、または前述のベ
クターについての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのベクターを含む
細胞を提供する。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子、組成物、核酸、またはベクターを
、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、前記細胞へと導入する。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子、
組成物、核酸、またはベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、前記細胞へと導入する。複
数の実施形態では、細胞は、動物細胞、例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞であ
る。複数の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細
胞の集団）、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細
胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合せである。複数の実施形態では、細胞は、例
えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されてい
るか、または操作されることになる。複数の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書で
記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むか、またはこれらを含むことになる。複数
の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を
コードする核酸を含むか、またはこれらを含むことになる。複数の実施形態では、ＣＡＲ
は、（ａ）ＣＤ１９ ＣＡＲ；または（ｂ）ＢＣＭＡ ＣＡＲである。複数の実施形態で
は、ＣＡＲは、配列番号７８８３～配列番号７８９８のうちのいずれか１つを含む抗原結
合性ドメインを含むＣＤ１９ ＣＡＲである。複数の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９
ＣＡＲであり、配列番号７９０８～配列番号７９２０のうちのいずれか１つを含む。複
数の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７９３９～配列番号８１１２のうちのいずれか１
つを含む抗原結合性ドメインを含むＢＣＭＡ ＣＡＲである。複数の実施形態では、ＣＡ
Ｒは、ＢＣＭＡ ＣＡＲであり、配列番号８５４９～配列番号８６２１のうちのいずれか
１つを含み、例えば、配列番号８５５９を含む。複数の実施形態では、細胞は、前記細胞
を投与される患者に関して同種異系である。複数の実施形態では、細胞を、健常ヒトドナ
ーから単離する。複数の実施形態では、細胞は、前記細胞を投与される患者に関して自家
である。複数の実施形態では、細胞は、請求項１から６０のいずれかの、第２のｇＲＮＡ
分子、または前述のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうちの
いずれかの、第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、含んでいるか、または含む
ことになり、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、同一でないターゲティン
グドメインを含む。複数の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、同種異系Ｔ細胞標的の
標的配列と相補的なターゲティングドメイン（例えば、表１、３、４、または５に記載さ
れているターゲティングドメイン）を含み、第２のｇＲＮＡ分子は、阻害性分子、または
阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの標的配列と相補的なターゲティ
ングドメインを含む（例えば、表２または表６に記載されているターゲティングドメイン
を含む）。複数の実施形態では、阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の
下流のエフェクターは、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２
、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／
またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６
０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１
）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラス
Ｉ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータ、またはＰＴＰＮ１
１である。複数の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢ
Ｃ２、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇの標的配列と相補的なターゲテ
ィングドメインを含み、第２のｇＲＮＡ分子は、ＮＬＲＣ５の標的配列と相補的なターゲ
ティングドメインを含む、例えば、配列番号８６２２～配列番号１００８９のうちのいず
れか１つを含む（例えば、これからなる）ターゲティングドメインを含む。複数の実施形
態では、第１のｇＲＮＡ分子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ２４７、ＣＤ
３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含み、
第２のｇＲＮＡ分子は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃの標的配列と
相補的なターゲティングドメインを含む。複数の実施形態では、細胞は、前述のｇＲＮＡ
分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの、第３のｇＲＮＡ
分子、または前述のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうちの
いずれかの、第３のｇＲＮＡ分子をコードする核酸をさらに含むか、含んでいるか、また
は含むことになり、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と、第３のｇＲＮＡ分子
とは、同一でないターゲティングドメインを含む。複数の実施形態では、第３のｇＲＮＡ
分子は、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、またはＲＦＸＡＰ、例えば、ＣＩＩＴＡ
の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含み、例えば、配列番号７７１７～配列
番号７８０４のうちのいずれか１つを含む、例えば、これからなるターゲティングドメイ
ンを含む、例えば、配列番号７７６９、配列番号７７７１、または配列番号７７８５のう
ちのいずれか１つを含む、例えば、これからなるターゲティングドメインを含む。複数の
実施形態では、細胞は、３つのｇＲＮＡ分子を含み、第１のｇＲＮＡ分子は、ＴＲＡＣの
標的配列と相補的なターゲティングドメインを含み；第２のｇＲＮＡ分子は、Ｂ２Ｍの標
的配列と相補的なターゲティングドメインを含み；第３のｇＲＮＡ分子は、ＣＩＩＴＡの
標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む。複数の実施形態では、細胞は、３つ
のｇＲＮＡ分子を含み、第１のｇＲＮＡ分子は、ＴＲＡＣの標的配列と相補的なターゲテ
ィングドメインを含み；第２のｇＲＮＡ分子は、ＮＬＲＣ５の標的配列と相補的なターゲ
ティングドメインを含み；第３のｇＲＮＡ分子は、ＣＩＩＴＡの標的配列と相補的なター
ゲティングドメインを含む。複数の実施形態では、細胞は、２つのｇＲＮＡ分子を含み、
第１のｇＲＮＡ分子は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、Ｃ
Ｄ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含み、第２のｇ
ＲＮＡ分子は、ＮＲ３Ｃ１、ＤＣＫ、ＣＤ５２またはＦＫＢＰ１Ａの標的配列と相補的な
ターゲティングドメインを含む。
ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載される、１つを超えるｇＲＮＡ分子）を含む細
胞についての複数の実施形態では、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１～配列番号８３、および配列番号５４９２～配
列番号５５２７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号９６９～配列番号１３４５からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含むか；
（３）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（４）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１６９９～配列番号２０６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（５）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２０６９～配列番号２９４１からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（６）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号５２７８～配列番号５４９１からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（７）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６２２７～配列番号６３２４からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（８）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６３２５～配列番号６５８３からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（９）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番
号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１～配列番号８３、および配列番号５４９２～配
列番号５５２７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（１０）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列
番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号９６９～配列番号１３４５からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（１１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列
番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１２）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列
番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１６９９～配列番号２０６８からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１３）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列
番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２０６９～配列番号２９４１からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１４）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列
番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号５２７８～配列番号５４９１からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１５）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列
番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６２２７～配列番号６３２４からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１６）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列
番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６３２５～配列番号６５８３からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１７）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１～配列番号８３、および配列番号５４９２～
配列番号５５２７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（１８）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号９６９～配列番号１３４５からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（１９）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（２０）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１６９９～配列番号２０６８からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（２１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２０６９～配列番号２９４１からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（２２）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号５２７８～配列番号５４９１からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（２３）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６２２７～配列番号６３２４からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（２４）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６３２５～配列番号６５８３からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（２５）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１～配列番号
８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択されるターゲティ
ングドメインを含むか；
（２６）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号９６９～配列
番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２７）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１３４６～配
列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２８）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１６９９～配
列番号２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２９）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２０６９～配
列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３０）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号５２７８～配
列番号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６２２７～配
列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３２）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６３２５～配
列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３３）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１～配列番
号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択されるターゲテ
ィングドメインを含むか；
（３４）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号９６９～配
列番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３５）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１３４６～
配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３６）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１６９９～
配列番号２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３７）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２０６９～
配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３８）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号５２７８～
配列番号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３９）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６２２７～
配列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（４０）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６３２５～
配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（４１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１～配列番
号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択されるターゲテ
ィングドメインを含むか；
（４２）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号９６９～配
列番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（４３）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１３４６～
配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（４４）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１６９９～
配列番号２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（４５）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２０６９～
配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（４６）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号５２７８～
配列番号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（４７）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６２２７～
配列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（４８）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６３２５～
配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（４９）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１～配列番
号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択されるターゲテ
ィングドメインを含むか；
（５０）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号９６９～配
列番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（５１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１３４６～
配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（５２）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号１６９９～
配列番号２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（５３）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２０６９～
配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（５４）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号５２７８～
配列番号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（５５）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６２２７～
配列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；または
（５６）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号６３２５～
配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングドメインを含む。
前述の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む、複数
の実施形態では、細胞は、阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流の
エフェクターの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子を
さらに含み、阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクター
は、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥ
ＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ
－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８
０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮ
ＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩ
Ｉ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータ、またはＰＴＰＮ１１であり、例えば、
第３のｇＲＮＡ分子は、１５（ａ）～１５（ｅ）のうちのいずれかのターゲティングドメ
インを含む。
ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載される、１つを超えるｇＲＮＡ分子）を含む細
胞についての複数の実施形態では、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２９４２～配列番号３２７０からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（２）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（３）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（４）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４０３３～配列番号４５８９、および配列番号５
７２０～配列番号５８１５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（５）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番
号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４５９０～配列番号５２７７からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（６）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番
号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２９４２～配列番号３２７０からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（７）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番
号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（８）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番
号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；
（９）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番
号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み
、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４０３３～配列番号４５８９、および配列番号５
７２０～配列番号５８１５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（１０）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列
番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４５９０～配列番号５２７７からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２９４２～配列番号３２７０からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１２）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１３）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１４）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４０３３～配列番号４５８９、および配列番号
５７２０～配列番号５８１５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか
；
（１５）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４５９０～配列番号５２７７からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；
（１６）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２９４２～配
列番号３２７０からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（１７）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３２７１～配
列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（１８）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３５４２～配
列番号４０３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（１９）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４０３３～配
列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から選択される
ターゲティングドメインを含むか；
（２０）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４５９０～配
列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２９４２～
配列番号３２７０からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２２）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３２７１～
配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２３）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３５４２～
配列番号４０３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２４）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４０３３～
配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から選択され
るターゲティングドメインを含むか；
（２５）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４５９０～
配列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２６）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２９４２～
配列番号３２７０からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２７）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３２７１～
配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２８）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３５４２～
配列番号４０３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（２９）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４０３３～
配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から選択され
るターゲティングドメインを含むか；
（３０）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４５９０～
配列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号２９４２～
配列番号３２７０からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３２）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３２７１～
配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３３）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号３５４２～
配列番号４０３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（３４）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４０３３～
配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から選択され
るターゲティングドメインを含むか；または
（３５）第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号４５９０～
配列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含む。
細胞についての複数の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインと
、第２のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインと、存在する場合、第３のｇＲＮＡ分子
のターゲティングドメインとは、
ｇ）表３３の組合せＡ１～組合せＡ７２；
ｈ）表３４の組合せＢ１～組合せＢ８４；
ｉ）表３５の組合せＣ１～組合せＣ４２；
ｊ）表３６の組合せＤ１～組合せＤ３６；
ｋ）表３７の組合せＥ１～組合せＥ３０；または
ｌ）表３８の組合せＦ１～組合せＦ６０
のうちのいずれかの配列
を含む、例えば、これからなる。
細胞についての複数の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５６９、配列
番号５５９２、または配列番号５５８６を含むターゲティングドメインを含み、第２のｇ
ＲＮＡ分子は、配列番号５７７５を含むターゲティングドメインを含む。
前述の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、第１の
ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子、および、任意
選択で、第２のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子
、および／または第３のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な標的配列を含
む遺伝子を、第１のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺
伝子、および、任意選択で、第２のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な標
的配列を含む遺伝子の機能的産物、ならびに／または第３のｇＲＮＡ分子のターゲティン
グドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の機能的産物の発現を、低減するか、または
消失させるように変更している。
別の態様では、本発明は、対象において抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、対象へと
、有効量の、本明細書で記載される細胞、例えば、前述の細胞についての、複数の態様お
よび複数の実施形態のうちのいずれかの細胞を投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、対象におけるがんを処置する方法であって、対象へと、有効
量の、本明細書で記載される細胞、例えば、前述の細胞についての、複数の態様および複
数の実施形態のうちのいずれかの細胞を投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、増殖性疾患、前が
ん性状態、がん、および腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症を有する対象を処置
する方法であって、対象へと、有効量の、本明細書で記載される細胞、例えば、前述の細
胞についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの細胞を投与するステ
ップを含む方法を提供する。複数の実施形態では、腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、が
んまたは非がん関連適応症である。複数の実施形態では、疾患は、結腸がん、直腸がん、
腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、
皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛
門領域がん、胃がん、精巣がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキ
ン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組
織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児充実性腫瘍、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、
中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹
神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境
誘導性がん、前記がんの組合せ、および前記がんの転移性病変から選択されるがんである
。複数の実施形態では、がんは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リ
ンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リ
ンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ
）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細
胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫
、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリン
パ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシ
ュトロームマクログロブリン血症、および前白血病からなる群から選択される血液がんで
ある。
前述の方法のうちのいずれかについての、複数の実施形態では、方法は、化学療法剤、
例えば、シクロホスファミド、フルダラビン、またはシクロホスファミドおよびフルダラ
ビンを投与するステップをさらに含む。方法についての複数の実施形態では、方法は、対
象へと、有効量の、本明細書で記載される細胞、例えば、前述の細胞についての、複数の
態様および複数の実施形態のうちのいずれかの細胞を投与するステップの前に、リンパ球
枯渇剤または免疫抑制薬を投与するステップを含む。
別の態様では、本発明は、免疫療法のための細胞（例えば、細胞集団）を調製する方法
であって、（ａ）例えば、２ｂ～２ｈのうちのいずれかのｇＲＮＡ分子（本明細書で記載
される）、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、例えば、請求項３、４、５、１０、１１
または１２のいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子を、前記細胞
へと導入することによって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の発現を低減するか、ま
たは消失させることにより、細胞を改変するステップと；（ｂ）例えば、２ａ、２ｉ、２
ｊ、または２ｋのうちのいずれかのｇＲＮＡ分子（本明細書で記載される）、例えば、１
つを超えるｇＲＮＡ分子、例えば、請求項６または７のいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば
、１つを超えるｇＲＮＡ分子を、前記細胞へと導入することによって、ＨＬＡ（例えば、
ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、および／またはＨＬＡ－Ｃ）またはＢ２Ｍの発現を低減するか
、または消失させることにより、細胞を改変するステップと；（ｃ）前記細胞を拡大する
ステップとを含む方法を提供する。複数の実施形態では、方法は、例えば、ｇＲＮＡ分子
（本明細書で記載される）、例えば、２ｐの、１つを超えるｇＲＮＡ分子、例えば、請求
項８または９のいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子を、前記細
胞へと導入することによって、ＣＩＩＴＡの発現を低減するか、または消失させることに
より、細胞を改変するステップをさらに含み、この場合、前記細胞を拡大するステップの
前に、前記改変するステップを、任意選択で行う。
別の態様では、本発明は、免疫療法のための細胞（例えば、細胞集団）を調製する方法
であって、（ａ）例えば、２ｂ～２ｈのうちのいずれかのｇＲＮＡ分子（本明細書で記載
される）、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、例えば、請求項３、４、５、１０、１１
または１２のいずれかのｇＲＮＡ分子（本明細書で記載される）、例えば、１つを超える
ｇＲＮＡ分子を、前記細胞へと導入することによって、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要
素の発現を低減するか、または消失させることにより、細胞を改変するステップと；（ｂ
）例えば、２ｌ、２ｍ、２ｎ、または２ｏのうちのいずれかのｇＲＮＡ分子（本明細書で
記載される）、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子（本明細書で記載される）、例えば、
請求項１３のｇＲＮＡ分子（本明細書で記載される）、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分
子を、前記細胞へと導入することによって、免疫抑制薬の標的の発現を低減するか、また
は消失させることにより、細胞を改変するステップと；（ｃ）前記細胞を拡大するステッ
プとを含む方法を提供する。
細胞を調製する前述の方法のうちのいずれかについての複数の実施形態では、方法は、
（ｄ）例えば、請求項１４または１５のｇＲＮＡ分子（本明細書で記載される）、例えば
、１つを超えるｇＲＮＡ分子を、前記細胞へと導入することによって、第１の阻害性分子
、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの発現を低減するか、ま
たは消失させることにより、細胞を改変するステップをさらに含み、この場合、前記細胞
を拡大するステップの前に、前記改変するステップを、任意選択で行う。
別の態様では、本発明は、免疫療法のための細胞（例えば、細胞集団）を調製する方法
であって、（ａ）例えば、請求項１４のｇＲＮＡ分子（本明細書で記載される）、例えば
、１つを超えるｇＲＮＡ分子、例えば、請求項１５から１７のいずれかのｇＲＮＡ分子、
例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子を、前記細胞へと導入することによって、第１の阻害
性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの発現を低減する
か、または消失させることにより、細胞を改変するステップと；（ｃ）前記細胞を拡大す
るステップとを含む方法を提供する。
細胞を調製する前述の方法のうちのいずれかについての複数の実施形態では、方法は、
（ｅ）例えば、請求項１４または１５のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分
子を、前記細胞へと導入することによって、第２の阻害性分子、または阻害性分子を介す
るシグナル伝達の下流のエフェクターの発現を低減するか、または消失させることにより
、細胞を改変するステップをさらに含み、この場合、第１の阻害性分子、または阻害性分
子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターと、第２の阻害性分子、または阻害性分子
を介するシグナル伝達の下流のエフェクターとは異なる。
細胞を調製する前述の方法のうちのいずれかについての複数の実施形態では、ｇＲＮＡ
分子の各々の導入は、同時的または逐次的である。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の
各々の導入は、逐次的であり、少なくとも２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、
６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間隔てられる。
細胞を調製する前述の方法のうちのいずれかについての複数の実施形態では、方法は、
細胞へと、例えば、本明細書で記載される、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核
酸を導入するステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸を、
鋳型核酸上に配置する。複数の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸を、ＲＮＡベクタ
ー上に配置する。複数の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸を、レンチウイルスベク
ター上に配置する。
細胞を調製する前述の方法のうちのいずれかについての複数の実施形態では、方法は、
ＴＣＲの発現について陰性である細胞を単離するステップをさらに含む。複数の実施形態
では、単離するステップは、細胞のうちの、約７５％を超えるもの、例えば、約８０％、
８５％、９０％、９１％、９２％、９３、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％または９９．５％を超えるものが、ＴＣＲの発現について陰性である細胞集団を結果
としてもたらす。複数の実施形態では、ＴＣＲの発現について陰性である細胞を単離する
ステップは、細胞集団を、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素に特異的な抗体を含み、任
意選択で、固体支持体または検出用標識に結合させた組成物と接触させること、および前
記抗体に結合しない細胞を単離することを含む。複数の実施形態では、細胞は、免疫エフ
ェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、Ｔ細胞である。複数の実施形態
では、細胞は、それらが投与される対象に対して同種異系であり、例えば、細胞を、健常
ドナー、例えば、腫瘍抗原の発現と関連する状態を患っていないドナーから単離する。複
数の実施形態では、細胞は、それらが投与される対象に対して自家である。細胞を調製す
る前述の方法のうちのいずれかについての複数の実施形態では、ステップ（ａ）および／
または（ｂ）を、ｅｘ ｖｉｖｏで実施する。複数の実施形態では、ステップ（ｃ）を、
ｅｘ ｖｉｖｏで実施する。複数の実施形態では、ステップ（ｃ）の拡大を、少なくとも
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５日間に
わたり、または２～１５、２～１４、２～１３、２～１２、２～１１、２～１０、３～１
０、２～９、３～９、２～８、３～８、２～７、３～７、２～６、３～６、２～５、もし
くは３～５日間にわたり実施する。
細胞を調製する前述の方法のうちのいずれかについての複数の実施形態では、ｇＲＮＡ
分子は、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子であり、ｇＲＮＡ分子（例えば、組合せで使
用される）の各々のターゲティングドメインは、表３３、表３４、表３５、表３６、表３
７または表３８に列挙される組合せのうちのいずれかの配列を含む、例えば、これからな
る。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々のターゲティングドメインは、
ａ）表３３の組合せＡ１～組合せＡ７２、例えば、組合せＡ１～Ａ４、組合せＡ５～Ａ
８、組合せＡ３７～Ａ４０、または組合せＡ４１～Ａ４４；
ｂ）表３４の組合せＢ１～組合せＢ８４；
ｃ）表３５の組合せＣ１～組合せＣ４２；
ｄ）表３６の組合せＤ１～組合せＤ３６、例えば、組合せＤ２、組合せＤ４、組合せＤ
２０、または組合せＤ２２；
ｅ）表３７の組合せＥ１～組合せＥ３０、例えば、組合せＥ２、組合せＥ４、組合せＥ
８、または組合せＥ１０；または
ｆ）表３８の組合せＦ１～組合せＦ６０、例えば、組合せＦ１～Ｆ４、組合せＦ５～Ｆ
８、組合せＦ１３～Ｆ１６、または組合せＦ１７～Ｆ２０のうちのいずれか
のうちのいずれかの配列
を含む、例えば、これからなる。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象を処置する方法であって、本明細書で
記載される細胞を調製する方法、例えば、細胞を調製する方法についての、前述の複数の
態様および複数の実施形態のうちのいずれかの方法により調製された細胞（例えば、細胞
集団）を投与するステップを含む方法を提供する。複数の実施形態、特に、免疫抑制薬の
標的の標的配列に結合するｇＲＮＡ分子を含む、複数の実施形態では、方法は、免疫抑制
剤、例えば、ラパマイシン、ラパログ、またはｍＴｏｒ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を
投与するステップをさらに含む。複数の実施形態では、対象は、腫瘍抗原の発現と関連す
る疾患、例えば、増殖性疾患、前がん性状態、がん、および腫瘍抗原の発現と関連する非
がん関連適応症を有し、この場合、前記投与は、前記腫瘍抗原の発現と関連する疾患を処
置する。複数の実施形態では、腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、がんまたは非がん関連
適応症である。複数の実施形態では、疾患は、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん
、肺非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部が
ん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん
、精巣がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリ
ンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、
陰茎がん、小児充実性腫瘍、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ
）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺
腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘導性がん、前記が
んの組合せ、および前記がんの転移性病変から選択されるがんである。複数の実施形態で
は、がんは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬ
Ｌ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ－
ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ
球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ
細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫
、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、
多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリン
パ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログ
ロブリン血症、および前白血病からなる群から選択される血液がんである。
別の態様では、本発明は、疾患を患っている患者を処置する方法であって、
（ａ）同種異系ドナーに由来する細胞集団を用意するステップと；
（ｂ）細胞へと、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１
、およびＴＲＢＣ２から選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメイ
ンを含む、第１のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、Ｃ
ＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）
を導入するステップと；
（ｃ）任意選択で、機能的ＴＣＲの発現を低減したか、または消失させた細胞を選択す
るステップと；
（ｄ）細胞に、ＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップと；
（ｅ）細胞を、それを必要とする患者、例えば、ＣＡＲにより認識される抗原の発現と
関連する疾患を有する患者へと投与するステップと
を含む方法を提供する。複数の実施形態では、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３
Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２に対する第１のｇＲＮＡ分子は、２（ｂ）
～２（ｈ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子である、例えば、請求項３、４、５、１０、
１１または１２のいずれかのｇＲＮＡ分子である。
複数の実施形態では、疾患を患っている患者を処置する方法は、細胞へと、Ｂ２Ｍ、Ｈ
ＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃから選択される遺伝子内の標的配列に相補的なタ
ーゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードす
る核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によ
るＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップをさらに含む。複数の実施形態では、Ｂ２Ｍ、Ｈ
ＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃに対する第２のｇＲＮＡは、２（ａ）または２
（ｉ）～２（ｋ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子である、例えば、請求項６または７の
いずれかのｇＲＮＡ分子である。複数の実施形態では、方法は、細胞へと、ＣＩＩＴＡ、
ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸ５、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｈ
ＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＰから選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲテ
ィングドメインを含む、第３のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸
）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲ
ＩＳＰＲ系）を導入するステップをさらに含む。複数の実施形態では、第３のｇＲＮＡ分
子は、２（ａ）または２（ｉ）～２（ｋ）のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子である、例え
ば、請求項６または７のいずれかのｇＲＮＡ分子である。
他の実施形態では、疾患を患っている患者を処置する方法は、細胞へと、ＤＣＫ、ＣＤ
５２、ＦＫＢＰ１Ａ、またはＮＲ３Ｃ１から選択される遺伝子内の標的配列に相補的なタ
ーゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードす
る核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によ
るＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップをさらに含む。複数の実施形態では、ＤＣＫ、Ｃ
Ｄ５２、ＦＫＢＰ１Ａ、またはＮＲ３Ｃ１に対する第２のｇＲＮＡ分子は、２（ｌ）～２
（ｏ）のうちのいずれかの第２のｇＲＮＡ分子である、例えば、請求項１３の第２のｇＲ
ＮＡ分子である。第２のｇＲＮＡが、ＤＣＫに対するものであり、方法が、ヌクレオシド
類似体ベースの薬物を、前記患者へと投与するステップをさらに含む、複数の実施形態で
は、例えば、ヌクレオシド類似体ベースの薬物は、シタラビンまたはゲムシタビンである
。第２のｇＲＮＡが、ＣＤ５２に対するものであり、方法が、抗ＣＤ５２抗体またはその
抗原結合性断片を、前記患者へと投与するステップをさらに含む、複数の実施形態では、
例えば、抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合性断片は、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ
（登録商標））である。第２のｇＲＮＡが、ＦＫＢＰ１Ａに対する複数の実施形態では、
方法は、ＦＫ５０６、シクロスポリン、ラパマイシンもしくはラパログ、またはＲＡＤ０
０１などのｍＴｏｒ阻害剤を、前記患者へと投与するステップをさらに含む。第２のｇＲ
ＮＡが、ＮＲ３Ｃ１に対するものであり、方法が、コルチコステロイドを、前記患者へと
投与するステップをさらに含む、複数の実施形態では、例えば、コルチコステロイドは、
デキサメタゾンである。
前述の疾患を患っている患者を処置する方法のうちのいずれかについての、複数の実施
形態では、ｇＲＮＡ分子は、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子であり、ｇＲＮＡ分子（
例えば、組合せで使用される）の各々のターゲティングドメインは、表３３、表３４、表
３５、表３６、表３７または表３８に列挙される組合せのうちのいずれかの配列を含む、
例えば、これからなる。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々のターゲティングドメ
インは、
ａ）表３３の組合せＡ１～組合せＡ７２、例えば、組合せＡ１～Ａ４、組合せＡ５～Ａ
８、組合せＡ３７～Ａ４０、または組合せＡ４１～Ａ４４；
ｂ）表３４の組合せＢ１～組合せＢ８４；
ｃ）表３５の組合せＣ１～組合せＣ４２；
ｄ）表３６の組合せＤ１～組合せＤ３６、例えば、組合せＤ２、組合せＤ４、組合せＤ
２０、または組合せＤ２２；
ｅ）表３７の組合せＥ１～組合せＥ３０、例えば、組合せＥ２、組合せＥ４、組合せＥ
８、または組合せＥ１０；または
ｆ）表３８の組合せＦ１～組合せＦ６０、例えば、組合せＦ１～Ｆ４、組合せＦ５～Ｆ
８、組合せＦ１３～Ｆ１６、または組合せＦ１７～Ｆ２０のうちのいずれか
のうちのいずれかの配列
を含む、例えば、これからなる。
前述の疾患を患っている患者を処置する方法のうちのいずれかについての、複数の実施
形態では、方法は、細胞へと、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ
－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、お
よび／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、Ｃ
Ｄ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴ
ＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣ
クラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータ、またはＰＴ
ＰＮ１１から選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、
第４のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ
系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入する
ステップをさらに含み、例えば、第４のｇＲＮＡ分子は、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、Ｌ
ＡＧ３、ＰＤＣＤ１、またはＰＴＰＮ１１に対するもの、例えば、１５（ａ）～（ｅ）の
うちのいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば、請求項１６から１７のいずれかのｇＲＮＡ分子
である。
別の態様では、本発明は、疾患を患っている患者を処置する方法であって、
（ａ）細胞集団（本明細書で記載される）、例えば、免疫エフェクター細胞を用意する
ステップと；
（ｂ）細胞集団へと、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ
Ｃ１、およびＴＲＢＣ２から選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングド
メインを含む、第１のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む
、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ
系）を導入するステップと；
（ｃ）細胞集団へと、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃから選択さ
れる遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子
（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連
鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと；
（ｄ）任意選択で、機能的ＴＣＲ、機能的Ｂ２Ｍ、または機能的ＴＣＲおよびＢ２Ｍの
両方の発現を低減したか、または消失させた細胞を選択するステップと；
（ｄ）細胞集団へとＣＡＲをコードする核酸を導入するステップと；
（ｅ）細胞集団を、それを必要とする患者、例えば、ＣＡＲにより認識される抗原の発
現と関連する疾患を有する患者へと投与するステップと
を含む方法を提供する。方法についての複数の実施形態では、方法は、（ｆ）細胞集団へ
と、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、およびＲＦＸＡＰから選択される遺伝子内の
標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第３のｇＲＮＡ分子（または前記ｇ
ＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyo
genes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップをさらに含む。複数の実施
形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書で記載される、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ
１、およびＴＲＢＣ２から選択される遺伝子、例えば、ＴＲＡＣ内の標的配列に相補的な
ターゲティングドメインを含み、例えば、配列番号５５６９、配列番号５５８５、配列番
号５５９２、配列番号５６０１、配列番号５５８９、配列番号５６００、配列番号５５９
４、配列番号５５７１、配列番号５５９３、配列番号５５７４、配列番号５５９８、配列
番号５５８６、配列番号５５９９、配列番号５５９１、配列番号５６１０、配列番号５６
０８、配列番号５６１７、配列番号５６１９、および配列番号５６２０から選択されるタ
ーゲティングドメイン、例えば、配列番号５５６９、配列番号５５９２、配列番号５５８
７、配列番号５５９９、配列番号５６００、および配列番号５５８６から選択されるター
ゲティングドメイン、例えば、配列番号５５６９、配列番号５５８６、および配列番号５
５９２から選択されるターゲティングドメインを含む（例えば、これからなる）。他の実
施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書で記載される、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３
Ｇ、およびＣＤ３Ｄから選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメイ
ンを含む。複数の実施形態では、第２のｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書で記載される
Ｂ２Ｍ遺伝子であって、例えば、配列番号５５１９、配列番号５４９７、配列番号５４９
９、配列番号５４９８、配列番号５５０３、配列番号５４９６、配列番号５５０７、配列
番号５５１５、配列番号５４９３、配列番号５５０６、配列番号５５０９、配列番号５５
１７、配列番号５５２１、配列番号５５２０、配列番号５５００、配列番号５４９４、配
列番号５５０８、配列番号５５１４、および配列番号５４９２から選択されるターゲティ
ングドメイン、例えば、配列番号５４９６、配列番号５４９８、および配列番号５５０９
から選択されるターゲティングドメインを含む（例えば、これからなる）Ｂ２Ｍ遺伝子内
の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む。複数の実施形態では、第３のｇＲ
ＮＡ分子は、例えば、本明細書で記載されるＣＩＩＴＡ遺伝子であって、例えば、配列番
号７７７１、配列番号７７６９、配列番号７７７３、配列番号７７２６、配列番号７７５
８、配列番号７７３９、配列番号７７７９、配列番号７７７０、配列番号７７４９、配列
番号７７５４、配列番号７７４５、配列番号７７８５、配列番号７７３１、配列番号７７
７２、配列番号７７４３、または配列番号７７５０から選択されるターゲティングドメイ
ン、例えば、配列番号７７６９、配列番号７７７１、配列番号７７３９、または配列番号
７７８５から選択されるターゲティングドメインを含む（例えば、これからなる）ＣＩＩ
ＴＡ遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む。好ましい実施形態で
は、ｇＲＮＡ分子（例えば、組合せで使用される）の各々のターゲティングドメインは、
表３３、表３４、または表３８に列挙される組合せのうちのいずれかの配列を含む、例え
ば、これからなる。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々のターゲティングドメイン
は、
ａ）表３３の組合せＡ１～組合せＡ７２、例えば、組合せＡ１～Ａ４、組合せＡ５～Ａ
８、組合せＡ３７～Ａ４０、または組合せＡ４１～Ａ４４；
ｂ）表３４の組合せＢ１～組合せＢ８４；または
ｃ）表３８の組合せＦ１～組合せＦ６０、例えば、組合せＦ１～Ｆ４、組合せＦ５～Ｆ
８、組合せＦ１３～Ｆ１６、または組合せＦ１７～Ｆ２０のうちのいずれか
のうちのいずれかの配列
を含む、例えば、これからなる。
疾患を患っている患者を処置する方法についての複数の実施形態では、方法は、前記細
胞へと、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸分子（例えば、本明細書で記載される）、例え
ば、ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合体をコードする核酸分子、例えば、配列番号１０６７４をコ
ードする核酸分子を導入するステップをさらに含む。疾患を患っている患者を処置する方
法についての複数の実施形態では、細胞（または細胞集団）は、免疫エフェクター細胞（
または免疫エフェクター細胞の集団）、例えば、Ｔ細胞（またはＴ細胞の集団）である。
複数の実施形態では、細胞（または細胞集団）は、患者に対して同種異系である、例えば
、健常ヒトドナーから単離される。他の実施形態では、細胞（または細胞集団）は、患者
に対して自家である。複数の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、本明
細書で記載される）、例えば、配列番号７８８３～配列番号７８９８のうちのいずれか１
つを含む抗原結合性ドメインを含むＣＤ１９ ＣＡＲである。他の実施形態では、ＣＡＲ
は、例えば、配列番号７９３９～配列番号８１１２、または配列番号８１５５～配列番号
８１６６のうちのいずれか１つを含む抗原認識ドメインを含むＢＣＭＡ ＣＡＲである、
例えば、配列番号７９４９を含む、例えば、これからなる、例えば、配列番号８５４９～
配列番号８６２１のうちのいずれか１つを含む、例えば、配列番号８５５９を含む、例え
ば、これからなる抗原認識ドメインを含む。
別の態様では、本発明は、同じ種類の非改変細胞と比べて、ａ）Ｔ細胞受容体の構成要
素；ｂ）Ｂ２Ｍ；および／またはｃ）ＣＩＩＴＡの発現を低減したか、または消失させた
改変細胞を提供する。複数の実施形態では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、ＴＣＲアルファ
鎖またはＴＣＲベータ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖である。他の実施形態では、ＴＣＲ
の構成要素は、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、またはＣＤ３ガンマである、例えば、
ＣＤ３イプシロンである。複数の実施形態では、改変細胞（または細胞集団）は、Ｔ細胞
受容体の構成要素、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡの発現を、低減するか、または消失させて
いる。
別の態様では、本発明は、同じ種類の非改変細胞と比べて、ａ）Ｔ細胞受容体の構成要
素をコードする遺伝子；ｂ）Ｂ２Ｍ；および／もしくはｃ）ＣＩＩＴＡにおいて、または
この近傍において、塩基対、例えば、１つを超える塩基対の挿入または欠失を含む改変細
胞を提供する。複数の実施形態では、前記挿入または欠失の各々は、インデルである。複
数の実施形態では、前記挿入または欠失の各々は、フレームシフト突然変異である。複数
の実施形態では、改変細胞（または細胞集団）は、Ｔ細胞受容体の構成要素コードする遺
伝子、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡにおいて、またはこれらの近傍において、塩基対、例え
ば、１つを超える塩基対の挿入または欠失を含む。
別の態様では、本発明は、前述の細胞（例えば、改変細胞）についての、複数の態様お
よび複数の実施形態のいずれかの改変細胞を含み、細胞のうちの少なくとも約３０％にお
いて、少なくとも１つの前記挿入または欠失が、例えば、ＮＧＳにより測定されるフレー
ムシフト突然変異である細胞集団を提供する。
別の態様では、本発明は、
（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
（ｂ）任意選択で、例えば、本明細書で記載されるＮＫ阻害性分子をコードする核酸配
列、例えば、本明細書で記載される、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合体をコー
ドする核酸；
（ｃ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、Ｃ
Ｄ３Ｄ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺
伝子の配列におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例え
ば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｄ、またはＣＤ３Ｇ、例えば
、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表１、表４、表５、表６
ｅ、表６ｆ、または表６ｇに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的
配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；
（ｄ）Ｂ２Ｍまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまたはこの
近傍におけるインデル、例えば、Ｂ２Ｍに対するターゲティングドメインを含む、例えば
、表１または表３に列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列にお
けるまたはこの近傍におけるインデル；
（ｅ）任意選択で、ＣＩＩＴＡまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列に
おけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＣＩＩＴＡに対するターゲティングド
メインを含む、例えば、表１または表６ｃに列挙されるターゲティングドメインを含む、
ｇＲＮＡの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；および
（ｆ）任意選択で、ＬＩＬＲＢ１またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列
におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＬＩＬＲＢ１に対するターゲティン
グドメインを含む、例えば、表６ｄに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮ
Ａの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル
を含む細胞であって、
細胞（または前記細胞を含む細胞集団）が、ＣＡＲと、任意選択で、ＮＫ阻害性分子と
を発現し、ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３
Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）、ｉｉ）Ｂ２Ｍ、ｉｉｉ）ＣＩＩＴ
Ａ、および／またはｉｖ）ＬＩＬＲＢ１のうちの１または複数の発現および／または機能
の、低減または消失を呈示する、
細胞（例えば、これらを含む細胞、例えば、１つを超える細胞を含む細胞集団）を提供す
る。複数の実施形態では、ＴＣＲの構成要素、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡに対するｇＲＮ
Ａ分子（本明細書で記載される）のターゲティングドメイン配列は、表３３、表３４また
は表３８に列挙される、任意の組合せ、例えば、
ａ）表３３の組合せＡ１～組合せＡ７２、例えば、組合せＡ１～Ａ４、組合せＡ５～Ａ
８、組合せＡ３７～Ａ４０、または組合せＡ４１～Ａ４４；
ｂ）表３４の組合せＢ１～組合せＢ８４；または
ｃ）表３８の組合せＦ１～組合せＦ６０、例えば、組合せＦ１～Ｆ４、組合せＦ５～Ｆ
８、組合せＦ１３～Ｆ１６、または組合せＦ１７～Ｆ２０のうちのいずれか
に列挙されるターゲティングドメインを含む、例えば、これらからなる。
別の態様では、本発明は、
（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
（ｂ）任意選択で、例えば、本明細書で記載されるＮＫ阻害性分子をコードする核酸配
列、例えば、本明細書で記載される、ＨＬＡ－Ｇをコードする核酸；
（ｃ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、Ｃ
Ｄ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺
伝子の配列におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例え
ば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば
、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表１、表４、表５、表６
ｅ、表６ｆ、または表６ｇに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的
配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；
（ｄ）ＮＬＲＣ５またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまたは
この近傍におけるインデル、例えば、ＮＬＲＣ５に対するターゲティングドメインを含む
、例えば、表１に列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列におけ
るまたはこの近傍におけるインデル；
（ｅ）任意選択で、ＣＩＩＴＡまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列に
おけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＣＩＩＴＡに対するターゲティングド
メインを含む、例えば、表１または表６ｃに列挙されるターゲティングドメインを含む、
ｇＲＮＡの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；および
（ｆ）任意選択で、ＬＩＬＲＢ１またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列
におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＬＩＬＲＢ１に対するターゲティン
グドメインを含む、例えば、表６ｄに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮ
Ａの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル
を含む細胞であって、
細胞（または前記細胞のうちの１もしくは複数を含む細胞集団）が、ＣＡＲと、任意選
択で、ＮＫ阻害性分子とを発現し、ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ
１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）、ｉｉ）Ｂ
２Ｍ、ｉｉｉ）ＮＬＲＣ５、および／またはｉｖ）ＬＩＬＲＢ１のうちの１または複数の
発現および／または機能の、低減または消失を呈示する、
細胞（例えば、これらを含む細胞、例えば、１つを超える細胞を含む細胞集団）を提供す
る。
別の態様では、本発明は、
（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
（ｂ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、Ｃ
Ｄ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺
伝子の配列におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例え
ば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば
、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表１、表４、表５、表６
ｅ、表６ｆ、または表６ｇに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的
配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；および
（ｃ）ＦＫＢＰ１Ａまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまた
はこの近傍におけるインデル、例えば、ＦＫＢＰ１Ａに対するターゲティングドメインを
含む、例えば、表１または表６ｂに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ
の標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル
を含む細胞であって、
細胞（またはこれらを含む細胞、例えば、１つを超える細胞を含む細胞集団）が、ＣＡ
Ｒを発現し、ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ
３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）、および／またはｉｉ）ＦＫＢＰ
１２のうちの１または複数の発現および／または機能の、低減または消失を呈示する、
細胞（例えば、これらを含む細胞、例えば、１つを超える細胞を含む細胞集団）を提供す
る。複数の実施形態では、ＴＣＲの構成要素およびＦＫＢＰ１Ａに対するｇＲＮＡ分子（
本明細書で記載される）のターゲティングドメイン配列は、表３５、表３６または表３７
に列挙される、任意の組合せ、例えば、
ａ）表３５の組合せＣ１～組合せＣ４２；
ｂ）表３６の組合せＤ１～組合せＤ３６、例えば、組合せＤ２、組合せＤ４、組合せＤ
２０、または組合せＤ２２；または
ｃ）表３７の組合せＥ１～組合せＥ３０、例えば、組合せＥ２、組合せＥ４、組合せＥ
８、または組合せＥ１０
に列挙されるターゲティングドメインを含む、例えば、これらからなる。
別の態様では、本発明は、
（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
（ｂ）例えば、本明細書で記載されるラパマイシン耐性ｍＴｏｒをコードする核酸配列
、例えば、Ｓ２０３５突然変異、例えば、Ｓ２０３５Ｉ突然変異を含むｍＴｏｒをコード
する核酸配列；および
（ｃ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、Ｃ
Ｄ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺
伝子の配列におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例え
ば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば
、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表１、表４、表５、表６
ｅ、表６ｆ、または表６ｇに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的
配列におけるまたはこの近傍におけるインデル
を含む細胞であって、
細胞（または前記細胞、例えば、前記細胞のうちの１つを超えるものを含む細胞集団）
が、ＣＡＲと、ラパマイシン耐性ｍＴｏｒとを発現し、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲ
ＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡ
Ｃ）の発現および／または機能の、低減または消失を呈示する、
細胞（例えば、これらを含む細胞、例えば、１つを超える細胞を含む細胞集団）を提供す
る。
ＴＣＲの構成要素をコードする遺伝子、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡにおけるインデルま
たはこれらの近傍におけるインデルを含む、複数の実施形態では、ＴＣＲの構成要素に対
するｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイン、Ｂ２Ｍに対するｇＲＮＡ分子のターゲティ
ングドメイン、およびＣＩＩＲＡに対するｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインは、そ
れぞれ、ａ）表３３のＡ１～Ａ７２の任意の組合せに列挙される、前記ｇＲＮＡ分子のタ
ーゲティングドメイン配列；ｂ）表３８のＦ１～Ｆ６０の任意の組合せに列挙される、前
記ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイン配列；またはｃ）表３４のＢ１～Ｂ８４の任意
の組合せに列挙される、各ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイン配列を含む、例えば、
これからなる。
ＴＣＲの構成要素をコードする遺伝子およびＦＫＢＰ１Ａにおけるインデルまたはこれ
らの近傍におけるインデルを含む、複数の実施形態では、ＴＣＲの構成要素に対するｇＲ
ＮＡ分子のターゲティングドメインおよびＦＫＢＰ１Ａに対するｇＲＮＡ分子のターゲテ
ィングドメインは、それぞれ、ａ）表３５のＣ１～Ｃ４２の任意の組合せに列挙される、
前記ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイン配列；ｂ）表３６のＤ１～Ｄ３６の任意の組
合せに列挙される、前記ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイン配列；またはｃ）表３７
のＥ１～Ｅ３０の任意の組合せに列挙される、前記ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイ
ン配列を含む、例えば、これからなる。
上記で記載した、細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかに
ついての、複数の実施形態では、前記細胞内の前記インデルの各々を、前記細胞へと、各
々が、前記インデルの各々において、またはこの近傍において、標的配列に相補的なター
ゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子（例えば
、前記ｇＲＮＡ分子、例えば、前記１つを超えるｇＲＮＡ分子の各々を含む、ＣＲＩＳＰ
Ｒ系、例えば、１つを超えるＣＲＩＳＰＲ系）を導入することにより作製する。
別の態様では、本発明は、集団の細胞のうちの、少なくとも約３０％、例えば、少なく
とも約５０％、例えば、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約９０％が、前述の細
胞についての、複数の態様または複数の実施形態のうちのいずれかの細胞である細胞集団
を提供する。複数の実施形態では、前記細胞のうちの、少なくとも約３０％において（例
えば、前記細胞のうちの、少なくとも約４０％において、例えば、少なくとも約５０％に
おいて、例えば、少なくとも約６０％において、例えば、少なくとも約７０％において、
例えば、少なくとも約８０％において、例えば、少なくとも約９０％において、例えば、
少なくとも約９５％において、例えば、少なくとも約９９％において）、前記インデルの
各々は、フレームシフト突然変異である。前述の細胞についての複数の態様および複数の
実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、本発明は、図３４Ａ、図３４Ｂ
、または図４９に列挙されるインデルを含む細胞（または細胞集団）を提供する。前述の
細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形
態では、本発明は、図３６または図４８に列挙されるインデルを含む細胞（または細胞集
団）を提供する。前述の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれ
かを含む、複数の実施形態では、本発明は、図３８、図４１、図４４、または図５０に列
挙されるインデルを含む細胞（または細胞集団）を提供する。前述の細胞についての複数
の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では、本発明は、
図５３に列挙されるインデルを含む細胞（または細胞集団）を提供する。
別の態様では、本発明は、前述の細胞についての、複数の態様および複数の実施形態の
うちのいずれかの細胞を含む細胞集団を提供する。複数の実施形態では、細胞集団の細胞
のうちの、少なくとも約２０％は、前述の細胞についての、複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかの細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の細胞のうちの、少
なくとも約５０％は、前述の細胞についての、複数の態様および複数の実施形態のうちの
いずれかの細胞である。複数の実施形態では、細胞集団の細胞のうちの、約５％未満、例
えば、約１％未満、例えば、約０．０１％％未満は、オフターゲットインデルを含む。複
数の実施形態では、細胞集団の細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操
作されている。複数の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲ（例えば、本明細書で
記載される）、例えば、配列番号７８８３～配列番号７８９８のうちのいずれか１つを含
む抗原結合性ドメインを含むＣＤ１９ ＣＡＲである、または配列番号７９０９もしくは
配列番号７９２０の配列を含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、配列番号７９３
９～配列番号８１１２、または配列番号８１５５～配列番号８１６６のうちのいずれか１
つを含む抗原認識ドメインを含む、例えば、配列番号７９４９を含む、例えば、これから
なる抗原認識ドメインを含むＢＣＭＡ ＣＡＲ、または、例えば、配列番号８５４９～配
列番号８６２１のうちのいずれか１つを含む、例えば、配列番号８５５９を含む、例えば
、これからなる抗原認識ドメインを含むＢＣＭＡ ＣＡＲである。複数の実施形態では、
細胞は、動物細胞、例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞、例えば、ヒト細胞であ
る。複数の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細
胞の集団）、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細
胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合せである。複数の実施形態では、細胞は、前
記細胞を投与される患者に対して同種異系であり、例えば、細胞を、健常ヒト対象から単
離する。他の実施形態では、細胞は、前記細胞を投与される患者に対して自家である。
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者における疾患、例えば、がんを処置す
る方法であって、前述の細胞についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいず
れかの細胞を投与することを含む方法を提供する。複数の実施形態では、特に、免疫抑制
薬の標的の発現または機能を低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、方法
は、免疫抑制薬、例えば、ＲＡＤ００１を投与するステップをさらに含む。
別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書で記載されるｇＲＮＡ
分子（例えば、前述のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうち
のいずれかにおけるｇＲＮＡ分子）、本明細書で記載される組成物（例えば、前述の組成
物についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける組成物）、本
明細書で記載される核酸（例えば、前述の核酸についての、複数の態様および複数の実施
形態のうちのいずれかにおける核酸）、本明細書で記載されるベクター（例えば、前述の
ベクターについての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおけるベクタ
ー）、または本明細書で記載される細胞（または細胞集団）（例えば、前述の細胞（例え
ば、改変細胞）または細胞集団についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのい
ずれかにおける細胞（または細胞集団）を提供する。
別の態様では、本発明は、医薬の製造における使用のための、本明細書で記載されるｇ
ＲＮＡ分子（例えば、前述のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態
のうちのいずれかにおけるｇＲＮＡ分子）、本明細書で記載される組成物（例えば、前述
の組成物についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける組成物
）、本明細書で記載される核酸（例えば、前述の核酸についての、複数の態様および複数
の実施形態のうちのいずれかにおける核酸）、本明細書で記載されるベクター（例えば、
前述のベクターについての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける
ベクター）、または本明細書で記載される細胞（または細胞集団）（例えば、前述の細胞
（例えば、改変細胞）または細胞集団についての、複数の態様および複数の実施形態のう
ちのいずれかにおける細胞（または細胞集団）を提供する。
別の態様では、本発明は、疾患の処置における使用のための、本明細書で記載されるｇ
ＲＮＡ分子（例えば、前述のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態
のうちのいずれかにおけるｇＲＮＡ分子）、本明細書で記載される組成物（例えば、前述
の組成物についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける組成物
）、本明細書で記載される核酸（例えば、前述の核酸についての、複数の態様および複数
の実施形態のうちのいずれかにおける核酸）、本明細書で記載されるベクター（例えば、
前述のベクターについての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける
ベクター）、または本明細書で記載される細胞（または細胞集団）（例えば、前述の細胞
（例えば、改変細胞）または細胞集団についての、複数の態様および複数の実施形態のう
ちのいずれかにおける細胞（または細胞集団）を提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、増殖性疾患、前が
ん性状態、がん、および腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症である疾患の処置に
おける使用のための、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子（例えば、前述のｇＲＮＡ分子
についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおけるｇＲＮＡ分子）
、本明細書で記載される組成物（例えば、前述の組成物についての、複数の態様および複
数の実施形態のうちのいずれかにおける組成物）、本明細書で記載される核酸（例えば、
前述の核酸についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける核酸
）、本明細書で記載されるベクター（例えば、前述のベクターについての、複数の態様お
よび複数の実施形態のうちのいずれかにおけるベクター）、または本明細書で記載される
細胞（または細胞集団）（例えば、前述の細胞（例えば、改変細胞）または細胞集団につ
いての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける細胞（または細胞集
団）を提供する。
別の態様では、本発明は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ
性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ
性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、
Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びま
ん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型
濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺
縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫
、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュト
ロームマクログロブリン血症、および前白血病からなる群から選択される血液がんである
がんの処置における使用のための、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子（例えば、前述の
ｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおけるｇ
ＲＮＡ分子）、本明細書で記載される組成物（例えば、前述の組成物についての、複数の
態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける組成物）、本明細書で記載される核
酸（例えば、前述の核酸についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれか
における核酸）、本明細書で記載されるベクター（例えば、前述のベクターについての、
複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおけるベクター）、または本明細書
で記載される細胞（または細胞集団）（例えば、前述の細胞（例えば、改変細胞）または
細胞集団についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける細胞（
または細胞集団）を提供する。
別の態様では、本発明は、例えば、中皮腫、腺癌、神経膠芽腫、結腸がん、直腸がん、
腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、
皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛
門領域がん、胃がん、精巣がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキ
ン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組
織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児充実性腫瘍、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、
中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹
神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境
誘導性がん、前記がんの組合せ、および前記がんの転移性病変からなる群から選択される
がんの処置における使用のための、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子（例えば、前述の
ｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおけるｇ
ＲＮＡ分子）、本明細書で記載される組成物（例えば、前述の組成物についての、複数の
態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける組成物）、本明細書で記載される核
酸（例えば、前述の核酸についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれか
における核酸）、本明細書で記載されるベクター（例えば、前述のベクターについての、
複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおけるベクター）、または本明細書
で記載される細胞（または細胞集団）（例えば、前述の細胞（例えば、改変細胞）または
細胞集団についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおける細胞（
または細胞集団）を提供する。
上記で記載した、本発明の具体的特色に加えて、ｇＲＮＡ分子、Ｃａｓ９分子、および
細胞の、以下の一般的な特色は、本明細書で記載される、本発明の任意の態様および実施
形態であって、上記で記載した複数の態様および複数の実施形態を含む態様および実施形
態にも適用可能であることが想定される。
本明細書で開示される、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、ｇＲ
ＮＡ分子（例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、
またはｇＲＮＡ分子の組合せ）は、以下の特色のうちの１または複数を含みうる。
ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載されるターゲティン
グドメインを含むｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ分子の組合せの、１もしくは複数のｇＲ
ＮＡ分子）は、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒとが、別個の核酸分子上に配置さ
れるｄｇＲＮＡ分子である。複数の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’から３’へと、［
ターゲティングドメイン］－：
ａ）配列番号６５８４；
ｂ）配列番号６５８５；
ｃ）配列番号６６０５；
ｄ）配列番号６６０６；
ｅ）配列番号６６０７；
ｆ）配列番号６６０８；または
ｇ）配列番号７８０６
を含む。好ましい実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’から３’へと、［ターゲティングド
メイン］－［配列番号６６０７］を含む。複数の実施形態では、ｔｒａｃｒは、化膿連鎖
球菌（S. Pyogenes）のｔｒａｃｒ配列（ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣ
ＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡ
ＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣのうちの、１５を超える、例えば、２０も
しくはこれを超える、３０もしくはこれを超える、４０もしくはこれを超える、５０もし
くはこれを超える、６０もしくはこれを超える、７０もしくはこれを超える、または８０
もしくはこれを超えるヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、ｔｒａｃｒは加えて、
３’末端における、１またはこれを超える、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６
つ、または７つ、例えば、好ましくは、４つまたは７つのＵヌクレオチドも含む。ｄｇＲ
ＮＡについての、好ましい実施形態では、ｔｒａｃｒは、配列番号７８２０を含む。複数
の実施形態では、ｔｒａｃｒは加えて、３’末端における、１またはこれを超える、例え
ば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ、例えば、好ましくは、４つまた
は７つのＵヌクレオチドも含む。ｄｇＲＮＡについての、好ましい実施形態では、ｔｒａ
ｃｒは、配列番号６６６０を含む、例えば、これからなる。ｄｇＲＮＡについての、好ま
しい実施形態では、ｃｒＲＮＡは、［ターゲティングドメイン］－配列番号６６０７を含
み、例えば、これからなり、ｔｒａｃｒは、配列番号７８２０を含む、例えば、配列番号
６６６０を含む、例えば、これからなる。
他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメ
インを含むｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ分子の組合せの、１もしくは複数のｇＲＮＡ分
子）は、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒとを、単一の核酸分子上に配置したｓｇ
ＲＮＡ分子である。複数の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子は、［ターゲティングドメイン
］－
（ａ）配列番号６６０１；
（ｂ）配列番号６６０２；
（ｃ）配列番号６６０３；
（ｄ）配列番号６６０４；または
（ｅ）３’末端において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラ
シル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記の（ａ）～（ｄ）のうちのいずれか
を含む、例えば、これからなる。好ましい実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子は、［ターゲテ
ィングドメイン］－配列番号６６０１を含む。好ましい実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子は
、［ターゲティングドメイン］－配列番号７８１１を含む、例えば、これからなる。
前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む、複数の実施形態では
、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子の核酸分子のうちの１または複数、例えば、本明細
書で記載されるｇＲＮＡ分子の核酸分子の全ては、ヌクレオチドまたはヌクレオチド間結
合への修飾を含まない。前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む
、他の実施形態では、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子の核酸分子のうちの１または複
数は、例えば、本明細書で記載される、ヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合への、１
または複数の修飾を含む。複数の実施形態では、前記修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾を含
む。複数の実施形態では、前記修飾は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）修飾を
含む。複数の実施形態では、前記修飾は、ｇＲＮＡ分子の核酸の、１つ、２つ、３つ、ま
たはこれを超える、例えば、３つの３’ヌクレオチドの各々における２’－Ｏ－メチル修
飾を含む。複数の実施形態では、前記修飾は、ｇＲＮＡ分子の核酸の、末端に対して４つ
目、末端に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’ヌクレオチドの各々における
２’－Ｏ－メチル修飾を含む。複数の実施形態では、前記修飾は、ｇＲＮＡ分子の核酸の
、１つ、２つ、３つ、またはこれを超える、例えば、３つの５’ヌクレオチドの各々にお
ける２’－Ｏ－メチル修飾を含む。複数の実施形態では、前記修飾は、ｇＲＮＡ分子の核
酸の、末端に対して４つ目、末端に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’ヌク
レオチドの各々における２’－Ｏ－メチル修飾と、ｇＲＮＡ分子の核酸の、１つ、２つ、
３つ、またはこれを超える、例えば、３つの５’ヌクレオチドの各々における２’－Ｏ－
メチル修飾とを含む。複数の実施形態では、前記修飾は、ｇＲＮＡの核酸分子の３’末端
における、１つまたは複数の、例えば、１つ、２つ、３つ、またはこれを超える、例えば
、３つのホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を含む。複数の実施形態では、前
記修飾は、ｇＲＮＡの核酸分子の５’末端における、１つまたは複数の、例えば、１つ、
２つ、３つ、またはこれを超える、例えば、３つのホスホロチオエート（phosphorothioa
te）結合を含む。複数の実施形態では、前記修飾は、ｇＲＮＡの核酸分子の３’末端およ
び５’末端における、１つまたは複数の、例えば、１つ、２つ、３つ、またはこれを超え
る、例えば、３つのホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を含む。ｄｇＲＮＡ分
子を伴う、複数の実施形態では、ｔｒａｃｒを含む分子およびｃｒＲＮＡを含む分子の両
方を、本明細書で記載される通りに修飾する。ｄｇＲＮＡ分子を伴う、他の実施形態では
、ｔｒａｃｒを含む分子は、修飾せず、ｃｒＲＮＡを含む分子は、本明細書で記載される
通りに修飾する。ｄｇＲＮＡ分子を伴う、他の実施形態では、ｃｒＲＮＡを含む分子は、
修飾せず、ｔｒａｃｒを含む分子は、本明細書で記載される通りに修飾する。
１つを超えるｇＲＮＡ分子を含む、本発明の複数の態様では、各ｇＲＮＡ分子は独立に
、例えば、本明細書で記載される、ｄｇＲＮＡ分子またはｓｇＲＮＡ分子でありうる。複
数の実施形態では、本明細書で記載される組合せの、ｇＲＮＡ分子の全ては、ｄｇＲＮＡ
分子である。複数の実施形態では、本明細書で記載される組合せの、ｇＲＮＡ分子の全て
は、ｓｇＲＮＡ分子である。複数の実施形態では、本明細書で記載される組合せの、ｇＲ
ＮＡ分子のうちの１または複数は、ｄｇＲＮＡ分子であり、本明細書で記載される組合せ
の、他のｇＲＮＡ分子のうちの１または複数は、ｓｇＲＮＡ分子である。
複数の実施形態では、本発明のｇＲＮＡ分子は、本明細書で記載される細胞へと導入さ
れると、ｇＲＮＡの標的配列において、またはこの近傍において、インデルをもたらすｇ
ＲＮＡ分子である。複数の実施形態では、本発明のｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子が導入
される細胞集団の、例えば、本明細書で記載される細胞のうちの、少なくとも約７０％、
例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５
％、例えば、少なくとも約９６％、例えば、少なくとも約９７％、例えば、少なくとも約
９８％、例えば、少なくとも約９９％、またはこれを超えるものにおいて、インデルをも
たらすｇＲＮＡ分子である。複数の実施形態では、インデルの頻度は、例えば、本明細書
で記載されるＮＧＳにより測定される。複数の実施形態では、前記１または複数のインデ
ルは、フレームシフト突然変異であるか、またはこれらを含む。複数の実施形態では、本
発明のｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子が導入される細胞集団の、例えば、本明細書で記載
される細胞のうちの、少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、例えば、少な
くとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、
少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％、例え
ば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、またはこれを超えるものにおい
て、フレームシフト突然変異をもたらすｇＲＮＡ分子である。複数の実施形態では、フレ
ームシフト突然変異の頻度は、例えば、本明細書で記載されるＮＧＳにより測定される。
複数の実施形態では、前記インデル、インデルの頻度、フレームシフト突然変異、および
／またはフレームシフト突然変異の頻度は、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲ
ＮＰとしてのｇＲＮＡ分子の導入の後に、細胞（または細胞集団）内で測定される。複数
の実施形態では、前記インデル、インデルの頻度、フレームシフト突然変異、および／ま
たはフレームシフト突然変異の頻度は、ｇＲＮＡ分子の導入の後に、細胞（または細胞集
団）内で、電気穿孔により測定される。
複数の実施形態では、本発明のｇＲＮＡ分子は、本明細書で記載される細胞または細胞
集団へと導入されると、ｇＲＮＡの標的配列またはこの近傍の、最大で５０分の１、例え
ば、最大で１００分の１、例えば、最大で１０００分の１の低い頻度で、オフターゲット
部位においてインデルをもたらすｇＲＮＡ分子である。好ましい実施形態では、ｇＲＮＡ
は、本明細書で記載される細胞または細胞集団へと導入されると、いかなるオフターゲッ
ト部位においても、検出可能なインデルをもたらさない。複数の実施形態では、オフター
ゲットインデルについての解析は、例えば、本明細書で記載される、予測オフターゲット
結合性部位についての、ターゲティングされたオフターゲットシーケンシングにより測定
される。複数の実施形態では、オフターゲットインデルについての解析は、例えば、本明
細書で記載される、ヌクレオチド挿入解析により測定される。複数の実施形態では、オフ
ターゲット解析は、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとしてのｇＲＮＡ分
子の導入の後に、細胞（または細胞集団）内で測定される。複数の実施形態では、オフタ
ーゲット解析は、ｇＲＮＡ分子の導入の後に、細胞（または細胞集団）内で、電気穿孔に
より測定される。
複数の実施形態では、ＲＮＰまたはＲＮＰの組合せを、細胞へと、単回の電気穿孔によ
り送達する。複数の実施形態では、本発明の細胞を、単回の電気穿孔ステップだけにかけ
る。
本発明の複数の態様および複数の実施形態であって、ｇＲＮＡ分子の組合せを含む態様
および実施形態では、組合せのｇＲＮＡ分子の各々は、前述の特色のうちのいずれかを独
立に含みうる。
本明細書で開示される、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、Ｃａ
ｓ９分子は、以下の特色のうちの１または複数を含みうる。
複数の態様ではＣａｓ９分子は、化膿連鎖球菌（S. Pyogenes）のＣａｓ９、例えば、
本明細書で記載される、修飾または非修飾の、化膿連鎖球菌（S. Pyogenes）のＣａｓ９
分子である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１を含む。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８２１を含む、例えば、これからなる。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８２２を含む、例えば、これからなる。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８２３を含む、例えば、これからなる。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８２４を含む、例えば、これからなる。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８２５を含む、例えば、これからなる。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８２６を含む、例えば、これからなる。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８２７を含む、例えば、これからなる。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８２８を含む、例えば、これからなる。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８２９を含む、例えば、これからなる。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８３０を含む、例えば、これからなる。他の実施
形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号７８３１を含む、例えば、これからなる。好ましい
Ｃａｓ９分子は、配列番号７８２１、配列番号７８２２、配列番号７８２５、および配列
番号７８２８を含む、例えば、これらからなるＣａｓ９分子である。
１または複数のＲＮＰ複合体、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を含む、１
または複数のＲＮＰ複合体を含む、複数の態様および複数の実施形態では、前記ＲＮＰ複
合体の各々は、約１０ｕＭ未満、例えば、約３ｕＭ未満、例えば、約１ｕＭ未満、例えば
、約０．５ｕＭ未満、例えば、約０．３ｕＭ未満、例えば、約０．１ｕＭ未満の濃度であ
る。複数の実施形態では、前記濃度は、例えば、本明細書で記載される通り、例えば、電
気穿孔により、ＲＮＰが導入される、例えば、本明細書で記載される細胞（例えば、細胞
集団）を含む組成物中の、ＲＮＰ複合体の濃度である。複数の実施形態では、組成物の培
地は、電気穿孔に適する。
本発明の複数の態様および複数の実施形態であって、ｇＲＮＡ分子の組合せ、例えば、
異なるｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰの組合せを含む態様および実施形態では、組合せのＣａ
ｓ９分子の各々は、前述の特色のうちのいずれかを独立に含みうる。
本明細書で開示される、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、細胞
（例えば、細胞集団）は、以下の特色のうちの１または複数を含みうる。
複数の態様では、細胞（例えば、細胞集団）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の
発現を低減したか、または消失させた、１または複数の細胞を含む。複数の実施形態では
、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の発現の低減または消失は、ＴＲＡＣの発現の低減
または消失を含む。複数の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の発現の低
減または消失は、ＴＲＢＣ１の発現の低減または消失を含む。複数の実施形態では、Ｔ細
胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の発現の低減または消失は、ＴＲＢＣ２の発現の低減また
は消失を含む。複数の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の発現の低減ま
たは消失は、ＣＤ３Ｇの発現の低減または消失を含む。複数の実施形態では、Ｔ細胞受容
体（ＴＣＲ）の構成要素の発現の低減または消失は、ＣＤ３Ｄの発現の低減または消失を
含む。複数の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素の発現の低減または消失
は、ＣＤ３Ｅの発現の低減または消失を含む。複数の実施形態では、前記ＴＣＲの構成要
素の、前記発現の低減または消失は、前記ＴＣＲの構成要素に対する、本明細書で記載さ
れる、１または複数のｇＲＮＡ分子、例えば、１つまたは２つのｇＲＮＡ分子、例えば、
１つのｇＲＮＡ分子の、前記細胞への導入の結果である。複数の実施形態では、細胞は、
前記ＴＣＲの構成要素に対する、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインの標的配列にお
いて、または近傍において、例えば、本明細書で記載されるインデル、例えば、フレーム
シフト突然変異を含む。複数の実施形態では、細胞集団は、ＴＣＲの構成要素の、発現の
低減または消失を呈示する、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば
、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、ま
たはこれを超える細胞（本明細書で記載される）を含む。複数の実施形態では、前記ＴＣ
Ｒの構成要素の、発現の低減または消失は、例えば、本明細書で記載されるフローサイト
メトリーにより測定されるものである。
複数の態様（ＴＣＲの構成要素の、発現の低減または消失を代替的に、またはこれに加
えて含む）では、細胞（例えば、細胞集団）は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）
の発現を低減したか、または消失させた、１または複数の細胞を含む。複数の実施形態で
は、前記Ｂ２Ｍの、前記発現の低減または消失は、Ｂ２Ｍに対する、本明細書で記載され
る、１または複数のｇＲＮＡ分子、例えば、１つまたは２つのｇＲＮＡ分子、例えば、１
つのｇＲＮＡ分子の、前記細胞への導入の結果である。複数の実施形態では、細胞は、前
記Ｂ２Ｍに対する、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインの標的配列において、または
近傍において、例えば、本明細書で記載されるインデル、例えば、フレームシフト突然変
異を含む。複数の実施形態では、細胞集団は、Ｂ２Ｍの、発現の低減または消失を呈示す
る、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、
例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、またはこれを超える細胞（
本明細書で記載される）を含む。複数の実施形態では、前記Ｂ２Ｍの、発現の低減または
消失は、例えば、本明細書で記載されるフローサイトメトリーにより測定されるものであ
る。
複数の態様（ＴＣＲの構成要素および／またはＢ２Ｍの、発現の低減または消失を代替
的に、またはこれに加えて含む）では、細胞（例えば、細胞集団）は、ＣＩＩＴＡの発現
を低減したか、または消失させた、１または複数の細胞を含む。複数の実施形態では、前
記ＣＩＩＴＡの、前記発現の低減または消失は、前記ＣＩＩＴＡに対する、本明細書で記
載される、１または複数のｇＲＮＡ分子、例えば、１つまたは２つのｇＲＮＡ分子、例え
ば、１つのｇＲＮＡ分子の、前記細胞への導入の結果である。複数の実施形態では、細胞
は、前記ＣＩＩＴＡに対する、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインの標的配列におい
て、または近傍において、例えば、本明細書で記載されるインデル、例えば、フレームシ
フト突然変異を含む。複数の実施形態では、細胞集団は、ＣＩＩＴＡの、発現の低減また
は消失を呈示する、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なく
とも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、またはこれ
を超える細胞（本明細書で記載される）を含む。複数の実施形態では、前記Ｂ２Ｍの、発
現の低減または消失は、例えば、本明細書で記載されるフローサイトメトリーにより測定
されるものである。
複数の態様（ＴＣＲの構成要素の、発現の低減または消失を代替的に、またはこれに加
えて含む）では、細胞（例えば、細胞集団）は、免疫抑制薬の標的、例えば、ＦＫＢＰ１
Ａの発現を低減したか、または消失させた、１または複数の細胞を含む。複数の実施形態
では、前記ＦＫＢＰ１Ａの、前記発現の低減または消失は、前記ＦＫＢＰ１Ａに対する、
本明細書で記載される、１または複数のｇＲＮＡ分子、例えば、１つまたは２つのｇＲＮ
Ａ分子、例えば、１つのｇＲＮＡ分子の、前記細胞への導入の結果である。複数の実施形
態では、細胞は、前記ＦＫＢＰ１Ａに対する、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインの
標的配列において、または近傍において、例えば、本明細書で記載されるインデル、例え
ば、フレームシフト突然変異を含む。複数の実施形態では、細胞集団は、ＦＫＢＰ１Ａの
、発現の低減または消失を呈示する、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％
、例えば、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９
０％、またはこれを超える細胞（本明細書で記載される）を含む。複数の実施形態では、
前記ＦＫＢＰ１Ａの、発現の低減または消失は、例えば、本明細書で記載されるフローサ
イトメトリーにより測定されるものである。
一部の態様では、細胞が、１つを超える遺伝子の、発現の低減または消失を呈示するこ
とが所望される。ある態様では、細胞は、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ
Ｃ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、および／またはＣＤ３Ｄ）の、発現の低減また
は消失、Ｂ２Ｍの発現の低減または消失、およびＣＩＩＴＡの発現の低減または消失を呈
示する。複数の実施形態では、発現の低減または消失は、組合せのｇＲＮＡ分子が、組合
せＡ１～Ａ７２のうちのいずれかに列挙される、ターゲティングドメイン配列を含む、ｇ
ＲＮＡ分子の組合せの、細胞への導入から生じる。複数の実施形態では、発現の低減また
は消失は、組合せのｇＲＮＡ分子が、組合せＢ１～Ｂ８４のうちのいずれかに列挙される
、ターゲティングドメイン配列を含む、ｇＲＮＡ分子の組合せの、細胞への導入から生じ
る。複数の実施形態では、前記細胞は、表３３、表３４または表３８（例えば、組合せＡ
１～Ａ７２、Ｂ１～Ｂ８４、またはＦ１～Ｆ６０のうちのいずれかにおけるｇＲＮＡ分子
）に列挙される、ｇＲＮＡ分子ターゲティングドメインの各々の標的配列において、また
はこの近傍において、インデル、例えば、フレームシフト突然変異を含む。
一部の態様では、細胞が、１つを超える遺伝子の、発現の低減または消失を呈示するこ
とが所望される。ある態様では、細胞は、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ
Ｃ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、および／またはＣＤ３Ｄ）の、発現の低減また
は消失、および免疫抑制薬の標的、例えば、ＦＫＢＰ１Ａの、発現の低減または消失を呈
示する。複数の実施形態では、発現の低減または消失は、組合せのｇＲＮＡ分子が、組合
せＣ１～Ｃ４２のうちのいずれかに列挙される、ターゲティングドメイン配列を含む、ｇ
ＲＮＡ分子の組合せの、細胞への導入から生じる。複数の実施形態では、発現の低減また
は消失は、組合せのｇＲＮＡ分子が、組合せＤ１～Ｄ３６のうちのいずれかに列挙される
、ターゲティングドメイン配列を含む、ｇＲＮＡ分子の組合せの、細胞への導入から生じ
る。複数の実施形態では、前記細胞は、表３５、表３６または表３７（例えば、組合せＣ
１～Ｃ４２、Ｄ１～Ｄ３６、またはＥ１～Ｅ３０のうちのいずれかにおけるｇＲＮＡ分子
）に列挙される、ｇＲＮＡ分子ターゲティングドメインの各々の標的配列において、また
はこの近傍において、インデル、例えば、フレームシフト突然変異を含む。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＡＣ、およびＢ２Ｍの両方の発現を低減するか
、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば、１つ
を超えるさらなる標的、例えば、ＣＩＩＴＡの発現または機能もまた、低減するか、また
は消失させる場合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮ
Ａ分子は、配列番号７８３３、配列番号７８３４、配列番号７８３５、配列番号７８３６
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８３７
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８３６
および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号
７８３７および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択
され、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８５３、配列番号７８５
４、配列番号７８５５、配列番号７８５６および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５７および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５６および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８５７および配列番号１０７９８を含む、例
えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せの
うちのいずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９
分子、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＡＣ、およびＢ２Ｍの両方の発現を低減するか
、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば、１つ
を超えるさらなる標的、例えば、ＣＩＩＴＡの発現または機能もまた、低減するか、また
は消失させる場合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮ
Ａ分子は、配列番号７８３３、配列番号７８３４、配列番号７８３５、配列番号７８３６
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８３７
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８３６
および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号
７８３７および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択
され、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８５８、配列番号７８５
９、配列番号７８６０、配列番号７８６１および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８６２および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８６１および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８６２および配列番号１０７９８を含む、例
えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せの
うちのいずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９
分子、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＡＣ、およびＢ２Ｍの両方の発現を低減するか
、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば、１つ
を超えるさらなる標的、例えば、ＣＩＩＴＡの発現または機能もまた、低減するか、また
は消失させる場合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮ
Ａ分子は、配列番号７８３８、配列番号７８３９、配列番号７８４０、配列番号７８４１
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４２
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４１
および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号
７８４２および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択
され、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８５３、配列番号７８５
４、配列番号７８５５、配列番号７８５６および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５７および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５６および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８５７および配列番号１０７９８を含む、例
えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せの
うちのいずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９
分子、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＡＣ、およびＢ２Ｍの両方の発現を低減するか
、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば、１つ
を超えるさらなる標的、例えば、ＣＩＩＴＡの発現または機能もまた、低減するか、また
は消失させる場合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮ
Ａ分子は、配列番号７８３８、配列番号７８３９、配列番号７８４０、配列番号７８４１
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４２
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４１
および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号
７８４２および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択
され、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８５８、配列番号７８５
９、配列番号７８６０、配列番号７８６１および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８６２および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８６１および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８６２および配列番号１０７９８を含む、例
えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せの
うちのいずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９
分子、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＢＣ、およびＢ２Ｍの両方の発現を低減するか
、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば、１つ
を超えるさらなる標的、例えば、ＣＩＩＴＡの発現または機能もまた、低減するか、また
は消失させる場合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＢＣをターゲティングするｇＲＮ
Ａ分子は、配列番号７８４３、配列番号７８４４、配列番号７８４５、配列番号７８４６
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４７
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４６
および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号
７８４７および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択
され、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８５３、配列番号７８５
４、配列番号７８５５、配列番号７８５６および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５７および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５６および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８５７および配列番号１０７９８を含む、例
えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せの
うちのいずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９
分子、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＢＣ、およびＢ２Ｍの両方の発現を低減するか
、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば、１つ
を超えるさらなる標的、例えば、ＣＩＩＴＡの発現または機能もまた、低減するか、また
は消失させる場合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＢＣをターゲティングするｇＲＮ
Ａ分子は、配列番号７８４３、配列番号７８４４、配列番号７８４５、配列番号７８４６
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４７
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４６
および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号
７８４７および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択
され、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８５８、配列番号７８５
９、配列番号７８６０、配列番号７８６１および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８６２および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８６１および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８６２および配列番号１０７９８を含む、例
えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せの
うちのいずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９
分子、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＢＣ、およびＢ２Ｍの両方の発現を低減するか
、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば、１つ
を超えるさらなる標的、例えば、ＣＩＩＴＡの発現または機能もまた、低減するか、また
は消失させる場合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＢＣをターゲティングするｇＲＮ
Ａ分子は、配列番号７８４８、配列番号７８４９、配列番号７８５０、配列番号７８５１
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５２
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５１
および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号
７８５２および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択
され、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８５３、配列番号７８５
４、配列番号７８５５、配列番号７８５６および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５７および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５６および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８５７および配列番号１０７９８を含む、例
えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せの
うちのいずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９
分子、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＢＣ、およびＢ２Ｍの両方の発現を低減するか
、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば、１つ
を超えるさらなる標的、例えば、ＣＩＩＴＡの発現または機能もまた、低減するか、また
は消失させる場合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＢＣをターゲティングするｇＲＮ
Ａ分子は、配列番号７８４８、配列番号７８４９、配列番号７８５０、配列番号７８５１
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５２
および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５１
および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号
７８５２および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択
され、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８５８、配列番号７８５
９、配列番号７８６０、配列番号７８６１および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８６２および配列番号６６６０を含む、例えば、これ
らからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８６１および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８６２および配列番号１０７９８を含む、例
えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せの
うちのいずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９
分子、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＡＣ、およびＦＫＢＰ１Ａの両方の発現を低減
するか、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば
、１つを超えるさらなる標的の発現または機能もまた、低減するか、または消失させる場
合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列
番号７８３３、配列番号７８３４、配列番号７８３５、配列番号７８３６および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８３７および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８３６および配列番号
１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８３７および
配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択され、ＦＫＢＰ
１ＡをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８６３、配列番号７８６４、配列
番号７８６５、配列番号７８６６および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８６７および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８６６および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらから
なるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８６７および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せのうちのい
ずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９分子、例
えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＡＣ、およびＦＫＢＰ１Ａの両方の発現を低減
するか、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば
、１つを超えるさらなる標的の発現または機能もまた、低減するか、または消失させる場
合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列
番号７８３３、配列番号７８３４、配列番号７８３５、配列番号７８３６および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８３７および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８３６および配列番号
１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８３７および
配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択され、ＦＫＢＰ
１ＡをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８６８、配列番号７８６９、配列
番号７８７０、配列番号７８７１および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８７２および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８７１および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらから
なるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８７２および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せのうちのい
ずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９分子、例
えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＡＣ、およびＦＫＢＰ１Ａの両方の発現を低減
するか、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば
、１つを超えるさらなる標的の発現または機能もまた、低減するか、または消失させる場
合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列
番号７８３８、配列番号７８３９、配列番号７８４０、配列番号７８４１および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４２および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４１および配列番号
１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８４２および
配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択され、ＦＫＢＰ
１ＡをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８６３、配列番号７８６４、配列
番号７８６５、配列番号７８６６および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８６７および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８６６および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらから
なるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８６７および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せのうちのい
ずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９分子、例
えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＡＣ、およびＦＫＢＰ１Ａの両方の発現を低減
するか、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば
、１つを超えるさらなる標的の発現または機能もまた、低減するか、または消失させる場
合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列
番号７８３８、配列番号７８３９、配列番号７８４０、配列番号７８４１および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４２および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４１および配列番号
１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８４２および
配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択され、ＦＫＢＰ
１ＡをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８６８、配列番号７８６９、配列
番号７８７０、配列番号７８７１および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８７２および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８７１および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらから
なるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８７２および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せのうちのい
ずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９分子、例
えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＢＣ、およびＦＫＢＰ１Ａの両方の発現を低減
するか、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば
、１つを超えるさらなる標的の発現または機能もまた、低減するか、または消失させる場
合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＢＣをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列
番号７８４３、配列番号７８４４、配列番号７８４５、配列番号７８４６および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４７および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４６および配列番号
１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８４７および
配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択され、ＦＫＢＰ
１ＡをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８６３、配列番号７８６４、配列
番号７８６５、配列番号７８６６および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８６７および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８６６および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらから
なるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８６７および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せのうちのい
ずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９分子、例
えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＢＣ、およびＦＫＢＰ１Ａの両方の発現を低減
するか、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば
、１つを超えるさらなる標的の発現または機能もまた、低減するか、または消失させる場
合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＢＣをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列
番号７８４３、配列番号７８４４、配列番号７８４５、配列番号７８４６および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４７および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８４６および配列番号
１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８４７および
配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択され、ＦＫＢＰ
１ＡをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８６８、配列番号７８６９、配列
番号７８７０、配列番号７８７１および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８７２および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８７１および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらから
なるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８７２および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せのうちのい
ずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９分子、例
えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＢＣ、およびＦＫＢＰ１Ａの両方の発現を低減
するか、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば
、１つを超えるさらなる標的の発現または機能もまた、低減するか、または消失させる場
合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＢＣをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列
番号７８４８、配列番号７８４９、配列番号７８５０、配列番号７８５１および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５２および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５１および配列番号
１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８５２および
配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択され、ＦＫＢＰ
１ＡをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８６３、配列番号７８６４、配列
番号７８６５、配列番号７８６６および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８６７および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８６６および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらから
なるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８６７および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せのうちのい
ずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９分子、例
えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＢＣ、およびＦＫＢＰ１Ａの両方の発現を低減
するか、または消失させることが意図される、好ましい実施形態（さらなる標的、例えば
、１つを超えるさらなる標的の発現または機能もまた、低減するか、または消失させる場
合は、複数の実施形態を含む）ではＴＲＢＣをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列
番号７８４８、配列番号７８４９、配列番号７８５０、配列番号７８５１および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５２および配列番号
６６６０を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、配列番号７８５１および配列番号
１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８５２および
配列番号１０７９８を含む、例えば、これらからなるｄｇＲＮＡから選択され、ＦＫＢＰ
１ＡをターゲティングするｇＲＮＡ分子は、配列番号７８６８、配列番号７８６９、配列
番号７８７０、配列番号７８７１および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８７２および配列番号６６６０を含む、例えば、これらからな
るｄｇＲＮＡ、配列番号７８７１および配列番号１０７９８を含む、例えば、これらから
なるｄｇＲＮＡ、および配列番号７８７２および配列番号１０７９８を含む、例えば、こ
れらからなるｄｇＲＮＡから選択される。本明細書で記載される通り、組合せのうちのい
ずれかについての、複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、Ｃａｓ９分子、例
えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を伴うＲＮＰとして提供される。
一態様では、細胞は、１つのＴＣＲの構成要素だけの、発現の低減または消失を呈示す
る（１または複数の、他のＴＣＲの構成要素ではない標的の発現の低減または消失も呈示
しうるが）。複数の実施形態では、細胞は、ＴＣＲの構成要素である、単一の遺伝子（ま
たはその調節エレメント）だけの中の標的配列において、またはその近傍において、イン
デルを含む（細胞はＴＣＲの構成要素でない、１または複数のさらなる遺伝子（またはそ
の調節エレメント）内の標的配列において、またはその近傍においても、インデルを含み
うるが）。したがって、複数の実施形態では、細胞は、ＴＣＲの構成要素である、１つを
超える遺伝子内に、インデルを含まない。複数の実施形態では、細胞は、ＴＲＡＣ内、お
よび第２のＴＣＲの構成要素、例えば、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２をコードする遺伝子
内に、インデルを含まない。
一態様では、細胞は、阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエ
フェクターの標的配列を含む遺伝子の、発現の低減または消失を呈示しない（１または複
数の、他の遺伝子の発現の低減または消失を呈示しうるが）。複数の実施形態では、細胞
は、阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの遺伝子
（またはその調節エレメント）内の標的配列において、またはその近傍において、インデ
ルを含まない（１または複数の他の遺伝子（またはその調節エレメント）において、イン
デルを含みうるが）。複数の実施形態では、細胞は、ＰＤＣＤ１内またはその調節エレメ
ント内に、インデルを含まない。
複数の態様では、細胞は、動物細胞、例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞、例
えば、ヒト細胞である。複数の態様では、細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、１ま
たは複数の免疫エフェクター細胞を含む細胞集団）、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例
えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合せで
ある。
複数の態様では、細胞は、前記細胞を投与される患者に関して自家である。他の複数の
態様では、細胞は、前記細胞を投与される患者に関して同種異系である。複数の実施形態
では、細胞は、前記細胞を投与される患者に関して同種異系であり、人工多能性幹細胞で
あるか、またはこれから導出される細胞である。複数の実施形態では、細胞は、前記細胞
を投与される患者に関して同種異系であり、免疫エフェクター細胞、例えば、健常ヒトド
ナーから単離されたＴ細胞である。
複数の態様では、例えば、本明細書で記載される細胞（または細胞集団）、例えば、本
明細書で記載されるＣＡＲ発現細胞を、例えば、本明細書で記載される方法により、ｅｘ
ｖｉｖｏにおいて修飾および／または変更する。他の複数の態様では、例えば、本明細
書で記載される細胞（または細胞集団）、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ発現細胞
を、例えば、本明細書で記載される方法により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて修飾および／ま
たは変更する。複数の態様では、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ系、ｇＲＮＡ分子（本明細書で
記載される、Ｃａｓ９分子を伴うＲＮＰ複合体内のものを含む）、および／または組成物
（例えば、１つを超える本発明のｇＲＮＡ分子を含む組成物）を、例えば、本明細書で記
載される細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ発現細胞へと、ｅｘ ｖｉｖｏにお
いて導入する。他の複数の態様では、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ系、ｇＲＮＡ分子（本明細
書で記載される、Ｃａｓ９分子を伴うＲＮＰ複合体内のものを含む）、および／または組
成物（例えば、１つを超える本発明のｇＲＮＡ分子を含む組成物）を、例えば、本明細書
で記載される細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ発現細胞へと、ｉｎ ｖｉｖｏ
において導入する。
複数の態様では、細胞は、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現す
るように操作されているか、操作されるか、または操作されることになる（例えば、細胞
は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むか、またはこれを含むことになる）。複数の実施
形態では、ＣＡＲは、例えば、本明細書で記載される、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２
；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、
ＣＤ３１９、および１９Ａ２４ともまた称する）；Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ－１ま
たはＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；表皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）
；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａ
Ｎｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＮ
Ｆ受容体ファミリーメンバーであるＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（ＴｎＡｇ）ま
たは（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体
チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（Ｆ
ＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児
性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ
（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒ
ａ２またはＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ
－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスチシンま
たはＰＲＳＳ２１）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；Ｌｅｗｉｓ（Ｙ）抗
原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲベータ）；発生段階特異的
胎児性抗原４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体型プロテインチ
ロシンキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）；
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立
腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；突然変異型伸長因子２（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２
；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（Ｉ
ＧＦ－１受容体）；炭酸脱水素酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；ベータ９型プロテアソーム（プロ
ソーム、マクロペイン）サブユニット（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）
；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびＡｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルスがん遺伝
子相同体１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナ
ーゼ；Ａ型エフリン受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルＬｅｗｉｓ接着
分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－
４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子
量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ
２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マー
カー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；ｃｌａｕｄｉｎ６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容
体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣ群５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；
Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９
ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；
ｇｌｏｂｏＨ糖セラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）
；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アド
レナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共
役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚
受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替的リーディングフレームタンパク質
（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ
－１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；
染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク
質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエ
チン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫がん精巣抗原１（ＭＡＤ－ＣＴ－１
）；黒色腫がん精巣抗原２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ
５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺
癌腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ－１またはガレクチン８）；Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原
１（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラ
ーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫アポトーシス阻害剤（ＭＬ－Ｉ
ＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通セリンプロテアーゼ２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；
Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタ
ンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；ＣｙｃｌｉｎＢ１；ｖ－ｍｙｃ
トリ骨髄細胞腫症ウイルスがん遺伝子神経芽細胞腫由来相同体（ＭＹＣＮ）；Ｒａｓ相同
体ファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；
チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合性因子（亜鉛フィンガ
ータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはBｒｏｔｈｅｒ ｏｆ the Rｅｇｕｌａｔｏｒ
ｏｆ Iｍｐｒｉｎｔｅｄ Sｉｔｅｓ）；Sｑｕａｍｏｕｓ Cｅｌｌ Cａｒｃｉｎｏｍ
ａ Aｎｔｉｇｅｎ Rｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ Cｅｌｌｓ ３（ＳＡＲＴ３）；
ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓ
ｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａ
キナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；
終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎ユビキタス１（ＲＵ１）；腎ユビキタス２（Ｒ
Ｕ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウ
イルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；突然変異型熱ショックタン
パク質７０－２（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血
球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲま
たはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲ
Ａ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメ
インファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；
ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（
ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；および免疫グ
ロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）から選択される抗原を認識する。
複数の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、本明細書で記載される、ＣＤ１９に結合する
抗原認識ドメインを含む。複数の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７８９５を含む、例
えば、これからなる、抗ＣＤ１９結合性ドメインを含む。複数の実施形態では、ＣＡＲは
、配列番号７８８４を含む、例えば、これからなる、抗ＣＤ１９結合性ドメインを含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、本明細書で記載される、ＢＣＭＡに結合する
抗原認識ドメインを含む。複数の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７９４９を含む、例
えば、これからなる、抗ＢＣＭＡ結合性ドメインを含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内
シグナル伝達ドメインを含む。複数の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６６４
４の配列を含む。複数の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝
達ドメイン、および／または共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。複数の実施形態では
、一次シグナル伝達ドメインは、配列番号６６４８、または配列番号６６５０の配列を含
む、例えば、これからなる。複数の実施形態では、共刺激性シグナル伝達ドメインは、配
列番号６６４６または配列番号６６３６の配列を含む、例えば、これからなる、例えば、
配列番号６６４６の配列を含む、例えば、これからなる。他の実施形態では、共刺激性シ
グナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する配列を含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲであり、配列番号７９２０の配列を
含む、例えば、これからなる。複数の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲであり
、配列番号７９０９の配列を含む、例えば、これからなる。複数の実施形態では、例えば
、本明細書で記載される細胞は、本明細書で記載されるＣＤ１９ ＣＡＲ、例えば、配列
番号７９２０または配列番号７９０９の配列を含むＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸配
列を含む。
複数の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ ＣＡＲであり、配列番号８５５９の配列を
含む、例えば、これからなる。複数の実施形態では、例えば、本明細書で記載される細胞
は、本明細書で記載されるＢＣＭＡ ＣＡＲ、例えば、配列番号８５５９を含むＢＣＭＡ
ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。複数の実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲをコード
する核酸配列は、配列番号８５７４を含む、例えば、これからなる。
複数の態様では、例えば、本明細書で記載される、本発明の細胞（例えば、本発明の細
胞集団）は、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸配列をさらに含む。このような細胞は、細
胞が、１もしくは複数の主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）分子の発現の低減もしく
は消失（例えば、例えば、本明細書で記載される方法により達成される、Ｂ２Ｍの発現の
低減または消失を介する）、および／または１もしくは複数の主要組織適合性クラスＩＩ
（ＭＨＣ ＩＩ）分子の発現の低減もしくは消失（例えば、例えば、本明細書で記載され
る方法により達成される、ＣＩＩＴＡの発現の低減または消失を介する）を呈示する場合
に好ましい。複数の実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、ＨＬＡ－Ｇ分子、例えば、Ｂ２Ｍ
を要求しないＨＬＡ－Ｇ分子、例えば、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４であ
る。他の実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合分子である。例示的
なＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合分子は、配列番号１０６７４である。前記ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ
融合体をコードする、例示的な核酸配列は、配列番号１０６７５である。
複数の実施形態では、細胞（例えば、細胞集団）は、ＮＫ阻害性分子の標的の発現の低
減または消失、例えば、ＬＩＬＲＢ１の発現の低減または消失を呈示する。
複数の実施形態では、本発明のＣＡＲ発現細胞（例えば、例えば、本明細書で記載され
る方法により、１または複数のタンパク質の発現または機能を、低減したか、または消失
させた細胞）は、刺激、例えば、ＣＡＲの、その標的抗原への結合に応答して増殖する能
力を維持する。複数の実施形態では、増殖は、ｅｘ ｖｉｖｏで生じる。複数の実施形態
では、増殖は、ｉｎ ｖｉｖｏで生じる。複数の実施形態では、増殖は、ｅｘ ｖｉｖｏ
およびｉｎ ｖｉｖｏの両方で生じる。複数の実施形態では、増殖レベルは、同じ細胞型
（例えば、ＣＡＲ発現細胞と同じ種類の細胞）により呈示される増殖レベルと実質的に同
じであるが、例えば、本明細書で記載される方法により低減したか、または消失させた、
１または複数のタンパク質の発現または機能を有さなかった。複数の実施形態では、増殖
レベルは、同じ細胞型（例えば、ＣＡＲ発現細胞と同じ種類の細胞）により呈示される増
殖レベルの、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５
％、少なくとも９８％、またはこれを超えるレベルであるが、例えば、本明細書で記載さ
れる方法により低減したか、または消失させた、１または複数のタンパク質の発現または
機能を有さなかった。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての技術用語お
よび科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意
味を有する。本発明の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と同様
または同等な方法および材料を使用しうるが、下記では、適する方法および材料について
記載する。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献
は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。加えて、材料、方法、および例は、
例示的なものであるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。見出し、小見
出し、または番号もしくは文字による要素、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、読
みやすさのためだけに提示される。本文献における、見出しまたは番号もしくは文字によ
る要素の使用は、ステップまたは要素が、アルファベット順に実施されることを要求する
ものでも、ステップまたは要素が、互いと個別であることを必ず要求するものでもない。
本発明の、他の特色、目的、および利点は、記載および図面、ならびに特許請求の範囲か
ら明らかであろう。
Ｃａｓ９による、Ｂ２Ｍ遺伝子座の編集を示す図である。リポフェクションによる、Ｂ２Ｍ遺伝子座をターゲティングするｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの送達の２４時間後において、ＨＥＫ－２９３ Ｃａｓ９ＧＦＰ内のＮＧＳにより検出される編集の割合である。各ドットは、異なるｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡが、一定に保持されたことを指し示す。ゲノム座標は、第１５染色体上の位置を指し示す（ｎ＝３）。 表１に列挙される、ＴＣＲアルファに対するターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子による編集の後における、ＴＣＲの発現についてのヒストグラムである。３つの異なる濃度のレンチウイルスを使用するＪｕｒｋａｔ細胞内で、７日後における、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ ＴＣＲ－細胞％が示される。 示されるｇＲＮＡと、Ｃａｓ９／ｍＣｈｅｒｒｙとをコードするレンチウイルスを導入した６および１２日後における、ＴＣＲ－初代Ｔ細胞％を示す図である。データは、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ ＴＣＲ－編集細胞％を表す。 示されたｇＲＮＡと、Ｃａｓ９／ｍＣｈｅｒｒｙとをコードするレンチウイルスをトランスフェクトされた細胞内の、再刺激（ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる）の３日後および活性化の８日後における、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ゲート集団内の、ＰＤ１－初代Ｔ細胞％を示す図である。 図５Ａおよび５Ｂ：ＴＲＡＣ－８ ｇＲＮＡを使用する培養の７日目におけるＴＣＲ（図５Ａ）、およびＰＤ１－６ ｇＲＮＡを使用する培養の８日目におけるＰＤ－１（図５Ｂ）の発現についてのヒストグラムを示す図である。 （上記の通り。） ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように操作され、ＴＣＲアルファをターゲティングするｇＲＮＡを含むＲＮＰで処置された初代Ｔ細胞の発現プロファイルを示す図である。前濃縮は、培養物中で１１日後において、ＣＡＲ＋／－およびＴＣＲ＋／－である細胞集団を示す。後濃縮は、ＣＤ３マイクロビーズ陰性選択ステップを使用する単離後において、＞９８％のＴＣＲ－ Ｔ細胞を示す。 ＣＤ１９ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞の、標的陽性細胞系（Ｎａｌｍ６－ｌｕｃ）および標的陰性細胞系（Ｋ５６２－ｌｕｃ）に対する細胞傷害性活性を示す図である。「Ｔ１」および「Ｔ８」とは、それぞれ、ｇＲＮＡ ＴＲＡＣ－１およびｇＲＮＡ ＴＲＡＣ－８を指す。レンチウイルスまたはＲＮＰにより導入されたＣａｓ９／ｇＲＮＡと、非選別Ｔ細胞集団およびＴＣＲ－で選別された（「選別」）Ｔ細胞集団の両方についての結果とが示される。 ２つのｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を援用する、Ｂ２Ｍ遺伝子内の切出しを示す図である。各実験では、細胞を、ＣＲ００４４２のターゲティングドメインを伴うｇＲＮＡ、および示された第２のｇＲＮＡ分子へと曝露した。予測される切出し産物のサイズが示される。 ｇＲＮＡ対の、Ｂ２Ｍ遺伝子への曝露の結果であって、１００未満の予測切出し産物を伴う結果を示す図である。＊は、見られる（緑矢印）予測切出し産物を指し示す。？＝予測切出し産物を、アッセイから分解できなかった。黄矢印は、野生型断片を指し示す。 ｇＲＮＡ対の、Ｂ２Ｍ遺伝子への曝露の結果であって、約４０００塩基対の予測切出し産物を伴う結果を示す図である。赤＊は、見られる（緑ボックス）予測切出し産物を指し示す。紫＊＝１０％未満の編集効率。オレンジボックスは、野生型断片を指し示す。 ｇＲＮＡ対の、Ｂ２Ｍ遺伝子への曝露の結果であって、約６０００塩基対の予測切出し産物を伴う結果を示す図である。赤＊は、見られる（緑ボックス）予測切出し産物を指し示す。紫＊＝１０％未満の編集効率。オレンジボックスは、野生型断片を指し示す。 ｄｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ系の平均（ｎ≧３）編集であって、ＨＥＫ細胞（Ｃａｓ９を安定的に発現する）内、または初代ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞（ｄｇＲＮＡの送達：電気穿孔によるＣａｓ９ ＲＮＰ）内のＴＲＡＣに対して指し示される平均編集を示す図である。また、抗ＴＣＲａ／ｂ抗体を使用するフローサイトメトリーにより決定される、ＴＣＲの喪失を呈示する細胞の％も示される。 ｄｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ系の平均（ｎ≧３）編集であって、ＨＥＫ細胞（Ｃａｓ９を安定的に発現する）内のＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２のコード領域に対して指し示される平均編集を示す図である。また、抗ＴＣＲａ／ｂ抗体を使用するフローサイトメトリーにより決定される、ＴＣＲの喪失を呈示するＴ細胞の％も示される。 ｄｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ系の平均（ｎ≧３）編集であって、ＨＥＫ細胞（Ｃａｓ９を安定的に発現する）内、ＣＤ３４＋初代ヒト造血幹細胞内のＢ２Ｍに対して指し示される平均編集と、フローサイトメトリーにより測定される、初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞内のＢ２Ｍの喪失％とを示す図である。ＮＧＳアッセイは、示された細胞へのＣＲＩＳＰＲ系の導入の２４時間後に行い、フローサイトメトリーアッセイは、ＣＤ３＋ Ｔ細胞へのＣＲＩＳＰＲ系の導入の３～５日後に行った。 ３例の異なるドナーに由来する、初代ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞内の、示されたｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系による、ＴＣＲ（フローサイトメトリー）の喪失により測定される編集を示す図である。各ｇＲＮＡについて、左バー＝ドナー＃１；中バー＝ドナー＃２；右バー＝ドナー＃３である。 ｄｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ系の平均（ｎ≧３）編集であって、ＮＧＳにより測定される、ＨＥＫ細胞（Ｃａｓ９を安定的に発現する）内のＰＤＣＤ１、および、ＰＤ－１の喪失（抗ＰＤ－１抗体を使用するフローサイトメトリー）により測定される、初代ヒトＣＤ３＋細胞（ＲＮＰ電気穿孔）内のＰＤＣＤ１に対して指し示される平均編集を示す図である。 図１７Ａ：フローサイトメトリーによる、示された比の、ＴＲＡＣおよび／またはＢ２Ｍに対するｇＲＮＡの電気穿孔後における、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍの発現を示す図である。 図１７Ｂ：示されたｇＲＮＡ比のときに、Ｂ２ＭおよびＴＣＲのいずれに対しても陰性である細胞の％を示す図である。 図１７Ｃ：フローサイトメトリーにより測定される、Ｂ２ＭまたはＴＣＲの編集を示す図である。 図１７Ｄ：電気穿孔の２４時間後における、細胞の生存率を示す図である。 初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞内の、ＰＤＣＤ１に対するターゲティングドメイン（示されたＣＲｘｘｘｘ配列のターゲティングドメイン）を含有するｄｇＲＮＡを使用する編集％であって、ＮＧＳ（黄色のバー）により測定されるか、またはフローサイトメトリー（抗ＰＤ－１抗体を使用する）によって、ＰＤ－１の喪失により測定される編集％を示す図である。ＮＧＳシーケンシングは、ＲＮＰ送達の２４時間後に実施し；フローサイトメトリーは、ＲＮＰ送達後５日目に実施した。 初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞内の、ＰＤＣＤ１に対するターゲティングドメイン（示されたＣＲｘｘｘｘ配列のターゲティングドメイン）を含有するｄｇＲＮＡを使用する編集％（ｎ＞＝３）であって、３例の異なるドナー（左端のバーであるドナー＃４；中央のバーであるドナー＃５；右端のバーであるドナー＃６）にわたり、フローサイトメトリー（抗ＰＤ－１抗体を使用する）によって、ＰＤ－１の喪失により測定される編集％を示す図である。一部の標的に対するターゲティングドメインを伴う系は、ＰＤ－１の、＞５０％の喪失を示し、複数のドナーにわたり一貫した結果を示す。ＣＲ００８５２、ＣＲ００８２８、ＣＲ００８７０、ＣＲ００８４８、ＣＲ００８５５、およびＣＲ００８３８のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡは、少なくとも２例のドナーにわたり、５０％を超える編集を示す。 初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞内の、Ｂ２Ｍに対するターゲティングドメイン（示されたＣＲｘｘｘｘ配列のターゲティングドメイン）を含有するｄｇＲＮＡを使用する編集％（ｎ＞＝３）であって、３例の異なるドナー（左端のバーであるドナー＃１；中央のバーであるドナー＃４；右端のバーであるドナー＃５）にわたり、フローサイトメトリーによって、Ｂ２Ｍの喪失により測定される編集％を示す図である。一部の標的配列に対するターゲティングドメインを伴う系は、Ｂ２Ｍの、＞４０％の喪失を示し、複数のドナーにわたり一貫した結果を示す。ＣＲ００４４２、ＣＲ００４４４、およびＣＲ００４５５のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡは、少なくとも２例のドナーにわたり、４０％を超える編集を示す。 示された、ＦＫＢＰ１Ａに対するターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡ（各非標識バーは、標識番号の間の、ＣＲｘｘｘｘが奇数のターゲティングドメインを使用する。例えば、ＣＲ００２０７３のターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡのデータは、標識されたＣＲ００２０７２と、ＣＲ００２０７４との間のバーにおいて報告される）を使用するＣａｓ９を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞内で、ＮＧＳにより測定される編集％（Ｎ＝３）を示す図である。 ＮＧＳにより測定される、示された、ＦＫＢＰ１Ａに対するターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡを使用する、Ｃａｓ９を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞内の編集％（Ｎ＝３）およびフレームシフト（ＦＳ）編集％を示す図である。 ＮＧＳにより測定される、示された、ＦＫＢＰ１Ａに対するターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡを使用する、Ｃａｓ９を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞内の編集％（Ｎ＝３）およびフレームシフト（ＦＳ）編集％を示す図である。 示された、ＦＫＢＰ１Ａに対するターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡを含むＲＮＰを使用するＣＤ３＋ Ｔ細胞内で、ＮＧＳにより測定される編集％（Ｎ＝３）およびフレームシフト編集％（ＦＳ編集）を示す図である。 標的に対するｇＲＮＡを含むＲＮＰの逐次的電気穿孔、または標的に対するｇＲＮＡを含むＲＮＰの同時的電気穿孔の後において、ＦＡＣＳにより測定される（第１の電気穿孔後４日目に）、Ｂ２Ｍ－ ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＴＣＲ－ ＣＤ３＋ Ｔ細胞（抗ＣＤ３Ａｂにより測定される）、またはＢ２Ｍ－／ＴＣＲ－ ＣＤ３＋ Ｔ細胞（二重陰性）の％を示す図である。 単回の電気穿孔、標的に対するｇＲＮＡを含むＲＮＰの逐次的電気穿孔、または標的に対するｇＲＮＡを含むＲＮＰの同時的（「Ｓｉｍｕｌｔ」）電気穿孔 （Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣ）の後において、ＮＧＳにより測定される（第１の電気穿孔の４８時間後に）、Ｂ２Ｍ－ ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＴＣＲ－ ＣＤ３＋ Ｔ細胞（抗ＣＤ３Ａｂにより測定される）、またはＢ２Ｍ－／ＴＣＲ－ ＣＤ３＋ Ｔ細胞（二重陰性）の％を示す図である。 遺伝子編集されたＴＣＲ－／Ｂ２Ｍ－ ＢＣＭＡ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞の調製についての概略図である。 図２８：（ＲＮＰの）電気穿孔の５日後における、ＴＣＲ（抗ＣＤ３－ＰｅｒｃｐＣｙ５．５を使用する）およびＢ２Ｍ（抗Ｂ２Ｍ－ＡＰＣを使用する）の表面発現を示す図である。Ｂ２Ｍに対するｇＲＮＡを含有するＲＮＰを形質導入されたＴ細胞は、「Ｂ２Ｍ」と標識し；ＴＲＡＣに対するｇＲＮＡを含有するＲＮＰを形質導入されたＴ細胞は、「ＴＣＲ」と標識する。ＢＣＭＡ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞は、「ＣＡＲ」と表示する。非形質導入細胞は、「ＵＴＤ」と表示する。Ｃａｓ９は電気穿孔されているが、ガイドＲＮＡは電気穿孔されていない細胞は、「ガイドなし」と表示する。抗ＣＤ４－Ｖ４５０を使用するＣＤ４染色を、下パネルに示して、ＣＤ３染色の喪失が、ＴＣＲの喪失に起因し、Ｔ細胞の喪失に起因するのではないことを検証する。 （上記の通り。） 全Ｔ細胞内で、各集団に由来するＣＡＲ＋ Ｔ細胞と対比して比較した、ＴＣＲおよびＢ２Ｍの表面発現を示す図である。「ＣＡＲ」は、ＣＡＲの形質導入を指し示し；「ガイドなし」は、ｇＲＮＡを伴わないＣａｓ９の電気穿孔を指し示し；「Ｂ２Ｍ」は、Ｂ２Ｍに特異的なｇＲＮＡを含有するＲＮＰによる電気穿孔を指し示し；「ＴＣＲ」は、ＴＲＡＣに特異的なｇＲＮＡを含有するＲＮＰによる電気穿孔を指し示す。 Ｂ２Ｍ（「Ｂ２Ｍ」）およびＴＲＡＣ（「ＴＣＲ」）に特異的なｇＲＮＡを含有するＲＮＰで電気穿孔された細胞内、またはｇＲＮＡを伴わないＣａｓ９（「ガイドなし」）で電気穿孔された細胞内のＣＡＲ発現レベルを示す図である。 高レベルのＢＣＭＡを発現する（ＫＭＳ１１）か、低レベルのＢＣＭＡを発現する（ＲＰＭＩ８２２６）か、またはＢＣＭＡ－である（Ｎａｌｍ６）腫瘍細胞系に応答する、Ｔ細胞の増殖についての査定を示す図である。Ｔ細胞を、示された通り、ｇＲＮＡを伴わないＣａｓ９（「ガイドなし」）で電気穿孔するか、もしくはＢ２ＭおよびＴＲＡＣに対するｇＲＮＡを含有するＲＮＰ（「Ｂ２Ｍ＋ＴＣＲ」）で電気穿孔し、かつ／またはＢＣＭＡ ＣＡＲ（「ＢＣＭＡ ＣＡＲ」）をコードするレンチウイルスベクターを形質導入するか、もしくは非形質導入（「ＵＴＤ」）とする。 高レベルのＢＣＭＡを発現する（ＫＭＳ１１）か、低レベルのＢＣＭＡを発現する（ＲＰＭＩ８２２６）か、またはＢＣＭＡ－である（Ｎａｌｍ６）腫瘍細胞系に応答する、ＣＡＲ＋ ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を示す図である。細胞を、示された通り、ｇＲＮＡを伴わないＣａｓ９（「ガイドなし」）で電気穿孔するか、もしくはＢ２ＭおよびＴＲＡＣに対するｇＲＮＡを含有するＲＮＰ（「Ｂ２Ｍ＋ＴＣＲ」）で電気穿孔し、かつ／またはＢＣＭＡ ＣＡＲ（「ＢＣＭＡ ＣＡＲ」）をコードするレンチウイルスベクターを形質導入するか、もしくは非形質導入（「ＵＴＤ」）とする。 図３３Ａおよび３３Ｂ：ＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮＡの、細胞表面のＴＣＲの発現に対する効果についての査定を示す図である。３３Ａは、ガイドである、ＣＲ０００９６１（９６１）、ＣＲ０００９７８（９７８）、ＣＲ０００９８４（９８４）、ＣＲ０００９９２（９９２）、ＣＲ０００９８５（９８５）、およびＣＲ０００９６０（ｇＲＮＡ１）、およびＣＲ０００９７９（ｇＲＮＡ８）を含有するＲＮＰについて、ＣＤ３染色の喪失が示されることを示す。３３Ｂは、ガイドである、ＣＲ０００９９１（９９１）、ＣＲ０００９９２（９９２）、ＣＲ０００９９３（９９３）、およびＣＲ０００９７８（９７８）を含有するＲＮＰについて、ＣＤ３染色の喪失が示されることを示す。９９１と、９９２とは、ほぼ重ね合わせ可能である。 （上記の通り。） 図３３Ｃ：示されたＴＲＡＣ遺伝子座をターゲティングするｇＲＮＡを含有するＲＮＰによる、ヒト初代Ｔ細胞電気穿孔から生じる、ＴＲＡＣ遺伝子座のゲノムの編集を示す図である。挿入または欠失の頻度（％インデル）を指し示し、コード配列のフレームシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百分率（フレームシフト編集％）を示す。 図３４Ａおよび３４Ｂ：初代ヒトＴ細胞編集のために使用される、各ＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮＡについて最も高頻度で観察される、上位５つの配列変化を、詳細に示す図である。図３４Ａおよび３４Ｂは、２つの独立に実施された電気穿孔実験からのアウトカムである。野生型（ｗｔ）の非修飾塩基を、大文字で示す。ｗｔ配列と比べた欠失を、「－」で示し、ｗｔ配列と比べた挿入を、小文字で示す。各実験についてのデータは、三連のＰＣＲ産物による平均である。図３４Ａ～３４Ｂは、それぞれ、出現の順に、配列番号１０８４５～１０８９９を開示する。 （上記の通り。） Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡの、細胞表面のＢ２Ｍの発現に対する効果についての査定を示す図である。ガイド番号は、ターゲティングドメインのＣＲ００ｘｘｘ識別子を指し示す。 Ｂ２Ｍ遺伝子座をターゲティングする、示されたｇＲＮＡを含有するＲＮＰによる、ヒト初代Ｔ細胞の電気穿孔から生じる、Ｂ２Ｍ遺伝子座のゲノム編集を示す図である。挿入または欠失の頻度（％インデル）を指し示し、コード配列のフレームシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百分率（フレームシフト編集％）を上パネルに示す。初代ヒトＴ細胞編集のために使用される、Ｂ２Ｍをターゲティングする各ｇＲＮＡについて最も高頻度で観察される、上位１０の配列変化を、下パネルに詳細に示す。野生型（ｗｔ）の非修飾塩基を、大文字で示す。ｗｔ配列と比べた欠失を、「－」で示し、ｗｔ配列と比べた挿入を、小文字で示す。データは、三連のＰＣＲ産物による平均である。図３６は、それぞれ、出現の順に、配列番号１０９００～１０９１９を開示する。 示された濃度の、示されたＣＩＩＴＡに対するｄｇＲＮＡ（番号は、ターゲティングドメインのＣＲｘｘｘｘｘ識別子を指し示す）を含むＲＮＰによる、初代ヒトＴ細胞の電気穿孔後３日目（細胞培養の５日目）における編集％であって、抗ＨＬＡ－ＤＲ試薬を使用するフローサイトメトリーにより測定される編集％を示す図である。 ＣＩＩＴＡ遺伝子座をターゲティングする、示されたｇＲＮＡを含有するＲＮＰによる、ヒト初代Ｔ細胞の電気穿孔から生じる、ＣＩＩＴＡ遺伝子座のゲノム編集を示す図である。挿入または欠失の頻度（％インデル）を指し示し、コード配列のフレームシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百分率（フレームシフト編集％）を示す。最も高頻度で観察される、上位５つの配列変化を、下パネルに詳細に示す。野生型（ｗｔ）の非修飾塩基を、大文字で示す。ｗｔ配列と比べた欠失を、「－」で示し、ｗｔ配列と比べた挿入を、小文字で示す。データは、三連のＰＣＲ産物による平均である。図３８は、それぞれ、出現の順に、配列番号１０９２０～１０９３９を開示する。 示された濃度で、ＣＩＩＴＡに対する、示されたｄｇＲＮＡ（番号は、ターゲティングドメインのＣＲ００ｘｘｘｘ識別子を指し示す）を含むＲＮＰによる、初代ヒトＴ細胞内の電気穿孔後３日目における編集％であって、抗ＨＬＡ－ＤＲ試薬を使用するフローサイトメトリーにより測定される編集％を示す図である。編集％は、ガイドＲＮＡを伴わずに電気穿孔された細胞内の発現と比べた、ＣＩＩＴＡガイドを伴い電気穿孔された細胞の細胞表面における、ＨＬＡ－ＤＲの発現を表す。 ＣＩＩＴＡ遺伝子座をターゲティングする、示されたｇＲＮＡを含有するＲＮＰによる、ヒト初代Ｔ細胞の電気穿孔から生じる、ＣＩＩＴＡ遺伝子座のゲノム編集を示す図である。挿入または欠失の頻度（％インデル）を指し示し、コード配列のフレームシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百分率（フレームシフト編集％）を示す。 初代ヒトＴ細胞編集のために使用される、各ＣＩＩＴＡをターゲティングするｇＲＮＡについて最も高頻度で観察される、上位５つの配列変化（インデル）を示す図である。データは、三連のＰＣＲ産物による平均である。野生型（ｗｔ）の非修飾塩基を、大文字で示す。ｗｔ配列と比べた欠失を、「－」で示し、ｗｔ配列と比べた挿入を、小文字で示す。図４１は、それぞれ、出現の順に、配列番号１０９４０～１０９７４を開示する。 示された濃度で、ＣＩＩＴＡに対する、示されたｄｇＲＮＡ（番号は、ターゲティングドメインのＣＲ００ｘｘｘｘ識別子を指し示す）を含むＲＮＰによる、初代ヒトＴ細胞内の電気穿孔後３日目における編集％であって、抗ＨＬＡ－ＤＲ試薬を使用するフローサイトメトリーにより測定される編集％を示す図である。編集％は、ガイドＲＮＡを伴わずに電気穿孔された細胞内の発現と比べた、ＣＩＩＴＡガイドを伴い電気穿孔された細胞の細胞表面における、ＨＬＡ－ＤＲの発現を表す。 ＣＩＩＴＡ遺伝子座をターゲティングする、示されたｇＲＮＡを含有するＲＮＰによる、ヒト初代Ｔ細胞の電気穿孔から生じる、ＣＩＩＴＡ遺伝子座のゲノム編集を示す図である。挿入または欠失の頻度（％インデル）を指し示し、コード配列のフレームシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百分率（フレームシフト編集％）を示す。 初代ヒトＴ細胞編集のために使用される、各ＣＩＩＴＡをターゲティングするｇＲＮＡについて最も高頻度で観察される、上位５つの配列変化を示す図である。データは、三連のＰＣＲ産物による平均である。野生型（ｗｔ）の非修飾塩基を、大文字で示す。ｗｔ配列と比べた欠失を、「－」で示し、ｗｔ配列と比べた挿入を、小文字で示す。図４４は、それぞれ、出現の順に、配列番号１０９７５～１１０１４を開示する。 Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、およびＣＩＩＴＡ遺伝子座において編集された初代ヒトＴ細胞（三重編集細胞）を調製するための概略的プロトコールを示す図である。 フローサイトメトリーにより、ＣＤ３イプシロン、Ｂ２Ｍ、およびＨＬＡ－ＤＲ、それぞれの細胞表面発現について調べることによる、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡの編集についての査定を示す図である。細胞表面発現は、単一のターゲティングＲＮＰ（単一のＢ２Ｍ ４４２、単一のＴＲＡＣ ９６１、または単一のＣＩＩＴＡ ９９１）、または３つのＲＮＰを同時に（三重１、三重２、三重３、三重４；図４５の詳細に従う）で電気穿孔された細胞内で調べた。電気穿孔を伴わない細胞は、「ＥＰなし」と表示する。Ｃａｓ９は電気穿孔されているが、ガイドＲＮＡは電気穿孔されていない細胞は、「ガイドなし」と表示する。 Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、およびＣＩＩＴＡ遺伝子座をターゲティングするｇＲＮＡを含有する３つのＲＮＰによる、ヒト初代Ｔ細胞の同時的な電気穿孔から生じる、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、およびＣＩＩＴＡ遺伝子座のゲノム編集を示す図である。挿入または欠失の頻度（％インデル）を指し示し、コード配列のフレームシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百分率を、カッコ内に示す。 異なる濃度の各ＲＮＰの、３つの遺伝子座の同時的編集（三重編集）の文脈で、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡであるＣＲ００４４２のための、初代ヒトＴ細胞内のＢ２Ｍ遺伝子座において最も高頻度で観察される、上位１０の配列変化であって、図４５の概略図において示される配列変化を示す図である。野生型（ｗｔ）の非修飾塩基を、大文字で示す。ｗｔ配列と比べた欠失を、「－」で示し、ｗｔ配列と比べた挿入を、小文字で示す。データは、三連のＰＣＲ産物による平均である。図４８は、それぞれ、出現の順に、配列番号１１０１５～１１０５４を開示する。 異なる濃度の各ＲＮＰの、３つの遺伝子座の同時的編集（三重編集）の文脈で、ＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮＡであるＣＲ０００９６１のための、初代ヒトＴ細胞内のＴＲＡＣ遺伝子座において最も高頻度で観察される、上位１０の配列変化であって、図４５の概略図において示される配列変化を示す図である。野生型（ｗｔ）の非修飾塩基を、大文字で示す。ｗｔ配列と比べた欠失を、「－」で示し、ｗｔ配列と比べた挿入を、小文字で示す。データは、三連のＰＣＲ産物による平均である。図４９は、それぞれ、出現の順に、配列番号１１０５５～１１０９４を開示する。 異なる濃度の各ＲＮＰの、３つの遺伝子座の同時的編集（三重編集）の文脈で、ＣＩＩＴＡをターゲティングするｇＲＮＡであるＣＲ００２９９１のための、初代ヒトＴ細胞内のＣＩＩＴＡ遺伝子座において最も高頻度で観察される、上位１０の配列変化であって、図４５の概略図において示される配列変化を示す図である。野生型（ｗｔ）の非修飾塩基を、大文字で示す。ｗｔ配列と比べた欠失を、「－」で示し、ｗｔ配列と比べた挿入を、小文字で示す。データは、三連のＰＣＲ産物による平均である。図５０は、それぞれ、出現の順に、配列番号１１０９５～１１１３４を開示する。 ガイドＲＮＡのフォーマットを、編集の効率について査定したことを示す図である。ＴＲＡＣ（ＣＲ０００９６１；上パネル）またはＢ２Ｍ（ＣＲ００４４２；下パネル）に対するガイドＲＮＡは、示された化学修飾（ＰＳまたはＯＭｅＰＳ）を伴うかまたは伴わない、単一ガイドフォーマットまたは二重ガイドフォーマットで合成した。ＲＮＰは、示された濃度で、ヒト初代Ｔ細胞へと電気穿孔した。編集効率は、フローサイトメトリーにより、ＴＲＡＣの編集については、ＣＤ３イプシロンの細胞表面染色（上）の解析により査定し、Ｂ２Ｍの編集については、Ｂ２Ｍタンパク質の細胞表面染色（下）の解析により査定した。 ＦＫＢＰ１Ａをターゲティングする、示されたｇＲＮＡを含有するＲＮＰによる、ヒト初代Ｔ細胞の電気穿孔から生じる、ＦＫＢＰ１Ａ遺伝子座のゲノム編集を示す図である。挿入または欠失の頻度（％インデル）を指し示し、コード配列のフレームシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百分率を示す。 初代ヒトＴ細胞の編集のために使用される、ＦＫＢＰ１Ａをターゲティングする各ｇＲＮＡについて、最も高頻度で観察される、上位５つの配列変化を示す図である。野生型（ｗｔ）の非修飾塩基を、大文字で示す。ｗｔ配列と比べた欠失を、「－」で示し、ｗｔ配列と比べた挿入を、小文字で示す。データは、三連のＰＣＲ産物による平均である。図５３は、それぞれ、出現の順に、配列番号１１１３５～１１１５９を開示する。 Ｔ細胞を、ＦＫＢＰ１Ａに対するターゲティングドメインを含むｇＲＮＡを含有するＲＮＰ（ＣＲ００２０８６、ＣＲ００２０９７、ＣＲ００２１２２；それぞれ、２０８６、２０９７、および２１１２として表示される）、また陰性対照：４４２（Ｂ２Ｍをターゲティングする、非関与のガイドＣＲ００４４２）；Ｃａｓ９（ｔｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを伴わないＣａｓ９単独）；ｔｒＲＮＡ（ｔｒａｃeｒＲＮＡを伴うが、ｃｒＲＮＡも、Ｃａｓ９タンパク質も伴わない）；Ｃａｓ９＋ｔｒＲＮＡ（Ｃａｓ９およびｔｒａｃeｒＲＮＡを伴うが、ｃｒＲＮＡは伴わない）；ＥＰ（電気穿孔を伴う細胞だけ）；ＥＰなし（電気穿孔を伴わない細胞だけ）で編集したことを示す図である。電気穿孔後、細胞を、２．５ｎＭのＲＡＤ００１で処置する（上パネル）か、または非処置のまま放置し（下パネル）、フローサイトメトリーによって、Ｓ６のリン酸化（ｐＳ６）を解析することにより、ｍＴＯＲ経路の阻害に対する影響を査定した。Ｙ軸は、前方散乱（ＦＳＣ）を指し示し、Ｘ軸は、ｐＳ６のレベルを指し示す。アイソタイプ抗体により染色された対照において見られる蛍光レベル（図示しない）の上方にゲートをかけることにより、ｐＳ６（ゲーティングの出力に示される）に対する陽性染色を決定した。フローサイトメトリーデータによる、Ｓ６リン酸化の定量化を、グラフの下パネルに示す。 図５５Ａおよび５５Ｂ：抗原への曝露に応答した、編集ＣＡＲＴ細胞によるサイトカイン産生を示す図である。遺伝子編集は、ＣＲ０００９６１ガイドを使用して、ＴＲＡＣ遺伝子座をターゲティングし、かつ／またはＣＲ００２０９７およびＣＲ００２０８６のガイド（それぞれ、ｃｒ９６１、２０９７、および２０８６として表示される）を使用して、ＦＫＢＰ１Ａ遺伝子座をターゲティングするＣＡＲＴ細胞に対して実施した。ガイドなしＲＮＡを含有するＲＮＰで電気穿孔されたＣＡＲＴ細胞は、陰性対照として調製した。ＣＡＲＴ－ＣＤ１９、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－１０、または非形質導入（ＵＴＤ）（示された通り）を発現するＣＡＲＴ細胞を、エフェクター対標的比を１：１または１：２．５（示された通り）として、示されたがん細胞（ＫＭＳ１１（ＢＣＭＡ陽性）、Ｎａｌｍ６（ＣＤ１９陽性）、またはＲＰＭＩ８２２６（ＢＣＭＡ陽性））と混合した。細胞培養物上清を回収し、インターフェロンガンマを測定する（図Ａ）か、またはＩＬ－２を測定した（図Ｂ）。 （上記の通り。） 編集ＣＡＲＴ細胞による、抗原陽性がん細胞系の殺滅を示す図である。遺伝子編集は、ＣＲ０００９６１ガイドを使用して、ＴＲＡＣ遺伝子座をターゲティングし、かつ／またはＣＲ００２０９７およびＣＲ００２０８６のガイド（それぞれ、ｃｒ９６１、２０９７、および２０８６として表示される）を使用して、ＦＫＢＰ１Ａ遺伝子座をターゲティングするＣＡＲＴ細胞に対して実施した。ガイドなしＲＮＡを含有するＲＮＰで電気穿孔されたＣＡＲＴ細胞は、陰性対照として調製した。ＣＡＲＴ－ＣＤ１９、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－１０、または非形質導入（ＵＴＤ）（示された通り）を発現するＣＡＲＴ細胞を、エフェクター対標的比を１：１として、ルシフェラーゼレポーターを安定的に発現する、示されたがん細胞系（ＫＭＳ１１（ＢＣＭＡ陽性）、Ｎａｌｍ６（ＣＤ１９陽性）、またはＲＰＭＩ８２２６（ＢＣＭＡ陽性））と混合した。ルシフェラーゼシグナルを測定し、細胞の殺滅を、ルシフェラーゼ活性の喪失として決定した。 抗原への曝露に応答した、編集ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す図である。遺伝子編集は、ＣＲ０００９６１のガイドを使用して、ＴＲＡＣ遺伝子座をターゲティングし、かつ／またはＣＲ００２０９７およびＣＲ００２０８６のガイドを使用して、ＦＫＢＰ１Ａ遺伝子座（それぞれ、９６１、２０９７、および２０８６で表示する）をターゲティングするＣＡＲＴ細胞に対して実施した。ガイドなしＲＮＡを含有するＲＮＰで電気穿孔されたＣＡＲＴ細胞は、陰性対照として調製した。ＣＡＲＴ－ＣＤ１９（標識されたＣＤ１９ＣＡＲ）、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－１０（標識されたＢＣＭＡ１０ＣＡＲ）、または非形質導入（ＵＴＤ）（示された通り）を発現するＣＡＲＴ細胞を、エフェクター対標的比を１：１として、示されたがん細胞系（ＫＭＳ１１（ＢＣＭＡ陽性）、Ｎａｌｍ６（ＣＤ１９陽性）、またはＲＰＭＩ８２２６（ＢＣＭＡ陽性））と混合した。増殖は、ＣＡＲ＋である、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の合計を、一定数のカウンティングビーズと比べてカウントすることにより測定した。 図５８：遺伝子（ＴＲＡＣおよび／またはＦＫＢＰ１Ａ）編集されたＣＡＲＴ細胞の、ＲＡＤ００１に対する感受性を示す図である。ＢＣＭＡ１０ ＣＡＲを発現するＣＡＲＴ細胞（Ａ）、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＣＡＲＴ細胞（Ｂ）、またはＣＡＲを発現しないＣＡＲＴ細胞（Ｃ；ＵＴＤ）を調製した。遺伝子編集は、ＣＲ０００９６１のガイドを使用して、ＴＲＡＣ遺伝子座をターゲティングし、かつ／またはＣＲ００２０９７およびＣＲ００２０８６のガイドを使用して、ＦＫＢＰ１Ａ遺伝子座（それぞれ、９６１、２０９７、および２０８６で表示する）をターゲティングする、ＣＡＲＴ細胞またはＵＴＤ細胞に対して実施した。ガイドなしＲＮＡを含有するＲＮＰで電気穿孔されたＣＡＲＴ細胞は、陰性対照として調製した。ＲＮＰによる電気穿孔の後で、細胞を、２．５ｎＭのＲＡＤ００１で処置する（上パネル；ＲＡＤ００１を伴うで表示する）か、または非処置のまま放置し（下パネル；ＲＡＤ００１を伴わないで表示する）、フローサイトメトリーによって、Ｓ６のリン酸化（ｐＳ６）を解析することにより、ｍＴＯＲ経路阻害に対する影響を査定した。Ｙ軸は、側方散乱（ＳＳＣ）を指し示し、Ｘ軸は、リン酸化Ｓ６タンパク質（ｐＳ６）のレベルを指し示す。ＦＡＣＳプロットの右下象限に示される、ｐＳ６についての陽性染色は、アイソタイプ抗体により染色された対照において見られる蛍光レベル（図示しない）の上方にゲートをかけることにより決定した。Ｓ６をリン酸化させた細胞の百分率を、ヒストグラム（上パネル）およびグラフ（下パネル）で示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） ＨＬＡ－Ｇフローサイトメトリーにより検出される、ＳｕｐＴ１細胞内の、ＨＬＡ－Ｇ／Ｂ２Ｍ融合タンパク質の発現を示す図である。ライトグレーのヒストグラムは、ＰＥチャネルの、非形質導入細胞内のバックグラウンド蛍光を指し示す。ダークグレーのヒストグラムは、ＰＥチャネル内の、ＨＬＡ－Ｇ／Ｂ２Ｍを形質導入された細胞に由来する蛍光を指し示す。 ＣＤ３４＋造血幹細胞内の、異なるＣａｓ９変異体によりターゲティングされたＢ２Ｍ遺伝子座における編集効率であって、ＮＧＳおよびフローサイトメトリーにより査定される編集効率を示す図である。ＮＬＳ＝ＳＶ４０ ＮＬＳであり；Ｈｉｓ６（配列番号１０７９５）またはＨｉｓ８（配列番号１０７９６）とは、それぞれ、６つまたは８つのヒスチジン残基を指し；ＴＥＶ＝タバコエッチウイルスの切断部位であり；Ｃａｓ９＝野生型化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９である（突然変異または変異体は、示された通りである）。 初代ヒトＴ細胞内の、異なるＣａｓ９変異体によりターゲティングされたＢ２Ｍ遺伝子座における編集効率および濃度範囲であって、フローサイトメトリーにより測定される編集効率および濃度範囲を示す図である。 Ｂ２Ｍ（左パネル）またはＴＲＡＣ（右パネル）をターゲティングする、２つの異なるｇＲＮＡを使用する、初代ヒトＴ細胞内の、多様な濃度の、２つの異なるＣａｓ９変異体の編集効率を示す図である。編集効率（編集％）は、フローサイトメトリーによって、Ｂ２Ｍ（左パネル）またはＴＣＲ（右パネル）の細胞表面発現の喪失を測定することにより測定した。 Ｃａｓ９を過剰発現するＨＥＫ－２９３細胞においてｄｓＤＮＡオリゴ挿入法を使用して、ＴＲＡＣガイドおよびＢ２Ｍガイドのオフターゲット活性について評価したことを示す図である。検出されたオンターゲット部位（三角）および潜在的なオフターゲット部位（丸）を表示する。ｙ軸は、検出頻度を指し示す。全てのｇＲＮＡについて、ＣＲｘｘｘｘｘ識別子により表示されるターゲティングドメインを伴う、ｄｇＲＮＡフォーマットで調べた。示された各ｇＲＮＡは、３つの５’側ヌクレオチド間結合および３つの３’側ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合（「ＰＳ」）となるように修飾した。 Ｃａｓ９を過剰発現するＨＥＫ－２９３細胞においてｄｓＤＮＡオリゴ挿入法を使用して、ＣＩＩＴＡ、ＦＫＢＰ１Ａ、ＰＤＣＤ１、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ２をターゲティングするガイドＲＮＡ分子のオフターゲット活性について評価したことを示す図である。検出されたオンターゲット部位（三角）および潜在的なオフターゲット部位（丸）を表示する。ｙ軸は、検出頻度を指し示す。全てのｇＲＮＡについて、ＣＲｘｘｘｘｘ識別子により表示されるターゲティングドメインを伴う、ｄｇＲＮＡフォーマットで調べた。 ＣＤ３デルタをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系（示されたターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡ）を導入した７２時間後における、ＣＤ３の表面発現の喪失（フローサイトメトリーにより測定される）により測定される、初代ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞内の編集％を示す図である。各ＣＤ３陰性細胞％は、３つの独立した実験の平均（ＳＤ＝標準偏差）である。 ＣＤ３ガンマをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系（示されたターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡ）を導入した７２時間後における、ＣＤ３の表面発現の喪失（フローサイトメトリーにより測定される）により測定される、初代ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞内の編集％を示す図である。各ＣＤ３陰性細胞％平均値は、３つの独立した実験の平均（ＳＤ＝標準偏差）である。
定義
「ＣＲＩＳＰＲ系」、「Ｃａｓ系」、または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」という用語は
、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子と、ｇＲＮＡ分子とを含む分
子のセットであって、併せて、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子
による、標的配列における核酸の修飾を方向付け、実行するのに必要かつ十分なセットを
指す。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ｇＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃ
ａｓ９タンパク質とを含む。本明細書では、Ｃａｓ９または修飾Ｃａｓ９分子を含む、こ
のような系を、「Ｃａｓ９系」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系」と称する。１つの例
では、ｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ分子とは、複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複
合体を形成する。
「ガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ分子」、「ｇＲＮＡ分子」、または「ｇＲＮＡ」と
いう用語は、互換的に使用され、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分
子（典型的に、ｇＲＮＡ分子と複合体化させた）の、標的配列への特異的な方向付けを促
進する核酸分子のセットを指す。一部の実施形態では、前記方向付けは、ｇＲＮＡの部分
の、ＤＮＡへのハイブリダイゼーション（例えば、ｇＲＮＡのターゲティングドメインを
介する）を介して、かつ、ｇＲＮＡ分子の部分の、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他
のエフェクター分子への結合（例えば、少なくともｇＲＮＡのｔｒａｃｒを介する）によ
り達せられる。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、本明細書では、「単一ガイドＲＮ
Ａ」または「ｓｇＲＮＡ」などと称する、単一の連続ポリヌクレオチド分子からなる。他
の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、複数のポリヌクレオチド分子、通例、２つのポリヌク
レオチド分子であって、それら自体、通例、ハイブリダイゼーションを介して、会合が可
能であり、本明細書では、「二重ガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」などと称するポリ
ヌクレオチド分子からなる。ｇＲＮＡ分子は、下記でより詳細に記載されるが、一般に、
ターゲティングドメインとｔｒａｃｒとを含む。複数の実施形態では、ターゲティングド
メインとｔｒａｃｒとを、単一のポリヌクレオチド上に配置する。他の実施形態では、タ
ーゲティングドメインとｔｒａｃｒとを、別個のポリヌクレオチド上に配置する。
ｇＲＮＡとの関連で使用される用語としての「ターゲティングドメイン」という用語は
、標的配列、例えば、細胞の核酸内、例えば、遺伝子内の標的配列を認識する、例えば、
これに相補的である、ｇＲＮＡ分子の部分である。
ｇＲＮＡ分子との関連で使用される用語としての「ｃｒＲＮＡ」という用語は、ターゲ
ティングドメインと、ｔｒａｃｒと相互作用して、フラッグポール領域を形成する領域と
を含む、ｇＲＮＡ分子の部分である。
「標的配列」という用語は、ｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的、例えば、完
全に相補的な核酸の配列を指す。複数の実施形態では、標的配列は、ゲノムＤＮＡ上に配
置される。ある実施形態では、標的配列は、（ＤＮＡの同じ鎖上または相補的な鎖上で）
ヌクレアーゼ活性または他のエフェクター活性を有するタンパク質により認識されるプロ
トスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、例えば、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配
列に隣接する。複数の実施形態では、標的配列は、同種異系Ｔ細胞標的の標的配列である
。複数の実施形態では、標的配列は、阻害性分子の標的配列である。複数の実施形態では
、標的配列は、阻害性分子の下流のエフェクターの標的配列である。
本明細書において、ｇＲＮＡ分子との関連で使用される「フラッグポール」という用語
は、ｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒとが、互いに結合するか、または互いにハイブリダイズす
る、ｇＲＮＡの部分を指す。
本明細書において、ｇＲＮＡ分子との関連で使用される「ｔｒａｃｒ」という用語は、
ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子に結合するｇＲＮＡの部分を指す。複数の実施
形態では、ｔｒａｃｒは、Ｃａｓ９に特異的に結合する核酸配列を含む。複数の実施形態
では、ｔｒａｃｒは、フラッグポールの一部を形成する核酸配列を含む。
「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９分子」という用語は、ＤＮＡ切断の一因となる、細菌性
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する酵素を指す。Ｃａｓ９はまた、野生型タンパク
質のほか、その機能的突然変異体および非機能的突然変異体も含む。
核酸との関連で使用される「相補的」という用語は、塩基の対合、Ａの、ＴまたはＵと
の対合、およびＧの、Ｃとの対合を指す。相補的という用語は、完全に相補的な核酸分子
、すなわち、基準配列の全体にわたり、Ａ－Ｔ対またはＡ－Ｕ対、およびＧ－Ｃ対を形成
する核酸分子のほか、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相補的な分子
も指す。
相同性指向修復または相同組換えとの関連で使用される「鋳型核酸」とは、切断部位に
おける遺伝子修復（挿入）のために、ＣＲＩＳＰＲ系ドナー配列による修飾部位に挿入さ
れる核酸を指す。一態様では、鋳型核酸は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受
容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む。一態様では、鋳型核酸は、例えば、本明細
書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むベクターを含む
。
本明細書で使用される用語としての「インデル」とは、ｇＲＮＡ分子、例えば、ＣＲＩ
ＳＰＲ系を含む組成物への曝露の後で生じる、基準核酸と比べて、１もしくは複数のヌク
レオチドの挿入、１もしくは複数のヌクレオチドの欠失、またはヌクレオチドの挿入と欠
失との組合せを含む核酸を指す。インデルは、ｇＲＮＡ分子を含む組成物への曝露の後で
、例えば、ＮＧＳにより核酸をシーケンシングすることにより決定することができる。イ
ンデル部位に関して、それが、基準部位から、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２
、もしくは１ヌクレオチド以内に、少なくとも１つの挿入もしくは欠失を含むか、または
前記基準部位の一部もしくは全部と重複する（例えば、少なくとも１つの挿入または欠失
であって、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイン、例えば、本明細書で記載されるｇＲ
ＮＡ分子に相補的な部位と重複する挿入もしくは欠失、またはこれから、１０、９、８、
７、６、５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチド以内の挿入もしくは欠失を含む）場合
、インデルは基準部位（例えば、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な部位
）「に、またはこの近傍に」あるという。
本明細書で使用される用語としての「インデルパターン」とは、ｇＲＮＡ分子を含む組
成物への曝露の後で生じる、インデルのセットを指す。ある実施形態では、インデルパタ
ーンは、出現の頻度による、上位３つのインデルからなる。ある実施形態では、インデル
パターンは、出現の頻度による、上位５つのインデルからなる。ある実施形態では、イン
デルパターンは、全シーケンシングリードと比べて、約５％を超える頻度で存在するイン
デルからなる。ある実施形態では、インデルパターンは、インデルシーケンシングリード
（すなわち、非修飾基準核酸配列からならないリード）の総数と比べて、約１０％を超え
る頻度で存在するインデルからなる。ある実施形態では、インデルパターンは、最も高頻
度で観察される、上位５つのインデルのうちの任意の３つを含む。インデルパターンは、
例えば、ｇＲＮＡ分子へと曝露された細胞集団の細胞をシーケンシングすることにより決
定することができる。
本明細書で使用される用語としての「オフターゲットインデル」とは、ｇＲＮＡ分子の
ターゲティングドメインの標的配列以外の部位におけるインデル、またはその近傍におけ
るインデルを指す。このような部位は、例えば、ｇＲＮＡのターゲティングドメインの配
列と比べて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれを超えるミスマッチヌクレオチ
ドを含みうる。例示的な複数の実施形態では、このような部位を、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで
予測されるオフターゲット部位のターゲティングされたシーケンシングを使用して、また
は当技術分野で公知の挿入法により検出する。
「阻害性分子」という用語は、活性化させると、細胞の生存、活性化、増殖、および／
または機能の阻害を引き起こすか、またはこれに寄与する分子と；前記分子をコードする
遺伝子、およびその関連する調節エレメント、例えば、プロモーターとを指す。複数の実
施形態では、阻害性分子は、免疫エフェクター細胞上、例えば、Ｔ細胞上で発現する分子
である。阻害性分子の非限定的な例は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４
、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、
および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、
ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（Ｖ
ＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨ
ＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータである。阻
害性分子という用語は、標的配列またはｇＲＮＡ分子との関連で使用される場合、阻害性
分子のタンパク質をコードする遺伝子（およびその関連する調節エレメント）を指すと理
解されるであろう。ある実施形態では、阻害性分子をコードする遺伝子は、ＣＤ２７４で
ある。ある実施形態では、阻害性分子をコードする遺伝子は、ＨＡＶＣＲ２である。ある
実施形態では、阻害性分子をコードする遺伝子は、ＬＡＧ３である。ある実施形態では、
阻害性分子をコードする遺伝子は、ＰＤＣＤ１である。
「阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクター」という用語は、阻害性分子
の阻害効果を媒介する分子と；前記分子をコードする遺伝子、およびその関連する調節エ
レメント、例えば、プロモーターとを指す。阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエ
フェクターという用語は、標的配列またはｇＲＮＡ分子との関連で使用される場合、阻害
性分子のタンパク質を介するシグナル伝達の下流のエフェクターをコードする遺伝子（お
よびその関連する調節エレメント）を指すと理解されるであろう。ある実施形態では、阻
害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターをコードする遺伝子は、ＰＴＰＮ１
１である。
本明細書では、「同種異系Ｔ細胞（Ｔ ｃｅｌｌ）標的」および「同種異系Ｔ細胞（Ｔ
－ｃｅｌｌ）標的」という用語は、互換的に使用され、ある宿主対移植片応答を媒介する
か、もしくはこれに寄与するか、移植片対宿主応答を媒介するか、もしくはこれに寄与す
るか、または免疫抑制薬の標的であるタンパク質と；前記分子をコードする遺伝子、およ
びその関連する調節エレメント、例えば、プロモーターとを指す。同種異系Ｔ細胞標的と
いう用語は、標的配列またはｇＲＮＡ分子との関連で使用される場合、同種異系Ｔ細胞の
標的タンパク質をコードする遺伝子（およびその関連する調節エレメント）を指すと理解
されるであろう。理論に束縛されずに、例えば、本明細書で開示される方法および組成物
による、１または複数の同種異系Ｔ細胞標的の阻害または消失は、例えば、望ましくない
免疫原性（宿主対移植片応答または移植片対宿主応答など）を低減するか、または消失さ
せることにより、同種異系細胞、例えば、同種異系Ｔ細胞の、有効性、生存、機能、およ
び／または生存率を改善しうる。
非限定的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、もしくは
これに寄与するタンパク質は、１または複数のＴ細胞受容体の構成要素である。ある実施
形態では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体アルファ、例えば、ＴＣＲアルファ
の定常ドメインである。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体の
ベータ鎖、例えば、ＴＣＲベータの定常ドメイン１または定常ドメイン２である。ある実
施形態では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体のデルタ鎖である。ある実施形態
では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体のイプシロン鎖である。ある実施形態で
は、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖である。ある実施形態では、Ｔ
細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体のガンマ鎖である。したがって、同種異系Ｔ細胞
標的によりコードされるタンパク質が、ＴＣＲの構成要素である、複数の実施形態では、
同種異系Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２
、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、またはＣＤ２４７、およびこれらの組合せでありうる
。
非限定的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、もしくは
これに寄与するタンパク質は、ＨＬＡタンパク質またはＢ２Ｍである。ＨＬＡタンパク質
の例は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃを含む。したがって、同種異系Ｔ細
胞の標的タンパク質が、ＨＬＡまたはＢ２Ｍのタンパク質である、複数の実施形態では、
同種異系Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－
Ｃ、またはＢ２Ｍ、およびこれらの組合せでありうる。他の実施形態では、同種異系Ｔ細
胞の標的タンパク質は、ＮＬＲＣ５であり、同種異系Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、
例えば、ＮＬＲＣ５でありうる。
非限定的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、もしくは
これに寄与するタンパク質は、主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）分子（
例えば、ＨＬＡ－Ｄｘ（名称中、ｘは、ＭＨＣ ＩＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ－ＤＭ
、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、および／またはＨＬＡ－ＤＰの文字を指
す））、またはＭＨＣ ＩＩの発現のための調節因子、およびこれらの組合せである。非
限定的な例は、ＣＩＩＴＡ（本明細書ではまた、Ｃ２ＴＡとも言及される）である。した
がって、同種異系Ｔ細胞の標的タンパク質が、ＣＩＩＴＡである、複数の実施形態では、
同種異系Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、例えば、ＣＩＩＴＡでありうる。別の非限定
的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、もしくはこれに寄
与するタンパク質は、ＲＦＸＡＮＫである。別の非限定的な例では、移植片対宿主応答ま
たは宿主対移植片応答を媒介するか、もしくはこれに寄与するタンパク質は、ＲＦＸＡＰ
である。別の非限定的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか
、もしくはこれに寄与するタンパク質は、ＲＦＸ５である。
本明細書で使用される「免疫抑制薬の標的」という用語は、免疫抑制剤の分子標的、例
えば、受容体または他のタンパク質（本明細書では、薬剤または薬剤の標的との関連で、
「免疫抑制薬（immunosuppressant）」および「免疫抑制薬（immunosuppressive）」とい
う用語を、互換的に使用する）を指す。免疫抑制剤とは、いくつかの作用機構のうちの１
つにより、免疫機能を抑制する薬剤である。言い換えると、免疫抑制剤とは、化合物によ
り果たされる役割であって、免疫応答の程度および／または貪食を減殺する能力により呈
示される役割である。免疫抑制剤により呈示される活性の種類の１つの例は、Ｔ細胞、例
えば、活性化Ｔ細胞を消失させる活性である。免疫抑制剤により呈示される活性の種類の
別の例は、Ｔ細胞の活性または活性化レベルを低減する活性である。非限定的な例として
、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２
ａ鎖ブロッカー、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸レダクター
ゼの阻害剤、コルチコステロイド、シクロスポリン、または免疫抑制性代謝拮抗剤であり
うる。古典的な細胞傷害性免疫抑制薬は、ＤＮＡ合成を阻害することにより作用する。他
の細胞傷害性免疫抑制薬は、Ｔ細胞の活性化を介して、またはヘルパー細胞の活性化を阻
害することにより作用する。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、デオキシシチジ
ンキナーゼ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子
メンバー、例えば、ＦＫＢＰ１２、およびシクロフィリンファミリー遺伝子のメンバーな
ど、免疫抑制剤の受容体でありうる。ある実施形態では、免疫抑制薬の標的は、デオキシ
シチジンキナーゼ（ＤＣＫ）であり、免疫抑制薬は、シタラビン（シトシンアラビノシド
）またはゲムシタビンなど、ヌクレオシド類似体ベースの薬物である。ある実施形態では
、免疫抑制薬の標的は、ＧＲであり、免疫抑制薬は、デキサメタゾンなどのコルチコステ
ロイドである。ある実施形態では、免疫抑制薬の標的は、ＣＤ５２であり、免疫抑制薬は
、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））などの抗ＣＤ５２抗体またはその抗原
結合性断片である。ある実施形態では、免疫抑制薬の標的は、ＦＫＢＰ１２であり、免疫
抑制薬は、ＦＫ５０６（またはその類似体もしくはそのＦＫＢＰ１２結合性断片）、シク
ロスポリン、ラパマイシンもしくはラパログ、またはＲＡＤ００１などのｍＴｏｒ阻害剤
である。したがって、同種異系Ｔ細胞標的が、免疫抑制薬の標的タンパク質である、複数
の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、例えば、ＮＲ３Ｃ１、ＦＫ
ＢＰ１Ａ、ＣＤ５２、またはＤＣＫ、およびこれらの組合せでありうる。
「ラパマイシン耐性ｍＴｏｒ」という用語は、ＦＫＢＰ１２への結合（ラパマイシン、
ＦＫ５０６、ラパログ、シクロスポリン、および／または他のＲＡＤ００１などのｍＴｏ
ｒ阻害剤の存在下を含む）を低減したか、または消失させたｍＴｏｒタンパク質（および
前記ｍＴｏｒタンパク質をコードする遺伝子）を指す。例示的な複数の実施形態では、ラ
パマイシン耐性ｍＴｏｒは、ＦＲＢドメインに対する、１または複数の突然変異を含む。
例示的な実施形態では、ラパマイシン耐性ｍＴｏｒは、Ｓ２０３５に対する突然変異であ
って、例えば、Ｓ２０３５Ｉ突然変異を含む、例えば、これからなる突然変異を含む、例
えば、これからなる。
「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」という用語は、冠詞の文法上の目的語が１つで
あるか、または１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）であることを指す。例を目的
として、「ある要素」とは、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
「約」という用語は、量、時間的な持続など、測定可能な値を指す場合、そのような変
動は、開示される方法を実施するのに適切であるので、指定された値から、±２０％、ま
たは、一部の場合、±１０％、または、一部の場合、±５％、または、一部の場合、±１
％または、一部の場合、±０．１％の変動を包摂することを意図する。
「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」という用語は、典型的に、最も単純な
複数の実施形態では、２つのポリペプチドのセットであって、免疫エフェクター細胞内に
ある場合、細胞に、標的細胞、典型的に、がん細胞に対する特異性と、細胞内シグナルの
発生とをもたらすセットを指す。一部の実施形態では、ＣＡＲは、下記で規定される、刺
激性分子および／または共刺激性分子から導出される機能的シグナル伝達ドメインを含む
、少なくとも、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達
ドメイン（本明細書ではまた、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称する）を含む。一
部の態様では、ポリペプチドのセットは、互いと連続する。一部の実施形態では、ポリペ
プチドのセットは、二量体化分子の存在時に、ポリペプチドを、互いにカップリングさせ
うる、例えば、抗原結合性ドメインを、細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングさせ
うる二量体化スイッチを含む。一態様では、刺激性分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合す
るゼータ鎖である。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、下記で規定される、少
なくとも１つの共刺激性分子から導出される、１または複数の機能的シグナル伝達ドメイ
ンをさらに含む。一態様では、共刺激性分子は、本明細書で記載される共刺激性分子、例
えば、４ １ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８から選
択される。一態様では、ＣＡＲは、刺激性分子から導出される、機能的シグナル伝達ドメ
インを含む、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ド
メインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、共刺激性分子から導
出される、機能的シグナル伝達ドメインと、刺激性分子から導出される、機能的シグナル
伝達ドメインとを含む、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグ
ナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、１または
複数の共刺激性分子から導出される、２つの機能的シグナル伝達ドメインと、刺激性分子
から導出される、機能的シグナル伝達ドメインとを含む、細胞外抗原結合性ドメイン、膜
貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。
一態様では、ＣＡＲは、１または複数の共刺激性分子から導出される、少なくとも２つの
機能的シグナル伝達ドメインと、刺激性分子から導出される、機能的シグナル伝達ドメイ
ンとを含む、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ド
メインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク
質のアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒ）における、任意選択のリーダー配列を含む。一態様では、
ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメインのＮ末端におけるリーダー配列をさらに含み、この
場合、リーダー配列は、任意選択で、細胞内プロセシング時、および細胞膜へのＣＡＲの
局在化時に、抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切断される。
本明細書で記載される腫瘍マーカーなどの特異的腫瘍マーカーＸをターゲティングする
抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはＴＣＲ）を含むＣＡＲはまた、Ｘ ＣＡＲ
とも称する。例えば、ＣＤ１９をターゲティングする抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを
、ＣＤ１９ ＣＡＲと称する。別の例として、ＢＣＭＡをターゲティングする抗原結合性
ドメインを含むＣＡＲを、ＢＣＭＡ ＣＡＲと称する。
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、第２のメッセンジャーを発生させることによ
り、規定されたシグナル伝達経路を介して、細胞の活性を調節するように、細胞内の情報
を伝達することにより、またはこのようなメッセンジャーに応答することを介して、エフ
ェクターとして機能することにより作用する、タンパク質の機能的部分を指す。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子から導出されるタン
パク質またはポリペプチドの配列であって、抗原と特異的に結合する配列を指す。抗体は
、ポリクローナル抗体の場合もあり、モノクローナル抗体の場合もあり、多重鎖の場合も
あり、単鎖の場合もあり、完全免疫グロブリンの場合もあり、天然供給源から導出される
場合もあり、組換え供給源から導出される場合もある。抗体は、免疫グロブリン分子の四
量体でありうる。
「抗体断片」という用語は、抗原のエピトープと、特異的に相互作用する（例えば、結
合、立体障害、安定化／脱安定化、空間的分布により）能力を保持する、抗体の少なくと
も１つの部分を指す。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、
ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨドメインとＣＨ１ド
メインとからなるＦｄ断片、直鎖状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨ）などの単一ドメイ
ン抗体、ラクダ科動物のＶＨＨドメイン、抗体断片から形成された多特異性抗体など、ヒ
ンジ領域において、ジスルフィド架橋により連結された、２つのＦａｂ断片を含む二価断
片、および単離ＣＤＲ、または他の抗体のエピトープ結合性断片を含むがこれらに限定さ
れない。抗原結合性断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディー、ミニボディー、ナ
ノボディー、イントラボディー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ｖ
－ＮＡＲ、およびビスｓｃＦｖにも組み込むことができる（例えば、Hollinger and Huds
on, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照されたい）。抗原結合断片はまた
、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場へとグラフトす
ることもできる（フィブロネクチンポリペプチドミニボディーについて記載する、米国特
許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む、少なくとも１つの抗体断片と、重
鎖の可変領域を含む、少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質であって、軽鎖
可変領域と、重鎖可変領域とが、例えば、合成リンカー、例えば、短い可撓性のポリペプ
チドリンカーを介して、連続的に連結され、単鎖ポリペプチドとして発現することが可能
な融合タンパク質を指し、ｓｃＦｖは、それが導出される完全抗体の特異性を保持する。
本明細書で使用されるｓｃＦｖが、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して
、いずれの順序でＶＬ可変領域およびＶＨ可変領域を有しうるのかが指定されない限りに
おいて、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含む場合もあり、ＶＨ－リンカー－ＶＬを
含む場合もある。
抗体またはその抗体断片を含む、本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合性ドメインを、例
えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、または
二特異性抗体を含む連続ポリペプチド鎖の一部として発現させた、様々な形態で存在しう
る（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。一態様では、本発
明のＣＡＲ組成物の抗原結合性ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様では、ＣＡＲ
は、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kaba
t et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Pu
blic Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」
番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ
」番号付けスキーム）により記載されているスキームを含む、周知の多数のスキームのう
ちのいずれか、またはこれらの組合せを使用して決定することができる。
本明細書で使用される「結合性ドメイン」または「抗体分子」という用語は、タンパク
質、例えば、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、免疫グロブリン
鎖またはその断片を指す。「結合性ドメイン」または「抗体分子」という用語は、抗体お
よび抗体断片を包摂する。ある実施形態では、抗体分子は、多特異性抗体分子である、例
えば、抗体分子は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、この場合、複数の免
疫グロブリン可変ドメイン配列のうちの、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第
１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列のう
ちの、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性
を有する。ある実施形態では、多特異性抗体分子は、二特異性抗体分子である。二特異性
抗体は、２つ以下の抗原に対する特異性を有する。二特異性抗体分子は、第１のエピトー
プに対する結合特異性を有する、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２のエピ
トープに対する結合特異性を有する、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列とを特徴と
する。
抗体またはその抗体断片を含む、本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合性ドメインを、例
えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、または
二特異性抗体を含む連続ポリペプチド鎖の一部として発現させた、様々な形態で存在しう
る（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。一態様では、本発
明のＣＡＲ組成物の抗原結合性ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様では、ＣＡＲ
は、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。
「抗体重鎖」という用語は、それらの自然発生のコンフォメーションで、抗体分子内に
存在するポリペプチド鎖の２つの種類のうちの大きいほうの鎖を指し、通常は、この鎖が
、抗体が属するクラスを決定する。
「抗体軽鎖」という用語は、それらの自然発生のコンフォメーションで、抗体分子内に
存在するポリペプチド鎖の２つの種類のうちの小さいほうの鎖を指す。カッパ（κ）軽鎖
およびラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「組換え抗体」という用語は、例えば、バクテリオファージ発現系または酵母発現系が
発現する抗体など、組換えＤＮＡ技術を使用して作出される抗体を指す。用語はまた、抗
体をコードするＤＮＡ分子の合成により作出された抗体を意味するようにも解釈され、こ
のＤＮＡ分子は、抗体タンパク質、または抗体を指定するアミノ酸配列を発現するが、こ
の場合、ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列は、入手可能であり、当技術分野でも周知の組換
えＤＮＡ技術またはアミノ酸配列技術を使用して得られている。
「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を惹起する分子を指す。この免疫応答
は、抗体の産生もしくは特異的な免疫コンピテント細胞の活性化、またはこれらの両方を
伴いうる。当業者は、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む、任意の高分子が、
抗原として機能しうると理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡから導出され
る場合もあり、ゲノムＤＮＡから導出される場合もある。当業者は、したがって、免疫応
答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列
を含む、任意のＤＮＡが、この用語を本明細書で使用する場合の「抗原」をコードすると
理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が、遺伝子の全長ヌクレオチド配列だけによ
りコードされる必要はないと理解するであろう。本発明が、１つを超える遺伝子の部分的
なヌクレオチド配列の使用を含むがこれらに限定されず、これらのヌクレオチド配列が、
所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように、多様な組合せで配置される
ことは、たやすく明らかである。さらに、当業者は、抗原が、「遺伝子」によりコードさ
れる必要は全くないと理解するであろう。抗原は、合成により作出される場合もあり、生
物学的試料から導出される場合もあり、ポリペプチドのほか、高分子の場合もありうるこ
とは、たやすく明らかである。このような生物学的試料は、他の生物学的構成要素を伴う
、組織試料、腫瘍試料、細胞、または体液を含みうるがこれらに限定されない。
「抗がん効果」という用語は、多様な手段により顕在化しうる生物学的効果であって、
例えば、腫瘍容量の減少、がん細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、がん細胞
増殖の減少、がん細胞生存の減少、またはがん性状態に関連する、多様な生理学的症状の
軽快を含むがこれらに限定されない生物学的効果を指す。「抗がん効果」はまた、第一に
、がんの発症の防止における、ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および抗体の能力に
よっても顕示されうる。「抗腫瘍効果」という用語は、多様な手段により顕在化しうる生
物学的効果であって、例えば、腫瘍容量の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少
、または腫瘍細胞生存の減少を含むがこれらに限定されない生物学的効果を指す。
「自家」という用語は、同じ個体から導出され、その後、その個体へと再導入される、
任意の材料を指す。
「同種異系」という用語は、材料が導入される個体と同じ種の、異なる動物から導出さ
れる、任意の材料を指す。１または複数の遺伝子座における遺伝子が、同一でない場合、
２つまたはこれを超える個体は、互いと同種異系であるという。一部の態様では、同じ種
の個体に由来する同種異系材料は、抗原として相互作用するのに十分に、遺伝子的に非同
一でありうる。
「異種」という用語は、異なる種の動物から導出される移植片を指す。
「がん」という用語は、異常な細胞の、制御不能な成長を特徴とする疾患を指す。がん
細胞は、局所的に拡散する場合もあり、血流およびリンパ系を介して、体内の他の部分へ
と拡散する場合もある。本明細書では、多様ながんの例が記載されており、乳がん、前立
腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓が
ん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺がんなどを含むがこれらに限定されない。本明細書で
は、「腫瘍」および「がん」という用語が互換的に使用され、例えば、いずれの用語も、
充実性腫瘍および液性腫瘍、例えば、びまん性腫瘍または循環性腫瘍を包摂する。本明細
書で使用される「がん」または「腫瘍」という用語は、前悪性がんおよび前悪性腫瘍のほ
か、悪性がんおよび悪性腫瘍も含む。
本明細書でこの用語を使用する場合の「～から導出される」とは、第１の分子と、第２
の分子との間の関係を指し示す。「～から導出される」とは一般に、第１の分子と、第２
の分子との構造的類似性を指すものであり、第２の分子から導出される第１の分子に対す
る、工程または供給源についての限定を含意したり、これらを含んだりするものではない
。例えば、ＣＤ３ゼータ分子から導出される細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内
シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインが、要求される機能、すなわち、
適切な条件下で、シグナルを発生させる能力を有するように、十分なＣＤ３ゼータ構造を
保持する。「ＣＤ３ゼータ分子から導出される」は、細胞内シグナル伝達ドメインを産生
する特定の工程に対する限定を含意したり、これらを含んだりするものではなく、例えば
、「ＣＤ３ゼータ分子から導出される」とは、細胞内シグナル伝達ドメインをもたらすた
めに、ＣＤ３ゼータ配列から始め、望ましくない配列を欠失させるか、または突然変異を
付与して、細胞内シグナル伝達ドメインに到達しなければならないことを意味するわけで
はない。
「本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連する疾患」という語句は、本明細書で記
載される、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、または本明細書で記載される腫瘍抗原を発現
する細胞と関連する状態であって、例えば、がんもしくは悪性腫瘍、または骨髄異形成、
骨髄異形成症候群、もしくは前白血病などの前がん性状態などの増殖性疾患；あるいは本
明細書で記載される腫瘍抗原を発現する細胞と関連する非がん関連適応症を含む疾患また
は状態を含むがこれらに限定されない。一態様では、本明細書で記載される腫瘍抗原の発
現と関連するがんは、血液がんである。一態様では、本明細書で記載される腫瘍抗原の発
現と関連するがんは、固形がんである。本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連する
さらなる疾患は、例えば、本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連する非定型がんお
よび／もしくは非古典がん、悪性腫瘍、前がん性状態、または増殖性疾患を含むがこれら
に限定されない。本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症は、
例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）、お
よび移植を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍抗原を発現する細胞
は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、または、任意の時点において、これを
発現した。ある実施形態では、腫瘍抗原を発現する細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば
、野生型または突然変異体）を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常レベルまたは低減レ
ベルで存在しうる。ある実施形態では、腫瘍抗原を発現する細胞は、検出可能レベルの腫
瘍抗原タンパク質を、１つの時点において産生したが、その後、検出可能な腫瘍抗原タン
パク質を、実質的に産生しなかった。
「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合
特徴に著明な影響を及ぼしたりこれを著明に変更したりしないアミノ酸修飾を指す。この
ような保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、および欠失を含む。修飾は、部位指向突然
変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発など、当技術分野で公知の標準的な技法により、
本発明の抗体または抗体断片へと導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミ
ノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえたアミノ酸置換である。当技術
分野では、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。これらのフ
ァミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例え
ば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギ
ン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極
性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラ
ニン、メチオニン）、ベータ－分枝型側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン
）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチ
ジン）を伴うアミノ酸を含む。したがって、本発明のＣＡＲ内の、１または複数のアミノ
酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基で置きかえることができ、変
更されたＣＡＲは、本明細書で記載される機能アッセイを使用して調べることができる。
「刺激」という用語は、刺激性分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ）の
、その同族リガンド（またはＣＡＲの場合、腫瘍抗原）との結合により誘導され、これに
より、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達、または適切なＮＫ受容体もしくはＣ
ＡＲのシグナル伝達ドメインを介するシグナル伝達などであるがこれらに限定されないシ
グナル伝達イベントを媒介する一次応答を指す。刺激は、ある特定の分子の発現の変更を
媒介しうる。
「刺激性分子」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）が発現
する分子であって、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の側面では、免疫細胞の
活性化を刺激性に調節する細胞質シグナル伝達配列をもたらす分子を指す。一態様では、
シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の、ペプチドをロードされたＭＨＣ分子との
結合により誘発され、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答
の媒介をもたらす一次シグナルである。刺激的な様態で作用する細胞質一次シグナル伝達
配列（「一次シグナル伝達ドメイン」ともまた称する）は、免疫受容体のチロシンベース
の活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有しうる。本発
明における使用に特に有用な、細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例は、ＣＤ
３ゼータ、一般的なＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ
（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９
ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２から導出されるＩＴＡＭを含むがこれら
に限定されない。本発明の具体的ＣＡＲでは、本発明の、任意の、１または複数のＣＡＲ
内の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの、細胞内シグナル伝達配列、例えば
、一次シグナル伝達配列を含む。本発明の具体的ＣＡＲでは、ＣＤ３ゼータの一次シグナ
ル伝達配列は、配列番号１８として提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、
齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基である。本発明の具体的ＣＡＲでは、
ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号２０に提供される配列、または非ヒト
種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基である。
「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、その表面上で、主要組織適合性複合
体（ＭＨＣ）と複合体化させた外来抗原を提示するアクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、
樹状細胞など）などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を
使用して、これらの複合体を認識しうる。ＡＰＣは、抗原を、プロセシングし、それらを
、Ｔ細胞へと提示する。
本明細書で使用される用語としての「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、分子の細胞
内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞
の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを発生させる。例えば、ＣＡＲＴ細胞におけ
る、免疫エフェクター機能の例は、細胞溶解活性と、サイトカインの分泌を含むヘルパー
活性とを含む。
ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内一次シグナル伝達ドメイン
を含みうる。例示的な細胞内一次シグナル伝達ドメインは、一次刺激または抗原依存性刺
激の一因となる分子から導出される、細胞内一次シグナル伝達ドメインを含む。ある実施
形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性細胞内ドメインを含みうる。例示的
な共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナルまたは抗原非依存性刺激の
一因となる分子から導出される、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例えば、
ＣＡＲＴの場合、細胞内一次シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含む
ことが可能であり、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激性分
子に由来する細胞質配列を含みうる。
細胞内一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフま
たはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含みうる。細胞質一次シグナル伝達配
列を含有するＩＴＡＭの例は、ＣＤ３ゼータ、一般的なＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、
ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デ
ルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２から
導出されるＩＴＡＭを含むがこれらに限定されない。
「ゼータ」、または、代替的に、「ゼータ鎖」、「ＣＤ３ゼータ」、もしくは「ＴＣＲ
ゼータ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供される
タンパク質、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する
同等な残基として規定され、「ゼータ刺激性ドメイン」、または、代替的に、「ＣＤ３ゼ
ータ刺激性ドメイン」もしくは「ＴＣＲゼータ刺激性ドメイン」は、ゼータ鎖、またはＴ
細胞の活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分な、その機能的な誘導体
の細胞質ドメインに由来するアミノ酸残基と規定される。一態様では、ゼータの細胞質ド
メインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、または非
ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基であって、
その機能的なオーソログである残基を含む。一態様では、「ゼータ刺激性ドメイン」また
は「ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン」は、配列番号１８として提供される配列である。一態
様では、「ゼータ刺激性ドメイン」または「ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン」は、配列番号
２０として提供される配列である。
「共刺激性分子」という用語は、Ｔ細胞上の同族結合パートナーであって、共刺激リガ
ンドと特異的に結合し、これにより、増殖などであるがこれらに限定されない、Ｔ細胞に
よる共刺激応答を媒介する結合パートナーを指す。共刺激性分子とは、抗原受容体または
それらのリガンド以外の細胞表面分子であって、効率的な免疫応答に寄与する細胞表面分
子である。共刺激性分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびＴｏｌｌリガンド受
容体のほか、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ
１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む
がこれらに限定されない。このような共刺激性分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－
１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（Ｋ
ＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、Ｉ
ＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬ
Ａ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、
ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ
１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２
Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４
（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、Ｃ
ＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（
ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬ
ＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（Ｃ
Ｄ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ
、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。
共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内部分でありうる。共刺
激性分子は、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様
タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Ｓ
ＬＡＭタンパク質）、および活性化ＮＫ細胞受容体で代表されうる。このような分子の例
は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、
ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原－１
（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫ
Ｇ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０
、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが導出される分子の、細胞内部分の全体、または
天然の細胞内シグナル伝達ドメインの全体、またはこれらの機能的断片もしくは誘導体を
含みうる。
「４－１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２、または
非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基として提
供されるアミノ酸配列を伴うＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４－１Ｂ
Ｂ共刺激性ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基
２１４～２５５、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来
する同等な残基として規定される。一態様では、「４－１ＢＢ共刺激性ドメイン」とは、
配列番号１４として提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル
、類人猿などに由来する同等な残基である。
本明細書でこの用語を使用する場合の「免疫エフェクター細胞」とは、免疫応答、例え
ば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例は、
Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュ
ラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マスト細胞、および骨髄
球由来の食細胞を含む。
本明細書でこの用語を使用する場合の「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター
応答」とは、例えば、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する免疫エフェクター細胞の
機能または応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能または応答とは、標的細胞の殺滅
、または成長もしくは増殖の阻害を促進する、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細
胞の場合、一次刺激および共刺激は、免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答
の例である。
「～をコードすること」という用語は、生物学的過程において、規定されたヌクレオチ
ド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）の配列、または規定されたアミノ酸
の配列を有する、他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として用いられる、遺伝
子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内の、ヌクレオチドの特異的配列
の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞内または他
の生物学的系内で、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、タンパク質を産
生する場合、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、タンパク質をコードする。そのヌクレ
オチド配列が、ｍＲＮＡの配列と同一であり、通例、配列表に提供されるコード鎖、およ
び遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方を、タン
パク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードする鎖と称することがで
きる。
そうでないことが指定されない限りにおいて、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列」は、互いの縮重形であり、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド
配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、
タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、一部の変化形では、イントロンも含有する
程度において、イントロンも含みうる。
本明細書では、「有効量」または「治療有効量」という用語は、互換的に使用され、本
明細書で記載される化合物、製剤、材料、または組成物の量であって、特定の生物学的結
果を達成するのに有効な量を指す。
「内因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の内部に由来するか、またはこ
れらから産生される、任意の材料を指す。
「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の外部から導入されるか、また
はこれらから産生される、任意の材料を指す。
「発現」という用語は、プロモーターにより駆動される、特定のヌクレオチド配列の転
写および／または翻訳を指す。
「移入ベクター」という用語は、単離核酸を含み、単離核酸を、細胞の内部へと送達す
るのに使用しうる組成物を指す。当技術分野では、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性化
合物または両親媒性化合物と会合させたポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルス
を含むがこれらに限定されない、多数のベクターが公知である。したがって、「移入ベク
ター」という用語は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。用語はまた、例えば、
ポリリシン化合物、リポソームなど、核酸の細胞への移入を容易とする、非プラスミド化
合物および非ウイルス化合物をさらに含むようにも解釈されるものとする。ウイルス性移
入ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイ
ルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むがこれらに限定されない。
「発現ベクター」という用語は、発現させるヌクレオチド配列に作動的に連結した発現
制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に
十分なシス作用型エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞により、
またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系内で供給することができる。発現ベクターは、組換えポリ
ヌクレオチドを組み込む、当技術分野で公知の、全ての発現ベクターであって、コスミド
、プラスミド（例えば、ネイキッドのプラスミドまたはリポソーム内に含有されたプラス
ミド）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、
およびアデノ随伴ウイルス）を含む発現ベクターを含む。
「相同な」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子の間、例えば、２つの
ＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子の間、または２つのポリペプ
チド分子の間の、サブユニットの配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニ
ット位置を、同じ単量体サブユニットが占める場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々に
おける位置を、アデニンが占める場合、それらは、その位置において相同なまたは同一で
ある。２つの配列の間の相同性とは、マッチする位置または相同な位置の数の直接的な関
数であり；例えば、２つの配列内の位置のうちの半分（例えば、１０サブユニットの長さ
のポリマー内の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は、５０％相同であり；９０
％の位置（例えば、１０のうち９つ）がマッチするかまたは相同である場合、２つの配列
は、９０％相同である。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから導出さ
れる最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン鎖、または
これらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合性
部分配列など）である。大部分において、ヒト化抗体およびそれらの断片は、レシピエン
トの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、マウス、ラット、またはウサギなど、
非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲであって、所望の特異性、アフィニティー、および能力
を有するＣＤＲに由来する残基により置きかえられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエン
ト抗体または抗体断片）である。一部の場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク
領域（ＦＲ）の残基を、対応する非ヒト残基により置きかえる。さらに、ヒト化抗体／抗
体断片は、レシピエント抗体内でも、移入ＣＤＲ配列内またはフレームワーク配列内でも
見出されない残基も含みうる。これらの修飾をさらに精緻化し、抗体または抗体断片の効
能を最適化することもできる。一般に、ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも１
つの可変ドメインであり、典型的に、２つの可変ドメインであって、ＣＤＲ領域の全てま
たは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリン配列のＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全て
または著明な部分が、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である可変ドメインの実質的に
全てを含むであろう。ヒト化抗体または抗体断片はまた、免疫グロブリンの定常領域（Ｆ
ｃ）のうちの少なくとも一部、典型的に、ヒト免疫グロブリンのＦｃのうちの少なくとも
一部も含みうる。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986
; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,
2: 593-596, 1992を参照されたい。
「完全ヒト」とは、抗体または抗体断片などの免疫グロブリンであって、全分子が、ヒ
ト由来であるか、または抗体もしくは免疫グロブリンのヒト形態と同一なアミノ酸配列か
らなる免疫グロブリンを指す。
「単離された」という用語は、天然状態から変更または除去されていることを意味する
。例えば、生存する動物において天然で存在する核酸またはペプチドは、「単離」されて
いないが、その天然状態の材料から、部分的または完全に分離された、同じ核酸またはペ
プチドは、「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製され
た形態で存在する場合もあり、例えば、宿主細胞など、非天然環境内に存在する場合もあ
る。
「作動可能に連結された」または「転写の制御」という用語は、調節的配列と、異種核
酸配列との機能的連結であって、後者の発現を結果としてもたらす機能的連結を指す。例
えば、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と機能的な関係に置かれたとき、第２の核酸配
列と、作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、コード配列の転写または発
現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結された
ＤＮＡ配列は、互いと連続する場合があり、例えば、２つのタンパク質のコード領域を接
続することが必要な場合、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）投与、静脈
内（ｉ．ｖ．）投与、筋内（ｉ．ｍ．）投与、または胸骨下注射投与、腫瘍内投与、また
は注入投与法を含む。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖形態または二本鎖形態の、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、およびこれらのポリマーを指す
。具体的に限定されない限りにおいて、用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体であっ
て、基準核酸と同様の結合特性を有し、自然発生のヌクレオチドと同様の様態で代謝され
る類似体を含有する核酸を包摂する。そうでないことが指し示されない限りにおいて、特
定の核酸配列はまた暗黙に、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）
、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、および相補性配列のほか、明示的に指し示される配
列も包摂する。具体的に、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全て
の）コドンの第３の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配
列を作出することにより、達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 1
9:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolin
i et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用
され、ペプチド結合により共有結合的に連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を
指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず
、タンパク質またはペプチドの配列を含みうるアミノ酸の最大数には、限定を設けない。
ポリペプチドは、ペプチド結合により互いと接続された、２つ以上のアミノ酸を含む、任
意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される用語は、当技術分野ではま
た一般に、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも称する短鎖、なら
びに、当技術分野では一般に、タンパク質と称し、多くの種類が存在する長鎖の両方を指
す。「ポリペプチド」は、例えば、中でも、生物学的に活性の断片、実質的に相同なポリ
ペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポ
リペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、
組換えペプチド、またはこれらの組合せを含む。
「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構、または導入された合成機構により認
識されるＤＮＡ配列であって、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を誘発するのに要求さ
れるＤＮＡ配列を指す。
「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結
した遺伝子産物の発現に要求される核酸配列を指す。一部の場合では、この配列は、コア
プロモーター配列であることが可能であり、他の場合では、この配列はまた、エンハンサ
ー配列、および遺伝子産物の発現に要求される、他の調節エレメントも含みうる。プロモ
ーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様態で、遺伝子産物を発現させる配列であり
うる。
「構成的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードするか、または指定するポ
リヌクレオチドと作動可能に連結されると、細胞の大半の生理学的状態下、または全ての
生理学的状態下で、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
「誘導的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードするか、または指定するポ
リヌクレオチドと作動可能に連結されると、実質的に、プロモーターに対応するインデュ
ーサーが細胞内に存在する場合に限り、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配
列を指す。
「組織特異的」プロモーターという用語は、遺伝子によりコードまたは指定されるポリ
ヌクレオチドと作動可能に連結されると、実質的に、プロモーターに対応する組織型の細
胞である場合に限り、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
「がん関連抗原」または「腫瘍抗原」という用語は互換的に、がん細胞の表面上で、全
体的に、または断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現し、薬理学的薬剤を、がん
細胞へと、優先的にターゲティングするのに有用である分子（典型的に、タンパク質、炭
水化物、または脂質）を指す。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞およびがん細
胞の両方が発現するマーカー、例えば、系統マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９であ
る。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、がん細胞内で、正常細胞と比較して過剰発現する
、例えば、正常細胞と比較して、１倍過剰発現する、２倍過剰発現する、３倍過剰発現す
るか、またはこれを超えて過剰発現する細胞表面分子である。一部の実施形態では、腫瘍
抗原は、がん細胞内で不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞上で発現する
分子と比較して、欠失、付加、または突然変異を含有する分子である。一部の実施形態で
は、腫瘍抗原はもっぱら、がん細胞の細胞表面上で、全体的に、または断片（例えば、Ｍ
ＨＣ／ペプチド）として発現し、正常細胞の表面上では、合成されたり、発現したりしな
いであろう。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣにより提示されたペプチド
に結合する抗原結合性ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）を含むＣＡＲを含む。通
常、内因性タンパク質から導出されるペプチドは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラ
スＩ分子のポケットを充填し、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により
認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全ての有核細胞が構成的に発現する。がんでは、
ウイルス特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体、および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複
合体は、免疫療法のための細胞表面標的の固有のクラスを表す。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ
）－Ａ１またはＨＬＡ－Ａ２の文脈における、ウイルス抗原または腫瘍抗原から導出され
るペプチドをターゲティングするＴＣＲ様抗体については、記載されている（例えば、Sa
stry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16)
:4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gen
e Ther 2001 8(21) :1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33 ;
Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100を参照されたい）。例えば、ＴＣ
Ｒ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーなどのライブラリーをスク
リーニングすることから同定することができる。
「腫瘍支持抗原」または「がん支持抗原」という用語は互換的に、それ自体はがん性で
はないが、例えば、それらの成長または生存、例えば、免疫細胞に対する耐性を促進する
ことにより、がん細胞を支持する細胞の表面上で発現する分子（典型的に、タンパク質、
炭水化物、または脂質）を指す。この種類の例示的な細胞は、間質細胞および骨髄系由来
サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。腫瘍支持抗原自体は、抗原が、がん細胞を支持す
る細胞上に存在する限りにおいて、腫瘍細胞の支持において役割を果たす必要がない。
ｓｃＦｖの文脈で使用される「可撓性のポリペプチドリンカー」または「リンカー」と
いう用語は、単独または組合せで、可変重鎖領域および可変軽鎖領域を一体に連結するの
に使用される、グリシン残基および／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチド
リンカーを指す。一実施形態では、可撓性のポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリ
ンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ［配列中、ｎは、１
と等しいかまたはこれを超える、正の整数である］を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ
＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ならびにｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、およびｎ＝１０であ
る（配列番号６５９２）。一実施形態では、可撓性のポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ
４Ｓｅｒ）４（配列番号６５９３）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６５９４）を
含むがこれらに限定されない。別の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（
ＧｌｙＳｅｒ）、または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）（配列番号６５９５）の複数のリピートを含
む。また、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１２／１３８４７５号パ
ンフレットに記載されているリンカーも、本発明の範囲内に含まれる。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）との関連で、本明細書で使用される、５’キャップ
（また、ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７－メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７
Ｇキャップとも称する）とは、転写開始の直後の、真核メッセンジャーＲＮＡの「フロン
ト」または５’末端へと付加された、修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは
、最初の転写ヌクレオチドへと連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによ
る認識、およびＲＮアーゼからの保護に極めて重要である。キャップの付加は、転写とカ
ップリングしており、各々が、互いに影響を及ぼしあうように、共転写的に生じる。転写
開始直後に、ＲＮＡポリメラーゼと会合するキャップ合成複合体が、合成されつつあるｍ
ＲＮＡの５’末端に結合する。この酵素複合体が、ｍＲＮＡのキャッピングに要求される
化学的反応を触媒する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング部分
は、その安定性または翻訳の効率など、ｍＲＮＡの機能性をモジュレートするように改変
することができる。
本明細書で使用される「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写された
ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクターから作出される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクタ
ーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを作出するのに使用される鋳型を含む。
本明細書で使用される「ポリ（Ａ）」とは、ポリアデニル化により、ｍＲＮＡへと接合
させたアデノシンの連鎖である。一過性発現のための構築物についての、好ましい実施形
態では、ポリＡは、５０～５０００（配列番号６５９６）の間であるか、好ましくは６４
を超えるか、より好ましくは１００を超えるか、最も好ましくは３００を超えるか、また
は４００である。ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性、または翻訳の効率など、ｍＲＮＡ
の機能性をモジュレートするように、化学的または酵素的に修飾することができる。
本明細書で使用される「ポリアデニル化」とは、ポリアデニルイル部分、またはその修
飾変異体の、メッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合的連結を指す。真核生物では、大半
のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端においてポリアデニル化されてい
る。３’ポリ（Ａ）テールとは、酵素であるポリアデニル酸ポリメラーゼの作用を介して
、プレｍＲＮＡへと付加された、アデニンヌクレオチド（数百であることが多い）の、長
い配列である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列である、ポリアデニ
ル化シグナルを含有する転写物へと付加されている。ポリ（Ａ）テールと、それに結合し
たタンパク質は、ｍＲＮＡを、エキソヌクレアーゼによる分解から保護する一助となる。
ポリアデニル化はまた、転写の終結、ｍＲＮＡの、核からの移出、および翻訳にも重要で
ある。ポリアデニル化は、ＤＮＡの、ＲＮＡへの転写の直後に、核内で生じるが、加えて
また、その後、細胞質内でも生じる。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラ
ーゼと会合するエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。切断部位は通例、
切断部位の近傍における、塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断さ
れた後で、アデノシン残基が、切断部位の遊離３’末端へと付加される。
本明細書で使用される「一過性」とは、組み込まれていないトランス遺伝子の、数時間
、数日間、または数週間の期間にわたる発現を指し、この場合、発現期間は、宿主細胞内
で、ゲノムへと組み込まれるか、または安定的なプラスミドレプリコン内に含有される場
合における、遺伝子の発現のための期間未満である。
本明細書で使用される「～を処置する」、「処置」、および「～を処置すること」とい
う用語は、１もしくは複数の療法（例えば、本発明のＣＡＲなど、１または複数の治療剤
）の投与から生じる、増殖性障害の進行、重症度、および／もしくは持続期間の低減もし
くは軽快、または増殖性障害の、１もしくは複数の症状（好ましくは、１または複数の識
別可能な症状）の軽快を指す。具体的な実施形態では、「～を処置する」、「処置」、お
よび「～を処置すること」という用語は、腫瘍の成長など、増殖性障害についての、少な
くとも１つの測定可能な物理的パラメータの軽快であって、患者により必ずしも識別可能
ではない軽快を指す。他の実施形態では、「～を処置する」、「処置」、および「～を処
置すること」という用語は、増殖性障害の進行の阻害であって、物理的な阻害、例えば、
識別可能な症状の安定化による阻害、生理学的な阻害、例えば、物理的パラメータの安定
化による阻害、またはこれらの両方を指す。他の実施形態では、「～を処置する」、「処
置」、および「～を処置すること」という用語は、腫瘍サイズまたはがん性細胞カウント
の低減または安定化を指す。
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞の１つの部分から、細胞の別の部分への、シ
グナルの伝達において役割を果たす、様々なシグナル伝達分子の間の生化学的関係を指す
。「細胞表面受容体」という語句は、シグナルを受け取り、細胞の膜を隔ててシグナルを
伝達することが可能な、分子および分子の複合体を含む。
「対象」という用語は、免疫応答が誘発されうる生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含
むように意図される。
「実質的な精製」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質
的な精製細胞はまた、その自然発生の状態では、通常、それが会合する他の細胞型から分
離された細胞も指す。一部の場合では、実質的な精製細胞の集団とは、均一の細胞集団を
指す。他の場合には、この用語は単に、それらの天然の状態では、それらが自然に会合す
る細胞から分離された細胞を指す。一部の態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養さ
れている。他の複数の態様では、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されていない。
本明細書で使用される「治療的」という用語は、処置を意味する。治療効果は、疾患状
態の低減、抑制、寛解、または根絶により得られる。
本明細書で使用される「予防」という用語は、疾患または疾患状態の防止、またはこれ
らのための防御的処置を意味する。
本発明の文脈では、「腫瘍抗原」または「高増殖性障害抗原」または「高増殖性障害と
関連する抗原」とは、具体的な高増殖性障害に一般的な抗原を指す。ある特定の態様では
、本発明の高増殖性障害抗原は、原発性または転移性の、黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉
腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子
宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、および乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がんなどの
腺癌を含むがこれらに限定されないがんから導出される。
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」とい
う用語は、外因性核酸を、宿主細胞へと移入または導入する工程を指す。「トランスフェ
クト」または「形質転換」または「形質導入」された細胞とは、外因性核酸を、トランス
フェクト、形質転換、または形質導入された細胞である。細胞は、初代対象細胞、および
その子孫細胞を含む。
「～に特異的に結合する」という用語は、試料中に存在する結合パートナー（例えば、
タンパク質または核酸）を認識し、これと結合する分子を指すが、この分子は、試料中の
他の分子を、実質的に認識したり、これらに結合したりはしない。
本明細書でこの用語を使用する場合の「膜アンカー」または「膜テザリングドメイン」
とは、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインを、細胞膜へとアンカリングするのに十分な
ポリペプチドまたは部分、例えば、ミリストイル基を指す。
「生体同等」という用語は、基準化合物（例えば、ＲＡＤ００１）以外の薬剤の量であ
って、基準用量または基準量の基準化合物（例えば、ＲＡＤ００１）によりもたらされる
効果と同等な効果をもたらすのに要求される量を指す。ある実施形態では、効果は、例え
ば、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて査定される、例え
ば、本明細書で記載されるアッセイ、例えば、ブーレーアッセイにより測定される、例え
ば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害により測定される、ｍＴＯＲ阻害のレベルである。ある実
施形態では、効果は、細胞選別により測定される、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞／ＰＤ－１陰性Ｔ
細胞比の変更である。ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の生体同等量または用量とは、
基準用量または基準量の基準化合物がもたらすのと同じレベルのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻
害を達成する量または用量である。ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の生体同等量また
は用量とは、基準用量または基準量の基準化合物がもたらすのと同じレベルの、ＰＤ－１
陽性Ｔ細胞／ＰＤ－１陰性Ｔ細胞比の変更を達成する量または用量である。
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１また
はラパマイシン、または触媒性ｍＴＯＲ阻害剤と共に使用される場合の、「低免疫増強用
量」という用語は、完全にではないが、部分的に、ｍＴＯＲ活性を阻害するｍＴＯＲ阻害
剤の用量であって、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定される用量を指
す。本明細書では、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害により、ｍＴＯＲ活性を査定する
ための方法について論じる。用量は、完全な免疫抑制を結果としてもたらすには不十分で
あるが、免疫応答を増強するには十分である。ある実施形態では、低免疫増強用量のｍＴ
ＯＲ阻害剤は、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞数の減少および／もしくはＰＤ－１陰性Ｔ細胞数の増
大、またはＰＤ－１陰性Ｔ細胞／ＰＤ－１陽性Ｔ細胞比の増大を結果としてもたらす。あ
る実施形態では、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ナイーブＴ細胞数の増大を結果と
してもたらす。ある実施形態では、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、以下：
例えば、メモリーＴ細胞上、例えば、メモリーＴ細胞前駆体上の、以下のマーカー：ＣＤ
６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋、およびＢＣＬ２のうちの１または複
数の発現の増大；
例えば、メモリーＴ細胞上、例えば、メモリーＴ細胞の前駆細胞上の、ＫＬＲＧ１の発現
の減少；ならびに
メモリーＴ細胞の前駆細胞、例えば、以下の特徴：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増大、ＣＤ１２
７ｈｉｇｈの増大、ＣＤ２７＋の増大、ＫＬＲＧ１の減少、およびＢＣＬ２の増大のうち
のいずれか１つまたは組合せを伴う細胞の数の増大；
のうちの１または複数を結果としてもたらし、
この場合、上記で記載した変化のうちのいずれかが、例えば、非処置対象と比較して、例
えば、少なくとも一過性に生じる。
本明細書で使用される「不応性」とは、処置に応答しない疾患、例えば、がんを指す。
複数の実施形態では、不応性がんは、処置の前または処置の開始時において、処置に対し
て耐性でありうる。他の実施形態では、不応性がんは、処置中に耐性となりうる。不応性
がんはまた、耐性がんとも呼ばれる。
本明細書で使用される「再発した」とは、改善期間の後、例えば、治療、例えば、がん
治療の既往の処置の後における、疾患（例えば、がん）、またはがんなどの疾患の徴候お
よび症状の再来を指す。
範囲：本開示を通して、本発明の多様な態様は、範囲のフォーマットで提示される場合
がある。範囲のフォーマットにおける記載は、単に簡便さおよび簡潔さのためであり、本
発明の範囲に対する、柔軟性のない限定として解釈すべきではないと理解されたい。した
がって、範囲についての記載は、全ての可能な部分範囲、加えてその範囲内の個々の数値
を具体的に開示していると考えるものとする。例えば、１から６などの範囲についての記
載は、例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など、具体的に開示さ
れる部分範囲のほか、その範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、
５．３、および６を有すると考えるものとする。別の例として、９５～９９％の同一性な
どの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を伴うあるものを
含み、さらに、９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８
％、および９８～９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関わらず適
用される。
詳細な説明
本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、組成物、および方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
、例えば、Ｃａｓ９系を使用する、真核細胞内のゲノム編集に関する。特に、本明細書で
記載されるｇＲＮＡ分子、組成物、および方法は、移植細胞、例えば、がん免疫療法のた
めの細胞の機能に対して影響を及ぼす標的分子の発現（またはこれらの機能的な変化形の
発現）の調節に関する。ある態様では、移植細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｎ
Ｋ細胞またはＴ細胞である。ある態様では、細胞は、同種異系細胞である。ある態様では
、細胞は、キメラ抗原受容体を発現するように操作されているか、操作されるか、または
操作されることになる。したがって、本明細書では、遺伝子産物の発現および／または機
能（例えば、機能的な変化形の発現レベル）を変更する、例えば、阻害または低減するた
めの組成物および方法であって、免疫療法のための移植細胞、例えば、移植免疫エフェク
ター細胞、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現
するように操作されたＴ細胞、例えば、ＣＡＲを発現する同種異系Ｔ細胞の有効性（例え
ば、望ましくない免疫原性（宿主対移植片応答または移植片対宿主応答など）を低減する
か、または消失させることにより）、機能、増殖、刺激、または生存を改善しうる組成物
および方法が提供される。
複数の態様では、遺伝子産物は、Ｔ細胞受容体の構成要素、例えば、ＣＤ３ゼータ、Ｃ
Ｄ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファまたは
ＴＣＲベータ；ＨＬＡ分子またはベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、例えば、ＨＬ
Ａ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＣまたはＢ２Ｍ；ＣＩＩＴＡ分子；または免疫抑制薬の標
的、例えば、グルココルチコイド受容体、デオキシシチジンキナーゼ、ＦＫＢＰ、ＣＤ５
２またはシクロフィリンファミリーメンバー；およびこれらの組合せなどの同種異系Ｔ細
胞標的である。理論に束縛されずに、同種異系Ｔ細胞標的のレベル、または同種異系Ｔ細
胞標的の遺伝子産物の発現レベルの阻害または消失（例えば、遺伝子の変更を介する）は
、移植片対宿主応答、宿主対移植片応答を低減するか、または消失させることにより、細
胞、例えば、移植細胞、例えば、移植免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞、例
えば、同種異系ＣＡＲＴ細胞の機能を改善しうるか、または前記移植細胞を、免疫抑制薬
療法に対して耐性とすると考えられる。
ある態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、Ｔ細胞受容体（Ｔ
ＣＲ）の構成要素、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デ
ルタ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、例えば、ＴＣＲアルファの定常領域、またはＴ
ＣＲベータ、例えば、ＴＣＲベータ遺伝子の定常領域１または定常領域２の遺伝子を変更
することにより、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲで操作されたＴ細胞、例えば、
ＣＡＲで操作された同種異系Ｔ細胞の機能（例えば、望ましくない免疫原性（宿主対移植
片応答または移植片対宿主応答など）を低減するか、または消失させることにより）、生
存、増殖、および／または有効性を改善することができる。理論に束縛されることを望ま
ないが、機能的Ｔ細胞受容体の構成要素の発現の低減または非存在は、前記細胞の表面上
のＴＣＲの存在を低減するか、または消失させ、これにより、Ｔ細胞受容体による、宿主
組織の認識およびこれへの応答を消失させることにより、移植片対宿主病を低減または防
止すると考えられる。したがって、この手法を使用して、「既製品」Ｔ細胞を作出しうる
であろう（Torikai et al., 2012 Blood 119, 5697-5705）。
ある態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、主要組織適合性複
合体の構成要素、例えば、ＨＬＡタンパク質またはＢ２Ｍ、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ
－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、もしくはＢ２Ｍ（Ｂ２Ｍ遺伝子によりコードされる）、または主要組
織適合性複合体の、１もしくは複数の構成要素の発現を調節するタンパク質、例えば、Ｎ
ＬＲＣ５の遺伝子を変更することにより、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲで操作
されたＴ細胞、例えば、ＣＡＲで操作された同種異系Ｔ細胞の機能（例えば、望ましくな
い免疫原性（宿主対移植片応答または移植片対宿主応答など）を低減するか、または消失
させることにより）、生存、増殖、および／または有効性を改善することができる。理論
に束縛されることを望まないが、ミスマッチ（例えば、細胞療法を施される対象の種類に
マッチしないミスマッチ）ＨＬＡタンパク質（または構成要素）の発現の低減または非存
在は、宿主Ｔ細胞受容体による、ミスマッチした（例えば、同種異系）移植片組織の認識
およびこれに対する応答を消失させることにより、宿主対移植片病を低減するか、または
消失させると考えられる。したがって、この手法を使用して、「既製品」Ｔ細胞を作出し
うるであろう。
ある態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、主要組織適合性複
合体クラスＩＩの構成要素、またはＭＨＣクラスＩＩの発現の調節因子、例えば、ＣＩＩ
ＴＡ（ＣＩＩＴＡ遺伝子によりコードされる）、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、またはＲＦＸ
ＡＰ、およびこれらの組合せ、例えば、ＣＩＩＴＡの遺伝子を変更することにより、細胞
、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲで操作されたＴ細胞、例えば、ＣＡＲで操作された同
種異系Ｔ細胞の機能（例えば、望ましくない免疫原性（宿主対移植片応答または移植片対
宿主応答など）を低減するか、または消失させることにより）、生存、増殖、および／ま
たは有効性を改善することができる。理論に束縛されることを望まないが、ＭＨＣクラス
ＩＩの発現の調節因子、例えば、ＣＩＩＴＡの発現を低減するか、または消失させること
は、同種異系細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減するか、または消失させ、これ
により、ミスマッチ（例えば、細胞療法を施される対象の種類にマッチしないミスマッチ
）ＭＨＣクラスＩＩタンパク質（または構成要素）の発現を低減するか、または消失させ
、これにより、例えば、宿主Ｔ細胞受容体による、ミスマッチした（例えば、同種異系）
移植片組織、例えば、同種異系Ｔ細胞、例えば、本明細書で記載される同種異系ＣＡＲＴ
細胞の認識およびこれに対する応答を消失させることにより、宿主対移植片病を低減する
か、または消失させると考えられる。したがって、この手法を使用して、「既製品」Ｔ細
胞を作出しうるであろう。
ある態様では、例えば、Ｔ細胞内、例えば、同種異系Ｔ細胞内、例えば、本明細書で記
載される、例えば、同種異系ＣＡＲＴ細胞内の、１または複数のＭＨＣクラスＩ分子、お
よび１または複数のＭＨＣ ＩＩ分子の両方の発現を低減するか、または消失させて、細
胞の投与時における、宿主対移植片病応答をさらに低減するか、または消失させることは
有益でありうる。したがって、本発明の細胞および方法についての複数の実施形態では、
細胞は、例えば、Ｂ２Ｍ（例えば、前記細胞内の、１または複数のＭＨＣクラスＩ分子の
発現を低減するか、または消失させるように）に対する、本明細書で記載されるｇＲＮＡ
分子を含む、本発明の組成物（例えば、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９分子を含む組成物）、お
よび、例えば、ＣＩＩＴＡ（例えば、１または複数のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低減
するか、または消失させるように）に対する、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含む
、本発明の組成物（例えば、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９分子を含む組成物）と接触させるこ
とができる。本発明の細胞および方法についての複数の実施形態では、細胞はまた、例え
ば、ＴＣＲの構成要素、例えば、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ（例えば、Ｔ細胞受容
体、例えば、１または複数のＴＣＲの構成要素の発現を低減するか、または消失させるよ
うに）に対する、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含む、本発明の組成物（例えば、
ｇＲＮＡおよびＣａｓ９分子を含む組成物）とも接触させることができる。ある実施形態
では、本発明の細胞は、ＴＣＲの発現（例えば、フローサイトメトリーにより検出される
）を低減または消失させ、１または複数のＭＨＣクラスＩ分子の発現（例えば、フローサ
イトメトリーにより検出される）を低減または消失させ、１または複数のＭＨＣクラスＩ
Ｉ分子の発現（例えば、フローサイトメトリーにより検出される）を低減または消失させ
ている。ある実施形態では、本発明の細胞は、ＴＲＡＣの発現を低減または消失させ、Ｂ
２Ｍの発現を低減または消失させ、ＣＩＩＴＡの発現を低減または消失させている。ある
実施形態では、本発明の細胞は、ＴＲＡＣの発現を低減または消失させ、ＮＬＲＣ５の発
現を低減または消失させ、ＣＩＩＴＡの発現を低減または消失させている。複数の実施形
態では、発現の低減または消失は、本発明の組成物またはＣＲＩＳＰＲ系で処置されなか
った、同様な細胞と比べて測定される。複数の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター
細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、Ｔ細胞
である。複数の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体
（ＣＡＲ）を発現するように操作されたＴ細胞である。複数の実施形態では、ＣＡＲは、
例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ ＣＡＲである。ある実施形態では、本発明は、
細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、ＴＣＲ
－／Ｂ２Ｍ－／ＣＩＩＴＡ－、またはＴＣＲ－／ＮＬＲＣ５－／ＣＩＩＴＡ－であるＢＣ
ＭＡ ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞を提供する。複数の実施形態では、細胞
は、ヒト細胞である。複数の実施形態では、細胞は、前記細胞を投与される対象に対して
同種異系である。複数の実施形態では、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、および／またはＣ
ＩＩＴＡの発現の低減または消失を、前記細胞へと、例えば、本明細書で記載される、ま
たは本明細書で記載される方法による、本発明の、組成物、ＣＲＩＳＰＲ系、またはｇＲ
ＮＡを導入することにより達する。
ある態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、免疫抑制薬の標的
、例えば、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）（ＮＲ３Ｃ１によりコードされる）の遺伝
子を変更することにより、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲで操作されたＴ細胞、
例えば、ＣＡＲで操作された同種異系Ｔ細胞の機能（例えば、望ましくない免疫原性（宿
主対移植片応答または移植片対宿主応答など）を低減するか、または消失させることによ
り）、生存、増殖、および／または有効性を改善することができる。理論に束縛されずに
、細胞療法生成物上の、機能的ＧＲの発現の非存在または低減は、この細胞療法生成物が
、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドなどの免疫抑制薬であって、例えば、宿主対
移植片病を低減するか、または消失させるように投与される免疫抑制薬の存在下で機能す
ることを可能とすると考えられる。したがって、この手法を使用して、「既製品」Ｔ細胞
を作出しうるであろう。
ある態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、免疫抑制薬の標的
、例えば、ＣＤ５２（ＣＤ５２によりコードされる）の遺伝子を変更することにより、細
胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲで操作されたＴ細胞、例えば、ＣＡＲで操作された
同種異系Ｔ細胞の機能（例えば、望ましくない免疫原性（宿主対移植片応答または移植片
対宿主応答など）を低減するか、または消失させることにより）、生存、増殖、および／
または有効性を改善することができる。理論に束縛されずに、細胞療法生成物上の、機能
的ＣＤ５２の発現の非存在または低減は、この細胞療法生成物が、アレムツズマブ（ＣＡ
ＭＰＡＴＨ（登録商標））などの抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合性断片などの免疫抑
制薬であって、例えば、宿主対移植片病を低減するか、または消失させるように投与され
る免疫抑制薬の存在下で機能することを可能とすると考えられる。したがって、この手法
を使用して、「既製品」Ｔ細胞を作出しうるであろう。
ある態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、免疫抑制薬の標的
、例えば、ＦＫＢＰファミリーのメンバー、例えば、ＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ１Ａにより
コードされる）の遺伝子を変更することにより、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲ
で操作されたＴ細胞、例えば、ＣＡＲで操作された同種異系Ｔ細胞の機能（例えば、望ま
しくない免疫原性（宿主対移植片応答または移植片対宿主応答など）を低減するか、また
は消失させることにより）、生存、増殖、および／または有効性を改善することができる
。理論に束縛されずに、細胞療法生成物上の、機能的ＦＫＢＰ１２の発現の非存在または
低減は、この細胞療法生成物が、ＦＫ５０６（またはＦＫＢＰ１２結合性断片またはその
類似体）、シクロスポリン、ラパマイシン、もしくはラパログ、またはＲＡＤ００１など
のｍＴｏｒ阻害剤などの免疫抑制薬であって、例えば、宿主対移植片病を低減するか、ま
たは消失させるように投与される免疫抑制薬の存在下で機能することを可能とすると考え
られる。したがって、この手法を使用して、「既製品」Ｔ細胞を作出しうるであろう。
ある態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、免疫抑制薬の標的
、例えば、デオキシシチジン（deoxycytdine）キナーゼ（ＤＣＫによりコードされる）の
遺伝子を変更することにより、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲで操作されたＴ細
胞、例えば、ＣＡＲで操作された同種異系Ｔ細胞の機能（例えば、望ましくない免疫原性
（宿主対移植片応答または移植片対宿主応答など）を低減するか、または消失させること
により）、生存、増殖、および／または有効性を改善することができる。理論に束縛され
ずに、細胞療法生成物上の、機能的デオキシシチジン（deoxycytdine）キナーゼの発現の
非存在または低減は、この細胞療法生成物が、シタラビン（シトシンアラビノシド）また
はゲムシタビンなどの免疫抑制薬であるヌクレオシド類似体ベースの薬物の存在下で機能
することを可能とすると考えられ、免疫抑制薬は、例えば、宿主対移植片病を低減するか
、もしくは消失させるか、またはがんを処置するように投与される。したがって、この手
法を使用して、「既製品」Ｔ細胞を作出しうるであろう。
複数の態様では、遺伝子産物は、阻害性分子、例えば、免疫チェックポイントタンパク
質、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、Ｃ
ＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡ
Ｍ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ
８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（Ｔ
ＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラス
ＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータである。理論に束縛されずに、阻害性
分子のレベルまたは阻害性分子の遺伝子産物の発現レベルの阻害または消失（例えば、遺
伝子の変更を介する）は、前記阻害性分子により媒介される阻害性効果を低減するか、ま
たは消失させることにより、細胞、例えば、移植細胞、例えば、移植免疫エフェクター細
胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞、例えば、同種異系ＣＡＲＴ細胞の機能を改善しうると考えら
れる。
一態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、阻害性分子、例えば
、ＰＤ１の遺伝子を変更することにより、免疫抑制因子の、細胞、例えば、ＣＡＲで操作
されたＴ細胞に対する影響を減殺することができる。理論に束縛されることを望まないが
、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）（ＰＤＣＤ１によりコードされる）の発現の低減また
は非存在は、抑制状態または非応答性状態（「アネルギー」）の誘導を失効化させると考
えられる。
一態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、阻害性分子、例えば
、Ｔｉｍ３の遺伝子を変更することにより、免疫抑制因子の、細胞、例えば、ＣＡＲで操
作されたＴ細胞に対する影響を減殺することができる。理論に束縛されることを望まない
が、Ｔｉｍ３（ＨＡＶＣＲ２によりコードされる）の発現の低減または非存在は、抑制状
態または非応答性状態（「アネルギー」）の誘導を失効化させると考えられる。
一態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、阻害性分子、例えば
、ＣＴＬＡ４遺伝子の遺伝子を変更することにより、免疫抑制因子の、細胞、例えば、Ｃ
ＡＲで操作されたＴ細胞に対する影響を減殺することができる。理論に束縛されることを
望まないが、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４によりコードされる）の発現
の低減または非存在は、抑制状態または非応答性状態（「アネルギー」）の誘導を失効化
させると考えられる。
一態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、阻害性分子、例えば
、Ｌａｇ３遺伝子の遺伝子を変更することにより、免疫抑制因子の、細胞、例えば、ＣＡ
Ｒで操作されたＴ細胞に対する影響を減殺することができる。理論に束縛されることを望
まないが、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ３）（ＬＡＧ３によりコードされる）の発現
の低減または非存在は、抑制状態または非応答性状態（「アネルギー」）の誘導を失効化
させると考えられる。
一態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、阻害性分子、例えば
、ＰＤ－Ｌ１遺伝子の遺伝子を変更することにより、免疫抑制因子の、細胞、例えば、Ｃ
ＡＲで操作されたＴ細胞に対する影響を減殺することができる。理論に束縛されることを
望まないが、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１；ＣＤ２７４およびＢ７－Ｈ１として
もまた公知である）（ＣＤ２７４によりコードされる）の発現の低減または非存在は、抑
制状態または非応答性状態（「アネルギー」）の誘導を失効化させると考えられる。
一態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、阻害性分子、例えば
、非受容体１型プロテインチロシンホスファターゼ遺伝子の下流のエフェクター分子の遺
伝子を変更することにより、免疫抑制因子の、細胞、例えば、ＣＡＲで操作されたＴ細胞
に対する影響を減殺することができる。理論に束縛されることを望まないが、１Ｂ型プロ
テインチロシンホスファターゼとしてもまた公知の、機能的非受容体１型プロテインチロ
シンホスファターゼ（ＰＴＰＮ１によりコードされる）の発現の低減または非存在は、阻
害性分子を介するシグナル伝達に影響を及ぼすことにより、抑制状態または非応答性状態
（「アネルギー」）の誘導を失効化させると考えられる。
複数の態様では、本明細書で記載される組成物および方法は、非改変細胞と比べて、有
効性（例えば、望ましくない免疫原性（宿主対移植片応答または移植片対宿主応答など）
を低減するか、または消失させることにより）、生存、増殖、および／または刺激を増強
した細胞、例えば、移植細胞、例えば、同種異系細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、
例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、例えば、ＣＡＲで操作されたＴ細胞を作出するように、
組合せで使用することができる。
一手法では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、機能的なＴＣＲの構
成要素のレベルまたは発現レベルを低減したか、または消失させた細胞と、機能的ＭＨＣ
のレベルまたは発現レベルを低減したか、または消失させた細胞とを作出することができ
る。一実施形態では、細胞は、ＴＣＲアルファおよびＨＬＡ－Ａのレベルまたは発現レベ
ルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＴＣＲアルファおよ
びＨＬＡ－Ｂのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施形
態では、細胞は、ＴＣＲアルファおよびＨＬＡ－Ｃのレベルまたは発現レベルを低減する
か、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＴＣＲアルファおよびＢ２Ｍのレ
ベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、
ＴＣＲアルファおよびＮＬＲＣ５のレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失さ
せている。一実施形態では、細胞は、ＴＣＲベータおよびＨＬＡ－Ａのレベルまたは発現
レベルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＴＣＲベータお
よびＨＬＡ－Ｂのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施
形態では、細胞は、ＴＣＲベータおよびＨＬＡ－Ｃのレベルまたは発現レベルを低減する
か、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＴＣＲベータおよびＢ２Ｍのレベ
ルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、Ｔ
ＣＲベータおよびＮＬＲＣ５のレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させて
いる。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３ゼータおよびＨＬＡ－Ａのレベルまたは発現レベ
ルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３ゼータおよび
ＨＬＡ－Ｂのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施形態
では、細胞は、ＣＤ３ゼータおよびＨＬＡ－Ｃのレベルまたは発現レベルを低減するか、
または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３ゼータおよびＢ２Ｍのレベルま
たは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３
ゼータおよびＮＬＲＣ５のレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている
。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３イプシロンおよびＨＬＡ－Ａのレベルまたは発現レベ
ルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３イプシロンお
よびＨＬＡ－Ｂのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施
形態では、細胞は、ＣＤ３イプシロンおよびＨＬＡ－Ｃのレベルまたは発現レベルを低減
するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３イプシロンおよびＢ２
Ｍのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細
胞は、ＣＤ３イプシロンおよびＮＬＲＣ５のレベルまたは発現レベルを低減するか、また
は消失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３ガンマおよびＨＬＡ－Ａのレベルま
たは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３
ガンマおよびＨＬＡ－Ｂのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている
。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３ガンマおよびＨＬＡ－Ｃのレベルまたは発現レベルを
低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３ガンマおよびＢ２
Ｍのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細
胞は、ＣＤ３ガンマおよびＮＬＲＣ５のレベルまたは発現レベルを低減するか、または消
失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３デルタおよびＨＬＡ－Ａのレベルまたは
発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３デル
タおよびＨＬＡ－Ｂのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。一
実施形態では、細胞は、ＣＤ３デルタおよびＨＬＡ－Ｃのレベルまたは発現レベルを低減
するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は、ＣＤ３デルタおよびＢ２Ｍの
レベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。一実施形態では、細胞は
、ＣＤ３デルタおよびＮＬＲＣ５のレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失さ
せている。前述の複数の実施形態のうちのいずれかでは、細胞は、ＣＩＩＴＡのレベルま
たは発現レベルを低減するか、または消失させている。ある実施形態では、細胞は、ＴＲ
ＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失さ
せている。ある実施形態では、細胞は、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡのレベルま
たは発現レベルを低減するか、または消失させている。ある実施形態では、細胞は、ＴＲ
ＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡのレベルまたは発現レベルを低減するか、ま
たは消失させている。ある実施形態では、細胞は、ＴＲＡＣ、ＮＬＲＣ５、およびＣＩＩ
ＴＡのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている。ある実施形態では
、細胞は、ＴＲＢＣ、ＮＬＲＣ５、およびＣＩＩＴＡのレベルまたは発現レベルを低減す
るか、または消失させている。ある実施形態では、細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＮＬＲ
Ｃ５、およびＣＩＩＴＡのレベルまたは発現レベルを低減するか、または消失させている
。前述の複数の実施形態のうちのいずれかでは、細胞は加えて、１もしくは複数の阻害性
分子、または阻害性分子の下流のエフェクターのレベルまたは発現レベルも低減するか、
または消失させている。一態様では、１または複数の阻害性分子は、ＰＤ－１を含む。一
態様では、１または複数の阻害性分子は、ＰＤ－Ｌ１を含む。一態様では、１または複数
の阻害性分子は、Ｌａｇ３を含む。一態様では、１または複数の阻害性分子は、Ｔｉｍ３
を含む。一態様では、１または複数の阻害性分子は、ＣＴＬＡ４を含む。一態様では、１
または複数の阻害性分子は、ＰＴＰＮ１を含む。一態様では、１または複数の阻害性分子
は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１を含む。一態様では、１または複数の阻害性分子は、ＰＤ
－１およびＬａｇ３を含む。一態様では、１または複数の阻害性分子は、ＰＤ－１および
Ｔｉｍ３を含む。一態様では、１または複数の阻害性分子は、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ４
を含む。一態様では、１または複数の阻害性分子は、ＰＤ－Ｌ１およびＬａｇ３を含む。
一態様では、１または複数の阻害性分子は、ＰＤ－Ｌ１およびＴｉｍ３を含む。一態様で
は、１または複数の阻害性分子は、ＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ４を含む。一態様では、１
または複数の阻害性分子は、Ｔｉｍ３およびＬａｇ３を含む。一態様では、１または複数
の阻害性分子は、Ｔｉｍ３およびＣＴＬＡ４を含む。一態様では、１または複数の阻害性
分子は、Ｌａｇ３およびＣＴＬＡ４を含む。一態様では、１または複数の阻害性分子は、
ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＬａｇ３を含む。一態様では、１または複数の阻害性分子
は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＴｉｍ３を含む。一態様では、１または複数の阻害性
分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ－４を含む。一態様では、１または複数
の阻害性分子は、ＰＤ－１、Ｔｉｍ３、およびＬａｇ３を含む。一態様では、１または複
数の阻害性分子は、ＰＤ－Ｌ１、Ｔｉｍ３、およびＬａｇ３を含む。一態様では、１また
は複数の阻害性分子は、ＣＴＬＡ４、Ｔｉｍ３、およびＬａｇ３を含む。
一態様では、本明細書で記載される組成物および方法を使用して、２つまたはこれを超
える、例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分子のレベルまたは発現レベ
ルを低減したか、または消失させた細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲで操作された
Ｔ細胞を作出することができる。一態様では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、
例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分子は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１を含む。一態様
では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分
子は、ＰＤ－１およびＬａｇ３を含む。一態様では、２つまたはこれを超える、例えば、
２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分子は、ＰＤ－１およびＴｉｍ３を含む。一
態様では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻害
性分子は、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ４を含む。一態様では、２つまたはこれを超える、例
えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分子は、ＰＤ－Ｌ１およびＬａｇ３を
含む。一態様では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４
つの阻害性分子は、ＰＤ－Ｌ１およびＴｉｍ３を含む。一態様では、２つまたはこれを超
える、例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分子は、ＰＤ－Ｌ１およびＣ
ＴＬＡ４を含む。一態様では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、例えば、３つ、
例えば、４つの阻害性分子は、Ｔｉｍ３およびＬａｇ３を含む。一態様では、２つまたは
これを超える、例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分子は、Ｔｉｍ３お
よびＣＴＬＡ４を含む。一態様では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、例えば、
３つ、例えば、４つの阻害性分子は、Ｌａｇ３およびＣＴＬＡ４を含む。一態様では、２
つまたはこれを超える、例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分子は、Ｐ
Ｄ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＬａｇ３.を含む。一態様では、２つまたはこれを超える、
例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、お
よびＴｉｍ３を含む。一態様では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、例えば、３
つ、例えば、４つの阻害性分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＴＬＡ－４を含む。
一態様では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻
害性分子は、ＰＤ－１、Ｔｉｍ３、およびＬａｇ３を含む。一態様では、２つまたはこれ
を超える、例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分子は、ＰＤ－Ｌ１、Ｔ
ｉｍ３、およびＬａｇ３を含む。一態様では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、
例えば、３つ、例えば、４つの阻害性分子は、ＣＴＬＡ４、Ｔｉｍ３、およびＬａｇ３を
含む。
細胞が、ＴＣＲアルファのレベルまたは発現レベルを低減したか、または消失させた、
複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番号５８１６～配列番号５９６５、もし
くは配列番号５５２８～配列番号５６２３、例えば、配列番号５５６９、配列番号５５８
７、配列番号５５９２、もしくは配列番号５５８６を含むターゲティングドメインを含む
ｇＲＮＡ分子、または配列番号５８１６～配列番号５９６５、もしくは配列番号５５２８
～配列番号５６２３の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２
５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるターゲティングドメ
インを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＴＣＲベータのレベルまたは発現レベルを低減したか、または消失させた、複
数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番号５９６６～配列番号６０９７、もしく
は配列番号５６２４～配列番号５６４３を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分
子、または配列番号５９６６～配列番号６０９７、もしくは配列番号５６２４～配列番号
５６４３の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５の連続ヌ
クレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるターゲティングドメインを含む
ｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。細胞が、ＴＣＲベータのレベルまた
は発現レベルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましく
は、配列番号６０９８～配列番号６２２６、もしくは配列番号５６４４～配列番号５７１
９を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、または配列番号６０９８～配列番
号６２２６、もしくは配列番号５６４４～配列番号５７１９の、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌ
クレオチドからなるターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつて
これを含んだ。
細胞が、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ２４７遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レ
ベルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列
番号８４～配列番号３９２を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、または配
列番号８４～配列番号３９２の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、も
しくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるターゲティ
ングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３Ｅ遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現
レベルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配
列番号５３３～配列番号８３９を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、また
は配列番号５３３～配列番号８３９の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるター
ゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＣＤ３デルタ（ＣＤ３Ｄ遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベ
ルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番
号３９３～配列番号５３２を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、または配
列番号３９３～配列番号５３２の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、
もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるターゲテ
ィングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＣＤ３ガンマ（ＣＤ３Ｇ遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベ
ルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番
号８４０～配列番号９６８を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、または配
列番号８４０～配列番号９６８の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、
もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるターゲテ
ィングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、Ｂ２Ｍ（Ｂ２Ｍ遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベルを低減
したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番号１～配
列番号８３、もしくは配列番号５４９２～配列番号５５２７を含むターゲティングドメイ
ンを含むｇＲＮＡ分子、または配列番号１～配列番号８３、もしくは配列番号５４９２～
配列番号５５２７の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５
の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるターゲティングドメイ
ンを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＮＬＲＣ５（ＮＬＲＣ５遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベ
ルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番
号８６２２～配列番号１００８９を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、ま
たは配列番号８６２２～配列番号１００８９の、１７、１８、１９、もしくは２０の連続
ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるターゲティングドメインを含
むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＨＬＡ－Ａ（ＨＬＡ－Ａ遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベ
ルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番
号９６９～配列番号１３４５を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、または
配列番号９６９～配列番号１３４５の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるター
ゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＨＬＡ－Ｂ（ＨＬＡ－Ｂ遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベ
ルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番
号１３４６～配列番号１６９８を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、また
は配列番号１３４６～配列番号１６９８の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
、２４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなる
ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＨＬＡ－Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベ
ルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番
号１６９９～配列番号２０６８を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、また
は配列番号１６９９～配列番号２０６８の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
、２４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなる
ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＣＩＩＴＡ（ＣＴＩＩＡ遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベ
ルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番
号６７５０～配列番号７７１６のうちのいずれか１つを含むターゲティングドメインを含
むｇＲＮＡ分子、または配列番号６７５０～配列番号７７１６の、１７、１８、１９、２
０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続
ヌクレオチドからなるターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつ
てこれを含んだ。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号７７１７～配列番号７
８０４のうちのいずれか１つを含むターゲティングドメインを含む。
細胞が、ＧＲ（ＮＲ３Ｃ１遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベルを低
減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番号２０
６９～配列番号２９４１を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、または配列
番号２０６９～配列番号２９４１の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４
、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるターゲ
ティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ１Ａ遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現
レベルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配
列番号６３２５～配列番号６５８３を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、
または配列番号６３２５～配列番号６５８３の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、
２３、２４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドから
なるターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＣＤ５２（ＣＤ５２遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベルを
低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番号６
２２７～配列番号６３２４を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、または配
列番号６２２７～配列番号６３２４の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるター
ゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＤＣＫ（ＤＣＫ遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベルを低減
したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番号５２７
８～配列番号５４９１を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、または配列番
号５２７８～配列番号５４９１の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、
もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるターゲテ
ィングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベ
ルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番
号２９４２～配列番号３２７０を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、また
は配列番号２９４２～配列番号３２７０の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
、２４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなる
ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、Ｔｉｍ３（ＨＡＶＣＲ２遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベ
ルを低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番
号３２７１～配列番号３５４１を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、また
は配列番号３２７１～配列番号３５４１の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
、２４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなる
ターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、Ｌａｇ３（ＬＡＧ３遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベルを
低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番号３
５４２～配列番号４０３２を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、または配
列番号３５４２～配列番号４０３２の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドからなるター
ゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
細胞が、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１遺伝子によりコードされる）のレベルまたは発現レベル
を低減したか、または消失させた、複数の実施形態では、細胞は、好ましくは、配列番号
４０３３～配列番号４５８９、もしくは配列番号５７２０～配列番号５８１５を含むター
ゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、または配列番号４０３３～配列番号４５８９、
または配列番号５７２０～配列番号５８１５の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、
２３、２４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドから
なるターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含んだ。
一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号５７７５を含むターゲティングドメインを含
むか、あるいは配列番号５７７５の、１７、１８、もしくは１９の連続ヌクレオチドを含
むか、またはこれからなるターゲティングドメインを含む。
細胞が、非受容体１型プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰＮ１遺伝子によりコ
ードされる）のレベルまたは発現レベルを低減したか、または消失させた、複数の実施形
態では、細胞は、好ましくは、配列番号４５９０～配列番号５２７７を含むターゲティン
グドメインを含むｇＲＮＡ分子、または配列番号４５９０～配列番号５２７７の、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５の連続ヌクレオチド、好まし
くは２０の連続ヌクレオチドからなるターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を含む
か、またはかつてこれを含んだ。
前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、細胞は、自家細胞であ
る。前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、細胞は、同種異系細
胞である。前述の複数の実施形態および複数の態様のうちのいずれかでは、細胞は、例え
ば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されるか、
または操作されることになる。前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれか
では、細胞は、Ｔ細胞である。
本発明の、ｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ系、Ｃａｓ９分子、細胞、ＣＡＲ分子、および
方法のさらなる特色を、下記に詳細に記載する。
Ｉ．ｇＲＮＡ分子
ｇＲＮＡ分子は、下記でより完全に記載される、多数のドメインを有しうるが、ｇＲＮ
Ａ分子は少なくとも、ｃｒＲＮＡドメイン（ターゲティングドメインを含む）と、ｔｒａ
ｃｒとを含むことが典型的である。ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素として使用される、本発明
のｇＲＮＡ分子は、標的部位において、またはこの近傍において、ＤＮＡを修飾する（例
えば、配列を修飾する）ために有用である。このような修飾は、例えば、標的部位を含む
遺伝子の機能的産物の、発現の低減または消失を結果としてもたらす、欠失および／また
は挿入を含む。これらの使用、およびさらなる使用については、下記でより完全に記載す
る。
ある実施形態では、単分子のまたはｓｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’へと、ｃ
ｒＲＮＡ（標的配列に相補的なターゲティングドメインと、フラッグポールの一部（すな
わち、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域）を形成する領域とを含有する）；ループ；およ
びｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的なドメインと、加えて、ヌクレ
アーゼまたは他のエフェクター分子、例えば、Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子にも結
合するドメインとを含有する）を含み、以下のフォーマット（５’から３’へと）：
［ターゲティングドメイン］－［ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域］－［任意選択の、第
１のフラッグポール伸長部］－［ループ］－［任意選択の、第１のｔｒａｃｒ伸長部］－
［ｔｒａｃｒのフラッグポール領域］－［ｔｒａｃｒのヌクレアーゼ結合性ドメイン］
をとりうる。
複数の実施形態では、ｔｒａｃｒのヌクレアーゼ結合性ドメインは、Ｃａｓタンパク質
、例えば、Ｃａｓ９タンパク質に結合する。
ある実施形態では、二分子のまたはｄｇＲＮＡは、２つのポリヌクレオチド；好ましく
は、５’から３’へと、第１のｃｒＲＮＡ（標的配列に相補的なターゲティングドメイン
と、フラッグポールの一部を形成する領域とを含有する）；および好ましくは、５’から
３’へと、第２のｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的なドメインと、
加えて、ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子、例えば、Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａ
ｓ９分子にも結合するドメインとを含有する）を含み、以下のフォーマット（５’から３
’へと）：
ポリヌクレオチド１（ｃｒＲＮＡ）：［ターゲティングドメイン］－［ｃｒＲＮＡのフラ
ッグポール領域］－［任意選択の、第１のフラッグポール伸長部］－［任意選択の、第２
のフラッグポール伸長部］
ポリヌクレオチド２（ｔｒａｃｒ）：［任意選択の、第１のｔｒａｃｒ伸長部］－［ｔｒ
ａｃｒのフラッグポール領域］－［ｔｒａｃｒのヌクレアーゼ結合性ドメイン］
をとりうる。
複数の実施形態では、ｔｒａｃｒのヌクレアーゼ結合性ドメインは、Ｃａｓタンパク質
、例えば、Ｃａｓ９タンパク質に結合する。
一部の態様では、ターゲティングドメインは、本明細書で記載されるターゲティングド
メイン配列、例えば、表１、２、３、４、５、６、６ｂ、もしくは６ｃに記載されるター
ゲティングドメイン、または表１、２、３、４、５、６、６ｂ、もしくは６ｃに記載され
るターゲティングドメイン配列の、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、
もしくは２５（好ましくは２０）の連続ヌクレオチドを含むか、またはこれからなるター
ゲティングドメインを含むか、またはこれらからなる。
一部の態様では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、５’
から３’へと、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８４）を含む。
一部の態様では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、５’
から３’へと、ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８５）を含む。
一部の態様では ループは、５’から３’へと、ＧＡＡＡ（配列番号６５８８）を含む
。
一部の態様ではｔｒａｃｒは、５’から３’へと、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡ
ＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧ
ＧＵＧＣ（配列番号６５８９）を含み、好ましくは、配列番号６５８４を含むｇＲＮＡ分
子内で使用される。
一部の態様では ｔｒａｃｒは、５’から３’へと、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡ
ＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣ
ＧＧＵＧＣ（配列番号６５９０）を含み、好ましくは、配列番号６５８５を含むｇＲＮＡ
分子内で使用される。
一部の態様では、ｇＲＮＡはまた、３’末端に、さらなるＵ核酸も含みうる。例えば、
ｇＲＮＡは、３’末端に、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、
９つ、または１０のＵ核酸を含みうる（配列番号１０８０６）。ある実施形態では、ｇＲ
ＮＡは、３’末端に、さらなる４つのＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポ
リヌクレオチド（例えば、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒ
ａｃｒを含むポリヌクレオチド）のうちの１または複数は、３’末端に、さらなるＵ核酸
を含みうる。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、ター
ゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド
）のうちの１または複数は、３’末端に、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ
、７つ、８つ、９つ、または１０のＵ核酸を含みうる（配列番号１０８０６）。ある実施
形態では、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、ターゲティング
ドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）のうちの
１または複数は、３’末端に、さらなる４つのＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある
実施形態では、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドだけが、さらなるＵ核酸、例えば、４
つのＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある実施形態では、ターゲティングドメインを
含むポリヌクレオチドだけが、さらなるＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある実施形
態では、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリ
ヌクレオチドのいずれもが、さらなるＵ核酸、例えば、４つのＵ核酸を含む。
一部の態様では、ｇＲＮＡはまた、３’末端に、さらなるＡ核酸も含みうる。例えば、
ｇＲＮＡは、３’末端に、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、
９つ、または１０のＡ核酸を含みうる（配列番号１０８０９）。ある実施形態では、ｇＲ
ＮＡは、３’末端に、さらなる４つのＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポ
リヌクレオチド（例えば、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒ
ａｃｒを含むポリヌクレオチド）のうちの１または複数は、３’末端に、さらなるＡ核酸
を含みうる。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、ター
ゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド
）のうちの１または複数は、３’末端に、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ
、７つ、８つ、９つ、または１０のＡ核酸を含みうる（配列番号１０８０９）。ある実施
形態では、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、ターゲティング
ドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）のうちの
１または複数は、３’末端に、さらなる４つのＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある
実施形態では、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドだけが、さらなるＡ核酸、例えば、４
つのＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある実施形態では、ターゲティングドメインを
含むポリヌクレオチドだけが、さらなるＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある実施形
態では、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリ
ヌクレオチドのいずれもが、さらなるＵ核酸、例えば、４つのＡ核酸を含む。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡのポリヌクレオチドのうちの１または複数は、５’末端
に、キャップを含みうる。
ある実施形態では、単分子のまたはｓｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’へと、ｃ
ｒＲＮＡ（標的配列に相補的なターゲティングドメインと、ｃｒＲＮＡのフラッグポール
領域と、第１のフラッグポール伸長部とを含有する）；ループ；第１のｔｒａｃｒ伸長部
（第１のフラッグポール伸長部の少なくとも一部に相補的なドメインを含有する）；およ
びｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的なドメインと、加えて、Ｃａｓ
９分子にも結合するドメインとを含有する）を含む。一部の態様では、ターゲティングド
メインは、本明細書で記載されるターゲティングドメイン配列、例えば、表１、２、３、
４、５、６、６ｂ、もしくは６ｃに記載されるターゲティングドメイン、または表１、２
、３、４、５、６、６ｂ、もしくは６ｃに記載されるターゲティングドメイン配列の、１
７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５（好ましくは２０）の連
続ヌクレオチドを含むか、またはこれからなるターゲティングドメイン、例えば、表１、
２、３、４、５、６、６ｂ、または６ｃに記載されるターゲティングドメイン配列の、３
’側の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５（好ましくは２０
）の連続ヌクレオチドを含む。
第１のフラッグポール伸長部および／または第１のｔｒａｃｒ伸長部を含む、複数の態
様では、フラッグポール、ループ、およびｔｒａｃｒ配列は、上記で記載した通りであり
うる。一般に、それらが相補的であるという条件で、任意の第１のフラッグポール伸長部
と、第１のｔｒａｃｒ伸長部とを援用することができる。複数の実施形態では、第１のフ
ラッグポール伸長部、および第１のｔｒａｃｒ伸長部は、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ
、８つ、９つ、１０、またはこれを超える相補的なヌクレオチドからなる。
一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部は、５’から３’へと、ＵＧＣＵＧ（配
列番号６５８６）を含む。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部は、配列番号６
５８６からなる。
一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、５’から３’へと、ＣＡＧＣＡ（配列番
号６５９１）を含む。一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号６５９１か
らなる。
ある実施形態では、ｄｇＲＮＡは、２つの核酸分子を含む。一部の態様では、ｄｇＲＮ
Ａは、好ましくは、５’から３’へと、標的配列に相補的なターゲティングドメイン；ｃ
ｒＲＮＡのフラッグポール領域；任意選択で、第１のフラッグポール伸長部；および、任
意選択で、第２のフラッグポール伸長部を含有する第１の核酸と；第２の核酸（本明細書
では、ｔｒａｃｒと称しうる）とを含み、好ましくは、５’から３’へと、任意選択で、
第１のｔｒａｃｒ伸長部；およびｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的
なドメインと、加えて、Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子にも結合するドメインとを含
有する）を含む、少なくとも１つのドメイン（Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子に結合
する）を含む。第２の核酸は加えて、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒに対して３’側に
）、さらなるＵ核酸も含みうる。例えば、ｔｒａｃｒは、３’末端に（例えば、ｔｒａｃ
ｒに対して３’側に）、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９
つ、または１０のＵ核酸を含みうる（配列番号１０８０６）。第２の核酸は加えて、また
は代替的に、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒに対して３’側に）、さらなるＡ核酸も含
みうる。例えば、ｔｒａｃｒは、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒに対して３’側に）、
さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のＡ核酸
を含みうる（配列番号１０８０９）。一部の態様では、ターゲティングドメインは、本明
細書で記載されるターゲティングドメイン配列、例えば、表１、２、３、４、５、６、６
ｂ、もしくは６ｃに記載されるターゲティングドメイン、または表１、２、３、４、５、
６、６ｂ、もしくは６ｃに記載されるターゲティングドメイン配列の、１７、１８、１９
、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５（好ましくは２０）の連続ヌクレオチド
を含むか、またはこれからなるターゲティングドメインを含む。
ｄｇＲＮＡを伴う複数の態様では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域、任意選択の、第
１のフラッグポール伸長部、任意選択の、第１のｔｒａｃｒ伸長部、およびｔｒａｃｒ配
列は、上記で記載した通りでありうる。
一部の態様では、任意選択の、第２のフラッグポール伸長部は、５’から３’へと、Ｕ
ＵＵＵＧ（配列番号６５８７）を含む。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の（ならびに、ｄｇＲＮＡ分子の場合、ターゲティ
ングドメインを含むポリヌクレオチド、および／またはｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチ
ドの）、３’側の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのヌクレオチド、５’側の１つ
、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのヌクレオチド、または３’側および５’側の１つ、
２つ、３つ、４つ、もしくは５つのヌクレオチドの両方は、下記のＸＩＩＩ節で、より完
全に記載される修飾核酸である。
ドメインについては、下記で簡略に論じる。
１）ターゲティングドメイン：
ターゲティングドメインの選択についての指針は、例えば、Fu Y el al. NAT BIOTECHN
OL 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808)およびSternberg SH el al. NATURE 2014 (doi: 10.10
38/naturel3011)において見出すことができる。
ターゲティングドメインは、標的核酸上の標的配列に相補的、例えば、少なくとも８０
、８５、９０、９５、または９９％相補的、例えば、完全に相補的であるヌクレオチド配
列を含む。ターゲティングドメインは、ＲＮＡ分子の一部であり、したがって、ウラシル
（Ｕ）塩基を含むが、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは、チミン（Ｔ）塩基を含
むであろう。理論に束縛されることを望まないが、ターゲティングドメインの、標的配列
との相補性は、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の、標的核酸との相互作用の特異性に
寄与すると考えられる。ターゲティングドメインと、標的配列との対では、ターゲティン
グドメイン内のウラシル塩基は、標的配列内のアデニン塩基と対合すると理解される。
ある実施形態では、ターゲティングドメインは、５～５０、例えば、１０～４０、例え
ば、１０～３０、例えば、１５～３０、例えば、１５～２５ヌクレオチドの長さである。
ある実施形態では、ターゲティングドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、
２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、タ
ーゲティングドメインは、１６ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲテ
ィングドメインは、１７ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティング
ドメインは、１８ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメイ
ンは、１９ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、
２０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２１ヌ
クレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２２ヌクレオ
チドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２３ヌクレオチドの
長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２４ヌクレオチドの長さで
ある。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２５ヌクレオチドの長さである。
複数の実施形態では、前述の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、
または２５ヌクレオチドは、表１、２、３、４、５、６、６ｂ、または６ｃに記載される
ターゲティングドメインに由来する、５’側の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２
２、２３、２４、または２５ヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、前述の１６、１
７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドは、表１、２
、３、４、５、６、６ｂ、または６ｃに記載されるターゲティングドメインに由来する、
３’側の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオ
チドを含む。
理論に束縛されずに、ターゲティングドメインの３’末端に配置される、ターゲティン
グドメインの、８つ、９つ、または１０の核酸は、標的配列をターゲティングするために
重要であり、したがって、ターゲティングドメインの「コア」領域と称しうると考えられ
る。ある実施形態では、コアドメインは、標的配列と完全に相補的である。
本明細書では、ターゲティングドメインが相補的な標的核酸の鎖を、標的配列と称する
。一部の態様では、標的配列は、染色体上に配置され、例えば、遺伝子内の標的である。
一部の態様では標的配列は、遺伝子のエクソン内に配置される。一部の態様では標的配列
は、遺伝子のイントロン内に配置される。一部の態様では、標的配列は、目的の遺伝子の
調節エレメントの結合性部位、例えば、プロモーターの結合性部位、または転写因子結合
性部位を含むか、またはこれらに対して近位（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、
１００、２００、３００、４００、５００、または１０００核酸以内）である。ドメイン
のヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書のＸＩＩＩ節で見出される
修飾を有しうる。
２）ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域：
フラッグポールは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒの両方に由来する部分を含有する。ｃ
ｒＲＮＡのフラッグポール領域は、ｔｒａｃｒの部分と相補的であり、ある実施形態では
、ｔｒａｃｒの部分に対して、少なくとも一部の生理学的条件下、例えば、正常な生理学
的条件下で、二重鎖領域を形成するのに十分な相補性を有する。ある実施形態では、ｃｒ
ＲＮＡのフラッグポール領域は、５～３０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では
、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、５～２５ヌクレオチドの長さである。ｃｒＲＮＡ
のフラッグポール領域は、細菌のＣＲＩＳＰＲアレイに由来する、自然発生のリピート配
列部分との相同性を共有しうるか、またはこれらから導出されうる。ある実施形態では、
ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、本明細書で開示される、ｃｒＲＮＡのフラッグポー
ル領域、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）またはストレプトコッカス・サーモフィ
ルス（S. thermophilus）のｃｒＲＮＡのフラッグポール領域と、少なくとも５０％の相
同性を有する。
ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、配
列番号６５８４を含む。ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡのフラ
ッグポール領域は、配列番号６５８４との、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％
、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する配列を含む。ある実施形態で
は、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、配列番号６５８４の
、少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１１のヌクレオチドを含む。
ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、配列
番号６５８５を含む。ある実施形態では、フラッグポールは、配列番号６５８５との、少
なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相
同性を有する配列を含む。ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡのフ
ラッグポール領域は、配列番号６５８５の、少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、
１０、または１１のヌクレオチドを含む。
ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書のＸＩＩＩ節で
記載される修飾を有しうる。
３）第１のフラッグポール伸長部
第１のｔｒａｃｒ伸長部を含むｔｒａｃｒを使用する場合、ｃｒＲＮＡは、第１のフラ
ッグポール伸長部を含みうる。一般に、それらが相補的であるという条件で、任意の第１
のフラッグポール伸長部と、第１のｔｒａｃｒ伸長部とを援用することができる。複数の
実施形態では、第１のフラッグポール伸長部、および第１のｔｒａｃｒ伸長部は、３つ、
４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはこれを超える相補的なヌクレオチド
からなる。
第１のフラッグポール伸長部は、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドと相補的、例
えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％、例えば、完全に相補的であるヌ
クレオチドを含みうる。一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部の相補的なヌクレオチ
ドとハイブリダイズする、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドは、連続である。
一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする
、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドは、不連続であり、例えば、第１のｔｒａ
ｃｒ伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドにより隔てられた、２つまたは
これを超えるハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様では、第１のフラッグポー
ル伸長部は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはこれを超えるヌクレ
オチドを含む。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部は、５’から３’へと、Ｕ
ＧＣＵＧ（配列番号６５８６）を含む。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部は
、配列番号６５８６からなる。一部の態様では 第１のフラッグポール伸長部は、配列番
号６５８６に対する、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同
性を有する核酸を含む。
第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書
のＸＩＩＩ節で見出される修飾を有しうる。
３）ループ
ループは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域（または、存在する場合、任意選択で、第
１のフラッグポール伸長部）を、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒ（または、存在する場合、任意
選択で、第１のｔｒａｃｒ伸長部）と連結するのに用いられる。ループは、ｃｒＲＮＡの
フラッグポール領域と、ｔｒａｃｒとを、共有結合的に連結する場合もあり、非共有結合
的に連結する場合もある。ある実施形態では、連結は、共有結合的である。ある実施形態
では、ループは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域と、ｔｒａｃｒとを共有結合的にカッ
プリングさせる。ある実施形態では、ループは、第１のフラッグポール伸長部と、第１の
ｔｒａｃｒ伸長部とを共有結合的にカップリングさせる。ある実施形態では、ループは、
ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域と、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域にハイブリダイズ
する、ｔｒａｃｒのドメインとの間に挿入される共有結合であるか、またはこれを含む。
典型的に、ループは、１つまたは複数の、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ
、８つ、９つ、または１０のヌクレオチドを含む。
ｄｇＲＮＡ分子内では、ｃｒＲＮＡの少なくとも一部分（例えば、ｃｒＲＮＡのフラッ
グポール領域）と、ｔｒａｃｒの少なくとも一部分（例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポー
ル領域に相補的な、ｔｒａｃｒのドメイン）との間のハイブリダイゼーションを介して、
２つの分子が会合しうる。
多種多様なループは、ｓｇＲＮＡにおける使用に適する。ループは、共有結合からなる
場合もあり、１または数ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド
の長さほどの短いものでもありうる。ある実施形態では、ループは、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１５、２０、もしくは２５ヌクレオチド、またはこれを超えるヌク
レオチドの長さである。ある実施形態では、ループは、２～５０、２～４０、２～３０、
２～２０、２～１０、または２～５ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ルー
プは、自然発生の配列との相同性を共有するか、またはこれから導出される。ある実施形
態では、ループは、本明細書で開示されるループと、少なくとも５０％の相同性を有する
。ある実施形態では、ループは、配列番号６５８８を含む。
ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書のＸＩＩＩ節で
記載される修飾を有しうる。
４）第２のフラッグポール伸長部
ある実施形態では、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域、または、存在す
る場合、第１のフラッグポール伸長部に対して３’側のさらなる配列であって、本明細書
では、第２のフラッグポール伸長部と称する配列を含みうる。ある実施形態では、第２の
フラッグポール伸長部は、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、または
２～４ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、第２のフラッグポール伸長部は、
２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド、またはこれを超えるヌク
レオチドの長さである。ある実施形態では、第２のフラッグポール伸長部は、配列番号６
５８７を含む。
５）ｔｒａｃｒ：
ｔｒａｃｒとは、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９の結合に要求される核酸配列である
。理論に束縛されずに、各Ｃａｓ９分子種は、特定のｔｒａｃｒ配列と関連すると考えら
れる。ｔｒａｃｒ配列は、ｓｇＲＮＡ系およびｄｇＲＮＡ系のいずれにおいても活用され
る。ある実施形態では、ｔｒａｃｒは、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のｔｒａｃｒに由
来するか、またはこれから導出された配列を含む。一部の態様では、ｔｒａｃｒは、ｃｒ
ＲＮＡのフラッグポール部分にハイブリダイズする部分を有する、例えば、ｃｒＲＮＡの
フラッグポール領域に対して、少なくとも一部の生理学的条件下で、二重鎖領域を形成す
るのに十分な相補性を有する（本明細書では、場合によって、ｔｒａｃｒのフラッグポー
ル領域、またはｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的なｔｒａｃｒドメインと称する
）。複数の実施形態では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域とハイブリダイズする、ｔｒ
ａｃｒのドメインは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域の相補的なヌクレオチドとハイブ
リダイズする、少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のヌクレオチドを含む。一部の態様では
、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする、ｔｒ
ａｃｒのヌクレオチドは、連続である。一部の態様では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領
域の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする、ｔｒａｃｒのヌクレオチドは、不連続
であり、例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域のヌクレオチドと塩基対合しないヌク
レオチドにより隔てられた、２つまたはこれを超えるハイブリダイゼーション領域を含む
。一部の態様では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域にハイブリダイズする、ｔｒａｃｒ
の部分は、５’から３’へと、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡ（配列番号６５９７）を含む
。一部の態様では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域にハイブリダイズする、ｔｒａｃｒ
の部分は、５’から３’へと、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡ（配列番号６５９８）を含む
。複数の実施形態では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域とハイブリダイズする配列は、
ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子にも加えて結合するｔｒａｃ
ｒの配列に対して５’側の、ｔｒａｃｒ上に配置される。
ｔｒａｃｒは、ヌクレアーゼ、例えば、加えて、Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子に
も結合するドメインをさらに含む。理論に束縛されずに、異なる種に由来するＣａｓ９は
、異なるｔｒａｃｒ配列に結合すると考えられる。一部の態様では、ｔｒａｃｒは、化膿
連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子に結合する配列を含む。一部の態様では、ｔｒ
ａｃｒは、本明細書で開示されるＣａｓ９分子に結合する配列を含む。一部の態様では、
Ｃａｓ９分子にも加えて結合するドメインは、５’から３’へと、ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵ
ＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列
番号６５９９）を含む。一部の態様では Ｃａｓ９分子にも加えて結合するドメインは、
５’から３’へと、ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵ
ＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号６６００）を含む。
一部の実施形態では、ｔｒａｃｒは、配列番号６５８９を含む。一部の実施形態では、
ｔｒａｃｒは、配列番号６５９０を含む。
ｔｒａｃｒのヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書のＸＩＩＩ節
で見出される修飾を有しうる。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、ま
たはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／もしくはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記で記載した、
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素のうちのいずれかは、ｇＲＮＡの、５’末端、３’末端
、または５’末端および３’末端の両方における、逆位非塩基性残基を含む。複数の実施
形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、またはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／もし
くはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記で記載した、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素のうちの
いずれかは、ポリヌクレオチドの５’末端における残基の間の、１または複数のホスホロ
チオエート（phosphorothioate）結合、例えば、最初の２つの５’残基の間、最初の３つ
の５’残基の各々の間、最初の４つの５’残基の各々の間、または最初の５つの５’残基
の各々の間のホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を含む。複数の実施形態では
、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素は、代替的に、または加えて、ポリヌクレオチドの３
’末端における残基の間の、１または複数のホスホロチオエート（phosphorothioate）結
合、例えば、最初の２つの３’残基の間、最初の３つの３’残基の各々の間、最初の４つ
の３’残基の各々の間、または最初の５つの３’残基の各々の間のホスホロチオエート（
phosphrothioate）結合も含みうる。ある実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ
、またはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／もしくはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記で記載し
た、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素のうちのいずれかは、最初の４つの５’残基の各々
の間のホスホロチオエート（phosphorothioate）結合（例えば、５’末端における、３つ
のホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を含む、例えば、これからなる）、およ
び最初の４つの３’残基の各々の間のホスホロチオエート（phosphorothioate）結合（例
えば、３’末端における、３つのホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を含む、
例えば、これからなる）を含む。ある実施形態では、上記で記載したホスホロチオエート
（phosphorothioate）修飾のうちのいずれかを、ポリヌクレオチドの、５’末端、３’末
端、または５’末端および３’末端の両方における、逆位非塩基性残基と組み合わせる。
このような実施形態では、逆位非塩基性ヌクレオチドを、リン酸結合またはホスホロチオ
エート（phosphorothioate）結合により、５’ヌクレオチドおよび／または３’ヌクレオ
チドと連結することができる。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、ま
たはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／もしくはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記で記載した、
ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素のうちのいずれかは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む、１
または複数のヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、５’残基のうちの、最初の１つ
、２つ、３つ、またはこれを超えるものの各々は、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。複数の
実施形態では、３’残基のうちの、最初の１つ、２つ、３つ、またはこれを超えるものの
各々は、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。複数の実施形態では、末端に対して４つ目、末端
に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’残基は、２’－Ｏ－メチル修飾を含む
。複数の実施形態では、５’残基のうちの、最初の１つ、２つ、３つ、またはこれを超え
るものの各々は、２’－Ｏ－メチル修飾を含み、３’残基のうちの、最初の１つ、２つ、
３つ、またはこれを超えるものの各々は、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。ある実施形態で
は、５’残基のうちの、最初の３つの各々は、２’－Ｏ－メチル修飾を含み、３’残基の
うちの、最初の３つの各々は、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。複数の実施形態では、５’
残基のうちの、最初の３つの各々は、２’－Ｏ－メチル修飾を含み、末端に対して４つ目
、末端に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’残基は、２’－Ｏ－メチル修飾
を含む。複数の実施形態では、例えば、上記で記載した２’－Ｏ－メチル修飾のうちのい
ずれかを、例えば、上記で記載した、１もしくは複数のホスホロチオエート（phosphorot
hioate）修飾、および／または例えば、上記で記載した、１もしくは複数の逆位非塩基性
修飾と組み合わせることができる。ある実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、
またはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／もしくはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記で記載した
、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素のうちのいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の
間のホスホロチオエート（phosphorothioate）結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末
端における、３つのホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を含む、例えば、これ
からなる）、最初の４つの３’残基の各々の間のホスホロチオエート（phosphorothioate
）結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端における、３つのホスホロチオエート（ph
osphorothioate）結合を含む、例えば、これからなる）、最初の３つの５’残基の各々に
おける２’－Ｏ－メチル修飾、および最初の３つの３’残基の各々における２’－Ｏ－メ
チル修飾を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲ
ＮＡ、またはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／もしくはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記で記
載した、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素のうちのいずれかは、最初の４つの５’残基の
各々の間のホスホロチオエート（phosphorothioate）結合（例えば、ポリヌクレオチドの
５’末端における、３つのホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を含む、例えば
、これからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間のホスホロチオエート（phosphorot
hioate）結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端における、３つのホスホロチオエー
ト（phosphorothioate）結合を含む、例えば、これからなる）、最初の３つの５’残基の
各々における２’－Ｏ－メチル修飾、ならびに末端に対して４つ目、末端に対して３つ目
、および末端に対して２つ目の３’残基の各々における２’－Ｏ－メチル修飾を含む、例
えば、これからなる。
ある実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、またはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒお
よび／もしくはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記で記載した、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要
素のうちのいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間のホスホロチオエート（phosph
orothioate）結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端における、３つのホスホロチオ
エート（phosphorothioate）結合を含む、例えば、これからなる）、最初の４つの３’残
基の各々の間のホスホロチオエート（phosphorothioate）結合（例えば、ポリヌクレオチ
ドの５’末端における、３つのホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を含む、例
えば、これからなる）、最初の３つの５’残基の各々における２’－Ｏ－メチル修飾、最
初の３つの３’残基の各々における２’－Ｏ－メチル修飾、および５’末端および３’末
端の各々における、さらなる逆位非塩基性残基を含む、例えば、これからなる。
ある実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、またはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒお
よび／もしくはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記で記載した、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要
素のうちのいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間のホスホロチオエート（phosph
orothioate）結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端における、３つのホスホロチオ
エート（phosphorothioate）結合を含む、例えば、これからなる）、最初の４つの３’残
基の各々の間のホスホロチオエート（phosphorothioate）結合（例えば、ポリヌクレオチ
ドの５’末端における、３つのホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を含む、例
えば、これからなる）、最初の３つの５’残基の各々における２’－Ｏ－メチル修飾、な
らびに末端に対して４つ目、末端に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’残基
の各々における２’－Ｏ－メチル修飾、ならびに５’末端および３’末端の各々における
、さらなる逆位非塩基性残基を含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡであり、
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊
ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（配列番号１０７９７）［配列中、ｍは、２’－Ｏ－メチル修飾を伴う
塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を指し示し、Ｎは
、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択
で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）；および
ｔｒａｃｒ：
ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡ
ＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号６
６６０）（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を
伴う）
を含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡであり、
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊
ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（配列番号１０７９７）［配列中、ｍは、２’－Ｏ－メチル修飾を伴う
塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を指し示し、Ｎは
、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択
で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）；および
ｔｒａｃｒ：
ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＣ＊ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵ
ＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ＊ｍＵ
＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号１０７９８［配列中、ｍは、２’－Ｏ－メチル修飾を伴う塩基を
指し示し、＊は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を指し示し、Ｎは、ター
ゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末端
において、逆位非塩基性残基を伴う）
を含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡであり、
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ
ＣＵＧＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＧ（配列番号）［配列中、ｍは、２’－Ｏ－メチル修飾を伴
う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を指し示し、Ｎ
は、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選
択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）；および
ｔｒａｃｒ：
ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡ
ＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号６
６６０）（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を
伴う）
を含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡであり、
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ
ＣＵＧＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＧ（配列番号）［配列中、ｍは、２’－Ｏ－メチル修飾を伴
う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を指し示し、Ｎ
は、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選
択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）；および
ｔｒａｃｒ：
ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＣ＊ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵ
ＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ＊ｍＵ
＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号１０７９８［配列中、ｍは、２’－Ｏ－メチル修飾を伴う塩基を
指し示し、＊は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を指し示す］（任意選択
で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）
を含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡであり、
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ
ＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡ
ＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号１０７
９９）［配列中、ｍは、２’－Ｏ－メチル修飾を伴う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチ
オエート（phosphorothioate）結合を指し示し、Ｎは、例えば、本明細書で記載されるタ
ーゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末
端において、逆位非塩基性残基を伴う）
を含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡであり、
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡ
ＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡ
ＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ［配列中、ｍは、
２’－Ｏ－メチル修飾を伴う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート（phosphorothi
oate）結合を指し示し、Ｎは、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの
残基を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基
性残基を伴う）
を含む、例えば、これからなる。
６）第１のｔｒａｃｒ伸長部
ｇＲＮＡが、第１のフラッグポール伸長部を含む場合、ｔｒａｃｒは、第１のｔｒａｃ
ｒ伸長部を含みうる。第１のｔｒａｃｒ伸長部は、第１のフラッグポール伸長部のヌクレ
オチドと相補的、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％、例えば、完
全に相補的であるヌクレオチドを含みうる。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長
部の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチ
ドは、連続である。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部の相補的なヌクレオチ
ドとハイブリダイズする、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドは、不連続であり、例
えば、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドにより
隔てられた、２つまたはこれを超えるハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様で
は、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ
、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または
これを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番
号６５９１を含む。一部の態様では 第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号６５９１に対
する、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する核酸
を含む。
第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書
のＸＩＩＩ節で見出される修飾を有しうる。
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ターゲティングドメインに対して３’側に配置さ
れて、５’から３’へと：
ａ）
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣ
ＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番
号６６０１）；
ｂ）
ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣ
ＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番
号６６０２）；
ｃ）
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ
ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵ
ＣＧＧＵＧＣ（配列番号６６０３）；
ｄ）
ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵ
ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵ
ＣＧＧＵＧＣ（配列番号６６０４）；
ｅ）３’末端において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７
つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もし
くは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）～ｄ）のうちのいずれ
か；
ｆ）３’末端において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７
つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もし
くは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）～ｄ）のうちのいずれ
か；または
ｇ）５’末端（end）において（例えば、５’末端（terminus）において、例えば、タ
ーゲティングドメインに対して５’側において）、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、
５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、
４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ
）～ｆ）のうちのいずれか
を含みうる。
ある実施形態では、本発明のｓｇＲＮＡは、５’から３’へと：［ターゲティングドメ
イン］－
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣ
ＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ
（配列番号７８１１）を含む、例えば、これからなる。
ある実施形態では、本発明のｓｇＲＮＡは、５’から３’へと：［ターゲティングドメ
イン］－
ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵ
ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵ
ＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号７８０７）を含む、例えば、これからなる。
複数の実施形態では、上記のａ）～ｇ）のうちのいずれかを、ターゲティングドメイン
に対して、すぐ３’側に配置する。
一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは、
好ましくは、ターゲティングドメインに対して、すぐ３’側に配置されて、５’から３
’へと、
ａ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８４）；
ｂ） ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８５）；
ｃ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧ（配列番号６６０５）；
ｄ） ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧ（配列番号６６０６）；
ｅ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号６６０７）；
ｆ） ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号６６０８）；または
ｇ） ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号７８０６）：
を含むｃｒＲＮＡと、
５’から３’へと、
ａ） ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６５８９）；
ｂ） ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６５９０）；
ｃ） ＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡ
ＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６６０９）；
ｄ） ＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡ
ＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６６１０）；
ｅ） ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵ
ＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列
番号６６６０）；
ｆ） ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵ
ＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列
番号６６６１）；
ｇ） ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡ
ＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧ
ＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号７８０７）；
ｈ） ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡ
ＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号７８０８）
；
ｉ） ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡ
ＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣ
ＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号７８０９）；
ｊ） ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵ
ＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７８２０）
；
ｋ）３’末端において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７
つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もし
くは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）～ｊ）のうちのいずれ
か；
ｌ）３’末端において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７
つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もし
くは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）～ｊ）のうちのいずれ
か；または
ｍ）５’末端（end）（例えば、５’末端（terminus））において、少なくとも１つ、
２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、
１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさ
らに含む、上記のa）～l）のうちのいずれか
を含むｔｒａｃｒと
を含みうる。
ある実施形態では、例えば、転写のために、Ｕ６プロモーターを使用する場合、上記の
ｋ）の配列は、３’配列であるＵＵＵＵＵＵを含む。ある実施形態では、例えば、転写の
ために、ＨＩプロモーターを使用する場合、上記のｋ）の配列は、３’配列であるＵＵＵ
Ｕを含む。ある実施形態では、上記のｋ）の配列は、例えば、使用されるｐｏｌ－ＩＩＩ
プロモーターの終結シグナルに応じて、可変数の３’Ｕを含む。ある実施形態では、Ｔ７
プロモーターを使用する場合、上記のｋ）の配列は、ＤＮＡ鋳型に由来する可変３’配列
を含む。ある実施形態では、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を使用して、ＲＮＡ分子を作
出する場合、上記のｋ）の配列は、ＤＮＡ鋳型に由来する可変３’配列を含む。ある実施
形態では、例えば、ｐｏｌ－ＩＩプロモーターを使用して、転写を駆動する場合、上記の
ｋ）の配列は、ＤＮＡ鋳型に由来する可変３’配列を含む。
ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、配列番号６６０７を含み、ｔｒａｃｒは、ＡＡＣＡ
ＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号６６６０）
を含む、例えば、これからなる。
ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、配列番号６６０８を含み、ｔｒａｃｒは、ＡＡＣＡ
ＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧ
ＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号６６６１）
を含む、例えば、これからなる。
ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ターゲティングドメインと、ターゲティングドメイ
ンに対して、３’側に配置され（例えば、ターゲティングドメインに対して、すぐ３’側
に配置され）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号７８０６）を含む、例えば
、これらからなる配列とを含み、例えば、これからなり、ｔｒａｃｒは、ＧＵＵＵＡＡＧ
ＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡ
ＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ
ＵＵＵ（配列番号７８０７）を含む、例えば、これからなる。
ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ターゲティングドメインと、ターゲティングドメイ
ンに対して、３’側に配置され（例えば、ターゲティングドメインに対して、すぐ３’側
に配置され）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号７８０６）を含む、例えば
、これらからなる配列とを含み、例えば、これからなり、ｔｒａｃｒは、ＡＧＣＡＵＡＧ
ＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧ
ＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号７８０８）を含む、例えば、これ
からなる。
ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ターゲティングドメインと、ターゲティングドメイ
ンに対して、３’側に配置され（例えば、ターゲティングドメインに対して、すぐ３’側
に配置され）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号６６０７）を
含む、例えば、これらからなる配列とを含み、例えば、これからなり、ｔｒａｃｒは、Ｇ
ＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣ
ＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧ
ＣＵＵＵ（配列番号７８０９）を含む、例えば、これからなる。
７）同種異系Ｔ細胞標的、阻害性分子、および／または阻害性分子の下流のエフェクター
の発現を変更するために有用なターゲティングドメイン
下記の表には、本発明の組成物および方法、例えば、同種異系Ｔ細胞標的の遺伝子、阻
害性分子の遺伝子、および／または阻害性分子の下流のエフェクターの遺伝子の発現の変
更またはこれらの変更における使用のための、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインを
提供する。
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Figure 2022137032000327
Figure 2022137032000328
Figure 2022137032000329
Figure 2022137032000330
Figure 2022137032000331
Figure 2022137032000332
Figure 2022137032000333
Figure 2022137032000334
Figure 2022137032000335
Figure 2022137032000336
Figure 2022137032000337
Figure 2022137032000338
Figure 2022137032000339
Figure 2022137032000340
Figure 2022137032000341
Figure 2022137032000342
Figure 2022137032000343
Figure 2022137032000344
Figure 2022137032000345
Figure 2022137032000346
Figure 2022137032000347
Figure 2022137032000348
Figure 2022137032000349
Figure 2022137032000350
Figure 2022137032000351
Figure 2022137032000352
Figure 2022137032000353
Figure 2022137032000354
本発明の組成物および方法において有用な、例示的な好ましいｇＲＮＡターゲティング
ドメインを、下記の表に記載する。
Figure 2022137032000355
Figure 2022137032000356
本発明の多様な態様では、ｇＲＮＡ分子は、上記で列挙したターゲティングドメインを
含みうる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
４６５のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本
発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００４４３のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ００４４５のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。
ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００４４４のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００４４９のターゲティングドメインを含む、例
えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは
、ＣＲ００４４２のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形
態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００４５３のターゲティン
グドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのター
ゲティングドメインは、ＣＲ００４６１のターゲティングドメインを含む、例えば、これ
からなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
４３９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本
発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００４５２のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ００４５５のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。
ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００４６３のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００４６７のターゲティングドメインを含む、例
えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは
、ＣＲ００４６６のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形
態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００４４６のターゲティン
グドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのター
ゲティングドメインは、ＣＲ００４４０のターゲティングドメインを含む、例えば、これ
からなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
４５４のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本
発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００４６０のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ００４３８のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。
ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００４３９のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。このようなｇＲＮＡ分子およびこ
れらの組合せは、例えば、本明細書で記載される、本発明のＣＲＩＳＰＲ系、方法、およ
び細胞、ならびに他の態様における使用に適する。
Figure 2022137032000357
Figure 2022137032000358
Figure 2022137032000359
Figure 2022137032000360
Figure 2022137032000361
本発明の多様な態様では、ｇＲＮＡ分子は、上記で列挙したターゲティングドメインを
含みうる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
０９６１のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、
本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００９７７のターゲティングドメ
インを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティ
ングドメインは、ＣＲ０００９８４のターゲティングドメインを含む、例えば、これから
なる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００９
９３のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発
明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００９８１のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ０００９９２のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる
。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００９８６
のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明の
ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００９６３のターゲティングドメインを含
む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメ
インは、ＣＲ０００９８５のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。あ
る実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００９６６のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００９９０のターゲティングドメインを含む、
例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメイン
は、ＣＲ０００９７８のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実
施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００９９１のターゲ
ティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡ
のターゲティングドメインは、ＣＲ０００９８３のターゲティングドメインを含む、例え
ば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、
ＣＲ０００９６０のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形
態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００１００２のターゲティ
ングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのタ
ーゲティングドメインは、ＣＲ００１０００のターゲティングドメインを含む、例えば、
これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ
００１００９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態で
は、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００１０１１のターゲティング
ドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲ
ティングドメインは、ＣＲ００１０１２のターゲティングドメインを含む、例えば、これ
からなる。このようなｇＲＮＡ分子およびこれらの組合せは、例えば、本明細書で記載さ
れる、本発明のＣＲＩＳＰＲ系、方法、および細胞、ならびに他の態様における使用に適
する。
Figure 2022137032000362
Figure 2022137032000363
Figure 2022137032000364
Figure 2022137032000365
Figure 2022137032000366
本発明の多様な態様では、ｇＲＮＡ分子は、上記で列挙したターゲティングドメインを
含みうる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
０８２３のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、
本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００７９８のターゲティングドメ
インを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティ
ングドメインは、ＣＲ０００８１０のターゲティングドメインを含む、例えば、これから
なる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８
００のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発
明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８１５のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ０００８１２のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる
。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８１３
のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明の
ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８１６のターゲティングドメインを含
む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメ
インは、ＣＲ０００８０７のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。あ
る実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８１１のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００７９１のターゲティングドメインを含む、
例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメイン
は、ＣＲ０００８０９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実
施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８１７のターゲ
ティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡ
のターゲティングドメインは、ＣＲ０００８１９のターゲティングドメインを含む、例え
ば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、
ＣＲ０００８１４のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。このような
ｇＲＮＡ分子およびこれらの組合せは、例えば、本明細書で記載される、本発明のＣＲＩ
ＳＰＲ系、方法、および細胞、ならびに他の態様における使用に適する。
Figure 2022137032000367
Figure 2022137032000368
Figure 2022137032000369
Figure 2022137032000370
本発明の多様な態様では、ｇＲＮＡ分子は、上記で列挙したターゲティングドメインを
含みうる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
０８４７のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、
本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００９０２のターゲティングドメ
インを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティ
ングドメインは、ＣＲ０００８５２のターゲティングドメインを含む、例えば、これから
なる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８
２６のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発
明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００９０４のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ０００８３９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる
。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８２８
のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明の
ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８３５のターゲティングドメインを含
む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメ
インは、ＣＲ０００８２９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。あ
る実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８７９のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８７０のターゲティングドメインを含む、
例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメイン
は、ＣＲ０００８３１のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実
施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０００８４８のターゲ
ティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡ
のターゲティングドメインは、ＣＲ０００８５５のターゲティングドメインを含む、例え
ば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、
ＣＲ０００８３８のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。このような
ｇＲＮＡ分子およびこれらの組合せは、例えば、本明細書で記載される、本発明のＣＲＩ
ＳＰＲ系、方法、および細胞、ならびに他の態様における使用に適する。
Figure 2022137032000371
Figure 2022137032000372
Figure 2022137032000373
Figure 2022137032000374
Figure 2022137032000375
本発明の多様な態様では、ｇＲＮＡ分子は、上記で列挙したターゲティングドメインを
含みうる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
２１００のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、
本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２０９７のターゲティングドメ
インを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティ
ングドメインは、ＣＲ００２０９１のターゲティングドメインを含む、例えば、これから
なる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２０
８５のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発
明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２０８６のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ００２０８９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる
。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２０８８
のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明の
ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２０９５のターゲティングドメインを含
む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメ
インは、ＣＲ００２０９６のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。あ
る実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２０８０のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２１０９のターゲティングドメインを含む、
例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメイン
は、ＣＲ００２１１２のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実
施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２１１０のターゲ
ティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡ
のターゲティングドメインは、ＣＲ００２１０８のターゲティングドメインを含む、例え
ば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、
ＣＲ００２１０４のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形
態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２１１５のターゲティ
ングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのタ
ーゲティングドメインは、ＣＲ００２１１６のターゲティングドメインを含む、例えば、
これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ
００２０８７のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態で
は、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２１０７のターゲティング
ドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲ
ティングドメインは、ＣＲ００２１１３のターゲティングドメインを含む、例えば、これ
からなる。それらの組合せを含む、このようなｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書で記載
される、本発明のＣＲＩＳＰＲ系、方法、および細胞、ならびに他の態様における使用に
適する。
Figure 2022137032000376
Figure 2022137032000377
Figure 2022137032000378
Figure 2022137032000379
本発明の多様な態様では、ｇＲＮＡ分子は、上記で列挙したターゲティングドメインを
含みうる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
２９３９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、
本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９４０のターゲティングドメ
インを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティ
ングドメインは、ＣＲ００２９４１のターゲティングドメインを含む、例えば、これから
なる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９
４２のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発
明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９４３のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ００２９４４のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる
。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９４５
のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明の
ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９４６のターゲティングドメインを含
む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメ
インは、ＣＲ００２９４７のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。あ
る実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９４８のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９４９のターゲティングドメインを含む、
例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメイン
は、ＣＲ００２９５０のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実
施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９５１のターゲ
ティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡ
のターゲティングドメインは、ＣＲ００２９５２のターゲティングドメインを含む、例え
ば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、
ＣＲ００２９５３のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形
態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９５４のターゲティ
ングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのタ
ーゲティングドメインは、ＣＲ００２９５５のターゲティングドメインを含む、例えば、
これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ
００２９５６のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態で
は、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９５７のターゲティング
ドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲ
ティングドメインは、ＣＲ００２９５８のターゲティングドメインを含む、例えば、これ
からなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
２９５９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、
本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９６０のターゲティングドメ
インを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティ
ングドメインは、ＣＲ００２９６１のターゲティングドメインを含む、例えば、これから
なる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９
６２のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発
明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９６３のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ００２９６４のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる
。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９６５
のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明の
ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９６６のターゲティングドメインを含
む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメ
インは、ＣＲ００２９６７のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。あ
る実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９６８のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９６９のターゲティングドメインを含む、
例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメイン
は、ＣＲ００２９７０のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実
施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９７１のターゲ
ティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡ
のターゲティングドメインは、ＣＲ００２９７２のターゲティングドメインを含む、例え
ば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、
ＣＲ００２９７３のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形
態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９７４のターゲティ
ングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのタ
ーゲティングドメインは、ＣＲ００２９７５のターゲティングドメインを含む、例えば、
これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ
００２９７６のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態で
は、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９７７のターゲティング
ドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲ
ティングドメインは、ＣＲ００２９７８のターゲティングドメインを含む、例えば、これ
からなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
２９７９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、
本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９８０のターゲティングドメ
インを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティ
ングドメインは、ＣＲ００２９８１のターゲティングドメインを含む、例えば、これから
なる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９
８２のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発
明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９８３のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ００２９８４のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる
。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９８５
のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明の
ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９８６のターゲティングドメインを含
む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメ
インは、ＣＲ００２９８７のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。あ
る実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９８８のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９８９のターゲティングドメインを含む、
例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメイン
は、ＣＲ００２９９０のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実
施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９９１のターゲ
ティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡ
のターゲティングドメインは、ＣＲ００２９９２のターゲティングドメインを含む、例え
ば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、
ＣＲ００２９９３のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形
態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９９４のターゲティ
ングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのタ
ーゲティングドメインは、ＣＲ００２９９５のターゲティングドメインを含む、例えば、
これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ
００２９９６のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態で
は、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００２９９７のターゲティング
ドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲ
ティングドメインは、ＣＲ００２９９８のターゲティングドメインを含む、例えば、これ
からなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００
２９９９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、
本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３０００のターゲティングドメ
インを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティ
ングドメインは、ＣＲ００３００１のターゲティングドメインを含む、例えば、これから
なる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３０
０２のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発
明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３００３のターゲティングドメイン
を含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティング
ドメインは、ＣＲ００３００４のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる
。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３００５
のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明の
ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３００６のターゲティングドメインを含
む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメ
インは、ＣＲ００３００７のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。あ
る実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３００８のタ
ーゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３００９のターゲティングドメインを含む、
例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメイン
は、ＣＲ００３０１０のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実
施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３０１１のターゲ
ティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡ
のターゲティングドメインは、ＣＲ００３０１２のターゲティングドメインを含む、例え
ば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、
ＣＲ００３０１３のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形
態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３０１４のターゲティ
ングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのタ
ーゲティングドメインは、ＣＲ００３０１５のターゲティングドメインを含む、例えば、
こ

れからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ０
０３０１６のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では
、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３０１７のターゲティングド
メインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲテ
ィングドメインは、ＣＲ００３０１８のターゲティングドメインを含む、例えば、これか
らなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３
０１９のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本
発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３０２０のターゲティングドメイ
ンを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティン
グドメインは、ＣＲ００３０２１のターゲティングドメインを含む、例えば、これからな
る。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３０２
２のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明
のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３０２３のターゲティングドメインを
含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングド
メインは、ＣＲ００３０２４のターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。
ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３０２５の
ターゲティングドメインを含む、例えば、これからなる。ある実施形態では、本発明のｇ
ＲＮＡのターゲティングドメインは、ＣＲ００３０２６のターゲティングドメインを含む
、例えば、これからなる。このようなｇＲＮＡ分子およびこれらの組合せは、例えば、本
明細書で記載される、本発明のＣＲＩＳＰＲ系、方法、および細胞、ならびに他の態様に
おける使用に適する。
Figure 2022137032000380
Figure 2022137032000381
Figure 2022137032000382
Figure 2022137032000383
Figure 2022137032000384
Figure 2022137032000385
Figure 2022137032000386
Figure 2022137032000387
Figure 2022137032000388
Figure 2022137032000389
Figure 2022137032000390
Figure 2022137032000391
Figure 2022137032000392
Figure 2022137032000393
Figure 2022137032000394
Figure 2022137032000395
Figure 2022137032000396
Figure 2022137032000397
Figure 2022137032000398
Figure 2022137032000399
Figure 2022137032000400
Figure 2022137032000401
Figure 2022137032000402
Figure 2022137032000403
Figure 2022137032000404
Figure 2022137032000405
Figure 2022137032000406
Figure 2022137032000407
Figure 2022137032000408
Figure 2022137032000409
Figure 2022137032000410
本発明の複数の態様では、ＴＲＡＣに対するｇＲＮＡであって、ＣＲ００９６１のター
ゲティングドメイン（配列番号５５６９；下方に下線を付した；またはその修飾形（これ
もまた、下方に下線を付した））を含むｇＲＮＡ、例えば、下記で記載されるｇＲＮＡ分
子のうちの１つを、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ系、方法、細胞、ならびに他の複数の態様お
よび複数の実施形態（およびこれらの組合せ）であって、例えば、本明細書で記載される
、１つを超えるｇＲＮＡ分子を伴う、複数の態様を含む態様および実施形態において使用
する。
Figure 2022137032000411
本発明の複数の態様では、ＴＲＡＣに対するｇＲＮＡであって、ＣＲ００９８４のター
ゲティングドメイン（配列番号５５９２；下方に下線を付した；またはその修飾形（これ
もまた、下方に下線を付した））を含むｇＲＮＡ、例えば、下記で記載されるｇＲＮＡ分
子のうちの１つを、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ系、方法、細胞、ならびに他の複数の態様お
よび複数の実施形態（およびこれらの組合せ）であって、例えば、本明細書で記載される
、１つを超えるｇＲＮＡ分子を伴う、複数の態様を含む態様および実施形態において使用
する。
Figure 2022137032000412
本発明の複数の態様では、ＴＲＢＣに対するｇＲＮＡであって、ＣＲ００７９８のター
ゲティングドメイン（配列番号５６９４；下方に下線を付した；またはその修飾形（これ
もまた、下方に下線を付した））を含むｇＲＮＡ、例えば、下記で記載されるｇＲＮＡ分
子のうちの１つを、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ系、方法、細胞、ならびに他の複数の態様お
よび複数の実施形態（およびこれらの組合せ）であって、例えば、本明細書で記載される
、１つを超えるｇＲＮＡ分子を伴う、複数の態様を含む態様および実施形態において使用
する。
Figure 2022137032000413
本発明の複数の態様では、ＴＲＢＣに対するｇＲＮＡであって、ＣＲ００８２３のター
ゲティングドメイン（配列番号５７１９；下方に下線を付した；またはその修飾形（これ
もまた、下方に下線を付した））を含むｇＲＮＡ、例えば、下記で記載されるｇＲＮＡ分
子のうちの１つを、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ系、方法、細胞、ならびに他の複数の態様お
よび複数の実施形態（およびこれらの組合せ）であって、例えば、本明細書で記載される
、１つを超えるｇＲＮＡ分子を伴う、複数の態様を含む態様および実施形態において使用
する。
Figure 2022137032000414
本発明の複数の態様では、Ｂ２Ｍに対するｇＲＮＡであって、ＣＲ００４４２のターゲ
ティングドメイン（配列番号５４９６；下方に下線を付した；またはその修飾形（これも
また、下方に下線を付した））を含むｇＲＮＡ、例えば、下記で記載されるｇＲＮＡ分子
のうちの１つを、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ系、方法、細胞、ならびに他の複数の態様およ
び複数の実施形態（およびこれらの組合せ）であって、例えば、本明細書で記載される、
１つを超えるｇＲＮＡ分子を伴う、複数の態様を含む態様および実施形態において使用す
る。
Figure 2022137032000415
本発明の複数の態様では、Ｂ２Ｍに対するｇＲＮＡであって、ＣＲ００４４４のターゲ
ティングドメイン（配列番号５４９８；下方に下線を付した；またはその修飾形（これも
また、下方に下線を付した））を含むｇＲＮＡ、例えば、下記で記載されるｇＲＮＡ分子
のうちの１つを、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ系、方法、細胞、ならびに他の複数の態様およ
び複数の実施形態（およびこれらの組合せ）であって、例えば、本明細書で記載される、
１つを超えるｇＲＮＡ分子を伴う、複数の態様を含む態様および実施形態において使用す
る。
Figure 2022137032000416
本発明の複数の態様では、ＦＫＢＰ１Ａに対するｇＲＮＡであって、ＣＲ００２０９７
のターゲティングドメイン（配列番号６７０５；下方に下線を付した；またはその修飾形
（これもまた、下方に下線を付した））を含むｇＲＮＡ、例えば、下記で記載されるｇＲ
ＮＡ分子のうちの１つを、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ系、方法、細胞、ならびに他の複数の
態様および複数の実施形態（およびこれらの組合せ）であって、例えば、本明細書で記載
される、１つを超えるｇＲＮＡ分子を伴う、複数の態様を含む態様および実施形態におい
て使用する。
Figure 2022137032000417
本発明の複数の態様では、ＦＫＢＰ１Ａに対するｇＲＮＡであって、ＣＲ００２１００
のターゲティングドメイン（配列番号６７０８；下方に下線を付した；またはその修飾形
（これもまた、下方に下線を付した））を含むｇＲＮＡ、例えば、下記で記載されるｇＲ
ＮＡ分子のうちの１つを、本発明の、ＣＲＩＳＰＲ系、方法、細胞、ならびに他の複数の
態様および複数の実施形態（およびこれらの組合せ）であって、例えば、本明細書で記載
される、１つを超えるｇＲＮＡ分子を伴う、複数の態様を含む態様および実施形態におい
て使用する。
Figure 2022137032000418
上記で記載したｇＲＮＡ分子の各々では、「＊」は、隣接するヌクレオチドの間のホス
ホロチオエート（phosphorothioate）結合を描示し、「ｍＮ」（この場合、Ｎ＝Ａ、Ｇ、
Ｃ、またはＵ）は、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを描示する。複数の実施形態では、例
えば、上記で記載した、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子のうちのいずれかを、例えば
、本明細書で記載されるＣａｓ９分子と複合体化させて、リボ核タンパク質複合体（ＲＮ
Ｐ）を形成する。このようなＲＮＰは、本発明の方法、細胞、および他の複数の態様およ
び複数の実施形態であって、例えば、本明細書で記載される態様および実施形態において
特に有用である。
ＩＩＩ．ｇＲＮＡをデザインするための方法
本明細書では、ｇＲＮＡをデザインするための方法であって、標的配列を選択し、デザ
インし、検証するための方法を含む方法が記載される。本明細書ではまた、例示的なター
ゲティングドメインも提供される。本明細書で論じられるターゲティングドメインを、本
明細書で記載されるｇＲＮＡへと組み込むことができる。
標的配列を選択および検証するための方法、ならびにオフターゲット解析のための方法
については、例えば、Mali el al. , 2013 SCIENCE 339(6121): 823-826; Hsu et al , 2
013 NAT BIOTECHNOL, 31 (9): 827-32; Fu et al , 2014 NAT BIOTECHNOL, doi: 10.1038
/nbt.2808. PubMed PM ID: 24463574; Heigwer et al, 2014 NAT METHODS ll (2): 122-3
. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae el al , 2014 BIOINFORMATIC
S PubMed PMID: 24463181 ; Xiao A el al , 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 243896
62において記載されている。
例えば、ソフトウェアツールを使用して、使用者の標的配列内のｇＲＮＡの選択を最適
化する、例えば、ゲノムにわたる、全オフターゲット活性を最小化することができる。オ
フターゲット活性は、切断以外の活性でもありうる。例えば、化膿連鎖球菌（（S. pyoge
nes）のＣａｓ９を使用する、可能な各ｇＲＮＡの選択のために、ツールは、ゲノムにわ
たり、ある特定の数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）まで
のミスマッチ塩基対を含有する、全てのオフターゲット配列（例えば、ＮＡＧ ＰＡＭま
たはＮＧＧ ＰＡＭに先行する）を同定しうる。各オフターゲット配列における切断効率
は、例えば、実験由来の重みづけスキームを使用して予測することができる。次いで、可
能な各ｇＲＮＡを、予測されるその全オフターゲット切断に従いランク付けすると、上位
にランク付けされたｇＲＮＡは、最多のオンターゲット切断と、最少のオフターゲット切
断とを有する可能性が高いｇＲＮＡを表す。ツールにはまた、他の機能、例えば、ＣＲＩ
ＳＰＲ構築のための自動式の試薬デザイン、オンターゲットについてのＳｕｒｖｅｙｏｒ
アッセイのためのプライマーデザイン、および次世代シーケンシングを介する、オフター
ゲット切断のハイスループットの検出および定量化のためのプライマーデザインも含まれ
うる。候補ｇＲＮＡ分子は、当技術分野で公知の方法、または本明細書で記載される方法
により査定することができる。
ソフトウェアアルゴリズムを使用して、潜在的なｇＲＮＡ分子の初期リストを作成しう
るが、切断の効率および特異性は、必ずしも、予測値を反映するものではなく、ｇＲＮＡ
分子は典型的に、例えば、切断効率、インデル形成、切断特異性、および、所望される表
現型の変化を決定するのに、具体的な細胞系、例えば、一次ヒト細胞系、例えば、一次ヒ
ト免疫エフェクター細胞、例えば、初代ヒトＴ細胞におけるスクリーニングを要求する。
これらの特性は、本明細書で記載される方法によりアッセイすることができる。
ＩＶ．Ｃａｓ分子
Ｃａｓ９分子
好ましい実施形態では、Ｃａｓ分子は、Ｃａｓ９分子である。本明細書で記載される方
法および組成物では、様々な種のＣａｓ９分子を、使用することができる。化膿連鎖球菌
（S. pyogenes）のＣａｓ９分子が、本明細書における本開示の大半の対象であるが、本
明細書で列挙される他の種のＣａｓ９タンパク質のＣａｓ９分子、これらから導出される
Ｃａｓ９分子、またはこれらに基づくＣａｓ９分子もまた、使用することができる。言い
換えると、他のＣａｓ９分子、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. therm
ophilus）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、および／または髄膜炎菌（Neis
seria meningitidis）のＣａｓ９分子も、本明細書で記載される系、方法、および組成物
において使用することができる。さらなるＣａｓ９分子種は、スイカ果実汚斑細菌病菌（
Acidovorax avenae）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuro
pneumoniae）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）、
アクチノバチルス・スイス（Actinobacillus suis）、口腔細菌（Actinomyces）属種、ア
リシクリフィルス・デニトリフィカンス（cycliphilus denitrificans（Alicycliphilus
denitrificans））、アミノモナス・パウシボランス（Aminomonas paucivorans）、セレ
ウス菌（Bacillus cereus）、バチルス・スミシー（Bacillus smithii）、バチルス・チ
ューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バクテロイデス（Bacteroides）属種、
ブラストピレルラ・マリーナ（Blastopirellula marina）、ブラジリゾビウム（Bradyrhi
z’ obium（Bradyrhizobium））属種、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus
latemsporus（Brevibacillus laterosporus））、カンピロバクター・コリー（Campylob
acter coli）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバク
ター・ラッド（Campylobacter lad）、カンジダタス・プニセイスピリルム（Candidatus
Puniceispirillum）属、クロストリジウム・セルロリティクム（Clostridiu cellulolyti
cum（Clostridium cellulolyticum））、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、コ
リネバクテリウム・アクコレンス（Corynebacterium accolens）、ジフテリア菌（Coryne
bacterium diphtheria（Corynebacterium diphtheriae））、コリネバクテリウム・マツ
ルショティイ（Corynebacterium matruchotii）、ディノロセオバクター・シバエ（Dinor
oseobacter sliibae（Dinoroseobacter shibae））、ユウバクテリウム・ドリクム（Euba
cterium dolichum）、ガンマプロテオバクテリア（gamma proteobacterium（Gammaproteo
bacterium））綱、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacler d
iazotrophicus（Gluconacetobacter diazotrophicus））、ヘモフィルス・パラインフル
エンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、ヘモフィルス・スプトルム（Haemophilus sput
orum）、ヘリコバクター・カナデンシス（Helicobacter canadensis）、ヘリコバクター
・シネディ（Helicobacter cinaedi）、ヘリコバクター・ムステレ（Helicobacter muste
lae）、イリオバクター・ポリトロプス（Ilyobacler polytropus（（Ilyobacter polytro
pus））、キンゲラ・キンゲ（Kingella kingae）、ラクトバチルス・クリスパツス（Lact
obacillus crispatus）、リステリア・イバノビ（Listeria ivanovii）、リステリア・モ
ノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア（Listeriaceae）科細菌、メチ
ロシスティス（Methylocystis）属種、メチロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus
trichosporium）、モビルンカス・ムリエリス（Mobiluncus mulieris）、ナイセリア・バ
シリフォルミス（Neisseria bacilliformis）、ナイセリア・シネレア（Neisseria ciner
ea）、ナイセリア・フラベセンス（Neisseria flavescens）、ナイセリア・ラクタミカ（
Neisseria lactamica）、ナイセリア（Neisseria）属種、ナイセリア・ワズワーシー（Ne
isseria wadsworthii）、ニトロソモナス（Nitrosomonas）属種、パルビバクラム・ラバ
メンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteu
rella multocida）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Phascolarct
obacterium succinatutens）、ラルストニア・シジジー（Ralstonia syzygii）、ロドシ
ュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドブラム（Rhodovulum
）属種、シモンシエラ・ムエレリ（Simonsiella muelleri）、スフィンゴモナス（Sphing
omonas）属種、スポロラクトバチルス・ビネエ（Sporolactobacillus vineae）、スタフ
ィロコッカス・ルグヅネンシス（Staphylococcus lugdunensis）、スタフィロコッカス（
Staphylococcus）属種、スブドリグラヌラム（Subdoligranulum）属種、チストレラ・モ
ビリス（Tislrella mobilis）（Tistrella mobilis）、トレポネーマ（Treponema）属種
、またはベルミネフロバクター・エイセニエ（Verminephrobacter eiseniae）を含む。
本明細書でこの用語を使用する場合のＣａｓ９分子とは、ｇＲＮＡ分子（例えば、ｔｒ
ａｃｒドメインの配列）と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協同して、標的配列およびＰＡＭ
配列を含む部位へと局在化する（例えば、ターゲティングまたはホーミングする）分子を
指す。
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子を切断することが可能であり、本明
細書では、これを、活性Ｃａｓ９分子と称することがある。ある実施形態では、活性Ｃａ
ｓ９分子は、以下の活性：ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の単一の鎖、例えば、非
相補鎖または相補鎖を切断する能力；二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の
両方の鎖を切断し、二本鎖切断を創出する能力であって、ある実施形態では、２つのニッ
カーゼ活性の存在である能力；エンドヌクレアーゼ活性；エキソヌクレアーゼ活性；およ
びヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のヘリックス構造をほどく能力のうちの１また
は複数を含む。
ある実施形態では、酵素的に活性のＣａｓ９分子は、両方のＤＮＡ鎖を切断する結果と
して、二本鎖切断をもたらす。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、１つの鎖、例えば、
ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖、またはｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖と相補的な鎖
だけを切断する。ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインと関連する
切断活性を含む。ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインと
関連する切断活性を含む。ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインと
関連する切断活性と、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する切断活性とを含む。ある実施
形態では、活性Ｃａｓ９分子は、活性ＨＮＨ様ドメイン、または切断コンピテントのＨＮ
Ｈ様ドメインと、不活性Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン、または切断インコンピテントのＮ末
端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、不活性ＨＮＨ
様ドメイン、または切断インコンピテントのＨＮＨ様ドメインと、活性Ｎ末端ＲｕｖＣ様
ドメイン、または切断コンピテントのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。
ある実施形態では、標的核酸と相互作用し、これを切断する、活性Ｃａｓ９分子の能力
は、ＰＡＭ配列依存的である。ＰＡＭ配列は、標的核酸内の配列である。ある実施形態で
は、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列から上流で生じる。異なる細菌種に由来する活性Ｃａ
ｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識しうる。ある実施形態で
は、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧを認識し
、この配列から、１～１０、例えば、３～５塩基対上流の標的核酸配列の切断を方向付け
る。例えば、Mali el ai, SCIENCE 2013; 339(6121): 823- 826を参照されたい。ある実
施形態では、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）の活性Ｃａｓ９
分子は、配列モチーフＮＧＧＮＧおよびＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識し、こ
れらの配列から、１～１０、例えば、３～５塩基対上流の、コア標的核酸配列の切断を方
向付ける。例えば、Horvath et al., SCIENCE 2010; 327(5962): 167- 170, and Deveau
et al , J BACTERIOL 2008; 190(4): 1390- 1400を参照されたい。ある実施形態では、ス
トレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans（S. mulans））の活性Ｃａｓ９分子は、配
列モチーフＮＧＧまたはＮＡＡＲ（Ｒ－ＡまたはＧ）を認識し、この配列から、１～１０
、例えば、３～５塩基対上流の、コア標的核酸配列の切断を方向付ける。例えば、Deveau
et al , J BACTERIOL 2008; 190(4): 1390- 1400を参照されたい。
ある実施形態では、黄色ブドウ球菌（S. aureus）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチー
フＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識し、この配列から、１～１０、例えば、３～５塩
基対上流の標的核酸配列の切断を方向付ける。例えば、Ran F. et al., NATURE, vol. 52
0, 2015, pp. 186-191を参照されたい。ある実施形態では、髄膜炎菌（N. meningitidis
）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＮＮＧＡＴＴを認識し、この配列から、１～
１０、例えば、３～５塩基対上流の標的核酸配列の切断を方向付ける。例えば、Hou et a
l., PNAS EARLY EDITION 2013, 1-6を参照されたい。Ｃａｓ９分子が、ＰＡＭ配列を認識
する能力は、例えば、Jinek et al, SCIENCE 2012, 337:816において記載されている形質
転換アッセイを使用して決定することができる。
一部のＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と共に、コア標的ド
メインへと、ホーミングする（例えば、ターゲティングされるか、または局在化する）能
力を有するが、標的核酸を切断することが不可能であるか、または効率的な比率での切断
が不可能である。本明細書では、切断活性を有さないか、または実質的な切断活性を有さ
ないＣａｓ９分子を、不活性Ｃａｓ９（酵素的に不活性のＣａｓ９）、ｄｅａｄ Ｃａｓ
９分子またはｄＣａｓ９分子と称することができる。例えば、不活性Ｃａｓ９分子は、本
明細書で記載されるアッセイにより測定される通り、切断活性を欠くか、または基準Ｃａ
ｓ９分子より実質的に低い、例えば、２０、１０、５、１、または０．１％未満の切断活
性を有しうる。
例示的な、自然発生のＣａｓ９分子については、Chylinski et al , RNA Biology 2013
; 10:5, 727-737において記載されている。このようなＣａｓ９分子は、クラスター１細
菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター
４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラス
ター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、ク
ラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファ
ミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１
細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラ
スター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミ
リー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３
細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラ
スター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミ
リー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１
細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラ
スター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミ
リー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９
細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラ
スター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミ
リー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７
細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラ
スター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミ
リー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５
細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラ
スター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミ
リー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３
細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラ
スター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミ
リー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１
細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラ
スター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミ
リー、クラスター７７細菌ファミリー、またはクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９
分子を含む。
例示的な、自然発生のＣａｓ９分子は、クラスター１細菌ファミリーのＣａｓ９分子を
含む。例は、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）（例えば、ＳＦ３７０株、ＭＧＡＳ１０２７
０株、ＭＧＡＳ１０７５０株、ＭＧＡＳ２０９６株、ＭＧＡＳ３１５株、ＭＧＡＳ５００
５株、ＭＧＡＳ６１８０株、ＭＧＡＳ９４２９株、ＮＺ１３１株、およびＳＳＩ－１株）
、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）（例えば、ＬＭＤ－９株）
、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス（S. pseudoporcinus）（例えば、ＳＰＩＮ
２００２６株）、ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）（例えば、ＵＡ１５
９株、ＮＮ２０２５株）、ストレプトコッカス・マカケ（S. macacae）（例えば、ＮＣＴ
Ｃ１１５５８株）、ウシ連鎖球菌（S. gallolylicus）（例えば、ＵＣＮ３４株、ＡＴＣ
ＣＢＡＡ－２０６９株）、ストレプトコッカス・エクイヌス（S. equinus（S. equines）
）（例えば、ＡＴＣＣ９８１２株、ＭＧＣＳ１２４株）、ストレプトコッカス・ディスガ
ラクティエ（S, dysgalactiae（S. dysdalactiae））（例えば、ＧＧＳ１２４株）、ウシ
連鎖球菌（S. bovis）（例えば、ＡＴＣＣ７００３３８株）、ストレプトコッカス・アン
ギノサス（S. anginosus（S. cmginosus））（例えば、Ｆ０２１１株）、アガラクチア菌
（S. agalactiae（S. agalactia＊））（例えば、ＮＥＭ３１６株、Ａ９０９株）、リス
テリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）（例えば、Ｆ６８５４株）、リス
テリア・イノクア（Listeria innocua）（L. innocua、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）
、エンテロコッカス・イタリクス（Enterococcus italicus（EtUerococcus italicus））
（例えば、ＤＳＭ１５９５２株）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus
faecium）（例えば、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子を含む。さらなる例示的な
Ｃａｓ９分子は、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のＣａｓ９分子（Hou et al. PNA
S Early Edition 2013, 1 -6）、および黄色ブドウ球菌（S. aureus）のＣａｓ９分子で
ある。
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子、例えば、活性のＣａｓ９分子または不活性のＣａｓ
９分子は、本明細書で記載される、任意のＣａｓ９分子配列、または自然発生のＣａｓ９
分子配列、例えば、本明細書で列挙されるか、またはChylinski et al, RNA Biology 201
3, 10:5, I2I-Τ,1; Hou et al. PNAS Early Edition 2013, 1-6において記載されている
種に由来するＣａｓ９分子との、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９
０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するか；これらと比
較した場合に、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、または４０％以下
のアミノ酸残基において異なるか；少なくとも１、２、５、１０、または２０アミノ酸だ
け異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０、または３０アミノ酸を超えては異
ならないか；またはこれらと同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、以下の化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９
との、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％の相同性を有するか；これらと比較した場合に、１％、２％
、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、または４０％以下のアミノ酸残基において異
なるか；少なくとも１、２、５、１０、または２０アミノ酸だけ異なるが、１００、８０
、７０、６０、５０、４０、または３０アミノ酸を超えては異ならないか；またはこれら
と同一であるアミノ酸配列を含む。
Figure 2022137032000419
Figure 2022137032000420
Figure 2022137032000421
Figure 2022137032000422
Figure 2022137032000423
Figure 2022137032000424
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、正に帯電したアミノ酸（例えば、リシン、アル
ギニン、またはヒスチジン）への、１または複数の突然変異であって、前記位置において
、非帯電または非極性のアミノ酸、例えば、アラニンを導入する突然変異を含む、配列番
号６６１１の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体である。複数の実施形態
では、突然変異は、Ｃａｓ９のｎｔグルーブ内の、１または複数の正に帯電したアミノ酸
へのものである。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１の、化膿連鎖
球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体であって、配列番号６６１１の８５５位における
突然変異、例えば、配列番号６６１１の８５５位における、非帯電アミノ酸、例えば、ア
ラニンへの突然変異を含むＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は
、配列番号６６１１の、８５５位だけにおいて、配列番号６６１１と比べた突然変異、例
えば、非帯電アミノ酸、例えば、アラニンへの突然変異を有する。複数の実施形態では、
Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体
であって、配列番号６６１１の、８１０位における突然変異、１００３位における突然変
異、および／または１０６０位における突然変異、例えば、配列番号６６１１の、８１０
位、１００３位、および／または１０６０位における、アラニンへの突然変異を含むＣａ
ｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１の、８１０
位、１００３位、および１０６０位だけにおいて、配列番号６６１１と比べた突然変異を
有し、例えば、この場合、各突然変異は、非帯電アミノ酸、例えば、アラニンへのもので
ある。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１の、化膿連鎖球菌（S. p
yogenes）のＣａｓ９変異体であって、配列番号６６１１の、８４８位における突然変異
、１００３位における突然変異、および／または１０６０位における突然変異、例えば、
配列番号６６１１の、８４８位、１００３位、および／または１０６０位における、アラ
ニンへの突然変異を含むＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、
配列番号６６１１の、８４８位、１００３位、および１０６０位だけにおいて、配列番号
６６１１と比べた突然変異を有し、例えば、この場合、各突然変異は、非帯電アミノ酸、
例えば、アラニンへのものである。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Science DOI:
10.1126/science.aad5227においてオンラインで入手可能であるSlaymaker et al., Scie
nce Express, December 1, 2015に記載されているＣａｓ９分子である。
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、１または複数の突然変異を含む、配列番号６６
１１の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、
Ｃａｓ９変異体は、配列番号６６１１の８０位における突然変異を含む、例えば、配列番
号６６１１の８０位におけるロイシンを含む（すなわち、Ｃ８０Ｌ突然変異を伴う配列番
号６６１１を含む、例えば、これからなる）。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、
配列番号６６１１の５７４位における突然変異を含む、例えば、配列番号６６１１の５７
４位におけるグルタミン酸を含む（すなわち、Ｃ５７４Ｅ突然変異を伴う配列番号６６１
１を含む、例えば、これからなる）。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、配列番号
６６１１の、８０位における突然変異と、５７４位における突然変異とを含む、例えば、
配列番号６６１１の８０位におけるロイシンと、配列番号６６１１の５７４位におけるグ
ルタミン酸とを含む（すなわち、Ｃ８０Ｌ突然変異およびＣ５７４Ｅ突然変異を伴う配列
番号６６１１を含む、例えば、これからなる）。理論に束縛されずに、このような突然変
異は、Ｃａｓ９分子の溶解特性を改善すると考えられる。
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、１または複数の突然変異を含む、配列番号６６
１１の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、
Ｃａｓ９変異体は、配列番号６６１１の１４７位における突然変異を含む、例えば、配列
番号６６１１の１４７位におけるチロシンを含む（すなわち、Ｄ１４７Ｙ突然変異を伴う
配列番号６６１１を含む、例えば、これからなる）。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異
体は、配列番号６６１１の４１１位における突然変異を含む、例えば、配列番号６６１１
の４１１位におけるトレオニンを含む（すなわち、Ｐ４１１Ｔ突然変異を伴う配列番号６
６１１を含む、例えば、これからなる）。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、配列
番号６６１１の、１４７位における突然変異と、４１１位における突然変異とを含む、例
えば、配列番号６６１１の１４７位におけるチロシンと、配列番号６６１１の４１１位に
おけるトレオニンとを含む（すなわち、Ｄ１４７Ｙ突然変異およびＰ４１１Ｔ突然変異を
伴う配列番号６６１１を含む、例えば、これからなる）。理論に束縛されずに、このよう
な突然変異は、例えば、酵母内の、Ｃａｓ９分子のターゲティング効率を改善すると考え
られる。
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、１または複数の突然変異を含む、配列番号６６
１１の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、
Ｃａｓ９変異体は、配列番号６６１１の１１３５位における突然変異を含む、例えば、配
列番号６６１１の１１３５位におけるグルタミン酸を含む（すなわち、Ｄ１１３５Ｅ突然
変異を伴う配列番号６６１１を含む、例えば、これからなる）。理論に束縛されずに、こ
のような突然変異は、Ｃａｓ９分子の、ＮＡＧ ＰＡＭ配列と対比した、ＮＧＧ ＰＡＭ
配列に対する選択性を改善すると考えられる。
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ある特定の位置に、非帯電または非極性のアミ
ノ酸、例えば、アラニンを導入する、１または複数の突然変異を含む、配列番号６６１１
の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａ
ｓ９分子は、配列番号６６１１の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体であ
って、配列番号６６１１の、４９７位における突然変異、６６１位における突然変異、６
９５位における突然変異、および／または９２６位における突然変異、例えば、配列番号
６６１１の、４９７位、６６１位、６９５位、および／または９２６位におけるアラニン
への突然変異を含むＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列
番号６６１１の、４９７位、６６１位、６９５位、および９２６位だけにおいて、配列番
号６６１１と比べた突然変異を有し、例えば、この場合、各突然変異は、非帯電アミノ酸
、例えば、アラニンへのものである。理論に束縛されずに、このような突然変異は、オフ
ターゲット部位における、Ｃａｓ９分子による切断を低減すると考えられる。
本明細書で記載される、Ｃａｓ９分子に対する突然変異を組み合わせることができ、本
明細書で記載される融合または他の修飾のうちのいずれかと組み合わせることができ、Ｃ
ａｓ９分子を、本明細書で記載されるアッセイにおいて調べうると理解されるであろう。
多様な種類のＣａｓ分子を使用して、本明細書で開示される本発明を実施することがで
きる。一部の実施形態では、ＩＩ型Ｃａｓ系のＣａｓ分子を使用する。他の実施形態では
、他のＣａｓ系のＣａｓ分子を使用する。例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型のＣａｓ分子を使
用することができる。例示的なＣａｓ分子（およびＣａｓ系）については、例えば、いず
れの参考文献の内容も、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Haft
et ai, PLoS COMPUTATIONAL BIOLOGY 2005, 1(6): e60 and Makarova et al , NATURE R
EVIEW MICROBIOLOGY 201 1 , 9:467-477において記載されている。
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、以下の活性：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（
例えば、エンドヌクレアーゼ活性および／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ
活性；またはｇＲＮＡ分子と一体となって、標的核酸へと局在化する能力のうちの１また
は複数を含む。
変更Ｃａｓ９分子
自然発生のＣａｓ９分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌク
レアーゼ活性および／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子
と、機能的に会合する能力；および核酸上の部位をターゲティングする（またはこれに局
在化する）能力（例えば、ＰＡＭの認識およびＰＡＭ特異性）を含む多数の特性を有する
。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、これらの特性の全てまたはサブセットを含みうる
。典型的な複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ
分子と協同して、核酸内の部位へと局在化する能力を有する。他の活性、例えば、ＰＡＭ
特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性は、Ｃａｓ９分子内で、より広範に変動しうる
。
所望の特性を伴うＣａｓ９分子は、多数の形で、例えば、所望の特性を有する変更Ｃａ
ｓ９分子をもたらす、親、例えば、自然発生のＣａｓ９分子の変更により作製することが
できる。例えば、親Ｃａｓ９分子と比べた、１または複数の突然変異または差違を導入す
ることができる。このような突然変異および差違は、置換（例えば、非必須アミノ酸の保
存的置換または置換）；挿入；または欠失を含む。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、
基準Ｃａｓ９分子と比べて、１または複数の突然変異または差違、例えば、少なくとも１
つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、３０、４０、または５０の突然変異で
あるが、２００、１００、または８０未満の突然変異を含みうる。
ある実施形態では、１または複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば、本明細書で記
載されるＣａｓ９活性に対して、実質的な影響を及ぼさない。ある実施形態では、１また
は複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９活性に対し
て、実質的な影響を及ぼす。ある実施形態では、例示的な活性は、ＰＡＭ特異性、切断活
性、およびヘリカーゼ活性のうちの１または複数を含む。突然変異は、例えば、１または
複数のＲｕｖＣ様ドメイン内、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン内；ＨＮＨ様ドメイン
内；ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインの外部の領域内に存在しうる。一部の実
施形態では、突然変異は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン内に存在する。一部の実施形態では
、突然変異は、ＨＮＨ様ドメイン内に存在する。一部の実施形態では、突然変異は、Ｎ末
端ＲｕｖＣ様ドメイン内およびＨＮＨ様ドメイン内の両方に存在する。
特定の配列、例えば、置換が、ターゲティング活性、切断活性など、１または複数の活
性に影響を及ぼしうるのかどうかは、例えば、突然変異が保存的であるのかどうかを査定
することにより、査定または予測することもでき、ＩＩＩ節で記載した方法により査定ま
たは予測することもできる。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子の文脈で使用される「非必
須」アミノ酸残基が、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を消滅させたり、より好ましく
は、これを実質的に変更したりせずに、Ｃａｓ９分子、例えば、自然発生のＣａｓ９分子
、例えば、活性Ｃａｓ９分子の野生型配列から変更しうる残基であるのに対し、「必須」
アミノ酸残基の変化は、活性（例えば、切断活性）の実質的な損失を結果としてもたらす
。
ＰＡＭ認識を変更したＣａｓ９分子、またはＰＡＭ認識を変更していないＣａｓ９分子
自然発生のＣａｓ９分子は、特異的ＰＡＭ配列、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes
）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）、ストレプトコッカス・
ミュータンス（S. mutans）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、および髄膜炎菌（N. menin
gitidis）について上記で記載したＰＡＭ認識配列を認識しうる。
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、自然発生のＣａｓ９分子と同じＰＡＭ特異性を有
する。他の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、自然発生のＣａｓ９分子と関連しないＰＡＭ
特異性、またはそれが緊密な配列相同性を有する、自然発生のＣａｓ９分子と関連しない
ＰＡＭ特異性を有する。例えば、自然発生のＣａｓ９分子を変更して、例えば、ＰＡＭ認
識を変更する、例えば、Ｃａｓ９分子が認識するＰＡＭ配列を変更して、オフターゲット
部位を減少させ、かつ／または特異性を改善することもでき；ＰＡＭ認識の要求を消失さ
せることもできる。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子を変更して、例えば、ＰＡＭ認識配
列の長さを増大させ、かつ／またはＣａｓ９特異性を、高レベルの同一性へと改善して、
オフターゲット部位を減少させ、特異性を増大させることができる。ある実施形態では、
ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、または１５アミノ
酸の長さである。異なるＰＡＭ配列を認識し、かつ／またはオフターゲット活性を低減し
たＣａｓ９分子は、指向性進化を使用して作出することができる。Ｃａｓ９分子の指向性
進化のために使用しうる、例示的な方法およびシステムについては、例えば、Esvelt el
al , Nature 2011, 472(7344): 499-503において記載されている。候補Ｃａｓ９分子は、
例えば、本明細書で記載される方法により査定することができる。
非切断型Ｃａｓ９分子および切断修飾型Ｃａｓ９分子
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、自然発生のＣａｓ９分子と異なる、例えば、緊密
な相同性を有する自然発生のＣａｓ９分子と異なる切断特性を含む。例えば、Ｃａｓ９分
子は、自然発生のＣａｓ９分子、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子
と、以下の通りに異なりうる：例えば、二本鎖切断（エンドヌクレアーゼ活性および／ま
たはエキソヌクレアーゼ活性）の減少もしくは増大であって、例えば、自然発生のＣａｓ
９分子（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子）と比較した減少もしく
は増大をモジュレートするその能力；例えば、核酸の一本鎖、例えば、核酸分子の非相補
鎖または核酸分子の相補鎖の切断（ニッカーゼ活性）の減少もしくは増大であって、例え
ば、自然発生のＣａｓ９分子（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子）
と比較した減少もしくは増大をモジュレートするその能力；または核酸分子、例えば、二
本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子を切断する能力を消失させることができる能力。
切断活性修飾型Ｃａｓ９分子
ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、以下の活性：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関
連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインと関連する切断活性；ＨＮＨドメインと関連する切断
活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する切断活性のうちの１または複数を含む。
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ニッカーゼであり、例えば、ＤＮＡの一
本鎖だけを切断する。ある実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、配列番号６６１１の、
１０位における突然変異および／または８４０位における突然変異を含む、例えば、配列
番号６６１１に対するＤ１０Ａ突然変異および／またはＨ８４０Ａ突然変異を含む。
非切断型不活性Ｃａｓ９分子
ある実施形態では、変更Ｃａｓ９分子は、核酸分子（二本鎖核酸分子または一本鎖核酸
分子）を切断しないか、または著明に低い効率、例えば、本明細書で記載されるアッセイ
により測定される通り、基準Ｃａｓ９分子の切断活性の、例えば、２０、１０、５、１、
もしくは０．１％未満の効率で、核酸分子を切断する、不活性Ｃａｓ９分子である。基準
Ｃａｓ９分子は、自然発生の非修飾Ｃａｓ９分子、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes
）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）、黄色ブドウ球菌（S. au
reus）、または髄膜炎菌（N. meningitidis）のＣａｓ９分子など、自然発生のＣａｓ９
分子でありうる。ある実施形態では、基準Ｃａｓ９分子は、緊密な配列同一性または相同
性を有する、自然発生のＣａｓ９分子である。ある実施形態では、不活性Ｃａｓ９分子は
、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する実質的な切断活性と、ＨＮＨ様ドメインと関連す
る実質的な切断活性とを欠く。
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ｄＣａｓ９である（Tsai et al. (2014), Nat. B
iotech. 32:569-577）。
触媒的に不活性のＣａｓ９分子を、転写リプレッサーと融合させることができる。不活
性のＣａｓ９融合タンパク質は、ｇＲＮＡと複合体化し、ｇＲＮＡのターゲティングドメ
インにより指定されるＤＮＡ配列へと局在化するが、活性Ｃａｓ９と異なり、標的ＤＮＡ
を切断しないであろう。転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインの、不活性Ｃａｓ
９への融合は、エフェクターの、ｇＲＮＡにより指定される、任意のＤＮＡ部位への動員
を可能とする。Ｃａｓ９融合タンパク質の、遺伝子のプロモーター領域への部位特異的タ
ーゲティングは、転写の活性化を増大させるか、または阻害するように、ポリメラーゼの
、プロモーター領域への結合、例えば、Ｃａｓ９の、転写因子（例えば、転写活性化因子
）との融合、および／または転写エンハンサーの、核酸への結合をブロックするか、また
はこれに影響を及ぼしうる。代替的に、Ｃａｓ９の、転写リプレッサーへの融合体の、遺
伝子のプロモーター領域への部位特異的ターゲティングを使用して、転写の活性化を減少
させることができる。
不活性Ｃａｓ９分子に融合させうる転写リプレッサーまたは転写リプレッサードメイン
はＫｒｕｅｐｐｅｌ結合ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作
用ドメイン（ＳＩＤ）、またはＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）を含みうる。
別の実施形態では、不活性Ｃａｓ９分子を、クロマチンを修飾するタンパク質と融合さ
せることができる。例えば、不活性Ｃａｓ９分子を、ヘテロクロマチン タンパク質 １
（ＨＰｌ）、ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＳＵＶ３９Ｈ １、
ＳＵＶ３９Ｈ２、Ｇ９Ａ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ １、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－
２０Ｈ １，ＲＩＺ１）、ヒストンリシンデメチラーゼ（例えば、ＬＳＤ１／ＢＨＣ１１
０、ＳｐＬｓｄ１／Ｓｗ１／Ｓａｆ１１０、Ｓｕ（ｖａｒ）３－３、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨ
ＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、Ｒｐｈ １、ＪＡ
ＲＩＤ １ Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩ ＤＩＢ／ＰＬＵ－Ｉ、ＪＡＲ１Ｄ １Ｃ／ＳＭＣ
Ｘ、ＪＡＲＩＤ１ Ｄ／ＳＭＣＹ、Ｌｉｄ、Ｊｈｎ２、Ｊｍｊ２）、ヒストンリシンデア
セチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、Ｒｐｄ３、Ｈ
ｏｓ ｌ、Ｃｉｒ６、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、Ｈｄａｌ、Ｃ
ｉｒ３、ＳＩＲＴ １、ＳＩＲＴ２、Ｓｉｒ２、Ｈｓｔ １、Ｈｓｔ２、Ｈｓｔ３、Ｈｓ
ｔ４、ＨＤＡＣ １１）、およびＤＮＡメチラーゼ（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２ａ／ＤＭＮ
Ｔ３ｂ、ＭＥＴ１）に融合させることができる。不活性Ｃａｓ９－クロマチン修飾分子融
合タンパク質を使用して、標的遺伝子の発現を低減するように、クロマチン状態を変更す
ることができる。
異種配列（例えば、転写リプレッサードメイン）を、不活性Ｃａｓ９タンパク質のＮ末
端またはＣ末端に融合させることができる。代替的な実施形態では、異種配列（例えば、
転写リプレッサードメイン）を、不活性Ｃａｓ９タンパク質の内部部分（すなわち、Ｎ末
端またはＣ末端以外の部分）に融合させることができる。
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合し、これを切断する能力は、例
えば、本明細書のＩＩＩ節で記載した方法により査定することができる。単独の、または
ｇＲＮＡ分子と複合体化させた、Ｃａｓ９分子、例えば、活性Ｃａｓ９または不活性Ｃａ
ｓ９の活性はまた、当技術分野で周知の方法であって、遺伝子発現アッセイ、ならびにク
ロマチンベースのアッセイ、例えば、クロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）、およびクロマチ
ンｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（ＣｉＡ）を含む方法により査定することもできる。
他のＣａｓ９分子の融合体
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ
９は加えて、さらなる活性を付与する、１または複数のアミノ酸配列も含みうる。
一部の態様では、Ｃａｓ９分子は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、
７つ、８つ、９つ、１０、またはこれを超えるＮＬＳなど、１または複数の核局在化配列
（ＮＬＳ）を含みうる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、アミノ末端における、も
しくはこの近傍における、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ
、９つ、１０、もしくはこれを超えるＮＬＳ、カルボキシ末端における、もしくはこの近
傍における、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０
、もしくはこれを超えるＮＬＳ、またはこれらの組合せ（例えば、アミノ末端における、
１または複数のＮＬＳ、およびカルボキシ末端における、１または複数のＮＬＳ）を含む
。１つを超えるＮＬＳが存在する場合、各ＮＬＳは、単一のＮＬＳが、１つを超えるコピ
ー内に存在することも可能であり、かつ／または１もしくは複数のコピー内に存在する、
１もしくは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在することも可能であるように、他のＮＬ
Ｓと独立に選択することができる。一部の実施形態では、ＮＬＳの最も近傍のアミノ酸が
、ポリペプチド鎖に沿って、Ｎ末端またはＣ末端から約１、２、３、４、５、１０、１５
、２０、２５、３０、４０、５０、またはこれを超えるアミノ酸以内である場合に、ＮＬ
Ｓは、Ｎ末端またはＣ末端の近傍にあると考えられる。典型的に、ＮＬＳは、正に帯電し
たリシンまたはアルギニンの、１または複数の短い配列であって、タンパク質表面に露出
した配列からなるが、他の種類のＮＬＳも公知である。ＮＬＳの非限定的な例は、アミノ
酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２）を有する、ＳＶ４０ウイルス大型Ｔ抗原のＮ
ＬＳ；ヌクレオプラスミンに由来するＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫ
ＫＫＫ（配列番号６６１３）を伴う、ヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）；アミノ酸配列Ｐ
ＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号６６１４）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号６６１
５）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹ
ＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号６６１６）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９
ＮＬＳ；インポルチンアルファに由来するＩＢＢドメインの配列である、ＲＭＲＩＺＦＫ
ＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号
６６１７）；筋腫Ｔタンパク質の配列である、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号６６１８）お
よびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号６６１９）；ヒトｐ５３の配列である、ＰＱＰＫＫＫＰ
Ｌ（配列番号６６２０）；マウスｃ－ａｂ１ ＩＶの配列である、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭ
ＡＰ（配列番号６６２１）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列である、ＤＲＬＲＲ（
配列番号６６２２）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号６６２３）；肝炎ウイルスデルタ抗
原の配列である、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号６６２４）；マウスＭｘ１タンパク質
の配列である、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号６６２５）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボー
ス）ポリメラーゼの配列である、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号
６６２６）；およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列である
、ＲＫＣLＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号６６２７）を含むかまたはこれらから
導出されるＮＬＳ配列を含む。当技術分野では、他の適するＮＬＳ配列も公知である（例
えば、Sorokin, Biochemistry (Moscow) (2007) 72:13, 1439-1457; Lange J Biol Chem.
(2007) 282:8, 5101-5）。
一部の態様では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子を特異的に認識することを可能とする
、１または複数のアミノ酸配列、例えば、タグを含みうる。一実施形態では、タグは、ヒ
スチジンタグ、例えば、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、
またはこれを超えるヒスチジンアミノ酸（配列番号１０８００）を含むヒスチジンタグで
ある。複数の実施形態では、ヒスチジンタグは、Ｈｉｓ６タグ（６ヒスチジン）（配列番
号１０７９５）である。他の実施形態では、ヒスチジンタグは、Ｈｉｓ８タグ（８ヒスチ
ジン）である。複数の実施形態では、ヒスチジンタグは、リンカーにより、Ｃａｓ９分子
の、１または複数の他の部分から隔てることができる。複数の実施形態では、リンカーは
、ＧＧＳである。このような融合体の例は、Ｃａｓ９分子である、ｉＰｒｏｔ１０６５２
０である。
一部の態様では、Ｃａｓ９分子は、プロテアーゼ（例えば、プロテアーゼ切断部位を含
む）により認識される、１または複数のアミノ酸配列を含みうる。複数の実施形態では、
切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり、例えば、配列ＥＮＬＹＦ
ＱＧ（配列番号７８１０）を含む。一部の態様では、プロテアーゼ切断部位、例えば、Ｔ
ＥＶ切断部位は、タグ、例えば、Ｈｉｓタグ、例えば、Ｈｉｓ６（配列番号１０７９５）
またはＨｉｓ８タグ（配列番号１０７９６）と、Ｃａｓ９分子の残余部分との間に配置さ
れる。理論に束縛されずに、このような導入は、例えば、Ｃａｓ９分子の精製のためのタ
グの使用、次いで、後続の切断を可能とするので、タグは、Ｃａｓ９分子の機能に干渉し
ないと考えられる。
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子）は
、Ｎ末端のＮＬＳおよびＣ末端のＮＬＳ（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、ＮＬＳ－Ｃ
ａｓ９－ＮＬＳを含む）を含み、例えば、配列中、各ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫ
ＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２））である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば
、本明細書で記載されるＣａｓ９分子）は、Ｎ末端のＮＬＳ、Ｃ末端のＮＬＳ、およびＣ
末端のＨｉｓ６タグ（配列番号１０７９５）（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、ＮＬＳ
－Ｃａｓ９－ＮＬＳ－Ｈｉｓタグを含む）を含み、例えば、配列中、各ＮＬＳは、ＳＶ４
０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２））である。複数の実施形態では、Ｃａ
ｓ９分子（例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子）は、Ｎ末端のＨｉｓタグ（例え
ば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号１０７９５））、Ｎ末端のＮＬＳ、およびＣ末端のＮＬＳ（
例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、Ｈｉｓタグ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳを含む）を含
み、例えば、配列中、各ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１
２））である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書で記載されるＣａ
ｓ９分子）は、Ｎ末端のＮＬＳおよびＣ末端のＨｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列
番号１０７９５））（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、Ｈｉｓタグ－Ｃａｓ９－ＮＬＳ
を含む）を含み、例えば、配列中、ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列
番号６６１２））である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書で記載
されるＣａｓ９分子）は、Ｎ末端のＨｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号１０７
９５））およびＣ末端のＮＬＳ（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、ＮＬＳ－Ｃａｓ９－
Ｈｉｓタグを含む）を含み、例えば、配列中、ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲ
ＫＶ（配列番号６６１２））である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば、本明
細書で記載されるＣａｓ９分子）は、Ｎ末端のＨｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ８タグ（配列
番号１０７９６））、Ｎ末端の切断ドメイン（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）
切断ドメイン（例えば、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７８１０）を含む））、Ｎ末端の
ＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ；配列番号６６１２）、およびＣ末端のＮＬＳ（例え
ば、ＳＶ４０ ＮＬＳ；配列番号６６１２）を含む（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、
Ｈｉｓタグ－ＴＥＶ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳを含む）。前述の複数の実施形態のうち
のいずれかでは、Ｃａｓ９は、配列番号６６１１の配列を有する。代替的に、前述の複数
の実施形態のうちのいずれかでは、Ｃａｓ９は、例えば、本明細書で記載される、配列番
号６６１１のＣａｓ９変異体の配列を有する。前述の複数の実施形態のうちのいずれかで
は、Ｃａｓ９分子は、Ｈｉｓタグと、分子の別の部分との間のリンカー、例えば、ＧＧＳ
リンカーを含む。上記で記載した、例示的なＣａｓ９分子のアミノ酸配列を、下記に提供
する。「ｉＰｒｏｔ」識別子は、図６０の識別子と合致する。
ｉＰｒｏｔ１０５０２６（タンパク質の調製に応じてまた、ｉＰｒｏｔ１０６１５４、ｉ
Ｐｒｏｔ１０６３３１、ｉＰｒｏｔ１０６５４５、およびＰＩＤ４２６３０３とも称する
）（配列番号７８２１）：
Figure 2022137032000425
ｉＰｒｏｔ１０６５１８（配列番号７８２２）：
Figure 2022137032000426
ｉＰｒｏｔ１０６５１９（配列番号７８２３）：
Figure 2022137032000427
ｉＰｒｏｔ１０６５２０（配列番号７８２４）：
Figure 2022137032000428
ｉＰｒｏｔ１０６５２１（配列番号７８２５）：
Figure 2022137032000429
ｉＰｒｏｔ１０６５２２（配列番号７８２６）：
Figure 2022137032000430
ｉＰｒｏｔ１０６６５８（配列番号７８２７）：
Figure 2022137032000431
ｉＰｒｏｔ１０６７４５（配列番号７８２８）：
Figure 2022137032000432
ｉＰｒｏｔ１０６７４６（配列番号７８２９）：
Figure 2022137032000433
ｉＰｒｏｔ１０６７４７（配列番号７８３０）：
Figure 2022137032000434
ｉＰｒｏｔ１０６８８４（配列番号７８３１）：
Figure 2022137032000435
Ｃａｓ９分子をコードする核酸
本明細書では、Ｃａｓ９分子、例えば、活性のＣａｓ９分子または不活性のＣａｓ９分
子をコードする核酸が提示される。
例示的なＣａｓ９分子をコードする核酸については、Cong et al , SCIENCE 2013, 399
(6121):819-823; Wang et al , CELL 2013, 153(4):910-918; Mali et al. , SCIENCE 20
13, 399(6121):823-826; Jinek et al, SCIENCE 2012, 337(6096):816-821において記載
されている。
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする核酸は、合成核酸配列でありうる。例え
ば、合成核酸分子は、例えば、ＸＩＩＩ節に記載する通り、化学修飾することができる。
ある実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、以下の特性：キャッピング、ポリアデニル化
、５－メチルシチジンおよび／またはシュードウリジンによる置換のうちの１または複数
、例えば、全てを有する。
加えて、または代替的に、合成核酸配列は、コドン最適化する、例えば、少なくとも１
つの非一般的コドンまたはそれほど一般的でないコドンを、一般的コドンにより置きかえ
ることができる。例えば、合成核酸は、最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡ、例えば、
例えば、本明細書で記載される、哺乳動物の発現系内の発現のために最適化されたメッセ
ンジャーｍＲＮＡの合成を方向づけうる。
下記には、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子をコードする、例示的なコド
ン最適化核酸配列を提供する。
Figure 2022137032000436
Figure 2022137032000437
Figure 2022137032000438
Figure 2022137032000439
上記のＣａｓ９配列を、ペプチドまたはポリペプチドとＣ末端において融合させる（例
えば、Ｃ末端において、転写リプレッサーと融合させた不活性Ｃａｓ９の）場合、終止コ
ドンは除去されると理解される。
Ｖ．キメラ抗原受容体
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、また
はキメラＴＣＲを形質導入された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞など、養子免疫
療法の方法および試薬との関連における使用のための、ｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲ
系を提供する。本発明のｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲ系を使用して、有効性および安
全性などの特性を改善した、養子免疫療法の細胞および組成物を創出することができる。
本節では、一般に、本発明のｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲ系と共に有用なＣＡＲ技術
について記載し、改善されたＣＡＲ試薬、例えば、細胞および組成物、ならびに方法につ
いて記載する。
一般に、本発明の複数の態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分
子であって、ＣＡＲが、本明細書で記載される腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメイン（
例えば、抗体または抗体断片、ＴＣＲまたはＴＣＲ断片）、膜貫通ドメイン（例えば、本
明細書で記載される膜貫通ドメイン）、および細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本
明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン）（例えば、共刺激性ドメイン（例えば
、本明細書で記載される共刺激性ドメイン）および／または一次シグナル伝達ドメイン（
例えば、本明細書で記載される一次シグナル伝達ドメイン）を含む細胞内シグナル伝達ド
メイン）を含む、単離核酸分子に関するか、またはこれを含む。他の複数の態様では、本
発明は、上記の核酸と、このような核酸分子によりコードされる単離タンパク質とを含有
する宿主細胞を含む。本発明と関連するＣＡＲ核酸構築物、コードされるタンパク質、含
有ベクター、宿主細胞、医薬組成物、ならびに投与法および処置法については、参照によ
りその全体において組み込まれる、国際特許出願公開第２０１５１４２６７５号パンフレ
ットにおいて詳細に開示されている。
一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分子であっ
て、ＣＡＲが、腫瘍支持抗原（例えば、本明細書で記載される腫瘍支持抗原）に結合する
抗原結合性ドメイン（例えば、抗体または抗体断片、ＴＣＲまたはＴＣＲ断片）、膜貫通
ドメイン（例えば、本明細書で記載される膜貫通ドメイン）、および細胞内シグナル伝達
ドメイン（例えば、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン）（例えば、共刺
激性ドメイン（例えば、本明細書で記載される共刺激性ドメイン）および／または一次シ
グナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される一次シグナル伝達ドメイン）を含む
細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む、単離核酸分子に関する。一部の実施形態では、腫
瘍支持抗原は、間質細胞上または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上に存在する抗
原である。他の複数の態様では、本発明は、このような核酸によりコードされるポリペプ
チドと、このような核酸および／またはポリペプチドを含有する宿主細胞とを特色とする
。
代替的に、本発明の複数の態様は、本明細書で記載されるがん抗原に対する特異性を伴
う、ＴＣＲアルファ可変ドメインおよび／またはＴＣＲベータ可変ドメインを含む、キメ
ラＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする単離核酸に関する。例えば、それらの内容が、参
照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Dembic et al., Nature, 320,
232-238 (1986), Schumacher, Nat. Rev. Immunol., 2, 512-519 (2002), Kershaw et al
., Nat. Rev. Immunol., 5, 928-940 (2005), Xue et al., Clin. Exp. Immunol., 139,
167-172 (2005), Rossig et al., Mol. Ther., 10, 5-18 (2004), and Murphy et al., I
mmunity, 22, 403-414 (2005); (Morgan et al. J. Immunol., 171, 3287-3295 (2003),
Hughes et al., Hum. Gene Ther., 16, 1-16 (2005), Zhao et al., J. Immunol., 174,
4415-4423 (2005), Roszkowski et al., Cancer Res., 65, 1570-1576 (2005), and Enge
ls et al., Hum. Gene Ther., 16, 799-810 (2005)；米国特許出願公開第２００９／０３
０４６５５７号明細書を参照されたい。このようなキメラＴＣＲは、例えば、ＭＡＲＴ－
１、ｇｐ－１００、ｐ５３、およびＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥＡ３／Ａ６、ＭＡＧＥＡ
３、ＳＳＸ２、ＨＰＶ－１６Ｅ６、またはＨＰＶ－１６Ｅ７などのがん抗原を認識しうる
。他の複数の態様では、本発明は、このような核酸によりコードされるポリペプチドと、
このような核酸および／またはポリペプチドを含有する宿主細胞とを特色とする。
標的
本発明は、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子またはＣＲＩＳＰＲ系であって、免疫エ
フェクター細胞を、所望されない細胞（例えば、がん細胞）へと方向付ける、１または複
数のＣＡＲを含有するように、さらに操作されたｇＲＮＡ分子またはＣＲＩＳＰＲ系を含
むか、または、任意の時点において、これを含んだ細胞、例えば、免疫エフェクター細胞
（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を提供する。これは、がん関連抗原に特異的なＣＡＲ上の
抗原結合性ドメインを介して達成される。本発明のＣＡＲによりターゲティングされるが
ん関連抗原（腫瘍抗原）には、２つのクラス：（１）がん細胞の表面上で発現するがん関
連抗原と；（２）それ自体は、細胞内にあるが、このような抗原（ペプチド）の断片は、
ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）により、がん細胞の表面上に提示されているがん関連抗
原とがある。
一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ
１７１；ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、およ
び１９Ａ２４ともまた称する）；Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ－１またはＣＬＥＣＬ１
）；ＣＤ３３；表皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシド
Ｇ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２
－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリ
ーメンバーであるＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（ＴｎＡｇ）または（ＧａｌＮＡ
ｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ
様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関
連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）
；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；
インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒａ２またはＣＤ２
１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前
立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスチシンまたはＰＲＳＳ２１
）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；Ｌｅｗｉｓ（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血
小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲベータ）；発生段階特異的胎児性抗原４（Ｓ
ＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体型プロテインチロシンキナーゼＥ
ＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）；表皮成長因子受容
体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファタ
ーゼ（ＰＡＰ）；突然変異型伸長因子２（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性
化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１受容体）
；炭酸脱水素酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；ベータ９型プロテアソーム（プロソーム、マクロペ
イン）サブユニット（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスタ
ー領域（ＢＣＲ）およびＡｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルスがん遺伝子相同体１（Ａｂ
ｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；Ａ型エフリ
ン受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルＬｅｗｉｓ接着分子（ｓＬｅ）；
ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ
（１－１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原
（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体
ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥ
Ｍ７Ｒ）；ｃｌａｕｄｉｎ６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；
Ｇタンパク質共役受容体クラスＣ群５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリ
ーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫
キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨ糖セラ
ミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（
ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベー
タ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰ
Ｒ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（Ｏ
Ｒ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替的リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィ
ルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；がん／精巣
抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；染色体１２ｐに位置
するＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７
）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合性細胞表面
受容体２（Ｔｉｅ ２）；黒色腫がん精巣抗原１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫がん精巣
抗原２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ
５３突然変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原１（ＰＣ
ＴＡ－１またはガレクチン８）；Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１（ＭｅｌａｎＡま
たはＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈ
ＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫アポトーシス阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜
貫通セリンプロテアーゼ２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコ
サミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３
（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；ＣｙｃｌｉｎＢ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウ
イルスがん遺伝子神経芽細胞腫由来相同体（ＭＹＣＮ）；Ｒａｓ相同体ファミリーメンバ
ーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；チトクロームＰ４５
０１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合性因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（Ｂ
ＯＲＩＳまたはBｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Rｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Iｍｐｒｉｎ
ｔｅｄ Sｉｔｅｓ）；Sｑｕａｍｏｕｓ Cｅｌｌ Cａｒｃｉｎｏｍａ Aｎｔｉｇｅｎ
Rｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ Cｅｌｌｓ ３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタ
ンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥ
Ｓ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータ
ンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（
ＲＡＧＥ－１）；腎ユビキタス１（ＲＵ１）；腎ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；
ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶＥ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶＥ７
）；腸カルボキシルエステラーゼ；突然変異型熱ショックタンパク質７０－２（ｍｕｔ
ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受
容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免
疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様
ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバ
ーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ム
チン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３
（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプ
チド１（ＩＧＬＬ１）のうちの１または複数から選択される。
本明細書で記載されるＣＡＲは、腫瘍支持抗原（例えば、本明細書で記載される腫瘍支
持抗原）に結合する抗原結合性ドメイン（例えば、抗体または抗体断片、ＴＣＲまたはＴ
ＣＲ断片）を含みうる。一部の実施形態では、腫瘍支持抗原は、間質細胞上または骨髄由
来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上に存在する抗原である。間質細胞は、マイクロ環境内
の細胞分裂を促進する成長因子を分泌しうる。ＭＤＳＣ細胞は、Ｔ細胞の増殖および活性
化を阻害しうる。理論に束縛されることを望まずに、一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細
胞は、腫瘍支持細胞を破壊し、これにより、腫瘍の成長または生存を間接的に阻害する。
複数の実施形態では、間質細胞抗原は、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、線維芽細胞
活性化タンパク質（ＦＡＰ）、およびテネイシンのうちの１または複数から選択される。
ある実施形態では、ＦＡＰ特異的抗体は、結合について、シブロツズマブと競合するか、
またはこれと同じＣＤＲを有する。複数の実施形態では、ＭＤＳＣ抗原は、ＣＤ３３、Ｃ
Ｄ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５、およびＣＤ６６ｂのうちの１または複数から選択される。
したがって、一部の実施形態では、腫瘍支持抗原は、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、またはテネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ
１４、ＣＤ１５、およびＣＤ６６ｂのうちの１または複数から選択される。
抗原結合性ドメインの構造
一部の実施形態では、コードされるＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、抗体、抗体断
片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨド
メインまたはＶＬドメイン、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、または二官能性（例えば、二
特異性）ハイブリッド抗体を含む（例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17
, 105 (1987)）。
一部の場合では、ｓｃＦｖは、当技術分野で公知の方法（例えば、Bird et al., (1988
) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5
879-5883を参照されたい）に従い調製することができる。ＳｃＦｖ分子は、可撓性のポリ
ペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域と、ＶＬ領域とを、一体に連結することにより産
生することができる。ｓｃＦｖ分子は、長さおよび／またはアミノ酸組成を最適化したリ
ンカー（例えば、Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変
領域が、どのようにしてフォールディングし、相互作用するのかに、多大な影響を及ぼし
うる。実際、短いポリペプチドリンカー（例えば、５～１０アミノ酸の間の）を援用する
場合、鎖内フォールディングが妨げられる。鎖内フォールディングはまた、２つの可変領
域を一体として、機能的なエピトープ結合性部位を形成するのにも要求される。リンカー
の配向性およびサイズについては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Hollin
ger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448；米国特許出願公開第２０
０５／０１００５４３号明細書、同第２００５／０１７５６０６号明細書、同第２００７
／００１４７９４号明細書、ならびにＰＣＴ国際公開第２００６／０２０２５８号パンフ
レットおよび国際公開第２００７／０２４７１５号パンフレットを参照されたい。
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域と、ＶＨ領域との間に、少なくとも１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、
２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはこれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含
みうる。リンカー配列は、任意の自然発生のアミノ酸を含みうる。一部の実施形態では、
リンカー配列は、アミノ酸である、グリシンおよびセリンを含む。別の実施形態では、リ
ンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなど、グリシンおよびセリンのリピートのセット［
配列中、ｎは、１と等しいか、またはこれを超える、正の整数である］（配列番号６６２
９）を含む。一実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６５９３）
または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号６５９４）でありうる。リンカーの長さの変動は
、活性を保持または増強することが可能であり、活性研究において、優れた有効性をもた
らす。
別の態様では、抗原結合性ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）、またはその断片
、例えば、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。当技術分野では、このようなＴＣＲを作製
する方法が公知である。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (200
0); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther.
19(4):365-74 (2012)（参考文献は、それらの全体において本明細書に組み込まれる）を
参照されたい。例えば、リンカー（例えば、可撓性のペプチド）により連結されたＴ細胞
クローンに由来するＶα遺伝子およびＶβ遺伝子を含有する、ｓｃＴＣＲを操作すること
ができる。この手法は、それ自体は細胞内にあるが、このような抗原（ペプチド）の断片
は、ＭＨＣにより、がん細胞の表面上に提示される、がん関連標的に対して極めて有用で
ある。
ある特定の実施形態では、コードされる抗原結合性ドメインは、１０－４Ｍ～１０－８
Ｍの結合アフィニティーであるＫＤを有する。
一実施形態では、コードされるＣＡＲ分子は、標的抗原に対して、１０－４Ｍ～１０－
８Ｍ、例えば、１０－５Ｍ～１０－７Ｍ、例えば、１０－６Ｍまたは１０－７Ｍの結合ア
フィニティーであるＫＤを有する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、抗原結合
性ドメインは、基準抗体、例えば、本明細書で記載される抗体の、少なくとも５分の１、
１０分の１、２０分の１、３０分の１、５０分の１、１００分の１、または１，０００分
の１である結合アフィニティーを有する。一実施形態では、コードされる抗原結合性ドメ
インは、基準抗体（例えば、抗原結合性ドメインが導出される抗体）の、少なくとも５分
の１の結合アフィニティーを有する。一態様では、このような抗体断片は、それらが、当
業者により理解される生物学的応答であって、免疫応答の活性化、その標的抗原からの、
シグナル伝達の発生の阻害、キナーゼ活性の阻害などを含むがこれらに限定されない生物
学的応答をもたらすという意味で機能的である。
一態様では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、それが導出されるｓｃＦｖのマウス配列
と比較してヒト化されたｓｃＦｖ抗体断片である。
一態様では、本発明のＣＡＲの抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、その配列
が、哺乳動物細胞内の発現についてコドン最適化された核酸分子によりコードされる。一
態様では、本発明のＣＡＲ構築物の全体は、その配列の全体が、哺乳動物細胞内の発現に
ついてコドン最適化された核酸分子によりコードされる。コドン最適化とは、異なる種で
は、コードＤＮＡ内の同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の発生
頻度にバイアスがかかるという発見を指す。このようなコドンの縮重は、同一のポリペプ
チドが、様々なヌクレオチド配列によりコードされることを可能とする。当技術分野では
、様々なコドン最適化法が公知であり、例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６
４号明細書および同第６，１１４，１４８号明細書において開示されている方法を含む。
抗原結合性ドメイン（および標的抗原）
一実施形態では、ＣＤ１９に対する抗原結合性ドメインは、ＰＣＴ国際公開第２０１２
／０７９０００号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレッ
ト；Kochenderfer, J.N. et al., J. Immunother. 32 (7), 689-702 (2009)；Kochenderf
er, J.N., et al., Blood, 116 (20), 4099-4102 (2010)；ＰＣＴ国際公開第２０１４／
０３１６８７号パンフレット；Bejcek, Cancer Research, 55, 2346-2351, 1995；または
米国特許第７，４４６，１９０号明細書において記載されている、ＣＡＲ、抗体または、
これらの抗原結合性断片の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、メソテリンに対する抗原結合性ドメインは、例えば、ＰＣＴ国際公開
第２０１５／０９０２３０号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断
片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、メソテ
リンに対する抗原結合性ドメインは、例えば、ＰＣＴ国際公開第１９９７／０２５０６８
号パンフレット、国際公開第１９９９／０２８４７１号パンフレット、国際公開第２００
５／０１４６５２号パンフレット、国際公開第２００６／０９９１４１号パンフレット、
国際公開第２００９／０４５９５７号パンフレット、国際公開第２００９／０６８２０４
号パンフレット、国際公開第２０１３／１４２０３４号パンフレット、国際公開第２０１
３／０４０５５７号パンフレット、または国際公開第２０１３／０６３４１９号パンフレ
ットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分
、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、メソテリンに対する抗原結合性ドメインは、
国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原
結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ１２３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、ＰＣＴ国際公開
第２０１４／１３０６３５号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断
片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＣＤ１
２３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１４／１３８８０５
号パンフレット、国際公開第２０１４／１３８８１９号パンフレット、国際公開第２０１
３／１７３８２０号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４６２２号パンフレット、
国際公開第２００１／６６１３９号パンフレット、国際公開第２０１０／１２６０６６号
パンフレット、国際公開第２０１４／１４４６２２号パンフレット、または米国特許出願
公開第２００９／０２５２７４２号明細書において記載されている、抗体、抗原結合性断
片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＣＤ１
２３に対する抗原結合性ドメインは、国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレット
において記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例
えば、ＣＤＲである。
例は、以下の抗原結合性ドメイン、またはＶＬおよびＶＨ（（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配
列番号６５９４）により隔てられた下記の配列内の）を含むＣＡＲ分子を含む。
ＣＤ１２３－１：
Figure 2022137032000440
ＣＤ１２３－２：
Figure 2022137032000441
ＣＤ１２３－３：
Figure 2022137032000442
ＣＤ１２３－４：
Figure 2022137032000443
前記抗ＣＤ１２３結合性ドメインを含むＣＡＲは、例えば、以下のアミノ酸配列を含み
うる。
ＣＡＲ１２３－２：
Figure 2022137032000444
ＣＡＲ１２３－３：
Figure 2022137032000445
ＣＡＲ１２３－４：
Figure 2022137032000446
ＣＡＲ１２３－１：
Figure 2022137032000447
 各場合に、ＣＡＲは、任意選択で、上記の配列の各々に含まれるリーダー配列（ＭＡＬＰ
ＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ；配列番号６６４０）を含む場合もあり、含まない
場合もある。
一実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開
第２０１４／１３０６５７号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断
片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ２２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Haso et al., Blo
od, 121(7): 1165-1174 (2013); Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903 (20
10); Kato et al., Leuk Res 37(1):83-88 (2013); Creative BioMart (creativebiomart
.net): MOM-18047-S(P)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤ
Ｒである。
一実施形態では、ＣＳ－１に対する抗原結合性ドメインは、エロツズマブ（ＢＭＳ）の
抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである（例えば、Tai et al., 2008, Blood 112(4):132
9-37; Tai et al., 2007, Blood. 110(5):1656-63を参照されたい）。
一実施形態では、ＣＬＬ－１に対する抗原結合性ドメインは、Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍから市販されている抗体であって、例えば、ＰＥ－ＣＬＬ１－ｈ
ｕ；型番３５３６０４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；およびＰＥ－ＣＬＬ１（ＣＬＥＣ１２Ａ
）型番５６２５６６（ＢＤ）である抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一
実施形態では、ＣＬＬ－１に対する抗原結合性ドメインは、国際公開第２０１６／０１４
５３５号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの
、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ３３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Bross et al., Cl
in Cancer Res 7(6):1490-1496 (2001) (Gemtuzumab Ozogamicin, hP67.6), Caron et al
., Cancer Res 52(24):6761-6767 (1992) (Lintuzumab, HuM195)；Lapusan et al., Inve
st New Drugs 30(3):1121-1131 (2012) (AVE9633), Aigner et al., Leukemia 27(5): 11
07-1115 (2013) (AMG330, CD33 BiTE)；Dutour et al., Adv hematol 2012:683065 (2012
),およびPizzitola et al., Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62 (2014)において記載さ
れている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＣＤ３３に
対する抗原結合性ドメインは、国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレットにおい
て記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、
ＣＤＲである。
一実施形態では、ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Mujoo et al., Canc
er Res. 47(4):1098-1104 (1987); Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1985)
, Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987), Cheung et al., J Clin Oncol
16(9):3053-3060 (1998), Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(3):1
99-204 (1992)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである
。一部の実施形態では、ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、ｍＡｂ１４．１８、１４
Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕ１４．１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６０
Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６．１、および８Ｈ９から選択される抗体の抗原結合性部分であ
る（例えば、国際公開第２０１２０３３８８５号パンフレット、国際公開第２０１３０４
０３７１号パンフレット、国際公開第２０１３１９２２９４号パンフレット、国際公開第
２０１３０６１２７３号パンフレット、国際公開第２０１３１２３０６１号パンフレット
、国際公開第２０１３０７４９１６号パンフレット、および国際公開第２０１３８５５５
２号パンフレットを参照されたい）。一部の実施形態では、ＧＤ２に対する抗原結合性ド
メインは、米国特許出願公開第２０１００１５０９１０号明細書またはＰＣＴ国際公開第
２０１１１６０１１９号パンフレットにおいて記載されている抗体の抗原結合性部分であ
る。
一実施形態では、ＢＣＭＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開第２０１
２１６３８０５号パンフレット、国際公開第２００１１２８１２号パンフレット、および
国際公開第２００３０６２４０１号パンフレットにおいて記載されている抗体の、抗原結
合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＢＣＭＡに対する抗原結合性ドメイ
ンは、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットにおいて記載されている、抗体
、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、Ｔｎ抗原に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第８，４
４０，７９８号明細書；Brooks et al., PNAS 107(22):10056-10061 (2010)；およびSton
e et al., OncoImmunology 1(6):863-873(2012)において記載されている抗体の、抗原結
合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＰＳＭＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Parker et al., P
rotein Expr Purif 89(2):136-145 (2013)；米国特許出願公開第２０１１０２６８６５６
号明細書（Ｊ５９１ ＳｃＦｖ）；Frigerio et al, European J Cancer 49(9):2223-223
2 (2013)（ｓｃＦｖ Ｄ２Ｂ）；国際公開第２００６１２５４８１号パンフレット（ｍＡ
ｂ ３／Ａ１２、ｍＡｂ ３／Ｅ７、およびｍＡｂ ３／Ｆ１１）において記載されてい
る抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲ、および単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ Ａ５およ
びｓｃＦｖ Ｄ７）である。
一実施形態では、ＲＯＲ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Hudecek et al.,
Clin Cancer Res 19(12):3153-3164 (2013)；国際公開第２０１１１５９８４７号パンフ
レット；および米国特許出願公開第２０１３０１０１６０７号明細書において記載されて
いる抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＦＬＴ３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開第２０１
１０７６９２２号パンフレット、米国特許第５７７７０８４号明細書、欧州特許第０７５
４２３０号明細書、米国特許出願公開第２００９０２９７５２９号明細書において記載さ
れている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲ、およびいくつかの市販のカタログ抗
体（Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍ）である。
一実施形態では、ＴＡＧ７２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Hombach et al.
, Gastroenterology 113(4):1163-1170 (1997)において記載されている抗体の、抗原結合
性部分、例えば、ＣＤＲ；およびＡｂｃａｍ ａｂ６９１である。
一実施形態では、ＦＡＰに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Ostermann et al.,
Clinical Cancer Research 14:4584-4592 (2008)（ＦＡＰ５）、米国特許出願公開第２０
０９／０３０４７１８号明細書において記載されている抗体；シブロツズマブ(例えば、H
ofheinz et al., Oncology Research and Treatment 26(1), 2003を参照されたい）；お
よびTran et al., J Exp Med 210(6):1125-1135 (2013)において記載されている抗体の、
抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ３８に対する抗原結合性ドメインは、ダラツムマブ（例えば、Gr
oen et al., Blood 116(21):1261-1262 (2010)を参照されたい）；ＭＯＲ２０２（例えば
、米国特許第８，２６３，７４６号明細書を参照されたい）；または米国特許第８，３６
２，２１１号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲで
ある。
一実施形態では、ＣＤ４４ｖ６に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Casucci et a
l., Blood 122(20):3461-3472 (2013)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、
例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＥＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Chmielewski et al.
, Gastoenterology 143(4):1095-1107 (2012)において記載されている抗体の、抗原結合
性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＥＰＣＡＭに対する抗原結合性ドメインは、ＭＴ１１０、ＥｐＣＡＭ
－ＣＤ３二特異的Ａｂ（例えば、clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596を参照され
たい）；エドレコロマブ；３６２２Ｗ９４；ＩＮＧ－１；およびアデカツムマブ（ＭＴ２
０１）から選択される抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲＳである。
一実施形態では、ＰＲＳＳ２１に対する抗原結合性ドメインは、米国特許第８，０８０
，６５０号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲであ
る。
一実施形態では、Ｂ７Ｈ３に対する抗原結合性ドメインは、抗体ＭＧＡ２７１（Ｍａｃ
ｒｏｇｅｎｉｃｓ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＫＩＴに対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７９１５
３９１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２８８５０６号明細書、およびいくつか
の市販のカタログ抗体において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲ
である。
一実施形態では、ＩＬ－１３Ｒａ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開
第２００８／１４６９１１号パンフレット、国際公開第２００４０８７７５８号パンフレ
ット、国際公開第２００４０８７７５８号パンフレットにおいて記載されている抗体、お
よびいくつかの市販のカタログ抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ３０に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７０９
０８４３号明細書および欧州特許第０８０５８７１号明細書において記載されている抗体
の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＧＤ３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７２５３
２６３号明細書；米国特許第８，２０７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１２
０２７６０４６号明細書；欧州特許第１０１３７６１号明細書；国際公開第２００５０３
５５７７号パンフレット；および米国特許第６４３７０９８号明細書において記載されて
いる抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ１７１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Hong et al., J
Immunother 37(2):93-104 (2014)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例
えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＩＬ－１１Ｒａに対する抗原結合性ドメインは、Ａｂｃａｍ（型番ａ
ｂ５５２６２）またはＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（型番ＥＰＲ５４４６）から
入手可能な抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。別の実施形態では、ＩＬ－
１１Ｒａに対する抗原結合性ドメインは、ペプチドである（例えば、Huang et al., Canc
er Res 72(1):271-281 (2012)を参照されたい）。
一実施形態では、ＰＳＣＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Morgenroth et al
., Prostate 67(10):1121-1131 (2007)（ｓｃＦｖ ７Ｆ５）；Nejatollahi et al., J o
f Oncology 2013(2013), article ID 839831（ｓｃＦｖ Ｃ５－ＩＩ）；および米国特許
出願公開第２００９０３１１１８１号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性
部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Chinnasamy e
t al., J Clin Invest 120(11):3953-3968 (2010)において記載されている抗体の、抗原
結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＬｅｗｉｓＹに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Kelly et al.
, Cancer Biother Radiopharm 23(4):411-423 (2008)（ｈｕ３Ｓ１９３ Ａｂ（ｓｃＦｖ
））；Dolezal et al., Protein Engineering 16(1):47-56 (2003)（ＮＣ１０ ｓｃＦｖ
）において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ２４に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Maliar et al., G
astroenterology 143(5):1375-1384 (2012)において記載されている抗体の、抗原結合性
部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＰＤＧＦＲベータに対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＡｂｃ
ａｍ ａｂ３２５７０の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＳＳＥＡ－４に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＭＣ８１３
（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、または他の市販されている抗体の、抗原結合性部分
、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ２０に対する抗原結合性ドメインは、抗体である、リツキシマブ
、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、またはＧＡ１０１の、抗原結合性部
分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、葉酸受容体アルファに対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＩＭ
ＧＮ８５３、または米国特許出願公開第２０１２０００９１８１号明細書；米国特許第４
８５１３３２号明細書において記載されている抗体、ＬＫ２６（米国特許第５９５２４８
４号明細書）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）に対する抗原結合性ドメインは、抗
体であるトラスツズマブまたはペルツズマブの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである
。
一実施形態では、ＭＵＣ１に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＳＡＲ５６６６
５８の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＥＧＦＲに対する抗原結合性ドメインは、抗体である、セツキシマブ
、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、またはマツズマブの、抗原結合性部分、
例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＮＣＡＭに対する抗原結合性ドメインは、抗体クローンである２－２
Ｂ：ＭＡＢ５３２４（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤ
Ｒである。
一実施形態では、エフリンＢ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Abengozar et
al., Blood 119(19):4565-4576 (2012)において記載されている抗体の、抗原結合性部分
、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＩＧＦ－１受容体に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許
第８３４４１１２号明細書；欧州特許出願公開第２３２２５５０号明細書；国際公開第２
００６／１３８３１５号パンフレット、またはＰＣＴ／米国特許出願公開第２００６／０
２２９９５号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲで
ある。
一実施形態では、ＣＡＩＸに対する抗原結合性ドメインは、抗体クローンである３０３
１２３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＬＭＰ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７，４
１０，６４０号明細書、または米国特許出願公開第２００５０１２９７０１号明細書にお
いて記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ｇｐ１００に対する抗原結合性ドメインは、抗体である、ＨＭＢ４５
、ＮＫＩベータＢ、または国際公開第２０１３１６５９４０号パンフレット、もしくは米
国特許出願公開第２０１３０２９５００７号明細書において記載されている抗体の、抗原
結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、チロシナーゼに対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第５
８４３６７４号明細書；または米国特許出願公開第１９９５０５０４０４８号明細書にお
いて記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＥｐｈＡ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Yu et al., Mol
Ther 22(1):102-111 (2014)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、
ＣＤＲである。
一実施形態では、ＧＤ３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７２５３
２６３号明細書；米国特許第８，２０７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１２
０２７６０４６号明細書；欧州特許出願公開第１０１３７６１号明細書；米国特許出願公
開第２０１２０２７６０４６号明細書；国際公開第２００５０３５５７７号パンフレット
；または米国特許第６４３７０９８号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性
部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、フコシルＧＭ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許出
願公開第２０１００２９７１３８号明細書；または国際公開第２００７／０６７９９２号
パンフレットにおいて記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ｓＬｅに対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＧ１９３（ｌｅｗ
ｉｓＹに対する抗体）（Scott AM et al, Cancer Res 60: 3254-61 (2000)を参照された
い；また、Neeson et al, J Immunol May 2013 190 (Meeting Abstract Supplement) 177
.10においても記載されている）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＧＭ３に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＣＡ ２５２３４
４９（ｍＡｂ １４Ｆ７）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＨＭＷＭＡＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Kmiecik et a
l., Oncoimmunology 3(1):e27185 (2014) (PMID: 24575382) (mAb9.2.27)；米国特許第６
５２８４８１号明細書；国際公開第２０１００３３８６６号パンフレット；または米国特
許出願公開第２０１４０００４１２４号明細書において記載されている抗体の、抗原結合
性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ｏ－アセチル－ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、抗体である８
Ｂ６の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Mart
y et al., Cancer Lett 235(2):298-308 (2006); Zhao et al., J Immunol Methods 363(
2):221-232 (2011)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲで
ある。
一実施形態では、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＩＭＡＢ０２
７（Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（例えば、clinicaltrial.gov/
show/NCT02054351を参照されたい）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＴＳＨＲに対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第８，６
０３，４６６号明細書；米国特許第８，５０１，４１５号明細書；または米国特許第８，
３０９，６９３号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤ
Ｒである。
一実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合性ドメインは、抗体である、ＦＡＢ６
３００Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；またはＬＳ－Ａ４１８０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ９７に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第６，８
４６，９１１号明細書；de Groot et al., J Immunol 183(6):4127-4134 (2009)において
記載されている抗体；またはＲ＆Ｄ製の抗体：ＭＡＢ３７３４の、抗原結合性部分、例え
ば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＡＬＫに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Mino-Kenudson et a
l., Clin Cancer Res 16(5):1561-1571 (2010)において記載されている抗体の、抗原結合
性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ポリシアル酸に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Nagae et al.
, J Biol Chem 288(47):33784-33796 (2013)において記載されている抗体の、抗原結合性
部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＰＬＡＣ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Ghods et al.,
Biotechnol Appl Biochem 2013 doi:10.1002/bab.1177において記載されている抗体の、
抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＧｌｏｂｏＨに対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＶＫ９；ま
たは、例えば、Kudryashov V et al, Glycoconj J.15(3):243-9 (1998), Lou et al., Pr
oc Natl Acad Sci USA 111(7):2482-2487 (2014)において記載されている抗体；ＭＢｒ１
（Bremer E-G et al. J Biol Chem 259:14773-14777 (1984)）の抗原結合性部分である。
一実施形態では、ＮＹ－ＢＲ－１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Jager et a
l., Appl Immunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83 (2007)において記載されている抗
体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＷＴ－１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Dao et al., Sci
Transl Med 5(176):176ra33 (2013)；または国際公開第２０１２／１３５８５４号パンフ
レットにおいて記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Willemsen
et al., J Immunol 174(12):7853-7858 (2005)において記載されている抗体（ＴＣＲ様ｓ
ｃＦｖ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、精子タンパク質１７に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Song e
t al., Target Oncol 2013 Aug 14 (PMID: 23943313); Song et al., Med Oncol 29(4):2
923-2931 (2012)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲであ
る。
一実施形態では、Ｔｉｅ ２に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＡＢ３３（Ｃ
ｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の、抗原結合性部分、例えば、Ｃ
ＤＲである。
一実施形態では、ＭＡＤ－ＣＴ－２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、PMID: 24
50952；米国特許第７６３５７５３号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性
部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、Ｆｏｓ関連抗原１に対する抗原結合性ドメインは、抗体である１２Ｆ
９（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである
。
一実施形態では、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１に対する抗原結合性ドメインは、欧州特許
出願公開第２５１４７６６号明細書；または米国特許第７，７４９，７１９号明細書にお
いて記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、肉腫転座切断点に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Luo et al,
EMBO Mol. Med. 4(6):453-461 (2012)において記載されている抗体の、抗原結合性部分
、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＴＲＰ－２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Wang et al, J
Exp Med. 184(6):2207-16 (1996)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例え
ば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＹＰ１Ｂ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Maecker et a
l, Blood 102 (9): 3287-3294 (2003)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、
例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＲＡＧＥ－１に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＭＡＢ５３
２８（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素に対する抗原結合性ドメインは、抗体で
ある型番ＬＳ－Ｂ９５－１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の、抗原
結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、腸カルボキシルエステラーゼに対する抗原結合性ドメインは、抗体で
ある４Ｆ１２：型番ＬＳ－Ｂ６１９０－５０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２に対する抗原結合性ドメインは、抗体である
、Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ：型番ＬＳ－Ｃ１
３３２６１－１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の、抗原結合性部分
、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ７９aに対する抗原結合性ドメインは、Ａｂｃａｍから入手可能
な抗体である、Ａｎｔｉ－ＣＤ７９ａ ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＨＭ４７／Ａ９］（ａｂ３１
２１）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な抗体で
ある、ＣＤ７９Ａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＃３３５１；またはウサギにおいて産生され、Ｓ
ｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能な抗体である、ＨＰＡ０１７７４８（Ａｎｔｉ－
ＣＤ７９Ａ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ７９ｂに対する抗原結合性ドメインは、Dornan et al., “Thera
peutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate, anti-CD79b-vc-MMAE, f
or the treatment of non-Hodgkin lymphoma” Blood. 2009 Sep 24;114(13):2721-9. do
i: 10.1182/blood-2009-02-205500. Epub 2009 Jul 24において記載されている抗ＣＤ７
９ｂ抗体であるポラツズマブベドチン、または“4507 Pre-Clinical Characterization o
f T Cell-Dependent Bispecific Antibody Anti-CD79b/CD3 As a Potential Therapy for
B Cell Malignancies” Abstracts of 56th ASH Annual Meeting and Exposition, San
Francisco, CA December 6-9 2014において記載されている二特異性抗体である、Ａｎｔ
ｉ－ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ７２に対する抗原結合性ドメインは、Myers, and Uckun, “An a
nti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic le
ukemia.” Leuk Lymphoma. 1995 Jun;18(1-2):119-22において記載されている抗体である
Ｊ３－１０９、またはPolson et al., “Antibody-Drug Conjugates for the Treatment
of Non-Hodgkin’s Lymphoma: Target and Linker-Drug Selection” Cancer Res March
15, 2009 69; 2358において記載されている抗ＣＤ７２（１０Ｄ６．８．１；ｍＩｇＧ１
）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＬＡＩＲ１に対する抗原結合性ドメインは、ＰｒｏＳｐｅｃから入手
可能な抗体である、ＡＮＴ－３０１ＬＡＩＲ１抗体；またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手
可能な抗ヒトＣＤ３０５（ＬＡＩＲ１）抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである
。
一実施形態では、ＦＣＡＲに対する抗原結合性ドメインは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｉｎｃから入手可能な抗体である、ＣＤ８９／ＦＣＡＲＡｎｔｉｂｏｄｙ（型番
１０４１４－Ｈ０８Ｈ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＬＩＬＲＡ２に対する抗原結合性ドメインは、Ａｂｎｏｖａから入手
可能な抗体である、ＬＩＬＲＡ２モノクローナル抗体（Ｍ１７）のクローン３Ｃ７、また
はＬｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－
ＬＩＬＲＡ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（２Ｄ７）の、抗原結合性部分
、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＤ３００ＬＦに対する抗原結合性ドメインは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
から入手可能な抗体である、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－ＣＭＲＦ３５－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅ
ｃｕｌｅ １ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＵＰ－Ｄ２］、またはＲ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な、Ｒａｔ Ａｎｔｉ－ＣＭＲＦ３５－ｌｉｋｅ ｍｏｌ
ｅｃｕｌｅ １ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［２３４９０３］の、抗原結
合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに対する抗原結合性ドメインは、Noordhuis et al.,
“Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugates and
Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody” 53rd ASH Annual Meeting and Exposition, De
cember 10-13, 2011において記載されている抗体である、二特異性Ｔ細胞エンゲージャー
（ＢｉＴＥ）ｓｃＦｖ抗体およびＡＤＣ、およびＭＣＬＡ－１１７（Ｍｅｒｕｓ）の、抗
原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＢＳＴ２（ＣＤ３１７ともまた呼ばれる）に対する抗原結合性ドメイ
ンは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｏｎｌｉｎｅから入手可能な抗体である、Ｍｏｕｓｅ Ａ
ｎｔｉ－ＣＤ３１７ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［３Ｈ４］、またはＲ＆
Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－ＣＤ３１７ ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［６９６７３９］の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲであ
る。
一実施形態では、ＥＭＲ２（ＣＤ３１２ともまた呼ばれる）に対する抗原結合性ドメイ
ンは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な抗体である、Ｍｏｕｓ
ｅ Ａｎｔｉ－ＣＤ３１２ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＬＳ－Ｂ８０３
３］、またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－ＣＤ３１
２ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［４９４０２５］の、抗原結合性部分、例
えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＬＹ７５に対する抗原結合性ドメインは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅから入手可能な抗体である、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉ
gen 75 ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＨＤ３０］、またはＬｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
ａｎｔｉgen 75 ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［Ａ１５７９７］の、抗
原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＧＰＣ３に対する抗原結合性ドメインは、Nakano K, Ishiguro T, Ko
nishi H, et al. Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafti
ng and stability optimization. Anticancer Drugs. 2010 Nov;21(10):907-916において
記載されている抗体であるｈＧＣ３３、またはそれらの３つ全てが、Feng et al., “Gly
pican-3 antibodies: a new therapeutic target for liver cancer.” FEBS Lett. 2014
Jan 21;588(2):377-82において記載されている、ＭＤＸ－１４１４、ＨＮ３、もしくは
ＹＰ７の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＦＣＲＬ５に対する抗原結合性ドメインは、Elkins et al., “FcRL5
as a target of antibody-drug conjugates for the treatment of multiple myeloma”
Mol Cancer Ther. 2012 Oct;11(10):2222-32において記載されている抗ＦｃＲＬ５抗体
の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＦＣＲＬ５に対する抗原
結合性ドメインは、例えば、国際公開第２００１／０３８４９０号パンフレット、国際公
開第２００５／１１７９８６号パンフレット、国際公開第２００６／０３９２３８号パン
フレット、国際公開第２００６／０７６６９１号パンフレット、国際公開第２０１０／１
１４９４０号パンフレット、国際公開第２０１０／１２０５６１号パンフレット、または
国際公開第２０１４／２１００６４号パンフレットにおいて記載されている抗ＦｃＲＬ５
抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、ＩＧＬＬ１に対する抗原結合性ドメインは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な抗体である、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ－ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １ ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＡＴ１Ｇ４］、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから市販されている、
Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ－ｌｉｋｅ ｐｏ
ｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＨＳＬ１１］の、
抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
一実施形態では、抗原結合性ドメインは、上記で列挙した抗体に由来する、１つ、２つ
、３つの（例えば、３つ全ての）重鎖ＣＤＲである、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、
およびＨＣ ＣＤＲ３、ならびに／または上記で列挙した抗体に由来する、１つ、２つ、
３つの（例えば、３つ全ての）軽鎖ＣＤＲである、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、お
よびＬＣ ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗原結合性ドメインは、上記で列挙した抗
体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
別の態様では、抗原結合性ドメインは、ヒト化抗体または抗体断片を含む。一部の態様
では、非ヒト抗体は、ヒト化されており、この場合、ヒトにおいて天然で産生される抗体
またはその断片との類似性を増大させるように、抗体の特異的配列または特異的領域を修
飾する。一態様では、抗原結合性ドメインをヒト化する。
ある実施形態では、ＣＡＲ、例えば、本発明の細胞が発現するＣＡＲの抗原結合性ドメ
インは、ＣＤ１９に結合する。ＣＤ１９は、プロ／プレＢ細胞段階から、終末分化段階で
ある形質細胞段階を経る分化系列全体にわたり、Ｂ細胞上で見出されている。ある実施形
態では、抗原結合性ドメインは、ヒトＣＤ１９に結合するマウスｓｃＦｖドメイン、例え
ば、ＣＴＬ０１９の抗原結合性ドメイン（例えば、配列番号７８９５）である。ある実施
形態では、抗原結合性ドメインは、ヒト化抗体またはヒト化抗体断片、例えば、マウスＣ
ＴＬ０１９ ｓｃＦｖから導出されるｓｃＦｖドメインである。ある実施形態では、抗原
結合性ドメインは、ヒトＣＤ１９に結合するヒト抗体またはヒト抗体断片である。ＣＤ１
９に結合する、例示的なｓｃＦｖドメイン（およびそれらの配列、例えば、ＣＤＲ、ＶＬ
、およびＶＨの配列）を、表１４に提供する。表１４に提供されるｓｃＦｖドメイン配列
は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＶＬとＶＨとは、配列Ｇ
ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６５９４）を含むリンカーにより、例えば、以
下の配向性：ＶＬ－リンカー－ＶＨで接合させる。
Figure 2022137032000448
Figure 2022137032000449
Figure 2022137032000450
表１４に提供されるＣＤ１９抗原結合性ドメインのｓｃＦｖドメインのＣＤＲ配列の配
列を、重鎖可変ドメインについては表１５に示し、軽鎖可変ドメインについては、表１６
に示す。「ＩＤ」とは、各ＣＤＲの、それぞれの配列番号を表す。
Figure 2022137032000451
Figure 2022137032000452
ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ１９抗体、またはその断片、例えば
、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合性ドメインは、表１７に列挙される可変重鎖および
可変軽鎖を含む。可変重鎖と、可変軽鎖とを結合するリンカー配列は、本明細書で記載さ
れるリンカー配列のうちのいずれかの場合もあり、代替的に、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧ
ＥＧＳＴＫＧ（配列番号８１６７）の場合もある。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可
変領域は、例えば、以下の配向性：軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域、または重鎖
可変領域－リンカー－軽鎖可変領域のうちのいずれかにありうる。
Figure 2022137032000453
一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、本明細書で記載される、例えば、表１４
もしくは１５に提供されるＣＤ１９結合性ドメインの、１もしくは複数の（例えば、３つ
全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤ
Ｒ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、および／または本明細書で記
載される、例えば、表１４もしくは１６に提供されるＣＤ１９結合性ドメインの、１もし
くは複数の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補
性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含
む。一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる、
表１６に提供される、任意のアミノ酸配列の、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、および
ＬＣ ＣＤＲ３のうちの、１つ、２つ、または全てと；表１５に提供される、任意のアミ
ノ酸配列の、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３のうちの、１つ、
２つ、または全てとを含む。
一実施形態では、ＣＤ１９の抗原結合性ドメインは、
（ｉ）（ａ）配列番号７９０５のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９０６のＬ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９０７のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；な
らびに
（ｂ）配列番号７８９９のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９００のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９０４のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｉｉ）（ａ）配列番号７９０５のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９０６の
ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９０７のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ならびに
（ｂ）配列番号７８９９のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９０１の
ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９０４のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号７９０５のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９０６
のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９０７のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
；ならびに
（ｂ）配列番号７８９９のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９０２
のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９０４のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
；または
（ｉｖ）（ａ）配列番号７９０５のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９０６の
ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９０７のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ならびに
（ｂ）配列番号７８９９のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９０３の
ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９０４のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
を含む。
一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、本明細書で記載される（例えば、表１４
または１７に）軽鎖可変領域、および／または本明細書で記載される（例えば、表１４ま
たは１７に）重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、表１４
または１７に列挙されるアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施
形態では、ＣＤ１９結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１４もしくは１７に提供
される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例
えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０を超える修飾
（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列、または表１４もしくは
１７に提供されるアミノ酸配列との、９５～９９％の同一性を伴う配列を含む軽鎖可変領
域；および／あるいは表１４もしくは１７に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の、
少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有
するが、３０、２０、もしくは１０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）
は有さないアミノ酸配列、または表１４もしくは１７に提供されるアミノ酸配列に対する
、９５～９９％の同一性を伴う配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、配列番号７８８３；配列番号７８８４、
配列番号７８８５；配列番号７８８６；配列番号７８８７；配列番号７８８８；配列番号
７８８９、配列番号７８９０、配列番号７８９１、配列番号７８９２、配列番号７８９３
、配列番号７８９４、配列番号７８９５、および配列番号７８９８からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列；または前記配列のうちのいずれかに対する、少なくとも１つ、２つ、
もしくは３つの修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、３０、２０、も
しくは１０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列
；または前記配列のうちのいずれかに対する、９５～９９％の同一性を伴う配列を含む。
一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書で記載されるア
ミノ酸配列であって、例えば、表１４または１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を、
本明細書で記載されるアミノ酸配列であって、例えば、表１４または１７のアミノ酸配列
を含む重鎖可変領域へと、リンカー、例えば、本明細書で記載されるリンカーを介して接
合させる。一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカ
ー［配列中、ｎは、１、２、３、４、５、または６、好ましくは３である］（配列番号１
０８０１）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配向
性：軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域、または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変
領域のうちのいずれかにありうる。
当技術分野で公知である、任意のＣＤ１９ ＣＡＲ、例えば、当技術分野で公知である
、任意のＣＤ１９ ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合性ドメインを、本発明に従い使用して、Ｃ
ＡＲを構築することができる。例えば、米国特許第８，３９９，６４５号明細書；米国特
許第７，４４６，１９０号明細書；Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(201
2); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18
):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochende
rfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013); and 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Th
er (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10において記載されているＣＤ１
９ ＣＡＲである、ＬＧ－７４０である。一実施形態では、ＣＤ１９に対する抗原結合性
ドメインは、抗原結合性部分、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１２／０７９０００号パン
フレット；ＰＣＴ国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット；Kochenderfer, J.
N. et al., J. Immunother. 32 (7), 689-702 (2009); Kochenderfer, J.N., et al., Bl
ood, 116 (20), 4099-4102 (2010)；ＰＣＴ国際公開第２０１４／０３１６８７号パンフ
レット；Bejcek, Cancer Research, 55, 2346-2351, 1995；または米国特許第７，４４６
，１９０号明細書において記載されているＣＡＲ、抗体、またはその抗原結合性断片のＣ
ＤＲである。
ある実施形態では、ＣＡＲ、例えば、本発明の細胞が発現するＣＡＲの抗原結合性ドメ
インは、ＢＣＭＡに結合する。ＢＣＭＡは、成熟Ｂリンパ球内で優先的に発現することが
見出されている。ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒトＢＣＭＡに結合するマ
ウスｓｃＦｖドメインである。ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒトＢＣＭＡ
に結合するヒト化抗体またはヒト化抗体断片、例えば、ｓｃＦｖドメインである。ある実
施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒトＢＣＭＡに結合するヒト抗体またはヒト抗体断
片である。ＢＣＭＡに結合する、例示的なｓｃＦｖドメイン（およびそれらの配列、例え
ば、ＣＤＲ、ＶＬ、およびＶＨの配列）を、表１８、表１９、表２０、および表２１に提
供する。表１８および表１９に提供されるｓｃＦｖドメイン配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ
）および重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＶＬとＶＨとは、リンカーにより、例えば、以下
の配向性：ＶＨ－リンカー－ＶＬで接合させる。
Figure 2022137032000454
Figure 2022137032000455
Figure 2022137032000456
Figure 2022137032000457
Figure 2022137032000458
Figure 2022137032000459
Figure 2022137032000460
Figure 2022137032000461
Figure 2022137032000462
Figure 2022137032000463
Figure 2022137032000464
Figure 2022137032000465
Figure 2022137032000466
Figure 2022137032000467
Figure 2022137032000468
Figure 2022137032000469
Figure 2022137032000470
Figure 2022137032000471
Figure 2022137032000472
Figure 2022137032000473
Figure 2022137032000474
Figure 2022137032000475
Figure 2022137032000476
Figure 2022137032000477
複数の実施形態では、ＰＣＴ国際公開第２０１２／０１６３８０５号パンフレット（そ
の内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）によるＶＨ配列および
ＶＬ配列を使用して、さらなる例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物を作出する。複数の実施
形態では、ＰＣＴ国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレット（その内容が、参照
によりその全体において本明細書に組み込まれる）によるＶＨ配列およびＶＬ配列を使用
して、さらなる例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物を作出する。複数の実施形態では、ＰＣ
Ｔ国際公開第２０１４／１２２１４４号パンフレット（その内容が、参照によりその全体
において本明細書に組み込まれる）によるＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、さらなる
例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物を作出する。複数の実施形態では、ＰＣＴ国際公開第２
０１６／０１４７８９号パンフレット（その内容が、参照によりその全体において本明細
書に組み込まれる）によるＣＡＲ分子、ならびに／またはＶＨ配列およびＶＬ配列を使用
して、さらなる例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物を作出する。複数の実施形態では、ＰＣ
Ｔ国際公開第２０１４／０８９３３５号パンフレット（その内容が、参照によりその全体
において本明細書に組み込まれる）によるＣＡＲ分子、ならびに／またはＶＨ配列および
ＶＬ配列を使用して、さらなる例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物を作出する。複数の実施
形態では、ＰＣＴ国際公開第２０１４／１４０２４８号パンフレット（その内容が、参照
によりその全体において本明細書に組み込まれる）によるＣＡＲ分子、ならびに／または
ＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、さらなる例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物を作出す
る。
複数の実施形態では、また、表１９に見出されるＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、
さらなる例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物も作出することができる。表１９にはまた、Ｖ
ＨドメインおよびＶＬドメインと、リンカー配列と、全長ＣＡＲとを含む、例示的なｓｃ
Ｆｖドメインのアミノ酸配列も見出される。
Figure 2022137032000478
ｓｃＦｖドメインのヒトＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについては、表２０に
示し、軽鎖可変ドメインについては、表２１に示す。「ＩＤ」とは、各ＣＤＲの、それぞ
れの配列番号を表す。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔによる定義に従い示されるが、他の慣例法、
例えば、Ｃｈｏｔｈｉａによる定義またはＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａによる定義の組合
せ下におけるＣＤＲも、上記のＶＨ配列およびＶＬ配列に基づき、たやすく推定すること
ができる。
Figure 2022137032000479
Figure 2022137032000480
Figure 2022137032000481
Figure 2022137032000482
Figure 2022137032000483
Figure 2022137032000484
一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、本明細書で記載される、例えば、表１８
、１９、もしくは２１に提供されるＢＣＭＡ結合性ドメインの、１もしくは複数の（例え
ば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（Ｌ
Ｃ ＣＤＲ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、および／または本明
細書で記載される、例えば、表１８、１９、もしくは２０に提供されるＢＣＭＡ結合性ド
メインの、１もしくは複数の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤ
Ｒ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ
ＣＤＲ３）を含む。一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、参照により本明細書
に組み込まれる、表１８に提供される、任意のアミノ酸配列の、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ
ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３のうちの、１つ、２つ、または全てと；表１８に提供さ
れる、任意のアミノ酸配列の、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３
のうちの、１つ、２つ、または全てとを含む。
一実施形態では、ＢＣＭＡ抗原結合性ドメインは、
（ｉ）（ａ）配列番号８４１４のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４５４のＬ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４９４のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；な
らびに
（ｂ）配列番号８２９４のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３３４のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３７４のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｉｉ）（ａ）配列番号８４０４のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４４４の
ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４８４のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ならびに
（ｂ）配列番号８２８４のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３２４の
ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３６４のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号８４０５のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４４５
のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４８５のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
；ならびに
（ｂ）配列番号８２８５のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３２５のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３６５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｉｖ）（ａ）配列番号８４０６のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４４６の
ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４８６のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ならびに
（ｂ）配列番号８２８６のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３２６のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３６６のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｖ）（ａ）配列番号８４０７のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４４７のＬ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４８７のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；な
らびに
（ｂ）配列番号８２８７のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３２７のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３６７のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｖｉ）（ａ）配列番号８４０８のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４４８の
ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４８８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ならびに
（ｂ）配列番号８２８８のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３２８のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３６８のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号８４０９のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４４９
のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４８９のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
；ならびに
（ｂ）配列番号８２８９のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３２９のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３６９のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号８４１０のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４５
０のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４９０のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配
列；ならびに
（ｂ）配列番号８２９０のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３３０のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３７０のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｉｘ）（ａ）配列番号８４１１のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４５１の
ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４９１のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ならびに
（ｂ）配列番号８２９１のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３３１のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３７１のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘ）（ａ）配列番号８４１２のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４５２のＬ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４９２のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；な
らびに
（ｂ）配列番号８２９２のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３３２のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３７２のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｉ）（ａ）配列番号８４１３のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４５３の
ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４９３のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ならびに
（ｂ）配列番号８２９３のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３３３のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３７３のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｉｉ）（ａ）配列番号８４１５のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４５５
のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４９５のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
；ならびに
（ｂ）配列番号８２９５のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３３５のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３７５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｉｉｉ）（ａ）配列番号８４１６のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４５
６のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４９６のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配
列；ならびに
（ｂ）配列番号８２９６のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３３６のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３７６のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｉｖ）（ａ）配列番号８４１７のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４５７
のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４９７のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
；ならびに
（ｂ）配列番号８２９７のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３３７のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３７７のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｖ）（ａ）配列番号８４１８のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４５８の
ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４９８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ならびに
（ｂ）配列番号８２９８のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３３８のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３７８のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｖｉ）（ａ）配列番号８４１９のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４５９
のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８４９９のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
；ならびに
（ｂ）配列番号８２９９のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３３９のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３７９のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｖｉｉ）（ａ）配列番号８４２０のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４６
０のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８５００のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配
列；ならびに
（ｂ）配列番号８３００のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３４０のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３８０のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｖｉｉｉ）（ａ）配列番号８４２１のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４
６１のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８５０１のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸
配列；ならびに
（ｂ）配列番号８３０１のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３４１のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３８１のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｉｘ）（ａ）配列番号８４２２のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４６２
のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８５０２のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
；ならびに
（ｂ）配列番号８３０２のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３４２のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３８２のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｘ）（ａ）配列番号８４２３のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４６３の
ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８５０３のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ならびに
（ｂ）配列番号８３０３のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３４３のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３８３のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｘｉ）（ａ）配列番号８４２４のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４６４
のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８５０４のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
；ならびに
（ｂ）配列番号８３０４のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３４４のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３８４のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｘｉｉ）（ａ）配列番号８４２５のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４６
５のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８５０５のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配
列；ならびに
（ｂ）配列番号８３０５のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３４５のＨ
Ｃ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３８５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列また
は
（ｘｘｉｉｉ）（ａ）配列番号８４２６のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８４
６６のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８５０６のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸
配列；ならびに
（ｂ）配列番号８３０６のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８３
４６のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８３８６のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸
配列
を含む。
一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、本明細書で記載される（例えば、表１８
または１９に）軽鎖可変領域、および／または本明細書で記載される（例えば、表１８ま
たは１９に）重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、表１８
または１９に列挙されるアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施
形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１８もしくは１９に提供
される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例
えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０を超える修飾
（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列、または表１８もしくは
１９に提供されるアミノ酸配列との、９５～９９％の同一性を伴う配列を含む軽鎖可変領
域；および／あるいは表１８もしくは１９に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の、
少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有
するが、３０、２０、もしくは１０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）
は有さないアミノ酸配列、または表１８もしくは１９に提供されるアミノ酸配列に対する
、９５～９９％の同一性を伴う配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、配列番号７９４９；配列番号７９３９、
配列番号７９４０；配列番号７９４１；配列番号７９４２；配列番号７９４３；配列番号
７９４４、配列番号７９４５、配列番号７９４６、配列番号７９４７、配列番号７９４８
、配列番号７９５０、配列番号７９５１、配列番号７９５２、配列番号７９５３、配列番
号８０２９、配列番号８０３０、配列番号８０３１、配列番号８０３２、配列番号８０３
３、配列番号８０３４、配列番号８０３５、配列番号８０３６、配列番号８０３７、配列
番号８０３８、配列番号８０３９、配列番号８０４０、配列番号８０４１、配列番号８０
４２、配列番号８０４３、配列番号８０４４、配列番号８０４５、配列番号８０４６、配
列番号８０４７、配列番号８０４８、配列番号８０４９、配列番号８１６３、配列番号８
１６４、配列番号８１６５および配列番号８１６６；からなる群から選択されるアミノ酸
配列；または前記配列のうちのいずれかに対する、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つ
の修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０を
超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列；または前記
配列のうちのいずれかに対する、９５～９９％の同一性を伴う配列を含む。一実施形態で
は、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書で記載されるアミノ酸配列で
あって、例えば、表１８または１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を、本明細書で記
載されるアミノ酸配列であって、例えば、表１８または１９のアミノ酸配列を含む重鎖可
変領域へと、リンカー、例えば、本明細書で記載されるリンカーを介して接合させる。一
実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカー［配列中、
ｎは、１、２、３、４、５、または６、好ましくは３である］（配列番号１０８０１）を
含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配向性：軽鎖可変
領域－リンカー－重鎖可変領域、または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域のうちの
いずれかにありうる。
当技術分野で公知である、任意のＢＣＭＡ ＣＡＲ、例えば、当技術分野で公知である
、任意のＢＣＭＡ ＣＡＲのＢＣＭＡ抗原結合性ドメインを、本発明に従い使用すること
ができる。例えば、本明細書で記載されているＢＣＭＡ抗原結合性ドメインである。
例示的なＣＡＲ分子
一態様では、ＣＡＲ、例えば、本発明の細胞が発現するＣＡＲは、例えば、ＣＤ１９ま
たはＢＣＭＡなど、本明細書で記載されるＢ細胞抗原に結合する抗原結合性ドメインを含
むＣＡＲ分子を含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９抗原結合性ドメイン（例えば、ＣＤ１９に特異的
に結合する、マウス抗体もしくはマウス抗体断片、ヒト抗体もしくはヒト抗体断片、また
はヒト化抗体もしくはヒト化抗体断片）、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ド
メイン（例えば、共刺激性ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞
内シグナル伝達ドメイン）を含むＣＡＲ分子を含む。
本明細書で記載される、例示的なＣＡＲ分子を、表２２に提供する。表２２のＣＡＲ分
子は、ＣＤ１９抗原結合性ドメイン、例えば、表１４に提供される、任意のＣＤ１９抗原
結合性ドメインのアミノ酸配列を含む。
Figure 2022137032000485
Figure 2022137032000486
Figure 2022137032000487
Figure 2022137032000488
一実施形態では、ＣＡＲ分子は、表２２または参照により本明細書に組み込まれる、２
０１４年３月１５日に出願された、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットの
表３に提供されるアミノ酸配列を含む（例えば、これらからなる）。一実施形態では、Ｃ
ＡＲ分子は、配列番号７９０８、配列番号７９０９、配列番号７９１０、配列番号７９１
１、配列番号７９１２、配列番号７９１３、配列番号７９１４、配列番号７９１５、配列
番号７９１６、配列番号７９１７、配列番号７９１８、配列番号７９１９、もしくは配列
番号７９２０のアミノ酸配列；または配列番号７９０８、配列番号７９０９、配列番号７
９１０、配列番号７９１１、配列番号７９１２、配列番号７９１３、配列番号７９１４、
配列番号７９１５、配列番号７９１６、配列番号７９１７、配列番号７９１８、配列番号
７９１９、もしくは配列番号７９２０のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、３つ、
４つ、５つ、１０、１５、２０、または３０の修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換
）は有するが、６０、５０、または４０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置
換）は有さないアミノ酸配列；または配列番号７９０８、配列番号７９０９、配列番号７
９１０、配列番号７９１１、配列番号７９１２、配列番号７９１３、配列番号７９１４、
配列番号７９１５、配列番号７９１６、配列番号７９１７、配列番号７９１８、配列番号
７９１９、もしくは配列番号７９２０のアミノ酸配列に対して、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、これ
らからなる）。
一態様では、ＣＡＲ、例えば、本発明の細胞が発現するＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する
抗原結合性ドメインを含むＣＡＲ分子を含む、例えば、ＢＣＭＡ抗原結合性ドメイン（例
えば、ＢＣＭＡ、例えば、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、マウス抗体もしくはマウス
抗体断片、ヒト抗体もしくはヒト抗体断片、またはヒト化抗体もしくはヒト化抗体断片）
、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激性ドメインおよ
び／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。
本明細書で記載されるＣＡＲの、例示的なＣＡＲ分子は、表２３もしくは国際公開第２
０１６／０１４５６５号パンフレットの表１に提供されているか、または、そうでなけれ
ば、本明細書で記載される通りである。表２３のＣＡＲ分子は、ＢＣＭＡ抗原結合性ドメ
イン、例えば、表１８または１９に提供される、任意のＢＣＭＡ抗原結合性ドメインのア
ミノ酸配列を含む。
Figure 2022137032000489
Figure 2022137032000490
Figure 2022137032000491
Figure 2022137032000492
Figure 2022137032000493
Figure 2022137032000494
Figure 2022137032000495
Figure 2022137032000496
Figure 2022137032000497
Figure 2022137032000498
Figure 2022137032000499
Figure 2022137032000500
Figure 2022137032000501
Figure 2022137032000502
Figure 2022137032000503
Figure 2022137032000504
Figure 2022137032000505
Figure 2022137032000506
Figure 2022137032000507
Figure 2022137032000508
Figure 2022137032000509
Figure 2022137032000510
Figure 2022137032000511
Figure 2022137032000512
Figure 2022137032000513
Figure 2022137032000514
Figure 2022137032000515
Figure 2022137032000516
Figure 2022137032000517
Figure 2022137032000518
Figure 2022137032000519
一実施形態では、ＣＡＲ分子は、表２３もしくは国際公開第２０１６／０１４５６５号
パンフレットの表１に提供されているか、または、そうでなければ、本明細書で記載され
る通りであるアミノ酸配列を含む（例えば、これらからなる）。一実施形態では、ＣＡＲ
分子は、配列番号８５４９、配列番号８５５０、配列番号８５５１、配列番号８５５２、
配列番号８５５３、配列番号８５５４、配列番号８５５５、配列番号８５５６、配列番号
８５５７、配列番号８５５８、配列番号８５５９、配列番号８５６０、配列番号８５６１
、配列番号８５６２、配列番号８５６３、配列番号８５７９、配列番号８５８０、配列番
号８５８１、配列番号８５８２、配列番号８５８３、配列番号８５８４、配列番号８５８
５、配列番号８５８６、配列番号８５８７、配列番号８５８８、配列番号８５８９、配列
番号８５９０、配列番号８５９１、配列番号８５９２、配列番号８５９３、配列番号８５
９４、配列番号８５９５、配列番号８５９６、配列番号８５９７、配列番号８５９８、ま
たは配列番号８５９９；のアミノ酸配列、または配列番号８５４９、配列番号８５５０、
配列番号８５５１、配列番号８５５２、配列番号８５５３、配列番号８５５４、配列番号
８５５５、配列番号８５５６、配列番号８５５７、配列番号８５５８、配列番号８５５９
、配列番号８５６０、配列番号８５６１、配列番号８５６２、配列番号８５６３、配列番
号８５７９、配列番号８５８０、配列番号８５８１、配列番号８５８２、配列番号８５８
３、配列番号８５８４、配列番号８５８５、配列番号８５８６、配列番号８５８７、配列
番号８５８８、配列番号８５８９、配列番号８５９０、配列番号８５９１、配列番号８５
９２、配列番号８５９３、配列番号８５９４、配列番号８５９５、配列番号８５９６、配
列番号８５９７、配列番号８５９８、または配列番号８５９９；のアミノ酸配列の、少な
くとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、もしくは３０の修飾（例えば
、置換、例えば、保存的置換）を有するが、６０、５０、もしくは４０を超える修飾（例
えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列、または配列番号８５４９、
配列番号８５５０、配列番号８５５１、配列番号８５５２、配列番号８５５３、配列番号
８５５４、配列番号８５５５、配列番号８５５６、配列番号８５５７、配列番号８５５８
、配列番号８５５９、配列番号８５６０、配列番号８５６１、配列番号８５６２、配列番
号８５６３、配列番号８５７９、配列番号８５８０、配列番号８５８１、配列番号８５８
２、配列番号８５８３、配列番号８５８４、配列番号８５８５、配列番号８５８６、配列
番号８５８７、配列番号８５８８、配列番号８５８９、配列番号８５９０、配列番号８５
９１、配列番号８５９２、配列番号８５９３、配列番号８５９４、配列番号８５９５、配
列番号８５９６、配列番号８５９７、配列番号８５９８、または配列番号８５９９のアミ
ノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有す
るアミノ酸配列を含む（例えば、これらからなる）。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、多様な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインへ
と接合させた膜貫通ドメインを含むようにデザインすることができる。膜貫通ドメインは
、膜貫通領域と隣接する、１または複数のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通部が導出さ
れたタンパク質の細胞外領域と関連する、１もしくは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領
域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～１５までのアミノ酸）、および／また
は膜貫通タンパク質が導出されるタンパク質の細胞内領域と関連する、１もしくは複数の
さらなるアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～
１５までのアミノ酸）を含みうる。一態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメイ
ンのうちの１つと関連する膜貫通ドメインである、例えば、一実施形態では、膜貫通ドメ
インは、シグナル伝達ドメイン、共刺激性ドメイン、またはヒンジドメインが導出される
、同じタンパク質に由来しうる。別の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他の任意の
ドメインが導出される、同じタンパク質から導出されない。一部の場合では、膜貫通ドメ
インは、表面膜タンパク質が同じであるかまたは異なる膜貫通ドメインへの、このような
ドメインの結合を回避するように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を
最小化するように、アミノ酸置換により選択または修飾することができる。一態様では、
膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の、別のＣＡＲとのホモ二量体化が可能
である。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞内に存
在する、天然の結合パートナーの結合性ドメインとの相互作用を最小化するように修飾ま
たは置換することができる。
膜貫通ドメインは、天然供給源から導出される場合もあり、組換え供給源から導出され
る場合もある。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または
膜貫通タンパク質から導出されうる。一態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結
合した場合はいつでも、細胞内ドメインへとシグナル伝達することが可能である。本発明
において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、
またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、
ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ
８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のうちの、少なくとも膜貫通領域を含みうる
。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、
ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ
（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡ
ＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０
、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ α、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、
ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、
ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－
１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧ
Ｂ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｓ
ＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣ
ＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、Ｃ
Ｄ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬ
ＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（Ｃ
Ｄ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃのうちの、少なくとも
膜貫通領域を含みうる。
一部の場合には、膜貫通ドメインを、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質に由来するヒン
ジを介して、ＣＡＲ、例えば、ＣＡＲの抗原結合性ドメインの細胞外領域へと接合させる
ことができる。例えば、一実施形態では、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ
（例えば、ＩｇＧ４のヒンジ、ＩｇＤのヒンジ）の場合もあり、ＧＳリンカー（例えば、
本明細書で記載されるＧＳリンカー）の場合もあり、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジの場合もあり
、ＣＤ８ａヒンジの場合もある。一実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号
６６４２のアミノ酸配列を含む（例えば、これからなる）。一態様では、膜貫通ドメイン
は、配列番号６６４４の膜貫通ドメインを含む（例えば、これからなる）。
ある特定の実施形態では、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号６６４４のアミノ
酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾を有するが、２０、１０、もしく
は５を超える修飾は有さない、ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列、または配列番号６
６４４のアミノ酸配列に対する、９５～９９％の同一性を伴う配列を含む。一実施形態で
は、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号６６４４の配列を含む。
他の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、ＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオ
チド配列であって、例えば、配列番号６６４５の配列、またはこれに対して９５～９９％
の同一性を伴う配列を含むヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、コードされる抗原結合性ドメインを、ヒンジ領域によって、
膜貫通ドメインに接続させる。一実施形態では、コードされるヒンジ領域は、ＣＤ８ヒン
ジのアミノ酸配列、例えば、配列番号６６４２；もしくはＩｇＧ４ヒンジのアミノ酸配列
、例えば、配列番号６６３０、または配列番号６６４２もしくは６６３０に対して９５～
９９％の同一性を伴う配列を含む。他の実施形態では、ヒンジ領域をコードする核酸配列
は、それぞれ、ＣＤ８ヒンジもしくはＩｇＧ４ヒンジに対応する、配列番号６６４３もし
くは配列番号６６３１の配列、または配列番号６６４３もしくは６６３１に対して９５～
９９％の同一性を伴う配列を含む。
一態様では、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４のヒンジを含む。例えば、一実施形
態では、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
Figure 2022137032000520
 のヒンジを含む。一部の実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、
Figure 2022137032000521
 のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
一態様では、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤのヒンジを含む。例えば、一実施形態
では、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
Figure 2022137032000522
 のヒンジを含む。一部の実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、
Figure 2022137032000523
 のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
一態様では、膜貫通ドメインは、組換えであることが可能であり、この場合、膜貫通ド
メインは、ロイシンおよびバリンなど、主に、疎水性残基を含むであろう。一態様では、
フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットを、組換え膜貫通ドメ
インの各末端において見出すことができる。
任意選択で、短鎖オリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、２～１０アミ
ノ酸の間の長さは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質領域との間の連結を形成しうる。
グリシン－セリンダブレットは特に、適するリンカーをもたらす。例えば、一態様では、
リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６６３４）のアミノ酸配列を含む。一部の
実施形態では、リンカーは、ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴ
ＴＣＣ（配列番号６６３５）のヌクレオチド配列によりコードされる。
一態様では、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインを有する、本発明の複数の実施形態では、このようなドメ
インは、例えば、一次シグナル伝達ドメイン、および／または共刺激性シグナル伝達ドメ
インのうちの１または複数を含有しうる。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメ
インは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。一部の実施形態では、細胞
内シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では
、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインと、共刺激性シグナル伝達
ドメインとを含む。
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、互いに、ランダムな順序
で連結することもでき、指定された順序で連結することもできる。任意選択で、例えば、
２～１０アミノ酸の間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸
）の長さの、短鎖オリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、細胞内シグナ
ル伝達配列の間の連結を形成しうる。一実施形態では、グリシン－セリンダブレットを、
適するリンカーとして使用することができる。一実施形態では、単一のアミノ酸、例えば
、アラニン、グリシンを、適するリンカーとして使用することができる。
一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインを、２つまたはこれを超える、例えば、２つ
、３つ、４つ、５つ、またはこれを超える共刺激性シグナル伝達ドメインを含むようにデ
ザインする。ある実施形態では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、３つ、４つ、
５つ、またはこれを超える共刺激性シグナル伝達ドメインを、リンカー分子、例えば、本
明細書で記載されるリンカー分子で隔てる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイ
ンは、２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、リンカー分子
は、グリシン残基である。一部の実施形態では、リンカーは、アラニン残基である。
一次シグナル伝達ドメイン
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を、刺激的または阻害的な形
で調節する。刺激的な様態で作用する細胞内一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チ
ロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有
しうる。
本発明で特に有用な、ＩＴＡＭを含有する細胞内一次シグナル伝達ドメインの例は、Ｃ
Ｄ３ゼータ、一般的ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ
（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９
ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２の細胞内一次シグナル伝達ドメインを含
む。一実施形態では、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３
ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態では、コードされる一次シグナル伝達ドメインは、機能的なＣＤ３ゼータシ
グナル伝達ドメインを含む。コードされるＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメインは、配
列番号６６４８、または配列番号６６５０のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、も
しくは３つの修飾を有するが、２０、１０もしくは５を超える修飾は有さないアミノ酸配
列、または配列番号６６４８、または配列番号６６５０のアミノ酸配列に対する、９５～
９９％の同一性を伴う配列を含みうる。一部の実施形態では、コードされる一次シグナル
伝達ドメインは、配列番号６６４８または配列番号６６５０の配列を含む。他の実施形態
では、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号６６４９または配列
番号６６５１の配列、またはこれに対して９５～９９％の同一性を伴う配列を含む。
共刺激性シグナル伝達ドメイン
一部の実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナル
伝達ドメインを含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイ
ンと、共刺激性シグナル伝達ドメインとを含みうる。一部の実施形態では、コードされる
共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｏ
Ｘ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－
１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合
するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ
）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８
アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧ
Ａ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－
６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ
１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、
ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ
／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ
８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９
）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、Ｓ
ＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ
－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ
、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ま
たはＮＫＧ２Ｄのうちの１または複数から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ド
メインを含む。
ある特定の実施形態では、コードされる共刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号６
６４６、または配列番号６６３６のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３
つの修飾を有するが、２０、１０、もしくは５を超える修飾は有さないアミノ酸配列、ま
たは配列番号６６４６、または配列番号６６３６のアミノ酸配列に対する、９５～９９％
の同一性を伴う配列を含む。一実施形態では、コードされる共刺激性シグナル伝達ドメイ
ンは、配列番号６６４６、または配列番号６６３６の配列を含む。他の実施形態では、共
刺激性シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号６６４７、または配列番
号６６３７の配列、またはこれに対して９５～９９％の同一性を伴う配列を含む。
他の実施形態では、コードされる細胞内ドメインは、配列番号６６４６または配列番号
６６３６の配列、および配列番号６６４８または配列番号６６５０の配列を含み、この場
合、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、単一のポリペプチド鎖と同じフレーム内
で発現する。
ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列
番号６６４７もしくは配列番号６６３７の配列、またはこれに対して９５～９９％の同一
性を伴う配列と、配列番号６６４９もしくは配列番号６６５１の配列、またはこれに対し
て９５～９９％の同一性を伴う配列とを含む。
一部の実施形態では、核酸分子は、リーダー配列をさらにコードする。一実施形態では
、リーダー配列は、配列番号６６４０の配列を含む。
一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインと
、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインとを含むようにデザインする。一態様では、細胞内シ
グナル伝達ドメインを、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインと、４－１ＢＢのシグナル
伝達ドメインとを含むようにデザインする。一態様では、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイ
ンは、配列番号６６４６のシグナル伝達ドメインである。一態様では、ＣＤ３ゼータのシ
グナル伝達ドメインは、配列番号６６４８のシグナル伝達ドメインである。
一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインと
、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインとを含むようにデザインする。一態様では、ＣＤ２７
のシグナル伝達ドメインは、ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＲＹＳＣＰＲＥ
ＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ（配列番号６６３６）のアミノ酸配列を含
む。一態様では、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、ＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣ
ＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣ
ＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣ
ＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣ（配列番号６６３７）の核
酸配列によりコードされる。
ベクター
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む
ベクターに関する。一実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プ
ラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベ
クターから選択される。一実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
とりわけ、これらのベクターまたはそれらの部分を使用して、本明細書で記載されるＣＲ
ＩＳＰＲ系を伴う使用のための、本明細書で記載される鋳型核酸を創出することができる
。代替的に、ベクターを使用して、核酸を、ＣＲＩＳＰＲ系と独立に、細胞、例えば、免
疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、同種異系Ｔ細胞へと直接送達することも
できる。
本発明はまた、本発明のＤＮＡを挿入したベクターも提供する。レンチウイルスなどの
レトロウイルスから導出されるベクターは、トランス遺伝子の、長期にわたる、安定的な
組込みと、娘細胞内のその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子移入を達成するの
に適するツールである。レンチウイルスベクターは、それらが、肝細胞などの非増殖性細
胞に形質導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスから導
出されるベクターを上回る、さらなる利点も有する。それらはまた、低免疫原性という、
さらなる利点も有する。レトロウイルスベクターはまた、例えば、ガンマレトロウイルス
ベクターでもありうる。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッ
ケージングシグナル（ψ）、プライマー結合性部位（ＰＢＳ）、１または複数の（例えば
、２つの）長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、および目的のトランス遺伝子、例えば、ＣＡＲ
をコードする遺伝子を含みうる。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、お
よびｅｎｖなど、ウイルスの構造遺伝子を欠く場合がある。例示的なガンマレトロウイル
スベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦ
Ｖ）、および骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、ならびにこれらから導出されるベク
ターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターについては、例えば、Tobias Maetzig e
t al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses.
2011 Jun; 3(6): 677-713において記載されている。
別の実施形態では、所望される本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、ア
デノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、ＣＡＲをコードする核
酸の発現は、スリーピングビューティー、ＣＲＩＳＰＲ、ＣＡＳ９、および亜鉛フィンガ
ーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達することができる。参照により本明細
書に組み込まれる、下記June et al. 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716を
参照されたい。
核酸は、多数種類のベクターへとクローニングすることができる。例えば、核酸は、プ
ラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれ
らに限定されないベクターへとクローニングすることができる。特に目的のベクターは、
発現ベクター、複製ベクター、プローブ作出ベクター、およびシーケンシングベクターを
含む。
本明細書では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ ＣＡＲを産生するための方法が開
示される。本発明はまた、ＣＡＲをコードするＲＮＡ構築物であって、細胞へと直接トラ
ンスフェクトされうるＲＮＡ構築物も含む。トランスフェクションにおける使用のための
ｍＲＮＡを作出するための方法は、３’非翻訳配列および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）
、５’キャップおよび／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、発現させる核酸、
およびポリＡテールを含有する構築物であって、典型的に、５０～２０００塩基の長さ（
配列番号６６３８）の構築物を産生するように、特別にデザインされたプライマー鋳型の
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）に続くポリＡ付加を伴いうる。このようにして産生され
たＲＮＡは、異なる種類の細胞に、効率的にトランスフェクトしうる。一態様では、鋳型
は、ＣＡＲの配列を含む。
ウイルス以外の送達法
一部の態様では、ウイルス以外の方法を使用して、本明細書で記載される、ＣＡＲをコ
ードする核酸を、細胞または組織または対象へと送達することができる。
一部の実施形態では、ウイルス以外の方法は、トランスポゾン（また、転移性エレメン
トとも呼ばれる）の使用を含む。一部の実施形態では、トランスポゾンは、自身を、ゲノ
ム内の位置へと挿入しうるＤＮＡの小片、例えば、自己複製およびそのコピーの、ゲノム
への挿入が可能な、ＤＮＡの小片、または長い核酸からスプライシングし、ゲノム内の別
の場所へと挿入しうる、ＤＮＡの小片である。例えば、トランスポゾンは、転移のための
遺伝子を挟む逆位リピートから作製されるＤＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、ＳＢＴＳを使用する遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ（例えば、亜鉛
フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡ
ＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、または操作メガヌクレアーゼ再操作ホーミングエン
ドヌクレアーゼ）を使用する遺伝子編集との組合せを使用することにより、細胞、例えば
、本明細書で記載されるＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞を作出する。
一部の実施形態では、本発明の細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、本明細
書で記載される、例えば、同種異系Ｔ細胞（例えば、本明細書で記載されるＣＡＲを発現
する）は、細胞を、（ａ）例えば、本明細書で記載される、１または複数のｇＲＮＡ分子
と、１または複数のＣａｓ分子、例えば、本明細書で記載される、例えば、Ｃａｓ９分子
とを含む組成物、および（ｂ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列を
含む核酸（本明細書で記載される鋳型核酸分子など）と接触させることにより作出する。
理論に束縛されずに、上記（ａ）の前記組成物は、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメイ
ンによりターゲティングされるゲノムＤＮＡにおいて、またはその近傍において、切断を
誘導し、（ｂ）の核酸は、組み込まれたら、コードされるＣＡＲ分子が発現するように、
例えば、前記切断において、またはその近傍において、ゲノムへと、部分的にまたは完全
に組み込まれるであろう。複数の実施形態では、ＣＡＲの発現は、ゲノムに対して内因性
のプロモーターまたは他の調節エレメント（例えば、（ｂ）の核酸が挿入された遺伝子か
らの発現を制御するプロモーター）により制御する。他の実施形態では、（ｂ）の核酸は
、組み込まれたら、ＣＡＲの発現が、このプロモーター、および／または他の調節エレメ
ントにより制御されるように、ＣＡＲをコードする配列に作動可能に連結した、例えば、
本明細書で記載されるプロモーター、および／または他の調節エレメント、例えば、ＥＦ
１アルファプロモーターをさらに含む。例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードす
る核酸配列の組込みを方向付ける、例えば、本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
９系の使用に関する、本発明のさらなる特色については、本出願の別の箇所、例えば、遺
伝子挿入および相同組換えに関する節において記載されている。複数の実施形態では、上
記のａ）の組成物は、１または複数のｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを含む組成物である。複
数の実施形態では、固有の標的配列をターゲティングするｇＲＮＡを含むＲＮＰを、細胞
へと、同時に、例えば、１または複数のｇＲＮＡを含むＲＮＰの混合物として導入する。
複数の実施形態では、固有の標的配列をターゲティングするｇＲＮＡを含むＲＮＰを、細
胞へと、逐次的に導入する。
一部の実施形態では、ウイルス以外の送達法の使用は、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮ
Ｋ細胞の再プログラム化と、細胞の、対象への直接的な注入とを可能とする。非ウイルス
ベクターの利点は、患者集団に見合うのに要求される、十分な量を産生することの容易さ
および比較的低廉な費用、保存時の安定性、ならびに免疫原性の欠如を含むがこれらに限
定されない。
阻害性ドメイン
ある実施形態では、ベクターは、ＣＡＲ、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコー
ドする核酸配列と、ｉｎｈＫＩＲの細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＫＩＲ膜
貫通ドメイン；および阻害性細胞質ドメイン、例えば、ＩＴＩＭドメイン、例えば、ｉｎ
ｈＫＩＲＩＴＩＭドメインを含む阻害性分子をコードする核酸配列とを含む。ある実施形
態では、阻害性分子は、自然発生のｉｎｈＫＩＲ、または自然発生のｉｎｈＫＩＲとの、
少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を共有す
るか、もしくはこれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以
下の残基だけ異なる配列である。
ある実施形態では、阻害性分子をコードする核酸配列は、ＳＬＡＭファミリーの細胞質
ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリーの膜貫通ドメイン；および阻害
性細胞質ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリードメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリー
ＩＴＩＭドメインを含む。ある実施形態では、阻害性分子は、自然発生のＳＬＡＭファミ
リーメンバー、または自然発生のＳＬＡＭファミリーメンバーとの、少なくとも５０、６
０、７０、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を共有するか、もしくはこれ
と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以下の残基だけ異なる
配列である。
一実施形態では、ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクター、例えば、本明細書で記
載される核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。一実施形態では、ベクター内の核
酸配列は、ポリ（Ａ）テール、例えば、ポリＡテールをさらに含む。一実施形態では、ベ
クター内の核酸配列は、３’ＵＴＲ、例えば、ヒトベータ－グロブリンから導出される３
’ＵＴＲの、少なくとも１つのリピートを含む、例えば、本明細書で記載される３’ＵＴ
Ｒをさらに含む。一実施形態では、ベクター内の核酸配列は、プロモーター、例えば、Ｔ
２Ａプロモーターをさらに含む。
プロモーター
一実施形態では、ベクターは、プロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、プロ
モーターは、ＥＦ－１プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ－１αプロ
モーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プ
ロモーターから選択される。一実施形態では、プロモーターは、ＥＦ－１プロモーターで
ある。一実施形態では、ＥＦ－１プロモーターは、配列番号６６３９の配列を含む。
ＣＡＲを発現するための宿主細胞
上記で言及した通り、一部の態様では、本発明は、本明細書で記載される核酸分子、Ｃ
ＡＲポリペプチド分子、またはベクターを含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例
えば、細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞の集団）に関する。
本開示のある特定の態様では、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌ
ｌ（商標）分離法など、当業者に公知の、任意の数の技法を使用して対象から回収された
、単位量の血液から得ることができる。好ましい一態様では、個体の循環血液に由来する
細胞を、アフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は典型的に、Ｔ細胞、単球、顆
粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。一態
様では、アフェレーシスにより回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、任意選択
で、細胞を、その後の加工ステップに適切な緩衝液中または培地中に入れることができる
。一実施形態では、細胞を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施
形態では、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠く場合もあり、全てではない
にせよ、多くの二価カチオンを欠く場合もある。
カルシウムの非存在下における初期の活性化ステップは、活性化の拡大をもたらしうる
。当業者がたやすく察知する通り、洗浄ステップは、製造元の指示書に従い、半自動式「
フロースルー」型遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓ
ｏｒ；Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ；またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓ
ａｖｅｒ ５）を使用することによるなど、当業者に公知の方法により達することができ
る。洗浄後、細胞を、例えば、Ｃａ非含有ＰＢＳ、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙ
ｔｅ Ａ、または緩衝液を伴うかもしくは伴わない、他の生理食塩液溶液など、様々な生
体適合性緩衝液中に再懸濁させることができる。代替的に、アフェレーシス試料の、所望
されない成分を除去し、細胞を、培養培地中に直接再懸濁させることもできる。
本出願の方法は、５％またはこれ未満、例えば、２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条
件を活用することが可能であり、公知の培養培地条件および培養組成物、例えば、Smith
et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using th
e novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational I
mmunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31において記載されている、培養培地
条件および培養組成物を援用しうることが認識される。
一態様では、赤血球を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介する遠心分
離、または対向流遠心溶出法により、単球を枯渇させることにより、Ｔ細胞を、末梢血リ
ンパ球から単離する。
本明細書で記載される方法は、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細書で記
載される、例えば、陰性選択法を使用して、例えば、Ｔ調節性細胞枯渇集団であるＴ細胞
の、ＣＤ２５＋枯渇細胞の特異的亜集団の選択を含みうる。Ｔ調節性枯渇細胞集団は、３
０％未満、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％のＣＤ２５
＋細胞を含有することが好ましい。
一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、またはＣＤ２５結合性リガンドで
あるＩＬ－２を使用して、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、集団から除去
する。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、またはＣＤ２５結合性リガン
ドを、基質、例えば、ビーズへとコンジュゲートさせるか、または、他の点では、基質、
例えば、ビーズ上にコーティングする。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはその断片
を、本明細書で記載される基質へとコンジュゲートさせる。
一実施形態では、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）製のＣＤ２５枯渇試薬を使用して、Ｔ調節
性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、集団から除去する。一実施形態では、細胞の、
ＣＤ２５枯渇試薬に対する比は、細胞１×１０７個対２０ｕＬ、または細胞１×１０７個
対１５ｕＬ、または細胞１×１０７個対１０ｕＬ、または細胞１×１０７個対５ｕＬ、ま
たは細胞１×１０７個対２．５ｕＬ、または細胞１×１０７個対１．２５ｕＬである。一
実施形態では、例えば、Ｔ調節性細胞には、例えば、１ｍｌ当たりの細胞５億個を超える
ＣＤ２５＋枯渇を使用する。さらなる態様では、１ｍｌ当たりの細胞６億、７億、８億、
または９億個の濃度を使用する。
一実施形態では、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９個のＣＤ２
５＋ Ｔ細胞を含む。他の複数の態様では、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、
約１×１０９～１×１０１０個、およびこれらの間の任意の整数値のＣＤ２５＋ Ｔ細胞
を含む。一実施形態では、結果として得られるＴ調節性枯渇細胞集団は、２×１０９個ま
たはこれ未満のＴ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞（例えば、１×１０９、５×１０
８、１×１０８、５×１０７、１×１０７、またはこれ未満のＣＤ２５＋細胞）を有する
。
一実施形態では、ＣｌｉｎｉＭＡＣ ｓｙｓｔｅｍを、例えば、チュービング１６２－
０１などの枯渇チュービングセットとともに使用して、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５
＋細胞を、集団から除去する。一実施形態では、ＣｌｉｎｉＭＡＣ ｓｙｓｔｅｍを、例
えば、ＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１など、枯渇設定で作動させる。
特定の理論に束縛されることを望まないが、対象におけるアフェレーシスの前、または
ＣＡＲ発現細胞製品の製造時において、免疫細胞の負の調節因子のレベルを減少させるこ
と（例えば、望ましくない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数を減少させること）は、
対象の再発の危険性を低減しうる。例えば、当技術分野では、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる
方法が公知である。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ
抗体（本明細書で記載される抗ＧＩＴＲ抗体）、ＣＤ２５の枯渇、およびこれらの組合せ
を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、製造法は、ＣＡＲ発現細胞を製造する前に、ＴＲＥＧ細胞の数を
低減すること（例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させること）を含む。例えば、製造法は、Ｃ
ＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）製品を製造する前に、試料、例えば、アフェ
レーシス試料を、例えば、抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体（もしくはその
断片、またはＣＤ２５結合性リガンド）と接触させて、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させるステッ
プを含む。
ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞製品を製造するための細胞を回収する前に、ＴＲＥ
Ｇ細胞を低減する、１または複数の療法で、対象を前処置し、これにより、ＣＡＲ発現細
胞による処置に対する対象の再発の危険性を低減する。ある実施形態では、ＴＲＥＧ細胞
を減少させる方法は、対象への、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５の枯渇
、またはこれらの組合せのうちの１または複数の投与を含むがこれらに限定されない。シ
クロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５の枯渇、またはこれらの組合せのうちの１
または複数の投与は、ＣＡＲ発現細胞製品の注入前、注入時、または注入後に行うことが
できる。
ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞製品を製造するための細胞を回収する前に、シクロ
ホスファミドで、対象を前処置し、これにより、ＣＡＲ発現細胞による処置に対する対象
の再発の危険性を低減する。ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞製品を製造するための細
胞を回収する前に、抗ＧＩＴＲ抗体で、対象を前処置し、これにより、ＣＡＲ発現細胞に
よる処置に対する対象の再発の危険性を低減する。
一実施形態では、除去される細胞集団は、調節性Ｔ細胞でも、腫瘍細胞でもなく、他の
形で、ＣＡＲＴ細胞の拡大および／または機能に負の影響を及ぼす細胞、例えば、ＣＤ１
４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５、または潜在的な免疫抑制性細胞が発現する他のマ
ーカーを発現する細胞である。一実施形態では、このような細胞は、調節性Ｔ細胞および
／または腫瘍細胞と共時的に、もしくは前記枯渇の後に、または別の順序で除去すること
が想定される。
本明細書で記載される方法は、１つを超える選択ステップ、例えば、１つを超える枯渇
ステップを含みうる。陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、例えば、陰性選択される細胞
に固有の表面マーカーを指向する抗体の組合せにより達することができる。１つの方法は
、負磁気による免疫接着、または陰性選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーを指
向するモノクローナル抗体のカクテルを使用するフローサイトメトリーを介する、細胞の
選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するには、
モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－
ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含みうる。
本明細書で記載される方法は、腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例え
ば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、またはＣＤ１１
ｂを発現する集団から細胞を除去し、これにより、ＣＡＲ、例えば、本明細書で記載され
るＣＡＲの発現に適する、Ｔ調節性細胞枯渇集団、例えば、ＣＤ２５＋細胞枯渇集団、お
よび腫瘍抗原枯渇細胞をもたらすステップをさらに含みうる。一実施形態では、腫瘍抗原
を発現する細胞を、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去する。例えば、
抗ＣＤ２５抗体またはその断片と、抗腫瘍抗原抗体またはその断片とを、細胞または抗Ｃ
Ｄ２５抗体もしくはその断片を除去するのに使用しうる、同じ基質、例えば、ビーズへと
接合させることもでき、抗腫瘍抗原抗体またはその断片を、別個のビーズへと接合させ、
これらの混合物を使用して、細胞を除去することもできる。他の実施形態では、Ｔ調節性
細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去と、腫瘍抗原を発現する細胞の除去とは、逐次的で
あり、例えば、いずれの順序でも行うことができる。
また、チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書で記載されるチェックポイント阻害
剤を発現する集団から細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞、およびＴＩＭ３＋
細胞のうちの１または複数を除去し、これにより、Ｔ調節性細胞枯渇集団、例えば、ＣＤ
２５＋枯渇細胞、およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３
＋、および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞をもたらすステップを含む方法も提供される。例
示的なチェックポイント阻害剤は、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４
、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、お
よび／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、お
よびＬＡＩＲ１を含む。一実施形態では、チェックポイント阻害剤を発現する細胞を、Ｔ
調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去する。例えば、抗ＣＤ２５抗体または
その断片と、抗チェックポイント阻害剤抗体またはその断片とを、細胞または抗ＣＤ２５
抗体もしくはその断片を除去するのに使用しうる、同じビーズへと接合させることもでき
、抗チェックポイント阻害剤抗体またはその断片を、別個のビーズへと接合させ、これら
の混合物を使用して、細胞を除去することもできる。他の実施形態では、Ｔ調節性細胞、
例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去と、チェックポイント阻害剤を発現する細胞の除去とは、
逐次的であり、例えば、いずれの順序でも行うことができる。
本明細書で記載される方法は、陽性選択ステップを含みうる。例えば、Ｔ細胞は、所望
されるＴ細胞の陽性選択に十分な時間にわたる、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４
５０ ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）コンジュゲ
ートビーズを伴うインキュベーションにより単離することができる。一実施形態では、時
間は、約３０分間である。さらなる実施形態では、時間は、３０分間～３６時間またはこ
れより長い時間、およびこの間の全ての整数値の範囲である。さらなる実施形態では、時
間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の実施形態では、
時間は、１０～２４時間、例えば、２４時間である。長いインキュベーション時間を使用
して、他の細胞型と比較して、Ｔ細胞が少数である任意の状況であって、腫瘍組織または
免疫障害個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合などの状況において、Ｔ細
胞を単離することができる。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋
Ｔ細胞の捕捉効率も増大させうる。したがって、単に時間を短縮もしくは延長することに
より、Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることもでき、かつ／またはビーズ
のＴ細胞に対する比を増大もしくは減少させる（本明細書でさらに記載される通り）こと
により、培養開始時または工程の他の時点において、Ｔ細胞の亜集団を、正または負に、
優先的に選択することもできる。加えて、ビーズ上または他の表面上の、抗ＣＤ３抗体お
よび／または抗ＣＤ２８抗体の比を増大または減少させることにより、培養開始時または
所望の他の時点において、Ｔ細胞の亜集団を、正または負に、優先的に選択することもで
きる。
一実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－
４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、およびペルフォリン、ま
たは他の適切な分子、例えば、他のサイトカインのうちの１または複数を発現するＴ細胞
集団を選択することができる。細胞の発現についてスクリーニングするための方法は、例
えば、ＰＣＴ国際公開第２０１３／１２６７１２号パンフレットにおいて記載されている
方法により決定することができる。
陽性選択または陰性選択により、所望される細胞集団を単離するために、細胞の濃度お
よび表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変化させることができる。ある特定の態様では
、細胞とビーズとの最大の接触を確保するように、ビーズと細胞とを併せて混合する容量
を、著明に減少させる（例えば、細胞の濃度を増大させる）ことが望ましい。例えば、一
態様では、１ｍｌ当たりの細胞１００億個、１ｍｌ当たり９０億個、１ｍｌ当たり８０億
個、１ｍｌ当たり７０億個、１ｍｌ当たり６０億個、または１ｍｌ当たり５０億個の濃度
を使用する。一態様では、１ｍｌ当たりの細胞１０億個の濃度を使用する。さらなる１つ
の態様では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９
５００万、または１億個からの細胞の濃度を使用する。さらなる複数の態様では、１ｍｌ
当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用することができる。
高濃度の使用は、細胞収量の増大、細胞の活性化、および細胞の拡大を結果としてもた
らしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など、目的の標的抗原の発
現が弱い場合がある細胞、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病性血液
、腫瘍組織など）に由来する細胞の効率的な捕捉を可能とする。このような細胞集団は、
治療的価値を有する可能性があり、得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞
の使用は、正常ではＣＤ２８の発現がより弱いＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可
能とする。
関連する態様では、低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と、表
面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を著明に希釈することにより、粒子と細胞と
の相互作用を最小化する。これにより、粒子に結合する所望の抗原を、高量で発現する細
胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度で
も、ＣＤ８＋ Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一態様では、使用される細胞の濃度は、
５×１０６／ｍｌである。他の複数の態様では、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌ
～１×１０６／ｍｌ、およびこの間の任意の整数値でありうる。
他の複数の態様では、細胞は、２～１０℃または室温のロテーター上、様々な速度で、
様々な長さの時間にわたりインキュベートすることができる。
刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄ステップの後で凍結させることもできる。理論に束縛
されることを望まないが、凍結ステップと、その後における解凍ステップとは、細胞集団
内の顆粒球と、ある程度、単球とを除去することにより、より均一の製品をもたらす。血
漿および血小板を除去する洗浄ステップの後で、細胞を、凍結溶液中に懸濁させることが
できる。当技術分野では、多くの凍結溶液および凍結パラメータが公知であり、この文脈
でも有用であるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯおよび８％のヒト血清アルブミンを
含有するＰＢＳ、または１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％
のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯ、もしくは３１．２５％のＰｌａｓ
ｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％
のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならび
に７．５％のＤＭＳＯを含有する培養物培地、あるいは、例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰ
ｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する、他の適する細胞凍結培地を使用することを伴い、次
いで、細胞を、１分間当たり１°の速度で、－８０℃まで凍結させ、液体窒素式保存タン
クの蒸気相内で保管する。他の制御凍結法のほか、－２０℃または液体窒素中の瞬時非制
御凍結も使用することができる。
ある特定の態様では、低温保存された細胞は、本明細書で記載される通りに解凍し、洗
浄し、室温で１時間にわたり休眠させてから、本発明の方法を使用して活性化させる。
本発明の文脈ではまた、本明細書で記載される拡大細胞が必要とされうる前の時点にお
ける、対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の回収も想定される。したがって、
拡大される細胞の供給源は、必要な任意の時点において回収することができ、Ｔ細胞など
、所望の細胞を、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞療法などの免疫エフェクタ
ー細胞療法から利益を得る、任意の数の疾患または状態のための免疫エフェクター細胞療
法におけるその後の使用のために、単離し、凍結させることができる。一態様では、血液
試料またはアフェレーシスは一般に、健常対象から採取する。ある特定の態様では、血液
試料またはアフェレーシスは一般に、疾患を発症する危険性があるが、いまだ疾患を発症
していない健常対象から採取し、目的の細胞を、その後の使用のために、単離し、凍結さ
せる。ある特定の態様では、Ｔ細胞を拡大し、凍結させ、その後の時点において、使用す
ることができる。ある特定の態様では、試料を、本明細書で記載される特定の疾患につい
ての診断の直後であるが、任意の処置の前に、患者から回収する。さらなる態様では、細
胞を、任意の数の、関与性の処置モダリティーであって、ナタリズマブ、エファリズマブ
、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサー
ト、マイコフェノール酸、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ
３抗体、キトサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフ
ェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８など、抗体または他の免疫除去剤、および照
射などの薬剤による処置を含むがこれらに限定されない処置モダリティーの前に、対象に
由来する血液試料またはアフェレーシスから単離する。
本発明のさらなる態様では、Ｔ細胞を、対象を、機能的Ｔ細胞下に置く処置の直後にお
ける患者から得る。この点で、ある特定のがん処置、特に、免疫系を損なう薬物による処
置後の、患者が通常、処置から回復する期間中である、処置の直後には、得られるＴ細胞
の品質は、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大されるそれらの能力が最適となりうるか、または改善さ
れうることが観察されている。同様に、本明細書で記載される方法を使用する、ｅｘ ｖ
ｉｖｏにおける操作後においても、これらの細胞は、生着の増強およびｉｎ ｖｉｖｏに
おける拡大に好ましい状態にありうる。したがって、本発明の文脈内では、Ｔ細胞、樹状
細胞、または他の造血系細胞を含む血液細胞を、この回復期の間に回収することが想定さ
れる。さらに、ある特定の態様では、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦによる動員）レジメン
およびコンディショニングレジメンを使用して、とりわけ、治療後の規定された時間ウィ
ンドウ内の対象において、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、および／または拡大が
好適となる状態を創出することができる。例示的な細胞型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞
、および免疫系の他の細胞を含む。
一実施形態では、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ分子を発現する免
疫エフェクター細胞を、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を施された対象から得る。ある
実施形態では、免疫エフェクター細胞の集団、例えば、ＣＡＲを発現するように操作され
るＴ細胞を、対象におけるＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル、
もしくはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクタ
ー細胞、例えば、Ｔ細胞の比、または対象から採取されたこれらが、少なくとも一過性に
、増大しているように、十分な時間の後で、または低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の十
分な投与の後で採取する。
他の実施形態では、免疫エフェクター細胞の集団、例えば、ＣＡＲを発現するように操
作されているか、または操作されることになるＴ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細
胞、例えば、Ｔ細胞の数を増大させるか、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例え
ば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増大させる量のｍ
ＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、ｅｘ ｖｉｖｏで処置することができる。
一実施形態では、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロール（diaglycerol）キナーゼ（Ｄ
ＧＫ）を欠損する。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫのＲＮＡもしくはタンパク質を発現しない
か、またはＤＧＫ活性を低減もしくは阻害した細胞を含む。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝子法
、例えば、ＤＧＫの発現を低減または防止する、ＲＮＡ干渉薬剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、
ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することにより作出することができる。代替的に、ＤＧＫ
欠損細胞は、本明細書で記載されるＤＧＫ阻害剤を伴う処置により作出することができる
。
一実施形態では、Ｔ細胞集団は、Ｉｋａｒｏｓを欠損する。Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、
ＩｋａｒｏｓのＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないか、またはＩｋａｒｏｓ活性を低
減もしくは阻害した細胞を含み、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、遺伝子法、例えば、Ｉｋａｒ
ｏｓの発現を低減または防止する、ＲＮＡ干渉薬剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、
ｍｉＲＮＡを投与することにより作出することができる。代替的に、Ｉｋａｒｏｓ欠損細
胞は、Ｉｋａｒｏｓ阻害剤、例えば、レナリドマイドを伴う処置により作出することがで
きる。
複数の実施形態では、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫを欠損し、かつ、Ｉｋａｒｏｓを欠損する
、例えば、ＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓを発現しないか、またはＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓ
の活性を低減もしくは阻害している。このようなＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓ欠損細胞は、
本明細書で記載される方法のうちのいずれかにより作出することができる。
ある実施形態では、ＮＫ細胞を、対象から得る。別の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ
細胞系、例えば、ＮＫ－９２細胞系（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
一部の態様では、本発明の細胞（例えば、本発明の免疫エフェクター細胞、例えば、本
発明のＣＡＲ発現細胞）は、人工多能性幹細胞（「ｉＰＳＣ」）もしくは胚性幹細胞（Ｅ
ＳＣ）であるか、または前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣから発生させた（例えば、こ
れらから分化させた）Ｔ細胞である。ｉＰＳＣは、例えば、当技術分野で公知の方法によ
り、末梢血Ｔリンパ球、例えば、健常ボランティアから単離された末梢血Ｔリンパ球から
発生させることができる。同様に、このような細胞は、当技術分野で公知の方法により、
Ｔ細胞へと分化させることもできる。例えば、それらの各々の内容が、参照によりその全
体において本明細書に組み込まれる、Themeli M. et al., Nat. Biotechnol., 31, pp. 9
28-933 (2013); doi:10.1038/nbt.2678;国際公開第２０１４／１６５７０７号パンフレッ
トを参照されたい。
発現されるさらなる薬剤
別の実施形態では、本明細書で記載される、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は
、別の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現しうる。例えば
、一実施形態では、薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤でありうる。阻害性分子の例は、
例えば、本明細書で記載される、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、Ｃ
ＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡ
Ｍ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、
２Ｂ４、およびＴＧＦベータを含む。一実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、細
胞、例えば、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメインへと、正のシグナルをも
たらす第２のポリペプチドと関連する、第１のポリペプチド、例えば、阻害性分子を含む
。一実施形態では、薬剤は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３
、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡ
ＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６
０、２Ｂ４、もしくはＴＧＦベータなどの阻害性分子、またはこれらのうちのいずれかの
断片の、第１のポリペプチドと、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例
えば共刺激性ドメイン（例えば、本明細書で記載される、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、
またはＣＤ２８）、および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載
される、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む）である、第２のポリペプチドとを
含む。一実施形態では、薬剤は、ＰＤ－１またはその断片の、第１のポリペプチドと、本
明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される、ＣＤ
２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、もしくは４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン、および／また
は本明細書で記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の、第２のポリペプチドと
を含む。複数の実施形態では、薬剤は、阻害性分子の細胞外ドメインの、第１のポリペプ
チドと、本明細書で記載される共刺激性分子または本明細書で記載される一次シグナル伝
達分子の細胞内シグナル伝達ドメインの、第２のポリペプチドとを含む。阻害性分子（例
えば、阻害性分子のドメイン）が、正のシグナルをもたらす分子（例えば、共刺激性分子
または一次シグナル伝達分子のドメイン）と関連する、このような分子については、例え
ば、国際公開第２０１３／０１９６１５号パンフレットにおいてさらに記載されている。
一実施形態では、本明細書で記載される、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、
第２のＣＡＲ、例えば、同じ標的（例えば、上記で記載した標的）または異なる標的に対
する、異なる抗原結合性ドメインを含む、例えば、第２のＣＡＲをさらに含みうる。一実
施形態では、第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲの標的と同じがん細胞型上で発現する標的に
対する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター
細胞は、第１の抗原をターゲティングし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一
次シグナル伝達ドメインは有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲと、
第２の、異なる抗原をターゲティングし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激
性シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲとを
含む。
理論に束縛されることを望まないが、共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、４－１
ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、またはＯＸ－４０を、第１のＣＡＲへと配置し、一次シグナ
ル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータを、第２のＣＡＲへと配置することにより、ＣＡ
Ｒの活性を、両方の標的が発現する細胞へと限定することができる。一実施形態では、Ｃ
ＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、例えば、上記で記載した標的をターゲティング
する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激性ドメインを含む、第１のＣＡ
Ｒと、第１のＣＡＲによりターゲティングされる抗原（例えば、第１の標的と同じがん細
胞型上で発現する抗原）以外の抗原をターゲティングし、抗原結合性ドメイン、膜貫通ド
メイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲとを含む。別の実施形態
では、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、例えば、上記で記載した標的をターゲ
ティングする抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを
含む、第１のＣＡＲと、第１のＣＡＲによりターゲティングされる抗原（例えば、第１の
標的と同じがん細胞型上で発現する抗原）以外の抗原をターゲティングし、抗原に対する
抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激性シグナル伝達ドメインを含む、第
２のＣＡＲとを含む。
一実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、本明細書で記載されるＣ
ＡＲ、例えば、上記で記載した標的に対するＣＡＲと、阻害性ＣＡＲとを含む。一実施形
態では、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、標的もまた発現する正常細胞上で見出され
るが、がん細胞上では見出されない抗原に結合する抗原結合性ドメインを含む。一実施形
態では、阻害性ＣＡＲは、阻害性分子の、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および
細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１
、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ
－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧ
ＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、またはＴＧＦベータの細胞内ドメインでありう
る。
一実施形態では、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、本明細書で
記載される腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメインを含む第１のＣＡＲと、ＰＤ１の細胞
外ドメインまたはその断片を含む第２のＣＡＲとを含む。
一実施形態では、細胞は、上記で記載した阻害性分子をさらに含む。
一実施形態では、細胞内の第２のＣＡＲは、阻害性ＣＡＲであり、この場合、阻害性Ｃ
ＡＲは、阻害性分子の抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含
む。阻害性分子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＶＩ
ＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦベータ、ＣＥ
ＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、およびＣＥＡＣＡＭ－５のうちの１または複数から選
択することができる。一実施形態では、第２のＣＡＲ分子は、ＰＤ１またはその断片の細
胞外ドメインを含む。
複数の実施形態では、細胞内の第２のＣＡＲ分子は、一次シグナル伝達ドメインを含む
細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む
。
他の実施形態では、細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的ド
メインを含む一次シグナル伝達ドメインと、４－１ＢＢの機能的ドメインを含む共刺激性
シグナル伝達ドメインとを含む。
一実施形態では、細胞内の第２のＣＡＲ分子は、配列番号６６５４のアミノ酸配列を含
む。
ある特定の実施形態では、第１のＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含み
、第２のＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含まない。例えば、第１のＣＡ
Ｒ分子の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲ分子の抗原結合性ドメイ
ンは、ラクダ科動物のＶＨＨドメインを含む。
他の複数の態様および複数の実施形態では、本発明の細胞、例えば、ＣＡＲを発現する
ように操作された細胞はまた、適切な場合（例えば、Ｔ細胞が抗腫瘍機能を達した後、ま
たはＴ細胞が致死性の副作用を引き起こしつつある場合）、細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細
胞の枯渇を媒介する分子（または分子のセット）など、安全性のための分子を発現するよ
うにも操作することができる。１つの例示的な態様では、安全性のための分子とは、細胞
の機能に影響を及ぼさないが、別の薬剤、例えば、前記分子をターゲティングする抗体ま
たはＡＤＣ分子によりターゲティングされうる分子である。このような分子についての、
１つの例示的な実施形態は、トランケート型受容体、例えば、受容体の細胞外ドメインお
よび膜貫通ドメインは含むが、受容体の細胞内ドメインの全て、または実質的な部分は欠
く受容体である。例は、例えば、国際公開第２０１１／０５６８９４号パンフレットにお
いて記載されている、トランケート型ＥＧＦＲ受容体である。理論に束縛されずに、前記
トランケート型ＥＧＦＲ受容体の、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブによるターゲ
ティングは、トランケート型ＥＧＦＲ受容体を発現する細胞を枯渇させるであろう。第２
の例は、ｉＣａｓｐ９スイッチポリペプチド、例えば、二量体化ドメイン、任意選択のリ
ンカー、およびカスパーゼドメインを有するポリペプチドであって、哺乳動物の宿主細胞
内、二量体化化合物の存在下で発現させると、ｉＣａｓｐ９スイッチポリペプチドが、ホ
モ二量体化し、宿主細胞のアポトーシスを結果としてもたらすように方向づけられたポリ
ペプチドである。複数の実施形態では、二量体化ドメインは、ＦＫＢＰベースの二量体化
ドメインであり、例えば、配列は、二量体化化合物として作用しうる分子である、ＡＰ１
９０３、およびＡＰ１９０３と構造的に関連するリガンド（ＡＰ２０１８７など）の、空
隙への相補的なはめ込みをもたらす突然変異（Ｆ３７Ｖ）を保有する。このようなｉＣａ
ｓｐ９スイッチポリペプチド（および関連する二量体化化合物）については、例えば、国
際公開第１９９７／０３１８９９号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１／２８６
９８０号明細書、国際公開第２０１４／１６４３４８号パンフレット、国際公開第２０１
３／０４０３７１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／０７１４１４号明細書
、国際公開第２０１４／２５５３６０号パンフレット；およびN Engl J Med. 2011 Nov 3
;365(18):1673-83において記載されている。第３のこのような分子の例は、抗ＣＤ２０抗
体によりターゲティングされる分子であり、この場合、例えば、抗ＣＤ２０抗体（例えば
、リツキシマブ）を投与することにより、前記細胞を枯渇させる。抗ＣＤ２０抗体により
ターゲティングされる分子の例は、ＣＤ２０、およびそのトランケート形（例えば、抗Ｃ
Ｄ２０抗体により認識可能な細胞外ドメイン、膜貫通ドメインを含むが、細胞内ドメイン
のうちの少なくとも一部を欠く分子）を含む。
他の複数の態様および複数の実施形態では、本発明の細胞、例えば、ＣＡＲを発現する
ように操作された細胞を、ＮＫ阻害性分子を発現するようにもまた操作する。本明細書で
使用される「ＮＫ阻害性分子」という用語は、ＮＫ細胞の機能、例えば、細胞溶解機能を
阻害する分子を指す。理論に束縛されずに、１または複数のＭＨＣクラスＩ分子の発現を
低減または消失させた細胞、例えば、本発明の細胞（例えば、本明細書で記載される、Ｂ
２Ｍ、ＮＬＲＣ５、および／またはＣＩＩＴＡをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系の、
前記細胞への導入により、例えば、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、および／またはＣＩＩＴＡの発
現を低減または消失させた）は、ＮＫ細胞により、非自己として認識され、細胞溶解のた
めにターゲティングされうると考えられる。したがって、前記細胞上の、１または複数の
ＮＫ阻害性分子の発現は、前記細胞を、ＮＫ細胞による破壊から保護する。一態様では、
ＮＫ阻害性分子は、ＮＫ阻害性受容体のリガンドである。ＮＫ阻害性受容体の非限定的な
例は、免疫受容体のチロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を有するか、またはこ
れと関連する、ＮＫ細胞の表面受容体を含む。このような受容体の非限定的な例は、２Ｂ
４（ＣＤ２４４としてもまた公知である）；ＮＫ細胞受容体タンパク質１（ＮＫＲ－Ｐ１
）ファミリーのメンバー（例えば、ＮＫＲ－Ｐ１Ａ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｂ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｃ、
ＮＫＲ－Ｐ１Ｄ、ＮＫＲ－Ｐ１Ｅ、およびＮＫＲ－Ｐ１Ｆ、例えば、ＮＫＲ－Ｐ１Ｂ、お
よびＮＫＲ－Ｐ１Ｄ）；癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーのメ
ンバー（例えば、ＣＥＡＣＡＭ１）；シアル酸結合性免疫グロブリン様レクチン（ＳＩＧ
ＬＥＣ）ファミリーメンバー（例えば、ＳＩＧＬＥＣ７およびＳＩＧＬＥＣ９）；白血球
関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；糖タンパク質４９Ｂ１（ｇｐ４９Ｂ１）
またはそのヒト相同体；ＣＤ８１；およびシグナル調節性タンパク質（ＳＩＲＰ）ファミ
リーのメンバーを含む。複数の実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、非ＭＨＣクラスＩ分子
である。ＮＫ阻害性分子の非限定的な例は、前述の受容体のリガンド、例えば、ＣＤ４８
、Ｃ型レクチン関連ファミリーのメンバー（例えば、ＣＬＲ－Ｂ（ＯＣＩＬとしてもまた
公知である）、ＣＬＲ－Ｆ、およびＣＬＲ－Ｇ（ＯＣＩＬｒＰ２としてもまた公知である
））、ＣＥＡＣＡＭ１、シアル酸を提示するポリペプチド、およびアルファＶベータ３イ
ンテグリンを含む。複数の実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、自然発生の分子の断片であ
り、例えば、ＮＫ阻害性分子の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは含むが、細胞内ド
メインの全部または一部は欠く（例えば、細胞内ＩＴＩＭまたは細胞内阻害性ドメインは
欠く）。他の実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、ＨＬＡ－Ｇ分子である。ＨＬＡ－Ｇは、
免疫系、例えば、ＮＫ細胞の機能を停止させるか、または低減することが示されている（
Carosella et al., Advances in Immunol., vol. 127, pp. 33-144, 2015; Torikai H. e
t al., Blood., vol. 122(8), pp. 1341-1349, 2013）。理論に束縛されずに、ＣＡＲ発
現細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、同種異系ＣＡＲ発現細胞、例えば、本
明細書で記載される、例えば、ＴＣＲ、（Ｂ２ＭまたはＮＬＲＣ５）、および／またはＣ
ＩＩＴＡの発現を低減または消失させたＣＡＲ発現細胞表面上の、ＨＬＡ－Ｇの存在は、
細胞を、ＮＫ細胞による攻撃から保護しうる。複数の実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、
Ｂ２Ｍを要求しないＨＬＡ－Ｇのアイソフォーム、例えば、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３
、ＨＬＡ－Ｇ４である。このような複数の実施形態は、例えば、本明細書で記載される、
本発明の細胞に対して好ましく、Ｂ２Ｍの機能および／または発現を阻害する薬剤または
系（例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含む。代替的
に、例えば、本明細書で記載される、本発明の細胞が、Ｂ２Ｍの機能および／または発現
を阻害する薬剤または系（例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓ系）を含む（または、任意の時点において、これを含んだ）、他の実施形態（すなわち
、例えば、本明細書で記載される、Ｂ２Ｍの機能および／または発現を低減したか、また
は消失させた細胞）では、ＮＫ阻害性分子が、Ｂ２Ｍ分子との融合体を含むという条件で
、ＮＫ阻害性分子は、天然の条件下でＢ２Ｍとの複合体を形成する、ＨＬＡ－Ｇ分子であ
りうる。当技術分野では、このような融合体、およびそれらを創出するための方法が公知
である。例えば、Favier B, HoWangYin K-Y, Wu J, Caumartin J, Daouya M, et al. (20
11) Tolerogenic Function of Dimeric Forms of HLA-G Recombinant Proteins: A Compa
rative Study In Vivo. PLoS ONE 6(7): e21011. doi:10.1371/journal.pone.0021011を
参照されたい。このような実施形態では、ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合分子をコードする遺伝
子が、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡ分子の標的配列を含む、Ｂ２Ｍコード配列を
含む程度において、ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合体の発現および／または機能を、低減するか
、または消失させないよう、ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合体をコードする核酸への、ｇＲＮＡ
の結合を低減するか、または消失させるように、前記核酸の配列を変更することができる
。複数の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合体は、膜貫通ドメインまたは膜アンカー
分子（ＧＰＩアンカーなど）の接合に適する配列をさらに含みうる。例示的なＨＬＡ－Ｇ
：Ｂ２Ｍ融合分子（例えば、ＨＬＡ－Ｇ１：Ｂ２Ｍ融合分子）を、下記に提供する（（Ｇ
４Ｓ）３リンカー（配列番号６５９４）を、グレーで強調する）。リンカーは、存在する
場合もあり、非存在の場合もあり、代替的に、例えば、本明細書で記載される、任意のペ
プチドリンカーも含みうる。この特定の構築物は、Ｂ２Ｍ－リンカー（（Ｇ４Ｓ）３）－
ＨＬＡ－Ｇのフォーマット：
Figure 2022137032000524
 を有する。
上記のＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合分子をコードする、例示的なコドン最適化核酸配列を下記
に提供する：
Figure 2022137032000525
Ｂ２Ｍ配列と組み合わせてもよい、またはＢ２Ｍ配列を伴わずに使用してもよい、別の例
示的なＨＬＡ－Ｇ分子を下記に提供する（任意選択のリーダー配列を、グレーで強調する
）：
Figure 2022137032000526
ＮＫ阻害性分子が、Ｂ２Ｍを要求し、１または複数のＨＬＡクラスＩ分子の発現を低減
するか、または消失させることが望ましい、他の実施形態では、ＮＬＲＣ５（ヒトＮＬＲ
Ｃ５：Ｅｎｔｒｅｚ ８４１６６；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ８６ＷＩ３）またはその調節エレ
メントの標的配列に相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ、例えば、表１に列
挙されるターゲティングドメインであって、ＮＬＲＣ５に対するターゲティングドメイン
を含むｇＲＮＡ（またはこのようなターゲティングドメインの断片、例えば、表１に列挙
されるこのようなターゲティングドメインであって、ＮＬＲＣ５に対するターゲティング
ドメインの、３’側の２０ヌクレオチド；例えば、配列番号８６２２～配列番号１００８
９のうちのいずれか１つ、またはその断片（例えば、３’側の２０ヌクレオチドの断片）
を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば
、本明細書で記載される）を使用することができる。理論に束縛されずに、ＮＬＲＣ５の
発現および／または機能の低減または消失は、Ｂ２Ｍの存在下であってもなお、１または
複数のＭＨＣクラスＩ分子の発現および／または機能を低減するか、または消失させると
考えられる。例えば、Downs, I., Vijayan, S., Sidiq, T. and Kobayashi, K. S. (2016
), CITA/NLRC5: A critical transcriptional regulator of MHC class I gene expressi
on. BioFactors, 42: 349-357. doi:10.1002/biof.1285を参照されたい。
他の実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、ＨＬＡ－Ｇの膜結合性アイソフォーム、例えば
、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、および／またはＨＬＡ－Ｇ４である。他
の実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、ＨＬＡ－Ｇの可溶性アイソフォーム、例えば、ｓＨ
ＬＡ－Ｇ１（解離型）、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６、および／またはＨＬＡ－Ｇ７であ
る。複数の実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、およびＨＬ
Ａ－Ｇ４のうちの１または複数から選択される。ある実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、
ＨＬＡ－Ｇ２である。
他の実施形態では、ＮＫ阻害性分子は、ＨＬＡ－Ｅ分子である。ＨＬＡ－Ｅは、ＨＬＡ
クラスＩ陰性細胞に対するＮＫ細胞の機能を停止させるか、または低減することが示され
ている（Torikai H. et al., Blood., vol. 122(8), pp. 1341-1349, 2013）。理論に束
縛されずに、ＣＡＲ発現細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、同種異系ＣＡＲ
発現細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＴＣＲ、（Ｂ２ＭまたはＮＬＲＣ５
）、および／またはＣＩＩＴＡの発現を低減または消失させたＣＡＲ発現細胞の表面上の
、ＨＬＡ－Ｅの存在は、細胞を、ＮＫ細胞による攻撃から保護しうる。ある実施形態では
、ＮＫ阻害性分子は、ＨＬＡ－Ｇ分子およびＨＬＡ－Ｅ分子である。
本発明の細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、本発明のＣＡＲ発現細胞を、
ＮＫ阻害性分子を発現するように操作する、複数の実施形態では、前記ＮＫ阻害性分子（
本明細書において「ＮＫ阻害性分子の標的」と称する）の、１または複数のリガンドまた
は結合パートナーの発現および／または機能を低減するか、または消失させるように、細
胞を、さらに操作することができる。理論に束縛されずに、ＮＫ阻害性分子の標的の発現
および／または機能、例えば、表面発現の低減または消失は、ＮＫ阻害性分子の発現によ
る、目的の細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、本発明のＣＡＲ発現細胞の阻
害を低減または回避し、これにより、本発明の細胞、例えば、本明細書で記載される、例
えば、本発明のＣＡＲ発現細胞の機能を改善すると考えられる。他の実施形態では、ＮＫ
阻害性分子の結合時に、阻害シグナルが伝搬しないように、ＮＫ阻害性分子の標的の、ド
ミナントネガティブの突然変異体または断片、例えば、細胞内阻害性ドメイン（例えば、
１または複数のＩＴＩＭドメイン）を修飾するか、または消失させた（部分的または完全
に）、ＮＫ阻害性分子の標的を発現させることにより、目的の細胞、例えば、本明細書で
記載される、例えば、本発明のＣＡＲ発現細胞内の、ＮＫ阻害性分子の阻害効果を低減す
るか、または消失させることができる。ＮＫ阻害性分子が、例えば、本明細書で記載され
る、ＨＬＡ－Ｇ分子である、複数の実施形態では、ＮＫ阻害性分子の標的は、ＬＩＬＲＢ
１（例えば、ヒトＬＩＬＲＢ１：Ｅｎｔｒｅｚ：１０８５９；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ８ＮＨ
Ｌ６）である。複数の実施形態では、ＮＫ阻害性分子の標的、例えば、ＬＩＬＲＢ１の発
現および／または機能の低減または消失は、ＮＫ阻害性分子の標的の核酸阻害剤（例えば
、ＬＩＬＲＢ１に特異的なｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子）を導入することにより達せ
られる。他の実施形態では、ＮＫ阻害性分子の標的、例えば、ＬＩＬＲＢ１の発現および
／または機能の低減または消失は、ＮＫ阻害性分子の標的、例えば、ＬＩＬＲＢ１の発現
および／または機能を低減するか、または消失させるように、遺伝子編集系、例えば、本
明細書で記載される、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系であって、ＮＫ阻害性
分子の標的の遺伝子内またはその調節エレメント内の標的配列を認識する（例えば、ＬＩ
ＬＲＢ１遺伝子内またはその調節エレメント内の標的配列を認識する）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ
ａｓ遺伝子編集系を導入することにより達せられる。ＮＫ阻害性分子の標的がＬＩＬＲＢ
１である、複数の実施形態では、遺伝子編集系は、例えば、本明細書で記載されるＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓ系であって、表６ｄに列挙されるターゲティングドメインを含む（または
、本明細書で記載される通り、表６ｄに列挙されるターゲティングドメインの断片、例え
ば、２０ヌクレオチドの断片、例えば、３’側の２０ヌクレオチドを含む）ｇＲＮＡ分子
を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。
複数の実施形態および複数の態様では、本発明は、例えば、ＮＫ阻害性分子を、例えば
、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸であって、細胞内で作動可能なプロモーターに作動可
能に連結した核酸を含む前記細胞内で発現するように、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸
を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（または前記細胞の集団）に関する。複数の
実施形態では、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲをコードするさらなる配
列を含む。複数の実施形態では、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸配列と、ＣＡＲをコー
ドする核酸配列とを、本明細書で記載される通り、個別のプロモーターに作動可能に連結
する。他の実施形態では、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸配列と、ＣＡＲをコードする
核酸配列とを、任意選択で、２つの分子をコードする配列の間に配置される切断型ペプチ
ド（例えば、２Ａペプチド）をコードする配列と共に、単一のプロモーターから発現する
。
本発明の細胞、例えば、ＣＡＲを発現するように操作された細胞は、上記で記載したさ
らなる分子のうちの１つを超えるものを発現するように操作することもできる。複数の実
施形態では、細胞を、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ、ｉＣａｓｐ９スイッチポリ
ペプチド、およびＮＫ阻害性分子を発現するように操作する。
複数の実施形態および複数の態様では、本発明の細胞、例えば、免疫エフェクター細胞
（または前記細胞の集団）、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ分
子の標的抗原（例えば、本明細書で記載される標的抗原）を含むタンパク質の発現を低減
するか、または消失させている。ＣＡＲ分子の標的抗原を含むタンパク質の発現の、この
ような低減または消失は、例えば、遺伝子編集系、例えば、例えば、本明細書で記載され
るＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系（例えば、前記遺伝子内の標的配列に相補的なｇＲＮＡ分子
を含む）を使用して、標的抗原を含む前記タンパク質をコードする遺伝子配列（またはそ
の調節エレメント）内に突然変異（例えば、インデル）を導入することの影響を受ける場
合がある。理論に束縛されずに、ＣＡＲ分子の標的抗原を含むタンパク質の発現の低減ま
たは消失は、前記ＣＡＲ発現細胞を、自己認識および／または自己攻撃から保護しうる。
複数の実施形態では、前記ＣＡＲ分子の標的抗原を含むタンパク質の発現の低減または消
失は、前記ＣＡＲ分子の標的抗原を含むタンパク質の、休眠細胞内、例えば、休眠Ｔ細胞
内の発現と比べたものである。他の実施形態では、前記ＣＡＲ分子の標的抗原を含むタン
パク質の発現の低減または消失は、活性化細胞内、例えば、活性化Ｔ細胞内、例えば、Ｃ
Ｄ３および／もしくはＣＤ２８による刺激により、またはＣＡＲ分子のシグナル伝達を介
する活性化により活性化させたＴ細胞内の前記ＣＡＲ分子の標的抗原を含むタンパク質の
発現と比べたものである。
スプリットＣＡＲ
一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣ
ＡＲ法については、国際公開第２０１４／０５５４４２号パンフレットおよび国際公開第
２０１４／０５５６５７号パンフレットにおいてより詳細に記載されている。略述すると
、スプリットＣＡＲ系は、第１の抗原結合性ドメインと、共刺激性ドメイン（例えば、４
１ＢＢ）とを有する、第１のＣＡＲを発現する細胞を含み、細胞はまた、第２の抗原結合
性ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）とを有する、第２
のＣＡＲも発現する。細胞が、第１の抗原に遭遇すると、共刺激性ドメインが活性化し、
細胞が増殖する。細胞が、第２の抗原に遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性
化し、細胞殺滅活性が始動する。したがって、ＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下に
限り、完全に活性化する。
複数のＣＡＲの発現
一態様では、本明細書で記載されるＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＡＲ、例えば、同じ標
的、または異なる標的（例えば、本明細書で記載されるがん関連抗原以外の標的、または
本明細書で記載される、異なるがん関連抗原）に対する、異なる抗原結合性ドメインを含
む、例えば、第２のＣＡＲをさらに含みうる。一実施形態では、第２のＣＡＲは、がん関
連抗原と同じがん細胞型上で発現する標的に対する抗原結合性ドメインを含む。一実施形
態では、ＣＡＲ発現細胞は、第１の抗原をターゲティングし、共刺激性シグナル伝達ドメ
インを有するが、一次シグナル伝達ドメインは有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含
む第１のＣＡＲと、第２の、異なる抗原をターゲティングし、一次シグナル伝達ドメイン
を有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含
む第２のＣＡＲとを含む。理論に束縛されることを望まないが、共刺激性シグナル伝達ド
メイン、例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、またはＯＸ－４０を、第１のＣＡＲ
へと配置し、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータを、第２のＣＡＲへと配
置することにより、ＣＡＲの活性を、両方の標的が発現される細胞へと限定することがで
きる。一実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、本明細書で記載される標的抗原に結合
する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激性ドメインを含む、第１のがん
関連抗原のＣＡＲと、異なる標的抗原（例えば、第１の標的抗原と同じがん細胞型上で発
現する抗原）をターゲティングし、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シ
グナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲとを含む。別の実施形態では、ＣＡＲを発現す
る細胞は、本明細書で記載される標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイ
ン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、第１のＣＡＲと、第１の標的抗原（例えば
、第１の標的抗原と同じがん細胞型上で発現する抗原）以外の抗原をターゲティングし、
抗原に対する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激性シグナル伝達ドメイ
ンを含む、第２のＣＡＲとを含む。
一部の実施形態では、特許請求される発明は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含み
、前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲのうちの１つの抗原結合性ドメインは、可変
軽ドメインおよび可変重ドメインを含まない。一部の実施形態では、前記第１のＣＡＲお
よび前記第２のＣＡＲのうちの１つの抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖであり、他の抗原
結合性ドメインは、ｓｃＦｖではない。一部の実施形態では、前記第１のＣＡＲおよび前
記第２のＣＡＲのうちの１つの抗原結合性ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラク
ダ科動物、サメ、もしくはヤツメウナギの単一ＶＨドメイン、またはヒト配列もしくはマ
ウス配列から導出される単一ＶＨドメインを含む。一部の実施形態では、前記第１のＣＡ
Ｒおよび前記第２のＣＡＲのうちの１つの抗原結合性ドメインは、ナノボディーを含む。
一部の実施形態では、前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲのうちの１つの抗原結合
性ドメインは、ラクダ科動物のＶＨＨドメインを含む。
テロメラーゼの発現
いかなる特定の理論によっても束縛されることを望まないが、一部の実施形態では、治
療用Ｔ細胞は、Ｔ細胞内のテロメアの短縮に起因して、患者において、短期の残留性を有
し、したがって、テロメラーゼ遺伝子のトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを延
長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善しうる。Carl June, “Adoptive T cell thera
py for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476
(2007)を参照されたい。したがって、ある実施形態では、免疫エフェクター細胞、例えば
、Ｔ細胞は、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、
例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを、異所的に発現する。一部の態様では、本開示
は、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法であって、細胞を、テロメラーゼサブユニット、例え
ば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコー
ドする核酸と接触させるステップを含む方法を提供する。細胞は、ＣＡＲをコードする構
築物と接触させる前に、核酸と接触させることもでき、これと同時に接触させることもで
き、この後で接触させることもできる。
１つを超える分子を発現するように細胞を操作する、複数の実施形態では、前記分子の
各々をコードする配列（例えば、ＣＡＲをコードする配列、およびＮＫ阻害性分子をコー
ドする配列）を、同じ核酸分子上、例えば、同じプラスミド上またはベクター上、例えば
、ウイルスベクター上、例えば、レンチウイルスベクター上に配置することができる。あ
る実施形態では、（ｉ）本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列と、（ｉｉ）本明
細書で記載されるＮＫ阻害性分子をコードする配列とは、同じ核酸上、例えば、ベクター
上に存在しうる。対応するタンパク質の産生は、例えば、個別のプロモーターの使用によ
り達成することもでき、バイシストロニックの転写産物の使用により達成することもでき
る（単一の翻訳産物の切断により、または２つの個別のタンパク質産物の翻訳により、２
つのタンパク質の産生を結果としてもたらしうる）。ある実施形態では、切断型ペプチド
をコードする配列、例えば、Ｐ２Ａ配列、Ｔ２Ａ配列、またはＦ２Ａ配列を、（ｉ）と（
ｉｉ）との間に配置する。ある実施形態では、ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳま
たはＥＶ７１ ＩＲＥＳをコードする配列を、（ｉ）と（ｉｉ）との間に配置する。これ
らの複数の実施形態では、（ｉ）と（ｉｉ）とは、単一のＲＮＡとして転写される。他の
複数の態様では、各分子を、異なるプロモーターから発現させることもできる。ある実施
形態では、（ｉ）と（ｉｉ）とが、個別のＲＮＡとして転写されるように、第１のプロモ
ーターを、（ｉ）に作動可能に連結し、第２のプロモーターを、（ｉｉ）に作動可能に連
結する。
代替的に、１つを超える分子をコードする配列を、異なる核酸分子上、例えば、異なる
プラスミド上またはベクター上、例えば、ウイルスベクター上、例えば、レンチウイルス
ベクター上に配置することもできる。例えば、（ｉ）本明細書で記載されるＣＡＲをコー
ドする配列は、第１の核酸上、例えば、第１のベクター上に存在することが可能であり、
（ｉｉ）ＮＫ阻害性分子をコードする配列は、第２の核酸上、例えば、第２のベクター上
に存在しうる。
Figure 2022137032000527
Figure 2022137032000528
Figure 2022137032000529
Figure 2022137032000530
Figure 2022137032000531
ＶＩ．細胞
別の態様では、本発明は、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載される、１もしくは
複数のｇＲＮＡ分子、または本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ系を含むか、または、任
意の時点において、これらを含んだ細胞を提供する。ある実施形態では、細胞は、変更さ
れている、例えば、ｇＲＮＡ分子によりターゲティングされる標的配列は、例えば、本明
細書で記載されるｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）、または、
例えば、本明細書で記載される方法により変更された、本明細書で記載されるＣＲＩＳＰ
Ｒ系（または前記ＣＲＩＳＰＲ系の１もしくは複数の構成要素をコードする核酸）の導入
により、インデルを創出するように変更されている。ある実施形態では、変更は、結果と
して、標的部位を含む遺伝子の、機能的な（例えば、野生型）遺伝子産物の発現の低減を
もたらす、または発現をもたらさない。
一態様では、細胞は、動物細胞である。複数の実施形態では、細胞は、哺乳動物、霊長
類、またはヒト細胞である。複数の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。複数の実施
形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）、例
えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。複数の実施形態では、Ｔ細胞（例えば、Ｔ細胞の集
団）は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合せであるか、または
これらを含む。複数の実施形態では、細胞は、自家である。複数の実施形態では、細胞は
、同種異系である。
好ましい実施形態では、細胞（例えば、細胞集団）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
例えば、Ｖ節で記載したＣＡＲを発現するように操作されているか、または操作されるこ
とになる。複数の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ ＣＡ
Ｒを発現するように操作される。複数の実施形態では、ＣＡＲ操作細胞は、同種異系であ
る。複数の実施形態では、ＣＡＲ操作細胞は、自家である。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載される、第２のｇＲＮＡ分子、例えば、第１
のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインと異なるターゲティングドメインを伴う、第２
のｇＲＮＡ分子を含むか、任意の時点において、これを含んだか、またはこれを含むこと
になる、上記で記載した細胞などの細胞を提供する。複数の実施形態では、２つのｇＲＮ
Ａ分子は、同じ遺伝子内の標的部位に相補的である、例えば、同じ同種異系Ｔ細胞標的に
ついて、遺伝子内の２つの標的部位に相補的である、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子内の、２つ
の標的部位を含む。このような細胞は、本明細書のＶＩＩＩ節で記載される、２つのｇＲ
ＮＡ分子の標的部位の間に位置するＤＮＡの、大型の、例えば、２０～６０、２０～７０
、２０～８０、２０～９０、２０～１００、または１０００を超える、２０００を超える
、３０００を超える、４０００を超える、５０００を超える、６０００を超える塩基対の
切出しを含みうる。代替的に、同じ遺伝子の標的配列をターゲティングする２つのｇＲＮ
Ａは、切出しをもたらしえない代わりに、例えば、標的部位の各々において、またはその
近傍において、インデルを創出しうる。他の実施形態では、２つまたはこれを超えるｇＲ
ＮＡ分子は、それらの遺伝子産物が会合して、分子複合体を形成する、２つの異なる遺伝
子内の標的部位に相補的である。このような実施形態の例は、ＴＲＡＣをターゲティング
する、第１のｇＲＮＡ分子、およびＴＲＢＣ１をターゲティングする、第２のｇＲＮＡ分
子である（この場合、ＴＣＲアルファ定常鎖およびＴＣＲベータ定常鎖１のいずれも、細
胞表面上のＴＣＲの構成要素である）。理論に束縛されずに、同じ遺伝子の、２つもしく
はこれを超える標的配列をターゲティングするか、または同じ分子複合体の、２つもしく
はこれを超える遺伝子をターゲティングする（例えば、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ１をター
ゲティングする場合）ＣＲＩＳＰＲ系を導入することにより、標的遺伝子産物の発現の、
標的遺伝子の、単一の標的配列だけをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系の導入と比べた
、さらなる低減または消失をもたらすことができる。
異なる遺伝子（または例えば、ＴＣＲおよびＢ２Ｍをターゲティングする場合における
、異なる分子複合体）の、２つまたはこれを超える標的部位をターゲティングする、本発
明の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、異なる遺伝子（または分子
複合体）標的のうちのいずれかまたは全てについて、前記異なる遺伝子または異なる分子
複合体のうちの１または複数に関して２つ以上のｇＲＮＡを援用しうると理解されるであ
ろう。例えば、ＴＣＲの発現およびＢ２Ｍの発現を、低減するか、または消失させる、複
数の実施形態および複数の態様では、ＴＣＲの発現の低減または消失を、例えば、ＴＲＡ
Ｃをターゲティングする、１つのｇＲＮＡにより達することもでき、ＴＲＡＣをターゲテ
ィングする、１つを超えるｇＲＮＡ分子により達することもでき、ＴＲＡＣをターゲティ
ングする、１つのｇＲＮＡ分子と、異なるＴＣＲの構成要素、例えば、ＴＲＢＣ１をター
ゲティングする、第２のｇＲＮＡとにより達することもできる一方で、同時に、または代
替的に、Ｂ２Ｍのターゲティングは、例えば、Ｂ２Ｍをターゲティングする、１つのｇＲ
ＮＡ分子により達することもでき、Ｂ２Ｍをターゲティングする、２つまたはこれを超え
るｇＲＮＡ分子により達することもできる。
他の実施形態では、２つまたはこれを超える、例えば、２つのｇＲＮＡ分子は、異なる
遺伝子内の標的部位に相補的である。このような細胞は、１つを超える遺伝子の機能的遺
伝子産物の発現を低減するか、または消失させるように、各標的部位において、またはこ
の近傍において、変更、例えば、インデルを含みうる。上記で論じた通り、このような複
数の実施形態では、異なる遺伝子の各々へとターゲティングされた、１つを超えるｇＲＮ
Ａ分子を援用することができる。
複数の実施形態では、細胞は、同種異系Ｔ細胞標的の標的配列と相補的なターゲティン
グドメイン（例えば、表１、３、４、または５に記載されているターゲティングドメイン
）を含む、第１のｇＲＮＡ分子と、阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達
の下流のエフェクターの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む（例えば、表
２または表６に記載されているターゲティングドメインを含む）、第２のｇＲＮＡ分子と
を含むか、含んでいるか、または含むことになる。複数の実施形態では、阻害性分子、ま
たは阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターは、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ
２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣ
ＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬ
Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（
ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０
７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、
およびＴＧＦベータ、またはＰＴＰＮ１１である。
複数の実施形態では、細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ２４７、ＣＤ
３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、
第１のｇＲＮＡ分子と、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－
Ｃの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子とを含むか
、含んでいるか、または含むことになる。
複数の実施形態では、本発明の細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ２４
７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇの標的配列と相補的なターゲティングドメイン
を含む、第１のｇＲＮＡ分子と；Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、または
ＨＬＡ－Ｃの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子と
；ＣＩＩＴＡの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、第３のｇＲＮＡ分子
とを含むか、含んでいるか、または含むことになる。理論に束縛されずに、例えば、Ｂ２
Ｍに対するｇＲＮＡ、またはＮＬＲＣ５に対するｇＲＮＡを援用する、本明細書で記載さ
れる方法により、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を低減するか、または消失させることは、改
変細胞に、１または複数のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を上方調節させうると考えられる
。このような状況下で、例えば、宿主対移植片病応答を回避することが可能な同種異系細
胞（例えば、同種異系Ｔ細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する同種異系
Ｔ細胞）を創出するためには、例えば、ＣＩＩＴＡに対するｇＲＮＡを援用する、本明細
書で記載される方法により、１または複数のＭＨＣクラスＩＩ分子（１または複数のＭＨ
ＣクラスＩ分子に加えて）の発現を低減するか、または消失させることが有益でありうる
。一実施形態では、細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲ発現細胞は、
例えば、本明細書で記載される、ＴＲＡＣに対する、第１のｇＲＮＡと、例えば、本明細
書で記載される、Ｂ２Ｍに対する、第２のｇＲＮＡと、例えば、本明細書で記載される、
ＣＩＩＴＡに対する、第３のｇＲＮＡとを含むか、含んでいるか、または含むことになる
。一実施形態では、細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲ発現細胞は、
例えば、本明細書で記載される、ＴＲＡＣに対する、第１のｇＲＮＡと、例えば、本明細
書で記載される、ＮＬＲＣ５に対する、第２のｇＲＮＡと、例えば、本明細書で記載され
る、ＣＩＩＴＡに対する、第３のｇＲＮＡとを含むか、含んでいるか、または含むことに
なる。
複数の実施形態では、本発明は、細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＴＣ
Ｒの構成要素、例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ（例えば、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２
）をコードする内因性遺伝子に対する、１もしくは複数の修飾（例えば、ヌクレオチドの
挿入または欠失）；内因性Ｂ２Ｍ遺伝子に対する、１もしくは複数の修飾（例えば、ヌク
レオチドの挿入または欠失）；および／または内因性ＣＩＩＴＡ遺伝子に対する、１もし
くは複数の修飾（例えば、ヌクレオチドの挿入または欠失）を含むＣＡＲ発現細胞を提供
する。複数の実施形態では、前記修飾は、前記遺伝子の発現を低減するか、または消失さ
せる。複数の実施形態では、本発明は、細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、
ＴＣＲ－である（例えば、同じ種類の非改変細胞による発現より、５０％、６０％、７０
％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて低い、Ｔ
ＣＲの発現レベルであって、ＦＡＣＳ、例えば、抗ＣＤ３抗体を使用するＦＡＣＳにより
検出される発現レベルを有する）ＣＡＲ発現細胞、Ｂ２Ｍ－である（例えば、同じ種類の
非改変細胞による発現より、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、または９９％を超えて低い、Ｂ２Ｍおよび／または１もしくは複数の
ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現レベルであって、ＦＡＣＳ、例えば、抗Ｂ２Ｍ抗体を使
用するＦＡＣＳにより検出される発現レベルを有する）ＣＡＲ発現細胞、および／または
ＣＩＩＴＡ－である（例えば、同じ種類の非改変細胞による発現より、５０％、６０％、
７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて低い
、ＣＩＩＴＡおよび／またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現レベルであって、ＦＡＣ
Ｓ、例えば、抗ＣＩＩＴＡ抗体を使用するＦＡＣＳにより検出される発現レベルを有する
）ＣＡＲ発現細胞を提供する。ある実施形態では、細胞を、例えば、本明細書で記載され
るＣＡＲ分子を発現するように操作する。複数の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、本明
細書で記載されるＣＤ１９ ＣＡＲである。他の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、本明
細書で記載されるＢＣＭＡ ＣＡＲである。他の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、本明
細書で記載されるＣＤ１２３ ＣＡＲである。
複数の実施形態では、本発明は、細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＴＣ
Ｒの構成要素、例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ（例えば、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２
）をコードする内因性遺伝子に対する、１もしくは複数の修飾（例えば、ヌクレオチドの
挿入または欠失）；内因性ＮＬＲＣ５遺伝子に対する、１もしくは複数の修飾（例えば、
ヌクレオチドの挿入または欠失）；および／または内因性ＣＩＩＴＡ遺伝子に対する、１
もしくは複数の修飾（例えば、ヌクレオチドの挿入または欠失）を含むＣＡＲ発現細胞を
提供する。複数の実施形態では、前記修飾は、前記遺伝子の発現を低減するか、または消
失させる。複数の実施形態では、本発明は、細胞、例えば、本明細書で記載される、例え
ば、ＴＣＲ－である（例えば、同じ種類の非改変細胞による発現より、５０％、６０％、
７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて低い
、ＴＣＲの発現レベルであって、ＦＡＣＳ、例えば、抗ＣＤ３抗体を使用するＦＡＣＳに
より検出される発現レベルを有する）ＣＡＲ発現細胞、ＮＬＲＣ５－である（例えば、同
じ種類の非改変細胞による発現より、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて低い、ＮＬＲＣ５および／または１ま
たは複数のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現レベルであって、ＦＡＣＳ、例えば、抗ＮＬ
ＲＣ５抗体を使用するＦＡＣＳにより検出される発現レベルを有する）ＣＡＲ発現細胞、
および／またはＣＩＩＴＡ－である（例えば、同じ種類の非改変細胞による発現より、５
０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９
％を超えて低い、ＣＩＩＴＡおよび／またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現レベルで
あって、ＦＡＣＳ、例えば、抗ＣＩＩＴＡ抗体を使用するＦＡＣＳにより検出される発現
レベルを有する）ＣＡＲ発現細胞を提供する。ある実施形態では、細胞を、例えば、本明
細書で記載されるＣＡＲ分子を発現するように操作する。複数の実施形態では、ＣＡＲは
、例えば、本明細書で記載されるＣＤ１９ ＣＡＲである。他の実施形態では、ＣＡＲは
、例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ ＣＡＲである。他の実施形態では、ＣＡＲは
、例えば、本明細書で記載されるＣＤ１２３ ＣＡＲである。
複数の実施形態では、細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ２４７、ＣＤ
３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、
第１のｇＲＮＡ分子と、ＮＲ３Ｃ１、ＤＣＫ、ＣＤ５２、またはＦＫＢＰ１Ａの標的配列
と相補的なターゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子とを含むか、含んでいる
か、または含むことになる。
複数の実施形態では、細胞は、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子を含むか
、含んでいるか、または含むことになり、この場合、（１）第１のｇＲＮＡ分子は、配列
番号５５２８～配列番号５６２３、または配列番号５８１６～配列番号５９６５からなる
群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子は、配列番号
１～配列番号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択され
るターゲティングドメインを含むか；（２）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～
配列番号５６２３、もしくは配列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号９６９～配列
番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（３）第１の
ｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番号５８１６～配
列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイド
ＲＮＡ分子が、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲテ
ィングドメインを含むか；（４）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５
６２３、もしくは配列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲ
ティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１６９９～配列番号２０
６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（５）第１のｇＲＮＡ
分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番号５８１６～配列番号５
９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分
子が、配列番号２０６９～配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティングド
メインを含むか；（６）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、
もしくは配列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティング
ドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５２７８～配列番号５４９１から
なる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（７）第１のｇＲＮＡ分子が、
配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番号５８１６～配列番号５９６５か
らなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配
列番号６２２７～配列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティングドメインを
含むか；（８）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは
配列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメイン
を含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６３２５～配列番号６５８３からなる群か
ら選択されるターゲティングドメインを含むか；（９）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号
５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群
から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１
～配列番号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択される
ターゲティングドメインを含むか；（１０）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～
配列番号５６４３、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号９６９～配列
番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（１１）第１
のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番号５９６６～
配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイ
ドＲＮＡ分子が、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲ
ティングドメインを含むか；（１２）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番
号５６４３、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるタ
ーゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１６９９～配列番号
２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（１３）第１のｇ
ＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番号５９６６～配列
番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲ
ＮＡ分子が、配列番号２０６９～配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティ
ングドメインを含むか；（１４）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５
６４３、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲ
ティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５２７８～配列番号５４
９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（１５）第１のｇＲＮ
Ａ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番号５９６６～配列番号
６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ
分子が、配列番号６２２７～配列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティング
ドメインを含むか；（１６）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４
３、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティ
ングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６３２５～配列番号６５８３
からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（１７）第１のｇＲＮＡ分
子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列番号６０９８～配列番号６２
２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子
が、配列番号１～配列番号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群
から選択されるターゲティングドメインを含むか；（１８）第１のｇＲＮＡ分子が、配列
番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列番号６０９８～配列番号６２２６からな
る群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番
号９６９～配列番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか
；（１９）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列
番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；（２０）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号Ｎ
Ｏ：５６４４～配列番号ＮＯ：５７１９、もしくは配列番号６０９８～配列番号６２２６
からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、
配列番号１６９９～配列番号２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメイン
を含むか；（２１）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もし
くは配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメ
インを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２０６９～配列番号２９４１からなる
群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（２２）第１のｇＲＮＡ分子が、配
列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列番号６０９８～配列番号６２２６から
なる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列
番号５２７８～配列番号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
むか；（２３）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
を含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６２２７～配列番号６３２４からなる群か
ら選択されるターゲティングドメインを含むか；（２４）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番
号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる
群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号
６３２５～配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか
；（２５）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択さ
れるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１～配列番号
８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択されるターゲティ
ングドメインを含むか；（２６）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２
からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、
配列番号９６９～配列番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
含むか；（２７）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から
選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１３４
６～配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（２
８）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択されるタ
ーゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１６９９～配列番号
２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（２９）第１のｇ
ＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択されるターゲティング
ドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２０６９～配列番号２９４１から
なる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（３０）第１のｇＲＮＡ分子が
、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５２７８～配列番号５４９１からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含むか；（３１）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８
４～配列番号３９２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガ
イドＲＮＡ分子が、配列番号６２２７～配列番号６３２４からなる群から選択されるター
ゲティングドメインを含むか；（３２）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号
３９２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分
子が、配列番号６３２５～配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングド
メインを含むか；（３３）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２から
なる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列
番号１～配列番号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択
されるターゲティングドメインを含むか；（３４）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９
３～配列番号５３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガ
イドＲＮＡ分子が、配列番号９６９～配列番号１３４５からなる群から選択されるターゲ
ティングドメインを含むか；（３５）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号
５３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分
子が、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングド
メインを含むか；（３６）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２から
なる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列
番号１６９９～配列番号２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含
むか；（３７）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２０６
９～配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（３
８）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択される
ターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５２７８～配列番
号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（３９）第１の
ｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択されるターゲティ
ン

グドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６２２７～配列番号６３２４か
らなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（４０）第１のｇＲＮＡ分子
が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択されるターゲティングドメイン
を含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６３２５～配列番号６５８３からなる群か
ら選択されるターゲティングドメインを含むか；（４１）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番
号５３３～配列番号８３９からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第
２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１～配列番号８３、および配列番号５４９２～配列番
号５５２７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（４２）第１の
ｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択されるターゲティ
ングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号９６９～配列番号１３４５か
らなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（４３）第１のｇＲＮＡ分子
が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択されるターゲティングドメイン
を含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる群か
ら選択されるターゲティングドメインを含むか；（４４）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番
号５３３～配列番号８３９からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第
２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１６９９～配列番号２０６８からなる群から選択され
るターゲティングドメインを含むか；（４５）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～
配列番号８３９からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイド
ＲＮＡ分子が、配列番号２０６９～配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲテ
ィングドメインを含むか；（４６）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８
３９からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子
が、配列番号５２７８～配列番号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメ
インを含むか；（４７）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からな
る群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番
号６２２７～配列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティングドメインを含む
か；（４８）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６３２５
～配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（４９
）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択されるタ
ーゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１～配列番号８３、
および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択されるターゲティングド
メインを含むか；（５０）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８から
なる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列
番号９６９～配列番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含む
か；（５１）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選
択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１３４６
～配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（５２
）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択されるタ
ーゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１６９９～配列番号
２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（５３）第１のｇ
ＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択されるターゲティン
グドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２０６９～配列番号２９４１か
らなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（５４）第１のｇＲＮＡ分子
が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択されるターゲティングドメイン
を含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５２７８～配列番号５４９１からなる群か
ら選択されるターゲティングドメインを含むか；（５５）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番
号８４０～配列番号９６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第
２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６２２７～配列番号６３２４からなる群から選択され
るターゲティングドメインを含むか；（５５）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～
配列番号９６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイド
ＲＮＡ分子が、配列番号６３２５～配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲテ
ィングドメインを含むか；（５６）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号
５６２３、もしくは配列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるター
ゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９４２～配列番号３
２７０からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（５７）第１のｇＲ
ＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番号５８１６～配列番
号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮ
Ａ分子が、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティン
グドメインを含むか；（５８）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６
２３、もしくは配列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲテ
ィングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３５４２～配列番号４０３
２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（５９）第１のｇＲＮＡ
分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番号５８１６～配列番号５
９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分
子が、配列番号４０３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１
５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（６０）第１のｇＲＮＡ
分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番号５８１６～配列番号５
９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分
子が、配列番号４５９０～配列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングド
メインを含むか；（６１）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３
、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティン
グドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９４２～配列番号３２７０か
らなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（６２）第１のｇＲＮＡ分子
が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９
７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が
、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティングドメイ
ンを含むか；（６３）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、も
しくは配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングド
メインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３５４２～配列番号４０３２からな
る群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（６４）第１のｇＲＮＡ分子が、
配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９７か
らなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配
列番号４０３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からな
る群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（６５）第１のｇＲＮＡ分子が、
配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９７か
らなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配
列番号４５９０～配列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを
含むか；（６６）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしく
は配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイ
ンを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９４２～配列番号３２７０からなる群
から選択されるターゲティングドメインを含むか；（６７）第１のｇＲＮＡ分子が、配列
番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列番号６０９８～配列番号６２２６からな
る群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番
号３２７１～配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含む
か；（６８）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配
列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメインを
含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる群から
選択されるターゲティングドメインを含むか；（６９）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号
５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群
から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４
０３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から
選択されるターゲティングドメインを含むか；（７０）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号
５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群
から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４
５９０～配列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
（７１）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択され
るターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９４２～配列
番号３２７０からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（７２）第１
のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択されるターゲティ
ングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３２７１～配列番号３５４１
からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（７３）第１のｇＲＮＡ分
子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択されるターゲティングドメイン
を含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる群か
ら選択されるターゲティングドメインを含むか；（７４）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番
号８４～配列番号３９２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２
のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４０３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０
～配列番号５８１５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（７５
）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選択されるター
ゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４５９０～配列番号５
２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（７６）第１のｇＲ
ＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択されるターゲティング
ドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９４２～配列番号３２７０から
なる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（７７）第１のｇＲＮＡ分子が
、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを
含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる群から
選択されるターゲティングドメインを含むか；（７８）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号
３９３～配列番号５３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２
のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる群から選択される
タ

