CN110960454B - 一种怀菊花提取物脂质体和制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种怀菊花提取物脂质体和制备方法及其用途，该怀菊花提取物脂质体，包括如下重量份数的原料组成：怀菊花提取物0.5～2份；磷脂4‑8份；缓冲液80‑95份，所述怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：取怀菊花提取物、磷脂和有机溶剂混合，溶解，浓缩去除有机溶剂，加入缓冲液，高速剪切，制得怀菊花提取物脂质体。本发明制得怀菊花提取物脂质体，能够明显提高怀菊花提取物在皮肤的贮存量，促进皮肤纤维细胞释放更多的胶原蛋白，增强其的抗光老化活性，进而提升皮肤的抗衰老能力。

Description

一种怀菊花提取物脂质体和制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及日常护肤技术领域，具体涉及一种怀菊花提取物脂质体和制备方法及其用途。
背景技术
皮肤衰老容易引起皮肤出现皱纹、松弛、干燥、色素沉积等一系列问题。而皮肤衰老包括两种衰老过程，一是自然老化，由内在基因决定；二是由外部环境因素导致的衰老，例如，紫外线、污染物等。皮肤老化机制非常复杂。现在的防衰老化妆品大多为了达到较好的防衰老效果而使用抗氧化性强的工业成分，尽管其短时见效快，但是长时间使用对人体危害极大。
怀菊花味甘、苦，微寒，归肺、肝经，具有散风清热、平肝明目、解毒消肿的功效，为“四大怀药”之一，主要产自河南武陟、温县等地，其栽培历史悠久，是药用菊花的始祖。怀菊花营养丰富，无毒副作用，其化学成分有挥发油、黄酮类化合物、有机酸类、多糖、氨基酸、微量元素等，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗衰老等药理作用，是一种具有较高开发利用和保护价值的自然资源。然而，发明人前期研究发现将现有的单一的怀菊花提取物应用于皮肤抗衰老研究时，其活性成分的释放性能较差，皮肤贮藏量低，使得作用时间较长，无法取得较好的抗衰老功能，限制了其的推广应用。
发明内容
因此，本发明解决的技术问题在于克服现有技术中怀菊花提取物释放性能较差，皮肤贮藏量低而导致抗衰老能力低下的缺陷，提供了一种怀菊花提取物脂质体和制备方法及其用途。
本发明提供了一种怀菊花提取物脂质体，包括如下重量份数的原料：
怀菊花提取物 0.5～2份；
磷脂 4-8份；
缓冲液 80-95份。
进一步地，所述磷脂为大豆卵磷脂。
进一步地，还包括表面活性剂，所述表面活性剂为聚乙二醇-8-辛酸癸酸酯、聚乙二醇-32-月桂酸酯、聚乙二醇-40-氢化蓖麻油、聚甘油-10-辛酸癸酸酯、聚甘油-10-月桂酸酯和聚甘油-10-油酸酯中的至少一种。
进一步地，所述表面活性剂为聚甘油-10-辛酸癸酸酯。
本发明还提供了一种制备上述任一所述怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
将怀菊花提取物、磷脂混合，或者将怀菊花提取物、磷脂和表面活性剂混合，然后加入有机溶剂溶解，浓缩去除有机溶剂，加入缓冲液，高速剪切，制得怀菊花提取物脂质体。
进一步地，在溶解过程中，控制溶解的温度为55-65℃。
进一步地，在高速剪切过程，将加入缓冲液之后的混合液以1000-1200rpm的转速高速剪切1-3min，制得乳液，然后将乳液在600-1500bar压力下高压均质循环3-4次，制得怀菊花提取物脂质体。
进一步地，所述怀菊花提取物脂质体的粒径不大于200nm，优选为100-200nm。
上述任一所述的怀菊花提取物脂质体或者上述任一所述的方法制得的怀菊花提取物脂质体在制备刺激皮肤胶原蛋白合成的护肤制剂中的应用。
上述任一所述的怀菊花提取物脂质体或者上述任一所述的方法制得的怀菊花提取物脂质体在制备抗皮肤光老化护肤制剂中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的怀菊花提取物脂质体，通过特定比例的怀菊花提取物、磷脂和有机溶剂和缓冲液，制得的怀菊花提取物脂质体，能够明显提高怀菊花提取物在皮肤的贮存量，促进皮肤纤维细胞释放更多的胶原蛋白，增强其的抗光老化活性，进而提升皮肤的抗衰老能力。
2.本发明提供的怀菊花提取物脂质体，通过加入表面活性剂修饰脂质体能够进一步提升怀菊花提取物在皮肤的贮存量，而且以聚甘油-10-辛酸癸酸酯为表面活性剂时能够最大限度提升怀菊花提取物在皮肤的贮存量。
3.本发明提供的怀菊花提取物脂质体的制备方法，通过控制所述高速剪切过程先将加入缓冲液之后的混合液以1000-1200rpm的转速高速剪切1-3min，制得乳液；然后将乳液在600-800bar压力下高压均质循环3-4次，制得怀菊花提取物脂质体，得到粒径在100-200nm范围内，且粒径分布均匀、质量稳定的怀菊花提取物脂质体，进一步提高了怀菊花提取物在皮肤的贮存量。
具体实施方式
实施例1怀菊花提取物的制备
