TW201936171A

TW201936171A - 指甲花(lawsonia inermis)之地上部分的萃取物及其製備方法

Info

Publication number: TW201936171A
Application number: TW107144581A
Authority: TW
Inventors: 克里斯托弗羅瑞尼浦亞巴瑞; 飛利浦茱莉亞; 勞倫特薩柏拉
Original assignee: 法商皮爾法伯皮膚化妝品公司
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2019-09-16
Also published as: WO2019115651A1; JP7458978B2; MA51182A; JP2021505643A; TWI805660B; FR3074690A1; US11207265B2; FR3074690B1; US20200330365A1; KR20200097250A; CN111447918A; EP3723723A1; AR113927A1

Abstract

本發明有關指甲花之地上部分的萃取物，以及其製備方法和可藉由該方法獲得的萃取物。本發明亦有關包含此一萃取物的美妝染料組成物。本發明最終涉及用於染色角蛋白纖維的美妝方法，包含此一組成物的施用。

Description

指甲花(LAWSONIA　INERMIS)之地上部分的萃取物及其製備方法

發明領域
本發明有關指甲花之地上部分的萃取物，以及其製備方法和可藉由該方法獲得的萃取物。本發明亦有關包含此一萃取物的美妝染料組成物。本發明最終涉及用於染色角蛋白纖維的美妝方法，包含此一組成物的施用。

發明背景
指甲花(LAWSONIA INERMIS) ，通常稱為海娜(henna)，屬於千屈菜科。這種灌木可以達到6公尺的高度，尤其是在非洲和亞洲的熱帶和亞熱帶地區自然地生長。其具有一灰色的樹皮，密集的分枝，且在最老的分枝上四角形和多刺的枝條。其葉對生，為單葉且全緣。帶香味的白色或紅色花朵係聚集成25 cm長的大金字塔形圓錐花序。

產生紅色和橙色色調的海娜葉子已經使用超過5000年了，用於染色毛髮和皮膚或甚至紡織品染色。

其之染料性質係歸因於指甲花醌(lawsone, 2-羥基-1,4-萘醌)，該者藉由一麥可加成(Michael addition)與存在於皮膚或指甲中的角蛋白反應。

指甲花醌

一般地，指甲花醌能夠與含有胺基的各種化合物(諸如蛋白質、胜肽或胺基酸)進行這種類型的縮合作用。這就是為什麼商業上可獲得的海娜萃取物具有相對低的指甲花醌含量，該者亦隨著時間推移迅速地減少。

再者，在指甲花葉中發現的游離狀態中的指甲花份量實際上非常小。事實上，它主要以雜糖苷的形式存在[Gallo等人之”Rev. Bras. Pharmacogn. 2014, 23, 133–140； COLIPA no. C169, 2013”]。

海娜賽(Hennoside) A、B和C尤其係為已被鑑定的單醣基化指甲花醌衍生物。

這些前驅物的水解，繼之該所得糖苷配基(aglycone)的自動氧化，導致根據下文指示之該反應方案的指甲花醌形成。

R₁ = 葡萄糖，R₂ = R₃ = H；
R₂ = 葡萄糖；R₁ = R₃ = H；或
R₃ = 葡萄糖；R₁ = R₂ = H。

因此，許多用於指甲花的已知萃取方法包括在酸性介質中的一步驟，典型地於含括在1與3之間之一pH，在該者期間，海娜賽係水解。

一萃取方法係尤其於文獻FR2473310中描述。

本發明之發明人已經能夠開發一種用於指甲花的萃取方法，其允許藉由施行該糖基化指甲花醌衍生物的酵素水解以獲得具高指甲花醌含量的一萃取物。該萃取物亦為卓越的，在於其隨時間推移的安定性。

本發明部分係意欲建立更綠色並且允許聲稱由此獲得的活性成分為天然的合成途徑。

所以，與化石資源相反，本發明中使用的溶劑較佳地將為天然溶劑及/或來自可再生資源的天然來源，這些溶劑有利地可藉由尊重環境的方法獲得。所以，根據本發明之該方法從而獲得的萃取物將為天然萃取物及/或來自可再生資源的天然來源，相反於化石資源。

發明概要
因此，本發明係有關指甲花之地上部分的萃取物，其相對於該乾燥萃取物的總重量含有介於10與60%重量份的指甲花醌，其特徵在於該指甲花醌由糖基化指甲花醌衍生物，諸如海娜賽，酵素水解產生，且其特徵在於該指甲花醌含量係隨時間推移而安定。

較佳實施例之詳細說明
「地上部分」意謂位於地面上的植物部分，舉例而言葉子、葉柄、花、種子和枝條，特別是葉子、枝條和葉柄，或其混合物，較佳地葉、枝條或其混合物。

有利地，根據本發明之該萃取物係為指甲花之葉及/或枝條的萃取物。

在本發明之含義內，「乾燥萃取物」意欲意指沒有萃取溶劑或介質的萃取物，或僅含有微量萃取溶劑或介質的萃取物。因此，這種乾燥萃取物僅含有來自指甲花的物質。

「糖基化指甲花醌衍生物」，亦稱為指甲花醌糖苷(lawsone glycoside)或雜糖苷，在本發明之架構內意謂下方通式(I)的任何化合物：

(I)
其中R₁ 、R₂ 與R₃ 彼此獨立地代表H或糖，諸如葡萄糖，R₁ 至R₃ 中至少一者不同於H，
其中糖苷鍵的水解導致糖苷配基的形成，其進行自動氧化反應以形成指甲花醌。

