KR102297600B1

KR102297600B1 - 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 증대된 은행나무 잎 추출물의 제조 방법

Info

Publication number: KR102297600B1
Application number: KR1020210003930A
Authority: KR
Inventors: 배형진; 김진모; 홍인기
Original assignee: 한국콜마 주식회사; 성균관대학교 산학협력단
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2021-09-06

Abstract

본 발명은 은행나무 잎에 황산(H₂SO₄) 및 아세톤의 혼합 용매를 첨가하여 쿼세틴 및 캠페롤을 추출하는 단계를 포함하는 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 증대된 은행나무 잎 추출물의 제조 방법, 상기 제조 방법으로 제조된 은행나무 잎 추출물, 상기 은행나무 잎 추출물을 포함하는 화장료 조성물, 및 은행나무 잎 추출물 내 쿼세틴 및 캠페롤의 함량 증진 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 은행나무 잎의 추출 방법은 은행나무 잎에 포함된 쿼세틴 및 캠페롤을 최대로 수득할 수 있으므로, 은행나무 잎 추출물의 제조와, 기능성 성분인 쿼세틴 및 캠페롤의 정제에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 증대된 은행나무 잎 추출물의 제조 방법 {A preparation method for extract of Ginkgo biloba leaf having increased contents of quercetin and kaempferol}

본 발명은 은행나무 잎에 황산(H₂SO₄) 및 아세톤의 혼합 용매를 첨가하여 쿼세틴 및 캠페롤을 추출하는 단계를 포함하는 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 증대된 은행나무 잎 추출물의 제조 방법, 상기 제조 방법으로 제조된 은행나무 잎 추출물, 상기 은행나무 잎 추출물을 포함하는 화장료 조성물, 및 은행나무 잎 추출물 내 쿼세틴 및 캠페롤의 함량 증진 방법에 관한 것이다.

플라보노이드(flavonoid)는 과일과 채소 등 천연물에 폭넓게 존재하는 폴리페놀 계열의 화합물로서, 화합물의 구조에 따라 안토사이아니딘(anthocyanidin), 안토산틴(anthoxanthin), 플라바논(flavanone), 플라바논올(flavanonol), 플라반(flavan) 등으로 분류된다. 플라보노이드는 강력한 항산화 활성에 더하여, 항암, 항균, 항염, 항노화 및 항비만 등 매우 다양한 생리활성을 발현함이 보고되었다. 이처럼 플라보노이드의 우수한 생리활성이 전 세계적으로 인식되면서, 천연물에서 플라보노이드의 추출 효율을 향상시키는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

쿼세틴(quercetin)은 플라보놀(flavonol) 골격을 가지는 대표적인 플라보노이드 화합물로서, 양파, 케이퍼, 사과, 적포도주 등에 함유되어 있다. 쿼세틴은 강력한 항산화 활성과 산화 스트레스에 대한 간 보호 효과, 암 세포 사멸 효과 등이 알려져 있다 (Free Radic. Res., 2004, 38(8), 877-884).

캠페롤(kaempferol) 또한 쿼세틴과 마찬가지로, 대표적인 플라보노이드 화합물로서, 케일, 콩, 브로콜리, 딸기 등에 함유되어 있다. 캠페롤은 우수한 항산화 활성과 항염, 항종양 활성 등이 보고된 바 있다 (Pharmacogn. Rev., 2014, 8, 122-146).

한편, 은행나무 잎(Ginkgo biloba leaf)은 동아시아에서 오랜 시간 동안 약재로 사용되어 왔다. 현재에는 전세계적으로 천연 건강기능식품 또는 보충제로서 널리 이용되고 있으며, 특히, 뇌 순환 장애, 알츠하이머 병, 단기 기억 상실, 우울증 등을 포함한 다양한 질병의 개선에 효과적인 것으로 알려져 있다 (Br. J. Clin. Pharmacol. 1992, 34, 352-358.). 은행나무 잎에는 플라보놀, 플라본, 바이플라본, 카테킨 등을 포함한 30 종 이상의 플라보노이드가 함유되어 있음이 보고되었다 (J. Sep. Sci. 2007, 30, 2153-2159).

