KR102026783B1 - 피부 미백용 인삼잎 발효추출물 및 이의 제조방법 - Google Patents

피부 미백용 인삼잎 발효추출물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부 미백용 인삼잎 발효추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타내는 피부 미백용 인삼잎 발효추출물, 이의 제조방법, 이를 통한 인삼잎 발효추출분획물 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

피부 미백용 인삼잎 발효추출물 및 이의 제조방법{Fermented Extract of Ginseng Leaf for Skin Whitening and manufacturing method thereof}
본 발명은 피부 미백용 인삼잎 발효추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타내는 피부 미백용 인삼잎 발효추출물, 이의 제조방법, 이를 통한 인삼잎 발효추출분획물 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
최근 피부 미백에 대한 관심이 급증하고 있다. 피부 미백 화장품에 대한 선호도가 여름철에서 4계절로 확대됨에 따라, 피부를 보호하고 건강한 상태를 유지하기 위해서 크림류나 로션류, 오일류 등의 각종 미백 화장료가 사용되고 있다.
사람의 피부색은 멜라닌(melanin), 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되는데 이중 멜라닌이 가장 결정적인 요소로 작용한다. 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서 합성되고, 멜라노사이트에는 다양한 효소가 존재하며, 이들이 함께 작용하여 생체 내에 항상 존재하는 특정 아미노산을 기질로 중합화하는 산화반응을 통해 흑갈색의 색소인 멜라닌을 형성하게 된다. 이렇게 형성된 멜라닌은 멜라노사이트의 수지상 돌기를 통하여 케라티노사이트(keratinocyte)로 전이되어 피부색을 나타내게 되며, 표피의 각화 과정(keratinization)을 거치면서 각질과 함께 소실된다.
한편, 멜라닌은 핵 주변에 모자와 같은 구조를 형성하여 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 라디칼(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 등 중요한 역할을 하고 피부에서 자외선을 흡수하거나 산란시켜 피부 내부의 세포나 조직들이 자외선에 의해 손상되는 것을 막아주지만, 과도한 자외선에 대한 노출, 대기오염, 스트레스 등 외부의 환경변화에 의해 멜라닌이 비정상적으로 과잉생산되거나, 각화작용이 원활히 이루어지지 않아 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 색소 침착 현상이 일어나게 되어 피부의 흑화(黑化), 기미, 주근깨 등의 원인이 된다.
이에, 미백효능을 나타낼 수 있는 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타낼 수 있는 물질에 대한 연구가 시급한 실정이다.
KR 10-2009-0032501 A
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타내는 피부 미백용 인삼잎 발효추출물, 이의 제조방법, 이를 통한 인삼잎 발효추출분획물 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, (1) 인삼잎 추출농축물을 제조하는 단계; 및 (2) 상기 인삼잎 추출농축물을 락토바실루스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) ATCC8041로 발효시켜서 인삼잎 발효추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 인삼잎 발효추출물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (1) 단계는 (1)-1 인삼잎을 분쇄하는 단계; (1)-2 분쇄한 인삼잎을 혼합액 중 0.5 ~ 2g/㎖가 되도록 유기용매와 혼합하여 6 ~ 18 시간씩 2 ~ 5회 반복추출하는 단계; 및 (1)-3 추출한 인삼잎을 50℃이하에서 감압농축 및 동결건조하여 인삼잎 추출농축물을 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 유기용매는 농도 70 ~ 95% 메탄올일 수 있다.
또한, 상기 발효는 8 ~ 12일 동안, 온도 30 ~ 44℃ 및 pH 4.5 ~ 7.5의 조건으로 수행할 수 있다.
또한, 상기 (2) 단계는 (2)-1 인삼잎 추출농축물 100 중량부에 대하여 탄소원 0.5 ~ 5 중량부를 혼합하고 멸균하는 단계; (2)-2 멸균한 인삼잎 추출농축물에 상기 인삼잎 추출농축물 100 중량부에 대하여 300 ~ 700 중량부로 락토바실루스 펜토서스를 첨가 및 배양시켜서 발효물을 제조하는 단계; (2)-3 상기 발효물에서 락토바실루스 펜토서스를 제거하고 멸균하는 단계; (2)-4 멸균한 발효물을 환류추출 및 침전시키고, 여과하여 여과물을 제조하는 단계; 및 (2)-5 상기 여과물을 45℃이하에서 감압농축 및 동결건조하여 인삼잎 발효추출물을 제조하는 단계;를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 제조되는 피부 미백용 인삼잎 발효추출물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 인삼잎 발효추출물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rk2 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3를 포함할 수 있으며, 하기 관계식 1에 따른 진세노사이드 Rk1의 증가율이 15,000% 이상일 수 있고, 하기 관계식 2에 따른 진세노사이드 Rk2의 증가율이 50,000% 이상일 수 있으며, 하기 관계식 3에 따른 진세노사이드 Rh3의 증가율이 45,000% 이상일 수 있다.
[관계식 1]
Figure 112017109465142-pat00001
[관계식 2]
Figure 112017109465142-pat00002
[관계식 3]
Figure 112017109465142-pat00003
이때, 발효인삼잎 및 발효전 인삼잎은 6년생 인삼의 인삼잎임.
