JP2021505643A

JP2021505643A - シコウカ地上部の抽出物およびその製造方法

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Publication number: JP2021505643A
Application number: JP2020532053A
Authority: JP
Inventors: クリステル、フィオリニ、ピュイバレ; フィリップ、ジュリア; ローラン、スブラ
Original assignee: Pierre Fabre Dermo Cosmetique SA
Current assignee: Pierre Fabre Dermo Cosmetique SA
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2018-12-12
Publication date: 2021-02-18
Anticipated expiration: 2038-12-12
Also published as: MA51182A; TWI805660B; AR113927A1; FR3074690A1; WO2019115651A1; US20200330365A1; JP7458978B2; TW201936171A; CN111447918A; EP3723723A1; KR20200097250A; US11207265B2; FR3074690B1

Abstract

本発明は、シコウカ地上部の抽出物、ならびにその製造方法およびこの方法により得ることができる抽出物に関する。本発明はまた、このような抽出物を含んでなる化粧用染料組成物に関する。最後に、本発明はこのような組成物の適用を含んでなるケラチン繊維を染色するための化粧料的方法に関する。

Description

本発明は、シコウカ(Lawsonia inermis)地上部の抽出物、ならびにその製造方法およびこの方法により得ることができる抽出物に関する。本発明はまた、このような抽出物を含んでなる化粧用染料組成物に関する。最後に、本発明はこのような組成物の適用を含んでなるケラチン繊維を染色するための化粧料的方法に関する。

一般にヘンナと呼ばれるシコウカは、ミソハギ科(Lythraceae family)に属す。この低木は、高さ６メートルに達することがあり、特に、アフリカおよびアジアの熱帯および亜熱帯地域に自生する。この樹皮は灰色で、分枝は密であり、最古のものの枝は四角形で有棘である。その葉は対生し、単葉で全縁葉である。芳香を伴った白色または赤色の花は長さ２５ｃｍの大きな錐体花序に群生する。

赤と橙の色合いを生み出すヘンナの葉は、毛髪および皮膚の染色、あるいは織物の染色にも５０００年以上使用されてきた。

それらの染料の特性は、マイケル付加によって皮膚または爪に存在するケラチンと反応するローソン(lawsone)（２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン）によるものである。

一般に、ローソンは、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸などのアミノ基を含有する様々な化合物とこのタイプの縮合を受ける可能性がある。これが、市販のヘンナ抽出物のローソン含量が比較的低い理由であり、この含量はまた経時的に急速に減少する。

さらに、シコウカの葉に遊離状態で見られるローソンの量は、実際には非常に少ない。実際には、ローソンは主にヘテロシドの形で存在する[Gallo et al. Rev. Bras. Pharmacogn. 2014, 23, 133-140; COLIPA no. C169, 2013]。

モノグリコシル化されたローソン誘導体であるヘンノシドＡ、ＢおよびＣが、特に確認されている。

これらの前駆体の加水分解と、得られたアグリコンのその後の自動酸化により、以下に示す反応スキームに従ってローソンが形成される。

よって、シコウカのいくつかの既知の抽出法は、酸性媒体中、典型的には１〜３のｐＨでの工程を含み、この間にヘンノシドが加水分解される。

抽出法は、特に文献ＦＲ２４７３３１０に記載されている。

本発明の発明者らは、グリコシル化ローソン誘導体の酵素加水分解を実施することによりローソン含量の高い抽出物を得ることができるシコウカの抽出法を開発することができた。前記抽出物は、その経時的安定性によっても差別化される。

本発明は、より環境に優しく、このようにして得られる有効成分が天然であると主張できる合成経路を設定したいという需要の一端を担う。

従って、本発明で使用される溶媒は、好ましくは、化石資源とは対照的に、再生可能資源からの天然溶媒および／または天然起源のものであり、これらの溶媒は有利には環境を尊重する方法によって得られる。従って、このように本発明の方法により得られる抽出物は、化石資源とは対照的に、再生可能資源由来の天然抽出物および／または天然起源のものである。

よって、本発明は、ローソンを乾燥抽出物の総重量に対して１０〜６０重量％含有するシコウカ地上部抽出物に関し、そのローソンが特にヘンノシドなどのグリコシル化ローソン誘導体の酵素加水分解から得られることを特徴とする。好ましくは、前記抽出物はまた、ローソン含量が経時的に安定していることも特徴とする。

発明の具体的説明

「地上部」とは、地面より上にある植物の部分、例えば、葉、葉柄、花、種子および枝、とりわけ、葉、枝および葉柄、またはこれらの混合物、好ましくは葉、枝またはこれらの混合物を意味する。

有利には、本発明による抽出物は、シコウカの葉および／または枝の抽出物である。

「乾燥抽出物」は、本発明の意味の範囲内で、抽出溶媒もしくは媒体を含まないか、またはそれらを重要でないごくわずかしか含有しない抽出物を指すことを意図する。よって、このような乾燥抽出物は、シコウカ由来の材料のみを含有する。

「グリコシル化ローソン誘導体」は、ローソングリコシドまたはヘテロシドとも呼ばれ、本発明の枠組みの中で、以下の一般式（Ｉ）のいずれの化合物も意味し：
［式中、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、互いに独立に、Ｈまたは、グルコースなどの糖を表し、Ｒ_１〜Ｒ_３の少なくとも１つはＨとは異なる］
、このグリコシド結合の加水分解によりアグリコンが形成され、このアグリコンが自動酸化反応を受けてローソンが形成される。

具体的には、ヘンノシドＡ、ＢおよびＣはグリコシル化ローソン誘導体である。

「酵素加水分解」は、本発明に関して、酵素により触媒される加水分解反応であり、この酵素は内因性シコウカ酵素または外因性供給源からのもの、好ましくは内因性シコウカ酵素であり得、前記酵素はβ−グルコシダーゼなどのグルコシダーゼであり[Gallo et al.]、この作用によりグリコシル化ローソン誘導体のグルコシド結合が破壊されることは理解される。

本発明の範囲内で、本発明による抽出物のローソン含量は、この抽出物に最初に存在したローソンの量が、相対湿度（ＲＨ）６０％でかつ光から保護して、室温（１５℃〜２５℃）で１ヶ月以内に、４０％を超えて減少しない、とりわけ３０％を超えない、好ましくは２０％を超えない、特に１５％を超えない、有利には１０％を超えない場合に、「経時的に安定している」と考えられる。室温値は、欧州薬局方で定義されている値である。

ある特定の実施態様では、本発明による抽出物のローソン含量は、すでに列挙された条件下で３ヶ月以内に４０％を超えて減少しない、とりわけ３０％を超えない、好ましくは２０％を超えない。

具体的には、本発明による抽出物のローソン含量は、すでに列挙された条件下で３ヶ月以内に１０％を超えて減少しない。

有利には、本発明による抽出物のローソン含量は、すでに列挙された条件下で６ヶ月以内に４０％を超えて減少しない、好ましくは３０％を超えない、より好ましくは２０％を超えない。

具体的には、本発明による抽出物のローソン含量は、すでに列挙された条件下で６ヶ月以内に１０％を超えて減少しない。

好ましくは、本発明による抽出物のローソン含量は、すでに列挙された条件下、室温で１２ヶ月以内に４０％を超えて減少しない、詳しくは３０％を超えない、より詳しくは２０％を超えない。

具体的には、本発明による抽出物のローソン含量は、すでに列挙された条件下、室温で１２ヶ月以内に１０％を超えて減少しない。

本発明による抽出物の安定性はまた、いわゆる加速安定性条件下で評価され得る。これらの条件は温度４０（±２）℃およびＲＨ７５（±５）％である。本発明による抽出物のローソン含量は、加速安定性条件下で、この抽出物に最初に存在したローソンの量が１ヶ月以内に４０％を超えて減少しない、好ましくは３０％を超えない、詳しくは２０％を超えない、特に１５％を超えない、有利には１０％を超えない場合に、「経時的に安定している」と評価される。

有利には、本発明による抽出物のローソン含量は、すでに列挙された加速安定性条件下で３ヶ月以内に４０％を超えて減少しない、詳しくは３０％を超えない、より詳しくは２０％を超えない。

具体的には、本発明による抽出物のローソン含量は、すでに列挙された加速安定性条件下で６ヶ月以内に４０％を超えて減少しない、詳しくは３０％を超えない、より詳しくは２０％を超えない、特に１０％を超えない。

ある特定の実施態様では、本発明による抽出物は、ローソンを乾燥抽出物の総重量に対して１０重量％〜５０重量％、とりわけ１５重量％〜４０重量％含有する。

有利には、本発明による抽出物は、ローソンを乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも１５重量％、好ましくは少なくとも２０重量％、より有利には少なくとも２５重量％含有し；このパーセンテージは乾燥抽出物の総重量に対して表される（乾燥担体の添加前）。

ローソン含量は、特に、実施例の後に記載されるＨＰＬＣアッセイ法（方法１）に従って決定することができる。

一つの実施態様では、本発明による抽出物は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を乾燥抽出物の総重量に対して２重量％以下、好ましくは１．５重量％以下、特に１重量％以下含有する。

