CN116836300A - 一种碱基编辑分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种融合蛋白及其用途。本发明提供一种融合蛋白，包括hA3A片段、dCas12a片段和UGI片段。本发明克服了现有碱基编辑器无法在A/T富集区域内进行精准高效碱基编辑的问题，利用可识别A/T富集PAM序列的CRISPR/Cas蛋白Cas12a(Cpf1)和人胞嘧啶脱氨酶3A(human APOBEC3A,hA3A)发展出新型碱基编辑器，在A/T富集区域内实现了高效率和高精准度的定向碱基编辑，有助于在各物种基因组更为广泛的位点实现精准高效的碱基编辑，并极大地扩充我们对于碱基编辑器的应用，特别是在医疗领域对相关疾病进行精准基因治疗方面。
Description
本申请是原申请的分案申请，原申请的申请日为：2019.01.21；申请号为：CN201910053295.1；发明创造名称为：一种碱基编辑分子及其用途。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种融合蛋白及其用途。
背景技术
基因组编辑技术指利用可设计的核酸酶(分子剪刀)通过碱基插入、缺失或置换等方式，对生物体基因组DNA特定片段进行改造从而达到对目标基因进行编辑的一种基因工程技术。利用基因组编辑技术对细胞进行遗传学操纵，可广泛的应用于生命科学基础研究、生物技术开发、农业技术开发以及医药研发领域。例如：直接在体内校正引起遗传疾病的基因突变，将能够从根本上治疗遗传疾病；对农作物进行精确的基因工程改造，使其产量提高或能够抵抗环境污染或病原体的感染；对微生物基因组进行精准改造，从而促进可再生生物能源的开发等。
CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)基因组编辑系统自问世以来，就有着其它基因组编辑技术无可比拟的优势，被认为能够在活细胞中广泛使用，并是迄今为止最有效、最便捷的基因组编辑系统。Cas9核酸酶利用引导RNA(guide RNA，gRNA)可在多种细胞的基因组特定靶点定位，对其进行切割从而产生DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)，然后利用细胞内源的DNA修复机制来实现编辑。根据不同DNA修复通路的激活，基因组编辑将会导致基因的失活或者突变的校正。通常来说，有两种主要的修复机制会被DNA双链断裂所激活，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源性介导修复(homology-directed repair，HDR)。做为DNA双链断裂最主要的修复通路，NHEJ在修复过程中能在DSB附近的基因组位点引入随机的碱基插入或缺失，从而导致基因的失活。与NHEJ相反，当HDR被激活时能够以外源性供体DNA作为模版，利用同源重组机制将外源性供体DNA的序列替换靶点基因组DNA的序列，从而完成基因突变的校正。但实际上，由于同源重组机制本身的局限性，HDR介导的基因校正效率一直很低(通常小于5％)。因此，限制了CRISPR/Cas基因组编辑工具从科研向应用的转化，尤其是在精准基因治疗方面的应用，这也是基因编辑领域的一大难题。
为了提高基因突变的校正效率，碱基编辑器(base editor,BE)在近期内应运而生。这种碱基编辑器将CRISPR/Cas系统和APOBEC胞嘧啶脱氨酶家族成员整合在一起，可执行将胞嘧啶(cytosine,C)编辑为胸腺嘧啶(thymine,T)的功能。目前已经成功开发的碱基编辑器包括将Cas9蛋白与大鼠胞嘧啶脱氨酶1(rat APOBEC1,rA1)或者人胞嘧啶脱氨酶3A(human APOBEC3A,hA3A)整合在一起。然而，Cas9蛋白主要识别鸟嘌呤G/胞嘧啶C富集区域的PAM序列，这一特点限制了Cas9碱基编辑器在腺嘌呤A/胸腺嘧啶T富集区域内开展碱基编辑。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种融合蛋白及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种融合蛋白，包括hA3A片段、dCas12a片段和UGI片段。
在本发明一些实施方式中，所述hA3A片段的氨基酸序列包括：
a)如SEQ ID NO.31～42其中之一所示的氨基酸序列；或，
b)与SEQ ID NO.31～42其中之一具有80％以上序列相似性、且具有a)所限定的氨基酸序列的功能的氨基酸序列，优选为具有胞苷脱氨酶活性。
在本发明一些实施方式中，所述dCas12a片段的氨基酸序列包括：
c)如SEQ ID NO.43～45其中之一所示的氨基酸序列；或，
d)与SEQ ID NO.43～45其中之一具有80％以上序列相似性的氨基酸序列、且具有c)所限定的氨基酸序列的功能；优选为具有的DNA结合活性、且完全丧失了DNA剪切活性，更优选为具有识别腺嘌呤A/胸腺嘧啶T富集PAM序列的功能，更优选为C/T ratio≤50％的PAM序列。
在本发明一些实施方式中，所述UGI片段的氨基酸序列包括：
e)如SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列；或，
f)与SEQ ID NO.46具有80％以上序列相似性的氨基酸序列、且具有e)所限定的氨基酸序列的功能；优选为具有尿嘧啶糖基化酶活性。
在本发明一些实施方式中，所述融合蛋白自5’端至3’端依次包括包括hA3A片段、dCas12a片段和UGI片段。
在本发明一些实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.47～57所示。
在本发明一些实施方式中，所述融合蛋白还包括NLS片段。
本发明另一方面提供一种分离的多核苷酸，编码所述的融合蛋白。
本发明另一方面提供一种碱基编辑体系，包括所述的融合蛋白，所述碱基编辑体系还包括sgRNA。
本发明另一方面提供一种表达系统，所述表达系统包括能够表达所述的碱基编辑体系的宿主细胞。