本实施例提供了一种怀菊花提取物的制备方法，包括如下步骤：
挑选品质优良的新鲜怀菊花放入干燥箱，在60℃下干燥12h后，用粉碎机将其粉碎并过40目筛，然后用体积分数为75％的乙醇溶液超声浸提3次，料液比1:30(g/mL)，每次浸提时间为1h，抽滤，合并滤液，然后在40℃下减压浓缩去除溶剂，得怀菊花提取物。
供试品溶液的制备：取怀菊花提取物1g，加入无水乙醇，定容至50mL，得供试品溶液。
对照品溶液的制备：分别取绿原酸标准品和木犀草素标准品，加乙醇溶解，配制成1mg/mL绿原酸和1mg/mL木犀草素的对照品溶液。
经高效液相色谱法(HPLC)检测，色谱柱采用SWELL Chromplus C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；柱温为25℃；进样量为10μL；流速为0.8mL/min，检测波长为350nm。流动相采用0.3％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～25min，90％A；25～80min，90％→82.5％A；80～90min，82.5％→79％A；90～110min，79％→74％A；110～125min，74％→70％A；125～150min，70％→60％A。结果显示，测定该怀菊花提取物中绿原酸占6.2％，木犀草素3.4％。
实施例2
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)600g混合，加入无水乙醇600ml，置于60℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9300ml，以12000rpm的转速高速剪切2min以形成均一乳液，随后将该乳液在600bar压力下经高压均质机循环4次，得到怀菊花提取物脂质体。
实施例3
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)600g混合，加入无水乙醇600ml，置于60℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9300ml，以12000rpm的转速高速剪切2min以形成均一乳液，随后将该乳液在1200bar压力下经高压均质机循环5次，得到怀菊花提取物脂质体。
实施例4
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)600g混合，加入无水乙醇600ml，置于60℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9300ml，以12000rpm的转速高速剪切2min以形成均一乳液，随后将该乳液在500bar压力下经高压均质机循环2次，得到怀菊花提取物脂质体。
实施例5
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)600g、聚乙二醇-8-辛酸癸酸酯20g混合，加入无水乙醇600ml，置于60℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9300ml，以12000rpm的转速高速剪切2min以形成均一乳液，随后将该乳液在600bar压力下经高压均质机循环4次，得到怀菊花提取物脂质体。
实施例6
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)600g、聚乙二醇-32-月桂酸酯20g混合，加入无水乙醇600ml，置于60℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9300ml，以12000rpm的转速高速剪切2min以形成均一乳液，随后将该乳液在600bar压力下经高压均质机循环4次，得到怀菊花提取物脂质体。
实施例7
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)600g、聚乙二醇-40-氢化蓖麻油20g混合，加入无水乙醇600ml，置于60℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9300ml，以12000rpm的转速高速剪切2min以形成均一乳液，随后将该乳液在600bar压力下经高压均质机循环4次，得到怀菊花提取物脂质体。
实施例8
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)600g、聚甘油-10-辛酸癸酸酯20g混合，加入无水乙醇600ml，置于60℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9300ml，以12000rpm的转速高速剪切2min以形成均一乳液，随后将该乳液在600bar压力下经高压均质机循环4次，得到怀菊花提取物脂质体。