遊離アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質は、特に実施例の後に記載される方法（方法２）に従ってニンヒドリン分光光度法によりアッセイすることができる。

一つの実施態様では、本発明による抽出物はまた、クロロフィル、特にクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂを含んでなり、総クロロフィル含量は、乾燥抽出物の総重量に対して２５重量％未満、特に乾燥抽出物に対して２０重量％未満、有利には１０重量％未満である。

ある特定の実施態様では、本発明による抽出物は、クロロフィルを乾燥抽出物の総重量に対して５重量％以下、好ましくは２重量％以下含有する。有利には、本発明による抽出物はクロロフィルを含有しない。

クロロフィルは、特に実施例の後に記載される方法（方法３）に従って重量アッセイによりアッセイすることができる。

本発明による抽出物はまた、シコウカ地上部、特にシコウカの葉およびまたは枝に自然に存在するいずれの化合物も含有し得る。

具体的には、本発明による抽出物はまた、没食子酸、パラクマル酸、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンおよび３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノンなどのフェノール化合物；ルテオリン、アピゲニン、カテキン、３’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン、３’，５，７−トリヒドロキシ−４’−メチルフラボンなどのフラボノイド；β−シトステロールなどのステロール、ルペオールなどのトリテルペン；ならびに／またはこれらのヘテロシド、例えば、ラリオシド、ミルシアフェノンＡ、１，２−ジヒドロキシ−４−Ｏ−グリコシルオキシナフタレン（４−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドとも呼ばれる）、ルテオリン−４’−Ｏ−グルコシド、アピゲニン−７−Ｏ−β−グルコシド、ルテオリン−３’−Ｏ−グルコシドおよびアピゲニン−４’−Ｏ−β−グルコシドを含有する。

より具体的には、本発明による抽出物はまた、没食子酸、パラクマル酸、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンおよび３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノンなどのフェノール化合物；ルテオリン、アピゲニン、カテキン、３’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン、３’，５，７−トリヒドロキシ−４’−メチルフラボンなどのフラボノイド；ならびに／またはこれらのヘテロシド、例えば、ラリオシド、ミルシアフェノンＡ、１，２−ジヒドロキシ−４−Ｏ−グリコシルオキシナフタレン、ルテオリン−４’−Ｏ−グルコシド、アピゲニン−７−Ｏ−β−グルコシド、ルテオリン−３’−Ｏ−グルコシドおよびアピゲニン−４’−Ｏ−β−グルコシドを含有する。

上記の特定の化合物の化学構造を以下の表１に示す。

ルテオリンおよびアピゲニンなどのフラボノイドには、フリーラジカル捕捉および抗酸化効果[Romanov et al., Neoplasma 2001, 48(2), 104-107]、ならびにＵＶ光を吸収する能力と相まって紫外線からの保護を提供する能力に関与する抗炎症活性[Saewan et al., JAPS 2013, 3(9), 129-141]などの多くの興味深い生物学的特性がある。毛髪の光防護は一般的に扱われていないテーマであるが、紫外線の化学的影響およびそれらの毛幹への影響は無視してはならない[Draelos, Dermatol. Clin. 2006, 24, 81-84]。従って、染毛を目的とした化粧料用組成物中に光防護効果を有する化合物が存在することは特に興味深い。

ルテオリンおよびアピゲニンはまた、毛髪および織物の着色(coulouring)に使用できる周知の天然染料でもある。

さらに、アピゲニンは育毛促進剤であることが示されている[Huh et al. Arch. Dermatol. Res., 2009, 301, 381-385]。

２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンなどのポリフェノール、およびパラクマル酸などのフェノール酸もまた、抗酸化特性および光防護特性を有する[Nichols et al., Arch. Dermatol. Res. 2010, 302, 71-83]。

よって、本発明は、より詳しくは、ローソンを乾燥抽出物の総重量に対して１０〜６０重量％含んでなり、そのローソンは特にヘンノシドなどのグリコシル化ローソン誘導体の酵素加水分解から生じ、ルテオリン、アピゲニンおよびパラクマル酸も含有する、上記のようなシコウカ地上部抽出物に関する。

本発明による抽出物はさらに、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノン、および場合により３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノンおよび１，２−ジヒドロキシ−４−Ｏ−グリコシルオキシナフタレンを含有し得る。

本発明はまた、ローソンを乾燥抽出物の総重量に対して１０〜６０重量％含んでなり、そのローソンは特にヘンノシドなどのグリコシル化ローソン誘導体の酵素加水分解から生じ、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンも含有する、上記のようなシコウカ地上部抽出物に関する。

一つの実施態様では、本発明による抽出物は、乾燥抽出物形態、有利には粉末形態であり得る。

一つの実施態様では、本発明による抽出物は、標準化された抽出物であり得る。

「標準化された抽出物」とは、選択されたローソン含量を有する抽出物を意味し、例えば、化粧料用途では、例えば、ローソン含量は、乾燥抽出物の総重量に対してローソン０．６重量％〜１．４重量％の間に含まれ、とりわけおよそ１．３重量％である。

このローソン含量は、タンパク質不含担体の中から選択される担体を単独でまたは混合物として添加することにより得られ得る。

前記「担体」は抽出物およびその成分に対して不活性でなければならない：前記「担体」は、抽出物ともその成分とも相互作用せず、より詳しくはローソンと相互作用せず、その保護に寄与し、活性抽出物または分子の最終含量を標準化することを可能にする。前記「担体」は、「化粧料的に許容可能」でなければならず、これは、本発明に関して、前記「担体」は、化粧料用組成物の製造に有用であり、一般に安全、非毒性で生物学的にもその他の観点でも望ましくないものではなく、かつそれが特に局所適用による化粧料的使用に許容可能であることを意味する。

この担体は、特にプロパンジオール、ペンタンジオール、グリセリン、プロピレングリコール、メチルＴＨＦおよびアミルアルコールの中から選択され得る。

本発明による乾燥抽出物はまた、標準化することができる。

乾燥抽出物の場合、担体は、抽出物の乾燥の間に支持体として働くことができ、好ましくは糖および多糖誘導体、例えばフルクトース、グルコース、スクロース、マルトデキストリン、セルロース誘導体、デンプン、特にトウモロコシ、コムギまたはコメデンプン、寒天、ガム、粘液質；ならびにマンニトール、ソルビトール、キシリトールなどのポリオールなどの中から選択される。具体的には、担体は、フルクトース、マルトデキストリンおよびデンプン、特にコメデンプンから選択される。

本発明の枠組みの中で、担体は、好ましくは、化石資源とは対照的に、再生可能資源からの天然担体および／または天然起源のものであり、これらの担体は有利には環境を尊重する方法によって得られる。

よって、本発明は、より詳しくは、ローソンを０．６〜１．４重量％含有し、さらに、ルテオリン、アピゲニンおよびパラクマル酸を含有するシコウカ地上部の標準化された乾燥抽出物に関する。

本発明による標準化された乾燥抽出物はさらに、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノン、および場合により３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノンおよび１，２−ジヒドロキシ−４−Ｏ−グリコシルオキシナフタレンを含有し得る。

この抽出物はまた、表１に列挙したいずれの化合物も含有し得る。

具体的には、本発明による標準化された乾燥抽出物は下記の通り：
ルテオリン含量が０．０５〜１．０重量％であり、
アピゲニン含量が０．０１〜０．５重量％であり、かつ
パラクマル酸含量が０．０１〜０．５重量％である
というものである。

一つの実施態様では、本発明による標準化された乾燥抽出物はさらに、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンを０．０５〜４重量％、特に０．１〜２重量％、とりわけ０．４〜１．２重量％含有する。

本発明はまた、より詳しくは、ローソンを０．６〜１．４重量％含有し、さらに、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンを含有するシコウカ地上部の標準化された乾燥抽出物に関する。

一つの実施態様では、この２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノン含量は、０．０５〜４重量％、特に０．１〜２重量％、とりわけ０．４〜１．２重量％である。

好ましくは、標準化された乾燥抽出物は、ローソン含量の経時的安定性に関してすでに定義された仕様に従うものである。

よって、ローソン含量は、相対湿度（ＲＨ）６０％でかつ光から保護して、室温（１５℃〜２５℃）で１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１２ヶ月後に、４０％を超えて減少しない、好ましくは３０％を超えない、とりわけ２０％を超えない、特に１５％を超えない、有利には１０％を超えない、より有利には５％を超えない。

本発明による標準化された乾燥抽出物の安定性はまた、加速安定性条件下で評価され得る。

よって、ローソン含量は、相対湿度（ＲＨ）７５％（±５％）で、４０℃（±２℃）で１ヶ月、３ヶ月または６ヶ月後に、４０％を超えて減少しない、好ましくは３０％を超えない、とりわけ２０％を超えない、特に１５％を超えない、有利には１０％を超えない、より有利には５％を超えない。

一つの実施態様では、本発明の標準化された乾燥抽出物は、担体を、標準化された乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも８０重量％、有利には少なくとも９０重量％、特に少なくとも９２重量％、とりわけ少なくとも９５重量％含有する。

