CN112312967A

CN112312967A - 植物水及其应用

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Publication number: CN112312967A
Application number: CN201980024086.2A
Authority: CN
Inventors: G·劳力阿品特; R·比安基; D·皮兹奇尼; G·洛弗兰科; A·洛弗兰科; B·洛弗兰科
Original assignee: Fattoria La Vialla di Gianni Antonio e Bandino Lo Franco Societa Agricola Semplice
Current assignee: Fattoria La Vialla di Gianni Antonio e Bandino Lo Franco Societa Agricola Semplice
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2021-02-02
Also published as: US20220387538A1; JP2021519820A; EP3773899A1; US20210046139A1; CA3095538A1; BR112020019729A2; WO2019186383A1; IT201800004123A1

Abstract

本发明涉及富含多酚化合物如羟基酪醇和3,4‑DHPA‑EDA的植物复合物或天然浓缩物，其来源于将橄榄压榨成油的水和/或橄榄碾磨过程中成为残余物的橄榄果渣，用于减轻/缓解与糖尿病相关/由糖尿病引起的症状和/或副作用和/或与之相关的病理状况。

Description

植物水及其应用

本发明涉及富含多酚化合物，特别是富含羟基酪醇和橄榄苦苷糖苷配基(oleuropein aglycone，3,4-DHPA-EDA)的天然植物复合物，其来源于将橄榄压榨成油的水(通常称为植物水)和/或橄榄碾磨过程中的果渣油残余物，用于减轻/缓解与糖尿病相关/由糖尿病引起的症状和/或副作用和/或与之相关的病理状况。

现有技术

糖尿病是由胰腺β细胞功能障碍和靶器官的胰岛素耐受引起的胰岛素缺乏导致的多器官疾病。

糖尿病是全世界致残的第六大原因，并导致全球医疗费用估计为8250亿美元。实际上，由于当今的生活方式，到2015年，糖尿病的传播范围估计为约4.15亿人，到2040年应增加到约6.42亿。此外，据估计，还有1.93亿人患有未经诊断的糖尿病。

已经证明，对葡萄糖水平的严格管理降低了心血管和脑血管的风险，特别是涉及诸如视网膜病变、肾病和神经病的微血管并发症，这是与糖尿病相关的发病率和死亡率的主要原因。

白内障是糖尿病的进一步并发症，约25％的糖尿病患者会出现白内障。其发病机理与慢性高血糖密切相关，并且据信严格控制血糖水平是基本要求，以防止其发展和/或进展。此外，不应低估以下事实，即白内障是糖尿病患者视力受损的主要原因之一，对于白内障的手术方法也构成了特殊的复杂性。总体而言，白内障是主要的健康和经济问题，尤其是在发展中国家，那里的糖尿病治疗不足，而且白内障手术通常难以获得。

尽管到目前为止，严格控制葡萄糖是减少糖尿病并发症的公认方法，但是严重的低血糖症与未接受胰岛素治疗的人在12个月时的死亡率较高相关。安全有效的药物(包括胰岛素)可将血糖水平降低1-2％。

已经提出将地中海饮食作为寻求阻止或在任何情况下减少长期糖尿病并发症和其他代谢综合征如肥胖、动脉粥样硬化性血脂异常、高血压和慢性低度炎症的重要模型。

实际上，众所周知，橄榄和橄榄油是地中海饮食中的重要成分，具有强大的抗氧化活性。同样，橄榄叶含有具有抗氧化作用的物质，最近已将其引入欧洲药典，以治疗高血压和糖尿病。

因此，仍然强烈需要确定与橄榄和衍生物的摄入相关的新的有益作用，特别是改善公众健康并减少和/或预防上述广泛性疾病的风险。

当提到来自橄榄加工的废产物，例如植物水时，甚至更加感到这种需要。实际上，尽管已经进行了许多关于植物水的研究，但是仍然非常需要确定可能为这些废品带来价值的新特性，否则这些特性只会给生产者带来成本，并且会危害环境。特别需要确定新的营养和/或医学/药理性质，以提高这种废物的价值。

在这方面，申请人建议使用植物水以治疗糖尿病和/或与其相关的病理状况。特别地，申请人提出使用植物水来减少/减轻与糖尿病相关/由糖尿病引起的症状和/或副作用和/或与之相关的病理状况。

实际上，如本申请的实施例中所报告的，申请人已经证明本发明的多酚浓缩物是有效的，特别是使用疼痛型糖尿病性神经病的模型，以减轻所列的症状和/或病症为目的，而且还表现出进一步的积极作用，将在下面更详细地描述。

