JP2019141089A - 金属製多孔膜、それを用いた分級方法、および分級装置 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞凝集塊の回収率を高めることができる金属製多孔膜、それを用いた分級方法および分級装置の提供。【解決手段】第１主面ＰＳ１と、前記第１主面に対向する第２主面ＰＳ２とを有すると共に、前記第１主面と前記第２主面とを連通する複数の貫通孔１２を有する膜部１１を備える金属製多孔膜１０を準備するステップ、細胞凝集塊を含む液体を前記金属製多孔膜に通過させ、前記細胞凝集塊を前記金属製多孔膜に捕捉することによって、前記細胞凝集塊を分級するステップ、前記金属製多孔膜に捕捉された細胞凝集塊を回収するステップ、回収された前記細胞凝集塊を再培養するステップ、を含む細胞凝集塊の作製方法。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞凝集塊を分級する金属製多孔膜、それを用いた分級方法および分級装置に関する。

細胞凝集塊（スフェロイド）を用いた薬効調査等において、均一な寸法の細胞凝集塊が求められている。

例えば、特許文献１には、フィルタを用いて細胞塊を分級することが開示されている。

特開２０１５−６２４００号公報

近年、フィルタを用いた細胞凝集塊の分級において、細胞凝集塊の回収率を高めることが望まれている。

本発明は、細胞凝集塊の回収率を高めることができる金属製多孔膜、それを用いた分級方法および分級装置を提供することを目的とする。

本発明の一態様の金属製多孔膜は、
細胞凝集塊を分級する金属製多孔膜であって、
前記細胞凝集塊が捕捉される第１主面と、前記第１主面に対向する第２主面とを有すると共に、前記第１主面と前記第２主面とを連通する複数の貫通孔を有する膜部を備える。

本発明の一態様の分級方法は、
細胞凝集塊を分級する分級方法であって、
前記細胞凝集塊が捕捉される第１主面と、前記第１主面に対向する第２主面とを有すると共に、前記第１主面と前記第２主面とを連通する複数の貫通孔を有する膜部を備える金属製多孔膜を準備するステップ、
前記細胞凝集塊を含む液体を前記金属製多孔膜に通過させ、前記細胞凝集塊を前記金属製多孔膜に捕捉することによって、前記細胞凝集塊を分級するステップ、
を含む。

本発明の一態様の分級装置は、
細胞凝集塊を分級する分級装置であって、
前記細胞凝集塊が捕捉される第１主面と、前記第１主面に対向する第２主面とを有すると共に、前記第１主面と前記第２主面とを連通する複数の貫通孔を有する膜部を備える金属製多孔膜を備える。

本発明によれば、細胞凝集塊の回収率を高めることができる金属製多孔膜、それを用いた分級方法および分級装置を提供することができる。

本発明に係る実施の形態１における金属製多孔膜の膜部の一部の拡大斜視図である。 図１の金属製多孔膜の膜部の一部を厚み方向から見た概略図である。 図２のＡ−Ａ線で切断した断面図である。 本発明に係る実施の形態１の分級装置の構成を示す概略図である。 本発明に係る実施の形態１の分級装置のハウジングを示す斜視図である。 図５のハウジングの一部を断面で示す斜視図である。 本発明に係る実施の形態１の分級方法のフローチャートである。 異なる寸法を有する細胞凝集塊を含む液体を示す写真である。 実施例１において細胞凝集塊を捕捉した金属製多孔膜の一部を拡大して撮影した写真である。 比較例１において、細胞凝集塊を捕捉したナイロンメッシュの一部を拡大して撮影した写真である。 比較例１のナイロンメッシュの交差部を拡大して撮影した写真を示す。 異なる寸法の細胞凝集塊を含む液体を示す写真である。 実施例２において、最上段の金属製多孔膜で回収した細胞凝集塊の拡大写真である。 実施例２において、中央の金属製多孔膜で回収した細胞凝集塊の拡大写真である。 実施例２において、最下段の金属製多孔膜で回収した細胞凝集塊の拡大写真である。 実施例２において、最上段の金属製多孔膜を通過した後の液体の一部を拡大して撮影した写真である。 実施例２において、中央の金属製多孔膜を通過した後の液体の一部を拡大して撮影した写真である。 実施例２において、最下段の金属製多孔膜を通過した後の液体の一部を拡大して撮影した写真である。 実施例３において、培養した細胞凝集塊の一部を拡大して撮影した写真である。 実施例３において、最上段の金属製多孔膜で捕捉した細胞凝集塊の拡大写真である。 実施例３において、中央の金属製多孔膜で捕捉した細胞凝集塊の拡大写真である。 実施例３において、最下段の金属製多孔膜で捕捉した細胞凝集塊の拡大写真である。 実施例３において、最下段の金属製多孔膜を通過した後の液体の一部を拡大して撮影した写真である。 実施例３において、細胞凝集塊の直径に対するＡＴＰ活性量の測定結果を示す図である。 実施例３において、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜で捕捉された１組の細胞凝集塊の写真である。 実施例３において、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜で捕捉された１組の細胞凝集塊の写真である。 実施例３において、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜で捕捉された１組の細胞凝集塊の写真である。 実施例３において、最上段の金属製多孔膜で捕捉した図２５に示す３個の細胞凝集塊を培養して作製した１個の細胞凝集塊の写真である。 実施例３において、中央の金属製多孔膜で捕捉した図２６に示す３個の細胞凝集塊を培養して作製した１個の細胞凝集塊の写真である。 実施例３において、最下段の金属製多孔膜で捕捉した図２７に示す３個の細胞凝集塊を培養して作製した１個の細胞凝集塊の写真である。 実施例４において、ボルテゾミブを１、３、１０、２０、１００ｎＭ投入して２４時間培養した細胞凝集塊のＡＴＰ活性量の測定結果を示す図である。 実施例４において、ボルテゾミブを１、３、１０、２０、１００ｎＭ投入して４８時間培養した細胞凝集塊のＡＴＰ活性量の測定結果を示す図である。 比較例２において、ボルテゾミブを１、３、１０、２０、１００ｎＭ投入して２４時間培養した細胞凝集塊のＡＴＰ活性量の測定結果を示す図である。 比較例２において、ボルテゾミブを１、３、１０、２０、１００ｎＭ投入して４８時間培養した細胞凝集塊のＡＴＰ活性量の測定結果を示す図である。 実施例５及び比較例３における細胞６６の培養状態を示す図である。 実施例５及び比較例３において、培養された細胞のＲＬＵ発光量（ＡＴＰ活性量）の測定結果を示す図である。 実施例６において、培養した細胞凝集塊の一部を拡大して撮影した写真である。 実施例６において、最上段の金属製多孔膜で捕捉した細胞凝集塊の拡大写真である。 実施例６において、中央の金属製多孔膜で捕捉した細胞凝集塊の拡大写真である。 実施例６において、最下段の金属製多孔膜で捕捉した細胞凝集塊の拡大写真である。 実施例６において、最下段の金属製多孔膜を通過した後の液体の一部を拡大して撮影した写真である。 実施例６において、細胞凝集塊の直径に対するＡＴＰ活性量の測定結果を示す図である。 実施例６において、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜で捕捉された１組の細胞凝集塊の写真である。 実施例６において、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜で捕捉された１組の細胞凝集塊の写真である。 実施例６において、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜で捕捉された１組の細胞凝集塊の写真である。 実施例６において、最上段の金属製多孔膜で捕捉した図４３に示す３個の細胞凝集塊を培養して作製した１個の細胞凝集塊の写真である。 実施例６において、中央の金属製多孔膜で捕捉した図４４に示す３個の細胞凝集塊を培養して作製した１個の細胞凝集塊の写真である。 実施例６において、最下段の金属製多孔膜で捕捉した図４５に示す３個の細胞凝集塊を培養して作製した１個の細胞凝集塊の写真である。

（本発明に至った経緯）
細胞凝集塊は、例えば、がんの薬効を調査する場合に、がん細胞のモデルとして用いられている。がん細胞は、進行度合いによって細胞の大きさが異なる。また、がん細胞の大きさが異なれば、効果のある薬も異なる。例えば、初期がんや小さながん組織に対して効果のある薬は、進行がんや大きながん組織に対しての効果が小さい場合がある。このため、細胞凝集塊を用いた薬効調査において、異なる寸法の細胞凝集塊を用いて薬効調査を行うと、薬効データにばらつきが生じる。したがって、薬効データのばらつきを抑えるため、均一な寸法の細胞凝集塊を得ることが求められている。

また、細胞凝集塊は、細胞凝集塊を再生医療用の組織として用いられようとしている。この場合、所望の大きさの組織が必要となるが、細胞凝集塊の作製の工夫によって所望の大きさの組織を作製することは難しく、様々な大きさの細胞凝集塊を作製しておいてから所望の大きさの組織を選択した方が効率が良い。従って、高効率に所望の組織を選択することが求められている。

培養した細胞凝集塊を所望の寸法に調製する方法として、例えば、メンブレン又はナイロンメッシュ等のフィルタを用いて所望の寸法の細胞凝集塊を捕捉することによって細胞凝集塊を分級する方法が用いられている。しかしながら、これらのフィルタを用いた場合では、捕捉できる細胞凝集塊の寸法精度が低いため、回収率が低くなるといった問題がある。そこで、本発明者らは、これらの問題を解決するため、以下の発明に至った。

本発明の一態様の金属製多孔膜は、
細胞凝集塊を分級する金属製多孔膜であって、
前記細胞凝集塊が捕捉される第１主面と、前記第１主面に対向する第２主面とを有すると共に、前記第１主面と前記第２主面とを連通する複数の貫通孔を有する膜部を備える。

このような構成により、細胞凝集塊の回収率を高めることができる。

前記金属製多孔膜において、前記膜部の前記第１主面は、平坦状に形成され、
前記複数の貫通孔は、前記膜部の前記第１主面側の開口と前記第２主面側の開口とが連続した壁面を通じて連通していてもよい。

