CN117987436A - 一种双链靶dna序列的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种双链靶DNA序列的制备方法，首先，设计DNA质粒，质粒包含靶DNA序列和非靶DNA序列，靶DNA序列两端插入归位内切酶识别序列，非靶DNA序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列；然后分别用归位内切酶和辅助内切酶切割质粒，得到靶DNA序列短片段和非靶DNA序列短片段的混合物；最后采用DNA水解酶水解混合物中的非靶DNA序列短片段，得到靶DNA序列。本申请提供的方法，可以有效酶切质粒，消化非靶基因序列片段并保留靶基因序列片段，最后经过纯化制备靶基因序列片段，能有效解决大规模制备靶基因序列片段的问题。

Description

一种双链靶DNA序列的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种双链靶DNA序列的制备方法及对应的质粒。

背景技术

质粒DNA作为基因传递的载体，已在传染病预防疫苗、肿瘤治疗、蛋白质替代治疗等领域得到应用。重组质粒由复制起始位点（Originofreplication，ORI）、抗性基因（resistance gene）、靶基因表达元件和多克隆位点（multiplecloningsite,MCS）组成。靶基因表达元件由启动子序列（promoter）、稳定mRNA结构的内含子序列、编码靶蛋白的CDS序列、PolyA序列等组成。在患者体内直接使用治疗性质粒DNA面临着各种挑战，如质粒DNA有整合到靶细胞基因组的风险，会触发原癌基因的活性或抑制肿瘤抑制基因；此外，存在于质粒DNA序列上的CpG基序(一类以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为核心的序列)可能具有免疫刺激作用，存在于人体内的细菌可能会发生质粒转化，导致质粒DNA复制，从而使体内的细菌携带耐药元素并产生耐药性。因此，在临床使用治疗性质粒时，应尽可能酶切去除细菌来源的DNA序列，防止患者在治疗过程中出现并发症，但是，质粒酶切后会产生靶基因序列片段与非靶基因序列片段，而大规模分离性质相同的靶基因序列片段与非靶基因序列片段的工艺是不成熟的，也是目前工业界面临的主要问题。

发明内容

本发明提供一种双链靶DNA序列（dsDNA）的制备方法，可以有效酶切质粒，消化非靶基因序列片段并保留靶基因序列片段，最后经过纯化制备靶基因序列片段，能有效解决大规模制备靶基因序列片段的问题。

在一方面，本发明提供一种双链靶DNA序列的制备方法，包含以下步骤：

S1：设计DNA质粒模板，质粒模板包含靶DNA序列和非靶DNA序列，靶DNA序列两端插入归位内切酶识别序列，非靶DNA序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列；

本申请所涉及的质粒，是一种双链的DNA质粒，包括承载目的基因片段的靶DNA序列，以及不包含任何目的基因片段的非靶DNA序列，质粒中除目的片段以外的其他序列均可视为非靶DNA序列。

在一些实施方式中，质粒上的靶DNA序列可以是一个，也可以是多个，具体地，可以是两个、三个、或四个。在一些实施方式中，质粒上的非靶DNA序列可以是一个，也可以是多个，具体地，可以是两个、三个、或四个。

在靶DNA序列的两端分别插入归位内切酶识别序列，归位内切酶识别序列可以被归位内切酶识别并切割。在一些实施方式中，归位内切酶选自PI-SceI、I-CeuI或PI-PspI中的一种或多种。

在非靶DNA序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列，具体地，可以是一个、两个、三个、四个或五个，辅助内切酶识别序列可以被辅助内切酶识别并切割。在一些实施方式中，辅助内切酶选自AseI、AgeI、AfeI、ApaI、AsiSI、AatII、 MluI、BamHI、BspEI、DraI、Eco53k、FspI、HindIII、KpnI、MfeI、NotI、NdeI、NruI、NsiI、PsiI、SalI、ScaI、SpeI、SphI、StuI、SmaI、SspI、TspMI、XhoI、XmaI或ZraI中的一种或多种。

在一些实施方式中，采用化学法合成DNA质粒模板，在另一些实施方式中，也可用其他常规方法制备质粒模板。

在一些实施方式中，非靶DNA序列的内部插入一个辅助内切酶识别序列。在一些实施方式中，非靶DNA序列的内部插入两个辅助内切酶识别序列。

S2：复制DNA质粒模板，得到DNA质粒，分别用归位内切酶和辅助内切酶切割DNA质粒，得到靶DNA序列和非靶DNA序列短片段的混合物；

对DNA质粒模板进行复制，得到大量DNA质粒。复制方法例如可采用引入宿主菌后在宿主菌中随宿主菌生长复制。采用归位内切酶和辅助内切酶双酶切质粒，得到靶DNA序列短片段和非靶DNA序列短片段的混合物，其中，靶DNA序列由于两端设置的归位内切酶识别序列被归位内切酶识别并切割；非靶DNA序列由于内部插入至少一个辅助内切酶识别序列，因此被辅助内切酶切割，生成的短片段两端或者至少一端为辅助内切酶切割端。