한편, 본 발명은 상술한 인삼잎 발효추출물을 유효성분으로 포함하며, 하기 조건 (a) 내지 (c)을 모두 만족하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
(a) 발효인삼잎 추출물의 농도가 35 ~ 65μM일 때 멜라닌 저해율이 8% 이상
(b) 발효인삼잎 추출물의 농도가 80 ~ 120μM일 때 멜라닌 저해율이 12% 이상
(c) 발효인삼잎 추출물의 농도가 180 ~ 220μM일 때 멜라닌 저해율이 21% 이상임.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 제조된 인삼잎 발효추출물을 분획하여 인삼잎 발효추출물의 분획물을 제조하는 단계; 및 상기 인삼잎 발효추출물의 분획물에서 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분을 분리하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 인삼잎 발효추출분획물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 인삼잎 발효추출물의 분획물은 에틸아세테이트 분획물일 수 있다.
또한, 상기 분리는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행할 수 있다.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 분리된 피부 미백용 인삼잎 발효추출분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 인삼잎 발효추출분획물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rk2 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하되, 상기 진세노사이드 Rk1은 농도 25 ~ 100μM로, 진세노사이드 Rk2는 농도 15 ~ 65μM로, 진세노사이드 Rh3는 농도 50 ~ 100μM로 포함될 수 있다.
본 발명의 피부 미백용 인삼잎 발효추출물, 이의 제조방법, 이를 통한 인삼잎 발효추출분획물 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물은 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과가 있다.
이하 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따른 피부 미백용 인삼잎 발효추출물의 제조방법은, (1) 인삼잎 추출농축물을 제조하는 단계; 및 (2) 상기 인삼잎 추출농축물을 락토바실루스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) ATCC8041로 발효시켜서 인삼잎 발효추출물을 제조하는 단계;를 포함한다.
먼저, 인삼잎 추출농축물을 제조하는 (1) 단계;에 대하여 설명한다.
상기 (1) 단계는, (1)-1 인삼잎을 분쇄하는 단계, (1)-2 분쇄한 인삼잎을 혼합액 중 0.5 ~ 2g/㎖가 되도록 유기용매와 혼합하여 6 ~ 18 시간씩 2 ~ 5회 반복추출하는 단계 및 (1)-3 추출한 인삼잎을 50℃이하에서 감압농축 및 동결건조하여 인삼잎 추출농축물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (1)-1 단계는 인삼잎을 분쇄하는 단계로써, 당업계에서 통상적으로 사용할 수 있는 분쇄 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 인삼잎을 수세 및 건조하고, 가로 및 세로 각각 2 ~ 6cm, 바람직하게는 3 ~ 5cm 크기로 세절한 후 분쇄할 수 있다.
또한, 상기 (1)-2 단계는 분쇄한 인삼잎 및 유기용매를 포함하는 혼합액을 반복추출하는 단계로써, 분쇄한 인삼잎을 혼합액 중 0.5 ~ 2g/㎖가 되도록, 바람직하게는 0.7 ~ 1.5g/㎖가 되도록 유기용매와 혼합하여 6 ~ 18 시간씩 2 ~ 5회, 바람직하게는 9 ~ 15 시간동안 2 ~ 4회 반복추출하여 수행할 수 있다. 만일 분쇄한 인삼잎이 혼합액 중 0.5g/㎖ 미만이면 후술하는 인삼잎 추출농축물의 수율이 좋지 않을 수 있다. 또한, 만일 상기 반복추출 의 조건을 만족하지 못하면 목적하는 수준으로 농축된 인삼잎 추출농축물을 제조할 수 없는 문제가 발생할 수 있다.
한편, 상기 유기용매는 통상적으로 추출용매로 사용될 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 발효에탄올 및 에틸아세테테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다. 상기 유기용매로 메탄올을 사용하는 경우 상기 유기용매는 농도 70 ~ 95% 메탄올일 수 있고, 바람직하게는 농도 75 ~ 90% 메탄올 일 수 있다. 만일 상기 메탄올의 농도가 상기 범위를 벗어나면 추출되는 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 고수득이 용이하지 않거나, 추출물 또는 분획물의 미백효능이 저하될 수 있다.
또한, 상기 (1)-3 단계의 감압농축의 조건은 통상적으로 사용할 수 있는 감압농축의 조건이라면 제한 없이 사용할 수 있고, 상기 (1)-3 단계의 동결건조 조건은 통상적으로 사용할 수 있는 동결건조의 조건이라면 제한 없이 사용할 수 있음에 따라, 본 발명에서는 이를 특별히 한정하지 않는다.
한편, 상기 (1)-2 단계와 후술하는 (1)-3 단계 사이에 추출한 인삼잎을 여과하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그리고, 상기 (1)-3 단계는 인삼잎 추출농축물을 제조하는 단계로써, (1)-2 단계에서 추출한 인삼잎을 50℃ 이하에서, 바람직하게는 45℃ 이하에서, 감압농축 및 동결건조하여 인삼잎 추출농축물을 제조할 수 있다. 만일 상기 감압농축의 온도가 50℃를 초과하면 목적하는 수준으로 농축된 인삼잎 추출농축물을 제조할 수 없는 문제가 발생할 수 있다.
다음으로, 상기 인삼잎 추출농축물을 락토바실루스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) ATCC8041로 발효시켜서 인삼잎 발효추출물을 제조하는 (2) 단계;에 대하여 설명한다.
