CN114371550B - 使显微镜自动聚焦的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种使显微镜自动聚焦的系统和方法。该系统通过使用至少两个相机来促进更快聚焦。第一相机可以设置在第一成像共轭平面中，并且从发射第一波长范围内的光的第一照明源接收光。第二相机可以设置在相对于第一成像共轭平面的偏移距离处，并且从发射第二波长范围内的光的副照明源接收光。

Description

使显微镜自动聚焦的系统和方法

本申请是原案申请号为201980018741.3的发明专利申请(国际申请号：PCT/US2019/022070，申请日：2019年3月13日，发明名称：用于自动显微聚焦的系统、装置以及方法)的分案申请。

技术领域

本公开涉及用于自动显微聚焦的基于图像的机制。

背景技术

利用显微镜观察的大多数样本在样本的整个表面上的高度变化很小。虽然这些变化常常是人眼所看不到的，但是它们可以导致显微镜拍摄的样本的一部分图像散焦。

显微镜可以创建可用的聚焦图像的范围被称为景深。显微镜必须将样本的一部分保持在该显微镜的景深内以生成有用的图像。然而，当从观察样本的第一部分过渡到观察样本的第二部分时，样本高度的细微变化可能导致第二部分超出景深。

可以使用不同的清晰度测量(诸如图像对比度、分辨率、熵和/或空间频率含量等)来对显微镜拍摄的图像的聚焦质量进行测量。通常，当样本焦点对准时，所拍摄的图像将表现出最佳的清晰度质量(例如，大对比度、高范围的强度值以及锐利的边缘)。可以被用于确定样本何时焦点对准的不同清晰度测量通常需要拍摄一系列图像，并且增加或减小显微镜物镜与样本之间的距离，直到图像显得焦点对准为止。这增加了各个样本的总显微镜扫描时间，使得对于高吞吐量扫描应用而言，使用这种测量的方法极其缓慢。

因此，希望使用较少数量的图像来找到样本的合适的对焦平面。

发明内容

提供了用于自动显微聚焦的系统、方法以及介质。

在一些实施方式中，提供了使显微镜自动聚焦的系统，所述系统包括：物镜；镜台，所述镜台将样本定位在第一成像共轭平面上；第一摄像头，所述第一摄像头被配置为进行聚焦，所述第一摄像头设置在第二成像共轭平面上；第二摄像头，所述第二摄像头被配置为进行聚焦，并且所述第二摄像头被设置在相对于所述第二成像共轭平面的偏移距离处；主照明源，所述主照明源发射第一波长范围内的光，其中，所发射的光被所述第一相机接收；副照明源，所述副照明源发射与所述第一波长范围不同的第二波长范围内的光，并且将光投射通过设置在第三成像共轭平面上的聚焦图案，其中，所投射的光被所述第二相机接收；以及硬件处理器，所述硬件处理器联接至所述第一相机和所述第二相机，并且所述硬件处理器被配置成：使用所述第一相机，基于清晰度值来确定样本是否在焦点上；当确定所述样本在所述第一相机的焦点上时，使用所述第二相机来确定所述样本的清晰度设定点；在所述样本移动之后，使用所述第二相机来确定所述样本的第一清晰度值；确定所述样本的所述第一清晰度值是高于所述清晰度设定点还是低于所述清晰度设定点；以及对所述物镜与所述镜台之间的距离进行调节，使得使用所述第二相机确定的所述样本的第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

在一些实施方式中，提供了使显微镜自动聚焦的系统，所述系统包括：物镜；镜台，所述镜台将样本定位在第一成像共轭平面上；第一相机，所述第一相机被配置为在确定所述样本在焦点上时拍摄所述样本的图像，并且所述第一相机被设置在第二成像共轭平面上；第二相机，所述第二相机被配置为进行聚焦并且被设置在第三成像共轭平面上；第三相机，所述第三相机被配置为进行聚焦并且被设置在相对于所述第三成像共轭平面的偏移距离处；主照明源，所述主照明源发射第一波长范围内的光，其中，所发射的光被所述第一相机接收；副照明源，所述副照明源发射与所述第一波长范围不同的第二波长范围内的光，并且将光投射通过设置在第四成像共轭平面上的聚焦图案，其中，所投射的光被所述第二相机和所述第三相机接收；以及硬件处理器，所述硬件处理器联接至所述第二相机和所述第三相机，并且所述硬件处理器被配置成：使用所述第二相机，基于清晰度值来确定样本何时在焦点上；当确定所述样本在所述第二相机的焦点上时，使用所述第三相机确定所述样本的清晰度设定点；在所述样本移动之后，使用所述第三相机来确定所述样本的第一清晰度值；确定所述样本的所述第一清晰度值是高于所述清晰度设定点还是低于所述清晰度设定点；以及对所述物镜与所述镜台之间的距离进行调节，使得使用所述第三相机确定的所述样本的第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

在一些实施方式中，提供了使显微镜自动聚焦的方法，所述方法包括以下步骤：将样本定位在处于第一成像共轭平面上的镜台上；将被配置为进行聚焦的第一相机设置在第二成像共轭平面上；将被配置为进行聚焦的第二相机设置在相对于所述第二成像共轭平面的偏移距离处；从主照明源发射第一波长范围内的光，其中，所发射的光被所述第一相机接收；从副照明源发射与所述第一波长范围不同的第二波长范围内的光，其中，所述光被投射通过设置在第三成像共轭平面上的聚焦图案，其中，所投射的光被所述第二相机接收；由硬件处理器使用所述第一相机，基于清晰度值来确定样本何时在焦点上；当确定所述样本在所述第一相机的焦点上时，由所述硬件处理器使用所述第二相机来确定所述样本的清晰度设定点；在所述样本移动之后，由所述硬件处理器使用所述第二相机来确定所述样本的第一清晰度值；由所述硬件处理器确定所述样本的所述第一清晰度值是高于所述清晰度设定点还是低于所述清晰度设定点；以及由所述硬件处理器对物镜与所述镜台之间的距离进行调节，使得使用所述第二相机确定的所述样本的第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

在一些实施方式中，提供了使显微镜自动聚焦的方法，所述方法包括以下步骤：将样本定位在处于第一成像共轭平面上的镜台上；将第一相机设置在第二成像共轭平面上，所述第一相机被配置为当确定所述样本在焦点上时拍摄所述样本的图像；将被配置为进行聚焦的第二相机设置在第三成像共轭平面上；将被配置为进行聚焦的第三相机设置在相对于所述第三成像共轭平面的偏移距离处；从主照明源发射第一波长范围内的光，其中，所发射的光被所述第一相机接收；从副照明源发射与所述第一波长范围不同的第二波长范围内的光，其中，所述光被投射通过设置在第四成像共轭平面上的聚焦图案，其中，所投射的光被所述第二相机和所述第三相机接收；由硬件处理器使用所述第二相机，基于清晰度值来确定样本何时在焦点上；当确定所述样本在所述第二相机的焦点上时，由所述硬件处理器使用所述第三相机来确定所述样本的清晰度设定点；在所述样本移动之后，由所述硬件处理器使用所述第三相机来确定所述样本的第一清晰度值；由所述硬件处理器确定所述样本的所述第一清晰度值是高于所述清晰度设定点还是低于所述清晰度设定点；以及由所述硬件处理器对所述物镜与所述镜台之间的距离进行调节，使得使用所述第三相机确定的所述样本的第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