具体地，申请人已经证明本发明的多酚浓缩物显示出以下效果：

-多食症的减少，即用本发明的浓缩物治疗引起糖尿病动物的食物消耗显著减少；和/或

-多饮症的减少，即用本发明的浓缩物进行治疗可显著减少糖尿病动物的饮水量；和/或

-降低血糖，即用本发明的浓缩物治疗使血糖浓度降低约8％；和/或

-糖化血红蛋白水平降低约24％；和/或

-白内障进展减慢；和/或

-机械敏感性的恢复，即在糖尿病大鼠中观察到机械敏感性平均降低约66％；和/或

-对热的敏感性降低，即在糖尿病大鼠中对热的敏感性平均提高了约70％；和/或

-由于糖尿病病理发作而受损(减慢)的神经传导速度恢复；即用多酚浓缩物进行处理可将坐骨神经和尾部水平的运动神经和感觉神经传导速度提高约8-10％；和/或

-血浆和肾脏中的硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)的浓度降低约20-25％；和/或

-血浆甘油三酸酯和胆固醇水平降低约39％。

总之，从申请人进行的测试中可以看出，与糖尿病相关的症状和病症，特别是糖尿病性神经病，在用本发明的多酚浓缩物治疗后得到了明显改善。

附图简要说明

通过详细描述和附图，本发明的其他优点将变得显而易见，其中：

图1显示了用多酚浓缩物或HT对STZ糖尿病大鼠和对照大鼠进行处理的热伤害感受阈值的影响。与对照组相比，患有糖尿病的STZ大鼠表现出热伤害感受性阈值的增加。给予多酚浓缩物能够降低伤害阈值，而给予HT不会引起明显的降低。

图2显示了用多酚浓缩物或HT对STZ糖尿病大鼠和对照大鼠进行处理的机械伤害感受阈值的影响。与对照组相比，患有糖尿病的STZ大鼠表现出机械伤害感受阈值的降低。给予多酚浓缩物和HT能够增加机械伤害感受阈值。

图3显示了用多酚浓缩物和HT对糖尿病大鼠和对照组进行处理的白内障发展的影响。糖尿病大鼠在处理后第九周出现白内障发作。用浓缩物和HT处理均可减少和预防白内障的发作。

定义

在本发明的上下文中，血糖是指血液中葡萄糖的浓度。

在本发明的上下文中，糖尿病是指可归类为糖尿病的一种慢性疾病，其特征在于由人体内胰岛素缺乏(绝对或相对)和/或其用途改变(胰岛素耐受)导致的血液中高浓度的葡萄糖。糖尿病的特征是多尿(尿液过多)，多饮(水摄入过多)和多食(饥饿过度)。

在本发明的上下文中，糖尿病性神经病是指由糖尿病引起的神经系统的损害和/或功能失常，特别是负责将信息从大脑传递到身体不同部位的神经纤维。

在本发明的上下文中，疼痛型糖尿病性神经病是指与人体内的一个或多个区域的慢性疼痛相关的糖尿病引起的神经病。

在本发明的上下文中，糖尿病性肾病是指肾容量的功能和/或结构性降低。

此外，在本发明的上下文中，白内障是指晶状体的混浊，其严重性是根据半定量量表评估的，该半定量的量表将每一只眼睛归因于实施例中所述的混浊阶段。

发明详述

本发明涉及植物水和/或橄榄果渣的植物复合物或浓缩物，其包含多酚化合物，优选羟基酪醇和3,4-DHPA-EDA，用于治疗和/或预防糖尿病和/或与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理和/或并发症。

在下文中，将简单地以“浓缩物”或“多酚浓缩物”的形式提及该植物复合物或浓缩物。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其包含浓缩物和药理学上可接受的赋形剂/成分，用于治疗和/或预防糖尿病和/或与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理和/或并发症。

根据本发明的优选实施方案，特别指出浓缩物和/或组合物的目的是减少/减轻/改善与糖尿病相关的症状和/或与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理/并发症。

因此，根据本发明的优选方面，所述浓缩物和/或组合物被指示用于治疗和/或预防和/或减轻与糖尿病相关/由糖尿病引起的症状和/或副作用和/或与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理/并发症。

糖尿病优选为1型(胰岛素依赖性)或2型(非胰岛素依赖性)。

所述与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理/并发症优选选自：糖尿病性神经病，优选疼痛型糖尿病性神经病，肾病，胰腺功能/结构的改变，视网膜病，糖尿病足和伴有血管舒缩功能障碍的皮肤干燥。

所述症状和/或所述副作用优选选自：高血糖症的减轻和/或糖化血红蛋白水平的升高，白内障和视网膜病变的发作和/或发展/进展，以及热和/或机械敏感性的改变。

在某些情况下，所述与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理/并发症也可以是与糖尿病相关/由糖尿病引起的症状和/或副作用。