本発明はまた、以下の工程：
ａ）シコウカ地上部の水中での浸軟処理、この間に、シコウカ地上部に最初に存在したヘンノシドなどのグリコシル化ローソン誘導体は部分的にまたは完全に酵素加水分解されてローソンを含有する水溶液となる、浸軟処理；
ｂ）工程ａ）から得られた溶液への有機溶媒の添加工程であって、前記溶媒の水との混和性は２５℃で１０重量％未満、有利には５重量％であり、水中での前記溶媒の混和性は２５℃で１０重量％未満、有利には５重量％であり、これにより水相と有機相が形成される、添加工程；
ｃ）工程ｂ）から得られた有機相の回収；および
ｄ）工程ｃ）から回収された有機相の濃縮処理であって、これによりローソン高含有抽出物を得ることが可能になる、濃縮処理
を含んでなるローソン抽出物の製造方法に関する。

「ローソン高含有抽出物」とは、本発明に関して、ローソンを乾燥抽出物の総重量に対して１０重量％〜６０重量％、特に１０重量％〜５０重量％、とりわけ１５重量％〜４０重量％含有する抽出物を意味する。

有利には、本発明による前記抽出物は、ローソンを乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも１５重量％、好ましくは少なくとも２０重量％、より有利には少なくとも２５重量％含有する；（乾燥担体の添加前）。

有利には、工程ｄ）から得られるローソン高含有抽出物は、工程ａ）において浸軟処理に供したシコウカ地上部に遊離形態でまたはヘンノシドなどのグリコシル化ローソン誘導体の形態で最初に存在したローソンの５０％超、特に６０％超、有利には７０％超を含有する。

工程ａ）において浸軟処理に供したシコウカ地上部に遊離形態でまたはグリコシル化ローソン誘導体形態で最初に存在したローソンの量は、「植物のローソン潜在量」とも呼ばれる。

本発明によるある好ましい実施態様では、工程ｄ）から得られるローソン高含有抽出物は、植物のローソン潜在量の５０％〜９０％、特に６０％〜９０％、とりわけ７０％〜９０％含有する。

植物のローソン潜在量は、特に、実施例の後に記載されるＨＰＬＣアッセイ法（方法１）に従って決定することができる。

具体的には、工程ａ）において浸軟処理の対象となるシコウカ地上部は、葉（新鮮なものでも乾燥したものでもよく、好ましくは乾燥したもの、枝またはこれら２つの混合物である。

工程ａ）は、好ましくは２０℃〜６０℃、特に２０℃〜５０℃、とりわけ２５℃〜４５℃、より詳しくは３０℃〜４５℃、典型的には４０℃の温度で行われる。

工程ａ）が、グリコシル化ローソン誘導体の加水分解を触媒する酵素または酵素群が働き得るｐＨで行われるものと理解される。具体的には、工程ａ）は、４〜８、好ましくは５〜７．５、有利には５．５〜７．５のｐＨで、典型的には中性ｐＨで行われる。

「中性ｐＨ」とは、６．５〜７．５、とりわけ７前後のｐＨを意味する。

有利には、工程ａ）は撹拌下で行われる。撹拌は、当業者に周知の方法のいずれによっても得てもよい。

浸軟処理の持続時間は、有利には１５分〜２時間、とりわけ１５分〜１時間の、有利にはおよそ３０分である。

工程ａ）の間に、使用される水の量は、浸軟処理に供したシコウカ地上部の質量の５〜１５倍、有利には６〜１０倍、典型的には１０倍である。よって、本発明による方法が１００ｇのシコウカ地上部で実施される場合、工程ａ）の間に使用される水の量は、５００ｍＬ〜１５００ｍＬ、有利には６００ｍＬ〜１０００ｍＬ、典型的には１０００ｍＬである。

工程ａ）から得られる全混合物、すなわち、植物材料ならびに水溶液は、工程ｂ）の間保持されることに留意されたい。

工程ｂ）は、バッチモードで行っても連続モードで行ってもよい。

ある特定の実施態様では、本発明による方法の工程ｂ）は、以下の３つの下位工程を含んでなる：
ｂ．１）工程ａ）から得られた水溶液への有機溶媒の添加工程であって、前記溶媒中での水の混和性は２５℃で１０重量％未満、有利には５重量％であり、水中での前記溶媒の混和性は２５℃で１０重量％未満、有利には５重量％である、添加工程、
ｂ．２）工程ｂ．１）から得られた溶液の撹拌工程であって、撹拌持続時間は１５分〜２時間、とりわけ１５分〜１時間；典型的には、撹拌持続時間はおよそ３０分である、撹拌工程、および
ｂ．３）工程ｂ．２）から得られた混合物のデカンテーション（２つの異なる相、すなわち、水相および有機相が得られるまで）。

よって、一連の下位工程ｂ．１）、ｂ．２）およびｂ．３）により水相と有機相の形成に至る。

工程ｂ）の間、とりわけ工程ｂ．１）の間に添加される有機溶媒の量は、ｂ）の間に添加される前記有機溶媒と工程ａ）の間に使用される水の量の体積比が０．２５〜２；特に０．５〜２、特に０．８〜１．５、とりわけ１〜１．３である。

ある特定の実施態様では、本発明による方法の工程ｂ）の間、とりわけ工程ｂ．１）の間に添加される有機溶媒は、弱極性溶媒である。「弱極性」とは、双極子モーメントが２．０Ｄ未満を特徴とする溶媒を意味する。

前記有機溶媒は、弱極性であるがローソンを可溶化すると理解される。よって、ｂ）で、とりわけ工程ｂ．１）で添加された有機溶媒中のローソンの溶解度は、前記溶媒中、２５℃で７０重量％より大きく、特に８０重量％より大きく、有利には９０重量％より大きく；このパーセンテージは、工程ａ）から得られたローソン含有水溶液中に存在するローソンの総重量に対して表される。

有利な側面によれば、本発明による方法の工程ｂ）の間、とりわけ工程ｂ．１）の間に添加される有機溶媒は、アルコール、塩素化溶媒、ケトン、エーテル、エステルおよびこれらの混合物の中から選択され、これにより、水中での混和性および前記有機溶媒中での水の混和性の以下の基準が確認される：
前記有機溶媒中での水の混和性は、２５℃で１０重量％未満、有利には５重量％未満であり、
水中での前記有機溶媒の混和性は、２５℃で１０重量％未満、有利には５重量％未満である。

「アルコール」とは、本発明に関して、Ｒ_４が（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基であるＲ_４−ＯＨ化合物を意味する。

「塩素化溶媒」とは、本発明に関して、１〜６個の炭素原子、特に１〜３個の炭素原子を含有し、その水素原子の一部または総てが塩素原子に置換されたアルカン、すなわち、飽和炭化水素を意味する。

「ケトン」とは、本発明に関して、Ｒ_５およびＲ_６が同一または異なる（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基である化合物Ｒ_５−ＣＯ−Ｒ_６を意味する。

「エーテル」とは、本発明に関して、Ｒ_７およびＲ_８が同一または異なる（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基である化合物Ｒ_７−Ｏ−Ｒ_８を意味する。

「エステル」とは、本発明に関して、Ｒ_９およびＲ_１０が同一または異なる（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基である化合物Ｒ_９−ＣＯＯ−Ｒ_１０を意味する。エステルは、とりわけ、酢酸エステル、すなわち、ＣＨ_３ＣＯＯ−Ｒ_１０化合物であり得る。

「（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル」基とは、本発明に関して、有利には１〜６個、好ましくは１〜４個の炭素原子を含んでなる直鎖または分岐飽和炭化水素鎖を意味する。例としては、以下の基：メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはヘキシルが挙げられる。

すでに列挙された混和性基準を満たすアルコールには、特にｎ−アミルアルコール（１−ペンタノールとも呼ばれる）が含まれる。すでに列挙された混和性基準を満たす塩素化溶媒には、特にジクロロメタンおよびクロロホルムが含まれる。

すでに列挙された混和性基準を満たすケトンには、特にメチルイソブチルケトン（一般にＭＩＢＫと呼ばれる）が含まれる。

すでに列挙された混和性基準を満たすエーテルには、特にジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテルおよびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルが含まれる。

すでに列挙された混和性基準を満たすエステルには、特に（Ｃ_１−Ｃ_６）酢酸アルキル、例えば酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチルおよび酢酸イソアミルが含まれる。

本発明のある特定の実施態様では、工程ｂ）で、とりわけ工程ｂ．１）の間に添加される有機溶媒は、好ましくは酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソアミルおよびこれらの混合物からなる群から選択される（Ｃ_１−Ｃ_６）酢酸アルキルまたは（Ｃ_１−Ｃ_６）酢酸アルキルの混合物である。特に好ましい様式では、この溶媒は酢酸イソプロピルである。

本発明による方法の工程ｃ）は、工程ｂ）から得られた有機相を回収することにある。

当業者には明らかであるように、前記工程ｂ）の前の反復で得られた水相に対して工程ｂ）を繰り返すことが可能である。次に、このようにして得られた新しい有機相を回収し（工程ｃ）の繰り返し）、工程ｂ）の先行する反復から得られたものと合わせる。