은행나무 잎 추출물을 기능성 식품이나 화장품, 또는 의약 원료로 사용하기 위해서는 은행나무 잎에 다량 함유된 플라보노이드의 안정성이 보장되어야 하며, 플라보노이드의 함량을 최대로 수득할 수 있는 추출 방법을 확립하는 것이 중요하다. 종래의 은행나무 잎의 추출 방법은 주로 에탄올로 추출하는 것을 기본으로 하였으나, 이는 쿼세틴 및 캠페롤의 수득률이 높지 않다는 문제가 있으며, 복잡한 단계로 이루어져 있어 추출 공정이 까다로워지는 단점이 있었다. 구체적으로, 에탄올로 추출한 경우에는 쿼세틴 또는 캠페롤과 같은 비배당체(aglycone) 형태보단, 배당체(glycoside) 형태의 유효성분이 많이 추출되어 수득률이 높지 않다. 또한, 에탄올로 추출한 결과물의 형태가 매우 끈적이며 물에 잘 녹지 않으므로, 물 또는 폴리올류에 녹여 추출물을 제조하는데 장시간 고온의 가온이 필요하며 높은 농도 희석을 통해 제조해야 하는 까다로움이 있었다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 기능성 성분의 함량이 증대된 은행나무 잎 추출물을 간편히 제조하기 위하여 예의 노력한 결과, 은행나무 잎에서 쿼세틴 및 캠페롤의 함량을 최대로 획득할 수 있는 최적의 추출 조건을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 은행나무 잎에 황산(H₂SO₄) 및 아세톤의 혼합 용매를 첨가하여 쿼세틴 및 캠페롤을 추출하는 단계를 포함하는, 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 증대된 은행나무 잎 추출물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 제조 방법으로 제조된 은행나무 잎 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 은행나무 잎 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 은행나무 잎에 황산 및 아세톤의 혼합 용매를 첨가하여 쿼세틴 및 캠페롤을 추출하는 단계를 포함하는, 은행나무 잎 추출물 내 쿼세틴 및 캠페롤의 함량 증진 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 제1양태로서 은행나무 잎에 황산(H₂SO₄) 및 아세톤의 혼합 용매를 첨가하여 쿼세틴 및 캠페롤을 추출하는 단계를 포함하는, 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 증대된 은행나무 잎 추출물의 제조 방법을 제공한다.

하나의 구체예로서, 상기 황산의 농도는 0.01 내지 1M인 것이 특징일 수 있다.

다른 구체예로서, 상기 혼합 용매는 황산 및 아세톤을 300 내지 500 : 1의 부피비로 포함하는 것이 특징일 수 있다.

또 다른 구체예로서, 상기 제조 방법은 은행나무 잎 추출물에서 쿼세틴 및 캠페롤을 분리, 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징일 수 있다.

또 다른 구체예로서, 상기 은행나무 잎 추출물에는 쿼세틴 1 내지 2 mg/ml, 또는 캠페롤 0.2 내지 0.5 mg/ml의 함량으로 포함되는 것이 특징일 수 있다.

또 다른 구체예로서, 상기 추출은 40 내지 60℃의 온도에서 2 내지 4시간 동안 수행되는 것이 특징일 수 있다.

본 발명은 제2양태로서 상기 제1양태의 제조 방법으로 제조된 은행나무 잎 추출물을 제공한다.

본 발명은 제3양태로서 상기 제2양태의 은행나무 잎 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 제4양태로서 은행나무 잎에 황산 및 아세톤의 혼합 용매를 첨가하여 쿼세틴 및 캠페롤을 추출하는 단계를 포함하는, 은행나무 잎 추출물 내 쿼세틴 및 캠페롤의 함량 증진 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 은행나무 잎의 추출 방법은 은행나무 잎에 포함된 쿼세틴 및 캠페롤을 최대로 수득할 수 있으므로, 은행나무 잎 추출물의 제조와, 기능성 성분인 쿼세틴 및 캠페롤의 정제에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 HPLC-MS/MS 및 H-NMR 스펙트라를 통해 은행나무 잎 추출물로부터 정제된 분리물을 나타낸 도이다 (비-가수분해 분리물(NI), 산-가수분해 분리물(AI), 쿼세틴(Q) 및 캠페롤(K)).
도 2는 가수분해에 이용되는 산의 종류에 따른 은행나무 잎 추출물의 쿼세틴 및 캠페롤 함량을 분석한 HPLC 결과이다.
도 3은 가수분해에 이용되는 산의 종류에 따른 은행나무 잎 추출물의 쿼세틴 및 캠페롤 함량을 비교한 그래프이다.
도 4는 추출 용매에 따른 은행나무 잎 추출물의 쿼세틴 및 캠페롤 함량을 분석한 HPLC 결과이다.
도 5는 추출 용매에 따른 은행나무 잎 추출물의 쿼세틴 및 캠페롤 함량을 비교한 그래프이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 발명은 은행나무 잎 추출물에서 쿼세틴과 캠페롤의 함량이 최대가 될 수 있도록 추출하는 최적의 조건을 확인한 것에 기초한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 은행나무 잎에 황산(H₂SO₄) 및 아세톤의 혼합 용매를 첨가하여 쿼세틴 및 캠페롤을 추출하는 단계를 포함하는, 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 증대된 은행나무 잎 추출물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 "은행나무 잎"은 동아시아의 고산, 고원 지대를 제외한 온대에 널리 분포하는 은행나무(Ginkgo biloba)의 잎을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 은행나무 잎은 원물, 건조물 또는 가공물일 수 있으며, 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "추출물"은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상 성분, 상기 액상 성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.