ーゲティングドメインを含むか；（７９）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列
番号５３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮ
Ａ分子が、配列番号４０３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５
８１５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（８０）第１のｇＲ
ＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から選択されるターゲティング
ドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４５９０～配列番号５２７７から
なる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（８１）第１のｇＲＮＡ分子が
、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択されるターゲティングドメインを
含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９４２～配列番号３２７０からなる群から
選択されるターゲティングドメインを含むか；（８２）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号
５３３～配列番号８３９からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２
のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる群から選択される
ターゲティングドメインを含むか；（８３）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配
列番号８３９からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲ
ＮＡ分子が、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる群から選択されるターゲティ
ングドメインを含むか；（８５）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３
９からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が
、配列番号４０３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５か
らなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；（８６）第１のｇＲＮＡ分子
が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から選択されるターゲティングドメイン
を含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４５９０～配列番号５２７７からなる群か
ら選択されるターゲティングドメインを含むか；（８７）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番
号８４０～配列番号９６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第
２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９４２～配列番号３２７０からなる群から選択され
るターゲティングドメインを含むか；（８８）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～
配列番号９６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイド
ＲＮＡ分子が、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲテ
ィングドメインを含むか；（８９）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９
６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子
が、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる群から選択されるターゲティングドメ
インを含むか；（９０）第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からな
る群から選択されるターゲティングドメインを含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番
号４０３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群
から選択されるターゲティングドメインを含むか；または（９１）第１のｇＲＮＡ分子が
、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを
含み、第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４５９０～配列番号５２７７からなる群から
選択されるターゲティングドメインを含む。
ある実施形態では、細胞は、配列番号５５６９または５５８６を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む、第１のｇＲＮＡ分子と、配列番号５７７５を含
む、例えば、これからなるターゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子とを含む
か、含んでいるか、または含むことになる。前記細胞は、好ましくは、機能的ＴＣＲの発
現、および機能的ＰＤ－１の発現を低減するか、または消失させるように、ＴＲＡＣおよ
びＰＤＣＤ１の両方に対する変更を含む。ある実施形態では、細胞は、免疫エフェクター
細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。ある実施形態では、細胞は、同種異系であ
る。ある実施形態では、細胞は、自家である。ある実施形態では、細胞は、本明細書で記
載されるＣＡＲを発現するように、さらに操作されるか、または操作されることになる。
本発明の複数の実施形態では、本発明の細胞は、Ｔ細胞受容体の構成要素（例えば、Ｔ
ＲＡＣ）の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第１のｇＲＮＡ分子と；
Ｂ２Ｍの標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子と；Ｃ
ＩＩＴＡの標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第３のｇＲＮＡ分子とを
含むか、含んでいるか、または含むことになる。前記細胞は、好ましくは、機能的ＴＣＲ
の発現、機能的Ｂ２Ｍの発現、および機能的ＣＩＩＴＡの発現を低減するか、または消失
させるように、前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、および前記第３のｇＲＮＡ分
子の標的配列における修飾、またはこれらの近傍における修飾を含む。ある実施形態では
、細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。ある実施形態
では、細胞は、同種異系である。ある実施形態では、細胞は、自家である。ある実施形態
では、細胞は、本明細書で記載されるＣＡＲを発現するように、さらに操作されるか、ま
たは操作されることになる。
ある態様では、本発明の細胞は、
（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
（ｂ）例えば、本明細書で記載されるＮＫ阻害性分子をコードする核酸配列、例えば、
本明細書で記載される、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合体をコードする核酸；
（ｃ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２、例えば
、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまたはこの近
傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、また
はＴＲＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表
１、表４、または表５に列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列
におけるまたはこの近傍におけるインデル；
（ｄ）Ｂ２Ｍまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまたはこの
近傍におけるインデル、例えば、Ｂ２Ｍに対するターゲティングドメインを含む、例えば
、表１または表３に列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列にお
けるまたはこの近傍におけるインデル；
（ｅ）任意選択で、ＣＩＩＴＡまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列に
おけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＣＩＩＴＡに対するターゲティングド
メインを含む、例えば、表１または表６ｃに列挙されるターゲティングドメインを含む、
ｇＲＮＡの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；および
（ｆ）任意選択で、ＬＩＬＲＢ１またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列
におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＬＩＬＲＢ１に対するターゲティン
グドメインを含む、例えば、表６ｄに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮ
Ａの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル
を含み（例えば、本発明の細胞集団は、これらを含む、１または複数の細胞を含み）、
この場合、細胞（または細胞集団が、これらを発現する１または複数の細胞を含む）は
、ＣＡＲと、ＮＫ阻害性分子とを発現し、ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、Ｔ
ＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）、ｉｉ）Ｂ２Ｍ、ｉｉｉ）ＣＩＩＴＡ
、および／またはｉｖ）ＬＩＬＲＢ１のうちの１または複数の発現および／または機能の
、低減または消失を呈示する。複数の実施形態では、インデルは
ある態様では、本発明の細胞は、
（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
（ｂ）例えば、本明細書で記載されるＮＫ阻害性分子をコードする核酸配列、例えば、
本明細書で記載される、ＨＬＡ－Ｇをコードする核酸；
（ｃ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２、例えば
、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまたはこの近
傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、また
はＴＲＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表
１、表４、または表５に列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列
におけるまたはこの近傍におけるインデル；
（ｄ）ＮＬＲＣ５またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまたは
この近傍におけるインデル、例えば、ＮＬＲＣ５に対するターゲティングドメインを含む
、例えば、表１に列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列におけ
るまたはこの近傍におけるインデル；
（ｅ）任意選択で、ＣＩＩＴＡまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列に
おけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＣＩＩＴＡに対するターゲティングド
メインを含む、例えば、表１または表６ｃに列挙されるターゲティングドメインを含む、
ｇＲＮＡの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；および
（ｆ）任意選択で、ＬＩＬＲＢ１またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列
におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＬＩＬＲＢ１に対するターゲティン
グドメインを含む、例えば、表６ｄに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮ
Ａの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル
を含み（例えば、本発明の細胞集団は、これらを含む、１または複数の細胞を含み）、
この場合、細胞（または細胞集団が、これらを発現する１または複数の細胞を含む）は
、ＣＡＲと、ＮＫ阻害性分子とを発現し、ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、Ｔ
ＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）、ｉｉ）Ｂ２Ｍ、ｉｉｉ）ＮＬＲＣ５
、および／またはｉｖ）ＬＩＬＲＢ１のうちの１または複数の発現および／または機能の
、低減または消失を呈示する。
ある態様では、本発明の細胞は、
（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
（ｂ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２、例えば
、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまたはこの近
傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、また
はＴＲＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表
１、表４、または表５に列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列
におけるまたはこの近傍におけるインデル；および
（ｃ）ＦＫＢＰ１Ａまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまた
はこの近傍におけるインデル、例えば、ＦＫＢＰ１Ａに対するターゲティングドメインを
含む、例えば、表１または表６ｂに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ
の標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル
を含み（例えば、本発明の細胞集団は、これらを含む、１または複数の細胞を含み）、
この場合、細胞（または細胞集団が、これらを発現する１または複数の細胞を含む）は
、ＣＡＲを発現し、ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲ
ＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）、および／またはｉｉ）ＦＫＢＰ１２のうちの１または複数
の発現および／または機能の、低減または消失を呈示する。このような細胞（または前記
細胞を含む細胞集団）は、例えば、免疫抑制薬（例えば、シクロスポリン、ラパマイシン
またはラパログ、またはｍＴｏｒ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１）を投与するステップを
含む処置法において、特に有用である。
ある態様では、本発明の細胞は、
（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
（ｂ）例えば、本明細書で記載されるラパマイシン耐性ｍＴｏｒをコードする核酸配列
、例えば、Ｓ２０３５突然変異、例えば、Ｓ２０３５Ｉ突然変異を含むｍＴｏｒをコード
する核酸配列；および
（ｃ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２、例えば
、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまたはこの近
傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、また
はＴＲＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表
１、表４、または表５に列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列
におけるまたはこの近傍におけるインデル
を含み（例えば、本発明の細胞集団は、これらを含む、１または複数の細胞を含み）、
この場合、細胞（または細胞集団が、これらを発現する１または複数の細胞を含む）は
、ＣＡＲと、ラパマイシン耐性ｍＴｏｒとを発現し、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡ
Ｃ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）の発現および／または機能の、
低減または消失を呈示する。このような細胞（または前記細胞を含む細胞集団）は、例え
ば、免疫抑制薬（例えば、シクロスポリン、ラパマイシンまたはラパログ、またはｍＴｏ
ｒ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１）を投与するステップを含む処置法において、特に有用
である。
前述の複数の実施形態および複数の態様のうちのいずれかでは細胞は、例えば、本明細
書で記載される、１または複数のＣＲＩＳＰＲ系であって、示されたｇＲＮＡ分子を含む
ＣＲＩＳＰＲ系を含む。複数の実施形態では、細胞は、各々が、例えば、本明細書で記載
されるＣａｓ９分子と、例えば、本明細書で記載される、示されたターゲティングドメイ
ンを含むｇＲＮＡ分子とを含む、１または複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含
む。本明細書で記載される方法のうちのいずれかを含む、複数の実施形態であって、１つ
を超える標的配列に対するｇＲＮＡを援用する実施形態では、ｇＲＮＡ（および前記ｇＲ
ＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系）を、細胞へと同時に導入することができる。本明細書で記載
される方法のうちのいずれかを含む、他の実施形態であって、１つを超える標的配列に対
するｇＲＮＡを援用する実施形態では、ｇＲＮＡ（および前記ｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰ
Ｒ系）を、細胞へと逐次的に導入することができる。
前述の複数の実施形態または複数の態様のうちのいずれかを伴う態様では、細胞集団は
、ｇＲＮＡ分子の各々によりターゲティングされる標的配列の各々において、またはその
近傍において、インデルを含む細胞のうちの、少なくとも２０％、例えば、少なくとも３
０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少
なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を含む
。前記集団は、例えば、高効率のｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子へと曝露され
た前記細胞のうちの＞８５％において、インデルを引き起こすｇＲＮＡ分子）を活用する
ことにより得ることもでき、集団を、所望の細胞について濃縮することにより、例えば、
アフィニティークロマトグラフィーまたは細胞選別によって、例えば、所望の細胞集団に
ついて選択することにより得ることもできる。
ＶＩＩ．鋳型核酸（核酸を導入するための）
本明細書で使用される「鋳型核酸」または「ドナー鋳型」という用語は、本発明のＣＲ
ＩＳＰＲ系により修飾された、例えば、切断された標的配列において、またはその近傍に
おいて挿入される核酸を指す。ある実施形態では、切断部位において、またはその近傍に
おいて、鋳型核酸の配列の一部または全部を有するように、標的配列における、またはそ
の近傍における核酸配列を修飾することが典型的である。ある実施形態では、鋳型核酸は
、一本鎖である。代替的な実施形態では、鋳型核酸は、二本鎖である。ある実施形態では
、鋳型核酸は、ＤＮＡ、例えば、二本鎖ＤＮＡである。代替的な実施形態では、鋳型核酸
は、一本鎖ＤＮＡである。
複数の実施形態では、鋳型核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、上記のＶ節
で記載したＣＡＲをコードする配列を含む。
ある実施形態では、鋳型核酸は、相同性指向修復イベントに参与することにより、標的
位置の構造を変更する。ある実施形態では、鋳型核酸は、標的位置の配列を変更する。あ
る実施形態では、鋳型核酸は、修飾塩基または非自然発生の塩基の、標的核酸への組込み
を結果としてもたらす。
本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異は、本明細書で論じられる手法
のうちの１つを使用して補正することができる。ある実施形態では、鋳型核酸を使用して
、相同性指向修復（ＨＤＲ）により、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然
変異を補正する。ある実施形態では、鋳型核酸を使用して、相同組換え（ＨＲ）により、
本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異を補正する。ある実施形態では、
鋳型核酸を使用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復により、本明細書で記載さ
れる遺伝子内または経路内の突然変異を補正する。他の実施形態では、目的の分子をコー
ドする核酸を、本発明のＣＲＩＳＰＲ系により修飾された部位において、またはその近傍
において挿入することができる。ある実施形態では、挿入される核酸は、本明細書で記載
されるキメラ抗原受容体をコードする。複数の実施形態では、鋳型核酸は、目的の分子、
例えば、本明細書で記載される、例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列に作動
可能に連結した調節エレメント、例えば、１または複数のプロモーターおよび／またはエ
ンハンサーを含む。
ＨＤＲによる修復および鋳型核酸
本明細書で記載されるヌクレアーゼ誘導型相同性指向修復（ＨＤＲ）を使用して、標的
配列を変更し、ゲノム内の突然変異を補正する（例えば、修復または編集する）ことがで
きる。理論に束縛されることを望まないが、標的配列の変更は、ドナー鋳型または鋳型核
酸による相同性指向修復（ＨＤＲ）を介して生じると考えられる。例えば、ドナー鋳型ま
たは鋳型核酸は、標的配列の変更をもたらす。プラスミドドナーを、相同組換えのための
鋳型として使用しうると想定される。さらに、一本鎖ドナー鋳型を、標的配列と、ドナー
鋳型との間の、相同性指向修復の代替法（例えば、一本鎖アニーリング）による、標的配
列の変更のための鋳型として使用しうるとも想定される。ドナー鋳型によりなされる標的
配列の変更は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断
または２つの一本鎖切断を含みうる。
ある実施形態では、突然変異は、単一の二本鎖切断により補正することもでき、２つの
一本鎖切断により補正することもできる。ある実施形態では、突然変異は、（１）単一の
二本鎖切断、（２）２つの一本鎖切断、（３）切断が標的配列の各側で生じる、２つの二
本鎖切断、（４）二本鎖切断および２つの一本鎖切断が、標的配列の各側で生じる、１つ
の二本鎖切断および２つの一本鎖切断、または（５）一本鎖切断の対が、標的配列の各側
で生じる、４つの一本鎖切断により補正することができる。
二本鎖切断媒介型補正
ある実施形態では、二本鎖切断は、ＨＮＨ様ドメインと関連する切断活性と、ＲｕｖＣ
様ドメインと関連する切断活性、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを有するＣａｓ９
分子、例えば、野生型Ｃａｓ９によりなされる。このような複数の実施形態は、単一のｇ
ＲＮＡだけを要求する。
一本鎖切断媒介型補正
他の実施形態では、２つの一本鎖切断、またはニックは、ニッカーゼ活性、例えば、Ｈ
ＮＨ様ドメインと関連する切断活性、またはＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する切断活
性を有するＣａｓ９分子によりなされる。このような複数の実施形態は、各一本鎖切断の
配置につき１つずつの、２つのｇＲＮＡを要求する。ある実施形態では、ニッカーゼ活性
を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖は切断するが、ｇＲＮＡがハ
イブリダイズする鎖に相補的な鎖は切断しない。ある実施形態では、ニッカーゼ活性を有
するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖は切断しないが、ｇＲＮＡがハイ
ブリダイズする鎖に相補的な鎖は切断する。
ある実施形態では、ニッカーゼは、ＨＮＨ活性、例えば、ＲｕｖＣ活性を不活化させた
Ｃａｓ９分子、例えば、Ｄ１０における突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有するＣ
ａｓ９分子を有する。Ｄ１０Ａは、ＲｕｖＣを不活化させ、したがって、Ｃａｓ９ニッカ
ーゼは、ＨＮＨ活性（だけ）を有し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖（例えば、その上
に、ＮＧＧ ＰＡＭを有さない相補鎖）上で切断する。他の実施形態では、Ｈ８４０にお
ける突然変異、例えば、Ｈ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子を、ニッカーゼとして
使用することができる。Ｈ８４０Ａは、ＨＮＨを不活化させ、したがって、Ｃａｓ９ニッ
カーゼは、ＲｕｖＣ活性（だけ）を有し、非相補鎖（例えば、ＮＧＧ ＰＡＭを有し、そ
の配列が、ｇＲＮＡと同一である鎖）上で切断する。
ニッカーゼと、２つのｇＲＮＡとを使用して、２つの一本鎖ニックを配置する実施形態
では、１つのニックは、標的核酸の＋鎖上にあり、１つのニックは、－鎖上にある。ＰＡ
Ｍは、外側を向いている。ｇＲＮＡは、約０～５０、０～１００、または０～２００ヌク
レオチド隔てられるように選択することができる。ある実施形態では、２つのｇＲＮＡの
ターゲティングドメインに相補的な標的配列の間に、重複がみられない。ある実施形態で
は、ｇＲＮＡは重複せず、最大で、５０、１００、または２００ヌクレオチド隔てられる
。ある実施形態では、２つのｇＲＮＡの使用は、例えば、オフターゲット結合を減少させ
ることにより、特異性を増大させることができる（Ran el cil., CELL 2013）。
ある実施形態では、単一のニックを使用して、ＨＤＲを誘導することができる。本明細
書では、単一のニックを使用して、所与の切断部位における、ＨＤＲ、ＨＲ、またはＮＨ
ＥＪの比を増大させうることが想定される。
標的位置と比べた、二本鎖切断または一本鎖切断の配置
鎖のうちの１つにおける二本鎖切断または一本鎖切断は、補正が生じるように、標的位
置に十分に近接するものとする。ある実施形態では、距離は、５０、１００、２００、３
００、３５０、または４００ヌクレオチド以下である。理論に束縛されることを望まない
が、切断は、切断が、末端切除時に、エキソヌクレアーゼ媒介型除去下に置かれる領域内
にあるように、標的位置に十分に近接するべきであると考えられる。標的位置と切断との
距離が大きすぎる場合、突然変異は、末端切除部に含まれず、したがって、末端切除領域
内の配列を補正するためにだけ使用されうるので、ドナー配列は、補正されない場合があ
る。
ｇＲＮＡ（単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡ）と、Ｃａｓ９
ヌクレアーゼとが、ＨＤＲ媒介型補正またはＨＲ媒介型補正の誘導を目的として、二本鎖
切断を誘導する実施形態では、切断部位は、標的位置から、０～２００ｂｐ（例えば、０
～１７５、０～１５０、０～１２５、０～１００、０～７５、０～５０、０～２５、２５
～２００、２５～１７５、２５～１５０、２５～１２５、２５～１００、２５～７５、２
５～５０、５０～２００、５０～１７５、５０～１５０、５０～１２５、５０～１００、
５０～７５、７５～２００、７５～１７５、７５～１５０、７５～１２５、７５～１００
ｂｐ）の間離れている。ある実施形態では、切断部位は、標的位置から、０～１００ｂｐ
（例えば、０～７５、０～５０、０～２５、２５～１００、２５～７５、２５～５０、５
０～１００、５０～７５、または７５～１００ｂｐ）の間離れている。
Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化する、２つのｇＲＮＡ（独立に、単分子（またはキメラ
）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡ）が、ＨＤＲ媒介型補正の誘導を目的として、２つ
の一本鎖切断を誘導する実施形態では、近い方のニックは、標的位置から、０～２００ｂ
ｐ（例えば、０～１７５、０～１５０、０～１２５、０～１００、０～７５、０～５０、
０～２５、２５～２００、２５～１７５、２５～１５０、２５～１２５、２５～１００、
２５～７５、２５～５０、５０～２００、５０～１７５、５０～１５０、５０～１２５、
５０～１００、５０～７５、７５～２００、７５～１７５、７５～１５０、７５～１２５
、７５～１００ｂｐ）の間離れており、２つのニックは、理想的には、互いから、２５～
５５ｂｐ以内（例えば、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０
、３０～５５、３０～５０、３０～４５、３０～４０、３０～３５、３５～５５、３５～
５０、３５～４５、３５～４０、４０～５５、４０～５０、４０～４５ｂｐ）にあり、互
いから、１００ｂｐを超えて離れない（例えば、互いから、９０、８０、７０、６０、５
０、４０、３０、２０、１０、または５ｂｐを超えて離れない）であろう。ある実施形態
では、切断部位は、標的位置から、０～１００ｂｐ（例えば、０～７５、０～５０、０～
２５、２５～１００、２５～７５、２５～５０、５０～１００、５０～７５、または７５
～１００ｂｐ）の間離れている。
一実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡ
またはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の両側に二本鎖切断を配置するように構成する。
代替的な実施形態では、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲ
ＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の片側に、二本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９
ヌクレアーゼを伴う１つのｇＲＮＡ複合体）と、２つの一本鎖切断または対をなした一本
鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複合体）とを配置する（
例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、標的位置の上流（すなわち、５’側）をターゲティ
ングし、第２のｇＲＮＡを使用して、標的位置の下流（すなわち、３’側）をターゲティ
ングする）ように構成する。別の実施形態では、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分
子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の片側に、一本鎖切
断の２つの対（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複合体の２つの対
）を作出する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、標的位置の上流（すなわち、５’側
）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して、標的位置の下流（すなわち、３’側
）をターゲティングする）ように構成する。二本鎖切断、または対内の、２つの一本鎖ニ
ックのうちの近い方は、理想的に、標的位置から０～５００ｂｐ以内（例えば、標的位置
から、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、また
は２５ｂｐ以下）であろう。ニッカーゼを使用する場合、対内の２つのニックは、互いか
ら２５～５５ｂｐ以内（例えば、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２
５～３０、５０～５５、４５～５５、４０～５５、３５～５５、３０～５５、３０～５０
、３５～５０、４０～５０、４５～５０、３５～４５、または４０～４５ｂｐの間の）に
あり、互いから、１００ｂｐを超えて離れない（例えば、互いから、９０、８０、７０、
６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｂｐを超えて離れない）。
一実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡ
またはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の両側に二本鎖切断を配置するように構成する。
代替的な実施形態では、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲ
ＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、挿入部位の、２つの標的配列上に、二本鎖切断（すな
わち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを伴う１つのｇＲＮＡ複合体）と、２つの一本鎖切断または
対をなした一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複合体）
とを配置する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、標的配列の上流（すなわち、５’側
）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して、標的配列の下流（すなわち、３’側
）をターゲティングする）ように構成する。別の実施形態では、４つのｇＲＮＡ、例えば
、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、挿入部位の片
側に、一本鎖切断の２つの対（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複
合体の２つの対）を作出する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載され
る標的配列の上流（すなわち、５’側）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して
、本明細書で記載される標的配列の下流（すなわち、３’側）をターゲティングする）よ
うに構成する。二本鎖切断、または対内の、２つの一本鎖ニックのうちの近い方は、理想
的に、標的位置から０～５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から、４５０、４００、３５
０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、または２５ｂｐ以下）であろう。
ニッカーゼを使用する場合、対内の２つのニックは、互いから２５～５５ｂｐ以内（例え
ば、２５～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、５０～５５、４５
～５５、４０～５５、３５～５５、３０～５５、３０～５０、３５～５０、４０～５０、
４５～５０、３５～４５、または４０～４５ｂｐの間の）にあり、互いから、１００ｂｐ
を超えて離れない（例えば、互いから、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２
０、または１０ｂｐを超えて離れない）。
相同性アームの長さ
相同性アームは、例えば、切除された一本鎖突出が、ドナー鋳型内の相補的な領域を見
出すことを可能とするために、少なくとも、末端切除が生じうる領域まで伸長するものと
する。全体の長さは、プラスミドサイズまたはウイルスのパッケージング限界などのパラ
メータにより制限されうるであろう。ある実施形態では、相同性アームは、反復エレメン
ト、例えば、ＡＬＵリピート、ＬＩＮＥリピートへと伸長しない。鋳型は、同じ長さまた
は異なる長さの、２つの相同性アームを有しうる。
例示的な相同性アームの長さは、少なくとも２５、５０、１００、２５０、５００、７
５０、または１０００ヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される標的位置とは、Ｃａｓ９分子依存型工程により修飾された標的核
酸（例えば、染色体）上の部位を指す。例えば、標的位置は、修飾Ｃａｓ９分子による標
的核酸の切断、および標的位置の鋳型核酸指向性修飾、例えば、鋳型核酸指向性補正であ
りうる。ある実施形態では、標的位置は、１または複数のヌクレオチドが付加される標的
核酸上の、２つのヌクレオチド、例えば、隣接ヌクレオチドの間の部位でありうる。標的
位置は、鋳型核酸により変更される、例えば、補正される、１または複数のヌクレオチド
を含みうる。ある実施形態では、標的位置は、標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配
列）内にある。ある実施形態では、標的位置は、標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する
配列）の上流または下流にある。
典型的に、鋳型配列は、切断に媒介または触媒される、標的配列との組換えを経る。あ
る実施形態では、鋳型核酸は、Ｃａｓ９により媒介される切断イベントにより切断される
、標的配列上の部位に対応する配列を含む。ある実施形態では、鋳型核酸は、第１のＣａ
ｓ９により媒介されるイベントにより切断される、標的配列上の第１の部位、および第２
のＣａｓ９により媒介されるイベントにより切断される、標的配列上の第２の部位の両方
に対応する配列を含む。
ある実施形態では、鋳型核酸は、翻訳される配列のコード配列内の変更を結果としても
たらす配列、例えば、タンパク質産物内の、１つのアミノ酸の、別のアミノ酸への置換、
例えば、突然変異体対立遺伝子の、野生型対立遺伝子への形質転換、野生型対立遺伝子の
、突然変異体対立遺伝子への形質転換、および／または終止コドンの導入、アミノ酸残基
の挿入、アミノ酸残基の欠失、もしくはナンセンス突然変異を結果としてもたらす配列を
含みうる。
他の実施形態では、鋳型核酸は、非コード配列内の変更、例えば、エクソン内、あるい
は５’側の非翻訳領域内もしくは非転写領域内、または３’側の非翻訳領域内もしくは非
転写領域内の変更を結果としてもたらす配列を含みうる。このような変更は、制御エレメ
ント内、例えば、プロモーター内、エンハンサー内の変更と、シス作用型制御エレメント
内またはトランス作用型制御エレメント内の変更とを含む。
鋳型核酸は、組み込まれると、
正の制御エレメントの活性の減少；
正の制御エレメントの活性の増大；
負の制御エレメントの活性の減少；
負の制御エレメントの活性の増大；
遺伝子の発現の減少；
遺伝子の発現の増大；
障害または疾患に対する耐性の増大；
ウイルスの侵入に対する耐性の増大；
突然変異の補正または望ましくないアミノ酸残基の変更；
例えば、酵素の酵素活性を増大させるか、または遺伝子産物が、別の分子と相互作用する
能力を増大させることにより、遺伝子産物の生物学的特性を付与するか、増大させるか、
消滅させるか、または減少させること
を結果としてもたらす配列を含みうる。
鋳型核酸は、
標的配列のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１
１、１２、またはこれを超えるヌクレオチドの配列の変化
を結果としてもたらす配列を含みうる。
ある実施形態では、鋳型核酸は、２０＋／－１０、３０＋／－１０、４０＋／－１０、
５０＋／－１０、６０＋／－１０、７０＋／－１０、８０＋／－１０、９０＋／－１０、
１００＋／－１０、１１０＋／－１０、１２０＋／－１０、１３０＋／－１０、１４０＋
／－１０、１５０＋／－１０、１６０＋／－１０、１７０＋／－１０、１８０＋／－１０
、１９０＋／－１０、２００＋／－１０、２１０＋／－１０、２２０＋／－１０、２００
～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００
～８００、８００～９００、９００～１０００、１０００～２０００、２０００～３００
０、または３０００を超えるヌクレオチドの長さである。
鋳型核酸は、以下の構成要素：
［５’相同性アーム］－［挿入配列］－［３’相同性アーム］を含む。
相同性アームは、所望されないエレメント、例えば、突然変異またはシグネチャーを、
置きかえ配列で置きかえる、染色体への組換えをもたらす。ある実施形態では、相同性ア
ームは、最も遠位の切断部位を挟む。
ある実施形態では、５’相同性アームの３’末端は、置きかえ配列の５’末端の隣の位
置にある。ある実施形態では、５’相同性アームは、置きかえ配列の５’末端から、５’
側に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１
２０、１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９
００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチド伸長しうる。
ある実施形態では、３’相同性アームの５’末端は、置きかえ配列の３’末端の隣の位
置にある。ある実施形態では、３’相同性アームは、置きかえ配列の３’末端から、３’
側に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１
２０、１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９
００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチド伸長しうる。
本明細書では、相同性アームの一方または両方を短縮して、ある特定の配列リピートエ
レメント、例えば、Ａｌｕリピート、ＬＩＮＥエレメントを含むことを回避しうることが
想定される。例えば、５’側相同性アームを短縮して、配列リピートエレメントを回避す
ることができる。他の実施形態では、３’側相同性アームを短縮して、配列リピートエレ
メントを回避することができる。一部の実施形態では、５’側相同性アームおよび３’側
相同性アームの両方を短縮して、ある特定の配列リピートエレメントの組入れを回避する
ことができる。
本明細書では、突然変異を補正するための鋳型核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓ
ｓＯＤＮ）としての使用のためにデザインしうることが想定される。ｓｓＯＤＮを使用す
る場合、５’側相同性アームおよび３’側相同性アームは、最長で約２００塩基対（ｂｐ
）の長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、ま
たは２００ｂｐの長さの範囲でありうる。オリゴヌクレオチド合成の改善を継続するとき
は、ｓｓＯＤＮのために、より長い相同性アームもまた想定される。
一態様では、挿入配列は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体をコードす
る核酸配列を含む。一実施形態では、挿入配列は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配
列に作動可能に連結したプロモーター、例えば、ＥＦ－１アルファプロモーターをさらに
含む。一態様では、挿入配列は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体または
その部分をコードするベクターを含む。
遺伝子ターゲティングのためのＮＨＥＪ法
本明細書で記載される通り、ヌクレアーゼ誘導型非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用し
て、遺伝子特異的ノックアウトをターゲティングすることができる。ヌクレアーゼ誘導型
ＮＨＥＪはまた、目的の遺伝子内の配列を除去する（例えば、これを欠失させる）のにも
使用することができる。
理論に束縛されることを望まないが、ある実施形態では、本明細書で記載される方法と
関連するゲノムの変更は、ヌクレアーゼ誘導型ＮＨＥＪと、ＮＨＥＪ修復経路のエラー誘
起的性質とに依拠すると考えられる。ＮＨＥＪは、２つの末端を一体に接続することによ
り、ＤＮＡ内の二本鎖切断を修復するが、一般に、元の配列は、それらが二本鎖切断によ
り形成されたときのままの、２つの適合性の末端が、完全にライゲーションされる場合に
限り回復される。二本鎖切断のＤＮＡ末端が、高頻度で酵素によるプロセシング下に置か
れる結果として、末端を再接続する前に、鎖の一方または両方における、ヌクレオチドの
付加または除去がもたらされる。この結果として、ＮＨＥＪ修復部位のＤＮＡ配列内に、
挿入および／または欠失（インデル）突然変異の存在がもたらされる。これらの突然変異
のうちの３分の２は、リーディングフレームを変更し、したがって、非機能的タンパク質
をもたらす。加えて、リーディングフレームは維持するが、著明量の配列を挿入するか、
または欠失させる突然変異は、タンパク質の機能性を破壊しうる。極めて重要な機能的ド
メイン内の突然変異は、タンパク質の、それほど重要でない領域内の突然変異より、許容
度が小さい可能性が高いので、これは、遺伝子座依存性である。
ＮＨＥＪにより発生するインデル突然変異は、予測不可能な性質であるが、所与の切断
部位では、ある特定のインデル配列が好適とされ、集団内で過剰代表される。欠失の長さ
は、大きく変動する場合があり、最も一般には、１～５０ｂｐの範囲であるが、容易に、
１００～２００ｂｐを超える範囲に到達しうる。挿入は、短くなる傾向があり、切断部位
のすぐ周囲に、短い配列の重複を含むことが多い。しかし、大型の挿入を得る可能性があ
り、これらの場合、挿入された配列は、細胞内に存在するゲノムＤＮＡまたはプラスミド
ＤＮＡの他の領域に由来していることが多い。
ＮＨＥＪは、突然変異原性の工程であるため、特異的な最終配列の作出が要求されない
限りにおいて、小型の配列モチーフを欠失させるのにもまた使用することができる。二本
鎖切断が、短い標的配列の近傍へとターゲティングされる場合、ＮＨＥＪ修復により引き
起こされる欠失突然変異は、望ましくないヌクレオチドに及び、したがって、これを除去
することが多い。大型のＤＮＡセグメントを欠失させるためには、配列の各側に１つずつ
の、２つの二本鎖切断を導入する結果として、末端の間にＮＨＥＪをもたらし、介在配列
の全体を除去することができる。これらの手法の両方を使用して、特異的ＤＮＡ配列を欠
失させうるが、ＮＨＥＪのエラー誘起的性質はやはり、修復部位において、インデル突然
変異をもたらしうる。
本明細書で記載される方法および組成物では、ＮＨＥＪ媒介型インデルを作出するのに
、二本鎖切断型Ｃａｓ９分子、および一本鎖Ｃａｓ９分子またはニッカーゼＣａｓ９分子
のいずれも使用することができる。遺伝子、例えば、目的の遺伝子のコード領域、例えば
、早期コード領域へとターゲティングされたＮＨＥＪ媒介型インデルを使用して、目的の
遺伝子をノックアウトする（すなわち、目的の遺伝子の発現を消失させる）ことができる
。例えば、目的の遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第１のエクソン内の、転写開
始部位のすぐ後の配列、または転写開始部位から５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５
０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、または５０ｂｐ未満）
の配列を含む。
標的位置と比べた、二本鎖切断または一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介型インデルを誘導する目的で、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼによ
り、二重鎖切断を作出する実施形態では、ｇＲＮＡ、例えば、単分子（またはキメラ）ｇ
ＲＮＡ分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子を、標的位置のヌクレオチドと近接して、１つ
の二本鎖切断を配置するように構成する。ある実施形態では、切断部位は、標的位置から
、０～５００ｂｐの間（例えば、標的位置から、５００、４００、３００、２００、１０
０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、ま
たは１ｂｐ未満）離れている。
ＮＨＥＪ媒介型インデルを誘導する目的で、Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化する、２つ
のｇＲＮＡにより、２つの一本鎖切断を誘導する実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば
、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、ＮＨＥＪ修復
に標的位置のヌクレオチドをもたらすように、２つの一本鎖切断を配置するように構成す
る。ある実施形態では、異なる鎖上で、同じ位置、または互いから数ヌクレオチド以内に
切断を配置し、二本鎖切断を本質的に模倣するように、ｇＲＮＡを構成する。ある実施形
態では、近い方のニックは、標的位置から、０～３０ｂｐの間（例えば、標的位置から、
３０、２５、２０、１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｂｐ未満）離
れており、２つのニックは、互いから２５～５５ｂｐ以内（例えば、２５～５０、２５～
４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、５０～５５、４５～５５、４０～５５、３
５～５５、３０～５５、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、３５～４５
、または４０～４５ｂｐの間の）であり、互いから１００ｂｐを超えて離れない（例えば
、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｂｐを超えて離れない
）。ある実施形態では、標的位置のヌクレオチドの片側に一本鎖切断を配置するように、
ｇＲＮＡを構成する。
本明細書で記載される方法および組成物では、標的位置の両側に切断を作出するのに、
二本鎖切断型Ｃａｓ９分子、および一本鎖Ｃａｓ９分子またはニッカーゼＣａｓ９分子の
いずれも使用することができる。２つの切断の間の核酸配列を除去する（例えば、２つの
切断の間の領域を欠失させる）ように、標的位置の両側に、二本鎖切断または対をなした
一本鎖切断を作出する。一実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（ま
たはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の両側に二本鎖切断を配置
する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される遺伝子内または経路内
の突然変異の上流（すなわち、５’側）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して
、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異の下流（すなわち、３’側）を
ターゲティングする）ように構成する。代替的な実施形態では、３つのｇＲＮＡ、例えば
、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の片
側に、二本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを伴う１つのｇＲＮＡ複合体）と、
２つの一本鎖切断または対をなした一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、
２つのｇＲＮＡ複合体）とを配置する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、本明細書で
記載される遺伝子内または経路内の突然変異の上流（すなわち、５’側）をターゲティン
グし、第２のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変
異の下流（すなわち、３’側）をターゲティングする）ように構成する。別の実施形態で
は、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラ
ーｇＲＮＡを、標的位置の片側に、一本鎖切断の２つの対（すなわち、Ｃａｓ９ニッカー
ゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複合体の２つの対）を作出する（例えば、第１のｇＲＮＡを使
用して、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異の上流（すなわち、５’
側）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される遺伝子内ま
たは経路内の突然変異の下流（すなわち、３’側）をターゲティングする）ように構成す
る。二本鎖切断、または対内の、２つの一本鎖ニックのうちの近い方は、理想的には、標
的位置から０～５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から、４５０、４００、３５０、３０
０、２５０、２００、１５０、１００、５０、または２５ｂｐ以下）であろう。ニッカー
ゼを使用する場合、対内の２つのニックは、互いから２５～５５ｂｐ以内（例えば、２５
～５０、２５～４５、２５～４０、２５～３５、２５～３０、５０～５５、４５～５５、
４０～５５、３５～５５、３０～５５、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５
０、３５～４５、または４０～４５ｂｐの間の）にあり、互いから、１００ｂｐを超えて
離れない（例えば、互いから、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、また
は１０ｂｐを超えて離れない）。
ＶＩＩＩ．１つを超えるｇＲＮＡ分子を含む系
理論に束縛されることを意図しないが、本明細書では、驚くべきことに、連続核酸上に
近接して位置する、２つの標的配列のターゲティング（例えば、各々が、それらのそれぞ
れの標的配列において、またはその近傍において、一本鎖切断または二本鎖切断を誘導す
る、２つのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体による）は、２つの標的配列の間に位置す
る核酸配列（または、核酸配列のうちの、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％）の切出し（例えば、欠失）を誘導することが示されて
いる。一部の態様では、本開示は、連続核酸、例えば、染色体、例えば、そのイントロン
、エクソン、および調節エレメントを含む、遺伝子上または遺伝子座上で近接する標的配
列をターゲティングするターゲティングドメインを含む、２つまたはこれを超えるｇＲＮ
Ａ分子の使用をもたらす。使用は、例えば、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子の、１
または複数のＣａｓ９分子と併せた（あるいは２つもしくはこれを超えるｇＲＮＡ分子、
および／または１もしくは複数のＣａｓ９分子をコードする核酸の）、細胞への導入によ
るものでありうる。
一部の態様では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子の標的配列は、連続核酸上で、
少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９
０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０
００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７００００ヌクレオ
チド隔てて位置するが、連続核酸上で、１００００ヌクレオチドを超えては隔てずに位置
する。ある実施形態では、標的配列は、約４０００ヌクレオチド隔てて位置する。ある実
施形態では、標的配列は、約６０００ヌクレオチド隔てて位置する。
一部の態様では、複数のｇＲＮＡ分子は、各標的配列を、同じ遺伝子内、または遺伝子
遺伝子座内に有する。別の態様では、複数のｇＲＮＡ分子は、各標的配列を、２つまたは
これを超える、異なる遺伝子内に有する。
一部の態様では、本発明は、複数、例えば、２つまたはこれを超える、例えば、２つの
、本発明のｇＲＮＡ分子を含む組成物および細胞であって、複数のｇＲＮＡ分子が、標的
配列を、１０，０００ヌクレオチド未満、９，０００ヌクレオチド未満、８，０００ヌク
レオチド未満、７，０００ヌクレオチド未満、６，０００ヌクレオチド未満、５，０００
ヌクレオチド未満、４，０００ヌクレオチド未満、３，０００ヌクレオチド未満、２，０
００ヌクレオチド未満、１，０００ヌクレオチド未満、９００ヌクレオチド未満、８００
ヌクレオチド未満、７００ヌクレオチド未満、６００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオ
チド未満、４００ヌクレオチド未満、３００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満
、１００ヌクレオチド未満、９０ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、７０ヌクレ
オチド未満、６０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、ま
たは３０ヌクレオチド未満隔てて有する、組成物および細胞を提供する。ある実施形態で
は、標的配列は、二重鎖核酸の同じ鎖上にある。ある実施形態では、標的配列は、二重鎖
核酸の異なる鎖上にある。
一実施形態では、本発明は、二重鎖核酸の同じ鎖上または異なる鎖上で、１０，０００
ヌクレオチド未満、９，０００ヌクレオチド未満、８，０００ヌクレオチド未満、７，０
００ヌクレオチド未満、６，０００ヌクレオチド未満、５，０００ヌクレオチド未満、４
，０００ヌクレオチド未満、３，０００ヌクレオチド未満、２，０００ヌクレオチド未満
、１，０００ヌクレオチド未満、９００ヌクレオチド未満、８００ヌクレオチド未満、７
００ヌクレオチド未満、６００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、４００ヌク
レオチド未満、３００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド
未満、９０ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、７０ヌクレオチド未満、６０ヌク
レオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、または３０ヌクレオチド
未満隔てて配置された、２つのｇＲＮＡ結合性部位の間に位置する核酸を切り出す（例え
ば、これを欠失させる）ための方法を提供する。ある実施形態では、方法は、各ｇＲＮＡ
結合性部位と関連するＰＡＭ部位の間に位置するヌクレオチドのうちの、５０％を超える
、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、８５％を超える、８６％を超える
、８７％を超える、８８％を超える、８９％を超える、９０％を超える、９１％を超える
、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、９６％を超える
、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超える、または１００％の欠失をもたらす
。複数の実施形態では、欠失は、各ｇＲＮＡ結合性部位と関連するＰＡＭ部位のうちの１
または複数の中の、１または複数のヌクレオチドをさらに含む。複数の実施形態では、欠
失はまた、各ｇＲＮＡ結合性部位と関連するＰＡＭ部位の間の領域の外部の、１または複
数のヌクレオチドも含む。
一態様では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子は、介在配列（または介在配列の部
分）の切出しが、目的の遺伝子の上方調節または下方調節を引き起こすように、遺伝子調
節エレメント、例えば、プロモーター結合性部位、エンハンサー領域、またはリプレッサ
ー領域を挟む標的配列をターゲティングするターゲティングドメインを含む。
ある実施形態では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子を、表１のｇＲＮＡ分子から
選択する。複数の態様では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子は、同じ遺伝子内の配
列と相補的なターゲティングドメインを含む。複数の態様では、２つまたはこれを超える
ｇＲＮＡ分子は、異なる遺伝子の配列と相補的なターゲティングドメインを含む。ある実
施形態では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子を、表２のｇＲＮＡ分子から選択する
。複数の態様では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子は、同じ遺伝子内の配列と相補
的なターゲティングドメインを含む。複数の態様では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ
分子は、異なる遺伝子の配列と相補的なターゲティングドメインを含む。ある実施形態で
は、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子を、表３のｇＲＮＡ分子から選択する。ある実
施形態では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子を、表４のｇＲＮＡ分子から選択する
。ある実施形態では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子を、表５のｇＲＮＡ分子から
選択する。ある実施形態では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子を、表６のｇＲＮＡ
分子から選択する。ある実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子を
、表１～６から選択し、異なる表から選択するが、例えば、異なる遺伝子の配列と相補的
なターゲティングドメインを含む。複数の実施形態では、このような２つまたはこれを超
えるｇＲＮＡ分子を、加えて、本明細書で記載される、異なる遺伝子の標的ドメインに相
補的な、１または複数のさらなるｇＲＮＡ分子と組み合わせることもできる。
２つまたはこれを超える、例えば、２つのｇＲＮＡ分子を活用する、本発明の複数の態
様では、第１のｇＲＮＡ分子（または１つを超えるｇＲＮＡ分子）が、ＴＲＡＣの配列に
特異的なターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡ分子（または１つを超えるｇＲ
ＮＡ分子）が、Ｂ２Ｍの配列に特異的なターゲティングドメインを含むことは、特に有用
でありうる。このような態様では、ＴＲＡＣに対する第１のｇＲＮＡ分子が、図１２の、
任意のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインを含み、Ｂ２Ｍに対する第２のｇＲＮＡ分
子が、図１４の、任意のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインを含むことは、特に好ま
しい。ある態様では、ＴＲＡＣに対する、第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号５５６９、配
列番号５５８７、配列番号５５９２、または配列番号５５８６を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含み、Ｂ２Ｍに対する、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番
号５４９６、配列番号５４９８、または配列番号５５０９を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５１９を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５４９７を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５４９９を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５４
９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列
番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９お
よび配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５６９および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５６９および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５６９および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５０９を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５１７を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５２１を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５
２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列
番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９お
よび配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５６９および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５６９および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５６９および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５４９７を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５４９９を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５４９８を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５５
０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列
番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５お
よび配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５８５および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５８５および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５８５および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５５１７を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５５２１を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５５２０を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５５
００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列
番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５お
よび配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５８５および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５８５および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５９２および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５４９９を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５４９８を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５５０３を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５４
９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列
番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２お
よび配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５９２および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５９２および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５９２および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５５２１を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５５２０を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５５００を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５４
９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列
番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２お
よ