このような構成により、細胞凝集塊の回収率を更に向上させることができる。

前記金属製多孔膜において、前記貫通孔の幅は、前記細胞凝集塊の大きさの１００％未満であってもよい。

このような構成により、所望の細胞凝集塊を確実に捕捉することができる。

前記金属製多孔膜において、前記貫通孔の幅は、前記細胞凝集塊の大きさの８０％未満であってもよい。

このような構成により、細胞凝集塊が変形したとしても確実に所望の細胞凝集塊を捕捉することができる。

前記金属製多孔膜において、前記貫通孔の幅は、前記細胞凝集塊の大きさの２０％以上であってもよい。

このような構成により、捕捉対象ではない流体が通過しやすくなり、作業時間を短縮することができる。

前記金属製多孔膜において、前記貫通孔の幅は、前記細胞凝集塊の大きさの４０％以上であってもよい。

このような構成により、捕捉対象ではない流体が更に通過しやすくなり、作業時間を短縮することができる。

本発明の一態様の細胞凝集塊の分級方法は、
細胞凝集塊を分級する分級方法であって、
前記細胞凝集塊が捕捉される第１主面と、前記第１主面に対向する第２主面とを有すると共に、前記第１主面と前記第２主面とを連通する複数の貫通孔を有する膜部を備える金属製多孔膜を準備するステップ、
前記細胞凝集塊を含む液体を前記金属製多孔膜に通過させ、前記細胞凝集塊を前記金属製多孔膜に捕捉することによって、前記細胞凝集塊を分級するステップ、
を含む。

このような構成により、細胞凝集塊の回収率を高めることができる。

前記分級方法において、前記金属製多孔膜を準備するステップは、貫通孔の寸法が異なる複数の金属製多孔膜を準備すると共に、前記細胞凝集塊を含む液体が流れる流路の上流側から、前記複数の金属製多孔膜を前記貫通孔の寸法の大きい順に直列に配列してもよい。

このような構成により、段階的に所望の寸法の細胞凝集塊を効率良く得ることができる。

前記分級方法において、前記細胞凝集塊を分級するステップは、前記複数の金属製多孔膜のうち最下段に位置する金属製多孔膜で前記細胞凝集塊から単離した単離細胞を通過させてもよい。

このような構成により、細胞凝集塊を含まず、単離細胞を含む液体を得ることができる。

前記分級方法において、更に、最下段に位置する前記金属製多孔膜を通過した前記単離細胞を継代するステップを含んでもよい。

このような構成により、最下段の金属製多孔膜を通過した液体に含まれる単離細胞を、新たな培地に移動させて培養することができる。あるいは、単離細胞を細胞凝集塊形成に再び用いることもできる。

前記分級方法において、更に、前記細胞凝集塊を前記金属製多孔膜に捕捉した状態で洗浄するステップを含んでもよい。

このような構成により、分級された細胞凝集塊を容易に洗浄することができる。

前記分級方法において、前記金属製多孔膜で捕捉された前記細胞凝集塊を回収するステップを含んでもよい。

このような構成により、分級された細胞凝集塊を容易に回収することができる。

前記分級方法において、前記金属製多孔膜を準備するステップは、滅菌した金属製多孔膜を準備してもよい。

このような構成により、分級する前に金属製多孔膜に付着している菌によって細胞凝集塊が汚染されるのを防ぐことができる。

前記分級方法において、前記細胞凝集塊を含む液体が前記金属製多孔膜を介して流れる流路は、外気から閉鎖されていてもよい。

このような構成により、外気により細胞凝集塊が汚染されるのを防ぐことができる。

本発明の一態様の細胞凝集塊の分級装置は、
細胞凝集塊を分級する分級装置であって、
前記細胞凝集塊が捕捉される第１主面と、前記第１主面に対向する第２主面とを有すると共に、前記第１主面と前記第２主面とを連通する複数の貫通孔を有する膜部を備える金属製多孔膜を備える。

このような構成により、細胞凝集塊の回収率を高めることができる。

前記分級装置において、貫通孔の寸法が異なる複数の金属製多孔膜を備え、
前記複数の金属製多孔膜は、前記細胞凝集塊を含む液体が流れる流路の上流側から、前記貫通孔の寸法の大きい順に直列に配列されていてもよい。

このような構成により、段階的に所望の寸法の細胞凝集塊を効率良く得ることができる。

前記分級装置において、前記複数の金属製多孔膜のうち最下段に位置する金属製多孔膜の貫通孔の寸法は、前記細胞凝集塊から単離した単離細胞の大きさ以下であってもよい。

このような構成により、最下段の金属製多孔膜によって捕捉する細胞凝集塊を規制することができる。

前記分級装置において、前記複数の金属製多孔膜のうち最下段に位置する金属製多孔膜の貫通孔の寸法は、前記細胞凝集塊から単離した単離細胞を通過させることができる大きさであってもよい。

このような構成により、細胞凝集塊を含まず、且つ単離細胞を含む液体を得ることができる。

前記分級装置において、更に、
前記金属製多孔膜を内包し、前記金属製多孔膜の前記第１主面に対向するように設けられた流体流入路と、前記金属製多孔膜の前記第２主面に対向するように設けられた流体排出路とを有するハウジング、
を備えてもよい。

このような構成により、金属製多孔膜を容易に保持して、回収率の高い分級を行うことができる。

前記分級装置において、前記細胞凝集塊を含む液体が前記金属製多孔膜を介して流れる流路は、外気から閉鎖されていてもよい。

このような構成により、外気により細胞凝集塊が汚染されるのを防ぐことができる。

前記分級装置において、前記金属製多孔膜は、滅菌されていてもよい。

このような構成により、分級する前に金属製多孔膜に付着している菌によって細胞凝集塊が汚染されるのを防ぐことができる。

以下、本発明に係る実施の形態１について、添付の図面を参照しながら説明する。また、各図においては、説明を容易なものとするため、各要素を誇張して示している。

（実施の形態１）
［金属製多孔膜］
図１は、本発明に係る実施の形態１における金属製多孔膜１０の一部の拡大斜視図である。図１中のＸ、Ｙ、Ｚ方向は、それぞれ金属製多孔膜１０の縦方向、横方向、厚み方向を示している。図１に示すように、金属製多孔膜１０は、互いに対向する第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを有し、且つ両主面を貫通する複数の貫通孔１２を有する膜部１１を備える。金属製多孔膜１０は、膜部１１においてマトリックス状に一定の間隔で複数の貫通孔１２を設けた板状構造体（格子状構造体）である。金属製多孔膜１０は、異なる寸法を有する複数の細胞凝集塊を含む液体を通過させることによって、細胞凝集塊を分級する金属製薄膜である。

本明細書において、「細胞凝集塊」とは、複数の細胞が接着することによって形成される細胞の集合塊を意味する。細胞凝集塊は、例えば、がん化細胞、肝細胞、ｉＰＳ細胞などを使用した細胞凝集塊である。

図１では金属製多孔膜１０の全体を示していないが、実施の形態１では、金属製多孔膜１０は、例えば、円形の金属メッシュである。金属製多孔膜１０の寸法は、例えば、直径７．８ｍｍ、厚さ２０μｍである。金属製多孔膜１０を構成する材料は、金、銀、銅、白金、ニッケル、ステンレス鋼、パラジウム、チタン、およびこれらの合金であってもよい。特に、金属製多孔膜１０の材料としては、細胞凝集塊との生体親和性の観点から、金、ニッケル、ステンレス、チタンがよい。なお、金属製多孔膜１０は、円形に限定されず、例えば、長方形、正方形等の矩形形状、又は楕円等の形状であってもよい。

図２は、金属製多孔膜１０の膜部１１の一部を厚み方向（Ｚ方向）から見た概略図である。図２に示すように、複数の貫通孔１２は、膜部１１の第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２上に周期的に配置されている。具体的には、複数の貫通孔１２は、膜部１１においてマトリクス状に等間隔で設けられている。複数の貫通孔１２は、金属製多孔膜の第１主面ＰＳ１側、即ちＺ方向から見て、正方形の形状を有する。複数の貫通孔１２は、正方形の各辺と平行な２つの配列方向、即ち図２中のＸ方向とＹ方向に等しい間隔で設けられている。なお、貫通孔１２は、正方形に限定されず、例えば長方形、円、又は楕円などの形状であってもよい。また、孔の配列は、正方格子配列に限定されず、例えば方形配列であれば、２つの配列方向の間隔は等しくない長方形配列でもよく、三角格子配列又は準周期配列などであってもよい。

貫通孔１２の形状及び寸法は、細胞凝集塊の大きさ、形状に応じて適宜設計されるものである。実施の形態１において、貫通孔１２は、例えば、金属製多孔膜１０の膜部１１の第１主面ＰＳ１側、即ちＺ方向から見て正方形であり、一辺ｄは、細胞凝集塊の大きさの１００％未満に設計される。好ましくは細胞凝集塊の大きさの８０％未満に設計されることで濾過中に細胞凝集塊が変形したとしても確実に捕捉することができる。また、一辺ｄを細胞凝集塊の大きさの２０％以上とすることで捕捉対象ではない流体が通過しやすくなり、作業時間を短縮することができる。更に好ましくは細胞凝集塊の大きさの４０％以上とすることで更に流体が通過しやすくなる。また、貫通孔１２間の格子間隔ｂは、例えば、貫通孔１２の一辺ｄの１倍より大きく１０倍以下であり、より好ましくは貫通孔１２の一辺ｄの３倍以下である。あるいは、開口率にして１０％以上が好ましい。なお、開口率は、（貫通孔１２が占める面積）／（貫通孔１２が空いていないと仮定したときの第１主面ＰＳ１の投影面積）で計算される。なお、貫通孔１２の形状は、正方形に限定されることなく、例えば、円形、楕円形、長方形、菱形などの形状であってもよい。実施の形態１では、正方形状の貫通孔１２の寸法を一辺ｄで説明したが、貫通孔１２の寸法を貫通孔１２の幅で定義してもよい。貫通孔１２の幅とは、貫通孔１２が矩形の場合、対向する辺と辺との距離が最大になる線分に相当する。また、貫通孔１２の幅は、貫通孔１２が円形（楕円含む）の場合、長径に相当する。

金属製多孔膜１０は、同じ大きさを有する複数の貫通孔１２を含む。ここで、「同じ大きさ」とは、複数の貫通孔１２の寸法のばらつきが±５μｍの範囲内であることを意味する。なお、複数の貫通孔１２のうち一部の貫通孔は、異なる寸法で形成されていてもよい。例えば、分級の精度を損なわない程度で、金属製多孔膜１０にかかる圧力を逃がすために、複数の貫通孔１２のうち一部の貫通孔の寸法を他の貫通孔の寸法と比べて、大きく形成していてもよい。

なお、本明細書では、細胞凝集塊を液中に配置し、顕微鏡で観察した際、２次元の観察像において、細胞凝集塊の外周の任意の２つの点を結んだ線のうち、最長なものを細胞凝集塊の長さとし、捕捉対象である細胞凝集塊３個以上についての平均値を「細胞凝集塊の大きさ」とした。