본 발명의 은행나무 잎 추출물은 상기 은행나무 잎 원물, 이의 건조물, 가공물 등을 단독으로 또는 조합하여, 용매 등으로 추출하여 수득하는 것일 수 있으며, 본 발명의 은행나무 잎 추출물은 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 증대된 추출물일 수 있다.

본 발명의 "쿼세틴(quercetin)"은 다양한 식물에 함유되어 있는 플라보노이드로서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미한다.

상기 쿼세틴의 분자량은 302.23, 화학식은 C₁₅H₁₀O₇, 화학명은 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one, CAS 번호는 117-39-5로 알려져 있으며, 퀘르세틴으로도 불리며, 본 발명에서 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 "캠페롤(kaempferol)"은 다양한 식물에 함유되어 있는 플라보노이드로서, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 의미한다.

상기 캠페롤의 분자량은 286.23, 화학식은 C₁₅H₁₀O₆, 화학명은 3,5,7-Trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one, CAS 번호는 520-18-3으로 알려져 있으며, 캠페라이드로도 불리며, 본 발명에서 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 은행나무 잎 추출물은 은행나무 잎에 산(acid)을 첨가하여 가수분해하고, 특정 용매로 추출하여 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 가수분해에 사용되는 산 용매는 황산(H₂SO₄), 염산(HCl), 아세트산(CH₃COOH), 질산(HNO₃) 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 황산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 산 용매의 농도는 0.01M 내지 1M, 구체적으로 0.01M 내지 0.5M, 더욱 구체적으로 0.01M 내지 0.1M일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 산 용매는 특정 추출 용매와 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 추출 용매는 물, C₁ 내지 C₆의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C₁ 내지 C₄의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 아세톤, 아세토나이트릴, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 산 용매와 혼합하여 사용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 추출 용매는 황산 및 아세톤의 혼합 용매일 수 있으며, 상기 혼합 용매는 황산 및 아세톤을 1: 200 내지 600의 부피비, 구체적으로 1: 300 내지 500의 부피비, 더욱 구체적으로 1:400의 부피비로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

은행나무 잎을 아세톤만으로 추출한 경우에는 배당체(glycoside) 형태의 유효성분의 수득률이 높다는 문제가 있는 바, 본 발명자들은 황산 및 아세톤의 혼합 용매를 이용하여 산가수분해를 통해 배당체를 제거하여 비배당체(aglycone) 형태의 쿼세틴 및 캠페롤을 특정적으로 수득할 수 있음을 최초로 규명하였다.

본 발명의 하나의 구체적인 일 구현예에서, 황산 및 아세톤 혼합 용매를 사용한 경우, 산 용매를 첨가하지 않고 아세톤 용매만으로 추출하거나, 염산 및 아세톤 혼합 용매를 사용한 경우에 비하여, 은행나무 잎 추출물에 포함된 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 현저히 증가한 것을 확인하였다 (실시예 3).

본 발명의 다른 하나의 구체적인 구현예에서, 황산 및 아세톤 혼합 용매를 사용한 경우, 아세토나이트릴 및 황산 혼합 용매; 또는 에탄올 및 황산 혼합 용매를 사용한 경우에 비하여, 은행나무 잎 추출물에 포함된 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 현저히 증가한 것을 확인하였다 (실시예 4).

이는, 황산 및 아세톤의 혼합 용매를 사용하는 것이 은행나무 잎에서 쿼세틴 및 캠페롤의 함량을 최대로 수득할 수 있는 최적의 추출 방법임을 시사하는 것이다.

