JP6225277B2 - 細胞分離フィルタ及び細胞培養容器 - Google Patents
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Description
本開示は、細胞分離フィルタ及び細胞培養容器に関する。
特表２０１３−５４１９５８号公報には、血液、生理学的流体等の流体サンプルから標的細胞を分離して採集するためのスクリーンフィルターを含む細胞採集装置が開示されている。この細胞採集装置では、流体サンプルに含まれている標的細胞を非標的細胞から濾過して採集するようになっている。また、標的細胞として癌細胞を選択し、非標的細胞として赤血球と白血球を選択することが開示されている。
上記した従来例では言及されていないが、流体サンプルから分離した細胞については、その後観察用の器具や培養容器等に移し替えて利用することが行われる。
しかしながら、移し替えの際に細胞が傷付くことがあるため、分離した細胞にはできるだけ触らないことが望ましい。
本開示は、流体サンプルから分離した細胞を、他の器具に移し替えることなくそのまま利用できるようにすることを目的とする。
第１の態様に係る細胞分離フィルタは、板状の基部と、前記基部に設けられ、流体サンプル中から分離対象の細胞を分離するための孔が形成された多孔領域と、前記基部に一体的に形成され、前記多孔領域を囲む壁部と、を有する。
分離対象の細胞を含む流体サンプルを、細胞分離フィルタの壁部側から壁部と反対側へ流すと、多孔領域の孔を通過できない大きさの細胞が捕捉され、孔を通過した細胞から分離される。細胞分離フィルタにおける板状の基部には、多孔領域を囲む壁部が一体的に形成されているので、壁部の内側で捕捉された細胞を、該壁部の内側に留めておき易い。このため、流体サンプルから分離した細胞を、他の器具に移し替えることなく、そのまま利用することができる。
第２の態様は、第１の態様に係る細胞分離フィルタにおいて、前記壁部で囲まれた前記多孔領域が複数設けられている。
この細胞分離フィルタでは、壁部で囲まれた多孔領域が複数設けられているので、流体サンプルを細胞分離フィルタに通すと、分離対象の細胞が、複数の多孔領域においてそれぞれ捕捉される。多孔領域はそれぞれ壁部で囲まれているので、細胞を複数の条件下で利用することが可能となる。
第３の態様は、第１の態様又は第２の態様に係る細胞分離フィルタにおいて、金属で構成されている。
この細胞分離フィルタは、金属により構成されているので、再利用性を高める等、低コスト化を図ることができる。
第４の態様は、第１の態様又は第２の態様に係る細胞分離フィルタにおいて、樹脂で構成されている。
この細胞分離フィルタは、樹脂により構成されているので、更に低コスト化を図ることができる。
第５の態様は、第４の態様に係る細胞分離フィルタにおいて、前記樹脂が透明である。
この細胞分離フィルタは、透明な樹脂により構成されているので、細胞分離フィルタの下側から光を当てることで、顕微鏡による細胞の観察が行い易くなる。
第６の態様に係る細胞培養容器は、第１〜第５の態様の何れか１態様に係る細胞分離フィルタと、前記細胞分離フィルタの前記基部における前記壁部と反対側の面に取り付けられ、前記多孔領域を閉塞する閉塞部材と、を有する。
この細胞培養容器では、細胞分離フィルタによる細胞の分離を行った後、基部における壁部と反対側の面に閉塞部材が取り付けられ、該閉塞部材により多孔領域が塞がれる。これにより、壁部の内側に培養液を保持することができる。流体サンプルから分離した細胞を、他の容器に移し替えることなく、そのまま培養することができる。
本開示に係る細胞分離フィルタ及び細胞培養容器によれば、流体サンプルから分離した細胞を、他の器具に移し替えることなくそのまま利用できる、という優れた効果が得られる。
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づき説明する。
［細胞分離フィルタ］