在本发明的另一个优选实施方案中，优选将浓缩物和/或组合物用于改善运动神经和/或感觉神经的传导速度，在受该病理影响的对象中优选降低运动和/或感觉神经传导速度。

所述植物水优选来自三相(油，植物水和果渣)和/或两相(油和果渣+植物水)橄榄碾磨过程。优选用酸性pH溶液(优选地pH 3-5，优选4/5，例如通过添加强酸)和/或果胶分解酶(即水解橄榄皮的纤维素基质)，来处理由研磨产生的植物水。

优选将橄榄果渣去核、稀释和/或预过滤。橄榄果渣的粒度或截留值(cut-off)优选为0.5至1毫米(mm)，更优选为约0.7mm。粒度的一个实例是通过用振动筛筛分而获得的粒度。

可以将去核的橄榄果渣溶解或分散在pH值为3至5，优选3.5至4.0的水性基质中。

溶解步骤的目的是使多酚溶解，否则多酚会保留在橄榄皮的固体基质中。

在本发明的一个优选的实施方案中，浓缩物可以进一步包含：至少一种另外的酚类化合物，其优选选自：酪醇，绿原酸，β-羟基毛蕊花甙(β-hydroxyverbascoide)，芸香苷(rutin)，毛蕊花甙(verbascoide)和藤黄菌素(luteolin)；和/或至少一种金属，其优选选自：钠，钙，镁和钾；和/或至少一种阴离子，其优选选自：氯离子，硫酸根，磷酸根和硝酸根；和/或至少一种碳水化合物，选自：葡萄糖，果糖，甘露醇和蔗糖。

本发明其他实施方案中，浓缩物包括含氮物(蛋白质、氨基酸)，优选含量为15-60mg/kg，更优选20-40mg/kg(mg氮/L活性溶液)。

任何情况中，浓缩物中存在的最大量的酚类化合物是羟基酪醇和3,4-DHPA-EDA。

优选地，羟基酪醇的含量范围为1-10克/L植物水(g/L)，更优选1.5-5g/L，更优选2-3g/L。

优选地，3,4-DHPA-EDA的含量为0.5-8g/L，更优选1-6g/L，更优选1.5-2.5g/L。

优选地，酪醇的含量为0.1-0.4g/L，更优选0.15-0.25g/L。

优选地，氯原酸的含量为0.06-0.24g/L，更优选0.8-0.16g/L。

优选地，β-羟基毛蕊花甙的含量为0.3-1.5g/L，更优选0.5-1g/L。

优选地，芸香苷的含量为0.05-0.2g/L，更优选0.08-0.15g/L。

优选地，毛蕊花甙的含量为0.4-1.7g/L，更优选0.6-1g/L。

优选地，藤黄菌素的含量为0.1-0.5g/L，更优选0.15-0.28g/L。

优选地，钠的含量为75-300mg/L，更优选120-180mg/L。

优选地，钙的含量为5-10g/L，更优选2-5g/L。

优选地，镁的含量为220-900mg/L，更优选400-500mg/L。

优选地，钾的含量为3-15g/L，更优选6-9g/L。

优选地，氯化物的含量为1.5-7g/L，更优选2.5-4.5g/L。

优选地，硫酸盐的含量为12-45g/L，更优选18-28g/L。

优选地，磷酸盐的含量为1.5-7g/L，更优选2.5-5g/L。

优选地，硝酸盐的含量为12-50mg/L，更优选18-30mg/L。

优选地，葡萄糖的含量为15-60g/L，更优选25-35g/L。

优选地，果糖的含量为3.5-15g/L，更优选5-9g/L。

优选地，甘露醇的含量为1-4g/L，更优选1.5-3g/L。

优选地，蔗糖的含量为4-16g/L，更优选6-10g/L。

在本发明的优选实施方案中，浓缩物通过/可通过包含下述步骤的方法获得：(i)微过滤植物水和/或橄榄果渣的样品，以获得浓缩物和微过滤的透过物；和(ii)通过反渗透处理步骤(i)的微过滤透过物来进行浓缩。

优选地，微过滤在前述溶解步骤之后进行。

微过滤目的在于分离浓缩物，即悬液中植物水/橄榄果渣的内含物的浓缩组分，例如微片段、纤维和微粒材料例如细胞和细菌。其在此类基质的标准条件下进行。

除了浓缩物以外，通过微过滤步骤可获得透过物，即澄清组分，其特征为与起始材料不同的颜色以及含有植物水/橄榄果渣中的溶解组分，例如蛋白质、糖、盐、多酚、有机酸和各种可溶性有机分子。

优选地，用至少一种，优选两种陶瓷膜进行微过滤。所述膜优选特征为管状。

在优选的实施方案中，所述膜由氧化铝和氧化锆制成。

优选地，所述膜具有下述特征：外直径约30-40mm、优选约25mm；和/或长度约500-1500mm、优选约1200mm；和/或一系列通道，其直径(优选水压直径)约2.5-5mm、优选约3.5mm；和/或过滤表面约0.15-0.7m²、优选约0.35m²；粒度或分子重量截留值为约0.1微米-约300kDa。