附图说明

图1示出了根据所公开的主题的一些实施方式的自动聚焦系统的示例。

图2示出了根据所公开的主题的一些实施方式的照明单元的示例。

图3示出了根据所公开的主题的一些实施方式的聚焦单元的示例。

图4示出了根据所公开的主题的一些实施方式的光路的示例。

图5示出了根据所公开主题的一些实施方式的主聚焦相机的清晰度曲线的示例。

图6示出了根据所公开的主题的一些实施方式的偏移聚焦相机的清晰度曲线的示例。

图7示出了根据所公开的主题的一些实施方式的处于相对于成像共轭平面的不同距离的偏移聚焦相机的清晰度曲线的示例。

图8示出了根据所公开的主题的一些实施方式的、使用诸如图1所示系统的自动聚焦系统来执行自动聚焦的处理的流程图的示例。

具体实施方式

根据所公开的主题的一些实施方式，提供了对样本进行自动显微聚焦的机制(其可以包括系统、方法、装置、设备等)。

图1例示了根据所公开的主题的一些实施方式的自动聚焦系统的示例100。在较高水平，根据一些实施方式的自动聚焦系统100的基本组件包括：提供光的照明单元200、寻找样本的对焦平面(in-focus plane)的聚焦单元300、垂直照明器13、成像相机5、物镜25、镜台30以及包括硬件、软件和/或固件的控制系统108。

可以将自动聚焦系统100实现为任何合适类型的显微镜的一部分。例如，在一些实施方式中，可以将系统100实现为使用透射光或反射光的光学显微镜的一部分。更特别地，可以将系统100实现为从Nanotronics Imaging,Inc.of Cuyahoga Falls,OH可获得的光学显微镜的一部分。尽管下面的描述涉及反射光垂直照明器13，但是本文所描述的机制可以是不使用反射光垂直照明器的显微镜的一部分。

根据一些实施方式，显微镜可以包括一个或更多个物镜25。物镜可以具有不同的放大倍率，和/或可以被配置成与明场/暗场显微镜、微分干涉对比(DIC)显微镜和/或任何其它合适形式的显微镜一起工作。在一些实施方式中，可以通过软件、硬件和/或固件来控制被用于检查样本的物镜和/或显微镜技术。

在一些实施方式中，可以使用精细聚焦致动器23来沿Z方向朝向和远离镜台30驱动物镜25。可以将精细聚焦致动器23设计为对物镜25进行高精度和精细聚焦调节。精细聚焦致动器23可以是步进马达、伺服马达、线性致动器、压电马达和/或任何其它合适机构。例如，在一些实施方式中，可以使用压电马达，它可以将物镜驱动0至50微米(μm)、0至100μm、0至200μm和/或任何其它合适的距离范围。

在一些实施方式中，可以将XY平移台可用于镜台30。可以由步进马达、伺服马达、直线马达和/或任何其它合适机构来驱动XY平移台。

在一些实施方式中，可以使用包括致动器35的聚焦单元32来沿Z方向朝向和远离物镜25调节镜台30。可以使用致动器35来进行粗略聚焦调节，例如，0至5mm、0至10mm、0至30mm和/或任何其它合适的距离范围。还可以使用致动器35来使镜台30上下移动，以允许将不同厚度的样本放置在镜台上。在一些实施方式中，可以使用致动器35来提供精细聚焦，例如，0至50μm、0至100μm、0至200μm和/或任何其它合适的距离范围。在一些实施方式中，聚焦单元32还可以包括定位装置33。即使自动聚焦系统100重置和/或周期性通电，也可以将定位装置配置成存储载镜台30的绝对位置(例如，样本在焦点上时的镜台位置)。在一些实施方式中，定位装置可以是线性编码器、旋转编码器或任何其它合适的机构以跟踪镜台30相对于物镜的绝对位置。

在一些实施方式中，自动聚焦系统100在其正确地聚焦并且对准时，可以包括一组共轭焦平面，例如，沿着穿过显微镜的光路出现的成像共轭组。成像共轭组内的各个平面与该组中的其它平面共轭，这是因为这些平面同时在焦点上，并且在通过显微镜观察样本时可以认为彼此重叠。自动聚焦系统100中的该组成像共轭平面可以包括：主聚焦相机72像平面、成像相机5像平面、聚焦图案55像平面、视场光阑(F挡)14像平面以及样本像平面。更具体地，本文中所有关于将主聚焦相机72和成像相机5设置在成像共轭平面上的指代均是指将相机5和相机7内的传感器设置在成像共轭平面上。

在一些实施方式中，聚焦图案55可以由不透明材料形成，并且从材料切出图案。该材料的切除部分允许光穿过样本像平面，而不透明的材料部分阻止光穿过。在其它实施方式中，聚焦图案55可以由诸如透明玻璃或透明塑料的透明材料形成，在该透明材料上具有不透明图案，该不透明图案使得由穿过透明玻璃或塑料的光将图像投射在样本像平面上。

在一些实施方式中，成像相机5可以包括位于自动聚焦系统100的成像共轭平面上的图像传感器6。一旦控制系统108确定样本在焦点上，就可以使用成像相机5来拍摄样本的图像。图像传感器6例如可以是CCD、CMOS和/或允许拍摄并存储样本图像的任何其它合适的电子装置。

在一些实施方式中，包括控制器110和控制器接口107的控制系统108可以控制自动聚焦系统100的组件(例如，致动器35和23、主照明源65，副照明源40、聚焦相机70和72、镜台30、聚焦图案55、成像相机5以及物镜25)的任何设定，并且控制由自动聚焦系统的组件执行的和在自动聚焦系统的组件之间进行的通信、操作((例如，拍摄图像、接通和关掉照明源、移动镜台30和物镜25、存储与样本相关联的不同的值)以及计算(例如，清晰度计算)。控制系统108可以包括任何合适的硬件(在一些实施方式中，该硬件可以执行软件)，举例来说，如计算机、微处理器、微控制器、专用集成电路(ASIC)以及数字信号处理器(其中任一个都可以被称为硬件处理器)、编码器、读取编码器的电路、存储器装置(包括一个或更多个EPROM、一个或更多个EEPROM、动态随机存取存储器(“DRAM”)、静态随机存取存储器(“SRAM”)和/或闪速存储器)和/或任何其它合适的硬件部件。在一些实施方式中，自动聚焦系统100内的各个组件可以包括它们自己的软件、固件和/或硬件，以对自动聚焦系统100中的各个组件进行控制并且与自动聚焦系统100中的其它组件进行通信。