상기 (2) 단계는, (2)-1 인삼잎 추출농축물에 탄소원을 혼합하고 멸균하는 단계, (2)-2 멸균한 인삼잎 추출농축물에 락토바실루스 펜토서스를 첨가 및 배양시켜서 발효물을 제조하는 단계, (2)-3 상기 발효물에서 락토바실루스 펜토서스를 제거하고 멸균하는 단계, (2)-4 멸균한 발효물을 환류추출 및 침전시키고, 여과하여 여과물을 제조하는 단계 및 (2)-5 상기 여과물을 45℃이하에서 감압농축 및 동결건조하여 인삼잎 발효추출물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (2)-1 단계는 인삼잎 추출농축물에 탄소원을 혼합하고 멸균하는 단계로써, 인삼잎 추출농축물 100 중량부에 대하여 탄소원 0.5 ~ 5 중량부를, 바람직하게는 탄소원 0.5 ~ 3 중량부를 혼합하고 멸균하여 수행할 수 있다. 만일 상기 인삼잎 추출농축물 100 중량부에 대하여 탄소원이 0.5 중량부 미만이면, 후술하는 락토바실루스 펜토서스의 배양이 용이하지 않음에 따라 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 고수득이 용이하지 않을 수 있고, 탄소원이 5 중량부를 초과하면 다당 및 올리고당 등이 전환이 되어, 목표로 하는 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3 함량이 저하될 수 있다.
또한, 상기 (2)-2 단계는 락토바실루스 펜토서스를 첨가 및 배양시켜서 발효물을 제조하는 단계로써, 상기 인삼잎 추출농축물 100 중량부에 대하여 300 ~ 700 중량부로, 바람직하게는 400 ~ 600 중량부로 락토바실루스 펜토서스를 첨가 및 배양시켜서 발효물을 제조할 수 있다. 만일 상기 인삼잎 추출농축물 100 중량부에 대하여 락토바실루스 펜토서스가 300 중량부 미만이면 인삼잎 추출농축물의 발효가 용이하지 않음에 따라 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 고수득이 용이하지 않을 수 있고, 700 중량부를 초과하면 후술하는 멸균단계를 통해 락토바실루스 펜토서스가 모두 제거되지 않고, 잔존하는 락토바실루스 펜토서스가 있을 수 있음에 따라 배양이 지속되는 문제가 발생할 수 있고, 목적하는 진세노사이드가 아닌 다른 진세노사이드가 전환되어 목표로 하는 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 성분함량이 저하될 수 있는 문제가 발생할 수 있다.
한편, 상기 배양은 8 ~ 12일 동안, 온도 30 ~ 44℃ 및 pH 4.5 ~ 7.5의 조건으로, 바람직하게는 9 ~ 11일 동안, 온도 32 ~ 42℃ 및 pH 5 ~ 7의 조건으로 수행할 수 있다. 만일 상기 배양 조건을 만족하지 못할 경우 인삼잎 추출농축물의 발효가 용이하지 않음에 따라 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 고수득이 용이하지 않을 수 있다.
또한, 상기 (2)-3 단계는 발효물에서 락토바실루스 펜토서스를 제거하고 멸균하는 단계로써, 상기 제거는 통상적으로 배양한 균을 제거할 수 있는 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 원심분리를 통해 배양한 균을 제거할 수 있다. 그리고, 상기 멸균은 통상적으로 배양한 균을 멸균할 수 있는 조건이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 100 ~ 140℃ 및 0.7 ~ 2.5 기압에서 10 ~ 50분 동안, 보다 바람직하게는 110 ~ 130℃ 및 1 ~ 2 기압에서 15 ~ 45분 동안 수행할 수 있다. 만일 상기 멸균 조건을 만족하지 못할 경우 멸균단계를 통해 락토바실루스 펜토서스가 모두 제거되지 않고, 잔존하는 락토바실루스 펜토서스가 있을 수 있음에 따라 배양이 지속되는 문제가 발생하거나, 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 수득과정에서 수율이 저하되는 문제가 있을 수 있다.
또한, 상기 (2)-4 단계는 멸균한 발효물을 환류추출 및 침전시키고, 여과하여 여과물을 제조하는 단계로써, 상기 환류추출은 통상적으로 환류추출을 수행할 수 있는 조건이라면 제한 없이 사용될 수 있음에 따라, 본 발명에서는 이를 별도로 한정하지 않는다. 일예로, 상기 환류추출은 6 ~ 18 시간씩 2 ~ 5회, 바람직하게는 9 ~ 15 시간동안 2 ~ 4회 반복추출하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 상기 환류추출을 수행하기 위하여 상기 멸균한 발효물을 유기용매와 혼합하여 환류추출을 수행할 수 있고, 상기 유기용매는 통상적으로 사용할 수 있는 유기용매라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 농도 70 ~ 85%의 메탄올을, 더욱 바람직하게는 75 ~ 85%의 메탄올을 사용할 수 있다. 또한, 상기 여과는 통상적인 여과방법을 통해 수행할 수 있음에 따라, 본 발명에서는 이를 별도로 한정하지 않는다.
그리고, 상기 (2)-5 단계는 상기 여과물을 감압농축 및 동결건조하여 인삼잎 발효추출물을 제조하는 단계로써, 상기 여과물을 45℃ 이하에서, 바람직하게는 40℃ 이하에서, 감압농축 및 동결건조하여 인삼잎 발효추출물을 제조할 수 있다. 만일 상기 감압농축의 온도가 45℃를 초과하면 목적하는 수준으로 농축된 인삼잎 발효추출물을 제조할 수 없는 문제가 발생할 수 있다.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 제조되는 피부 미백용 인삼잎 발효추출물을 제공한다.
