JP2021519820A - 植物水及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、糖尿病に関連する／糖尿病により引起される症状及び／又は副作用、及び／又はそれらと関連する病理学的状態の低減／軽減への使用のための、オリーブを圧搾して油を搾り取った水及び／又はオリーブ粉砕工程の搾りかす油の残留物に由来する、ポリフェノール化合物、例えばヒドロキシチロソール及び３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡに富んだ植物複合体又は天然の濃縮物に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、糖尿病及び／又はそれに関連する病的状態に関連する／それにより引起される症状及び／又は副作用の低減／軽減への使用のための、オリーブを圧搾して油を搾り取った水（植物水として一般的に知られている）及び／又はオリーブ粉砕工程の搾りかす油の残留物に由来する、ポリフェノール化合物に富んだ、特にヒドロキシチロソール及びオレウロペインアグリコン（３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡ）に富んだ天然植物複合体に関する。

糖尿病は、膵臓β細胞機能不全及び標的臓器のインスリン抵抗性によるインスリン欠乏により引起される多臓器疾患である。

糖尿病は、世界で６番目の障害の原因であり、そして世界の医療費は８２５億ドルと推定されている。実際、現在のライフスタイルのために、糖尿病の蔓延は２０１５年に約４億１５００万人が罹患していると推定され、そして２０４０年までに約６億４２００万人に増加するはずである。さらに、１億９３００万人が未診断の糖尿病に罹患していると推定される。

グルコースレベルの集中的な管理は、特に糖尿病に関連する罹患率及び死亡率の主要原因を表す微小血管合併症、例えば網膜症、腎症及び神経障害に関して、心血管及び脳血管リスクを低減することが実証されている。

白内障は、糖尿病患者の約２５％に現れる糖尿病のさらなる合併症を表す。その病因は、慢性高血糖症に関連しており、そして血糖値のレベルの厳密な制御が、その発症及び／又はその進行を防ぐために基本的であると考えられている。さらに、白内障が糖尿病患者の視力障害の主な原因の１つであり、白内障への外科的アプローチにも特定の複雑さをもたらすという事実を過小評価してはいけない。全体として、白内障は、とりわけ糖尿病の治療が不十分であり、白内障手術にアクセスできないことが多い発展途上国において、主要な健康及び経済的問題を表している。

グルコースの集中管理は、糖尿病の合併症を減らすことを目的としたかなり確立された慣行であるが、重度の低血糖症は、インスリンを投与されていない人でも１２ヶ月での死亡率が高くなっている。インスリンを含む安全で効果的な薬は、血糖値を１〜２％低める。

地中海式食事療法は、長期的な糖尿病合併症、及び他のメタボリックシンドローム、例えば肥満、アテローム性脂質異常症、高血圧及び慢性の軽度の炎症を阻止又は何れの場合でも、軽減するための重要なモデルとして提案されて来た。

実際、地中海式食事療法の重要な成分であるオリーブ及びオリーブ油は、強力な抗酸化活性を有することは良く知られている。同様に、オリーブの葉は、高血圧及び糖尿病の治療を目的としてヨーロッパ薬局方に最近、導入された抗酸化作用のある物質を含む。

従って、特に、公衆衛生を改善し、そして上記のような広範な病状のリスクを低め、そして／又は防止するために、オリーブ及びその誘導体の摂取に関連する新しい有益な効果を特定する必要が強く感じられている。

オリーブ加工からの廃棄物、例えば植物水が参照される場合、その必要性はさらに大きく感じられる。実際、植物水に関する多くの研究が行われているが、それらの廃棄物に価値をもたらす可能性のある新しい特性を特定する必要性が以前として強く感じられる。そうでなければ、生産者のコスト及び環境への危険に過ぎません。特に感じられるのは、この廃棄物の価値を高める可能性のある新しい栄養的及び／又は医学的／薬理学的特性を特定する必要性がある。

これに関して、出願人は、糖尿病及び／又はそれに関連する病的状態を治療するために植物水の使用を提案している。特に、出願人は、糖尿病及び／又はそれに関連する病的状態に関連する病状及び／又は副作用を低め／軽減するために植物水の使用を提案する。

実際、本出願の実施例において報告されているように、出願人は、本発明のポリフェノール濃縮物が、特認、以下でより詳細に説明されるであろうさらなる正の効果を明らかにすることに加えて、上記の症状及び／又は状態を軽減するために、痛みを伴う糖尿病性神経障害のモデルを用いて、有効であることを実証した。

特に、出願人は、本発明のポリフェノール濃縮物が以下の効果を示すことを実証した：
−多食症の低下、すなわち本発明の濃縮物による治療は、糖尿病の動物による食物の消費の有意な減少を誘発する；及び／又は
−多飲症の低下、すなわち本発明の濃縮物による治療は、糖尿病の動物による水の消費の有意な減少を誘発する；及び／又は
−血糖値の低下、すなわち本発明の濃縮物による治療は、血糖濃度を約８％低める；及び／又は
−糖化ヘモグロビンのレベルを約２４％低める；及び／又は
−白内障の進行を遅らせる；及び／又は
−機械的感受性の回復、すなわち糖尿病のラットにおいては、平均で約６６％の機械的感受性の低下が観察される；及び／又は
−熱に対する感受性の低下、すなわち糖尿病のラットにおいては、平均約７０％の熱に対する感受性の上昇が観察される；及び／又は
−糖尿病性病変の発症の結果として、神経伝導速度の回復が損なわれ（遅くなる）、すなわちポリフェノール濃縮物による治療が坐骨神経及び尾のレベルで、運動神経及び感覚神経を約８〜１０％改善する；及び／又は
−血漿及び腎臓の両方でチオバルピツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）の濃度の約２０〜２５％の低下；及び／又は
血漿トリグリセリド及びコレステロールレベルの約３９％の低下。

結論として、出願人によって実施された試験から、糖尿病、特に糖尿病性神経障害に関連する症状及び状態が、本発明のポリフェノール濃縮物による治療後、相当に改善することが明らかになった。