在本发明一些实施方式中，所述表达系统包括含有编码所述融合蛋白的多核苷酸的表达载体的宿主细胞、或染色体中整合有编码所述融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞。
在本发明一些实施方式中，所述表达系统包括含有编码所述sgRNA的多核苷酸的表达载体的宿主细胞、或染色体中整合有编码所述sgRNA的多核苷酸的宿主细胞。
在本发明一些实施方式中，所述表达系统为包括目标基因的目标区域的宿主细胞。
在本发明一些实施方式中，所述宿主细胞选自真核细胞以及原核细胞。
在本发明一些实施方式中，所述宿主细胞选自人细胞。
在本发明一些实施方式中，所述宿主细胞选自人胎肾细胞。
在本发明一些实施方式中，所述宿主细胞选自人胎肾HEK293T细胞。
本发明另一方面提供所述的融合蛋白、所述的多核苷酸、所述的碱基编辑体系或所述的表达系统在基因编辑中的用途。
在本发明一些实施方式中，所述用途具体为在真核生物的基因编辑中的用途。
本发明另一方面提供一种基因编辑方法，包括：通过所述的融合蛋白、或所述的碱基编辑体系进行基因编辑。
在本发明一些实施方式中，所述基因编辑方法包括：在适当条件下培养所述的表达系统。
在本发明一些实施方式中，所述基因编辑方法为体外基因编辑方法。
在本发明一些实施方式中，所述基因编辑方法的编辑窗口≤23个、≤20个、≤15个、≤12个、≤9个、或≤6个碱基。
附图说明
图1显示为本发明实施例1测序结果分析示意图。
图2显示为本发明实施例1测序结果分析示意图。
图3显示为本发明实施例2测序结果分析示意图。
图4显示为本发明实施例2测序结果分析示意图。
图5显示为本发明实施例3测序结果分析示意图。
图6显示为本发明实施例3测序结果分析示意图。
图7显示为本发明实施例1sanger测序结果示意图。
图8显示为本发明实施例1sanger测序结果示意图。
图9显示为本发明实施例2sanger测序结果示意图。
图10显示为本发明实施例2sanger测序结果示意图。
图11显示为本发明实施例3sanger测序结果示意图。
图12显示为本发明实施例3sanger测序结果示意图。
具体实施方式
本发明发明人经过大量探索性研究，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白是一种新的碱基编辑分子，所述融合蛋白可以包括hA3A片段、dCas12a片段和UGI片段，可以实现对sgRNA靶点区域内C的高效率的碱基编辑，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种融合蛋白，包括hA3A(人胞嘧啶脱氨酶3A，humanAPOBEC3A)片段、dCas12a(dCpf1)片段和UGI片段。本发明所提供的融合蛋白可以是一种碱基编辑分子，其可以与靶向靶点区域的sgRNA相配合，实现高效率、高精度的C-to-T的碱基编辑。
本发明所提供的融合蛋白中，所述hA3A片段的氨基酸序列可以包括：a)如SEQ IDNO.31～42其中之一所示的氨基酸序列；或，b)与SEQ ID NO.31～42其中之一具有80％以上序列相似性、且具有a)所限定的氨基酸序列的功能的氨基酸序列；具体的，所述b)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.31～42其中之一所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID No.31～42其中之一所示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，可以是具有胞苷脱氨酶活性，更具体可以是将胞嘧啶(cytosine，C)脱氨产生尿嘧啶(uracil，U)的功能。所述b)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.31～42其中之一具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的相似性。
本发明所提供的融合蛋白中，所述dCas12a片段可以来源于包括但不限于AsCas12a(U2UMQ6.1)、LbCas12a(WP_051666128.1)、或FnCas12a(A0Q7Q2.1)等，所述dCas12a片段的氨基酸序列可以包括：c)如SEQ ID NO.43～45其中之一所示的氨基酸序列；或，d)与SEQ ID NO.43～45其中之一具有80％以上序列相似性、且具有c)所限定的氨基酸序列的功能的氨基酸序列。具体的，所述d)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.43～45其中之一所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID No.43～45其中之一所示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，可以是具有DNA结合活性、且完全丧失了DNA剪切活性，更优选为具有识别腺嘌呤A/胸腺嘧啶T富集PAM序列的功能(具体可以是C/T ratio≤50％的PAM序列)。所述d)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.43～45其中之一具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的相似性。
本发明所提供的融合蛋白中，所述UGI片段的氨基酸序列可以包括：e)如SEQ IDNO.46所示的氨基酸序列；或，f)与SEQ ID NO.46具有80％以上序列相似性、且具有e)所限定的氨基酸序列的功能的氨基酸序列；具体的，所述f)中的氨基酸序列具体指：如SEQ IDNo.46所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID No.46所示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，具有尿嘧啶糖基化酶活性。所述f)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.46具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的相似性。
