JP2020202836A - ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年6月23日に出願された米国仮特許出願第62/015,809号、2014年6月24日に出願された米国仮特許出願第62/016,400号、及び2014年8月13日に出願された米国仮特許出願第62/036,983号の利益を主張し、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の公式コピーは、461002SEQLIST.TXTという名の、2015年6月23日に作製された、66KBのサイズを有するファイルで、ASCII形式の配列表としてEFS−Webを介して電子的に提出され、本明細書と同時に出願される。このASCII形式文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
少なくとも2つの核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を第1のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第1のヌクレアーゼ剤が、第1の標的部位で前記第1の核酸を切断して、第1のダイジェストされた核酸を、前記第1のダイジェストされた核酸と第2の核酸との間におけるオーバーラップ末端配列を伴って産生する、接触させることと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸をエキソヌクレアーゼと接触させて、前記第1のダイジェストされた核酸と前記第2の核酸との間の相補的配列を曝露することと、
(c)工程(b)から生成された2つの核酸断片をアセンブルすることと、を含む、方法。
(項目2)
工程(c)が、
(i)前記曝露された相補的配列をアニーリングすることと、
(ii)前記アニーリングした相補的配列の3’末端を伸長することと、
(iii)前記第1及び前記第2の核酸をライゲーションすることと、を更に含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
工程(a)が、前記第2の核酸を第2のヌクレアーゼ剤と接触させることを更に含み、前記第2の核酸が、前記オーバーラップ末端配列を含まず、前記第2のヌクレアーゼ剤が、第2の標的部位で前記第2の核酸を切断して、第2のダイジェストされた核酸を、前記第1のダイジェストされた核酸と前記第2のダイジェストされた核酸との間における前記オーバーラップ末端配列を伴って産生し、かつ
工程(b)の前記第2の核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸である、項目1又は2に記載の方法。
(項目4)
前記第1のヌクレアーゼ剤及び前記第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、前記第1の標的部位又は前記第2の標的部位を標的とする、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記第1のヌクレアーゼ剤及び前記第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含み、
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質であり、前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含み、前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記オーバーラップ末端配列が、20bp〜200bpの長さの範囲である、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記細菌人工染色体が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、ヒトポリヌクレオチド配列、又はこれらの組み合わせを含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
少なくとも2つの核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を、第1のヌクレアーゼ剤及び第2のヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を産生することであって、前記第1のヌクレアーゼ剤が、第1の標的部位で前記第1の核酸の第1の鎖上に切れ目を生成し、前記第2のヌクレアーゼ剤が、第2の標的部位で前記第1の核酸の第2の鎖上に切れ目を生成して、その両端のうちの1つに5’又は3’オーバーハング配列を含む前記第1のダイジェストされた核酸を産生する、産生することと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記5’又は3’オーバーハング配列に対する相補的配列を含む第2の核酸をアニーリングすることと、
(c)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸をライゲーションすることと、を含む、方法。
(項目11)
工程(b)が、前記第2の鎖を鋳型として使用して前記第1の鎖の3’末端を伸長することと、前記第1の鎖を鋳型として使用して前記第2の鎖の3’末端を伸長することと、を更に含む、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記第1のヌクレアーゼ剤及び前記第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、前記第1の標的部位又は前記第2の標的部位を標的とする、Cas9タンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含む、項目10又は11に記載の方法。
(項目13)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記第1の標的部位が、前記第2の標的部位から少なくとも4bp離れている、項目10〜13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含み、前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目10〜14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
2つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を少なくとも1つのヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を生成することと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸を第2の核酸、結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
(i)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)スペーサーと、
