CN116716666A - 一种针对低浓度核酸的文库构建方法及其在制备检测诊断试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种针对低浓度核酸的文库构建方法制备检测诊断试剂中的应用，属于生物分子技术领域。本发明的方法，在低浓度的DNA中加入特定DNA片段后进行文库构建，再利用针对所述特定DNA片段设计的sgRNA和CRISPR/Cas9系统去除文库中的特定DNA片段。本发明利用先投入特定的DNA片段来解决建库起始浓度低的问题，建库后又结合CRISPR/Cas系统除去投入的序列，提高了目标序列的数据占比；操作简单，有效解决了低浓度DNA文库构建时，失败率高，接头自连率高，背景核酸序列占比高等问题；特别适合应用于病原宏基因组测序中的低浓度核酸样本，在有限的测序数据量下，提高靶标序列的检出。
Description
技术领域
本发明涉及一种针对低浓度核酸的文库构建方法制备检测诊断试剂中的应用，属于生物分子技术领域。
技术背景
随着高通量DNA测序技术，也称为二代测序技术(Next-Generation Sequencing)的发展。其在临床上的诊断应用也越来越广泛，通过对DNA序列的分析，达到对疾病精准诊疗的目的。目前从遗传性疾病的诊断，肿瘤驱动基因突变位点的检测，再到病原宏基因组测序的应用，二代测序NGS技术在各种疾病的诊断中已经发挥着举足轻重的作用。
二代测序技术对遗传性疾病的诊断，通过测序结果分析可以发现染色体的异常和基因组的各种遗传变异，例如目前应用最广泛成熟的无创产前诊断NIPT，CNV等产品的应用，该技术在肿瘤方向的应用，对已知特定靶基因的突变检测，有利于肿瘤靶向药的选择性治疗；另外肿瘤驱动基因大panel的检测，肿瘤TMB的突变的检测是目前的肿瘤治疗和伴随诊断中最具有前景的应用方向。而最近几年来基于二代测序技术发展的mNGS即病原宏基因组测序在临床上诊断病原微生物引起感染性疾病得到了快速的发展应用。mNGS技术对病毒的序列溯源工作和全球疫情的防控都发挥着重大的作用，如SARS-CoV-2病毒就是通过该技术最早发现，并获得了病毒的全基因组序列，为人类迅速了解和认识SARS-CoV-2病毒提供了最重要的基础信息。然而在病原宏基因组检测中，由于样本类型和来源的复杂性，临床上经常会存在大量的难重复取样，核酸含量极低的样本，这些样本进行文库构建后，文库中往往会产生高比例的接头自连和无关的环境DNA序列，对文库构建的质量，测序数据量的要求和测序分析结果的有效性都提出了更大的挑战。
CRISPR/Cas系统是细菌长期进化形成的获得性免疫系统，通过酶切破坏入侵的噬菌体和外源的DNA。目前CRISPR/Cas系统已经发展成最高效，最简便，应用最广泛的基因编辑系统。CRISPR/Cas系统可以分为：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三种不同类型。其中目前应用最广基因编辑技术的CRISPR/Cas系统基本都属于Ⅱ型，例如Cas9，Cas12等。CRISPR/Cas系统主要由三部分组成，Cas蛋白和两部分RNA组件，一个crRNA和一个tracrRNA，其中的crRNA包含由CRISPR基因座转录来的核苷酸间隔序列区，tracrRNA对于一般的crRNA成熟加工以及II型监控复合体的形成是必须的。通过人工设计将这两种RNA，连接改造形成一个具有引导作用的sgRNA(single guide RNA)，Cas9蛋白在sgRNA的引导下识别靶基因PAM区，特异的切割靶位点序列，产生DNA双链断裂。目前CRISPR/Cas9技术已经成为了最快速最有效和应用最广泛的基因编辑技术。近几年来CRISPR/Cas系统在体外分子方面应用也变得越来越多，例如利用其特异性的切割活性。
