JP2021152544A5

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Publication number: JP2021152544A5
Application number: JP2021092988A
Authority: JP
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2022-06-30
Anticipated expiration: 2036-05-11

Description

一実施形態では、リガンドは、サブユニットに結合する抗体である。第１のリガンドは、第１のサブユニットに結合するが第２のサブユニットには結合しない抗体であり、第２のリガンドは、第２のサブユニットに結合するが第１のサブユニットには結合しない抗体である。一実施形態では、リガンドのｐＩ（等電点）は、各多量体のｐＩと異なっているかまたは異なるように改変される（例えば、より酸性であるかまたはｐＩが低い）。
[1]
マルチサブユニットタンパク質の第1のサブユニットに結合し、かつ前記マルチサブユニットタンパク質の第2のサブユニットには結合しない、リガンドであって、前記第1のサブユニット、前記第2のサブユニット、または前記マルチサブユニットタンパク質の等電点よりも低い等電点を有する、前記リガンド。
[2]
前記第1のサブユニット及び前記第2のサブユニットがそれぞれ免疫グロブリン重鎖を含み、前記第2のサブユニットが、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムに従ってナンバリングされたアミノ酸置換Ｈ95Ｒ及びＹ96Ｆを含む、[1]のリガンド。
[3]
前記マルチサブユニットタンパク質が二重特異性抗体である、[1]または[2]のリガンド。
[4]
前記リガンドが抗体又は抗体フラグメントを含む、[1]のリガンド。
[5]
前記リガンドがビオチン分子を含む、[4]のリガンド。
[6]
前記リガンドが蛍光標識を含む、[4]または[5]のリガンド。
[7]
前記リガンドが、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）1、2及び3を含む、[4]のリガンド。
[8]
前記リガンドが、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）1、2及び3を含む、[4]または[7]のリガンド。
[9]
マルチサブユニットタンパク質の第2のサブユニットに結合し、かつ前記マルチサブユニットタンパク質の第1のサブユニットには結合しない、リガンドであって、前記第1のサブユニット、前記第2のサブユニット、または前記マルチサブユニットタンパク質の等電点よりも低い等電点を有する、前記リガンド。
[10]
前記第1のサブユニット及び前記第2のサブユニットが、それぞれ免疫グロブリン重鎖を含み、前記第2のサブユニットが、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムに従ってナンバリングされたアミノ酸置換Ｈ95Ｒ及びＹ96Ｆを含む、[9]のリガンド。
[11]
前記マルチサブユニットタンパク質が二重特異性抗体である、[9]または[10]のリガンド。
[12]
前記リガンドが抗体又は抗体フラグメントである、[9]のリガンド。
[13]
前記リガンドがビオチン分子を含有する、[12]のリガンド。
[14]
前記リガンドが蛍光標識を含む、[12]または[13]のリガンド。
[15]
前記リガンドが、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）1、2及び3を含む、[12]のリガンド。
[16]
前記リガンドが、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）1、2及び3を含む、[12]または[15]のリガンド。
[17]
リガンド、第1のホモ二量体、第2のホモ二量体、ヘテロ二量体、キャピラリー、検出器、前記キャピラリーの一方の端部またはその付近にあるアノード、前記キャピラリーの他方の端部またはその付近にあるカソード、及び電源を備えたシステムであって、前記第1のホモ二量体が、少なくとも2つの同一の第1のサブユニットを含み、前記第2のホモ二量体が、少なくとも2つの同一の第2のサブユニットを含み、前記ヘテロ二量体が、1つの第1のサブユニット及び1つの第2のサブユニットを含む、前記システム。