(iii)前記第2の核酸に相補的である第2の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第1及び第2の相補的配列を曝露する、接触させることと、
(c)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
(項目17)
工程(c)におけるアセンブルが、
(i)前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列を前記第1のダイジェストされた核酸に、及び前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列を前記第2の核酸にアニーリングすることと、
(ii)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸にライゲーションすることと、を含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列が、15〜120の相補的塩基を含む、項目16又は17に記載の方法。
(項目19)
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、非相補的核酸を含む、項目16〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2の核酸にシームレスにアセンブルされる、項目16〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記少なくとも1つのヌクレアーゼ剤が、前記第1の核酸の末端から少なくとも20bpの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも20bpの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第1の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第2の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、
したがって、前記第1の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第2の核酸とのアセンブリが、前記少なくとも20bpの断片を再構築し、前記第1の核酸及び前記第2の核酸をシームレスにアセンブルする、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記少なくとも1つのヌクレアーゼ剤が、前記第2の核酸の末端から少なくとも20bpの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも20bpの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第1の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第2の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、
したがって、前記第1の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第2の核酸とのアセンブリが、前記少なくとも20bpの断片を再構築し、前記第1の核酸及び前記第2の核酸をシームレスにアセンブルする、項目20に記載の方法。
(項目23)
前記スペーサーが、約20bp〜約120bpから構成される、項目21又は22に記載の方法。
(項目24)
工程(a)が、前記第2の核酸を、第2のヌクレアーゼ剤及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記第2のヌクレアーゼ剤が、前記第2の核酸を切断して、前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第2のダイジェストされた核酸を産生し、前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目16〜23のいずれか一項に記載の方法。(項目25)
工程(a)が、前記第2の核酸を、制限酵素又はメガヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記制限酵素又はメガヌクレアーゼが、前記第2の核酸を切断して、前記結合体オリゴにおける前記第2の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第2のダイジェストされた核酸を産生し、前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目16〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
工程(b)が、前記第1のダイジェストされた核酸及び/又は前記第2のダイジェストされた核酸の3’末端を伸長することを更に含む、項目24又は25に記載の方法。
(項目27)
前記結合体オリゴが、同じ反応において、前記第1の核酸及び前記第2の核酸にアセンブルされる、項目16〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記結合体オリゴが、連続的に前記第1の核酸及び前記第2の核酸にアセンブルされる、項目16〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記少なくとも1つの前記第1のヌクレアーゼ剤及び/又は前記第2のヌクレアーゼ剤が、前記第1又は前記第2の標的部位を標的とする、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む、項目24〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記第1のヌクレアーゼ剤及び前記第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含み、
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質であり、前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含み、前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目10〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、又はこれらの組み合わせを含む、項目10〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、少なくとも10kbである、項目10〜33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記結合体オリゴが、直鎖状2本鎖DNA断片を含む、項目16〜34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記直鎖状2本鎖DNA断片が、選択カセットを含まない、項目35に記載の方法。
(項目37)
2つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を少なくとも1つのヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を生成することと、
(b)第2の核酸を第2のヌクレアーゼ剤と接触させて第2のダイジェストされた核酸を生成することと、
(c)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2のダイジェストされた核酸を、結合体オリゴ及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
(i)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)スペーサーと、
(iii)前記第2のダイジェストされた核酸に相補的である第2の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第1及び第2の相補的配列を曝露する、接触させることと、
(d)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2のダイジェストされた核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、コード化された、及びコード化されないアミノ酸、並びに化学的に若しくは生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。本用語はまた、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなど、修飾されたポリマーも含む。
for Unix(登録商標),Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)を使用して(デフォルト設定を使用、これは、Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482〜489)のアルゴリズムを使用する)、慣用的に決定され得る。
核酸をアセンブルする従来の方法は、制限酵素を用いた従来の酵素ダイジェスト、核酸のクローニング、及び核酸を一緒にライゲーションする、時間を要する工程を採用する(従来の方法及び時系列の例示については図3及び図4を参照されたい)。これらの方法は、大きい断片又はベクターが一緒にアセンブルされるとき、より困難となる。本明細書に提供される方法は、核酸を、迅速なアセンブリ反応において使用するのに適した形態に変換するために、ヌクレアーゼ(例えば、ガイドRNA及びCas9ヌクレアーゼ)の柔軟な標的特異性を利用する。
本方法は、ポリヌクレオチドの部位指向性切断に、ヌクレアーゼ剤を用いる。具体的に、特定された標的部位でのポリヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ切断は、後に第2のポリヌクレオチドに結合されて、部位特異的様式で2つ以上のポリヌクレオチドをアセンブルすることができる末端を伴ってダイジェストされたポリヌクレオチドを産生する。
A1号、同第2005/0064474 A1号、同第2006/0188987 A1号、及び同第2006/0063231 A1号に開示されている(それぞれ参照により本明細書に組み込まれる)。様々な実施形態では、TALエフェクターヌクレアーゼ、例えば、関心のゲノム遺伝子座の標的核酸配列又はその付近で切り離されるように操作され、この標的核酸配列は標的ベクターにより修飾される配列又はその付近にある。本明細書に提供される様々な方法及び組成物と共に使用するのに好適なTALヌクレアーゼは、本明細書に記載される、標的ベクターにより修飾される標的核酸配列又はその付近で結合するように具体的に設計されるものを含む。
本方法は、核酸の部位指向性切断に、CRISPR/Cas系(例えば、gRNA−Cas複合体)を採用し得る。具体的には、特定された標的部位にgRNAにより指向された核酸のCas切断は、後に、部位特異的様式で2つ以上の核酸をアセンブルするために第2の核酸に結合され得る末端を伴ってダイジェストされた核酸を産生する。
Casタンパク質は一般的に、少なくとも1つのRNA認識又は結合ドメインを含む。このようなドメインは、ガイドRNA(gRNA、以下により詳細に記載される)と相互作用し得る。Casタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン(例えば、DNase又はRNaseドメイン)、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインも含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断のための触媒活性を有する。切断は、核酸分子の共有結合の破断を含む。切断は、平滑末端又はねじれ末端を産生することができ、1本鎖又は2本鎖であり得る。
「ガイドRNA」又は「gRNA」は、Casタンパク質に結合し、Casタンパク質を標的DNA内の特定の位置に誘導する、RNA分子を含む。ガイドRNA(gRNA)は、「DNA標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」の2つのセグメントを含み得る。「セグメント」は、RNAにおけるヌクレオチドの連続的ストレッチなど、分子のセグメント、部分、又は領域を含む。いくつかのgRNAは、2つの別個のRNA分子:「活性化因子RNA」及び「標的因子(targeter)RNA」を含む。他のgRNAは、単一RNA分子(単一RNAポリヌクレオチド)であり、これは、「単一分子gRNA」、「単一ガイドRNA」、又は「sgRNA」と呼ばれる場合もある。例えば、国際公開第WO/2013/176772A1号、第WO/2014/065596A1号、第WO/2014/089290A1号、第WO/2014/093622A2号、第WO/2014/099750A2号、第WO/2013142578A1号、及び第WO2014/131833A1号を参照されたい(これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる)。用語「ガイドRNA」及び「gRNA」は、2重分子gRNA及び単一分子gRNAの両方を含む。
を形成する配列)、RNAを細胞内位置(例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など)に誘導する修飾又は配列、追跡を提供する修飾又は配列(例えば、蛍光分子への直接抱合、蛍光検出を容易にする部分への抱合、蛍光検出を可能にする配列など)、タンパク質に結合部位を提供する修飾又は配列(例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含むDNAに作用するタンパク質)、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