在一些实施方式中，非靶DNA序列内部插入了一个辅助内切酶识别序列，质粒双酶切后产生一个靶DNA序列短片段和两个非靶DNA序列短片段。其中靶DNA序列短片段两端为归位内切酶切割端；非靶DNA序列短片段的一端为辅助内切酶切割端，另一端为归位内切酶切割端。

在一些实施方式中，非靶DNA序列内部插入了两个辅助内切酶识别序列，质粒双酶切后产生一个靶DNA序列短片段和三个非靶DNA序列短片段。其中靶DNA序列短片段两端为归位内切酶切割端；两个非靶DNA序列短片段的一端为辅助内切酶切割端，另一端为归位内切酶切割端；一个非靶DNA序列短片段的两端均为辅助内切酶切割端。

S3：采用DNA水解酶水解混合物中的包括非靶DNA序列的短片段，得到双链靶DNA序列；

上一步获得的混合物中包含靶DNA序列短片段和非靶DNA序列短片段，向混合物中加入DNA水解酶，水解酶会水解掉非靶DNA序列短片段，从而留下靶DNA序列短片段。具体地，水解酶选自核酸外切酶 III（Exonuclease III）、T5 核酸外切酶（T5 Exonuclease）、T7 核酸外切酶（T7 Exonuclease）或λ核酸外切酶（Lambda Exonuclease）中的一种或多种。

质粒的双酶切及水解过程可参照图1，将同一归位内切酶序列插入到质粒DNA靶基因序列的两端，同时将两辅助内切酶序列插入到质粒DNA的非靶向基因序列中间（如图1中的a所示）。后使用归位内切酶和辅助内切酶对质粒同时进行双酶切反应，质粒酶切后会得到两端均为归位酶切割端的靶基因序列片段，一端有归位内切酶切割端和一端有辅助内切酶切割端的非靶基因序列片段，以及两端均为辅助内切酶切割端的非靶基因序列片段（如图1中的b所示）。后直接使用水解酶消化非靶基因序列片段，水解酶消化后剩余两端均为归位酶序列的靶基因序列片段（如图1中的c所示），最后经过纯化得到靶基因序列片段（如图1中的d所示）。

在另一方面，本发明还提供一种质粒，质粒包含靶DNA序列和非靶DNA序列，靶DNA序列的两端均插入归位内切酶识别序列，非靶DNA序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列。在一些实施方式中，非靶DNA序列的内部插入两个辅助内切酶识别序列。

在另一方面，本发明还提供一种从质粒中获得靶DNA序列的方法，包含以下步骤：

a：分别采用归位内切酶和辅助内切酶切割所述质粒，得到包括靶DNA序列和非靶DNA序列短片段的混合物 。优选地，归位内切酶的比活性高于0.125 U/μg质粒，辅助内切酶的比活性高于0.25 U/μg质粒。

b：采用DNA水解酶水解混合物中的非靶DNA序列短片段，得到所述靶DNA序列。优选地，水解酶的比活性高于0.5 U/μg质粒。

本发明提供一种双链靶DNA序列的制备方法，首先，设计DNA质粒，质粒包含靶DNA序列和非靶DNA序列，靶DNA序列两端插入归位内切酶识别序列，非靶DNA序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列；其次，分别用归位内切酶和辅助内切酶切割所述质粒，得到靶DNA序列和非靶DNA序列短片段的混合物；最后，采用DNA水解酶水解混合物中的非靶DNA序列短片段，得到靶DNA序列。本申请提供的方法，可以有效酶切质粒，消化非靶基因序列片段并保留靶基因序列片段，最后经过纯化制备靶基因序列片段，能有效解决大规模制备靶基因序列片段的问题。

附图说明

图1：靶序列制备流程图。a：质粒示意图；b：双酶切后基因序列片段；c：水解酶特异性消化非靶序列片段后留下的dNTP和没有被水解的靶序列片段；d：纯化得到靶序列片段。