实施例9
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)600g、聚甘油-10-月桂酸酯20g混合，加入无水乙醇600ml，置于60℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9300ml，以12000rpm的转速高速剪切2min以形成均一乳液，随后将该乳液在600bar压力下经高压均质机循环4次，得到怀菊花提取物脂质体。
实施例10
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)600g、聚甘油-10-油酸酯20g混合，加入无水乙醇600ml，置于60℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9300ml，以12000rpm的转速高速剪切2min以形成均一乳液，随后将该乳液在600bar压力下经高压均质机循环4次，得到怀菊花提取物脂质体。
实施例11
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)800g、聚甘油-10-辛酸癸酸酯20g混合，加入无水乙醇1200ml，置于55℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9100ml，以10000rpm的转速高速剪切3min以形成均一乳液，随后将该乳液在700bar压力下经高压均质机循环4次，得到怀菊花提取物脂质体。
实施例12
本实施例提供了一种怀菊花提取物脂质体的制备方法，包括如下步骤：
取实施例1制得的怀菊花提取物100g与大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量大于70％)700g、聚甘油-10-辛酸癸酸酯20g混合，加入无水乙醇1000ml，置于60℃加热溶解，然后通过旋转蒸发仪去除乙醇，并向其中加入pH7.4的PBS缓冲液9200ml，以12000rpm的转速高速剪切1min以形成均一乳液，随后将该乳液在800bar压力下经高压均质机循环4次，得到怀菊花提取物脂质体。
实验例1I型胶原蛋白分泌影响的试验
选用人皮肤成纤维细胞，考察实施例1制备的怀菊花提取物和实施例2制备的怀菊花提取物脂质体对I型胶原蛋白分泌的影响。
待测样品溶液的配制：用无血清DMEM培养基将实施例1制得的怀菊花提取物和实施例2制得的怀菊花提取物脂质体分别配制成含有怀菊花提取物为0.1～0.8mg/ml的溶液，得到一系列待测样品溶液。
取第5代人皮肤成纤维细胞，并培养至一定程度，消化细胞，制备细胞悬液，并将之接种到96孔板上，每孔100μL，于二氧化碳培养箱(37℃)中过夜培养后，弃去细胞培养液。分别加入待测样品溶液，以不含怀菊花提取物(0mg/mL)的为空白对照，细胞培养48h后，收集上清液并离心，通过I型前胶原蛋白Elasa试剂盒按照试剂盒说明书中提供的检测方法检测其中I型前胶原蛋白含量。其试验结果如表1所示。
表1怀菊花提取物对I型胶原蛋白分泌的影响
Figure BDA0002297061300000091
与空白组相比，怀菊花提取物对正常成人皮肤成纤维细胞分泌I型胶原蛋白的量随着其浓度升高而增强。当怀菊花提取物的浓度升高至0.8mg/mL时，I型胶原蛋白的含量为空白对照组的1.41倍，说明怀菊花提取物可显著促进正常成人皮肤成纤维细胞分泌I型胶原蛋白，增加皮肤中的胶原纤维含量，具有抗皮肤老化的功效。而且，相对于怀菊花提取物，本发明制得的怀菊花提取物脂质体更能够明显提升I型胶原蛋白的分泌，提高抗衰老功能。
实验例2抗皮肤老化试验
待测样品溶液的配制：用无血清DMEM培养基将实施例1制得的怀菊花提取物和实施例2制得的怀菊花提取物脂质体分别配制成含有怀菊花提取物为0.1～0.8mg/ml的溶液，得到一系列待测样品溶液。
将所购买的一支人表皮角化细胞复苏后传代培养至第5代时，转移至6孔板继续进行培养，待细胞密度达到60％-70％时，将其分为5组，依次为阴性空白对照组(既不添加任何药物，又不进行紫外线辐射)、阴性加药对照组(添加0.4μg/mL怀菊花提取物水溶液，但不进行紫外线辐射)、阳性空白对照组(不添加任何药物，但进行紫外线辐射)、阳性加药实验组1(添加0.4μg/mL的怀菊花提取物水溶液，并进行紫外线辐射)和阳性加药实验组2(添加0.4μg/mL的怀菊花提取物脂质体水溶液，并进行紫外线辐射)。
培养4h后，所有对照组及实验组均去除培养基，PBS洗两遍，加入适量PBS(没过细胞即可)。将阴性加药对照组和阴性空白对照组进行遮光处理，阳性空白对照组、阳性加药实验组1和阳性加药实验组2暴露于紫外交联仪下，进行紫外光照射处理(光照强度250μw/cm2、200s，共计光照强度50mJ/cm2)。UVB辐射后去除PBS，将阳性加药实验组1和阳性加药实验组2加相应浓度怀菊花提取物的培养基，继续培养4h，弃培养基，对照组及实验组均用PBS洗后加TRIZOL裂解，分别获得各皿细胞裂解液，抽提总RNA，并进行cDNA转录，通过RT-PCR分别检测c-fos、MMP1、MMP3、IL-6、TNF-α等基因mRNA表达的变化，如表2。