SEQ ID No.31～46的具体序列如表1所示：
表1
本发明所提供的融合蛋白中，所述的取代、缺失或者添加可以是保守氨基酸取代。所述“保守氨基酸取代”具体可以是指氨基酸残基被其他具有相似侧链的氨基酸残基取代的情况。具有相似侧链的氨基酸残基家族对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是包括但不限于碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)等家族。保守型氨基酸取代更具体可以包括但不限于下表中所列的具体情况，表2(氨基酸相似度矩阵)中的数字表示两个氨基酸之间的相似度，当数字大于等于0时认为是保守氨基酸取代，表3为示例性的保守氨基酸取代的方案。
表2
| C | G | P | S | A | T | D | E | N | Q | H | K | R | V | M | I | L | F | Y | W | |
| W | -8 | -7 | -6 | -2 | -6 | -5 | -7 | -7 | -4 | -5 | -3 | -3 | 2 | -6 | -4 | -5 | -2 | 0 | 0 | 17 |
| Y | 0 | -5 | -5 | -3 | -3 | -3 | -4 | -4 | -2 | -4 | 0 | -4 | -5 | -2 | -2 | -1 | -1 | 7 | 10 | |
| F | -4 | -5 | -5 | -3 | -4 | -3 | -6 | -5 | -4 | -5 | -2 | -5 | -4 | -1 | 0 | 1 | 2 | 9 | ||
| L | -6 | -4 | -3 | -3 | -2 | -2 | -4 | -3 | -3 | -2 | -2 | -3 | -3 | 2 | 4 | 2 | 6 | |||
| I | -2 | -3 | -2 | -1 | -1 | 0 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | 4 | 2 | 5 | ||||
| M | -5 | -3 | -2 | -2 | -1 | -1 | -3 | -2 | 0 | -1 | -2 | 0 | 0 | 2 | 6 | |||||
| V | -2 | -1 | -1 | -1 | 0 | 0 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | -2 | 4 | ||||||
| R | -4 | -3 | 0 | 0 | -2 | -1 | -1 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 6 | |||||||
| K | -5 | -2 | -1 | 0 | -1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 5 | ||||||||
| H | -3 | -2 | 0 | -1 | -1 | -1 | 1 | 1 | 2 | 3 | 6 | |||||||||
| Q | -5 | -1 | 0 | -1 | 0 | -1 | 2 | 2 | 1 | 4 | ||||||||||
| N | -4 | 0 | -1 | 1 | 0 | 0 | 2 | 1 | 2 | |||||||||||
| E | -5 | 0 | -1 | 0 | 0 | 0 | 3 | 4 | ||||||||||||
| D | -5 | 1 | -1 | 0 | 0 | 0 | 4 | |||||||||||||
| T | -2 | 0 | 0 | 1 | 1 | 3 | ||||||||||||||
| A | -2 | 1 | 1 | 1 | 2 | |||||||||||||||
| S | 0 | 1 | 1 | 1 | ||||||||||||||||
| P | -3 | -1 | 6 | |||||||||||||||||
| G | -3 | 5 | ||||||||||||||||||
| C | 12 |
表3
本发明所提供的融合蛋白中，所述融合蛋白自5’端至3’端可以依次包括包括hA3A(人胞嘧啶脱氨酶3A，human APOBEC3A)片段、dCas12a(dCpf1)片段和UGI片段。在本发明一具体实施例中，所述融合蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID No.47～57所示。
表4
本发明所提供的融合蛋白中，所述融合蛋白还可以包括NLS(核定位序列)片段，所述NLS片段主要可以用于引导蛋白质进入细胞核，从而可以实现对目标区域的碱基编辑。本领域技术人员可根据目标细胞(例如，真核细胞等，更具体可以是人胎肾细胞等，更具体可以是HEK293T细胞等)，选择合适的NLS片段，例如，所述NLS片段的氨基酸序列可以是PKKKRKV(SEQ ID No.58)。
本发明第二方面提供一种分离的多核苷酸，编码本发明第一方面所提供的融合蛋白。
本发明第三方面提供一种碱基编辑体系，包括本发明第一方面所提供的融合蛋白，所述碱基编辑体系还可以包括sgRNA。本领域技术人员可以根据基因的目标编辑区域，选择合适的靶向目标区域的sgRNA。例如，所述sgRNA的序列通常可以与目标区域至少部分互补，从而可以与所述融合蛋白相配合，将所述融合蛋白定位到目标区域，实现目标区域的碱基编辑，具体可以是胞嘧啶脱氨基反应，即将胞嘧啶(cytosine，C)编辑为胸腺嘧啶(thymine，T)。在本发明一具体实施例中，所述sgRNA可以靶向人基因组DYRK1A、人基因组SITE6、人基因组RUNX1等。