更优选地，膜具有上述所有特征。

如上所述，用于浓缩从植物水/橄榄果渣的微过滤获得的透过物的反渗透步骤是在用于这类基质的标准条件下进行的，优选通过使用聚合物膜，更优选由聚酰胺制成的膜。

具体地，所述膜具有卷绕螺旋形状以及高脱盐率的分子截留值，即能脱除99.9％的氯化钠分子。这意味着渗透膜捕获感兴趣的生物医药分子并仅允许水分子通过。

优选地，聚合物膜的过滤面积为约5-15m²，更优选约7m²。

反渗透步骤能够浓缩获自微过滤的透过物，优选浓缩约4倍；这表示100L微过滤透过物会得到25L浓缩物。

在这种情况下，体积浓度比(VCR)为4，即100/25。

基于起始基质(植物水)，尤其是基于其盐含量，VCR可发生变化，这是由于反渗透过程必须抗衡将要浓缩的基质的渗透压。

本发明还涉及获自/可获自上述过程的植物水/橄榄果渣的浓缩物(或植物复合物)。

浓缩物优选具有前述组成，涉及酚类化合物、金属、糖、阴离子和氮的含量。

根据本发明的另一方面，如上所述的浓缩物和/或组合物可以单独使用或与对糖尿病具有预防和/或治疗作用的其他物质、化合物、药物或组合物组合使用，例如胰岛素，口服降糖药，已知的或潜在感兴趣的以及正在研究中的其他具有抗糖尿病药理活性的物质，以及与体育锻炼相结合。

优选将用于上述用途的植物水和/或橄榄果渣的浓缩物和/或组合物配制成用于口服给予，优选作为饮料。根据本发明的饮料可以进一步包含一种或多种通常存在于这种类型的制剂中的赋形剂。

饮料可以优选基于水和/或水果和/或牛奶。在本发明的特别优选的实施方案中，饮料基于水果，优选地基于葡萄，优选地是葡萄汁和/或葡萄液，更优选地是有机葡萄。

或者，用于上述用途的前述植物水/橄榄果渣的浓缩物和/或组合物可以配制成锭剂、丸剂、胶囊剂、片剂等。

换句话说，凭借本文发现和描述的治疗效果，可以将饮料和/或口服制剂作为饮食补充剂，优选用于治疗和/或预防糖尿病和/或与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理和/或并发症，如前所述，或用于治疗与糖尿病相关/由糖尿病引起的症状和/或副作用和/或与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理和/或并发症，如前所述。

饮料和/或口服制剂可以任选地与一种或多种用于该目的的其他物质、化合物、药物或组合物结合使用。

或者，将用于上述用途的植物水和/或橄榄果渣的浓缩物和/或组合物配制成用于局部施用，优选为乳膏、油、软膏、气雾剂、凝胶、阴道栓剂、喷雾剂、溶液、贴剂、纱布、绷带、颗粒或粉末的形式。所述制剂，优选当局部施用时，优选用于治疗与糖尿病相关/由糖尿病引起的症状和/或副作用，和/或如前所述与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理和/或并发症，优选选自：糖尿病足和伴有血管舒缩功能障碍的皮肤干燥。

上述用于局部使用的制剂还任选地包含具有生物活性功能的试剂/分子，所述生物活性功能优选选自：愈合，抗炎，抗菌，润肤，舒缓，镇痛及其组合。

与羟基酪醇相比，与使用本发明的多酚浓缩物有关的显著优点除了对糖尿病和糖尿病性神经病的几种症状或病症的更明显改善之外，还在于其廉价。实际上，浓缩物可从植物水和/或橄榄果渣中获得，它们是油工业的废料，并且作为环境污染物，必须适当处置，从而导致可观的成本。

通过这种不需要复杂设备或仪器的简单且廉价的方法，可以使用此类废料来获得可用于制药、营养学和食品添加剂领域的有效产品，从而使多酚浓缩物成为有效的替代品，替代目前使用的用于治疗糖尿病和/或如上所述的与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理和/或并发症的药物，特别是神经病变，正如已经看到的，其与相当明显的不良后果有关，以及代替使用纯的羟基酪醇。

实施例

药理学处理

通过HPLC(高效液相色谱)对浓缩物中多酚的存在进行定量。结果表明，存在量最大的多酚是羟基酪醇(HT)，含量为5.5g/l。纯羟基酪醇由意大利马科化学公司(MackerChemie Italia)(米兰)提供。HT和本发明的浓缩物的剂量为50mg/kg。

