JP2021516370A - 顕微鏡自動焦点のシステム、装置、および方法 - Google Patents

Abstract

少なくとも２台のカメラを用いてより速やかな合焦を容易にする光学顕微鏡の自動焦点システム。第１のカメラは、第１の画像形成共役面上に配置されてもよく、第１の波長範囲の光を出射する第１の照明光源から光を受光する。第２のカメラは、第１の画像形成共役面に対してオフセット距離を有するように配置されてもよく、第２の波長範囲の光を出射する第２の照明光源から光を受光する。

Description

本開示は、顕微鏡自動焦点のための画像に基づく機構に関する。

顕微鏡を用いて観察されるほとんどの試料は、表面のいたるところで小さな高さの変動を有する。これらの変動は人間の目には見えないことが多いが、顕微鏡で撮影される試料の一部の画像が焦点からはずれる可能性がある。

顕微鏡が使用可能な合焦画像を生成することができる範囲は被写界深度として知られている。顕微鏡は、有用な画像を生成するために試料の一部を被写界深度内に保持しなければならない。しかし、試料の第１の部分の観察から当該試料の第２の部分の観察に移行する際に、試料の高さに小さな変動があると当該第２の部分が被写界深度外に出てしまう場合がある。

異なる鮮明度測定値、たとえば、数ある中で画像コントラスト、解像度、エントロピー、および／または空間的周波数成分などを用いて顕微鏡で撮影された画像の焦点の品質を測定することができる。一般に、試料が合焦されている場合、撮影された画像は最高の鮮明度の品質（例えば、高コントラスト、広範囲の強度値、および鮮明な縁部）を示す。試料が合焦されていることを決定するのに用いることができる異なる鮮明度測定値を得るには、通常、一連の画像を撮影し、画像が合焦されるまで顕微鏡の対物レンズと試料の間の距離を広げるか狭める必要がある。その結果、各試料の全顕微鏡走査時間が長くなり、そのような測定を用いる方法は処理量の多い走査用途にはとてつもない時間がかかる。

したがって、より少数の画像を用いて試料の適切な合焦面を見つけることが望ましい。

顕微鏡自動焦点のシステム、方法、および媒体が提供される。

実施形態によっては、顕微鏡自動焦点システムが提供される。本システムは、対物レンズ、第１の画像形成共役面上に試料を配置する試料台、第２の画像形成共役面上に配置され、合焦するように構成される第１のカメラ、前記第２の画像形成共役面に対してオフセット距離を有するように配置され、合焦するように構成される第２のカメラ、前記第１のカメラで受光される第１の波長範囲の光を出射する主照明光源、前記第１の波長範囲と異なる第２の波長範囲の光を出射し、第３の画像形成共役面上に配置される合焦パターンを通してその光を投影し、前記投影光は前記第２のカメラで受光される、副照明光源、および前記第１のカメラおよび前記第２のカメラに連結されているハードウェアプロセッサを含み、前記ハードウェアプロセッサは、前記第１のカメラを用い、鮮明度値（ｓｈａｒｐｎｅｓｓ ｖａｌｕｅ）に基づいて前記試料が合焦されるときを決定し、前記試料が前記第１のカメラで合焦されていると決定された場合に、前記第２のカメラを用いて前記試料の鮮明度設定点を決定し、前記試料の移動後に、前記第２のカメラを用いて前記試料の第１の鮮明度値を決定し、前記試料の前記第１の鮮明度値が前記鮮明度設定点よりも高いか低いかを決定し、かつ前記第２のカメラを用いて決定される前記試料の第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記対物レンズと前記試料台の間の距離を調節するように構成される。

実施形態によっては、顕微鏡自動焦点システムが提供される。本システムは、対物レンズ、第１の画像形成共役面上に試料を配置する試料台、第２の画像形成共役面上に配置され、前記試料が合焦されていると決定された場合に、前記試料の画像を撮影するように構成される第１のカメラ、第３の画像形成共役面上に配置され、合焦するように構成される第２のカメラ、前記第３の画像形成共役面に対してオフセット距離を有するように配置され、合焦するように構成される第３のカメラ、前記第１のカメラで受光される第１の波長範囲の光を出射する主照明光源、前記第１の波長範囲と異なる第２の波長範囲の光を出射し、第４の画像形成共役面上に配置される合焦パターンを通してその光を投影し、前記投影光は前記第２および第３のカメラで受光される、副照明光源、および前記第２のカメラおよび前記第３のカメラに連結されているハードウェアプロセッサを含み、前記ハードウェアプロセッサは、前記第２のカメラを用い、鮮明度値に基づいて前記試料が合焦されるときを決定し、前記試料が前記第２のカメラで合焦されていると決定された場合に、前記第３のカメラを用いて前記試料の鮮明度設定点を決定し、前記試料の移動後に、前記第３のカメラを用いて前記試料の第１の鮮明度値を決定し、前記試料の前記第１の鮮明度値が前記鮮明度設定点よりも高いか低いかを決定し、かつ前記第３のカメラを用いて決定される前記試料の第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記対物レンズと前記試料台の間の距離を調節するように構成される。

実施形態によっては、顕微鏡自動焦点方法が提供される。本方法は、第１の画像形成共役面上にある試料台上に試料を配置する工程、合焦するように構成された第１のカメラを第２の画像形成共役面上に配置する工程、合焦するように構成された第２のカメラを前記第２の画像形成共役面に対してオフセット距離を有するように配置する工程、主照明光源から第１の波長範囲の光を出射し、その光を前記第１のカメラで受光する工程、副照明光源から前記第１の波長範囲と異なる第２の波長範囲の光を出射し、その光を第３の画像形成共役面上に配置される合焦パターンを通して投影し、前記投影光を前記第２のカメラで受光する工程、前記第１のカメラを用い、鮮明度値に基づいて、ハードウェアプロセッサにより前記試料が合焦されるときを決定する工程、前記試料が前記第１のカメラで合焦されていると決定された場合に、前記ハードウェアプロセッサにより、前記第２のカメラを用いて前記試料の鮮明度設定点を決定する工程、前記試料の移動後に、前記第２のカメラを用いて、前記ハードウェアプロセッサにより前記試料の第１の鮮明度値を決定する工程、前記ハードウェアプロセッサにより、前記試料の前記第１の鮮明度値が前記鮮明度設定点よりも高いか低いかを決定する工程、および前記第２のカメラを用いて決定される前記試料の第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記ハードウェアプロセッサにより対物レンズと前記試料台の間の距離を調節する工程を含む。

実施形態によっては、顕微鏡自動焦点方法が提供される。本方法は、第１の画像形成共役面上にある試料台上に試料を配置する工程、前記試料が合焦されていると決定された場合に、前記試料の画像を撮影するように構成された第１のカメラを第２の画像形成共役面上に配置する工程、合焦するように構成された第２のカメラを第３の画像形成共役面上に配置する工程、合焦するように構成された第３のカメラを前記第３の画像形成共役面に対してオフセット距離を有するように配置する工程、主照明光源から第１の波長範囲の光を出射し、その光を前記第１のカメラで受光する工程、副照明光源から前記第１の波長範囲と異なる第２の波長範囲の光を出射し、その光を第４の画像形成共役面上に配置される合焦パターンを通して投影し、前記投影光を前記第２および第３のカメラで受光する工程、前記第２のカメラを用い、鮮明度値に基づいて、ハードウェアプロセッサにより前記試料が合焦されるときを決定する工程、前記試料が前記第２のカメラで合焦されていると決定された場合に、前記ハードウェアプロセッサにより、前記第３のカメラを用いて前記試料の鮮明度設定点を決定する工程、前記試料の移動後に、前記第３のカメラを用いて、前記ハードウェアプロセッサにより前記試料の第１の鮮明度値を決定する工程、前記ハードウェアプロセッサにより、前記試料の前記第１の鮮明度値が前記鮮明度設定点よりも高いか低いかを決定する工程、および前記第３のカメラを用いて決定される前記試料の第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記ハードウェアプロセッサにより前記対物レンズと前記試料台の間の距離を調節する工程を含む。

開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う自動焦点システムの一例を示す。

開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う照明装置の一例を示す。

開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う合焦装置の一例を示す。

開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う光路の一例を示す。

開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う主合焦カメラの鮮明度曲線の一例を示す。

開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従うオフセット合焦カメラの鮮明度曲線の一例を示す。

開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う、画像形成共役面からの異なる距離におけるオフセット合焦カメラの鮮明度曲線の一例を示す。