图2：质粒、质粒酶切混合物以及质粒酶切混合物水解产物的琼脂糖凝胶电泳检测示意图。1号泳道对应未进行水解（-）以及水解后（+）的原始质粒；2号泳道对应未进行水解（-）以及水解后（+）的A组实验混合物；3号泳道对应未进行水解（-）以及水解后（+）的B组实验混合物；4号泳道对应未进行水解（-）以及水解后（+）的C组实验混合物。

图3：靶DNA序列毛细管电泳检测示意图。

图4：质粒、质粒酶切混合物以及质粒酶切混合物水解产物的琼脂糖凝胶电泳检测示意图。1号泳道对应的原始质粒；2号泳道对应的双酶切后的实验混合物；3号泳道对应水解后的实验混合物。

图5：靶DNA序列毛细管电泳检测示意图。

图6：质粒、质粒酶切混合物以及质粒酶切混合物水解产物的琼脂糖凝胶电泳检测示意图。1号泳道对应的原始质粒；2号泳道对应的双酶切后的实验混合物；3号泳道对应水解后的实验混合物。

图7：靶DNA序列毛细管电泳检测示意图。

图8：质粒、质粒酶切混合物以及质粒酶切混合物水解产物的琼脂糖凝胶电泳检测示意图。1号泳道对应的原始质粒；2号泳道对应的双酶切后的实验混合物；3号泳道对应水解后的实验混合物。

图9：靶DNA序列毛细管电泳检测示意图。

图10：不同浓度的归位内切酶单酶切质粒琼脂糖凝胶电泳检测示意图。

图11：不同浓度的辅助内切酶单酶切质粒琼脂糖凝胶电泳检测示意图。

图12：不同浓度的水解酶水解质粒双酶切后的混合物的琼脂糖凝胶电泳检测示意图。

具体实施方式

为了对本发明的说明书中所使用的术语提供清楚且一致的理解，在下文中提供一些定义。此外，除了特殊说明，本发明所用的全部技术和科学术语具有同本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。

当在权利要求和/或说明书中与术语“包括”结合使用时，词语“一”的使用可以表示“一个”，但它也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的含义已知。类似地，词语“另一个”可以表示至少第二个或者很多个。

如在本说明书和权利要求中所使用的词语“包括”（以及包括的任何形式，诸如“包括”和“包含”），“具有”（以及任何形式的具有，“具有”、“包含”和“含有”）是包括性的和开放式的，并且不排除另外的未列出的要素或处理步骤。

质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的，少部分为RNA型。天然DNA质粒大都具有共价、封闭、环状的分子结构，其分子量范围：1-300 kb。本文所用“质粒”均指双链闭合的环形DNA质粒。

如本文所用，“靶DNA序列”或“靶DNA”或“靶序列”可互换使用，均指代感兴趣的目标双链DNA序列（dsDNA）。在一些实施方式中，感兴趣的目标序列可以是能够转录出具有生物学活性的RNA序列的DNA序列，在一些实施方式中，具有生物学活性的RNA序列包括但不限于基因编辑中使用的引导RNAs（如gRNA、sgRNA、crRNA、omegaRNA和pegRNA等），RNA编辑中使用的自招募RNA（arRNA），反义RNA，干扰RNA，微小RNA（microRNA），长链非编码RNA（lncRNA）和自放大RNA（saRNA）以及编码所需蛋白质如抗原的RNA等RNA序列中的一种或多种。

如本文所用，“内切酶识别序列”意指能够引起酶切作用的序列，包括例如可被归位内切酶或辅助内切酶靶向识别和定点切割的序列。

如本文所用，“归位内切酶”或“归巢内切酶”可互换使用，归位核酸内切酶(Meganuclease)是具有较大识别序列(12至40个碱基对的双链DNA序列)特征的脱氧核糖核酸内切酶，该酶的切割位点在任何给定的基因组中通常只出现一次。例如，被I-SceI归位内切酶识别的18个碱基对的序列平均需要一个人类基因组大小的二十倍的基因组才能被一次偶然发现。 因此，归位内切酶被认为是最特异性的天然限制酶。在一些实施方式中，归位内切酶切割后产生的DNA片段切割端会留下四个碱基突出。

如本文所用，“辅助内切酶”是指非归位内切酶的限制性内切酶，该辅助内切酶相较于归位内切酶识别序列较短，一般为4至6个碱基对的双链DNA序列，能够特异性识别DNA链的特定序列，然后进行定点切割。在一些实施方式中，辅助内切酶切割后产生的DNA片段切割端会留下四个以下的碱基突出，具体地，可以是三个、两个、一个或没有碱基突出的平末端。

实施例

通过参考以下实施例将更容易理解本发明，所述实施例用于说明本发明，而不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。