用語「CRISPR RNA認識配列」は、gRNAのDNA標的化セグメントが結合する標的DNAに存在する核酸配列を含むが、但し、結合のための十分な条件が存在することを条件とする。例えば、CRISPR RNA認識配列は、ガイドRNAが相補性を有するように設計される配列を含み、CRISPR RNA認識配列とDNA標的化配列との間のハイブリダイズは、CRISPR複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではないが、但し、ハイブリダイゼーションをもたらし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在することを条件とする。CRISPR RNA認識配列は、以下により詳細に記載される、Casタンパク質の切断部位も含む。CRISPR RNA認識配列は、例えば、ミトコンドリア又は葉緑体など、細胞の核若しくは細胞質に、又は細胞の細胞小器官内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含み得る。
RNA認識配列の直ぐ5’である)であろう。いくつかの場合では、N1及びN2は相補的であり、N1−N2塩基対は、任意の塩基対(例えば、N1=C及びN2=G、N1=G及びN2=C、N1=A及びN2=T、N1=T及びN2=A)であり得る。
本明細書に開示される方法は、DNA分子を結合して実質的に無傷若しくはシームレスな2本鎖DNA分子を形成するのに十分な条件下で、少なくとも2つの核酸をアセンブルすることができる。オーバーラップ配列を有する関心の任意の核酸は、本明細書に開示される方法に従いアセンブルされ得る。例えば、自然に生じるDNA、クローン化DNA分子、合成的に生成されたDNAなどを含む、オーバーラップ配列を有する関心の任意のDNA分子をアセンブルすることができる。結合されたDNA分子は、所望する場合、本発明の方法を使用して、ベクターにクローン化される(例えば、挿入される)。2つの核酸のアセンブルは、2つの核酸の鎖を結合する任意の方法を含む。例えば、アセンブリは、各核酸からの鎖が他方とアニーリングするように、ダイジェストされた核酸を結合すること、及び伸長を含み、ここで、各鎖は、他方の伸長のための鋳型として機能する。
人工crRNA及び人工tracrRNAを、3kb PCR産物(UB−HYG)とのアセンブリのために、MAID 6177(116kb LTVEC)において特定の配列を標的とするように設計した。PCR産物は、ベクターとの50bpのオーバーラップを含有していた。最初に、crRNA及びtracrRNAをDuplex緩衝液(30mM HEPES、pH7.5、100mM酢酸カリウム)中100uMに溶解する。RNAをアニーリングするために、10ulの100uM crRNA及び10ulの100uM tracrRNAを80ulのアニーリング緩衝液に添加した。90℃の温度のブロックにおいてRNAを加熱し、次に、ヒーターからブロックを取り出し、ベンチ上で冷却する。RNAの最終濃度は約10uMである。
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(配列番号9)である。このCRISPR RNA(crRNA)は、(1)標的配列に相補的なRNAの約20のヌクレオチド、及び(2)tracrRNAにアニーリングされるテイル配列(GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号10))を含有する。
人工crRNA及び人工tracrRNAを、ヒト化HLA−DR BACとのアセンブリのために、ヒト化HLA−DQ BACにおいて特定の配列を標的とするように設計した。ベクターは、各ベクター上の2つの部位でCas9切断により作製された、互いに約70bpのオーバーラップを含有していた(図2を参照)。crRNA及びtracrRNAをHybe緩衝液中100uMに溶解する。RNAをアニーリングするために、10ulの100uM crRNA及び10ulの100uM tracrRNAを80ulのアニーリング緩衝液に添加した。90℃の加熱ブロックにRNAを設置し、次に、ヒーターからブロックを取り出し、ベンチ上で冷却する。RNAの最終濃度は約10uMである。
標的化ベクターを構築するために、pMJ8502xを、2つの同一のcrRNAで切断して、400bp断片及び2283bp Amp骨格を取り出した。(図7)。全反応物の精製には、Qiagenカラムを使用した。次に、R6KZenUbiNeoを、2つの異なるcrRNAで切断して、Neo耐性(1086bp)及び骨格(5390bp)に分離した。全反応物の精製には、Qiagenカラムを使用した。(図7)。切断反応:1170ngのDNA、30ulの緩衝液、4ulのアニーリングしたRNA(100uM)、1.7ulのCas9(0.89ng/ul)、60ulまでのH2O。混合物を37℃で1時間インキュベートし、30ulの溶出緩衝液において溶出する前に、Qiagenカラムで精製した。
ノックアウトマウス標的化ベクターを構築するために、40kbのBAC標的化ベクターを、組換え認識部位に隣接する選択カセットに置き換えた。(図8)。mBACから関心の領域を除去し、選択カセットを挿入するように2つのリンカー(1つは5’用、そして1つは3’用)を設計した。リンカーは、mBACに対する40bpのオーバーラップ、及び選択カセットに対する40bpのオーバーラップを有していた。最初に、以下の反応により、206kbの標的化ベクター(mBAC)のうちの39.5kbを切断した。500ulの反応物(H2Oで増やす):1ulのCas9(0.89ug/ul)、各RNA2本鎖を2ulずつ(50uM)、250ulの緩衝液、220ul(12.5ng)のBAC maxi prepを添加し、37℃で1時間インキュベートする。ダイジェストしたDNAを、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(PCI)抽出を介して精製し、次に、55ulのTE緩衝液に再懸濁した。mBAC切断のPCIクリーンアップ後、50℃で1時間アセンブリを行い、10ulの反応物をDH10B細胞内に電気穿孔した。(図9)。接合部にわたる配列決定により正しいアセンブリが確認された。(図10)。リンカー1(結合体オリゴ1)は、mBAC配列からカセット配列までシームレスである(配列番号12)。リンカー2(結合体オリゴ2)は、カセット配列からmBAC配列までシームレスである(配列番号13)。
Crispr RNA(crRNA)(ssRNAとして注文)は、(1)切断のための標的領域に相補的であるRNAの20ヌクレオチド、及び(2)tracr RNA:<20nt crisprRNA>GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号10)にアニーリングするテイルを含有する。
2X切断緩衝液は、40mM HEPES pH7.5(最終=20mM)、300mM KCl(最終=150mM)、1mM DTT(最終=0.5mM)、0.2mM EDTA(最終=0.1mM)、20mM MgCl2(最終=10mM)を含有する。
ヒト化標的化ベクターを構築するために、MAID 6236を、gRNA−Cas複合体で切断してオーバーラップ配列を伴う切断された断片を生成した。VI568もgRNA−Cas複合体で切断して、MAID6236の断片とオーバーラップする配列を生成した。Cas9/等温アセンブリを、上述のように行い、結果としてヒト化遺伝子座がベクター(VI599)内に挿入された。このプロセスは図14に概説される。