図１において、本実施形態に係る細胞分離フィルタ１０は、板状の基部１２と、多孔領域１４と、壁部１６とを有している。この細胞分離フィルタ１０は、金属又は樹脂で構成されている。金属製の細胞分離フィルタ１０は、例えば、Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用して製造される。樹脂製の細胞分離フィルタ１０は、例えば、Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用して製造した金型を用いて成形される。樹脂は、透明であることが好ましいが、不透明であってもよい。
図１において、本実施形態に係る細胞分離フィルタ１０は、板状の基部１２と、多孔領域１４と、壁部１６とを有している。この細胞分離フィルタ１０は、金属又は樹脂で構成されている。金属製の細胞分離フィルタ１０は、例えば、Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用して製造される。樹脂製の細胞分離フィルタ１０は、例えば、Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用して製造した金型を用いて成形される。樹脂は、透明であることが好ましいが、不透明であってもよい。
金属の材質は、例えばパラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、イリジウム（Ｉｒ）、ロジウム（Ｒｈ）又はルテニウム（Ｒｕ）の少なくとも何れか１つを含む。この材質は、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、イリジウム（Ｉｒ）、ロジウム（Ｒｈ）若しくはルテニウム（Ｒｕ）の単体金属でもよく、例えば、パラジウム（Ｐｄ）・ニッケル（Ｎｉ）合金、白金（Ｐｔ）・ニッケル（Ｎｉ）合金でもよく、金（Ａｕ）・ニッケル（Ｎｉ）合金等でもよい。合金の場合、ニッケルなどの相手金属に対し、上記の金属の比率が多いことが望ましい。
これらの金属は、例えばニッケル（Ｎｉ）などの金属と比べると、細胞に対する毒性が非常に低い。理由としては、パラジウム（Ｐｄ）自体の毒性が低いことと、Ｐｄとニッケル（Ｎｉ）の合金は固溶体を形成することによりニッケル（Ｎｉ）の溶出を防ぐことができるからである。これらのうち、金属コスト、低毒性の点で、パラジウム又はパラジウム（Ｐｄ）・ニッケル（Ｎｉ）の合金が好ましく、Ｐｄ・Ｎｉ合金の場合、Ｐｄが５０％（重量）超である合金、例えばＰｄ８０％・Ｎｉ２０％の合金が好ましい。ＰｄとＮｉの合金フィルタ、Ｐｄフィルタ等は、耐酸性、耐熱性を有し、フィルタのままＦＩＳＨ法などの種々の染色が可能であり、そのまま（正立）顕微鏡観察することができる。また、硬性かつ耐久性が高く、表面処理なしでも細胞が接着し難い。
板状の基部１２は、例えば円盤状に形成されている。なお、基部１２は、図示しない細胞分離デバイスの濾過ユニットに装着されるフィルターリング（カセット）に配置可能であればよく、基部１２の形状は方形等であってもよい。基部１２のサイズは、血液等の流体サンプル量、後述する孔２０の径、時間、流速、耐圧等の物理的要因、操作性、コスト等を考慮して適宜決定される。例えば血液５ｍＬを処理する場合、直径（円形の場合）、又は、縦、横の長さ（方形の場合）は、通常約１０〜１５ｍｍであるが、血液量に応じて、サイズを非限定的に、例えば約５〜２０ｍｍの範囲とすることもできる。また、基部１２の厚さは、孔密度、耐圧、コストなどとの関係を考慮して適宜決定され、通常１０〜４０μｍ、好ましくは約１５〜４０μｍである。
多孔領域１４は、基部１２に設けられている。この多孔領域１４には、図示しない流体サンプル中から分離対象の細胞１８（図２（Ａ）〜（Ｃ））を分離するための孔２０が多数形成されている。孔２０は、均一で規則的に配置されている。フィルタ表面積１ｃｍ２あたりの孔２０の密度は、配列の形態により異なるが、通常１×１０４〜２×１０５／ｃｍ２、好ましくは５×１０４〜１×１０５／ｃｍ２である。
また、孔２０の孔径は、分離対象の細胞１８を通過させず、かつ、分離対象外の細胞（図示せず）を通過させることができるサイズを有するものである。分離対象の細胞１８とは、例えば、末梢循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ；「ＣＴＣ」とも称する）又は希少細胞といったがん細胞である。分離対象外のヒト血球成分の大きさ（長径）は、ヒストグラム解析の結果、赤血球で約６〜７μｍ、白血球で約７〜９μｍ、血小板で５μｍ未満である。これに対して、分離対象となる細胞１８の大きさは、約１０〜２０μｍである。したがって、孔２０の最小径は、通常約７〜１０μｍ、好ましくは約７．５〜９μｍ、さらに好ましくは約７．５〜８．５μｍである。