除非另有定义或上下文另有明确规定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。应当理解，与本文所述类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试。

尽管参照本发明的实施例详细描述了本发明，但提供这些实施例是为了说明而不是限制本发明。根据本发明原理能够得到的其它实施例均属于本发明权利要求所界定的范畴。

本发明中未作具体说明的实验方法，均根据《分子克隆实验指南》（第四版）J. 萨姆布鲁克一书中具体方法进行，或者按照相关产品说明书进行。当在本文中使用时，除非另有说明，否则本发明中的所有术语均应按照它们在本领域中已知的普通含义来理解。本发明中所用生物试剂，无特殊说明，均可以从商业途径获得。

实施例1：

质粒1的制备及切割。

1）质粒构建

设置质粒模板1，如图1中的a所示，质粒模板1包含靶DNA序列和非靶DNA序列的原始质粒，靶DNA序列与非靶DNA序列之间插入两个PI-SceI ( NEB, 货号：R0696S）识别序列，非靶DNA序列的中间插入两个AseI ( NEB, 货号：R0526L）识别序列，质粒模板通过化学合成获得，后转入大肠埃希菌S17-1Apir中复制、扩增、提取质粒(卡那毒素抗性)，获得质粒1，质粒1的具体序列如SEQ ID NO.1 所示。

SEQ ID NO.1 （其中加粗下划线序列为归位内切酶识别序列，斜体加粗下划线序列为辅助内切酶识别序列）

ccatttcattacctctttctccgcacccgacatagattaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgt attaat tcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacct attaat 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2）质粒的酶切

设置A、B、C三组实验，分别对质粒进行不同酶切体系的酶切，A组实验酶切体系如表1所示，采用归位内切酶与辅助内切酶双酶切质粒，得到的混合物包含靶序列片段和非靶序列片段，如图1中的b所示，其中靶序列片段的两端均为归位内切酶切割后留下的切割端，非靶序列的两端至少有一端是辅助内切酶切割后留下的切割端。酶切体系的温度为37 ℃，反应时间为4 h，得到酶切后的混合物。

表1 归位内切酶与辅助内切酶双酶切体系

B组实验酶切体系如表2所示，采用辅助内切酶单酶切质粒，得到的混合物包含两种片段，其中包含靶序列的片段与非靶序列的两端均为辅助内切酶切割后留下的切割端。

表2 辅助内切酶单酶切体系

C组实验酶切体系如表3所示，采用归位内切酶单酶切质粒，得到的混合物包含两种片段，其中靶序列片段与非靶序列的两端均为归位内切酶切割后留下的切割端。酶切体系的温度为37 ℃，反应时间为4 h，得到酶切后的混合物。

表3 归位内切酶单酶切体系

3）水解DNA

对质粒以及A、B、C三组实验酶切后的混合物使用核酸外切酶III（ExonucleaseIII） （NEB，M0545L）进行进一步的水解，核酸外切酶III（Exonuclease III） 能够消化水解至少一端被相应辅助内切酶酶切后的DNA片段，不能消化两端均被归位内切酶酶切后的DNA片段。因此，核酸外切酶III（Exonuclease III） 酶消化中能选择性的将非靶序列片段消化，而靶序列片段被保留。水解体系如下表4所示，反应温度为37 ℃，反应时间为1 h：

表4 水解体系

4）琼脂糖凝胶电泳检测

称量0.3 g琼脂糖（品牌：生工，货号：9012-36-6），加入到30 ml TAE（1×）（品牌：生工，货号：B548101-0500）中，微波加热溶化，加入3 μl GelRed（品牌：Biotium，货号：41003），混匀，倒入制胶板中，等待冷却凝固。取质粒的最终的水解产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定条带大小符合目的条带的大小，检测结果见图2。

1号泳道对应未进行水解（-）以及水解后（+）的原始质粒，由图2可知原始质粒并不会被水解酶直接水解掉。2号泳道对应未进行水解（-）以及水解后（+）的A组实验混合物，由图2中2号泳道结果可知原始质粒被切割成不同于质粒的靶序列片段和非靶序列片段，水解过程中非靶序列片段被水解掉，而靶序列片段并不会被水解酶直接水解掉。3号泳道对应未进行水解（-）以及水解后（+）的B组实验混合物，由图2中3号泳道结果可知原始质粒被切割成不同于质粒的含有靶序列的片段和非靶序列片段，水解过程中所有序列片段均被水解掉。4号泳道对应未进行水解（-）以及水解后（+）的C组实验混合物，由图2中4号泳道结果可知原始质粒被切割成不同于质粒的含有靶序列的片段和非靶序列片段，水解过程中所有序列片段均未被水解掉。总结可知：对于PI-SceI与AseI双酶切后质粒，水解酶可以完全消化两端为AseI酶切割端的序列以及一端为AseI酶切割端另一端为PI-SceI酶切割端的序列，但不能消化两端为PI-SceI酶切割端的序列。