상기 인삼잎 발효추출물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rk2 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3를 포함하며, 하기 관계식 1에 따른 진세노사이드 Rk1의 증가율이 15,000% 이상, 바람직하게는 16,000%이상일 수 있고, 하기 관계식 2에 따른 진세노사이드 Rk2의 증가율이 50,000% 이상, 바람직하게는 51,000% 이상일 수 있으며, 하기 관계식 3에 따른 진세노사이드 Rh3의 증가율이 45,000% 이상, 바람직하게는 46,000% 이상일 수 있다.
[관계식 1]
Figure 112017109465142-pat00004
[관계식 2]
Figure 112017109465142-pat00005
[관계식 3]
Figure 112017109465142-pat00006
이때, 발효인삼잎 및 발효전 인삼잎은 6년생 인삼의 인삼잎임.
또한, 본 발명은 상술한 인삼잎 발효추출물을 유효성분으로 포함하여, 하기 조건 (a) 내지 (c)을 모두 만족하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
조건 (a)로써, 발효인삼잎 추출물의 농도가 35 ~ 65μM일 때 멜라닌 저해율이 8% 이상, 바람직하게는 9% 이상일 수 있고, 조건 (b)로써, 발효인삼잎 추출물의 농도가 80 ~ 120μM일 때 멜라닌 저해율이 12% 이상, 바람직하게는 13% 이상일 수 있으며, 조건 (c)로써, 발효인삼잎 추출물의 농도가 180 ~ 220μM일 때 멜라닌 저해율이 21% 이상, 바람직하게는 23% 이상일 수 있다. 상기 범위를 만족함에 따라 소량으로도 높은 멜라닌 저해율을 나타냄과 동시에 세포독성이 없는 효과를 나타낼 수 있다.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 제조된 인삼잎 발효추출물을 분획하여 인삼잎 발효추출물의 분획물을 제조하는 단계; 및 상기 인삼잎 발효추출물의 분획물에서 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분을 분리하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 인삼잎 발효추출분획물 제조방법을 제공한다.
먼저 상술한 제조방법으로 제조된 인삼잎 발효추출물을 분획하여 인삼잎 발효추출물의 분획물을 제조하는 단계를 설명한다.
상기 분획은 인삼잎 발효추출물을 에틸아세테이트(EtOAc)/물(H2O)을 이용하여 분배 추출한 다음, 물 층을 수득하여 부탄올(n-BuOH)로 2 ~ 4회 분배 추출하고, 상기 에틸아세테이트층, 물층 및 부탄올층을 각각 감압농축하여 n-부탄올 분획, H20분획 및 에틸아세테이트 분획을 수득할 수 있다.
한편, 상기 분획을 수행함에 따라, n-부탄올 분획, H20분획 및 에틸아세테이트 분획을 얻을 수 있으며, 후술하는 분리 단계를 수행함에 따라 목적하는 수준으로 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3를 고수득 하기 위하여, 상기 분획을 통해 얻어진 n-부탄올 분획, H20분획 및 에틸아세테이트 분획 중 에틸아세테이트 분획을 분획물로 사용할 수 있다.
다음, 상기 인삼잎 발효추출물의 분획물에서 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분을 분리하는 단계를 설명한다.
상기 분리는 통상적인 분리방법이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행할 수 있고, 보다 바람직하게는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 일련의 공정으로 수행할 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 상기 분리하는 단계 뒤에 분리한 분리물을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 상술한 제조방법으로 분리된 피부 미백용 인삼잎 발효추출분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 인삼잎 발효추출분획물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rk2 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하되, 상기 진세노사이드 Rk1은 농도 25 ~ 100μM로, 바람직하게는 농도 30 ~ 90μM로, 진세노사이드 Rk2는 농도 15 ~ 65μM로, 바람직하게는 농도 15 ~ 55μM로, 진세노사이드 Rh3는 농도 50 ~ 100μM로, 바람직하게는 농도 60 ~ 90μM로 포함될 수 있다. 상기 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rk2 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3이 상기 농도 범위를 만족하도록 유효성분으로 포함됨에 따라, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 피부 미백용 인삼잎 발효추출물, 이의 제조방법, 이를 통한 인삼잎 발효추출분획물 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물은 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 고수득이 가능하고, 세포독성이 없는 동시에 미백효능이 월등히 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 인삼잎 발효 추출물의 제조
(1) 인삼잎 추출농축물의 제조
6년생 인삼의 인삼잎을 수확하여 수세 및 건조하고, 가로 및 세로 각각 4cm 크기로 세절한 후 분쇄하였다. 그리고, 분쇄한 인삼잎을 혼합액 중 1g/ ㎖가 되도록 농도 80%의 메탄올과 혼합하여 12 시간씩 3회 반복추출한 후 여과지로 여과하였다. 그 후, 추출한 인삼잎을 온도 45℃에서 45 psi의 압력으로 1.5 시간 동안 감압농축을 수행하고, 온도 -80℃에서 24시간동안 동결건조하여 인삼잎 추출농축물을 제조하였다.