開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う、自動焦点システム、例えば図１に示すシステムを用いて自動焦点を行う処理の流れ図の一例を示す。

開示される発明の対象のいくつかの実施形態によれば、試料の顕微鏡自動焦点のための機構（システム、方法、装置などを含むことができる）が提供される。

図１に開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う自動焦点システム１００の一例を示す。いくつかの実施形態に従う自動焦点システム１００の基本的部品は、光を提供する照明装置２００、試料の合焦面を見つける合焦装置３００、垂直照明器１３、撮影カメラ５、対物レンズ２５、試料台３０、およびハードウェア、ソフトウェア、および／またはファームウェアを含む制御システム１０８を含む。

自動焦点システム１００は、任意の適切な種類の顕微鏡の一部として実装されてもよい。例えば実施形態によっては、システム１００は透過光または反射光を用いる光学顕微鏡の一部として実装されてもよい。より具体的には、システム１００はオハイオ州カヤホガ・フォールズ市のNanotronics Imaging, Incから市販されるnSpec（登録商標）光学顕微鏡の一部として実装されてもよい。以下の記載では反射光垂直照明器１３を参照するが、本明細書に記載する機構は反射光垂直照明器を用いない顕微鏡の一部であってもよい。

いくつかの実施形態によれば、顕微鏡は１枚以上の対物レンズ２５を含んでもよい。これらの対物レンズは異なる拡大倍率を有し、かつ／または明視野・暗視野顕微鏡法、微分干渉コントラスト顕微鏡法、および／または任意の他の適切な形態の顕微鏡法を用いて動作するように構成されてもよい。試料を検査するのに用いられる対物レンズおよび／または顕微鏡技術は、実施形態によってはソフトウェア、ハードウェア、および／またはファームウェアにより制御されてもよい。

実施形態によっては、微動焦点アクチュエータ２３を用いて対物レンズ２５を試料台３０に向かいかつ試料台３０から離れるようにＺ軸方向に駆動してもよい。微動焦点アクチュエータ２３は、対物レンズ２５の高精度の焦点微調節を行うように設計されてもよい。微動焦点アクチュエータ２３は、ステッピングモータ、サーボモータ、リニアアクチュエータ、圧電モータ、および／または任意の他の適切な機構であってもよい。例えば実施形態によっては、圧電モータを用いて対物レンズを０〜５０マイクロメートル（μｍ）、０〜１００μｍ、あるいは０〜２００μｍ、および／または任意の他の適切な範囲の距離だけ駆動してもよい。

実施形態によっては、Ｘ・Ｙ軸移動台を試料台３０に用いてもよい。Ｘ・Ｙ軸移動台は、ステッピングモータ、サーボモータ、リニアモータ、および／または任意の他の適切な機構で駆動されてもよい。

実施形態によっては、アクチュエータ３５を含む焦点装置３２を用いて試料台３０を対物レンズ２５に向かいかつ対物レンズ２５から離れるようにＺ軸方向に調節してもよい。アクチュエータ３５を用いて例えば、０〜５ｍｍ、０〜１０ｍｍ、０〜３０ｍｍ、および／または任意の他の適切な範囲の距離の大まかな合焦を行ってもよい。アクチュエータ３５を用いて試料台３０を上下に移動させて異なる厚みの試料を試料台に置くことができるようにしてもよい。実施形態によっては、アクチュエータ３５を用いて例えば、０〜５０μｍ、０〜１００μｍ、０〜２００μｍ、および／または任意の他の適切な距離の微動焦点を提供してもよい。実施形態によっては、合焦装置３２は位置決め装置３３も含んでもよい。この位置決め装置は、自動焦点システム１００の再設定および／または動力サイクル時であっても試料台３０の絶対位置（例えば、試料が合焦されている場合の試料台の位置）を保存するように構成されてもよい。実施形態によっては、位置決め装置は、対物レンズに対する試料台３０の絶対位置を追跡するリニア符号器、回転符号器、または任意の他の適切な機構であってもよい。

実施形態によっては、自動焦点システム１００は、合焦すなわち位置合わされると、顕微鏡を通る光路に沿って現れる一組の共役面、例えば画像形成共役装置を含んでもよい。画像形成共役装置内の各平面は、当該装置内で他の平面と共役する。と言うのは、これらの平面は同時に合焦されていて、顕微鏡で試料を観察する際に互いに重ね合わされて表示されるからである。自動焦点システム１００内のこの一組の画像形成共役面は、主合焦カメラ７２の画像面、撮影カメラ５の画像面、合焦パターン５５の画像面、視野絞り（絞り目盛り）１４の画像面、および試料の画像面を含む。より具体的には、本明細書において画像形成共役面上の主合焦カメラ７２および撮影カメラ５の配置に言及する場合はすべて、画像形成共役面上のカメラ５および７の内部のセンサの配置を指す。

実施形態によっては、合焦パターン５５は不透明材料で形成され、この不透明材料からパターンを切り取ってもよい。材料の切り取り区間から光が通って試料の画像面に進むことができるが、不透明材料の区間は光の通過を阻止する。他の実施形態では、合焦パターン５５は不透明なパターンを表面に有する透明材料、例えば透明ガラスまたは透明プラスチックで形成されてもよい。不透明なパターンは、透明ガラスまたは透明プラスチックを通る光により試料の画像面に投影される。

実施形態によっては、撮影カメラ５は自動焦点システム１００の画像形成共役面上に配置される画像センサ６を含んでもよい。制御システム１０８が試料は合焦されていると決定すると、撮影カメラ５を用いて試料を撮影することができる。画像センサ６は、例えば試料の画像を撮影かつ保存することができるＣＣＤ、ＣＭＯＳ、および／または任意の他の適切な電子装置であってもよい。

実施形態によっては、制御システム１０８は制御部１１０および制御部インターフェース１０７を含み、自動焦点システム１００の部品（例えば、アクチュエータ３５および２３、主照明光源６５、副照明光源４０、合焦カメラ７０、７２、試料台３０、合焦パターン５５、撮影カメラ５、および対物レンズ２５）の任意の設定、通信、動作（例えば、撮影、照明光源の点灯および消灯、試料台３０および対物レンズ２５の移動、試料に関連する異なる値の保存）や自動焦点システムの複数の部品により、またはこれらの間で実行された計算（例えば、鮮明度の計算）を制御してもよい。制御システム１０８は、（実施形態によってはソフトウェアを実行することができる）任意の適切なハードウェア、例えばコンピュータ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、特定用途向け集積回路、およびデジタル信号プロセッサ（ハードウェアプロセッサと称することができるもののいずれか）、符号器、符号器を読み取る回路、メモリ装置（１つ以上のＥＰＲＯＭ、１つ以上のＥＥＰＲＯＭ、動的ランダムアクセスメモリー、静的ランダムアクセスメモリー、および／またはフラッシュメモリーを含む）、および／または任意の他の適切なハードウェア要素を含んでもよい。実施形態によっては、自動焦点システム１００内の個別の部品は、当該個別の部品を制御し自動焦点システム１００内の他の部品と通信する独自のソフトウェア、ファームウェア、および／またはハードウェアを含んでもよい。

実施形態によっては、制御システム（例えば、制御部１１０および制御部インターフェース１０７）と自動焦点システム１００の部品の間の通信１２０に、アナログ技術（例えば、リレー論理）、デジタル技術（例えばＲＳ２３２、イーサネット、または無線を用いる）、および／または任意の他の適切な通信技術を用いてもよい。

実施形態によっては、任意の適切な入力装置（例えば、キーボード、マウス、またはジョイスティック）を用いて運用者の入力を制御システムに通信してもよい。

図２に、開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う自動焦点システムの照明装置の実施形態の一般的構成を示す。照明装置２００は２つの照明光源、例えば主照明光源６５と副照明光源４０を含んでもよい。これらの照明光源は互いに異なる波長の範囲の光線を提供することができる。