5）目的DNA纯化

采用阴离子交换层析(AEX层析）纯化质粒水解后获得的线性靶DNA序列。AEX层析的目的是去除蛋白质，并进一步提高dsDNA 的纯度和质量。AEX层析选用Diamond QMustang（博格隆(上海)生物技术有限公司）填料，使用低盐上样，高盐洗脱的工艺，收集目的片段对应的洗脱峰，达到DNA纯化的目的。检测结果见图3。

实施例2：

双酶切质粒1及T7 核酸外切酶（T7 Exonuclease）水解。

1）水解DNA

由实施例1可知，质粒1双酶切后，水解酶能选择性的将非靶序列片段消化，而靶序列片段被保留。选择实施例1中的质粒1进行双酶切，酶切过程参照实施例1，进而选择T7 核酸外切酶（T7 Exonuclease）进行水解，水解体系如下表5所示，反应温度为37 ℃，反应时间为1 h：

表5 水解体系

2）琼脂糖凝胶电泳检测

称量0.3 g琼脂糖（品牌：生工，货号：9012-36-6），加入到30 ml TAE（1×）（品牌：生工，货号：B548101-0500）中，微波加热溶化，加入3 μl GelRed（品牌：Biotium，货号：41003），混匀，倒入制胶板中，等待冷却凝固。取质粒的最终的水解产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定条带大小符合目的条带的大小，检测结果见图4。

1号泳道对应的原始质粒。2号泳道对应的双酶切后的实验混合物，由图4中2号泳道结果可知原始质粒被切割成不同于质粒的靶序列片段和非靶序列片段。3号泳道对应水解后的实验混合物，由图4中3号泳道结果可知非靶序列片段被完全水解，但是靶序列的片段没有被水解。

3）目的DNA纯化

采用阴离子交换层析(AEX层析）纯化质粒水解后获得的线性靶DNA序列。AEX层析的目的是去除蛋白质，并进一步提高dsDNA 的纯度和质量。AEX层析选用Diamond QMustang（博格隆(上海)生物技术有限公司）填料，使用低盐上样，高盐洗脱的工艺，收集目的片段对应的洗脱峰，达到DNA纯化的目的。检测结果见图5。

实施例3：

质粒2的制备及切割

1）质粒构建

设置质粒模板2，质粒模板2包含靶DNA序列和非靶DNA序列的原始质粒，靶DNA序列与非靶DNA序列之间插入两个I-CeuI （NEB，R0699L）识别序列，非靶DNA序列的中间插入一个MluI （NEB，R3198L）识别序列，质粒模板通过化学合成获得，后转入大肠埃希菌S17-1Apir中复制、扩增、提取质粒(卡那毒素抗性)，获得质粒2，质粒2的具体序列如SEQ IDNO.2 所示。