孔２０の断面形状は、例えば図２（Ａ）〜（Ｃ）に示されるとおりである。図２（Ａ）に示される例では、孔２０が、入口側（上側）から出口側（下側）に向かって縮径すると共に、孔２０の内壁が、該孔２０の中心側に向かって凸の断面弧状に形成されている。図２（Ｂ）に示される例では、孔２０が、入口側（上側）から出口側（下側）に向かって縮径するテーパ状に形成されている。
図２（Ｃ）に示される例では、孔２０の入口側（上側）に該孔２０よりも大径の窪み２２が形成されている。孔２０の入口側（下側）は、図２（Ａ）に示される孔２０の形状を上下反転させた形状となっている。換言すれば、孔２０は、該孔２０の入口側（上側）から出口側（下側）に向かって拡径すると共に、孔２０の内壁が、該孔２０の中心側に向かって凸の断面弧状に形成されている。窪み２２のサイズは、分離対象の細胞１８が捕捉可能なサイズであればよく、非限定的に、例えば直径２０〜３０μｍ及び深さ５〜１５μｍ、好ましくは直径２５〜３０μｍ及び深さ１０μｍである。
図１において、壁部１６は、基部１２に一体的に形成され、多孔領域１４を囲んでいる。壁部１６は、例えば円環状に形成され、基部１２の上面側（図２（Ａ）〜（Ｃ）における孔２０の入口側）に立設されている。基部１２の上面からの壁部１６の高さは、分離対象の細胞１８の直径よりも大きいことが望ましく、例えば５〜１０μｍ、好ましくは６〜８μｍである。
壁部１６で囲まれた多孔領域１４は、複数設けられている。図１に示される例では、壁部１６で囲まれた多孔領域１４が、円形に配列されて例えば５箇所設けられている。なお、壁部１６で囲まれていない部分を、更に多孔領域１４としてもよい。また、各々の多孔領域１４毎に、孔２０の大きさや形状を変えてもよい。
壁部１６の配置は、図１に示される例に限られず、図３に示されるように、壁部１６を、基部１２の中央部から放射状に延びる直線部１６Ａと、基部１２の外周に沿って円環状に延びる環状部１６Ｂとで構成してもよい。直線部１６Ａと環状部１６Ｂは、複数の多孔領域１４をそれぞれ囲むように一体的に形成されている。この例では、基部１２の周方向に、壁部１６で囲まれた８箇所の多孔領域１４が形成されている。この他、壁部１６を格子状に構成してもよい。
［細胞培養容器］
図４において、本実施形態に係る細胞培養容器３０は、細胞分離フィルタ１０と、閉塞部材３２とを有している。閉塞部材３２は、細胞分離フィルタ１０の板状の基部１２における壁部１６と反対側の面（裏面）に取り付けられ、多孔領域１４を閉塞する部材である。この閉塞部材３２は、例えば基部１２と同等の面積を有するエラストマーやゴム等で構成されている。そして、閉塞部材３２は、分離対象の細胞１８を捕捉した状態の細胞分離フィルタ１０の裏面側に、接着や貼着等により取り付けられる。この閉塞部材３２により、多孔領域１４の孔２０（図２（Ａ）〜（Ｃ））が塞がれる。
図４において、本実施形態に係る細胞培養容器３０は、細胞分離フィルタ１０と、閉塞部材３２とを有している。閉塞部材３２は、細胞分離フィルタ１０の板状の基部１２における壁部１６と反対側の面（裏面）に取り付けられ、多孔領域１４を閉塞する部材である。この閉塞部材３２は、例えば基部１２と同等の面積を有するエラストマーやゴム等で構成されている。そして、閉塞部材３２は、分離対象の細胞１８を捕捉した状態の細胞分離フィルタ１０の裏面側に、接着や貼着等により取り付けられる。この閉塞部材３２により、多孔領域１４の孔２０（図２（Ａ）〜（Ｃ））が塞がれる。
（作用）
本実施形態は、上記のように構成されており、以下その作用について説明する。図２（Ａ）〜（Ｃ）において、本実施形態に係る細胞分離フィルタ１０では、分離対象の細胞１８を含む流体サンプルを、細胞分離フィルタの壁部１６側から壁部１６と反対側へ矢印Ａ方向に流すと、多孔領域１４の孔２０を通過できない大きさの細胞１８が捕捉され、孔２０を通過した細胞（図示せず）から分離される。細胞分離フィルタにおける板状の基部１２には、多孔領域１４を囲む壁部１６が一体的に形成されているので、壁部１６の内側で捕捉された細胞１８を、該壁部１６の内側に留めておき易い。このため、流体サンプルから分離した細胞１８を、他の器具に移し替えることなく、そのまま利用することができる。