特別的，海娜賽A、B和C係為糖基化的指甲花醌衍生物。

在本發明之上下文中，「酵素水解」係為由一酵素催化的水解反應，該酵素可以為一內源性指甲花酵素或來自一外部來源，較佳地一內源性指甲花酵素，應為理解的是，該酵素係為一葡萄糖苷酶，諸如β-葡萄糖苷酶[Gallo等人]，其作用導致該糖基化指甲花醌衍生物的葡萄糖苷鍵斷裂。

在本發明之範圍內，根據本發明之一萃取物的指甲花醌含量係視為「隨時間推移安定的」，假若最初存在該萃取物中的指甲花醌的份量於室溫(15℃-25℃)、相對濕度(RH)60%且避光下，1個月內減少不超過20%，尤其是不超過15%，有利地不超過10%。室溫值係為歐洲藥典中定義的值。

在一特別實施例中，根據本發明之一萃取物的指甲花醌含量在先前列舉的條件下在3個月內減少不超過20%。

特別地，根據本發明之一萃取物的指甲花醌含量在先前列舉的條件下，在3個月內減少不超過10%。

有利地，根據本發明之一萃取物的指甲花醌含量在先前列舉的條件下，在6個月內減少不超過20%。

特別地，根據本發明之一萃取物的指甲花醌含量在先前列舉的條件下，在6個月內減少不超過10%。

較佳地，根據本發明之一萃取物的指甲花醌含量在先前列舉的條件下，於室溫在12個月內減少不超過20%。

特別地，根據本發明之一萃取物的指甲花醌含量在先前列舉的條件下，於室溫在12個月內減少不超過10%。

根據本發明之一萃取物的安定性亦可能在所謂的加速安定性條件下評價。這些條件係為40℃(±2)的溫度和75%(±5)的RH。根據本發明之一萃取物的指甲花醌含量在加速安定性條件下係評價為「隨時間推移而安定」，假若最初存在於該萃取物中的指甲花醌份量在1個月內減少不超過20%，尤其是不超過15%，有利地不超過10%。

有利地，根據本發明之一萃取物的指甲花醌含量在先前列舉的加速安定性條件下，在3個月內減少不超過20%。

特別地，根據本發明之一萃取物的指甲花醌含量在先前列舉的加速安定性條件下，在6個月內減少不超過10%。

在一特別實施例中，根據本發明之該萃取物含有介於10%與50%之間，特別是介於15%與40%之間重量份的指甲花醌，相對於該乾燥萃取物的總重量。

有利地，相對於該乾燥萃取物的總重量，根據本發明之該萃取物含有至少15%，較佳地至少20%，更有利地至少25%重量份的指甲花醌；百分比係相對於該乾燥萃取物的總重量(在添加任何乾燥載體之前)表示。

指甲花醌含量尤其可以根據在實例後面描述的HPLC測定方法(方法1)確定。

在一實施例中，相對於該乾燥萃取物的總重量，根據本發明之一萃取物含有不超過2%，較佳地不超過1%重量份的蛋白質、胜肽或胺基酸。

游離胺基酸、胜肽和蛋白質尤其可以藉由茚三酮(ninhydrin)分光光度法，根據在實例後面描述的方法(方法2)測定。

在一實施例中，根據本發明之一萃取物亦包含葉綠素，尤其是葉綠素a和/或葉綠素b，相對於該乾燥萃取物之總重量，總葉綠素含量係小於25 %重量份，尤其是小於20%重量份，有利地相對於該乾燥萃取物小於10%重量份。

在一特別實施例中，相對於該乾燥萃取物之總重量，根據本發明之該萃取物含有不超過5%，較佳地不超過2%重量份的葉綠素。有利地，根據本發明之該萃取物不含有葉綠素。

葉綠素尤其可以藉由重量測定，根據實例後面描述的方法(方法3)測定。

根據本發明之一萃取物亦可能含有任何天然存在於指甲花地上部分的化合物，尤其是指甲花的葉子和/或枝條。

特別地，根據本發明之一萃取物亦含有酚類化合物，諸如沒食子酸；固醇，諸如β-植物固醇；和/或三萜類，諸如羽扇豆醇(lupeol)。

在一實施例中，根據本發明之該萃取物可能以乾燥萃取物形式，有利地以粉末形式。

在一實施例中，根據本發明之該萃取物可能為一標準化的萃取物。

「標準化萃取物」意謂具有一經擇取指甲花醌含量的萃取物，諸如，對於譬如美妝應用，指甲花醌含量含括在0.6%與1.4%之間，特別地大概1.3%重量份的指甲花醌，相對於該乾燥萃取物之總重量。

此指甲花醌含量可能藉由添加一載體而獲得，該載體係擇自單獨或混合的無蛋白質載體之中。

該載體尤其可以擇自丙二醇(propanediol)、戊二醇、甘油、丙二醇(propylene glycol)、甲基THF和戊醇之中。

根據本發明之一乾燥萃取物亦可以標準化的。

對於乾燥萃取物，該載體較佳地係擇自醣類和多醣衍生物之中，諸如果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖糊精、纖維素衍生物、瓊脂、樹膠、黏液、多元醇諸如甘露醇、山梨醇、木糖醇……等等。

本發明亦有關一種富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其包含下列步驟：
a) 將指甲花的地上部分浸漬在水中，在此期間，最初存在於指甲花地上部分的糖基化指甲花醌衍生物，諸如海娜賽，係由酵素部分或全部地水解，導致含有指甲花醌的水溶液；
b) 加入一有機溶劑至步驟a)獲得的溶液中，該溶劑與水的混溶性在25℃下係小於10%，有利地5%重量份，該溶劑在水中的混溶性在25℃下係小於10%，有利地5%重量份，導致水相和有機相的形成；
c) 回收從步驟b)獲得的有機相；及
d) 濃縮從步驟c)回收的有機相，允許獲得一富含指甲花醌的萃取物。