実施形態によっては例えば、主照明光源６５は４５１〜７５０ナノメートル（ｎｍ）の範囲の波長を有する光線を提供する一方、副照明光源４０は主照明光源に用いられる波長の範囲よりも高いか低い波長を有する光線を提供する。例えば、主照明光源６５の波長範囲は５５０〜７５０ｎｍの範囲であり、副照明光源の波長範囲は４００〜４５０ｎｍの範囲である。波長範囲の値が分かっており、かつ既知のフィルタ技術を用いて他の波長から分離することができる限り、任意の波長範囲の光を主照明光源６５に用いてもよい。同様に、光が主照明光源６５と同じ波長範囲でない限り、任意の波長範囲の光を副照明光源４０に用いてもよい。

実施形態によっては図１に示すように、主照明光源６５は、その光が垂直照明器１３に向かって水平方向に透過されるように配置される。主照明光源６５は主光線を集束する合焦レンズ４９（例えば、両凸レンズ）を含んでもよい。副照明光源４０は、画像形成共役面５４上に配置される合焦パターン５５の下方の適切な距離に配置されてもよい。合焦パターン５５の投影が合焦カメラ７０および７２の視野よりも小さくなるように、合焦パターン５５の直径（例えば５ｍｍ）を調整してもよい。合焦パターン５５は、任意の適切な幾何学形状、例えば円形、矩形、三角形、または六角形であってもよい。合焦パターン５５は一連の個別の開口部も含み、その結果、光が個別の開口部を通して透過されると、線と空間が視野全体に投影される。実施形態によっては、主照明光源６５および副照明光源４０の位置を交換してもよい。

実施形態によっては、自動焦点システム１００は、合焦パターン像を合焦カメラ７０および７２で撮影することができる試料に継続的に投影するために副照明光源４０を合焦パターン５５を通して継続的に透過するように構成されてもよい。合焦パターン像を継続的に投影することにより、試料、特に透明試料または視覚的に認識可能な特徴を欠く試料の鮮明な焦点を容易にすることができる。鮮明な合焦のために、視野絞りの代わりにまたは視野絞りに加えて合焦パターン５５を用いてもよい。例えば、自動焦点システム１００は合焦パターン５５に加えて、垂直照明器１３内に配置することができる視野絞り（絞り目盛り）１４も含んでもよい。視野絞り１４は、自動焦点システム１００の画像形成共役面上にも配置されてもよい。実施形態によっては、視野絞り１４は、照明光源６５および４０で出射し、対物レンズ２５に透過される光の直径を制御する。より具体的には、実施形態によっては視野絞りの寸法を小さくすることにより通過する光の直径を小さくする。これにより合焦カメラ７０および７２が受け取る試料の画像の周囲に暗い輪郭を生成し、（例えば、試料および対物レンズを互いにより近くなるように、またはより遠くなるように移動させることにより）試料の焦点の調節に用いることができる。最も高い鮮明度が測定された時点で、試料が合焦されているとみなされ、視野絞りをより大きな寸法に開いて撮影カメラ５で試料を撮影することができる。しかし、視野絞りを小さくして元の寸法に戻すには時間がかかり（例えば２〜５秒）、走査処理および処理能力が遅くなってしまう場合がある。

必要なら、適切なフィルタを用いて合焦パターン５５が撮影カメラ５に投影されないことを保証する限り、合焦パターン５５を自動焦点システム１００の任意の適切な画像形成共役面（例えば（図１に示すように）副照明光源４０の上方または視野絞り１４側）に配置してもよい。例えば、視野絞り１４の代わりに、合焦パターン５５を視野絞り１４の画像形成共役面上に配置する場合、フィルタが必要になる。実施形態によっては、（視野絞り１４の代わりに）帯域フィルタを視野絞りの画像形成共役面上に配置し、パターン切り取り形状の合焦パターンを帯域フィルタ内に作製してもよい。より具体的には、合焦パターン５５の領域以外では、主照明光源６５と同じ波長範囲（例えば４５０ｎｍを超える）の光を透過し、かつ副照明光源４０と同じ波長範囲（例えば４５０ｎｍ以下）の光を遮断する帯域フィルタを選択してもよい。すなわち、副照明光源４０と同じ波長範囲の光は合焦パターン５５の領域以外では遮断され、これにより副照明光源４０からの光が合焦カメラ７０および７２に透過できるようにする。図４との関連で以下に記載するように、光学フィルタ１１は主照明光源６５からの光のみを撮影カメラ５に向けて透過する。

なお、実施形態によっては任意の適切な照明光源を照明装置２００とともに用いてもよい。例えば４００ｎｍの紫外線平行化発光ダイオード（ＬＥＤ）を副照明光源４０に、５５００Ｋの白色光平行化ＬＥＤを主照明光源６５に用いてもよい。

実施形態によっては、合焦レンズ４５（例えば、６０ｍｍの焦点距離の両凸レンズ）が副照明光源４０と合焦パターン５５の間の適切な距離に配置されてもよい。さらに、もう一つの合焦レンズ４７が合焦パターン５５の他方の側の適切な距離に配置されてもよい。実施形態によっては、レンズ４５および４７の合焦パターン５５からの距離は、光の集束および合焦パターン５５の配置が画像形成共役面内で行われることを保証するために顕微鏡の光学特性に基づいてもよい。

実施形態によっては、光が垂直照明器１３に進む前に、ダイクロイック素子６０が主照明光源６５および副照明光源４０の両方の光路内に配置される。本明細書で用いられるダイクロイック素子は、特定の既知波長の光を透過し、この光の波長をもう一つの特定の既知波長と合成する鏡、ビームスプリッタ、フィルタ、またはビームコンバイナを指すことができる。なお、上記の装置の組み合わせを用いて望ましい照明光源および波長を反射かつ透過することができる。実施形態によっては、副照明光源４０から出射した光の波長を反射し、かつ主照明光源６５から出射した光の波長を通過させることができるようにするため、特定の遮断波長を有するダイクロイック素子が選択される。例えば、副照明光源４０が４００〜４５０ｎｍの波長範囲の光を出射し、かつ主照明光源６５が５５０〜７５０ｎｍの波長範囲の光を出射する場合、４５０ｎｍ遮断ダイクロイック素子（すなわち、４５０ｎｍ以下の波長を有する光を反射し、かつ４５０ｎｍを超える波長を有する光を通過させることができるようにすることで光線を合成するダイクロイック素子）を用いて副照明光源４０からの光を反射し、かつ主照明光源６５からの光を通過させることができるようにしてもよい。ダイクロイック素子６０は４５°の入射角用に設計されてもよく、その結果、副照明光源４０から出射した光は９０°の角度で反射され、かつ主照明光源６５からの光路に平行に進む。

実施形態によっては、主照明光源６５は撮影カメラ５内の撮影センサ６で試料を撮影するのに用いられる光源であってもよく、副照明光源４０は合焦カメラ７０および７２の合焦センサ７１および７３で試料を撮影するのに用いられる光源であってもよい。

なお、実施形態によっては任意の適切なダイクロイック素子、照明器、照明光源、合焦レンズ、センサ、および合焦パターンを照明装置２００とともに用いてもよい。実施形態によっては、任意の適切な構成のこれらの部品を照明装置２００とともに用いてもよい。実施形態によっては、可変配置できるようにするために、照明装置２００の部品は、任意の適切な方法、例えば合焦カメラ７２が図３の合焦筐体１８に取り付けられる（下記）のと類似の方法で案内棒を用いて照明器１３に取り付けられてもよい。

図３に、開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う自動焦点システムの合焦装置の実施形態の一般的構成の一例を示す。合焦装置３００は２つのカメラ、すなわち主合焦カメラ７０とオフセット合焦カメラ７２を含んでもよい。これらのカメラは、例えば試料の画像を撮影することができる電荷結合素子（ＣＣＤ）画像センサ、ＣＭＯＳ画像センサ、および／または任意の他の適切な画像センサを含んでもよい。実施形態によっては、撮影画像は、制御システム１０８により保存かつ分析される。

合焦装置３００は垂直照明器１３と撮影カメラ鏡筒１０の間の区域に取り付けられてもよい。この区域は無限遠空間として知られている。実施形態によっては、合焦装置３００は適切な部品を用いて他の位置に取り付けられ、選択された位置をシステムの光学特性に適合させてもよい。