よって、本発明による方法の変形では、工程ｄ）は、工程ｄ’）において、工程ｂ）と、それに続く工程ｃ）の複数回の反復から回収された有機相を合わせたものを濃縮することからなる。

一つの実施態様では、本発明による方法は、工程ｄ）から得られたローソン高含有抽出物を乾燥させる追加の工程ｅ）を含み得る。前記工程ｅ）の終わりに、得られるローソン高含有抽出物は乾燥抽出物である。

乾燥工程ｅ）は、当業者に周知の方法に従って実施してよい。具体的には、この乾燥工程は、パレット乾燥機、噴霧、マイクロ波、ゼオライト乾燥(zeodration)または凍結乾燥により行ってよい。

ある特定の実施態様では、本発明による方法は、工程ｃ）とｄ）の間に、上記で定義されるような担体を添加する追加の工程ｃ’）を含んでなり、工程ｄ）の後に上記の乾燥工程ｅ）が続く。

前記工程ｅ）の終わりに、得られるローソン高含有抽出物は、このようにして得られた標準化された乾燥抽出物である。

ある好ましい実施態様によれば、本発明による方法は、酸または塩基の添加による前記水溶液または前記水相のｐＨを変更する工程を含まない。

ある特定の実施態様では、本発明による方法はまた、脱色工程とも呼ばれる色素抽出工程を含んでなる。

脱色工程の間に抽出される色素は、特にクロロフィルである。しかしながら、ローソンは、脱色工程によって排除しようとする色素には含まれないと理解される。

この色素抽出工程は、特に有機溶媒を用いて行うことができる。

前記有機溶媒はローソンを十分に可溶化しないと理解される。よって、脱色工程に使用される有機溶媒工程におけるローソンの溶解度は、２５℃で１５重量％未満、特に１０重量％未満、有利には５重量％未満であり；このパーセンテージは、脱色工程を受けている抽出物または溶液に含まれるローソンの総重量に対して表される。

好ましくは、ローソンは、色素抽出工程に使用される有機溶媒に溶解しない。

有利には、前記有機溶媒は飽和または不飽和炭化水素である。

「飽和または不飽和炭化水素」とは、水素および炭素原子から独自に構成された化合物を意味する。

具体的には、前記飽和炭化水素は、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ノナン、デカンおよびシクロヘキサンの中から選択することができる。

前記不飽和炭化水素は、特にベンゼンであり得る。

好ましくは、クロロフィルのような色素の抽出工程は、ヘプタンを用いて行われる。

有機溶媒を用いて行われる色素抽出工程は、液液抽出または液固抽出からなってよい。

前記工程が液液抽出である場合、この工程は、本発明による方法の工程ａ）とｂ）の間に挿入される。

有利には、有機溶媒を用いた液液抽出による脱色工程は、以下の４つの下位工程を含んでなる：
ｉ）工程ａ）から得られた水溶液への前記有機溶媒の添加、
ｉｉ）工程ｉ）から得られた溶液の撹拌工程であって、撹拌持続時間は１５分〜２時間、とりわけ１５分〜１時間であり、典型的には撹拌持続時間はおよそ３０分である、撹拌工程、および
ｉｉｉ）工程ｉｉ）から得られた混合物のデカンテーション（２つの異なる相、すなわち、水相および有機相が得られるまで）、ならびに
ｉｖ）有機相の排除。

次に、本方法の工程ｂ）が、工程ｉｉｉ）から得られた水相で実施される。

液固抽出に関して、この工程は、本発明による方法の乾燥工程ｅ）の後に続く。液固抽出は、当業者に周知の方法に従って行うことができる。

あるいは、脱色工程は、補助溶媒を添加してまたは添加せずに、超臨界ＣＯ_２を用いて乾燥抽出物で直接行うことができる。クロロフィルは超臨界ＣＯ_２に同伴される。残留物は脱色された乾燥抽出物である。

ある特定の実施態様では、本発明による方法はまた、ローソンを含有する水溶液からシコウカ地上部を分離するために工程ａ）とｂ）の間に設けられるか、または工程ｃ）で回収された有機相からシコウカ地上部の残留物を分離するために工程ｃ）とｄ）の間に設けられる濾過工程を含んでなる。

別の特定の実施態様では、ペクチナーゼタイプの酵素が、工程ａ）において添加され得る。

本発明による方法はまた、ホウセンカ(Impatiens balsamina)などのローソンを含有する他の植物にも適用し得る。当業者ならば、本発明の方法を対象植物に適合させる方法を知っているであろう。よって、ホウセンカの場合、当業者ならば、ホウセンカの、ローソンが最も豊富な部分である根の抽出を行うであろう。

本発明はまた、上述の方法により得ることができる抽出物に関する。このような抽出物はすでに定義された仕様に従うものである。

具体的には、前記抽出物は、ローソンを乾燥抽出物の総重量に対して１０重量％〜６０重量％、特に１０重量％〜５０重量％、とりわけ１５重量％〜４０重量％含有し、そのローソン含量は経時的に安定している。

好ましくは、本発明による方法により得ることができる前記抽出物のローソン含量は、相対湿度（ＲＨ）６０％でかつ光から保護して、室温（１５℃〜２５℃）で１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１２ヶ月後に、４０％を超えて減少しない、好ましくは３０％を超えない、とりわけ２０％を超えない、特に１５％を超えない、有利には１０％を超えない。

有利には、前記抽出物は、ローソンを乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも１５重量％、好ましくは少なくとも２０重量％、より有利には少なくとも２５重量％含有し；このパーセンテージは、前記乾燥抽出物の総重量に対して表される（乾燥担体の添加前）。

好ましくは、本発明による前記抽出物は、ンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を乾燥抽出物の総重量に対して２重量％以下、好ましくは１．５重量％以下、特に１重量％以下含有する。

前記抽出物はまた、クロロフィル、特にクロロフィルａおよび／またはクロロフィルｂを含んでなり、総クロロフィル含量は、乾燥抽出物の総重量に対して２５重量％未満、特に乾燥抽出物の重量に対して２０重量％未満、有利には１０重量％未満である。

有利には、前記抽出物は、クロロフィルを乾燥抽出物の総重量に対して５重量％以下、好ましくは２重量％以下含有する。さらにより有利には、前記抽出物はクロロフィルを含有しない。

前記抽出物はまた、シコウカ地上部、特にシコウカの葉およびまたは枝に自然に存在するいずれの化合物も含有し得る。具体的には、前記抽出物はまた、没食子酸、パラクマル酸、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンおよび３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノンなどのフェノール化合物；ルテオリン、アピゲニン、カテキン、３’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン、３’，５，７−トリヒドロキシ−４’−メチルフラボンなどのフラボノイド；β−シトステロールなどのステロール、ルペオールなどのトリテルペン；ならびに／またはこれらのヘテロシド、例えばラリオシド、ミルシアフェノンＡ、１，２−ジヒドロキシ−４−Ｏ−グリコシルオキシナフタレン（４−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドとも呼ばれる）、ルテオリン−４’−Ｏ−グルコシド、アピゲニン−７−Ｏ−β−グルコシド、ルテオリン−３’−Ｏ−グルコシドおよびアピゲニン−４’−Ｏ−β−グルコシドを含有する。

具体的には、前記抽出物はまた、没食子酸、パラクマル酸、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンおよび３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノンなどのフェノール化合物；ルテオリン、アピゲニン、カテキン、３’，４’，５，７−テトラヒドロキシフラバノン、３’，５，７−トリヒドロキシ−４’−メチルフラボンなどのフラボノイド；ならびに／またはこれらのヘテロシド、例えばラリオシド、ミルシアフェノンＡ、１，２−ジヒドロキシ−４−Ｏ−グリコシルオキシナフタレン、ルテオリン−４’−Ｏ−グルコシド、アピゲニン−７−Ｏ−β−グルコシド、ルテオリン−３’−Ｏ−グルコシドおよびアピゲニン−４’−Ｏ−β−グルコシドを含有する。

より具体的には、前記抽出物はまた、ルテオリン、アピゲニンおよびパラクマル酸を含有する。

前記抽出物はさらに、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノン、および場合により３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノンおよび１，２−ジヒドロキシ−４−Ｏ−グリコシルオキシナフタレンを含有し得る。

一つの実施態様では、前記抽出物は、タンパク質不含担体の中から選択される担体を単独でまたは混合物として添加することにより標準化され得る。

この担体は、特にプロパンジオール、ペンタンジオール、グリセリン、プロピレングリコール、メチルＴＨＦおよびアミルアルコールの中から選択することができる。

前記抽出物が乾燥抽出物である場合、担体は、好ましくは糖および多糖誘導体、例えばフルクトース、グルコース、スクロース、マルトデキストリン、セルロース誘導体、デンプン、特にトウモロコシ、コムギまたはコメデンプン、寒天、ガム、粘液質；ならびにマンニトール、ソルビトール、キシリトールなどのポリオールなどの中から選択される。

具体的には、担体は、フルクトース、マルトデキストリンおよびデンプン、特にコメデンプンから選択される。担体は、好ましくは、化石資源とは対照的に、再生可能資源からの天然担体および／または天然起源のものであり、これらの担体は有利には環境を尊重する方法によって得られる。

