JP6741984B2 - 流体デバイス - Google Patents

Description

本発明は、流体デバイスに関する。

血球などの細胞および生体組織に含まれる核酸は、生体の遺伝子情報を担っていることから、診断などに用いられている。そこで、細胞および生体組織から核酸を分離する種々の手段が提案されている（例えば、非特許文献１などを参照）。非特許文献１には、血球から核酸を分離する手段として、血球を溶解させる領域と所望の核酸を捕捉する領域とを含むマイクロ流路を有する流体デバイスが提案されている。一方、筋組織などの生体組織からの核酸の分離の際には、ホモジナイザーなどによる生体組織の物理的な破砕、不要成分の分離除去、核酸の抽出などの複雑な操作が行なわれている。

ヒューズ−チンコタ（Ｃｈａｎｔｅｌｌｅ Ｎ． Ｈｕｇｈｅｓ−Ｃｈｉｎｋｈｏｔａ）ら、「マイクロ流体チップ上でのｍＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成のための１０−（カルボメトキシ）デシル−ジメチルクロロシランを用いたオリゴヌクレオチド固定化〔Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ １０−（ｃａｒｂｏｍｅｔｈｏｘｙ）ｄｅｃｙｌ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ ｆｏｒ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｎ ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐ〕」、センサーズ・アンド・アクチュエーターズＢ：ケミカル（Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、第１５５巻、第２号、２０１１年７月２０日、ｐ．４３７−４４５

本発明の課題は、生体組織が粗破砕されるようにするとともに、粗破砕後の生体組織を適度に目詰まりさせるとともに生体試料を適度に流通させることである。

本発明は、１つの側面では、生体組織から核酸を単離するための流体デバイスであって、壁部と当該壁部によって囲まれた流路空間とを含み、前記生体組織を含む生体試料を流通可能な流路と、前記流路の中途に設けられ、前記生体組織との接触部に凹凸構造を有し、前記生体組織と前記接触部とが接触した状態での当該接触部に対する生体組織の相対的な移動によって当該生体組織を粗破砕する粗破砕部と、前記流路の壁部から前記流路空間に突き出した複数個の突出構造体が、前記流路における生体試料の流れ方向に沿って、当該流路の前記粗破砕部の下流側に配置された突出構造体アレイと、を備えており、前記突出構造体アレイにおいて、前記流路における生体試料の流れ方向に沿って、上流側に配置された突出構造体の間または前記流路の壁部と当該上流側に配置された突出構造体との間を通過する生体組織が接触するように、下流側の突出構造体が配置されていることを特徴とする流体デバイスに関する。

本実施形態に係る流体デバイスは、前記生体組織との接触部に凹凸構造を有する粗破砕部が前記流路の中途に設けられ、かつ当該流路の前記粗破砕部の下流側に、複数個の突出構造体が配置された突出構造体アレイが設けられており、突出構造体アレイにおいて、上流側に配置された突出構造体の間または前記流路の壁部と当該上流側に配置された突出構造体との間を通過する生体組織が接触するように、下流側の突出構造体が配置されている。そのため、本実施形態に係る流体デバイスでは、粗破砕部において、生体試料に含まれる生体組織が接触部に対する相対的に移動によって粗破砕され、粗破砕後の生体組織の断片の一部が、前記突出構造体アレイの突出構造体に接触して破砕される。一方、前記突出構造体の一部の間に、前記粗破砕後の生体組織の断片の一部が捕捉され、生体試料の流通に伴なって前記生体組織の断片がさらに破砕される。また、上流側の列の突出構造体の間を通過した前記粗破砕後の生体組織の断片の一部は、下流側の突出構造体に接触するか、当該下流側の突出構造体の間をさらに通過する。これにより、前記突出構造体アレイにおいて、生体組織を適度に目詰まりさせるとともに生体試料を適度に流通させることができる。したがって、本実施形態に係る流体デバイスによれば、生体試料を当該流体デバイスに流すという簡単な操作で生体組織から高い回収率で核酸を取得することができる。また、１つの流体デバイスにおいて、生体組織の粗破砕から核酸の分離までの一連の工程を行なうことができるため、本実施形態に係る流体デバイスによれば、生体組織からの核酸の回収率を向上させることができる。

前記流路は、前記突出構造体アレイを流通した生体試料を当該突出構造体アレイに循環させる循環流路をさらに有していることが好ましい。この場合、生体組織の破砕をより確実に行なうことができることから、核酸の回収率を一層向上させることができる。

また、前記流路において、前記突出構造体アレイよりも下流側に、生体組織から分離された核酸を回収する回収部をさらに備えることが好ましい。この場合、１つの流体デバイスにおいて、生体組織から分離された核酸を回収することができることから、核酸の分解を抑制することができ、核酸の回収率を向上させることができる。