主合焦カメラ７０は（例えば線８０で表すように）自動焦点システム１００の画像形成共役面上に配置されるセンサ７１を含んでもよい。

オフセット合焦カメラ７２は画像形成共役面８０に対してオフセット距離を有するように配置することができるセンサ７３を含んでもよい。オフセットは正の方向８１または負の方向７９のいずれかであってもよい。オフセット合焦カメラ７２は主合焦カメラ７０の上方または下方に配置されてもよい。オフセット合焦カメラ７２は、オフセット合焦カメラ７２オフセット距離を調節するために案内棒７６に沿って移動可能であってもよく、または任意の他の適切な構造であってもよい。図７との関連で以下で考察するように、オフセット距離は画像形成共役面８０からの異なる距離で計算されたオフセット合焦カメラ７２の鮮明度カーブに基づいて調節されてもよい。

合焦装置３００は２つの合焦レンズ２４および２２も含んでもよい。合焦レンズ２２は主合焦カメラ７０と同じ水平方向の光路内に配置されてもよく、かつ合焦レンズ２４はオフセット合焦カメラ７２と同じ水平方向の光路内に配置されてもよい。実施形態によっては、合焦レンズ２２および２４は顕微鏡の鏡筒１０と同じ焦点距離を達成することで、センサ７１および７３が画像形成共役面８０上に配置された場合に、それぞれが合焦されることを保証する。顕微鏡の鏡筒１０はセンサ６に試料の画像を合焦するレンズ（図示せず）を含み、その結果、センサ６が自動焦点システム１００の画像形成共役面上に配置されると、試料は合焦される。

なお、実施形態によってはレンズ２２および２４は両凸レンズまたは任意の他の適切な種類のレンズであってもよい。実施形態によっては、レンズの焦点距離は顕微鏡の光学特性に基づいてもよい。

図３に示すように、合焦装置３００は試料から反射される光の光路内で垂直照明器１３の上方に配置される遮断ダイクロイック素子１５も含んでもよい。ダイクロイック素子１５は、遮断ダイクロイック素子の下方にある試料から反射された光が９０°の角度で主合焦カメラ７０に向かって反射されるように配置される。副照明光源４０から出射する光（「集束光線」）の波長を反射するために、特定の遮断波長を有するダイクロイック素子が選択されてもよい。例えば、集束光線が４００〜４５０ｎｍの範囲である場合、集束光線を主合焦カメラ７０に向かって反射するために４５０ｎｍの遮断フィルタを合焦装置３００とともに用いてもよい。

実施形態によっては、合焦装置３００はダイクロイック素子１５と主合焦カメラ７０の間に配置することができるビームスプリッタ２６を含んでもよい。ビームスプリッタ２６は、例えば集束光線の５０％を主合焦カメラ７０に送り、集束光線の５０％をオフセット合焦カメラ７２に送るように設計される５０：５０のビームスプリッタであってもよい。鏡２８はビームスプリッタ２６の直ぐ上方に配置されてもよく、ビームスプリッタ２６からの光線をオフセット合焦カメラ７２に向けるように設計されてもよい。

実施形態によっては、遮断フィルタ１７がダイクロイック素子１５とビームスプリッタ２６の間に配置され、主照明光源６５から入射する任意の光（「撮影光線」）にフィルタをかけてもよい。例えば、撮影光線が４５０ｎｍ以上の範囲の波長を有する場合、４５０ｎｍの遮断フィルタを用いて撮影光線にフィルタをかけ、かつ撮影光線が合焦カメラ７０および７２に光を透過するのを防止してもよい。他の実施形態では、２つの遮断フィルタが用いられ、各フィルタが、例えばレンズ２２および２４の前方または後方に配置されてもよい。

なお、実施形態によっては任意の適切なダイクロイック素子、合焦カメラ、合焦レンズ、鏡、画像センサ、ビームスプリッタ、および遮断フィルタを合焦装置３００とともに用いてもよい。実施形態によっては、任意の適切な構成のこれらの部品を合焦装置３００とともに用いてもよい。合焦装置３００の部品は、部品を接続する案内棒または任意の他の適切な構造体に取り付けられてもよい。さらに実施形態によっては、主合焦カメラ７０は不要であり、本明細書に記載する主合焦カメラ７０の合焦動作は、撮影カメラ５により実行されてもよい。

図４に、開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う、１対の破線で表される自動焦点システム１００の例示的な光路を示す。自動焦点システム１００は、副照明光源４０から出射する光（より短い破線で表される「集束光線」）が試料Ｓに投影され、次に合焦カメラ７０および７２に反射されるように構成されてもよい。自動焦点システム１００は、主照明光源６５から出射する光（より長い破線で表される「撮影光線」）が試料Ｓに投影され、次に撮影カメラ５に反射されるようにも構成されてもよい。

より具体的には、実施形態によっては、集束光線は照明光源４０から合焦パターン５５を通ってダイクロイック素子６０に進むことができる。ダイクロイック素子６０は垂直照明器１３に向かって集束光線を反射する。

撮影光線は主照明光源６５から進みダイクロイック素子６０を通過し、集束光線と合成される。

次に、合成光線は、垂直照明器１３を通ってプリズム２０に進むことができる。プリズム２０は、照明光源から入射する光を対物レンズ台および対物レンズ２５経由で下向きに９０°の角度で試料Ｓに反射させることができる。試料Ｓは、対物レンズ２５経由で合成光線を上向きに反射させることができる。次に合成光線はプリズム２０に入射し、ダイクロイック素子１５に向かって透過する。ダイクロイック素子１５は、例えば、集束光線の波長を合焦カメラ７０および７２に向かって反射し、かつ撮影光線の波長がカメラ５に向かって通過できるようにすることで透過光線を再び撮影光線と集束光線に分離することができる。

実施形態によっては、ダイクロイック素子１５で反射された集束光線は遮断フルタ１７を通過して遮断波長を超える任意の光を除去してもよい。次に、集束光線はビームスプリッタ２６に進むことができる。ビームスプリッタ２６は、合焦筐体１８内に配置されている合焦レンズ２２を通して光を導くことで集束光線の５０％を主合焦カメラ７０に送ることができる。集束光線は、主合焦カメラ７０からカメラ７０の内部の光センサ７１（図３）に進むことができる。集束光線のさらに５０％は、ビームスプリッタ２６で鏡２８に向かって上向きに導かれてもよい。鏡２８は、合焦筐体１９内に配置されている合焦レンズ２４に向かって集束光線を反射させることができる。集束光線は、合焦レンズ２４からオフセット合焦カメラ７２内部のセンサ７３（図３）に導かれてもよい。

実施形態によっては、ダイクロイック素子１５を通過した撮影光線は、光学フィルタ１１（例えば、撮影光線の波長のみを透過するフィルタ）を通過し、鏡筒１０を通り、撮影カメラ５内に配置されているカメラセンサ６に向かってもよい。

実施形態によっては、主合焦カメラ７０を用いて試料の合焦点を決定してもよい。例えば（図１に示すように）Ｚ軸に沿って対物レンズおよび試料台を互いにより近くなるように、またはより遠くなるように移動させることで、試料の焦点を調節してもよい。より具体的には、主合焦カメラ７０を用いて（例えばＺ軸方向に試料台３０および／または対物レンズ２５を移動させることで）Ｚ軸に沿った２箇所以上の位置で試料の画像を得てもよい。得られた画像から、制御システム１０８で試料のＺ軸に沿った位置毎に相対鮮明度値を計算し、焦点の品質を決定してもよい。自動焦点システム１００は、任意の適切な鮮明度の方程式を用いて得られた画像の相対鮮明度を計算してもよい。自動焦点システム１００で用いて相対鮮明度の得点を計算することができる１つの例示的な方程式は、強度変動を説明するために平均μで正規化される画像変動Ｖの度合いである。

式中、ｓ（ｉ，ｊ）は座標（ｉ，ｊ）でのグレースケール画素値であり、ＮおよびＭはｉ方向およびｊ方向の画素数をそれぞれ表す。自動焦点システム１００で用いることができる相対鮮明度値を計算する他の例示的な方法は、"Simple and Robust Image-Based Autofocusing for Digital Microscopy," Optics Express Vol. 16, No. 12, 8670 (2008)にSivash Yazdanfarらにより記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。上記で開示される方法は単なる例であり、限定を意図しない。