図３は、図２の金属製多孔膜１０の膜部１１の一部をＡ−Ａ線で切断した断面図である。図３に示すように、貫通孔１２は、膜部１１の第１主面ＰＳ１側の開口と第２主面ＰＳ２側の開口とが連続した壁面を通じて連通している。具体的には、貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口に投影可能に設けられている。即ち、金属製多孔膜１０を第１主面ＰＳ１側、即ちＺ方向から見た場合に、貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口と重なるように設けられている。実施の形態１１において、貫通孔１２は、その内壁が第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２に対して垂直となるように設けられている。尚、第１主面ＰＳ１側の開口の大きさと第２主面ＰＳ２側の開口の大きさが異なっていてもよい。

また、金属製多孔膜１０において、細胞凝集塊が捕捉される膜部１１の第１主面ＰＳ１は、平坦状に形成されている。即ち、膜部１１の第１主面ＰＳ１は、面一に形成されており、実質的にＺ方向に凹凸が形成されていない。また、膜部１１の第２主面ＰＳ２についても、平坦状に形成されている。さらには、膜部１１の両主面における面精度は、単離細胞の大きさよりも小さいことが好ましい。膜部１１の両主面へ単離細胞が付着することを低減できるからである。

［分級装置］
本発明の実施の形態１に係る分級装置について、図４を用いて説明する。図４は、実施の形態１に係る分級装置５０の構成を示す概略図である。

図４に示すように、分級装置５０は、複数の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを備える。複数の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃと単離細胞６２とを含む液体６０が流れる方向７０へ直列に配列されている。実施の形態１においては、液体６０が流れる流路において、上流側から金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に配置されている。即ち、分級装置５０において、金属製多孔膜１０Ａを最上段に配置し、金属製多孔膜１０Ｂを中央に配置し、金属製多孔膜１０Ｃを最下段に配置している。また、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、液体６０の流れる方向７０に対してそれぞれの第１主面ＰＳ１が直交するように配置されている。

実施の形態１において、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃとは、それぞれ寸法が異なる細胞凝集塊である。細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃの寸法は、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃの順に大きい。即ち、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃにおいて、細胞凝集塊６１ａが最も大きく、細胞凝集塊６１ｃが最も小さい。

本明細書において、「単離細胞」とは、細胞凝集塊を形成する１つの細胞であり、細胞凝集塊に接着せずに独立した状態の１つの細胞を意味する。即ち、「単離細胞」とは、細胞凝集塊から単離した１つの細胞を意味する。あるいは、細胞凝集塊の形成に関与しなかった単離した１つの細胞を意味する。実施の形態１において、単離細胞６２の寸法は、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃよりも小さい。

金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの膜部１１ａ、１１ｂ、１１ｃには、それぞれ異なる寸法の貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃが設けられている。貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃの寸法は、貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃの順に大きい。即ち、貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃにおいて、貫通孔１２ａの寸法が最も大きく、貫通孔１２ｃの寸法が最も小さい。

金属製多孔膜１０Ａの貫通孔１２ａは、細胞凝集塊６１ａを通過させずに、細胞凝集塊６１ｂ、６１ｃと単離細胞６２とを通過させることができる寸法で設計されている。具体的に、貫通孔１２ａは、細胞凝集塊６１ａよりも小さく、細胞凝集塊６１ｂよりも大きい寸法で設計されている。このため、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃと単離細胞６２とを含む液体６０が金属製多孔膜１０Ａを通過することによって濾過されると、細胞凝集塊６１ａは、貫通孔１２ａを通り抜けることができず、金属製多孔膜１０Ａの第１主面ＰＳ１上に捕捉される。即ち、金属製多孔膜１０Ａの第１主面ＰＳ１上には、貫通孔１２ａの寸法より大きい細胞凝集塊６１ａが捕捉される。一方、液体６０に含まれる細胞凝集塊６１ｂ、６１ｃ及び単離細胞６２は、貫通孔１２ａを通り抜けることができる。このため、金属製多孔膜１０Ａで濾過された後の液体（濾液）６０Ａは、細胞凝集塊６１ｂ、６１ｃ及び単離細胞６２を含んでいるが、細胞凝集塊６１ａを含まない。したがって、金属製多孔膜１０Ａにおいては、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃと単離細胞６２とを含む液体６０から細胞凝集塊６１ａを分級することができる。

金属製多孔膜１０Ｂの貫通孔１２ｂは、細胞凝集塊６１ｂを通過させずに、細胞凝集塊６１ｃと単離細胞６２とを通過させることができる寸法で設計されている。具体的に、貫通孔１２ｂは、細胞凝集塊６１ｂよりも小さく、細胞凝集塊６１ｃよりも大きい寸法で設計されている。このため、金属製多孔膜１０Ａで濾過された液体６０Ａが金属製多孔膜１０Ｂを通過することによって濾過されると、細胞凝集塊６１ｂは、貫通孔１２ｂを通り抜けることができず、金属製多孔膜１０Ｂの第１主面ＰＳ１上に捕捉される。一方、液体６０Ａに含まれる細胞凝集塊６１ｃ及び単離細胞６２は、貫通孔１２ｂを通り抜けることができる。このため、金属製多孔膜１０Ｂで濾過された後の液体（濾液）６０Ｂは、細胞凝集塊６１ｃ及び単離細胞６２を含んでいるが、細胞凝集塊６１ｂを含まない。したがって、金属製多孔膜１０Ｂにおいては、細胞凝集塊６１ｂ、６１ｃと単離細胞６２とを含む液体６０Ａから細胞凝集塊６１ｂを分級することができる。

金属製多孔膜１０Ｃの貫通孔１２ｃは、細胞凝集塊６１ｃを通過させずに、単離細胞６２を通過させることができる寸法で設計されている。具体的に、貫通孔１２ｃは、細胞凝集塊６１ｃよりも小さく単離細胞６２よりも大きい寸法で設計されている。このため、金属製多孔膜１０Ｂで濾過された液体６０Ｂが金属製多孔膜１０Ｃを通過することによって濾過されると、細胞凝集塊６１ｃは、貫通孔１２ｃを通り抜けることができず、金属製多孔膜１０Ｃの第１主面ＰＳ１上に捕捉される。一方、液体６０Ｂに含まれる単離細胞６２は、貫通孔１２ｃを通り抜けることができる。このため、金属製多孔膜１０Ｃで濾過された後の液体（濾液）６０Ｃは、単離細胞６２を含んでいるが、細胞凝集塊６１ｃを含まない。したがって、金属製多孔膜１０Ｃにおいては、細胞凝集塊６１ｃと単離細胞６２とを含む液体６０Ｂから細胞凝集塊６１ｃを分級することができる。

また、金属製多孔膜１０Ｃで濾過された後の液体（濾液）６０Ｃに含まれる単離細胞６２は、継代することができる。あるいは、別の細胞凝集塊の作製に利用することができる。

このように、分級装置５０においては、液体６０が流れる流路の上流側から、複数の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃの寸法が大きい順に直列に配列している。このような構成によって、異なる寸法の細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃと単離細胞６２とを含む液体６０から所望の寸法の細胞凝集塊を段階的に分級することができる。

分級装置５０は、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを保持するハウジングを備えてもよい。この場合、分級装置５０は、流体流入路と流体排出路とが設けられたハウジングに内包された金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃによって流体流入路から流入した流体中の濾過対象物を濾過し、当該金属製多孔膜を通過した流体を流体排出路から排出する。

図５は金属製多孔膜１０Ａを保持するハウジング２０の概略構造を示す分解斜視図であり、図６はその分解断面図である。なお、図５及び図６においては、金属製多孔膜１０Ａの図示を省略している。

図５及び図６に示すように、ハウジング２０は、略円筒形の第１ハウジング部２１と、略円筒形の第２ハウジング部２２とを備えている。

第１ハウジング部２１は、金属製多孔膜１０Ａの第１主面ＰＳ１に対向するように設けられた流体流入路２１ａを備えている。第１ハウジング部２１は、金属製多孔膜１０Ａの外周部を挟持する第１枠部材５１と一体に形成されている。すなわち、第１枠部材５１は、第１ハウジング部２１の一部として構成されている。第１枠部材５１の内径は、例えば、６.０ｍｍである。

第１ハウジング部２１の第１枠部材５１の周囲には、流体流入路２１ａの延在方向と交差（例えば、直交）する方向に延びるフランジ部２１ｂが形成されている。フランジ部２１ｂには、当該フランジ部２１ｂの厚み方向に貫通する複数の貫通穴２１ｃが形成されている。実施の形態１において、複数の貫通穴２１ｃは、９０度間隔で４つ形成されている。フランジ部２１ｂの厚さは、例えば、２．１ｍｍである。貫通穴２１ｃの直径は、例えば、１．４２ｍｍである。貫通穴２１ｃの長さは、例えば、０．９ｍｍである。

第２ハウジング部２２は、金属製多孔膜１０Ａの第２主面ＰＳ２に対向するように設けられた流体排出路２２ａを備えている。第２ハウジング部２２は、金属製多孔膜１０Ａの外周部を挟持する第２枠部材５２と一体に形成されている。すなわち、第２枠部材５２は、第２ハウジング部２２の一部として構成されている。第２枠部材５２の内径は、例えば、６.０ｍｍである。

第２ハウジング部２２の第２枠部材５２の周囲には、流体排出路２２ａの延在方向と交差（例えば、直交）する方向に延びるフランジ部２２ｂが形成されている。フランジ部２２ｂには、当該フランジ部２２ｂの厚み方向に突出する複数の凸部２２ｃが形成されている。実施の形態１において、複数の凸部２２ｃは、９０度間隔で４つ形成されている。凸部２２ｃの直径は、例えば、１．４ｍｍである。凸部２２ｃの高さは、例えば、０．９ｍｍである。

第１ハウジング部２１と第２ハウジング部２２とは、複数の凸部２２ｃが複数の貫通穴２１ｃに挿入されることで、互いに嵌合するように構成されている。第１ハウジング部２１と第２ハウジング部２２とが互いに嵌合することで、金属製多孔膜１０Ａの外周部が第１枠部材５１と第２枠部材５２との間で保持される。

ハウジング２０は、例えば、ルアーロック型シリンジ（図示せず）に取り付けて使用することができる。この場合、第１ハウジング部２１の末端部２１ｄ（図６では上端部）と第２ハウジング部２２の末端部２２ｄ（図６では下端部）の少なくとも一方に、ルアーロック型シリンジと接続可能な突条部等を設ければよい。