Cas9ダイジェスト及びアセンブリは、選択なしで、例えば、gBlock DNA断片を利用することにより行うこともできる。選択カセットなしで2本鎖DNAを遺伝子座内に追加する可能性を試験するために、gBlock DNA断片を合成し、構築物内に挿入した。図15A及びBに概説するように、Cas9/gRNAを、4.4kbの断片を除去するために、TCRベータ遺伝子座内の2つの部位を標的とするように設計した。gBlockを、メガヌクレアーゼ認識部位を構築物内に導入するように設計した。gBlockは、選択マーカーを使用することなく、構築物内に挿入することができた。図15Aは、PISceI gBlockの挿入を示し、図15Bは、MauBI gBlockの挿入を示す。
図16は、Cas9/等温アセンブリ及び結合体オリゴを使用した直接ヒト化の例を提供する。ヒト断片及びマウス欠失を、Cas9により取り出す(各BACは2つのcrispr RNAを使用する)。ヒト断片及びマウス骨格を、3つのリンカー(結合体オリゴ)及び選択カセットを用いてギブソンアセンブリ反応において一緒に連結させる。
図18は、点変異を導入するためにCas9/等温アセンブリを利用する例を提供する。ドナーは、従来のクローニングにより作製される。選択カセットを、リンカーオーバーラップ及び点変異を含有する合成DNA断片内に挿入する。mBACをCas9で切断し、配列をmBACから除去し、mBACをドナーにギブソンアセンブルし、点変異及び選択カセットを含む構築物(LTVEC)を得る。
図19は、Cas9/等温アセンブリ法を使用したBACトリミングの例を提供する。LTVECから除去する必要がある領域を、Cas9を使用してトリミングする。この例では、BACトリミングによりOri配列を除去する。2つのリンカー(結合体オリゴ)を使用してギブソンアセンブリ反応において、Oriを置き換えられる。
本明細書に提供される方法において以下を含む他の方法が使用され得る。合成又はインビトロ転写tracrRNA及びcrRNAを、95℃に加熱し、室温にゆっくり冷却することにより反応前に予備アニーリングした。10mM MgCl2を含む又は含まないCas9プラスミド切断緩衝液(20mM HEPES(pH7.5)、150mM KCl、0.5mM DTT、0.1mM EDTA)中の精製したCas9タンパク質(50〜500nM)及びtracrRNA:crRNA2本鎖(50〜500nM、1:1)と共に、未変性の又は直線化されたプラスミドDNA(300ng(約8nM))を37℃で60分間インキュベートした。250mM EDTAを含有する5倍DNAローディング緩衝液で反応を停止させ、0.8又は1%アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。Cas9突然変異切断アッセイに関しては、アガロースゲルに充填する前に反応を5倍SDSローティング緩衝液(30%グリセロール、1.2% SDS、250mM EDTA)で停止させた。
NAD、0.02U/μl T5エキソヌクレアーゼ、4U/μl Taq DNAリガーゼ、及び0.03U/μlのPHUSION DNAポリメラーゼの最終濃度が得られた。
本明細書に提供される方法において以下を含む他の方法が使用され得る。合成又はインビトロ転写tracrRNA及びcrRNAを、95℃に加熱し、室温にゆっくり冷却することにより反応前に予備アニーリングした。10mM MgCl2を含む又は含まないCas9プラスミド切断緩衝液(20mM HEPES(pH7.5)、150mM KCl、0.5mM DTT、0.1mM EDTA)中の精製したCas9タンパク質(50〜500nM)及びtracrRNA:crRNA2本鎖(50〜500nM、1:1)と共に、未変性の又は直線化されたプラスミドDNA(300ng(約8nM))を37℃で60分間インキュベートした。250mM EDTAを含有する5倍DNAローディング緩衝液で反応を停止させ、0.8又は1%アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。Cas9突然変異切断アッセイに関しては、アガロースゲルに充填する前に反応を5倍SDSローティング緩衝液(30%グリセロール、1.2% SDS、250mM EDTA)で停止させた。
本明細書に提供される方法において以下を含む他の方法が使用され得る。crRNA及びtracrRNAを、Hybe緩衝液(10X緩衝液:20mMトリス(7.5)、100〜150mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM EDTA、100ug/ml BSA)中100uMに溶解する。RNAをアニーリングするために、10ulの100uM crRNA及び10ulの100uM tracrRNAを80ulのアニーリング緩衝液に添加した。90℃の温度ブロックにおいてRNAを加熱し、次に、ヒーターからブロックを取り出し、ベンチ上で冷却する。RNAの最終濃度は約10uMである。
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(配列番号9)である。このCRISPR RNA(crRNA)は、(1)標的配列に相補的なRNAの約20ヌクレオチド、及び(2)tracrRNAにアニーリングされるテイル配列(GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号10))を含有する。
(項目1)
少なくとも2つの核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を第1のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第1のヌクレアーゼ剤が、第1の標的部位で前記第1の核酸を切断して、第1のダイジェストされた核酸を、前記第1のダイジェストされた核酸と第2の核酸との間におけるオーバーラップ末端配列を伴って産生する、接触させることと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸をエキソヌクレアーゼと接触させて、前記第1のダイジェストされた核酸と前記第2の核酸との間の相補的配列を曝露することと、
(c)工程(b)から生成された2つの核酸断片をアセンブルすることと、を含む、方法。
(項目2)
工程(c)が、
(i)前記曝露された相補的配列をアニーリングすることと、
(ii)前記アニーリングした相補的配列の3’末端を伸長することと、
(iii)前記第1及び前記第2の核酸をライゲーションすることと、を更に含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
工程(a)が、前記第2の核酸を第2のヌクレアーゼ剤と接触させることを更に含み、前記第2の核酸が、前記オーバーラップ末端配列を含まず、前記第2のヌクレアーゼ剤が、第2の標的部位で前記第2の核酸を切断して、第2のダイジェストされた核酸を、前記第1のダイジェストされた核酸と前記第2のダイジェストされた核酸との間における前記オーバーラップ末端配列を伴って産生し、かつ
工程(b)の前記第2の核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸である、項目1又は2に記載の方法。
(項目4)