[18]
前記検出器が、前記キャピラリーの前記カソード側の端部の付近に配置され、前記リガンド、前記第1のホモ二量体、前記第2のホモ二量体、及び前記ヘテロ二量体が、前記キャピラリーの前記アノード側の端部において前記キャピラリーにロードされる、[17]のシステム。
[19]
前記検出器が、210ｎｍ～280ｎｍでの吸光度またはレーザー誘起蛍光を検出する、[17]または[18]のシステム。
[20]
前記キャピラリーが、前記アノードと前記検出器との間にリガンドプラグを含有する、[17]のシステム。
[21]
前記リガンドが、前記第1のサブユニットに結合し、かつ前記第2のサブユニットには結合しない、[17]のシステム。
[22]
前記リガンド及び前記第1のホモ二量体を含む第1の複合体と、前記リガンド及び前記ヘテロ二量体を含む第2の複合体とを含む、[21]のシステム。
[23]
前記第1の複合体及び前記第2の複合体が、前記第2のホモ二量体よりも電気泳動移動度が低い、[22]のシステム。
[24]
前記リガンドが、前記第2のサブユニットに結合し、かつ前記第1のサブユニットには結合しない、[17]のシステム。
[25]
前記リガンド及び前記第2のホモ二量体を含む第3の複合体と、前記リガンド及び前記ヘテロ二量体を含む第4の複合体とを含む、[24]のシステム。
[26]
前記第3の複合体及び前記第4の複合体が、前記第1のホモ二量体よりも電気泳動移動度が低い、[25]のシステム。
[27]
前記リガンドが、抗体またはそのフラグメントである、[21]から[26]のいずれかのシステム。
[28]
前記ヘテロ二量体が二重特異性抗体であり、前記第2のサブユニットが、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムに従ってナンバリングされたアミノ酸置換Ｈ95Ｒ及びＹ96Ｆを含む、[17]のシステム。
[29]
多量体の混合物中にあるホモ二量体を検出するための方法であって、（ａ）前記多量体の混合物及びリガンドを組み合わせる工程と、（ｂ）工程（ａ）の前記組み合わせをキャピラリーにアプライする工程と、（ｃ）前記キャピラリーに電圧を印加して前記キャピラリー内で前記ホモ二量体を移動させる工程と、（ｄ）前記ホモ二量体を検出する工程と、を含む前記方法。
[30]
多量体の混合物中にあるホモ二量体を検出するための方法であって、（ａ）リガンドプラグを含有するキャピラリーに前記多量体の混合物をアプライする工程と、（ｂ）前記キャピラリーに電圧を印加して前記キャピラリー内で前記ホモ二量体を移動させる工程と、（ｃ）前記ホモ二量体を検出する工程と、を含む前記方法。
[31]
前記キャピラリーが、カソード側の端部、アノード側の端部、及び検出器窓を含む、[29]または[30]の方法。
[32]
前記ホモ二量体が、200ｎｍもしくは280ｎｍにおける吸光度またはレーザー誘起蛍光を測定する検出器によって前記検出器窓から検出される、[31]の方法。
[33]
前記検出器窓が、前記キャピラリーの前記カソード側の端部の付近にある、[31]の方法。
[34]
前記電圧が28キロボルトである、[29]または[30]の方法。
[35]
前記多量体の混合物が、（ａ）2つの第1のサブユニットを含む第1のホモ二量体と、（ｂ）2つの第2のサブユニットを含む第2のホモ二量体と、（ｃ）前記第1のサブユニット及び前記第2のサブユニットを含むヘテロ二量体とを含む、[29]または[30]の方法。
[36]
前記ヘテロ二量体が二重特異性抗体であり、各ホモ二量体がモノクローナル抗体である、[35]の方法。
[37]
前記第2のサブユニットが、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムに従ってナンバリングされたアミノ酸置換Ｈ95Ｒ及びＹ96Ｆを含む、[36]の方法。
[38]
前記多量体の混合物がＣＨＯ細胞培養物から得られ、前記ＣＨＯ細胞培養物が、免疫グロブリン軽鎖と、Ｈ95Ｒ及びＹ96Ｆ置換を含む免疫グロブリン重鎖と、プロテインＡに結合する免疫グロブリン重鎖とを発現するＣＨＯ細胞を含む、[37]の方法。
[39]
前記リガンドが、任意の多量体の等電点よりも低い等電点を有する、[29]または[30]の方法。
[40]
前記リガンドが抗体又は抗体フラグメントを含む、[39]の方法。
[41]
前記リガンドがビオチン分子を含む、[40]の方法。