在一些实施方式中，控制系统(例如，控制器110和控制器接口107)与自动聚焦系统100的组件之间的通信120可以使用模拟技术(例如，继电器逻辑)、数字技术(例如，使用RS232、以太网或无线)和/或任何其它合适的通信技术。

在一些实施方式中，可以使用任何合适的输入装置(例如，键盘、鼠标或操纵杆)来向控制系统传送操作员输入。

图2示出了根据所公开的主题的一些实施方式的自动聚焦系统的照明单元的实施方式的总体配置。照明单元200可以包括两个照明源，例如，主照明源65和副照明源40。照明源可以提供波长范围彼此不同的光束。

在一些实施方式中，例如，主照明源65提供波长在451纳米(nm)至750nm范围内的光束，而副照明源40提供波长高于或低于被用于主照明源的波长范围的光束。例如，主照明源65的波长范围可以在550nm至750nm的范围内，并且副照明源的波长范围可以在400nm至450nm的范围内。只要范围值是已知的并且可以使用已知的滤波技术将所述光与其它波长分离开，就可以将任何波长范围内的光用于主照明源65。类似地，只要任何波长范围内的光与主照明源65不在同一波长范围内，就可以将所述光用于副照明源40。

在一些实施方式中，如图1所示，设置主照明源65，以使该主照明源的光在水平方向上朝向垂直照明器13传输。主照明源65可以包括用于聚焦主光束的聚焦透镜49(例如，双凸透镜)。可以将副照明源40设置在位于成像共轭平面54上的聚焦图案55下方的合适距离处。可以调节聚焦图案55的直径(例如，5mm)，以使聚焦图案55的投影小于聚焦相机70和72的视场(FOV)。聚焦图案55可以是任何合适的几何形状，例如，圆形、矩形、三角形或六边形。聚焦图案55还可以包括一系列离散的开口，以使在光传输通过离散的开口时，将线条和空间投影在整个视场中。在一些实施方式中，主照明源65和副照明源40两者的位置可以切换。

在一些实施方式中，可以将自动聚焦系统100配置成使得来自副照明源40的光连续地透过聚焦图案55，以便将聚焦图案图像连续地投影在可以由聚焦相机70和72拍摄的样本上。尤其是对于透明样本或者缺少任何视觉上可识别特征的样本，聚焦图案图像的连续投影可以促进样本的清晰聚焦。对于清晰度聚焦，可以代替视场光阑或者除了视场光阑外，还可以使用聚焦图案55。例如，自动聚焦系统100除了聚焦图案55外还可以包括可位于垂直照明器13中的视场光阑(F-stop)14。也可以将视场光阑14定位在自动聚焦系统100的成像共轭平面上。在一些实施方式中，视场光阑14对由照明源65和40发射并透射到物镜25的光的直径进行控制。更具体地，在一些实施方式中，通过减小视场光阑的尺寸，使穿过的光的直径减小。这在由聚焦相机70和72接收到的样本图像周围产生了深色轮廓，并且该深色轮廓可以被用于调节样本的聚焦(例如，通过将样本和物镜一起靠近或分离得更远)。在最大测得清晰度的点处，样本被认为在焦点上，并且可以将视场光阑打开至更大的尺寸以允许成像相机5对样本进行成像。然而，减小视场光阑并将其恢复到其原始尺寸需要花费时间(例如，2秒钟至5秒钟)，并且会减慢扫描过程和吞吐量。

可以将聚焦图案55设置在自动聚焦系统100的任何合适的成像共轭平面上(例如，在副照明源40上方(如图1所示)，或者在视场光阑14处)，只要在必要时使用合适的滤光器以确保聚焦图案55没有投影到成像相机5上即可。例如，如果将聚焦图案55设置在视场光阑14成像共轭平面上以代替视场光阑14，那么就需要滤光器。在一些实施方式中，可以在视场光阑成像共轭平面上设置带通滤光器(band filter)(以代替视场光阑14)，并且可以在该带通滤光器中创建采用图案切口的形式的聚焦图案。更具体地，可以选择这样的带通滤光器：透射在主照明源65的相同波长范围(例如，大于450nm)内的光，并且在除了聚焦图案55区域以外的其它区域中，阻挡在副照明源40的相同波长范围(例如，小于或等于450nm)内的光。换句话说，在除了聚焦图案55的区域以外的其它区域中，将阻挡副照明源40的相同波长范围内的光，这将允许来自副照明源40的光透射至聚焦相机70和72。如下结合图4所述，滤光器11确保仅来自主照明源65的光透射至成像相机5。

应注意，在一些实施方式中，可以将任何合适的照明源与照明单元200一起使用，诸如用于副照明源40的400nm紫外光准直发光二极管(LED)以及用于主照明源65的5500K白光准直LED。

在一些实施方式中，可以将聚焦透镜45(例如，焦距为60mm的双凸透镜)放置在副照明源40与聚焦图案55之间的合适距离处。此外，可以在聚焦图案55的另一侧以合适的距离放置另一聚焦透镜47。在一些实施方式中，透镜45和47与聚焦图案55的距离可以基于显微镜的光学特性，以确保光的聚焦和聚焦图案55的定位将处于成像共轭平面中。

在一些实施方式中，在光行进至垂直照明器13之前，将双色向镜60放置在主照明源65和副照明源40两者的光路中。如本文所用，双色向镜可以指反射镜、分束器、滤光器或光束组合器，该双色向镜透射已知的指定波长的光，并将所述光与另一已知的指定波长的光组合。应注意，可以将前述装置的组合用于反射和透射希望的照明源和波长。在一些实施方式中，选择具有特定截止波长的双色向镜，以便反射由副照明源40发射的光的波长并使从主照明源65发射的光的波长通过。例如，如果副照明源40发射400nm至450nm波长范围内的光，而主照明源65发射550nm至750nm波长范围内的光，则可以使用450nm的截止双色向镜(即，反射波长为450nm及以下的光并允许波长大于450nm的光穿过从而对光束进行组合的双色向镜)，以反射来自副照明源40的光并且允许来自主照明源65的光穿过。可以将双色向镜60设计为45°的入射角，使得来自副照明源40的被拒绝的光以90°的角度反射，并且平行于来自主照明源65的光路行进。

在一些实施方式中，主照明源65可以是被用于在成像相机5中的成像传感器6上对样本进行成像的光源，而副照明源40可以是被用于在聚焦相机70和72的聚焦传感器71和73上对样本进行成像的光源。