表2怀菊花提取物抑制UVB诱导细胞因子mRNA基因表达的影响
Figure BDA0002297061300000101
Figure BDA0002297061300000111
由表2可知，质量分数为0.4μg/mL的怀菊花提取物可以有效抑制UVB诱导角质的炎症因子的表达，并且怀菊花提取物脂质体更有效的抑制UVB诱导角质的炎症因子的表达，说明怀菊花提取物脂质体比怀菊花提取物更有效的预防皮肤光老化的效果。
实验例3透皮性能测试
通过激光粒度仪检测实施例2-9制得的怀菊花提取物脂质体的平均粒径和粒径分布，结果见下表所示。
取冷冻备用小型猪腹部离体皮肤，置于生理盐水中37℃解冻。将其固定在Franz扩散池的样品池与接受池之间，皮肤正表面面向样品池，接受池中加入10ml生理盐水，保持液面与皮肤贴合，排尽气泡，调节水浴温度37℃。在样品池中分别加入0.5g怀菊花提取物的1,3丁二醇水溶液(对照组，怀菊花提取物含量1％，采用实施例1制备的怀菊花提取物)与怀菊花提取物脂质体的1,3丁二醇水溶液(实验组，怀菊花提取物含量1％，分别采用实施例2-12制得的怀菊花提取物脂质体)，每个样品平行重复3次。磁力搅拌速度为200rmp，分别于4h时间点，去除皮肤表面试验样品，采用生理盐水清洗三次，然后将试验样品接触皮肤截取，并通过研磨器充分研磨，并加入无水乙醇置于超声波清洗器中超声提取5min，离心取上清液，并经过0.22μm过滤膜过滤，得接受液，通过HPLC检测法测定接受液中怀菊花提取物的含量，在该HPLC检测方法中，以怀菊花的主要成分之一绿原酸为标志物检测。
绿原酸标准品溶液的配制：取绿原酸标准品，加乙醇溶解，配制成1mg/mL绿原酸的对照品溶液。
经高效液相色谱法(HPLC)检测，色谱柱采用SWELL Chromplus C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；柱温为25℃；进样量为10μL；流速为0.8mL/min，检测波长为350nm。流动相采用0.3％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～25min，90％A；25～80min，90％→82.5％A；80～90min，82.5％→79％A；90～110min，79％→74％A；110～125min，74％→70％A；125～150min，70％→60％A，结果见下表所示。
表3怀菊花提取物脂质体的粒径分布
Figure BDA0002297061300000121
由表3可知，将怀菊花提取物经过脂质包裹后，显著促进了怀菊花提取物的透皮渗透量，通过对比实施例2-4可知，在没有表面活性剂修饰情况下，处于中等粒径134nm的实施例2制备的脂质体在皮肤层中贮存量较高，有利于怀菊花提取物在皮肤层中发挥生物功能。通过对比实施例5-12，在相似粒径不同表面活性剂修饰的脂质体中，与聚乙二醇酯相比，聚甘油酯修饰更有利于脂质体增加怀菊花在皮肤层贮存，尤其是聚甘油10-辛酸癸酸酯修饰的脂质体，在皮肤层中贮存量最高。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (2)

1.一种怀菊花提取物脂质体，其特征在于，由如下重量份数的原料组成：
怀菊花提取物 0.5～2份；
磷脂 4-8份；
缓冲液 80-95份；
表面活性剂；
所述磷脂为大豆卵磷脂；
所述缓冲液为pH=7.4的PBS缓冲液；
所述表面活性剂为聚乙二醇-8-辛酸癸酸酯、聚乙二醇-32-月桂酸酯、聚乙二醇-40-氢化蓖麻油、聚甘油-10-辛酸癸酸酯、聚甘油-10-月桂酸酯和聚甘油-10-油酸酯中的至少一种；
所述怀菊花提取物脂质体的制备 方法，步骤如下：
将怀菊花提取物、磷脂和表面活性剂混合，然后加入无水乙醇溶解，在溶解过程中，控制溶解的温度为55-65℃；
浓缩去除无水乙醇，加入缓冲液，高速剪切，在高速剪切过程中，将加入缓冲液之后的混合液以10000rpm或12000rpm的转速高速剪切1-3min，制得乳液，然后将乳液在600-1500bar压力下高压均质循环3-4次，制得粒径为100-200nm的怀菊花提取物脂质体；
所述怀菊花提取物的制备方法，包括如下步骤：挑选品质优良的新鲜怀菊花放入干燥箱，在60℃下干燥12h后，用粉碎机将其粉碎并过40目筛，然后用体积分数为75％的乙醇溶液超声浸提3次，料液比1:30(g/mL)，每次浸提时间为1h，抽滤，合并滤液，然后在40℃下减压浓缩去除溶剂，得怀菊花提取物。
2.根据权利要求1所述的怀菊花提取物脂质体，其特征在于，所述表面活性剂为聚甘油-10-辛酸癸酸酯。
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