また、分級装置５０においては、液体６０、６０Ａ、６０Ｂ、６０Ｃの流れる流路が外気から閉鎖されていてもよい。このように、液体６０、６０Ａ、６０Ｂ、６０Ｃを外気から遮断することによって、液体６０、６０Ａ、６０Ｂ、６０Ｃに含まれる細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃ及び単離細胞６２が汚染されるのを防止することができる。

［分級方法］
本発明の実施の形態１に係る分級方法について、図７を用いて説明する。図７は、実施の形態１に係る分級方法を示すフローチャートである。

実施の形態１に係る分級方法は、複数の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを用いて細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃと単離細胞６２とを含む液体６０を、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃ及び単離細胞６２のそれぞれに分級する。

図７に示すように、ステップＳＴ１１において、複数の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを準備する。具体的には、液体６０が流れる流路に、上流から金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に直列に配列する（図４参照）。金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃについては、前述した分級装置５０の構成と同じであるため、説明を省略する。

なお、ステップＳＴ１１で準備する金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、滅菌処理がされているものであってもよい。滅菌処理は、例えば、ガンマ線照射によるガンマ線滅菌、高温高圧の飽和水蒸気によるオートクレーブ滅菌、酸化エチレンガスを用いた酸化エチレンガス滅菌、又はオゾンによる酸化滅菌などである。

ステップＳＴ１２において、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃによって細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃをそれぞれ分級する。ステップＳＴ１２では、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃに、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃと単離細胞６２とを含む液体６０を通過させることによって濾過を行う。

より詳しく説明すると、まず、液体６０を金属製多孔膜１０Ａに通過させることによって濾過を行う。金属製多孔膜１０Ａによる液体６０の濾過によって、金属製多孔膜１０Ａの第１主面ＰＳ１上に、貫通孔１２ａの寸法より大きい細胞凝集塊６１ａを捕捉する。これにより、細胞凝集塊６１ａを分級する。

次に、金属製多孔膜１０Ａで濾過された後の濾液、即ち細胞凝集塊６１ｂ、６１ｃと単離細胞６２とを含む液体６０Ａを、金属製多孔膜１０Ａの下流に配置された金属製多孔膜１０Ｂに通過させることによって濾過を行う。金属製多孔膜１０Ｂによる液体６０Ａの濾過によって、金属製多孔膜１０Ｂの第１主面ＰＳ１上に、貫通孔１２ｂの寸法より大きい細胞凝集塊６１ｂを捕捉する。これにより、細胞凝集塊６１ｂを分級する。

次に、金属製多孔膜１０Ｂで濾過された後の濾液、即ち細胞凝集塊６１ｃと単離細胞６２とを含む液体６０Ｂを、金属製多孔膜１０Ｂの下流に配置された金属製多孔膜１０Ｃに通過させることによって濾過を行う。金属製多孔膜１０Ｃによる液体６０Ｂの濾過によって、金属製多孔膜１０Ｃの第１主面ＰＳ１上に、貫通孔１２ｃの寸法より大きい細胞凝集塊６１ｃを捕捉する。これにより、細胞凝集塊６１ｃを分級する。

また、金属製多孔膜１０Ｃで液体６０Ｂを濾過することによって、濾液として単離細胞６２を含む液体６０Ｃを得ることができる。この液体６０Ｃから取り出した単離細胞６２は、継代することができる。即ち、液体６０Ｃに含まれる単離細胞６２を新しい培地に移動させて、再度培養することができる。

ステップＳＴ１３において、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃに捕捉された細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを洗浄液で洗浄する。例えば、液体６０が流れる方向７０に洗浄液を流して、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃに捕捉された状態で細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを洗浄する。なお、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃの洗浄方法については、これに限定されるものではなく、様々な洗浄方法を用いてもよい。また、ステップＳＴ１３を省略しても良い。

ステップＳＴ１４において、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃに捕捉された細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを回収する。例えば、細胞凝集塊６１ａを捕捉した状態の金属製多孔膜１０Ａを取り外し、金属製多孔膜１０Ａを培地に入れて、金属製多孔膜１０Ａの厚み方向に振動させる。これにより、金属製多孔膜１０Ａに捕捉されていた細胞凝集塊６１ａを、金属製多孔膜１０Ａの第１主面ＰＳ１から分離し、回収することができる。あるいは、細胞凝集塊６１ａが付着していない第２主面ＰＳ２から第１主面ＰＳ１に向かって貫通孔１２ａを通じて回収液を通過させることにより、細胞凝集塊６１ａを金属製多孔膜１０Ａの第１主面ＰＳ１から分離し、回収することができる。なお、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃの回収方法については、これに限定されず、様々な回収方法を用いてもよい。

このようにして回収された細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃは、薬効の調査に用いられる。例えば、がんに対する薬の効果を調査する場合、初期がんの薬効調査では、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂより寸法の小さい細胞凝集塊６１ｃを用いて薬効調査を行う。一方、進行がんの薬効調査では、細胞凝集塊６１ａを用いて薬効調査を行う。

［効果］
実施の形態１に係る金属製多孔膜１０によれば、以下の効果を奏することができる。

金属製多孔膜１０においては、細胞凝集塊６１が捕捉される第１主面ＰＳ１と、第１主面に対向する第２主面ＰＳ２とを有すると共に、第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを連通する複数の貫通孔１２を有する膜部１１を備えている。このような構成により、細胞凝集塊６１を分級する際の寸法精度を高めることができるため、細胞凝集塊６１の回収率を高めることができる。

金属製多孔膜１０は、メンブレン又はナイロンメッシュ等のフィルタと比べて、剛性が高い。そのため、細胞凝集塊６１を含む液体６０を濾過する際、金属製多孔膜１０では、メンブレン又はナイロンメッシュ等のフィルタと比べて、膜部１１の第１主面ＰＳ１に液体６０による圧力が加わっても貫通孔１２が変形しにくい。したがって、金属製多孔膜１０は、メンブレン又はナイロンメッシュ等のフィルタと比べて、貫通孔１２より大きい細胞凝集塊６１を、金属製多孔膜１０の第１主面ＰＳ１上に確実に捕捉することができる。なお、メンブレン又はナイロンメッシュ等のフィルタは、膜面に液体６０による圧力が加わると、貫通孔が変形しやすいため、貫通孔よりも大きい細胞凝集塊６１がフィルタを通過してしまう場合がある。

金属製多孔膜１０において、貫通孔１２は、膜部１１の第１主面ＰＳ１側の開口と第２主面ＰＳ２側の開口とが連続した壁面を通じて連通している。また、貫通孔１２では、膜部１１の第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口に投影可能に設けられている。このような構成により、貫通孔１２より小さい細胞凝集塊６１が貫通孔１２を通り抜けやすくなっている。なお、メンブレンフィルタでは、貫通孔が膜部の第１主面側の開口と第２主面側の開口とが連続した壁面を通じて連通しておらず、貫通孔１２より小さい細胞凝集塊６１が貫通孔を通りにくい。このため、メンブレンフィルタでは、フィルタ内に細胞凝集塊６１が残ってしまう。

また、金属製多孔膜１０において、細胞凝集塊６１を捕捉する膜部１１の第１主面ＰＳ１が平坦状に形成されている。即ち、金属製多孔膜１０の膜部１１の第１主面ＰＳ１は、面一に形成されている。このような構成により、金属製多孔膜１０の貫通孔１２よりも小さい細胞凝集塊６１は、貫通孔１２へ流入しやすくなっている。また、金属製多孔膜１０の膜部１１の第１主面ＰＳ１上に捕捉された細胞凝集塊６１を回収するとき、細胞凝集塊６１を膜部１１の第１主面ＰＳ１から容易に分離することができる。なお、メンブレン又はナイロンメッシュ等のフィルタでは、細胞凝集塊６１を捕捉する膜部の第１主面に凹凸が形成されている。このため、貫通孔より小さい細胞凝集塊６１であっても、この凹凸部分に引っ掛かることがあるため、所望の寸法以外の細胞凝集塊６１を回収することがある。また、細胞凝集塊６１を回収するとき、この凹凸部分に細胞凝集塊６１が引っ掛かることがある。

金属製多孔膜１０は火炎滅菌によっても変化することなく、さらには、熱伝導性も高いため、高い滅菌効果が得られる。

このように、金属製多孔膜１０では、貫通孔１２より大きい細胞凝集塊６１をより確実に捕捉することができると共に、貫通孔１２より小さい細胞凝集塊６１を貫通孔１２に流入させやすい構成になっている。また、金属製多孔膜１０では、膜部１１の第１主面ＰＳ１から細胞凝集塊６１を簡単に分離して回収することができる。このため、金属製多孔膜１０は、メンブレン又はナイロンメッシュ等のフィルタに比べて、分級する細胞凝集塊６１の寸法精度を向上させると共に、回収率を向上させることができる。

実施の形態１に係る分級装置５０によれば、以下の効果を奏することができる。

分級装置５０によれば、前述した金属製多孔膜１０を用いて細胞凝集塊６１の分級を行うため、細胞凝集塊６１の回収率を高めることができる。

分級装置５０は、異なる寸法の貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃを有する金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを備える。複数の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを含む液体６０が流れる流路の上流側から、貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃの寸法の大きい順に直列に配列されている。このような構成により、複数の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを用いて、液体６０から細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃをそれぞれ分級することができる。即ち、分級装置５０によれば、段階的に寸法の異なる細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを得ることができる。また、分級装置５０では、上流側の金属製多孔膜によって捕捉し損ねた細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを、下流側の金属製多孔膜によって確実に回収することができる。

分級装置５０において、最下段に位置する金属製多孔膜１０Ｃの貫通孔１２ｃの寸法は、単離細胞６２を通過させることができる大きさに設計されている。このような構成により、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを分級した後、単離細胞６２を含む液体６０Ｃを得ることができる。そのため、単離細胞６２を継代することができる。即ち、単離細胞６２を新しい培地に移動させて、再度培養することによって、例えば、細胞の生死判定を行うことができる。あるいは、単離細胞６２を別の細胞凝集塊の作製に利用することもできる。