前記粗破砕部は、前記生体組織との接触面に複数個の微細有底孔からなることが好ましい。この場合、生体試料に含まれる生体組織が接触部に対して相対的に移動する際に、複数個の微細有底孔に生体組織の表面がひっかかるので、当該生体組織が粗破砕されやすい。

前記流路における前記粗破砕部の下流側で、かつ前記突出構造体アレイの上流側には、前記粗破砕部で粗破砕されていない生体組織を濾別する濾過部をさらに有していることが好ましい。この場合、粗破砕されていない生体組織を除去することができるので、突出構造体アレイでの生体組織からの核酸の分離をより確実に行なうことができる。

前記濾過部は、複数個のピラーからなる複数列のピラー列を有しており、前記複数個のピラーは、隣接するピラーの間の配置間隔が前記生体試料の流れ方向上流から下流に向かって漸次密となるように配置されていることが好ましい。この場合、粗破砕されていない生体組織をより確実に除去することができる。

前記複数個の突出構造体は、前記複数個の突出構造体は、隣接する突出構造体の間の配置間隔が前記生体試料の流れ方向上流から下流に向かって漸次密となるように配置されていることが好ましい。この場合、生体試料が流路の下流側に流れるにしたがって当該生体試料に含まれる生体組織が徐々に破砕される。また、流路の下流側の突出構造体の間から順に、破砕された生体組織による目詰まりが生じる。したがって、かかる構成が採用された流体デバイスによれば、突出構造体アレイにおける上流側の突出構造体の間における粗大な生体組織の目詰まりによって生体試料の流通が短時間で停止するのを抑制することができるので、生体組織をより確実に破砕することができる。

前記突出構造体は、前記生体試料の流れ方向の上流側に向かって尖った尖頭形状を有することが好ましい。この場合、前記突出構造体との接触によってせん断応力が生体組織に与えられやすくなる。したがって、かかる構成が採用された流体デバイスによれば、破砕される生体組織の量を向上させることができ、生体組織からの核酸の回収率をより向上させることができる。

前記流路において、前記生体試料の流れ方向最下流に配置された前記流路の幅方向に隣接する突出構造体の間の配置間隔は、前記生体組織に含まれる細胞の大きさよりも小さい間隔であることが好ましい。この場合、個々の細胞を確実に破砕できるため、細胞からの核の流出の効率を向上させることができる。

前記突出構造体の両端は、前記流路の内面に接していることが好ましい。この場合、流体デバイスの強度を確保することができる。

本発明によれば、簡単な操作で生体組織から核酸を取得することができる新たな手段を提供することができる。

（Ａ）は本発明の一実施形態に係る流体デバイスを模式的に示す概略平面説明図、（Ｂ）は本発明の一実施形態に係る流体デバイスを模式的に示す概略側面説明図である。 （Ａ）は粗破砕部を分解した状態を模式的に示す概略斜視説明図、（Ｂ）は粗破砕部の要部を模式的に示す概略断面説明図である。 （Ａ）粗破砕部の要部を模式的に示す概略平面説明図、（Ｂ）は微細孔有底孔部の一部拡大説明図、（Ｃ）はピラー構造部の一部拡大説明図である。 分離部を模式的に示す概略平面説明図である。 回収部の要部を模式的に示す概略断面説明図である。 製造例１で得られた粗破砕部の要部を模式的に示す概略平面説明図である。 製造例２で得られた分離部の一部拡大説明図である。 （Ａ）は製造例３で得られた回収部を分解した状態を模式的に示す概略斜視説明図、（Ｂ）は回収部の要部を模式的に示す概略斜視説明図である。 （Ａ）は試験例１において、製造例１で得られた粗破砕部を用いて粗破砕を行なう前の筋組織の状態を示す図面代用写真、（Ｂ）は試験例１において、製造例１で得られた粗破砕部を用いて粗破砕を行なった後の筋組織の状態を示す図面代用写真、（Ｃ）は図７（Ｂ）の一部を拡大した図面代用写真である。 試験例１において、製造例１で得られた粗破砕部を用いて粗破砕を行なった後の組織の粒径分布を調べた結果を示すグラフである。 （Ａ）は試験例２において、１回目の送液時の突出構造体アレイにおける組織の状態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は試験例２において、２回目の送液時の突出構造体アレイにおける組織の状態を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｃ）は試験例２において、３回目の送液時の突出構造体アレイにおける組織の状態を観察した結果を示す図面代用写真を示す。 試験例２において、３回目の送液後の試料に含まれる組織の粒径分布を調べた結果を示すグラフである。 試験例２において、分離部への送液回数と得られた試料におけるｍＲＮＡ濃度との関係を調べた結果を示すグラフである。 （Ａ）は試験例３において、ビーズ充填量とＲＮＡ回収量との関係を調べた結果を示すグラフ、（Ｂ）は試験例３において、分離時間とＲＮＡ回収量との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例４において、静置下でｍＲＮＡ精製用ビーズにＲＮＡを吸着させたときのｍＲＮＡ回収量および灌流下でｍＲＮＡ精製用ビーズにＲＮＡを吸着させたときのｍＲＮＡ回収量を調べた結果を示すグラフである。