본 발명에서 상기 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다. 또한, 상술한 방법으로 추출된 추출물을 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 추출물을 추출하는 온도는 20 내지 80℃, 구체적으로 30 내지 70℃, 더욱 구체적으로는 40 내지 60℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 통상적으로 추출이 될 수 있는 온도 범위라면 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 추출물을 추출하는 시간은 1 내지 7시간, 구체적으로 1 내지 5시간, 더욱 구체적으로는 2 내지 4시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 은행나무 잎 추출물의 제조 방법은 은행나무 잎 추출물에서 쿼세틴 및 캠페롤을 분리, 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 및 정제는 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 추가 정제의 비제한적인 예로는, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 은행나무 잎 추출물 제조 방법으로 제조된 은행나무 잎 추출물을 제공한다.

본 발명의 "은행나무 잎","추출물", 및 "제조 방법"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 제조 방법으로 제조된 은행나무 잎 추출물은 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 유의하게 증대된 것일 수 있다.

본 발명의 제조 방법으로 제조된 은행나무 잎 추출물에는 쿼세틴이 1 내지 3mg/ml, 구체적으로 1 내지 2 mg/ml, 더욱 구체적으로 1.2 내지 1.5 mg/ml의 함량으로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제조 방법으로 제조된 은행나무 잎 추출물에는 캠페롤이 0.1 내지 1 mg/ml, 구체적으로 0.1 내지 0.7 mg/ml, 더욱 구체적으로 0.1 내지 0.5 mg/ml의 함량으로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서 본 발명의 제조 방법으로 은행나무 잎 추출물을 제조한 결과, 은행나무 잎 추출물에 포함된 쿼세틴의 함량은 1.3mg/ml 및 캠페롤의 함량은 0.3mg/ml인 것을 확인하였다 (실시예 3 및 4).

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 은행나무 잎 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 은행나무 잎 추출물은 본 발명의 제조 방법으로 제조된 은행나무 잎 추출물을 의미한다.

본 발명의 화장료 조성물은 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "화장료 조성물"은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제형이 파우더인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 본 발명의 제형이 캡슐인 경우에는, 알지네이트(alginate) 캡슐, 아가(agar) 캡슐, 젤라틴(gelatin) 캡슐, 왁스(wax)류 캡슐, 또는 이중 캡슐의 형태로 제형화될 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 은행나무 잎 추출물 이외에 통상적으로 이용되는 보조제, 예컨대 친수성 또는 친지성 겔화제, 친수성 또는 친지성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 및 염료 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 은행나무 잎에 황산 및 아세톤의 혼합 용매를 첨가하여 쿼세틴 및 캠페롤을 추출하는 단계를 포함하는, 은행나무 잎 추출물 내 쿼세틴 및 캠페롤의 함량 증진 방법을 제공한다.

본 발명의 "황산", "아세톤", "혼합 용매", "은행나무 잎", "추출물", "쿼세틴", 및 "캠페롤"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 조성물은 황산 및 아세톤의 혼합 용매를 처리하여 은행나무 잎 추출물 내 쿼세틴 및 캠페롤의 함량 증진을 위해 활용되는 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 은행나무 잎 추출물 제조

은행나무 잎(GBL) 분말은 TnV International Inc. (Chino, CA, USA)에서 구매하여 사용하였다 (배치 넘버: GB0170920).

GBL 분말로부터 플라보노이드를 두 가지 방법으로 분리하였다. 첫 번째 방법은 4g의 GBL 분말에 40ml 아세톤 용액을 50℃에서 3시간 동안 처리하였다. 그 후, GBL 아세톤 추출물을 여과지에 통과시키고 회전 증발기(R-100, BUCHI, Rheinstetten, Germany)에서 아세톤을 증발시켜 분말화하였다. 상기 분말을 비-가수분해 분리물(NI, non-hydrolyzed isolate)로 명명하였다.

두 번째 방법은 4g의 GBL 분말에 100μl 0.1M 황산(H₂SO₄) 및 40ml 아세톤 혼합 용액을 50℃에서 3시간 동안 처리하였다. 그 후, 상기 황산 및 아세톤 혼합 용액 추출물을 여과지에 통과시키고, 회전증발기에서 아세톤을 증발시켜 분말화하였다. 상기 분말을 산-가수분해 분리물(AI, acidolyzed isolate)로 명명하였다.

상기 농축액을 80ml 증류수에 용해 후 원심분리하였고 (10분, 25℃, 6000RCF), 플라보노이드를 제외한 친수성 화합물 (락톤, 징코라이드, 빌로발리드, 당류 등)이 포함된 상등액을 제거하여 침전물을 수득하였다. 상기 용해/침전 절차를 수집된 침전물을 이용하여 2회 반복하였으며, 얻어진 최종 침전물을 회전증발기로 분말화한 후 -80℃에서 보관하였다.