図５に、Ｚ軸方向の試料の相対位置（「Ｚ位置」）を表すＸ軸と、相対鮮明度の得点を表すＹ軸を含むグラフを示す。相対Ｚ位置は、試料台３０の上面と対物レンズ２５の間の距離を表す。Ｚ位置を、試料台３０を対物レンズ２５に向けるあるいは対物レンズ２５から遠ざけるように調節することで、かつ／または対物レンズ２５を試料台３０に向けてあるいは試料３０から遠ざけるように調節することで変更してもよい。図５に示す鮮明度曲線は、曲線に沿うそれぞれの測定地点で、主合焦カメラ７０で撮影された画像の相対鮮明度を相対Ｚ位置と比較している。図５に示すように、試料の鮮明度値は（合焦位置と呼ぶことができる）所定の相対位置（例えばＺ位置１３０）で最大測定鮮明度（例えば、図５の鮮明度の得点７０）を有する場合があり、合焦位置（例えば、Ｚ位置１３０）の両側で対称的に低下する場合がある。場合によっては、図５の合焦位置の曲線の傾きはゼロまたはゼロに近くなることがある。当然のことであるが、本明細書で用いる「合焦」という用語は、鮮明度測定値が鮮明度曲線の頂点またはその付近になるように対物レンズと試料台が相対的に配置される場合を指すことを意図する。「合焦」という用語は焦点が完全または最適であることに限定されることを意図しない。

Ｚ軸方向の大まかな移動の範囲が（例えば５００μｍにおける）直線１３７および（例えば２５００μｍにおける）直線１４２により表される。焦点のＺ軸方向での微細移動の範囲は（例えば１４００μｍにおける）直線１３６および（例えば１６００μｍにおける）直線１４１により表される。なお、Ｚ軸方向の移動の範囲は、対物レンズ２５と試料台３０の間の異なるＺ位置を達成する移動の実際的な範囲を指す。Ｚ軸方向の移動の範囲は、鮮明度の計算を用いて試料を合焦するＺ軸方向の移動の範囲も指す。矢印１３５は、試料台３０と対物レンズ２５が互いに離れるように移動するときにＺ位置１３０の最高地点まで増加する鮮明度の得点（上記のように画像が合焦されているとみなされることを示す）を示し、矢印１４０は、試料台３０と対物レンズ２５が互いに離れるように移動し続けるときにＺ位置１３０の最高地点から低下する鮮明度の得点を示す。

図６にオフセット合焦カメラ７２の例示的な鮮明度曲線を示す。図５と同様に、グラフのＸ軸は相対Ｚ位置を表し、Ｙ軸は相対鮮明度の得点を表し、線１３０は主合焦カメラ７０が最大鮮明度測定値を取るＺ位置を示す。図６に示す鮮明度曲線は、曲線に沿うそれぞれの地点で、オフセット合焦カメラ７２で撮影された画像の相対鮮明度を相対Ｚ位置と比較している。実施形態によっては、自動焦点システム１００は同じ方程式を用いて主合焦カメラ７０およびオフセット合焦カメラ７２の鮮明度曲線を計算してもよい。

図６の例に示すように、図５との関連で述べたように主合焦カメラ７０を用いて決定された合焦位置（例えばＺ位置１３０）で、オフセット合焦カメラ７２で撮影された画像の相対鮮明度値は（矢印１３８で示すように）約２８である。この値（例えば２８）は、当該特定の試料、試料等級、および／または任意の他の適切な分類に対するオフセット合焦カメラ７２の鮮明度設定点として制御システム１０８で保存されてもよい。実施形態によっては、試料等級は類似の反射品質の材料から製造された試料に基づいて規定されてもよい。いくつかの例示的な試料等級としては、未加工のシリコンウェハ、既知のパターンを有する半導体ウェハ、およびガラススライドおよびカバー片と一致するように調製される同じ既知の物質の生物学的試料が挙げられるが、これらに限定されない。

図６に示すように、オフセット合焦カメラ７２で撮影された画像の鮮明度曲線は、（Ｚ軸方向の移動の範囲を表す）直線１３７と直線１４２の間で（矢印１５０で表されるように）絶えず増加する。試料の鮮明度設定点あるいは試料の等級が分かると、オフセット合焦カメラ７２を用いて試料台３０と対物レンズ２５を互いにより近くなるように、またはより遠くなるように移動するかどうかを決定することができる。例えば、試料の鮮明度設定点が２８であると決定され、かつ試料が合焦されないように試料台３０がＺ軸に対して垂直にＸ・Ｙ平面で移動された場合、オフセット合焦カメラ７２で撮影された画像の鮮明度を鮮明度設定点および鮮明度曲線とともに用いて試料を再び合焦してもよい。例えば、オフセット合焦カメラ７２で撮影された試料の画像の鮮明度設定点が上記のように２８であり、かつオフセット合焦カメラ７２で撮影された試料台移動後の試料の画像の相対鮮明度が（例えば）５２である場合、図６の鮮明度曲線から明らかなように、試料台と対物レンズの間の距離を（例えば２０００μｍから１５００μｍに）小さくして試料を再び合焦しなければならない。他方、オフセット合焦カメラ７２で撮影された試料の画像の相対鮮明度値が２８未満（例えば２０）である場合、図６の鮮明度曲線から明らかなように、試料台と対物レンズの間の距離を（例えば１０００μｍから１５００μｍに）大きくして試料を再び合焦しなければならない。オフセット合焦カメラ７２の相対鮮明度曲線は鮮明度設定点とともに、試料台と対物レンズの間の距離を小さく、または大きくしなければならないかどうかを示すので、試料のより少ない画像を撮影して試料を再び合焦することができる。

試料台と対物レンズを互いにより近くなるように、またはより遠くなるように移動させるかどうかに関する同じ情報を図５に示す鮮明度曲線から収集することはできない。例えば図５に示すように、主合焦カメラ７０で撮影された試料の最大鮮明度測定値が７０であり、かつ試料の実際の鮮明度値が５１であると測定された場合、鮮明度曲線は、相対Ｚ位置がＺ位置１３０で合焦点の右側または左側である可能性があることを示す。相対Ｚ位置がＺ位置１３０で合焦点の右側または左側にある可能性があるので、鮮明度曲線を用いて試料台と対物レンズを互いに近くなるように、またはより遠くになるように移動させるかどうかを決定することはできない。

図７に（図３に示すように）画像形成共役面８０から異なる距離に配置される場合のオフセット合焦カメラ７２の異なる例示的な鮮明度曲線（すなわち、鮮明度曲線Ａ、Ｂ、およびＣ）を示す。図６と同様に、図７のグラフのＸ軸は相対Ｚ位置を表し、Ｙ軸は相対鮮明度の得点を表し、直線１３０は主合焦カメラ７０が最大鮮明度測定値を取るＺ位置を示す。鮮明度曲線Ａ、Ｂ、およびＣは、曲線に沿うそれぞれの地点で、オフセット合焦カメラ７２で撮影された画像の相対鮮明度を相対Ｚ位置と比較している。鮮明度曲線Ｄは、曲線に沿うそれぞれの地点で、主合焦カメラ７０で撮影された画像の相対鮮明度を相対Ｚ位置と比較している。実施形態によっては、自動焦点システム１００は同じ鮮明度の方程式を用いて鮮明度曲線Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤを計算する。なお、本明細書でのオフセット合焦カメラ７２の配置はオフセット合焦カメラ７２の内部のセンサ７３の配置を指す。

これらの３本の鮮明度曲線のうち、曲線Ｃは、オフセット合焦カメラ７２が画像形成共役面８０に最も近いときのオフセット合焦カメラ７２の鮮明度曲線を表す。曲線Ｂは、オフセット合焦カメラ７２が曲線Ｃのオフセット距離よりも遠いが曲線Ａのオフセット距離よりも近い距離にあるときのオフセット合焦カメラの鮮明度曲線を表す。曲線Ａは、オフセット合焦カメラ７２が画像形成共役面８０から最も遠いときのオフセット合焦カメラの鮮明度曲線を表す。オフセット距離は、オフセット合焦カメラ７２のセンサ７３と画像形成共役面８０の間の距離を指す。

直線Ａ’、Ｂ’、およびＣ’は、試料が（図５との関連で述べたように）主合焦カメラ７０と合焦されているとみなされる場合のＺ位置（例えば直線１３０）でのそれぞれの曲線Ａ、Ｂ、およびＣの傾きを表す。曲線の傾きは、オフセット合焦カメラ７２が画像形成共役面８０のより近くに移動するにつれてより急峻になる。より急峻な傾きは、Ｚ軸での高さのより小さな変化に対する鮮明度のより大きな変化（より大きな解像度の変化とも呼ぶ）を表す。より急峻な傾きが望ましい、と言うのはより微細な焦点の調節および制御が可能だからである。