本発明のさらなる利点は、詳細な説明及び添付の図面から明らかになるであろう。

図１は、ＳＴＺ糖尿病ラット及び対照ラットに対するポリフェノール濃縮物又はＨＴによる治療の熱侵害受容閾値への影響を示す。誘発された糖尿病のＳＴＺラットは、対照と比較して、熱侵害受容閾値の上昇を示す。ポリフェノール濃縮物の投与は、侵害受容閾値を低めることができ、ところがＨＴの投与は有意な低下を誘発しない。

図２は、ＳＴＺ糖尿病ラット及び対照ラットに対するポリフェノール濃縮物又はＨＴによる治療の機械的侵害受容閾値への影響を示す。誘発された糖尿病のＳＴＺラットは、対照と比較して、機械的侵害受容閾値の低下を示す。ポリフェノール濃縮物及びＨＴの投与は、機械的侵害受容閾値を高めることができる。

図３は、糖尿病のラット及び対照に対する、ポリフェノール濃縮物及びＨＴによる治療の白内障進行への影響を示す。糖尿病のラットは、治療の９週目で白内障の発症を示す。濃縮物及びＨＴの両方による治療は、白内障の発症を軽減及び予防する。

定義：
本発明の文脈において、血糖とは、血中のグルコースの濃度を意味する。

本発明の文脈において、糖尿病とは、真性糖尿病として知られている病状のグループに分類できる慢性疾患を意味し、血液中の高濃度のグルコースにより特徴づけられ、次にヒトにおけるインスリン欠乏（絶対的又は相対的）、及び／又はその変更された使用（インスリン抵抗性）により引起される。糖尿病は、多尿症（豊富な尿の生成）、多飲症（豊富な水分摂取）及び多食症（過度の空腹）により特徴づけられる。

本発明の文脈において、糖尿病性神経障害とは、糖尿病により引起される神経系、特に脳から身体の異なる部分への情報の伝達に関与する神経線維への損傷及び／又は機能不全を意味する。

本発明の文脈において、痛みを伴う糖尿病性ニューロパシーとは、人体の１又は２以上の領域における慢性的な痛みと相関する糖尿病によるニューオロパシーを意味する。

本発明の文脈において、糖尿病性腎賞とは、腎能力の機能的及び／又は構造的に低下を意味する。

さらに、本発明の文脈において、白内障とは、水晶体の混濁を意味し、その重症度は、実施例に記載されている混濁の段階を各眼に帰する判定量的スケールに従って評価される。

本発明は、糖尿病、及び／又は糖尿病に関連する／糖尿病により引起される病状及び／又は合併症の治療及び／又は予防への使用のための、ポリフェノール化合物、好ましくはヒドロキシチロソール及び３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡを含む、植物水及び／又はオリーブ搾りかすの植物複合体又は濃縮物に関する。

この後、この植物複合体又は濃縮物は単に「濃縮物」又は「ポリフェノールの濃縮物」として参照される。

本発明のさらなる側面は、前記濃縮物、及び糖尿病、及び／又は糖尿病に関連する／糖尿病により引起される病状及び／又は合併症の治療及び／又は予防への使用のために薬理学的に許容される追加の賦形剤／成分を含む組成物に関する。

本発明の好ましい実施形態によれば、濃縮物及び／又は組成物は、糖尿病に関連する症状、及び／又は糖尿病に関連する／糖尿病により引起される病状／合併症を軽減／減衰／改善する目的で特に示される。

従って、本発明の好ましい側面によれば、濃縮物及び／又は組成物は、糖尿病に関連する／糖尿病により引起される病状及び／又は副作用、及び／又は糖尿病に関連する／糖尿病により引起される病状／合併症の治療及び／又は予防及び／又は軽減のために示される。

糖尿病は、好ましくはタイプ１（インスリン依存性）またはタイプ２（インスリン非依存性）である。

糖尿病に関連する／糖尿病により引起される前記病理／合併症が、好ましくは、糖尿病性神経障害、好ましくは痛みを伴う糖尿病性神経障害、腎症、膵臓の機能/構造の変化、網膜症、糖尿病性足及び血管運動の非自律的症状を伴う乾燥皮膚から選択される。

前記症状及び／又は前記副作用が、好ましくは、以下：高血糖の低下及び／又は糖化ヘモグロビンのレベルの上昇、白内障及び網膜症の発症及び／又は発達／進行、熱的及び機械的感受性の変化から選択される。

ある場合、糖尿病に関連する／糖尿病により引起される前記病状／合併症はまた、糖尿病に関連する／糖尿病により引起される症状及び／又は副作用であり得る。

本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、濃縮物及び／又は組成物は好ましくは、運動及び／又は感覚神経伝導速度を改善するために使用され、これは好ましくは、この病状により影響を受ける対象において低減される。

植物水は好ましくは、三相（油、植物水及び搾りかす）、及び／又は二相（油及び搾りかす＋植物水）オリーブ粉砕工程から誘導される。ミルにより生成された植物水は、好ましくは、酸性ｐＨ溶液により、好ましくは３〜５の範囲のｐＨで、好ましくは４／５で、例えば強酸及び／又はペクチン分解酸素、すなわちオリーブの皮のセルロースマトリックスを加水分解する酵素の添加により処理され得る。

オリーブ搾りかすは好ましくは、穴を開けられ、希釈され、そして／又は事前に濾過される。オリーブ搾りかすは好ましくは、０．５〜１ｍｍ、より好ましくは約０．７ｍｍの範囲の粒子サイズ又はカットオフを有する。粒子サイズの例は、振動スクリーンにより篩にかけることにより得られるものである。