动物

使用48只雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(意大利哈兰)，体重为180-200g。

诱导糖尿病和实验处理

使用已建立的链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的大鼠糖尿病模型。链脲佐菌素是亚硝基脲的葡糖胺衍生物，可选择性破坏胰岛的β细胞，并导致糖尿病和高血糖症和糖尿症的发展。该模型在功能水平和生化水平上均具有人类糖尿病并发症的一系列特征，例如神经传导减少，皮肤中小直径感觉神经纤维丢失，Na+和K+的ATP酶活性降低，以及热和机械伤害感受阈值的早期改变。

在这项研究中，通过腹膜内注射60mg/kg溶于柠檬酸钠缓冲液(pH4.5)的STZ，在24只大鼠中诱发糖尿病。仅注射载剂的24只大鼠用作非糖尿病对照。高血糖症是通过使用Keto-Diabur胶条(KD-5000；罗氏诊断公司(Roche Diagnostics Spa)，意大利)在STZ注射后72小时测量糖尿来证实的。只有糖尿>5％的动物被归类为糖尿病并纳入研究。一只不符合标准的大鼠被排除在试验之外。

然后根据以下处理组将动物随机分为接受饮用水中50mg/kg/天HT等效剂量的本发明浓缩物或50mg/kg/天纯HT：

(1)用载剂处理的非糖尿病对照(n＝8)；

(2)用根据本发明的浓缩物处理的非糖尿病对照，HT当量为50mg/kg/天(n＝8)；

(3)用HT处理的非糖尿病对照，剂量为50mg/kg/天(n＝8)；

(4)用载剂处理的糖尿病对象(由于STZ)(n＝8)；

(5)用根据本发明的浓缩物处理的糖尿病患者(由于STZ)，HT当量为50mg/kg/天(n＝8)；

(6)用HT处理的糖尿病对象(由于STZ)，剂量为50mg/kg/天(n＝7)。

从注射STZ或载剂后的第7周开始每天给予化合物。处理持续了5周，并采集了尿液样本。然后处死动物，并获取血浆、肾脏和坐骨神经。在最后一次给予浓缩物、HT或载剂后2小时内进行处死。

在试验过程中，每周对大鼠称重以监测其体重增加/减少。在注射STZ 15天后，通过使用合适的仪器(Glucomen，美纳里尼(Menarini)，意大利)测量从尾静脉采集的血液中的葡萄糖水平，从而在每只大鼠中证实了高血糖。血浆葡萄糖水平高于300mg/dL被定义为动物糖尿病的高血糖阈值。

热伤害感受阈值

辐射热的伤害感受阈值使用热板测试进行量化。将一个40厘米长的有机玻璃圆柱体放在加热板上(乌戈巴西勒(Ugo Basile)，瓦雷泽，意大利)，以容纳动物；板温度保持在50±0.2℃。潜伏时间定义为大鼠在加热板上的位置到后爪退缩或舔食或动物表现出的不适之间的时间。在注射STZ或载剂后15天和30天，在给予本发明的浓缩物后1周并且在处死之前进行测试。每只动物都要接受两次测试；测试间隔30分钟，然后取平均值。

机械伤害感受阈值

机械伤害感受阈值(Randall-Selitto测试)使用机电设备(Ugo Basile，瓦雷泽，意大利)进行评估。该仪器通过锥形活塞产生直接施加在大鼠后爪背面的线性机械力。结果代表动物所忍受的最大压力(以克表示)，由爪回缩表现出来。在用于确定热阈值指示的时间进行测试(参见上文)。在每次测量测试的过程中，对动物进行两次测试，两次测量之间的休息间隔为30分钟，值为两次测定的平均值。

眼科检查和白内障分类

从糖尿病诱发后的第七周/第八周开始，每周检查一次眼睛和晶状体的不透明度，在STZ糖尿病模型中，白内障会在这段时期内表现出来。白内障严重程度使用经过验证的半定量量表进行分类。具体地，使用以下评估方案和以下评分：

通过以下公式计算不透明度指数，以定量评估晶状体的不透明度：

运动和感觉传导速度

使用便携式肌电图仪(Alpine Biomed ApS DK-2740，丹麦)进行电生理研究。坐骨神经传导的测试是通过使用双极电极，以单个2.2ms超最大脉冲刺激跟腱中和尾部附着点处坐骨神经上方空洞中的坐骨神经来进行的。通过将有源电极放置在皮下组织中，后爪脚趾的第一骨间肌中，以及将参比电极放置在同一爪的第四骨间肌中，可以测量运动动作电位(CMAP)。通过以近端CMAP的第一个负峰的潜伏期从近端值中减去远端值，以毫秒为单位，并且将差值除以两个刺激电极之间的距离(以毫米为单位)，来计算运动传导速度。

采用足底神经测定感觉传导速率。足底神经的感觉神经动作电位(SNAP)是通过将记录电极(针)放置在靠近内踝的髋部水平的皮下组织中和将参比电极放置在约1cm附近来测量的。将圆形刺激电极放置在后爪的三个中间脚趾的中间，用持续时间仅为0.05ms的方波进行刺激，几乎没有超最大电流强度刺激。