実施形態によっては、試料を合焦するのに必要なＺ軸方向の移動の範囲によりオフセット距離を決定してもよい。Ｚ軸方向の移動の範囲は、例えば、試料の厚みおよび／もしくは任意の他の適切な特性、試料等級および／もしくは試料の任意の他の適切な分類、および／または顕微鏡の光学特性（例えば、対物レンズの倍率）に基づいてもよい。広範な試料の種類を含むようにＺ軸方向の移動の範囲を選択してオフセット距離を絶えず調節するのを防いでもよい。

実施形態によっては、自動焦点システム１００の適切なオフセット距離を決定するために、オフセット合焦カメラ７２を異なるオフセット距離に配置してもよい。鮮明度曲線をそれぞれのオフセット距離で計算してもよい。Ｚ軸方向の移動の望ましい範囲を表し、かつその範囲で絶えず上昇する（正の傾きで表される）か、降下する（負の傾きで表される）鮮明度曲線を生成するオフセット距離を選択してもよい。

より具体的には、Ｚ軸方向の移動の範囲が大きい場合（例えば、図７に示す直線１３７と直線１４２の間の距離）、オフセット合焦カメラ７２を（曲線Ａで表されるように）画像形成共役面８０からより遠くに配置してもよい。例えば、Ｚ軸方向の移動の望ましい範囲が（直線１３７および１４２で表されるように）５００μｍと２５００μｍの間である場合、オフセット合焦カメラを曲線Ｂまたは曲線Ｃを生成するオフセット距離に配置するべきではない。と言うのは、曲線Ｂおよび曲線Ｃの両方がＺ軸方向の移動の望ましい範囲で上昇および降下しており、試料と対物レンズを互いにより近くなるように、またはより遠くなるように移動させるかどうかを決定するのに用いることができないからである。

実施形態によっては、オフセット距離は、（例えば、直線Ａ’、Ｂ’、およびＣ’で表されるように）試料の主合焦カメラ７０との合焦が最適である位置での鮮明度曲線の急峻度に基づいてもよい。例えば、試料を合焦するのに必要なＺ軸方向の移動の範囲が小さい場合（例えば１３００μｍ〜１７００μｍ）、オフセット合焦カメラ７２を画像形成共役面８０のより近くに（例えば、曲線Ｃを生成するオフセット距離に）配置してもよい。オフセット距離がより大きいと、受け入れ可能な鮮明度曲線（例えば、曲線ＢおよびＡ）を生成することができるが、曲線Ｃを生成するオフセット合焦カメラ７２の位置を選択することができる、と言うのは、その位置が画像形成共役面８０からより遠いオフセット距離と比較して最も急峻な傾きおよび最も大きな解像度を有するからである。実施形態によっては、画像形成共役面８０からより遠い位置を選択して自動焦点システム１００のＺ軸方向の移動の最大範囲に適合するようにし、その結果、様々な厚みの試料に対してオフセット合焦カメラ７２を絶えず配置し直す必要をなくしてもよい。

なお、オフセット合焦カメラ７２は、画像形成共役面８０の右側または左側のオフセット距離に配置されてもよい。右側または左側に配置される場合のＺ軸方向の移動の範囲にわたる鮮明度の傾きは一方向を向いており、かつ互いに逆である。例えば、オフセット合焦カメラ７２が画像形成共役面８０の右側に配置され、かつＺ軸の値が増加する範囲にわたって鮮明度の傾きが上昇し、その次にオフセット合焦カメラ７２が画像形成共役面８０の左側に配置された場合、鮮明度の傾きは逆になる（すなわち、Ｚ軸の値が増加する範囲にわたって減少する）。つまり、鮮明度の傾きの符号（すなわち、傾きが正または負であるか）は、オフセット合焦カメラが画像形成共役面の右側または左側にあるかに依存する。したがって、オフセット合焦カメラの相対位置（すなわち、オフセット合焦カメラが画像形成共役面の右側または左側にあるか）、鮮明度設定、および鮮明度値が分かっている場合、対物レンズおよび試料台の相対的配置を上昇または降下させることでより良い焦点を達成することを推測することができる。

実施形態によっては、オフセット合焦カメラ７２のオフセット距離を、自動焦点システム１００で一旦設定してもよい。他の実施形態では、異なる対物レンズ、異なる試料の厚み、異なる試料等級、または任意の他の適切な基準に適合するようにオフセット距離を変更してもよい。例えば、より高い倍率の対物レンズの場合に、オフセット合焦カメラ７２を画像形成共役面のより近くに移動させることで、より小さい被写界深度（焦点）およびより小さな範囲のＺ軸方向の移動に適合させてもよい。実施形態によっては、オフセット距離を、制御システム１０８でオフセット距離設定点として保存してもよい。オフセット距離設定点を、例えば、試料の厚みおよび／もしくは任意の他の適切な特性、試料等級および／もしくは試料の任意の他の適切な分類、および／または顕微鏡の光学特性（例えば、対物レンズの倍率）に関連付けてもよい。オフセット距離設定点を用いてオフセット合焦カメラ７２を自動的に配置してもよい。

図１〜図７を参照して、図８に開示される発明の対象のいくつかの実施形態に従う、自動焦点システム１００の自動焦点動作の一例を示す。自動焦点処理８００では自動焦点システム１００を用いる。

工程８１０で試料を試料台３０上に置いてもよい。

自動焦点システム１００が試料の鮮明度設定点（例えば、この値は使用者の入力または制御システム１０８により保存され、特定の試料、特定の試料等級、および／または試料の任意の他の適切な分類に関連付けられた以前の値により得られる）を知らない場合、工程８２０で制御システム１０８は試料台３０と対物レンズ２５を互いに近くなるようにおよび／またはより遠くなるように移動させ、その後、制御システムは（図５との関連で既に考察したように）適切な鮮明度アルゴリズムを用いて主合焦カメラ７０で撮影された画像が合焦されていると決定してもよい（例えば、制御システム１０８は（例えば、Ｚ位置１３０、すなわち図５に示す、試料が主合焦カメラ７０と合焦されている場合のＺ位置における）合焦位置を決定する）。実施形態によっては、主合焦カメラ７０の代わりに撮影カメラ５を用いて試料の最大鮮明度測定値を決定してもよい。実施形態によっては、自動焦点処理中に試料台および対物レンズの様々なＺ位置で、オフセット合焦カメラ７２で撮影された画像に基づいて、オフセット合焦カメラ７２の鮮明度曲線を計算してもよい。オフセット合焦カメラ７２の鮮明度曲線を、鮮明度曲線設定点として保存し、かつ特定の試料、特定の試料等級、および／または試料の任意の他の適切な分類と関連付けてもよい。

工程８３０で、実施形態によっては試料が合焦されていると決定したら、合焦画像を撮影カメラ５で撮影してもよい。

工程８４０で、主合焦カメラ７０（または撮影カメラ５）が試料に合焦していると決定したら、試料の画像をオフセット合焦カメラ７２で撮影してもよい。撮影された画像の鮮明度値を（例えば、主合焦カメラ７０に用いられた同じ鮮明度の方程式を用いて）計算し、制御システム１０８により保存してもよい。保存される値を、合焦鮮明度設定点として保存され、かつ特定の試料、特定の試料等級、および／または試料の任意の他の適切な分類と関連付けてもよい。実施形態によっては、主合焦カメラ７０または撮影カメラ５が試料に合焦している場合、試料台３０、対物レンズ２５、試料台３０上の試料の上面、および／または試料台３０の上面と対物レンズ２５との間の距離の絶対位置を制御システム１０８により位置設定点として保存してもよい。この位置設定点は、特定の試料、特定の試料等級、および／または試料の任意の他の適切な分類と関連付けられてもよい。