在本發明之上下文中，「富含指甲花醌的萃取物」意謂相對於該乾燥萃取物之總重量，含有10%與60%重量份之間，尤其是10%與50%之間，特別是15%與40%重量份之間指甲花醌的萃取物。

有利地，相對於乾燥萃取物之總重量，根據本發明之該萃取物含有至少15%，較佳地至少20%，更有利地至少25%重量份的指甲花醌；(在添加任何乾燥載體之前)。

有利地，從步驟d)獲得之該富含指甲花醌的萃取物含有超過50%，尤其是超過60%，有利地超過70%最初以游離形式或以糖基化指甲花醌衍生物(諸如海娜賽)形式存在於步驟a)中經受浸漬之指甲花地上部分中的指甲花醌。

最初以游離形式或以糖基化指甲花醌衍生物形式存在於步驟a)中經受浸漬之指甲花地上部分中的指甲花醌的份量亦稱為「該植物的潛在指甲花醌」。

在根據本發明之一較佳實施例中，從步驟d)獲得之該富含指甲花醌之萃取物含有60%與90%之間，尤其是70%與90%之間植物的潛在指甲花醌。

植物的潛在指甲花醌尤其可以根據實例後面描述的HPLC測定方法(方法1)確定。

特別地，在步驟a)中經受浸漬的指甲花地上部分為葉子(可以是新鮮的或乾燥的，較佳地乾燥)、枝條或兩者的混合物。

步驟a)較佳地係於含括20℃與60℃之間的一溫度下執行，尤其是在20℃與50℃之間，特別是在25℃與45℃之間，更特別地在30℃與45°C之間，典型地 40°C。

其應理解的是，步驟a)係於允許催化該糖基化指甲花醌衍生物水解的酵素或酵素等起作用的pH下執行。特別地，步驟a)係於含括4與8之間之一pH下執行，較佳地在5與7.5之間，有利地在5.5與7.5之間，典型地於中性pH下。

「中性pH」意謂含括6.5與7.5之間的pH，特別地大約7。

有利地，步驟a)係於攪拌下實行。攪拌可能藉由熟習該項技藝者所廣為知悉的任何方法獲得。

浸漬的持續時間有利地含括在15分鐘與2小時之間，特別是在15分鐘與1小時之間，有利地大概為30分鐘。

在步驟a)期間，所用水體積係為經受至浸漬的指甲花地上部分之質量的5至15倍大，有利地6至10倍大，典型地10倍大。因此，當根據本發明之方法在100 g指甲花的地上部分上施行時，步驟a)期間所用的水體積係含括在500mL與1500mL之間，有利地在600mL與1000mL之間，典型地1000 mL。

其應注意的是，從步驟a)得到的全部混合物，意即植物材料以及水溶液，係保留用於步驟b)。

步驟b)可能於批次或連續模式中完成。

在一特別實施例中，根據本發明之該方法的步驟b)包含下列3子步驟：
b.1)加入一有機溶劑至步驟a)獲得的水溶液中，水在該溶劑中的混溶性於25℃下係小於10%，有利地5%重量份，該溶劑在水中的混溶性於25℃下係小於10%，有利地5%重量份，
b.2)攪拌從步驟b.1)獲得的溶液，該攪拌持續時間係含括在15分鐘與2小時之間，特別是在15分鐘與1小時之間；典型地該攪拌持續時間係大概30分鐘，且
b.3)將從步驟b.2)獲得的混合物傾析，直至獲得兩個區別的相，即水相和有機相。

因此，子步驟b.1)、b.2)和b.3)的接續導致水相和有機相的形成。

在步驟b)期間，特別是在步驟b.1)期間，加入的有機溶劑的體積係為使在步驟b)期間加入的有機溶劑與步驟a)期間所用水體積的體積比含括在0.25與2之間；尤其是在0.5與2之間，尤其是在0.8與1.5之間，特別是在1與1.3之間。

在一特別實施例中，根據本發明該方法的步驟b)期間，特別是在步驟b.1)期間添加之該有機溶劑係為一弱極性溶劑。「弱極性」意謂特徵為偶極矩小於2.0 D的一溶劑。

其係理解的是，雖然弱極性，該有機溶劑確實溶解指甲花醌。因此，指甲花醌在b)中，特別是在步驟b.1)中，加入之有機溶劑中的溶解度於25℃下係大於70%，尤其是大於80%，有利地大於90%重量份；百分比係相對於從步驟a)獲得的之該含有指甲花醌的水溶液中存在的指甲花醌之總重量表示。

根據一有利層面，在根據本發明之該方法的步驟b)期間，特別是在步驟b.1)期間，添加的有機溶劑係擇自醇類、氯化溶劑、酮類、醚類、酯類及其混合物，其驗證下列水中混溶性和水在該有機溶劑中之混溶性的準則：
- 水在該有機溶劑中的混溶性於25℃下係小於10%，有利地係小於5%重量份，
- 該有機溶劑在水中的混溶性於25℃下係小於10%，有利地係小於5%重量份，

在本發明之上下文中，「醇類」意謂一R₄ –OH化合物，其中R₄ 係為一(C₁ –C₆ )烷基。

在本發明之上下文中，「氯化溶劑」意謂含有介於1與6之間碳原子的一烷烴(即一飽和烴)，尤其介於1與3之間碳原子，其中部分或全部的氫原子被氯原子取代。

在本發明之上下文中，「酮類」意謂一R₅ –CO–R₆ 化合物，其中R₅ 和R₆ 係為相同或不同的(C₁ –C₆ )烷基。

在本發明之上下文中，「醚類」意謂一R₇ –O–R₈ 化合物，其中R₇ 和R₈ 係為相同或不同的(C₁ –C₆ )烷基。

在本發明之上下文中，「酯類」意謂一R₉ –COO–R₁₀ 化合物，其中R₉ 和R₁₀ 係為相同或不同的(C₁ –C₆ )烷基。該酯類特別可能為一乙酸酯，即一CH₃ COO–R₁₀ 化合物。