应注意，在一些实施方式中，可以将任何合适的双色向镜、照明器、照明源、聚焦透镜、传感器以及聚焦图案与照明单元200一起使用。在一些实施方式中，可以将这些组件的任何合适的布置与照明单元200一起使用。在一些实施方式中，可以将照明单元200的组件以任何合适的方式安装至照明器13，诸如以与图3中示出的将聚焦相机72安装至聚焦壳体18类似的方式(如下所述)，通过使用导杆将照明单元的组件安装至照明器，以便允许可变的几何形状。

图3示出了根据所公开的主题的一些实施方式的自动聚焦系统的聚焦单元的实施方式的总体配置的示例。聚焦单元300可以包括两个相机：主聚焦相机70和偏移聚焦相机72。这些相机例如可以包括电荷耦合器件(CCD)图像传感器、CMOS图像传感器和/或允许拍摄样本图像的任何其它合适的图像传感器。在一些实施方式中，由控制系统108存储和分析所拍摄的图像。

可以将聚焦单元300安装在垂直照明器13与成像相机镜筒10之间的区域中。该区域被称为无限空间。在一些实施方式中，可以使用合适的组件将聚焦单元300安装在其它位置，以使选择的位置适应系统的光学特性。

主聚焦相机70可以包括位于自动聚焦系统100的成像共轭平面上的传感器71(举例来说，如线80所示)。

偏移聚焦相机72可以包括传感器73，传感器73可以相对于成像共轭平面80偏移地设置。该偏移可以是正方向81或负方向79。偏移聚焦相机72可以位于主聚焦相机70上方或下方。偏移聚焦相机72可以沿着导杆76或者任何其它合适的结构移动，以便调节偏移相机72的偏移距离。可以基于在距成像共轭平面80的不同距离处计算出的偏移聚焦相机72的清晰度曲线来调节偏移距离，如下结合图7所讨论的。

聚焦单元300还可以包括两个聚焦透镜24和22。可以将聚焦透镜22放置在与主聚焦相机70相同的水平光路中，并且可以将聚焦透镜24放置在与偏移聚焦相机72相同的水平光路中。在一些实施方式中，聚焦透镜22和24的焦距与显微镜镜筒透镜10相同，以确保当传感器71和73位于成像共轭平面80上时它们皆在焦点上。显微镜镜筒透镜10可以包括将样本图像聚焦在传感器6上的透镜(未示出)，使得当传感器6位于自动聚焦系统100的成像共轭平面上时，样本在焦点上。

注意，在一些实施方式中，透镜22和24可以是双凸透镜或者任何其它合适类型的透镜。在一些实施方式中，透镜的焦距可以基于显微镜的光学特性。

还如图3所示，聚焦单元300还可以包括截止双色向镜15，该截止双色向镜15位于从样本反射的光的光路中的垂直照明器13上方。设置双色向镜15以使从样本反射的、位于双色向镜的截止点以下的光以90°的角度朝向主聚焦相机70反射。可以选择具有特定截止波长的双色向镜，以便反射由副照明源40发射的光的波长(“聚焦光束”)。例如，如果聚焦光束在400nm至450nm的范围内，则可以将450nm截止滤光器与聚焦单元300一起使用，以便将聚焦光束朝向主聚焦相机70反射。

在一些实施方式中，聚焦单元300可以包括分束器26，该分束器可以位于双色向镜15与主聚焦相机70之间。分束器26例如可以是50/50分束器，该50/50分束器被设计成将50％的聚焦光束发送至主聚焦相机70，并将50％的聚焦光束发送至偏移聚焦相机72。可以将反射镜28放置在分束器26正上方的某一距离处，并且可以将该反射镜设计成，将来自分束器26的光束引导至偏移聚焦相机72。

在一些实施方式中，可以将截止滤光器17设置在双色向镜15与分束器26之间，以滤除来自主照明源65的任何光(“成像光束”)。例如，如果成像光束的波长在450nm和以上的范围内，则可以使用450nm截止滤光器来滤除成像光束并防止成像光束将光传输至聚焦相机70和72。在其它实施方式中，可以使用两个截止滤光器，并且可以将各个滤光器例如放置在透镜22和24的前面或后面。

应注意，在一些实施方式中，可以将任何合适的双色向镜、聚焦相机、聚焦透镜、反射镜、图像传感器、分束器以及截止滤光器与聚焦单元300一起使用。在一些实施方式中，可以将这些组件的任何合适的布置与聚焦单元300一起使用。可以将聚焦单元300的组件安装至导杆或连接这些组件的任何其它合适的结构。此外，在一些实施方式中，主聚焦相机70不是必需的，并且本文所描述的主聚焦相机70的聚焦操作可以代替地由成像相机5来执行。

图4示出了根据所公开的主题的一些实施方式的自动聚焦系统100的、由一对虚线表示的示例光路。可以将自动聚焦系统100配置成使得从副照明源40发射的光(“聚焦光束(FB)”，由短虚线表示)投影到样本S上，然后被反射至聚焦相机70和72。还可以将自动聚焦系统100配置成，以使从主照明源65发射的光(“成像光束(IB)”，如由长虚线表示的)投影到样本S上，然后被反射至成像相机5。

更具体地，在一些实施方式中，聚焦光束可以从照明源40穿过聚焦图案55行进至双色向镜60。双色向镜60可以朝向垂直照明器13反射聚焦光束。

成像光束可以从主照明源65开始行进，穿过双色向镜60以与聚焦光束组合。

然后，组合的光束可以行进穿过垂直照明器13以到达棱镜20。棱镜20可以以90°的角度向下方穿过换镜转盘(nosepiece)和物镜25将来自照明源的光反射至样本S。样本S可以向上穿过物镜25反射组合的光束，然后所述光束透过棱镜20朝向双色向镜15传输。双色向镜15可以例如通过将聚焦光束的波长朝向聚焦相机70和72反射并且通过使成像光束的波长能够朝向相机5穿过，来将所透射的光束分离回成像光束和聚焦光束。

在一些实施方式中，被双色向镜15反射的聚焦光束可以穿过截止滤光器17以去除高于截止波长的任何光。然后，聚焦光束可以行进至分束器26。分束器26可以通过将光引导通过位于聚焦壳体18中的聚焦透镜22，来将聚焦光束的50％朝向主聚焦相机70发送。聚焦光束可以从聚焦透镜22行进至相机70中的光传感器71(图3)。聚焦光束的其它50％可以由分束器26向上朝向反射镜28引导。反射镜28可以将聚焦光束朝向位于聚焦壳体19中的聚焦透镜24反射。聚焦光束可以从聚焦透镜24被引导至偏移相机72中的传感器73(图3)。

在一些实施方式中，穿过双色向镜15的成像光束可以穿过滤光器11(例如，仅透射来自成像光束的波长的滤光器)、向上通过镜筒透镜10，然后直至位于成像相机5中的相机传感器6。