실시예 2. 은행나무 잎 추출물에 포함된 쿼세틴 및 캠페롤 정제

HPLC 분석은 Ultimate 3000 RS 모듈 시스템(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 LTQ-orbitrap classic(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에 연결하여 수행하였다. 2μl의 샘플 용액을 이동상 구배 설정으로 40℃에서 2시간 동안 역상 컬럼(U-VD Spher Pur C18-E, 1.8μm, 100 x 2.0mm; VDS Optilab, Berlin, Germany)을 이용하여 분리하고, HPLC에서 나온 액체를 electrospray-ionization을 통해 질량 분석기로 직접 이동하였다.

실시예 1의 두 가지 방법을 통해 제조된 은행나무 잎 추출물에 포함된 플라보노이드를 아세톤을 사용하여 분리 후, 침전을 통해 정제하였다. 도 1은 HPLC-MS/MS 및 H-NMR 스펙트라를 통해 정제된 분리물, 즉, NI, AI, 쿼세틴(Q) 및 캠페롤(K)을 나타낸다.

쿼세틴 및 캠페롤의 크로마토그램에서 주요 피크는 각각 15.3분 및 16.3분에 관찰되었다. 이러한 주요 피크에 대하여 양이온화된 질량 스펙트럼은 쿼세틴 및 캠페롤에 대해 각각 303.3 및 287.2 [M]⁺(m/z)를 나타내었으며, 상기 결과는 쿼세틴 (302.3) 및 캠페롤 (286.2)의 분자량 (MWs)과 일치하였다.

NI의 크로마토그램에서 13.6, 14.1, 및 15.3분에 세 개의 주요 피크가 관찰되었다. 음이온화된 질량 스펙트럼에서 피크 1의 경우 609.6, 피크 2의 경우 431.5 및 577.5, 피크 3의 경우 301.3 및 571.6 의 [M]⁺(m/z)를 나타내었다. 이러한 결과는 은행나무 잎 추출물에서 분리된 화합물의 분자량과 일치하였다. 610.6, 432.5, 578.5 및 302.3의 분자량은 각각 루틴 (rutin, 쿼세틴의 루티노사이드), 아프젤린 (afzelin, 캠페롤의 람노사이드), 알려지지 않은 캠페롤의 글리코사이드, 및 쿼세틴에 상응한다. 상기 결과를 통해, 산가수분해 되지 않은 분리물 (NI)의 주요 화합물은 쿼세틴 배당체(glycosides), 캠페롤 배당체(glycosides), 쿼세틴 아글리콘(aglycone) 등인 것을 알 수 있었다. NI의 log p 값은 0.76±0.03 이며, 이는 글리코사이드의 존재로 인하여 쿼세틴의 값(2.59±0.06) 또는 캠페롤의 값(3.05±0.13) 보다 작은 것임을 확인하였다.

AI의 크로마토그램에서 14.2분에 부수적인 하나의 피크, 15.2, 및 15.6분에 두 개의 주요 피크가 관찰되었다. 음이온화된 질량 스펙트럼에서 부수적 피크는 캠페롤 배당체에 상응하며, 피크 1의 경우 301.3 의 [M]⁺(m/z)를 나타내어 쿼세틴인 것으로 판명되었다. 피크 2의 경우, 269.4, 285.3, 301.3, 및 315.3 네 개의 [M]⁺(m/z)를 나타낸 바, 각각 아피제닌(apigenin), 캠페롤 또는 루테올린(luteolin), 쿼세틴 및 이소람네틴(isorhamnetin)인 것으로 확인되었다. 상기 결과를 통해 NI와 다르게, AI의 주요 플라보노이드는 아글리콘인 것을 알 수 있었다. 그에 따라, AI의 log p 값은 1.45±0.06으로, NI에 비하여 거의 2배 정도 큰 수치를 나타내었다. 이러한 차이는 AI의 분리에 사용된 용매인 황산이 당(sugar) 잔기를 제거함으로써 나타난 결과이다.

실시예 3. 산 종류에 따른 은행나무 잎 추출물의 쿼세틴 및 캠페롤 함량 분석

황산 가수분해의 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1의 추출 방법에서 황산 대신 염산(HCl)을 사용하거나, 또는 산 가수분해를 수행하지 않은 경우의 은행나무 잎 추출물에 포함된 쿼세틴 및 캠페롤의 함량을 비교하였다.