分級装置５０において、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、当該金属製多孔膜の第１主面ＰＳ１に対向するように設けられた流体流入路２１ａと、当該金属製多孔膜の第２主面ＰＳ２に対向するように設けられた流体排出路２２ａとを有するハウジング２０に収容することができる。このような構成により、流体流入路２１ａと流体排出路２２ａとを有するハウジング２０内に金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを容易に保持することができる。また、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの外周部を挟持する第１枠部材５１及び第２枠部材５２が、それぞれ第１ハウジング部２１及び第２ハウジング部２２と一体に形成されているので、分級装置５０の部品点数を減らすことができる。

実施の形態１に係る分級方法によれば、以下の効果を奏することができる。

分級方法によれば、前述した金属製多孔膜１０を用いて、細胞凝集塊６１の分級を行うため、細胞凝集塊６１の回収率を高めることができる。また、分級方法は、前述した分級装置５０の効果と同様の効果を有する。

分級方法において、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃで捕捉した状態で洗浄することができる。例えば、液体６０の流れる方向７０の方向に洗浄液を流すことによって、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃで捕捉した細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを洗浄することができる。このため、分級した細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを容易に洗浄することができる。

分級方法では、例えば、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを捕捉した金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを培地の中で、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの厚さ方向に振動させる等によって、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを容易に回収することができる。あるいは、細胞凝集塊６１ａが付着していない第２主面ＰＳ２から第１主面ＰＳ１に向かって貫通孔１２ａを通じて回収液を通過させることにより、細胞凝集塊６１ａを金属製多孔膜１０Ａの第１主面ＰＳ１から分離し、回収することができる。このように、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃのそれぞれに捕捉された細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃは、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃから容易に分離することができる。

分級方法では、分級された細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを用いて薬効調査をすることができる。分級された細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃは、それぞれ均一な寸法となっているため、薬効調査データのばらつきを低減することができる。

なお、実施の形態１において、分級装置５０は、複数の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを備える構成について説明したが、これに限定されない。分級装置５０は、少なくとも１つ以上の金属製多孔膜１０を備えていればよい。また、複数の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、それぞれ異なる寸法の貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃを設けた構成について説明したが、これに限定されない。例えば、複数の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、同じ寸法の貫通孔１２を設けてもよい。このような構成により、上流側の金属製多孔膜１０Ａで捕捉し損ねた細胞凝集塊６１ａを下流側の金属製多孔膜１０Ｂで捕捉することができる。

実施の形態１において、最下段の金属製多孔膜１０Ｃの貫通孔１２ｃが、単離細胞６２を通過させることができる寸法で設計されている構成について説明したが、これに限定されない。金属製多孔膜１０Ｃの貫通孔１２ｃは、例えば、細胞凝集塊から単離した単離細胞６２の大きさ以下で設計されていてもよい。即ち、金属製多孔膜１０Ｃの貫通孔１２ｃは、単離細胞６２と同じ寸法で設計されていてもよいし、又は単離細胞６２よりも小さい寸法で設計されていてもよい。

実施の形態１において、第１ハウジング部２１と第２ハウジング部２２とは、複数の凸部２２ｃが複数の貫通穴２１ｃに挿入されることで、互いに嵌合するように構成したが、本発明はこれに限定されない。例えば、第１ハウジング部２１に複数の貫通穴を設け、第２ハウジング部２２に複数の凸部を設け、当該複数の凸部を複数の貫通穴に挿入することで、第１ハウジング部２１と第２ハウジング部２２とが互いに嵌合するように構成されてもよい。第１ハウジング部２１と第２ハウジング部２２とが互いに嵌合する構造であればよい。

実施の形態１において、第１枠部材５１及び第２枠部材５２が、それぞれ第１ハウジング部２１及び第２ハウジング部２２と一体に形成される構成について説明したが、これに限定されない。例えば、第１枠部材５１及び第２枠部材５２は、第１ハウジング部２１及び第２ハウジング部２２と別々の部材で構成されていてもよい。

以下、実施例について説明する。

（実施例１）
実施例１においては、実施の形態１の金属製多孔膜１０を用いて、細胞凝集塊６１の分級を行った。また、比較例１として、ナイロンメッシュを用いて、細胞凝集塊６１の分級を行った。

実施例１及び比較例１において、細胞凝集塊６１を含む液体６０を図８に示す。図８に示すように、液体６０には、異なる寸法の複数の細胞凝集塊６１が含まれている。

図８に示す細胞凝集塊６１は、直径３５ｍｍのディッシュにＮＩＨ３Ｔ３／ｒａｓが含まれた液量０．２ｍｌの細胞懸濁液を播種し、汎用のインキュベーターで１日培養することによって作製した。このとき、培地は３ｍｌ、総細胞凝集塊数は約１×１０^５個であった。

実施例１は、実施の形態１の金属製多孔膜１０を用いた。金属製多孔膜１０は、ニッケル製の円形のメッシュである。金属製多孔膜１０は、外径が７．８ｍｍであり、中央部に直径６ｍｍの膜部１１を形成している。膜部１１には、正方形の貫通孔１２が正方格子配列で設けられている。貫通孔１２の一辺は、１２０μｍである。貫通孔１２の間隔、即ち２つの貫通孔１２、１２の間の金属部分の距離は、５０μｍである。言い換えると、貫通孔１２の格子間隔は１７０μｍである。厚みは１７μｍである。また、金属製多孔膜１０は、分級を行う前にガンマ線照射によって滅菌処理が行われている。実施例１では、図８に示す異なる寸法の細胞凝集塊６１を含む液体６０を、金属製多孔膜１０に通過させて濾過することによって、細胞凝集塊６１の分級を行った。

比較例１は、ナイロンメッシュを用いた。ナイロンメッシュは、ナイロン６．６製の円形のメッシュである。ナイロンメッシュは、外径が７．８ｍｍであり、中央部に直径６ｍｍの膜部を形成している。膜部には、正方形の貫通孔が正方格子配列で設けられている。貫通孔の一辺は、１３１μｍである。貫通孔の間隔、即ちナイロンメッシュの線径は、７２μｍである。言い換えると、貫通孔の格子間隔は２０３μｍである。なお、ナイロンメッシュは、ガンマ線を照射すると、メッシュ自体が損傷するため、減菌処理を行っていない。比較例１では、図８に示す異なる寸法の細胞凝集塊６１を含む液体６０を、ナイロンメッシュに通過させて濾過することによって、細胞凝集塊６１の分級を行った。

図９は、実施例１において、細胞凝集塊６１を分級した後の金属製多孔膜１０の一部の写真を示す。図１０は、比較例１において、細胞凝集塊６１を分級した後のナイロンメッシュの一部の写真を示す。

図９に示す実施例１の金属製多孔膜１０では、図１０に示す比較例１のナイロンメッシュと比べて、より多くの細胞凝集塊６１が捕捉されていることがわかる。即ち、実施例１では、比較例１と比べて、より多くの細胞凝集塊６１を回収できていることがわかる。

比較例１のメッシュ構造体では、液体６０が通過することによって膜部に圧力がかかると、貫通孔が変形する。このため、ナイロンメッシュの貫通孔よりも大きい細胞凝集塊６１が、変形した貫通孔を通過してしまうことがある。このため、比較例１では、回収されるべき寸法の細胞凝集塊６１が、ナイロンメッシュによって回収できなかったものと考えられる。

図１１は、ナイロンメッシュの交差部Ｚ１の拡大写真を示す。ナイロンメッシュは、線状のナイロンを編み込んで作製されているため、線状のナイロンが交差する交差部Ｚ１では、ナイロンメッシュの厚み方向に段差部が形成される。即ち、ナイロンメッシュにおいて、細胞凝集塊６１を捕捉する主面が、複数の段差部により凹凸を含む面となっている。このため、ナイロンメッシュの貫通孔を通過可能な細胞凝集塊６１が、交差部Ｚ１に引っ掛かってしまうことがある。このように、ナイロンメッシュの交差部Ｚ１に引っ掛かった細胞凝集塊６１は、回収できなくなることがある。また、ナイロンメッシュの交差部Ｚ１に引っ掛かった細胞凝集塊６１を回収できたとしても、この細胞凝集塊６１は、所望の寸法のものではないため、分級したい細胞凝集塊６１を得ることができない。

一方、実施例１の金属製多孔膜１０では、液体６０が通過することによって膜部１１に圧力がかかっても、貫通孔１２が変形しにくい。このため、金属製多孔膜１０の貫通孔１２よりも大きい細胞凝集塊６１は、貫通孔１２を通過することが少ない。また、実施例１では、金属製多孔膜１０の第１主面ＰＳ１は、平坦状に形成されている。このため、実施例１では、金属製多孔膜１０の第１主面ＰＳ１で、貫通孔１２を通過可能な寸法の細胞凝集塊６１が引っ掛からずに、貫通孔１２を通過することができる。したがって、実施例１では、比較例１よりも多くの細胞凝集塊６１を回収することができたと考えられる。また、実施例１では、比較例１よりも寸法精度を向上させた細胞凝集塊６１を回収することができると考えられる。

このように、比較例１のナイロンメッシュでは、細胞凝集塊６１の回収率の低下、分級の誤差、再現性の低下が生じる。したがって、実施例１の金属製多孔膜１０では、ナイロンメッシュと比べて、細胞凝集塊６１の回収率、分級の精度、再現性を向上させることができる。

（実施例２）
実施例２においては、実施の形態１の分級装置５０を用いて、異なる寸法の複数の細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃの分級を行った。なお、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃの寸法については、細胞凝集塊６１ａが最も大きく、細胞凝集塊６１ｃが最も小さい寸法とする。

実施例２は、実施の形態１の分級装置５０を用いた。分級装置５０の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、ニッケル製の円形のメッシュである。金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、外径が７．８ｍｍであり、中央部に直径６ｍｍの膜部１１ａ、１１ｂ、１１ｃを形成している。膜部１１ａ、１１ｂ、１１ｃには、正方形の貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃが正方格子配列で設けられている。貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃの寸法は、それぞれ正方形の一辺が１８０μｍ、１２０μｍ、５８μｍ、格子間隔が２６０μｍ、１７０μｍ、７６．３μｍ、厚みが２０μｍ、１７μｍ、２０μｍである。また、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃは、分級を行う前にガンマ線照射によって滅菌処理が行われている。実施例２の分級装置５０では、液体６０の流路の上流側から金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順で直列に配列されている。