(2) 인삼잎 발효추출물의 제조
제조한 인삼잎 추출농축물 100 중량부에 대하여 탄소원 1.5 중량부를 혼합하고, 온도 120℃에서 1 시간 동안 멸균을 수행한 후, 상기 인삼잎 추출농축물 100 중량부에 대하여 락토바실루스 펜토서스(Lactobacillus pentosus, ATCC8041)를 500 중량부로 첨가하고, 10일 동안 37℃ 및 pH 6의 조건으로 배양시켜서 발효물을 제조하였다. 그리고, 제조한 발효물을 원심분리하여 배양균을 제거한 후 온도 120℃ 및 1.5 기압에서 30분 동안 멸균한 후, 멸균한 발효물을 혼합액 중 100g/ 1000㎖가 되도록 농도 80% 메탄올과 혼합하여 12시간씩 3회 환류추출하고 침전시키고 여과지로 여과하여 여과물을 제조하였다. 제조한 여과물을 온도 40℃에서 45 psi의 압력으로 1.5 시간 동안 감압농축을 수행하고, 온도 -80℃에서 24 시간동안 동결건조하여 인삼잎 발효추출물을 제조하였다.
실시예 2 ~ 11 및 비교예 1 ~ 3
실시예 1과 동일하게 실시하되, 분쇄한 잎삼잎과 혼합하는 유기용매의 농도, 배양균주의 종류와 함량, 탄소원의 함량 및 발효 유무 등을 달리하여 표 1 및 표 2와 같이 인삼잎 발효추출물을 제조하였다.
<실험예 1>
상기 실시예 1 ~ 11 및 비교예 1 ~ 3에 대해 하기 항목에 대하여 측정/평가하여 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
1. 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 피크면적 측정
상기 실시예 1 ~ 11 및 비교예 1 ~ 3에 따라 제조한 인삼잎 발효추출물에 대하여, 고분해능 액체그래마토그래피/질량분석기(UPLC-QTOF/MS, 워터스)를 통해 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 피크면적값을 측정하였다.
2. 멜라닌 저해효능 평가
상기 실시예 1 ~ 11 및 비교예 1 ~ 3에 따라 제조한 인삼잎 발효추출물에 대하여, 멜라닌 저해효능을 평가하였다.
구체적으로, 먼저 Dorothy C Bennett(St George’s Hospital Medical School, London, UK) 교수로부터 분양 받은 C57BL/6J mice 유래 Melan-a 세포를 배양하여 사용하였고, 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum), 100 mg/mL의 스트렙토마이신-페니실린(streptomycin-penicillin) 및 200 nM의 TPA(12-ο-tetradecanoylphorbol-13-acetate)가 포함된 RPMI-1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 세포주를 배양하여 사용하였다.
그 후, Melan-a 세포 1×105개를 24-웰 플레이트(24-well plate)의 각 웰(well)에 분주하여 하룻밤 배양하고, 각 샘플을 200μM 농도로 배지에 처리하여 4일 동안 배양한 후, 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline)로 세척하고 0.85N KOH를 250L 씩 각각의 웰(well)에 처리하여 용해시켰다. 그리고, 용해된 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)로 옮겨 마이크로플레이트리더(3550, Bio-Rad)를 사용하여 광학밀도(optical density)를 405 nm에서 측정하고 멜라닌 생성 억제율은 대조군(비처리군)과 대비한 비율(%)로 계산하였다.
구분 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6 실시예7
분쇄한 잎삼잎과 혼합하는 유기용매의 종류/농도(%) 80 60 75 90 97 80 80
배양균주 종류/
함량(중량부)		 락토바실루스 펜토서스/500 락토바실루스 펜토서스/500 락토바실루스 펜토서스/500 락토바실루스 펜토서스/500 락토바실루스 펜토서스/500 락토바실루스 펜토서스/200 락토바실루스 펜토서스/400
탄소원 함량(중량부) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Rk1의 피크면적 713,667 495,372 681,401 672,139 488,130 391,506 690,166
Rk2의 피크면적 125,950 103,445 121,195 122,988 106,552 84,078 124,149
Rk3의 피크면적 148,669 124,856 141,259 140,884 122,540 91,210 142,982
멜라닌 저해율(%) 30 19 29 28 19 19 29
구분 실시예8 실시예9 실시예
10		 실시예
11		 비교예
11) 		비교예2 비교예3
분쇄한 잎삼잎과 혼합하는 유기용매의 종류/농도(%) 80 80 80 80 80 80 80
배양균주 종류/함량(중량부) 락토바실루스 펜토서스/600 락토바실루스 펜토서스/800 락토바실루스 펜토서스/500 락토바실루스 펜토서스/500 - 락토바실루스 람노서스/500 락토바실루스 플라타룸/500
탄소원 함량(중량부) 1.5 1.5 0.1 1 - 1.5 1.5
Rk1의 피크면적 686,548 388,072　 446,186 692,198 3841 223,110 322,121
Rk2의 피크면적 128,565 79,603 98,052 121,937 234.6 20,242 45,457
Rk3의 피크면적 141,326 83,253 112,793 143,360 305.3 35,362 25,450
멜라닌 저해율(%) 28 19 20 29 13 8 12
1) 상기 비교예 1은 발효하지 않은 인삼잎 추출물을 나타낸다.
상기 표 1 및 표 2에서 알 수 있듯이,
본 발명에 따른 분쇄한 잎삼잎과 혼합하는 유기용매의 농도, 배양균주의 종류와 함량, 탄소원의 함량 및 발효 유무 등을 모두 만족하는 실시예 1, 3, 4, 7, 8 및 11이, 이 중에서 하나라도 누락된 실시예 2, 5, 6, 9, 10 및 비교예 1 ~ 3에 비하여 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 피크면적이 우수한 동시에 멜라닌 저해율이 우수하였다.