前記第1又は第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、前記第1又は前記第2の標的部位を標的とする、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含む、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記オーバーラップ末端配列が、20bp〜200bpの長さの範囲である、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含む、項目4〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記第1の標的部位及び第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目4〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記第1、前記第2、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目1〜10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記細菌人工染色体が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、又はこれらの組み合わせを含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記細菌人工染色体が、ヒト配列を含む、項目11又は12に記載の方法。
(項目14)
少なくとも2つの核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を、第1のヌクレアーゼ剤及び第2のヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を産生することであって、前記第1のヌクレアーゼ剤が、第1の標的部位で前記第1の核酸の第1の鎖上に切れ目を生成し、前記第2のヌクレアーゼ剤が、第2の標的部位で前記第1の核酸の第2の鎖上に切れ目を生成して、その両端のうちの1つに5’又は3’オーバーハング配列を含む第1のダイジェストされた核酸を産生する、産生することと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記5’又は3’オーバーハング配列に対する相補的配列を含む第2の核酸をアニーリングすることと、
(c)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸をライゲーションすることと、を含む、方法。
(項目15)
工程(b)が、前記第2の鎖を鋳型として使用して前記第1の鎖の3’末端を伸長することと、前記第1の鎖を鋳型として使用して前記第2の鎖の3’末端を伸長することと、を更に含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記第1又は第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、前記第1又は前記第2の標的部位を標的とする、Cas9タンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含む、項目13又は14に記載の方法。
(項目17)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記第1の標的部位が、前記第2の標的部位から少なくとも4bp離れている、項目14〜17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)
をコードする核酸配列を含む、項目14〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記第1の標的部位及び第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目14〜19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
2つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を少なくとも1つのヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を生成することと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸を第2の核酸、結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
(i)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)スペーサーと、
(iii)前記第2の核酸に相補的である第2の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第1及び第2の相補的配列を曝露する、接触させることと、
(c)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
(項目22)
工程(c)におけるアセンブルが、
(i)前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列を前記第1のダイジェストされた核酸に、及び前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列を前記第2の核酸にアニーリングすることと、
(ii)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸にライゲーションすることと、を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列が、15〜120の相補的塩基を含む、項目21又は22に記載の方法。
(項目24)
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、非相補的核酸を含む、項目21〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2の核酸にシームレスにアセンブルされる、項目21〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記ヌクレアーゼ剤が、前記第1の核酸の末端から少なくとも20bpの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも20bpの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第1の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第2の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、