び配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５
９２および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６０１および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６０１および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５４９８を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５５０３を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５４９６を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５５０
７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番
号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１およ
び配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
０１および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６０１および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６０１および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５５２０を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５５００を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５４９４を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５５０
８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番
号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１およ
び配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５
８９および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５５８９および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５５８９および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５５０３を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５４９６を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５５０７を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５５１
５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番
号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９およ
び配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５
８９および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５５８９および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５５８９および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５５００を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５４９４を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５５０８を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５５１
４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番
号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００およ
び配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
００および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６００および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６００および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５４９６を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５５０７を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５５１５を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５４９
３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番
号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００およ
び配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
００および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６００および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６００および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５４９４を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５５０８を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５５１４を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５４９
２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番
号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４およ
び配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５
９

４および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５５９４および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５５９４および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５５０７を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５５１５を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５４９３を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５５０６
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号
５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および
配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９
４および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５５９４および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５５９４および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５５０８を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５５１４を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５４９２を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５５１９
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号
５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および
配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７
１および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５５７１および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５５７１および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５５１５を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５４９３を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５５０６を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５５０９
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号
５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および
配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７
１および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５５７１および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５５７１および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５５１４を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５４９２を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５５１９を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５４９７
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号
５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および
配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９
３および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５５９３および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５５９３および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５４９３を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５５０６を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５５０９を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５５１７
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号
５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および
配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９
３および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５５９３および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５５９３および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５４９２を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５５１９を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５４９７を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５４９９
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号
５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および
配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７
４および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号

５５７４および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５５７４および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５５７４および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５５０６を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５５０９を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５５１７を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５５２１を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５
５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配
列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４
および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５５７４および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５５７４および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５５７４および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５５１９を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５４９７を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５４９９を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５４９８を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５
５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配
列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８
および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５５９８および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５５９８および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５５９８および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５５０９を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５５１７を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５５２１を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５５２０を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５
５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配
列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８
および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５５９８および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５５９８および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５５８６および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５４９７を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５４９９を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５４９８を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５５０３を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５
４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配
列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６
および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５５８６および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５５８６および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５５８６および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５５１７を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５５２１を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５５２０を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５５００を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５
４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配
列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６
および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５５８６および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５５９９および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５５９９および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５４９９を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５４９８を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５５０３を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５４９６を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５
５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配
列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９
および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５５９９および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配

列番号５５９９および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５９９および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５５２０を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５５００を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５４９４を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５５
０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列
番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９お
よび配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５９１および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５９１および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５９１および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５５０３を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５４９６を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５５０７を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５５
１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列
番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１お
よび配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５９１および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５９１および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５９１および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５５００を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５４９４を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５５０８を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５５
１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列
番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８お
よび配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５６８および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５６８および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５６８および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５４９６を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５５０７を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５５１５を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５４
９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列
番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８お
よび配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５６８および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５６８および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５６８および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５５００を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５４９４を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５５０８を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５５１４を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５４
９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列
番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０お
よび配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
６１０および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５６１０および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５６１０および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５５０７を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５５１５を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５４９３を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５５
０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列
番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０お
よび配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
６１０および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５６１０および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞ

れ、配列番号５６１０および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５５０８を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５５１４を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５４９２を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５５１
９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番
号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８およ
び配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
０８および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６０８および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６０８および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５５１５を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５４９３を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５５０６を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５５０
９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番
号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８およ
び配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
０８および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６０８および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６０８および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５５１４を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５４９２を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５５１９を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５４９
７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番
号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７およ
び配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
１７および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６１７および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６１７および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５４９３を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５５０６を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５５０９を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５５１
７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番
号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７およ
び配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
１７および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６１７および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６１７および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５４９２を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５５１９を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５４９７を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５４９
９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番
号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９およ
び配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
１９および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６１９および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６１９および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５５０６を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５５０９を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５５１７を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５５２
１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番
号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９およ
び配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
１９および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６１９および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６１９および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、

それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５５１９を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５４９７を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５４９９を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５４９８
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号
５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および
配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２
０および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５６２０および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５６２０および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５５０９を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５５１７を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５５２１を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５５２０
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号
５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および
配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２
０および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５６２０および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５６２０および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。前述の組合せのうちのいずれかでは、本発明の態様または実施形態
は加えて、例えば、本明細書の表６ｃで記載される、例えば、本明細書で記載されるＣＩ
ＩＴＡの配列に特異的なターゲティングドメインを含む、第３のｇＲＮＡ分子（または１
つを超えるｇＲＮＡ分子）も含みうる。
２つまたはこれを超える、例えば、２つのｇＲＮＡ分子を活用する、本発明の複数の態
様では、第１のｇＲＮＡ分子が、ＴＲＢＣ（例えば、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２）の配
列に特異的なターゲティングドメインを含み、第２のｇＲＮＡ分子が、Ｂ２Ｍの配列に特
異的なターゲティングドメインを含むことは、特に有用でありうる。このような態様では
、ＴＲＢＣに対する第１のｇＲＮＡ分子が、図１３の、任意のｇＲＮＡ分子のターゲティ
ングドメインを含み、Ｂ２Ｍに対する第２のｇＲＮＡ分子が、図１４の、任意のｇＲＮＡ
分子のターゲティングドメインを含むことは、特に好ましい。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９および配列番号５５
１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９および配列
番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９お
よび配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
７１９および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５７１９および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５７１９および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５７１９および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９および配列番号５５１５を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９および配列番号５４９３を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９および配列番号５５０６を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９および配列番号５５
０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９および配列
番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９お
よび配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
７１９および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５７１９および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５７１９および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５７１９および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９および配列番号５５１４を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１９および配列番号５４９２を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４および配列番号５５１９を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４および配列番号５４
９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４および配列
番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４お
よび配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
６９４および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５６９４および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５６９４および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５６９４および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４および配列番号５４９３を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４および配列番号５５０６を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４および配列番号５５０９を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４および配列番号５５
１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４および配列
番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４お
よび配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
６９４および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５６９４および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５６９４および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５６９４および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５６９４および配列番号５４９２を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６および配列番号５５１９を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６および配列番号５４９７を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６および配列番号５４
９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６および配列
番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６お
よび配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
７０６および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５７０６および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５７０６および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５７０６および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６および配列番号５５０６を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６および配列番号５５０９を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６および配列番号５５１７を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６および配列番号５５
２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６および配列
番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０６お
よび配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
７０６および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５７０６および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５７０６および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５７０６および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６および配列番号５５１９を含む、例えば、これ
ら

からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６および配列番号５４９７を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６および配列番号５４９９を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６および配列番号５４９
８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６および配列番
号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６およ
び配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
９６および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６９６および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６９６および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５６９６および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５６９６および配列番号５５０９を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６および配列番号５５１７を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６および配列番号５５２１を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６および配列番号５５２
０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６および配列番
号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６９６およ
び配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６
９６および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５６９６および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５６９６および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５７１１および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５７１１および配列番号５４９７を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１１および配列番号５４９９を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１１および配列番号５４９８を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１１および配列番号５５０
３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１１および配列番
号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１１およ
び配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７
１１および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５７１１および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５７１１および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５７１１および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５７１１および配列番号５５１７を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１１および配列番号５５２１を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１１および配列番号５５２０を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１１および配列番号５５０
０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１１および配列番
号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１１およ
び配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７
１１および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５７１１および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５７０８および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５７０８および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５７０８および配列番号５４９９を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０８および配列番号５４９８を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０８および配列番号５５０３を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０８および配列番号５４９
６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０８および配列番
号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０８およ
び配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７
０８および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５７０８および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５７０８および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５７０８および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５７０８および配列番号５５２１を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０８および配列番号５５２０を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０８および配列番号５５００を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０８および配列番号５４９
４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０８および配列番
号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０８およ
び配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７
０８および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５７０９および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５７０９および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号５４９８を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号５５０３を含む、例えば
、

これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号５４９６を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号５５０７
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号
５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および
配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０
９および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５７０９および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５７０９および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５７０９および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号５５２０を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号５５００を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号５４９４を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号５５０８
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および配列番号
５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０９および
配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１
２および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５７１２および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５７１２および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５７１２および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５７１２および配列番号５５０３を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１２および配列番号５４９６を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１２および配列番号５５０７を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１２および配列番号５５１５
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１２および配列番号
５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１２および
配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１
２および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５７１２および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５７１２および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５７１２および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５７１２および配列番号５５００を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１２および配列番号５４９４を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１２および配列番号５５０８を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１２および配列番号５５１４
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１２および配列番号
５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０３および
配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０
３および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５７０３および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５７０３および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５７０３および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５７０３および配列番号５４９６を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０３および配列番号５５０７を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０３および配列番号５５１５を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０３および配列番号５４９３
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０３および配列番号
５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０３および
配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０
３および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５７０３および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５７０３および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５７０３および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５７０３および配列番号５４９４を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０３および配列番号５５０８を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０３および配列番号５５１４を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０３および配列番号５４９２
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０７および配列番号
５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０７および
配列番号５４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０
７および配列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５７０７および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５７０７および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５７０７および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５７０７および配列番号５５０７を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０７および配列番号５５１５を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０７および配列番号５４９３を含む、
例

えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０７および配列番号５５０６を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０７および配列番号５
５０９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０７および配
列番号５５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０７
および配列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５７０７および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５７０７および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５７０７および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５７０７および配列番号５５０８を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０７および配列番号５５１４を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０７および配列番号５４９２を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７および配列番号５５１９を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７および配列番号５
４９７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７および配
列番号５４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７
および配列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５６８７および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５６８７および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５６８７および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５６８７および配列番号５５１５を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７および配列番号５４９３を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７および配列番号５５０６を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７および配列番号５５０９を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７および配列番号５
５１７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７および配
列番号５５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７
および配列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５６８７および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５６８７および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５６８７および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５６８７および配列番号５５１４を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６８７および配列番号５４９２を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５および配列番号５５１９を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５および配列番号５４９７を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５および配列番号５
４９９を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５および配
列番号５４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５
および配列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５７０５および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５７０５および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５７０５および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５７０５および配列番号５４９３を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５および配列番号５５０６を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５および配列番号５５０９を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５および配列番号５５１７を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５および配列番号５
５２１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５および配
列番号５５２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７０５
および配列番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５７０５および配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５７０５および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５７０５および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５７０５および配列番号５４９２を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３および配列番号５５１９を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３および配列番号５４９７を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３および配列番号５４９９を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３および配列番号５
４９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３および配
列番号５５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３
および配列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５７１３および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５７１３および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５７１３および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５７１３および配列番号５５０６を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３および配列番号５５０９を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３および配列番号５５１７を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３および配列番号５５２１を
含

む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３および配列番号５５
２０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３および配列
番号５５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１３お
よび配列番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
７１３および配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５７１３および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５７１３および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５７１５および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５および配列番号５４９７を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５および配列番号５４９９を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５および配列番号５４９８を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５および配列番号５５
０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５および配列
番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５お
よび配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
７１５および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５７１５および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５７１５および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５７１５および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５および配列番号５５１７を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５および配列番号５５２１を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５および配列番号５５２０を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５および配列番号５５
００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５および配列
番号５４９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１５お
よび配列番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
７１５および配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５７１５および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５７１０および配列番号５５１９を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５７１０および配列番号５４９７を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０および配列番号５４９９を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０および配列番号５４９８を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０および配列番号５５０３を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０および配列番号５４
９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０および配列
番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０お
よび配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
７１０および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５７１０および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５７１０および配列番号５５０９を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５７１０および配列番号５５１７を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０および配列番号５５２１を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０および配列番号５５２０を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０および配列番号５５００を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０および配列番号５４
９４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０および配列
番号５５０８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５７１０お
よび配列番号５５１４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
７１０および配列番号５４９２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。前述の組合せのうちのいずれかでは、本発明の態様または実施形態は加えて、例
えば、本明細書の表６ｃで記載される、例えば、本明細書で記載されるＣＩＩＴＡの配列
に特異的なターゲティングドメインを含む、第３のｇＲＮＡ分子（または１つを超えるｇ
ＲＮＡ分子）も含みうる。
２つまたはこれを超える、例えば、２つのｇＲＮＡ分子を活用する、本発明の複数の態
様では、第１のｇＲＮＡ分子が、ＴＲＡＣの配列に特異的なターゲティングドメインを含
み、第２のｇＲＮＡ分子が、ＰＤＣＤ１の配列に特異的なターゲティングドメインを含む
ことは、特に有用でありうる。このような態様では、ＴＲＡＣに対する第１のｇＲＮＡ分
子が、図１２の、任意のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインを含み、ＰＤＣＤ１に対
する第２のｇＲＮＡ分子が、図１６の、任意のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインを
含むことは、特に好ましい。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５７４３を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５４９７を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５４９９を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５４９８を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５
５０３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配
列番号５４９６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９
および配列番号５５０７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５５６９および配列番号５５１５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５５６９および配列番号５４９３を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５０６を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５０９を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５１７を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５２１を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５５２０を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６９および配列番号５
５００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配
列番号５７４３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５
および配列番号５７９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５５８５および配列番号５７４８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５５８５および配列番号５７２２を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５５８５および配列番号５８００を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５７３５を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５７２４を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５７３１を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５７２５を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配列番号５
７７５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５および配
列番号５７６６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８５
および配列番号５７２７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５５８５および配列番号５７４４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５５８５および配列番号５７５１を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５５８５および配列番号５７３４を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５７４３を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５７９８を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５７４８を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５７２２を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５
８００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配
列番号５７３５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２
および配列番号５７２４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５５９２および配列番号５７３１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５５９２および配列番号５７２５を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５５９２および配列番号５７７５を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５７６６を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５７２７を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５７４４を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５７５１を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９２および配列番号５
７３４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配
列番号５７４３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１
および配列番号５７９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５６０１および配列番号５７４８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５６０１および配列番号５７２２を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５６０１および配列番号５８００を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５７３５を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５７２４を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５７３１を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５７２５を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配列番号５
７７５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１および配
列番号５７６６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０１
および配列番号５７２７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５６０１および配列番号５７４４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ン

を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５６０１および配列番号５７５１を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５６０１および配列番号５７３４を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５７４３を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５７９８を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５７４８を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５７２２を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５８
００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列
番号５７３５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９お
よび配列番号５７２４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５８９および配列番号５７３１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５８９および配列番号５７２５を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５８９および配列番号５７７５を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５７６６を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５７２７を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５７４４を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５７５１を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８９および配列番号５７
３４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列
番号５７４３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００お
よび配列番号５７９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
６００および配列番号５７４８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５６００および配列番号５７２２を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５６００および配列番号５８００を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５７３５を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５７２４を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５７３１を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５７２５を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列番号５７
７５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００および配列
番号５７６６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６００お
よび配列番号５７２７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
６００および配列番号５７４４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５６００および配列番号５７５１を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５６００および配列番号５７３４を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５７４３を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５７９８を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５７４８を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５７２２を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５８
００を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列
番号５７３５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４お
よび配列番号５７２４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５９４および配列番号５７３１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５９４および配列番号５７２５を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５９４および配列番号５７７５を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５７６６を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５７２７を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５７４４を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５７５１を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９４および配列番号５７
３４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列
番号５７４３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１お
よび配列番号５７９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５７１および配列番号５７４８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５７１および配列番号５７２２を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それ
ぞれ、配列番号５５７１および配列番号５８００を含む、例えば、これらからなるターゲ
ティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子と
は、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５７３５を含む、例えば、これらからな
るターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮ
Ａ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５７２４を含む、例えば、これ
らからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２
のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５７３１を含む、例え
ば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子
と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５７２５を含
む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲ
ＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列番号５７
７５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第
１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１および配列
番号５７６６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様
では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７１お
よび配列番号５７２７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５
５７１および配列番号５７４４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイン
を含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配
列番号５５７１および配列番号５７５１を含む、例えば、これらからなるターゲティング
ド

メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５５７１および配列番号５７３４を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５７４３を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５７９８を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５７４８を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５７２２を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５８０
０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番
号５７３５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３およ
び配列番号５７２４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５
９３および配列番号５７３１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５５９３および配列番号５７２５を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５５９３および配列番号５７７５を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５７６６を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５７２７を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５７４４を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５７５１を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９３および配列番号５７３
４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番
号５７４３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４およ
び配列番号５７９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５
７４および配列番号５７４８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５５７４および配列番号５７２２を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５５７４および配列番号５８００を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５７３５を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５７２４を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５７３１を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５７２５を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番号５７７
５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４および配列番
号５７６６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５７４およ
び配列番号５７２７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５
７４および配列番号５７４４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５５７４および配列番号５７５１を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５５７４および配列番号５７３４を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５７４３を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５７９８を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５７４８を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５７２２を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５８０
０を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番
号５７３５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８およ
び配列番号５７２４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５
９８および配列番号５７３１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５５９８および配列番号５７２５を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５５９８および配列番号５７７５を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５７６６を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５７２７を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５７４４を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５７５１を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９８および配列番号５７３
４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番
号５７４３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６およ
び配列番号５７９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５
８６および配列番号５７４８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５５８６および配列番号５７２２を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５５８６および配列番号５８００を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは
、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５７３５を含む、例えば、これらからなる
ターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ
分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５７２４を含む、例えば、これら
からなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２の
ｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５７３１を含む、例えば
、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と
、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５７２５を含む
、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮ
Ａ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番号５７７
５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１
のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６および配列番
号５７６６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様で
は、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５８６およ
び配列番号５７２７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。あ
る態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５
８６および配列番号５７４４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを
含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列
番号５５８６および配列番号５７５１を含む、例えば、これらからなるターゲティングド
メインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞ
れ、配列番号５５８６および配列番号５７３４を含む、例えば、これらからなるターゲテ
ィ

ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５７４３を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５７９８を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５７４８を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５７２２を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５８００
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号
５７３５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および
配列番号５７２４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９
９および配列番号５７３１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５５９９および配列番号５７２５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５５９９および配列番号５７７５を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５７６６を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５７２７を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５７４４を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５７５１を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９９および配列番号５７３４
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号
５７４３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および
配列番号５７９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９
１および配列番号５７４８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５５９１および配列番号５７２２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５５９１および配列番号５８００を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５７３５を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５７２４を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５７３１を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５７２５を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号５７７５
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および配列番号
５７６６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９１および
配列番号５７２７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５９
１および配列番号５７４４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５５９１および配列番号５７５１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５５９１および配列番号５７３４を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５７４３を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５７９８を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５７４８を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５７２２を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５８００
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号
５７３５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および
配列番号５７２４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６
８および配列番号５７３１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５５６８および配列番号５７２５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５５６８および配列番号５７７５を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５７６６を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５７２７を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５７４４を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５７５１を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５５６８および配列番号５７３４
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号
５７４３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および
配列番号５７９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１
０および配列番号５７４８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５６１０および配列番号５７２２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５６１０および配列番号５８００を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５７３５を含む、例えば、これらからなるタ
ーゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分
子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５７２４を含む、例えば、これらか
らなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇ
ＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５７３１を含む、例えば、
これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、
第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５７２５を含む、
例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ
分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号５７７５
を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１の
ｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および配列番号
５７６６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では
、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１０および
配列番号５７２７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある
態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１
０および配列番号５７４４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含
む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番
号５６１０および配列番号５７５１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメ
インを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ
、配列番号５６１０および配列番号５７３４を含む、例えば、これらからなるターゲティ
ングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、
それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５７４３を含む、例えば、これらからなるタ
ー

ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５７９８を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５７４８を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５７２２を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５８００を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５
７３５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配
列番号５７２４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８
および配列番号５７３１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５６０８および配列番号５７２５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５６０８および配列番号５７７５を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５６０８および配列番号５７６６を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５７２７を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５７４４を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５７５１を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６０８および配列番号５７３４を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５
７４３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配
列番号５７９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７
および配列番号５７４８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５６１７および配列番号５７２２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５６１７および配列番号５８００を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５６１７および配列番号５７３５を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５７２４を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５７３１を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５７２５を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５７７５を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配列番号５
７６６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７および配
列番号５７２７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１７
および配列番号５７４４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５６１７および配列番号５７５１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５６１７および配列番号５７３４を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５６１９および配列番号５７４３を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５７９８を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５７４８を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５７２２を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５８００を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５
７３５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配
列番号５７２４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９
および配列番号５７３１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５６１９および配列番号５７２５を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５６１９および配列番号５７７５を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５６１９および配列番号５７６６を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５７２７を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５７４４を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５７５１を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６１９および配列番号５７３４を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５
７４３を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配
列番号５７９８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０
および配列番号５７４８を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５６２０および配列番号５７２２を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５６２０および配列番号５８００を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、そ
れぞれ、配列番号５６２０および配列番号５７３５を含む、例えば、これらからなるター
ゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子
とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５７２４を含む、例えば、これらから
なるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲ
ＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５７３１を含む、例えば、こ
れらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第
２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５７２５を含む、例
えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分
子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５７７５を
含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、第１のｇ
ＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配列番号５
７６６を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態様では、
第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０および配
列番号５７２７を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。ある態
様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号５６２０
および配列番号５７４４を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む
。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、配列番号
５６２０および配列番号５７５１を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメイ
ンを含む。ある態様では、第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とは、それぞれ、
配列番号５６２０および配列番号５７３４を含む、例えば、これらからなるターゲティン
グドメインを含む。
本明細書で記載される通り、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡの発現を低減したか
、または消失させた細胞（または細胞集団）、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、
本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作出すること
が想定される。これらの標的の各々に対する、本明細書で開示される、任意のターゲティ
ングドメインを含むｇＲＮＡを、組合せで使用しうることが想定されるが、例えば、組合
せで使用するのに、特に、好ましいターゲティングドメイン配列を、下記の表３３に提供
する。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、二重ガイドＲＮＡフォーマットで提
供され、配列［ターゲティングドメイン］－配列番号６６０７を含む、例えば、これらか
らなるｃｒＲＮＡと、配列番号６６６０の配列を含む、例えば、これらからなるｔｒａｃ
ｒとを含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメイ
ン］－配列番号６６０１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマット
で提供される。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメ
イン］－配列番号７８１１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマッ
トで提供される。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のうちの１または複数、例えば、ｇ
ＲＮＡ分子の全ては加えて、本明細書で記載される、１または複数の修飾も含む、例えば
、１もしくは複数の、例えば、３つの、３’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結
合および／もしくは５’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合、ならびに／また
は１もしくは複数の、例えば、３つの、３’側の２’－Ｏ－Ｍｅ修飾および／もしくは５
’側の２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々を、Ｃａｓ
９分子（例えば、本明細書で記載される）と複合体化させ、細胞（または例えば、本明細
書で記載される細胞集団）へと、例えば、電気穿孔により、ＲＮＰとして送達する。複数
の実施形態では、各ｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを、細胞と混合し、例えば、単回の電気穿
孔ステップにより、同時に導入する。他の実施形態では、ＲＮＰは、逐次的に導入するこ
ともできる。細胞内の、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡの両方の発現を低減するか、または消失
させることが想定される場合（本明細書の場合など）、複数の実施形態では、例えば、本
明細書で記載されるＮＫ阻害性分子、例えば、本明細書で記載されるＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ
融合体を発現するように、細胞をさらに操作することができる。
Figure 2022137032000532
Figure 2022137032000533
Figure 2022137032000534
特に好ましい組合せは、組合せＡ１～Ａ４、組合せＡ５～Ａ８、組合せＡ３７～Ａ４０
、または組合せＡ４１～Ａ４４を含む。
本明細書で記載される通り、ＣＤ３Ｅ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡの発現を低減したか
、または消失させた細胞（または細胞集団）、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、
本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作出すること
が想定される。これらの標的の各々に対する、本明細書で開示される、任意のターゲティ
ングドメインを含むｇＲＮＡを、組合せで使用しうることが想定されるが、例えば、組合
せで使用するのに、特に、好ましいターゲティングドメイン配列を、下記の表３４に提供
する。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、二重ガイドＲＮＡフォーマットで提
供され、配列［ターゲティングドメイン］－配列番号６６０７を含む、例えば、これらか
らなるｃｒＲＮＡと、配列番号６６６０の配列を含む、例えば、これらからなるｔｒａｃ
ｒとを含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメイ
ン］－配列番号６６０１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマット
で提供される。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメ
イン］－配列番号７８１１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマッ
トで提供される。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のうちの１または複数、例えば、ｇ
ＲＮＡ分子の全ては加えて、本明細書で記載される、１または複数の修飾も含む、例えば
、１もしくは複数の、例えば、３つの、３’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結
合および／もしくは５’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合、ならびに／また
は１もしくは複数の、例えば、３つの、３’側の２’－Ｏ－Ｍｅ修飾および／もしくは５
’側の２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々を、Ｃａｓ
９分子（例えば、本明細書で記載される）と複合体化させ、細胞（または例えば、本明細
書で記載される細胞集団）へと、例えば、電気穿孔により、ＲＮＰとして送達する。複数
の実施形態では、各ｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを、細胞と混合し、例えば、単回の電気穿
孔ステップにより、同時に導入する。他の実施形態では、ＲＮＰは、逐次的に導入するこ
ともできる。細胞内の、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡの両方の発現を低減するか、または消失
させることが想定される場合（本明細書の場合など）、複数の実施形態では、例えば、本
明細書で記載されるＮＫ阻害性分子、例えば、本明細書で記載されるＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ
融合体を発現するように、細胞をさらに操作することができる。
Figure 2022137032000535
Figure 2022137032000536
Figure 2022137032000537
本明細書で記載される通り、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡの発現を低減したか
、または消失させた細胞（または細胞集団）、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、
本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作出すること
が想定される。これらの標的の各々に対する、本明細書で開示される、任意のターゲティ
ングドメインを含むｇＲＮＡを、組合せで使用しうることが想定されるが、例えば、組合
せで使用するのに、特に、好ましいターゲティングドメイン配列を、下記の表３８に提供
する。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、二重ガイドＲＮＡフォーマットで提
供され、配列［ターゲティングドメイン］－配列番号６６０７を含む、例えば、これらか
らなるｃｒＲＮＡと、配列番号６６６０の配列を含む、例えば、これらからなるｔｒａｃ
ｒとを含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメイ
ン］－配列番号６６０１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマット
で提供される。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメ
イン］－配列番号７８１１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマッ
トで提供される。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のうちの１または複数、例えば、ｇ
ＲＮＡ分子の全ては加えて、本明細書で記載される、１または複数の修飾も含む、例えば
、１もしくは複数の、例えば、３つの、３’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結
合および／もしくは５’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合、ならびに／また
は１もしくは複数の、例えば、３つの、３’側の２’－Ｏ－Ｍｅ修飾および／もしくは５
’側の２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々を、Ｃａｓ
９分子（例えば、本明細書で記載される）と複合体化させ、細胞（または例えば、本明細
書で記載される細胞集団）へと、例えば、電気穿孔により、ＲＮＰとして送達する。複数
の実施形態では、各ｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを、細胞と混合し、例えば、単回の電気穿
孔ステップにより、同時に導入する。他の実施形態では、ＲＮＰは、逐次的に導入するこ
ともできる。細胞内の、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡの両方の発現を低減するか、または消失
させることが想定される場合（本明細書の場合など）、複数の実施形態では、例えば、本
明細書で記載されるＮＫ阻害性分子、例えば、本明細書で記載されるＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ
融合体を発現するように、細胞をさらに操作することができる。
Figure 2022137032000538
Figure 2022137032000539
特に好ましい組合せは、組合せＦ１～Ｆ４、組合せＦ５～Ｆ８、組合せＦ１３～Ｆ１６
、または組合せＦ１７～Ｆ２０を含む。
本明細書で記載される通り、ＣＤ３Ｅ、およびＦＫＢＰ１Ａの発現を低減したか、また
は消失させた細胞（または細胞集団）、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細
書で記載される、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作出することが想定
される。これらの標的の各々に対する、本明細書で開示される、任意のターゲティングド
メインを含むｇＲＮＡを、組合せで使用しうることが想定されるが、例えば、組合せで使
用するのに、特に、好ましいターゲティングドメイン配列を、下記の表３５に提供する。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、二重ガイドＲＮＡフォーマットで提供され
、配列［ターゲティングドメイン］－配列番号６６０７を含む、例えば、これらからなる
ｃｒＲＮＡと、配列番号６６６０の配列を含む、例えば、これらからなるｔｒａｃｒとを
含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメイン］－
配列番号６６０１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマットで提供
される。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメイン］
－配列番号７８１１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマットで提
供される。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のうちの１または複数、例えば、ｇＲＮＡ
分子の全ては加えて、本明細書で記載される、１または複数の修飾も含む、例えば、１も
しくは複数の、例えば、３つの、３’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合およ
び／もしくは５’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合、ならびに／または１も
しくは複数の、例えば、３つの、３’側の２’－Ｏ－Ｍｅ修飾および／もしくは５’側の
２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々を、Ｃａｓ９分子
（例えば、本明細書で記載される）と複合体化させ、細胞（または細胞集団）へと、例え
ば、電気穿孔により、ＲＮＰとして送達する。複数の実施形態では、各ｇＲＮＡ分子を含
むＲＮＰを、細胞と混合し、例えば、単回の電気穿孔ステップにより、同時に導入する。
他の実施形態では、ＲＮＰは、逐次的に導入することもできる。
Figure 2022137032000540
Figure 2022137032000541
本明細書で記載される通り、ＴＲＡＣ、およびＦＫＢＰ１Ａの発現を低減したか、また
は消失させた細胞（または細胞集団）、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細
書で記載される、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作出することが想定
される。これらの標的の各々に対する、本明細書で開示される、任意のターゲティングド
メインを含むｇＲＮＡを、組合せで使用しうることが想定されるが、例えば、組合せで使
用するのに、特に、好ましいターゲティングドメイン配列を、下記の表３６に提供する。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、二重ガイドＲＮＡフォーマットで提供され
、配列［ターゲティングドメイン］－配列番号６６０７を含む、例えば、これらからなる
ｃｒＲＮＡと、配列番号６６６０の配列を含む、例えば、これらからなるｔｒａｃｒとを
含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメイン］－
配列番号６６０１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマットで提供
される。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメイン］
－配列番号７８１１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマットで提
供される。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のうちの１または複数、例えば、ｇＲＮＡ
分子の全ては加えて、本明細書で記載される、１または複数の修飾も含む、例えば、１も
しくは複数の、例えば、３つの、３’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合およ
び／もしくは５’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合、ならびに／または１も
しくは複数の、例えば、３つの、３’側の２’－Ｏ－Ｍｅ修飾および／もしくは５’側の
２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々を、Ｃａｓ９分子
（例えば、本明細書で記載される）と複合体化させ、細胞（または例えば、本明細書で記
載される細胞集団）へと、例えば、電気穿孔により、ＲＮＰとして送達する。複数の実施
形態では、各ｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを、細胞と混合し、例えば、単回の電気穿孔ステ
ップにより、同時に導入する。他の実施形態では、ＲＮＰは、逐次的に導入することもで
きる。
Figure 2022137032000542
Figure 2022137032000543
特に好ましい組合せは、組合せＤ２、組合せＤ４、組合せＤ２０、または組合せＤ２２
を含む。
本明細書で記載される通り、ＴＲＢＣ、およびＦＫＢＰ１Ａの発現を低減したか、また
は消失させた細胞（または細胞集団）、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細
書で記載される、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作出することが想定
される。これらの標的の各々に対する、本明細書で開示される、任意のターゲティングド
メインを含むｇＲＮＡを、組合せで使用しうることが想定されるが、例えば、組合せで使
用するのに、特に、好ましいターゲティングドメイン配列を、下記の表３７に提供する。
複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、二重ガイドＲＮＡフォーマットで提供され
、配列［ターゲティングドメイン］－配列番号６６０７を含む、例えば、これらからなる
ｃｒＲＮＡと、配列番号６６６０の配列を含む、例えば、これらからなるｔｒａｃｒとを
含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメイン］－
配列番号６６０１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマットで提供
される。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々が、配列：［ターゲティングドメイン］
－配列番号７８１１を含む、例えば、これらからなる単一ガイドＲＮＡフォーマットで提
供される。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のうちの１または複数、例えば、ｇＲＮＡ
分子の全ては加えて、本明細書で記載される、１または複数の修飾も含む、例えば、１も
しくは複数の、例えば、３つの、３’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合およ
び／もしくは５’ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合、ならびに／または１も
しくは複数の、例えば、３つの、３’側の２’－Ｏ－Ｍｅ修飾および／もしくは５’側の
２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の各々を、Ｃａｓ９分子
（例えば、本明細書で記載される）と複合体化させ、細胞（または細胞集団）へと、例え
ば、電気穿孔により、ＲＮＰとして送達する。複数の実施形態では、各ｇＲＮＡ分子を含
むＲＮＰを、細胞と混合し、例えば、単回の電気穿孔ステップにより、同時に導入する。
他の実施形態では、ＲＮＰは、逐次的に導入することもできる。
Figure 2022137032000544
Figure 2022137032000545
特に好ましい組合せは、組合せＥ２、組合せＥ４、組合せＥ８、または組合せＥ１０を
含む。
理論に束縛されることを意図しないが、本明細書ではまた、驚くべきことに、異なる遺
伝子内に位置する、２つまたはこれを超える標的配列のターゲティングが、各標的部位に
おいて、突然変異（例えば、１または複数の核酸残基の挿入または欠失）を誘導し、これ
により、細胞内の２つまたはこれを超えるタンパク質の発現を低減するか、または消失さ
せうることも示されている。本明細書では、２つまたはこれを超える、異なる、目的の遺
伝子をターゲティングするｇＲＮＡの組合せについて記載される。
本明細書で記載される通り、１つを超えるｇＲＮＡ分子（または１つを超えるｇＲＮＡ
分子を含むＣＲＩＳＰＲ系、例えば、第１のｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系および第
２のｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系、例えば、各ｇＲＮＡ分子を、Ｃａｓ分子、例え
ば、本明細書で記載される、例えば、Ｃａｓ９分子と複合体化させたＣＲＩＳＰＲ系）を
活用する場合、１つを超えるｇＲＮＡ分子を、細胞へと、例えば、単一の導入ステップ、
例えば、単回の電気穿孔ステップで、同時に導入することができる。代替的に、１つを超
えるｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系）を、細胞へと、１つ
を超えるステップ、例えば、１回を超える電気穿孔により導入することもできる。複数の
導入ステップを活用する場合、ステップは、数時間、数日間、または数週間にわたる期間
、例えば、１時間、２時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、２日間
、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、またはこれを
超える期間隔てることができる。
ＩＸ．ｇＲＮＡの特性
本明細書ではさらに、驚くべきことに、前記ｇＲＮＡ分子を含むｇＲＮＡ分子およびＣ
ＲＩＳＰＲ系が、異なる送達法にわたり、異なるｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ構成要素を使用
して、異なる細胞型内で、同様なインデルパターンまたは同一なインデルパターンをもた
らすことも示されている。理論に束縛されずに、あるインデルパターンは、他のインデル
パターンより有利でありうると考えられる。例えば、「フレームシフト突然変異」を結果
としてもたらす挿入および／または欠失（例えば、１塩基対もしくは２塩基対の挿入もし
くは欠失、または任意の挿入もしくは欠失であって、ｎ／３（式中、ｎ＝挿入内または欠
失内のヌクレオチドの数）が整数ではない、挿入もしくは欠失）を主に含むインデルは、
機能的なタンパク質の発現を低減するか、または消失させるのに有益でありうる。同様に
、「大型の欠失」（１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、または３０ヌク
レオチドを超える欠失）を主に含むインデルもまた、例えば、プロモーター結合性部位な
ど、極めて重要な調節配列を除去するのに有益な場合があり、これは同様に、機能的なタ
ンパク質発現に対する効果の改善をもたらしうる。所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系によ
り誘導されるインデルパターンは、驚くべきことに、細胞型を越えて、一貫して再現され
ることが見出されているが、本明細書で記載される通り、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系の導
入時には、所与の細胞内で、１つのインデル構造ももたらされないことが不可避的となる
。
したがって、本発明は、有益なインデルのパターンまたは構造を創出するｇＲＮＡ分子
、例えば、フレームシフト突然変異および／または大規模な欠失から主に構成されるイン
デルのパターンまたは構造を有するｇＲＮＡ分子を提供する。このようなｇＲＮＡ分子は
、被験細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞または目的の細胞、例えば、Ｔ細胞）内で、候補
ｇＲＮＡ分子により創出される、インデルのパターンまたは構造を、本明細書で記載され
る通り、ＮＧＳにより評価することにより選択することができる。実施例で示す通り、所
望の細胞集団へと導入されると、標的遺伝子内にフレームシフト突然変異を有する、著明
な割合の細胞を含む細胞集団を結果としてもたらすｇＲＮＡ分子が発見された。場合によ
って、フレームシフト突然変異率は、７５％、８０％、８５％、９０％またはこれを超え
る高い効率である。したがって、本発明は、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子の標的部
位において、またはこれらの近傍において、例えば、本明細書で記載されるフレームシフ
ト突然変異を有する、少なくとも約４０％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約
５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約
７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約
９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）の細胞を含む細胞集団を提供
する。本発明はまた、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位において、またはこ
れらの近傍において、例えば、本明細書で記載されるフレームシフト突然変異を有する、
少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約
６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約
８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）の細胞
を含む細胞集団も提供する。
したがって、本発明は、本発明の治療法における使用のためのｇＲＮＡ分子を選択する
方法であって、１）目的の標的に対する、複数のｇＲＮＡ分子を用意するステップと、２
）前記ｇＲＮＡ分子の使用により創出される、インデルパターンまたは構造を評価するス
テップと、３）フレームシフト突然変異、大型の欠失、またはこれらの組合せから主に構
成される、インデルパターンまたは構造を形成するｇＲＮＡ分子を選択するステップと、
４）前記選択されたｇＲＮＡを、本発明の方法において使用するステップとを含む方法を
提供する。
本発明はさらに、細胞を変更する方法、および変更された細胞であって、この細胞型内
では、特定のインデルパターンが、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系により一貫してもた
らされる、方法および細胞も提供する。例えば、実施例では、本明細書で記載されるｇＲ
ＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系について観察される、最も高頻度で生じる、上位５つのインデルを
含むインデルパターンが開示される。実施例で示す通り、著明な割合の細胞が、上位５つ
のインデルのうちの１つを含む細胞集団（例えば、上位５つのインデルのうちの１つが、
集団の３０％を超える、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える細胞、または
これを超える細胞内に存在する細胞集団）が作出される。したがって、本発明は、所与の
ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系について観察される、上位５つのインデルのうちのいずれか１
つのインデルを含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲを発現する免
疫エフェクター細胞（本明細書で記載される）を提供する。さらに、本発明は、細胞、例
えば、免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（本明細
書で記載される）の集団であって、例えば、ＮＧＳで評価されると、所与のｇＲＮＡ／Ｃ
ＲＩＳＰＲ系について、本明細書で記載される、上位５つのインデルのうちの１つを含む
、高百分率の細胞を含む集団を提供する。インデルパターンの解析との関連で使用される
「高百分率」とは、集団の、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なく
とも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なく
とも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または
少なくとも約９９％）の細胞であって、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系について、本明
細書で記載される、上位５つのインデルのうちの１つを含む細胞を指す。他の実施形態で
は、細胞集団は、少なくとも約２５％（例えば、約２５％～約６０％、例えば、約２５％
～約５０％、例えば、約２５％～約４０％、例えば、約２５％～約３５％）の細胞であっ
て、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系について、本明細書で記載される、上位５つのイン
デルのうちの１つを有する細胞を含む。複数の実施形態では、ＴＲＡＣをターゲティング
する、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系についての、上位５つのインデルを、図３４Ａ、
図３４Ｂおよび図４９に提供する。複数の実施形態では、Ｂ２Ｍをターゲティングする、
所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系についての、上位５つのインデルを、図３６および図４
８に提供する。複数の実施形態では、ＣＩＩＴＡをターゲティングする、所与のｇＲＮＡ
／ＣＲＩＳＰＲ系についての、上位５つのインデルを、図３８、図４１、図４４、および
図５０に提供する。複数の実施形態では、ＦＫＢＰ１Ａをターゲティングする、所与のｇ
ＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系についての、上位５つのインデルを、図５３に提供する。
また、ある特定のｇＲＮＡ分子が、標的細胞型のゲノム内のオフターゲット配列におい
て、インデルを創出しないか、または標的部位におけるインデル創出の頻度と比べて、極
めて低頻度（例えば、集団内の細胞のうちの＜５％）でオフターゲット部位においてイン
デルをもたらすことも発見されている。したがって、本発明は、標的細胞型内で、オフタ
ーゲットインデルの形成を呈示しないか、またはオフターゲットインデルの形成頻度を＜
５％とする、ｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲ系を提供する。複数の実施形態では、本発
明は、標的細胞型内で、いかなるオフターゲットインデルの形成も呈示しないｇＲＮＡ分
子およびＣＲＩＳＰＲ系を提供する。したがって、本発明はさらに、本明細書で記載され
るｇＲＮＡ分子の標的部位におけるインデル、またはこれらの近傍におけるインデル（例
えば、例えば、本明細書で記載される、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系によりもたらさ
れる、フレームシフトインデル、または上位５つのインデルのうちのいずれか１つ）は含
むが、ｇＲＮＡ分子の任意のオフターゲット部位におけるインデル含まない、細胞、例え
ば、細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば
、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞も提供する。他の実施形態では、本発明はさら
に、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位におけるインデル、またはこれらの近
傍におけるインデル（例えば、例えば、本明細書で記載される、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩ
ＳＰＲ系によりもたらされる、フレームシフトインデル、または上位５つのインデルのう
ちのいずれか１つ）を有する細胞のうちの＞５０％は含むが、ｇＲＮＡ分子の任意のオフ
ターゲット部位におけるインデルを含む細胞のうちの、５％未満、例えば、４％未満、３
％未満、２％未満、または１％未満を含む、細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞、
例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞も提供
する。
Ｘ．送達／構築物
構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子もしくはｇＲＮＡ分子、またはこれらの両方は、様々
な形態で、送達するか、製剤化するか、または投与することができる。非限定的な例とし
て述べると、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、製剤化する（１または複数の組成物中
に）こともでき、ゲノム編集イベントが所望される細胞へと直接送達または投与すること
もできる。代替的に、１または複数の構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子もしくはｇＲＮＡ
分子、またはこれらの両方をコードする核酸は、製剤化する（１または複数の組成物中に
）こともでき、送達または投与することもできる。一態様では、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮ
Ａ分子をコードするＤＮＡとして提供することができ、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子を
コードするＤＮＡとして提供することができる。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ
９分子とは、個別の核酸分子上でコードされる。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ
９分子とは、同じ核酸分子上でコードされる。一態様では、ｇＲＮＡ分子は、ＲＮＡとし
て提供することができ、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするＤＮＡとして提供す
ることができる。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書で記載される、１
または複数の修飾と共に提供される。一態様では、ｇＲＮＡ分子は、ＲＮＡとして提供さ
れ、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするｍＲＮＡとして提供される。一態様では
、ｇＲＮＡ分子は、ＲＮＡとして提供され、Ｃａｓ９分子は、タンパク質として提供され
る。一実施形態では、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ
）として提供される。一態様では、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡと
して提供され、Ｃａｓ９分子は、タンパク質として提供される。
送達は、例えば、電気穿孔（例えば、当技術分野で公知の）または細胞膜を、核酸およ
び／もしくはポリペプチド分子に対して透過性とする他の方法により達することができる
。当技術分野では、膜を透過性とするためのさらなる技法が公知であり、例えば、細胞ス
クイージング（例えば、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組
み込まれる、国際公開第２０１５／０２３９８２号パンフレットおよび国際公開第２０１
３／０５９３４３号パンフレットにおいて記載されている）、ナノニードル（例えば、そ
れらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Chiappini et
al., Nat. Mat., 14; 532-39、または米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５８号
明細書において記載されている）、およびナノストロー（例えば、それらの内容が、参照
によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Xie, ACS Nano, 7(5); 4351-58に
おいて記載されている）を含む。
ＤＮＡにコードされる構成要素を、送達する場合、ＤＮＡは典型的に、制御領域、例え
ば、発現を実行するためのプロモーターを含む制御領域を含むであろう。Ｃａｓ９分子の
配列に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ－１アルファ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ制
御プロモーターを含む。ｇＲＮＡに有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ－１ａ、およびＵ
６プロモーターを含む。構成要素の発現を微調整するように、強度の類似するプロモータ
ーを選択することもでき、強度の類似しないプロモーターを選択することもできる。Ｃａ
ｓ９分子をコードする配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ
を含みうる。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子のプロモーターは、独
立に、誘導的プロモーターの場合もあり、組織特異的の場合もあり、細胞特異的の場合も
ある。
Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の、ＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、対象へと投与するこ
ともでき、当技術分野で公知の方法、または本明細書で記載される方法により、細胞へと
送達することもできる。例えば、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡ
をコードするＤＮＡは、例えば、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルス
ベクター）により送達することもでき、非ベクターベースの方法（例えば、ネイキッドＤ
ＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用する）により送達することもでき、これらの組合せにより
送達することもできる。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコード
するＤＮＡを、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルス、プラスミド、ミニサー
クル、またはナノプラスミド）により送達する。
ベクターは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードする配列を含みうる。
ベクターはまた、シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア
局在化のための）をコードする配列であって、例えば、Ｃａｓ９分子配列へと融合させた
配列も含みうる。例えば、ベクターは、１または複数の核局在化配列（例えば、ＳＶ４０
に由来する）であって、Ｃａｓ９分子をコードする配列へと融合させた配列を含みうる。
１または複数の調節／制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、イント
ロン、ポリアデニル化シグナル、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位
（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、およびスプライスアクセプターまたはスプライスドナーを、ベ
クター内に組み入れることができる。一部の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリ
メラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶプロモーター）により認識される。他の実施形態では、プ
ロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６プロモーター）により認識され
る。一部の実施形態では、プロモーターは、調節的プロモーター（例えば、誘導的プロモ
ーター）である。他の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。一部
の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では
、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、
非ウイルスプロモーターである。
一部の実施形態では、ベクターまたは送達媒体は、ミニサークルである。一部の実施形
態では、ベクターまたは送達媒体は、ナノプラスミドである。
一部の実施形態では、ベクターまたは送達媒体は、ウイルスベクター（例えば、組換え
ウイルスを作出するための）である。一部の実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡウイルス
（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。他の実施形態では、ウイルス
は、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。
例示的なウイルスベクター／ウイルスは、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイル
ス、および単純ヘルペスウイルスを含む。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知で
あり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, vol
umes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY、ならびに他のウイルス学マニュアルおよび
分子生物学マニュアルにおいて記載されている。
一部の実施形態では、ウイルスは、分裂細胞に感染する。他の実施形態では、ウイルス
は、非分裂細胞に感染する。一部の実施形態では、ウイルスは、分裂細胞および非分裂細
胞の両方に感染する。一部の実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムへと組み込まれうる
。一部の実施形態では、ウイルスを、例えば、ヒトにおける免疫が低減されるように操作
する。一部の実施形態では、ウイルスは、複製コンピテントである。他の実施形態では、
ウイルスは、複製欠損である、例えば、ビリオンの複製および／またはパッケージングの
さらなるラウンドに必要な遺伝子の、１または複数のコード領域を、他の遺伝子で置きか
えているか、または欠失させている。一部の実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子お
よび／またはｇＲＮＡ分子の一過性発現を引き起こす。他の実施形態では、ウイルスは、
Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の、長期にわたり持続する、例えば、少なくと
も１週間、２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、６カ月間、９カ月間、１年間、２年
間にわたる、または永続的な発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング能力は、例え
ば、少なくとも約４ｋｂ～少なくとも約３０ｋｂ、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋ
ｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または
５０ｋｂで変動しうる。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコード
するＤＮＡを、組換えレトロウイルスにより送達する。一部の実施形態では、レトロウイ
ルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組込みを可
能とする逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、レトロウイルスは、複製コンピテント
である。他の実施形態では、レトロウイルスは、複製欠損である、例えば、ビリオンの複
製およびパッケージングのさらなるラウンドに必要な遺伝子の、１または複数のコード領
域を、他の遺伝子で置きかえているか、または欠失させている。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコード
するＤＮＡを、組換えレンチウイルスにより送達する。例えば、レンチウイルスは、複製
欠損であり、例えば、ウイルスの複製に要求される、１または複数の遺伝子を含まない。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコード
するＤＮＡを、組換えアデノウイルスにより送達する。一部の実施形態では、アデノウイ
ルスは、ヒトにおける免疫を低減しているように操作されている。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコード
するＤＮＡを、組換えＡＡＶにより送達する。一部の実施形態では、ＡＡＶは、宿主細胞
、例えば、本明細書で記載される標的細胞のゲノムへと、そのゲノムを組み込みうる。一
部の実施形態では、ＡＡＶは、自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、
二本鎖ＤＮＡを一体に形成するようにアニールする鎖の両方をパッケージングするｓｃＡ
ＡＶである。開示される方法において使用されうるＡＡＶ血清型は、例えば、ＡＡＶ１、
ＡＡＶ２、改変ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、および／また
はＳ６６２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ３、改変ＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１
Ｆ、および／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、改変Ａ
ＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ８を含む
。ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、お
よびＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶもまた、開示される方法において使用することができ
る。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコード
するＤＮＡを、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書で記載されるウイルスのうちの
１または複数のハイブリッド体により送達する。
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞または標的細胞に感染することが可能なウイ
ルス粒子を形成することができる。このような細胞は、アデノウイルスをパッケージング
しうる２９３細胞と、レトロウイルスをパッケージングしうる、ψ２細胞またはＰＡ３１
７細胞とを含む。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通例、核酸ベクター
を、ウイルス粒子へとパッケージングする、プロデューサー細胞系により作出される。ベ
クターは典型的に、パッケージングと、その後における、宿主細胞または標的細胞（該当
する場合）への組込みとに要求される、最小限のウイルス配列を、発現させるタンパク質
をコードする発現カセットにより置きかえられる、他のウイルス配列と共に含有する。例
えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは典型的に、ＡＡＶゲノムに由来す
る逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列であって、パッケージングと、宿主細胞内または標的
細胞内の遺伝子発現とに要求されるＩＴＲだけを保有する。逸失するウイルスの機能は、
パッケージング細胞系により、トランスで供給される。よって、ウイルスＤＮＡは、他の
ＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐはコードするが、ＩＴＲ配列は欠く、ヘルパ
ープラスミドを含有する細胞系内でパッケージングされる。細胞系にはまた、ヘルパーと
してのアデノウイルスも感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製と、ヘ
ルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現とを促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴ
Ｒ配列の欠如のために、著明量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染
は、例えば、アデノウイルスが、ＡＡＶより感受性である熱処理により低減することがで
きる。
ある実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織型を認識する能力
を有する。例えば、ウイルスベクターは、ウイルスエンベロープの、異なる／代替的な糖
タンパク質を伴う偽型の場合もあり、細胞型特異的受容体で操作（例えば、ウイルスエン
ベロープの糖タンパク質の遺伝子改変であって、ペプチドリガンド、単鎖抗体、成長因子
などのターゲティングリガンドを組み込む遺伝子改変）される場合もあり、かつ／または
１つの末端が、ウイルスの糖タンパク質を認識し、他の末端が標的細胞表面の部分を認識
する、二重の特異性を伴う分子架橋（例えば、リガンド－受容体、モノクローナル抗体、
アビジン－ビオチン、および化学的コンジュゲーション）を有するように操作される場合
もある。
ある実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、トラ
ンス遺伝子（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）の発現を、標的細胞内だけに限定するように、組
織特異的プロモーターを構築することができる。ベクターの特異性はまた、トランス遺伝
子発現の、マイクロＲＮＡ依存型制御によっても媒介されうる。ある実施形態では、ウイ
ルスベクターは、ウイルスベクターと、標的細胞膜との融合の効率を増大させている。例
えば、ウイルスの細胞への取込みを増大させるように、融合コンピテントヘマグルチニン
（hemagglutin）（ＨＡ）などの融合タンパク質を組み込むことができる。ある実施形態
では、ウイルスベクターは、核局在化能を有する。例えば、細胞壁の破壊（細胞分裂時の
）を要求し、したがって、非分裂細胞には感染しないウイルスは、ウイルスのマトリック
スタンパク質内に、核局在化ペプチドを組み込み、これにより、非増殖細胞への形質導入
を可能とするように変更することができる。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコード
するＤＮＡを、非ベクターベースの方法（例えば、ネイキッドＤＮＡまたはＤＮＡ複合体
を使用する）により送達する。例えば、ＤＮＡを、例えば、有機修飾されたシリカまたは
ケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、電気穿孔、遺伝子銃、超音波穿孔、マグネトフェクション
、脂質媒介型トランスフェクション、デンドリマー、無機ナノ粒子、リン酸カルシウム、
またはこれらの組合せにより送達することができる。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコード
するＤＮＡを、ベクターベースの方法と、非ベクターベースの方法との組合せにより送達
する。例えば、ウィロソームは、不活化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザ
ウイルス）と組み合わせたリポソームであって、例えば、呼吸器上皮細胞内で、ウイルス
法単独またはリポソーム法単独より効率的な遺伝子移入を結果としてもたらしうるリポソ
ームを含む。
ある実施形態では、送達媒体は、非ウイルスベクターである。ある実施形態では、非ウ
イルスベクターは、無機ナノ粒子（例えば、ナノ粒子の表面へと、ペイロードを接合させ
た）である。例示的な無機ナノ粒子は、例えば、磁気ナノ粒子（例えば、Ｆｅ、ＭｎＯ２
）またはシリカを含む。ナノ粒子の表面は、正に帯電したポリマー（例えば、ポリエチレ
ンイミン、ポリリシン、ポリセリン）とコンジュゲートさせることができるが、これは、
ペイロードの接合（例えば、コンジュゲーションまたはエントラップメント）を可能とす
る。ある実施形態では、非ウイルスベクターは、有機ナノ粒子（例えば、ペイロードの、
ナノ粒子の内部へのエントラップメント）である。例示的な有機ナノ粒子は、例えば、カ
チオン性脂質を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプロタミンでコーティングさ
れた中性ヘルパー脂質、ならびに脂質コーティングでコーティングされた核酸複合体と併
せて含有するＳＮＡＬＰリポソームを含む。
ＣＲＩＳＰＲ系、またはＣＲＩＳＰＲ系もしくはその構成要素をコードする核酸、例え
ば、ベクターを移入するための、例示的な脂質および／またはポリマーは、例えば、国際
公開第２０１１／０７６８０７号パンフレット、国際公開第２０１４／１３６０８６号パ
ンフレット、国際公開第２００５／０６０６９７号パンフレット、国際公開第２０１４／
１４０２１１号パンフレット、国際公開第２０１２／０３１０４６号パンフレット、国際
公開第２０１３／１０３４６７号パンフレット、国際公開第２０１３／００６８２５号パ
ンフレット、国際公開第２０１２／００６３７８号パンフレット、国際公開第２０１５／
０９５３４０号パンフレット、および国際公開第２０１５／０９５３４６号パンフレット
において記載されている脂質および／またはポリマーを含む、前出の各々の内容は、参照
によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、媒体は、標的
細胞による、ナノ粒子およびリポソームの取込みを増大させるように、ターゲティングの
修飾、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、単鎖抗体、アプタマー、ポリマー
、糖、および細胞透過性ペプチドを有する。ある実施形態では、媒体は、融合性ペプチド
／ポリマーおよびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを使用する。ある実施形態で
は、媒体は、酸誘発性コンフォメーション変化（例えば、カーゴのエンドソームからの脱
出を加速化させる）を経る。ある実施形態では、例えば、細胞内コンパートメント内の放
出のために、刺激切断型ポリマーを使用する。例えば、細胞内の還元性環境内で切断され
る、ジスルフィドベースのカチオン性ポリマーを使用することができる。
ある実施形態では、送達媒体は、非ウイルス性の生物学的送達媒体である。ある実施形
態では、媒体は、弱毒化細菌（例えば、天然弱毒化細菌、または侵入性ではあるが、病原
性を防止するように弱毒化され、かつ、トランス遺伝子を発現するように人工的に操作さ
れた弱毒化細菌（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、
ある特定のサルモネラ（Salmonella）属株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidoba
cterium longum）、および改変大腸菌（Escherichia coli））、標的特異的組織に対する
、栄養的および組織特異的向性を有する細菌、標的組織特異性を変更するように、修飾表
面タンパク質を有する細菌）である。ある実施形態では、媒体は、遺伝子改変されたバク
テリオファージ（例えば、大きなパッケージング能力、低い免疫原性を有し、哺乳動物プ
ラスミド維持配列を含有し、ターゲティングリガンドを組み込んだ操作ファージ）である
。ある実施形態では、媒体は、哺乳動物ウイルス様粒子である。例えば、改変ウイルス粒
子を作出することができる（例えば、「空」粒子の精製に続く、所望のカーゴを伴うウイ
ルスの、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるアセンブリーにより）。媒体はまた、ターゲティングリ
ガンドを組み込んで、標的組織特異性を変更するように操作することもできる。ある実施
形態では、媒体は、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細
胞から導出されるリン脂質ベースの粒子（例えば、対象から導出される赤血球であって、
球状構造へと破壊された赤血球である、赤血球ゴースト（例えば、組織ターゲティングは
、多様な組織特異的リガンドまたは細胞特異的リガンドの接合により達成することができ
る））、または分泌性エクソソーム（対象（すなわち、患者）由来の、細胞内由来の膜結
合性ナノ小胞（３０～１００ｎｍ）（例えば、多様な細胞型から産生することができ、し
たがって、ターゲティングリガンドを必要とせずに、細胞に取り込まれうる））である。
ある実施形態では、Ｃａｓ系の構成要素、例えば、本明細書で記載される、Ｃａｓ９分
子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構成要素以外の、１または複数の核酸分子（
例えば、ＤＮＡ分子）を送達する。ある実施形態では、核酸分子を、Ｃａｓ系の構成要素
のうちの１または複数を送達するのと同時に送達する。ある実施形態では、核酸分子を、
Ｃａｓ９系の構成要素のうちの１または複数を送達する前に、または送達した後で（例え
ば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３
日間、１週間、２週間、または４週間以内に）送達する。ある実施形態では、核酸分子を
、Ｃａｓ９系の構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子
の構成要素のうちの１または複数を送達する手段と異なる手段により送達する。核酸分子
を、本明細書で記載される送達法のうちのいずれかにより送達することができる。例えば
、核酸分子は、ウイルスベクター、例えば、組込み欠損レンチウイルスにより送達するこ
とができ、Ｃａｓ９分子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構成要素を、例えば、
核酸（例えば、ＤＮＡ）により引き起こされる毒性を低減しうるように、電気穿孔により
送達することができる。ある実施形態では、核酸分子は、治療用タンパク質、例えば、本
明細書で記載されるタンパク質をコードする。ある実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分
子、例えば、本明細書で記載されるＲＮＡ分子をコードする。
Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、活性のＣａｓ９分子、不活性のＣａｓ９分子、または不活性の
Ｃａｓ９融合タンパク質）および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡを、当技術分
野で公知の方法、または本明細書で記載される方法により、細胞、例えば、本明細書で記
載される標的細胞へと送達することができる。例えば、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡおよ
び／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡを、例えば、マイクロインジェクション、電気穿
孔、脂質媒介型トランスフェクション、ペプチド媒介型送達、またはこれらの組合せによ
り送達することができる。
Ｃａｓ９分子の、タンパク質としての送達
Ｃａｓ９分子（例えば、活性のＣａｓ９分子、不活性のＣａｓ９分子、または不活性の
Ｃａｓ９融合タンパク質）を、当技術分野で公知の方法、または本明細書で記載される方
法により、細胞へと送達することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子を、例えば
、マイクロインジェクション、電気穿孔、脂質媒介型トランスフェクション、ペプチド媒
介型送達、細胞スクイージングもしくは細胞アブレーション（例えば、ナノニードルによ
る）、またはこれらの組合せにより送達することができる。送達は、ｇＲＮＡをコードす
るＤＮＡにより達することもでき、ｇＲＮＡにより達することもできる。
ある実施形態では、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を、タンパク質として
送達し、ｇＲＮＡ分子を、１または複数のＲＮＡ（例えば、本明細書で記載されるｄｇＲ
ＮＡまたはｓｇＲＮＡ）として送達する。複数の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質を、
例えば、本明細書で記載される細胞への送達の前に、リボ核タンパク質複合体（「ＲＮＰ
」）として、ｇＲＮＡ分子と複合体化させる。複数の実施形態では、ＲＮＰを、例えば、
本明細書で記載される細胞へと、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、電気穿孔によ
り送達することができる。本明細書で記載される通り、かつ、理論に束縛されずに、細胞
へと送達されるＲＮＰの濃度が低減される場合であってもなお、例えば、本明細書で記載
される標的細胞内の、標的配列において、高編集％（例えば、＞８５％、＞９０％、＞９
５％、＞９８％、または＞９９％）を結果としてもたらすｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分
子を使用することが好ましい場合がある。ここでもまた、理論に束縛されずに、標的細胞
内の標的配列において、高編集％（低ＲＮＰ濃度における高編集％を含む）をもたらすｇ
ＲＮＡ分子を含む、低減濃度または低濃度のＲＮＰを送達することは、オフターゲットの
編集イベントの頻度および数を低減しうるため、有益でありうる。低濃度または低減濃度
のＲＮＰを使用する一態様では、以下の手順：
１．Ｃａｓ９分子およびｔｒａｃｒを、溶液中、高濃度（例えば、細胞へと送達される
最終ＲＮＰ濃度より高濃度）で用意し、２つの構成要素を平衡化させる手順；
２．ｃｒＲＮＡ分子を用意し、構成要素を平衡化させる（これにより、ＲＮＰの高濃度
溶液を形成する）手順；
３．ＲＮＰ溶液を、所望の濃度まで希釈する手順；
４．前記所望の濃度の、前記ＲＮＰを、標的細胞へと、例えば、電気穿孔により送達す
る手順
を使用して、ＲＮＰを作出することができる。
ｓｇＲＮＡ分子を伴う使用では、上記のステップ２を省略し、ステップ１において、Ｃ
ａｓ９分子およびｓｇＲＮＡ分子を、溶液中、高濃度で用意し、構成要素を平衡化させる
ことにより、上記の手順を改変することができる。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子お
よび各ｇＲＮＡ構成要素を、溶液中、１：２比（Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ）で、例えば、Ｃａ
ｓ９：ｇＲＮＡ分子のモル比を１：２として用意する。ｄｇＲＮＡ分子を使用する場合、
比、例えば、モル比は、１：２：２（Ｃａｓ９：ｔｒａｃｒ：ｃｒＲＮＡ）である。複数
の実施形態では、ＲＮＰを、２０ｕＭまたはこれを超える濃度、例えば、約２０ｕＭ～約
５０ｕＭの濃度で形成する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、１０ｕＭまたはこれを超え
る濃度、例えば、約１０ｕＭ～約３０ｕＭの濃度で形成する。複数の実施形態では、ＲＮ
Ｐを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含
む溶液中に、１０ｕＭまたはこれ未満（例えば、濃度約０．０１ｕＭ～約１０ｕＭ）の最
終濃度まで希釈する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、
標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、３ｕＭまたはこれ未満（例
えば、濃度約０．０１ｕＭ～約３ｕＭ）の最終濃度まで希釈する。複数の実施形態では、
ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）
を含む溶液中に、１ｕＭまたはこれ未満（例えば、濃度約０．０１ｕＭ～約１ｕＭ）の最
終濃度まで希釈する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、
標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、０．３ｕＭまたはこれ未満
（例えば、濃度約０．０１ｕＭ～約０．３ｕＭ）の最終濃度まで希釈する。複数の実施形
態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載
される）を含む溶液中に、約３ｕＭの最終濃度で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰ
を、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む
溶液中に、約１ｕＭの最終濃度で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細
胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約０
．３ｕＭの最終濃度で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達
のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約０．１ｕＭの
最終濃度で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、
標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約０．０５ｕＭの最終濃度
で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞
（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約０．０３ｕＭの最終濃度で用意す
る。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば
、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約０．０１ｕＭの最終濃度で用意する。
構成要素の、バイモーダル送達または示差的送達
Ｃａｓ系の構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子の構成要素、およびｇＲＮＡ分子の構成要
素の個別の送達であり、より特定すると、異なる方式による構成要素の送達は、例えば、
組織特異性および安全性を改善することにより、効能を増強しうる。
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを、場合によって、本明細書では、
示差的方式と称する、異なる方式により送達する。本明細書で使用される、異なる方式ま
たは示差的方式とは、対象の構成要素分子、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、また
は鋳型核酸に対して、異なる薬力学特性または薬物動態特性を付与する送達方式を指す。
例えば、送達方式は、例えば、選択されたコンパートメント内、組織内、または臓器内で
、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布を結果としてもたらしうる。
一部の送達方式、例えば、細胞内または細胞の子孫細胞内に残留する核酸ベクターによ
る送達、例えば、自己複製または細胞内の核酸への挿入による送達は、残留性のより大き
な構成要素の発現および存在を結果としてもたらす。
ＸＩ．処置法
Ｃａｓ系、例えば、本明細書で記載される、１または複数のｇＲＮＡ分子、および１ま
たは複数のＣａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９分子）は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾
患の処置に有用である。「～を処置する」、「処置された」、「～を処置すること」、お
よび「処置」という用語は、ｃａｓ系、例えば、１または複数のｇＲＮＡ分子、および１
または複数のＣａｓ９分子の、細胞への投与であって、疾患の症状、合併症、または生化
学的徴候の発症を防止するか、または遅延させ、疾患、状態、または障害の症状を緩和す
るか、またはこれらを停止させるか、またはこれらのさらなる発生を阻害する投与を含む
。処置は、予防的（疾患の発症を防止するか、もしくは遅延させるか、またはその臨床症
状または潜在症状の顕在化を防止する）な場合もあり、疾患が顕在化した後における、症
状の、治療的抑制または緩和の場合もある。処置は、本明細書で記載される治療的尺度に
より測定することができる。本発明の「処置」法は、ｃａｓ系（例えば、１または複数の
ｇＲＮＡ分子、および１または複数のＣａｓ分子）の細胞への導入により変更された前記
細胞の、対象への投与であって、疾患または状態を治癒させるか、これらの重症度を低減
するか、またはこれらの１もしくは複数の症状を軽快させるための投与、対象の健康また
は生存を、このような処置の非存在下で予測される健康または生存を超えて延長するため
の投与を含む。例えば、「処置」は、対象における、疾患の症状の、少なくとも５％、６
％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１
７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５
５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の、またはこ
れを超える緩和を含む。
処置法／組合せ療法
別の態様では、本発明は、本発明の細胞、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子
を含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ細胞を、対象へと投与するステップ
を含む方法を提供する。複数の実施形態では、細胞は、この遺伝子の機能的産物の発現を
、非改変細胞と比べて低減するか、または消失させるよう、ｇＲＮＡ分子のターゲティン
グドメインに相補的な配列を含む遺伝子を変更するように、ｇＲＮＡ分子の導入により変
更されている。複数の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲを発
現するように、さらに操作される。複数の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞
、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞である。複数の実施形態では、細胞は、同種異系である
。複数の実施形態では、細胞は、自家である。
別の態様では、本発明は、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子
、またはｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、もしくは
、任意の時点においてこれを含んだ細胞を、それを必要とする対象へと投与するステップ
を含む方法を提供する。一実施形態では、対象は、本明細書で記載される障害を有する、
例えば、対象は、がんを有する、例えば、対象は、本明細書で記載される標的抗原を発現
するがんを有する。一実施形態では、対象は、ヒトである。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾患を
有する対象を処置する方法であって、対象へと、有効量のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細
書で記載されるｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲ
ＮＡ分子を含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞を投与するステップ
を含む方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、腫瘍抗原（例えば、本明細書で記載される抗原）の発
現と関連する疾患を有する対象を処置する方法であって、対象へと、有効量のｇＲＮＡ分
子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ分子、例えば、本明細
書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞
、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）を投与するス
テップを含み、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むＣＡ
Ｒ分子をさらに含み、前記細胞内ドメインが、共刺激性ドメインおよび／または一次シグ
ナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインが、疾患と関連する腫瘍抗原、例えば
、本明細書で記載される腫瘍抗原に結合する、方法を特色とする。
関連する態様では、本発明は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患を有する対象を処置する
方法を特色とする。方法は、対象へと、有効量の、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記
載されるｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分
子を含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞を、細胞の有効性を増大さ
せる薬剤と組み合わせて投与するステップを含み、この場合、
免疫細胞の有効性を増大させる薬剤は、
プロテインホスファターゼ阻害剤；
キナーゼ阻害剤；
サイトカイン；
免疫阻害性分子の阻害剤；または
ＴＲＥＧ細胞のレベルもしくは活性を低下させる薬剤
のうちの１または複数から選択される。
別の態様では、本発明は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、本明細書で記載さ
れる障害を有する対象の処置における使用のための、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で
記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ、免疫エフ
ェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）を含む組成物を特色とする。
前記方法または使用のうちのいずれかについての、ある特定の実施形態では、本明細書
で記載されるｇＲＮＡを含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ細胞は、ｇＲ
ＮＡターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の、機能的な遺伝子産物の
発現を、低減するか、または消滅させるように変更されている。ある実施形態では、ｇＲ
ＮＡのターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の、機能的な遺伝子産物
の発現を消滅させている。複数の実施形態では、細胞はさらに、例えば、本明細書で記載
されるＣＡＲも発現する。複数の実施形態では、細胞は、同種異系である。複数の実施形
態では、細胞は、自家である。
前記方法または使用のうちのいずれかについての、ある特定の実施形態では、腫瘍抗原
、例えば、本明細書で記載される腫瘍抗原と関連する疾患は、がんもしくは悪性腫瘍、ま
たは骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病などの前がん性状態などの増殖性
疾患から選択されるか、あるいは、本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連する非が
ん関連適応症である。一実施形態では、疾患は、本明細書で記載されるがん、例えば、本
明細書で記載される標的と関連するものとして本明細書で記載されるがんである。一実施
形態では、疾患は、血液がんである。一実施形態では、血液がんは、白血病である。一実
施形態では、がんは、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞性急性リン
パ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがこれらに限定され
ない、１または複数の急性白血病；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病
（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない、１または複数の慢性白血病；Ｂ細胞前リンパ
球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ
細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫
、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、
多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリン
パ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログ
ロブリン血症、および骨髄系血液細胞の無効な産生（または異形成）により統一される血
液学的状態の多様なコレクションである「前白血病」を含むがこれらに限定されない、さ
らなる血液がんまたは血液学的状態からなる群から選択され、本明細書で記載される腫瘍
抗原の発現と関連する疾患は、本明細書で記載される腫瘍抗原を発現する、非定型がんお
よび／もしくは非古典がん、悪性腫瘍、前がん性状態、または増殖性疾患；ならびにこれ
らの任意の組合せを含むがこれらに限定されない。別の実施形態では、本明細書で記載さ
れる腫瘍抗原と関連する疾患は、充実性腫瘍である。
ある特定の実施形態では、方法または使用を、免疫エフェクター細胞の有効性を増大さ
せる薬剤、例えば、本明細書で記載される薬剤と組み合わせて実行する。
前記方法または使用のうちのいずれかでは、腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、増殖性
疾患、前がん性状態、がん、および腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症からなる
群から選択される。
がんは、血液がん、例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リン
パ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リン
パ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、
芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫
、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ
増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫
、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽
細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症
、または前白血病のうちの１または複数から選択されるがんでありうる。
がんはまた、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、食
道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫
、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管癌
、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系が
ん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児充実
性腫瘍、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性Ｃ
ＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類
表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘導性がん、前記がんの組合せ、および
前記がんの転移性病変からも選択することができる。
本明細書で記載される方法または使用についての、ある特定の実施形態では、細胞を、
免疫エフェクター細胞の有効性を増大させる薬剤、例えば、プロテインホスファターゼ阻
害剤、キナーゼ阻害剤、サイトカイン、免疫阻害性分子の阻害剤、またはＴＲＥＧ細胞の
レベルもしくは活性を低下させる薬剤のうちの１または複数と組み合わせて投与する。
本明細書で記載される方法または使用についての、ある特定の実施形態では、プロテイ
ンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ－１阻害剤および／またはＳＨＰ－２阻害剤である。
本明細書で記載される方法または使用についての、他の実施形態では、キナーゼ阻害剤
は、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）、ＢＴＫ阻害剤（
例えば、イブルチニブまたはＲＮ－４８６）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシンま
たはエベロリムス（ＲＡＤ００１））、ＭＮＫ阻害剤、またはＰ１３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻
害剤のうちの１または複数から選択される。一実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、インター
ロイキン２誘導性キナーゼ（ＩＴＫ）のキナーゼ活性を低減しないか、またはこれを阻害
しない。
本明細書で記載される方法または使用についての、他の実施形態では、ＴＲＥＧ細胞の
レベルまたは活性を低下させる薬剤は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５
枯渇、またはこれらの組合せから選択される。
他の実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、阻害性分子またはその断片を含む第
１のポリペプチドと、細胞へと正のシグナルをもたらす第２のポリペプチドとを含み、こ
の場合、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ＣＡＲ含有免疫細胞上で発現
し、ここで、（ｉ）第１のポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ
－３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４
、ＴＧＦベータ、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、およびＣＥＡＣＡＭ－５、もし
くはこれらの断片を含み；かつ／または（ｉｉ）第２のポリペプチドは、一次シグナル伝
達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび／もしくは共刺激性シグナル伝達ド
メインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的ド
メインを含み；かつ／または共刺激性シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ、ＣＤ２７、お
よびＣＤ２８から選択されるタンパク質の機能的ドメインを含む。
他の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－７；ＩＬ－１５；インターロイキン１５（
ＩＬ－１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒａ）ポ
リペプチド、もしくはＩＬ－１５ポリペプチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方
の組合せ、例えば、ｈｅｔＩＬ－１５；ＩＬ－１８；ＩＬ－２１、またはこれらの組合せ
を含む組成物から選択される。例示的なｈｅｔＩＬ－１５は、ＩＬ－１５と、ＩＬ－１５
Ｒａとの、ヘテロ二量体による非共有結合的複合体（Ａｄｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃｓ，ＬＬＣ）である。このようなｈｅｔＩＬ－１５については、例えば、参照により
本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１２４，０８４号明細書、米国特許出願公開第
２０１２／０１７７５９８号明細書、米国特許出願公開第２００９／００８２２９９号明
細書、米国特許出願公開第２０１２／０１４１４１３号明細書、および米国特許出願公開
第２０１１／００８１３１１号明細書において記載されている。ｈｅｔＩＬ－１５につい
ては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１２４，０８４号明
細書、米国特許出願公開第２０１２／０１７７５９８号明細書、米国特許出願公開第２０
０９／００８２２９９号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１４１４１３号明細書
、および米国特許出願公開第２０１１／００８１３１１号明細書において記載されている
。ｈｅｔＩＬ－１５についての、他の例示的な複数の実施形態は、ＩＬ－１５ポリペプチ
ドと、ＩＬ－１５Ｒ（例えば、ＩＬ－１５Ｒａ）ポリペプチドとの間の共有結合的複合体
である。
他の実施形態では、細胞と、第２の薬剤、例えば、本明細書で開示される組合せ療法の
うちのいずれか（例えば、細胞の有効性を増大させる薬剤）とを、実質的に同時に、また
は逐次的に投与する。
他の実施形態では、細胞を、ＧＩＴＲをターゲティングし、かつ／またはＧＩＴＲ機能
をモジュレートする分子と組み合わせて投与する。ある特定の実施形態では、ＧＩＴＲを
ターゲティングし、かつ／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子を、ＣＡＲを発現
する細胞もしくは細胞集団の前、またはアフェレーシスの前に投与する。
一実施形態では、リンパ球の注入、例えば、同種異系リンパ球の注入を、がんの処置に
おいて使用するが、この場合、リンパ球の注入は、少なくとも１つの細胞、例えば、本発
明のＣＡＲ発現細胞を含む。一実施形態では、自家リンパ球の注入を、がんの処置におい
て使用するが、この場合、自家リンパ球の注入は、少なくとも１つの細胞、例えば、本明
細書で記載されるＣＡＲ発現細胞を含む。
一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、Ｔ細胞は、ジアシルグリセロールキナーゼ（
ＤＧＫ）欠損性である。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、Ｔ細胞は、Ｉｋａｒｏ
ｓ欠損性である。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、Ｔ細胞は、ＤＧＫ欠損性およ
びＩｋａｒｏｓ欠損性の両方である。
一実施形態では、方法は、本明細書で記載される、本発明の細胞を、細胞の活性を増強
する薬剤と組み合わせて投与するステップを含み、この場合、薬剤は、サイトカイン、例
えば、ＩＬ－７；ＩＬ－１５；インターロイキン１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド、イン
ターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒａ）ポリペプチド、もしくはＩＬ－１５
ポリペプチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩＬ－
１５；ＩＬ－１８；ＩＬ－２１；またはこれらの組合せを含む組成物である。サイトカイ
ンを、細胞の投与と組み合わせて、例えば、細胞の投与と同時に、またはこの短期間の後
に送達することができる。代替的に、サイトカインを、細胞の投与の長期間の後に、例え
ば、細胞に対する対象の応答についての評価の後に送達することができる。一実施形態で
は、サイトカインを、対象へと、請求項６１から８０のいずれかに記載の細胞または細胞
集団の投与と同時に投与する（例えば、同じ日に投与する）か、またはこの短期間の後に
投与する（例えば、投与の、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日後に投与
する）。他の実施形態では、サイトカインを、対象へと、請求項６１から８０のいずれか
に記載の細胞または細胞集団の投与の長期間（例えば、少なくとも２週間、３週間、４週
間、６週間、８週間、１０週間、またはこれを超える）の後に、または細胞に対する対象
の応答についての評価の後に投与する。
他の実施形態では、ＣＡＲを発現するようにさらに操作された、本発明の細胞を、ＣＡ
Ｒ分子を発現する細胞の投与と関連する、１または複数の副作用を軽快させる薬剤と組み
合わせて投与する。ＣＡＲ発現細胞と関連する副作用は、サイトカイン放出症候群（ＣＲ
Ｓ）または血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）から選択することができる。
前記方法または使用のうちのいずれかについての、複数の実施形態では、ＣＡＲ分子を
発現する細胞を、腫瘍抗原の発現と関連する疾患を処置する薬剤、例えば、本明細書で開
示される第２の療法または第３の療法のうちのいずれかと組み合わせて投与する。さらな
る例示的な組合せは、以下のうちの１または複数を含む。
別の実施形態では、例えば、本明細書で記載される細胞は、別の薬剤、例えば、本明細
書で記載される、キナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤と組み合わせて
投与することができる。ある実施形態では、本発明の細胞は、別の薬剤、例えば、細胞の
活性を増強する薬剤をさらに発現しうる。
例えば、一実施形態では、細胞の活性を増強する薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤で
ありうる。
一実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈ
ＲＮＡである阻害性核酸である。
別の実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、例えば、本明細書で記載される分子
、例えば、細胞、例えば、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメインへと、正の
シグナルをもたらす第２のポリペプチドと関連する、第１のポリペプチド、例えば、阻害
性分子を含む薬剤である。一実施形態では、薬剤は、例えば、阻害性分子またはその断片
（例えば、これらのうちのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）の、第１のポリ
ペプチドと、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば共刺激性ドメイ
ン（例えば、本明細書で記載される、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２８）、
および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される、ＣＤ３ゼー
タシグナル伝達ドメイン）を含む）である、第２のポリペプチドとを含む。一実施形態で
は、薬剤は、ＰＤ１またはその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部
）の、第１のポリペプチドと、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例え
ば、本明細書で記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、および／または本明細書で記
載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の、第２のポリペプチドとを含む。
一実施形態では、本発明の細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、前出の幹細胞移植
、例えば、自家幹細胞移植を施された対象へと投与する。
一実施形態では、本発明の細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、前出の用量のメル
ファランを施された対象へと投与する。
一実施形態では、本発明の細胞を、細胞の有効性を増大させる薬剤、例えば、本明細書
で記載される薬剤と組み合わせて投与する。
一実施形態では、本発明の細胞を、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投
与する。理論に束縛されることを望まないが、低免疫増強用量（例えば、免疫系を完全に
抑制するには不十分であるが、免疫機能を改善するには十分な用量）による処置は、ＰＤ
－１陽性Ｔ細胞の減少、またはＰＤ－１陰性細胞の増大を伴うと考えられる。ＰＤ－１陽
性Ｔ細胞は、ＰＤ－１リガンド、例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２を発現する細胞と
の係合により消尽させることができるが、ＰＤ－１陰性Ｔ細胞は、これらにより消尽させ
ることができない。
ある実施形態では、この手法を使用して、対象における、本明細書で記載される細胞の
効能を最適化することができる。理論に束縛されることを望まないが、ある実施形態では
、内因性の非改変免疫エフェクター細胞、例えば、非改変Ｔ細胞または非改変ＮＫ細胞の
効能が改善されると考えられる。理論に束縛されることを望まないが、ある実施形態では
、ＣＡＲ発現細胞の効能が改善されると考えられる。他の実施形態では、本発明のｇＲＮ
Ａ分子を含むか、または含むように操作されることになる細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮ
Ｋ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増大させるか、また
はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞
、例えば、Ｔ細胞の比を増大させる量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、ｅｘ
ｖｉｖｏで処置することができる。
ある実施形態では、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤
、例えば、ＲＡＤ００１、または触媒性阻害剤の投与を、本明細書で記載される、ＣＡＲ
を発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与の前に開始する。ある実施形態で
は、細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞のレベ
ル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェク
ター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過性に、増大しているように、十分な時
間の後で、またはｍＴＯＲ阻害剤の十分な投与の後で投与する。
ある実施形態では、本発明のｇＲＮＡを含むように操作される細胞、例えば、Ｔ細胞ま
たはＮＫ細胞を、対象におけるＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベ
ル、もしくはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェ
クター細胞、例えば、Ｔ細胞の比、または対象から採取されたこれらが、少なくとも一過
性に、増大しているように、十分な時間の後で、または低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤
の十分な投与の後で採取する。
一実施形態では、本発明の細胞を、細胞の投与と関連する、１または複数の副作用を軽
快させる薬剤、例えば、本明細書で記載される薬剤と組み合わせて投与する。
一実施形態では、細胞を、本明細書で記載されるがん関連抗原と関連する疾患を処置す
る薬剤、例えば、本明細書で記載される薬剤と組み合わせて投与する。
一実施形態では、細胞を、本明細書で記載される用量および／または投与スケジュール
で投与する。
一実施形態では、対象（例えば、ヒト）に、本発明の細胞の初回投与を施し、本発明の
細胞の、後続の１回または複数回の投与を施すが、この場合、後続の１回または複数回の
投与を、前回の投与の１５日未満後、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、
７、６、５、４、３、または２日後に投与する。一実施形態では、本発明の細胞の、対象
（例えば、ヒト）への、毎週１回を超える投与を行う、例えば、ＣＡＲ分子を含む細胞の
、毎週２、３、または４回の投与を行う。一実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）に
、本発明の細胞の、毎週１回を超える投与（例えば、毎週２、３、または４回の投与）（
本明細書ではまた、サイクルとも称する）を施すのに続く週では、本発明の細胞の投与を
行わず、次いで、本発明の細胞の、１回または複数回のさらなる投与（例えば、本発明の
細胞の、毎週１回を超える投与）を、対象へと投与する。別の実施形態では、対象（例え
ば、ヒト対象）に、本発明の細胞の、１つを超えるサイクルを施し、各サイクルの間の時
間は、１０、９、８、７、６、５、４、または３日間未満である。一実施形態では、本発
明の細胞を、毎週３回の投与のために、隔日で投与する。一実施形態では、本発明の細胞
を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間、またはこれを超える期間にわたり投与
する。
一実施形態では、本発明の細胞を、疾患、例えば、がん、例えば、本明細書で記載され
るがんのための、第１選択処置として投与する。別の実施形態では、本発明の細胞を、疾
患、例えば、がん、例えば、本明細書で記載されるがんのための、第２選択処置、第３選
択処置、第４選択処置として投与する。
一実施形態では、本明細書で記載される細胞集団を、投与する。
別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明のｇＲＮＡをコードする
単離核酸分子と、本発明のｇＲＮＡ分子と、本発明のｇＲＮＡを含むか、または、任意の
時点においてこれを含んだ細胞とに関する。複数の実施形態では、本発明のｇＲＮＡを含
むか、または、任意の時点においてこれを含んだ細胞は、ｇＲＮＡのターゲティングドメ
インに相補的な配列を含む遺伝子の機能的産物の発現を、低減するか、または消滅させる
ように、変更されるか、または変更されることになる。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する疾患の処置に
おける使用のための、本発明のｇＲＮＡをコードする単離核酸分子と、本発明のｇＲＮＡ
分子と、本発明のｇＲＮＡを含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ細胞とに
関する。複数の実施形態では、本発明のｇＲＮＡを含むか、または、任意の時点において
これを含んだ細胞は、ｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な配列を含む遺伝子の
機能的産物の発現を、低減するか、または消滅させるように、変更されるか、または変更
されることになる。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載されるサイトカイン、例えば、ＩＬ－７；Ｉ
Ｌ－１５；インターロイキン１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受
容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒａ）ポリペプチド、もしくはＩＬ－１５ポリペプチドおよび
ＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩＬ－１５；ＩＬ－１８；
ならびに／またはＩＬ－２１；ならびに／またはこれらの組合せを含む組成物と組み合わ
せた、医薬としての使用のための、本発明のｇＲＮＡをコードする単離核酸分子と、本発
明のｇＲＮＡ分子と、本発明のｇＲＮＡを含むか、または、任意の時点においてこれを含
んだ細胞とに関する。別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書で
記載されるサイトカインであって、本明細書で記載される細胞と組み合わせたサイトカイ
ンに関する。複数の実施形態では、本発明のｇＲＮＡを含むか、または、任意の時点にお
いてこれを含んだ細胞は、ｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な配列を含む遺伝
子の機能的産物の発現を、低減するか、または消滅させるように、変更されるか、または
変更されることになる。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載されるキナーゼ阻害剤および／またはチェッ
クポイント阻害剤と組み合わせた、医薬としての使用のための、本発明のｇＲＮＡをコー
ドする単離核酸分子と、本発明のｇＲＮＡ分子と、本発明のｇＲＮＡを含むか、または、
任意の時点においてこれを含んだ細胞とに関する。別の態様では、本発明は、本発明のｇ
ＲＮＡを含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ細胞と組み合わせた、医薬と
しての使用のための、本明細書で記載される、キナーゼ阻害剤および／またはチェックポ
イント阻害剤に関する。
別の態様では、本発明は、腫瘍支持抗原の発現と関連する疾患、例えば、本明細書で記
載される障害を有する対象の処置における使用のための、本発明の細胞を含む組成物を特
色とする。
前記方法または使用のうちのいずれかでは、腫瘍支持抗原の発現と関連する疾患は、増
殖性疾患、前がん性状態、がん、および腫瘍支持抗原の発現と関連する非がん関連適応症
からなる群から選択される。ある実施形態では、本明細書で記載される腫瘍支持抗原と関
連する疾患は、充実性腫瘍である。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、本発明の細胞を、別
の薬剤と組み合わせて投与する。一実施形態では、薬剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、Ｃ
ＤＫ４／６阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＮＫ阻害剤、またはＰＩ３Ｋ／ｍ
ＴＯＲ二重阻害剤、およびこれらの組合せでありうる。一実施形態では、キナーゼ阻害剤
は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、本明細書で記載されるＣＤＫ４阻害剤、例えば、６－アセ
チル－８－シクロペンチル－５－メチル－２－（５－ピペラジン－１－イル－ピリジン－
２－イルアミノ）－８Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－オン、ヒドロクロリド
（パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１ともまた称する）など、例えば、ＣＤ４／６
阻害剤である。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニ
ブなど、例えば、本明細書で記載されるＢＴＫ阻害剤である。一実施形態では、キナーゼ
阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ＯＳＩ－０２
７など、例えば、本明細書で記載されるｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例え
ば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、本明細書で記載さ
れるｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤でありうる。一実施形態では
、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４－アミノ－５－（４－フルオロアニリノ
）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジンなど、例えば、本明細書で記載されるＭＮＫ阻害
剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ阻害剤、ＭＮＫ１ｂ阻害剤、ＭＮＫ２ａ
阻害剤、および／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤でありうる。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤は
、例えば、ＰＦ－０４６９５１０２でありうる。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、
アロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ－１２７５、２－（２－クロロフェニル）
－５，７－ジヒドロキシ－８－［（３Ｓ，４Ｒ）－３－ヒドロキシ－１－メチル－４－ピ
ペリジニル］－４－クロメノン；クリゾチニブ（ＰＦ－０２３４１０６６；２－（２－ク
ロロフェニル）－５，７－ジヒドロキシ－８－［（２Ｒ，３Ｓ）－２－（ヒドロキシメチ
ル）－１－メチル－３－ピロリジニル］－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン、ヒドロク
ロリド（Ｐ２７６－００）；１－メチル－５－［［２－［５－（トリフルオロメチル）－
１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－４－ピリジニル］オキシ］－Ｎ－［４－（トリフルオ
ロメチル）フェニル］－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－アミン（ＲＡＦ２６５）；イン
ジスラム（Ｅ７０７０）；ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）；パルボシクリブ（ＰＤ０３３
２９９１）；ジナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）；Ｎ－［５－［［（５－ｔｅｒｔ－ブ
チルオキサゾール－２－イル）メチル］チオ］チアゾール－２－イル］ピペリジン－４－
カルボキサミド（ＢＭＳ３８７０３２）；４－［［９－クロロ－７－（２，６－ジフルオ
ロフェニル）－５Ｈ－ピリミド［５，４－ｄ］［２］ベンザゼピン－２－イル］アミノ］
－安息香酸（ＭＬＮ８０５４）；５－［３－（４，６－ジフルオロ－１Ｈ－ベンズイミダ
ゾール－２－イル）－１Ｈ－インダゾール－５－イル］－Ｎ－エチル－４－メチル－３－
ピリジンメタンアミン（ＡＧ－０２４３２２）；４－（２，６－ジクロロベンゾイルアミ
ノ）－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボン酸Ｎ－（ピペリジン－４－イル）アミド（ＡＴ７
５１９）；４－［２－メチル－１－（１－メチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イ
ル］－Ｎ－［４－（メチルスルホニル）フェニル］－２－ピリミジンアミン（ＡＺＤ５４
３８）；およびＸＬ２８１（ＢＭＳ９０８６６２）から選択されるＣＤＫ４阻害剤である
。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、
ＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）であり、パルボシクリ
ブは、約５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、
１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍ
ｇ（例えば、７５ｍｇ、１００ｍｇ、または１２５ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎
日、例えば、２８日間のサイクルの、１４～２１日間にわたり毎日、または２１日間のサ
イクルの、７～１２日間にわたり毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはこれを超えるサイクルのパルボシクリブを
投与する。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、
イブルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５）；ＧＤＣ－０８３４；ＲＮ－４８６；ＣＧＩ－５６
０；ＣＧＩ－１７６４；ＨＭ－７１２２４；ＣＣ－２９２；ＯＮＯ－４０５９；ＣＮＸ－
７７４；およびＬＦＭ－Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。一実施形態では、Ｂ
ＴＫ阻害剤は、インターロイキン２誘導性キナーゼ（ＩＴＫ）のキナーゼ活性を低減しな
いか、またはこれを阻害せず、ＧＤＣ－０８３４；ＲＮ－４８６；ＣＧＩ－５６０；ＣＧ
Ｉ－１７６４；ＨＭ－７１２２４；ＣＣ－２９２；ＯＮＯ－４０５９；ＣＮＸ－７７４；
およびＬＦＭ－Ａ１３から選択される。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、
ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５）であり、イブルチニブは、
約２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０
ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６
００ｍｇ（例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇ、または５６０ｍｇ）の用量で、ある期間に
わたり毎日、例えば、２１日間のサイクルにわたり毎日、または２８日間のサイクルにわ
たり毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
１、１２、またはこれを超えるサイクルのイブルチニブを投与する。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、
ＩＴＫのキナーゼ活性を阻害しないＢＴＫ阻害剤、例えば、ＲＮ－４８６であり、ＲＮ－
４８６は、約１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍ
ｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、２１０ｍｇ、２２
０ｍｇ、２３０ｍｇ、２４０ｍｇ、２５０ｍｇ（例えば、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、また
は２５０ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２８日間のサイクルにわたり
毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、またはこれを超えるサ
イクルのＲＮ－４８６を投与する。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、
テムシロリムス；ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としてもまた公知のリダホロリムス
（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－［（２Ｒ）－２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，
１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ、２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）
－１，１８－ジヒドロキシ－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３、２９，
３５－ヘキサメチル－２，３，１０，１４，２０－ペンタオキソ－１１，３６－ジオキサ
－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２
６，２８－テトラエン－１２－イル］プロピル］－２－メトキシシクロヘキシルジメチル
ホスフィネート；エベロリムス（ＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９）；シ
マピモド；（５－｛２，４－ビス［（３Ｓ）－３－メチルモルホリン－４－イル］ピリド
［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル｝－２－メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８
０５５）；２－アミノ－８－［ｔｒａｎｓ－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキ
シル］－６－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピ
リミジン－７（８Ｈ）－オン（ＰＦ０４６９１５０２）；およびＮ２－［１，４－ジオキ
ソ－４－［［４－（４－オキソ－８－フェニル－４Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）モ
ルホリニウム－４－イル］メトキシ］ブチル］－Ｌ－アルギニルグリシル－Ｌ－α－アス
パルチルＬ－セリン－（配列番号６６５９）、内塩（ＳＦ１１２６）；およびＸＬ７６５
から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンは、約３ｍｇ、４ｍｇ、５
ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ（例えば、６ｍｇ）の用量で、ある期
間にわたり毎日、例えば、２１日間のサイクルにわたり毎日、または２８日間のサイクル
にわたり毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、１１、１２、またはこれを超えるサイクルのラパマイシンを投与する。一実施形態では
、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスは、
約２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１
０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ（例えば、１０ｍｇ）の用
量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２８日間のサイクルにわたり毎日投与される。一
実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはこれを
超えるサイクルのエベロリムスを投与する。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、
ＣＧＰ０５２０８８；４－アミノ－３－（ｐ－フルオロフェニルアミノ）－ピラゾロ［３
，４－ｄ］ピリミジン（ＣＧＰ５７３８０）；セロコスポラミド；ＥＴＣ－１７８０４４
５－２；および４－アミノ－５－（４－フルオロアニリノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピ
リミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、
２－アミノ－８－［ｔｒａｎｓ－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６
－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－
７（８Ｈ）－オン（ＰＦ－０４６９１５０２）；Ｎ－［４－［［４－（ジメチルアミノ）
－１－ピペリジニル］カルボニル］フェニル］－Ｎ’－［４－（４，６－ジ－４－モルホ
リニル－１，３，５－トリアジン－２－イル）フェニル］尿素（ＰＦ－０５２１２３８４
ＰＫＩ－５８７）；２－メチル－２－｛４－［３－メチル－２－オキソ－８－（キノリン
－３－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］
フェニル｝プロパンニトリル（ＢＥＺ－２３５）；アピトリシブ（ＧＤＣ－０９８０、Ｒ
Ｇ７４２２）；２，４－ジフルオロ－Ｎ－｛２－（メチルオキシ）－５－［４－（４－ピ
リダジニル）－６－キノリニル］－３－ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド（ＧＳＫ２
１２６４５８）；８－（６－メトキシピリジン－３－イル）－３－メチル－１－（４－（
ピペラジン－１－イル）－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－イミダゾ［４
，５－ｃ］キノリン－２（３Ｈ）－オン マレイン酸塩（ＮＶＰ－ＢＧＴ２２６）；３－
［４－（４－モルホリニルピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２－ｄ］ピリミジン
－２－イル］フェノール（ＰＩ－１０３）；５－（９－イソプロピル－８－メチル－２－
モルホリノ－９Ｈ－プリン－６－イル）ピリミジン－２－アミン（ＶＳ－５５８４、ＳＢ
２３４３）；およびＮ－［２－［（３，５－ジメトキシフェニル）アミノ］キノキサリン
－３－イル］－４－［（４－メチル－３－メトキシフェニル）カルボニル］アミノフェニ
ルスルホンアミド（ＸＬ７６５）から選択される、ホスファチジルイノシトール３－キナ
ーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ｍＴＯＲ二重阻害剤である。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、本明細書で記載され
る、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を、対象へと、プロテインチロシンホスファ
ターゼ阻害剤、例えば、本明細書で記載される、プロテインチロシンホスファターゼ阻害
剤と組み合わせて投与する。一実施形態では、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤
は、ＳＨＰ－１阻害剤、例えば、スチボグルコン酸ナトリウムなど、例えば、本明細書で
記載されるＳＨＰ－１阻害剤である。一実施形態では、プロテインチロシンホスファター
ゼ阻害剤は、ＳＨＰ－２阻害剤である。
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、本発明の細胞を、別
の薬剤と組み合わせて投与し、薬剤は、サイトカインである。サイトカインは、例えば、
ＩＬ－７；ＩＬ－１５；インターロイキン１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド、インターロ
イキン１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒａ）ポリペプチド、もしくはＩＬ－１５ポリペ
プチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩＬ－１５；
ＩＬ－１８；ＩＬ－２１；またはこれらの組合せを含む組成物でありうる。別の実施形態
では、本発明の細胞を、チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書で記載されるチェッ
クポイント阻害剤と組み合わせて投与する。例えば、一実施形態では、チェックポイント
阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、
ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３
、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＴＧＦ
ベータから選択される阻害性分子を阻害する。
一態様では、本発明は、対象、例えば、本明細書で記載される状態を有する対象を、本
発明のｇＲＮＡ分子を含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ、同種異系細胞
、例えば、同種異系免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲを発現する同種異系Ｔ細胞で
処置する方法を提供する。複数の実施形態では、細胞は、ｇＲＮＡのターゲティングドメ
インに相補的な標的配列を含む遺伝子の、機能的な遺伝子産物の発現を、低減するか、ま
たは消失させるように、変更されている。
一態様では、本発明は、
（ａ）同種異系ドナーに由来する細胞集団を用意するステップと；
（ｂ）細胞へと、本発明の第１のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする
核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９による
ＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと；
（ｃ）任意選択で、第１のｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な標的配列を含
む遺伝子の、遺伝子産物（例えば、機能的遺伝子産物）の発現を低減したか、または消失
させた細胞を選択するステップと；
（ｄ）細胞に、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップ
と；
（ｅ）細胞を、それを必要とする患者、例えば、ＣＡＲにより認識される抗原の発現と
関連する疾患を有する患者へと投与するステップと
を含む処置法を提供する。
複数の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、同種異系Ｔ細胞標的、例えば、ＴＣＲの
構成要素、例えば、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１
、およびＴＲＢＣ２から選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメイ
ンを含む、第１のｇＲＮＡ分子に相補的なターゲティングドメインを含む。複数の実施形
態では、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴ
ＲＢＣ２に対する第１のｇＲＮＡは、表１、表４、または表５で列挙されるターゲティン
グドメインを含む第１のｇＲＮＡである。複数の実施形態では、ステップ（ｃ）は、これ
らの、選択された、ＴＣＲの発現について陰性である細胞を含む。複数の実施形態では、
方法は、患者へと、例えば、ＮＫ細胞を選択的に阻害するか、または枯渇させる薬剤と、
ＮＫ細胞に特異的な抗原であって、例えば、Ｔ細胞上で発現しない抗原に対する、抗体ま
たは抗原結合性断片とを投与するステップをさらに含む。
複数の実施形態では、方法は、細胞へと、本発明の第２のｇＲＮＡ分子（または前記ｇ
ＲＮＡ分子をコードする核酸）を導入するステップ、例えば、細胞へと、本発明の第２の
ｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例
えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステッ
プをさらに含む。複数の実施形態では、第２のｇＲＮＡ分子は、同種異系Ｔ細胞標的に相
補的なターゲティングドメイン、例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬ
Ａ－Ｃから選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第
２のｇＲＮＡ分子を含む。複数の実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、また
はＨＬＡ－Ｃに対する第２のｇＲＮＡは、表１、または表３のターゲティングドメインを
含む、第２のｇＲＮＡである。複数の実施形態では、ステップ（ｃ）は、任意選択で、第
１のｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の、遺伝子産物
（例えば、機能的な遺伝子産物）の発現、および第２のｇＲＮＡのターゲティングドメイ
ンに相補的な標的配列を含む遺伝子の、遺伝子産物（例えば、機能的な遺伝子産物）の発
現を、低減したか、または消失させた細胞を選択することを含む。複数の実施形態では、
ステップ（ｃ）は、これらの、選択された、ＴＣＲの発現について陰性であり、かつ／ま
たはＢ２ＭまたはＨＬＡの発現について陰性である細胞を含む。複数の実施形態では、方
法は、患者へと、例えば、ＮＫ細胞を選択的に阻害するか、または枯渇させる薬剤と、Ｎ
Ｋ細胞に特異的な抗原であって、例えば、Ｔ細胞上で発現しない抗原に対する、抗体また
は抗原結合性断片とを投与するステップをさらに含む。
複数の実施形態では、方法は、細胞へと、本発明の第３のｇＲＮＡ分子（または前記ｇ
ＲＮＡ分子をコードする核酸）を導入するステップ、例えば、細胞へと、本発明の第２の
ｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例
えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステッ
プをさらに含む。複数の実施形態では、第３のｇＲＮＡ分子は、阻害性分子、または阻害
性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの遺伝子内の標的配列に相補的なター
ゲティングドメイン、例えば、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ
－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、お
よび／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、Ｃ
Ｄ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴ
ＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣ
クラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータ、ならびにＰ
ＴＰＮ１１から選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む
、第３のｇＲＮＡ分子を含む。複数の実施形態では、第３のｇＲＮＡは、ＣＤ２７４、Ｈ
ＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、またはＰＴＰＮ１１に対するターゲティングドメイ
ンであって、表２または表６のターゲティングドメインから選択されるターゲティングド
メインを含む。複数の実施形態では、ステップ（ｃ）は、任意選択で、第１のｇＲＮＡの
ターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の、遺伝子産物（例えば、機能
的な遺伝子産物）の発現、第２のｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な標的配列
を含む遺伝子の、遺伝子産物（例えば、機能的な遺伝子産物）の発現、および／または第
３のｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の、遺伝子産物
（例えば、機能的な遺伝子産物）の発現を、低減したか、または消失させた細胞を選択す
ることを含む。複数の実施形態では、ステップ（ｃ）は、ＴＣＲの発現について陰性であ
り、Ｂ２ＭまたはＨＬＡの発現について陰性であり、かつ／またはターゲティングされた
、阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの発現につ
いて陰性である細胞を選択することを含む。複数の実施形態では、方法は、患者へと、例
えば、ＮＫ細胞を選択的に阻害するか、または枯渇させる薬剤と、ＮＫ細胞に特異的な抗
原であって、例えば、Ｔ細胞上で発現しない抗原に対する、抗体または抗原結合性断片と
を投与するステップをさらに含む。他の実施形態では、第３のｇＲＮＡは、例えば、本明
細書で記載される、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰから選択される遺
伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む。複数の実施形態では、第３
のｇＲＮＡは、例えば、本明細書の、例えば、表６ｃに記載されるＣＩＩＴＡ遺伝子内の
標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む。
前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、ＣＡＲは、本明細書で
記載されるＣＡＲである。前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは
、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ ＣＡＲ、例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ ＣＡＲであり
、配列番号８５５９を含むＣＡＲを含むか、またはこれを発現するように操作される。複
数の態様では、ＣＡＲをコードする核酸を、ウイルスのベクター、例えば、レンチウイル
スベクターの形質導入により、細胞へと導入する。他の複数の態様では、ＣＡＲをコード
する核酸を、前記細胞へと導入されたＣＲＩＳＰＲ系のうちの１つにより修飾される部位
において、またはこの近傍において、宿主細胞ゲノム内に組み込まれるＤＮＡとして導入
する。
一態様では、本発明は、
（ａ）細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細書で記載される、例
えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、同種異系ドナーに由来する前記細胞集団）を用意
するステップと；
（ｂ）細胞集団へと、ＣＤ２４７内、ＣＤ３Ｄ内、ＣＤ３Ｅ内、ＣＤ３Ｇ内、ＴＲＡＣ
内、ＴＲＢＣ１内、ＴＲＢＣ２内の標的配列、例えば、ＴＲＡＣ内、ＴＲＢＣ１内、また
はＴＲＢＣ２内の標的配列、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＴＲＡＣ内の標的
配列に、相補的なターゲティングドメインを含む、本発明の第１のｇＲＮＡ分子（または
前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（
S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと；
（ｃ）細胞集団へと、例えば、本明細書で記載されるＢ２Ｍ内の標的配列に相補的なタ
ーゲティングドメインを含む、本発明の第２のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子を
コードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａ
ｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと；
（ｄ）任意選択で、機能的ＴＣＲの発現を低減したか、または消失させた細胞を選択す
るステップと；
（ｅ）細胞集団に、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書で記載さ
れるＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップと；
（ｆ）細胞集団を、それを必要とする患者、例えば、ＣＡＲにより認識される抗原の発
現と関連する疾患を有する患者へと投与するステップと
を含む処置法を提供する。
一実施形態では、方法は、（ｇ）前記細胞集団へと、ＣＩＩＴＡ内、ＲＦＸＡＮＫ内、
ＲＦＸ５内、またはＲＦＸＡＰ内の標的配列に相補的な、例えば、本明細書で記載される
ＣＩＩＴＡ内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、本発明の第３のｇＲ
ＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば
、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップを
さらに含む。
一態様では、本発明は、
（ａ）細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細書で記載される、例
えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（例えば、同種異系ドナーに由来する前記細胞集団）を用意
するステップと；
（ｂ）細胞集団へと、ＣＤ２４７内、ＣＤ３Ｄ内、ＣＤ３Ｅ内、ＣＤ３Ｇ内、ＴＲＡＣ
内、ＴＲＢＣ１内、ＴＲＢＣ２内の標的配列、例えば、ＴＲＡＣ内、ＴＲＢＣ１内、また
はＴＲＢＣ２内の標的配列、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＴＲＡＣ内の標的
配列に相補的なターゲティングドメインを含む、本発明の第１のｇＲＮＡ分子（または前
記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S.
pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと；
（ｃ）細胞集団へと、例えば、本明細書で記載されるＮＬＲＣ５内の標的配列に相補的
なターゲティングドメインを含む、本発明の第２のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分
子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）
Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと；
（ｄ）任意選択で、機能的ＴＣＲの発現を低減したか、または消失させた細胞を選択す
るステップと；
（ｅ）細胞集団に、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書で記載さ
れるＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップと；
（ｆ）細胞集団を、それを必要とする患者、例えば、ＣＡＲにより認識される抗原の発
現と関連する疾患を有する患者へと投与するステップと
を含む処置法を提供する。
一実施形態では、方法は、（ｇ）前記細胞集団へと、ＣＩＩＴＡ内、ＲＦＸＡＮＫ内、
ＲＦＸ５内、またはＲＦＸＡＰ内の標的配列に相補的な、例えば、本明細書で記載される
、例えば、ＣＩＩＴＡ内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、本発明の
第３のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ
系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入する
ステップをさらに含む。
一態様では、本発明は、
（ａ）細胞集団、例えば、同種異系ドナーまたは自家ドナーに由来する免疫エフェクタ
ー細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）を用意するステップと；
（ｂ）細胞へと、本発明の第１のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする
核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９による
ＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと；
（ｃ）任意選択で、第１のｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な標的配列を含
む遺伝子の、遺伝子産物（例えば、機能的遺伝子産物）の発現を低減したか、または消失
させた細胞を選択するステップと；
（ｄ）細胞に、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップ
と；
（ｅ）細胞を、それを必要とする患者、例えば、ＣＡＲにより認識される抗原の発現と
関連する疾患を有する患者へと投与するステップと
を含む処置法を提供する。
複数の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子は、阻害性分子、または阻害性分子を介する
シグナル伝達の下流のエフェクターの遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメ
インを含む、例えば、第１のｇＲＮＡ分子は、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、Ｐ
ＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡ
ＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、
ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ
７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ
２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベー
タ、ならびにＰＴＰＮ１１から選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティング
ドメインを含む。複数の実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、
ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、またはＰＴＰＮ１１に対するターゲティングドメインであって、
表２または表６のターゲティングドメインから選択されるターゲティングドメインを含む
。複数の実施形態では、ステップ（ｃ）は、任意選択で、第１のｇＲＮＡのターゲティン
グドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の、遺伝子産物（例えば、機能的遺伝子産物
）の発現を低減したか、または消失させた細胞を選択することを含む。
複数の実施形態では、方法は、細胞へと、本発明の、少なくとも第２のｇＲＮＡ分子（
例えば、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子）（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする
核酸）を導入するステップをさらに含む。複数の実施形態では、各さらなるｇＲＮＡ分子
、例えば、第２のｇＲＮＡ分子は、阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達
の下流のエフェクターの遺伝子内の標的配列に、例えば、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、Ｌ
ＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－
１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、Ｔ
ＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１
１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、
ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、および
ＴＧＦベータ、ならびにＰＴＰＮ１１から選択される遺伝子内の標的配列に相補的なター
ゲティングドメインを含む。複数の実施形態では、第３のｇＲＮＡは、ＣＤ２７４、ＨＡ
ＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、またはＰＴＰＮ１１に対するターゲティングドメイン
であって、表２または表６のターゲティングドメインから選択されるターゲティングドメ
インを含む。複数の実施形態では、各さらなるｇＲＮＡ分子は、異なる阻害性分子、また
は阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの遺伝子内の標的配列に相補的
なターゲティングドメインを含む。複数の実施形態では、ステップ（ｃ）は、任意選択で
、第１のｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の、遺伝子
産物（例えば、機能的遺伝子産物）の発現、第２のｇＲＮＡのターゲティングドメインに
相補的な標的配列を含む遺伝子の、遺伝子産物（例えば、機能的遺伝子産物）の発現、お
よび／または第３のｇＲＮＡもしくはこれを超えるｇＲＮＡ（存在する場合）のターゲテ
ィングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の、遺伝子産物（例えば、機能的遺伝子
産物）の発現を、低減したか、または消失させた細胞を選択することを含む。
一態様では、本発明は、対象、例えば、本明細書で記載される状態を有する対象を、Ｔ
ＣＲの構成要素をターゲティングするｇＲＮＡ分子と、免疫抑制薬の標的をターゲティン
グするｇＲＮＡ分子とを含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ、同種異系細
胞、例えば、同種異系免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲを発現する同種異系Ｔ細胞
で処置する方法を提供する。複数の実施形態では、細胞は、機能的ＴＣＲの発現と、免疫
抑制薬の機能的標的の発現とを、低減するか、または消失させるように、変更されている
。
一態様では、本発明は、
（ａ）同種異系ドナーに由来する細胞集団を用意するステップと；
（ｂ）細胞へと、ＣＤ２４７内、ＣＤ３Ｄ内、ＣＤ３Ｅ内、ＣＤ３Ｇ内、ＴＲＡＣ内、
ＴＲＢＣ１内、ＴＲＢＣ２内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、本発
明の第１のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳ
ＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入
するステップと；
（ｃ）細胞へと、ＤＣＫ内、ＣＤ５２内、ＦＫＢＰ１Ａ内、またはＮＲ３Ｃ１内の標的
配列に相補的なターゲティングドメインを含む、本発明の第２のｇＲＮＡ分子（または前
記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S.
pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと；
（ｄ）任意選択で、機能的ＴＣＲの発現、免疫抑制薬の機能的標的の発現、または機能
的ＴＣＲ、および免疫抑制薬の機能的標的の発現を低減したか、または消失させた細胞を
選択するステップと；
（ｅ）細胞に、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップ
と；
（ｆ）細胞を、それを必要とする患者、例えば、ＣＡＲにより認識される抗原の発現と
関連する疾患を有する患者へと投与するステップと；
（ｇ）患者へと、（ｃ）のｇＲＮＡによりターゲティングされる免疫抑制薬の標的に結
合する免疫抑制薬を投与するステップと
を含む処置法を提供する。
複数の実施形態では、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ
Ｃ１、またはＴＲＢＣ２に対する第１のｇＲＮＡは、表１、表４、または表５で列挙され
るターゲティングドメインを含む第１のｇＲＮＡである。複数の実施形態では、ＤＣＫ、
ＣＤ５２、ＦＫＢＰ１Ａ、またはＮＲ３Ｃ１に対する第２のｇＲＮＡは、表１に列挙され
るターゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子である。複数の実施形態では、第
１のｇＲＮＡは、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２をターゲティングする。複数
の実施形態では、第２のｇＲＮＡは、ＤＣＫをターゲティングし、（ｇ）の免疫抑制薬は
、シタラビン（シトシンアラビノシド）またはゲムシタビンなど、ヌクレオシド類似体ベ
ースの薬物である。ある実施形態では、第２のｇＲＮＡは、ＮＲ３Ｃ１（グルココルチコ
イド受容体（ＧＲ）をコードする遺伝子）をターゲティングし、免疫抑制薬は、デキサメ
タゾンなどのコルチコステロイドである。ある実施形態では、第２のｇＲＮＡは、ＣＤ５
２をターゲティングし、免疫抑制薬は、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））
などの抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合性断片である。ある実施形態では、第２のｇＲ
ＮＡは、ＦＫＢＰ１Ａをターゲティングし、免疫抑制薬は、ＦＫ５０６（またはＦＫＢＰ
１２結合性断片またはその類似体）、シクロスポリン、ラパマイシン、もしくはラパログ
、またはＲＡＤ００１などのｍＴｏｒ阻害剤である。
前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む、本発明の複数の実施
形態および複数の態様のうちのいずれかでは、細胞集団を、例えば、製造時に、特定のサ
ブセットまたは亜集団、例えば、Ｔ細胞、例えば、ステムセルメモリー様Ｔ細胞について
濃縮することができる。
別の態様では、対象を処置する方法、例えば、対象における過剰増殖性状態または過剰
増殖性障害（例えば、がん）、例えば、充実性腫瘍、軟部組織腫瘍、または転移性病変を
低減するか、または軽快させる方法が提供される。本明細書で使用される「がん」という
用語は、組織病理学型または浸潤性の段階に関わらず、全ての種類のがん性成長または発
がん性過程、転移性組織または悪性形質転換された細胞、組織、もしくは臓器を含むこと
を意図する。充実性腫瘍の例は、肝臓、肺、乳腺、リンパ系、消化管（例えば、結腸）、
非尿生殖路（例えば、腎細胞、尿路上皮細胞）、前立腺、および咽頭に影響を及ぼす悪性
腫瘍など、多様な臓器系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺癌、および癌腫を含む。腺癌は、
大半の結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、および食道
がんなどの悪性腫瘍を含む。一実施形態では、がんは、黒色腫、例えば、進行期黒色腫で
ある。本発明の方法および組成物を使用して、前述のがんの転移性病変もまた、処置また
は防止することができる。処置されうる他のがんの例は、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、
頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん
、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキ
ン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺
がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白
血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む、慢性白血病または急性白
血病、小児性充実性腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、
中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹
神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アス
ベストにより誘導される環境誘導性がんを含む環境誘導性がん、および前記がんの組合せ
を含む。転移性がん、例えば、ＰＤ－Ｌ１を発現する転移性がんの処置（Iwai et al. (2
005) Int. Immunol. 17:133-144）も、本明細書で記載される抗体分子を使用して行うこ
とができる。
それらの成長が阻害されうる例示的ながんは、典型的に、免疫療法に対して応答性のが
んを含む。処置のためのがんの非限定的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、
腎臓がん（例えば、明細胞癌）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺癌）、乳が
ん、結腸がん、および肺がん（例えば、非小型細胞肺がん）を含む。加えて、不応性悪性
腫瘍または再発性悪性腫瘍も、本明細書で記載される分子を使用して処置することができ
る。
一態様では、本発明は、対象におけるがんを処置する方法に関する。一態様では、本明
細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連するがんは、血液がんである。一態様では、
血液がんは、白血病またはリンパ腫である。一態様では、本明細書で記載されるがん関連
抗原の発現と関連するがんは、例えば、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、
Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むが
これらに限定されない、例えば、１または複数の急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病
（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない、１または複
数の慢性白血病を含むがこれらに限定されない、がんおよび悪性腫瘍を含む。本明細書で
記載されるがん関連抗原の発現と関連する、さらなるがんまたは血液学的状態は、例えば
、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、び
まん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞
型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、
辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成性症候群、非ホジキンリン
パ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログロ
ブリン血症、ならびに骨髄系血液細胞の無効な産生（または異形成）により統一される血
液学的状態の多様なコレクションである「前白血病」などを含むがこれらに限定されない
。さらに、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する、疾患は、例えば、本明
細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する、非定型がんおよび／もしくは非古典が
ん、悪性腫瘍、前がん性状態、または増殖性疾患を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、処置されうるがんは、多発性骨髄腫である。一般に、骨髄腫細胞
は、フローサイトメトリーにより、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現について陰
性であると考えられる。したがって、一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲ
、例えば、本明細書で記載されるＣＤ１９ ＣＡＲまたはＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するよ
うに、さらに操作された細胞を使用して、骨髄腫細胞をターゲティングすることができる
。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲ療法を、１または複数のさらなる療法、例えば、
レナリドマイド処置と組み合わせて使用することができる。
多様な態様では、患者へと投与された、本発明の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細
胞、ＮＫ細胞）、またはそれらの子孫細胞は、患者へのＴ細胞またはＮＫ細胞の投与の後
、少なくとも４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月
間、１１カ月間、１２カ月間、１３カ月間、１４カ月間、１５カ月間、１６カ月間、１７
カ月間、１８カ月間、１９カ月間、２０カ月間、２１カ月間、２２カ月間、２３カ月間、
２年間、３年間、４年間、または５年間にわたり、患者に残留する。
本発明はまた、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を、例えば、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡによりさらに修飾して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一
過性に発現させ、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、それを必要とするレシピエントへと
注入する種類の細胞療法も含む。注入された細胞は、レシピエント内の腫瘍細胞を殺滅さ
せることが可能である。したがって、多様な態様では、患者へと投与された免疫エフェク
ター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、患者へと投与した
後で、１カ月間未満、例えば、３週間、２週間、１週間にわたり存在する。
いかなる特定の理論にも束縛されることを望まずに、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞
（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）により誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的免疫応答
の場合もあり、受動的免疫応答の場合もあり、代替的に、間接的免疫応答対直接的免疫応
答に起因する場合もある。一態様では、ＣＡＲを形質導入された免疫エフェクター細胞（
例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現するヒトがん
細胞に応答して、特異的な炎症促進性サイトカインの分泌および強力な細胞溶解活性を呈
示し、可溶性の、本明細書で記載されるがん関連抗原による阻害に抵抗し、バイスタンダ
ー殺滅を媒介し、確立されたヒト腫瘍の退縮を媒介する。例えば、本明細書で記載される
がん関連抗原を発現する腫瘍の不均質場内の無抗原腫瘍細胞は、本明細書で記載されるが
ん関連抗原によりリダイレクトされた免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞
）であって、隣接する抗原陽性がん細胞に対して既に反応している免疫エフェクター細胞
による間接的破壊を受けやすい場合がある。
当技術分野では、ｅｘ ｖｉｖｏにおける手順が周知であり、下記でより完全に論じら
れる。略述すると、細胞を、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、本発明のｇＲＮＡ分
子と、任意選択で、本明細書で開示されるＣＡＲを発現するベクターとで遺伝子改変する
（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、形質導入またはトランスフェクトする）。改変
細胞は、治療的有益性をもたらすように、哺乳動物レシピエントへと投与することができ
る。哺乳動物レシピエントは、ヒトであることが可能であり、細胞は、レシピエントに対
して自家でありうる。代替的に、細胞は、レシピエントに対して同種異系でもありうる。
造血幹細胞および造血始原細胞の、ｅｘ ｖｉｖｏにおける拡大のための手順について
は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１９９，９４２号明細書におい
て記載されており、本発明の細胞にも適用することができる。当技術分野では、他の適す
る方法も公知であり、したがって、本発明は、いかなる特定のｅｘ ｖｉｖｏ細胞拡大法
にも限定されない。略述すると、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の
、ｅｘ ｖｉｖｏにおける培養および拡大は、（１）哺乳動物に由来するＣＤ３４＋造血
幹細胞および造血始原細胞を、末梢血採取物または骨髄外植体から回収することと；（２
）このような細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大することとを含む。細胞を培養および拡大す
るためには、米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載されている細胞成長因子に加
えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３、およびｃ－ｋｉｔのリガンドなど、他の因子
も使用することができる。
免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて拡大するための手
順については、例えば、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組
み込まれる、国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットにおいて記載されている
。このような手順は、本明細書で記載される方法と共に使用する場合に有用である。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける免疫化との関係で、細胞ベースのワクチンを使用することに加
えて、本発明はまた、患者における抗原に対して方向づけられた免疫応答を誘発する、ｉ
ｎ ｖｉｖｏにおける免疫化のための組成物および方法も提供する。
一般に、本明細書で記載される通りに活性化させ、拡大した細胞は、免疫障害性の個体
において生じる疾患の処置および防止において活用することができる。特に、本発明のＣ
ＡＲ改変免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を、本明細書で記載される
がん関連抗原の発現と関連する疾患、障害、および状態の処置に使用する。ある特定の態
様では、本発明の細胞を、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾患、障
害、および状態を発症する危険性がある患者の処置に使用する。したがって、本発明は、
本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾患、障害、および状態を処置また
は防止するための方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、本発明のＣ
ＡＲ改変免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を投与するステップを含む
方法を提供する。
一態様では、ＣＡＲを発現するようにさらに操作された細胞を含む、本発明の細胞を使
用して、がんもしくは悪性腫瘍、または骨髄異形成、骨髄異形成症候群、または前白血病
などの前がん性状態などの増殖性疾患を処置することができる。本明細書で記載されるが
ん関連抗原の発現と関連する、さらなる疾患は、例えば、本明細書で記載されるがん関連
抗原を発現する、非定型がんおよび／もしくは非古典がん、悪性腫瘍、前がん性状態、ま
たは増殖性疾患を含むがこれらに限定されない。本明細書で記載されるがん関連抗原の発
現と関連する非がん関連適応症は、例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性
障害（アレルギーおよび喘息）、および移植を含むがこれらに限定されない。
本発明の細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、単独で投与することもでき、希釈剤お
よび／あるいはＩＬ－２もしくは他のサイトカイン、または細胞集団など、他の成分と組
み合わせた医薬組成物として投与することもできる。
血液がん
血液がん状態とは、血液、骨髄、およびリンパ系に影響を及ぼす、白血病、リンパ腫、
および悪性リンパ増殖性状態などの種類のがんである。
白血病は、急性白血病および慢性白血病として分類することができる。急性白血病は、
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）として、さらに分類す
ることができる。慢性白血病は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ性白血病
（ＣＬＬ）を含む。他の類縁の状態は、骨髄系血液細胞の無効な産生（または異形成）と
、ＡＭＬへと形質転換する危険性とにより統一される、血液学的状態の多様なコレクショ
ンである骨髄異形成症候群（ＭＤＳ；「前白血病」の旧称で公知であった）を含む。
リンパ腫とは、リンパ球から発生する血液細胞腫瘍の群である。例示的なリンパ腫は、
非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む。
本発明はまた、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞集団の増殖を阻害ま
たは低減するための方法であって、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞を
含む細胞集団を、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを
発現するようにさらに操作された、本発明の細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）と接
触させるステップを含む方法も提供する。具体的な態様では、本発明は、本明細書で記載
されるがん関連抗原を発現する、がん細胞の集団の増殖を阻害または低減するための方法
であって、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現するがん細胞集団を、本明細書で記
載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを発現するようにさらに操作され
た、本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞と接触させるステップを含む方法を提供する。一態様
では、本発明は、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する、がん細胞の集団の増殖
を阻害または低減するための方法であって、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現す
るがん細胞集団を、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲ
を発現するようにさらに操作された、本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞と接触させるステッ
プを含む方法を提供する。ある特定の態様では、本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞は、骨髄
性白血病、または本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連する別のがん
を伴う対象、またはこれらについての動物モデルにおいて、細胞および／またはがん細胞
の、数量、数、量、または百分率を、陰性対照と比べて、少なくとも２５％、少なくとも
３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、
少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減する。一態様では、
対象は、ヒトである。
本発明はまた、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連する疾患（例
えば、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する、血液がんまたは非定型がん）を防
止、処置、および／または管理するための方法であって、それを必要とする対象へと、本
明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを発現するようにさら
に操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を含む、本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞を投与するス
テップを含む方法も提供する。一態様では、対象は、ヒトである。本明細書で記載される
がん関連抗原を発現する細胞と関連する障害の非限定的な例は、自己免疫障害（ループス
など）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息など）、およびがん（本明細書で記載される
がん関連抗原を発現する血液がんまたは非定型がんなど）を含む。
本発明はまた、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連する疾患を防
止、処置、および／または管理するための方法であって、それを必要とする対象へと、本
明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを発現するようにさら
に操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を含む、本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞を投与するス
テップを含む方法も提供する。一態様では、対象は、ヒトである。
本発明は、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連するがんの再発を
防止するための方法であって、それを必要とする対象へと、本明細書で記載されるがん関
連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを発現するようにさらに操作されたＴ細胞または
ＮＫ細胞を含む、本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞を投与するステップを含む方法を提供す
る。一態様では、方法は、有効量の別の治療と組み合わせた細胞を投与するステップを含
む。
医薬組成物および処置
本発明の医薬組成物は、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希
釈剤、または賦形剤と組み合わせた細胞、例えば、本明細書で記載される複数の細胞を含
みうる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液
；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化
物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまた
はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；およ
び保存剤を含みうる。一態様では、本発明の組成物を、静脈内投与のために製剤化する。
本発明の医薬組成物は、処置される（または防止される）疾患に適切な様態で投与する
ことができる。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および
重症度などの因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定することが
できる。
一実施形態では、医薬組成物は、例えば、内毒素、マイコプラズマ、複製コンピテント
のレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ－Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、抗ＣＤ３／抗
ＣＤ２８コーティングビーズの残留物、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清ア
ルブミン、ウシ血清、培養培地の成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミドの
構成要素、細菌、および真菌からなる群から選択される、検出可能レベルの汚染物質を実
質的に含まない、例えば、これらが存在しない。一実施形態では、細菌は、アルカリゲネ
ス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans
）、大腸菌（Escherichia coli）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae（Haemop
hilus influenza））、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis（Neisseria meningitides）
）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae（Streptococcus pneumonia））、およびＡ群
溶血連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）からなる群から選択される、少なくとも１つで
ある。
「免疫有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」を表示す
る場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、医師が、患者（対象）の年齢、体重、
腫瘍サイズ、感染または転移の広がり、および状態の個別の差違を考慮することにより決
定することができる。一般に、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ
細胞、ＮＫ細胞）を含む医薬組成物は、体重１ｋｇ当たりの細胞１０４～１０９個、一部
の場合、体重１ｋｇ当たりの細胞１０５～１０６個の投与量であって、これらの範囲内の
全ての整数値を含む投与量で投与しうると言明することができる。Ｔ細胞組成物はまた、
これらの投与量で、複数回にわたり投与することもできる。細胞は、免疫療法において一
般に公知の注入法を使用することにより投与することができる（例えば、Rosenberg et a
l., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照されたい）。
ある特定の態様では、活性化免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を、
対象へと投与し、次いで、その後、血液を再採取し（またはアフェレーシスを実施し）、
これに由来する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を、本発明に従い活
性化させ、活性化させ、拡大したこれらの免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ
細胞）を、患者に再注入することが所望されうる。この工程は、数週間ごとに、複数回に
わたり実行することができる。ある特定の態様では、１０ｃｃ～４００ｃｃの血液採取物
に由来する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化させることがで
きる。ある特定の態様では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０
ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの血液採取物に由来する免疫エフェクター
細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化させる。
対象組成物の投与は、エアゾール吸入、注射、内服、輸液、植込み、または移植を含む
、任意の簡便な様態で実行することができる。本明細書で記載される組成物は、患者へと
、経動脈投与、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、リンパ節内投与、髄内投与、筋内投与
、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または腹腔内投与することができる。一態様では、本発明の
Ｔ細胞組成物を、患者へと、皮内注射または皮下注射により投与する。一態様では、本発
明のＴ細胞組成物を、ｉ．ｖ．注射により投与する。免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ
細胞、ＮＫ細胞）の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位へと、直接注射すること
ができる。
特定の例示的な態様では、対象は、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を、選択および／また
は単離するように、白血球を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、回収するか、濃縮するか、また
は枯渇させる白血球アフェレーシスを経ることができる。これらのＴ細胞単離物を、当技
術分野で公知の方法により拡大し、本明細書で記載される通りに処置し、これにより、本
発明のＴ細胞を創出することができる。その後、それを必要とする対象は、高用量化学療
法に続く、末梢血幹細胞移植による標準的な処置を経ることができる。ある特定の態様で
は、移植の後、またはこれと共時的に、対象に、拡大された本発明のＴ細胞の注入を施す
。さらなる態様では、拡大された細胞は、手術の前に、またはこの後で投与する。
患者へと投与される上記の処置の投与量は、処置される状態および処置のレシピエント
の正確な性質と共に変動するであろう。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当技
術分野で許容される慣例に従い実施することができる。ＣＡＭＰＡＴＨの用量は、例えば
、一般に、成人患者で、１～約１００ｍｇの範囲内となり、通例、１～３０日間の間の期
間にわたり毎日投与されるであろう。好ましい１日の用量は、毎日１～１０ｍｇであるが
、一部の場合では、毎日４０ｍｇまでのより高い用量も使用することができる（米国特許
第６，１２０，７６６号明細書において記載されている）。
一態様では、レンチウイルスなどのレンチウイルスウイルスベクターを使用して、本発
明のＣＡＲ発現細胞を作出する。このようにして作出された細胞、例えば、ＣＡＲＴは、
ＣＡＲを、安定的に発現するであろう。
一態様では、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、本明細書で記載されるガンマレ
トロウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して、ＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｃ
ＡＲＴを作出する。これらのベクターを使用して作出されたＣＡＲＴは、ＣＡＲを、安定
的に発現することができる。
一態様では、ＣＡＲＴは、形質導入後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５日間にわたり、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現
は、ＲＮＡ ＣＡＲベクターの送達により行うことができる。一態様では、ＣＡＲ ＲＮ
Ａを、Ｔ細胞へと、電気穿孔により形質導入する。
ＣＡＲを一過性に発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）（特に
、ＣＡＲＴを保有するマウスｓｃＦｖを伴う）を使用して処置される患者において生じう
る潜在的な問題は、複数回にわたる処置後におけるアナフィラキシーである。
この理論に束縛されずに、このようなアナフィラキシー応答は、体液性抗ＣＡＲ応答、
すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体を発生させる患者により引き起こ
されうると考えられる。患者の抗体産生細胞は、抗原への曝露に、１０～１４日間にわた
る間断が生じると、ＩｇＧアイソタイプ（アナフィラキシーを引き起こさない）から、Ｉ
ｇＥアイソタイプへのクラススイッチを経ると考えられる。
患者が、一過性ＣＡＲ療法の過程において、抗ＣＡＲ抗体応答（ＲＮＡの形質導入など
により発生する抗ＣＡＲ抗体応答など）を発生させる危険性が高い場合、ＣＡＲＴ注入の
間断は、１０～１４日間を超えて持続しないものとする。
修飾ＣＡＲ発現細胞を作製する方法
別の態様では、本発明は、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団）を作
製する方法であって、細胞、例えば、本明細書で記載されるＴ細胞またはＮＫ細胞へと、
ＣＡＲ、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクター；または
ＣＡＲ分子、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を導入するステップ
（例えば、形質導入するステップ）を含む方法に関する。
方法における細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、また
はこれらの組合せ）である。一部の実施形態では、方法における細胞は、ジアシルグリセ
ロールキナーゼ（ＤＧＫ）および／またはＩｋａｒｏｓを欠損するものである。
一部の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子を導入するステップは、ＣＡＲをコ
ードする核酸分子を含むベクターを形質導入すること、またはＣＡＲをコードする核酸分
子をトランスフェクトすることを含み、この場合、核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写さ
れたＲＮＡである。
一部の実施形態では、方法は、
免疫エフェクター細胞の集団（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を用意するステップと
；
Ｔ調節性細胞を、集団から除去し、これにより、Ｔ調節性枯渇細胞集団を用意するステ
ップと；
をさらに含み、
この場合、ステップａ）およびｂ）は、ＣＡＲをコードする核酸および／またはＣＲＩ
ＳＰＲ系を集団に導入する前に実施される。
方法についての複数の実施形態では、Ｔ調節性細胞は、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を含み、抗
ＣＤ２５抗体またはその断片を使用して、細胞集団から除去される。抗ＣＤ２５抗体また
はその断片は、基質、例えば、ビーズへとコンジュゲートさせることができる。
他の実施形態では、ステップ（ｂ）により用意されるＴ調節性枯渇細胞集団は、ＣＤ２
５＋細胞のうちの、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％
、１％未満を含有する。
さらに他の実施形態では、方法は、ＣＡＲをコードする核酸を、集団へと導入する前に
、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原を発現する集団から細胞を除去して、Ｔ調節性枯渇および
腫瘍抗原枯渇細胞集団を用意するステップをさらに含む。腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３
０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、もしくはＣＤ１１ｂ、またはこれらの
組合せから選択することができる。
他の実施形態では、方法は、ＣＡＲをコードする核酸またはＣＲＩＳＰＲ系を、集団へ
と導入する前に、チェックポイント阻害剤を発現する集団から、細胞を除去して、Ｔ調節
性枯渇および阻害性分子枯渇細胞集団を用意するステップをさらに含む。チェックポイン
ト阻害剤は、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ３、Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ
４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥ
ＡＣＡＭ－５）、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、およびＬＡＩＲ１から選択する
ことができる。
本明細書で開示される、さらなる複数の実施形態は、免疫エフェクター細胞の集団を用
意するステップを包摂する。用意される免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＤ３、ＣＤ２
８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＤ４５ＲＯのうちの１または複数
の発現に基づき選択することができる。ある特定の実施形態では、用意される免疫エフェ
クター細胞の集団は、ＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である。
方法についてのある特定の実施形態では、方法は、ＣＡＲをコードする核酸分子を導入
した後で、細胞集団を拡大するステップをさらに含む。
複数の実施形態では、細胞集団を、８日間またはこれ未満の期間にわたり拡大する。
ある特定の実施形態では、細胞集団は、培養物中で、５日間にわたり拡大され、結果と
して得られる細胞は、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞よ
り強力である。
他の実施形態では、細胞集団は、培養物中で、５日間にわたり拡大され、抗原刺激時に
おいて、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞と比較して、少
なくとも１、２、３、または４倍の、細胞倍加の増大を示す。
さらに他の実施形態では、細胞集団は、培養物中で、５日間にわたり拡大され、結果と
して得られる細胞は、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞と
比較して高レベルの、炎症促進性ＩＦＮ－γおよび／またはＧＭ－ＣＳＦを呈示する。
他の実施形態では、細胞集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体と関連するシグナルを刺激する
薬剤、および／または細胞表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドの存在下で細胞を培
養することにより拡大する。薬剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、および／または抗
ＣＤ２８抗体もしくはその断片とコンジュゲートさせたビーズでありうる。
他の実施形態では、細胞集団を、フローサイトメトリーにより測定される通り、細胞の
、少なくとも２００倍、２５０倍、３００倍、または３５０倍の増大を結果としてもたら
す、１または複数のインターロイキンを含む、適切な培地中で、１４日間の拡大期間にわ
たり拡大する。
他の実施形態では、細胞集団を、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－７の存在下で拡大す
る。
ある特定の実施形態では、方法は、適切な拡大期間の後で、細胞集団を低温保存するス
テップをさらに含む。
さらに他の実施形態では、本明細書で開示される作製法は、免疫エフェクター細胞の集
団を、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させるス
テップをさらに含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡでありうる
。
本発明はまた、外因性ＲＮＡを一過性に発現するＲＮＡ操作細胞、例えば、本明細書で
記載される細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の集団を
作出する方法も提供する。方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡ
を、細胞へと導入するステップを含み、この場合、ＲＮＡは、本明細書で記載されるＣＡ
Ｒをコードする核酸を含む。
別の態様では、本発明は、対象において抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、対象へと
、有効量の、ＣＡＲ分子を含む細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ分子を発現す
る細胞を投与するステップを含む方法に関する。一実施形態では、細胞は、自家Ｔ細胞ま
たは自家ＮＫ細胞である。一実施形態では、細胞は、同種異系Ｔ細胞または同種異系ＮＫ
細胞である。一実施形態では、対象は、ヒトである。
一態様では、本発明は、例えば、本明細書で記載される、ＣＡＲ分子をコードする核酸
分子を含むベクターをトランスフェクトするかまたは形質導入した自家細胞の集団を含む
。一実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。一実施形態では、ベク
ターは、本明細書の別の箇所で記載される、自己不活化レンチウイルスベクターである。
一実施形態では、ベクターを、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞へと送達する（例え
ば、トランスフェクトまたは電気穿孔することにより）が、この場合、ベクターは、本明
細書で記載される、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子であって、ｍＲＮＡ分子として
転写される核酸分子を含み、ＲＮＡ分子から、本発明のＣＡＲが翻訳され、細胞表面上で
発現する。
別の態様では、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクタ
ー細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団を提供する。一部の実施形態では、ＣＡ
Ｒ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態
では、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団
は、本明細書で記載される第１の腫瘍抗原に結合する、抗原結合性ドメインを有するＣＡ
Ｒを発現する、第１の細胞と、本明細書で記載される第２の腫瘍抗原に結合する、異なる
抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現する、第２の細胞とを含みうる。別の例として
、ＣＡＲ発現細胞の集団は、本明細書で記載される腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメイ
ンを含むＣＡＲを発現する、第１の細胞と、本明細書で記載される腫瘍抗原以外の標的に
対する抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを発現する、第２の細胞とを含みうる。一実施形
態では、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、細胞内一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡ
Ｒを発現する、第１の細胞と、二次シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝
達ドメインを含むＣＡＲを発現する、第２の細胞とを含む。
別の態様では、本発明は、集団内の、少なくとも１つの細胞が、本明細書で記載される
腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現し、第２の細胞が、別の薬
剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する細胞集団を提供する。例え
ば、一実施形態では、薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤でありうる。阻害性分子の例は
、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣ
ＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳ
ＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＴＧＦベータを
含む。一実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、例えば、本明細書で記載される分
子、例えば、細胞、例えば、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメインへと、正
のシグナルをもたらす第２のポリペプチドと関連する、第１のポリペプチド、例えば、阻
害性分子を含む薬剤である。一実施形態では、薬剤は、例えば、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、
ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば
、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、２Ｂ４、
ならびにＴＩＧＩＴなどの阻害性分子、またはこれらのうちのいずれかの断片の、第１の
ポリペプチドと、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば共刺激性ド
メイン（例えば、本明細書で記載される、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２８
）、および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される、ＣＤ３
ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む）である、第２のポリペプチドとを含む。一実施形
態では、薬剤は、ＰＤ－１またはその断片の、第１のポリペプチドと、本明細書で記載さ
れる細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される、ＣＤ２８、ＣＤ２７
、ＯＸ４０、もしくは４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン、および／または本明細書で記
載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の、第２のポリペプチドとを含む。
一実施形態では、例えば、本明細書で記載される、本発明のＣＡＲ分子をコードする核
酸分子は、ｍＲＮＡ分子として発現する。一実施形態では、本発明のＣＡＲを発現する遺
伝子改変細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、所望の
ＣＡＲをコードするＲＮＡ分子を、細胞へとトランスフェクトまたは電気穿孔する（例え
ば、ベクター配列を伴わずに）ことにより作出することができる。一実施形態では、本発
明のＣＡＲ分子は、組み込まれると、ｍＲＮＡ分子から翻訳され、組換え細胞の表面上で
発現する。
トランスフェクションにおける使用のためのｍＲＮＡを作出するための方法は、３’非
翻訳配列および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）（例えば、本明細書で記載される３’ＵＴ
Ｒおよび／または５’ＵＴＲ）、５’キャップ（例えば、本明細書で記載される５’キャ
ップ）および／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、本明細書で記載さ
れるＩＲＥＳ）、発現させる核酸、およびポリＡテールを含有する構築物であって、典型
的に、５０～２０００塩基の長さ（配列番号６６３８）の構築物を産生するように、特別
にデザインされたプライマー鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）に続くポリＡ付加を
伴う。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に、効率的にトランスフェ
クトすることができる。一実施形態では、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。ある実施形態で
は、ＲＮＡ ＣＡＲベクターを、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞へと、電気穿孔に
より形質導入する。
ＸＩＩ．製造法
本開示は、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、同種異系Ｔ細胞、例えば、本明細書で記載
されるｇＲＮＡ分子で修飾されているか、または修飾されるＣＡＲ操作細胞を製造する方
法を提示する。
ＣＲＩＳＰＲ系の導入
本発明は、本明細書で記載される、１または複数のｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつ
てこれらを含んだ細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、同種異系細胞または自
家細胞を含む。本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ系を、本明細書で記載される方法のう
ちのいずれかにより、細胞へと導入することができる。細胞は、本明細書で記載されるＣ
ＡＲを発現するように、さらに操作することができる。
一態様では、本開示は、細胞を作製するための方法であって、
ａ）ｇＲＮＡ分子、または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸であって、本明細書で記
載される核酸を、前記細胞へと導入するステップと；
ｂ）本明細書で記載されるＣａｓ９分子、または前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸を
、前記細胞へと導入するステップと；
ｃ）ＣＡＲをコードする核酸を、前記細胞へと導入するステップと；
ｄ）細胞を拡大し、活性化させるステップと
を含む方法を提供する。
複数の実施形態では、ａ）およびｂ）の導入は、ステップｃ）およびｄ）の前に行う。
複数の実施形態では、ｃ）の導入を、ａ）およびｂ）の導入の前に行う。複数の実施形態
では、ｃ）の導入、ならびにｄ）の拡大および活性化を、ａ）およびｂ）の導入の前に行
う。複数の実施形態では、方法は、ｅ）ＣＡＲ発現細胞である細胞を選択するステップを
さらに含む。複数の実施形態では、方法は、ｆ）ステップａ）のｇＲＮＡ分子によりター
ゲティングされる遺伝子を発現しないか、またはこの発現を低減した細胞を選択するステ
ップをさらに含む。例えば、ｇＲＮＡ分子が、ＴＲＡＣ遺伝子（例えば、配列番号５８１
６～配列番号５９６５、または配列番号５５２８～配列番号５６２３のうちのいずれか１
つを含むターゲティングドメインを含む）内の標的配列に相補的なターゲティングドメイ
ンを含む場合、ａ）およびｂ）の導入の後で、ＴＣＲの発現（例えば、例えば、抗ＣＤ３
抗体により検出可能である）を欠く細胞を、本明細書で記載される製造法におけるさらな
る適用、または本明細書で記載される治療法におけるさらなる適用のために選別すること
ができる。このような選別は、細胞選別または機械的分離（例えば、磁気ビーズに結合さ
せた抗ＣＤ３抗体による分離であって、ＣＤ３／ＴＣＲをやはり発現する細胞を除去する
分離）など、当技術分野で公知の方法により行うことができる。
細胞の拡大および活性化
一般に、例えば、それぞれが参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米
国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０
５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細
書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４
４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細
書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８
３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細
書；同第６，８６７，０４１号明細書；および米国特許出願公開第２００６０１２１００
５号明細書において記載されている方法を使用して、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞
を活性化させ、拡大することができる。
一般に、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ調節性細胞枯渇細胞の集団は、ＣＤ３／Ｔ
ＣＲ複合体と関連するシグナルを刺激する薬剤、およびＴ細胞の表面上の共刺激性分子を
刺激するリガンドをそれへと接合させた表面と接触させることにより、拡大することがで
きる。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定化させた、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合
性断片、または抗ＣＤ２抗体との接触、あるいはカルシウムイオノフォアと共に、プロテ
インキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によるなど、本明細書で
記載される通りに刺激することができる。Ｔ細胞表面のアクセサリー分子の共刺激のため
には、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細
胞を増殖させる刺激に適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させる
ことができる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を刺激するためには、抗
ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．
３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）
を含み、当技術分野で一般に公知の他の方法と同様に使用することができる（Berg et al
., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13
191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999）。
細胞の、ＴＣＲの構成要素の発現レベルまたはレベルを、低減するか、または非存在と
した、複数の実施形態では、活性化は、ＣＤ３との相互作用以外の手段を介して達成する
ことができる。ＣＡＲをさらに発現する細胞では、活性化は、前記細胞を、ＣＡＲの抗原
結合性ドメイン、またはＣＡＲに結合することが可能なその断片が結合する抗原と接触さ
せることにより達成することができる。このような抗原またはその断片は、例えば、抗体
足場上、細胞（例えば、抗原提示細胞、例えば、前記抗原を天然で発現する細胞、または
その細胞表面上で、前記抗原を発現するように人工的に操作された細胞）上、またはビー
ズもしくは膜などの固体支持体上に存在しうる。
ある特定の態様では、Ｔ細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルを、異な
るプロトコールによりもたらすこともできる。例えば、各シグナルをもたらす薬剤を、溶
液中とすることもでき、表面にカップリングさせることもできる。表面にカップリングさ
せる場合、薬剤は、同じ表面に（すなわち、「シス」形態で）カップリングさせることも
でき、別個の表面に（すなわち、「トランス」形態で）カップリングさせることもできる
。代替的に、１つの薬剤を、表面にカップリングさせ、他の薬剤を、溶液中の薬剤とする
こともできる。一態様では、共刺激シグナルをもたらす薬剤を、細胞表面に結合させ、一
次活性化シグナルをもたらす薬剤を、溶液中とするか、または表面にカップリングさせる
。ある特定の態様では、いずれの薬剤も、溶液中とすることができる。一態様では、薬剤
は、可溶性形態であることが可能であり、次いで、Ｆｃ受容体もしくは抗体、または薬剤
に結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面へと架橋することができる。この点で、
本発明の、Ｔ細胞の活性化および拡大における使用に想定される人工抗原提示細胞（ａＡ
ＰＣ）については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書および
同第２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
一態様では、２つの薬剤を、同じビーズ上、すなわち、「シス」、または個別のビーズ
上、すなわち、「トランス」である、ビーズ上に固定化させる。例を目的として、一次活
性化シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であり、共刺激
シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片であり；両方の薬
剤を、等分子量で、同じビーズ上に共固定化させる。一態様では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の拡
大およびＴ細胞の成長のために、ビーズに結合させる各抗体の比１：１を使用する。本発
明のある特定の態様では、ビーズに結合させる抗ＣＤ３抗体：抗ＣＤ２８抗体の比を、１
：１の比を使用して観察される拡大と比較した、Ｔ細胞拡大の増大が観察されるように使
用する。特定の一態様では、１：１の比を使用して観察される拡大と比較して、約１～約
３倍の増大が観察される。一態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の
比は、１００：１～１：１００、およびこの間の全ての整数値の範囲である。一態様では
、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体を、粒子に結合させる、すなわち、ＣＤ３：Ｃ
Ｄ２８の比を１未満とする。ある特定の態様では、ビーズに結合させる抗ＣＤ２８抗体：
抗ＣＤ３抗体の比は、２：１を超える。特定の一態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗
体：ＣＤ２８抗体の比として１：１００を使用する。一態様では、ビーズに結合させるＣ
Ｄ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：７５を使用する。さらなる態様では、ビーズに結
合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：５０を使用する。一態様では、ビーズ
に結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：３０を使用する。好ましい一態様
では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：１０を使用する。一
態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：３を使用する。
さらなる１つの態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として３：
１を使用する。
１：５００～５００：１、およびこれらの間の任意の整数値である粒子対細胞比を使用
して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者がたやすく察知しうる
通り、粒子対細胞比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存しうる。例えば、小型サイズ
のビーズは、少数の細胞に結合しうるのみであるが、大型のビーズは、多数の細胞に結合
しうるであろう。ある特定の態様では、細胞対粒子比は、１：１００～１００：１、およ
びこれらの間の任意の整数値の範囲であり、さらに複数の態様では、比は、１：９～９：
１、およびこれらの間の任意の整数値を含み、これらもまた、Ｔ細胞を刺激するのに使用
することができる。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８とカップリングさせた粒子の、Ｔ細胞に対
する比であって、Ｔ細胞の刺激を結果としてもたらす比は、上記で言及した通り、変動し
うるが、ある特定の好ましい値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２
０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１
：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、
および１５：１を含み、１つの好ましい比は、少なくとも１：１の粒子対Ｔ細胞比である
。一態様では、１：１またはこれ未満の粒子対細胞比を使用する。特定の一態様では、好
ましい粒子：細胞比は、１：５である。さらなる複数の態様では、粒子対細胞比は、刺激
日に応じて変動しうる。例えば、一態様では、粒子対細胞比は、１日目には、１：１～１
０：１であり、その後、さらなる粒子を、細胞へと、毎日または隔日で、最大１０日間に
わたり、最終比を、１：１～１：１０（添加日における細胞カウントに基づく）として添
加する。特定の一態様では、粒子対細胞比は、刺激の１日目には、１：１であり、刺激の
３および５日目には、１：５へと調整される。一態様では、粒子は、毎日ベースまたは隔
日ベースで、刺激の１日目における１：１、および３および５日目における１：５の最終
比まで添加する。一態様では、粒子対細胞比は、刺激の１日目には、２：１であり、刺激
の３および５日目には、１：１０へと調整される。一態様では、粒子は、毎日ベースまた
は隔日ベースで、１日目における刺激の１：１、および３および５日目における１：１０
の最終比まで添加する。当業者は、他の様々な比も、本発明における使用に適しうること
を察知するであろう。特に、比は、粒子サイズならびに細胞サイズおよび細胞型に応じて
変動するであろう。一態様では、使用のための最も典型的な比は、１日目において、１：
１、２：１、および３：１の近傍である。
さらなる複数の態様では、Ｔ細胞などの細胞を、薬剤コーティングビーズと組み合わせ
、その後、ビーズと細胞とを分離し、次いで、細胞を培養する。代替的な態様では、培養
の前に、薬剤コーティングビーズと細胞とを、分離せず、併せて培養する。さらなる態様
では、ビーズおよび細胞を、磁力などの力を適用することによりまず濃縮する結果として
、細胞表面マーカーへのライゲーションの増大をもたらし、これにより、細胞刺激を誘導
する。
例を目的として、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を接合させた常磁性ビーズ（３×２８ビー
ズ）を、Ｔ細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質をライゲーションすること
ができる。一態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞１０４～１０９個）と、ビーズ（例えば、
比を１：１とする、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ
常磁性ビーズ）とを、緩衝液中、例えば、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの
二価カチオンを伴わない）中で組み合わせる。ここでもまた、当業者は、任意の細胞濃度
を使用しうることを、たやすく察知しうる。例えば、標的細胞は、試料中で極めて希少で
あり、試料のうちの０．０１％を含むに過ぎない場合もあり、試料の全体（すなわち、１
００％）が、目的の標的細胞を含む場合もある。したがって、任意の細胞数が、本発明の
文脈内にある。ある特定の態様では、細胞と粒子との最大の接触を確保するように、粒子
と細胞とを併せて混合する容量を、著明に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増大させ
る）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様では、約１ｍｌ当たりの細胞１００億個
、１ｍｌ当たり９０億個、１ｍｌ当たり８０億個、１ｍｌ当たり７０億個、１ｍｌ当たり
６０億個、１ｍｌ当たり５０億個、または１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する
。一態様では、１ｍｌ当たり１億個を超える細胞を使用する。さらなる態様では、１ｍｌ
当たりの細胞１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０００万個の
細胞の濃度を使用する。さらなる１つの態様では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０
００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞の濃度を使用する。
さらなる複数の態様では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の
濃度を使用することができる。高濃度の使用は、細胞収量の増大、細胞の活性化、および
細胞の拡大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細
胞など、目的の標的抗原の発現が弱い場合がある細胞のより効率的な捕捉を可能とする。
ある特定の態様では、このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得るこ
とが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞の使用は、正常ではＣＤ２８の発現が弱い
ＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
一実施形態では、本発明の細胞、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか
、または、任意の時点においてこれを含んだか、またはこれを含むことになる細胞、例え
ば、ＣＡＲ、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を形質導入された前
記細胞を、例えば、本明細書で記載される方法により拡大する。一実施形態では、細胞を
、培養物中で、数時間（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１８
、２１時間）～約１４日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、または１４日間）の期間にわたり拡大する。一実施形態では、細胞を、４
～９日間の期間にわたり拡大する。一実施形態では、細胞を、８日間またはこれ未満、例
えば、７、６、または５日間の期間にわたり拡大する。一実施形態では、細胞は、培養物
中で、５日間にわたり拡大され、結果として得られる細胞は、同じ培養条件下の培養物中
で９日間にわたり拡大された同じ細胞より強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機
能、例えば、増殖、標的細胞の殺滅、サイトカインの産生、活性化、遊走、またはこれら
の組合せにより規定することができる。一実施形態では、細胞は、５日間にわたり拡大さ
れ、抗原刺激時において、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細
胞と比較して、少なくとも１、２、３、または４倍の、細胞倍加の増大を示す。一実施形
態では、細胞は、培養物中で、５日間にわたり拡大され、結果として得られる細胞は、同
じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞と比較して高い炎症促進性
サイトカインの産生、例えば、高レベルのＩＦＮ－γおよび／またはＧＭ－ＣＳＦを呈示
する。一実施形態では、５日間にわたり拡大された細胞は、同じ培養条件下の培養物中で
９日間にわたり拡大された同じ細胞と比較して、１ｍｌ当たりのｐｇ単位で、少なくとも
１、２、３、４、５、１０倍、またはこれを超える、炎症促進性サイトカインの産生の増
大、例えば、ＩＦＮ－γおよび／またはＧＭ－ＣＳＦのレベルの上昇を示す。
Ｔ細胞の培養時間が、６０日間またはこれを超えうるように、数サイクルにわたる刺激