SEQ ID NO.2 （其中加粗下划线序列为归位内切酶识别序列，斜体加粗下划线序列为辅助内切酶识别序列）

TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgttcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgtgcgaggcgaaatacgcgatcactgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacgatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccaggcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccataca ACGCGT aacgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgcgcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgaacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgtccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcgTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAgggctcctcagagagcctcggctaggtaggggagcggaactctggtgggaggggaggtgcggtacactggggggatgggtggctaggggggccgtctggtggcttgcgggggttgcctttcccgtgggaagtcgggaacataatgtttgttacgttgggagggaaaggggtggctggatgcaggcgggagggaggcccgccctgcggcaaccggagggggagggagaagggagcggaaaatgctcgaaaccggcggagccattgctctcgcagagggaggagcgcttccggctagcctcttgtcgccgattggccgtttctcctcccgccgtgtgtgaaaacacaaatggcgtattctggttggagtaaagctcctgtcagttacgccgtcgggagtacgcagccgcttagcgactctcgcgttgccccctgggtggggcgggtaggtaggtggggtgtagagatgctgggtgtgcgggcgcggccggcctcctgcggcgggaggggagggtcagtgaaatcggctctggcgcgggcgtcctcccaccctccccttccttcgggggagtcggtttacccgccgcctgcttgtcttcgacacctgattggctgtcgaagctgtgggaccgggcccttgctactggctcgagtctcacatgagcgaaaccactgcgcggggcgcgggggtggcggggaggcgggcgttggtacggtcctccccgaggccgagcgccgcagtgtctggccccgcgcccctgcgcaacgtggcaggaagcgcgcgctggaggcgggggcgggctgccggccgagacttctggatggcggcggccgcggctccgccccgggttcccaccgcctgaagggcgagacaagcccgacctgctacaggcactcgtgggggtgggggaggagcgggggtcggtccggctggtttgtgggtgggaggcgcttgttctccaaaaaccggcgcgagctgcaatcctgagggagctgcggtggaggaggtggagagaaggccgcacccttctgggcagggggaggggagtgccgcaatacctttatgggagttctctgctgcctcccgtcttgtaaggaccgccctgggcctggaagaagccctccctcctttcctcctcgcgtgatcactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacttaatacgactcactataaggagaataaactagtattcttctggtccccacagactcagagagaacccgccaccatgttcgtgttcctggtgctgctgcctctggtgtccagccagtgtgtgaacctgaccaccagaacacagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactaccacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgtttaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatatcgccgataccacagacgccgttagagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggaatctgcgccagctaccagacacagacaaacagccctcggagagccagaagcgtggccagccagagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgctgcctcctctgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagcaggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgatatcctgagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcacaggcagactgcagagcctccagacatacgtgacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatatgtgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacacagcggaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggacaagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgatatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctgaagggcgtgaaactgcactacacctgatgactcgagctggtactgcatgcacgcaatgctagctgcccctttcccgtcctgggtaccccgagtctcccccgacctcgggtcccaggtatgctcccacctccacctgccccactcaccacctctgctagttccagacacctcccaagcacgcagcaatgcagctcaaaacgcttagcctagccacacccccacgggaaacagcagtgattaacctttagcaataaacgaaagtttaactaagctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccacaccctggagctagcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcatatgactaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatgcatgaaaaccgcaacaaagccccaaaggctcttttcagagccacccactgaatttagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttggcgatcgcgatcatgaagctctctggcccattacatttcatttaactgcttgttttgttttatttattatatatttagctgaaagctaagtccaacaaaccatttttaaagatgtgcctgccttggacaacagtgaaagcaagcgttaatgagtttggatttcaaaaaaaaatgcataatgaattttagggaggtgagattccattaaactgttacaggagctacatagttaaatatatcagaacttgaatgaagaataggtctgtgtgatacaaatgaacccagcctaaatttctgtcctacaagttttcacttcctggaaacacttgattggaggagctctaagcatcatatcttgagttatagaaaacaatcacaaagtaagttttatcctgaggaattataataccaacattttaacaccaaatgctttttatattgctaatacagtatcttacacattttaattatctttttttttttttgagacggagtcttagtgtcacatactggattgcaatggcatgatcatggctcacgcagccttgacttcctgggctcaagtgatcctcctgcctcagcctcctgagtagctggaactacaggcacacgcttccatgcccagctaatttttttgtgttttttttttgtagagatgggtttttgctgtgctgcacaggttagaactcctgggctcaagtgatcttcctgccctaagcttcccaaagtcctgggattacaggtgtgagccaccgccctaggccattaaatatactttttaaaaagacccttatgtcagcgatcttcaggcct

2)质粒的酶切

采用归位内切酶与辅助内切酶双酶切质粒，得到的混合物包含靶序列片段和非靶序列片段，其中靶序列片段的两端均为归位内切酶切割后留下的切割端，非靶序列的两端有一端是辅助内切酶切割后留下的切割端。实验酶切体系如表6所示，酶切体系的温度为37℃，反应时间为4 h，得到酶切后的混合物。

表6 归位内切酶与辅助内切酶双酶切体系

3)水解DNA

对酶切后的混合物使用核酸外切酶 III（Exonuclease III ）（NEB，M0545L）进行进一步的水解。核酸外切酶 III（Exonuclease III ）（NEB，M0545L）能够消化水解至少一端被相应辅助内切酶酶切后的DNA片段，不能消化两端均被归位内切酶酶切后的DNA片段。因此，核酸外切酶 III（Exonuclease III） 酶消化中能选择性的将非靶序列片段消化，而靶序列片段被保留。水解体系如下表7所示，反应温度为37 ℃，反应时间为1 h：

表7 水解体系

4）琼脂糖凝胶电泳检测

称量0.3 g琼脂糖（品牌：生工，货号：9012-36-6），加入到30 ml TAE（1×）（品牌：生工，货号：B548101-0500）中，微波加热溶化，加入3 μl GelRed（品牌：Biotium，货号：41003），混匀，倒入制胶板中，等待冷却凝固。取质粒及质粒的最终的水解产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定条带大小符合目的条带的大小，检测结果见图6。