在本發明之上下文中，「(C₁ –C₆ )烷基」意謂一飽和、直鏈或支鏈的烴鏈，有利地包含1至6個，較佳地1至4個碳原子。實例包括下列基團：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或己基。

滿足先前列舉之混溶性準則的醇類尤其包括正戊醇，亦稱為1-戊醇。滿足先前列舉之混溶性準則的氯化溶劑尤其包括二氯甲烷和氯仿。

滿足先前列舉之混溶性準則的酮類尤其包括甲基異丁基酮，通常稱為MIBK。

滿足先前列舉之混溶性準則的醚類尤其包括二乙醚、二異丙醚、二丁醚和甲基叔丁基醚。

滿足先前列舉之混溶性準則的酯類尤其包括(C₁ –C₆ )烷基乙酸酯，諸如乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯和乙酸異戊酯。

在本發明之一特別實施例中，步驟b)中，特別是在步驟b.1)期間，加入的有機溶劑係為一(C₁ –C₆ )烷基乙酸酯或(C₁ –C₆ )烷基乙酸酯的混合物，較佳地擇自由乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯及其混合物所組成之該群組。在一特別較佳方式中，其係為乙酸異丙酯。

根據本發明之該方法的步驟c)在於回收從步驟b)獲得的有機相。

對熟習該項技藝者將為清楚的是，在步驟b)的前一次迭代中獲得的水相上重複步驟b)係為可能的。由此獲得的新有機相(重複步驟c))然後係回收並與步驟b)的前一次迭代得到的有機相合併。

因此，在根據本發明之該方法的一變體中，步驟d)存在於步驟d')，其濃縮從步驟b)的幾次迭代繼之的步驟c)回收的合併有機相。

在一實施例中，根據本發明之該方法可以含有乾燥從步驟d)獲得之該富含指甲花醌之萃取物的額外步驟e)。在步驟e)結束時，該所獲得的富含指甲花醌之萃取物係為一乾燥萃取物。

乾燥步驟e)可能根據熟習該項技藝者所廣為知悉的方法進行。特別地，該乾燥步驟可能藉由托盤乾燥器(pallet dryer)、霧化、微波、沸石乾燥法(zeodration)或冷凍乾燥而完成。

根據一較佳實施例，根據本發明之該方法不包括任何藉由添加酸或鹼而改變該水溶液或水相之pH的步驟。

在一較佳實施例中，根據本發明之該方法亦包含萃取色素的步驟，亦稱為脫色步驟。

於脫色步驟期間萃取之該等色素尤其是葉綠素。然而，係為理解的是，指甲花醌不是該脫色步驟試圖消除之該等色素的一部分。

該色素萃取步驟尤其可以以一有機溶劑完成。

係為理解的是，該有機溶劑不會很好地溶解指甲花醌。因此，指甲花醌在用於脫色步驟的有機溶劑步驟中的溶解度在25℃下係小於15%，尤其是小於10%，有利地小於5%重量份；百分比係相對於進行脫色步驟之該萃取物或溶液中含有的指甲花醌的總重量表示。

較佳地，指甲花醌係不溶於用於色素萃取步驟之該有機溶劑。

有利地，該有機溶劑係為一飽和或不飽和的烴。

「飽和或不飽和烴」意謂獨由氫和碳原子構成的化合物。

特別地，飽和烴可以擇自戊烷、己烷、庚烷、壬烷、癸烷和環己烷。

該不飽和烴尤其可以為苯。

較佳地，對於像葉綠素之色素等的萃取步驟係以庚烷完成。

用有機溶劑完成的色素萃取步驟可能存在於一液-液或液-固萃取。

當其係為液-液萃取時，該步驟係插入根據本發明之該方法的步驟a)和b)之間。

有利地，使用有機溶劑的液-液萃取脫色步驟包含下列4子步驟：
i) 將該有機溶劑加入至步驟a)獲得之該水溶液中，
ii) 攪拌從步驟i)獲得之該溶液，攪拌持續時間係含括在15分鐘與2小時之間，特別是15分鐘與1小時之間，典型地該攪拌持續時間係大概30分鐘，且
iii) 將從步驟ii)獲得的混合物的傾析，直至獲得兩個區別的相，即水相和有機相，和
iv) 消除該有機相。

然後，該方法之步驟b)係於從步驟iii)得到之該水相中施行。

當其係為液-固萃取的問題時，此步驟繼之根據本發明之該方法的乾燥步驟e)後。液-固萃取可能根據熟習該項技藝者所廣為知悉的方法完成。

或者，該脫色步驟可能使用超臨界CO₂ ，在添加或不添加共溶劑的情況下，直接在該乾燥萃取物中完成。葉綠素係藉由該超臨界CO₂ 挾帶。殘餘物係為脫色的乾燥萃取物。

在一特別實施例中，根據本發明之該方法亦包含位於步驟a)和b)之間的一過濾步驟，以為了將指甲花的地上部分與含有指甲花醌的水溶液分離開。

在另一特別實施例中，一果膠酶型酵素可能在步驟a)中加入。

根據本發明之該方法亦可能應用於任何其他含有指甲花醌的植物，諸如鳳仙花(Impatiens balsamina )。熟習該項技藝者將知道如何使本發明的方法適應所討論的植物。因此，在鳳仙花的事例中，熟習該項技藝者將對根部做一萃取，根部為鳳仙花中指甲花醌最豐富的部分。