宏基因组测序mNGS技术在病原体测序应用中能否获得良好的目标DNA序列数据，关键在于用于测序的文库质量，比如合适的文库大小，纯度，文库中较高的有效靶序列占比等。在对一些核酸含量极低的样本进行建库和测序时，由于建库起始的DNA浓度非常低，构建的文库往往会产生大量接头adapter自连和大量的背景序列，这些都是无效文库序列，会产生大量的无效数据，这时候往往就需要增加测序的数据量，增加了测序的成本，而且经常也不能达到很好的测序结果。DNA浓度极低的临床样本，也会经常导致建库失败。目前对于低浓度核酸建库存在的上述问题，主要的解决方法有两个：
1)在构建文库前，对低浓度的DNA核酸进行全基因组的扩增(whole genomeamplification，WGA)，以获得足够量的DNA来进行文库构建，目前该方法最主要应用在科学研究的单细胞DNA测序领域，其他科学研究和特殊的司法需求也会用到该方法扩增后再建库。但是WGA方法会对低浓度的DNA进行整体扩增，这样往往也会扩增放大样本中的背景核酸，并不能有效改善靶数据量的比例；另外WGA的过程对于临床操作相对复杂，试剂成本较高，不同WGA方法，效果也有差异，这些原因导致目前用于临床诊断的样本，特别是病原宏基因组的检测时，都不会采用该方法进行。
2)主要是从样本到核酸，再到文库构建过程中的试剂和流程进行优化，例如选择适合的微量核酸提取试剂盒，提高样本核酸得率；选择针对低浓度核酸建库性能更好的建库试剂盒，来提高构建文库的成功率和质量，该方法由于目前的提取和建库试剂盒厂家、种类繁多，很难形成统一实验预期，并且该方法本质上对低浓度核酸构建文库改善的效果是非常的有限。总体来看目前在临床上对低浓度DNA文库构建合适的解决方法还是比较欠缺，没有一个简便，经济且有效解决问题方案。
发明内容
本发明要解决上述技术问题，提供一种针对低浓度核酸的文库构建方法。本发明通过在低浓度的DNA中加入特定的人工合成DNA序列片段，提高文库构建的质量和成功率，再通过CRISPR/Cas9系统去除上述人工合成序列；本发明可以有效提高低浓度DNA建库的成功率和文库的质量。
本发明的技术方案如下：
一种针对低浓度核酸的文库构建方法，在低浓度的DNA中加入特定DNA片段后进行文库构建，再利用针对所述特定DNA片段设计的sgRNA和CRISPR/Cas9系统去除文库中的特定DNA片段。
本发明上述技术方案中，特定DNA片段可以为人工合成的片段序列；或是来源于已知质粒、其他微生物、动植物的基因组，经PCR后的片段产物；其大小范围50bp～500bp，投入量的范围0.1～10ng。并且特定DNA片段加入的步骤顺序，不但包括在DNA的片段化处理之后加入再进行文库构建；同样也包括先加入特定DNA片段，再进行DNA片段化处理和文库构建。
本发明通过在文库构建前，人为加入特定序列的核酸片段提高起始建库的核酸浓度，这样就避免了由于浓度低而产生的建库失败率高，接头自连率高，背景核酸序列占比高等问题。而构建好的文库中的人为投入的序列，再通过CRISPR/Cas系统切割，破坏该序列构建的文库结构，去除投入的序列，提高目的靶序列的检出占比。
本发明可以提高文库构建的成功率，文库质量，极大的降低文库接头自连比例。是解决目前低浓度核酸建库质量差，失败率高等问题的有效办法。并且该方法简单，快速，经济，可高通量。
本发明方法(SpikeCas法建库)，可以应用在所有低浓度核酸起始的文库构建，特别是对特殊样本类型的病原宏基因组的文库质量和成功率有着显著的改善，提高靶序列的检出。
本发明中的CRISPR/Cas系统包括常规Cas9蛋白以及经过其他改造的过程形成的各种Cas9蛋白，也包括Cas12a，Cas12b及其他们经过改造的各种变体蛋白。
本发明中的CRISPR系统为CRISPR/Cas蛋白和文库结合形成的复合的物；所述的文库是基于特定DNA片段和针对该特定DNA片段设计的sgRNA而构建的。
其中sgRNA也包括对应Cas蛋白的crRNA和tracrRNA的组合，其中sgRNA可以根据Spike序列，使用单个或多个sgRNA。
作为上述技术方案的优选，所述的特定DNA片段为人工合成片段(Spike序列)，该序列具体如下：