通过测量在峰值电势的负偏差下的潜伏时间和刺激电极与记录电极之间的距离来计算感觉传导速度。运动和感觉传导速度表示为米/秒。

尾巴运动和感觉传导测试要求采用在超最大强度下持续0.05ms的方波脉冲下，通过插入距尾尖2cm的阴极和远端1cm的阳极，刺激尾部的感觉神经。通过将有源电极离开阴极5cm插入，将参比电极距近端1cm插入，从而记录SNAP。感觉神经传导速度是通过测量第一个负偏斜的峰值处的潜伏期以及刺激电极和记录电极之间的距离来计算的。

使用双极记录配置获得了尾部运动神经传导。有源电极位于距尾尖2cm处，参比电极则位于距远端1cm处。尾部的运动神经最初在距有源记录电极近端5cm处受到刺激，随后在近10cm处受到刺激。从第一个负峰值开始，从远端CMAP中减去近端CMAP，以毫秒为单位；该差异除以两个刺激电极之间的距离(以毫米为单位)，计算运动神经传导速度。

硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)

在5周的处理期结束时，收集血浆和肾脏。将EDTA和谷胱甘肽添加到血浆和肾脏匀浆中，最终浓度分别为1.34和0.65mmol/L。确定TBARS的水平作为活性氧物质产生的指标。将100μL血浆或肾脏匀浆在0.6mL的1％磷酸(w/v)和0.2mL的硫代巴比妥酸(0.42mmol/L)中煮沸45分钟。将混合物冷却，然后通过将其与1.2ml正丁醇搅拌并通过离心(在1500g下10-20分钟)分离两相进行萃取。使用荧光测定法(Infinite M200；Tecan，米兰，意大利)在激发波长为532nm和发射波长为553nm下测量上层相。用标准的1,1,3,3,3-四乙氧基丙烷以1.64μmol/mL的最终浓度制备校准曲线。

其他生化分析

在为期5周的处理期结束时，收集尿液和血浆，使用市售诊断试剂盒测量甘油三酸酯(TG)，总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白(HDL)和其他参数的水平。

统计学分析

通过双向方差分析(ANOVA)分析数据，将处理和疾病作为自变量，然后进行Student-Newman-Keuls事后检验。数据表示为平均值±SEM。两尾检验值p<0.05被认为是显著的。所有分析均使用StatView 5(SAS Institute Inc.)进行。

体重、每日食物和水摄入量、血浆葡萄糖和糖化血红蛋白(HbA1c)的变化

未处理的糖尿病大鼠的体重低于对照大鼠，在糖尿病组中给予浓缩物和HT均未改变这种情况。与未处理的对照大鼠相比，用浓缩物或HT处理非糖尿病对照大鼠未显示体重增加(表1a)。与对照组相比，用STZ处理的糖尿病大鼠的食物摄入量增加了40％。在5周处理结束时，用多酚浓缩物处理的组能够抵抗25％的多食症(但是用HT处理的组不能)(表1a)。同样，在用多酚浓缩物处理的组中，用STZ处理的组的每日饮水量增加有所减少(表1a；多饮症的减少)。

未处理的糖尿病大鼠的血糖和HbA1c值显著增加。在多酚浓缩物和HT处理的两组中，HbA1c均显著降低，分别降低了24％和20％(与未用STZ处理的组相比，p<0.01)。用浓缩物和HT处理的对照大鼠不影响血糖或HbA1c值。

表1a

表1b

表1a和1b总结了值，表示为每组大鼠数量(n)的平均值±S.E.。用单向ANOVA检验进行比较。p<0.05，相对于对照，对照+浓缩物，或对照+HT；**p<0.01，相对于对照，对照+浓缩物，或对照+HT；***p<0.005，相对于对照，对照+浓缩物，或对照+HT；****p<0.001，相对于对照，对照+浓缩物，或对照+HT；§§p<0.01，相对于STZ。

肾脏和血浆中TBARS、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和甘油三酯(TG)的变化

STZ诱导的糖尿病显著增加了肾脏和血浆的TBARS(分别为86％和57％，p<0.05)。用浓缩物处理使TBARS的血浆水平降低18％。如表2所示，与非糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠中TC、HDL和TG的水平显著增加(P<0.001)。与STZ糖尿病组相比，给予浓缩物显著降低TC(P<0.001)，TG(P<0.05)和LDL(P<0.05)的血浆水平。