제조예 1: 피부 미백용 화장료 조성물의 제조
상기 실시예 1에 따라 제조된 인삼잎 발효추출물을 하기와 같은 함량으로 혼합하여 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하였다.
인삼잎 발효추출물 100mg/10㎖
모노스테아린산글리세린 4㎖
세테아릴알콜 4.5㎖
스테아린산 3㎖
밀납 1.5㎖
글리세린 3㎖
스쿠알란 8㎖
베타인 6㎖
소듐히아루로네이트 0.5㎖
경화식물유 2㎖
폴리솔베이트60 3㎖
증류수 100㎖가 되도록 혼합함.
제조예 2 ~ 11 비교제조예 1 ~ 3
상기 제조예 1과 동일하게 실시하여 제조하되, 실시예 1에 따라 제조된 인삼잎 발효추출물을, 각각 실시예 2 ~ 11 및 비교예 1 ~ 3에 따라 제조된 인삼잎 발효추출물로 변경하여 표 3 및 표 4와 같이 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하였다.
<실험예 2>
상기 제조예 1 ~ 11 및 비교제조예 1 ~ 3에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 하기 항목에 대하여 측정/평가하여 하기 표 3 내지 5에 나타내었다.
1. 농도별 멜라닌 저해율 측정
상기 제조예 1 ~ 11 및 비교제조예 1 ~ 3에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 인삼잎 발효추출물의 농도 50μM, 100μM 및 200μM 에서 멜라닌 저해율을 측정하였다.
구체적으로, 먼저 Dorothy C Bennett(St George’s Hospital Medical School, London, UK) 교수로부터 분양 받은 C57BL/6J mice 유래 Melan-a 세포를 배양하여 사용하였고, 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum), 100 mg/mL의 스트렙토마이신-페니실린(streptomycin-penicillin) 및 200 nM의 TPA(12-ο-tetradecanoylphorbol-13-acetate)가 포함된 RPMI-1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 세포주를 배양하여 사용하였다.
그 후, Melan-a 세포 1×105개를 24-웰 플레이트(24-well plate)의 각 웰(well)에 분주하여 하룻밤 배양하고, 각 샘플을 각각 인삼잎 발효추출물의 농도가 50μM, 100μM 및 200μM이 되도록 배지에 처리하여 4일 동안 배양한 후, 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline)로 세척하고 0.85N KOH를 250L 씩 각각의 웰(well)에 처리하여 용해시켰다. 그리고, 용해된 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)로 옮겨 마이크로플레이트리더(3550, Bio-Rad)를 사용하여 광학밀도(optical density)를 405 nm에서 측정하고 멜라닌 생성 억제율은 대조군(비처리군)과 대비한 비율(%)로 계산하였다.
2. 세포독성 평가
상기 제조예 1 ~ 11 및 비교제조예 1 ~ 3에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 인삼잎 발효추출물이 농도 200 μM일 때, 세포독성을 평가하였다.
구체적으로, 상기 농도별 멜라닌 저해율 측정방법과 동일하게 실시하여 수행하되, 하기 수학식에 따라 대조군(비처리군)과의 세포생존의 비율로써 측정하였으며, 세포생존 비율이 95% 이상인 경우 세포독성이 없는 것으로 평가하였다.
[수학식]
세포 생존률(%) =[(화합물 처리 세포수 OD 값- blank 웰 OD 값)/(대조군 OD 값 - blank 웰 OD 값)] × 100(%)
구분 제조예1 제조예2 제조예3 제조예4 제조예5
인삼잎 발효추출물 종류 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5
인삼잎 발효추출물 농도에 따른 멜라닌 저해율(%) 50μM 12 7 11 10 7
100μM 16 11 14 14 10
200μM 30 19 29 28 19
세포독성 없음 없음 없음 없음 없음
구분 제조예6 제조예7 제조예8 제조예9 제조예10
인삼잎 발효추출물 종류 실시예6 실시예7 실시예8 실시예9 실시예10
인삼잎 발효추출물 농도에 따른 멜라닌 저해율(%) 50μM 6 11 10　 6 7
100μM 9 15 15 9 9
200μM 19 28 27 18 20
세포독성 없음 없음 없음 없음 없음
구분 제조예11 비교제조예1 비교제조예2 비교제조예3
인삼잎 발효추출물 종류 실시예11 비교예1 비교예2 비교예3
인삼잎 발효추출물 농도에 따른 멜라닌 저해율(%) 50μM 11 0 0 0
100μM 15 2 2 4
200μM 29 13 8 12
세포독성 없음 없음 없음 없음
상기 표 3 내지 표 5에서 알 수 있듯이,
본 발명에 따른 분쇄한 잎삼잎과 혼합하는 유기용매의 농도, 배양균주의 종류와 함량, 탄소원의 함량 및 발효 유무 등을 모두 만족하는 실시예 1, 3, 4, 7, 8 및 11에 따른 인삼잎 발효추출물을 포함하여 제조한 제조예 1, 3, 4, 7, 8 및 11이, 이 중에서 하나라도 누락된 실시예 2, 5, 6, 9, 10 및 비교예 1 ~ 3에 따른 인삼잎 발효추출물을 포함하여 제조한 제조예 2, 5, 6, 9, 10 및 비교제조예 1 ~ 3에 비하여 농도별 멜라닌 저해율이 월등히 우수한 동시에 세포독성이 없었다.