在一些实施方式中，可以将主聚焦相机70用于确定样本的对焦点。可以例如通过将物镜和镜台一起沿着Z轴移动得更近或更远来调节样本的焦点(如图1所示)。更特别地，可以将主聚焦相机70用于获得在两个或更多个Z位置处的样本的图像(例如，通过在Z方向上移动镜台30和/或物镜25)。根据所得到的图像，控制系统108可以针对样本的各个Z位置计算出相对清晰度值，以确定聚焦质量。自动聚焦系统100可以使用任何合适的清晰度方程来计算所得到的图像的相对清晰度。自动聚焦系统100可以用来计算相对清晰度得分的一个示例方程是通过均值μ进行归一化以解决强度波动的图像方差V的度量：

其中，s(i,j)是坐标(i,j)处的灰度像素值，N和M分别表示i和j方向上的像素数。Sivash Yazdanfar等人的“Simple and Robust Image-Based Autofocusing for DigitalMicroscopy”Optics Express Vol.16,No.12,8670(2008)描述了自动聚焦系统100可以使用的其它计算相对清晰度值的示例方法，因此通过引用其全部内容而并入本文。上面公开的技术只是示例，而并非旨在进行限制。

图5示出了包括表示样本在Z方向上的相对位置(“Z位置”)的X轴和表示相对清晰度得分的Y轴的图形。相对的Z位置表示镜台30的顶部与物镜25之间的距离。可以通过朝向或背向物镜25调节镜台30和/或朝向或背向镜台30调节物镜25来改变Z位置。图5所示的清晰度曲线在沿着该曲线的各个测量点处，对主聚焦相机70拍摄的图像的相对清晰度与相对的Z位置进行比较。如图5所示，样本的清晰度值在给定的相对位置(例如，Z位置130(该相对位置可以被称为对焦位置)处可以具有最大测得清晰度(例如，图5中的清晰度得分70)，并且在对焦位置(例如，Z位置130)的每一侧上对称地减小。在一些情况下，图5中的曲线的在对焦位置处的斜率可以为零或者接近零。应当理解，如本文所用，术语“在焦点上”旨在表示物镜和镜台的相对定位何时使得清晰度测量结果处于清晰度曲线的顶部的点处或顶部附近。术语“在焦点上”并非旨在限制成完美或最佳的聚焦。

粗略的Z移动的范围由线137(例如，500μm)和线142(例如，2500μm)表示。精细聚焦的Z移动的范围由线136(例如，1400μm)和线141(例如，1600μm)表示。注意，Z移动的范围是指在物镜25与镜台30之间实现不同的Z位置的实际运动范围。Z移动的范围还指的是可以使用清晰度计算来聚焦样本的Z移动的范围。箭头135示出了清晰度得分随着镜台30和物镜25移动分开更远而在Z位置130处增加至最高点(指示图像如上所述地被视为在焦点上)，箭头140示出了清晰度得分随着镜台30和物镜25继续移动分开更远而从Z位置130处的最大点开始降低。

图6示出了偏移聚焦相机72的示例清晰度曲线。与图5类似，该图形中的X轴表示相对的Z位置，Y轴表示相对清晰度得分，线130指示Z位置，在该位置找到主聚焦相机70的最大测得清晰度值。图6所示的清晰度曲线在沿着该曲线的各个点处，对偏移聚焦相机72拍摄的图像的相对清晰度与相对的Z位置进行比较。在一些实施方式中，自动聚焦系统100可以使用相同的方程来计算主聚焦相机70和偏移聚焦相机72的清晰度曲线。

如图6的示例所示，在如上面结合图5所述的使用主聚焦相机70确定的对焦位置(例如，Z位置130)处，由偏移聚焦相机72拍摄的图像的相对清晰度值约为28(如箭头138所示)。可以由控制系统108将该值(例如，28)存储为偏移相机72的针对该特定样本、样本类别和/或任何其它合适的分类组的清晰度设定点。在一些实施方式中，可以基于由具有类似的反射质量的材料制成的样本来定义样本类别。一些示例样本类别可以包括但不限于：裸硅晶片；具有已知图案的半导体晶片；以及与载玻片和盖玻片一致制备的相同已知物质的生物样本。

如图6所示，偏移聚焦相机72拍摄的图像的清晰度曲线在线137与线142之间(表示Z移动的范围)不断增加(如箭头150所示)。一旦找到样本或一类样本的清晰度设定点，就可以使用偏移聚焦相机72来确定是将镜台30和物镜25移动得靠近一起还是分离开更远。例如，如果确定样本的清晰度设定点是28并且在垂直于Z轴的X/Y平面上平移样本台30以使得样本不再处于焦点上，则可以使用由偏移聚焦相机72拍摄的图像的清晰度值，连同清晰度设定点以及清晰度曲线，以使样本重新处于焦点上。例如，如果由偏移聚焦相机72拍摄的样本图像的清晰度设定点如上所述是28，并且镜台平移后由偏移聚焦相机72拍摄的样本图像的相对清晰度值是52(例如)，那么如从图6中的清晰度曲线看出，必须减小镜台与物镜之间的距离(例如，从2000μm降至1500μm)，以使样本重新处于焦点上。另一方面，如果由偏移聚焦相机72拍摄的样本图像的相对清晰度值小于28(例如，20)，那么如从图6中的清晰度曲线看出，必须增大镜台与物镜之间的距离(例如，从1000μm增至1500μm)，以使样本重新处于焦点上。由于偏移聚焦相机72的相对清晰度曲线连同清晰度设定点一起指示是否必须减小或增大镜台与物镜之间的距离，因此可以拍摄更少的样本图像来使样本重新处于焦点上。

不能从图5所示的清晰度曲线中收集到有关是否将镜台和物镜移动得更靠近一起或分离得更远的相同信息。例如，如图5所示，如果由主聚焦相机70拍摄的样本的最大测得清晰度值是70，并且样本的实际清晰度值被测得为51，则清晰度曲线表明相对的Z位置可能位于Z位置130处的对焦点的右侧或者左侧。由于相对的Z位置可能位于Z位置130处的对焦点的右侧或者左侧，因此无法将该清晰度曲线用于确定是否将镜台和物镜移动得更靠近一起或分离得更远。

图7示出了当将偏移聚焦相机72定位在距成像共轭平面80(如图3所示)的不同的距离处时，该偏移聚焦相机的不同的示例清晰度曲线(即，清晰度曲线A、B及C)。与图6类似，图7的图形中的X轴表示相对的Z位置，Y轴表示相对清晰度得分，线130指示Z位置，在该位置找到主聚焦相机70的最大测得清晰度值。清晰度曲线A、B及C在沿着该曲线的各个点处，对偏移聚焦相机72拍摄的图像的相对清晰度与相对的Z位置进行比较。清晰度曲线D在沿着该曲线的各个点处，对主聚焦相机70拍摄的图像的相对清晰度与相对的Z位置进行比较。在一些实施方式中，自动聚焦系统100使用相同的清晰度方程来计算清晰度曲线A、B、C及D。注意，本文中的偏移聚焦相机72的定位是指传感器73在聚焦相机72中的定位。