よって、本発明はまた、上述の方法により得ることができる標準化された乾燥抽出物に関する。

このような標準化された乾燥抽出物は、すでに定義された仕様に従うものである。

具体的には、前記標準化された乾燥抽出物は、ローソンを０．６〜１．４重量％含有し、さらに、ルテオリン、アピゲニンおよびパラクマル酸を含有する。

より具体的には、この抽出物は：
ルテオリン含量が０．０５〜１．０重量％であり、
アピゲニン含量が０．０１〜０．５重量％であり、かつ
パラクマル酸含量が０．０１〜０．５重量％である
というものである。

この抽出物はさらに、２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノン、および場合により３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノンおよび１，２−ジヒドロキシ−４−Ｏ−グリコシルオキシナフタレンを含有し得る。

好ましくは、前記標準化された乾燥抽出物はまた、ローソン含量の経時的安定性に関してすでに定義された仕様に従うものである。

よって、ローソン含量は、相対湿度（ＲＨ）６０％でかつ光から保護して、室温（１５℃〜２５℃）で１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１２ヶ月後に；または相対湿度（ＲＨ）７５％（±５％）で、４０℃（±２℃）で１ヶ月、３ヶ月または６ヶ月後に、４０％を超えて減少しない、好ましくは３０％を超えない、とりわけ２０％を超えない、特に１５％を超えない、有利には１０％を超えない、より有利には５％を超えない。

一つの実施態様では、本発明の方法により得ることができる標準化された乾燥抽出物は、担体を、標準化された乾燥抽出物の総重量に対して少なくとも８０重量％、有利には少なくとも９０重量％、特に少なくとも９２重量％、とりわけ少なくとも９５重量％含有する。

以下、本明細書では、「本発明による抽出物」とは、上記で定義されるような抽出物自体、または上記のような本発明による方法により得ることができる抽出物を表す。

同様に、「本発明による標準化された乾燥抽出物」とは、上記で定義されるような標準化された乾燥抽出物自体、または上記のような本発明による方法により得ることができる標準化された乾燥抽出物を表す。

本発明はまた、本発明による抽出物または標準化された乾燥抽出物を、必要な場合には、適当な賦形剤を含んでなる組成物に関する。本発明による抽出物および標準化された乾燥抽出物は、抽出物および標準化された乾燥抽出物自体に関する上記段落で定義されているようなもの、ならびに本発明による方法により得ることができる抽出物および標準化された乾燥抽出物に関するものである。

従って、前記抽出物および標準化された乾燥抽出物は、ルテオリン、アピゲニンおよびパラクマル酸を含有し、さらに２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノン、および場合により３，４，５−トリヒドロキシアセトフェノンおよび１，２−ジヒドロキシ−４−Ｏ−グリコシルオキシナフタレンを含有し得る。

具体的には、標準化された乾燥抽出物は、抽出物の総重量に対してローソンを０．６重量％〜１．４重量％、とりわけおよそ１．３重量％含有する。

前記組成物は、好ましくは外用的および局所的に投与されるように処方される。

本発明による組成物は、局所投与に適した、特にクリーム、エマルション、乳液、軟膏、ローション、オイル、水性もしくは水−アルコールまたはグリコール溶液、粉末、スプレー、シャンプー、ワニスまたはいずれの他の外用製品をも含む異なる調製物の形態で処方され得る。

この組成物は、有利には少なくとも１種の化粧料的に許容可能な賦形剤を含んでなる化粧用染料組成物である。

「化粧料的に許容可能な賦形剤」とは、本発明に関して、化粧料用組成物の製造に有用であり、一般に安全、非毒性で、生物学的にもその他の観点でも望ましくないものではなく、かつ特に局所適用による化粧料的使用に許容可能なものを意味する。

特に、本発明による組成物はまた、界面活性剤、増粘剤、防腐剤、香料、染料、ケミカルフィルターまたはミネラルフィルター、保湿剤、温泉水などの中から選択される当業者に知られている少なくとも１種の化粧料的に許容可能な賦形剤を含んでなり得る。当業者は、一般的な知識を使用することにより本発明による組成物の配合を調整することを知っている。

しかしながら、この組成物は、ローソンを安定化するためにヘンナ組成物中に通常存在する安定剤を含まない。

よって、本発明による化粧用染料組成物は、ジアミノトルエンおよびジアミノベンゼンなどの合成染料、特に最もよく使用されるＰＰＤ（パラジフェニレンジアミン）、または重金属で作られた添加剤を含まない[Wang et al. J. Environ. Anal. Toxicol. 2016, 6(3); Wang et al. J. Chromatogr. B 2011, 879, 1795-1801]。

ある特定の実施態様では、本発明による化粧用染料組成物は、本発明による抽出物を０．０１〜５０重量％、特に１〜４０重量％、とりわけ２〜３０重量％含んでなり、抽出物の重量は組成物の総重量に対する乾燥抽出物で表される。

ある特定の実施態様では、本発明による化粧用染料組成物は、本発明による標準化された抽出物を１〜２０重量％、特に５〜２０重量％、とりわけ１０〜２０重量％含んでなり、標準化された抽出物の重量は組成物の総重量に対する乾燥抽出物で表される。

好ましくは、本発明による化粧用染料組成物は、組成物の総重量に対してローソンを０．２重量％〜２重量％、特に０．５〜１．５重量％含有する。

具体的には、この化粧用染料組成物は、組成物の総重量に対してローソンをおよそ１．３重量％含有する。

本発明による化粧用染料組成物が粉末形態である場合、担体は、好ましくは糖および多糖誘導体、例えばフルクトース、グルコース、スクロース、マルトデキストリン、セルロース誘導体、デンプン、特にトウモロコシ、コムギまたはコメデンプン、寒天、ガム、粘液質；ならびにマンニトール、ソルビトール、キシリトールなどのポリオールなどの中から選択される。

本発明による化粧用染料組成物が粉末形態である場合、当業者はその粒径を、当業者に周知のいずれの方法によっても調整することができる。

具体的には、本発明による化粧用染料組成物は、粒径２５０μｍ未満の粉末形態であり得る。

好ましくは、本発明による化粧用染料組成物は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を乾燥抽出物の総重量に対して２重量％以下含有する。

本発明による化粧用染料組成物はまた、１以上の付加的染料および／または色素を含んでなり得る。

好ましくは、本発明による組成物のローソン含量が経時的に安定していると理解される。

よって、前記抽出物のローソン含量は、相対湿度（ＲＨ）６０％でかつ光から保護して、室温（１５℃〜２５℃）で１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１２ヶ月後に、６０％を超えて減少しない、特に５０％を超えない、好ましくは５０％を超えない、より好ましくは３０％を超えない、とりわけ２０％を超えない、特に１５％を超えない、有利には１０％を超えない。

本発明はまた、本発明による組成物をケラチン繊維上に適用し、場合によりその後洗い流すことを含んでなる、ケラチン繊維を染色するための化粧料的方法に関する。

「ケラチン繊維」とは、表皮および外皮、例えば毛髪および爪に存在するケラチンを意味する。

本発明はまた、皮膚に入れ墨をするための方法に関する。

本発明はまた、本発明による抽出物を含んでなる織物染料または家具染料も対象とする。

このような染料はまた、１以上の付加的染料および／または色素を含んでなり得る。

本発明による染料はまた、当業者に知られているいずれの補助剤も含んでよく、当業者は、一般的な知識を使用することにより本発明による染料の配合を調整する方法を知っている。