실시예 12: 인삼잎 발효추출분획물의 제조
상기 실시예 1에 따라 제조한 인삼잎 발효추출물을 에틸아세테이트(EtOAc)/물(H2O)을 이용하여 분배 추출한 다음, 물 층을 수득하여 부탄올(n-BuOH)로 3회 분배 추출하고, 상기 에틸아세테이트층, 물층 및 부탄올층을 각각 감압농축하여 n-부탄올 분획, H20분획 및 에틸아세테이트 분획을 얻었으며, 이 중에서 인삼잎 발효추출물의 분획물로 에틸아세테이트 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를순차적으로 수행함에 따라 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분을 분리하여 인삼잎 발효추출분획물을 제조하였다.
<실험예 3>
상기 제조예 및 비교제조예에 대해 하기의 사항을 측정 및/또는 평가하여 하기 표 6에 나타내었다.
1. 인삼잎 발효추출분획물의 Rk1, Rk2 및 Rh3 수득 평가
상기 실시예 12에 따라 제조한 인삼잎 발효추출분획물에 대하여 피크면적을 통해 인삼잎 발효추출분획물의 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 수득을 평가하였으며, 실시예 1를 기준으로 실시예 12의 n-부탄올 분획, H20분획 및 에틸아세테이트 분획의 상대적인 비율을 나타내었다.
구분 실시예1 실시예12
에틸
아세테이트		 부탄올 물
화합물 수득평가(%) 진세노사이드 Rk1 100 525 20 15
진세노사이드 Rk2 100 681 11 5
진세노사이드 Rk3 100 720 33 10
상기 표 6에서 알 수 있듯이,
본 발명에 따른 인삼잎 발효추출물의 분획물 종류인 에틸아세테이트 분획을 포함하는 실시예 12가, 실시예 1에 비하여 월등히 많은 양의 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3가 수득되었음을 알 수 있고, n-부탄올 분획 및 H2O분획에 비하여도 월등히 많은 양의 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3가 수득되었음을 알 수 있다.
이에 따라, 분획을 수행함으로써 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3의 수득량을 증가시킬 수 있다는 것을 알 수 있고, 부탄올 분획 및 물 분획에 비하여 에틸 아세테이트 분획이 월등이 많은 양의 진세노사이드 Rk1, Rk2 및 Rh3을 수득할 수 있음을 알 수 있다.
제조예 12
상기 실시예 12에 따라 제조한 인삼잎 발효추출분획물에서 수득된 진세노사이드 Rk1을 농도 80μM로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하였다.
제조예 13 ~ 제조예 24
상기 제조예 12와 동일하게 실시하여 제조하되, 진세노사이드 Rk1의 농도, 진세노사이드 유도체의 종류 및 농도를 하기 표 7과 같이 변경하여 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하였다.
<실험예 4>
상기 제조예 13 ~ 24에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 하기 항목에 대하여 측정/평가하여 하기 표 7에 나타내었다.
1. 멜라닌 저해율 측정
상기 제조예 13 ~ 24에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 Rk1의 농도 20μM, 40μM, 80μM 및 120μM에서, Rk2의 농도 10μM, 20μM, 40μM 및 70μM에서, Rh3의 농도 40μM, 60μM, 80μM 및 110μM에서 멜라닌 저해율 측정을 측정하였다.
구체적으로, 먼저 Dorothy C Bennett(St George’s Hospital Medical School, London, UK) 교수로부터 분양 받은 C57BL/6J mice 유래 Melan-a 세포를 배양하여 사용하였고, 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum), 100 mg/mL의 스트렙토마이신-페니실린(streptomycin-penicillin) 및 200 nM의 TPA(12-ο-tetradecanoylphorbol-13-acetate)가 포함된 RPMI-1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 세포주를 배양하여 사용하였다.
그 후, Melan-a 세포 1×105개를 24-웰 플레이트(24-well plate)의 각 웰(well)에 분주하여 하룻밤 배양하고, 각 샘플을 각각 Rk1의 농도 20μM, 40μM, 80μM 및 120μM에서, Rk2의 농도 10μM, 20μM, 40μM 및 70μM에서, Rh3의 농도 40μM, 60μM, 80μM 및 110μM이 되도록 배지에 처리하여 4일 동안 배양한 후, 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline)로 세척하고 0.85N KOH를 250L 씩 각각의 웰(well)에 처리하여 용해시켰다. 그리고, 용해된 세포를 96-웰 플레이트(96-well plate)로 옮겨 마이크로플레이트리더(3550, Bio-Rad)를 사용하여 광학밀도(optical density)를 405 nm에서 측정하고 멜라닌 생성 억제율은 대조군(비처리군)과 대비한 비율(%)로 계산하였다.
2. 세포독성 평가
상기 제조예 13 ~ 24에 따라 제조된 피부 미백용 화장료 조성물에 대해 각각 Rk1의 농도 20μM, 40μM, 80μM 및 120μM일 때, Rk2의 농도 10μM, 20μM, 40μM 및 70μM일 때, Rh3의 농도 40μM, 60μM, 80μM 및 110μM일 때, 세포독성을 평가하였다.
구체적으로, 상기 농도별 멜라닌 저해율 측정방법과 동일하게 실시하여 수행하되, 하기 수학식에 따라 대조군(비처리군)과의 세포생존의 비율로써 측정하였으며, 세포생존 비율이 95% 이상인 경우 세포독성이 없는 것으로 평가하였다.