穴の開けられたオリーブ搾りかすは、３〜５のｐＨ、好ましくは３．５〜４．０のｐＨの水性マトリックスに溶解されるか又は分散され得る。

可溶化工程は、オリーブの皮の固体マトリックスに閉じ込められたままになっているポリフェノールを可溶化することを目的としている。

本発明の好ましい実施形態によれば、濃縮物はさらに、以下を含むことができ：チロソール、クロロゲン酸、β-ヒドロキシベルバスコイド、ルチン、ベルバスコイド、及びルテオリンから好ましくは選択された少なくとも１つの追加のフェノール化合物；及び／又はナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びカリウムから好ましくは選択された少なくとも１つの金属；及び／又は塩化物、硫酸塩、リン酸塩及び硝酸塩から好ましくは選択された少なくとも１つのアニオン；及び／又はグルコース、フルクトース、マンニトール及びスクロースから選択された少なくとも１つの炭水化物。

本発明のさらなる実施形態によれば、濃縮物は、好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは２０〜４０ｍｇ／ｋｇ（活性溶液１Ｌ当たりの窒素のｍｇ）の量で、窒素性物質（タンパク質、アミノ酸）を含むことができる。

いずれにせよ、濃縮物中に最大量で存在するフェノール化合物は、ヒドロキシチロソール及び３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡである。

ヒドロキシチロソールの量は好ましくは、植物水１Ｌ当たり１〜１０ｇ（ｇ／Ｌ）、より好ましくは１．５〜５ｇ／Ｌ４、さらにより好ましくは２〜３ｇ／Ｌの範囲である。

３．４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡの量は好ましくは、０．５〜８ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜６ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは１．５〜２．５ｇ／Ｌである。

チロソールの量は好ましくは、０．１〜０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１５〜０．２５ｇ／Ｌである。

クロロゲン酸の量は好ましくは、０．０６〜０．２４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．８〜０．１６ｇ／Ｌである。

β−ヒドロキシベルバスコイドの量は好ましくは、０．３〜１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜１ｇ／Ｌである。

ルチンの量は好ましくは、０．０５〜０．２ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０８〜０．１５ｇ／Ｌである。

ベルバスコシドの量は好ましくは、０．４〜１．７ｇ／Ｌ、より好ましくは０．６〜１ｇ／Ｌである。

ルテオリンの量は好ましくは、０．１〜０．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１５〜０．２８ｇ／Ｌである。

ナトリウムの量は好ましくは、７５〜３００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１２０〜１８０ｍｇ／Ｌである。

カルシウムの量は好ましくは、５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは２〜５ｇ／Ｌである。

マグネシウムの量は好ましくは、２２０〜９００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４００〜５００ｍｇ／Ｌである。

カリウムの量は好ましくは、３〜１５ｇ／Ｌ、より好ましくは６〜９ｇ／Ｌである。

塩化物の量は好ましくは、１．５〜７ｇ／Ｌ、より好ましくは２．５〜４．５ｇ／Ｌである。

硫酸塩の量は好ましくは、１２〜４５ｇ／Ｌ、より好ましくは１８〜２８ｇ／Ｌである。

リン酸塩の量は好ましくは、１．５〜７ｇ／Ｌ、より好ましくは２．５〜５ｇ／Ｌである。

硝酸塩の量は好ましくは、１２〜５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１８〜３０ｍｇ／Ｌである。

グルコースの量は好ましくは、１５〜６０ｇ／Ｌ、より好ましくは２５〜３５ｇ／Ｌである。

フルクトースの量は好ましくは、３．５〜１５ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜９ｇ／Ｌである。

マンニトールの量は好ましくは、１〜４ｇ／Ｌ、より好ましくは１．５〜３ｇ／Ｌである。

スクロースの量は好ましくは、４〜１６ｇ／Ｌ、より好ましくは６〜１０ｇ／Ｌである。

本発明の好ましい実施形態によれば、濃縮物は、以下の工程：（ｉ）精密濾過の濃縮物及び透過液を得るために、植物水及び／又はオリーブ搾りかすのサンプルを精密濾過し；そして（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた精密透過液を逆浸透により濃縮する方法により得られる／得ることができる。

精密濾過は好ましくは、前述のような可溶化工程の後に実施される。

精密濾過は、濃縮物、すなわち懸濁液中の植物水／オリーブ搾りかすの内容物の濃縮画分、例えば微小断片、繊維及び小体材料、例えば細胞及び細菌を分離することを目的とする。それは、このタイプのマトリックスの標準条件下で実行される。

精密濾過工程に続いて、濃縮物に加えて、透過液、すなわち出発物質に応じて変化し、そして植物水／オリーブ搾りかすの溶解成分、例えばタンパク質、糖、塩、ポリフェノール、有機酸及び種々の可溶性有機分子を含む色により特徴付けられる透明な画分を得る。

精密濾過は好ましくは、少なくとも１つ、好ましくは２つのセラミック膜を用いて実施される。膜は、好ましくは、管状形状により特徴づけられる。

好ましい実施形態によれば、膜は、酸化アルミナ及び／又はジルコニアにより製造される。

膜は、好ましくは、以下の特性を有する：約３０〜約４０ｍｍ、好ましくは約２５ｍｍの範囲の外径；及び／又は約５００〜約１５００ｍｍ、好ましくは約１２００ｍｍの範囲の長さ；及び／又は約２．５〜約５ｍｍ、好ましくは約３．５ｍｍの範囲の直径、好ましくは水力直径を有する一連のチャネル；及び／又は約０．１５〜約０．７ｍ２、好ましくは約０．３５ｍ２の範囲の濾過表面；及び／又は約０．１ミクロン〜約３００ｋＤａの範囲の粒子サイズ、又は分子量カットオフ。

より好ましくは、膜は上記の全ての特性を有する。

前述のように、植物水／オリーブ搾りかすの精密濾過から得られた透過液を濃縮するための逆浸透工程は、このタイプのマトリックスの標準条件下で、より好ましくはポリアミドにより製造されたポリマー膜を用いることにより実行される。

特に、膜は、高い塩除去を伴う、すなわち塩化ナトリウム分子を９９．９％除去できる、螺旋状に巻かれた立体構造及び／又は分子量カットオフを有する。これは、浸透膜が生物医学的に関心のある分子を抑制し、そして水分子のみの通過を可能にすることを意味する。