本実施形態は、上記のように構成されており、以下その作用について説明する。図２（Ａ）〜（Ｃ）において、本実施形態に係る細胞分離フィルタ１０では、分離対象の細胞１８を含む流体サンプルを、細胞分離フィルタの壁部１６側から壁部１６と反対側へ矢印Ａ方向に流すと、多孔領域１４の孔２０を通過できない大きさの細胞１８が捕捉され、孔２０を通過した細胞（図示せず）から分離される。細胞分離フィルタにおける板状の基部１２には、多孔領域１４を囲む壁部１６が一体的に形成されているので、壁部１６の内側で捕捉された細胞１８を、該壁部１６の内側に留めておき易い。このため、流体サンプルから分離した細胞１８を、他の器具に移し替えることなく、そのまま利用することができる。
特に、本実施形態では、壁部１６で囲まれた多孔領域１４が複数設けられているので、流体サンプルを細胞分離フィルタ１０に通すと、分離対象の細胞１８（図２（Ａ）〜（Ｃ））が、複数の多孔領域１４においてそれぞれ捕捉される。多孔領域１４はそれぞれ壁部１６で囲まれているので、細胞１８を複数の条件下で利用することが可能となる。
細胞分離フィルタ１０が金属により構成されている場合、再利用性を高める等、低コスト化を図ることができる。また、細胞分離フィルタ１０が樹脂により構成されている場合、高価な金属と比較して更に低コスト化を図ることができる。更に、細胞分離フィルタ１０が透明な樹脂により構成されている場合、細胞分離フィルタ１０の下側から光を当てることで、顕微鏡による細胞１８の観察が行い易くなる。また、樹脂により構成された細胞分離フィルタ１０は、ディスポーザブルである。
図４において、細胞培養容器３０では、細胞分離フィルタ１０による細胞１８の分離を行った後、基部１２における壁部１６と反対側の面に閉塞部材３２が取り付けられ、該閉塞部材３２により多孔領域１４が塞がれる。これにより、壁部１６の内側に培養液３３を保持することができる。この結果、流体サンプルから分離した細胞１８を、他の容器に移し替えることなく、そのまま培養することができる。換言すれば、細胞分離フィルタ１０を培養皿として利用できる。壁部１６で囲まれた多孔領域１４が複数設けられている場合には、各多孔領域１４で培養された細胞１８を、互いに異なる条件下で利用することができる。一例として、複数種類の抗がん剤を、１つの細胞培養容器３０上で試すことができる。またこの場合には、細胞１８を複数の容器に移し替える必要がないので、移し替えの際に細胞１８を傷め、培養に適さなくなることを防止できる。
［金属製の細胞分離フィルタの量産方法］
図５（Ａ）〜（Ｅ）において、金属製の細胞分離フィルタ１０を量産する際には、上記のように、Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用して、基となる細胞分離フィルタ１０を製造する（図５（Ａ））。次に、この細胞分離フィルタ１０に対して樹脂成型を行う（図５（Ｂ））。この際、多孔領域１４の孔２０の内部まで樹脂２４が充填されるようにする。次に、脱型を行い、樹脂型２６を得る（図５（Ｃ））。この樹脂型２６に対して電鋳を行い（図５（Ｄ））、脱型を行うことで、金属製の細胞分離フィルタ１０を得ることができる（図５（Ｅ））。同様に、樹脂型２６への電鋳と脱型を繰り返すことにより、多孔領域１４及び壁部１６を有する金属製の細胞分離フィルタ１０を量産することができる。
図５（Ａ）〜（Ｅ）において、金属製の細胞分離フィルタ１０を量産する際には、上記のように、Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィー、及び電鋳を利用して、基となる細胞分離フィルタ１０を製造する（図５（Ａ））。次に、この細胞分離フィルタ１０に対して樹脂成型を行う（図５（Ｂ））。この際、多孔領域１４の孔２０の内部まで樹脂２４が充填されるようにする。次に、脱型を行い、樹脂型２６を得る（図５（Ｃ））。この樹脂型２６に対して電鋳を行い（図５（Ｄ））、脱型を行うことで、金属製の細胞分離フィルタ１０を得ることができる（図５（Ｅ））。同様に、樹脂型２６への電鋳と脱型を繰り返すことにより、多孔領域１４及び壁部１６を有する金属製の細胞分離フィルタ１０を量産することができる。