在这三个清晰度曲线中，曲线C表示当偏移聚焦相机72距成像共轭平面80最近时该偏移聚焦相机的清晰度曲线。曲线B表示当偏移聚焦相机72处于以下距离时该偏移聚焦相机的清晰度曲线：所述距离比该偏移聚焦相机在曲线C时的偏移距离远，但比该偏移聚焦相机在曲线A时的偏移距离近。曲线A表示当偏移聚焦相机72距成像共轭平面80最远时该偏移聚焦相机的清晰度曲线。偏移距离是指偏移聚焦相机72的传感器73与成像共轭平面80之间的距离。

线A'、B'及C'表示相应曲线A、B及和C在Z位置(例如，线130)处的斜率，在该位置，样本被认为处于主聚焦相机70的焦点上(如上面结合图5所述)。随着偏移聚焦相机72移动得更靠近成像共轭平面80，曲线的斜率变得较陡。较陡的斜率表示清晰度的较大变化与Z高度的较小变化(也被称为较高的分辨率)。希望较陡的斜率，因为它可以实现较精细的聚焦调节和控制。

在一些实施方式中，使样本在焦点上所需的Z移动的范围可以确定偏移距离。Z移动的范围例如可以基于：样本的厚度和/或任何其它合适的特性；样本类别和/或样本的任何其它合适的分组；和/或显微镜的光学特性(例如，物镜的放大倍率)。还可以将Z移动的范围选择成涵盖大范围的样本类型，以防止必须不断调节偏移距离。

在一些实施方式中，为了确定自动聚焦系统100的合适的偏移距离，可以将偏移聚焦相机72定位在不同的偏移距离处。可以在各个偏移距离处计算清晰度曲线。可以选择生成清晰度曲线的偏移距离，该清晰度曲线表示希望的Z移动范围，并且在该范围内不断增加(以正斜率表示)或减小(以负斜率表示)。

更具体地，如果Z移动的范围较大(例如，图7所示的线137与线142之间的距离)，则可以将偏移聚焦相机72定位成距成像共轭平面80更远(如曲线A所示)。例如，如果Z移动的希望范围在500μm至2500μm之间(如线137和线142所示)，则不应将偏移相机定位在生成曲线B或曲线C的偏移距离处，因为曲线B和曲线C均在Z移动的希望范围内增加和减少，因此无法被用于确定是否将样本和物镜移动得更靠近一起或分离得更远。

在一些实施方式中，偏移距离也可以基于样本处于主聚焦相机70的最佳聚焦位置的清晰度曲线的陡度(例如，由线A'、B'及C'表示)。例如，如果使样本处于焦点上所需的Z移动的范围较小(例如，在1300μm至1700μm之间)，则可以将偏移聚焦相机72放置得更靠近成像共轭平面80(例如，在生成曲线C的偏移距离处)。即使较大的偏移距离可以生成可接受的清晰度曲线(例如，曲线B和A)，也可以选择偏移聚焦相机72的生成曲线C的位置，这是因为与距成像共轭平面80更远的偏移距离相比，该位置具有最陡的斜率和最大的分辨率。在一些实施方式中，可以选择距成像共轭平面80更远的位置，以适应自动聚焦系统100的Z移动的最大范围，使得对于厚度不同的样本，不必将偏移聚焦相机72不断地重新定位。

注意，可以将偏移聚焦相机72定位在成像共轭平面80的右侧或左侧的偏移距离处。在Z移动的范围内的清晰度斜率在定位至右侧或左侧时将沿一个方向移动并且彼此相反。例如，如果将偏移聚焦相机72定位至成像共轭平面80的右侧，并且清晰度斜率在Z值增大的范围内增大，那么如果将偏移聚焦相机72定位至成像共轭平面80的左侧，则清晰度斜率将是相反的(即，在Z值增大的范围内减小)。换句话说，清晰度斜率的符号(即，该斜率是正还是负)取决于偏移聚焦相机是在成像共轭平面的右侧还是左侧。因此，如果偏移聚焦相机的相对位置(即，偏移聚焦相机是在成像共轭平面的右侧还是左侧)、清晰度设定以及清晰度值是已知的，则可以推断是增加还是减小物镜和镜台的相对定位，以实现更好的聚焦。

在一些实施方式中，对于自动聚焦系统100，可以一次设定偏移聚焦相机72的偏移距离。在其它实施方式中，偏移距离可以改变以适应不同的物镜、不同的样本厚度、不同的样本类别或者任何其它合适的标准。例如，为了较高的放大倍率物镜，可以将偏移相机72移近成像共轭平面，以适应较小的景深(焦深)以及较小的Z移动范围。在一些实施方式中，可以由控制系统108将偏移距离保存为偏移距离设定点。例如，可以将偏移距离设定点与样本的厚度和/或任何其它合适的特性、样本类别和/或样本的任何其它合适的分组、和/或显微镜的光学特性(例如，物镜的放大倍率)相关联。可以将偏移距离设定点用于自动定位偏移聚焦相机72。

图8还参照图1至图7以高水平示出了根据所公开的主题的一些实施方式的自动聚焦系统100的自动聚焦操作的示例。自动聚焦处理800可以使用自动聚焦系统100。

在810，可以将样本放置在镜台上30。

如果自动聚焦系统100不知道样本的清晰度设定点(例如，该值可以通过用户输入来获得或者是由控制系统108存储并与特定样本、特定样本类别和/或样本的任何其它合适的分类组相关联的先前值)，则在820，控制系统108可以将镜台30和物镜25移动得更靠近一起和/或分离开更远，直到控制系统使用合适的清晰度算法确定(如上面结合图5所述)由主聚焦相机70拍摄的图像在焦点上(例如，控制系统108确定对焦位置例如在Z位置130处，即，当样本被视为处于主聚焦相机的焦点上时的Z位置，如图5所示)。在一些实施方式中，可以使用成像相机5而不是主聚焦相机70来确定样本的最大测得清晰度值。在一些实施方式中，可以基于在聚焦处理期间在镜台和物镜的各个Z位置处由偏移聚焦相机72拍摄的图像，来计算偏移聚焦相机72的清晰度曲线。可以将偏移聚焦相机72的清晰度曲线存储为清晰度曲线设定点，并且与特定样本、特定样本类别和/或样本的任何其它合适的分类组相关联。