ポリマー膜は好ましくは、約５〜約１５ｍ２、より好ましくは約７ｍ２の範囲の濾過表面を有する。

逆浸透工程は、精密濾過により得られた透過液を、好ましくは約４倍に濃縮することができ；これは１００Ｌの精密濾過透過液から、２５Ｌの濃縮物が得られることを意味する。

この場合、体積分率（ＶＣＲ）は、４、すなわち１００／２５である。

逆浸透工程は、濃縮されるマトリックスの浸透圧をオフセットすべきであるので、ＶＣＲは、開始マトリックス（植物水）に基づいて、及びとりわけ、その塩分に基いて変化できる。

本発明はさらに、上記方法により得ることができる／得られる植物水／オリーブ搾りかすの濃縮物（又は植物複合体）に関する。

ポリフェノール濃縮物は好ましくは、フェノール化合物、金属、炭水化物、アニオン及び窒素の含有量に関して前述した組成を有する。

本発明のさらなる側面によれば、上記の濃縮物及び／又は組成物は、単独で、又は糖尿病に対する保護及び／又は治療作用を有する他の物質、化合物、薬物又は組成物、例えばインスリン、経口血糖降下剤、既知であるか、又は潜在的に関心があり、そして研究中である抗糖尿病薬理学的活性、並びに物理的活性を有する他の物質と組合して使用される。

植物水及び／又はオリーブ搾りかすの濃縮物、及び／又は上記使用のための組成物は、好ましくは、経口投与のために、好ましくは飲料として処方される。本発明の飲料は、このタイプの製剤に通常存在する１又は２以上の任意の賦形剤をさらに含むことができる。

飲料は、好ましくは水及び／又は果物及び／又は牛乳ベースであり得る。本発明の特に好ましい実施形態によれば、飲料は、果物ベース、好ましくはブドウベース、好ましくはグレープジュース、そして／又はより好ましくは、有機ブドウベースであるべきである。

あるいは、植物水及び／又はオリーブ搾りかすの濃縮的、及び／又は上記の使用のために組成物は、トローチ、ピル、カプセル、錠剤などとして処方される。

言い換えれば、本明細書に見出され、そして記載される治療効果により、飲料及び／又は経口製剤は、好ましくは、前に記載されたように、糖尿病及び／又は、糖尿病に関連する／糖尿病により引起される病状及び／又は合併症を治療及び／又は予防するために、又は前に記載されたように、糖尿病に関連する／糖尿病により引起される病状及び／又は副作用、及び／又は糖尿病に関連する／糖尿病により引起される病状及び／又は合併症の治療のために栄養サプリメントとして摂取され得る。

飲料及び／又は経口製剤は任意には、その目的のために有用な１又は２以上のさらなる物質、化合物、薬物又は組成物と組合して摂取され得る。

あるいは、植物水及び／又はオリーブ搾りかすの濃縮物、及び／又は上記使用のための組成物は、好ましくは、クリーム、オイル、軟膏、エアゾール、ジェル、膣坐剤、スプレー、溶液、パッチ、ガーゼ、包帯、顆粒又は粉末として、局所適用のために処方される。前記製剤は、好ましくは、局所的に使用される場合、糖尿病に関連する／糖尿病により引起された症状及び／又は副作用、及び／又は前記のような糖尿病に関連する／糖尿病人より引起された病状及び／又は合併症、好ましくは糖尿病性足及び血管運動の非自律的症状を伴う乾燥肌の治療のために示される。

上記局所使用のための製剤は任意には、さらに、瘢痕形成、抗炎症、抗生物質、皮膚軟化、鎮静、鎮痛及びそれらの組み合わせから好ましくは選択された生物学的活性機能を有する剤／分子を含む。

ヒドロキシチロソールに比較して本発明のポリフェノール濃縮物の使用に関連する相当な利点は、糖尿病及び糖尿病性神経障害のいくつかの症状又は状態のより顕著な改善に加えて、その安価さにもある。濃縮物は、実際、石油産業の廃棄物である植物水及び／又はオリーブ搾りかすから入手可能であり、そして環境汚染物質であるために、適切に処方する必要があり、かなりの費用が発生する。

そのような廃棄物を使用して、複雑な装置又は機器を必要としない単純で安価な方法により、医薬、栄養補助食品及び食品添加物の分野で使用され得る効果的製品を得る可能性は、見られたように、相当の好ましくない効果に関連する、前に記載されたように、糖尿病、及び／又は糖尿病に関連する／糖尿病により引起される病状及び／又は合併症、特に神経障害の治療のために現在使用される薬物の使用、並びに純粋なヒドロキシチロソールの使用に変わるものにポリフェノール濃縮物をする。

薬理学的治療
濃縮物中のポリフェノールの存在の定量化を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により実施した。結果は、最大量で存在するポリフェノールが、５．５ｇ／Ｌで存在するヒドロキシチロソール（ＨＴ）であることを示している。純粋なヒドロキシチロソールは、Macker Chemie Italia (Milan)により供給された。本発明のＨＴ及び濃縮物投与量は、５０ｍｇ／ｋｇである。

動物
１８０〜２００ｇの体重の４８匹の雄のSprague-Dawley ラット (Harlan, Italy)を使用した。

糖尿病の誘発及び実験的治療
ラットにおけるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病の十分に確立されたモデルを使用した。ストレプトゾトシンは、ニトロソウレアのグルコサミン誘導体であり、膵島のβ細胞を選択的に破壊し、そして高血糖及び糖尿病を伴う糖尿病の発症を引起す。このモデルは、機能レベル及び生化学レベルの両方で、ヒト糖尿病合併症と一連の特性、例えば神経伝導の低下、皮膚における小径感覚神経線維の喪失、Ｎａ＋及びＫ＋−ＡＴＰａｓｅ活性の低下、及び熱的及び機械的侵害受容閾値の初期変化とを共有する。