本发明第四方面提供一种表达系统，所述表达系统包括能够表达所述碱基编辑体系的宿主细胞，具体可以包括能够表达所述融合蛋白和所述sgRNA的宿主细胞。从而可以通过sgRNA靶向目标区域，并进一步配合所述融合蛋白，将所述融合蛋白定位到目标区域(例如，宿主细胞的目标基因的目标区域)，实现目标区域的碱基编辑。使所述表达系统能够表达所述融合蛋白和所述sgRNA的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以使所述表达系统包括含有编码所述融合蛋白的多核苷酸的表达载体的宿主细胞、或染色体中整合有编码所述融合蛋白的多核苷酸的宿主细胞；再例如，可以使所述表达系统包括含有编码所述sgRNA的多核苷酸的表达载体的宿主细胞、或染色体中整合有编码所述sgRNA的多核苷酸的宿主细胞。所述表达系统还可以是包括目标基因的目标区域的宿主细胞。在本发明一具体实施例中，所述目标基因可以是包括但不限于人基因组DYRK1A、人基因组SITE6、人基因组RUNX1等。在本发明另一具体实施例中，所述宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞，更具体可以是人细胞等，更具体可以是人胎肾，更具体可以是人胎肾HEK293T细胞等。本领域技术人员可以根据宿主细胞的种类，选择合适的表达载体，例如，所述表达载体可以是包括但不限于pCMV、pcDNA、PGL3等。所述表达系统中，所述宿主细胞可以表达所述融合蛋白和/或所述sgRNA，从而可以将所述融合蛋白定位到目标区域，实现目标区域的碱基编辑。
本发明第五方面提供本发明第一方面所提供的融合蛋白、或本发明第二方面所提供的多核苷酸、本发明第三方面所提供的碱基编辑体系或本发明第四方面所提供的表达系统在基因编辑中的用途，优选为真核生物的基因编辑中的用途，所述真核生物具体可以是包括但不限于真菌、植物、动物、或人等。在本发明一具体实施例中，本编辑的目标基因可以是包括但不限于人基因组DYRK1A、人基因组SITE6、人基因组RUNX1等。
本发明第六方面提供一种基因编辑方法，所述基因编辑方法可以为体外基因编辑方法，所述基因编辑方法可以包括：通过本发明第一方面所提供的融合蛋白、或本发明第三方面所提供的碱基编辑体系进行基因编辑。例如，所述基因编辑方法可以包括：在适当条件下培养本发明第四方面所提供的表达系统。在本发明一优选实施例中，编辑窗口可以是≤23个、≤20个、≤15个、≤12个、≤9个、或≤6个碱基的范围，实现了更为精准的碱基编辑。
综上所述，本发明克服了现有碱基编辑器无法在A/T富集区域内进行精准高效碱基编辑的问题，利用可识别A/T富集PAM序列的CRISPR/Cas蛋白Cas12a(Cpf1)和人胞嘧啶脱氨酶3A(human APOBEC3A,hA3A)发展出新型碱基编辑器，在A/T富集区域内实现了高效率和高精准度的定向碱基编辑，有助于在各物种基因组更为广泛的位点实现精准高效的碱基编辑，并极大地扩充我们对于碱基编辑器的应用，特别是在医疗领域对相关疾病进行精准基因治疗方面。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1人基因组DYRK1A靶点利用一系列dCas12a-hA3A碱基编辑器实现高效且高精度的C-T碱基编辑
1.1实验材料
试剂及质粒：引物合成自生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性内切酶、DNA连接酶、高保真DNA聚合酶购自NEB公司；质粒重组试剂盒Clone购自Vazyme公司；DNA胶回收试剂盒购自Corning公司；转染试剂LTX，购自Thermo Fisher公司；QuickExtractTM基因组DNA抽提试剂购自Illumina公司。
细胞株：人胎肾细胞HEK293T培养在加入了10％胎牛血清(Gbico)，1％双抗的DMEM培养基(Gibco)中贴壁培养。
1.2实验方法
dCas12a-hA3A-BE表达载体的构建：
以puc57-hA3A(金斯瑞生物科技有限公司合成)为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对，各引物序列具体如表1所示，下同)进行PCR，得到hA3A的CDS序列，并且在两端带有与线性化载体同源的区段，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone重组至经SacI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-BE载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y表达载体的构建：
以dCas12a-hA3A-BE为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.4所示的引物对)和引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对)进行PCR，得到两段带有W98Y突变且带有同源臂，同时带有与线性化载体同源区段的PCR产物，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone 将两个片段同时重组至经ApaI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-hA3A-BE载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE-W98Y。
dCas12a-hA3A-BE-W104A表达载体的构建：
以dCas12a-hA3A-BE为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.6所示的引物对)和引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.2所示的引物对)进行PCR，得到两段带有W104A突变且带有同源臂，同时带有与线性化载体同源区段的PCR产物，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone 将两个片段同时重组至经ApaI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-hA3A-BE载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE-W104A。