本發明亦有關一種可藉由上文提及該方法獲得的萃取物。這種萃取物符合先前界定的規格。

特別地，該萃取物含有10%與60%重量份之間，尤其是10%與50%之間，特別是15%與40%重量份之間的指甲花醌，相對於該乾燥萃取物之總重量，該指甲花醌的含量係隨著時間推移而安定。

因此，於室溫(15°C-25°C)、相對濕度(RH)60%且避光下，在1個月、3個月、6個月或12個月後，藉由根據本發明之該方法可以獲得之該萃取物的指甲花醌含量減少不會超過20%，尤其是不超過15%，有利地不超過10%。

有利地，相對於乾燥萃取物之總重量，該萃取物含有至少15%，較佳地至少20%，更有利地至少25%重量份的指甲花醌；百分比係相對於該乾燥萃取物的總重量(在添加任何乾燥載體之前)表示。

較佳地，相對於該乾燥萃取物之總重量，根據本發明之該萃取物含有不超過2%，較佳地不超過1%重量份的蛋白質、胜肽或胺基酸。

該萃取物亦包含葉綠素，尤其是葉綠素a和/或葉綠素b，相對於該乾燥萃取物之總重量，總葉綠素含量係小於25 %重量份，尤其是小於20%重量份，有利地相對於該乾燥萃取物之重量小於10%重量份。

有利地，相對於該乾燥萃取物總重量，該萃取物含有不超過5%，較佳地不超過2%重量份的葉綠素。還更有利地，該萃取物不含有葉綠素。

該萃取物亦可能含有任何天然存在於指甲花地上部分的化合物，尤其是指甲花的葉子和/或枝條。特別地，該萃取物亦含有酚類化合物，諸如沒食子酸；固醇，諸如β-植物固醇；和/或三萜類，諸如羽扇豆醇。

在一實施例中，該萃取物可能藉由加入一載體而標準化，該載體係擇自單獨或混合的無蛋白質載體之中。

該載體尤其可以擇自丙二醇、戊二醇、甘油、丙二醇、甲基THF和戊醇之中。

當該萃取物係為一乾燥萃取物時，該載體較佳地係擇自醣類和多醣衍生物之中，諸如果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖糊精、纖維素衍生物、瓊脂、樹膠、黏液、多元醇諸如甘露醇、山梨醇、木糖醇……等等。

在本說明的其餘部分中，「根據本發明之萃取物」將指如上文這樣界定的萃取物，或者可以藉由諸如上述根據本發明之該方法獲得的萃取物。

本發明亦有關一種組成物，其包含根據本發明之一萃取物，且假若適用的話，包含一適當的賦形劑。根據本發明之該萃取物係如上文關於該萃取物的段落，及關於可藉由根據本發明之該方法獲得之萃取物的段落中所界定的。

特別地，其可能為一標準化萃取物的問題，該者具有含括在0.6%與1.4%之間的一指甲花醌含量，特別地，大概1.3%重量份的指甲花醌，相對於該萃取物之總重量。

該組成物較佳地係配製成外部和局部投藥的。

根據本發明之該組成物可能於適於局部投藥的不同製劑形式中配製，且尤其是包括乳膏、乳液(emulsions)、乳劑(milks)、軟膏、洗劑、油、水性或水-醇或乙醇酸溶液、粉末、噴霧劑、洗髮精、清漆或任何其他外部施用產品。

該組成物有利地為一美妝染料組成物，包含至少一種美妝可接受的賦形劑。

在本發明之上下文中，「美妝上可接受的賦形劑」意謂可用於製備一美妝組成物的賦形劑，該者一般為安全、無毒的，且既不是生物學上也不是其他方面非所欲的，且對於美美妝用途為可接受的，尤其藉由局部施用。

尤其是，根據本發明之該組成物亦可能包含至少一種熟習該項技藝者所知悉的美妝上可接受的賦形劑，該者係擇自界面活性劑、增稠劑、防腐劑、芳香劑、染料、化學或礦物質過濾劑、保濕劑、地熱水(thermal waters)……等等。熟習該項技藝者藉由使用其一般知識知道調整根據本發明之該組成物的配方。

然而，該組成物沒有通常存在於海娜組成物中以安定指甲花醌的安定劑。

因此，根據本發明之該美妝染料組成物不含由合成染料製成的添加劑，諸如二胺基甲苯和二胺基苯，特別是最常用的PPD(對苯二胺)，或重金屬[Wang等人之”J. environ. Anal. Toxicol. 2016, 6(3)”；Wang等人之”J. Chromatogr. B 2011, 879, 1795–1801” ]。

在一特別實施例中，根據本發明之該美妝染料組成物包含0.01至50%，尤其是1至40%，特別是2至30%重量份的根據本發明之該萃取物，該萃取物的重量係以相對於該組成物總重量的乾燥萃取物表示。

在一特別實施例中，根據本發明之該美妝染料組成物包含1至20%，尤其是5至20%，特別是10至20%重量份之根據本發明的標準化萃取物，該標準化萃取物的重量係以相對於該組成物總重量的乾燥萃取物表示。.