この研究においては、糖尿病を、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解された６０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺの１回の腹腔内注射により２４匹のラットに誘発した。ビークルのみにより注射された２４匹のラットを、非糖尿病対照として使用した。高血糖が、Keto-Diaburストリップ (KD-5000; Roche Diagnostics Spa, Italy)を用いてのＳＴＺの注射の後、糖尿を測定することにより確認された。糖尿が５％以上の動物のみを、糖尿病として分類し、そして研究に含んだ。１匹のラットは基準を満たさず、そして試験から除外された。

次に、以下の治療グループに従って、飲料水中純粋なＨＴの５０ｍｇ／ｋｇ／日又は５０ｍｇ／ｋｇ／日のＨＴ等価用量で本発明の濃縮物を受け取るように動物をランダム化した：
（1） ビークルで治療された非糖尿病対照（ｎ ＝ ８）；
（2） 本発明の濃縮物で処理された非糖尿病対照、ＨＴ当量５０ｍｇ / ｋｇ /日（ｎ ＝ ８）；
（3） ＨＴ、５０ｍｇ / ｋｇ /日で治療された非糖尿病対照（ｎ ＝ ８）；
（4） ビークルで治療された糖尿病患者（ＳＴＺによる）（ｎ ＝ ８）；
（5） 本発明の濃縮物で治療された糖尿病患者（ＳＴＺによる）、ＨＴ当量５０ｍｇ ／ ｋｇ ／日（ｎ ＝ ８）；
（6） ＨＴ、５０ｍｇ / ｋｇ /日で治療された糖尿病患者（ＳＴＺによる）（ｎ ＝ ７）。

化合物の１日の用量を、ＳＴＺ又はビークルの注射後７週目から出発して投与した。治療は５週間続き、そして尿サンプルを採取した。次に、動物を犠牲にし、そして血漿、腎臓及び坐骨神経を除いた。犠牲は、濃縮物、ＨＴ又はビークルの最後の投与後２時間以内に起こった。

試験の間、ラットの体重増減を監視するために、毎週体重を測定した。高血糖が、ＳＴＺの注射の１５日後、適切な装置（Glucomen, Menarini, Italy）により尾の静脈から採取された血液中のグルコースレベルを測定することにより、全てのラットで確認された。３００ｍｇ／ｄＬを超える血漿グルコースレベルを、糖尿病として動物を定義するのは高血糖閾値として定義した。

熱侵害受容閾値
放射熱の侵害受容閾値を、ホットプレート試験を用いて定量化した。動物を収容するために、長さ４０ｃｍのプレキシガラスシリンダーを、ホットプレート（Ugo Basile, Varese, Italy）上に配置し；プレート温度を、５０±０．２℃で維持した。潜在時間は、ホットプレート上のラットの配置と、後足の引っ込め又は舐めの瞬間、又は動物により現れる不快感との間の経過時間として定義された。試験を、ＳＴＺ又はビークルの注射の１５日及び３０日後、本発明の濃縮物の投与の１週間後、及び犠牲の前に実施した。全ての動物を２回試験し；試験を、３０分の休息間隔で分け、そして値を平均化した。

機械的侵害受容閾値
機械的侵害受容閾値（Randall-Selitto試験）を、電気機械装置（Ugo Basile, Varese, Italy）を用いて評価した。この器具は、円錐型のピストンにより、ラットの後足の背面に直接加えられる線形の機械的な力を増加させる。結果は、足を引っ込めることで明らかになるように、動物により許容される最大圧力（ｇで表される）を表す。試験を、熱閾値の決定のために表された時間で実施した（上記を参照のこと）。全ての測定試験の間、動物を２回、試験し、１つの測定と他の測定との間に３０分の休息があり、そして値は２回の測定の平均である。

眼の検査及び白内障の分類
眼及び水晶体の混濁を、ＳＴＺ糖尿病モデルにおいて、白内障が現れる期間である糖尿病の誘発後７／８週から出発して毎週試験した。白内障の重症度を、検証された半定量的尺度を用いて分類した。特に、以下の評価スキーム及び以下の評点を使用した：
評点
フェーズ０：両眼で透明な水晶体 ０
フェーズ１：片方の目は透明、もう片方の目はわずかに
不透明な水晶体 １
フェーズ２：両方の水晶体がわずかに不透明 ２
フェーズ３：片方の目に成熟した白内障があり、
もう片方の目にわずかに不透明な水晶体 ３
フェーズ４：成熟した白内障を伴う両方の水晶体 ４

不透明度指数を、以下の式により、水晶体の不透明度を定量的に評価するために計算した：
不透明度指数＝各フェーズにおける眼の数×眼の段階／眼の総数

運動及び感覚伝導速度
電気生理学的研究を、携帯型筋電計（Alpine Biomed ApS DK-2740, Denmark）を用いて実施した。坐骨神経伝導の試験を、双極電極を使用して、アキレス腱及び尾の付着点での坐骨神経の上のくぼみの坐骨神経を単一の２２ｍｓの過最大パルスにより刺激することにより実施した。運動作用電位（ＣＭＡＰ）の測定値を、活性電極を、皮下組織、後足のつま先の最初の骨関節に配置し、そして参照電極を、同じ足の４番目の骨関節に配置することによって得た。運動伝導速度を、ミリ単位で測定された近位ＣＭＡＰの最初の負のピークの潜時を取る近位値から遠位置を差し引くことにより計算し、そしてその差を、ミリ単位で測定された２つの刺激電極間の距離により除算した。

感覚伝導速度を、足底神経を用いて決定した。足低神経の感覚神経活動電位（ＳＮＡＰ）を、記録電極（針）を、内側くるぶしの隣の股関節の高さの皮下組織に配置し、そして参照電極を約１ｃｍ近位に配置することにより測定した。円形刺激電極を、後足の３つの中指の中央に配置し、そして０．０５ｍｓ持続する方形パルス波により刺激を行い、そして電流強度の刺激はほとんどなかった。