下表2总结了给予结束时，给予本发明的浓缩物和HT的饮食对不同实验组的大鼠血浆和肾脏TBARS以及TC，HDL和TG的影响。

表2

值表示为每组的大鼠数量(n)的平均值±S.E.。采用单向ANOVA检验进行比较分析。*p<0.05，相对于对照，对照+浓缩物，或对照+HT；****p<0.001，相对于对照，对照+浓缩物，或对照+HT；°°p<0.01，相对于对照+浓缩物；§p<0.05，相对于STZ；§§§§p<0.001，相对于STZ。

STZ诱导的糖尿病以及给予浓缩物和HT对热伤害感受阈值的影响

STZ诱导的糖尿病显著影响热伤害感受阈值。在5周的时间结束时，糖尿病大鼠的热伤害感受阈值比非糖尿病对照高69％(图1，p<0.001)。给予HT降低了糖尿病大鼠的热伤害感受阈值的受损情况，但没有达到统计学显著性。在5周治疗结束时，与未处理的STZ大鼠相比，用多酚浓缩物处理的组显示出最低的阈值。

STZ诱导的糖尿病以及给予浓缩物和HT对机械伤害感受阈值的影响

STZ诱导的糖尿病显著影响机械伤害感受(图2)。在5周处理结束时，与非糖尿病动物相比，糖尿病动物的阈值降低了66％。给予浓缩物和HT对机械伤害阈值有显著影响(p<0.001)。此外，未处理的STZ组与用浓缩物和HT处理的糖尿病大鼠之间的Randall-Selitto检验值存在显著差异。给予浓缩物和HT对非糖尿病大鼠的机械伤害感受阈值没有影响。

STZ诱导的糖尿病以及给予浓缩物和HT对白内障发展和进展的影响

从诱发糖尿病后的第八周开始，连续13周每周评估一次白内障的发展。图3显示了各实验组的评分。在整个试验期间，对照大鼠的晶状体得分为0。所有组均在第9周出现白内障发作。未处理的STZ组在研究期间严重性评分增加，第12周最大浑浊度(评分为3.7)。给予本发明的浓缩物或HT可降低白内障的严重程度(图3)。在第五周结束时，未处理的糖尿病动物中有67％处于白内障的阶段4，而用浓缩物或HT处理的糖尿病大鼠中只有30％处于白内障阶段4。在未处理的糖尿病大鼠中，处理疗结束时的不透明度指数是5.3，在用HT处理的糖尿病大鼠中是2.0，在用浓缩物处理的糖尿病大鼠中是1.6。

此外，在处理结束时，用浓缩物处理的组中仍然有7只眼睛处于白内障阶段0；用HT处理的组也有3只眼睛处于阶段0，而未处理的糖尿病组没有眼睛处于阶段0。

总体而言，这些数据强烈表明，与HT相比，浓缩物更有效地延迟了糖尿病的发作并减缓了糖尿病性白内障的进展。

STZ诱导的糖尿病以及给予浓缩物和HT对尾部和坐骨的神经传导速度(NCV)的影响

与对照大鼠相比，用载剂处理的糖尿病大鼠在5周时的尾部运动和感觉传导速度显著降低。与未处理的糖尿病大鼠相比，用浓缩物或HT处理显著改善了尾部NCV(表3)。

下表3总结了在给予结束时(第12周)用多酚浓缩物和HT处理对各个实验组中大鼠的坐骨神经和尾部的NCV(NCV)的影响。

表3

值是平均值±S.E.。采用单向ANOVA检验进行比较。*p<0.05，相对于对照组；****p<0.001，相对于对照组。

在为期5周的处理期间，对照组大鼠显示出预期的NCV增加，约为10％，以m/s计。相比之下，糖尿病大鼠没有增加。在5周时间结束时，与对照大鼠相比，用载剂处理的糖尿病大鼠的NCV降低约18％。用浓缩物或HT处理的大鼠的NCV值高13-25％。浓缩物和HT均未显示对非糖尿病大鼠NCV值的任何影响。

结论

本实施例的独特特征是使用12周的治疗方案，其中在糖尿病发作后开始用浓缩物和HT进行治疗，并在实验中记录并发症，以提供能够忠实再现人类状况的数据。

与未处理的糖尿病大鼠相比，用本发明的浓缩物治疗的大鼠显示HbA1c降低22-24％，对应于HbA1c水平降低1.5％，从8.5％降低至7.0％。

这些数据的显著相关性涉及糖尿病高血糖控制与减少大血管和微血管并发症发生率(包括视网膜病变，肾病，神经病，癌症和/或癌症致死率)之间的相关性。HbA1c水平降低1％预示着与糖尿病相关的死亡数降低21％，心肌梗死降低14％，微血管并发症降低37％。

此外，该浓缩物能够将用STZ处理的糖尿病大鼠中测得的血浆TBARS的增加降低20-25％，证明了这些天然化合物的体内抗氧化作用。

该浓缩物具有有利于减少糖尿病动物中脂质化合物的性质。事实上，在糖尿病大鼠的血清中观察到TC升高约2倍，TG升高约4倍，而用浓缩液治疗的糖尿病大鼠的水平分别降低40％和24％。因此，数据强烈暗示用浓缩物治疗能够减少与糖尿病有关的动脉粥样硬化并发症。