図１２は、実施例２において異なる寸法の細胞凝集塊を含む液体６０を示す。実施例２では、図１２に示す異なる寸法の細胞凝集塊を含む液体６０を１ｍｌ、分級装置５０に投与し、デッドエンド方式にて濾過を行うことによって細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃの分級を行った。濾過を開始してから５分後に、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃをそれぞれ取り出した。次に、各々の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃについて、細胞凝集塊が捕捉された面（第１主面ＰＳ１）を下側にした状態で、細胞凝集塊が捕捉されていない面（第２主面ＰＳ２）から生理食塩水５ｍｌを通過させることで、シャーレに細胞凝集塊を回収した。回収した細胞凝集塊を顕微鏡にて観察した。

図１３は、実施例２において金属製多孔膜１０Ａで回収した細胞凝集塊の拡大写真を示す。図１３に示すように、金属製多孔膜１０Ａでは、貫通孔１２ａより大きい細胞凝集塊６１ａが捕捉されていることがわかる。

図１４は、実施例２において金属製多孔膜１０Ｂで回収した細胞凝集塊の拡大写真を示す。図１４に示すように、金属製多孔膜１０Ｂでは、貫通孔１２ｂより大きい細胞凝集塊６１ｂが捕捉されていることがわかる。

図１５は、実施例２において金属製多孔膜１０Ｃで回収した細胞凝集塊拡大写真を示す。図１５に示すように、金属製多孔膜１０Ｃでは、貫通孔１２ｃより大きい細胞凝集塊６１ｃが捕捉されていることがわかる。

また、前述した実施例２の条件と同じ条件で液体６０の濾過を行うことによって分級を行い、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃで濾過された後の液体６０Ａ、６０Ｂ、６０Ｃの一部を顕微鏡にて拡大観察した。

図１６は、実施例２において金属製多孔膜１０Ａを通過した後の液体６０Ａの一部を拡大した写真を示す。図１６に示すように、金属製多孔膜１０Ａを通過した液体６０Ａには、細胞凝集塊６１ｂ、６１ｃと単離細胞６２とが含まれているが、細胞凝集塊６１ａは含まれていないことがわかる。

図１７は、実施例２において金属製多孔膜１０Ｂを通過した後の液体６０Ｂの一部を拡大した写真を示す。図１７に示すように、金属製多孔膜１０Ｂを通過した液体６０Ｂには、細胞凝集塊６１ｃと単離細胞６２とが含まれているが、細胞凝集塊６１ｂは含まれていないことがわかる。

図１８は、実施例２において金属製多孔膜１０Ｃを通過した後の液体６０Ｃの一部を拡大した写真を示す。図１８に示すように、金属製多孔膜１０Ｃを通過した液体６０Ｃには、単離細胞６２が含まれているが、細胞凝集塊６１ｃは含まれていないことがわかる。

このように、実施例２の分級装置５０では、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃにおいて所望の寸法の細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを捕捉していることができる。即ち、実施例２の分級装置５０では、段階的に異なる寸法の細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを分級することができる。

（実施例３）
実施例３においては、実施の形態１の分級装置５０を用いて、培養した細胞凝集塊（スフェロイド）を大きさ毎に分級した。

細胞凝集塊は、ｒａｓ遺伝子が導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を１０％ＦＢＳが含まれた１％ＰＣＳＭのＤＭＥＭ培地で培養した。使用した容器は、３．５ｍｍディッシュであり、播種細胞数は３×１０^５個／ｍｌであった。３７度のインキュベーション内で２４時間培養した結果、様々な大きさの細胞凝集塊を生成することができた。

図１９は、培養した細胞凝集塊の一部を拡大した写真を示す。図１９に示すように、分級する前において、異なるサイズの細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃが生成されていることがわかる。

実施例３において、分級装置５０の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃの孔サイズは、それぞれ、１８０μｍ、１００μｍ、５８μｍである。ここで、貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃの形状は、正方形であり、孔サイズとは正方形の孔の一辺の長さｄを意味する。

実施例３では、図１９に示す異なるサイズの細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを含む培地６０を、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に通過させることによって、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃの分級を行った。具体的には、新たに培養液を投入した３．５ｍｍディッシュを３個用意し、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃで捕捉された細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを、逆洗することによってそれぞれの３．５ｍｍディッシュに移した。

図２０は、実施例３において金属製多孔膜１０Ａで捕捉した細胞凝集塊６１ａの一部を拡大した写真を示す。図２１は、実施例３において金属製多孔膜１０Ｂで捕捉した細胞凝集塊６１ｂの一部を拡大した写真を示す。図２２は、実施例３において金属製多孔膜１０Ｃで捕捉した細胞凝集塊６１ｃの一部を拡大した写真を示す。図２３は、実施例３において金属製多孔膜１０Ｃを通過した後の液体６０の一部を拡大した写真を示す。

図２０〜２２に示すように、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃでは、それぞれほぼ均等なサイズの細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃが捕捉されていることがわかる。また、図２３に示すように、金属製多孔膜１０Ｃを通過した後の液体６０には、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃが含まれておらず、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃよりも小さいサイズの細胞凝集塊６１ｄが含まれていることがわかる。なお、金属製多孔膜１０Ｃを通過した後の液体６０には、細胞凝集塊６１ｄの他に、例えば、単離細胞６２などを含んでいてもよい。

このように、実施例３において、異なる大きさの細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを含む培地６０（図１９参照）を、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃに通過させることによって、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃをサイズ毎に分級することができたことがわかる（図２０〜２３参照）。

次に、細胞凝集塊のサイズと活性の関係を調べるために、細胞凝集塊を含む培地をディッシュ毎に等分し、等分した一方の培地に対してＡＴＰ活性量を測定した。ここで、ＡＴＰ活性量の測定は、ＡＴＰ定量アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｇａ）によって行った。ＡＴＰ活性量とは、細胞の活性、即ち細胞の生存率を意味している。即ち、ＡＴＰ活性量の値が大きいほど、生きた細胞が多いことを意味する。なお、等分したうちの他方の培地は、後述の再培養に使用した。

各ディッシュ内の細胞凝集塊を、ピペットで無作為に１個ずつ選択し、Ｕ底プレート（３７５ウェル）に投入した。そして、Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｅｒで各細胞凝集塊の直径とＡＴＰ活性量を測定した。なお、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜１０Ａで捕捉された細胞凝集塊６１ａは１７個、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂで捕捉された細胞凝集塊６１ｂは２０個、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜１０Ｃで捕捉された細胞凝集塊６１ｃは１２個を選択した。

図２４は、実施例３において、細胞凝集塊の直径に対するＡＴＰ活性量の測定結果を示す。図２４の横軸は細胞凝集塊の直径、縦軸はＡＴＰ活性量である。図２４において、四角の点は、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜１０Ａで捕捉された細胞凝集塊６１ａに関するデータ、三角の点は、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂで捕捉された細胞凝集塊６１ｂに関するデータ、菱形の点は、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜１０Ｃで捕捉された細胞凝集塊６１ｃに関するデータを示す。

図２４に示すように、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃのそれぞれで捕捉された細胞の活性が保たれていることがわかる。具体的に説明すると、ＡＴＰ活性量は、生きている細胞が多いほど、活性量（ＲＬＵ発光量）の値が大きくなる。細胞凝集塊は、サイズが大きくなるほど、多くの細胞を含んで構成される。そのため、細胞凝集塊のサイズが大きくなるほど、細胞凝集塊に含まれる細胞が生きていれば、ＡＴＰ活性量の値は大きくなる。

図２４に示すように、細胞凝集塊の直径が大きくなるほど、ＡＴＰの活性量の値が大きくなっていることがわかる。このことから、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃのそれぞれで捕捉された細胞の活性が保たれていることがわかる。即ち、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃのそれぞれで捕捉された細胞が生存していることがわかる。なお、元来、細胞凝集塊は、表面近傍の細胞のみ活性が保たれており、細胞凝集塊の中心部の細胞の活性は失われている。そのため、細胞凝集塊の直径とＡＴＰ活性量の関係は、２次から３次の曲線になる。

金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃのそれぞれで捕捉された細胞凝集塊に関して、細胞凝集塊の直径の最大値、最小値、平均値、及び標準偏差を表１に示す。

表１に示すように、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜金属製多孔膜１０Ａ、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂ、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜１０Ｃにおいて、捕捉された細胞凝集塊の直径の最大値は、それぞれ、４９５μｍ、２６８μｍ、１５８μｍであった。捕捉された細胞凝集塊の直径の最小値は、金属製多孔膜金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に、２６７μｍ、１３８μｍ、６５μｍであった。捕捉された細胞凝集塊の直径の平均値は、金属製多孔膜金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に、３６５μｍ、２０３μｍ、１１１μｍであった。捕捉された細胞凝集塊の標準偏差は、金属製多孔膜金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に、６８、３６、３０であった。また、捕捉された細胞凝集塊の平均値に対する標準偏差の割合は、金属製多孔膜金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に、１９％、１８％、２７％であった。

更に、分級した細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを再培養した。なお、再培養には、前述の等分したうちの他方の培地を用いた。

各ディッシュ内の細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを、ピペットで無作為に３個ずつ選択して１組とし、この１組をＵ底プレート（３７５ウェル）に投入した。図２５は、実施例３において、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜１０Ａで捕捉された１組の細胞凝集塊６１ａの写真を示す。図２６は、実施例３において、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂで捕捉された１組の細胞凝集塊６１ｂの写真を示す。図２７は、実施例３において、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜１０Ｃで捕捉された１組の細胞凝集塊６１ｃの写真を示す。

実施例３では、金属製多孔膜１０Ａで捕捉された図２５に示す細胞凝集塊６１ａを３３組、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂで捕捉された図２６に示す細胞凝集塊６１ｂを４３組、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜１０Ｃで捕捉された図２７に示す細胞凝集塊６１ｃを３４組作製した。これらを３７度のインキュベーション内で２４時間培養した結果、３個の細胞凝集塊から１個の細胞凝集塊を作製することができた。

図２８は、実施例３において、金属製多孔膜１０Ａで捕捉した図２５に示す３個の細胞凝集塊６１ａを培養して作製した１個の細胞凝集塊６３の写真を示す。図２９は、金属製多孔膜１０Ｂで捕捉した図２６に示す３個の細胞凝集塊６１ｂを培養して作製した１個の細胞凝集塊６４の写真を示す。図３０は、金属製多孔膜１０Ｃで捕捉した図２７に示す３個の細胞凝集塊６１ｃを培養して作製した１個の細胞凝集塊６５の写真を示す。