感覚伝導速度を、ピーク電位の負の偏差での潜時、及び刺激電極と記録電極との間の距離を測定することにより計算した。運動及び感覚伝導速度を、ｍ／秒として表す。

尾部運動及び感覚伝導試験は、尾の感覚神経を、最大強度で０．０５ｍｓ持続する方形波パルスを用いて、尾の先端から２ｃｍの陰極及び遠位に陽極を挿入することにより刺激する必要がある。ＳＮＡＰを、陰極から５ｃｍの位置に活性電極及びより近位に１ｃｍの位置に参照電極を挿入することにより記録した。感覚神経伝導速度を、最初の負のたわみのピークでの潜時、及び刺激電極と記録電極との間の距離を測定することにより計算した。

尾の運動神経伝導を、双極記録構成を用いて得た。活性電極を、尾の先端から２ｃｍに配置し、そして参照電極を、１ｃｍ遠位に配置した。尾の運動神経を、最初に活性記録電極から近位に５ｃｍで、続いて近位に１０ｃｍで刺激した。運動神経伝導速度を、ミリ単位で測定された最初の負のピークから出発して、遠位ＣＭＡＰから近位ＣＭＡＰを差し引くことにより計算し；差は、ミリ単位で測定された２つの刺激電極間の距離により除算された。

チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）
５週間の治療期間の最後で、血漿及び腎臓を収集した。ＥＤＴＡ及びグルタチオンを、血漿及び腎臓ホモジネートにそれぞれ添加し、１．３４及び０．６５ｍモル／Ｌの最終濃度にした。ＴＢＡＲＳのレベルを、活性酸素種の生成の指標として決定した。１００μｌの血漿又は腎臓ホモジネートを、０．６ｍｌの１％リン酸（ｗ／ｖ）及び０．２ｍｌのチオバルビツール酸（０．４２ｍモル／ｌ）において４５分間、煮沸した。混合物を冷却し、そして次に、抽出を、それを１．２ｍｌのｎ−ブタノールと共に攪拌し、そして遠心分離（１５００ｇで１０〜２０分）により２つの相を分離することにより実施した。上相を、蛍光測定（nfinite M200; Tecan, Milan, Italy）を用いて、５３２ｎｍの励起波長及び５５３ｎｍの発光波長で測定した。検量線を、１．６４μモル／ｍｌの最終濃度で標準１，１，３，３，３−テトラエトキシプロパンを用いて調整した。

他の化学的分析
５週間の治療期間の最後で、尿及び血漿を収集し、市販の診断キットを用いて、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及び他のパラメーターを測定した。

統計学的分析
データを、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析し、治療及び疾患は独立変数として使用し、続いて、Student-Newman-Keuls post-hoc検定を行った。データを、平均±ＳＥＭとして報告した。ｐ＜０．０５の両側検定値は有意であると見なされた。全ての分析は、StatView 5 (SAS Institute Inc.)により実行された。

体重、毎日の食物及び水の摂取、血漿グルコース及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の変化
未治療の糖尿病ラットは、対照ラットよりも体重が低く、そして糖尿病グループにおける濃縮物及びＨＴの両方の投与は、この状況を変えなかった。濃縮物又はＨＴによる非糖尿病対照ラットの治療は、未治療対照ラットに比較して、体重の増加を示さなかった（表１ａ）。食物摂取の４０％上昇が、対照に比較して、ＳＴＺにより治療された糖尿病ラットにおいて観察された。５週間の治療の最後で、ポリフェノール濃縮物により治療されたグループ（ＨＴにより治療されたグループではない）は、多食病の２５％に対抗することができた（表１ａ）。同様に、ＳＴＺにより治療されたグループにおける毎日の水摂取の上昇が、ポリフェノール濃縮物により治療をされたグループにおいて低められた（表１ａ；多食症の減少）。

血糖値及びＨｂＡ１ｃ値は、未治療の糖尿病ラットにおいては有意に高められた。ＨｂＡ１ｃは、ポリフェノール濃縮物及びＨＴにより治療された両方のグループにおいて、それぞれ２４％及び２０％、有意に低められた（ＳＴＺにより治療されなかったグループ対してｐ＜０．０１）。濃縮物及びＨＴによる対照ラットの治療は、血漿又はＨｂＡ１ｃの値に影響を与えなかった。

表１ａ及び１ｂは、グループ当たりのラットの数（ｎ）当たりの平均±Ｓ．Ｅ．として値を要約する。比較を、一元配置分散分析により行った。ｐ＜０．０５ ｖｓ． ＣＴＲＬ、ＣＴＲＬ ＋ 濃縮物 又はＣＴＲＬ ＋ ＨＴ； ＊＊ ｐ＜０．０１ ｖｓ． ＣＴＲＬ、 ＣＴＲＬ ＋ 濃縮物又はＣＴＲＬ ＋ ＨＴ； ＊＊＊ ｐ＜０．００５ ｖｓ． ＣＴＲＬ、ＣＴＲＬ ＋ 濃縮物又は ＣＴＲＬ ＋ ＨＴ； ＊＊＊＊ ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＣＴＲＬ、ＣＴＲＬ ＋ 濃縮物又は ＣＴＲＬ ＋ ＨＴ； §§ ｐ＜０．０１ ｖｓ． ＳＴＺ。

腎臓及び血漿ＴＢＡＲＳ、総コレステロール（ＴＣ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の変化
ＳＴＺ誘発糖尿病は、腎臓及び血漿ＴＢＡＲＳを有意に高める（それぞれ、８６％及び５７％、ｐ＜０．０５）。濃縮物による治療は、ＴＢＡＲＳの血漿レベルを１８％低めた。表２に示されるように、ＴＣ、ＨＤＬ及びＴＧのレベルは、非糖尿病ラットに比較して、糖尿病ラットにおいて有意に上昇した（ｐ＜０．００１）。濃縮物の投与は、ＳＴＺ糖尿病グループに比較して、ＴＣの血漿レベルを有意に低めた（ｐ＜０．００１）。