[42]
前記リガンドが、前記第1のサブユニットに結合し、かつ前記第2のサブユニットには結合せず、検出される前記ホモ二量体が前記第2のホモ二量体である、[39]または[40]の方法。
[43]
前記リガンドが、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）1、2及び3を含む、[42]の方法。
[44]
前記リガンドが、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）1、2及び3を含む、[43]の方法。
[45]
前記リガンドが、前記第2のサブユニットに結合し、かつ前記第1のサブユニットには結合せず、検出される前記ホモ二量体が前記第1のホモ二量体である、[39]または[40]の方法。
[46]
前記リガンドが、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）1、2及び3を含む、[45]の方法。
[47]
前記リガンドが、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）1、2及び3を含む、[46]の方法。
[48]
第1のホモ二量体、第2のホモ二量体、及びヘテロ二量体を含有する混合物中にある前記ヘテロ二量体の量を定量化する方法であって、（ａ）[45]の方法に従って、前記混合物中にある第1のホモ二量体の量を決定する工程と、（ｂ）[42]の方法に従って、前記混合物中にある第2のホモ二量体の量を決定する工程と、（ｃ）前記混合物中にある前記ヘテロ二量体の量を算出する工程と、を含む前記方法。

Claims

二重特異性抗体とその単一特異性抗体副生成物との混合物中の単一特異性抗体を定量化するための方法であって、該方法が
（ａ）二重特異性抗体とその単一特異性抗体副生成物との混合物をリガンドと組み合わせる工程であって、
該単一特異性抗体副生成物が、第1の単一特異性抗体および第2の単一特異性抗体からなり、
該二重特異性抗体が、第1のエピトープに特異的な第1のサブユニットおよび第2のエピトープに特異的な第2のサブユニットを含み、
該第1の単一特異性抗体は、2つの同一の第1のサブユニットを含み、
該第2の単一特異性抗体は、2つの同一の第2のサブユニットを含み、
該リガンドは、該第2のサブユニットに結合することができ、かつ該第1のサブユニットには結合しない、工程、
（ｂ）工程（ａ）の組み合わせをキャピラリーにアプライする工程、
（ｃ）該キャピラリー全体に電圧を印加する工程、
（ｄ）該リガンドに結合していない第1の単一特異性抗体を、該リガンドに結合している二重特異性抗体および第2の単一特異性抗体と比較して、キャピラリー内をより速く移動させる工程、
（ｅ）該結合していない単一特異性抗体を定量化する工程
を含む、前記方法。
二重特異性抗体とその単一特異性抗体副生成物との混合物中の単一特異性抗体を定量化するための方法であって、該方法が
（ａ）請求項1において規定される混合物を、第1のサブユニットに結合することができ、かつ第2のサブユニットには結合しないリガンドと組み合わせる工程、
（ｂ）工程（ａ）の組み合わせをキャピラリーにアプライする工程、
（ｃ）該キャピラリー全体に電圧を印加する工程、
（ｄ）該リガンドに結合していない第2の単一特異性抗体を、該リガンドに結合している二重特異性抗体および第1の単一特異性抗体と比較して、キャピラリー内をより速く移動させる工程、
（ｅ）該結合していない単一特異性抗体を定量化する工程
を含み、
該方法が、請求項1の方法とは別個にまたは並行して実行される、
前記方法。
前記キャピラリーが、カソード側の端部、アノード側の端部、および該カソード側の端部の付近に配置された検出器窓を含む、請求項1～2のいずれか一項記載の方法。
二重特異性抗体とその単一特異性抗体副生成物との混合物中の単一特異性抗体を定量化するための方法であって、該方法が
（ａ）二重特異性抗体とその単一特異性抗体副生成物との混合物を、リガンドプラグを含むキャピラリーにアプライする工程であって、
該単一特異性抗体副生成物が、第1の単一特異性抗体および第2の単一特異性抗体からなり、
該二重特異性抗体が、第1のエピトープに特異的な第1のサブユニットおよび第2のエピトープに特異的な第2のサブユニットを含み、
該第1の単一特異性抗体は、2つの同一の第1のサブユニットを含み、
該第2の単一特異性抗体は、2つの同一の第2のサブユニットを含み、