較佳地，根據本發明之該美妝染料組成物具有含括在0.2%與2%之間的指甲花醌含量，尤其是在0.5與1.5%之間重量份的指甲花醌，相對於該組成物之總重量。

特別地，該美妝染料組成物具有大概1.3%重量份的指甲花醌含量，就該組成物之總重量而言。

此指甲花醌的含量可能藉由添加一載體而獲得，該載體係擇自單獨或混合的無蛋白質載體之中。

當根據本發明之該美妝染料組成物為粉末形式時，該載體較佳地係擇自醣類和多醣衍生物之中，諸如果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖糊精、纖維素衍生物、瓊脂、樹膠、黏液、多元醇諸如甘露醇、山梨醇、木糖醇……等等。

當根據本發明之該美妝染料組成物為粉末形式時，熟習該項技藝者可以藉由其等熟知的任何方法調整其粒徑。

特別地，根據本發明之一美妝染料組成物可能為粉末形式，具小於250μm的粒徑。

較佳地，根據本發明之一美妝染料組成物，含有不超過2%重量份的蛋白質、胜肽或胺基酸，相對於乾燥萃取物之總重量。

根據本發明之該美妝染料組成物亦可能包含一或多種額外的染料和/或色素。

其係理解的是，根據本發明之一組成物的指甲花醌含量係隨時間推移而安定。

因此，於室溫(15°C-25°C)、相對濕度(RH)60%且避光下，在1個月、3個月、6個月或12個月後，該萃取物的指甲花醌含量減少不會超過20%，尤其是不超過15%，有利地不超過10%。

本發明亦涉及一種用於染色角蛋白纖維的美妝方法，包含施用根據本發明之一組成物至角蛋白纖維上，任選地隨後漂洗。

「角蛋白纖維」意謂存在於表皮和外皮(integuments)中的角蛋白，諸如頭髮和指甲。

本發明亦涉及一種用於紋身皮膚的方法。

本發明亦對包含根據本發明之萃取物的一紡織品或家具染料具有標的。

此種染料亦可能包含一或多種額外的染料和/或色素。

根據本發明之該染料亦可能包含熟習該項技藝者所知悉的任何佐劑，藉由使用其一般知識，該等技藝者知道如何調整根據本發明之該染料的配方。

本發明亦有關此種染料用於染色紡織品或木纖維的用途。

下列實例例示本發明。
實例1：根據本發明之乙酸異丙酯萃取物N°1。

將50g未碾碎的指甲花葉藉由500 mL的水於30-40℃下萃取30 min。加入600 mL乙酸異丙酯至此溶液中。將此混合30分鐘。在傾析後，回收上層的乙酸異丙酯相(480mL)，分離水相，因為其實際上無指甲花醌。過濾該乙酸異丙酯相，然後以旋轉蒸發器(Rotavapor)乾燥。殘餘物係為該乾燥的海娜萃取物(樣品E1)。

該植物含有1.5g指甲花醌/100g乾燥植物。

該乙酸異丙酯相含有80.7%存在於植物中的潛在指甲花醌。

該乾燥的海娜萃取物(樣品E1)含有30.2%的指甲花醌，即71%存在於植物中的潛在指甲花醌。

安定性研究：樣品係於25°C、60%相對濕度下保存並避光：
於T0：指甲花醌含量= 30.2%重量份的指甲花醌，相對於該乾燥萃取物重量。

於T1個月：指甲花醌含量= 29.7%重量份的指甲花醌，相對於該乾燥萃取物重量；意即在本發明之含義內沒有顯著的損失。
實例2：根據本發明之乙酸異丙酯萃取物N°2。

將49.5 g未碾碎的指甲花葉藉由500 mL的水於30-40℃下萃取30 min。加入600mL乙酸異丙酯至此溶液中。將此混合30分鐘。在傾析後，回收上層的乙酸異丙酯相，並在Büchner(K900)上過濾，以50mL乙酸異丙酯沖洗該殘餘物。然後以旋轉蒸發器乾燥所得溶液。殘餘物係為該乾燥的海娜萃取物(樣品E2)。

該乾燥的指甲花萃取物(樣品E2)含有30.9 wt.%的指甲花醌。
實例3：根據本發明之乙酸乙酯標準化萃取物。

將50g碾碎的指甲花葉藉由500mL水於30-40℃下萃取30分鐘。加入600mL乙酸乙酯至該溶液中。將此混合30分鐘。在傾析後，回收上層的乙酸乙酯相，並移除水相，因為其指甲花醌的含量非常低。

藉由H.P.L.C測定乙酸乙酯相的指甲花醌含量，並加入充足份量的麥芽糖糊精，以獲得含有1.3wt%指甲花醌的混合物，然後將其冷凍乾燥。

以麥芽糖糊精標準化的乾燥海娜萃取物(樣品E3)含有1.1 wt.%的指甲花醌，即植物中最初指甲花醌含量的71%。

為了比較的目的，反例係於下文描述。
反例1：酸性乙酸異丙酯萃取物N°1

將20g未碾碎的指甲花葉藉由以磷酸(1N H₃ PO₄ )飽和的60mL乙酸異丙酯於室溫下萃取60 min。在Büchner(K900)上固/液分離並藉由在1N H₃ PO₄ 中飽和的20mL乙酸異丙酯沖洗該殘餘物後，收集所獲得的液體並測定(樣品CE1)。

該植物含有1.52克指甲花醌/100克乾燥植物。

樣品CE1含有0.9%的植物中潛在指甲花醌。
反例2：酸性甲基乙基酮萃取物

將20g未碾碎的指甲花葉藉由以磷酸(1N H₃ PO₄ )飽和的60mL甲基乙基酮於室溫下萃取60 min。在Büchner漏斗(K900)中固/液分離並藉由在1N H₃ PO₄ 中飽和的20mL甲基乙基酮沖洗該殘餘物後，收集所獲得的液體並測定(樣品CE2)。

該植物含有1.52克指甲花醌/100克乾燥植物。

樣品CE2含有0.9%植物中的潛在指甲花醌。
反例3：石灰水萃取物N°1

將20g未碾碎的指甲花葉藉由80mL石灰水於室溫下萃取60 min。在Büchner漏斗(K900)中固/液分離並藉由20mL石灰水沖洗該殘餘物後，收集所獲得的液體並測定(樣品CE3)。