再培養して作製した図２８〜３０に示す細胞凝集塊６３、６４、６５について、前述のＣｅｌｌ Ｉｍａｇｅｒを使用して大きさを測定した。細胞凝集塊６３、６４、６５の大きさの平均値と標準偏差は、それぞれ、３４０±８１μｍ、１９４±３４μｍ、１１０±３０μｍであった。また、細胞凝集塊６３、６４、６５の大きさの平均値に対する標準偏差の割合は、それぞれ、２４％、１８％、２７％であった。これらの値は、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃで分級した表１に示す結果と同等であった。

以上の結果は、細胞凝集塊の作製において、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを使用して、異なるサイズの細胞凝集塊を含む培地から所望のサイズの細胞凝集塊を分級可能であることを示している。また、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃで分級された細胞凝集塊を用いて更に培養した場合、培養される細胞凝集塊の大きさを均一化させやすいことを示している。

（実施例４）
実施例４においては、実施の形態１の分級装置５０を用いて分級した細胞凝集塊（スフェロイド）を用いて薬効調査を行った。また、比較例２として、分級していない細胞凝集塊、即ち異なるサイズの細胞凝集塊を用いて薬効調査を行った。

実施例４及び比較例２では、抗がん剤ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）に対する薬効を調査した。ボルテゾミブは、再発または難治性多発性骨髄腫の治療に用いられるプロテアーム阻害剤である。作用機序としては、アポトーシス誘導、増殖抑制、血管新生抑制により抗腫瘍作用を示すことが知られている。また、ＮＦ−ｋＢの活性化を阻害し、接着阻害及び／又はＩＬ−６分泌の抑制を引き起こすことが知られている。

細胞凝集塊は、ｒａｓ遺伝子が導入されたＮＩＨ３Ｔ３／ＥＧＦＰ細胞を１０％ＦＢＳが含まれた１％ＰＣＳＭのＤＭＥＭ培地で培養した。使用した容器は、３．５ｍｍディッシュであり、播種細胞数は１×１０^５個／ｍｌであった。３７度のインキュベーション内で２４時間培養した結果、様々な大きさの細胞凝集塊を生成することができた。この細胞凝集塊を含む培地を二等分し、一方を実施例４に、他方を比較例２に使用した。

実施例４では、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜１０Ａ、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂを通過させた後、金属製多孔膜１０Ｂ上に捕捉された細胞凝集塊を１個ずつ選択し、Ｕ底プレート（３７５ウェル）に投入した。そして、Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｅｒで各細胞凝集塊の直径と体積を求めた。

実施例４では、次に、各ウェルに対して、ボルテゾミブを１、３、１０、２０、１００ｎＭ投入した。その後、３７度のインキュベーション内で２４時間培養した後、ＡＴＰ定量アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｇａ）によってＡＴＰ活性量を測定した。さらにその後、３７度のインキュベーション内で２４時間培養した後（合計４８時間）、ＡＴＰ活性量を測定した。

図３１は、実施例４において、ボルテゾミブを１、３、１０、２０、１００ｎＭ投入して２４時間培養した細胞凝集塊のＡＴＰ活性量の測定結果を示す。図３２は、実施例４において、ボルテゾミブを１、３、１０、２０、１００ｎＭ投入して４８時間培養した細胞凝集塊のＡＴＰ活性量の測定結果を示す。なお、図３１及び図３２において、縦軸はＡＴＰ活性率を示し、横軸はボルテゾミブ濃度を示す。

一方、比較例２では、金属製多孔膜による分級を行わずに細胞凝集塊を１個ずつ選択し、Ｕ底プレート（３７５ウェル）に投入した。そして、Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｅｒで各細胞凝集塊の直径と体積を求めた。

比較例２では、次に、各ウェルに対して、ボルテゾミブを１、３、１０、２０、１００ｎＭ投入した。その後、３７度のインキュベーション内で２４時間培養した後、ＡＴＰ定量アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｇａ）によってＡＴＰ活性量を測定した。さらにその後、３７度のインキュベーション内で２４時間培養した後（合計４８時間）、ＡＴＰ活性量を測定した。

図３３は、比較例２において、ボルテゾミブを１、３、１０、２０、１００ｎＭ投入して２４時間培養した細胞凝集塊のＡＴＰ活性量の測定結果を示す。図３４は、比較例２において、ボルテゾミブを１、３、１０、２０、１００ｎＭ投入して４８時間培養した細胞凝集塊のＡＴＰ活性量の測定結果を示す。なお、図３３及び図３４において、縦軸はＡＴＰ活性率を示し、横軸はボルテゾミブ濃度を示す。

図３１及び図３２に示される実施例４のＡＴＰ活性率と、図３３及び図３４に示される比較例２のＡＴＰ活性率とを比較すると、実施例４は比較例２よりもエラーバーが小さいことがわかる。これは、細胞凝集塊を用いた薬効試験（薬効研究又は薬効開発）において、金属製多孔膜１０を用いた分級により得られた均一なサイズの細胞凝集塊を用いて薬効試験を行うことにより、信頼性の高い結果が得られることを示している。即ち、金属製多孔膜１０を用いて細胞凝集塊の分級を行うことによって、精度の高い薬効試験結果を得られるという効果がある。また、金属製多孔膜１０は、ナイロンメッシュ等と比べて機械強度が高いため、分級精度が高い。そのため、金属製多孔膜１０によれば、ナイロンメッシュ等と比べて、薬効試験において細胞凝集塊のサイズに起因する試験結果の誤差を小さくすることができる。

（実施例５）
実施例５においては、金属製多孔膜１０が細胞凝集塊の培養に与える影響を調べるために、火炎滅菌した金属製多孔膜１０を培養液に浸した状態で細胞凝集塊を培養した。また、比較例３として、金属製多孔膜１０を培養液に浸さない状態で細胞凝集塊を培養した。

実施例５及び比較例３では、ｒａｓ遺伝子が導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地ＤＭＥＭ（ナカライテスク製）に５％ＦＣＳと１％ＰＣＳＭを添加した培地で培養した。

図３５は、実施例５及び比較例３における細胞６６の培養状態を示す。図３５に示すように、ウェルプレート８０（住友ベークライト製スミロンタイトプレート２４Ｆ）を準備した。ウェルプレート８０において、Ａ列の３つのウェルに比較例３の細胞６６及び培地６０を播種し、Ｃ列の３つのウェルに実施例５の細胞６６及び培地６０を播種した。なお、１ウェルあたりの播種量は、細胞の数が７．０×１０^４個、培地が２ｍｌであった。

実施例５では、金属製多孔膜１０を３枚用意し、１秒間バーナーで曝した。その後、金属製多孔膜１０を切断し、ウェル内の培地６０に浸漬した。なお、実施例５に用いた金属製多孔膜１０は、外形１８ｍｍ、厚み４０μｍである。貫通孔１２の形状は、正方形であり、正方形の一辺の長さは５８μｍである。また、２つの貫通孔１２の間の距離ｂは、１８μｍである。

実施例５では、金属製多孔膜１０を培地６０に浸漬させた状態で、細胞６６の培養を１０分間行った後、金属製多孔膜１０を取り除いた。一方、比較例３では、金属製多孔膜１０を培地に浸漬させずに、細胞６６の培養を１０分間行った。そして、実施例５及び比較例３で培養された細胞の活性量を以下の方法で確認した。

実施例５及び比較例３の培地６０と細胞６６を、それぞれ２０分割して別のプレートに分注した。分注された培地、細胞それぞれに、ＴＯＹＯＩＮＫ製のＡＴＰ試薬を１００μＬ添加した後に、プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製Ｆｕｓｉｏｎ α−ＦＰ）でＲＬＵ発光量（ＡＴＰ活性量）を測定した。

図３６は、実施例５及び比較例３において、培養された細胞のＲＬＵ発光量（ＡＴＰ活性量）の測定結果を示す。図３６に示すように、実施例５と比較例３と比較すると、ＲＬＵ発生量（ＡＴＰ活性量）が同等であることがわかる。これは、火炎滅菌された金属製多孔膜１０が、細胞の培養に何ら影響を与えないことを示している。

（実施例６）
実施例６においては、実施の形態１の分級装置５０を用いて、培養したマウスＥＳ細胞に由来する細胞凝集塊（スフェアまたは胚様体）を大きさ毎に分級した。金属製多孔膜１０は、ニッケル製の円形のメッシュである。金属製多孔膜１０は、外径が７．８ｍｍであり、中央部に直径６ｍｍの膜部１１を形成している。膜部１１には、正方形の貫通孔１２が正方格子配列で設けられている。貫通孔１２の一辺は、１２０μｍである。貫通孔１２の間隔、即ち２つの貫通孔１２の間の金属部分の距離は、５０μｍである。言い換えると、貫通孔１２の格子間隔は１７０μｍである。厚みは１７μｍである。また、金属製多孔膜１０は、分級を行う前にガンマ線照射によって滅菌処理が行われている。実施例６では、図３７に示す異なる寸法の細胞凝集塊６１を含む液体６０を、金属製多孔膜１０に通過させて濾過することによって、細胞凝集塊６１の分級を行った。

細胞凝集塊は、マウスＥＳ細胞を１０％ＦＢＳが含まれた１％ＰＣＳＭのＤＭＥＭ培地で培養した。使用した容器は、３．５ｍｍディッシュであり、播種細胞数は３×１０^５個／ｍｌであった。３７度のインキュベーション内で４８時間培養した結果、様々な大きさの細胞凝集塊を生成することができた。

図３７は、培養した細胞凝集塊の一部を拡大した写真を示す。図３７に示すように、分級する前において、異なるサイズの細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃが生成されていることがわかる。

実施例６において、分級装置５０の金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃの孔サイズは、それぞれ、１８０μｍ、１００μｍ、５８μｍである。ここで、貫通孔１２ａ、１２ｂ、１２ｃの形状は、正方形であり、孔サイズとは正方形の孔の一辺の長さｄを意味する。

実施例６では、図３７に示す異なるサイズの細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを含む培地６０を、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に通過させることによって、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃの分級を行った。具体的には、新たに培養液を投入した３．５ｍｍディッシュを３個用意し、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃで捕捉された細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを、逆洗することによってそれぞれの３．５ｍｍディッシュに移した。

図３８は、実施例６において金属製多孔膜１０Ａで捕捉した細胞凝集塊６１ａの一部を拡大した写真を示す。図３９は、実施例６において金属製多孔膜１０Ｂで捕捉した細胞凝集塊６１ｂの一部を拡大した写真を示す。図４０は、実施例６において金属製多孔膜１０Ｃで捕捉した細胞凝集塊６１ｃの一部を拡大した写真を示す。図４１は、実施例６において金属製多孔膜１０Ｃを通過した後の液体６０の一部を拡大した写真を示す。