dCas12a-hA3A-BE-P134Y表达载体的构建：
以dCas12a-hA3A-BE为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.8所示的引物对)和引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.2所示的引物对)进行PCR，得到两段带有P134Y突变且带有同源臂，同时带有与线性化载体同源区段的PCR产物，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone 将两个片段同时重组至经ApaI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-hA3A-BE载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE-P134Y。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A表达载体的构建：
以dCas12a-hA3A-BE为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.10所示的引物对)和引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.2所示的引物对)进行PCR，得到两段带有W98Y-W104A双突变且带有同源臂，同时带有与线性化载体同源区段的PCR产物，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone 将两个片段同时重组至经ApaI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-hA3A-BE载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-P134Y表达载体的构建：
以dCas12a-hA3A-BE-W98Y为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.8所示的引物对)和引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.2所示的引物对)进行PCR，得到两段带有P134Y突变且带有同源臂，同时带有与线性化载体同源区段的PCR产物，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone 将两个片段同时重组至经ApaI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-hA3A-BE-W98Y载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE-W98Y-P134Y。
dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y表达载体的构建：
以dCas12a-hA3A-BE-W104A为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.8所示的引物对)和引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.2所示的引物对)进行PCR，得到两段带有P134Y突变且带有同源臂，同时带有与线性化载体同源区段的PCR产物，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone 将两个片段同时重组至经ApaI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-hA3A-BE-W104A载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y130F表达载体的构建：
以dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.12所示的引物对)和引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.2所示的引物对)进行PCR，得到两段带有Y130F突变且带有同源臂，同时带有与线性化载体同源区段的PCR产物，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone将两个片段同时重组至经ApaI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y130F。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y132D表达载体的构建：
以dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.14所示的引物对)和引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.2所示的引物对)进行PCR，得到两段带有Y132D突变且带有同源臂，同时带有与线性化载体同源区段的PCR产物，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone将两个片段同时重组至经ApaI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y132D。
dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y130F-P134Y表达载体的构建：
以dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.16所示的引物对)和引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.2所示的引物对)进行PCR，得到两段带有Y130F-P134Y双突变且带有同源臂，同时带有与线性化载体同源区段的PCR产物，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone将两个片段同时重组至经ApaI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y130F-P134Y。
dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y132D-P134Y表达载体的构建：
以dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y为模板，利用引物对(核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.18所示的引物对)和引物对(核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.2所示的引物对)进行PCR，得到两段带有Y132D-P134Y双突变且带有同源臂，同时带有与线性化载体同源区段的PCR产物，进行凝胶电泳纯化。经凝胶电泳纯化后，利用质粒重组试剂盒Clone将两个片段同时重组至经ApaI和SmaI处理后产生的线性化dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y载体中，得到表达载体dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y132D-P134Y。
sgRNA表达质粒的构建：
将核苷酸序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的引物退火，将退火产物利用T4DNA连接酶连入经限制性内切酶BsaI消化后的sgRNA表达载体pLb-Cas12a-pGL3-U6-sgRNA，得到靶向人基因组DYRK1A位点的sgRNA表达质粒sgDYRK1A。
表5
步骤1.2中质粒构建实验中扩增各种片段使用的PCR体系如下：HSDNA Polymerase(TAKARA)0.5μl；5×buffer 10μl；dNTPs 4μl；Forward Primer(10μM)1μl；Reverse Primer(10μM)1μl；Template 5ng；RNase-free water补至50μl。PCR程序如下：3min 94℃；32x(15sec 98℃，30sec 58℃，45s 72℃)；7min 72℃。
真核细胞转染：
将sgDYRK1A和得到的序列正确的dCas12a-hA3A-BE、dCas12a-hA3A-BE-W98Y、dCas12a-hA3A-BE-W104A、dCas12a-hA3A-BE-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y130F、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y132D、dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y130F-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y132D-P134Y分别以0.68ug：1μg的比例混合入200μlOpti-MEM中，加入1.68μl LIPOFECTAMINE plus，加入5.04ul LIPOFECTAMINE LTX，室温放置5分钟后加入500ul DMEM(+10％ FBS)培养基和16万HEK293T细胞的24孔板中进行转染。12h后换成含1％双抗(青链霉素)的新鲜培养基。继续培养60h后收细胞。
基因组DNA抽提和PCR扩增：
利用QuickExtractTM试剂按照试剂操作说明抽提转染后HEK293T细胞的基因组DNA，将抽提得到的基因组DNA利用表2中所示的引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22所示的引物)进行PCR扩增，并利用DNA胶回收试剂按照试剂操作说明对PCR产物进行切胶回收，用于DNA sanger测序。
表6
扩增基因组DNA使用PCR体系如下：HS DNA Polymerase(TAKARA)0.5μl；5×buffer 10μl；dNTPs 4μl；Forward Primer(10μM)1μl；Reverse Primer(10μM)1μl；Template 1ul；RNase-free water补至50μl。PCR程序如下：3min 94℃；32x(15sec 98℃，30sec 58℃，45s 72℃)；7min 72℃。
DNA sanger测序：
对PCR产物进行DNA sanger测序。将对基因组DNA扩增得到的PCR产物分别使用Qubit Fluorometer和Aglient Bioanalyzer 2100进行浓度质检和纯度鉴定；质检合格的样品，送交苏州金唯智生物科技有限公司进行sanger测序。Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。测序结果具体如图7和图8所示(两次重复实验数据)。EditR分析sanger测序结果：
利用EditR软件(https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/)对DNAsanger测序结果进行分析。EditR是2018年开发的一款网页版sanger测序结果分析软件(Kluesner M G,Nedveck DA,Lahr W S,et al.EditR:A Method to Quantify BaseEditing from Sanger Sequencing[J].The CRISPR Journal,2018,1(3):239-250.)。EditR是一款利用sanger测序信号，根据sgRNA序列，对DNA样品的测序结果进行处理，最后输出sgRNA靶位点处的碱基编辑效率的简洁、准确、高效的分析工具。分析结果如图1和图2所示。
实施例2人基因组SITE6靶点利用一系列dCas12a-hA3A碱基编辑器实现高效且高精度的C-T碱基编辑