もまた、所望されうる。Ｔ細胞の培養に適切な条件は、増殖および生存に必要な因子であ
って、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ－２）
、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１
２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ－α、または当業者に公知の、細胞を成長させ
るための他の任意の添加剤を含む因子を含有しうる、適切な培地（例えば、最少必須培地
またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ－ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞を成
長させるための他の添加剤は、界面活性剤、プラズマネート、およびＮ－アセチルシステ
インおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤を含むがこれらに限定されない。培地
は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加し、血清非含有であるか、
あるいはＴ細胞の成長および拡大に十分な適量の血清（または血漿）または規定されたホ
ルモンのセット、および／もしくは規定量のサイトカインを補充した、ＲＰＭＩ １６４
０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、および
Ｘ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含みうる。抗生剤、例えば、ペニシリンおよび
ストレプトマイシンは、実験培養物中だけに組み入れ、対象へと注入される細胞培養物中
には組み入れない。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（
例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、５％のＣＯ２を加えた空気）下で維持する。
一実施形態では、細胞を、１または複数のインターロイキンを含む適切な培地（例えば
、本明細書で記載される培地）であって、例えば、フローサイトメトリーなど、本明細書
で記載される方法により測定される通り、１４日間の拡大期間にわたり、細胞の、少なく
とも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）の増大を結果として
もたらす培地中で拡大する。一実施形態では、細胞を、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－
７（例えば、ＩＬ－１５およびＩＬ－７）の存在下で拡大する。
複数の実施形態では、本明細書で記載される方法であって、本発明の細胞、例えば、本
明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、または、任意の時点においてこれを含んだか
、またはこれを含むことになる細胞、例えば、ＣＡＲを発現する前記細胞のための製造法
は、例えば、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、またはＣＤ２５結合性リガンドであるＩ
Ｌ－２を使用して、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、細胞集団から除去す
るステップを含む。本明細書では、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、細胞
集団から除去する方法が記載される。複数の実施形態では、方法、例えば、製造法は、細
胞集団（例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞などのＴ調節性細胞を枯渇させた細胞集団；または
抗ＣＤ２５抗体、その断片、もしくはＣＤ２５結合性リガンドに既に接触した細胞集団）
を、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－７と接触させるステップをさらに含む。例えば、細
胞集団（例えば、抗ＣＤ２５抗体、その断片、またはＣＤ２５結合性リガンドに既に接触
した細胞集団）を、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－７の存在下で拡大する。
一部の実施形態では、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおける、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、
本発明の細胞、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、または、任意の時
点においてこれを含んだか、またはこれを含むことになる細胞、例えば、本明細書で記載
されるＣＡＲを発現する前記細胞を、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド
、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒａ）ポリペプチド、またはＩＬ－
１５ポリペプチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩ
Ｌ－１５を含む組成物と接触させる。複数の実施形態では、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにお
ける、細胞の製造時に、本明細書で記載される細胞を、ＩＬ－１５ポリペプチドを含む組
成物と接触させる。複数の実施形態では、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおける、ＣＡＲ発現
細胞の製造時に、本明細書で記載される細胞を、ＩＬ－１５ポリペプチドおよびＩＬ－１
５Ｒａポリペプチドの両方の組合せを含む組成物と接触させる。複数の実施形態では、例
えば、ｅｘ ｖｉｖｏにおける、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、本明細書で記載される細胞
を、ｈｅｔＩＬ－１５を含む組成物と接触させる。
一実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおける拡大時に、本発明の細胞、例えば、本明細書
で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、または、任意の時点においてこれを含んだか、また
はこれを含むことになる細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する前記細胞
を、ｈｅｔＩＬ－１５を含む組成物と接触させる。ある実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏに
おける拡大時に、本明細書で記載される細胞を、ＩＬ－１５ポリペプチドを含む組成物と
接触させる。ある実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏにおける拡大時に、本明細書で記載され
るＣＡＲ発現細胞を、ＩＬ－１５ポリペプチドおよびＩＬ－１５Ｒａポリペプチドの両方
を含む組成物と接触させる。一実施形態では、接触させることは、リンパ球亜集団、例え
ば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および増殖を結果としてもたらす。
回数を変動させる刺激へと曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈示しうる。例えば、典
型的な血液生成物またはアフェレーシスにかけられた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害
性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より多くの、ヘルパーＴ細胞集団（
ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによる、
ｅｘ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の拡大は、約８～９日目以前には、主にＴＨ細胞からなる
Ｔ細胞集団をもたらすが、約８～９日目以後には、Ｔ細胞集団は、ますます多くのＴＣ細
胞集団を含む。したがって、処置の目的に応じて、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集
団を注入することも有利でありうる。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットを単離し
た場合は、このサブセットを、より高度に拡大することも有益でありうる。
さらに、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、細胞
拡大工程の過程において、著明ではあるが、大部分は、再現可能な形で変動する。したが
って、このような再現可能性は、活性化Ｔ細胞産物を、具体的な目的に向けてテーラーメ
イド化する能力を可能とする。
本明細書で記載されるＣＡＲを発現するように操作された、本発明の細胞を構築したら
、多様なアッセイを使用して、抗原による刺激後にＴ細胞を拡大する能力、再刺激の非存
在下で、Ｔ細胞の拡大を維持する能力、ならびに適切なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルおよび動
物モデルにおける抗がん活性などであるがこれらに限定されない、分子の活性について査
定することができる。本発明のＣＡＲの効果を査定するアッセイについては、下記でさら
に詳細に記載する。
初代Ｔ細胞内のＣＡＲ発現についてのウェスタンブロット解析を使用して、単量体およ
び二量体の存在を検出することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 1
7(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。ごく簡単に略述すると、ＣＡＲを発現するＴ細
胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、１０日間
を超えて拡大するのに続いて、溶解させ、還元条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。全
長ＴＣＲ－ζ細胞質ドメインと、内因性ＴＣＲ－ζ鎖とを含有するＣＡＲを、ＴＣＲ－ζ
鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロット法により検出する。同じＴ細胞のサブセッ
トを、非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析のために使用して、共有結合による二量体の
形成についての査定を可能とした。
抗原刺激後のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の拡大は、フローサイトメト
リーにより測定することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＣＤ８＋Ｔ細胞との混合
物を、αＣＤ３／αＣＤ２８ ａＡＰＣで刺激するのに続き、プロモーターの制御下でＧ
ＦＰを発現するレンチウイルスベクターを形質導入して、解析する。例示的なプロモータ
ーは、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ユビキチンＣプロモ
ーター、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光は、
ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット内における培養の６日目に、フローサ
イトメトリーによりにより査定する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8)
: 1453-1464 (2009)を参照されたい。代替的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＣＤ８＋Ｔ細胞との
混合物を、０日目に、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズで刺激し、
１日目に、２Ａリボソームスキッピング配列を使用して、ｅＧＦＰと共に、ＣＡＲを発現
する、バイシストロニックのレンチウイルスベクターを使用して、ＣＡＲを形質導入する
。洗浄後において、培養物を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（Ｋ５６２－ＢＢＬ－
３／２８）の存在下において、本明細書で記載されるがん関連抗原＋Ｋ５６２細胞（本明
細書で記載されるがん関連抗原を発現するＫ５６２）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野
生型）、またはｈＣＤ３２および４－１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞で再刺激する。外
因性ＩＬ－２を、隔日、１００ＩＵ／ｍｌで、培養物へと添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞は、
ビーズベースのカウンティングを使用して、フローサイトメトリーにより数え上げる。例
えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。
また、再刺激の非存在下における、持続的なＣＡＲ＋Ｔ細胞の拡大についても、測定す
ることができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)
を参照されたい。略述すると、０日目の、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁
気ビーズによる刺激、および１日目の、示されたＣＡＲの形質導入後である、培養の８日
目において、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩＩ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏ
ｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ、またはＭｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ Ｓｃｅｐｔｅｒを使用して、平均Ｔ細胞容量（ｆｌ）を測定する。
ＣＡＲＴ活性を測定するのに、動物モデルもまた使用することができる。例えば、免疫
欠損マウスにおいて、本明細書で記載されるがん関連抗原に特異的なヒトＣＡＲ＋Ｔ細胞
を使用して、原発性ヒトｐｒｅ－Ｂ ＡＬＬを処置する、異種移植片モデルを使用するこ
とができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参
照されたい。ごく簡単に略述すると、ＡＬＬを確立した後で、マウスを、処置群へと無作
為化する。異なる数の、がん関連抗原特異的ＣＡＲで操作されたＴ細胞を、１：１の比で
、Ｂ－ＡＬＬを保有するＮＯＤ－ＳＣＩＤ－γ－／－マウスへと共注射する。マウスに由
来する脾臓ＤＮＡ内の、がん関連抗原特異的ＣＡＲベクターのコピー数を、Ｔ細胞注射後
の、多様な時点において査定する。動物を、毎週の間隔で、白血病について評価する。末
梢血の、本明細書で記載されるがん関連抗原＋Ｂ－ＡＬＬ芽球カウントを、本明細書で記
載されるがん関連抗原ζＣＡＲ＋Ｔ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞を注射されたマウス
において測定する。ログランク検定を使用して、群ごとの生存曲線を比較する。加えて、
ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－γ－／－マウスにおけるＴ細胞注射の４週間後における、絶対末梢血
ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のカウントについてもまた解析することができる。
マウスに白血病性細胞を注射し、３週間後、ｅＧＦＰへと連結されたＣＡＲをコードする
バイシストロニックのレンチウイルスベクターにより、ＣＡＲを発現するように操作され
たＴ細胞を注射した。注射の前に、Ｔ細胞を、モック形質導入細胞と混合することにより
、インプットＧＦＰ＋Ｔ細胞の４５～５０％へと標準化し、フローサイトメトリーにより
確認する。動物を、１週間の間隔で、白血病について評価する。ログランク検定を使用し
て、ＣＡＲ＋Ｔ細胞群についての生存曲線を比較する。
用量依存性のＣＡＲ処置応答について査定することができる。例えば、Milone et al.,
Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。例えば、２１日目に、Ｃ
ＡＲ Ｔ細胞を注射されたマウス、同等数のモック形質導入Ｔ細胞を注射されたマウス、
またはＴ細胞を注射されなかったマウスにおいて、白血病を確立した３５～７０日後に、
末梢血を得る。末梢血の、本明細書で記載されるがん関連抗原＋ＡＬＬ芽球カウントを決
定するために、各群に由来するマウスからランダムに採血し、次いで、３５および４９日
目に死なせた。残りの動物は、５７および７０日目に査定した。
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価については、例えば、Milone et al., Molecul
ar Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)において、既に記載されている。略述すると、マイ
クロ滴定プレート内で、洗浄されたＴ細胞を、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現
するＫ５６２細胞（Ｋ１９）またはＣＤ３２およびＣＤ１３７を発現するＫ５６２細胞（
ＫＴ３２－ＢＢＬ）と、最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比を２：１として混合することにより、Ｃ
ＡＲ媒介型増殖についての評価を実施する。Ｋ５６２細胞は、使用の前に、ガンマ放射線
で照射した。これらのシグナルは、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を、
長期にわたり支援するので、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８（クローン
９．３）モノクローナル抗体を、ＫＴ３２－ＢＢＬ細胞を伴う培養物へと添加して、Ｔ細
胞増殖の刺激についての陽性対照として用いる。製造元により記載される通りに、Ｃｏｕ
ｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびフローサイトメトリーを使用して、培養物中のＴ細胞
を数え上げる。ｅＧＦＰ－２Ａと連結された、ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター
で操作されたＴ細胞を使用して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＧＦＰの発現により同定する。ＧＦ
Ｐを発現しないＣＡＲ＋Ｔ細胞については、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ビオチニル化された、組
換えの、本明細書で記載されるがん関連抗原タンパク質、および二次アビジン－ＰＥコン
ジュゲートにより検出する。また、Ｔ細胞上のＣＤ４＋およびＣＤ８＋の発現も、特異的
モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、同時に検出する。サイト
カインの測定は、製造元の指示書に従い、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリ
ービーズアレイキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を
使用して、再刺激の２４時間後において回収された上清について実施した。蛍光は、ＦＡ
ＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して評価し、データは、製造元の指示書
に従い解析する。
細胞傷害作用は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより評価することができる。例えば
、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。略述す
ると、標的細胞（Ｋ５６２系および原発性ｐｒｏ－Ｂ－ＡＬＬ細胞）に、５１Ｃｒ（Ｎａ
ＣｒＯ４としての、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を
、３７℃で、頻繁に攪拌しながら、２時間にわたりロードし、完全ＲＰＭＩ中で、２回に
わたり洗浄し、マイクロ滴定プレートへと播種した。エフェクターＴ細胞を、標的細胞と
、ウェル内で、完全ＲＰＭＩ中、多様なエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で混合
する。また、培地だけ（自発放出；ＳＲ）または１％のｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００洗浄剤
溶液（全放出：ＴＲ）を含有する、さらなるウェルも調製する。３７℃で４時間にわたる
インキュベーションの後、上清を、各ウェルから採取する。次いで、ガンマ粒子カウンタ
ー（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用し
て、放出された５１Ｃｒを測定する。各条件を、少なくとも三連で実施し、式：溶解％＝
（ＥＲ－ＳＲ）／（ＴＲ－ＳＲ）［式中、ＥＲは、各実験条件で放出される平均５１Ｃｒ
を表す］を使用して、溶解百分率を計算する。
イメージング技術を使用して、腫瘍保有動物モデルにおける、ＣＡＲの特異的トラフィ
ッキングおよび増殖について査定することができる。このようなアッセイについては、例
えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)において記載されてい
る。略述すると、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ－／－（ＮＳＧ）マウスに、Ｎａｌｍ－６細胞
をＩＶ注射し、７日後、ＣＡＲ構築物を電気穿孔した４時間後に、Ｔ細胞をＩＶ注射する
。Ｔ細胞に、レンチウイルス構築物を安定的にトランスフェクトして、ホタルルシフェラ
ーゼを発現させ、マウスを、生物発光についてイメージングする。代替的に、Ｎａｌｍ－
６異種移植片モデルにおける、単回のＣＡＲ＋Ｔ細胞の注射の治療有効性および特異性は
、以下の通りに測定することもできる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的
に発現するように形質導入されたＮａｌｍ－６を注射し、７日後に、本発明のＣＡＲを電
気穿孔されたＴ細胞の、単回の尾静脈注射が続く。注射後の多様な時点において、動物を
イメージングする。例えば、５日目（処置の２日前）および８日目（ＣＡＲ＋ＰＢＬの２
４時間後）の代表的マウスにおいて、ホタルルシフェラーゼ陽性白血病についての光子密
度ヒートマップを作成することができる。
本明細書の実施例節に記載されるアッセイのほか、当技術分野で公知のアッセイも含む
、他のアッセイもまた、本明細書で記載される細胞およびＣＡＲを発現する細胞について
査定するのに使用することができる。
送達のタイミング
ある実施形態では、Ｃａｓ系の構成要素、例えば、本明細書で記載される、Ｃａｓ９分
子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構成要素以外の、１または複数の核酸分子（
例えば、ＤＮＡ分子）を送達する。ある実施形態では、核酸分子を、Ｃａｓ系の構成要素
のうちの１または複数を送達するのと同時に送達する。ある実施形態では、核酸分子を、
Ｃａｓ系の構成要素のうちの１または複数を送達する前に、または送達した後で（例えば
、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日
間、１週間、２週間、または４週間以内に）送達する。ある実施形態では、核酸分子を、
Ｃａｓ系の構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構
成要素のうちの１または複数を送達する手段と異なる手段により送達する。核酸分子を、
本明細書で記載される送達法のうちのいずれかにより送達することができる。例えば、核
酸分子は、ウイルスベクター、例えば、組込み欠損レンチウイルスにより送達することが
でき、Ｃａｓ９分子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構成要素を、例えば、核酸
（例えば、ＤＮＡ）により引き起こされる毒性を低減しうるように、電気穿孔により送達
することができる。ある実施形態では、核酸分子は、治療用タンパク質、例えば、本明細
書で記載されるタンパク質をコードする。ある実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、
例えば、本明細書で記載されるＲＮＡ分子をコードする。
構成要素の、バイモーダル送達または示差的送達
Ｃａｓ系の構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子の構成要素、およびｇＲＮＡ分子の構成要
素の個別の送達であり、より特定すると、示差的方式による構成要素の送達は、例えば、
組織特異性および安全性を改善することにより、効能を増強しうる。ある実施形態では、
Ｃａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを、場合によって、本明細書では、示差的方式と称する、
異なる方式により送達する。本明細書で使用される、異なる方式または示差的方式とは、
対象の構成要素分子、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、鋳型核酸、またはペイロー
ドに対して、異なる薬力学特性または薬物動態特性を付与する送達方式を指す。例えば、
送達方式は、例えば、選択されたコンパートメント内、組織内、または臓器内で、異なる
組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布を結果としてもたらしうる。
一部の送達方式、例えば、細胞内または細胞の子孫細胞内に残留する核酸ベクターによ
る送達、例えば、自己複製または細胞内の核酸への挿入による送達は、残留性の大きな構
成要素の発現および存在を結果としてもたらす。例は、ウイルスによる送達、例えば、ア
デノ随伴ウイルスによる送達、またはレンチウイルスによる送達を含む。
例を目的として、構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を、結果として
得られる、送達された構成要素の、体内、または特定のコンパートメント内、組織内、も
しくは臓器内における半減期または残留性との関係で、異なる方式により送達することが
できる。ある実施形態では、ｇＲＮＡ分子を、このような方式により送達することができ
る。Ｃａｓ９分子構成要素を、その身体、または特定のコンパートメント、組織、もしく
は臓器への、低い残留性またはより少ない曝露を結果としてもたらす方式により送達する
ことができる。
より一般に、ある実施形態では、第１の送達方式を使用して、第１の構成要素を送達し
、第２の送達方式を使用して、第２の構成要素を送達する。第１の送達方式は、第１の薬
力学特性または薬物動態特性を付与する。第１の薬力学特性は、例えば、体内、コンパー
トメント内、組織内、または臓器内の、構成要素、または構成要素をコードする核酸の、
分布、残留性、または曝露でありうる。第２の送達方式は、第２の薬力学特性または薬物
動態特性を付与する。第２の薬力学特性は、例えば、体内、コンパートメント内、組織内
、または臓器内の、構成要素、または構成要素をコードする核酸の、分布、残留性、また
は曝露でありうる。
ある実施形態では、第１の薬力学特性または薬物動態特性、例えば、分布、残留性、ま
たは曝露を、第２の薬力学特性または薬物動態特性より、大きく制限する。
ある実施形態では、第１の送達方式を選択して、薬力学特性または薬物動態特性、例え
ば、分布、残留性、または曝露を最適化する、例えば、これらを最小化する。
ある実施形態では、第２の送達方式を選択して、薬力学特性または薬物動態特性、例え
ば、分布、残留性、または曝露を最適化する、例えば、これらを最大化する。
ある実施形態では、第１の送達方式は、比較的残留性のエレメント、例えば、核酸、例
えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスの使用
を含む。このようなベクターは、比較的残留性であるので、それらから転写される産物も
、比較的残留性となるであろう。
ある実施形態では、第２の送達方式は、比較的一過性のエレメント、例えば、ＲＮＡま
たはタンパク質を含む。
ある実施形態では、第１の構成要素は、ｇＲＮＡを含み、送達方式は、比較的残留性で
ある、例えば、ｇＲＮＡは、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶまたは
レンチウイルスから転写される。遺伝子は、タンパク質産物をコードせず、ｇＲＮＡは、
孤立して作用することは不可能であるため、これらの遺伝子の転写は、生理学的帰結をそ
れほど有しないであろう。第２の構成要素であるＣａｓ９分子は、例えば、ｍＲＮＡまた
はタンパク質として、一過性で送達され、完全なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、
短時間に限り存在し、活性となることを確保する。
さらに、構成要素は、安全性および組織特異性を増強するように、互いを補完し合う、
異なる分子形態で送達することもでき、異なる送達ベクターにより送達することもできる
。
示差的送達方式の使用は、効能、安全性、および有効性を増強しうる。例えば、最終的
なオフターゲット修飾の可能性を低減することができる。細菌由来のＣａｓ酵素に由来す
るペプチドは、ＭＨＣ分子により、細胞の表面上に表示されるので、低残留性方式による
、免疫原性構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子の送達は、免疫原性を低減しうる。二元送達
系は、これらの欠点を緩和しうる。
示差的送達方式を使用して、構成要素を、異なるが、重複する標的領域へと送達するこ
とができる。標的領域の重複部の外側では、活性複合体の形成を最小化する。したがって
、ある実施形態では、第１の構成要素、例えば、ｇＲＮＡ分子を、第１の空間、例えば、
組織への分布を結果としてもたらす、第１の送達方式により送達する。第２の構成要素、
例えば、Ｃａｓ９分子を、第２の空間、例えば、組織への分布を結果としてもたらす、第
２の送達方式により送達する。ある実施形態では、第１の方式は、リポソーム、ナノ粒子
、例えば、ポリマー性ナノ粒子、および核酸、例えば、ウイルスベクターから選択される
第１のエレメントを含む。第２の方式は、これらの群から選択される第２のエレメントを
含む。ある実施形態では、第１の送達方式は、第１のターゲティングエレメント、例えば
、細胞特異的受容体または抗体を含み、第２の送達方式は、このエレメントを含まない。
ある実施形態では、第２の送達方式は、第２のターゲティングエレメント、例えば、第２
の細胞特異的受容体または第２の抗体を含む。
Ｃａｓ９分子を、ウイルス送達ベクター、リポソーム、またはポリマー性ナノ粒子によ
り送達する場合、単一の組織だけをターゲティングすることが望ましい場合に、複数の組
織への送達がなされ、これらにおける治療活性がもたらされる潜在的可能性がある。二元
送達系は、この課題を解決し、組織特異性を増強する。ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子
を、顕著に異なるが、組織向性が重複する、個別の送達媒体内にパッケージングする場合
、両方のベクターによりターゲティングされる組織内に限り、完全に機能的な複合体が形
成される。
一態様では、送達を、ｅｘ ｖｉｖｏで達する。
ＸＩＩＩ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、核酸内、例えば、特に、ｇＲＮＡ内に存
在しうるが、また、ＲＮＡの他の形態、例えば、ｍＲＮＡ内、ＲＮＡｉ内、またはｓｉＲ
ＮＡ内にも存在しうる。本明細書で記載される「ヌクレオシド」とは、五炭糖分子（ペン
トースまたはリボース）もしくはその誘導体、および有機塩基、プリンもしくはピリミジ
ン、またはこれらの誘導体を含有する化合物と規定される。本明細書で記載される「ヌク
レオチド」とは、リン酸基をさらに含むヌクレオシドとして規定される。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、
（ｉ）ホスホジエステル骨格連結内の、非連結型リン酸酸素の一方もしくは両方、およ
び／または連結型リン酸酸素のうちの１もしくは複数の変更、例えば、置きかえ；
（ｉｉ）リボース糖上のリボース糖の構成要素、例えば、２’ヒドロキシルの変更、例
えば、置きかえ；
（ｉｉｉ）リン酸部分の、「脱リン酸化」リンカーでの、完全な置きかえ；
（ｉｖ）自然発生のヌクレオ塩基の修飾または置きかえであって、非カノニカルのヌク
レオ塩基での修飾または置きかえを含む修飾または置きかえ；
（ｖ）リボース－リン酸骨格の置きかえまたは修飾；
（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基
の除去、修飾、もしくは置きかえ、または部分、キャップ、もしくはリンカーのコンジュ
ゲーション；ならびに
（ｖｉｉ）糖の修飾または置きかえ
のうちの１または複数を含みうる。
上記で列挙した修飾を組み合わせて、２つ、３つ、４つ、またはこれを超える修飾を有
しうる、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドをもたらすことができる。例えば、修
飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドは、修飾糖および修飾ヌクレオ塩基を有しうる。
ある実施形態では、ｇＲＮＡのどの塩基も、修飾されている、例えば、全ての塩基は、修
飾リン酸基を有する、例えば、全ての修飾リン酸基は、ホスホロチオエート（phosphorot
hioate）基である。ある実施形態では、単分子ｇＲＮＡ分子またはモジュラーｇＲＮＡ分
子のリン酸基の全てまたは実質的に全ては、ホスホロチオエート（phosphorothioate）基
で置きかえられている。
ある実施形態では、修飾ヌクレオチド、例えば、本明細書で記載される修飾を有するヌ
クレオチドを、核酸、例えば、「修飾核酸」へと組み込むことができる。一部の実施形態
では、修飾核酸は、１つ、２つ、３つ、またはこれを超える修飾ヌクレオチドを含む。一
部の実施形態では、修飾核酸内の位置のうちの、少なくとも５％（例えば、少なくとも約
５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２
５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４
５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６
５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）は、修飾ヌクレオ
チドである。
非修飾核酸は、例えば、細胞内のヌクレアーゼによる分解を受けやすい場合がある。例
えば、ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解しうる。したがって、一
態様では、本明細書で記載される修飾核酸は、例えば、ヌクレアーゼに対する安定性を導
入するように、１または複数の修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドを含有しうる。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および本明細書で記載さ
れる修飾核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏのいずれにおいても、細胞集団へ
と導入されると、生得的免疫応答の低減を呈示しうる。「生得的免疫応答」という用語は
、一般に、ウイルス由来または細菌由来の一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞の応
答であって、サイトカイン、特に、インターフェロンの発現および放出、ならびに細胞死
の誘導を伴う応答を含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、
および本明細書で記載される修飾核酸は、パートナーと相互作用する主溝の、核酸との結
合を破壊しうる。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および本
明細書で記載される修飾核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏのいずれにおいて
も、細胞集団へと導入されると、生得的免疫応答の低減を呈示することが可能であり、ま
た、パートナーと相互作用する主溝の、核酸との結合も破壊する。
化学基の定義
本明細書で使用される「アルキル」とは、直鎖状または分枝状である、飽和炭化水素基
を指すことを意図する。アルキル基の例は、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル
（例えば、ｎ－プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ－ブチル、イソブチ
ル、ｔ－ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）な
どを含む。アルキル基は、１～約２０、２～約２０、１～約１２、１～約８、１～約６、
１～約４、または１～約３個の炭素原子を含有しうる。
本明細書で使用される「アリール」とは、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニ
ル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなど、単環式または多環式の（例えば、
２つ、３つ、または４つの融合環を有する）芳香族炭化水素を指す。一部の実施形態では
、アリール基は、６～約２０個の炭素原子を有する。
本明細書で使用される「アルケニル」とは、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪
族基を指す。本明細書で使用される「アルキニル」とは、２～１２個の炭素原子を含有す
る、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖を指し、１または複数の三重結合を有することを特
徴とする。アルキニル基の例は、エチニル、プロパルギル、および３－ヘキシニルを含む
がこれらに限定されない。
本明細書で使用される「アリールアルキル」または「アラルキル」とは、アルキルの水
素原子が、アリール基により置きかえられたアルキル部分を指す。アラルキルは、１つを
超える水素が、アリール基により置きかえられた基を含む。「アリールアルキル」または
「アラルキル」の例は、ベンジル基、２－フェニルエチル基、３－フェニルプロピル基、
９－フルオレニル基、ベンズヒドリル基、およびトリチル基を含む。
本明細書で使用される「シクロアルキル」とは、３～１２個の炭素を有する、環式、二
環式、三環式、または多環式の、非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例は
、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルを含むがこれらに限定されな
い。
本明細書で使用される「ヘテロシクリル」とは、複素環系の一価ラジカルを指す。代表
的なヘテロシクリルは、限定せずに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピ
ロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、
ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、およびモルホリニルを
含む。
本明細書で使用される「ヘテロアリール」とは、ヘテロ芳香族環系の一価ラジカルを指
す。ヘテロアリール部分の例は、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリ
ル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニ
ル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリ
ル、およびプテリジニルを含むがこれらに限定されない。
リン酸骨格修飾
リン酸基
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、酸素のうちの１または複数を、
異なる置換基で置きかえることにより修飾することができる。さらに、修飾ヌクレオチド
、例えば、修飾核酸内に存在する修飾ヌクレオチドは、非修飾リン酸部分の、本明細書で
記載される修飾リン酸による、完全な置きかえを含みうる。一部の実施形態では、リン酸
骨格の修飾は、非対称的な電荷分布を伴う、非帯電リンカーまたは帯電リンカーを結果と
してもたらす変更を含みうる。
修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスホロセレネート
（phosphoroselenate）、ボラノホスフェート（boranophosphate（borano phosphate））
、ボラノホスフェート（boranophosphate（borano phosphate））エステル、ホスホン酸
水素、ホスホルアミデート（phosphoramidate（phosphoroamidate））、ホスホン酸アル
キルまたはホスホン酸アリール、およびホスホトリエステルを含む。一部の実施形態では
、リン酸骨格部分内の、非架橋リン酸酸素原子のうちの１つを、以下の基：硫黄（Ｓ）、
セレニウム（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールで
ありうる）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例
えば、水素、アルキル、またはアリールでありうる）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例えば
、アルキルまたはアリールでありうる）のうちのいずれかにより置きかえることができる
。非修飾リン酸基内のリン原子は、アキラルである。しかし、非架橋酸素のうちの１つの
、上記の原子または原子群のうちの１つでの置きかえは、リン原子をキラルとしうる、す
なわち、このようにして修飾されたリン酸基内のリン原子は、立体中心である。ステレオ
ジェニックのリン原子は、「Ｒ」立体配置（本明細書では、Ｒｐ）または「Ｓ」立体配置
（本明細書では、Ｓｐ）を有しうる。
ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）は、非架橋酸素の両方が、硫黄により置
きかえられている。ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）内のリン中心は、アキ
ラルであり、これは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を除外する。一部
の実施形態では、非架橋酸素の一方または両方に対する修飾はまた、非架橋酸素の、Ｓ、
Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールでありうる
）から独立に選択される基での置きかえも含みうる。
また、リン酸リンカーも、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドへと連結する酸
素）の、窒素（架橋ホスホルアミデート（phosphoramidate（phosphoroamidate）））、
硫黄（架橋ホスホロチオエート（phosphorothioate））、および炭素（架橋ホスホン酸メ
チレン）での置きかえにより修飾することができる。置きかえは、連結酸素の一方または
両方において生じうる。
リン酸基の置きかえ
リン酸基は、非リン含有コネクターにより置きかえることができる。一部の実施形態で
は、リン酸基の電荷を、中性部分により置きかえることができる。
リン酸基を置きかえうる部分の例は、限定せずに、例えば、ホスホン酸メチル、ヒドロ
キシルアミノ、シロキサン、カーボネート（carbonate）、カルボキシメチル、カルバメ
ート（carbamate）、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート
（sulfonate）、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム
、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラ
ゾ、およびメチレンオキシメチルイミノを含みうる。
リボリン酸骨格の置きかえ
また、核酸を模倣しうる足場であって、リン酸リンカーおよびリボース糖を、ヌクレア
ーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートにより置きかえた足場も、構築する
ことができる。一部の実施形態では、ヌクレオ塩基を、サロゲート骨格でテザリングする
ことができる。例は、限定せずに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプ
チド核酸（ＰＮＡ）によるヌクレオシドサロゲートを含みうる。
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖基に対する、１または複数の修飾を含
みうる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「オキシ」または「デオ
キシ」置換基で、修飾するか、または置きかえることができる。一部の実施形態では、２
’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが脱プロトン化されて、２’－アルコキ
シドイオンを形成することがもはやできなくなるので、核酸の安定性を増強しうる。２’
－アルコキシドは、リンカーリン原子に対する、分子内の求核攻撃による分解を触媒しう
る。
「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾の例は、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ
［式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロ
アリールまたは糖でありうる］）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ
２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ［式中、Ｒは、例えば、Ｈ、または、任意選択で、置換アルキ
ルであることが可能であり、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～
１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２
～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、および４～２０）の整数でありうる］
を含みうる。一部の実施形態では、「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロ
キシルを、例えば、Ｃ１～６アルキレンまたはＣ１～６ヘテロアルキレン架橋により、同
じリボース糖の４’炭素へと接続した「ロックト」核酸（ＬＮＡ）であって、例示的な架
橋がメチレン架橋、プロピレン架橋、エーテル架橋、またはアミノ架橋；Ｏ－アミノ（式
中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、
アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールア
ミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノでありうる）；およびアミノアルコキシ、Ｏ
（ＣＨ２）ｎ－アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキル
アミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、
またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノでありうる）を含
みうる、ＬＮＡを含みうる。一部の実施形態では、「オキシ」－２’ヒドロキシル基修飾
は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３；例えば、ＰＥＧ誘導体）を
含みうる。
「デオキシ」修飾は、水素（すなわち、デオキシリボース糖、例えば、部分的にｄｓで
あるＲＮＡの突出部分における）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨ
ード）；アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ
、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテ
ロアリールアミノ、またはアミノ酸でありうる）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２Ｃ
Ｈ２－アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書で記載される通りでありうる）、－Ｎ
ＨＣ（０）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル
、ヘテロアリール、または糖でありうる）、シアノ；メルカプト；アルキルチオアルキル
；チオアルコキシ；ならびに任意選択で、例えば、本明細書で記載されるアミノで置換さ
れうる、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルを含みうる
。
糖基はまた、リボース内の対応する炭素の立体化学配置とは逆の立体化学配置を有する
、１または複数の炭素も含有しうる。したがって、修飾核酸は、例えば、アラビノースを
糖として含有するヌクレオチドを含みうる。ヌクレオチド「単量体」は、糖上のΓ位、例
えば、アルファ－ヌクレオシドにおいて、アルファ連結を有しうる。修飾核酸はまた、Ｃ
－において、ヌクレオ塩基を欠く、「非塩基性」糖も含みうる。これらの非塩基性糖はま
た、構成糖原子のうちの１または複数においても、さらに修飾されうる。修飾核酸はまた
、Ｌ形態、例えば、Ｌ－ヌクレオシド内の１または複数の糖も含みうる。
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環の糖基である、リボースを含む。例示的な修飾
ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、限定せずに、リボースの酸素の置きかえ（例え
ば、硫黄（Ｓ）、セレニウム（Ｓｅ）、または例えば、メチレンもしくはエチレンなどの
アルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースを、シクロペンテニルまたはシ
クロヘキセニルで置きかえる）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセ
タンの４員環を形成する）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アル
トリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホルアミ
デート（phosphoramidate）骨格もまた有するモルホリノなど、さらなる炭素またはヘテ
ロ原子を有する、例えば、６員環または７員環を形成する）を含みうる。一部の実施形態
では、修飾ヌクレオチドは、多環形態（例えば、トリシクロ）；およびグリコール核酸（
ＧＮＡ）（例えば、リボースを、ホスホジエステル結合へと接合させたグリコール単位に
より置きかえた、Ｒ－ＧＮＡまたはＳ－ＧＮＡ）、トレロース核酸（リボースを、ａ－Ｌ
－トレオフラノシル－（３’－→２’）で置きかえたＴＮＡ）などの「非ロックト」形態
を含みうる。
ヌクレオ塩基に対する修飾
修飾核酸へと組み込みうる、本明細書で記載される、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌク
レオチドは、修飾ヌクレオ塩基を含みうる。ヌクレオ塩基の例は、アデニン（Ａ）、グア
ニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含むがこれらに限定されない。こ
れらのヌクレオ塩基は、修飾核酸へと組み込みうる、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレ
オチドをもたらすように、修飾するか、または完全に置きかえることができる。ヌクレオ
チドのヌクレオ塩基は、プリン、ピリミジン、プリン、またはピリミジン類似体から独立
に選択することができる。一部の実施形態では、ヌクレオ塩基は、例えば、自然発生の塩
基および塩基の合成誘導体を含みうる。
ウラシル
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有す
る、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、限定せずに、シュードウリジン（ψ）
、ピリジン－４－オン リボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、
２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（
ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ
－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、
５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）
、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリ
ジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ＾Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン
（ｃｍｓＵ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメ
チル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエス
テル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－
メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル
－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５
Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルア
ミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウ
リジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）
、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ＼ｓ２Ｕ）、５－
プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリ
ジン（ｘｃｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２
－チオ－ウリジン（Ｔｒｎ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジ
ン、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、ヌクレオ塩基であるデオキシチミンを有す
る）、１－メチル－プソイドウリジン（ιτι’ψ）、５－メチル－２－チオ－ウリジン
（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ’ｓ＼｜／）、４－チオ
－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ’Ｖ）、２－チオ
－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チ
オ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウンジン（Ｄ）、ジヒドロプ
ソイドウンジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）
、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－
ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－
メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－
アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－ア
ミノ－３－カルボキシプロピルプソイドウリジン５－（イソペンテニルアミノメチル）ウ
リジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチ］）－２－チオ－ウリジン（ｉ
ｎｍ５ｓ２Ｕ）、ａ－チオ－ウリジン、２’－０－メチル－ウリジン（Ｕｒｎ）、５，２
’－０－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－０－メチル－プソイドウリジン（ψπ
ι）、２－チオ－２’－０－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメ
チル－２’－０－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－
０－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－０
－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－０－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ
）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－０－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ
）、ｌ－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－ａｒａ－ウリジン、２’－Ｆ－
ウリジン、２’－ＯＨ－ａｒａ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン
、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジ
ネス、キサンチン、およびヒポキサンチンを含む。
シトシン
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有す
る、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、限定せずに、５－アザ－シチジン、６
－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４－ア
セチル－シチジン（ａｃｔ）、５－ホルミル－シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４－メチル－シチ
ジン（ｍ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－
ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－プソ
イドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチ
ジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、
４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プ
ソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５
－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－
チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４
－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン
、リシジン（ｋ２Ｃ）、ａ－チオ－シチジン、２’－０－メチル－シチジン（Ｃｍ）、５
，２’－０－ジメチル－シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４－アセチル－２’－０－メチル－シ
チジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’－０－ジメチル－シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５－ホルミ
ル－２’－０－メチル－シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’－０－トリメチル－シ
チジン（ｍ４ ２Ｃｍ）、１－チオ－シチジン、２’－Ｆ－ａｒａ－シチジン、２’－Ｆ－
シチジン、および２’－ＯＨ－ａｒａ－シチジンを含む。
アデニン
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有す
る、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、限定せずに、２－アミノ－プリン、２
，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロ
ロ－プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロロ－プリン）、２－アミノ－６－メ
チル－プリン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ
－アデニン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プ
リン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノ
プリン、１－メチル－アデノシン（ｍ’Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ Ａ）、Ｎ６－
メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍｓ２ｍ
６Ａ）、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン（ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペ
ンテニル－アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）
アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル
）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデノシン（ｇ６Ａ
）、Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレ
オニルカルバモイル－アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカ
ルバモイル－アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン（ｍ６ ２
Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２－メチル
チオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６
－アセチル－アデノシン（ａｃ６Ａ）、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニ
ン、２－メトキシ－アデニン、ａ－チオ－アデノシン、２’－０－メチル－アデノシン（
Ａｍ）、Ｎ６，２’－０－ジメチル－アデノシン（ｍ５Ａｍ）、Ｎ６－メチル－２’－デ
オキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－０－トリメチル－アデノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、１
，２’－０－ジメチル－アデノシン（ｍ’Ａｍ）、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン
酸）（Ａｒ（ｐ））、２－アミノ－Ｎ６－メチルプリン、１－チオアデノシン、８－アジ
ドアデノシン、２’－Ｆ－アラアデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－アラア
デノシン、およびＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノンアデシル）－アデノシンを含
む。
グアニン
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有す
る、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、限定せずに、イノシン（Ｉ）、１－メ
チルイノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４－
デメチルワイオシン（ｉｍＧ－１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙ
Ｗ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯHｙＷ）、非
修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯHｙＷ＊）、７－デアザグアノシン、クエオシン（Ｑ）
、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシルクエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシルクエ
オシン（ｍａｎＱ）、７－シアノ－７－デアザグアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメ
チル－７－デアザグアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７－デアザ－８
－アザグアノシン、６－チオグアノシン、６－チオ－７－デアザグアノシン、６－チオ－
７－デアザ－８－アザグアノシン、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、６－チオ－７－メ
チルグアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシグアノシン、１－メチルグアノシン
（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチルグアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン（ｍ
２ ２Ｇ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチルグ
アノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８－オキソグアノシン、７－メチル－８－オキソグアノシ
ン、１－メチル－６－チオグアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオグアノシン、Ｎ２，Ｎ２
－ジメチル－６－チオグアノシン、ａ－チオグアノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン（
Ｇｍ）、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチルグアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチ
ル－２’－Ｏ－メチルグアノシン（ｍ２ ２Ｇｍ）、１－メチル－２’－Ｏ－メチルグアノ
シン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチル－２’－Ｏ－メチルグアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）
、２’－Ｏ－メチルイノシン（Ｉｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン（ｍ１Ｉｍ）、
０６－フェニル－２’－デオキシイノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸）（
Ｇｒ（ｐ））、１－チオグアノシン、Ｏ６－メチルグアノシン、０６－メチル－２’－デ
オキシグアノシン、２’－Ｆ－アラグアノシン、および２’－Ｆ－グアノシンを含む。
修飾ｇＲＮＡ
一部の実施形態では、修飾核酸は、修飾ｇＲＮＡでありうる。一部の実施形態では、ｇ
ＲＮＡは、３’末端において修飾することができる。この実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｕ
リボースの３’末端において修飾することができる。例えば、Ｕリボースの２つの末端の
ヒドロキシル基を、アルデヒド基へと酸化させ、かつ、これと共時的に、リボース環を開
裂させて、修飾ヌクレオシドをもたらすことができるが、この場合、Ｕは、非修飾ウリジ
ンの場合もあり、修飾ウリジンの場合もある。
別の実施形態では、３’末端のＵを、２’３’環状リン酸エステルで修飾することがで
き、この場合、Ｕは、非修飾ウリジンの場合もあり、修飾ウリジンの場合もある。一部の
実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書で記載される修飾ヌクレオチドのうち
の１または複数を組み込むことにより、分解に対して安定化させうる３’ヌクレオチドを
含有しうる。この実施形態では、例えば、ウリジンを、修飾ウリジン、例えば、５－（２
－アミノ）プロピルウリジン、および５－ブロモウリジン、または本明細書で記載される
修飾ウリジンのうちのいずれかで置きかえることができ、アデノシンおよびグアノシンを
、修飾アデノシンおよび修飾グアノシン、例えば、８位における修飾、例えば、８－ブロ
モグアノシン、または本明細書で記載される修飾アデノシンもしくは修飾グアノシンのう
ちのいずれかで置きかえることができる。一部の実施形態では、デアザヌクレオチド、例
えば、７－デアザ－アデノシンを、ｇＲＮＡへと組み込むことができる。一部の実施形態
では、Ｏ－アルキル化ヌクレオチドおよびＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６－
メチルアデノシンを、ｇＲＮＡへと組み込むことができる。一部の実施形態では、例えば
、２’ＯＨ基を、Ｈ、－ＯＲ、－Ｒ（式中、Ｒは、例えば、メチル、アルキル、シクロア
ルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖でありうる）、ハロ、－ＳＨ
、－ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘ
テロアリール、または糖でありうる）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アル
キルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、
ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸でありうる）；または
シアノ（－ＣＮ）から選択される群により置きかえた、糖修飾リボヌクレオチドを組み込
むことができる。一部の実施形態では、リン酸骨格は、本明細書で記載される通り、例え
ば、ホスホロチオエート（phosphorothioate（phosphothioate））基で修飾することがで
きる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの突出領域内のヌクレオチドは、各々独立に、２－
Ｆ ２’－Ｏ－メチルチミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン
（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチ
ル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組合せなどの２’－糖修
飾ヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオ
チドでありうる。
ある実施形態では、ＲＮＡ分子、例えば、ｇＲＮＡ分子の一本鎖突出内のヌクレオチド
の１もしくは複数または全ては、デオキシヌクレオチドである。
候補Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲ
ＮＡ分子複合体、および候補ＣＲＩＳＰＲ系は、当技術分野で公知の方法、または本明細
書で記載される方法により査定することができる。例えば、Ｃａｓ９分子エンドヌクレア
ーゼ活性を査定するための例示的な方法については、例えば、Jinek el al., SCIENCE 20
12; 337(6096):8 16-821において記載されている。
[実施例１]
アッセイ
ガイド選択
初期のガイド選択は、目的の領域内のＰＡＭを同定するために、ヒト基準ゲノムと、使
用者により規定される目的のゲノム領域（例えば、遺伝子、遺伝子のエクソン、非コード
調節領域など）とを使用して、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施した。同定された各ＰＡＭにつ
いて、解析を実施し、統計を報告した。ｇＲＮＡ分子をさらに選択し、当技術分野で公知
の多数の基準に基づきランク付けした。次いで、ｇＲＮＡ分子を、本明細書で記載される
切断効率と、インデル形成とについて、本明細書で記載される通り調べた。
本実施例を通して、下記の実験では、ｓｇＲＮＡ分子またはｄｇＲＮＡ分子を使用した
。そうでないことが指し示されない限りにおいて、ターゲティングドメインについてのＣ
Ｒｘｘｘｘｘの識別子について言及する実験では、ｄｇＲＮＡフォーマットを援用した。
そうでないことが指し示されない限りにおいて、ｄｇＲＮＡ分子を使用する場合、ｇＲＮ
Ａは、以下：
ｃｒＲＮＡ：［ターゲティングドメイン］－［配列番号６６０７］
ｔｒａｃｒ（ｔｒＲＮＡ）：配列番号６６６０
を含む。
そうでないことが指し示されない限りにおいて、ｓｇＲＮＡ分子を援用する実験では、
以下の配列：
［ターゲティングドメイン］－［配列番号６６０１］－ＵＵＵＵ
を使用した。
一次ガイドスクリーニングのための、ＨＥＫ－２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞のトランスフ
ェクション
Ｃａｓ９ＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ－２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ）のト
ランスフェクションを、標的特異的ｃｒＲＮＡの一次スクリーニングのために使用した。
本実施例では、例えば、本明細書で記載される、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏオフターゲットの検
出を含む、規定された基準を使用して、標的特異的ｃｒＲＮＡをデザインし、一次スクリ
ーニングのために選択した。選択されたｃｒＲＮＡを化学合成し、９６ウェルフォーマッ
トで送達した。ＨＥＫ－２９３－Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞に、配列番号６６０７のフラッグポ
ール領域を、配列番号６６６０のストックｔｒＲＮＡと、１：１の比で含む標的ｃｒＲＮ
Ａを形質導入した。トランスフェクションは、製造元のプロトコール（ＤｈａｒｍａＦＥ
ＣＴ Ｄｕｏ、ＧＥ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ；またはＲＮＡｉＭａｘ、ＬｉｆｅＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従うリポフェクション技術を使用して媒介した。トランスフェ
クト細胞は、リポフェクションの２４時間後に溶解させ、Ｔ７Ｅ１アッセイおよび／また
は次世代シーケンシング（ＮＧＳ；下記）により、溶解物内の編集（例えば、切断）を検
出した。
Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイを、Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断後において、非相同末端結合（ＮＨＥ
Ｊ）を介して創出された挿入、欠失、および置換など、ゲノムＤＮＡ内の突然変異イベン
トを検出するのに使用した（Cho et al., Targeted genome engineering in human cells
with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 2013; 31, 230-232
を参照されたい）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による切断のためにターゲティングされたゲノムＤＮＡ領域を
、ＰＣＲにより増幅し、９５℃で１０分間にわたり変性させ、次いで、１秒間当たり０．
５℃で、９５℃から、２５℃へと低下させることにより、再アニールさせた。増幅される
領域内に突然変異が存在する場合は、ＤＮＡは、組み合わされて、ヘテロ二重鎖を形成し
た。次いで、再アニールさせたヘテロ二重鎖を、Ｔ７Ｅ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）で、３７℃、１時間にわたり消化した。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼは、
ＤＮＡミスマッチ、ヘテロ二重鎖を認識し、二本鎖ＤＮＡにニックを形成し、これらの部
位において、二本鎖切断を発生させる。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して
、結果として得られるＤＮＡ断片を解析し、定量化して、切断効率を決定した。
オンターゲット切断効率およびインデルの形成についての、次世代シーケンシング（ＮＧ
Ｓ）および解析
ゲノム内の編集（例えば、切断）標的位置の効率を決定するために、ディープシーケン
シングを活用して、非相同末端結合により導入された挿入および欠失の存在を同定した。
まず、ＰＣＲプライマーを、標的部位の近傍においてデザインし、目的のゲノム領域を
、ＰＣＲで増幅した。製造元のプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従い、さらなるＰＣ
Ｒを実施して、シーケンシングに必要な化学反応を追加した。次いで、単位複製配列を、
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置上でシーケンシングした。次いで、品質スコアが低い
リードを消失させた後で、リードを、ヒト基準ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に対してアラ
イメントした。結果として得られる、基準ゲノムへとマップされたリードを含有するファ
イル（ＢＡＭファイル）から、目的の標的領域と重複するリードを選択し、挿入または欠
失を含有するリードの数と対比した野生型リードの数を計算した。次いで、編集百分率を
、野生型を含むリードの総数に対する、挿入または欠失を伴うリードの総数として規定し
た。編集から生じる挿入および／または欠失のパターンを決定するために、インデルを伴
う、アライメントされたリードを選択し、所与のインデルを伴うリードの数を合計した。
次いで、この情報を、リストとして表示するほか、各インデルの頻度を表すヒストグラム
の形態でも視覚化した。
ＲＮＰの作出
ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡ（ｄｇＲＮＡの場合）、またはキメラｇＲＮＡ（ｓｇＲＮ
Ａの場合）の、Ｃａｓ９タンパク質への付加は、ｃｒＲＮＡにより指定される標的領域へ
の結合と、標的ゲノムＤＮＡの特異的切断とを媒介する、活性のＣａｓ９リボヌクレオタ
ンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成を結果としてもたらす。この複合体は、ｔｒＲＮＡおよ
びｃｒＲＮＡの、Ｃａｓ９へのロードであって、Ｃａｓ９に対して、ｄｓＤＮＡに結合し
、これを切断することを可能とするコンフォメーション変化を引き起こすと考えられるロ
ードにより形成した。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを、９５℃で２分間にわたり、個別に変性させ、室温へと
至らせた。Ｃａｓ９タンパク質（１０ｍｇ／ｍｌ）を、５×のＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロ
ール）へと添加し、これに、ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを、添加し（別個の反応）、３
７℃で１０分間にわたりインキュベートし、これにより、活性のＲＮＰ複合体を形成した
。複合体を、電気穿孔および他の方法により、ＨＥＫ－２９３細胞およびＣＤ３＋ Ｔ細
胞を含む、多種多様な細胞へと送達した。
Ｔ細胞へのＲＮＰの送達
ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を含む、
複数のＴ細胞集団から構成される。これらの細胞は、全血液から単離することもでき、白
血球アファレーシス試料から単離することもできる。Ｃａｓ９媒介型編集を使用して、患
者のＴ細胞を操作することにより、がん性細胞を特異的にターゲティングし、免疫原性を
低下させるように、Ｔ細胞を改変することができる。本実施例では、Ｃａｓ９ ＲＮＰ、
例えば、Ｂ２ＭをターゲティングするＣａｓ９ ＲＮＰを、Ｔ細胞内に送達するのに使用
される基礎的方法について記載する。このプロトコールを、異なるＴ細胞標的（例えば、
本明細書で提供されるＴ細胞標的のうちのいずれか）に適応させるには、ＲＮＰ内のター
ゲティングｃｒＲＮＡを変化させさえすればよいであろう。
まず、Ｔ細胞を、市販のキット（例えば、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃ
ｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を
使用して、Ｌｅｕｋｏｐａｋから濃縮した。濃縮されたＴ細胞を、アリコート分割し、そ
の後の使用のために凍結させた（バイアル１つ当たり１０×１０６個で）。その後、必要
に応じて、バイアルを解凍し、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ １６４０、ＦＢＳ、Ｌ－グルタミ
ン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝液、２－メルカプトエタノ
ール、および、任意選択のＩＬ２）中に、３：１の比のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎ
ａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することにより、またはＩ
ｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏ
ｒ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して活性化させた。本明細
書で記載される通りに、ＲＮＰを作出し、Ｐ３緩衝液中に再懸濁させた、約５０，０００
～１００，０００個のＣＤ３＋ Ｔ細胞へと添加し、Ａｍａｘａヌクレオフェクションプ
ログラムＥＯ－１１５を使用してヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション直後に、
Ｔ細胞培地を、細胞へと添加し、２４時間にわたり、またはこれを超えて培養した。
[実施例２]
Ｂ２Ｍの編集
Ｃａｓ９を安定的に発現するＨＥＫ－２９３細胞内で、Ｂ２Ｍへとターゲティングされた
ｇＲＮＡを使用する編集の結果
Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡの切断効率についてのＮＧＳアッセイの結果を、
表９および図１にまとめる。これらの結果は、複数のガイドＲＮＡ分子が、Ｂ２Ｍ遺伝子
座の、高効率の編集を媒介することが可能であることを支持する。ＨＥＫ細胞内の編集％
（に続く、ＣＤ３４＋細胞内の編集％）によりランク付けされた、上位のｇＲＮＡ分子を
、１）ＮＧＳにより測定される、ＣＤ３４＋細胞内の編集％、および２）フローサイトメ
トリーにより測定される、ＣＤ３＋ Ｔ細胞内の、Ｂ２Ｍの喪失％の結果と併せて、図１
４に示す。図１４に示す通り、３つのｄｇＲＮＡ分子、例えば、ＣＲ００４４２、ＣＲ０
０４４４、およびＣＲ００４５５のターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡ分子は、フ
ローサイトメトリーにより測定される通り、ＣＤ３＋ Ｔ細胞内で、４０％を超える編集
を示した。
Figure 2022137032000546
Ｂ２Ｍの発現についてのフローサイトメトリー解析
ＲＮＰの製剤化および送達後における編集効率をモニタリングするように、フローベー
スのアッセイを開発した。ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）は、全ての有核細胞
の表面上で提示されるＭＨＣクラスＩ（１型ＨＬＡ）複合体の、不可欠の構成要素である
。ＭＨＣクラスＩは、内因性（例えば、自己および非自己）ペプチドを、免疫系へと提示
する。Ｂ２Ｍの発現を検出するフローサイトメトリーアッセイを使用して、Ｂ２Ｍをター
ゲティングする一連のｃｒＲＮＡについて調べた。この初期のスクリーニングから、５～
２５％の間の範囲の、一貫した編集を指し示すｃｒＲＮＡを同定した。
懸濁液中の細胞を、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＢ２Ｍ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；型番３
１６３１２）、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；型
番３１１４０５）、およびヨウ化プロピジウム（１／１０００まで希釈された、０．５ｍ
ｇ／ｍｌ）で標識した。適切な対照を確立した（例えば、アイソタイプ－ＡＰＣ、アイソ
タイプ－ＰＥ、別個に、ＰＥ－抗ＨＬＡ、別個に、ＡＰＣ－抗Ｂ２Ｍ）。次いで、試料を
、フローサイトメーターにかけた。本実施例では、表面マーカー染色により評価されるＢ
２Ｍ発現の喪失は、Ｃａｓ９媒介型編集（例えば、切断）を指し示す。結果を、図１４に
報告する。
[実施例３]
ＣＡＲ－Ｔ細胞内を含む、Ｔ細胞内の、ＴＣＲおよび／またはＰＤ－１の編集
表１０は、ＴＣＲアルファおよびＰＤ－１の遺伝子を編集するための、ｇＲＮＡのター
ゲティングドメインを列挙する。５’から３’へと、示されたターゲティングドメイン－
配列番号６６０１－（Ｕ）７を含むｓｇＲＮＡとして下記で記載されるｇＲＮＡ分子を作
出した。
Figure 2022137032000547
上記の表１０に列挙したターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子をコードする、フ
ォワードＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびリバースＤＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｕ６プ
ロモーターの下流の、レンチウイルスベクターへとクローニングした。略述すると、標準
的な手順を使用して、ベクターを、３７℃、１時間にわたり、ＢＢＳＩで消化した。ＰＣ
Ｒ－ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ベクターを精製し
た。ＢＢＳＩ部位突出（フォワードオリゴのＡＣＣＧ ５’、およびリバース鎖のＡＡＡ
Ｃ ５’）の付加を伴う、ｇＲＮＡのフォワードＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびリバー
スＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ）により合成させた。オリゴは、ＩＤＴ二重鎖緩衝液を使用して、９５℃へ
と加熱し、室温で冷却することによりアニールさせた。次いで、ＮＥＢ ｑｕｉｃｋ ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して、アニールしたオリゴを、切断され、精製されたベク
ターへとライゲーションした。ベクターはまた、ＥＦ１アルファプロモーターの下流に、
Ｃａｓ９およびｍＣｈｅｒｒｙレポーター（ｍＣｈｅｒｒｙは、ＣＡＳ９の下流のＴ２Ａ
配列を使用して発現する）をコードする核酸も含有する。レンチウイルスは、パッケージ
ング系（Ｃｅｌｌｅｃｔａ；型番ＣＰＣＰ－Ｋ２Ａ）を使用してパッケージングした。ウ
イルスによる全てのＣＲＩＳＰＲの産生のために、ウイルスを、２００倍に濃縮した。９
６ウェル平底プレート内、１０％のＦＢＳによるＲＰＭＩ培地１００ｕｌ中に、１×１０
５個のＪｕｒｋａｔ細胞を播種した。濃縮されたウイルス５０ｕｌずつを、各ウェルへと
直接添加した。次いで、ウイルスを添加した２４時間後、１００ｕｌの培地を、細胞へと
添加した。細胞を、１ｍＬ当たりの細胞０．５×１０６個で維持するように、新たな培地
を添加することにより、３日ごとに継代することにより、細胞を培養した。ウイルスの形
質導入の７日後に、ＴＣＲの発現を測定した。ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（型番１７－００
３７－４２）製のＡＰＣへとコンジュゲートさせた、抗ＣＤ３イプシロン抗体クローンで
あるＯＫＴ３を使用して、ＴＣＲを検出した。１×１０５個の細胞を、２ｕｌの抗体と共
に、２０分間にわたりインキュベートし、フローサイトメトリー（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓ
ａ）により解析した。Ｆｌｏｗ Ｊｏソフトウェアを使用して、データを解析した。まず
、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞にゲートをかけて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９陽性細胞を検出し
た。この集団を、ＴＣＲの喪失について解析した。結果を、図２に示す。これらの結果は
、ＴＣＲアルファへとターゲティングされたｇＲＮＡが、Ｊｕｒｋａｔ細胞における、表
面ＴＣＲの発現の喪失を引き起こすことが可能なことを支持する。
ＴＣＲアルファをターゲティングするｇＲＮＡを使用する、ＴＣＲ－初代Ｔ細胞の作出
以下の修飾による、初代Ｔ細胞内のＴＣＲの編集および喪失について評価するため、上
記で言及した手順に従った。０日目に、９６ウェル平底プレート内、１０ｕｌのＴ細胞培
地中で、３：１の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用して、１×１０５個の
初代Ｔ細胞を活性化させた。１日目に、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９／ｍＣｈｅｒｒｙ（上記
で記載した）をコードするレンチウイルス５０ｕｌを添加した。１ｍｌ当たりの細胞５×
１０５個の濃度を維持するように、２日ごと、１２日間にわたり新鮮な培地を添加するこ
とにより、Ｔ細胞を培養した。レンチウイルス導入後６日目および１２日目に、上記で記
載した通りに、ＴＣＲの喪失を測定した。結果を、図３に示す。これらの結果は、ＴＣＲ
アルファへとターゲティングされたｇＲＮＡが、初代Ｔ細胞における、表面ＴＣＲの発現
の喪失を引き起こすことが可能なことを支持する。
ＰＤＣＤ１をターゲティングするｇＲＮＡを使用する、ＰＤ１－初代Ｔ細胞の作出
上記で記載した通りに、表１０で列挙される、ＰＤ－１に対するｇＲＮＡ分子をコード
するレンチウイルスベクターを使用して、ＰＤ－１遺伝子座の編集およびＰＤ－１発現の
喪失について評価した。ＰＤ－１の発現の増大を駆動し、タンパク質のより良好な検出を
可能とするように、５日目に、培養物中に３：１の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａ
ｄｓで、細胞を再刺激することを除き、初代Ｔ細胞内のＴＣＲノックアウトを評価するた
めに、上記で記載した通りに、実験を実施した。結果を、図４に報告する。これらの結果
は、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１）をターゲティングする本発明のｇＲＮＡ分子が、初代Ｔ細胞
における、ＰＤ－１の発現の、高効率の喪失をもたらすことを支持する。
ＲＮＰを使用する、初代Ｔ細胞内の、ＰＤ－１またはＴＣＲの編集
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を使用して、初代Ｔ細胞
内の、ＴＣＲまたはＰＤ－１の編集について調べた。ＲＮＰは、２０ｕｇのＣＡＳ９（Ｐ
ＮＡ ｂｉｏ）と、ＴＲＡＣ－８またはＰＤ１－６のターゲティングドメインを含む２０
ｕｇの化学合成ｓｇＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ｂｉｏｔｅｃｈ）とを混合し、室温で１５
分間にわたりインキュベートすることにより作出した。Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌ
ａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、Ｔ細胞を、Ｌｅｕｋｏｐａｋ Ｐ
ＢＭＣから単離し、次いで、３：１のＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｔ
ｒｏｇｅｎ）で活性化した。活性化の４８時間後、２×１０５個のＴ細胞（ビーズを除去
しない）を、３００ｇで、６分間にわたり遠心分離し、２０ｕｌのＯｐｔｉｍｅｍ内に再
懸濁させ、ＲＮＰ複合体を添加し、混合した。次いで、細胞を、１ｍｍの電気穿孔キュベ
ット（ＢＴＸ）へと移し、２５０Ｖで、５００マイクロ秒間にわたる、１パルスを使用す
る、ＢＴＸ ＥＣＭ８３０マシンを使用してパルス処置した。細胞を、それらのＴ細胞培
地へと戻し、５日間にわたり培養してから、解析した。図５は、培養物中で７日後に、フ
ローサイトメトリーにより検出される、ＴＣＲまたはＰＤ－１の発現についてのヒストグ
ラムを示す。これらの結果は、ＴＣＲアルファおよびＰＤ－１をターゲティングするｇＲ
ＮＡが、ＲＮＰとして導入された場合に、ＴＣＲ陰性またはＰＤ１陰性Ｔ細胞の作出にお
いて有効であることを示す。
ＴＣＲ陰性のＣＡＲ Ｔ細胞
ＴＲＡＣ遺伝子座をターゲティングするｇＲＮＡ分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
を発現するように操作されたＴ細胞内で、ＴＣＲ陰性表現型を編集し、これをもたらす能
力を決定した。０日目に、Ｔ細胞培地中、１ｍｌ当たりの細胞５×１０５個の濃度の初代
Ｔ細胞を、３：１のＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化させた。１日目に、
レンチウイルス粒子を使用して、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように、Ｔ細胞を操作した
。レンチウイルス粒子（国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットに記載されて
いるレンチウイルス）を、５～のＭＯＩで使用して、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するように
、Ｔ細胞を操作した。２日目に、Ｔ細胞を、Ｃａｓ９タンパク質と、ＴＲＡＣ－１または
ＴＲＡＣ－８のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子とを含むＲＮＰで電気穿孔し
た。４日目以降、１ｍｌ当たりの細胞５×１０５個の濃度を維持するように、２日ごとに
、Ｔ細胞に、新鮮な培地を補充した。Ｔ細胞培養の１１日目に、Ｔ細胞をカウントし、製
造元プロトコールに従い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ製のＣＤ３マイクロビーズ
を添加した。ＬＤ磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、陽性選択を実施した。図
６に示される通り、約４０～５０％がＴＣＲ陰性であるＴ細胞集団を濃縮して、９８％を
超える純度の、ＴＣＲ陰性ＣＡＲＴ細胞の単離集団を創出することができた。
ＴＣＲ陰性ＣＡＲＴ細胞の活性
Ｔ細胞は、以下の改変を伴う、標準的な培養条件下で培養した。２日目にＴ細胞に、上
記の「ＲＮＰを使用する、初代Ｔ細胞内の、ＰＤ－１またはＴＣＲの編集」で記載した通
りに、ＴＣＲアルファ（ＴＲＡＣ－１またはＴＲＡＣ－８）をターゲティングするｇＲＮ
Ａを含むＲＮＰで電気穿孔するか、または、上記の、「ＴＣＲアルファをターゲティング
するｇＲＮＡを使用する、ＴＣＲ－初代Ｔ細胞の作出」で記載した通りに、前記ｇＲＮＡ
およびＣａｓ９／ｍＣｈｅｒｒｙをコードするレンチウイルスを形質導入した。１１日目
に、上記の、「ＴＣＲ－ ＣＡＲ Ｔ細胞」で記載した通りに、ＴＣＲ－細胞の精製を追
加した。単離ＴＣＲ陰性細胞を、ルシフェラーゼを発現するＣＤ１９＋ ＮＡＬＭ６（Ｂ
－ＡＬＬ細胞）またはＣＤ１９－ Ｋ５６２（ＣＭＬ細胞）細胞と共に共培養し、ＴＣＲ
－ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ１９＋細胞を特異的に殺滅させる能力を評価した。結果を、図
７（細胞溶解％）に示し、ＴＣＲをターゲティングするｇＲＮＡを含むＴＣＲ陰性ＣＤ１
９ ＣＡＲ Ｔ細胞（レンチウイルスまたはＲＮＰのトランスフェクションによる）が、
ＣＤ１９＋細胞を特異的に殺滅させることが可能であることを支持する。
[実施例４]
２つのｇＲＮＡ分子を使用するＢ２Ｍの切出し
２つのｇＲＮＡ分子が、同じ遺伝子に結合して、標的遺伝子の大型の切片を切り出す能
力について調べるために、本発明者らは、細胞を、２つのｇＲＮＡ分子へと曝露した。各
実験では、ＣＲ００４４２の結合性部位から約１０～約６０００塩基対離れて位置する標
的部位に結合することが予測される第２のｇＲＮＡ分子に加えて、ＣＲ００４４２を使用
した。図８は、２つのｇＲＮＡ分子標的部位の間の塩基対の数に基づき予測される、切出
し産物のサイズを示す。上記の通りに、Ｃａｓ９を安定的に発現するように操作されたＨ
ＥＫ２９３細胞へとトランスフェクトされる、示されたｇＲＮＡ分子（例えば、ＣＲ００
４４２）のターゲティングドメインを含むｃｒＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡとにより、実験
を実施した。２４時間後に、細胞溶解物を回収し、ＰＣＲにかけた。図９～１１は、これ
らの実験の結果を示す。図９に示す通り、ＣＲ００４３８、ＣＲ００４３９、ＣＲ００４
４０、ＣＲ００４４５、またはＣＲ００４４６と対にしたＣＲ００４４２は、４０～６５
塩基対の範囲の、予想される切出し産物に対応するＤＮＡ断片を示した。２０塩基対未満
の切出し産物をもたらすことが予想されるｇＲＮＡ分子の対は、ＰＣＲにより測定される
通り、検出可能な切出し産物を結果としてもたらさなかった。図１０および１１に示す通
り、予想される切出し産物が、約４０００塩基対（図１０）または約６０００塩基対（図
１１）である場合、ガイド対のうちの多くは、＞１０％の編集を伴う、予想される切出し
をもたらした。これらの結果は、２つのｇＲＮＡ分子の使用を介して、宿主遺伝子または
宿主ゲノムから、大型のＤＮＡ部分を切出すことの実行可能性を支持し、遺伝子または遺
伝子産物を失活させる代替的な手法をもたらす。
[実施例５]
ＨＥＫ内および初代ヒトＣＤ３＋細胞内のＴＲＡＣの編集
ＴＲＡＣの配列に対するターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡ分子を含有するＣＲ
ＩＳＰＲ系の編集を、本明細書で記載される方法に従う、ＨＥＫ（Ｃａｓ９を安定的に発
現する細胞へと送達されるｇＲＮＡ）内、および初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞（電気穿孔により
送達されるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ）内の編集について調べた。同様に、編集後にお
けるＴＣＲの表面発現についても、フローサイトメトリーによりアッセイした。略述する
と、編集されたＣＤ３＋細胞を、電気穿孔後３～５日目に、ＣＤ３に対する抗体（ＯＫＴ
３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および／またはＴＣＲアルファ／ベータ（ＩＰ２６＃、Ｂ
ｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。生細胞内の、非編集対照と比べた、ＣＤ３またはＴＣＲ
アルファ／ベータの発現（ヨウ化プロピジウム排除により同定される）を使用して、ＲＮ
Ｐ編集の頻度を決定した。
結果を、表１１に報告する。全ての平均編集％は、ＮＧＳにより測定される通りであり
、少なくとも３回の実験に基づく。ｇＲＮＡ分子を、ＨＥＫ細胞内の編集％によりランク
付けする。図１２は、ＴＣＲの表面発現の喪失により測定される、初代ヒトＣＤ３＋ Ｔ
細胞内の編集％を示すフローサイトメトリーデータと併せた、ＨＥＫ細胞内の編集％に従
いランク付けされた、ＴＲＡＣに対する、上位のｇＲＮＡ分子を示す。
ＣＤ３＋ Ｔ細胞内で、編集後に形成されるインデルについてもまたアッセイした。フ
レームシフト突然変異を含有する、編集された細胞の％を、表１１（「平均ＦＳ編集％」
）に示す。ＴＲＡＣ遺伝子座は、発現タンパク質を結果としてもたらしうるので、３ｂｐ
の欠失または挿入は、ＴＲＡＣの破壊および分解を結果としてもたらしえない可能性があ
る。これに対し、フレームシフト突然変異（１～２ｂｐのイン／デル）は、編集後におけ
る配列を、フレーム外とし、ナンセンス媒介型分解を結果としてもたらす可能性が高いで
あろう。注目すべきことに、ＨＥＫ細胞と、ＣＤ３＋ Ｔ細胞との間では、多くの場合編
集％の大きな差違が見られた、すなわち、Ｔ細胞内の編集％は典型的に、ＨＥＫ細胞内で
観察される編集％未満であった。これらの差違は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、および異なる初代
Ｔ細胞のドナー供給源を含む、複数の試料にわたり再現可能であった（図示しない）。理
論に束縛されずに、１つの説明は、ＴＣＲ遺伝子座が、Ｔ細胞内およびＪｕｒｋａｔ細胞
内では、再配列を受けるが、ＨＥＫ細胞内ではこれを受けないことでありうる。実際、Ｎ
ＧＳシーケンシングは、Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞について、ドナー、使用されるプ
ライマー、または細胞を解析のために採取した編集後の日数に関わらず、一貫して、失敗
するか、または低品質であった（図示しない）。したがって、初代Ｔ細胞内の編集％の、
より信頼できる測定は、タンパク質レベルのノックアウト（例えば、フローサイトメトリ
ーによるＴＣＲの喪失）でありうる。
Figure 2022137032000548
Figure 2022137032000549
Figure 2022137032000550
Figure 2022137032000551
次に、ＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮＡを含む系による、初代ヒトＴ細胞内の編
集について、３例の異なるドナーに由来する、初代ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞内で調べた。図
１５に示す通り、編集％（フローサイトメトリーによって、ＴＣＲの喪失により決定され
る）は、全てのドナーにわたり一貫した。これらのデータは、Ｃａｓ９と組み合わせた、
ある特定のｇＲＮＡ分子が、ＴＣＲアルファサブユニット内に、Ｔ細胞の表面上の、ＴＣ
Ｒの発現の喪失を結果としてもたらす、インデルを創出することが可能であることを支持
した。編集効率は、ドナー非依存性であり、したがって、この手法の広範な適用可能性を
示す。
[実施例６]
ＨＥＫ細胞内のＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２の編集
ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２の配列に対するターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡ
分子を含有するＣＲＩＳＰＲ系の編集を、本明細書で記載される方法に従う、ＨＥＫ（Ｃ
ａｓ９を安定的に発現する細胞へと送達されるｇＲＮＡ）内およびＣＤ３＋ Ｔ細胞（Ｒ
ＮＰとして送達されるｇＲＮＡおよびＣａｓ９）内の編集について調べた。結果を、表１
２に報告する。全ての平均編集％は、ＮＧＳにより測定される通りであり、少なくとも３
回の実験に基づく。図１３は、ＴＣＲの表面発現の喪失により測定される、初代ヒトＣＤ
３＋ Ｔ細胞内の編集％を示すフローサイトメトリーデータと併せた、ＨＥＫ細胞内の編
集％に従いランク付けされた、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２に対する、上位のｇＲＮＡ分
子を示す。
Figure 2022137032000552
Figure 2022137032000553
これらのデータは、Ｃａｓ９と組み合わせた、ある特定のｇＲＮＡ分子が、ＴＣＲベー
タサブユニット内に、Ｔ細胞の表面上の、ＴＣＲの発現の喪失を結果としてもたらす、イ
ンデルを創出することが可能であることを支持した。
[実施例７]
ＨＥＫ細胞内および初代ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞内のＰＤＣＤ１の編集
ＰＤＣＤ１の配列に対するターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡ分子を含有するＣ
ＲＩＳＰＲ系の編集を、本明細書で記載される方法に従う、ＨＥＫ（Ｃａｓ９を安定的に
発現する細胞へと送達されるｇＲＮＡ）内およびＣＤ３＋ Ｔ細胞（ＲＮＰとして送達さ
れるｇＲＮＡおよびＣａｓ９）内の編集について調べた。
ＨＥＫ細胞内の編集の結果を、表１３に報告する。全ての平均編集％は、ＮＧＳにより
測定される通りであり、少なくとも３回の実験に基づく。図１６は、ＨＥＫ細胞内の編集
％に従いランク付けされた、ＰＤＣＤ１に対する、上位のｇＲＮＡ分子を示す。図１６は
また、抗ＰＤ－１抗体を使用するフローサイトメトリー（ｃｅＢｉｏＪ１０５、ｅＢｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ）により測定される、ＰＤ－１発現の喪失を伴う細胞の％も示す。略述す
ると、０日目から始めて、初代ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞を、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｉｍｍｕｎ
ｏＣｕｌｔで活性化させた。３日目に、示されたｄｇＲＮＡを含有するＲＮＰを、細胞へ
と電気穿孔した（Ｎｅｏｎ；１６００Ｖ、１０ミリ秒間、３つのパルス）。トランスフェ
クションの２日後（５日目）、細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１：
３細胞：ビーズ比）で刺激した。１０日目に、ＰＤ－１の発現について評価した。
Figure 2022137032000554
Figure 2022137032000555
Figure 2022137032000556
次に、示されたＣＲｘｘｘｘＩＤのターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡ分子を含
むＲＮＰによるＰＤＣＤ１の編集について、ＮＧＳにより測定される通りに、初代ヒトＣ
Ｄ３＋ Ｔ細胞内でアッセイし、ＰＤ－１の表面発現の喪失について、本明細書で記載さ
れる通りに、フローサイトメトリーによりアッセイした。結果を、図１８に報告する。い
くつかのｇＲＮＡ分子は、ＰＤ－１の、良好な編集および喪失を示す。次いで、これらの
同じガイドを、３つの異なるドナーに由来する、ＣＤ３＋ Ｔ細胞内で調べた。データを
、図１９に報告する。示される通り、ＣＲ００８５２、ＣＲ００８２８、ＣＲ００８７０
、ＣＲ００８４８、ＣＲ００８５５、およびＣＲ００８３８のターゲティングドメインを
含むｇＲＮＡは、少なくとも２例のドナーにわたり、５０％を超える編集を示す。
[実施例８]
初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞内の、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍの同時的ノックアウトおよび逐次的
ノックアウト
初代ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞を活性化させ、Ｂ２Ｍに対するｇＲＮＡ（ＣＲ０００４４２
）および／またはＴＲＡＣに対するｇＲＮＡ（ＣＲ０００９８４）を含有するＲＮＰで電
気穿孔した。略述すると、Ｂ２Ｍおよび／またはＴＲＡＣをターゲティングするＲＮＰを
、ＣＤ３＋ Ｔ細胞へと、以下の比：Ｂ２Ｍ ＲＮＰだけ；ＴＲＡＣ ＲＮＰだけ；Ｂ２
Ｍ ＲＮＰ＋ＴＲＡＣ ＲＮＰ；０．５×のＢ２Ｍ ＲＮＰ＋０．５×のＴＲＡＣ ＲＮ
Ｐ；０．５×のＢ２Ｍ ＲＮＰ＋１×のＴＲＡＣ ＲＮＰ；１×のＢ２Ｍ ＲＮＰ＋０．
５×のＴＲＡＣ ＲＮＰ；ＲＮＰなしで電気穿孔した。これにより、多様な量のＲＮＰ（
１つまたは２つの標的）の、細胞生存率および標的遺伝子の編集効率に対する効果を決定
することが可能となった。細胞を、フローサイトメトリーにより、ＴＣＲの発現およびＢ
２Ｍ発現の両方について評価した。結果を、図１７Ａ～１７Ｄに示す。これらの結果は、
生存率に対する負の影響を伴ったり、いずれのガイドの編集効率も損なったりせずに、２
つの個別の標的をターゲティングするＲＮＰを、電気穿孔により、ＣＤ３＋ Ｔ細胞へと
、同時に送達しうることを示した。加えて、ＣＤ３＋ Ｔ細胞は、いずれの標的において
も、高頻度で、編集に成功する結果として、ＣＤ３－ Ｂ２Ｍ－集団をもたらした。
次に、Ｂ２Ｍに対するｄｇＲＮＡと、ＴＲＡＣに対するｄｇＲＮＡとを含有するＲＮＰ
の、同時的導入または逐次的導入による、２つの標的である、Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣの編
集の効果。この実験のために、上記で記載した通り、Ｂ２Ｍをターゲティングするための
ＣＲ０００４４２のターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡを使用するＲＮＰと、ＴＲ
ＡＣをターゲティングするためのＣＲ０００９８４のターゲティングドメインを含むｄｇ
ＲＮＡを使用するＲＮＰとを作出した。略述すると、ＣＤ３＋ Ｔ細胞を解凍し、３日間
にわたり活性化させた（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＩｍｍｕｎｏ
ｃｕｌｔ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）。３日目および４日
目（逐次的）または３日目（同時的）に、細胞に電気穿孔して、ＲＮＰを導入し、送達後
５日目（９日目）まで維持し、ここで、ＦＡＣＳにより（次いで、細胞溶解後におけるＮ
ＧＳにより）、Ｂ２Ｍおよび／またはＴＣＲの発現について評価した。Ｔ細胞は、電気穿
孔および電気穿孔工程後を通して、活性化試薬の存在下で維持した。Ｂ２ＭおよびＴＣＲ
の発現について、ＦＡＣＳにより（抗Ｂ２Ｍクローンである２Ｍ２または抗ＣＤ３クロー
ンであるＯＫＴ３を、１：２００の希釈率で使用して）評価した。その後、細胞を溶解さ
せ、ターゲティングされた遺伝子座の編集について、ＮＧＳにより評価した。結果を、図
２５および２６に報告する。これらの結果は、Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣの、逐次的ターゲテ
ィングおよび同時的ターゲティングのいずれも、同様な二重ノックアウト頻度をもたらす
ことを指し示す。
[実施例９]
ＦＫＢＰ１Ａの編集
ＦＫＢＰ１Ａ遺伝子へとターゲティングされたｄｇＲＮＡによるＦＫＢＰ１Ａの編集に
ついて、上記で記載した通り、Ｃａｓ９を発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞内
でアッセイした。編集％およびフレームシフト（ＦＳ）編集％を含むデータを、図２１、
図２２、および図２３に報告する。これらの結果に基づき、上位１５のｇＲＮＡ分子を、
最高のＦＳ編集パーセントにより同定した。それらのターゲティングドメインを含む、こ
れらのｇＲＮＡ分子を、図２３に報告する。次に、ＣＤ３＋ Ｔ細胞内のＦＫＢＰ１Ａの
編集について、同定されたＦＫＢＰ１Ａに対するターゲティングドメインを含む二重ガイ
ドを含むＲＮＰを使用してアッセイした。細胞、ＲＮＰ、および全ての方法は、上記で記
載した通りに形成し、実施した。結果を、図２４に報告する。
前出の実験を追跡するために、最も効率的な編集ｇＲＮＡのターゲティングドメインを
含むｇＲＮＡについて、初代ヒトＴ細胞内で、再度調べた。図５２は、ｄｇＲＮＡフォー
マット（上記で記載した）内で、ＦＫＢＰ１Ａをターゲティングする、示されたｇＲＮＡ
を含有するＲＮＰによるヒト初代Ｔ細胞電気穿孔から生じる、ＦＫＢＰ１Ａ遺伝子座のゲ
ノム編集を示す。挿入または欠失の頻度（％インデル）を指し示し、コード配列のフレー
ムシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百分率を示す。結果は、高編集効
率（＞８０％）を、高比率のフレームシフト編集（＞６５％）と共に達成することが可能
なｇＲＮＡのサブセットを支持する。図５３は、初代ヒトＴ細胞の編集のために使用され
る、ＦＫＢＰ１Ａをターゲティングする各ｇＲＮＡについて、最も高頻度で観察される、
上位５つの配列変化（インデル）を示す。
[実施例１０]
ＣＩＩＴＡの編集
ＣＩＩＴＡ遺伝子へとターゲティングされたｄｇＲＮＡによるＣＩＩＴＡの編集につい
て、上記の実施例１で記載した通り、Ｃａｓ９を発現するように操作されたＨＥＫ２９３
細胞内でアッセイした。編集％およびフレームシフト（ＦＳ）編集％を含むデータを、下
記の表２４に報告する。
Figure 2022137032000557
Figure 2022137032000558
Figure 2022137032000559
次に、編集％を最高とする、ｇＲＮＡ分子によるＣＩＩＴＡの編集について、実施例１
で記載した通り、ＣＤ３＋初代ヒトＴ細胞について評価した。結果を、表３２に示す。
Figure 2022137032000560
次に、ＣＩＩＴＡをターゲティングするｇＲＮＡ分子のサブセットに応答する、ＭＨＣ
クラスＩＩ分子の発現の編集および喪失について、初代ヒトＴ細胞内で評価した。略述す
ると、初代ヒトＴ細胞を、培養物中で調製し、ビーズ対細胞比を３：１とする、ＣＤ３／
ＣＤ２８ビーズ刺激（ＤｙｎａＢｅａｄｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番１１１．４１Ｄ
）を使用して活性化させた。２日目に、Ｎｅｏｎ電気穿孔機を使用して、示されたターゲ
ティングドメインを含むｄｇＲＮＡ分子とあらかじめ複合体化させた（上記で記載したｃ
ｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒ配列を使用して）化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ
９からなるＲＮＰを、３つの異なる濃度のＲＮＰ（０．３ｕＭ、１．０ｕＭ、および３．
０ｕＭ；ＲＮＰの形成後に希釈された）で、Ｔ細胞へと電気穿孔した。５日目および７日
目に、編集％について、フローサイトメトリーにより評価される、ＨＬＡ－ＤＲの発現の
喪失により評価した。５日目の結果と、７日目の結果とは、同等であった。５日目におけ
るＴ細胞内の編集％（例えば、ＣＤ３＋かつＨＬＡ－ＤＲ－である細胞の％）を、図３７
に示す。示される通り、被験最高濃度では、ｄｇＲＮＡ分子である、ＣＲ０２９９１、Ｃ
Ｒ０２９９３、およびＣＲ０３００７の各々を含むＲＮＰは、ＨＬＡ－ＤＲ表面染色の喪
失により測定される通り、＞５０％の編集を結果としてもたらした。下記に示される通り
、ｇＲＮＡであるＣＲ００２９６１について観察される編集の欠如は、実験プロトコール
における過誤に起因した。実験を繰り返したところ（データは、図３９に示す）、ｇＲＮ
ＡであるＣＲ００２９６１を含むＲＮＰは、ＨＬＡ－ＤＲ発現の、用量応答性の低減レベ
ルを結果としてもたらした。
上記で記載した実験を、ＣＩＩＴＡをターゲティングするｇＲＮＡ分子の別のセットに
ついて繰り返した。図３８は、この実験の結果を、ＣＩＩＴＡ遺伝子座をターゲティング
する、示されたｇＲＮＡを含有するＲＮＰによるヒト初代Ｔ細胞電気穿孔から生じる、Ｃ
ＩＩＴＡ遺伝子座のゲノム編集とともに示す。挿入または欠失の頻度（％インデル）を指
し示し、コード配列のフレームシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百分
率（フレームシフト編集％）を示す。最も高頻度で観察される、上位５つの配列変化を、
下パネルに詳細に示す。これらのデータは、ＣＩＩＴＡをターゲティングするｇＲＮＡが
、初代ヒトＴ細胞内で、最大７４％のフレームシフト編集を伴う、＞９０％の編集を達成
することが可能であることを指し示す。
多様な濃度のＲＮＰでＣＩＩＴＡをターゲティングする、ｇＲＮＡの第３のセットを使
用して、実験を再度実施した。図３９は、示された濃度で、ＣＩＩＴＡに対する、示され
たｄｇＲＮＡ（番号は、ターゲティングドメインのＣＲ００ｘｘｘｘ識別子を指し示す）
を含むＲＮＰによる、初代ヒトＴ細胞内の電気穿孔後３日目における編集％であって、抗
ＨＬＡ－ＤＲ試薬を使用するフローサイトメトリーにより測定される編集％を示す。編集
％は、ガイドＲＮＡを伴わずに電気穿孔された細胞内の発現と比べた、ＣＩＩＴＡガイド
を伴い電気穿孔された細胞の細胞表面における、ＨＬＡ－ＤＲの発現を表す。上記で言及
した通り、この実験では、ｇＲＮＡであるＣＲ００２９６１の活性を確認した。図４０に
、挿入または欠失の頻度（％インデル）を指し示し、コード配列のフレームシフティング
を結果としてもたらす、これらの編集の百分率（フレームシフト編集％）を示す。これら
のデータは、ＣＩＩＴＡをターゲティングするｇＲＮＡの別のセットであって、初代ヒト
Ｔ細胞内で、最大８７％のフレームシフト編集（ＣＲ００２９６７）を伴う、＞８５％の
編集を達成することが可能なセットを同定することを指し示す。初代ヒトＴ細胞編集のた
めに使用される、ＣＩＩＴＡをターゲティングする各ｇＲＮＡについて最も高頻度で観察
される、上位５つの配列変化を、図４１に示す。
ＣＩＩＴＡをターゲティングする、ｇＲＮＡの異なるセットを使用して、実験を再度実
施し、前出の実験による、性能が最高のｇＲＮＡ（ＣＲ０００２９６７）と比較した。図
４２は、示された濃度で、ＣＩＩＴＡに対する、示されたｄｇＲＮＡ（番号は、ターゲテ
ィングドメインのＣＲ００ｘｘｘｘ識別子を指し示す）を含むＲＮＰによる、初代ヒトＴ
細胞内の電気穿孔後３日目における編集％であって、抗ＨＬＡ－ＤＲ試薬を使用するフロ
ーサイトメトリーにより測定される編集％の結果を示す。図４２に、これらのｇＲＮＡを
使用する場合の、挿入または欠失の頻度（％インデル）を指し示し、コード配列のフレー
ムシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百分率（フレームシフト編集％）
を示す。図４４は、初代ヒトＴ細胞内の、ＣＩＩＴＡをターゲティングする、これらのｇ
ＲＮＡの各々について最も高頻度で観察される、上位５つの配列変化（インデル）を示す
。これらのデータは、ｄｇＲＮＡであるＣＲ００２９６７を含むＲＮＰについて、ＨＬＡ
－ＤＲの高編集／フレームシフト／喪失を確認し、加えて、ＣＩＩＴＡへとターゲティン
グされた他のｇＲＮＡであって、初代ヒトＴ細胞内の、高編集（＞９０％）および高フレ
ームシフト突然変異（＞８０％）を結果としてもたらすｇＲＮＡも同定する。
[実施例１１]
ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞内の、ＴＣＲ（ＴＲＡＣ）およびＢ２Ｍの編集
Figure 2022137032000561
Figure 2022137032000562
ＢＣＭＡ ＣＡＲＴを発現するように操作されたＴ細胞内の同種異系Ｔ細胞標的の編集
と、編集された細胞の機能とについて評価した。これらの実験で使用されるＴＣＲ－ Ｂ
２Ｍ－／ＢＣＭＡ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を含むＴ細胞は、図２７に概略的に記載される通り
に調製した。略述すると、ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌを使用する遠心分離法を使用するこ
とにより、ヒト血液から単離した。全Ｔ細胞は、ｈｕｍａｎ Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉ
ｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；型番１３０－０９６－５
３５）を使用して、これらのＰＢＭＣ（Ｈｅｍａｃａｒｅ）から単離した。これらの細胞
をアリコート分割し、ＣＲＹＯＳＴＯＲ ＣＳ１０培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉ
ｏｎ－２１０１０２）を使用して凍結させ、液体窒素中に保管した。次いで、これらの凍
結させた細胞アリコートを、３７度の水浴中で、２０秒間にわたり解凍し、次いで、１０
ｍｌの、あらかじめ温められたＴ細胞培地を伴う５０ｍｌのコニカルチューブへと移し、
２４度、３００ｒｐｍで、５～１０分間にわたり遠心分離して、凍結培地を除去し、あら
かじめ温めたＴ細胞培地と共に再懸濁させた。次いで、細胞を、２４ウェルディッシュへ
と移し、ビーズ対細胞比を３：１とする、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ
；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番１１１．４１Ｄ）を添加することにより活性化させた。活
性化後１日目、ＣＡＲ ＢＣＭＡ－１３をコードする配列（上記の表２３による１３９１
１２）を含むレンチウイルスを、感染多重度（ＭＯＩ）を５として、これらの細胞へと形
質導入した。ＵＴＤ（非形質導入細胞）は、ウイルスで処置しなかった。次いで、活性化
後４日目に、ＢＴＸ（設定：１０００Ｖ／０．６ミリ秒／１パルス）を使用して、ＣＡＲ
ＢＣＭＡ－１３ Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞である条件１つ当たりの細胞２５０，
０００個を、示されたガイドＲＮＡを伴うか、または伴わないＲＮＰで電気穿孔した。Ｒ
ＮＰを作出するために、ｔｒａｃｒＲＮＡと、ｃｒＲＮＡとを含むｄｇＲＮＡ分子であっ
て、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍに対するｄｇＲＮＡ分子を、併せて、９５℃で２分間にわたり
加熱し、室温となるように徐々に冷却し、ここで、それらを、Ｃａｓ９タンパク質および
５×のＣＣＥ緩衝液と共に、３７℃で、１０分間にわたりインキュベートした。ＴＲＡＣ
を編集するために、ＣＲ０００９８５（配列：ＣＣＧＡＡＵＣＣＵＣＣＵＣＣＵＧＡＡＡ
Ｇ（配列番号５５９３））のターゲティングドメインを使用し、Ｂ２Ｍを編集するために
、ＣＲ０００４４２（配列：ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＵＣＵ（配列番号５４
９６））のターゲティングドメインを使用した。各場合には、ｃｒＲＮＡ配列：［ターゲ
ティングドメイン］－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号６６０
７）と、ｔｒａｃｒ配列：ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡ
ＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ
ＵＵＵＵＵＵ（配列番号６６６０）とを伴う、ｄｇＲＮＡを使用した。電気穿孔後、細胞
を、２４ウェルプレート内のＴ細胞培地０．５ｍｌへと戻した。電気穿孔の２日後、細胞
を隔日で分けて、１ｍｌ当たりの細胞５０万個で維持した。電気穿孔の５日後、Ｆｌｏｗ
Ｊｏソフトウェアを使用するフローサイトメトリー（ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）により、
細胞１００，０００個を解析した。細胞１００，０００個を、丸底９６ウェルプレートの
各ウェルへとアリコート分割した。細胞を各試料から採取し、それらを、ビーズから解離
させるようにピペッティングし、９６ウェルプレート用磁石を使用することにより、ビー
ズを除去し、０．５％のＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；型番１３０－０９１－３７６）を伴
う、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ緩衝液；型番１３０－０
９２－９８７）と共に遠心分離して、細胞を洗浄した。次いで、細胞を、氷上、３０分間
にわたり、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に希釈した異なる抗体と共にインキュベートし
た。次いで、細胞を、２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液で、２回にわたり洗浄した。次いで、
細胞を、１５０ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａフロ
ーサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にかけた。ＴＣＲの発現は、抗
ＣＤ３－ＰｅｒｃｐＣｙ５．５（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；４５－００３７－４２）を
使用することにより検出し、Ｂ２Ｍの発現は、抗Ｂ２Ｍ－ＡＰＣ（３１６３１２；Ｂｉｏ
ｌｅｇｅｎｄ）を使用することにより検出した。ＣＡＲの細胞表面発現は、ビオチニル化
プロテインＬに続く、ストレプトアビジン－ＰＥ（０１６－１１０－０８４；Ｊａｃｋｓ
ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）による染色によって査定した。Ｔ細胞は、抗Ｃ
Ｄ４－Ｖ４５０（４８－００４７－４２；Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する、ＣＤ
４の染色、または抗ＣＤ８－ａｌｅｘａ７００（３００９２０；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を
使用する、ＣＤ８の染色により検出した。ＴＣＲ（抗ＣＤ３－ＰｅｒｃｐＣｙ５．５を使
用する）およびＢ２Ｍ（抗Ｂ２Ｍ－ＡＰＣを使用する）の発現を、図２８に示す。ＢＣＭ
Ａ ＣＡＲ ＢＣＭＡ－１３を形質導入されたＴ細胞は、「ＣＡＲ」と表示する。非形質
導入細胞は、「ＵＴＤ」と表示する。Ｃａｓ９は電気穿孔されているが、ガイドＲＮＡは
電気穿孔されていない細胞は、「ガイドなし」と表示する。抗ＣＤ４－Ｖ４５０を使用す
るＣＤ４染色を、図２８の下パネルに示して、ＣＤ３染色の喪失が、ＴＣＲの喪失に起因
するものであり、Ｔ細胞の喪失に起因するものではないことを検証する。これらの結果は
、高収量の、ＴＣＲの発現およびＢ２Ｍの発現を欠くＴ細胞の集団を作出するのに、ＣＲ
ＩＳＰＲ系の、Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣへの同時的導入を使用することが可能であり、ＣＡ
Ｒ形質導入セット内のＴ細胞のうちの７２％が、ＴＣＲおよびＢ２Ｍのいずれについても
、染色が陰性であることを支持する。次に、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍの編集について、図２
８で評価される、細胞のＣＡＲ＋サブセット内で査定した。結果を、図２９に示す。略述
すると、左パネルでは、ＣＡＲ＋細胞（ビオチニル化プロテインＬに続いて、ストレプト
アビジン－ＰＥを使用して染色した）についてゲートをかけることにより、またはＣＡＲ
にゲートをかけずに（全Ｔ細胞；右パネル）、図２８による細胞について解析した。編集
レベルは、ＣＡＲ＋細胞集団内および全Ｔ細胞集団内で同様であり、ＣＡＲの発現が、編
集効率に対して、影響を及ぼさなかったことを指し示す。
次に、ＰＥチャネルを解析することにより、図２８による細胞を、ＣＡＲの発現につい
て解析した。図３０に示す通り、ＣＡＲ陽性細胞の百分率は、ガイドＲＮＡ（ＴＲＡＣお
よびＢ２Ｍ）を施される細胞内と、ガイドＲＮＡを施されない細胞（ガイドなし）内とで
同様であることから、ＴＣＲおよびＢ２Ｍの編集が、ＣＡＲの発現に対して、影響を及ぼ
さなかったことが指し示される。ＵＴＤは、非形質導入細胞を指し示す。ＣＡＲは、ＢＣ
ＭＡ ＣＡＲを形質導入した細胞を指し示す。
次に、Ｔ細胞が、ＢＣＭＡ（ＣＡＲ分子の標的抗原）に応答して増殖する能力を評価し
た。略述すると、細胞は、上記で記載した通りに調製し、解凍し、ＢＣＭＡを発現する標
的細胞（ＫＭＳ１１（高）、ＲＰＭＩ８２２６（低））、またはＢＣＭＡを発現しない標
的細胞（Ｎａｌｍ６）と共に共培養した。ＣＡＲ ＢＣＭＡ－１３を形質導入されたＴ細
胞は、「ＢＣＭＡ ＣＡＲ」と表示する。非形質導入細胞は、「ＵＴＤ」と表示する。Ｃ
ａｓ９は電気穿孔されているが、ガイドＲＮＡは電気穿孔されていない細胞は、「ガイド
なし」と表示する。Ｂ２ＭガイドおよびＴＣＲガイドを含有するＲＮＰを電気穿孔された
細胞は、「Ｂ２Ｍ＋ＴＣＲ」と表示する。２５，０００個の、照射された標的腫瘍細胞を
、Ｔ細胞と共に、１：１の比で、４日間にわたり共培養し、その後フローサイトメトリー
解析を行った。Ｔ細胞（抗ＣＤ４－Ｖ４５０および抗ＣＤ８－ａｌｅｘａ７００で染色さ
れた）の数は、３０００個のカウンティングビーズ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；
型番Ｃ３６９５０）と比べた、ＣＤ４＋細胞に加えたＣＤ８＋細胞の数により決定した。
図３１に示す通り、ＢＣＭＡ ＣＡＲレンチウイルスを形質導入された細胞集団のいずれ
も、ＢＣＭＡを発現する細胞型の両方に応答した増殖を呈示し、Ｂ２Ｍターゲティングｇ
ＲＮＡ分子およびＴＲＡＣターゲティングｇＲＮＡ分子を含有するＲＮＰを施される細胞
集団は、４日間にわたる共培養の後で、高値のＴ細胞カウントを呈示する。図３２に示す
通り、ＣＡＲ＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞、および／またはＣＡＲ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖
を、個別に評価したところ、結果は、同様であり、ＣＡＲ＋（ビオチニル化タンパク質Ｌ
による染色に続き、ストレプトアビジン－ＡＰＣ－ｅｆｌｕｏｒ７８０でゲートをかけた
）Ｔ細胞は、ＢＣＭＡを発現する細胞型の両方に応答して増殖した。前出の明細書は、当
業者が、本発明を実施することを可能とするのに十分であると考えられる。
[実施例１２]
ＴＣＲまたはＢ２ＭをターゲティングするＲＮＰを使用する、ＲＮＰ濃度の効果およびイ
ンデルパターンについての解析、ならびにＣＩＩＴＡ－／Ｂ２Ｍ－／ＴＣＲ－ ＣＡＲ
Ｔ細胞の作出
方法
ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌを使用する遠心分離法を使用することにより、ヒト血液（Ｈ
ｅｍａｃａｒｅ）から単離した。全Ｔ細胞は、ｈｕｍａｎ Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓ
ｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；型番１３０－０９６－５３
５）を使用して、これらのＰＢＭＣから単離した。これらの細胞を、アリコート分割し、
凍結させた。次いで、これらの凍結させた細胞アリコートを、解凍し、ビーズ対細胞比を
３：１とする、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；
型番１１１．４１Ｄ）を使用して活性化させた。ビーズによる活性化後２日目または３日
目に、細胞２００，０００個を、電気穿孔のために、培養物から取り出した。Ｔ細胞のゲ
ノム編集のために使用されるＲＮＰ複合体は、Ｃａｓ９タンパク質対ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ
およびｔｒａｃＲＮＡ）の１：２のモル比を使用して形成した。１００μＭのｃｒＲＮＡ
および１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡを、個別に、９５℃で２分間にわたり変性させ、室
温へと冷却した。５μＬの最終容量中、濃度を５．９μｇ／μＬ（ＮＬＳ－Ｃａｓ９－Ｎ
ＬＳ）とするＣａｓ９タンパク質１．４μＬを、１．６μＬのＣａｓ９緩衝液（２０ｍＭ
のトリス、ｐＨ８．０；２００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）と混合し、１００
μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ １μＬと、室温で混合した。次に、１００μＭのｃｒＲＮＡ
１μＬを、添加し、混合し、３７℃で、１０分間にわたりインキュベートした。電気穿孔
ステップ時に、１つを超えるＲＮＰを添加する場合は、上記の方法を使用して、異なる遺
伝子をターゲティングするｃｒＲＮＡを伴う各ＲＮＰを、個別にアセンブルし、次いで、
異なる条件に対して、異なるＲＮＰの最終濃度を得るために、Ｃａｓ９緩衝液の添加と併
せて組み合わせた。「三重編集」、すなわち、異なる遺伝子をターゲティングする、３つ
のＲＮＰの同時的添加のために、ＲＮＰの数量についての詳細を、図に提供する。次いで
、アセンブルされたＲＮＰを、１０ｕｌのＴ緩衝液（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎ Ｓｙｓｔｅｍ １０ｕｌ Ｋｉｔ）中の細胞２００，０００個と共に混合した。電気
穿孔は、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １０μＬ Ｋ
ｉｔ（ＭＰＫ１０９６）を、１６００Ｖ、１０ミリ秒間、３つのパルスで使用する、Ｎｅ
ｏｎ電気穿孔機により実施した。ＣＩＩＴＡについては、電気穿孔の３日後に、フローサ
イトメトリーによってＨＬＡ－ＤＲの細胞表面発現の喪失を測定することにより、編集を
定量化した。細胞を、抗ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、抗ＨＬＡ－ＤＲ－Ｖ４５０
、およびＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｄｙｅ ｅ７８０（ＡＰＣ－Ｃｙ７）で染色し
、フローサイトメトリーにより解析した。ＴＲＡＣの編集は、電気穿孔の３日後において
、抗ＣＤ３抗体（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）を使用して、フローサイトメトリーを使用し
てＣＤ３イプシロンの細胞表面発現の喪失を測定することにより定量化した。Ｂ２Ｍの編
集は、電気穿孔の４日後において、抗Ｂ２Ｍ抗体－ＡＰＣ（３１６３１２；Ｂｉｏｌｅｇ
ｅｎｄ）を使用する、フローサイトメトリーを使用する、細胞表面発現の喪失により測定
した。上記で調製したＴ細胞内の遺伝子編集から生じる、編集頻度および配列変化につい
て査定するため、ゲノムＤＮＡを単離し、シーケンシングにかけた。略述すると、凍結さ
せた細胞ペレットを解凍し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑ
ｉａｇｅｎ；６９５０６）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離するように加工した。溶出さ
せたＤＮＡを、Ｔｉｔａｎｉｕｍ Ｔａｑ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ；６３９２１１）と、表２７におけるプライマーとを使用して、ＰＣＲ
を実行するのに使用した。
Figure 2022137032000563
Figure 2022137032000564
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉ
ａｇｅｎ、２８１０４）を使用して精製した。次いで、精製ＰＣＲ産物を、塩基対ミスマ
ッチを検出し、遺伝子編集を確認する、Ｔ７Ｅ１アッセイのために使用した。ＰＣＲ単位
複製配列を、標準的なＮｅｘｔｅｒａ ＮＧＳ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐ（Ｉｌｌｕｍ
ｉｎａ）にかけ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサー上で、ペアドエンドリード
によりシーケンシングした。シーケンシングリードを、基準ゲノムに対してアライメント
し、変異体をコールした。
結果
まず、ＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮＡを、Ｃａｓ９（ＲＮＰ）の多様な濃度に
おける、細胞表面のＴＣＲの発現に対する効果について査定した。ヒト初代Ｔ細胞を、Ｃ
Ｄ３／ＣＤ２８ビーズによる活性化後３日目に、二重ガイドフォーマットの、示されたｇ
ＲＮＡを含有する、示された濃度（ｕＭ）のＲＮＰで電気穿孔した。さらなるガイド番号
は、ｇＲＮＡのターゲティングドメインのＣＲｘｘｘｘｘ識別子を指し示す。ＴＣＲの発
現の喪失は、電気穿孔の３日後において、抗ＣＤ３抗体を伴う染色と、フローサイトメト
リーによる解析により査定した（ＣＤ３ ＫＯ Ｔ細胞（％））。図３３Ａは、ガイドで
ある、ＣＲ０００９６１（９６１）、ＣＲ０００９７８（９７８）、ＣＲ０００９８４（
９８４）、ＣＲ０００９９２（９９２）、ＣＲ０００９８５（９８５）、およびＣＲ００
０９６０（ｇＲＮＡ１）、およびＣＲ０００９７９（ｇＲＮＡ８）を含有するＲＮＰの電
気穿孔時における、ＣＤ３染色の喪失を示す。これらのデータは、ほぼ最大限の編集（Ｃ
Ｄ３染色の喪失により示される）が、ＣＲ０００９６１およびＣＲ０００９８４を含有す
るｇＲＮＡを伴うＲＮＰであって、０．２～０．３ｕＭの間のＲＮＰ濃度のＲＮＰについ
て達成されることを示す。他のｇＲＮＡは、１ｕＭの濃度で、最大限の編集を達成した。
図３３Ｂは、ガイドである、ＣＲ０００９９１（９９１）、ＣＲ０００９９２（９９２）
、ＣＲ０００９９３（９９３）、およびＣＲ０００９７８（９７８）を含有するＲＮＰの
電気穿孔時における、ＣＤ３染色の喪失を示す。９９１と、９９２とは、ほぼ重ね合わせ
可能である。ここでもまた、ｇＲＮＡ ９９１、ｇＲＮＡ ９９２、およびｇＲＮＡ ９
９３を含有するＲＮＰについて、最大の編集が、０．３ｕＭのＲＮＰ濃度で観察されたの
に対し、ｇＲＮＡ ９７８の編集％は、１．１ｕＭまで増大し続けた。図３３Ｃに示す通
り、ＴＲＡＣ遺伝子座をターゲティングするｇＲＮＡによる、Ｔ細胞の電気穿孔物は、標
的部位における高レベルのインデル形成（最大で９７％の編集）と、タンパク質発現の喪
失を結果としてもたらすことが予測される、高レベルのフレームシフト突然変異（最大で
７８％）とを結果としてもたらす。次に、各標的遺伝子座における突然変異（インデル）
を、次世代シーケンシングにより評価した。図３４Ａおよび図３４Ｂは、ＴＲＡＣをター
ゲティングする各ｄｇＲＮＡであって、初代ヒトＴ細胞編集のために使用される各ｄｇＲ
ＮＡについて、最も高頻度で観察される、上位５つの配列変化を示す。図ＡおよびＢは、
２つの独立に実施された電気穿孔実験からのアウトカムである。データは、三連のＰＣＲ
産物による平均である。これらのデータは、同じｇＲＮＡフォーマットおよびＲＮＰを、
同じ送達技法において使用する場合における、複数の実験にわたる編集の一貫したパター
ンを示す。
次に、同様な実験を、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡ（二重ガイドフォーマット
）により実施した。まず、ＲＮＰ濃度の効果を評価した。ヒト初代Ｔ細胞を、ＣＤ３／Ｃ
Ｄ２８ビーズによる活性化後２日目に、示されたｇＲＮＡを含有する、示された濃度のＲ
ＮＰで電気穿孔した。ガイド番号は、ターゲティングドメインのＣＲ００ｘｘｘ識別子を
指し示す。Ｂ２Ｍ発現の喪失は、抗Ｂ２Ｍ抗体を伴う染色、および電気穿孔の４日後にお
けるフローサイトメトリーによる解析により査定した（Ｂ２Ｍ陰性細胞）。結果を、図３
５に報告し、＞８５％の編集（Ｂ２Ｍの表面発現の喪失によりアッセイされる）が、０．
２ｕＭのｇＲＮＡ ４４２により達成され、ｇＲＮＡ ４４２およびｇＲＮＡ ４５５に
ついては、わずかに高いＲＮＰ濃度（０．４ｕＭ）で達成されたことを支持する。図３６
に示す通り、ｇＲＮＡである、ＣＲ０００４４４およびＣＲ０００４５５を含むＲＮＰは
、初代ヒトＴ細胞内の、高レベルの編集および高レベルのフレームシフト編集を結果とし
てもたらす。各ｇＲＮＡにより産生される、上位１０のインデルを、下パネルに示す。デ
ータは、三連のＰＣＲ産物による平均である。
次に、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡの同時的編集を、ＣＡＲＴ細胞内で実施し、
このようなＣＡＲＴ細胞の機能について評価した。図４５は、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＲＡＣ
遺伝子座、およびＣＩＩＴＡ遺伝子座において編集された、初代ヒトＴ細胞（三重編集細
胞）を調製するための、これらの実験のために従った、概略的なプロトコールを示す。図
４６は、フローサイトメトリーによる、ＣＤ３イプシロン、Ｂ２Ｍ、およびＨＬＡ－ＤＲ
のそれぞれの細胞表面発現の喪失％（ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡのそれぞれに
おける編集の指標としての）を示す。予想される通り、単一のｇＲＮＡだけで電気穿孔さ
れた細胞は、予想されるタンパク質だけの喪失を示した。各々が異なる標的に対するｇＲ
ＮＡを含有する、３つのＲＮＰで処置された細胞では、最低濃度の、ＣＩＩＴＡをターゲ
ティングするｇＲＮＡであって、高濃度の、このＲＮＰを細胞へと送達する場合より、低
いＨＬＡ－ＤＲの喪失を結果としてもたらすｇＲＮＡ（三重４）を除き、各集団に由来す
る細胞は、標的タンパク質の各々の、８０％を超える喪失のほか、Ｂ２ＭおよびＴＲＡＣ
の両方の、＞８０％の喪失も呈示した。図４７は、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、
およびＣＩＩＴＡ遺伝子座をターゲティングするｇＲＮＡを含有する、３つのＲＮＰによ
る、ヒト初代Ｔ細胞の同時的電気穿孔から生じる、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、
およびＣＩＩＴＡ遺伝子座のゲノム編集を示す。挿入または欠失の頻度（％インデル）を
指し示し、コード配列のフレームシフティングを結果としてもたらす、これらの編集の百
分率を、カッコ内に示す。図４８、図４９、および図５０は、異なる濃度の各ＲＮＰの、
３つの遺伝子座の同時的編集（三重編集）の文脈で、初代ヒトＴ細胞内の、Ｂ２Ｍ遺伝子
座（ＣＲ０００４４２を含むｇＲＮＡに応答する）、ＴＲＡＣ遺伝子座（ＣＲ０００９６
１を含むｇＲＮＡに応答する）、およびＣＩＩＴＡ遺伝子座（ＣＲ００２９９１を含むｇ
ＲＮＡに応答する）のそれぞれにおいて最も高頻度で観察される、上位１０の配列変化で
あって、図４５の概略図において示される配列変化を示す。これらのデータは、本明細書
で使用される効率的なｇＲＮＡ分子は、高い効率で、初代ヒトＴ細胞内のＴＲＡＣ、ＣＩ
ＩＴＡ、およびＢ２Ｍを、効率的にノックアウトし、移植片対宿主病能を低減した（ＴＣ
Ｒの喪失を介して）Ｔ細胞、宿主対移植片病能を低減した（Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡの両
方の喪失を介して）Ｔ細胞を結果としてもたらすが、これは、既製品の同種異系Ｔ細胞製
品への重要なステップを表すことを指し示す。
次に、ｇＲＮＡ分子のフォーマットの効果を評価した。ＴＲＡＣ（ＣＲ０００９６１の
ターゲティングドメインを含む；上パネル）またはＢ２Ｍ（ＣＲ００４４２のターゲティ
ングドメインを含む；下パネル）に対するガイドＲＮＡを、示された化学修飾を伴うかま
たはこれを伴わずに、単一ガイドフォーマットまたは二重ガイドフォーマットで合成した
（ＰＳ（５’末端および３’末端の両方における３ヌクレオチドは、ホスホロチオエート
（phosphorothioate）である）またはＯＭｅＰＳ（５’末端および３’末端の両方におけ
る３ヌクレオチドは、２’－ＯＭｅおよびホスホロチオエート（phosphorothioate）であ
る）；二重ガイドＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのいずれもが、修飾を
含んだ）。ＲＮＰを、示された濃度で、ヒト初代Ｔ細胞へと電気穿孔した。図５１は、こ
れらの実験の結果を示す。編集効率を、フローサイトメトリーによる、ＴＲＡＣの編集に
ついてのＣＤ３イプシロン（上）、およびＢ２Ｍ編集についてのＢ２Ｍタンパク質（下）
の細胞表面染色の解析により査定した。図５１に示す通り、全てのフォーマットは、１ｕ
ＭのＲＮＰ濃度で、高効率の編集を達成することが可能であったが、ｓｇＲＮＡフォーマ
ットは、ｄｇＲＮＡフォーマットより低濃度でも、高編集効率を維持することが可能であ
った（ＣＲ０００９６１のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡについては、０．０４
ｕＭの低値までであり、ＣＲ０００４４２のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡにつ
いては、０．１ｕＭの低値まで）。ＴＲＡＣをターゲティングするｇＲＮＡでは、化学修
飾は、被験ＲＮＰ濃度における編集効率に対して影響を及ぼさなかった。Ｂ２Ｍをターゲ
ティングするｇＲＮＡでは、ｓｇＲＮＡの化学修飾は、被験最低濃度における編集効率に
対して影響を及ぼし、ＰＳ修飾ｓｇＲＮＡは、０．０４ｕＭのＲＮＰ濃度で、最高の編集
効率を有した。
[実施例１３]
ＦＫＢＰ１Ａのゲノム編集後における免疫抑制に対するＴ細胞の耐性、およびＴＣＲ－／
ＦＫＢＰ１２－ ＣＡＲＴ細胞についての機能評価
理論に束縛されずに、本明細書で記載される通り、既製品（「ユニバーサル」）のＣＡ
ＲＴ細胞を作出するための別の戦略は、ＴＣＲの発現を低減するか、または消失させ（例
えば、移植片対宿主病を低減するか、または抑制し）、また、免疫抑制剤の標的（例えば
、ｍＴｏｒ阻害剤）の発現も低減するか、または消失させることであると考えられる。前
記免疫抑制剤と組み合わせた、このような、ゲノム編集されたＣＡＲＴ細胞による、その
後の患者の処置は、ＣＡＲＴ細胞の機能（例えば、ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍機能）を阻害せ
ずに、宿主免疫応答を阻害する（例えば、これにより、宿主対移植片反応を阻害する）で
あろう。この目的に向けて、それらをＴＣＲ－かつＦＫＢＰ１２－とするように編集され
たＴ細胞の機能について、ｍＴｏｒ阻害剤であるＲＡＤ００１の存在下を含めてアッセイ
した。
方法：
解凍の後で、単離ヒトＴ細胞を、ビーズ対細胞比を３：１とするＣＤ３／ＣＤ２８ビー
ズで、３日間にわたり活性化させた。次いで、１００ｕｌのチップキットを伴うＮｅｏｎ
装置を使用して、細胞を、二重ガイドＲＮＡ分子（これらの実施例の上記で記載した通り
、表示される）と、Ｃａｓ９タンパク質とを含有するＲＮＰで、電気穿孔した。ＲＮＰは
、以下の様態で調製した。ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡ（各々、１００ｕＭで１０ｕｌず
つの）を、別個の試験管内で、２分間にわたり、摂氏９５度まで加熱し、次いで、室温で
５分間にわたり冷却した。Ｃａｓ９タンパク質（１．５ｍｇ／ｍｌ）と、２０ｕＭのｔｒ
ＲＮＡと、２０ｕＭのｃｒＲＮＡおよび１７ｕｌの緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．
０、２００ｎＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）とを、合計５０ｕｌ容量に組み合わせ
、３７度で１０分間にわたりインキュベートした。次いで、ＲＮＰを、Ｔ緩衝液（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ；型番ＭＰＫ１０９６）１ｍｌ当たりの細胞２００万個の細胞カウントで
、１００ｕｌの細胞と混合した。ＲＮＰと混合された１００ｕｌの細胞を、Ｎｅｏｎピペ
ットチップへと移し、１６００Ｖ、１０ミリ秒間、３つのパルスで電気穿孔した。Ｃａｓ
９タンパク質の尺度としてのＲＮＰは、３．３ｕＭの最終濃度とした。
次いで、電気穿孔の後、細胞を、ビーズ対細胞比を３：１とするビーズを伴う、２ｍｌ
のＴ細胞培地と共に、６ウェルプレートへと移した。隔日で、新鮮な培地を添加した。電
気穿孔後４日目に、細胞からビーズを除去し、１００ｕｌの培地を伴う９６ウェルプレー
ト内、ウェル１つ当たり５０万個の密度で再播種し、ビーズ対細胞比を１：１とする新鮮
なビーズを、２時間にわたり添加した。次いで、ＦＫＢＰ１Ａ編集の機能的効果を決定す
るため、２．５ｎＭのＲＡＤ００１（示された通り）を伴うかまたは伴わずに、細胞を、
３時間にわたり処置した。フローサイトメトリーにより、Ｓ６のリン酸化を検出し、ＲＡ
Ｄ００１による免疫抑制の指標として使用した。フローサイトメトリー用の試料を調製す
るために、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆ
ｆｅｒ＋０．５％のＢＳＡ）で洗浄し、Ｄｅａｄ／ｌｉｖｅ ｓｔａｉｎ（Ｚｏｍｂｉｅ
ｖｉｏｌｅｔ ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；
型番４２３１１４）で、１０分間にわたり染色した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で
洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；型
番５５４７１４）で、一晩にわたり固定した。次いで、細胞を、ＰＢＳで２回にわたり洗
浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；型番
５５４７１４）で、２０分間にわたり透過化させた。次いで、細胞を、ＰＢＳで、２回に
わたり洗浄し、ＰＥコンジュゲート抗ホスホ－Ｓ６抗体（ホスホ－Ｓ６リボソームタンパ
ク質Ｓｅｒ２４０／２４４（Ｄ６８Ｆ８）ウサギｍＡｂ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；型番１４２３６）と共に、４度で１時間にわたりインキュ
ベートした。次いで、細胞を、ＰＢＳで、２回にわたり洗浄し、ＦｌｏＪｏ－Ｖ１０ソフ
トウェアを使用する、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ上
のフローサイトメトリーにより解析した。
図５４は、ＦＫＢＰ１ＡへとターゲティングされたｇＲＮＡへの曝露後の、ｍＴｏｒ阻
害剤であるＲＡＤ００１の存在下または非存在下における、Ｓ６リン酸化の結果を示す。
Ｔ細胞を、ＦＫＢＰ１Ａをターゲティングするガイド配列を含有するＲＮＰ（ＣＲ００２
０８６、ＣＲ００２０９７、ＣＲ００２１２２；それぞれ、２０８６、２０９７、および
２１１２として表示される）、または陰性対照：４４２（Ｂ２Ｍをターゲティングする、
非関与のガイドＣＲ００４４２）；Ｃａｓ９（ｔｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを伴わないＣ
ａｓ９単独）；ｔｒＲＮＡ（ｔｒａｃｅｒＲＮＡを伴うが、ｃｒＲＮＡも、Ｃａｓ９タン
パク質も伴わない）；Ｃａｓ９＋ｔｒＲＮＡ（Ｃａｓ９およびｔｒａｃeｒＲＮＡを伴う
が、ｃｒＲＮＡは伴わない）；ＥＰ（電気穿孔を伴う細胞だけ）；ＥＰなし（電気穿孔を
伴わない細胞だけ）で編集した。電気穿孔後、細胞を、２．５ｎＭのＲＡＤ００１で処置
する（上パネル）か、または非処置のまま放置し（下パネル）、フローサイトメトリーに
よって、Ｓ６のリン酸化（ｐＳ６）を解析することにより、ｍＴＯＲ経路の阻害に対する
影響を査定した。Ｙ軸は、前方散乱（ＦＳＣ）を指し示し、Ｘ軸は、ｐＳ６のレベルを指
し示す。アイソタイプ抗体により染色された対照において見られる蛍光レベル（図示しな
い）の上方にゲートをかけることにより、ｐＳ６（ゲーティングの出力に示される）に対
する陽性染色を決定した。フローサイトメトリーデータによる、Ｓ６リン酸化の定量化を
、下パネルのグラフに示す。これらのデータは、ＦＫＢＰ１Ａの編集（およびその後にお
ける、ＦＫＢＰ１２タンパク質の喪失）が、初代Ｔ細胞を、ラパログであるＲＡＤ００１
の阻害効果に対して不応性とすることを指し示す。
次に、ＴＣＲ陰性であり、ＦＫＢＰ１２陰性であるＣＡＲＴ細胞を作出し、それらの機
能を査定した。略述すると、ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌを使用する遠心分離法を使用する
ことにより、ヒト血液から単離した。全Ｔ細胞は、ｈｕｍａｎ Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；型番１３０－０９６－
５３５）を使用して、これらのＰＢＭＣから単離した。これらの細胞を、アリコート分割
し、凍結させた。次いで、これらの凍結させた細胞アリコートを、解凍し、ビーズ対細胞
比を３：１とする、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ；型番１１１．４１Ｄ）を使用して活性化させた。活性化後１日目、ＭＯＩを５として
、ＣＡＲ ＢＣＭＡ－１０ウイルスまたはＣＡＲ－ＣＤ１９（ＣＴＬ０１９）ウイルスを
使用して、これらの細胞に形質導入した。ＵＴＤ（非形質導入細胞）は、ウイルスで処置
しなかった。次いで、活性化後４日目、Ｎｅｏｎ電気穿孔機を使用して、ＣＡＲ ＢＣＭ
Ａ－１０またはＣＡＲ－ＣＤ１９または非形質導入Ｔ細胞を、示されたガイドＲＮＡを伴
うか、または、示された通り、ガイドＲＮＡを伴わない（ガイドなし）ＲＮＰで電気穿孔
した。ＲＮＰは、上記で記載した通りに調製した。ＴＲＡＣを編集するために、ＣＲ００
０９６１（９６１として表示される）を、単独で、または示された、ＦＫＢＰ１Ａをター
ゲティングするガイドと共に使用した。ＦＫＢＰ１Ａを編集するために、ＣＲ０００２０
９７（２０９７として表示される）を使用するか、またはＣＲ００２０９７と、ＣＲ００
２０８６とを併せて（２０９７＋２０８６として表示される）使用した。次いで、ＲＮＰ
（または複数のＲＮＰ）を、細胞カウントを、Ｔ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番Ｍ
ＰＫ１０９６）１ｍｌ当たりの細胞２００万個とする細胞１００ｕｌと混合した。ＲＮＰ
と混合された１００ｕｌの細胞を、Ｎｅｏｎピペットチップへと移し、１６００Ｖ、１０
ミリ秒間、３つのパルスで電気穿孔した。Ｃａｓ９タンパク質の尺度としてのＲＮＰは、
３．３ｕＭの最終濃度とした。次いで、電気穿孔の後、細胞を、ビーズ対細胞比を３：１
とするビーズを伴う、２ｍｌのＴ細胞培地と共に、６ウェルプレートへと移した。隔日で
、新鮮な培地を添加した。電気穿孔の５日後、細胞５００，０００個（ホスホ－Ｓ６染色
のための）または細胞表面マーカー染色（例えば、ＣＤ３）のための細胞５０，０００個
を、培養物から取り出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用するフローサイトメトリー（
ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ）により解析した。ＴＣＲの発現は、抗ＣＤ３－ＰｅｒｃｐＣｙ
５．５（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；４５－００３７－４２）を使用することにより検出
した。ＣＡＲの細胞表面発現は、ビオチニル化プロテインＬに続く、ストレプトアビジン
－ＰＥ（０１６－１１０－０８４；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
による染色によって査定した。Ｔ細胞は、抗ＣＤ４－Ｖ４５０（４８－００４７－４２；
Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＣＤ４の染色または抗ＣＤ８－ＡＰＣ（１７－０
０８７－４２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＣＤ８の染色により検出した。
ＦＫＢＰ１Ａ編集の機能効果を決定するために、電気穿孔後４日目に、細胞からビーズ
を除去し、１００ｕｌのＴ細胞培地を伴う９６ウェルプレート内、ウェル１つ当たり５０
万個の密度で再播種し、ビーズ対細胞比を１：１とする新鮮なビーズを、２時間にわたり
添加した。次いで、２．５ｎＭのＲＡＤ００１（示された通り）を伴うかまたは伴わずに
、細胞を、３時間にわたり処置した。フローサイトメトリーにより、Ｓ６のリン酸化を検
出した。フローサイトメトリー用の試料を調製するために、細胞をスピンダウンし、ＦＡ
ＣＳ緩衝液（ＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋０．５％のＢＳＡ）で洗浄し、
Ｄｅａｄ／ｌｉｖｅ ｓｔａｉｎ（Ｚｏｍｂｉｅ ｖｉｏｌｅｔ ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉ
ａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；型番４２３１１４）で、１０分間にわた
り染色した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅ
ｒｍ液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；型番５５４７１４）で、一晩にわたり固定
した。次いで、細胞を、ＰＢＳで２回にわたり洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒ
ｍ液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；型番５５４７１４）で、２０分間にわたり透
過化させた。次いで、細胞を、ＰＢＳで、２回にわたり洗浄し、ＰＥコンジュゲート抗ホ
スホ－Ｓ６抗体（ホスホ－Ｓ６リボソームタンパク質Ｓｅｒ２４０／２４４（Ｄ６８Ｆ８
）ウサギｍＡｂ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；型番１４
２３６）と共に、４度で１時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、ＰＢＳで
、２回にわたり洗浄し、ＦｌｏＪｏ－Ｖ１０ソフトウェアを使用する、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ上のフローサイトメトリーにより解析した
。
編集されたＣＡＲＴ細胞からのサイトカイン放出について調べるために、エフェクター
細胞（編集／非編集ＣＡＲＴ細胞または非形質導入細胞）を、アッセイ日に、培地（ＲＰ
ＭＩ、５％のＦＣＳ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１×のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×のグルタ
ミン）中で解凍し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｅｌｃｏｍ）上でカウントした。次い
で、これらの細胞を、ＢＣＭＡ（ＫＭＳ１１、ＲＰＭＩ８２２６）を発現する標的細胞３
０，０００個、またはＣＤ１９（Ｎａｌｍ６）を発現する細胞と共に、エフェクター：標
的比を１：１として共培養した。２０時間後に、１００ｕｌの共培養物上清を採取した。
次いで、製造元のプロトコールに従い、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｐ
ｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １；型番Ｎ０５０４９Ａ－１システムを使
用して、放出されたサイトカインである、ＩＬ－２およびＩＦＮ－ガンマを測定するのに
、これらの上清を使用した。
エフェクター細胞（編集／非編集ＣＡＲＴ細胞または非形質導入細胞）の細胞溶解能を
測定するために、細胞を、アッセイ日に、培地（ＲＰＭＩ、５％のＦＣＳ、１０ｍＭのＨ
ｅｐｅｓ、１×のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×のグルタミン）中で解凍し、Ｃｅｌｌｏｍｅ
ｔｅｒ（Ｎｅｘｅｌｃｏｍ）上でカウントした。次いで、これらの細胞を、透明底の黒色
９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ；型番３９０４）内で、ルシフェラーゼレポ
ーター遺伝子を安定的に発現し、ＢＣＭＡ（ＫＭＳ１１、ＲＰＭＩ８２２６）を発現する
標的細胞３０，０００個、またはＣＤ１９（Ｎａｌｍ６）を発現する細胞と共に、エフェ
クター：標的比を１：１として２０時間共培養した。ルシフェラーゼシグナルは、Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のＥｎＶｉｓｉｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅ
ｒ装置上で、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照番号Ｅ２６３Ｂ）を使用
して測定した。細胞の殺滅は、ルシフェラーゼシグナルの減殺から推定し、以下：
標的細胞の殺滅（％）＝１００－（試料発光／平均最大発光）＊１００
の通りに計算した。
Ｔ細胞増殖アッセイのために、上記で調製した細胞を解凍し、ＢＣＭＡ（ＫＭＳ１１、
ＲＰＭＩ８２２６）を発現する標的細胞、またはＣＤ１９（Ｎａｌｍ６）を発現する細胞
と共に共培養した。照射された標的腫瘍細胞を、編集ＣＡＲＴ細胞または非編集ＣＡＲＴ
細胞と共に、エフェクター対標的比を１：１として、４日間にわたり共培養し、上記の通
りの、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＡＲについての試料染色、ならびにＢｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａによるフローサイトメトリー解析が続き、Ｆ
ｌｏＪｏ－Ｖ１０ソフトウェアで解析した。Ｔ細胞（抗ＣＤ４－Ｖ４５０および抗ＣＤ８
－ＡＰＣにより染色された）の数は、３０００個のカウンティングビーズ（Ｌｉｆｅ ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；型番Ｃ３６９５０）と比べた、ＣＤ４＋細胞に加えたＣＤ８＋細胞
の数により決定した。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の数は、ＣＡＲ＋細胞集団（ビオチニル化プロテ
インＬに続いて、ストレプトアビジン－ＰＥで染色された）にゲートをかけることにより
決定した。
結果：
抗原への曝露に応答した、ＣＡＲＴ細胞によるサイトカインの産生を決定した。遺伝子
編集は、ＣＲ０００９６１ガイドを使用して、ＴＲＡＣ遺伝子座をターゲティングし、か
つ／またはＣＲ００２０９７およびＣＲ００２０８６のガイド（それぞれ、ｃｒ９６１、
２０９７、および２０８６として表示される）を使用して、ＦＫＢＰ１Ａ遺伝子座をター
ゲティングするＣＡＲＴ細胞に対して実施した。図５５Ａおよび５５Ｂは、それぞれ、編
集／非編集ＣＡＲＴ細胞からの、インターフェロンガンマの放出およびＩＬ－２の放出を
示す。これらのデータは、遺伝子編集を介する、ＦＫＢＰ１２および／またはＴＣＲの喪
失が、活性化ＣＡＲＴ細胞内のサイトカイン産生を損なわないことを指し示す。図５６は
、編集ＣＡＲＴ細胞および非編集ＣＡＲＴ細胞による、抗原陽性がん細胞系の殺滅を示す
。これらのデータは、遺伝子編集を介するＦＫＢＰ１２および／またはＴＣＲの喪失が、
ＣＡＲＴ細胞の標的細胞殺滅能を損なわないことを指し示す。図５７は、抗原への曝露に
応答した、編集ＣＡＲＴ細胞および非編集ＣＡＲＴ細胞の増殖を示す。これらのデータは
、遺伝子編集を介するＦＫＢＰ１２の喪失が、ガイドなしで処置された細胞と比べて、Ｃ
ＡＲＴ細胞の増殖能を損なわないことを指し示す。最後に、編集ＣＡＲＴ細胞を、ラパロ
グであるＲＡＤ００１による免疫抑制に抵抗するそれらの能力について探索した。結果を
、図５８に示す。これらのデータは、ＦＫＢＰ１Ａの編集（およびその後における、ＦＫ
ＢＰ１２タンパク質の喪失）が、ＣＡＲＴ細胞を、ラパログであるＲＡＤ００１の阻害効
果に対して不応性とすることを指し示す。
[実施例１４]
ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合タンパク質の発現
理論に束縛されずに、ＴＣＲ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＩＩＴＡ－とされた細胞は、ＮＫ細胞に
より、外来細胞として認識され、破壊のためにターゲティングされうると考えられる。し
たがって、他の点では非修飾のＴＣＲ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＩＩＴＡ－同種異系ＣＡＲＴ細胞
は、例えば、がん患者へと投与されると、攻撃される危険性がある。ここでもまた、理論
に束縛されずに、前記細胞上のＨＬＡ－Ｇの発現は、この細胞に対する任意のＮＫ細胞活
性を抑制すると考えられる。ＨＬＡ－Ｇの一部の形態は、Ｂ２Ｍを要求するため、Ｂ２Ｍ
の発現を低減したか、または消失させた細胞について、本発明者らは、ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２
Ｍ融合分子の発現を探索した。
ＨＬＡ－Ｇ／Ｂ２Ｍ融合タンパク質は、以下の通り合成した。β２ミクログロブリンお
よびＨＬＡ－Ｇのアミノ酸配列は、データベースから得た。ＨＬＡ－ＧのＨＬＡ－Ｇ１ア
イソフォームは、細胞表面において、Ｂ２Ｍとの複合体を形成することが公知である。こ
の複合体を、例えば、Ｂ２Ｍ－細胞内で再構成するために、β２ミクログロブリンＮ末端
融合ポリペプチドを、ＨＬＡ－Ｇ１へと連結した。さらに、Ｂ２Ｍを、グリシン／セリン
（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（配列番号６６２９）を介して、ＨＬＡ－Ｇ１へと連結する。アミ
ノ酸配列を、以下：Ｂ２Ｍ配列－（Ｇ４Ｓ）３－ＨＬＡ－Ｇ１（「（Ｇ４Ｓ）３」は、配
列番号６５９４として開示されている）の順序でデザインして、融合タンパク質を創出し
た。融合タンパク質のヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞の発現のための、ＧｅｎｅＡｒ
ｔ（登録商標）ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）工程（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈ
ｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）によりコドンを最適化した。最適化されたＤＮＡ
は、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔにより合成した。合成されたＤＮＡは、ＰＣＲ（ＮＥＢ，Ｑ５
（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ；型番Ｍ０４９３Ｌ）により増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ
、型番Ｅ２６１１Ｌ）により、ｐＥＬＰＳベクターへとサブクローニングした。サブクロ
ーン配列は、Ｇｅｎｅｗｉｚシーケンシングにより、さらに検証した。
ＨＬＡ－Ｇ－Ｂ２ＭウイルスまたはＨＬＡ－Ｇウイルスは、ＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ細
胞を使用して作出した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）を使用して、細胞に、ＨＬＡ－Ｇ－Ｂ２ＭレンチウイルスＤＮＡプラスミドまたはＨＬ
Ａ－ＧレンチウイルスＤＮＡプラスミドを、パッケージングプラスミドＤＮＡ（ｐＲＳＶ
．ＲＥＶ（Ｒｅｖ発現プラスミド）、ｐＭＤＬｇ／ｐ．ＲＲＥ（Ｇａｇ／Ｐｏｌ発現プラ
スミド）、ｐＶＳＶ－Ｇ（ＶＳＶ糖タンパク質発現プラスミド））と共にトランスフェク
トした。トランスフェクションの１２時間後に、培地を交換した。新鮮な培地を、細胞へ
と添加し、培地を交換した３０時間後に、上清を採取した。ＬｅｎｔｉＸ濃縮器を使用し
て、ウイルスを濃縮し、凍結させるようにアリコート分割した。ｓｕｐＴ１細胞を使用し
て、ウイルスを滴定した。ウイルスを含有する上清の系列希釈液を、ＳｕｐＴ１細胞２０
，０００個と共に、３日間にわたりインキュベートした。形質導入の２４時間後、新鮮な
培地を添加した。細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、抗ＨＬＡ－Ｇ－ＰＥ抗体（３
３５９０６；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共にインキュベートし、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａお
よびＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、細胞を解析した。
図５９は、上記で記載したＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合体をコードする核酸による、Ｓｕｐ
Ｔ１細胞の形質導入の結果を示す。レンチウイルスの形質導入により、ＨＬＡ－Ｇ／Ｂ２
Ｍ融合タンパク質を、ＳｕｐＴ１細胞へと導入した。フローサイトメトリーにより、ＨＬ
Ａ－Ｇの細胞表面発現を検出した。ライトグレーのヒストグラムは、ＰＥチャネルの、非
形質導入細胞内のバックグラウンド蛍光を指し示す。ダークグレーのヒストグラムは、Ｐ
Ｅチャネル内の、ＨＬＡ－Ｇ／Ｂ２Ｍを形質導入された細胞に由来する蛍光を指し示す。
これは、Ｔ細胞内の、ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合体タンパク質の、発現および表面への局在
化の成功を指し示す。
[実施例１５]
ＨＥＫ－２９３（Ｃａｓ９）細胞内の、ＣＤ３－イプシロン（ＣＤ３Ｅ）の編集
示されたターゲティングドメインを含むｄｇＲＮＡ分子を化学合成し、実施例１で記載
した通り、ＮＧＳにより、ＨＥＫ－２９３細胞内の編集を評価した。編集実験の結果を、
表２８に示す。本実施例は、ＣＤ３ＥをターゲティングするｇＲＮＡ分子が、３％～７５
％を超える範囲の頻度で、ＲＮＰとして送達される場合、標的遺伝子座を編集することが
可能であることを示す。いくつかのｇＲＮＡ分子は、細胞のうちの５０％を超えるものの
編集であって、細胞のうちの５０％を超えるものにおいて、フレームシフト突然変異をも
たらすことを含む編集が可能であった。
Figure 2022137032000565
Figure 2022137032000566
Figure 2022137032000567
[実施例１６]
Ｃａｓ９変異体の査定
ＣＤ３４＋造血幹細胞内の査定
本発明者らは、初代ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）内で、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ
２Ｍ）遺伝子をノックアウトするそれらの効率を測定することにより、１４の精製化膿連
鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳＰｙＣａｓ９）タンパク質について査定
した。これらのタンパク質を、３つの群へと分けた。第１の群は、選択性が改善されたＳ
ＰｙＣａｓ９変異体からなった（Slaymaker et al. 2015, Science 351: 84（ｅ１．０、
ｅ１．１、およびＫ８５５Ａ）；Kleinstiver et al. 2016, Nature 529: 490（ＨＦ））
。第２の群は、異なる数および／または位置のＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）と、
切断型ＴＥＶ部位を伴うかまたは伴わない、６×ヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ（配列番号
１０７９５）または８×ヒスチジン（Ｈｉｓ８）タグ（配列番号１０７９６）とを伴う野
生型ＳＰｙＣａｓ９、ならびに構造研究（Nishimasu et al. 2014, Cell 156:935）で、
Ｃａｓ９を安定化させることが報告されている、２つのシステイン置換（Ｃ８０Ｌ、Ｃ５
７４Ｅ）を伴うＳＰｙＣａｓ９タンパク質からなった。第３の群は、異なる工程により産
生された、同じ組換えＳＰｙＣａｓ９（図６０）からなった。Ｂ２Ｍノックアウトは、Ｆ
ＡＣＳおよび次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により決定した。
方法
材料
１．Ｎｅｏｎ電気穿孔装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＰＫ５０００）
２．Ｎｅｏｎ電気穿孔キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＰＫ１０２５）
３．ｃｒＲＮＡ（配列番号６６０７へと融合させた、ＣＲ００４４１のターゲティング
ドメイン（配列番号５４９５））
４．ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号６６６０）
５．Ｃａｓ９保存緩衝液：２０ｍＭのトリス－Ｃｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭのＫＣｌ
、１０ｍＭのＭｇＣｌ２
６．骨髄由来ＣＤ３４＋ ＨＳＣ（Ｌｏｎｚａ；２Ｍ－１０１Ｃ）
７．細胞培養培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳｔｅｍＳｐａｍ
ＳＦＥＭ ＩＩおよびＳｔｅｍＳｐａｍ ＣＣ－１００）
８．ＦＡＣＳ洗浄緩衝液：ＰＢＳに２％のＦＣＳ
９．ＦＡＣＳブロック緩衝液：ＰＢＳ １ｍＬ当たり０．５ｕｇのマウスＩｇＧ、１５
０ｕｇのＦｃブロック、２０ｕＬのＦＣＳを添加する
１０．Ｃｈｅｌｅｘ懸濁液：Ｈ２Ｏ中に１０％のＣｈｅｌｅｘ １００（ＢｉｏＲａｄ
、型番１４２－１２５３）
１１．抗Ｂ２Ｍ抗体：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、型番３１６３０４
工程
Ｌｏｎｚａの推奨に従い、細胞を解凍し、成長させ、２～３日ごとに培地を添加する。
５日目に、細胞を、２００×ｇで、１５分間にわたりペレット化させ、ＰＢＳで１回洗浄
し、細胞を、ＮＥＯＮキットによるＴ緩衝液により、１ｕＬ当たり２×１０４個で再懸濁
させ、氷上に置く。Ｃａｓ９タンパク質を、Ｃａｓ９保存緩衝液で、５ｍｇ／ｍｌまで希
釈する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、Ｈ２Ｏで、１００ｕＭへと再構成する。
ＣＡＳ９タンパク質、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの各々０．８ｕＬずつを、０．
６ｕＬのＣａｓ９保存緩衝液と混合することにより、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）
複合体を作製し、室温で１０分間にわたりインキュベートする。７ｕＬのＨＳＣを、ＲＮ
Ｐ複合体と、２分間にわたり混合し、１０ｕＬの全体を、Ｎｅｏｎピペットチップへと移
し、１７００Ｖ、２０ミリ秒、および１パルスで電気穿孔する。電気穿孔の後、細胞を、
５％のＣＯ２、３７℃であらかじめ較正した１ｍｌの培地を含有する２４ウェルプレート
のウェルへと速やかに移す。電気穿孔の７２時間後、ＦＡＣＳ解析およびＮＧＳ解析のた
めに、細胞を採取する。
ＦＡＣＳ：２５０ｕＬの細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルから、９６ウェルＵ字
底プレートのウェルへと取り込み、細胞をペレット化する。２％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清
）－ＰＢＳで１回洗浄する。５０ｕＬのＦＡＣＳブロック緩衝液を、細胞へと添加し、氷
上で１０分間にわたりインキュベートし、１ｕＬのＦＩＴＣ標識Ｂ２Ｍ抗体を添加し、３
０分間にわたりインキュベートする。１５０ｕＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液で１回洗浄するの
に続き、２００ｕＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液で、さらに１回洗浄する。細胞を、ＦＡＣＳ解
析のために、２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。
ＮＧＳ試料の調製：２５０ｕＬの細胞懸濁液を、２４ウェルプレートの各ウェルから、
１．５ｍｌのエッペンドルフ管へと移し、１ｍＬのＰＢＳを添加し、細胞をペレット化さ
せる。１００ｕＬのＣｈｅｌｅｘ懸濁液を添加し、９９℃で８分間にわたりインキュベー
トし、１０秒間にわたりボルテックスするのに続き、９９℃で８分間にわたりインキュベ
ートし、１０秒間にわたりボルテックスする。１０，０００×ｇで３分間にわたり遠心分
離することにより、樹脂の下方にペレット化させ、上清溶解物を、ＰＣＲのために使用す
る。４ｕＬの溶解物を採取し、Titanium kit（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ；型番６３９２０８
）を使用して、ｂ２ｍプライマー（ｂ２ｍｇ６７Ｆ：ＣＡＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＣ
ＣＣＡＧＴ（配列番号１０８０７）、ｂ２ｍｇ６７Ｒ：ＣＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＣＧＡＣ
ＧＣＣＣＴ（配列番号１０８０８）によるＰＣＲ反応を行い、製造元の指示書に従う。以
下のＰＣＲ条件：９８℃で５分間の１サイクル；９５℃で１５秒間、６２℃で１５秒間、
および７２℃で１分間の３０サイクル；ならびに、最後に、７２℃で３分間の１サイクル
を使用する。ＰＣＲ産物を、ＮＧＳのために使用した。
統計学的解析：ＦＡＣＳによるＢ２Ｍ ＫＯ細胞の百分率、およびＮＧＳによるインデ
ルの百分率を使用して、ＣＡＳ９切断効率について査定する。Ｃａｓ９を固定効果として
、実験をデザインした。各実験を、ネスト化ランダム効果として、ドナー内でネスト化さ
せる。こうして、ＦＡＣＳデータおよびＮＧＳデータを解析するために、混合線形モデル
を適用した。
結果
実験およびドナー変動を標準化するために、本発明者らは、野生型ＳＰｙＣａｓ９を挟
む、２つのＳＶ４０ ＮＬＳと、タンパク質のＣ末端におけるＨｉｓ６タグ（配列番号１
０７９５）とを伴う、元のデザインであるｉＰｒｏｔ１０５０２６に対して、各タンパク
質の相対活性をグラフ化した（図６０）。統計学的解析は、基準Ｃａｓ９タンパク質と比
較して、ｉＰｒｏｔ１０５０２６、ｉＰｒｏｔ１０６３３１、ｉＰｒｏｔ１０６５１８、
ｉＰｒｏｔ１０６５２０、およびｉＰｒｏｔ１０６５２１が、ＨＳＣ内のＢ２Ｍのノック
アウトにおいて、それほど異ならないのに対し、他の被験変異体（ＰＩＤ４２６３０３、
ｉＰｒｏｔ１０６５１９、ｉＰｒｏｔ１０６５２２、ｉＰｒｏｔ１０６５４５、ｉＰｒｏ
ｔ１０６６５８、ｉＰｒｏｔ１０６７４５、ｉＰｒｏｔ１０６７４６、ｉＰｒｏｔ１０６
７４７、ｉＰｒｏｔ１０６８８４）は、ＨＳＣ内のＢ２Ｍのノックアウトにおいて、基準
ｉＰｒｏｔ１０５０２６と、非常に著明に異なることを示す。本発明者らは、Ｈｉｓ６タ
グ（配列番号１０７９５）の、Ｃ末端から、Ｎ末端への移動（ｉＰｒｏｔ１０６５２０）
が、タンパク質の活性に影響を及ぼさないことを見出した（図６０）。１つのＮＬＳは、
タンパク質のＣ末端に置かれた場合に限り、活性を維持するのに十分であった（ｉＰｒｏ
ｔ１０６５２１対ｉＰｒｏｔ１０６５２２；図６０）。工程１により精製されたタンパク
質は、工程２および３によるタンパク質より、一貫して高いノックアウト効率を有した（
ｉＰｒｏｔ１０６３３１対ｉＰｒｏｔ１０６５４５およびＰＩＤ４２６３０３；図６０）
。一般に、選択性の改善が報告されたＳＰｙＣａｓ９変異体は、野生型ＳＰｙＣａｓ９ほ
ど活性ではなかった（ｉＰｒｏｔ１０６７４５、ｉＰｒｏｔ１０６７４６、およびｉＰｒ
ｏｔ１０６７４７；図６０）。興味深いことに、ｉＰｒｏｔ１０６８８４は、ターゲティ
ング部位を切断しなかった。これは、この変異体が、哺乳動物細胞内の正規のターゲティ
ング部位のうちの最大で２０％を切断できなかったという、Kleinstiver et alによる報
告と符合する（Kleinstiver et al. 2016, Nature 529: 490）。最後に、２つのシステイ
ン置換を伴うＣａｓ９変異体（ｉＰｒｏｔ１０６５１８）は、高レベルの酵素活性を維持
した（図６０）。
Ｔ細胞内の査定
方法
これらの実験では、表２９に示される、異なる化膿連鎖球菌（S. Pyogenes）Ｃａｓ９
変異体を使用した。また、構造も、図６０に示す。
Figure 2022137032000568
ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌを使用する遠心分離法を使用することにより、ヒト血液（Ｈ
ｅｍａｃａｒｅ／ＡＬＬ Ｃｅｌｌｓから得られる）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ 型
番１７－１４４０－０３）から単離した。全Ｔ細胞は、ｈｕｍａｎ Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌ
ｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 型番１３０－０９
６－５３５）を使用して、これらのＰＢＭＣから単離した。これらの細胞をアリコート分
割し、ＣＲＹＯＳＴＯＲ ＣＳ１０培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ－２１０１
０２）を使用して凍結させ、液体窒素中に保管した。次いで、これらの凍結させた細胞ア
リコートを、摂氏３７度の水浴中で、２０秒間にわたり解凍し、次いで、１０ｍｌの、あ
らかじめ温められたＴ細胞培地中の５０ｍｌのコニカルチューブへと移し、摂氏２４度、
３００ｒｐｍで、５～１０分間にわたり遠心分離して、凍結培地を除去し、あらかじめ温
めたＴ細胞培地と共に再懸濁させた。次いで、これらを、ビーズ対細胞比を３：１とする
、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 型番１１１．
４１Ｄ）を使用し、１ｍｌ当たり５０万個の細胞濃度を保つことにより活性化させた。
ビーズによる活性化後３日目に、細胞２００，０００個を、電気穿孔のために使用する
。Ｔ細胞のゲノム編集のために使用されるＲＮＰ複合体は、Ｃａｓ９タンパク質対ＲＮＡ
（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃＲＮＡ）の１：２のモル比を使用して形成した。１００μＭ
のｃｒＲＮＡ（［ターゲティングドメイン］－［配列番号６６０７］）、および１００μ
ＭのｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号６６６０）を、個別に、９５℃で２分間にわたり変性さ
せ、室温へと冷却した。５μＬの最終容量中、濃度を５．９μｇ／μＬとするＣａｓ９タ
ンパク質１．４μＬを、１．６μＬの反応緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０；２０
０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）と混合し、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ １
μＬと、室温で混合した。次に、１００μＭのｃｒＲＮＡ １μＬを、添加し、混合し、
３７℃で、１０分間にわたりインキュベートした。Ｂ２Ｍに対するターゲティングドメイ
ンは、ＣＲ０００４４２であり、ＴＲＡＣに対するターゲティングドメインは、ＣＲ００
０９６１であった。これらの高濃度のＲＮＰを使用して、ＲＮＰ系列希釈液の試料を作出
した。次いで、これらのＲＮＰ希釈液を使用して、１０ｕｌのＴ緩衝液（Ｎｅｏｎ Ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １０ｕｌ Ｋｉｔ）中の細胞２００，０００個と
共に混合した。電気穿孔は、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔ
ｅｍ １０μＬ Ｋｉｔ（ＭＰＫ１０９６）を、１６００Ｖ、１０ミリ秒間、３つのパル
スで使用する、Ｎｅｏｎ電気穿孔機により実施した。細胞は、抗生剤を伴わないＴ細胞培
地中で培養した。細胞を各試料から採取し、それらを、ビーズから解離させるようにピペ
ッティングし、９６ウェルプレート用磁石を使用することにより、ビーズを除去し、０．
５％のＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ－型番１３０－０９１－３７６）を伴う、１００ｕｌの
ＦＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ緩衝液；型番１３０－０９２－９８７）と
共に遠心分離して、細胞を洗浄した。次いで、細胞を、氷上、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝
液中で希釈された、異なる抗体と共に、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、
細胞を、２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液で、２回にわたり洗浄した。次いで、細胞を、１５
０ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ ５ ｌｅｓｅｒ Ｆｏｒｔｅｓｓａにか
けた。ＴＣＲの発現は、抗ＣＤ３－ＰｅｒｃｐＣｙ５．５（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；
４５－００３７－４２）を使用することにより検出し、Ｂ２Ｍの発現は、抗Ｂ２Ｍ－ＡＰ
Ｃ（３１６３１２ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用することにより検出した。フローサイト
メトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。
結果
低濃度のＲＮＰの作出と、最高の編集効率とは、ＲＮＰを、高濃度で作出し、次いで、
所望の濃度へと希釈する場合に、良好になされた。６つの異なるＣａｓ９タンパク質を、
初代Ｔ細胞内のＢ２ＭガイドであるＣＲ００４４２を使用する編集効率について調べた。
編集効率は、フローサイトメトリーによる、Ｂ２Ｍタンパク質の、細胞表面における検出
を使用して測定し、結果を、ＲＮＰによる電気穿孔の３日後において、ＲＮＰを示された
濃度（Ｘ軸）とするときの、図６１（Ｙ軸；Ｂ２Ｍの編集％）に示す。異なる被験Ｃａｓ
９タンパク質を、それらの「ｉｐｒｏｔ」ＩＤにより表示する（図６０および表を参照さ
れたい）。結果を、図６１に示す。これらのデータは、これらのＣａｓ９変異体の全ては
、活性であるが、Ｃａｓ９タンパク質１０６５２１、１０６５１８、および１０６１５４
（また、１０５０２６とも称する）は、ＲＮＰを低濃度とするときの、それらの高活性に
より証拠立てられる通り、Ｔ細胞内でも高活性を示すことを指し示す。次に、Ｘ軸上に表
示される、ＲＮＰの異なる濃度を使用することにより、Ｂ２Ｍターゲティングガイドであ
るＣＲ００４４２（図６２、左パネル）またはＴＲＡＣターゲティングガイドであるＣＲ
０００９６１（図６２、右パネル）を使用して、示された２つの異なるＣａｓ９タンパク
質である、１０６８８４または１０６１５４（また、１０５０２６とも称する）を、編集
効率について調べた。編集効率（編集％）は、フローサイトメトリーにより、Ｂ２Ｍ（図
６２、左パネル）、またはＣＤ３イプシロン抗体を使用するＴＣＲ（図６２、右パネル）
の、細胞表面発現の喪失を測定することにより測定した。
[実施例１７]
オフターゲットの査定
Ｔ細胞の培養およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、標準的なＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法を使用して
、ヒト血液（ＨｅｍａＣａｒｅ、型番ＰＢ０００）から単離した。全Ｔ細胞は、製造元の
推奨に従い、ヒト細胞のためのＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍ
ｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、型番１３０－０９６－５３５）を使用して、ＰＢＭＣか
ら単離し、－８０℃で保管した。Ｔ細胞を解凍し、製造元の推奨に従い、ビーズ対細胞数
比を３：１とし、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／
ＣＤ２８ ｆｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、型番１１１３１Ｄ）を使用して
活性化させた。Ｔ細胞は、３７℃、５％のＣＯ２、抗生剤非含有完全Ｔ細胞培地（Ｌ－グ
ルタミンを伴うＲＰＭＩ １６４０、Ｌｏｎｚａ、型番１２－７０２Ｆ；１０％のＦＢＳ
、ＧＥ ＨｙＣｌｏｎｅ、型番ＳＨ３００７１；２００ｍＭのＬ－グルタミン、ＧＥ Ｈ
ｙＣｌｏｎｅ、型番ＳＨ３００３４．０１；１０ｍＭの非必須アミノ酸、ＧＥ ＨｙＣｌ
ｏｎｅ、型番１３－１１４Ｅ；１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、型番１１３６０－０７０；１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ＧＥ ＨｙＣｌｏｎｅ、型番１
７－７３７Ｅ；および５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、型
番２１９８５－０２３）中で、ゲノム編集の前に、３日間にわたり培養した。
Ｔ細胞のゲノム編集のために使用されるＲＮＰ複合体は、Ｃａｓ９タンパク質対ｇＲＮ
Ａ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃＲＮＡ）の１：２のモル比を使用して形成した。濃度を１
００μＭとする、化学合成されたｃｒＲＮＡ（［ターゲティングドメイン］－［配列番号
６６０７］）、および濃度を１００μＭとするｔｒａｃｒ（配列番号６６６０）を、個別
に、９５℃で２分間にわたり変性させ、室温へと冷却した。最終容量を５μＬとする緩衝
液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０；２００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）中、
Ｃａｓ９タンパク質（ＮＬＳ－Ｃａｓ９－ＮＬＳ－Ｈｉｓ６（配列番号１０７９５として
開示される「Ｈｉｓ６」）；ｉＰＲＯＴ１０５０２６；ＮＬＳ＝ＳＶ４０ ＮＬＳ；Ｃａ
ｓ９＝ｗｔ Ｓ．ＰｙＣａｓ９）を、まず、ｔｒａｃｒＲＮＡと、室温で混合し、次いで
、ｃｒＲＮＡと混合し、３７℃で５分間にわたりインキュベートした。使用されるＣａｓ
９タンパク質、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡの最終濃度は、それぞれ、１０μＭ
、２０μＭ、および２０μＭであった。ビーズで活性化させたＴ細胞を、遠心分離により
回収し、１ｍＬ当たりの細胞密度を２０×１０６個として、Ｎｅｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｏｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番ＭＰＫ１０９
６）中に再懸濁させた。５μＬのＲＮＰを、静かなピペッティングにより、１０μＬのＴ
細胞と混合し、室温で５分間にわたりインキュベートした。ＲＮＰ－Ｔ細胞混合物を、１
０μＬのＮｅｏｎ電気穿孔チッププローブへと移した。電気穿孔は、以下の条件：１０ミ
リ秒間当たり１６００ボルトで、３つのパルスを使用する、Ｎｅｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｃ
ｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＭＰＫ５０００Ｓ）を使用して実施し
た。１０μＬの電気穿孔反応を、二連で実施した。次いで、電気穿孔されたＴ細胞を、９
６ウェルプレート内、２００μＬの、あらかじめ温めた抗生剤非含有完全Ｔ細胞培地へと
速やかに移し、３７℃、５％のＣＯ２で、２日間にわたりインキュベートした。次いで、
抗生剤非含有完全Ｔ細胞培地を使用して、Ｔ細胞を、１：１の容量で希釈し、２４ウェル
プレートへと移し、３７℃、５％のＣＯ２で、さらに４～７日間にわたり培養した。これ
と並行して、ＲＮＰ処置を伴わない活性化Ｔ細胞も、同様に培養して、非処置対照試料と
して用いた。次いで、Ｔ細胞を、遠心分離により回収し、製造元の推奨に従い、ＤＮｅａ
ｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、型番６９５０６）を使用
して、ゲノムＤＮＡを、細胞１～２００万個から単離した。ゲノム編集は、ＣＲ００４４
２、ＣＲ００４４４、ＣＲ０００９６１、およびＣＲ０００９８４のターゲティングドメ
イン配列を含むｇＲＮＡについて実施し、ｇＲＮＡ１つ当たり、２つの処置レプリケート
と、１つの非処置レプリケートとを作出した。
潜在的なｇＲＮＡオフターゲット遺伝子座の、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ同定
最大で５ヌクレオチドのミスマッチを許容する、標準的なパラメータを使用する、ＢＦ
ＡＳＴ配列アライナー（ｖｅｒｓｉｏｎ ０．６．４ｆ；Homer et al, PLoS One, 2009,
4(11), e7767, PMID: 19907642）を使用して、ｇＲＮＡである、ＣＲ００４４２、ＣＲ
００４４４、ＣＲ０００９６１、およびＣＲ０００９８４について、２０ヌクレオチドの
ｇＲＮＡプロトスペーサー配列を、ヒトゲノム基準配列（ビルドＧＲＣｈ３８）に対して
アライメントすることにより、潜在的なオフターゲット遺伝子座を同定した。同定された
遺伝子座には、カノニカルのＣａｓ９ ５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭ配列の５’側に隣接す
る部位（すなわち、５’－オフターゲット遺伝子座－ＰＡＭ－３’）だけを含有するよう
にフィルターをかけた。ＢＥＤＴｏｏｌｓ ｓｃｒｉｐｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１１.
２、Quinlan and Hall, Bioinformatics, 2010 26(6):841-2, PMID: 20110278）を使用し
て、５ヌクレオチドのミスマッチを伴う部位に、エクソンとして注釈された遺伝子座だけ
を含有するように、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子アノテーションに対して、さらにフィルターをか
けた（Pruitt et al, Nucleic Acids Res., 2014 42(Database issue):D756-63, PMID: 2
4259432）。各ｇＲＮＡについて同定された、潜在的なオフターゲット遺伝子座のカウン
トを、表３０に示す。
Figure 2022137032000569
潜在的なオフターゲット部位のターゲティングされた増幅のための、ＰＣＲプライマーの
デザイン
ｇＲＮＡプロトスペーサー配列を、単位複製配列の中央部に配置する、約１６０～３０
０ｂｐの範囲の長さの、単位複製配列のサイズを目標とする、デフォルトパラメータを使
用する、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．３.６；Untergasser et al, Nucleic Ac
ids Res., 2012 40(15):e115, PMID: 22730293）を使用して、ｇＲＮＡである、ＣＲ００
４４２、ＣＲ００４４４、ＣＲ０００９６１、およびＣＲ０００９８について同定された
、潜在的なオフターゲット遺伝子座（およびオンターゲット遺伝子座）をターゲティング
する、ＰＣＲ用の単位複製配列をデザインした。ヒトゲノム基準配列（ビルドＧＲＣｈ３
８）に対して、配列をＢＬＡＳＴ検索（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２.１９、Altschul et al,
J Mol Biol., 1990, 215(3):403-10, PMID: 2231712）することにより、結果として得ら
れるＰＣＲプライマー対および単位複製配列配列を、固有性について点検した。１つを超
える単位複製配列配列を結果としてもたらすプライマー対は棄却し、デザインし直した。
表３１は、各ｇＲＮＡのためのデザインに成功したプライマー対についてのカウントを提
供する。
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーの調製、定量化、およびシーケンシング
製造元の推奨を使用する、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ ｋｉ
ｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、型番Ｐ７５８１）を使用して、ＲＮＰ処置（ｇＲＮＡ
１つ当たり２つのレプリケート）Ｔ細胞試料、およびＲＮＰ非処置（ｇＲＮＡ１つ当たり
１つのレプリケート）Ｔ細胞試料に由来するゲノムＤＮＡを定量化した。２回にわたる逐
次的ＰＣＲ反応を使用して、各試料について、個々のオフターゲット遺伝子座（およびオ
ンターゲット遺伝子座）をターゲティングする、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブ
ラリーを作出した。第１のＰＣＲでは、ユニバーサルのＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング
適合性配列をテールとする、標的特異的ＰＣＲプライマー（上記でデザインされた）を使
用して、標的遺伝子座を増幅した。第２のＰＣＲでは、第１のＰＣＲ単位複製配列に、シ
ーケンシング時のマルチプレックス化を可能とする試料バーコードを含む、さらなるＩｌ
ｌｕｍｉｎａシーケンシング適合性配列を追加した。ＰＣＲ１は、６ｎｇのｇＤＮＡ（細
胞約１０００個と同等）、最終濃度を０．２５μＭとするＰＣＲ１プライマー対（Ｉｎｔ
ｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および最終濃度を１×とするＱ
５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａ
ｂｓ、型番１０２５００－１４０）を含有する各反応物を伴う、１０μＬの最終容量で実
施した。ＰＣＲ１の左プライマーは、配列５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴ
ＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１０８１０）を伴う５’テール（すな
わち、５’－テール－標的特異的左プライマー－３’）であり、右プライマーは、配列５
’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（
配列番号１０８１１）を伴う５’テール（すなわち、５’－テール－標的特異的右プライ
マー－３’）であった。ＰＣＲ１は、サーモサイクラー上で、以下のサイクリング条件：
９８℃で１分間の１サイクル；９８℃で１０秒間、６３℃で２０秒間、および７２℃で３
０秒間の２５サイクル；７２℃で２分間の１サイクルを使用して実施した。次いで、ヌク
レアーゼ非含有水（Ａｍｂｉｏｎ、型番ＡＭ９９３２）を使用して、ＰＣＲ１を、１００
中１に希釈し、ＰＣＲ２へのインプットとして使用した。ＰＣＲ２は、２μＬの希釈ＰＣ
Ｒ１産物、最終濃度を０．５μＭとするＰＣＲ２プライマー対（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および最終濃度を１×とするＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔ
ａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、型番１０２
５００－１４０）を含有する各反応物を伴う、１０μＬの最終容量で実施した。使用され
るＰＣＲ２左プライマー配列は、５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡ
ＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ－３’（配列番号１０８
１２）であり、使用されるＰＣＲ２右プライマー配列は、５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡ
ＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ－３’（
配列番号１０８１３）であった［配列中、ＮＮＮＮＮＮＮＮは、標準的なＩｌｌｕｍｉｎ
ａシーケンシング工程の一部としての、試料マルチプレックス化のために使用される、８
ヌクレオチドのバーコード配列を描示する］。ＰＣＲ２は、サーモサイクラー上で、以下
のサイクリング条件：７２℃で３分間の１サイクル；９８℃で２分間の１サイクル；９８
℃で１０秒間、６３℃で３０秒間、および７２℃で２分間の１５サイクルを使用して実施
した。製造元の推奨に従い、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、型番Ａ６３８８２）を使用して、今や実行可能なＩｌｌｕｍｉ
ｎａシーケンシングライブラリーとなった、ＰＣＲ２単位複製配列を清浄化した。次いで
、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番４３６７６６０）と、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライ
ブラリーの末端（フォワードプライマー配列５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴ
ＡＣＧＡ－３’（配列番号１０８１４）、およびリバースプライマー配列５’－ＡＡＴＧ
ＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡ－３’（配列番号１０８１５））に特異的なプラ
イマーとを使用する、標準的なｑＰＣＲ定量化法を使用して、清浄化されたＩｌｌｕｍｉ
ｎａシーケンシングライブラリーを定量化した。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシン
グライブラリーを、等モルでプールし、製造元の推奨に従い、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎ
ｔ Ｋｉｔ ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、型番ＭＳ－１０２－３００３）を使用して、３０
０塩基のペアドエンドリードを伴う、ＭｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、型番ＳＹ－４
１０－１００３）上のＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングにかけた。各遺伝子座について、
最小で１０００倍の配列カバレッジを生成した。処置試料および非処置試料の、ＰＣＲ、
清浄化、プーリング、およびシーケンシングを、個別に実施して、処置試料および非処置
試料、またはこれらから作出されたＰＣＲ単位複製配列の間の交差夾雑のいかなる可能性
も回避した。
ＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングデータについてのＱＣ解析および変異体解析
デフォルトパラメータを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ解析ソフトウェア（
ＭｉＳｅｑ ｒｅｐｏｒｔｅｒ；ｖｅｒｓｉｏｎ ２．６．２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使
用して、単位複製配列特異的な、ＦＡＳＴＱシーケンシングデータファイル（Cock et al
, Nucleic Acids Res. 2010, 38(6):1767-71, PMID: 20015970）を作出した。次いで、標
準的なＰｅｒｌスクリプトラッパーを使用して合体させた、一連のパブリックドメインの
ソフトウェアパッケージからなる、社内開発の変異体解析パイプラインを介して、ＦＡＳ
ＴＱファイルを加工した。使用されるワークフローを、５段階に分けた。
段階１、ＰＣＲプライマー、ならびにオンターゲット配列およびオフターゲット配列に
ついてのＱＣ：オンターゲット部位およびオフターゲット部位のいずれについても、ＢＬ
ＡＳＴ検索（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２.２９＋、Altschul et al, J Mol Biol., 1990, 21
5(3):403-10, PMID: 2231712）を使用して、ＰＡＭ配列および標的特異的ＰＣＲプライマ
ー配列に加えた、２０ヌクレオチドのｇＲＮＡプロトスペーサー配列（さらなるＩｌｌｕ
ｍｉｎａシーケンシングを伴わない、左配列および右配列）を、ヒトゲノム基準配列（ビ
ルドＧＲＣｈ３８）に対してアライメントした。複数のゲノム位置を伴う、オンターゲッ
ト部位およびオフターゲット部位を、フラッグ付けした。
段階２、シーケンサーファイルの解凍：ｇｚｉｐスクリプト（ｖｅｒｓｉｏｎ １．３
．１２）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにより生成されたＦＡＳＴＱ．ＧＺ
ファイルを、ＦＡＳＴＱファイルへと解凍し、ファイル１つ当たりのリード数を計算した
。リードを伴わないファイルは、さらなる解析から除外した。
段階３、配列リードアライメントおよび品質トリミング：Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列のリー
ドの３’末端と、低品質塩基とをトリミングする「ハードクリッピング」を使用するＢＷ
Ａ－ＭＥＭアライナー（ｖｅｒｓｉｏｎ ０．７.４-r３８５；Li and Durbin, Bioinfor
matics, 2009, 25(14):1754-60, PMID: 19451168）を使用して、ＦＡＳＴＱファイル内の
シーケンシングリードを、ヒトゲノム基準配列（ビルドＧＲＣｈ３８）に対してアライメ
ントした。ＳＡＭｔｏｏｌｓスクリプト（ｖｅｒｓｉｏｎ ０．１.１９-４４４２８ｃd
；Li et al, Bioinformatics, 2009 25(16):2078-9, PMID: 19505943）を使用して、結果
として得られる、ＢＡＭファイルフォーマット（Li et al, Bioinformatics, 2009 25(16
):2078-9, PMID: 19505943）のアライメントリードを、ＦＡＳＴＱファイルへと転換した
。次いで、今回は「ハードクリッピング」を伴わずに、ＢＷＡ－ＭＥＭアライナーを使用
して、ＦＡＳＴＱファイルを、ヒトゲノム基準配列（ビルドＧＲＣｈ３８）に対して、再
度アライメントした。
段階４、変異体（ＳＮＰおよびインデル）解析：変異体（ＳＮＰおよびインデル）を同
定する、対立遺伝子頻度検出限界を、＞＝０．０００１に設定した、ＶａｒＤｉｃｔ ｖ
ａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｅｒ（開発者であるＺｈａｎｇＷｕＬｉａにより改変された、ｖ
ｅｒｓｉｏｎ １．０の「Ｃａｓ９ ａｗａｒｅ」、Lai et al, Nucleic Acids Res., 2
016, 44(11):e108, PMID: 27060149）を使用して、アライメントリードのＢＡＭファイル
を加工した。Ｃａｓ９ ａｗａｒｅ ＶａｒＤｉｃｔ ｃａｌｌｅｒは、パブリックドメ
インパッケージに基づくが、変異体イベントのアライメント領域内の反復配列に起因して
生成された、両義的な変異体コールを、ＰＡＭ配列の５’側から３塩基に位置する、ｇＲ
ＮＡのプロトスペーサー配列内の、潜在的なＣａｓ９ヌクレアーゼ切断部位へと移動させ
ることが可能である。ＳＡＭｔｏｏｌｓスクリプトを使用して、試料である単位複製配列
１つ当たりのリードカバレッジを計算して、オンターゲット部位およびオフターゲット部
位が、＞１０００倍の配列カバレッジでカバーされたのかどうかを決定した。配列カバレ
ッジが＜１０００倍である部位には、フラッグ付けし、より多くのシーケンシングデータ
を生成した。
段階５、ｄｂＳＮＰのフィルタリングおよび処置／非処置についての示差的解析：同定
された変異体に、ｄｂＳＮＰ内で見出される、公知の変異体（ＳＮＰおよびインデル）（
ビルド１４２、Shery et al, Nucleic Acids Res. 2001, 29(1):308-11, PMID: 11125122
）についてフィルターをかけた。処置試料中の変異体には、１）非処置対照試料中で同定
された変異体；２）ＶａｒＤｉｃｔ鎖バイアスが２：１である変異体（基準配列を支持す
るフォワードリードカウントと、リバースリードカウントとは、均衡しているが、非基準
変異体コールについては、均衡していない場合）；３）潜在的なＣａｓ９切断部位の近傍
で、１００ｂｐウィンドウの外部に位置する変異体；４）潜在的なＣａｓ９切断部位の近
傍で、１００ｂｐウィンドウ内の単一ヌクレオチド変異体を除外するように、さらにフィ
ルターをかけた。最後に、潜在的なＣａｓ９切断部位についての、１００ｂｐのウィンド
ウ内で、組合せインデル頻度が＞２％（約２０個を超える細胞内の編集）の部位だけを考
慮した。ゲノム基準配列に対するリードアライメントの目視検査を可能とする、Ｉｎｔｅ
ｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ；ｖｅｒｓｉｏｎ ２．３、Robi
nson et al, Nat Biotechnol. 2011, 9(1):24-6, PMID: 21221095）を使用して、潜在的
な活性の編集部位を、リードアライメントレベルでさらに検討した。潜在的なオフターゲ
ット活性を有することが同定された部位については、検査室工程（ＰＣＲから始める）お
よび解析工程の全体を介して、再度作業し直した。
オンターゲットおよびオフターゲットについての解析の結果
ｇＲＮＡである、ＣＲ００４４２、ＣＲ００４４４、ＣＲ０００９６１、およびＣＲ０
００９８４のオンターゲット部位は全て、処置された生物学的レプリケートのいずれにお
いても、平均変異体頻度が、それぞれ、９６％、８４％、８１％、および９８％であり、
意図されたＣａｓ９切断部位において、頑健な編集を示した。非処置対照試料のうちのい
ずれにおいても、編集が観察されなかった。表３１は、同定され、特徴づけられたオフタ
ーゲット部位の数を示す。特徴づけされていない部位は、ＰＣＲプライマーのデザインま
たはＰＣＲ増幅で失敗し、現在のところ、依然として探索下にある。
ｇＲＮＡであるＣＲ００４４２：ｇＲＮＡであるＣＲ００４４２のオンターゲット部位
は、処置された生物学的レプリケートのいずれにおいても、平均インデル頻度が、９６％
であり、意図されたＣａｓ９切断部位において、頑健な編集を示した。非処置対照試料で
は、編集が観察されなかった。表３１は、特徴づけられたオフターゲット部位の数を示す
。特徴づけされていない部位は、ＰＣＲプライマーのデザインまたはＰＣＲ増幅で失敗し
、現在のところ、依然として探索下にある。潜在的なオフターゲット部位の特徴づけは、
ｇＲＮＡであるＣＲ００４４２の、２つの弱いオフターゲット部位であって、提起される
Ｃａｓ９切断部位の近傍における、１００ｂｐのウィンドウ内の平均インデル頻度が、３
．７％および４．４％であるオフターゲット部位を同定した。１つの部位は、オンターゲ
ットのｇＲＮＡプロトスペーサー配列（５’－ＧＧＣａＡＣａＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡａＣ
Ｔ－ＰＡＭ－３’、ＰＡＭ＝ＧＧＧ（配列番号１０８１６））と比べて、３つのミスマッ
チを有し、第１９染色体の、エクソン１から、約０．９ｋｂ離れた、塩基対１１，８１５
，２５３～１１，８１５，２７５位における、亜鉛フィンガータンパク質４４０遺伝子（
ＺＮＦ４４０）のイントロン１に位置する。また、第２の部位も、オンターゲットｇＲＮ
Ａプロトスペーサー配列（５’－ＧＧＣｇＡＣａＧＡａＣＧＡＧＡＣＡＴＣＴ－ＰＡＭ－
３’、ＰＡＭ＝ＣＧＧ（配列番号１０８１７））と比べて、３つのミスマッチを有し、第
６染色体の、エクソン９から、約２ｋｂ離れた、塩基対１３８，８５６，２３４～１３８
，８５６，２５６位における、上皮細胞形質転換配列２がん遺伝子様遺伝子（ＥＣＴ２Ｌ
）のイントロン９に位置する。両方の部位についての手動検査は、Ｃａｓ９により媒介さ
れる、二本鎖切断の非相同末端結合性ＤＮＡ修復に典型的な、提起されたＣａｓ９切断部
位を取り囲む典型的なインデルパターンを示した。両方の部位の再増幅と、シーケンシン
グとは、同様な結果をもたらした。同定されたいずれかの部位における編集が、遺伝子の
発現または細胞生存率に対して、何らかの有害作用を及ぼしたのかどうかは不明であり、
さらなる解析が要求される。
ｇＲＮＡであるＣＲ００４４４：ｇＲＮＡであるＣＲ００４４４のオンターゲット部位
は、処置された生物学的レプリケートのいずれにおいても、平均インデル頻度が、８４％
であり、意図されたＣａｓ９切断部位において、頑健な編集を示した。非処置対照試料で
は、編集が観察されなかった。表３１は、特徴づけに成功したオフターゲット部位の数を
示す。特徴づけされていない部位は、ＰＣＲプライマーのデザインまたはＰＣＲ増幅で失
敗し、現在のところ、依然として探索下にある。検討される部位では、ｇＲＮＡであるＣ
Ｒ００４４４の著明なオフターゲット活性は現在まで観察されなかった。しかし、表３１
が示す通り、いまだ特徴づけられていないなお２つの部位であって、１つの部位は、遺伝
子間領域内に位置する、４つのミスマッチを伴い、別の部位は、非コードのダイナミン１
偽遺伝子４６遺伝子（ＤＮＭ１Ｐ４６）のエクソン４内に位置する、５つのミスマッチを
伴う部位が存在する。これらの部位における高ミスマッチ数に基づき、これらの部位は、
いかなる著明な編集も示さない可能性が高いことが予想されるが、これを確認するには、
さらなる解析が要求される。
ｇＲＮＡであるＣＲ０００９６１：ｇＲＮＡであるＣＲ０００９６１のオンターゲット
部位は、処置された生物学的レプリケートのいずれにおいても、平均インデル頻度が、８
１％であり、意図されたＣａｓ９切断部位において、頑健な編集を示した。非処置対照試
料では、編集が観察されなかった。表３１は、特徴づけに成功したオフターゲット部位の
数を示す。特徴づけされていない部位は、ＰＣＲプライマーのデザインまたはＰＣＲ増幅
で失敗し、現在のところ、依然として探索下にある。潜在的なオフターゲット部位の特徴
づけは、ｇＲＮＡであるＣＲ０００９６１の、１つの弱いオフターゲット部位であって、
提起されるＣａｓ９切断部位の近傍における、１００ｂｐのウィンドウ内の平均インデル
頻度が、５．５％であるオフターゲット部位を同定した。部位は、ｇＲＮＡプロトスペー
サー配列（５’－ＡａＡＧＴＣａＣａＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ－ＰＡＭ－３’、ＰＡＭ＝
ＴＧＧ（配列番号１０８１８））と比べて、３つのミスマッチを有し、第１１染色体の、
エクソン１３から、約０．６ｋｂ離れた、塩基対３１，１０２，９２０～３１，１０２，
９４２位における、ダブルコルチンドメイン含有タンパク質１遺伝子（ＤＣＤＣ１）のイ
ントロン１２に位置する。部位についての手動検査は、Ｃａｓ９により媒介される、二本
鎖切断の非相同末端結合性ＤＮＡ修復に典型的な、提起されたＣａｓ９切断部位を取り囲
む、典型的なインデルパターンを示した。部位の再増幅と、シーケンシングとは、同様な
結果をもたらした。この部位における編集が、遺伝子の発現または細胞生存率に対して、
何らかの有害作用を及ぼしたのかどうかは不明であり、しかし さらなる解析が要求され
る。
ｇＲＮＡであるＣＲ０００９８４：ｇＲＮＡであるＣＲ０００９８４のオンターゲット
部位は、処置された生物学的レプリケートのいずれにおいても、平均インデル頻度が、９
８％であり、意図されたＣａｓ９切断部位において、頑健な編集を示した。非処置対照試
料では、編集が観察されなかった。表３１は、特徴づけに成功したオフターゲット部位の
数を示す。特徴づけされていない部位は、ＰＣＲプライマーのデザインまたはＰＣＲ増幅
で失敗し、現在のところ、依然として探索下にある。オフターゲット部位の特徴づけは、
検討した部位において、ｇＲＮＡであるＣＲ０００９８４について、著明なオフターゲッ
ト活性を同定しなかった。しかし、表３１が示す通り、いまだ特徴づけられていない、な
お１つの部位が存在する。部位は、５つのミスマッチを有し、特徴づけられていない、長
い非コードＲＮＡ（ＬＯＣ４４０８９６）のエクソン内に位置する。高ミスマッチ数に基
づき、この部位は、いかなる著明な編集も示さない可能性が高いことが予想されるが、こ
れを確認するには、さらなる解析が要求される。
Figure 2022137032000570
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑヒットについての検証結果
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ同定された部位について記載した同じ方法を使用して、ＧＵＩＤＥ
－ｓｅｑ法（Tsai et al, Nat Biotechnol. 2015, 33(2):187-97, PMID: 25513782）を使
用して同定された、潜在的なオフターゲット遺伝子座を、ＲＮＰ処置Ｔ細胞内およびＲＮ
Ｐ非処置Ｔ細胞内で特徴づけた。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、ｇＲＮＡＣＲ００４４２の、２
つの潜在的な部位であって、１つは、ＣＲ００４４４の潜在的な部位であり、１つは、ｇ
ＲＮＡであるＣＲ０００９８４の潜在的な部位である部位を同定した。ｇＲＮＡであるＣ
Ｒ０００９６１の活性部位は、同定されなかった。全ての潜在的なＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ部
位についての標的シーケンシング解析は、ＲＮＰで処置された被験Ｔ細胞内で、著明な活
性を示さなかった。
挿入解析による、オフターゲット編集の評価
オリゴ挿入ベースのアッセイ（例えば、Tsai et al., Nature Biotechnology. 33, 187
-197; 2015を参照されたい）を使用して、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ２、ＰＤＣＤ１、
ＣＩＩＴＡ、およびＦＫＢＰ１ＡをターゲティングするＣａｓ９により切断される、潜在
的なオフターゲットゲノム部位を決定した。Ｂ２Ｍ（５）、ＴＲＡＣ（９）、ＴＲＢＣ２
（２）、ＰＤＣＤ１（８）、ＦＫＢＰ１Ａ（５）、またはＣＩＩＴＡ（５）をターゲティ
ングする、合計３４のガイドＲＮＡ（示された通り、修飾されているか、または修飾され
ていない、示されたターゲティングドメインを含む二重ガイドＲＮＡ）を、上記の実施例
１で記載した、Ｃａｓ９を発現するＨＥＫ２９３細胞内でスクリーニングし、結果を、図
６３および図６４にプロットする。アッセイは、予想される標的配列において、高効率の
編集を検出した。Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡであって、ＣＲ００４４４のター
ゲティングドメインまたはＣＲ００４４１のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡにつ
いては、オフターゲット編集は観察されず、Ｂ２ＭをターゲティングするｇＲＮＡであっ
て、ＣＲ００４４２のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡを使用して、単一の極めて
低効率のオフターゲット編集だけが検出された。結果は、ＴＲＡＣをターゲティングする
ｇＲＮＡであって、ＣＲ００９６１、ＣＲ００９７８、ＣＲ００９８４、ＣＲ００９９１
、およびＣＲ００９９２のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡについて、各々が、い
ずれのオフターゲット位置においても編集を伴わずに、標的配列の高効率の編集を結果と
してもたらしたことを示す。同様に、ＰＤＣＤ１をターゲティングするｇＲＮＡであって
、ＣＲ００９０２のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡについても、オフターゲット
編集は検出されなかった。このアッセイで潜在的なオフターゲット編集を実証したｇＲＮ
Ａ分子に関しては、ディープシーケンシングを使用して、潜在的な部位が、Ｃａｓ９によ
り切断される、真のオフターゲット部位であるのかどうかを決定する。同様に、任意の潜
在的なオフターゲット編集を、Ｔ細胞内の存在および頻度についても評価する。
[実施例１８]
初代ヒトＣＤ３＋細胞内の、ＣＤ３デルタおよびＣＤ３ガンマの編集
ＣＤ３デルタおよびＣＤ３ガンマの配列に対するターゲティングドメインを含むｄｇＲ
ＮＡ分子を含有するＣＲＩＳＰＲ系の編集を、本明細書で記載される方法に従う、初代Ｃ
Ｄ３＋ Ｔ細胞（電気穿孔により送達されるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ）内の編集につ
いて調べた。編集後におけるＣＤ３の表面発現について、フローサイトメトリーによりア
ッセイした。略述すると、編集されたＣＤ３＋細胞を、電気穿孔後７日目に、ＣＤ３に対
する抗体（ＯＫＴ３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。生細胞内の、ＣＤ３の、非編集
対照と比べた発現（７ＡＡＤの排除を使用して同定される）を使用して、ＲＮＰによる編
集の頻度を決定した。結果を、ＣＤ３の表面発現の喪失により測定される、初代ヒトＣＤ
３＋ Ｔ細胞内の編集％を示すフローサイトメトリーデータを含む、図６５および図６６
に報告する。注目すべきことに、ＣＲ００５３３４のターゲティングドメインを含むｄｇ
ＲＮＡは、ＣＤ３の９８％の喪失を結果としてもたらした。
例示される複数の実施形態は、本発明のある特定の態様だけを例示することを意図する
ものであり、機能的に同等な任意の構築物も、本発明の範囲内にあるので、本発明の範囲
は、例示される構築物により限定されるものではない。当業者には、前出の記載から、本
明細書で示され、記載される改変に加えて、本発明の多様な改変が明らかであり、これら
も、付属の特許請求の範囲内に収まるであろう。
本発明の教示の、具体的問題または状況への適用は、本明細書に含有される教示に照ら
して、当業者の能力の範囲内にあると理解される。
本明細書内の各引用およびあらゆる引用の開示は、参照により本明細書に明示的に組み
込まれる。
本出願は、配列表と共に出願されている。配列表と、本明細書内で列挙される任意の配
列との間に、齟齬が見られる範囲においては、本明細書内で列挙される配列が正確な配列
とみなされるものとする。そうでないことが指し示されない限りにおいて、全てのゲノム
位置は、ｈｇ３８に従う。