1号泳道对应的原始质粒。2号泳道对应的双酶切后的实验混合物，由图6中2号泳道结果可知原始质粒被切割成不同于质粒的靶序列片段和非靶序列片段。3号泳道对应水解后的实验混合物，由图6中3号泳道结果可知非靶序列片段倍完全水解，但是靶序列的片段没有被水解。总结可知：对于I-CeuI与MulI双酶切后质粒，水解酶可以完全消化一端为MulI酶切割端及另一端为I-CeuI酶切割端的非靶序列片段，但不能消化两端为I-CeuI酶切割端的靶序列片段。

5）目的DNA纯化

采用阴离子交换层析(AEX层析）纯化质粒水解后获得的线性靶DNA序列。AEX层析的目的是去除蛋白质，并进一步提高dsDNA 的纯度和质量。AEX层析选用Diamond QMustang（博格隆(上海)生物技术有限公司）填料，使用低盐上样，高盐洗脱的工艺，收集目的片段对应的洗脱峰，达到DNA纯化的目的。检测结果见图7。

实施例4：

质粒3的制备及切割。

1）质粒构建

设置质粒模板3，质粒模板3包含靶DNA序列和非靶DNA序列的原始质粒，靶DNA序列与非靶DNA序列之间插入两个PI-PspI（NEB，R0695S）识别序列，非靶DNA序列的中间插入两个MluI（NEB，R3198L）识别序列，质粒模板通过化学合成获得，后转入大肠埃希菌S17-1Apir中复制、扩增、提取质粒(卡那毒素抗性)，获得质粒3，质粒3的具体序列如SEQ ID NO.3 所示。

SEQ ID NO.3 （其中加粗下划线序列为归位内切酶识别序列，斜体加粗下划线序列为辅助内切酶识别序列）

TGGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGTttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgttcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaag ACGCGT gagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgtgcgaggcgaaatacgcgatcactgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacgatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccaggcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaaacgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgcgcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcg ACGCGT 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2）质粒的酶切

采用归位内切酶与辅助内切酶双酶切质粒，得到的混合物包含靶序列片段和非靶序列片段，其中靶序列片段的两端均为归位内切酶切割后留下的切割端，非靶序列的两端有一端是辅助内切酶切割后留下的切割端。实验酶切体系如表8所示，酶切体系的温度为37℃，反应时间为4 h，得到酶切后的混合物。

表8 归位内切酶与辅助内切酶双酶切体系

3）水解DNA

对酶切后的混合物使用核酸外切酶 III（Exonuclease III ）（NEB，M0545L）进行进一步的水解。核酸外切酶 III（Exonuclease III ）能够消化水解至少一端被相应辅助内切酶酶切后的DNA片段，不能消化两端均被归位内切酶酶切后的DNA片段。因此，核酸外切酶III（Exonuclease III） 酶消化中能选择性的将非靶序列片段消化，而靶序列片段被保留。水解体系如下表9所示，反应温度为37 ℃，反应时间为1 h：

表9 水解体系

4）琼脂糖凝胶电泳检测

称量0.3 g琼脂糖（品牌：生工，货号：9012-36-6），加入到30 ml TAE（1×）（品牌：生工，货号：B548101-0500）中，微波加热溶化，加入3 μl GelRed（品牌：Biotium，货号：41003），混匀，倒入制胶板中，等待冷却凝固。取质粒及质粒的最终的水解产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定条带大小符合目的条带的大小，检测结果见图8。

1号泳道对应的原始质粒。2号泳道对应的双酶切后的实验混合物，由图8中2号泳道结果可知原始质粒被切割成不同于质粒的靶序列片段和非靶序列片段。3号泳道对应水解后的实验混合物，由图8中3号泳道结果可知非靶序列片段倍完全水解，但是靶序列的片段没有被水解。总结可知：对于PI-pspI与MulI双酶切后质粒，水解酶可以完全消化两端均为MulI酶切割端以及一端为MulI酶切割端另一端为PI-SceI酶切割端的非靶序列片段，但不能消化两端为PI-pspI酶切割端的靶序列片段。

5）目的DNA纯化

采用阴离子交换层析(AEX层析）纯化质粒水解后获得的线性靶DNA序列。AEX层析的目的是去除蛋白质，并进一步提高dsDNA 的纯度和质量。AEX层析选用Diamond QMustang（博格隆(上海)生物技术有限公司）填料，使用低盐上样，高盐洗脱的工艺，收集目的片段对应的洗脱峰，达到DNA纯化的目的。检测结果见图9。