2.1实验材料
试剂及质粒：同实施例1。
细胞株：同实施例1。
2.2实验方法
dCas12a-hA3A-BE表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W104A表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-P134Y表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-P134Y表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y130F表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y132D表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y130F-P134Y表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y132D-P134Y表达载体的构建：同实施例1。
sgRNA表达质粒的构建：
将核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的引物退火，将退火产物利用T4DNA连接酶连入经限制性内切酶BsaI消化后的sgRNA表达载体pLb-Cas12a-pGL3-U6-sgRNA，得到靶向人基因组SITE6位点的sgRNA表达质粒sgSITE6。
表7
质粒构建实验中扩增各种片段使用PCR体系如下：HS DNAPolymerase(TAKARA)0.5μl；5×buffer 10μl；dNTPs 4μl；Forward Primer(10μM)1μl；Reverse Primer(10μM)1μl；Template 5ng；RNase-free water补至50μl。PCR程序如下：3min 94℃；32x(15sec 98℃，30sec 58℃，45s 72℃)；7min 72℃。
真核细胞转染：
将sgSITE6和得到的序列正确的dCas12a-hA3A-BE、dCas12a-hA3A-BE-W98Y、dCas12a-hA3A-BE-W104A、dCas12a-hA3A-BE-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y130F、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y132D、dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y130F-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y132D-P134Y分别以0.68ug：1μg的比例混合入200μlOpti-MEM中，加入1.68μl LIPOFECTAMINE plus，加入5.04ul LIPOFECTAMINE LTX,室温放置5分钟后加入500ul DMEM(+10％ FBS)培养基和16万HEK293T细胞的24孔板中进行转染。12h后换成含1％双抗的新鲜培养基。继续培养60h后收细胞。
基因组DNA抽提和PCR扩增：
利用QuickExtractTM试剂按照试剂操作说明抽提转染后HEK293T细胞的基因组DNA，将抽提得到的基因组DNA利用表4中所示的引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26所示的引物)进行PCR扩增，并利用DNA胶回收试剂按照试剂操作说明对PCR产物进行切胶回收，用于DNA sanger测序。
表8
扩增基因组DNA使用PCR体系如下：HS DNA Polymerase(TAKARA)0.5μl；5×buffer 10μl；dNTPs 4μl；Forward Primer(10μM)1μl；Reverse Primer(10μM)1μl；Template 1ul；RNase-free water补至50μl。PCR程序如下：3min 94℃；32x(15sec 98℃，30sec 58℃，45s 72℃)；7min 72℃。
DNA sanger测序：同实施例1。测序结果具体如图9和图10所示(两次重复实验数据)。
EditR分析sanger测序结果：同实施例1，分析结果如图3和图4所示。
实施例3人基因组RUNX1靶点利用一系列dCas12a-hA3A碱基编辑器实现高效且高精度的C-T碱基编辑
3.1实验材料
试剂及质粒：同实施例1。
细胞株：同实施例1。
3.2实验方法
dCas12a-hA3A-BE表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W104A表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-P134Y表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-P134Y表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y130F表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y132D表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y130F-P134Y表达载体的构建：同实施例1。
dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y132D-P134Y表达载体的构建：同实施例1。
sgRNA表达质粒的构建：
将核苷酸序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的引物退火，将退火产物利用T4DNA连接酶连入经限制性内切酶BsaI消化后的sgRNA表达载体pLb-Cas12a-pGL3-U6-sgRNA，得到靶向人基因组RUNX1位点的sgRNA表达质粒sgRUNX1。
表9