Claims (286)

  1. ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、前記ｃｒＲＮＡが、Ｂ２Ｍ、
    ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＨＬ
    Ａ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＦＫＢＰ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＮＬ
    ＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、またはＮＲ３Ｃ１から選択される、同種
    異系Ｔ細胞標的の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ分子。
  2. （ａ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、Ｂ２Ｍであり、前記ターゲティングドメインが、配
    列番号１～配列番号８３、もしくは配列番号５４９２～配列番号５５２７のうちのいずれ
    か１つを含むか；
    （ｂ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＴＲＡＣであり、前記ターゲティングドメインが、
    配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配列番号５８１６～配列番号５９６５の
    うちのいずれか１つを含むか；
    （ｃ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＴＲＢＣ１であり、前記ターゲティングドメインが
    、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配列番号５９６６～配列番号６０９７
    のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｄ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＴＲＢＣ２であり、前記ターゲティングドメインが
    、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは配列番号６０９８～配列番号６２２６
    のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｅ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＣＤ２４７であり、前記ターゲティングドメインが
    、配列番号８４～配列番号３９２のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｆ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＣＤ３Ｄであり、前記ターゲティングドメインが、
    配列番号３９３～配列番号５３２、もしくは配列番号１０７８０～配列番号１０７９４の
    うちのいずれか１つを含むか；
    （ｇ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＣＤ３Ｅであり、前記ターゲティングドメインが、
    配列番号５３３～配列番号８３９、もしくは配列番号１０６７７～配列番号１０７６４の
    うちのいずれか１つを含むか；
    （ｈ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＣＤ３Ｇであり、前記ターゲティングドメインが、
    配列番号８４０～配列番号９６８、もしくは配列番号１０７６５～配列番号１０７７９の
    うちのいずれか１つを含むか；
    （ｉ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＨＬＡ－Ａであり、前記ターゲティングドメインが
    、配列番号９６９～配列番号１３４５のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｊ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＨＬＡ－Ｂであり、前記ターゲティングドメインが
    、配列番号１３４６～配列番号１６９８のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｋ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＨＬＡ－Ｃであり、前記ターゲティングドメインが
    、配列番号１６９９～配列番号２０６８のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｌ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＤＣＫであり、前記ターゲティングドメインが、配
    列番号５２７８～配列番号５４９１のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｍ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＣＤ５２であり、前記ターゲティングドメインが、
    配列番号６２２７～配列番号６３２４のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｎ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＦＫＢＰ１Ａであり、前記ターゲティングドメイン
    が、配列番号６３２５～配列番号６５８３、もしくは配列番号６６６２～配列番号６７４
    ９のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｏ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＮＲ３Ｃ１であり、前記ターゲティングドメインが
    、配列番号２０６９～配列番号２９４１のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｐ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＣＩＩＴＡであり、前記ターゲティングドメインが
    、配列番号６７５０～配列番号７７１６、もしくは配列番号７７１７～配列番号７８０４
    のうちのいずれか１つを含むか；または
    （ｑ）前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＮＬＲＣ５であり、前記ターゲティングドメインが
    、配列番号８６２２～配列番号１００８９のうちのいずれか１つを含む、
    請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
  3. 前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＴＲＡＣであり、前記ターゲティングドメインが、配列番
    号５５６９、配列番号５５８５、配列番号５５８７、配列番号５５９２、配列番号５６０
    １、配列番号５５８９、配列番号５６００、配列番号５５９４、配列番号５５７１、配列
    番号５５９３、配列番号５５７４、配列番号５５９８、配列番号５５８６、配列番号５５
    ９９、配列番号５５９１、配列番号５６１０、配列番号５６０８、配列番号５６１７、配
    列番号５６１９、または配列番号５６２０を含む、請求項１から２のいずれかに記載のｇ
    ＲＮＡ分子。
  4. 前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＴＲＡＣであり、前記ターゲティングドメインが、配列番
    号５５６９、配列番号５５８６、配列番号５５８７、配列番号５５９２、配列番号５５９
    ９、または配列番号５６００を含む、請求項３に記載のｇＲＮＡ分子。
  5. 前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＴＲＢＣ２であり、前記ターゲティングドメインが、配列
    番号５７１９、配列番号５６９４、配列番号５７０６、配列番号５６９６、配列番号５７
    １１、配列番号５７０８、配列番号５７０９、配列番号５７１２、配列番号５７０３、配
    列番号５７０７、配列番号５６８７、配列番号５７０５、配列番号５７１３、配列番号５
    ７１５、または配列番号５７１０を含む、請求項１から２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分
    子。
  6. 前記同種異系Ｔ細胞標的が、Ｂ２Ｍであり、前記ターゲティングドメインが、配列番号
    ５５１９、配列番号５４９７、配列番号５４９９、配列番号５４９８、配列番号５５０３
    、配列番号５４９６、配列番号５５０７、配列番号５５１５、配列番号５４９３、配列番
    号５５０６、配列番号５５０９、配列番号５５１７、配列番号５５２１、配列番号５５２
    ０、配列番号５５００、配列番号５４９４、配列番号５５０８、配列番号５５１４、また
    は配列番号５４９２を含む、請求項１から２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  7. 前記同種異系Ｔ細胞標的が、Ｂ２Ｍであり、前記ターゲティングドメインが、配列番号
    ５４９６、配列番号５４９８、または配列番号５５０９を含む、請求項６に記載のｇＲＮ
    Ａ分子。
  8. 前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＣＩＩＴＡであり、前記ターゲティングドメインが、配列
    番号７７７１、配列番号７７６９、配列番号７７７３、配列番号７７２６、配列番号７７
    ５８、配列番号７７３９、配列番号７７７９、配列番号７７７０、配列番号７７４９、配
    列番号７７５４、配列番号７７４５、配列番号７７８５、配列番号７７３１、配列番号７
    ７７２、配列番号７７４３、または配列番号７７５０を含む、請求項１から２のいずれか
    一項に記載のｇＲＮＡ分子。
  9. 前記ターゲティングドメインが、配列番号７７６９、配列番号７７７１、配列番号７７
    ３９、または配列番号７７８５を含む、請求項８に記載のｇＲＮＡ分子。
  10. 前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＴＲＡＣであり、前記ターゲティングドメインが、配列番
    号５５６９、配列番号５５８７、配列番号５５９２、または配列番号５５８６を含む、請
    求項１から４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  11. 前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＴＲＡＣであり、前記ターゲティングドメインが、配列番
    号５５６９を含む、請求項１から４または１０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  12. 前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＣＤ３Ｅであり、前記ターゲティングドメインが、配列番
    号１０７２９、配列番号１０７１９、配列番号１０７６４、配列番号１０７８９、配列番
    号１０７０１、配列番号１０７００、または配列番号１０７２２を含む、請求項１から２
    のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  13. 前記同種異系Ｔ細胞標的が、ＦＫＢＰ１Ａであり、前記ターゲティングドメインが、配
    列番号６６９３、配列番号６７０５、配列番号６６９４、配列番号６７０８、または配列
    番号６６９９を含む、請求項１から２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  14. ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、前記ｃｒＲＮＡが、ＣＤ２７
    ４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（例
    えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩ
    ＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６
    、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４
    またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９
    、アデノシン、およびＴＧＦベータ、またはＰＴＰＮ１１から選択される阻害性分子、ま
    たは阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの標的配列と相補的なターゲ
    ティングドメインを含む、ｇＲＮＡ分子。
  15. （ａ）前記阻害性分子が、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）であり、前記ターゲティングドメ
    インが、配列番号２９４２～配列番号３２７０のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｂ）前記阻害性分子が、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ３）であり、前記ターゲティングドメ
    インが、配列番号３２７１～配列番号３５４１のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｃ）前記阻害性分子が、ＬＡＧ３であり、前記ターゲティングドメインが、配列番号
    ３５４２～配列番号４０３２のうちのいずれか１つを含むか；
    （ｄ）前記阻害性分子が、ＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）であり、前記ターゲティングドメイ
    ンが、配列番号４０３３～配列番号４５８９、もしくは配列番号５７２０～配列番号５８
    １５のうちのいずれか１つを含むか；または
    （ｅ）前記阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターが、ＰＴＰＮ１であ
    り、前記ターゲティングドメインが、配列番号４５９０～配列番号５２７７のうちのいず
    れか１つを含む、
    請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子。
  16. 前記阻害性分子が、ＰＤＣＤ１であり、前記ターゲティングドメインが、配列番号５７
    ４３、配列番号５７９８、配列番号５７４８、配列番号５７２２、配列番号５８００、配
    列番号５７３５、配列番号５７２４、配列番号５７３１、配列番号５７２５、配列番号５
    ７７５、配列番号５７６６、配列番号５７２７、配列番号５７４４、配列番号５７５１、
    または配列番号５７３４を含む、請求項１４から１５のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  17. 前記阻害性分子が、ＰＤＣＤ１であり、前記ターゲティングドメインが、配列番号５７
    ７５を含む、請求項１４から１５のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  18. 前記ターゲティングドメインが、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいず
    れか１つの、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４の連続核酸を含む
    、請求項２から１３または１５から１６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  19. 前記ターゲティングドメインが、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいず
    れか１つの、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４の連続核酸からな
    る、請求項２から１３または１５から１６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  20. 前記列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１
    ９、２０、２１、２２、２３、または２４の連続核酸が、列挙されたターゲティングドメ
    イン配列の３’末端に配置された、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または
    ２４の連続核酸である、請求項１８または１９に記載のｇＲＮＡ分子。
  21. 前記列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１
    ９、２０、２１、２２、２３、または２４の連続核酸が、列挙されたターゲティングドメ
    イン配列の５’末端に配置された、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または
    ２４の連続核酸である、請求項１８または１９に記載のｇＲＮＡ分子。
  22. 前記列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１
    ９、２０、２１、２２、２３、または２４の連続核酸が、列挙されたターゲティングドメ
    イン配列の５’または３’核酸を含まない、請求項１８または１９に記載のｇＲＮＡ分子
    。
  23. 前記ターゲティングドメインが、列挙されたターゲティングドメイン配列からなる、請
    求項２から１３または１５から１６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  24. 前記ｃｒＲＮＡの部分と、前記ｔｒａｃｒの部分とが、ハイブリダイズして、配列番号
    ６５８４または配列番号６５８５を含むフラッグポールを形成する、先行する請求項のい
    ずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  25. 前記フラッグポールが、前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分に対して３’側に位
    置する、第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部が
    、配列番号６５８６を含む、請求項２４に記載のｇＲＮＡ分子。
  26. 前記フラッグポールが、前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分と、存在する場合、
    前記第１のフラッグポール伸長部とに対して３’側に位置する、第２のフラッグポール伸
    長部をさらに含み、前記第２のフラッグポール伸長部が、配列番号６５８７を含む、請求
    項２４または２５に記載のｇＲＮＡ分子。
  27. 前記ｔｒａｃｒが、
    （ａ）任意選択で、前記３’末端において、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、
    ６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む配列番号７８２０；
    （ｂ）配列番号６６６０；または
    （ｃ）配列番号６６６１
    を含む、請求項１から２６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  28. 前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分が、配列番号６６０７または配列番号６６０
    ８を含む、請求項２７に記載のｇＲＮＡ分子。
  29. 前記ｔｒａｃｒが、配列番号６５８９または配列番号６５９０と、任意選択で、第１の
    フラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号６５８９または配列番号６５９０に対し
    て５’側に配置された、第１のｔｒａｃｒ伸長部とを含み、前記第１のｔｒａｃｒ伸長部
    が、配列番号６５９１を含む、請求項１から２６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  30. 前記ターゲティングドメインと、前記ｔｒａｃｒとが、別個の核酸分子上に配置された
    、請求項１９から２０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  31. 前記ｃｒＲＮＡが、５’から３’へと、［ターゲティングドメイン］－：
    ａ）配列番号６５８４；
    ｂ）配列番号６５８５；
    ｃ）配列番号６６０５；
    ｄ）配列番号６６０６；
    ｅ）配列番号６６０７；
    ｆ）配列番号６６０８；または
    ｇ）配列番号７８０６
    を含む、請求項１から２３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  32. 前記ｔｒａｃｒが、５’から３’へと：
    ａ）配列番号６５８９；
    ｂ）配列番号６５９０；
    ｃ）配列番号６６０９；
    ｄ）配列番号６６１０；
    ｅ）配列番号６６６０；
    ｆ）配列番号６６６１；
    ｇ）配列番号７８２０；
    ｈ）配列番号７８０７；
    ｉ）配列番号７８０８；
    ｊ）配列番号７８０９；
    ｋ）前記３’末端において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしく
    は７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、
    もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）～ｊ）のうちのい
    ずれか；
    ｌ）前記３’末端において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしく
    は７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、
    もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）～ｋ）のうちのい
    ずれか；または
    ｍ）前記５’末端（end）（例えば、５’末端（terminus））において、少なくとも１
    つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例え
    ば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド
    をさらに含む、上記のa）～l）のうちのいずれか
    を含む、請求項１から２３または３１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  33. 前記ターゲティングドメインと、前記ｔｒａｃｒとが、別個の核酸分子上に配置され、
    前記ターゲティングドメインを含む前記核酸分子が、任意選択で、前記ターゲティングド
    メインに対してすぐ３’側に配置された配列番号６６０７を含み、前記ｔｒａｃｒを含む
    前記核酸分子が、配列番号６６６０を含む、例えば、これからなる、請求項１から２３の
    いずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  34. 前記ターゲティングドメインと、前記ｔｒａｃｒとが、単一の核酸分子上に配置され、
    前記ｔｒａｃｒが、前記ターゲティングドメインに対して３’側に配置された、請求項２
    ７から２８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  35. 前記ターゲティングドメインに対して３’側に配置され、かつ、前記ｔｒａｃｒに対し
    て５’側に配置されたループをさらに含む、請求項３４に記載のｇＲＮＡ分子。
  36. 前記ループが、配列番号６５８８を含む、請求項３５に記載のｇＲＮＡ分子。
  37. ５’から３’へと、［ターゲティングドメイン］－：
    （ａ）配列番号６６０１；
    （ｂ）配列番号６６０２；
    （ｃ）配列番号６６０３；
    （ｄ）配列番号６６０４；
    （ｅ）配列番号７８１１；または
    （ｆ）前記３’末端において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つの
    ウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記の(ａ）～（ｅ）のうちのいずれか
    を含む、請求項１から２３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  38. 前記ターゲティングドメインと、前記ｔｒａｃｒとが、単一の核酸分子上に配置され、
    前記核酸分子が、前記ターゲティングドメインと、任意選択で、前記ターゲティングドメ
    インに対してすぐ３’側に配置された配列番号６６０１とを含む、例えば、これからなる
    、請求項１から２３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  39. 前記ターゲティングドメインと、前記ｔｒａｃｒとが、単一の核酸分子上に配置され、
    前記核酸分子が、前記ターゲティングドメインと、任意選択で、前記ターゲティングドメ
    インに対してすぐ３’側に配置された配列番号７８１１とを含む、例えば、これからなる
    、請求項１から２３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  40. 前記ｇＲＮＡ分子を含む前記核酸分子のうちの、１つの核酸分子、または、任意選択で
    、１つを超える核酸分子が、
    ａ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端における、ある、例えば３つのホスホロ
    チオエート（phosphorothioate）修飾；
    ｂ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端における、ある、例えば３つのホスホロ
    チオエート（phosphorothioate）修飾；
    ｃ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端における、ある、例えば３つの２’－Ｏ
    －メチル修飾；
    ｄ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端における、ある、例えば３つの２’－Ｏ
    －メチル修飾；
    ｅ）前記１つまたは複数の核酸分子の、末端に対して４つ目、末端に対して３つ目、お
    よび末端に対して２つ目の３’残基の各々における２’－Ｏ－メチル修飾；または
    ｆ）これらの任意の組合せ
    を含む、請求項１から３９のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  41. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、
    細胞へと導入すると、前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインに相補的な前記標
    的配列において、またはこの近傍において、インデルが形成される、請求項１から４０の
    いずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  42. 前記インデルが、フレームシフト突然変異である、請求項４１に記載のｇＲＮＡ分子。
  43. 前記インデルが、図３４Ａ、図３４Ｂ、図３６、図３８、図４１、図４４、図４８、図
    ４９、図５０、または図５３のうちのいずれかに列挙されるインデルである、請求項４１
    から４２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  44. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、
    細胞集団へと導入すると、前記集団の前記細胞のうちの、少なくとも約４０％、例えば、
    少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例え
    ば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、
    例えば、少なくとも約９６％、例えば、少なくとも約９７％、例えば、少なくとも約９８
    ％、例えば、少なくとも約９９％の中の、前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメイ
    ンに相補的な前記標的配列において、またはこの近傍において、インデルが形成される、
    請求項１から４０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  45. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、
    細胞集団へと導入すると、前記集団の前記細胞のうちの、少なくとも約２０％、例えば、
    少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約３５％、例えば、少なくとも約４０％、例え
    ば、少なくとも約４５％、例えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約５５％、
    例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約６５％、例えば、少なくとも約７０
    ％、例えば、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約
    ８５％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、例えば、少なくと
    も約９９％の中の、前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインに相補的な前記標的
    配列において、またはこの近傍において、フレームシフト突然変異であるインデルが形成
    される、請求項１から４０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  46. 前記集団の前記細胞のうちの、少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、例
    えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％
    、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９
    ５％、例えば、少なくとも約９６％、例えば、少なくとも約９７％、例えば、少なくとも
    約９８％、例えば、少なくとも約９９％の中で、前記インデルが、図３４Ａ、図３４Ｂ、
    図３６、図３８、図４１、図４４、図４８、図４９、図５０、または図５３のうちのいず
    れかに列挙されるインデルである、請求項４３から４４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子
    。
  47. 前記細胞集団内で最も高頻度で検出される５つのインデルが、図３４Ａ、図３４Ｂ、図
    ３６、図３８、図４１、図４４、図４８、図４９、図５０、または図５３のうちのいずれ
    かにおいて列挙される任意のｇＲＮＡと関連する前記インデルのうちの３つ以上、例えば
    、４つ、例えば、５つを含む、請求項４３から４５のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  48. 前記インデルが、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により測定されるものである、請求
    項４１から４６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  49. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、
    細胞へと導入すると、前記細胞内で、前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインに
    相補的な前記標的配列を含む前記遺伝子の発現が、低減されるか、または消失する、請求
    項１から４７のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  50. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、
    細胞集団へと導入すると、前記集団の前記細胞のうちの、少なくとも約４０％、例えば、
    少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例え
    ば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、
    例えば、少なくとも約９６％、例えば、少なくとも約９７％、例えば、少なくとも約９８
    ％、例えば、少なくとも約９９％の中で、前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメイ
    ンに相補的な前記標的配列を含む前記遺伝子の発現が、低減されるか、または消失する、
    請求項１から４８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  51. 前記低減されるか、または消失する発現が、フローサイトメトリーにより測定される、
    請求項４８から４９のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  52. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、
    細胞へと導入すると、前記細胞内で、例えば、次世代シーケンシングおよび／またはヌク
    レオチド挿入アッセイにより検出可能なオフターゲットインデルが形成されない、請求項
    ４１から５０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  53. 前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、
    細胞集団へと導入すると、例えば、次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド挿
    入アッセイにより検出可能なオフターゲットインデルが、前記細胞集団の前記細胞のうち
    の約５％以下、例えば、約１％以下、例えば、約０．１％以下、例えば、約０．０１％以
    下の中で検出される、請求項４１から５０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  54. 前記細胞が、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞であり、例えば、ヒト細胞である（ま
    たは細胞集団は、これらを含む）、請求項４１から５２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子
    。
  55. 前記細胞が、免疫エフェクター細胞である（または細胞集団は、これを含む）、請求項
    ５３に記載のｇＲＮＡ分子。
  56. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり、例えば、Ｔ細胞である（
    または細胞集団は、これらを含む）、請求項５４に記載のｇＲＮＡ分子。
  57. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合せである（
    または細胞集団は、これらを含む）、請求項５５に記載のｇＲＮＡ分子。
  58. 前記細胞（または細胞集団）が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作さ
    れているか、または操作されることになる、請求項５２から５５のいずれかに記載のｇＲ
    ＮＡ分子。
  59. 前記ＣＡＲが、
    （ａ）ＣＤ１９ ＣＡＲ；または
    （ｂ）ＢＣＭＡ ＣＡＲ
    である、請求項５７に記載のｇＲＮＡ分子。
  60. （ａ）前記ＣＡＲが、配列番号７８８３～配列番号７８９８のうちのいずれか１つを含
    む抗原結合性ドメインを含むＣＤ１９ ＣＡＲであるか；
    （ｂ）前記ＣＡＲが、配列番号７９０９または配列番号７９２０を含むＣＤ１９ ＣＡ
    Ｒであるか；
    （ｃ）前記ＣＡＲが、配列番号７９３９～配列番号８１１２のうちのいずれか１つを含
    む抗原結合性ドメインを含む、例えば、配列番号７９４９の抗原結合性ドメインを含むＢ
    ＣＭＡ ＣＡＲであるか；または
    （ｄ）前記ＣＡＲが、配列番号８５４９～配列番号８６２１のうちのいずれか１つを含
    む、例えば、配列番号８５５９を含むＢＣＭＡ ＣＡＲである、
    請求項５８に記載のｇＲＮＡ分子。
  61. 前記細胞が、前記細胞を投与される患者に関して同種異系である、請求項４１から５９
    のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
  62. Ｃａｓ９分子をさらに含む、請求項１から６０のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子
    を含む組成物。
  63. 前記Ｃａｓ９分子が、配列番号６６１１、または配列番号７８２１～配列番号７８３１
    のうちのいずれか１つを含む、例えば、これからなる、請求項６１に記載の組成物。
  64. 前記Ｃａｓ９分子が、活性または不活性の化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９であ
    る、請求項６１に記載の組成物。
  65. 前記第１のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子が、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）内
    に存在する、請求項６１から６３のいずれかに記載の組成物。
  66. 第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子；または第２のｇ
    ＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子、および第４のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記第２の
    ｇＲＮＡ分子、前記第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および前記第４のｇＲＮＡ分
    子（存在する場合）が、請求項１から２６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子であり、前記
    組成物の各ｇＲＮＡ分子が、異なる標的配列に相補的である、請求項６１から６４のいず
    れかに記載の組成物。
  67. 前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記第３のｇＲＮＡ分子（存在す
    る場合）、および前記第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）が、同じ遺伝子内の標的配列
    に相補的である、請求項６５に記載の組成物。
  68. 前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記第３のｇＲＮＡ分子（存在す
    る場合）、および前記第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）が、２００００ヌクレオチド
    以下、１００００ヌクレオチド以下、６０００以下、５０００ヌクレオチド以下、４００
    ０以下、１０００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下
    、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌ
    クレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下
    、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオ
    チド以下、または１０ヌクレオチド以下だけ隔たった標的配列に相補的である、請求項６
    ５または６６に記載の組成物。
  69. 前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記第３のｇＲＮＡ分子（存在す
    る場合）、および前記第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）が、異なる遺伝子内の標的配
    列に相補的である、請求項６５に記載の組成物。
  70. 第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、および第３のｇＲＮＡ分子を含み、前記第
    １のｇＲＮＡ分子が、請求項２（ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｄ）、２（ｅ）、２（
    ｆ）、２（ｇ）、または２（ｈ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子であり；前記第２のｇ
    ＲＮＡ分子が、請求項２（ａ）、２（ｉ）、２（ｊ）、２（ｋ）、または２（ｑ）のいず
    れかに記載のｇＲＮＡ分子であり；前記第３のｇＲＮＡ分子が、請求項１５（ａ）、１５
    （ｂ）、１５（ｃ）、１５（ｄ）、または１５（ｅ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子で
    ある、請求項６８に記載の組成物。
  71. 第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、および第３のｇＲＮＡ分子を含み、前記第
    １のｇＲＮＡ分子が、請求項２（ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｄ）、２（ｅ）、２（
    ｆ）、２（ｇ）、または２（ｈ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子であり；前記第２のｇ
    ＲＮＡ分子が、請求項２（ｌ）、２（ｍ）、２（ｎ）、または２（ｏ）のいずれかに記載
    のｇＲＮＡ分子であり；前記第３のｇＲＮＡ分子が、請求項１５（ａ）、１５（ｂ）、１
    ５（ｃ）、１５（ｄ）、または１５（ｅ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子である、請求
    項６９に記載の組成物。
  72. 第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子を含み、前記第１のｇＲＮＡ分子が、請
    求項２（ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｄ）、２（ｅ）、２（ｆ）、２（ｇ）、または
    ２（ｈ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子であり；前記第２のｇＲＮＡ分子が、請求項２
    （ｌ）、２（ｍ）、２（ｎ）、または２（ｏ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子である、
    請求項７０に記載の組成物。
  73. 第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子を含み、前記第１のｇＲＮＡ分子が、請
    求項２（ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｄ）、２（ｅ）、２（ｆ）、２（ｇ）、または
    ２（ｈ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子であり；前記第２のｇＲＮＡ分子が、請求項２
    （ａ）、２（ｉ）、２（ｊ）、または２（ｋ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子である、
    請求項７０に記載の組成物。
  74. 第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子を含み、前記第１のｇＲＮＡ分子が、請
    求項２（ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｄ）、２（ｅ）、２（ｆ）、２（ｇ）、または
    ２（ｈ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子であり；前記第２のｇＲＮＡ分子が、請求項１
    ５（ａ）、１５（ｂ）、１５（ｃ）、１５（ｄ）、または１５（ｅ）のいずれかに記載の
    ｇＲＮＡ分子である、請求項７０に記載の組成物。
  75. 第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子を含み、前記第１のｇＲＮＡ分子が、請
    求項１５（ａ）、１５（ｂ）、１５（ｃ）、１５（ｄ）、または７（ｅ）のいずれかに記
    載のｇＲＮＡ分子であり；前記第２のｇＲＮＡ分子が、請求項１５（ａ）、１５（ｂ）、
    １５（ｃ）、１５（ｄ）、または１５（ｅ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子である、請
    求項７０に記載の組成物。
  76. 第３のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記第３のｇＲＮＡ分子が、請求項１５（ａ）、１
    ５（ｂ）、１５（ｃ）、１５（ｄ）、または１５（ｅ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子
    である、請求項７４に記載の組成物。
  77. 請求項１から６０のいずれかに記載の２つのｇＲＮＡ分子からなる、請求項６５から６
    ８、７１、７２、７３、または７４のいずれかに記載の組成物。
  78. 請求項１から６０のいずれかに記載の３つのｇＲＮＡ分子からなる、請求項６５から７
    ０または７５のいずれかに記載の組成物。
  79. ａ）その前記ターゲティングドメインが、請求項２（ａ）、２（ｉ）、２（ｊ）、また
    は２（ｋ）のいずれかに記載のターゲティングドメインである、請求項１から６０のいず
    れかに記載の第１のｇＲＮＡ分子と；
    ｂ）その前記ターゲティングドメインが、請求項２（ｂ）、２（ｃ）、２（ｄ）、２（
    ｆ）、２（ｇ）、２（ｈ）、または２（ｉ）のいずれかに記載のターゲティングドメイン
    である、請求項１から６０のいずれかに記載の第２のｇＲＮＡ分子と
    を含む組成物。
  80. ａ）前記第１のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項６に記載のター
    ゲティングドメインであり；
    ｂ）前記第２のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項３に記載のター
    ゲティングドメインである、
    請求項７８に記載の組成物。
  81. ａ）前記第１のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項７に記載のター
    ゲティングドメインであり；
    ｂ）前記第２のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項４に記載のター
    ゲティングドメインである、
    請求項７８に記載の組成物。
  82. ａ）前記第１のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項７に記載のター
    ゲティングドメインであり；
    ｂ）前記第２のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項１１に記載のタ
    ーゲティングドメインである、
    請求項７８に記載の組成物。
  83. ａ）前記第１のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項７に記載のター
    ゲティングドメインであり；
    ｂ）前記第２のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項１２に記載のタ
    ーゲティングドメインである、
    請求項７８に記載の組成物。
  84. 請求項１から６０のいずれかに記載の第３のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記第３のｇ
    ＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項２（ｎ）または２（ｑ）のいずれか
    に記載のターゲティングドメインである、請求項７８から８２のいずれかに記載の組成物
    。
  85. 前記第３のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項８に記載のターゲテ
    ィングドメインである、請求項８３に記載の組成物。
  86. 前記第３のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、請求項９に記載のターゲテ
    ィングドメインである、請求項８３に記載の組成物。
  87. 第４のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記第４のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメ
    インが、ＮＫ阻害性分子の標的の標的配列に相補的である、請求項７８から８５のいずれ
    かに記載の組成物。
  88. 前記ＮＫ阻害性分子の標的が、ＬＩＬＲＢ１である、請求項８６に記載の組成物。
  89. 前記第４のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、
    ａ）配列番号１００９０～配列番号１０６７３のうちのいずれか１つ；
    ｂ）配列番号１００９０～配列番号１０６７３のうちのいずれか１つの、１７、１８、
    １９、２０、２１、２２、２３、または２４の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続
    ヌクレオチド；
    ｃ）配列番号１００９０～配列番号１０６７３のうちのいずれか１つの、５’側の１７
    、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレ
    オチド；または
    ｄ）配列番号１００９０～配列番号１０６７３のうちのいずれか１つの、３’側の１７
    、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレ
    オチド
    を含む、例えば、これからなる、請求項８７に記載の組成物。
  90. 前記ｇＲＮＡ分子の各々が、本明細書で記載されるＣａｓ９分子と共に、リボ核タンパ
    ク質複合体（ＲＮＰ）内にある、請求項７８から８８のいずれか一項に記載の組成物。
  91. 電気穿孔に適する培地中で製剤化された、請求項６１から８９のいずれかに記載の組成
    物。
  92. 前記ｇＲＮＡ分子の各々が、本明細書で記載されるＣａｓ９分子と共に、ＲＮＰ複合体
    内にあり、前記ＲＮＰ複合体の各々が、約１０ｕＭ未満、例えば、約３ｕＭ未満、例えば
    、約１ｕＭ未満、例えば、約０．５ｕＭ未満、例えば、約０．３ｕＭ未満、例えば、約０
    ．１ｕＭ未満の濃度である、請求項６１から９０のいずれかに記載の組成物。
  93. 細胞、例えば、細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細書で記載さ
    れる、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞をさらに含む、請求項９１に記載
    の組成物。
  94. 請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、または請求項６１から９２のいず
    れかに記載の組成物のある、例えば全ての構成要素をコードする核酸配列。
  95. 前記核酸が、前記ｇＲＮＡ分子をコードする前記配列に作動可能に連結したプロモータ
    ーを含む、請求項９３に記載の核酸配列。
  96. 前記プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより
    認識されるプロモーターである、請求項９４に記載の核酸配列。
  97. 前記プロモーターが、Ｕ６プロモーターまたはＨＩプロモーターである、請求項９５に
    記載の核酸配列。
  98. 前記核酸が、Ｃａｓ９分子をさらにコードする、請求項９３から９６のいずれかに記載
    の核酸配列。
  99. 前記核酸が、Ｃａｓ９分子をコードする前記配列に作動可能に連結したプロモーターを
    含む、請求項９７に記載の核酸配列。
  100. 前記プロモーターが、ＥＦ－１プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ
    －１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（
    ＰＧＫ）プロモーターである、請求項９８に記載の核酸配列。
  101. 請求項９３から９９のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
  102. レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベ
    クター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプ
    ラスミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される、請求項８０に記載のベクタ
    ー。
  103. 請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９分子をコードする核酸
    とを含む組成物。
  104. 請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９分子とをコードする核
    酸を含む組成物。
  105. 鋳型核酸をさらに含む、請求項６１から９２または１０２から１０３のいずれかに記載
    の組成物。
  106. 前記鋳型核酸が、前記ｇＲＮＡ分子の標的配列のヌクレオチドに対応するヌクレオチド
    を含む、請求項１０４に記載の組成物。
  107. 前記鋳型核酸が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、請求項１０４
    から１０５のいずれかに記載の組成物。
  108. 前記ＣＡＲが、
    （ａ）例えば、国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレットもしくは国際公開第
    ２０１４／１５３２７０号パンフレットにおいて記載されているＣＤ１９ ＣＡＲ；また
    は
    （ｂ）例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ ＣＡＲ、例えば、配列番号８５５９を
    含むＢＣＭＡ ＣＡＲ
    である、請求項１０６に記載の組成物。
  109. 前記鋳型核酸が、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸を含む、請求項１０４から１０７の
    いずれかに記載の組成物。
  110. 細胞の標的配列を変更する、例えば、その構造、例えば配列を変更する方法であって、
    前記細胞を、
    ａ）請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮ
    Ａ分子、およびＣａｓ９分子；
    ｂ）請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮ
    Ａ分子、およびＣａｓ９分子をコードする核酸；
    ｃ）請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮ
    Ａ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子；
    ｄ）請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮ
    Ａ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子をコードする核酸；
    ｅ）上記のａ）～ｄ）のうちのいずれか、および鋳型核酸；
    ｆ）上記のａ）～ｄ）のうちのいずれか、および鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
    ；
    ｇ）請求項６１から９２または１０２から１０８のいずれかに記載の組成物；または
    ｈ）請求項１００から１０１のいずれかに記載のベクター
    と接触させるステップを含む方法。
  111. 前記ｇＲＮＡ分子または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、前記Ｃａｓ９分子また
    は前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸とを、単一の組成物中に製剤化する、請求項１０９
    に記載の方法。
  112. 前記ｇＲＮＡ分子または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、前記Ｃａｓ９分子また
    は前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸とを、１つを超える組成物中に製剤化する、請求項
    １０９に記載の方法。
  113. 前記１つを超える組成物を、同時に、または逐次的に送達する、請求項１１１に記載の
    方法。
  114. 前記細胞が、動物細胞である、請求項１０９から１１２のいずれかに記載の方法。
  115. 前記細胞が、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞である、請求項１０９から１１２のい
    ずれかに記載の方法。
  116. 前記細胞が、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）である、
    請求項１１４に記載の方法。
  117. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項１１５に記載の方
    法。
  118. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、請求項１１５から１１６のいずれかに記
    載の方法。
  119. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合せである、
    請求項１１７８に記載の方法。
  120. 前記細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されているか、または
    操作されることになる、請求項１１３から１１９のいずれかに記載の方法。
  121. 前記ＣＡＲが、
    （ａ）ＣＤ１９ ＣＡＲ；または
    （ｂ）ＢＣＭＡ ＣＡＲ
    である、請求項１１９に記載の方法。
  122. 前記ＣＡＲが、配列番号７８８３～配列番号７８９８のうちのいずれか１つを含む抗原
    結合性ドメインを含むＣＤ１９ ＣＡＲである、請求項１２０に記載の方法。
  123. 前記ＣＡＲが、ＣＤ１９ ＣＡＲであり、配列番号７９０８～配列番号７９２０のうち
    のいずれか１つを含む、請求項１２０および１２１のいずれかに記載の方法。
  124. 前記ＣＡＲが、配列番号７９３９～配列番号８１１２のうちのいずれか１つを含む抗原
    結合性ドメインを含むＢＣＭＡ ＣＡＲである、請求項１２０に記載の方法。
  125. 前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ ＣＡＲであり、配列番号８５４９～配列番号８６２１のうち
    のいずれか１つを含み、例えば、配列番号８５５９を含む、請求項１２０および１２３の
    いずれかに記載の方法。
  126. 前記細胞が、前記細胞を投与される患者に関して自家または同種異系である、請求項１
    １３から１２４のいずれかに記載の方法。
  127. 請求項１０９から１２４のいずれかに記載の方法により変更された細胞。
  128. 請求項１から６０のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子、または請求項６１から９２
    もしくは１０２から１０８のいずれかに記載の組成物、請求項９３から９９のいずれかに
    記載の核酸、または請求項１００から１０１のいずれかに記載のベクターを含む細胞。
  129. 動物細胞である、請求項１２６および１２７のいずれかに記載の細胞。
  130. 哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞である、請求項１２６から１２８のいずれかに記載
    の細胞。
  131. 免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）である、請求項１２９
    に記載の細胞。
  132. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項１３０に記載の細
    胞。
  133. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、請求項１３０から１３１のいずれかに記
    載の細胞。
  134. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合せである、
    請求項１３２に記載の細胞。
  135. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されているか、または操作されるこ
    とになる、請求項１２６から１３３のいずれかに記載の細胞。
  136. 前記細胞を投与される患者に関して自家である、請求項１２６から１３４のいずれかに
    記載の細胞。
  137. 前記細胞を投与される患者に関して同種異系である、請求項１２６から１３４のいずれ
    かに記載の細胞。
  138. 請求項１から６０のいずれかに記載の第２のｇＲＮＡ分子、または請求項１から６０の
    いずれかに記載の第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、含んでいるか、または
    含むことになり、前記第１のｇＲＮＡ分子と、第２のｇＲＮＡ分子とが、同一でないター
    ゲティングドメインを含む、請求項１２６から１３６のいずれかに記載の細胞。
  139. 前記第１のｇＲＮＡ分子が、同種異系Ｔ細胞標的の標的配列と相補的なターゲティング
    ドメイン（例えば、表１、３、４、または５に記載されているターゲティングドメイン）
    を含み、前記第２のｇＲＮＡ分子が、阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝
    達の下流のエフェクターの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む（例えば、
    表２または表６に記載されているターゲティングドメインを含む）、請求項１３７に記載
    の細胞。
  140. 前記阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターが、Ｃ
    Ｄ２７４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡ
    Ｍ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）
    、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、Ｃ
    Ｄ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳ
    Ｆ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｇ
    ＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータ、またはＰＴＰＮ１１である、請求項１３８に
    記載の細胞。
  141. 前記第１のｇＲＮＡ分子が、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ２４７、ＣＤ３
    Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含み、前
    記第２のｇＲＮＡ分子が、ＮＬＲＣ５の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含
    む、例えば、配列番号８６２２～配列番号１００８９のうちのいずれか１つを含む（例え
    ば、これからなる）ターゲティングドメインを含む、請求項１３７に記載の細胞。
  142. 前記第１のｇＲＮＡ分子が、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ２４７、ＣＤ３
    Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含み、前
    記第２のｇＲＮＡ分子が、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ または ＨＬＡ－Ｃの標的配
    列と相補的なターゲティングドメインを含む、請求項１３７に記載の細胞。
  143. 請求項１から６０のいずれかに記載の第３のｇＲＮＡ分子、または請求項１から６０の
    いずれかに記載の第３のｇＲＮＡ分子をコードする核酸をさらに含むか、含んでいるか、
    または含むことになり、前記第１のｇＲＮＡ分子と、前記第２のｇＲＮＡ分子と、前記第
    ３のｇＲＮＡ分子とが、同一でないターゲティングドメインを含む、請求項１３７および
    １４１のいずれかに記載の細胞。
  144. 前記第３のｇＲＮＡ分子が、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、またはＲＦＸＡＰ
    の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、請求項１４２に記載の細胞。
  145. 前記第３のｇＲＮＡ分子が、ＣＩＩＴＡの標的配列と相補的なターゲティングドメイン
    を含む、請求項１４３に記載の細胞。
  146. 前記第３のｇＲＮＡ分子が、配列番号７７１７～配列番号７８０４のうちのいずれか１
    つを含む、例えば、これからなるターゲティングドメインを含む、例えば、配列番号７７
    ６９、配列番号７７７１、または配列番号７７８５のうちのいずれか１つを含む、例えば
    、これからなるターゲティングドメインを含む、請求項１４４に記載の細胞。
  147. 前記第１のｇＲＮＡ分子が、ＴＲＡＣの標的配列と相補的なターゲティングドメインを
    含み；前記第２のｇＲＮＡ分子が、Ｂ２Ｍの標的配列と相補的なターゲティングドメイン
    を含み；前記第３のｇＲＮＡ分子が、ＣＩＩＴＡの標的配列と相補的なターゲティングド
    メインを含む、請求項１４２から１４５のいずれかに記載の細胞。
  148. 前記第１のｇＲＮＡ分子が、ＴＲＡＣの標的配列と相補的なターゲティングドメインを
    含み；前記第２のｇＲＮＡ分子が、ＮＬＲＣ５の標的配列と相補的なターゲティングドメ
    インを含み；前記第３のｇＲＮＡ分子が、ＣＩＩＴＡの標的配列と相補的なターゲティン
    グドメインを含む、請求項１４２から１４５のいずれかに記載の細胞。
  149. 前記第１のｇＲＮＡ分子が、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ２４７、ＣＤ３
    Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含み、前
    記第２のｇＲＮＡ分子が、ＮＲ３Ｃ１、ＤＣＫ、ＣＤ５２ または ＦＫＢＰ１Ａの標的配
    列と相補的なターゲティングドメインを含む、請求項１３７に記載の細胞。
  150. （１）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１～配列番号８３、および配列番号５４
    ９２～配列番号５５２７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号９６９～配列番号１３４５からなる群か
    ら選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１６９９～配列番号２０６８からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （５）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２０６９～配列番号２９４１からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （６）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５２７８～配列番号５４９１からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （７）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６２２７～配列番号６３２４からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （８）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６３２５～配列番号６５８３からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （９）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配
    列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１～配列番号８３、および配列番号５４
    ９２～配列番号５５２７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１０）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは
    配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号９６９～配列番号１３４５からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１１）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは
    配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１２）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは
    配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１６９９～配列番号２０６８からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１３）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは
    配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２０６９～配列番号２９４１からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１４）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは
    配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５２７８～配列番号５４９１からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１５）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは
    配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６２２７～配列番号６３２４からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１６）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは
    配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６３２５～配列番号６５８３からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１７）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１～配列番号８３、および配列番号５
    ４９２～配列番号５５２７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１８）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号９６９～配列番号１３４５からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１９）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１３４６～配列番号１６９８からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２０）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１６９９～配列番号２０６８からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２１）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２０６９～配列番号２９４１からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２２）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５２７８～配列番号５４９１からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２３）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６２２７～配列番号６３２４からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２４）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６３２５～配列番号６５８３からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２５）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１～
    配列番号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択されるタ
    ーゲティングドメインを含むか；
    （２６）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号９６
    ９～配列番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２７）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１３
    ４６～配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２８）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１６
    ９９～配列番号２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２９）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２０
    ６９～配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３０）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５２
    ７８～配列番号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３１）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６２
    ２７～配列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３２）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６３
    ２５～配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３３）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１
    ～配列番号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択される
    ターゲティングドメインを含むか；
    （３４）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号９
    ６９～配列番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３５）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１
    ３４６～配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３６）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１
    ６９９～配列番号２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３７）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２
    ０６９～配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３８）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５
    ２７８～配列番号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３９）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６
    ２２７～配列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４０）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６
    ３２５～配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４１）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１
    ～配列番号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択される
    ターゲティングドメインを含むか；
    （４２）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号９
    ６９～配列番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４３）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１
    ３４６～配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４４）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１
    ６９９～配列番号２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４５）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２
    ０６９～配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４６）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５
    ２７８～配列番号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４７）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６
    ２２７～配列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４８）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６
    ３２５～配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４９）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１
    ～配列番号８３、および配列番号５４９２～配列番号５５２７からなる群から選択される
    ターゲティングドメインを含むか；
    （５０）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号９
    ６９～配列番号１３４５からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （５１）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１
    ３４６～配列番号１６９８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （５２）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号１
    ６９９～配列番号２０６８からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （５３）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２
    ０６９～配列番号２９４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （５４）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号５
    ２７８～配列番号５４９１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （５５）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６
    ２２７～配列番号６３２４からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    または
    （５６）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号６
    ３２５～配列番号６５８３からなる群から選択されるターゲティングドメインを含む、
    請求項１３７に記載の細胞。
  151. 阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの標的配列
    と相補的なターゲティングドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記阻害性
    分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターが、ＣＤ２７４、Ｈ
    ＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、
    ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ
    、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７
    －Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４または
    ＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデ
    ノシン、およびＴＧＦベータ、またはＰＴＰＮ１１である、請求項１４９に記載の細胞。
  152. 前記第３のｇＲＮＡ分子が、請求項１５に記載の第３のｇＲＮＡ分子である、請求項１
    ５０に記載の細胞。
  153. （１）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９４２～配列番号３２７０からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （４）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４０３３～配列番号４５８９、および配
    列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含むか；
    （５）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５２８～配列番号５６２３、もしくは配
    列番号５８１６～配列番号５９６５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４５９０～配列番号５２７７からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （６）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配
    列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９４２～配列番号３２７０からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （７）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配
    列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （８）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配
    列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる群
    から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （９）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは配
    列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４０３３～配列番号４５８９、および配
    列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から選択されるターゲティングドメインを
    含むか；
    （１０）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６２４～配列番号５６４３、もしくは
    配列番号５９６６～配列番号６０９７からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４５９０～配列番号５２７７からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１１）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９４２～配列番号３２７０からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１２）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３２７１～配列番号３５４１からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１３）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３５４２～配列番号４０３２からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１４）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４０３３～配列番号４５８９、および
    配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含むか；
    （１５）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５６４４～配列番号５７１９、もしくは
    配列番号６０９８～配列番号６２２６からなる群から選択されるターゲティングドメイン
    を含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４５９０～配列番号５２７７からなる
    群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１６）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２９
    ４２～配列番号３２７０からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１７）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３２
    ７１～配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１８）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３５
    ４２～配列番号４０３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （１９）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４０
    ３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２０）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４～配列番号３９２からなる群から選
    択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４５
    ９０～配列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２１）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２
    ９４２～配列番号３２７０からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２２）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３
    ２７１～配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２３）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３
    ５４２～配列番号４０３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２４）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４
    ０３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２５）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号３９３～配列番号５３２からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４
    ５９０～配列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２６）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２
    ９４２～配列番号３２７０からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２７）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３
    ２７１～配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２８）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３
    ５４２～配列番号４０３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （２９）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４
    ０３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３０）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５３３～配列番号８３９からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４
    ５９０～配列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３１）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号２
    ９４２～配列番号３２７０からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３２）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３
    ２７１～配列番号３５４１からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３３）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号３
    ５４２～配列番号４０３２からなる群から選択されるターゲティングドメインを含むか；
    （３４）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４
    ０３３～配列番号４５８９、および配列番号５７２０～配列番号５８１５からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含むか；または
    （３５）前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号８４０～配列番号９６８からなる群から
    選択されるターゲティングドメインを含み、前記第２のガイドＲＮＡ分子が、配列番号４
    ５９０～配列番号５２７７からなる群から選択されるターゲティングドメインを含む、
    請求項１３７に記載の細胞。
  154. 前記第１のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインと、前記第２のｇＲＮＡ分子の
    前記ターゲティングドメインと、存在する場合、前記第３のｇＲＮＡ分子の前記ターゲテ
    ィングドメインとが、以下のうちのいずれかの配列：
    ａ）表３３の組合せＡ１～組合せＡ７２；
    ｂ）表３４の組合せＢ１～組合せＢ８４；
    ｃ）表３５の組合せＣ１～組合せＣ４２；
    ｄ）表３６の組合せＤ１～組合せＤ３６；
    ｅ）表３７の組合せＥ１～組合せＥ３０；または
    ｆ）表３８の組合せＦ１～組合せＦ６０
    を含む、例えば、これからなる、請求項１３７または請求項１４２に記載の細胞。
  155. 前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５６９、配列番号５５９２、または配列番号５
    ５８６を含むターゲティングドメインを含み、前記第２のｇＲＮＡ分子が、配列番号５７
    ７５を含むターゲティングドメインを含む、請求項１３７に記載の細胞。
  156. 前記第１のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝
    子、および、任意選択で、前記第２のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインに相補
    的な標的配列を含む遺伝子を、前記第１のｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインに
    相補的な標的配列を含む前記遺伝子、および、任意選択で、前記第２のｇＲＮＡ分子の前
    記ターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む前記遺伝子の機能的産物の発現を、
    低減するか、または消失させるように変更した、請求項１２６から１５４のいずれかに記
    載の細胞。
  157. 対象において抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項１
    ２６から１５５のいずれかに記載の細胞を投与するステップを含む方法。
  158. 腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、増殖性疾患、前がん性状態、がん、および前
    記腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症を有する対象を処置する方法であって、前
    記対象へと、有効量の、請求項１２６から１５５のいずれかに記載の細胞を投与するステ
    ップを含む方法。
  159. 前記腫瘍抗原の発現と関連する疾患が、がんまたは非がん関連適応症である、請求項１
    ５７に記載の方法。
  160. 前記疾患が、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、食
    道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫
    、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣がん、卵管癌、子宮内膜
    癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺
    がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児充実性腫瘍、膀
    胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ
    腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、
    扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘導性がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急
    性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）
    、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄
    性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バー
    キットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、
    小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マン
    トル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群
    、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュト
    ロームマクログロブリン血症、および前白血病、前記がんの組合せ、および前記がんの転
    移性病変から選択されるがんである、請求項１５８に記載の方法。
  161. 化学療法剤を投与するステップをさらに含む、請求項１５６から１５９のいずれかに記
    載の方法。
  162. 前記化学療法剤が、シクロホスファミド、フルダラビン、またはシクロホスファミドお
    よびフルダラビンである、請求項１６０に記載の方法。
  163. 前記対象へと、有効量の、請求項１２６から１５５のいずれかに記載の細胞を投与する
    ステップの前に、リンパ球枯渇剤または免疫抑制薬を投与するステップを含む、請求項１
    ５６から１６１のいずれかに記載の方法。
  164. 免疫療法のための細胞（例えば、細胞集団）を調製する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受
    容体（ＴＣＲ）の構成要素の発現を低減するか、または消失させることにより、細胞を改
    変するステップであって、前記細胞へと、請求項２ｂから２ｈのいずれかに記載のｇＲＮ
    Ａ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、例えば、請求項３、４、５、１０、１１ま
    たは１２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子を導入す
    ることを含むステップと；（ｂ）ＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、および／ま
    たはＨＬＡ－Ｃ）またはＢ２Ｍの発現を低減するか、または消失させることにより、細胞
    を改変するステップであって、前記細胞へと、請求項２ａ、２ｉ、２ｊまたは２ｋのいず
    れかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、例えば、請求項６また
    は７のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子を導入するこ
    とを含むステップと；（ｃ）前記細胞を拡大するステップとを含む方法。
  165. ＣＩＩＴＡの発現を低減するか、または消失させることにより、前記細胞を改変するス
    テップであって、前記細胞へと、請求項２ｐに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超え
    るｇＲＮＡ分子、例えば、請求項８または９のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、
    １つを超えるｇＲＮＡ分子を導入することを含むステップをさらに含み、前記細胞を拡大
    するステップの前に、前記改変するステップを、任意選択で行う、請求項１６３に記載の
    方法。
  166. 免疫療法のための細胞（例えば、細胞集団）を調製する方法であって、（ａ）Ｔ細胞受
    容体（ＴＣＲ）の構成要素の発現を低減するか、または消失させることにより、細胞を改
    変するステップであって、前記細胞へと、請求項２ｂから２ｈのいずれかに記載のｇＲＮ
    Ａ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、例えば、請求項３、４、５、１０、１１ま
    たは１２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子を導入す
    ることを含むステップと；（ｂ）免疫抑制薬の標的の発現を低減するか、または消失させ
    ることにより、細胞を改変するステップであって、前記細胞へと、請求項２ｌ、２ｍ、２
    ｎ、または２ｏのいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、
    例えば、請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子を導入す
    ることを含むステップと；（ｃ）前記細胞を拡大するステップとを含む方法。
  167. （ｄ）第１の阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクタ
    ーの発現を低減するか、または消失させることにより、細胞を改変するステップであって
    、前記細胞へと、請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子
    を導入することを含むステップをさらに含み、前記細胞を拡大するステップの前に、前記
    改変するステップを、任意選択で行う、請求項１６３から１６５のいずれかに記載の方法
    。
  168. 免疫療法のための細胞（例えば、細胞集団）を調製する方法であって、（ａ）第１の阻
    害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクターの発現を低減す
    るか、または消失させることにより、細胞を改変するステップであって、前記細胞へと、
    請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、例えば、請求項
    １５から１７のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子を導
    入することを含むステップと；（ｃ）前記細胞を拡大するステップとを含む方法。
  169. （ｅ）第２の阻害性分子、または阻害性分子を介するシグナル伝達の下流のエフェクタ
    ーの発現を低減するか、または消失させることにより、細胞を改変するステップであって
    、前記細胞へと、請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子
    を導入することを含むステップをさらに含み、前記第１の阻害性分子、または阻害性分子
    を介するシグナル伝達の下流のエフェクターと、第２の阻害性分子、または阻害性分子を
    介するシグナル伝達の下流のエフェクターとが異なる、請求項１６６から１６７のいずれ
    かに記載の方法。
  170. 前記ｇＲＮＡ分子の各々の前記導入が、同時的または逐次的である、請求項１６３から
    １６８のいずれかに記載の方法。
  171. 前記ｇＲＮＡ分子の各々の前記導入が、逐次的であり、少なくとも２４時間、２日間、
    ３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間隔てられる
    、請求項１６９に記載の方法。
  172. 前記細胞へと、例えば、本明細書で記載される、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコード
    する核酸を導入するステップをさらに含む、請求項１６３から１７０のいずれかに記載の
    方法。
  173. 前記ＣＡＲをコードする核酸を、鋳型核酸上に配置する、請求項１７１に記載の方法。
  174. 前記ＣＡＲをコードする核酸を、ＲＮＡベクター上に配置する、請求項１７１に記載の
    方法。
  175. 前記ＣＡＲをコードする核酸を、レンチウイルスベクター上に配置する、請求項１７１
    に記載の方法。
  176. ＴＣＲの発現について陰性である細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１６３
    から１６６または１６９から１７４のいずれかに記載の方法。
  177. 前記単離するステップが、前記細胞のうちの、約９０％、９１％、９２％、９３、９４
    ％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％を超えるものが、ＴＣＲ
    の発現について陰性である細胞集団を結果としてもたらす、請求項１７５に記載の方法。
  178. 前記ＴＣＲの発現について陰性である細胞を単離するステップが、前記細胞集団を、Ｔ
    細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素に特異的な抗体を含み、任意選択で、固体支持体または
    検出用標識に結合させた組成物と接触させること、および前記抗体に結合しない細胞を単
    離することを含む、請求項１７５または１７６に記載の方法。
  179. 前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項１６３から１７７のいずれかに記載
    の方法。
  180. 前記細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項１７８に記載の方法。
  181. 前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項１７８に記載の方法。
  182. 前記細胞を、健常ドナー、例えば、腫瘍抗原の発現と関連しない状態を患っていないド
    ナーから単離する、請求項１６３から１８０のいずれかに記載の方法。
  183. ステップ（ａ）および／または（ｂ）を、ｅｘ ｖｉｖｏで実施する、請求項１６３か
    ら１８１のいずれかに記載の方法。
  184. ステップ（ｃ）を、ｅｘ ｖｉｖｏで実施する、請求項１８２に記載の方法。
  185. ステップ（ｃ）の前記拡大を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
    １、１２、１３、１４、もしくは１５日間にわたり、または２～１５、２～１４、２～１
    ３、２～１２、２～１１、２～１０、３～１０、２～９、３～９、２～８、３～８、２～
    ７、３～７、２～６、３～６、２～５、もしくは３～５日間にわたり実施する、請求項１
    ６３から１８３のいずれかに記載の方法。
  186. それを必要とする対象を処置する方法であって、請求項１６３から１６４のいずれかに
    記載の方法により調製された細胞（例えば、細胞集団）を投与するステップを含む方法。
  187. それを必要とする対象を処置する方法であって、免疫抑制剤と組み合わせて、請求項１
    ６５に記載の方法により調製された細胞（例えば、細胞集団）を投与するステップを含む
    方法。
  188. 前記細胞（例えば、細胞集団）が、前記対象に対して自家である、請求項１８５から１
    ８６のいずれかに記載の方法。
  189. 前記細胞（例えば、細胞集団）が、前記対象に対して同種異系である、請求項１８５か
    ら１８６に記載の方法。
  190. 前記対象が、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、増殖性疾患、前がん性状態、が
    ん、および前記腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症を有し、前記投与が、前記腫
    瘍抗原の発現と関連する疾患を処置する、請求項１８５から１８８のいずれかに記載の方
    法。
  191. 前記腫瘍抗原の発現と関連する疾患が、がんまたは非がん関連適応症である、請求項１
    ８９に記載の方法。
  192. 前記疾患が、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、食
    道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫
    、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣がん、卵管癌、子宮内膜
    癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺
    がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児充実性腫瘍、膀
    胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ
    腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、
    扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘導性がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急
    性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）
    、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄
    性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バー
    キットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、
    小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マン
    トル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群
    、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュト
    ロームマクログロブリン血症、および前白血病、前記がんの組合せ、および前記がんの転
    移性病変から選択されるがんである、請求項１９０に記載の方法。
  193. 疾患を患っている患者を処置する方法であって、
    （ａ）同種異系ドナーに由来する細胞集団を用意するステップと；
    （ｂ）前記細胞へと、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ
    Ｃ１、およびＴＲＢＣ２から選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングド
    メインを含む、第１のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む
    、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ
    系）を導入するステップと；
    （ｃ）任意選択で、機能的ＴＣＲの発現を低減したか、または消失させた細胞を選択す
    るステップと；
    （ｄ）前記細胞に、ＣＡＲをコードする核酸を形質導入するステップと；
    （ｅ）前記細胞を、それを必要とする患者、例えば、前記ＣＡＲにより認識される抗原
    の発現と関連する疾患を有する患者へと投与するステップと
    を含む方法。
  194. ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ
    ２に対する前記第１のｇＲＮＡ分子が、請求項２（ｂ）～２（ｈ）のいずれかに記載のｇ
    ＲＮＡ分子である、例えば、請求項３、４、５、１０、１１、または１２のいずれかに記
    載のｇＲＮＡ分子である、請求項１９２に記載の方法。
  195. 前記細胞へと、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃから選択される遺伝
    子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子（または
    前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（
    S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップをさらに含む、請求
    項１９２から１９３のいずれかに記載の方法。
  196. Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃに対する前記第２のｇＲＮＡが、
    請求項２（ａ）または２（ｉ）～２（ｋ）のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子である、例え
    ば、請求項６または７のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子である、請求項１９４に記載の方
    法。
  197. 前記細胞へと、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸ５、ＨＬＡ－ＤＭ、Ｈ
    ＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＰから選択される遺伝子内
    の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第３のｇＲＮＡ分子（または前記
    ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. p
    yogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップをさらに含む、請求項１
    ９２から１９５のいずれかに記載の方法。
  198. 前記第３のｇＲＮＡ分子が、請求項２（ａ）または２（ｉ）～２（ｋ）のいずれかに記
    載のｇＲＮＡ分子である、例えば、請求項６または７のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子で
    ある、請求項１９６に記載の方法。
  199. 前記細胞へと、ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＦＫＢＰ１Ａ、またはＮＲ３Ｃ１から選択される遺
    伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ分子（また
    は前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌
    （S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップをさらに含む、請
    求項１９２から１９３のいずれかに記載の方法。
  200. ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＦＫＢＰ１Ａ、またはＮＲ３Ｃ１に対する前記第２のｇＲＮＡ分子
    が、請求項２（ｌ）～２（ｏ）のいずれかに記載の第２のｇＲＮＡ分子である、例えば、
    請求項１３に記載の第２のｇＲＮＡ分子である、請求項１９８に記載の方法。
  201. 前記第２のｇＲＮＡが、ＤＣＫに対するものであり、前記方法が、ヌクレオシド類似体
    ベースの薬物を、前記患者へと投与するステップをさらに含む、請求項１９８から１９９
    のいずれかに記載の方法。
  202. 前記ヌクレオシド類似体ベースの薬物が、シタラビンまたはゲムシタビンである、請求
    項２００に記載の方法。
  203. 前記第２のｇＲＮＡが、ＣＤ５２に対するものであり、前記方法が、抗ＣＤ５２抗体ま
    たはその抗原結合性断片を、前記患者へと投与するステップをさらに含む、請求項１９８
    から１９９のいずれかに記載の方法。
  204. 前記抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合性断片が、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（
    登録商標））である、請求項２０２に記載の方法。
  205. 前記第２のｇＲＮＡが、ＦＫＢＰ１Ａに対するものであり、前記方法が、ＦＫ５０６、
    シクロスポリン、ラパマイシンもしくはラパログ、またはＲＡＤ００１などのｍＴｏｒ阻
    害剤を、前記患者へと投与するステップをさらに含む、請求項１９８から１９９のいずれ
    かに記載の方法。
  206. 前記第２のｇＲＮＡが、ＮＲ３Ｃ１に対するものであり、前記方法が、コルチコステロ
    イドを、前記患者へと投与するステップをさらに含む、請求項１９８から１９９のいずれ
    かに記載の方法。
  207. 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾンである、請求項２０５に記載の方法。
  208. 前記細胞へと、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴ
    ＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、および／または
    ＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２
    Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、Ｈ
    ＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、Ｍ
    ＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータ、またはＰＴＰＮ１１から
    選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第４のｇＲＮ
    Ａ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、
    化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップをさ
    らに含む、請求項１９２から２０６のいずれかに記載の方法。
  209. 前記第４のｇＲＮＡ分子が、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、また
    はＰＴＰＮ１１に対するものであり、請求項１５（ａ）～（ｅ）のいずれかに記載のｇＲ
    ＮＡ分子、例えば、請求項１５から１７のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子である、請求項
    ２０７に記載の方法。
  210. 疾患を患っている患者を処置する方法であって、
    （ａ）免疫エフェクター細胞の集団を用意するステップと；
    （ｂ）前記細胞集団へと、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、Ｔ
    ＲＢＣ１、およびＴＲＢＣ２から選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティン
    グドメインを含む、第１のｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を
    含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳ
    ＰＲ系）を導入するステップと；
    （ｃ）前記細胞集団へと、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃから選
    択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第２のｇＲＮＡ
    分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、化
    膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと；
    （ｄ）任意選択で、機能的ＴＣＲ、機能的Ｂ２Ｍ、または機能的なＴＣＲおよびＢ２Ｍ
    の両方の発現を低減したか、または消失させた細胞を選択するステップと；
    （ｄ）前記細胞集団へとＣＡＲをコードする核酸を導入するステップと；
    （ｅ）前記細胞集団を、それを必要とする患者、例えば、前記ＣＡＲにより認識される
    抗原の発現と関連する疾患を有する患者へと投与するステップと
    を含む方法。
  211. （ｆ）前記細胞集団へと、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、およびＲＦＸＡＰか
    ら選択される遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、第３のｇＲ
    ＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）を含む、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば
    、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップ
    をさらに含む、請求項２０９に記載の方法。
  212. 前記第１のｇＲＮＡ分子が、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、およびＴＲＢＣ２から選択される
    遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、請求項２０９から２１０
    に記載の方法。
  213. 前記第２のｇＲＮＡ分子が、Ｂ２Ｍ遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティングドメ
    インを含む、請求項２０９から２１１に記載の方法。
  214. 前記第３のｇＲＮＡ分子が、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の標的配列に相補的なターゲティング
    ドメインを含む、請求項２１０から２１２に記載の方法。
  215. 前記第１のｇＲＮＡ分子が、ＴＲＡＣ遺伝子の配列をターゲティングし、配列番号５５
    ６９、配列番号５５８５、配列番号５５９２、配列番号５６０１、配列番号５５８９、配
    列番号５６００、配列番号５５９４、配列番号５５７１、配列番号５５９３、配列番号５
    ５７４、配列番号５５９８、配列番号５５８６、配列番号５５９９、配列番号５５９１、
    配列番号５６１０、配列番号５６０８、配列番号５６１７、配列番号５６１９、または配
    列番号５６２０のうちのいずれか１つを含む、例えば、これからなるターゲティングドメ
    インを含む、請求項２０９から２１３のいずれかに記載の方法。
  216. 前記第１のｇＲＮＡ分子が、配列番号５５６９、配列番号５５９２、配列番号５５８７
    、配列番号５５９９、配列番号５６００、配列番号５５８６、例えば、配列番号５５６９
    、配列番号５５８６、または配列番号５５９２のうちのいずれか１つを含む、例えば、こ
    れからなるターゲティングドメインを含む、請求項２１４に記載の方法。
  217. 前記第２のｇＲＮＡ分子が、Ｂ２Ｍ遺伝子の配列をターゲティングし、配列番号５５１
    ９、配列番号５４９７、配列番号５４９９、配列番号５４９８、配列番号５５０３、配列
    番号５４９６、配列番号５５０７、配列番号５５１５、配列番号５４９３、配列番号５５
    ０６、配列番号５５０９、配列番号５５１７、配列番号５５２１、配列番号５５２０、配
    列番号５５００、配列番号５４９４、配列番号５５０８、配列番号５５１４、または配列
    番号５４９２のうちのいずれか１つを含む、例えば、これからなるターゲティングドメイ
    ンを含む、請求項２０９から２１５のいずれかに記載の方法。
  218. 前記第２のｇＲＮＡ分子が、配列番号５４９６、配列番号５４９８、または配列番号５
    ５０９を含む、例えば、これからなるターゲティングドメインを含む、請求項２１６に記
    載の方法。
  219. 前記第３のｇＲＮＡ分子が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の配列をターゲティングし、配列番号７
    ７７１、配列番号７７６９、配列番号７７７３、配列番号７７２６、配列番号７７５８、
    配列番号７７３９、配列番号７７７９、配列番号７７７０、配列番号７７４９、配列番号
    ７７５４、配列番号７７４５、配列番号７７８５、配列番号７７３１、配列番号７７７２
    、配列番号７７４３、または配列番号７７５０のうちのいずれか１つを含む、例えば、こ
    れからなるターゲティングドメインを含む、請求項２１０から２１７のいずれかに記載の
    方法。
  220. 前記第３のｇＲＮＡ分子が、配列番号７７６９、配列番号７７７１、配列番号７７３９
    、または配列番号７７８５のうちのいずれか１つを含む、例えば、これからなるターゲテ
    ィングドメインを含む、請求項２１８に記載の方法。
  221. 前記細胞へと、ＮＫ阻害性分子をコードする核酸分子、例えば、ＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融
    合体をコードする核酸分子、例えば、配列番号１０６７４をコードする核酸分子を導入す
    るステップをさらに含む、請求項２０９から２１９のいずれかに記載の方法。
  222. 前記免疫エフェクター細胞の集団が、Ｔ細胞の集団である、請求項２０９から２２０の
    いずれかに記載の方法。
  223. 前記免疫エフェクター細胞の集団が、前記患者に対して同種異系である、請求項２２１
    に記載の方法。
  224. 前記ＣＡＲが、ＣＤ１９ ＣＡＲである、請求項２０９から２２２のいずれかに記載の
    方法。
  225. 前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ ＣＡＲである、請求項２０９から２２２のいずれかに記載の
    方法。
  226. 前記ＢＣＭＡ ＣＡＲが、配列番号７９３９～配列番号８１１２、または配列番号８１
    ５５～配列番号８１６６のうちのいずれか１つを含む抗原認識ドメインを含む、例えば、
    配列番号７９４９を含む、例えば、これからなる抗原認識ドメインを含む、請求項２２４
    に記載の方法。
  227. 前記ＢＣＭＡ ＣＡＲが、配列番号８５４９～配列番号８６２１のうちのいずれか１つ
    を含む、例えば、配列番号８５５９を含む、例えば、これからなる、請求項２２４に記載
    の方法。
  228. 同じ種類の非改変細胞と比べて、
    ａ）Ｔ細胞受容体の構成要素；
    ｂ）Ｂ２Ｍ；および／または
    ｃ）ＣＩＩＴＡ
    の発現を低減したか、または消失させた改変細胞。
  229. 前記Ｔ細胞受容体の構成要素が、ＴＣＲアルファ鎖またはＴＣＲベータ鎖である、請求
    項２２７に記載の細胞。
  230. 前記Ｔ細胞受容体の構成要素が、ＴＣＲアルファ鎖である、請求項２２７に記載の細胞
    。
  231. 前記ＴＣＲの構成要素が、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、またはＣＤ３ガンマであ
    る、例えば、ＣＤ３イプシロンである、請求項２２７に記載の細胞。
  232. 同じ種類の非改変細胞と比べて、
    ａ）Ｔ細胞受容体の構成要素をコードする遺伝子；
    ｂ）Ｂ２Ｍ；および／もしくは
    ｃ）ＣＩＩＴＡ；
    において、またはこれらの近傍において、塩基対、例えば、１つを超える塩基対の挿入ま
    たは欠失を含む改変細胞。
  233. 前記挿入または欠失の各々が、インデルである、請求項２３１に記載の改変細胞。
  234. 前記挿入または欠失の各々が、フレームシフト突然変異である、請求項２３１から２３
    ２のいずれかに記載の改変細胞。
  235. 請求項２３１から２３３のいずれかに記載の改変細胞を含み、前記細胞のうちの少なく
    とも約３０％において、少なくとも１つの前記挿入または欠失が、例えば、ＮＧＳにより
    測定されるフレームシフト突然変異である、細胞集団。
  236. 前記Ｔ細胞受容体の構成要素、Ｂ２Ｍ、およびＣＩＩＴＡの発現を、低減したか、また
    は消失させた、請求項２３１から２３４のいずれかに記載の改変細胞（または細胞集団）
    。
  237. （ｇ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
    （ｈ）任意選択で、例えば、本明細書で記載されるＮＫ阻害性分子をコードする核酸配
    列、例えば、本明細書で記載されるＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｇ：Ｂ２Ｍ融合体をコード
    する核酸；
    （ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、Ｃ
    Ｄ３Ｄ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺
    伝子の配列におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例え
    ば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｄ、またはＣＤ３Ｇ、例えば
    、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表１、表４、表５、表６
    ｅ、表６ｆ、または表６ｇに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的
    配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；
    （j）Ｂ２Ｍまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまたはこの
    近傍におけるインデル、例えば、Ｂ２Ｍに対するターゲティングドメインを含む、例えば
    、表１または表３に列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列にお
    けるまたはこの近傍におけるインデル；
    （k）任意選択で、ＣＩＩＴＡまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列に
    おけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＣＩＩＴＡに対するターゲティングド
    メインを含む、例えば、表１または表６ｃに列挙されるターゲティングドメインを含む、
    ｇＲＮＡの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；および
    （l）任意選択で、ＬＩＬＲＢ１またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列
    におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＬＩＬＲＢ１に対するターゲティン
    グドメインを含む、例えば、表６ｄに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮ
    Ａの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデルを含む細胞であって、
    前記細胞（または前記細胞を含む細胞集団）が、前記ＣＡＲと、任意選択で、前記ＮＫ
    阻害性分子とを発現し、ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢ
    Ｃ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）、ｉｉ）Ｂ２Ｍ、ｉｉ
    ｉ）ＣＩＩＴＡ、および／またはｉｖ）ＬＩＬＲＢ１のうちの１または複数の発現および
    ／または機能の、低減または消失を呈示する、
    細胞（例えば、これらを含む細胞、例えば、１つを超える細胞を含む細胞集団）。
  238. （ｇ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
    （ｈ）任意選択で、例えば、本明細書で記載されるＮＫ阻害性分子をコードする核酸配
    列、例えば、本明細書で記載されるＨＬＡ－Ｇをコードする核酸；
    （ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、Ｃ
    Ｄ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺
    伝子の配列におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例え
    ば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば
    、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表１、表４、表５、表６
    ｅ、表６ｆ、または表６ｇに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的
    配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；
    （ｊ）ＮＬＲＣ５またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまたは
    この近傍におけるインデル、例えば、ＮＬＲＣ５に対するターゲティングドメインを含む
    、例えば、表１に列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列におけ
    るまたはこの近傍におけるインデル；
    （ｋ）任意選択で、ＣＩＩＴＡまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列に
    おけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＣＩＩＴＡに対するターゲティングド
    メインを含む、例えば、表１または表６ｃに列挙されるターゲティングドメインを含む、
    ｇＲＮＡの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；および
    （ｌ）任意選択で、ＬＩＬＲＢ１またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列
    におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＬＩＬＲＢ１に対するターゲティン
    グドメインを含む、例えば、表６ｄに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮ
    Ａの標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデルを含む細胞であって、
    前記細胞（または前記細胞のうちの１もしくは複数を含む細胞集団）が、前記ＣＡＲと
    、任意選択で、前記ＮＫ阻害性分子とを発現し、ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡ
    Ｃ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ
    ）、ｉｉ）Ｂ２Ｍ、ｉｉｉ）ＮＬＲＣ５、および／またはｉｖ）ＬＩＬＲＢ１のうちの１
    または複数の発現および／または機能の、低減または消失を呈示する、
    細胞（例えば、これらを含む細胞、例えば、１つを超える細胞を含む細胞集団）。
  239. （ｄ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
    （ｅ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、Ｃ
    Ｄ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺
    伝子の配列におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例え
    ば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば
    、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表１、表４、表５、表６
    ｅ、表６ｆ、または表６ｇに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的
    配列におけるまたはこの近傍におけるインデル；および
    （ｆ）ＦＫＢＰ１Ａまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列におけるまた
    はこの近傍におけるインデル、例えば、ＦＫＢＰ１Ａに対するターゲティングドメインを
    含む、例えば、表１または表６ｂに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ
    の標的配列におけるまたはこの近傍におけるインデルを含む細胞であって、
    前記細胞（またはこれらを含む細胞、例えば、１つを超える細胞を含む細胞集団）が、
    前記ＣＡＲを発現し、ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ
    ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）、および／またはｉｉ）
    ＦＫＢＰ１２のうちの１または複数の発現および／または機能の、低減または消失を呈示
    する、
    細胞（例えば、これらを含む細胞、例えば、１つを超える細胞を含む細胞集団）。
  240. （ｄ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列；
    （ｅ）例えば、本明細書で記載されるラパマイシン耐性ｍＴｏｒをコードする核酸配列
    、例えば、Ｓ２０３５突然変異、例えば、Ｓ２０３５Ｉ突然変異を含むｍＴｏｒをコード
    する核酸配列；および
    （ｆ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、Ｃ
    Ｄ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺
    伝子の配列におけるまたはこの近傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例え
    ば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例えば
    、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、例えば、表１、表４、表５、表６
    ｅ、表６ｆ、または表６ｇに列挙されるターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的
    配列におけるまたはこの近傍におけるインデルを含む細胞であって、
    前記細胞（または前記細胞、例えば、前記細胞のうちの１つを超えるものを含む細胞集
    団）が、前記ＣＡＲと、前記ラパマイシン耐性ｍＴｏｒとを発現し、ＴＣＲの構成要素（
    例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、またはＣＤ３Ｇ、例
    えば、ＴＲＡＣ）の発現および／または機能の、低減または消失を呈示する、
    細胞（例えば、これらを含む細胞、例えば、１つを超える細胞を含む細胞集団）。
  241. ＴＣＲの構成要素に対するターゲティングドメインを含む前記ｇＲＮＡが、配列番号５
    ５６９、配列番号５５６８、配列番号５６０１、配列番号５５９２、配列番号５５８６、
    配列番号５５８７、配列番号５５９９、配列番号５６００、例えば、配列番号５５６９、
    配列番号５５８６、配列番号５５８７、または配列番号５５９２のうちのいずれか１つを
    含む（例えば、これからなる）ターゲティングドメインを含む、請求項２３６から２３９
    のいずれか一項に記載の細胞。
  242. Ｂ２Ｍに対するターゲティングドメインを含む前記ｇＲＮＡが、配列番号５４９６、配
    列番号５４９８、または配列番号５５０９のうちのいずれか１つを含む（例えば、これか
    らなる）ターゲティングドメインを含む、請求項２３６または２４０のいずれか一項に記
    載の細胞。
  243. ＣＩＩＴＡに対するターゲティングドメインを含む前記ｇＲＮＡが、配列番号７７３９
    、配列番号７７６９、配列番号７７７１、または配列番号７７８５のうちのいずれか１つ
    を含む（例えば、これからなる）ターゲティングドメインを含む、請求項２３６、２３７
    、２３９、２４０、または２４１のいずれか一項に記載の細胞。
  244. ＫＦＢＰ１Ａに対するターゲティングドメインを含む前記ｇＲＮＡが、配列番号６６９
    ３、配列番号６７０５、配列番号６６９４、配列番号６６９９、または配列番号６７０８
    のうちのいずれか１つを含む（例えば、これからなる）ターゲティングドメインを含む、
    請求項２３８、２４０、または２４１のいずれか一項に記載の細胞。
  245. ＴＣＲの構成要素に対するターゲティングドメインを含む前記ｇＲＮＡが、表６ｅ、表
    ６ｆまたは表６ｇ、例えば、表６ｅに列挙されるターゲティングドメインを含む（例えば
    、これからなる）ターゲティングドメイン、例えば、配列番号１０７２９、配列番号１０
    ７１９、配列番号１０７６４、配列番号１０６８９、配列番号１０７０１、配列番号１０
    ７００、または配列番号１０７２２のうちのいずれか１つを含む、請求項２３６から２３
    ９または２４１から２４３のいずれか一項に記載の細胞。
  246. 前記ＴＣＲの構成要素に対する前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメイン、Ｂ２
    Ｍに対する前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメイン、およびＣＩＩＲＡに対する
    前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、それぞれ、：
    ａ）表３３のＡ１～Ａ７２の任意の組合せに列挙される、前記ｇＲＮＡ分子の前記ター
    ゲティングドメイン配列；または
    ｂ）表３８のＦ１～Ｆ６０の任意の組合せに列挙される、前記ｇＲＮＡ分子の前記ター
    ゲティングドメイン配列
    を含む、例えば、これからなる、請求項２３６に記載の細胞。
  247. 前記ＴＣＲの構成要素に対する前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメイン、Ｂ２
    Ｍに対する前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメイン、およびＣＩＩＲＡに対する
    前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、それぞれ、表３４のＢ１～Ｂ８４の
    任意の組合せに列挙される、各ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメイン配列を含む、
    例えば、これからなる、請求項２３６に記載の細胞。
  248. 前記ＴＣＲの構成要素に対する前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメイン、およ
    びＦＫＢＰ１Ａに対する前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、それぞれ、
    表３５のＣ１～Ｃ４２の任意の組合せに列挙される、前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティ
    ングドメイン配列を含む、例えば、これからなる、請求項２３８に記載の細胞。
  249. 前記ＴＣＲの構成要素に対する前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメイン、およ
    びＦＫＢＰ１Ａに対する前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインが、それぞれ、
    ：
    ａ）表３６のＤ１～Ｄ３６の任意の組合せに列挙される、前記ｇＲＮＡ分子の前記ター
    ゲティングドメイン配列；または
    ｂ）表３７のＥ１～Ｅ３０の任意の組合せに列挙される、前記ｇＲＮＡ分子の前記ター
    ゲティングドメイン配列
    を含む、例えば、これからなる、請求項２３８に記載の細胞。
  250. 前記細胞内の前記インデルの各々を、前記細胞へと、各々が、前記インデルの各々にお
    いて、またはこの近傍において、標的配列に相補的なターゲティングドメインを含む、ｇ
    ＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子、例えば、
    前記１つを超えるｇＲＮＡ分子の各々を含む、ＣＲＩＳＰＲ系、例えば、１つを超えるＣ
    ＲＩＳＰＲ系）を導入することにより作製する、請求項２３６から２４８のいずれかに記
    載の細胞。
  251. 前記集団の前記細胞のうちの、少なくとも約３０％が、請求項２３６から２４９のいず
    れかに記載の細胞である、細胞集団。
  252. 集団の細胞のうちの、少なくとも約５０％が、請求項２３６から２４９のいずれかに記
    載の細胞である、細胞集団。
  253. 集団の細胞のうちの、少なくとも約７５％が、請求項２３６から２４９のいずれかに記
    載の細胞である、細胞集団。
  254. 集団の細胞のうちの、少なくとも約９０％が、請求項２３６から２４９のいずれかに記
    載の細胞である、細胞集団。
  255. 請求項２３６から２４９のいずれかに記載の細胞を含み、前記細胞のうちの、少なくと
    も約３０％において（例えば、少なくとも約４０％において、例えば、少なくとも約５０
    ％において、例えば、少なくとも約６０％において、例えば、少なくとも約７０％におい
    て、例えば、少なくとも約８０％において、例えば、少なくとも約９０％において、例え
    ば、少なくとも約９５％において、例えば、少なくとも約９９％において）、前記インデ
    ルの各々が、フレームシフト突然変異である、細胞集団。
  256. 図３４Ａ、図３４Ｂ、または図４９に列挙されるインデルを含む、請求項２３６から２
    ５４のいずれか一項に記載の細胞（または細胞集団）。
  257. 図３６または図４８に列挙されるインデルを含む、請求項２３６または２３９から２５
    ５のいずれか一項に記載の細胞（または細胞集団）。
  258. 図３８、図４１、図４４、または図５０に列挙されるインデルを含む、請求項２３６、
    ２３７、または２３９から２５６のいずれか一項に記載の細胞（または細胞集団）。
  259. 図５３に列挙されるインデルを含む、請求項２３８から２５７のいずれか一項に記載の
    細胞（または細胞集団）。
  260. 請求項２５５から２５８のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞集団。
  261. 細胞集団の前記細胞のうちの、少なくとも約２０％が、請求項２５５から２５８のいず
    れか一項に記載の細胞である、細胞集団。
  262. 細胞集団の前記細胞のうちの、少なくとも約５０％が、請求項２５５から２５８のいず
    れか一項に記載の細胞である、請求項２６０に記載の細胞集団。
  263. 細胞集団の前記細胞のうちの、約５％未満、例えば、約１％未満、例えば、約０．０１
    ％％未満が、オフターゲットインデルを含む、請求項２５９から２６１のいずれかに記載
    の細胞集団。
  264. キメラ抗原受容体を発現するように操作された、請求項２２７から２３５のいずれかに
    記載の細胞（または細胞集団）。
  265. 前記ＣＡＲが、ＣＤ１９ ＣＡＲである、請求項２３６から２６３のいずれかに記載の
    細胞（または細胞集団）。
  266. 前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ ＣＡＲである、請求項２３６から２６３のいずれかに記載の
    細胞（または細胞集団）。
  267. 前記ＢＣＭＡ ＣＡＲが、配列番号７９３９～配列番号８１１２、または配列番号８１
    ５５～配列番号８１６６のうちのいずれか１つを含む抗原認識ドメインを含む、例えば、
    配列番号７９４９を含む、例えば、これからなる抗原認識ドメインを含む、請求項２６５
    に記載の細胞（または細胞集団）。
  268. 前記ＢＣＭＡ ＣＡＲが、配列番号８５４９～配列番号８６２１のうちのいずれか１つ
    を含む、例えば、配列番号８５５９を含む、例えば、これからなる、請求項２６５に記載
    の細胞（または細胞集団）。
  269. 前記ＣＤ１９ ＣＡＲが、配列番号７８８３～配列番号７８９８のうちのいずれか１つ
    を含む抗原結合性ドメインを含む、請求項２６４に記載の細胞（または細胞集団）。
  270. 前記ＣＤ１９ ＣＡＲが、配列番号７９０９または配列番号７９２０を含む、請求項２
    ６４に記載の細胞（または細胞集団）。
  271. 前記細胞が、動物細胞である、請求項２２７から２６９のいずれかに記載の細胞（また
    は細胞集団）。
  272. 前記細胞が、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞、例えば、ヒト細胞である、請求項２
    ２７から２７０のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）。
  273. 前記細胞が、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）である、
    請求項２２７から２７１のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）。
  274. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項２７２に記載の細
    胞（または細胞集団）。
  275. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞である、請求項２７２から２７３のいずれかに記
    載の細胞（または細胞集団）。
  276. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはこれらの組合せである、
    請求項２７４に記載の細胞（または細胞集団）。
  277. 前記細胞を、健常ヒト対象から単離する、請求項２２７から２７５のいずれかに記載の
    細胞（または細胞集団）。
  278. 前記細胞が、前記細胞を投与される患者に対して同種異系である、請求項２２７から２
    ７６のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）。
  279. それを必要とする患者における疾患、例えば、がんを処置する方法であって、請求項２
    ２７から２７７のいずれかに記載の細胞を投与するステップを含む方法。
  280. 免疫抑制薬、例えば、ＲＡＤ００１と組み合わせて、請求項２２７から２７７のいずれ
    かに記載の細胞を投与するステップを含む、請求項２７８に記載の方法。
  281. 医薬としての使用のための、請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、請求
    項６１から９２もしくは１０２から１０８のいずれかに記載の組成物、請求項９３から９
    ９のいずれかに記載の核酸、請求項１００から１０１のいずれかに記載のベクター、また
    は請求項１２６から１５５もしくは２２７から２７７のいずれかに記載の細胞（または細
    胞集団）。
  282. 医薬の製造における使用のための、請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子
    、請求項６１から９２もしくは１０２から１０８のいずれかに記載の組成物、請求項９３
    から９９のいずれかに記載の核酸、請求項１００から１０１のいずれかに記載のベクター
    、または請求項１２６から１５５もしくは２２７から２７７のいずれかに記載の細胞（ま
    たは細胞集団）。
  283. 疾患の処置における使用のための、請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子
    、請求項６１から９２もしくは１０２から１０８のいずれかに記載の組成物、請求項９３
    から９９のいずれかに記載の核酸、請求項１００から１０１のいずれかに記載のベクター
    、または請求項１２６から１５５もしくは２２７から２７７のいずれかに記載の細胞（ま
    たは細胞集団）。
  284. 腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、増殖性疾患、前がん性状態、がん、および前
    記腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症である疾患の処置における使用のための、
    請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、請求項６１から９２もしくは１０２
    から１０８のいずれかに記載の組成物、請求項９３から９９のいずれかに記載の核酸、請
    求項１００から１０１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２６から１５５もし
    くは２２７から２７７のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）。
  285. 慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細
    胞性急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、
    慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病
    、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ
    腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リン
    パ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄
    腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質
    芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログロブリン血
    症、および前白血病からなる群から選択される血液がんであるがんの処置における使用の
    ための、請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、請求項６１から９２もしく
    は１０２から１０８のいずれかに記載の組成物、請求項９３から９９のいずれかに記載の
    核酸、請求項１００から１０１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２６から１
    ５５もしくは２２７から２７７のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）。
  286. 例えば、中皮腫、腺癌、神経膠芽腫、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非
    小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮
    膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣
    がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫
    、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎が
    ん、小児充実性腫瘍、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生
    物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カ
    ポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘導性がん、前記がんの組
    合せ、および前記がんの転移性病変からなる群から選択されるがんの処置における使用の
    ための、請求項１から６０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、請求項６１から９２もしく
    は１０２から１０８のいずれかに記載の組成物、請求項９３から９９のいずれかに記載の
    核酸、請求項１００から１０１のいずれかに記載のベクター、または請求項１２６から１
    ５５もしくは２２７から２７７のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）。
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