本発明はまた、織物または木質繊維を染色するためのこのような染料の使用に関する。

図１は、本発明による抽出物（サンプルＥ２）のＵＨＰＬＣ−ＵＶクロマトグラムを表す。（３５℃でのＶａｎｇｕａｒｄ（商標）プレカラム（５ｍｍ×２．１）（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルフォード、ＵＳＡ)を備えたＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＢＥＨＳｈｉｅｌｄＲＰ１８カラム（１００ｍｍ×２．１、１．７μｍ）；流速：０．４ｍＬ／分；移動相：（Ａ）０．１％ギ酸を含む水および（Ｂ）アセトニトリルおよび（Ｃ）メタノール（洗浄溶媒）の線形勾配系：０〜９分、２％〜１００％Ｂ；９〜９．５５分、１００％Ｂを維持；９．５５〜９．７０分、０％〜１００％Ｃ；９．７〜１０．２分、１００％Ｃを維持；１０．２０〜１０．３５分、０％〜１００％Ｂ；１０．３５〜１０．８５分、１００％Ｂを維持；１０．８５〜１１分、０％〜９８％Ａ；カラムの平衡化のために９８％Ａ−２％Ｂで１分間保持。図２は、図１の場合と同じクロマトグラムを表す：塗りつぶしたピークは図１に見られるピークに相当し、通常の線は前記クロマトグラムの拡大表示に相当する。図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄおよび３ｅは、サンプルＥ２から単離されたローソン(lawson)、ルテオリン、アピゲニン、パラクマル酸および２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンのＵＶスペクトルを表す。図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄおよび３ｅは、サンプルＥ２から単離されたローソン(lawson)、ルテオリン、アピゲニン、パラクマル酸および２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンのＵＶスペクトルを表す。図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄおよび３ｅは、サンプルＥ２から単離されたローソン(lawson)、ルテオリン、アピゲニン、パラクマル酸および２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンのＵＶスペクトルを表す。図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄおよび３ｅは、サンプルＥ２から単離されたローソン(lawson)、ルテオリン、アピゲニン、パラクマル酸および２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンのＵＶスペクトルを表す。図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄおよび３ｅは、サンプルＥ２から単離されたローソン(lawson)、ルテオリン、アピゲニン、パラクマル酸および２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンのＵＶスペクトルを表す。図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄおよび４ｅは、サンプルＥ２から単離されたローソン(lawson)の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄおよび４ｅは、サンプルＥ２から単離されたローソン(lawson)の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄおよび４ｅは、サンプルＥ２から単離されたローソン(lawson)の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄおよび４ｅは、サンプルＥ２から単離されたローソン(lawson)の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄおよび４ｅは、サンプルＥ２から単離されたローソン(lawson)の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄおよび５ｅは、サンプルＥ２から単離されたルテオリンの^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄおよび５ｅは、サンプルＥ２から単離されたルテオリンの^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄおよび５ｅは、サンプルＥ２から単離されたルテオリンの^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄおよび５ｅは、サンプルＥ２から単離されたルテオリンの^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄおよび５ｅは、サンプルＥ２から単離されたルテオリンの^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄおよび６ｅは、サンプルＥ２から単離されたアピゲニンの^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄおよび６ｅは、サンプルＥ２から単離されたアピゲニンの^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄおよび６ｅは、サンプルＥ２から単離されたアピゲニンの^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄおよび６ｅは、サンプルＥ２から単離されたアピゲニンの^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄおよび６ｅは、サンプルＥ２から単離されたアピゲニンの^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄおよび７ｅは、サンプルＥ２から単離されたパラクマル酸の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄおよび７ｅは、サンプルＥ２から単離されたパラクマル酸の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄおよび７ｅは、サンプルＥ２から単離されたパラクマル酸の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄおよび７ｅは、サンプルＥ２から単離されたパラクマル酸の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄおよび７ｅは、サンプルＥ２から単離されたパラクマル酸の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを表す。

以下、実施例を挙げて本発明を説明する。

Ｉ．本発明の抽出物、標準化された乾燥抽出物および製造方法
実施例１：本発明による酢酸イソプロピル抽出物１番
５０ｇのシコウカの未粉砕葉を５００ｍＬの水により３０〜４０℃で３０分間抽出する。この溶液に６００ｍＬの酢酸イソプロピルを添加する。これを３０分間混合する。デカンテーション後、上部の酢酸イソプロピル相（４８０ｍＬ）を回収し、水相は、ローソンが実質的に含まれないために分離する。酢酸イソプロピル相を濾過した後、Ｒｏｔａｖａｐｏｒで乾燥させる。残留物が乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＥ１）である。

この植物は、ローソン１．５ｇ／乾燥植物１００ｇを含有する。酢酸イソプロピル相は、この植物に存在するローソン潜在量の８０．７％を含有する。
乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＥ１）は、３０．２％のローソン、すなわち、この植物に存在するローソンの７１％を含有する。

安定性研究：２５℃、相対湿度６０％および光から保護して保存したサンプル：
Ｔ０時点：ローソン含量＝乾燥抽出物の重量に対してローソン３０．２重量％。
Ｔ１ヶ月時点：ローソン含量＝乾燥抽出物の重量に対してローソン２９．７重量％；すなわち、本発明の意味の範囲内で有意な損失はない。

実施例２：本発明による酢酸イソプロピル抽出物２番
４９，５ｇのシコウカの未粉砕葉を５００ｍＬの水により３０〜４０℃で３０分間抽出する。この溶液に６００ｍＬの酢酸イソプロピルを添加する。これを３０分間混合する。デカンテーション後、上部の酢酸イソプロピル相を回収し、ブフナー（Ｋ９００）で濾過し、残渣を５０ｍＬの酢酸イソプロピルで洗い流す。次に、得られた溶液をＲｏｔａｖａｐｏｒで乾燥させる。残留物が乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＥ２）である。

乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＥ２）は、３０．９重量％のローソンを含有する。

実施例３：本発明による酢酸エチル標準化乾燥抽出物
５０ｇのシコウカの粉砕葉を５００ｍＬの水により３０〜４０℃で３０分間抽出する。この溶液に６００ｍＬの酢酸エチルを添加する。これを３０分間混合する。デカンテーション後、上部の酢酸エチル相を回収し、水相は、そのローソン含量が非常に低いために除去する。

酢酸エチル相のローソン含量をＨ．Ｐ．Ｌ．Ｃによって決定し、マルトデキストリンを、１．３重量％のローソンを含有する混合物を得るために十分な量で添加し、その後、凍結乾燥する。

マルトデキストリンで標準化された乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＥ３）は、１．１重量％のローソン、すなわち、この植物中の最初のローソン含量の７１％を含有する。

比較のために、反例を以下に記載する。

反例１：酸性酢酸イソプロピル抽出物１番
２０ｇの未粉砕のシコウカ葉を、リン酸（１ＮＨ_３ＰＯ_４）で飽和させた酢酸イソプロピル６０ｍＬにより室温で６０分間抽出する。ブフナー（Ｋ９００）で固／液分離し、１ＮＨ_３ＰＯ_４で飽和させた酢酸イソプロピル２０ｍＬにより残渣を洗い流した後、得られた液体を集め、アッセイする（サンプルＣＥ１）

この植物は、ローソン１．５２ｇ／乾燥植物１００ｇを含有する。
サンプルＣＥ１は、この植物に存在するローソン潜在量の０．９％を含有する。

反例２：酸性メチルエチルケトン抽出物
２０ｇの未粉砕のシコウカ葉を、リン酸（１ＮＨ_３ＰＯ_４）で飽和させたメチルエチルケトン６０ｍＬにより室温で６０分間抽出する。ブフナー漏斗（Ｋ９００）で固／液分離し、１ＮＨ_３ＰＯ_４で飽和させたメチルエチルケトン２０ｍＬにより残渣を洗い流した後、得られた液体を集め、アッセイする（サンプルＣＥ２）。

この植物は、ローソン１．５２ｇ／乾燥植物１００ｇを含有する。
サンプルＣＥ２は、この植物に存在するローソン潜在量の０．９％を含有する。

反例３：石灰水抽出物１番
２０ｇの未粉砕のシコウカ葉を８０ｍＬの石灰水により室温で６０分間抽出する。ブフナー漏斗（Ｋ９００）で固／液分離し、２０ｍＬの石灰水により残渣を洗い流した後、得られた液体を集め、アッセイする（サンプルＣＥ３）。

この植物は、ローソン１．５２ｇ／乾燥植物１００ｇを含有する。
サンプルＣＥ３は、この植物に存在するローソン潜在量の２４％を含有する。

反例４：石灰水抽出物２番
１９，７５ｇの粉砕シコウカ葉を水８０ｍＬおよび石灰水（ＣａＯ（ＯＨ）_２、５０ｇ／Ｌ）２０ｍＬの混合物により室温で６０分間抽出する。ブフナー漏斗（Ｋ９００）で固／液分離し、５０ｍＬの水により残渣を洗い流した後、得られた液体を集め、次いで、Ｒｏｔａｖａｐｏｒで乾燥させる。残留物が乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＣＥ４）である。

乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＣＥ４）は、１．８重量％のローソンを含有する。

反例５：酸性酢酸イソプロピル抽出物２番
２０，０ｇの粉砕シコウカ葉を、リン酸（１ＮＨ_３ＰＯ_４）で飽和させた酢酸イソプロピル６０ｍＬにより室温で６０分間抽出する。ブフナー漏斗（Ｋ９００）で固／液分離し、２０ｍＬの飽和酢酸イソプロピルにより残渣を洗い流した後、得られた液体を集め、次いで、Ｒｏｔａｖａｐｏｒで乾燥させる。残留物が乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＣＥ５）である。

乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＣＥ５）は、０．２重量％のローソンを含有する。

反例６：水溶液抽出物
５０ｇの未粉砕シコウカ葉を１５０ｍＬの酸性水溶液（ＨＣｌ、ｐＨ＝２．５）により室温で３０分間抽出する。得られたマッシュを、フィルターなしのブフナーで搾りかすと水溶液に分ける。搾りかすを１Ｌのアルカリ性水溶液（ＮａＯＨ０．１５％）を用いて５０℃で３時間抽出する。濾過（１００メッシュサイズのガーゼで）により固／液分離した後、得られた溶液を真空下で１／１５に濃縮し、冷却し、ＨＣｌを用いてｐＨ＝２．５に酸性化する。次に、これを遠心分離し、真空下４０℃にて炉で乾燥させる。残留物が乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＣＥ６）である。

乾燥ヘンナ抽出物（サンプルＣＥ６）は、９．５重量％のローソンを含有する。

比較を容易にするために、抽出物Ｅ２、ＣＥ４、ＣＥ５およびＣＥ６の重要な側面を以下に要約する。同じ植物ロットが出発材料として使用された場合に、前記抽出物の比較が特に適切であることに留意されたい。