实施例5：

归位内切酶使用浓度测试。

设置五组实验对质粒进行双酶切，双酶切体系中归位内切酶使用量浓度梯度为0.0625 U/μg质粒、0.125 U/μg质粒、0.25 U/μg质粒、0.5 U/μg质粒、1 U/μg质粒，其他实验过程参照实施例1表1。对酶切物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图10。

由图10可知，0.125 U/μg质粒的浓度不能完全酶切质粒，0.25 U/μg质粒及以上的浓度可以完全酶切质粒。

实施例6：

辅助内切酶使用浓度测试。

设置五组实验对质粒进行双酶切，双酶切体系中辅助内切酶使用量浓度梯度为0.125 U/μg质粒、0.25 U/μg质粒、0.5 U/μg质粒、1 U/μg质粒、2 U/μg质粒，其他实验过程参照实施例1表1。对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图11。

由图11可知，0.25 U/μg质粒的浓度不能完全酶切质粒，0.5 U/μg质粒及以上的浓度可以完全酶切质粒。

实施例7：

水解酶使用浓度测试。

设置五组实验对A组实验质粒双酶切后的混合产物进行水解，水解体系中水解酶使用量浓度梯度为0 U/μg质粒、0.25 U/μg质粒、0.1 U/μg质粒、2 U/μg质粒、4 U/μg质粒，其他实验过程参照实施例1表4。对最终的水解产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图12。

由图12可知，1 U/μg质粒的浓度不能完全消化非靶基因序列片段，2 U/μg质粒及以上的浓度可以完全消化非靶基因序列片段。

综上所述，使用归位内切酶和辅助内切酶对质粒同时进行双酶切或者多酶切反应，质粒酶切后会得到两端均为归位内切酶切割端的靶基因序列片段，一端为归位内切酶切割端和一端为辅助内切酶切割端的非靶基因序列片段，以及两端均为辅助内切酶切割端的非靶基因序列片段；水解酶特异性消化有辅助内切酶切割端的非靶基因序列片段，剩余两端均为归位酶切割端的靶基因序列片段，纯化后得到靶基因序列片段。本方法简单高效，能有效解决大规模制备靶基因序列片段的问题。

尽管参照本发明的实施例详细描述了本发明，但提供这些实施例是为了说明而不是限制本发明。根据本发明原理能够得到的其它实施例均属于本发明权利要求所界定的范畴。

Claims (10)

1.一种双链靶DNA序列的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1：设计DNA质粒模板，所述质粒模板包含靶DNA序列和非靶DNA序列，所述靶DNA序列两端插入归位内切酶识别序列，所述非靶DNA序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列；

S2：复制所述DNA质粒模板，得到DNA质粒，分别用所述归位内切酶和所述辅助内切酶切割所述DNA质粒，得到所述靶DNA序列和所述非靶DNA序列短片段的混合物；

S3：采用DNA水解酶水解所述混合物中的所述非靶DNA序列短片段，得到所述靶DNA序列。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述归位内切酶选自PI-SceI、I-CeuI或PI-PspI中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述辅助内切酶选自AseI、AgeI、AfeI、ApaI、AsiSI、AatII、 MluI、BamHI、BspEI、DraI、Eco53k、FspI、HindIII、KpnI、MfeI、NotI、NdeI、NruI、NsiI、PsiI、SalI、ScaI、SpeI、SphI、StuI、SmaI、SspI、TspMI、XhoI、XmaI或ZraI中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水解酶选自核酸外切酶 III、T5核酸外切酶、T7 核酸外切酶或λ核酸外切酶中的一种或多种。

5.一种质粒，其特征在于，包含靶DNA序列和非靶DNA序列，所述靶DNA序列的两端均插入归位内切酶识别序列，所述非靶DNA序列的内部插入至少一个辅助内切酶识别序列。

6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，所述非靶DNA序列的内部插入两个辅助内切酶识别序列。

7.一种从权利要求5或权利要求6所述的质粒中获得靶DNA序列的方法，其特征在于，包含以下步骤：

a：分别采用所述归位内切酶和辅助内切酶切割所述质粒，得到所述靶DNA序列和所述非靶DNA序列短片段的混合物；

b：采用DNA水解酶水解所述混合物中的所述非靶DNA序列短片段，得到所述靶DNA序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述归位内切酶的比活性不低于0.25 U/μg质粒。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述辅助内切酶的比活性不低于0.5 U/μg质粒。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述DNA水解酶的比活性不低于2 U/μg质粒。