在830，在一些实施方式中，一旦确定样本在焦点上，就可以由成像相机5拍摄对焦图像。

在840，一旦主聚焦相机70(或成像相机5)确定样本在焦点上，就可以由偏移聚焦相机72拍摄样本的图像。可以计算出所拍摄的图像的清晰度值(例如，使用与用于主聚焦相机70相同的清晰度方程)并由控制系统108存储该清晰度值。可以将所存储的值存储为对焦清晰度曲线设定点，并且与特定样本、特定样本类别和/或样本的任何其它合适的分类组相关联。在一些实施方式中，当样本处于主相机70或成像相机5的焦点上时，可以由控制系统108将以下项的绝对位置存储为位置设定点：镜台30；物镜25；镜台30上的样本的顶部；和/或镜台30的顶部与物镜25之间的距离。可以将位置设定点与特定样本、特定样本类别和/或样本的任何其它合适的分类组相关联。

在850，可以使镜台30在垂直于Z轴的X/Y平面中移动。

在860，在一些实施方式中，可以将偏移相机72用于在镜台30的新的X、Y位置处拍摄样本的图像，并且控制系统108可以计算该图像的清晰度值。基于图像的清晰度值与对焦清晰度设定点进行的比较，控制系统108可以确定样本是否处于镜台30的新的X、Y坐标处的焦点上，或者Z高度是否需要进行调节，以使样本重新处于焦点上。例如，基于图6所示的清晰度曲线，如果计算出的清晰度值大于所存储的对焦清晰度设定点，则可以使镜台30和物镜25在Z方向上靠得更近，直到计算出偏移相机72拍摄的图像的清晰度值与所存储的清晰度设定点相同为止。相反地，如果计算出的清晰度值小于所存储的对焦清晰度设定点，则可以使镜台和物镜在Z方向上相距更远，直到计算出偏移相机72拍摄的图像的清晰度值与所存储的对焦清晰度设定点相同为止。可以根据在820处的聚焦处理期间为偏移相机72捕获的清晰度曲线或者基于偏移聚焦相机72相对于成像共轭平面72的位置来确定调节Z位置的方向。每当镜台30的X、Y坐标发生变化时，可以重复该处理：计算偏移聚焦相机的图像的清晰度值并且将该清晰度值与所存储的对焦清晰度设定点进行比较。

在870，可以将新的样本放置在镜台30上。如果控制系统108确定存在已经与样本、样本类别和/或样本的任何其它合适的分类组相关联的清晰度设定点，则控制系统可以使用由偏移聚焦相机72拍摄的图像(如在840处所述)，来确定新样本何时在焦点上。例如，可以由偏移聚焦相机72拍摄新样本的图像，并且可以将清晰度值与和新样本相关联的清晰度设定点进行比较。可以使镜台和物镜在Z方向上靠得更近或者相距更远，直到计算出偏移相机72所拍摄的图像的清晰度值与所存储的清晰度设定点相同为止。

在一些实施方式中，一旦计算出的样本的清晰度值(使用偏移聚焦相机72)对应于清晰度设定点，就可以将主聚焦相机70用于精细调谐样本的聚焦和偏移聚焦相机72的清晰度设定点。例如，使用主聚焦相机70，可以计算镜台和物镜的至少两个相对的Z位置的清晰度值，以确定是已实现所估计的最大清晰度，还是需要调节相对的Z位置以实现估计的最大清晰度(即，清晰度曲线上的斜率为0或接近0的点)。一旦实现所估计的最大清晰度，就可以使用偏移聚焦相机计算样本的清晰度值，并存储为新的清晰度设定点。

在一些实施方式中，控制系统108还可以确定是否存在与新的样本、样本类别和/或样本的任何其它合适分类组相关联的位置设定点，并且可以在开始前述聚焦处理之前将自动聚焦系统100定位在该位置设定点处。知道相对的Z位置，减小了使样本在焦点上所需的相对的Z距离，并可使偏移相机定位得更靠近成像共轭平面。如上结合图7讨论的，随着偏移聚焦相机72移近成像共轭平面，清晰度曲线的斜率可以变得较陡。较陡的斜率表示较大的分辨率或与Z高度的较小变化相对的较大的清晰度变化。较陡的斜率可以允许较精细的聚焦调节和控制。

何时执行处理800的特定部分的划分是可以改变的，并且未划分或不同的划分都处于本文所公开的主题的范围内。注意，在一些实施方式中，可以在任何合适的时间执行处理800的框。应当理解，在一些实施方式中，可以以不限于图8所示和描述的次序和顺序的任何次序或顺序来执行本文所描述的处理800的至少一些部分。而且，在一些实施方式中，在合适的情况下或者并行地，可以基本同时执行或者基本同时地执行本文所描述的处理800的一些部分。另外或另选地，在一些实施方式中，可以省略处理800的一些部分。

可以以任何合适的硬件和/或软件来实现处理800。例如，在一些实施方式中，可以在控制系统108中实现处理800。

已经具体参照这些例示的实施方式详细描述了自动显微聚焦系统和方法。然而，显而易见的是，可以在前述说明书中所描述的本公开的精神和范围内进行各种修改和改变，并且这样的修改和改变应被认为是本公开的等同物和一部分。本公开的范围仅通过所附的权利要求来限定。

Claims (32)

1.一种使显微镜自动聚焦的系统，所述系统包括：

第一相机，所述第一相机被配置为进行聚焦并且被设置在成像共轭平面上；

第二相机，所述第二相机被配置为进行聚焦并且被设置在相对于所述成像共轭平面的偏移距离处；以及

硬件处理器，所述硬件处理器联接至所述第一相机和所述第二相机，并且所述硬件处理器被配置成：

使用所述第一相机，基于清晰度值来确定样本何时在焦点上；

当确定所述样本在所述第一相机的焦点上时，使用所述第二相机来确定所述样本的清晰度设定点；

在所述样本移动之后，使用所述第二相机来确定所述样本的第一清晰度值；

确定所述样本的所述第一清晰度值是高于所述清晰度设定点还是低于所述清晰度设定点；以及

对所述显微镜进行调节，使得使用所述第二相机确定的所述样本的第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述硬件处理器还被配置成：

使用所述第二相机来确定所述样本的清晰度曲线；以及

基于所述清晰度曲线，对所述显微镜进行调节，以使得使用所述第二相机确定的所述样本的所述第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