最后，对运动神经和感觉神经传导速度进行了评估，这是评估糖尿病性神经病的发作和进展的标准终点。数据表明，该浓缩物在很大程度上抵抗了由糖尿病引起的轴突变性。与非糖尿病动物相比，糖尿病动物的热和机械伤害感受阈值增加了一倍以上，而浓缩物分别将损伤降低了15％和66％，间接证明了对神经纤维功能的深刻神经保护作用。

总之，以上报道的数据清楚地证明，多酚浓缩物对长期糖尿病并发症的潜在治疗作用。事实上，在已建立的大鼠糖尿病模型中，用本发明的浓缩物的饮食补充可导致各种病理学终点的消退。

Claims

1.一种包含羟基酪醇和3,4-DHPA-EDA的植物水和/或橄榄果渣的浓缩物，和/或包含所述浓缩物的组合物，用于治疗和/或预防糖尿病和/或用于治疗和/或用于预防和/或减轻与糖尿病有关/由糖尿病引起的症状和/或副作用和/或与糖尿病有关/由糖尿病引起的病理/并发症。

2.如权利要求1所述的浓缩物和/或组合物，其中，3,4-DHPA-EDA的含量优选为0.5-0.8g/L，更优选为1-6g/L，甚至更优选为1.5-2.5g/L，和/或酪醇的含量优选为0.1-0.4g/L，更优选为0.15-0.25g/L。

3.如权利要求1或2所述的浓缩物和/或组合物，其中，所述浓缩物还包含：

-至少一种酚类化合物，优选选自酪醇、氯原酸、β-羟基毛蕊花甙、芸香苷、毛蕊花甙和藤黄菌素；和/或

至少一种金属，优选选自钠、钙、镁和钾；和/或

至少一种阴离子，优选选自氯化物、硫酸根、磷酸根和硝酸根；和/或

至少一种碳水化合物，选自葡萄糖、果糖、甘露醇和蔗糖；和/或

氮。

4.如权利要求1-3中任一项所述的浓缩物和/或组合物，其中，所述浓缩物通过包括以下步骤的方法获得：

(i)微过滤植物水和/或橄榄果渣的样品，以获得微过滤的透过物和浓缩物；和

(ii)通过反渗透处理步骤(i)的微过滤透过物来进行浓缩。

5.如权利要求1-4中任一项所述的浓缩物和/或组合物，其中，所述微过滤步骤涉及使用至少一种陶瓷膜，其优选管状，更优选由氧化铝和氧化锆制成。

6.如权利要求1-5中任一项所述的浓缩物和/或组合物，其中，所述反渗透通过使用聚合物膜进行，所述聚合物膜优选(1)螺旋形和/或(2)由包含聚酰胺的材料制成。

7.如权利要求1-6中任一项所述的浓缩物和/或组合物，其被配制用于口服给予，优选以饮料的形式，优选基于水果，优选基于葡萄，优选葡萄汁和/或葡萄液，更优选基于有机葡萄。

8.如权利要求1-6中任一项所述的浓缩物和/或组合物，其被配制成锭剂、丸剂、胶囊剂、片剂等。

9.如权利要求1-6中任一项所述的浓缩物和/或组合物，其被配制用于局部给予，优选以乳膏、油、软膏、气雾剂、凝胶、阴道栓剂、喷雾剂、溶液、贴剂、纱布、绷带、颗粒或粉末的形式。

10.如权利要求9所述的浓缩物和/或组合物，还包含具有生物学活性功能的试剂/分子，所述生物学活性功能选自：愈合、抗炎、抗菌、润肤、舒缓、镇痛及其组合。

11.如前述权利要求中任一项所述的浓缩物和/或组合物，其中，所述与糖尿病相关/由糖尿病引起的病理/并发症选自：糖尿病性神经病，优选疼痛型糖尿病性神经病，肾病，胰腺功能/结构改变，视网膜病变，糖尿病足和伴有血管舒缩功能障碍的皮肤干燥。

12.如前述权利要求中任一项所述的浓缩物和/或组合物，其中，所述症状和/或所述副作用选自：高血糖症的减轻和/或糖化血红蛋白水平的升高，白内障和视网膜病变的发作和/或发展/进展，热和机械敏感性的改变。

13.如前述权利要求中任一项所述的浓缩物和/或组合物，其与对糖尿病具有预防和/或治愈作用的其他物质、化合物、药物或组合物组合，优选地与选自：胰岛素，口服降糖药，以及具有已知抗糖尿病药理活性或潜在感兴趣并正在研究的其他物质组合。