上記の表に示した結果から明らかなように、本発明の方法は、この植物のローソン潜在量を、他の方法よりもはるかに大きな割合で抽出することを可能にする。これは特に特有の浸軟工程ａ）によるものであり、この間に、この植物に最初に存在するグリコシル化ローソン誘導体が酵素加水分解を受ける。

ＩＩ．特性評価研究
Ａ）構造分析
材料および方法
分析に使用された本発明の抽出物はサンプルＥ２である
クロマトグラフィー分離は、クオータナリーポンプ、自動サンプルインジェクター、オンライン脱気装置、自動調温カラムオーブンおよびＤＡＤ検出器（２００〜５００ｎｍ）を備えたＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＵＨＰＬＣシステムで実施した。３５℃のＶａｎｇｕａｒｄ（商標）プレカラム（５ｍｍ×２．１）（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルフォード、ＵＳＡ)を備えたＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＢＥＨＳｈｉｅｌｄＲＰ１８カラム（１００ｍｍ×２．１、１．７μｍ）を使用し、流速を０．４ｍＬ／分に設定した。移動相は（Ａ）０．１％ギ酸を含む水および（Ｂ）アセトニトリルおよび（Ｃ）洗浄溶媒としてのメタノールの線形勾配系で構成した：０〜９分、２％〜１００％Ｂ；９〜９．５５分、１００％Ｂを維持；９．５５〜９．７０分、０％〜１００％Ｃ；９．７〜１０．２分、１００％Ｃを維持；１０．２０〜１０．３５分、０％〜１００％Ｂ；１０．３５〜１０．８５分、１００％Ｂを維持；１０．８５〜１１分、０％〜９８％Ａ；カラムの平衡化のために９８％Ａ−２％Ｂで１分間保持。

化合物は、高分解能質量分析、１Ｄ−および２Ｄ−ＮＭＲ実験（^１ＨＮＭＲ、^１３ＣＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、ＨＳＱＣ）によって同定した。

ＮＭＲ実験は、ＢＢＯＰｒｏｄｉｇｙ５ｍｍプローブ（ＢｒｕｋｅｒＢｉｏｓｐｉｎ、カールスルーエ、バーデンヴュルテンベルク州、ドイツ）を備えたＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅＩＩＩＨＤ５００ＭＨｚ分光計で実施した。重水素化ジメチルスルホキシドを溶媒として使用した。取得順序は、^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣとした。化学シフトは、前記溶媒を内部標準として用いて調整した（δ_Ｈ２，５２ｐｐｍおよびδ_Ｃ３９，５２ｐｐｍ）。

ＨＲＭＳデータは、Ｍａｓｓｌｙｎｘｖ４．１ＳＣＮ９５７ソフトウェアを用いてＳｙｎａｐｔＧ２Ｓｉ（ＷａｔｅｒｓＱ−ＴＯＦＳＹＮＡＰＴ（商標）、ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐ、マンチェスター、イギリス）で得た。ＭＳ源温度を１２５℃に設定し、脱溶媒和温度を５００℃に設定した。窒素を乾燥ガスとして使用し、脱溶媒和ガス流量を１０００Ｌ／時に設定し、コーンガス流を５０Ｌ／時で維持した。ポジティブモードおよびネガティブモードの両方で、キャピラリー電圧およびコーン電圧をそれぞれ０．５ｋＶおよび５０Ｖに設定した。質量スペクトルは、１００〜１５００Ｄａの範囲で記録した。安定した正確なスキャンを確保するために、ロイシンエンケファリンを参照化合物として使用した（ポジティブイオンモード(［Ｍ＋Ｈ］＋＝５５６．２７７１および２７８．１１４１)およびネガティブイオンモード（［Ｍ−Ｈ］−＝５５４．２６１５および２３６．１０３５））。)。総てのデータは、分解能２５，０００にて連続モードで取得した。

結果
ＵＨＰＬＣ−ＵＶクロマトグラム
得られたＵＨＰＬＣ−ＵＶクロマトグラムを図１および２に示す。前記クロマトグラムの拡大表示で観察することができるピーク（図２、通常の線）は、以下の化合物に関連付けられる：

ＵＶスペクトル
ピーク番号１５、２０、２２、１０および５に相当する化合物のＵＶスペクトルをそれぞれ図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄおよび３ｅに示す。

ＮＭＲスペクトル
ピーク１５
ピーク１５に相当する化合物の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄおよび４ｅに示す。

前記化合物はローソンと同定された。

実際に、^１Ｈおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルに関しては以下の特定を行うことができる。

Ｃ１０Ｈ５Ｏ３のＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）計算値［Ｍ−Ｈ］−：１７３．０２３９、実測値：１７３．０２４４（０，５ｍＤａ／２，９ｐｐｍ）
Ｃ１０Ｈ７Ｏ３のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値［Ｍ＋Ｈ］＋：１７５．０３９５、実測値：１７５．０４０５（１，０ｍＤａ／５，７ｐｐｍ）

ピーク２０
ピーク１５に相当する化合物の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄおよび５ｅに示す。

前記化合物はルテオリンと同定された。

Ｃ１５Ｈ９Ｏ６のＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）計算値［Ｍ−Ｈ］−：２８５．０３９９、実測値：２８５．０３９８(０，１ｍＤａ／０，４ｐｐｍ)
Ｃ１５Ｈ１１Ｏ６のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値［Ｍ＋Ｈ］＋：２８７．０５５６、実測値：２８７．０５６０（０，４ｍＤａ／１，４ｐｐｍ）

ピーク２２
ピーク１５に相当する化合物の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを図６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄおよび６ｅに示す。

前記化合物はアピゲニンと同定された。

実際に、^１Ｈおよび^１３Ｃスペクトルに関しては以下の特定を行うことができる。

Ｃ１５Ｈ９Ｏ５のＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）計算値［Ｍ−Ｈ］−：２６９．０４５、実測値：２６９．０４６２（１，２ｍＤａ／４，５ｐｐｍ）
Ｃ１５Ｈ１１Ｏ５のＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値［Ｍ＋Ｈ］＋：２７１．０６０６、実測値：２７１．０６０８（０，２ｍＤａ／０，７ｐｐｍ）

ピーク１０
ピーク１５に相当する化合物の^１Ｈ、^１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄおよび７ｅに示す。

前記化合物はパラクマル酸と同定された。

実際、^１Ｈおよび^１３Ｃスペクトルに関しては以下の特定を行うことができる。

Ｃ９Ｈ７Ｏ３のＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）計算値［Ｍ−Ｈ］−：１６３．０３９５、実測値：１６３．０４０３（０，８ｍＤａ／４，９ｐｐｍ）

Ｂ）定量分析
材料および方法
バッチサンプル
・ＬＰ１１０：マルトデキストリン(maltodextrine)で標準化された酢酸エチル抽出物−工業規模。
・ＥＳ３１０：マルトデキストリン(maltodextrine)で標準化された酢酸エチル抽出物−実験室規模。
・ＪＱ１３７Ａ：フルクトースを含有するヘンナ酢酸イソプロピル抽出物−実験室規模。

上記の標準化された抽出物それぞれのローソンは１，１重量％に等しい。

実験条件
ルテオリン、アピゲニンは、Ｃ１８カラム（ＸＢｒｉｄｇｅ１００Ｃ１８；３，５ｍｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）で、溶離液としてＨ_２Ｏ／トリフルオロ酢酸０，１％（Ａ）およびアセトニトリル／トリフルオロ酢酸０，１％（Ｂ）による勾配条件（下記参照）を用いて行った分析的ＨＰＬＣにより滴定した：
勾配条件：ｔ０Ａ１８％Ｂ８２％；ｔ１分：Ａ１８％Ｂ８２％；１０分Ａ５０％Ｂ５０％；１０．１分：Ａ１８％Ｂ８２％
ＵＶ検出は、アピゲニンについては３４０ｎｍであり、３１０である。流量は１ｍＬ／分、温度は４０℃であった。純粋なルテオリン、アピゲニンおよびｐ−クマリンを校正に使用した。

結果

ＩＩＩ．アッセイ方法
方法１：ＨＰＬＣによるローソンアッセイ
この方法は以下に適用することができる：
Ａ．抽出物中のローソンのアッセイ
Ｂ．酸加水分解により得られた、シコウカ地上部に遊離形態でまたはグリコシル化ローソン誘導体の形態で存在する総ローソンのアッセイ、従って、その植物のローソン潜在量が定量される、
Ｃ．酵素によって形成されたローソンのアッセイ。

試薬
ローソン＞９７％（ＨＰＬＣ）ＳＩＧＭＡ−参照：Ｈ４６８０５
分析用ジクロロメタン
分析用硫酸
分析用メタノール
ＨＰＬＣグレードの水
ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル
ＨＰＬＣグレードのトリフルオロ酢酸