GTATGATTTGATCGTCACAATGACATAATAGAGAGATTGATTTAGTGACTCGGACAATAAAATGCGTTGTGAGAGGTTAAGCAAGCA。
针对该Spike DNA设计2个spCas9 sg RNA的引物：
sgRNA1的引物：taatacgactcactataggGAGAGATTGATTTAGTGACTgttttagagctagaaatagc。sgRNA2的引物：taatacgactcactataggACAATAAAATGCGTTGTGAGgttttagagctagaaatagc。
分别与Cas9-scaffold RV引物序列AGCACCGACTCGGTGCCACT，以pSGKP载体为模板进行PCR扩增，产物回收后，用T7 RNA转录酶体外转录得到sgRNA。
本发明的另一个目的是提供上述文库构建方法在制备检测诊断试剂中的应用。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1)、本发明利用先投入特定的DNA片段来解决建库起始浓度低的问题，建库后又结合CRISPR/Cas系统除去投入的序列，提高了目标序列的数据占比；
2)CRISPR/Cas系统除去投入的序列，是在文库构建后，该过程不会引入额外的背景文库序列；
3)本发明的方法操作简单，有效解决了低浓度DNA文库构建时，失败率高，接头自连率高，背景核酸序列占比高等问题；特别适合应用于病原宏基因组测序中的低浓度核酸样本，在有限的测序数据量下，提高靶标序列的检出。
附图说明
图1.为低浓度核酸SpikeCas法建库的原理流程图；
图2为低浓度核酸SpikeCas法建库测序结果柱状示意图；
图3为低浓度核酸的SpikeCas法建库实验结果表；
图4为临床样本低浓度核酸SpikeCas法建库结果表。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的方法进行详细的说明，这些实施例应理解成对本发明的具体说明和阐述，不应理解成为本发明范围的限制。本领域的专业人员在本发明基础上的修改或改动，这些等价修改的方式同样落在本发明权利要求书中所述的权利要求范围。
实施例1
低浓度核酸SpikeCas法建库示例，过程如图1所示。
在本实施例中，我们人工加入的DNA序列，为人工合成的长度为89bp Spike DNA序列(本文中均称为Spike DNA)，该序列具体如下：
GTATGATTTGATCGTCACAATGACATAATAGAGAGATTGATTTAGTGACTCGGACAATAAAATGCGTTGTGAGAGGTTAAGCAAGCA。
针对该Spike DNA设计2个spCas9 sg RNA引物：
sgRNA1引物：taatacgactcactataggGAGAGATTGATTTAGTGACTgttttagagctagaaatagc
sgRNA2引物：taatacgactcactataggACAATAAAATGCGTTGTGAGgttttagagctagaaatagc。
分别与Cas9-scaffold RV引物序列AGCACCGACTCGGTGCCACT，以pSGKP载体为模板进行PCR扩增，产物回收后，用T7 RNA转录酶体外转录得到sgRNA：
sgRNA1：
GAGAGAUUGAUUUAGUGACUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。
sgRNA2：
ACAAUAAAAUGCGUUGUGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU。
在该实施例中，我们选择培养的jurkat细胞进行核酸提取，将DNA核酸稀释到0.01ng作为极低浓度的样本核酸，然后进行片段化处理后，向其中加入0.5ng人工合成的长度为89bp的spike DNA序列，然后进行补平加A和接头连接，进行正常的文库构建，构建好的文库经过文库PCR扩增后。然后按照下面的反应体系，分别用sgRNA1，sgRNA2，或同时sgRNA1和sgRNA2，对文库进行切割，该实施例中我们优选同时用sgRNA1和sgRNA2方法对文库进行切割(即SpikeCas法文库构建)。