したがって、前記第1の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第2核酸とのアセンブリが、前記少なくとも20bpの断片を再構築し、前記第1及び第2の核酸をシームレスにアセンブルする、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記ヌクレアーゼ剤が、前記第2の核酸の末端から少なくとも20bpの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも20bpの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第1の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第2の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、
したがって、前記第1の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第2の核酸とのアセンブリが、前記少なくとも20bpの断片を再構築し、前記第1及び第2の核酸をシームレスにアセンブルする、項目25に記載の方法。
(項目28)
前記スペーサーが、約20bp〜約120bpから構成される、項目26又は27に記載の方法。
(項目29)
工程(a)が、前記第2の核酸を、第2のヌクレアーゼ剤及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記第2のgRNA−Cas複合体が、前記第2の核酸を切断して、前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第2のダイジェストされた核酸を産生し、前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目21〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
工程(a)が、前記第2の核酸を、制限酵素又はメガヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記制限酵素又はメガヌクレアーゼが、前記第2の核酸を切断して、前記結合体オリゴにおける前記第2の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第2のダイジェストされた核酸を産生し、前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目21〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
工程(b)が、前記第1及び/又は前記第2のダイジェストされた核酸の3’末端を伸長することを更に含む、項目21〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記結合体オリゴが、同じ反応において、前記第1の核酸及び前記第2の核酸にアセンブルされる、項目21〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記結合体オリゴが、前記第1の核酸及び前記第2の核酸に連続してアセンブルされる、項目21〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記少なくとも1つのヌクレアーゼ剤及び/又は前記第2のヌクレアーゼ剤が、前記第1又は前記第2の標的部位を標的とする、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含む、項目21〜33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含む、項目34〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記第1の標的部位及び第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目34〜37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記少なくとも1つのヌクレアーゼ剤及び/又は前記第2のヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む、項目21〜33のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記第1、前記第2、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目14〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記細菌人工染色体が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、又はこれらの組み合わせを含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記細菌人工染色体が、ヒトポリヌクレオチド配列を含む、項目40又は41に記載の方法。
(項目43)
前記第1、前記第2、又は両方の核酸が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、又はこれらの組み合わせを含む、項目14〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記第1、前記第2、又は両方の核酸が、少なくとも10kbである、項目21〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記結合体オリゴが、gBlockを含む、項目21〜44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記gBlockが、選択カセットを含まない、項目45に記載の方法。
(項目47)
2つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を少なくとも1つのヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を生成することと、
(b)第2の核酸を第2のヌクレアーゼ剤と接触させて第2のダイジェストされた核酸を生成することと、
(c)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2のダイジェストされた核酸を、結合体オリゴ及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
(i)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)スペーサーと、
(iii)前記第2のダイジェストされた核酸に相補的である第2の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第1及び第2の相補的配列を曝露する、接触させることと、
(d)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
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- 本明細書に記載の発明。
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