図３８〜図４１に示すように、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃでは、それぞれほぼ均等なサイズの細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃが捕捉されていることがわかる。また、図４１に示すように、金属製多孔膜１０Ｃを通過した後の液体６０には、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃが含まれておらず、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃよりも小さいサイズの細胞凝集塊６１ｄが含まれていることがわかる。なお、金属製多孔膜１０Ｃを通過した後の液体６０には、細胞凝集塊６１ｄの他に、例えば、単離細胞６２などを含んでいてもよい。

このように、実施例６において、異なる大きさの細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを含む培地６０（図３７参照）を、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃに通過させることによって、細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃをサイズ毎に分級することができたことがわかる（図３８〜図４１参照）。

次に、細胞凝集塊のサイズと活性の関係を調べるために、細胞凝集塊を含む培地をディッシュ毎に等分し、等分した一方の培地に対してＡＴＰ活性量を測定した。ここで、ＡＴＰ活性量の測定は、ＡＴＰ定量アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｇａ）によって行った。ＡＴＰ活性量とは、細胞の活性、即ち細胞の生存率を意味している。即ち、ＡＴＰ活性量の値が大きいほど、生きた細胞が多いことを意味する。なお、等分したうちの他方の培地は、後述の再培養に使用した。

各ディッシュ内の細胞凝集塊を、ピペットで無作為に１個ずつ選択し、Ｕ底プレート（３７５ウェル）に投入した。そして、Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｅｒで各細胞凝集塊の直径とＡＴＰ活性量を測定した。なお、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜１０Ａで捕捉された細胞凝集塊６１ａは１３個、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂで捕捉された細胞凝集塊６１ｂは１０個、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜１０Ｃで捕捉された細胞凝集塊６１ｃは１６個を選択した。

図４２は、実施例６において、細胞凝集塊の直径に対するＡＴＰ活性量の測定結果を示す。図４２の横軸は細胞凝集塊の直径、縦軸はＡＴＰ活性量である。図４２において、四角の点は、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜１０Ａで捕捉された細胞凝集塊６１ａに関するデータ、三角の点は、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂで捕捉された細胞凝集塊６１ｂに関するデータ、菱形の点は、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜１０Ｃで捕捉された細胞凝集塊６１ｃに関するデータを示す。

図４２に示すように、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃのそれぞれで捕捉された細胞の活性が保たれていることがわかる。具体的に説明すると、ＡＴＰ活性量は、生きている細胞が多いほど、活性量（ＲＬＵ発光量）の値が大きくなる。細胞凝集塊は、サイズが大きくなるほど、多くの細胞を含んで構成される。そのため、細胞凝集塊のサイズが大きくなるほど、細胞凝集塊に含まれる細胞が生きていれば、ＡＴＰ活性量の値は大きくなる。

図４２に示すように、細胞凝集塊の直径が大きくなるほど、ＡＴＰの活性量の値が大きくなっていることがわかる。このことから、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃのそれぞれで捕捉された細胞の活性が保たれていることがわかる。即ち、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃのそれぞれで捕捉された細胞が生存していることがわかる。なお、元来、細胞凝集塊は、表面近傍の細胞のみ活性が保たれており、細胞凝集塊の中心部の細胞の活性は失われている。そのため、細胞凝集塊の直径とＡＴＰ活性量の関係は、２次から３次の曲線になる。

金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃのそれぞれで捕捉された細胞凝集塊に関して、細
胞凝集塊の直径の最大値、最小値、平均値、及び標準偏差を表２に示す。

表２に示すように、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜金属製多孔膜１０Ａ、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂ、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜１０Ｃにおいて、捕捉された細胞凝集塊の直径の最大値は、それぞれ、６４９μｍ、２１１μｍ、１３６μｍであった。捕捉された細胞凝集塊の直径の最小値は、金属製多孔膜金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に、２７６μｍ、１４２μｍ、５９μｍであった。捕捉された細胞凝集塊の直径の平均値は、金属製多孔膜金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に、４１３μｍ、１７８μｍ、９９μｍであった。捕捉された細胞凝集塊の標準偏差は、金属製多孔膜金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に、６８、３６、３０であった。また、捕捉された細胞凝集塊の平均値に対する標準偏差の割合は、金属製多孔膜金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃの順に、３１％、１２％、２３％であった。

更に、分級した細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを再培養した。なお、再培養には、前述の等分したうちの他方の培地を用いた。

各ディッシュ内の細胞凝集塊６１ａ、６１ｂ、６１ｃを、ピペットで無作為に３個ずつ選択して１組とし、この１組をＵ底プレート（３７５ウェル）に投入した。図４３は、実施例６において、孔サイズ１８０μｍの金属製多孔膜１０Ａで捕捉された１組の細胞凝集塊６１ａの写真を示す。図４４は、実施例６において、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂで捕捉された１組の細胞凝集塊６１ｂの写真を示す。図４５は、実施例６において、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜１０Ｃで捕捉された１組の細胞凝集塊６１ｃの写真を示す。

実施例６では、金属製多孔膜１０Ａで捕捉された図４３に示す細胞凝集塊６１ａを３０組、孔サイズ１００μｍの金属製多孔膜１０Ｂで捕捉された図４４に示す細胞凝集塊６１ｂを１７組、孔サイズ５８μｍの金属製多孔膜１０Ｃで捕捉された図４５に示す細胞凝集塊６１ｃを５０組作製した。これらを３７度のインキュベーション内で２４時間培養した結果、３個の細胞凝集塊から１個の細胞凝集塊を作製することができた。

図４６は、実施例６において、金属製多孔膜１０Ａで捕捉した図４３に示す３個の細胞凝集塊６１ａを培養して作製した１個の細胞凝集塊６３の写真を示す。図４７は、金属製多孔膜１０Ｂで捕捉した図４４に示す３個の細胞凝集塊６１ｂを培養して作製した１個の細胞凝集塊６４の写真を示す。図４８は、金属製多孔膜１０Ｃで捕捉した図４５に示す３個の細胞凝集塊６１ｃを培養して作製した１個の細胞凝集塊６５の写真を示す。

再培養して作製した図４６〜図４８に示す細胞凝集塊６３、６４、６５について、前述のＣｅｌｌ Ｉｍａｇｅｒを使用して大きさを測定した。細胞凝集塊６３、６４、６５の大きさの平均値と標準偏差は、それぞれ、４４１±１４６μｍ、２０３±２６μｍ、１１４±３４μｍであった。また、細胞凝集塊６３、６４、６５の大きさの平均値に対する標準偏差の割合は、それぞれ、３３％、１３％、３０％であった。これらの値は、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃで分級した表２に示す結果と同等であった。

以上の結果は、細胞凝集塊の作製において、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを使用して、異なるサイズの細胞凝集塊を含む培地から所望のサイズの細胞凝集塊を分級可能であることを示している。また、金属製多孔膜１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃで分級された細胞凝集塊を用いて更に培養した場合、培養される細胞凝集塊の大きさを均一化させやすいことを示している。

本発明は、添付図面を参照しながら好ましい実施形態に関連して充分に記載されているが、この技術の熟練した人々にとっては種々の変形や修正は明白である。そのような変形や修正は、添付した特許請求の範囲による本発明の範囲から外れない限りにおいて、その中に含まれると理解されるべきである。

本発明は、細胞凝集塊の回収率を高めて分級を行うことができるため、例えば、薬効調査や再生医療薬の製造等の分野に有用である。

１０、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ 金属製多孔膜
１１、１１ａ、１１ｂ、１１ｃ 膜部
１２、１２ａ、１２ｂ、１２ｃ 貫通孔
２０ ハウジング
２１ 第１ハウジング部
２１ａ 流体流入路
２１ｂ フランジ部
２１ｃ 貫通穴
２１ｄ 末端部
２２ 第２ハウジング部
２２ａ 流体排出路
２２ｂ フランジ部
２２ｃ 凸部
２２ｄ 末端部
５０ 分級装置
６０、６０Ａ、６０Ｂ、６０Ｃ 液体
６１、６１ａ、６１ｂ、６１ｃ、６１ｄ 細胞凝集塊
６２ 単離細胞
６３、６４、６５ 細胞凝集塊
６６ 細胞
７０ 液体の流れる方向
８０ ウェルプレート
ＰＳ１ 第１主面
ＰＳ２ 第２主面

Claims (4)

1. 第１主面と、前記第１主面に対向する第２主面とを有すると共に、前記第１主面と前記第２主面とを連通する複数の貫通孔を有する膜部を備える金属製多孔膜を準備するステップ、
   細胞凝集塊を含む液体を前記金属製多孔膜に通過させ、前記細胞凝集塊を前記金属製多孔膜に捕捉することによって、前記細胞凝集塊を分級するステップ、
   前記金属製多孔膜に捕捉された細胞凝集塊を回収するステップ、
   回収された前記細胞凝集塊を再培養するステップ、
   を含む細胞凝集塊の作製方法。
2. 前記細胞凝集塊を再培養するステップは、第１細胞凝集塊を再培養する第１再培養ステップと、前記第１細胞凝集塊より大きさが大きい第２細胞凝集塊を再培養する第２再培養ステップと、を含む、請求項１に記載の細胞凝集塊の作製方法。
3. 前記金属製多孔膜を準備するステップは、第１金属製多孔膜と、第１金属製多孔膜の貫通孔の寸法より大きい複数の貫通孔を有する第２金属製多孔膜と、を準備し、
   前記細胞凝集塊を分級するステップは、前記第１細胞凝集塊を前記第１金属製多孔膜に捕捉することによって前記第１細胞凝集塊を分級する第１分級ステップと、前記第２細胞凝集塊を前記第２金属製多孔膜に捕捉することによって前記第２細胞凝集塊を分級する第２分級ステップと、を有し、
   前記細胞凝集塊を回収するステップは、前記第１金属製多孔膜で捕捉された前記第１細胞凝集塊を回収する第１回収ステップと、前記第２金属製多孔膜で捕捉された前記第２細胞凝集塊を回収する第２回収ステップと、を有し、
   前記第１再培養ステップは、回収された前記第１細胞凝集塊を再培養し、
   前記第２再培養ステップは、回収された前記第２細胞凝集塊を再培養する、
   請求項２に記載の細胞凝集塊の作製方法。
4. 細胞凝集塊を分級するための金属製多孔膜を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞凝集塊の作製方法を実施するためのキット。