該植物含有1.52克指甲花醌/100克乾燥植物。

樣品CE3含有24%植物中存在的潛在指甲花醌。
反例4：石灰水萃取物N°2

將19,75g碾碎的指甲花葉藉由80mL水和20mL石灰水(CaO(OH)₂ , 50 g/L)的混合物於室溫下萃取60 min。在Büchner漏斗(K900)中固/液分離並藉由50mL水沖洗該殘餘物後，收集所獲得的液體，且然後以旋轉蒸發器乾燥。殘餘物係為乾燥的海娜萃取物(樣品CE4)。

該乾燥的海娜萃取物(樣品CE4)含有1.8 wt.%的指甲花醌。
反例5：酸性乙酸異丙酯萃取物N°2

將20,0g碾碎的指甲花葉藉由以磷酸(1N H₃ PO₄ )飽和的60mL乙酸異丙酯於室溫下萃取60 min。在Büchner漏斗(K900)上固/液分離並藉由20mL飽和的乙酸異丙酯沖洗該殘餘物後，收集所獲得的液體且然後以旋轉蒸發器乾燥。該殘餘物係為乾燥的海娜萃取物(樣品CE5)。

該乾燥的海娜萃取物(樣品CE5)含有0.2 wt.%的指甲花醌。
反例6：酸性水溶液萃取物

將50g未碾碎的指甲花葉藉由150mL酸性水溶液(HCl，pH = 2.5)於室溫下萃取30 min。該所獲得的糊狀物係於沒有過濾器的情況下在Büchner上分離成渣滓和水溶液。該渣滓係以1L鹼性水溶液(NaOH 0.15%)於50℃下萃取3小時。藉由過濾(在100目大小篩網上)固/液分離後，將所獲得的溶液於真空下濃縮至1/15，冷卻並以HCl酸化至pH = 2.5。然後將其離心並於40℃真空下烘箱乾燥。該殘餘物係為乾燥的海娜萃取物(樣品CE6)。

該乾燥的海娜萃取物(樣品CE6)含有9.5 wt.%的指甲花醌。

為便於比較，萃取物E2、CE4、CE5和CE6的重要面向係總結如下。值得注意的是，鑑於相同的植物批次係使用作為起始材料，該等萃取物的比較係特別相關的。

從上表中顯示的結果可以明顯地看出，本發明之該方法較諸其他方法允許萃取該植物潛在指甲花醌之一更重要部分。這尤其是歸因於該特定的浸漬步驟a)，在此期間，最初存在於該植物中的糖基化指甲花醌衍生物進行一酵素水解。
方法1：藉由HPLC測定指甲花醌

此方法適用於：
A. 萃取物中指甲花醌的測定
B. 以游離形式或糖基化指甲花醌衍生物形式存在於指甲花地上部分中的總指甲花醌的測定，藉由酸水解獲得，且從而量化植物中的潛在指甲花醌，
C. 測定藉由酵素形成的指甲花醌。
試劑

指甲花醌＞ 97% (HPLC) SIGMA– ref： H46805
用於分析之二氯甲烷。
用於分析的硫酸。
用於分析的甲醇。
HPLC級水。
HPLC級乙腈。
HPLC級三氟乙酸。
HPLC條件

- 管柱： XBridge C18, 3.5 µm, 4.6 x 150 mm Waters Furnace： 40°C
- 溶劑： S–A： 0.1%三氟乙酸於水中。
S–B： 0.1%三氟乙酸於乙腈中。
- 梯度： T0 min 40% S–A； T 1 min 40% S–A； T 10 min 5% S–A； T 11 min 5% S–A； T 11.1 min 40% S–A。
- 波長： l=278 nm。
- 流速： 1 mL/min
- 注射： 10 µL。
樣品製備

對於整個或大致碾碎的葉子：
將50g葉子碾碎，然後通過0.355μm的篩子篩分。

對於葉子粉末：
按原樣使用50 g葉子粉末。
溶液製備

對照溶液：
0.3mg/mL的指甲花醌溶液於1/1甲醇/乙醇中。在1/1甲醇/水中稀釋至1/10、1/20、1/100。

試驗溶液：
- 試驗溶液A (存在於萃取物中的指甲花醌的測定)
將50 mg萃取物溶於100 mL的1/1甲醇/水中。
以超音波溶解。
在Acrodisc GF GHP上過濾。
注入10μL。
- 試驗溶液B(測定總指甲花醌)
將80mg葉子粉末引入一定量瓶中。
加入50 mL的2N H₂ SO₄ 。
加熱至97°C計30分鐘。
冷卻。
加入甲醇至100 mL。
在0.45μm Acrodisc GF GHP上過濾該溶液。
注入10μL濾液。
- 試驗溶液C(測定藉由酵素形成的指甲花醌)
將80mg葉子粉末引入一定量瓶中。
加入50 mL去礦物質水。
放置在30至40℃之間的超音波浴中30 min。
冷卻。
加入甲醇至100 mL。
在0.45μm Acrodisc GF GHP上過濾該溶液。
注入10μL濾液。
結果

使用以該對照溶液計算的回歸線確定：
A. 該萃取物的指甲花醌含量，
B. 該指甲花醌總含量，及/或
C. 由酵素形成的指甲花醌含量。
方法2：測定含氮化合物(胺基酸、蛋白質)。