그 결과, 도 2 및 도 3에서 알 수 있듯이, 황산 가수분해를 수행한 경우 은행나무 잎 추출물에 포함된 쿼세틴의 함량은 1.3mg/ml 및 캠페롤의 함량은 0.3mg/ml임을 알 수 있었다. 이에 비하여, 황산 대신 염산을 이용하여 가수분해한 경우에는 (Acetone+HCl), 쿼세틴의 함량이 0.8mg/ml 및 캠페롤의 함량이 0.1mg/ml로 황산 가수분해 방법에 비하여 쿼세틴은 약 38%, 캠페롤은 약 67% 감소한 것을 확인하였다. 또한, 산 가수분해를 수행하지 않은 경우에는 (Acetone), 쿼세틴의 함량이 0.11mg/ml 및 캠페롤의 함량이 0.03mg/ml로서 쿼세틴은 약 92%, 캠페롤은 약 90% 감소한 것을 확인하였다. 즉, 산 가수분해를 수행함으로써 은행나무 잎 추출물에 포함된 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 현저히 증가하며, 그 중에서도 황산을 이용한 경우 상기 유효성분을 추출하는 가장 우수한 방법임을 알 수 있었다.

실시예 4. 용매 종류에 따른 은행나무 잎 추출물의 쿼세틴 및 캠페롤 함량 분석

쿼세틴 및 캠페롤 함량을 최대로 갖는 은행나무 추출물을 제조하기 위하여, 용매에 따른 은행나무 잎 추출물의 쿼세틴 및 캠페롤 함량을 분석하였다. 아세톤, 아세토나이트릴(Acetonitrile), 및 에탄올을 황산과 혼합한 혼합 용매로 하여 실시예 1과 동일한 방법으로 은행나무 잎 추출물을 제조하였다.

그 결과, 도 4 및 도 5에서 알 수 있듯이, 아세톤 및 황산 혼합 용매로 추출한 경우 은행나무 잎 추출물에 포함된 쿼세틴의 함량은 1.3mg/ml 및 캠페롤의 함량은 0.3mg/ml인 것에 비하여, 아세토나이트릴 및 황산 혼합 용매로 추출한 경우에는 쿼세틴 함량은 0.65mg/ml로 약 50% 감소하였으며, 캠페롤 함량은 0.05mg/ml로 약 83% 감소한 것을 확인하였다. 또한, 에탄올 및 황산 혼합 용매를 사용하여 은행나무 잎을 추출한 경우, 쿼세틴 함량은 0.35mg/ml로 아세톤 및 황산 추출물에 비하여 약 73% 감소하였으며, 캠페롤 함량은 0.1mg/ml로 약 67% 감소한 것을 확인하였다.

결론적으로, 은행나무 잎에 황산(H₂SO₄) 및 아세톤 혼합 용액을 처리한 결과, 쿼세틴의 함량이 1.3mg/ml 및 캠페롤의 함량이 0.3mg/ml로 증대된 것을 확인한 바, 황산 및 아세톤 혼합 용매를 사용한 은행나무 잎 추출물에서 쿼세틴 및 캠페롤 함량이 최대가 됨을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

은행나무 잎에 황산(H₂SO₄) 및 아세톤의 혼합 용매를 첨가하여 쿼세틴 및 캠페롤을 추출하는 단계를 포함하는, 쿼세틴 및 캠페롤의 함량이 증대된 은행나무 잎 추출물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 황산의 농도는 0.01 내지 1M인 것인, 은행나무 잎 추출물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 혼합 용매는 황산 및 아세톤을 1 : 300 내지 500의 부피비로 포함하는 것인, 은행나무 잎 추출물의 제조 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 은행나무 잎 추출물에는 쿼세틴 1 내지 2 mg/ml, 또는 캠페롤 0.2 내지 0.5 mg/ml의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 은행나무 잎 추출물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 추출은 40 내지 60℃의 온도에서 2 내지 4시간 동안 수행되는 것인, 은행나무 잎 추출물의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조된 은행나무 잎 추출물.
제7항의 은행나무 잎 추출물을 포함하는 화장료 조성물.
은행나무 잎에 황산 및 아세톤의 혼합 용매를 첨가하여 쿼세틴 및 캠페롤을 추출하는 단계를 포함하는, 은행나무 잎 추출물 내 쿼세틴 및 캠페롤의 함량 증진 방법.