下記表２は、本発明の濃縮物及びＨＴを補充された食餌が、血漿及び腎臓ＴＢＡＲＳ、並びに投与の最後での異なる実験グループにおけるラットのＴＣ、ＨＤＬ及びＴＧに及ぼす効果を要約している。

値は、グループ当たりｎ匹のラット当たりの平均±Ｓ．Ｅ．を表す。比較分析を、一元配置分散分析を用いて実施した。＊ ｐ＜０．０５ ｖｓ． ＣＴＲＬ、 ＣＴＲＬ ＋ 濃縮物又は ＣＴＲＬ ＋ ＨＴ； ＊＊＊＊ ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＣＴＲＬ、 ＣＴＲＬ ＋ 濃縮物又は ＣＴＲＬ ＋ ＨＴ； °° ｐ＜０．０１ ｖｓ． ＣＴＲＬ ＋ 濃縮物； § ｐ＜０．０５ ｖｓ． ＳＴＺ； §§§§ ｐ＜０．００１ ｖｓ． ＳＴＺ。

ＳＴＺ誘発糖尿病、及び濃縮物及びＨＴの投与の熱侵害受容閾値に対する効果
ＳＴＺ誘発糖尿病は、熱侵害受容閾値に有意に影響を与えた。５週期間の最後で、糖尿病ラットは、非糖尿病対照に比較して、６９％高い熱侵害受容閾値を示した（図１、ｐ＜０．００１）。ＨＴの投与は、統計学的有意性に達することなく、糖尿病ラットにおける熱侵害受容閾値の障害を低めた。５週間の治療の最後で、ポリフェノール濃縮物により治療されたグループは、未治療のＳＴＺラットに比較して、最低の閾値を示した。

ＳＴＺ誘発糖尿病、及び濃縮物及びＨＴの投与の機械的侵害受容閾値に対する効果
ＳＴＧ誘発糖尿病は、機械的侵害受容閾値に優位な影響を与えた（図２）。５週間の治療の最後で、閾値は、非糖尿病の動物と比較して、糖尿病の動物においては、６６％低められた。濃縮物及びＨＴの両方の投与は、機械的侵害受容閾値に対して有意な効果を有した（ｐ＜０．００１）。さらに、末治療のＳＴＺグループと、濃縮物及びＨＴにより治療された糖尿病ラットとの間でのRandall-Selitto試験の値に有意な差異が存在した。濃縮物及びＨＴの投与は、非糖尿病ラットにおける機械的侵害受容閾値に対する効果を有さなかった。

白内障の発症及び進行に対するＳＴＺ誘発糖尿病及び濃縮物及びＨＴの投与の効果
白内障の発症を、糖尿病の誘発後８週目から出発して１３週連続して週１回、評価した。図３は、実験グループの評点を示す。対照ラットの水晶体は、試験期間を通して評点０を得た。白内障の発症は、全グループにおいて９週目で発生した。評点の重症度は、末治療のＳＴＺグループの研究期間中、上昇し、そして１２週間目で最大の混濁（３．７の評点）を示した。本発明の濃縮物又はＨＴの投与は、白内障の重症度を低めた（図３）。５週目の最後で、末治療糖尿病動物の６７％が第４白内障期にあり、ところが濃縮物又はＨＴにより治療された糖尿病ラットの３０％のみが第４白内障期にあった。治療の最後での不透明度指数は、末治療の糖尿病ラットにおいて５．３であり、ＨＴにより治療された糖尿病ラットにおいて２．０であり、そして濃縮物により治療された糖尿病ラットにおいて１．６であった。

さらに、治療の最後で、濃縮物により治療されたグループは、ステージ０で白内障を伴う７つの眼をまだ有し；ＨＴにより治療されたグループもまた、ステージ０での３つの眼を有し、ところが末治療の糖尿病グループは、ステージ０で眼を有さなかった。

全体として、それらのデータは、濃縮物がＨＴよりもより効果的に糖尿病性白内障の発症を遅らせ、そして進行を遅らせることを強く示唆している。

尾及び挫骨神経伝導速度（ＮＣＶ）に対するＳＴＺ誘発糖尿病、及び濃縮物及びＨＴの投与の効果
尾の運動及び感覚伝導速度は、対照ラットに比較して、ビークルにより治療された糖尿病ラットにおいて５週で有意に減少した。濃縮物又はＨＴによる治療は、糖尿病ラットに比較して、尾のＮＣＶを有意に改善した（表３）。

以下の表３は、投与の最後（１２週目）での種々の実験グループにおけるラットの坐骨神経及び尾（ＮＣＶ）のＮＣＶに対する、ポリフェノール濃縮物及びＨＴによる治療の効果を要約する。

値は、平均±Ｓ．Ｅ．である。比較は、一元配置分散分析により行われた。* ｐ ＜０．０５ ｖｓ. ＣＴＲＬグループ; **** ｐ ＜０．００１ ｖｓ. ＣＴＲＬグループ。

５週間の治療期間中、対照ラットは、ｍ／ｓで約１０％のＮＣＶの予想される上昇を示した。対照的に、糖尿病ラットは、上昇を示さなかった。５週間の期間の最後で、ビークルにより治療された糖尿病ラットは、対照ラットと比較して、約１８％のＮＣＶの低下を有した。濃縮物又はＨＴにより治療されるラットは、１３〜２５％高いＮＣＶ値を有した。濃縮物もＨＴも、非糖尿病ラットのＮＣＶ値に対していずれの効果も示さなかった。

結論
本実施例のユニーク特性は、ヒト状態を忠実に再現するデータを提供するために、糖尿病の発症後に濃縮物及びＨＴによる治療を開始し、そして実験的に文書化された合併症を伴う１２週間の治療プロトコルの使用である。

本発明の濃縮物により治療されたラットは、未治療の糖尿病ラットに比較して、ＨｂＡ１ｃの２２〜２４％の低下を示し、これは、ＨｂＡ１ｃレベルの８．５％から７．０％への１．５％の低下に対応する。