3.根据权利要求1所述的系统，所述系统还包括：

第一滤光器，所述第一滤光器设置在第二照明源与所述第一相机之间的光路中，以防止来自所述第二照明源的光到达所述第一相机；以及

第二滤光器，所述第二滤光器设置在第一照明源与所述第二相机之间的光路中，以防止来自所述第一照明源的光到达所述第二相机。

4.根据权利要求1所述的系统，其中，所述第一相机还被配置为在确定所述样本在焦点上时拍摄所述样本的图像。

5.根据权利要求1所述的系统，所述系统还包括视场光阑，所述视场光阑被设置在第一照明源与物镜之间的光路中。

6.根据权利要求1所述的系统，其中，所述硬件处理器还被配置成对所述显微镜进行调节以实现粗略聚焦和精细聚焦。

7.根据权利要求1所述的系统，其中，对所述显微镜进行调节以使得使用所述第二相机确定的所述样本的所述第二清晰度值对应于所述清晰度设定点包括重复地：

对所述显微镜进行调节；

使用所述第二相机来确定所述第二清晰度值；以及

对所述第二清晰度值与所述清晰度设定点进行比较。

8.根据权利要求1所述的系统，其中，所述硬件处理器还被配置成保存所述显微镜的调节设定。

9.根据权利要求8所述的系统，其中，所保存的调节设定用于确定所述第二相机相对于所述成像共轭平面的位置。

10.一种使显微镜自动聚焦的系统，所述系统包括：

第一相机，所述第一相机被配置为当确定样本在焦点上时拍摄所述样本的图像，并且所述第一相机被设置在成像共轭平面上；

第二相机，所述第二相机被配置为进行聚焦并且被设置在第二成像共轭平面上；

第三相机，所述第三相机被配置为进行聚焦并且被设置在相对于所述第二成像共轭平面的偏移距离处；

硬件处理器，所述硬件处理器联接至所述第二相机和所述第三相机，并且所述硬件处理器被配置成：

使用所述第二相机，基于清晰度值来确定所述样本何时在焦点上；

当确定所述样本在所述第二相机的焦点上时，使用所述第三相机来确定所述样本的清晰度设定点；

在所述样本移动之后，使用所述第三相机来确定所述样本的第一清晰度值；

确定所述样本的所述第一清晰度值是高于所述清晰度设定点还是低于所述清晰度设定点；以及

对所述显微镜进行调节，以使得使用所述第三相机确定的所述样本的第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

11.根据权利要求10所述的系统，其中，所述硬件处理器还被配置成：

使用所述第三相机来确定所述样本的清晰度曲线；以及

基于所述清晰度曲线，对所述显微镜进行调节，以使得使用所述第三相机确定的所述样本的所述第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

12.根据权利要求10所述的系统，所述系统还包括：

第一滤光器，所述第一滤光器被设置在第二照明源与所述第一相机之间的光路中，以防止来自所述第二照明源的光到达所述第一相机；以及

第二滤光器，所述第二滤光器被设置在第一照明源与所述第二相机和所述第三相机之间的光路中，以防止来自所述第一照明源的光到达所述第二相机和所述第三相机。

13.根据权利要求10所述的系统，所述系统还包括视场光阑，所述视场光阑被设置在第一照明源与物镜之间的光路中。

14.根据权利要求10所述的系统，其中，所述硬件处理器还被配置成对所述显微镜进行调节以实现粗略聚焦和精细聚焦。

15.根据权利要求10所述的系统，其中，对所述显微镜进行调节以使得使用所述第三相机确定的所述样本的所述第二清晰度值对应于所述清晰度设定点包括重复地：

对所述显微镜进行调节；

使用所述第三相机来确定所述第二清晰度值；以及

对所述第二清晰度值与所述清晰度设定点进行比较。

16.根据权利要求10所述的系统，其中，所述硬件处理器被配置成保存所述显微镜的调节设定。

17.根据权利要求16所述的系统，其中，所保存的调节设定用于确定所述第三相机相对于第三成像共轭平面的位置。

18.一种使显微镜自动聚焦的方法，所述方法包括以下步骤：

将被配置为进行聚焦的第一相机设置在成像共轭平面上；

将被配置为进行聚焦的第二相机设置在相对于所述成像共轭平面的偏移距离处；

由硬件处理器使用所述第一相机，基于清晰度值来确定样本何时在焦点上；

当确定所述样本在所述第一相机的焦点上时，由所述硬件处理器使用所述第二相机来确定所述样本的清晰度设定点；

在所述样本移动之后，由所述硬件处理器使用所述第二相机来确定所述样本的第一清晰度值；

由所述硬件处理器确定所述样本的所述第一清晰度值是高于所述清晰度设定点还是低于所述清晰度设定点；以及

由所述硬件处理器对所述显微镜进行调节，以使得使用所述第二相机确定的所述样本的第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

19.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

使用所述第二相机来确定所述样本的清晰度曲线；以及

基于所述清晰度曲线对所述显微镜进行调节，以使得使用所述第二相机确定的所述样本的所述第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

20.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

防止来自第二照明源的光到达所述第一相机；以及

防止来自第一照明源的光到达所述第二相机。

21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一相机还被配置为在确定所述样本在焦点上时拍摄所述样本的图像。

22.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括以下步骤：对所述显微镜进行调节以实现粗略聚焦和精细聚焦。

23.根据权利要求18所述的方法，其中，对所述显微镜进行调节以使得使用所述第二相机确定的所述样本的所述第二清晰度值对应于所述清晰度设定点的步骤包括重复地：

对所述显微镜进行调节；

使用所述第二相机来确定所述第二清晰度值；以及

对所述第二清晰度值与所述清晰度设定点进行比较。

24.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括以下步骤：保存所述显微镜的调节设定。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，所保存的调节设定用于确定所述第二相机相对于所述成像共轭平面的位置。

26.一种使显微镜自动聚焦的方法，所述方法包括以下步骤：

将第一相机设置在第一成像共轭平面上，所述第一相机被配置为在确定样本在焦点上时拍摄所述样本的图像；

将被配置为进行聚焦的第二相机设置在第二成像共轭平面上；

将被配置为进行聚焦的第三相机设置在相对于所述第二成像共轭平面的偏移距离处；

由硬件处理器使用所述第二相机，基于清晰度值来确定所述样本何时在焦点上；

当确定所述样本在所述第二相机的焦点上时，由所述硬件处理器使用所述第三相机确定所述样本的清晰度设定点；

在所述样本移动之后，由所述硬件处理器使用所述第三相机来确定所述样本的第一清晰度值；

由所述硬件处理器来确定所述样本的所述第一清晰度值是高于所述清晰度设定点还是低于所述清晰度设定点；以及

由所述硬件处理器对所述显微镜进行调节，以使得使用所述第三相机确定的所述样本的第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

27.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

使用所述第三相机来确定所述样本的清晰度曲线；以及

基于所述清晰度曲线，对所述显微镜进行调节，以使得使用所述第三相机确定的所述样本的所述第二清晰度值对应于所述清晰度设定点。

28.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

防止来自第二照明源的光到达所述第一相机；以及

防止来自第一照明源的光到达所述第二相机和所述第三相机。

29.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括以下步骤：对所述显微镜进行调节以实现粗略聚焦和精细聚焦。

30.根据权利要求26所述的方法，其中，对所述显微镜进行调节以使得使用所述第三相机确定的所述样本的所述第二清晰度值对应于所述清晰度设定点的步骤包括重复地：

对所述显微镜进行调节；

使用所述第三相机来确定所述第二清晰度值；以及

对所述第二清晰度值与所述清晰度设定点进行比较。

31.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括以下步骤：保存所述显微镜的调节设定。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，所保存的调节设定用于确定所述第三相机相对于所述第二成像共轭平面的位置。