[수학식]
세포 생존률(%) =[(화합물 처리 세포수 OD 값- blank 웰 OD 값)/(대조군 OD 값 - blank 웰 OD 값)] × 100(%)
구분 진세노사이드 유도체 종류 농도(μM) 멜라닌 저해율(%) 세포독성
제조예13 Rk1 80 38 ×
제조예14 Rk1 20 9 ×
제조예15 Rk1 40 23 ×
제조예16 Rk1 120 41 ○(83%)
제조예17 Rk2 10 3 ×
제조예18 Rk2 20 16 ×
제조예19 Rk2 40 40 ×
제조예20 Rk2 70 44 ○(87%)
제조예21 Rh3 40 8 ×
제조예22 Rh3 60 25 ×
제조예23 Rh3 80 34 ×
제조예24 Rh3 110 38 ○(86%)
상기 표 7에서 알 수 있듯이,
본 발명에 따른 진세노사이드 유도체의 농도 범위를 만족하는 제조예 13, 15, 18, 19, 22 및 23은, 이를 만족하지 못하는 제조예 14, 16, 17, 20, 21 및 24에 비하여 멜라닌 저해율이 우수한 동시에 세포독성이 없는 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 일 실시 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. (1)-1 인삼잎을 분쇄하는 단계;
    (1)-2 분쇄한 인삼잎을 혼합액 중 0.5 ~ 2g/㎖가 되도록 농도 70 ~ 95% 메탄올인 유기용매와 혼합하여 6 ~ 18 시간씩 2 ~ 5회 반복추출하는 단계;
    (1)-3 추출한 인삼잎을 50℃이하에서 감압농축 및 동결건조하여 인삼잎 추출농축물을 제조하는 단계;
    (2)-1 인삼잎 추출농축물 100 중량부에 대하여 탄소원 0.5 ~ 5 중량부를 혼합하고 멸균하는 단계;
    (2)-2 멸균한 인삼잎 추출농축물에 상기 인삼잎 추출농축물 100 중량부에 대하여 300 ~ 700 중량부로 락토바실루스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) ATCC8041를 첨가 및 배양시켜서 발효물을 제조하는 단계;
    (2)-3 상기 발효물에서 락토바실루스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) ATCC8041를 제거하고 멸균하는 단계;
    (2)-4 멸균한 발효물을 환류추출 및 침전시키고, 여과하여 여과물을 제조하는 단계; 및
    (2)-5 상기 여과물을 45℃이하에서 감압농축 및 동결건조하여 인삼잎 발효추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 인삼잎 발효추출물 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 발효는 8 ~ 12일 동안, 온도 30 ~ 44℃ 및 pH 4.5 ~ 7.5의 조건으로 수행하는 피부 미백용 인삼잎 발효추출물 제조방법.
  5. 삭제
  6. 제1항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조되는 피부 미백용 인삼잎 발효추출물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 인삼잎 발효추출물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rk2 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3를 포함하며,
    하기 관계식 1에 따른 진세노사이드 Rk1의 증가율이 15,000% 이상이고,
    하기 관계식 2에 따른 진세노사이드 Rk2의 증가율이 50,000% 이상이며,
    하기 관계식 3에 따른 진세노사이드 Rh3의 증가율이 45,000% 이상인 피부 미백용 인삼잎 발효추출물:
    [관계식 1]
    Figure 112017109465142-pat00007

    [관계식 2]
    Figure 112017109465142-pat00008

    [관계식 3]
    Figure 112017109465142-pat00009

    이때, 발효인삼잎 및 발효전 인삼잎은 6년생 인삼의 인삼잎임.
  8. 제6항에 따른 인삼잎 발효추출물을 유효성분으로 포함하며,
    하기 조건 (a) 내지 (c)을 모두 만족하는 피부 미백용 화장료 조성물:
    (a) 발효인삼잎 추출물의 농도가 35 ~ 65μM일 때 멜라닌 저해율이 8% 이상
    (b) 발효인삼잎 추출물의 농도가 80 ~ 120μM일 때 멜라닌 저해율이 12% 이상
    (c) 발효인삼잎 추출물의 농도가 180 ~ 220μM일 때 멜라닌 저해율이 21% 이상임.
  9. 제1항 및 제4항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 인삼잎 발효추출물을 분획하여 인삼잎 발효추출물의 분획물을 제조하는 단계; 및
    상기 인삼잎 발효추출물의 분획물에서 피부 미백용 화장료 조성물의 유효성분을 분리하는 단계;를 포함하는 피부 미백용 인삼잎 발효추출분획물 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 인삼잎 발효추출물의 분획물은 에틸아세테이트 분획물인 피부 미백용 인삼잎 발효추출분획물 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 분리는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행하는 피부 미백용 인삼잎 발효추출분획물 제조방법.
  12. 제9항에 따른 제조방법으로 분리된 피부 미백용 인삼잎 발효추출분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 인삼잎 발효추출분획물은 진세노사이드(Ginsenoside) Rk1, 진세노사이드(Ginsenoside) Rk2 및 진세노사이드(Ginsenoside) Rh3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하되,
    상기 진세노사이드 Rk1은 농도 25 ~ 100μM로, 진세노사이드 Rk2는 농도 15 ~ 65μM로, 진세노사이드 Rh3는 농도 50 ~ 100μM로 포함되는 피부 미백용 화장료 조성물.
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