工程８５０で、試料台３０をＺ軸に対して垂直なＸ・Ｙ平面で移動させてもよい

工程８６０で、実施形態によってはオフセット合焦カメラ７２を用いて試料台３０の新たなＸ軸およびＹ軸方向の位置で試料の画像を撮影してもよく、また、制御システム１０８は当該画像の鮮明度値を計算してもよい。合焦鮮明度設定点と比較した画像の鮮明度値に基づいて、制御システム１０８は、試料台３０’の新たなＸ・Ｙ座標で試料が合焦されているか、またはＺ軸方向の高さを調節する必要があるかを決定し、その結果、試料を合焦することができる。例えば、図６に示す鮮明度曲線に基づいて計算した鮮明度値が、保存した合焦鮮明度設定点よりも大きい場合、オフセット合焦カメラ７２で撮影した画像の鮮明度値が、保存した鮮明度設定点と同じであると判断されるまで、試料台３０と対物レンズ２５をＺ軸方向で互いに近づける。逆に、計算した鮮明度値が、保存した合焦鮮明度設定点よりも小さい場合、オフセット合焦カメラ７２で撮影した画像の鮮明度値が、保存した合焦鮮明度設定点と同じであると判断されるまで、試料台と対物レンズをＺ軸方向で互いに遠ざける。Ｚ位置を調節する方向を、自動焦点処理中に工程８２０においてオフセット合焦カメラ７２で撮影した画像の鮮明度曲線から、または画像形成共役面７２に対するオフセット合焦カメラ７２の位置に基づいて決定してもよい。オフセット合焦カメラで画像の鮮明度値を計算し、鮮明度値を保存した合焦鮮明度設定点と比較するこの処理は、試料台３０のＸ・Ｙ座標を変更する度に繰り返してもよい。

工程８７０で、新たな試料を試料台３０上に置いてもよい。試料、試料等級、および／または試料の任意の他の適切な分類にすでに関連付けられた鮮明度設定点があると制御システム１０８が決定した場合、制御システムは、工程８４０に記載したようにオフセット合焦カメラ７２で撮影した画像を用いて新たな試料が合焦されたときを決定する。例えば、新たな試料の画像をオフセット合焦カメラ７２で撮影し、かつ鮮明度値を当該新たな試料に関連付けられている鮮明度設定点と比較してもよい。オフセット合焦カメラ７２で撮影した画像の鮮明度値が、保存した鮮明度設定点と同じであると判断されるまで、Ｚ軸方向に試料台および対物レンズを互いに近づけるか、遠ざけてもよい。

実施形態によっては、オフセット合焦カメラ７２を用いて鮮明度設定点に対応する試料の鮮明度値を計算したら、主合焦カメラ７０を用いて試料の焦点およびオフセット合焦カメラ７２の鮮明度設定点を微調節してもよい。例えば、主合焦カメラ７０を用いて試料台および対物レンズの少なくとも２つの相対Ｚ位置の鮮明度値を計算し、推定最大鮮明度を達成したか、あるいは相対Ｚ位置を調節することで推定最大鮮明度（すなわち、傾きが０または０に近い鮮明度曲線の地点）を達成する必要があるかどうかを決定してもよい。推定最大鮮明度を達成したら、オフセット合焦カメラを用いて試料の鮮明度値を計算し、新たな鮮明度設定点として保存してもよい。

実施形態によっては、上述の合焦処理を開始する前に、制御システム１０８は新たな試料、試料等級、および／または試料の任意の他の適切な分類に関連付けられている位置設定点があるかどうかも決定し、自動焦点システム１００をその位置設定点に配置してもよい。相対Ｚ位置が分かっていれば、試料を合焦するのに必要なＺ軸方向の相対距離を小さくし、オフセット合焦カメラを画像形成共役面のより近くに配置することができる。図７との関連で既に考察したように、オフセット合焦カメラ７２が画像形成共役面のより近くに移動するにつれて、鮮明度曲線の傾きはより急峻になり得る。より急峻な傾きは、Ｚ軸方向の高さのより小さな変化に対するより大きな解像度つまり鮮明度のより大きな変化を表す。より急峻な傾きにより、より微細な焦点の調節および制御を行うことができる。

処理８００の特定部分を実行するときの分割は変えてもよく、分割しないことまたは異なる分割をすることが本明細書に開示される発明の対象の範囲内である。なお、実施形態によっては処理８００の各ブロックを任意の適切な時間に実行してもよい。当然のことであるが、実施形態によっては本明細書に記載する処理８００の複数の部分のうちの少なくともいくつかを図８に示し、かつ記載した順序に限定されない任意の順序で実行してもよい。また、実施形態によっては、適切または並列である場合には、本明細書に記載する処理８００の複数の部分のうちのいくつかは実質的に同時であってもよい、または実質的に同時に実行されてもよい。それに加えて、あるいはそれに代えて、処理８００のいくつかの部分を実施形態によっては省いてもよい。

処理８００は任意の適切なハードウェアおよび／またはソフトウェアで実装されてもよい。例えば、実施形態によっては、処理８００は制御システム１０８に実装されてもよい。

顕微鏡自動焦点のシステムおよび方法を、図示したこれらの実施形態を具体的に参照して詳細に説明した。しかし、上述の明細書に記載した本開示の趣旨および範囲内で様々な変形および改変を行うことができることが明らかであり、そのような変形および改変は本開示の均等物および一部とみなされる。本発明の範囲は以下の特許請求の範囲のみにより限定される。

Claims (32)