质粒构建实验中扩增各种片段使用PCR体系如下：HS DNAPolymerase(TAKARA)0.5μl；5×buffer 10μl；dNTPs 4μl；Forward Primer(10μM)1μl；Reverse Primer(10μM)1μl；Template 5ng；RNase-free water补至50μl。PCR程序如下：3min 94℃；32x(15sec 98℃，30sec 58℃，45s 72℃)；7min 72℃。
真核细胞转染：
将sgRUNX1和得到的序列正确的dCas12a-hA3A-BE、dCas12a-hA3A-BE-W98Y、dCas12a-hA3A-BE-W104A、dCas12a-hA3A-BE-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W104A-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y130F、dCas12a-hA3A-BE-W98Y-W104A-Y132D、dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y130F-P134Y、dCas12a-hA3A-BE-W104A-Y132D-P134Y分别以0.68ug：1μg的比例混合入200μlOpti-MEM中，加入1.68μl LIPOFECTAMINE plus，加入5.04ul LIPOFECTAMINE LTX,室温放置5分钟后加入500ul DMEM(+10％ FBS)培养基和16万HEK293T细胞的24孔板中进行转染。12h后换成含1％双抗的新鲜培养基。继续培养60h后收细胞。
基因组DNA抽提和PCR扩增：
利用QuickExtractTM试剂按照试剂操作说明抽提转染后HEK293T细胞的基因组DNA，将抽提得到的基因组DNA利用以下引物29和引物30进行PCR扩增，并利用DNA胶回收试剂按照试剂操作说明对PCR产物进行切胶回收，用于DNA sanger测序。
表10
扩增基因组DNA使用PCR体系如下：HS DNA Polymerase(TAKARA)0.5μl；5×buffer 10μl；dNTPs 4μl；Forward Primer(10μM)1μl；Reverse Primer(10μM)1μl；Template 1ul；RNase-free water补至50μl。PCR程序如下:3min 94℃；32x(15sec 98℃,30sec 58℃,45s 72℃)；7min 72℃。
DNA sanger测序：同实施例1。测序结果具体如图11和图12所示(两次重复实验数据)。
EditR分析sanger测序结果：同实施例1。。分析结果如图5和图6所示。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (14)
1.一种融合蛋白，包括hA3A片段、dCas12a片段和UGI片段，所述hA3A片段氨基酸序列包括：如SEQ ID NO.33～42其中之一所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述dCas12a片段的氨基酸序列含如SEQID NO.43～45其中之一所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述UGI片段的氨基酸序列包括如SEQID NO.46所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白自5’端至3’端依次包括hA3A片段、dCas12a片段和UGI片段；优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.49-57所示；更优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.51或SEQ ID No.53。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括NLS片段。
6.一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1～5任一权利要求所述的融合蛋白。
7.一种碱基编辑体系，包括如权利要求1～5任一权利要求所述的融合蛋白，所述碱基编辑体系还包括sgRNA。
8.一种表达系统，所述表达系统包括能够表达如权利要求7所述的碱基编辑体系的宿主细胞。
9.如权利要求8所述的表达系统，其特征在于，所述表达系统包括含有编码所述融合蛋白的多核苷酸的表达载体的宿主细胞、或染色体中整合有编码所述碱基编辑分子的多核苷酸的宿主细胞；
和/或，所述表达系统包括含有编码所述sgRNA的多核苷酸的表达载体的宿主细胞、或染色体中整合有编码所述sgRNA的多核苷酸的宿主细胞；
和/或，所述表达系统为包括目标基因的目标区域的宿主细胞。
10.如权利要求8所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞选自真核细胞以及原核细胞，优选选自人细胞，更优选选自人胎肾细胞，更优选选自人胎肾HEK293T细胞。
11.如权利要求1～5任一权利要求所述的融合蛋白、如权利要求6所述的多核苷酸、如权利要求7所述的碱基编辑体系或如权利要求8～10任一所述的表达系统在非疾病诊断或治疗目的的基因编辑中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述用途具体为在真核生物的基因编辑中的用途。
13.一种非疾病诊断或治疗目的的基因编辑方法，包括：通过如权利要求1～5任一权利要求所述的融合蛋白、或如权利要求7所述的碱基编辑体系进行基因编辑。
14.如权利要求13所述的基因编辑方法，其特征在于，所述基因编辑方法包括：在适当条件下培养如权利要求8～10所述的表达系统；
和/或，所述基因编辑方法为体外基因编辑方法；
和/或，所述基因编辑方法的编辑窗口≤23个、≤20个、≤15个、≤12个、≤9个、或≤6个碱基。
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