それらのデータのかなりの関連性は、糖尿病性高血糖の制御と、網膜症、腎症、神経障害、癌及び／又は癌による死亡率を含む大血管及び微小血管合併症の発生率の低下との間の相関性に関する。ＨｂＡ１ｃのレベルの１％低下は、糖尿病に関連する死亡の２１％減少し、心筋梗塞の２１％減少し、そして微小血管合併症の３７％減少する。

さらに、濃縮物は、ＳＴＺにより治療された糖尿病ラットにおいて測定された血漿ＴＢＡＲＳの上昇を２０〜２５％減少させ、このことは、それらの天然化合物の抗酸化効果をインビボで実証している。

濃縮物は、糖尿病の動物における脂質化合物の低下に有利な特性を有する。実際、ＴＣにおける約２倍の上昇及びＴＧにおける約４倍の上昇が糖尿病ラットの血清において観察され、ところが濃縮物により治療された糖尿病は、それぞれ４０％及び２４％減少したレベルを示した。従って、データは、濃縮物による治療が糖尿病と相関するアテローム発生性合併症を低めることができることを強く示唆している。

最終的に、糖尿病性神経障害の発症及び進行を評価するための標準的エンドポイントである運動神経伝導速度及び感覚神経伝導速度の両方の評価を行った。データは、濃縮物が糖尿病により引起された軸索変性に、かなりの程度まで対抗したことを実証した。熱及び機械的侵害受容閾値は、非糖尿病動物と比較して、糖尿病動物において２倍以上であり、そして濃縮物はそれぞれ１５％及び６６％障害を低め、このことは、神経線維の機能に対する深刻な神経保護効果を間接的に実証している。

結論として、上記で報告されたデータは、長期の糖尿病合併症に対するポリフェノール濃縮物の潜在的な治療効果を明確に示している。実際、ラットにおける糖尿病の十分に確立されたモデアルにおける本発明の濃縮物による栄養補助食品は、種々の病理学的エンドポイントの退行をもたらした。

Claims (13)

1. 糖尿病の治療及び／又は予防への使用のための、及び／又は糖尿病に関連する／糖尿病により引起される症状及び／又は副作用、及び／又は糖尿病に関連する／糖尿病により引起される病理／合併症の治療及び予防及び／又は軽減のための、ヒドロキシチロソール及び３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡを含む、植物水及び／又はオリーブ搾りかすの濃縮物、及び／又は前記濃縮物を含む組成物。
2. ３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡが好ましくは、０．５〜０．８ｇ／Ｌ、より好ましくは、１〜６ｇ／Ｌ，さらにより好ましくは、１．５〜２．５ｇ／Ｌの量で存在し、そして／又はチロソールが好ましくは、０．１〜０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは、０．１５ｇ／Ｌ〜０．２５ｇ／Ｌの量で存在する、請求項１に記載の濃縮物及び／又は組成物。
3. 前記濃縮物がさらに、以下：
   −チロソール、クロロゲン酸、β−ヒドロキシベルバスコイド、ルチン、ベルバスコイド、及びルテオリンから好ましくは選択された少なくとも１つのフェノール化合物；及び／又は
   −ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びカリウムから好ましくは選択された少なくとも１つの金属；及び／又は
   −塩化物、硫黄塩、リン酸塩及び硝酸塩から好ましくは選択された少なくとも１つのアニオン；及び／又は
   −グルコース、フルクトース、マンニトール及びスクロースから選択された少なくとも１つの炭水化物；及び／又は
   −窒素、
   を含む、請求項１又は２に記載の濃縮物及び／又は組成物。
4. 前記濃縮物が、以下の工程：
   （ｉ）精密濾過の濃縮物及び透過液を得るために、植物水及び／又はオリーブ搾りかすのサンプルを精密濾過し；そして
   （ｉｉ）工程（ｉ）で得られた精密透過液を逆浸透により濃縮する方法により得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の濃縮物及び／又は組成物。
5. 前記精密濾過工程が、好ましくは管状形状により特徴づけされ、より好ましくは酸化アルミニウム及びジルコニアから製造された少なくとも１つのセラミック膜の使用を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の濃縮物及び／又は組成物。
6. 前記逆浸透が、好ましくは、（１）螺旋形状により特徴づけられ、そして／又は（２）ポリアミドを含む材料により製造された高分子膜の使用により実行される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の濃縮物及び／又は組成物。
7. 経口投与のために処方され、好ましくは飲料の形で、好ましくは果物ベース、好ましくはブドウジュース、及び／又はより好ましくは有機ブドウベースでなければならない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の濃縮物及び／又は組成物。
8. トローチ、ピル、カプセル、錠剤などとして処方される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の濃縮物及び／又は組成物。
9. 局所適用のために、好ましくはクリーム、オイル、軟膏、エアゾール、ジェル、膣坐剤、スプレー、溶液、パッチ、ガーゼ、包帯、顆粒又は粉末として処方される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の濃縮物及び／又は組成物。
10. 瘢痕形成、抗炎症、抗生物質、皮膚軟化、鎮静、鎮痛及びそれらの組み合わせから選択された生物学的活性機能を有する剤／分子をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の濃縮物及び／又は組成物。
11. 糖尿病に関連する／糖尿病により引起される前記病理／合併症が、糖尿病性神経障害、好ましくは痛みを伴う糖尿病性神経障害、腎症、膵臓の機能/構造の変化、網膜症、糖尿病性足及び血管運動の非自律的症状を伴う乾燥皮膚から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の濃縮物及び／又は組成物。
12. 前記症状及び／又は前記副作用が、以下：高血糖の低下及び／又は糖化ヘモグロビンのレベルの上昇、白内障及び網膜症の発症及び／又は発達／進行、熱的及び機械的感受性の変化から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の濃縮物及び／又は組成物。
13. 糖尿病に対する保護及び／又は治療効果を有する他の物質、化合物、薬物又は組成物と組合して、好ましくは、インスリン、経口血糖降下剤、及び既知の抗糖尿病薬理学的活性を有するか又は潜在的に関心があり、そして研究中の他の物質から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の濃縮物及び／又は組成物。

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