［樹脂製の細胞分離フィルタの量産方法］
図６（Ａ）〜（Ｅ）において、樹脂製の細胞分離フィルタ１０を量産する際には、上記のように、Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィーを利用して、細胞分離フィルタ１０（図５（Ａ））に相当する形状のフォトレジスト３４を製造する（図６（Ａ））。次に、このフォトレジスト３４に対して電鋳を行う（図６（Ｂ））。この際、フォトレジスト３４における多孔領域１４の孔２０（図５（Ａ））に相当する部分の内部まで電鋳金属３５が充填されるようにする。次に、脱型を行い、金型３６を得る（図６（Ｃ））。この金型３６に対して樹脂成形を行い（図６（Ｄ））、脱型を行うことで、樹脂製の細胞分離フィルタ１０を得ることができる（図６（Ｅ））。同様に、金型３６への樹脂成形と脱型を繰り返すことにより、多孔領域１４及び壁部１６を有する樹脂製の細胞分離フィルタ１０を量産することができる。
図６（Ａ）〜（Ｅ）において、樹脂製の細胞分離フィルタ１０を量産する際には、上記のように、Ｘ線又は紫外線によるリソグラフィーを利用して、細胞分離フィルタ１０（図５（Ａ））に相当する形状のフォトレジスト３４を製造する（図６（Ａ））。次に、このフォトレジスト３４に対して電鋳を行う（図６（Ｂ））。この際、フォトレジスト３４における多孔領域１４の孔２０（図５（Ａ））に相当する部分の内部まで電鋳金属３５が充填されるようにする。次に、脱型を行い、金型３６を得る（図６（Ｃ））。この金型３６に対して樹脂成形を行い（図６（Ｄ））、脱型を行うことで、樹脂製の細胞分離フィルタ１０を得ることができる（図６（Ｅ））。同様に、金型３６への樹脂成形と脱型を繰り返すことにより、多孔領域１４及び壁部１６を有する樹脂製の細胞分離フィルタ１０を量産することができる。
［他の実施形態］
以上、本発明の実施形態の一例について説明したが、本発明の実施形態は、上記に限定されるものでなく、上記以外にも、その主旨を逸脱しない範囲内において種々変形して実施可能であることは勿論である。
以上、本発明の実施形態の一例について説明したが、本発明の実施形態は、上記に限定されるものでなく、上記以外にも、その主旨を逸脱しない範囲内において種々変形して実施可能であることは勿論である。
例えば、壁部１６で囲まれた多孔領域１４が複数設けられているものとしたが、壁部１６で囲まれた多孔領域１４を１箇所としてもよい。また、細胞分離フィルタ１０が金属又は樹脂で構成されるものとしたが、他の材料で構成されるものであってもよい。
２０１５年８月６日に出願された日本国特許出願２０１５−１５５９３７号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載されたすべての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
本明細書に記載されたすべての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (3)
- 板状の基部と、
前記基部に設けられ、流体サンプル中から分離対象の細胞を分離するための孔が形成された多孔領域と、
前記基部に一体的に形成され、前記多孔領域を囲む壁部と、
を有し、
前記壁部で囲まれた前記多孔領域が複数設けられている細胞分離フィルタ。 - 請求項１に記載の細胞分離フィルタと、
前記細胞分離フィルタの前記基部における前記壁部と反対側の面に取り付けられ、前記多孔領域を閉塞する閉塞部材と、
を有する細胞培養容器。 - 板状の基部と、前記基部に設けられ、流体サンプル中から分離対象の細胞を分離するための孔が形成された多孔領域と、前記基部に一体的に形成され、前記多孔領域を囲む壁部と、を有する細胞分離フィルタと、
前記細胞分離フィルタの前記基部における前記壁部と反対側の面に取り付けられ、前記多孔領域を閉塞する閉塞部材と、
を有する細胞培養容器。
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