1. 顕微鏡自動焦点システムであって、
   対物レンズ、
   第１の画像形成共役面上に試料を配置する試料台、
   第２の画像形成共役面上に配置され、合焦するように構成される第１のカメラ、
   前記第２の画像形成共役面に対してオフセット距離を有するように配置され、合焦するように構成される第２のカメラ、
   前記第１のカメラで受光される第１の波長範囲の光を出射する主照明光源、
   前記第１の波長範囲と異なる第２の波長範囲の光を出射し、第３の画像形成共役面上に配置される合焦パターンを通してその光を投影し、前記投影光は前記第２のカメラで受光される、副照明光源、および
   前記第１のカメラおよび前記第２のカメラに連結されているハードウェアプロセッサを含み、
   前記ハードウェアプロセッサは、
   前記第１のカメラを用い、鮮明度値に基づいて前記試料が合焦されるときを決定し、
   前記試料が前記第１のカメラで合焦されていると決定された場合に、前記第２のカメラを用いて前記試料の鮮明度設定点を決定し、
   前記試料の移動後に、前記第２のカメラを用いて前記試料の第１の鮮明度値を決定し、
   前記試料の前記第１の鮮明度値が前記鮮明度設定点よりも高いか低いかを決定し、かつ
   前記第２のカメラを用いて決定される前記試料の第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記対物レンズと前記試料台の間の距離を調節するように構成される、システム。
2. 前記ハードウェアプロセッサは、
   前記第２のカメラを用いて前記試料の鮮明度曲線を決定し、かつ
   前記第２のカメラを用いて決定された前記試料の前記第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記鮮明度曲線に基づいて前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を調節するようにさらに構成される、請求項１に記載のシステム。
3. 前記副照明光源と前記第１のカメラの間の光路内に配置され、前記副照明光源からの光が前記第１のカメラに到達するのを防止する第１のフィルタ、および
   前記第１の照明光源と前記第２のカメラの間の光路内に配置され、前記第１の照明光源からの光が前記第２のカメラに到達するのを防止する第２のフィルタをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
4. 前記第１のカメラは、前記試料が合焦されていると決定された場合に、前記試料の画像を撮影するようにも構成される、請求項１に記載のシステム。
5. 前記主照明光源と前記対物レンズの間の光路に配置される視野絞りをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
6. 前記ハードウェアプロセッサは、前記試料台および前記対物レンズのうちの少なくとも一方を移動させて大まかな合焦および微細な合焦を達成するようにさらに構成される、請求項１に記載のシステム。
7. 前記第２のカメラを用いて決定された前記試料の前記第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を調節することは、
   前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を繰り返し調節すること、
   前記第２のカメラを用いて前記第２の鮮明度値を繰り返し決定すること、および
   前記第２の鮮明度値を前記鮮明度設定点と繰り返し比較することを含む、請求項１に記載のシステム。
8. 前記ハードウェアプロセッサは、前記対物レンズに対する前記試料台の位置を保存するようにさらに構成される、請求項１に記載のシステム。
9. 前記保存された位置は、前記第２の画像形成共役面に対する前記第２のカメラの位置を決定するのに用いられる、請求項８に記載のシステム。
10. 顕微鏡自動焦点システムであって、
    対物レンズ、
    第１の画像形成共役面上に試料を配置する試料台、
    第２の画像形成共役面上に配置され、前記試料が合焦されていると決定された場合に、前記試料の画像を撮影するように構成される第１のカメラ、
    第３の画像形成共役面上に配置され、合焦するように構成される第２のカメラ、
    前記第３の画像形成共役面に対してオフセット距離を有するように配置され、合焦するように構成される第３のカメラ、
    前記第１のカメラで受光される第１の波長範囲の光を出射する主照明光源、
    前記第１の波長範囲と異なる第２の波長範囲の光を出射し、第４の画像形成共役面上に配置される合焦パターンを通してその光を投影し、前記投影光は前記第２および第３のカメラで受光される、副照明光源、および
    前記第２のカメラおよび前記第３のカメラに連結されているハードウェアプロセッサを含み、
    前記ハードウェアプロセッサは、
    前記第２のカメラを用い、鮮明度値に基づいて前記試料が合焦されるときを決定し、
    前記試料が前記第２のカメラで合焦されていると決定された場合に、前記第３のカメラを用いて前記試料の鮮明度設定点を決定し、
    前記試料の移動後に、前記第３のカメラを用いて前記試料の第１の鮮明度値を決定し、
    前記試料の前記第１の鮮明度値が前記鮮明度設定点よりも高いか低いかを決定し、かつ
    前記第３のカメラを用いて決定される前記試料の第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記対物レンズと前記試料台の間の距離を調節するように構成される、システム。
11. 前記ハードウェアプロセッサは、
    前記第３のカメラを用いて前記試料の鮮明度曲線を決定し、かつ
    前記第３のカメラを用いて決定された前記試料の前記第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記鮮明度曲線に基づいて前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を調節するようにさらに構成される、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記副照明光源と前記第１のカメラの間の光路内に配置され、前記副照明光源からの光が前記第１のカメラに到達するのを防止する第１のフィルタ、および
    前記第１の照明光源と前記第２および第３のカメラの間の光路内に配置され、前記第１の照明光源からの光が前記第２および第３のカメラに到達するのを防止する第２のフィルタをさらに含む、請求項１０に記載のシステム。
13. 前記主照明光源と前記対物レンズの間の光路に配置される視野絞りをさらに含む、請求項１０に記載のシステム。
14. 前記ハードウェアプロセッサは、前記試料台および前記対物レンズのうちの少なくとも一方を移動させて大まかな合焦および微細な合焦を達成するようにさらに構成される、請求項１０に記載のシステム。
15. 前記第３のカメラを用いて決定された前記試料の前記第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を調節することは、
    前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を繰り返し調節すること、
    前記第３のカメラを用いて前記第２の鮮明度値を繰り返し決定すること、および
    前記第２の鮮明度値を前記鮮明度設定点と繰り返し比較することを含む、請求項１０に記載のシステム。
16. 前記ハードウェアプロセッサは、前記対物レンズに対する前記試料台の位置を保存するように構成される、請求項１０に記載のシステム。
17. 前記保存された位置は、前記第３の画像形成共役面に対する前記第３のカメラの位置を決定するのに用いられる、請求項１６に記載のシステム。
18. 顕微鏡自動焦点方法であって、
    試料台上にある試料を第１の画像形成共役面上に配置する工程、
    合焦するように構成された第１のカメラを第２の画像形成共役面上に配置する工程、
    合焦するように構成された第２のカメラを前記第２の画像形成共役面に対してオフセット距離を有するように配置する工程、
    主照明光源から第１の波長範囲の光を出射し、その光を前記第１のカメラで受光する工程、
    副照明光源から前記第１の波長範囲と異なる第２の波長範囲の光を出射し、その光を第３の画像形成共役面上に配置される合焦パターンを通して投影し、前記投影光を前記第２のカメラで受光する工程、
    ハードウェアプロセッサにより、前記第１のカメラを用いて、鮮明度値に基づいて、前記試料が合焦されるときを決定する工程、
    前記試料が前記第１のカメラで合焦されていると決定された場合に、前記ハードウェアプロセッサにより、前記第２のカメラを用いて前記試料の鮮明度設定点を決定する工程、
    前記試料の移動後に、前記ハードウェアプロセッサにより、前記第２のカメラを用いて、前記試料の第１の鮮明度値を決定する工程、
    前記ハードウェアプロセッサにより、前記試料の前記第１の鮮明度値が前記鮮明度設定点よりも高いか低いかを決定する工程、および
    前記第２のカメラを用いて決定される前記試料の第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記ハードウェアプロセッサにより対物レンズと前記試料台の間の距離を調節する工程を含む、方法。
19. 前記第２のカメラを用いて前記試料の鮮明度曲線を決定する工程、および
    前記第２のカメラを用いて決定された前記試料の前記第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記鮮明度曲線に基づいて前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を調節する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記副照明光源からの光が前記第１のカメラに到達するのを防止する工程、および
    前記第１の照明光源からの光が前記第２のカメラに到達するのを防止する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
21. 前記第１のカメラは、前記試料が合焦されていると決定された場合に、前記試料の画像を撮影するようにも構成される、請求項１８に記載の方法。
22. 前記試料台および前記対物レンズのうちの少なくとも一方を移動させて大まかな合焦および微細な合焦を達成する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
23. 前記第２のカメラを用いて決定された前記試料の前記第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を調節する工程は、
    前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を繰り返し調節する工程
    前記第２のカメラを用いて前記第２の鮮明度値を繰り返し決定する工程、および
    前記第２の鮮明度値を前記鮮明度設定点と繰り返し比較する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
24. 前記対物レンズに対する前記試料台の位置を保存する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
25. 前記保存された位置は、前記第２の画像形成共役面に対する前記第２のカメラの位置を決定するのに用いられる、請求項２４に記載の方法。
26. 顕微鏡自動焦点方法であって、
    試料台上にある試料を第１の画像形成共役面上に配置する工程、
    前記試料が合焦されていると決定された場合に、前記試料の画像を撮影するように構成された第１のカメラを第２の画像形成共役面上に配置する工程、
    合焦するように構成された第２のカメラを第３の画像形成共役面上に配置する工程、
    合焦するように構成された第３のカメラを前記第３の画像形成共役面に対してオフセット距離を有するように配置する工程、
    主照明光源から第１の波長範囲の光を出射し、その光を前記第１のカメラで受光する工程、
    副照明光源から前記第１の波長範囲と異なる第２の波長範囲の光を出射し、その光を第４の画像形成共役面上に配置される合焦パターンを通して投影し、前記投影光を前記第２および第３のカメラで受光する工程、
    ハードウェアプロセッサにより、前記第２のカメラを用いて、鮮明度値に基づいて、前記試料が合焦されるときを決定する工程、
    前記試料が前記第２のカメラで合焦されていると決定された場合に、前記ハードウェアプロセッサにより、前記第３のカメラを用いて前記試料の鮮明度設定点を決定する工程、
    前記試料の移動後に、前記ハードウェアプロセッサにより、前記第３のカメラを用いて、前記試料の第１の鮮明度値を決定する工程、
    前記ハードウェアプロセッサにより、前記試料の前記第１の鮮明度値が前記鮮明度設定点よりも高いか低いかを決定する工程、および
    前記第３のカメラを用いて決定される前記試料の第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記ハードウェアプロセッサにより前記対物レンズと前記試料台の間の距離を調節する工程を含む、方法。
27. 前記第３のカメラを用いて前記試料の鮮明度曲線を決定する工程、および
    前記第３のカメラを用いて決定された前記試料の前記第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記鮮明度曲線に基づいて前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を調節する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記副照明光源からの光が前記第１のカメラに到達するのを防止する工程、および
    前記第１の照明光源からの光が前記第２および第３のカメラに到達するのを防止する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
29. 前記試料台および前記対物レンズのうちの少なくとも一方を移動させて大まかな合焦および微細な合焦を達成する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
30. 前記第３のカメラを用いて決定された前記試料の前記第２の鮮明度値が前記鮮明度設定点に対応するように、前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を調節する工程は、
    前記対物レンズと前記試料台の間の前記距離を繰り返し調節する工程、
    前記第３のカメラを用いて前記第２の鮮明度値を繰り返し決定する工程、および
    前記第２の鮮明度値を前記鮮明度設定点と繰り返し比較する工程を含む、請求項２６に記載の方法。
31. 前記対物レンズに対する前記試料台の位置を保存する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
32. 前記保存された位置は、前記第３の画像形成共役面に対する前記第３のカメラの位置を決定するのに用いられる、請求項３１に記載の方法。

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