Cas9切割文库反应体系：
程序：37℃温浴1h，70℃保温10分钟，然后进行文库PCR扩增，再进行文库纯化。用illumina测序平台的进行测序。
实验结果见图2和图3。
图1和图2表明：在极低浓度下的DNA直接进行文库构建，会产生大量的接头adapter自连，并且背景微生物核酸会升高，而特异性的靶标的序列reads并没有提高。在进行SpikeCas法建库后，adapter自连基本消除，目标的病原体的序列得到显著的提升，。
实施例2
本实施列中人工加入的Spike DNA序列，与实施例1中的相同，使用的sgRNA1和sgRNA2序列与实施例1中同样相同。并且在本实施例中优选了同时使用sgRNA1和sgRNA2的方案。
在本实施例中，两例临床来源的脑脊液样本，经过核酸提取后，发现核酸浓度非常低。样本1-01D2135250N，浓度0.011ng/μL，样本2-01C2132042N样本0.012ng/μL，几乎是qubit能测到核酸最低浓度。对这两个样本取分别进行的常规的文库构建和SpikeCas法文库构建。
SpikeCas法建库过程，对两个样本进行了片段化处理后，向其中加入1ng人工合成的spike DNA序列，然后进行补平加A和接头连接进行正常的文库构建，构建好得文库经过文库PCR扩增后。然后按照下面的反应体系，同时sgRNA1和sgRNA2，对文库进行切割。
Cas9切割文库反应体系：
程序：37℃温浴1h，70℃保温10分钟，然后进行文库PCR扩增，再进行文库纯化，用illumina测序平台的进行测序。
实验结果见图4。
图4表明：在低浓度临床样本的DNA进行SpikeCas法建库后，相比于正常的直接建库样本1-2135250N脑脊液样本未检出结核分枝杆菌复合群(阴性样本)，SpikeCas建库后接头自连率从77.3％降低到了6.3％，并且成功的检出的结核分枝杆菌复合群，(RPM 3.81)；样本2-2132042N的接头自连率从70.8％降低到了5.8％，样本中检出结核分枝杆菌复合群的RPM从3.12增加到了81.33。说明在临床上样本核酸浓度低时，SpikeCas法建库相比于正常的直接建库方法，同样可以使接头adapter自连大幅度降低，并且在有限的数据量下，对目标序列或目标病原体序列的检出得到显著的提升。
Claims (5)
1.一种针对低浓度核酸的文库构建方法，其特征在于：在低浓度的DNA中加入特定DNA片段后进行文库构建，再利用针对所述特定DNA片段设计的sgRNA和CRISPR/Cas9系统去除文库中的特定DNA片段；所述的特定DNA片段：大小范围50bp～500bp，为人工合成的片段序列，或是来源于已知质粒、其他微生物、动植物的基因组，经PCR后的片段产物。
2.根据权利要求1所述的一种针对低浓度核酸的文库构建方法，其特征在于：所述特定DNA片段加入的时机为：在片段化处理之后，或者是片段化处理之前。
3.根据权利要求1所述的一种针对低浓度核酸的文库构建方法，其特征在于：所述的CRISPR/Cas系统包括Cas9蛋白以及经过改造形成的各种Cas9蛋白，也包括Cas12a、Cas12b及它们经过改造的各种变体蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种针对低浓度核酸的文库构建方法，其特征在于：所述CRISPR系统为CRISPR/Cas蛋白和文库结合形成的复合的物；所述的文库是基于所述特定DNA片段和针对该所述特定DNA片段设计的sgRNA而构建的。
5.权利要求1～4任一项所述的文库构建方法在制备检测诊断试剂中的应用。
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