該リガンドプラグ中のリガンドは、該第2のサブユニットに結合することができ、かつ該第1のサブユニットには結合しない、工程、
（ｂ）該キャピラリー全体に電圧を印加する工程、
（ｃ）該リガンドに結合していない第1の単一特異性抗体を、該リガンドに結合している二重特異性抗体および第2の単一特異性抗体と比較して、キャピラリー内をより速く移動させる工程、
（ｄ）該結合していない単一特異性抗体を定量化する工程
を含む、前記方法。
二重特異性抗体とその単一特異性抗体副生成物との混合物中の単一特異性抗体を定量化するための方法であって、該方法が
（ａ）請求項4において規定される混合物を、リガンドプラグを含むキャピラリーにアプライする工程であって、該リガンドプラグ中のリガンドが、第1のサブユニットに結合することができ、かつ第2のサブユニットには結合しない、工程、
（ｂ）該キャピラリー全体に電圧を印加する工程、
（ｃ）該リガンドに結合していない第2の単一特異性抗体を、該リガンドに結合している二重特異性抗体および第1の単一特異性抗体と比較して、キャピラリー内をより速く移動させる工程、
（ｄ）該結合していない単一特異性抗体を定量化する工程
を含み、
該方法が、請求項4の方法とは別個にまたは並行して実行される、
前記方法。
前記キャピラリーが、カソード側の端部、アノード側の端部、および該カソード側の端部の付近に配置された検出器窓を含み、かつ前記リガンドプラグが、該アノード側の端部の付近に配置される、請求項4～5のいずれか一項記載の方法。
前記結合していない単一特異性抗体が、200ｎｍもしくは280ｎｍにおける吸光度またはレーザー誘起蛍光を測定する検出器によって前記検出器窓から検出される、請求項3または6記載の方法。
前記リガンドの等電点が、前記二重特異性抗体およびその単一特異性抗体副生成物のそれぞれの等電点よりも低い、または、より低くなるように改変されている、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
前記リガンドが抗体またはそのフラグメントである、請求項8記載の方法。
前記リガンドがビオチン分子を含む、請求項9記載の方法。
前記第1のサブユニットおよび前記第2のサブユニットが、それぞれ第1の重鎖および第2の重鎖である、請求項１～10のいずれか一項記載の方法。
前記第1のサブユニットおよび前記第2のサブユニットが、それぞれ第1の重鎖および第2の重鎖であり、かつ該第2の重鎖が、ＩＭＧＴエキソンナンバリングシステムに従ってナンバリングされたアミノ酸置換Ｈ９５Ｒ及びＹ９６Ｆを含む、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
前記第1のサブユニットに結合する前記リガンドが、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）1、2及び3を含む抗体である、請求項12記載の方法。
前記第1のサブユニットに結合する前記リガンドが、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）1、2及び3を含む抗体である、請求項12記載の方法。
前記第2のサブユニットに結合する前記リガンドが、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）1、2及び3を含む抗体である、請求項12記載の方法。
前記第2のサブユニットに結合する前記リガンドが、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）1、2及び3を含む抗体である、請求項12記載の方法。
前記リガンドがビオチン化によって改変されている、請求項13～16のいずれか一項記載の方法。
前記リガンドが、一級アミンのカップリング及びリジン側鎖修飾を介したビオチン化によって改変されている、請求項17記載の方法。
前記二重特異性抗体およびその単一特異性抗体副生成物が、組換えタンパク質である、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
前記二重特異性抗体およびその単一特異性抗体副生成物が、2つの別々の重鎖および1つの共通の軽鎖の組換え発現によって産生される、請求項19記載の方法。
前記組換え発現が、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞派生物由来である、請求項19記載の方法。