ＨＰＬＣ条件
・カラム：ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍＷａｔｅｒｓ
炉：４０℃
溶媒：Ｓ−Ａ：水中０．１％トリフルオロ酢酸
Ｓ−Ｂ：アセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸
勾配：Ｔ０分４０％Ｓ−Ａ；Ｔ１分４０％Ｓ−Ａ；Ｔ１０分５％Ｓ−Ａ；Ｔ１１分５％Ｓ−Ａ；Ｔ１１．１分４０％Ｓ−Ａ
波長；λ＝２７８ｎｍ
流速：１ｍＬ／分
注入:１０μＬ

サンプル調製：
全葉または粗く粉砕した葉の場合：
５０ｇの葉を粉砕した後、０．３５５μｍの篩にかける。
葉粉末の場合：
５０ｇの葉粉末をそのまま使用する。

溶液の調製
対照溶液：
１／１メタノール／エタノール中０．３ｍｇ／ｍＬのローソン溶液。１／１メタノール／水で１／１０、１／２０、１／１００に希釈する。

試験溶液：
試験溶液Ａ（抽出物中に存在するローソンのアッセイ）
５０ｍｇの抽出物を１００ｍＬの１／１メタノール／水に溶解する。
超音波で溶解する。
ＡｃｒｏｄｉｓｃＧＦＧＨＰで濾過する。
１０μＬを注入する。

試験溶液Ｂ（総ローソンのアッセイ）
８０ｍｇの葉粉末をメスフラスコに入れる。
５０ｍＬの２ＮＨ_２ＳＯ_４を添加する。
３０分間９７℃に加熱する。
冷却する。
メタノールを添加して１００ｍＬにする。
この溶液をＡｃｒｏｄｉｓｃＧＦＧＨＰ０．４５μmで濾過する。
１０μＬの濾液を注入する。

試験溶液Ｃ（酵素によって形成されたローソンのアッセイ）
８０ｍｇの葉粉末をメスフラスコに入れる。
５０ｍＬの脱塩水に加える。
超音波浴中に３０〜４０℃で３０分間置く。
冷却する。
メタノールを添加して１００ｍＬにする。
この溶液をＡｃｒｏｄｉｓｃＧＦＧＨＰ０．４５μmで濾過する。
１０μＬの濾液を注入する。

結果
対照溶液を用いて計算された回帰直線を使用して、以下を決定する：
Ａ．抽出物のローソン含量、
Ｂ．総ローソン含量、および／または
Ｃ．酵素によって形成されたローソンの含量。

方法２：窒素含有化合物（アミノ酸、タンパク質のアッセイ
遊離アミノ酸およびタンパク質は、ニンヒドリン分光光度法により加水分解の前または後にアッセイすることができる。結果は、アスパラギンに対するアミノ酸のパーセンテージで表される。

総タンパク質・アミノ酸のアッセイ
原理
酸加水分解後のニンヒドリン試薬によるアミノ酸の比色アッセイ。結果は、アスパラギンに対する総アミノ酸のパーセンテージで表される。

試薬
クエン酸バッファー（ｐＨ＝５）
２．１ｇのクエン酸を２０ｍＬの水に溶解し、２０ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウムを添加し、水で５０ｍＬに調整する。
ニンヒドリン試薬：
０．０８ｇの塩化スズ（ＩＩ）（ＳｎＣｌ_２、２Ｈ_２Ｏ）を５０ｍｌのクエン酸バッファー（ｐＨ＝５）に溶解する。
２ｇのニンヒドリンを５０ｍＬエチレングリコールモノメチルエーテル（ＥＧＭＥ）に溶解する。
これらの２つの溶液を混合する。
６Ｎ塩酸
濃塩酸の１／２（３６％）に希釈する。
希釈剤
１００ｍＬの１−プロパノールと１００ｍＬの水を混合する。

溶液の調製
校正範囲の調製
１７ｍｇのアスパラギンを１００ｍＬの水に溶解する。
試験溶液の調製
分析するサンプルに応じておよそ３０〜２００ｍｇの抽出物（ｐｅ_１）をねじ込み式試験管に秤量し、２ｍＬの６ＮＨＣｌを添加する。
密封して１１０℃で約１６時間置く。
３Ｎ水酸化ナトリウムで中和（メチルレッドが変色）した後、水で２０ｍｌに調整する。

アッセイ

撹拌し、１００℃の水浴に２０分間置く。
氷浴中で冷却する。
希釈剤で１０ｍｌに調整する。
種々の溶液の５７０ｎｍでの吸光度をブランクに対して測定する。

計算
検量線を作成する。
試験溶液中の総アミノ酸濃度（Ｑ_ＡＡＴ）（アスパラギンで表される）を検量線から推定する。
抽出物の総アミノ酸含量（Ｔ_ＡＡＴ）は、次式で与えられる。

方法３：クロロフィルの重量アッセイ
抽出物中のクロロフィル含量は、抽出物をヘプタンで洗浄した後に得られる重量によって評価することができる。抽出物を１０Ｖのメタノールにとる。１５分間撹拌した後、溶液を濾過する。上清を乾燥させ、クロロフィルを含有する画分とする。

Claims

シコウカ（Lawsonia inermis）地上部の抽出物であって、乾燥抽出物の総重量に対して１０〜６０重量％のローソンを含有し、そのローソンは、特に、ヘンノシドなどのグリコシル化ローソン誘導体の酵素加水分解から生じ、ルテオリン、アピゲニンおよびパラ−クマル酸も含有する、抽出物。
２，３，４，６−テトラヒドロキシアセトフェノンをさらに含有する、請求項１に記載の抽出物。
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸の含量が、乾燥抽出物の総重量に対して２重量％以下である、請求項１または２に記載の抽出物。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物と担体とを含んでなる、シコウカ（Lawsonia inermis）地上部の標準化された乾燥抽出物であって、０．６〜１．４重量％のローソンを含有する、標準化された乾燥抽出物。
ルテオリン含量が０．０５〜１．０重量％であり、
アピゲニン含量が０．０１〜０．５重量％であり、かつ
パラ−クマル酸含量が０．０１〜０．５重量％である、
請求項４に記載の標準化された乾燥抽出物。
ローソン抽出物の製造方法であって、以下の工程：
ａ）シコウカ（Lawsonia inermis）地上部の水中での浸軟処理であって、ｐＨ４〜８で実施され、この間に、シコウカ地上部に最初に存在したヘンノシドなどのグリコシル化ローソン誘導体が、部分的にまたは完全に酵素加水分解されて、ローソンを含有する水溶液となる、浸軟処理；
ｂ）工程ａ）から得られた溶液への有機溶媒の添加工程であって、前記溶媒の水との混和性が２５℃で１０重量％未満、有利には５重量％であり、水中での前記溶媒の混和性が２５℃で１０重量％未満、有利には５重量％であり、これにより水相と有機相が形成される、添加工程；
ｃ）工程ｂ）から得られた有機相の回収；および
ｄ）工程ｃ）から回収された有機相の濃縮処理であって、これによりローソン高含有抽出物を得ることが可能になる、濃縮処理
を含んでなる、製造方法。
工程ａ）における水温が２０℃〜６０℃、特に２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４５℃、とりわけ３０℃〜４５℃である、請求項６に記載の製造方法。
工程ａ）がｐＨ５〜７．５、とりわけ５．５〜７．５、特に６．５〜７．５で実施される、請求項６または７に記載の製造方法。
酸または塩基の添加により前記水溶液または前記水相のｐＨを変更する工程を含まない、請求項６〜８のいずれか一項に記載のローソン高含有抽出物製造方法。
工程ａ）が撹拌下で実施され、前記浸軟処理の持続時間が１５分間〜２時間、とりわけ１５分間〜１時間であり、有利にはおよそ３０分間である、請求項６〜９のいずれか一項に記載のローソン高含有抽出物製造方法。
工程ａ）において、使用される水の量が、浸軟処理に供したシコウカ地上部の質量の５〜１５倍、有利には６〜１０倍、典型的には１０倍である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のローソン高含有抽出物製造方法。
工程ｂ）において添加される有機溶媒が、双極子モーメント２．０Ｄ未満を特徴とし、アルコール、塩素化溶媒、ケトン、エーテル、エステルおよびこれらの混合物の中から選択される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の製造方法。
前記有機溶媒が、酢酸（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルまたは酢酸（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルの混合物、好ましくは、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソアミルおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
工程ｄ）から得られるローソン高含有抽出物が、工程ａ）において浸軟処理に供したシコウカ地上部に遊離形態でまたはヘンノシドなどのグリコシル化ローソン誘導体の形態で最初に存在したローソンの５０％超、特に６０％超、有利には７０％超を含有する、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の製造方法。
追加の工程：
ｃ’）工程ｃ）とｄ）の間での担体の添加工程、および
ｅ）工程ｄ）後の乾燥工程であって、これにより標準化された乾燥抽出物を得ることが可能になる、乾燥工程
を含んでなる、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
請求項６〜１５のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、抽出物または標準化された乾燥抽出物。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物または請求項４もしくは５に記載の標準化された乾燥抽出物または請求項６〜１５のいずれか一項に記載の方法により得ることができる抽出物もしくは標準化された乾燥抽出物と、少なくとも１種の化粧料的に許容可能な賦形剤とを含んでなる、化粧用染料組成物。