游離胺基酸和蛋白質可以在水解前後藉由茚三酮分光光度法測定。結果表示為相對於該天冬醯胺的胺基酸百分比。
總蛋白質和胺基酸的測定
原理

在酸水解後藉由茚三酮試劑對胺基酸的比色測定。結果表示為相對於天冬醯胺的總胺基酸的百分比。
試劑

檸檬酸鹽緩衝液(pH=5)
將2.1g檸檬酸溶於20mL水中，加入20mL 1N氫氧化鈉並以水調整至50mL。
· 茚三酮試劑：
將0.08g氯化錫(II) (SnCl_2, 2H₂ O)溶於50ml檸檬酸鹽緩衝液(pH = 5)中。
將2g茚三酮溶於50mL乙二醇單甲醚(EGME)中。
混合該兩種溶液。
· 6N 鹽酸
稀釋至1/2的濃鹽酸(36%)。
· 稀釋劑
將100 mL的1-丙醇與100 mL水混合。

溶液的製備
· 製備校準範圍
將17mg天冬醯胺溶於100mL水中。
· 製備測試溶液
取決於待分析的樣品(pe₁ )，稱取大概30至200mg的萃取物於螺紋管中，加入2mL的6N HCl。
密封然後於110°C下放置大約16小時。
以3N氫氧化鈉中和(甲基紅變色)，然後以水調整至20ml。

測定
攪拌並置於100℃的水浴中20分鐘。
在冰浴中冷卻。
以稀釋劑調整至10 ml。
對照空白組測量不同溶液在570nm處的吸光度。
計算
構建校準曲線。

從中推論試驗溶液中的總胺基酸濃度(Q_AAT )，表示為天冬醯胺。
該萃取物之總胺基酸含量(T_AAT )係由下式給出：

Q_AAT x 100 x 20
T_AAT (%) =^{____________________}
pe₁
伴隨： Q_AAT 單位 mg/ml
pe₁ 單位mg
方法3：葉綠素重量測定

該萃取物中的葉綠素含量可能藉由在以庚烷沖洗該萃取物後獲得的重量而評估。該萃取物係藉由10V的甲醇取出。在攪拌15min後，過濾該溶液。該上清液係乾燥並構成含有葉綠素的餾分。

Claims

一種富含指甲花醌(lawsone)之萃取物的製備方法，其包含下列步驟： a) 將指甲花(Lawsonia inermis )的地上部分浸漬在水中，在pH 4與8之間實行，在此期間，最初存在於指甲花地上部分的糖基化指甲花醌衍生物，諸如海娜賽(hennosides)，係由酵素部分或全部地水解，導致含有指甲花醌的水溶液； b) 加入一有機溶劑至步驟a)獲得的溶液中，該溶劑與水的混溶性在25℃下係小於10%重量份，有利地係5%重量份，該溶劑在水中的混溶性在25℃下係小於10%重量份，有利地係5%重量份，導致水相和有機相的形成； c) 回收從步驟b)獲得的該有機相；及 d) 濃縮從步驟c)回收的該有機相，允許獲得一富含指甲花醌的萃取物。
如請求項1之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中步驟a)期間之水溫係含括在20℃與60℃之間，尤其是在20℃與50℃之間，較佳地在25℃與45℃之間，特別是在30℃與45℃之間。
如請求項1或2之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中步驟a)係在pH 5與7.5之間實行，特別是在5.5與7.5之間，尤其是在6.5與7.5之間。
如請求項1至3中任一項之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中其不包括任何藉由加入酸或鹼改變該水溶液或該水相之pH的步驟。
如請求項1至4中任一項之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中步驟a)係在攪拌下實行，且該浸漬持續時間係含括在15分鐘與2小時之間，特別是15分鐘與1小時之間，有利地其係大概30分鐘。
如請求項1至5中任一項之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中在步驟a)中，所用水體積係為經受至浸漬的指甲花地上部分之質量的5至15倍大，有利地為6至10倍大，典型地為10倍大。
如請求項1至6中任一項之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中步驟b)包含下列3個子步驟： b.1)加入一有機溶劑至步驟a)獲得的水溶液中，水在該溶劑中的混溶性於25℃下係小於10%重量份，有利地係5%重量份，該溶劑在水中的混溶性於25℃下係小於10%重量份，有利地係5%重量份， b.2)攪拌從步驟b.1)獲得的溶液，該攪拌持續時間係含括在15分鐘與2小時之間，特別是在15分鐘與1小時之間；典型地該攪拌持續時間係大概30分鐘，且 b.3)將從步驟b.2)獲得的混合物的傾析，直至獲得兩個區別的相，即水相和有機相。
如請求項1至7中任一項之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中在步驟b)期間，特別是在步驟b.1)期間，加入的有機溶劑的體積係為使在步驟b)期間加入的有機溶劑與步驟a)期間所用水體積的體積比含括在0.25與2之間；尤其是在0.5與2之間，尤其是在0.8與1.5之間，特別是在1與1.3之間。
如請求項1至8中任一項之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中其亦包含藉由一飽和或不飽和烴，特別是庚烷，來萃取諸如葉綠素之色素的步驟。
如請求項1至9中任一項之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中在步驟b)期間或步驟b.1)期間加入之該有機溶劑之特徵為小於2.0D的偶極矩，且係擇自醇類、氯化溶劑、酮類、醚類、酯類及其等之混合物。
如請求項1至10中任一項之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中該有機溶劑係為一(C₁ -C₆ )烷基乙酸酯或(C₁ -C₆ )烷基乙酸酯的混合物，較佳地擇自由乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異戊酯及其等之混合物所組成之該群組。
如請求項1至11中任一項之富含指甲花醌之萃取物的製備方法，其中從步驟d)獲得之該富含指甲花醌的萃取物含有超過50%，有利地超過70%，最初以游離形式或以糖基化指甲花醌衍生物(諸如海娜賽)形式存在於步驟a)中經受浸漬之指甲花地上部分中的指甲花醌。
一種萃取物，其可藉由如請求項1至12中任一項之方法獲得。