［用語の説明］
本明細書において、「生体試料」とは、生体組織を含む試料をいう。生体試料は、通常、生体組織を含む。生体組織としては、例えば、筋組織、血液、肝臓組織などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

また、本明細書において、「生体組織の残渣」とは、生体組織における核酸以外の成分をいう。かかる生体組織の残渣としては、生体組織に含まれる細胞の細胞膜などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

さらに、本明細書において、「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の総称をいう。ＲＮＡの概念には、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡが包含される。なお、本明細書において、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡを含むＲＮＡを「全ＲＮＡ」ともいう。

［流体デバイスの全体構成］
以下、添付図面を参照しつつ、本発明の一実施形態に係る流体デバイスを詳細に説明する。図１（Ａ）は本発明の一実施形態に係る流体デバイス１の流路を模式的に示す概略平面説明図、図１（Ｂ）は本発明の一実施形態に係る流体デバイス１を模式的に示す概略側面説明図である。

本実施形態に係る流体デバイス１は、図１（Ａ）に示されるように、流路２の中途に、生体組織の粗破砕するための粗破砕部１０と、粗破砕後の組織を破砕して当該組織から核酸を分離するための分離部２０と、分離された核酸を回収するための回収部３０とを備えている。

流路２は、マイクロ流路である。ここで、「マイクロ流路」とは、ガラス製基板、シリコーン樹脂製基板などの基板上に微細加工された溶液を送液可能な溝であって、幅および深さが５０μｍ〜１５００μｍである溝をいう。流路２は、壁部２ａと、壁部２ａで囲まれた流路空間とを含む。流路２の端部には、第１インレット５、第２インレット６およびアウトレット７が設けられている。流体デバイス１は、基板３と、基板３の上面に接合された天板４とから構成されている。流体デバイス１は、流体が粗破砕部１０、分離部２０および回収部３０の順に流通し、アウトレット７から排出されるように構成されている。以下において、便宜上、流路２における第１インレット５側を「上流側」、アウトレット７側を「下流」という。基板３の材料としては、例えば、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン樹脂；ポリカーボネート、環状オレフィンコポリマー、シクロオレフィンコポリマーなどの汎用透明エンジニアリングプラスチック；ガラス；フォトレジストなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの材料のなかでは、精密な流路などの形成が容易であることから、ポリジメチルシロキサン、フォトレジストなどが好ましい。天板４の材料としては、例えば、ガラス、シリコーン樹脂、汎用透明エンジニアリングプラスチックなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの材料のなかでは、流体デバイス１内の密封度を維持することができ、接合が容易である観点から、ガラス、シリコーン樹脂が好ましい。

流体デバイス１によれば、流路２の中途に、粗破砕部１０と、分離部２０と、回収部３０とを有しているので、生体試料に含まれる生体組織の粗破砕、粗破砕後の組織からの核酸の分離および核酸の回収の一連の操作を１つの流体デバイス１の流路２上で行なうことができる。したがって、流体デバイス１によれば、生体組織からの核酸の単離に際して、当該核酸を分解する酵素との接触などに起因する核酸の回収量の低減を抑制することができる。

また、流体デバイス１は、粗破砕部１０の上流側の流路と、分離部２０の下流側の流路とが接続されるように、第１インレット５と第２インレット６との間にポンプ９を介して接続された循環流路８を有している。この場合、第２インレット６は、アウトレットとして機能する。循環流路８は、分離部２０を通って破砕された生体試料を含む液体を、再度、分離部２０に戻す。これにより、突出構造体アレイ２２の突出構造体２２ａ間で捕捉される生体組織の量が増加するので、流体デバイス１によれば、生体組織の破砕をより確実に行なうことができ、生体組織から核酸の回収率をより一層向上させることができる。

［粗破砕部］
粗破砕部１０は、粗破砕部本体１０ａと、天板１０ｂと、円筒部１０ｃとから構成されている〔図２（Ａ）参照〕。生体組織の粗破砕を行なう場合、粗破砕部１０は、図示しない撹拌子と、例えば、必要により、生体組織を溶解させるための試薬などとともに用いられる。前記生体組織を溶解させるための試薬としては、例えば、タンパク質の溶解性を高める界面活性剤、タンパク質変性剤、酵素溶液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

粗破砕部本体１０ａは、流体デバイス１の基板３の一部からなる。粗破砕部本体１０ａは、マイクロパターン１１と、マイクロパターン１１の上流側に形成されたインレット１２に対応する有底孔部１０ａ１および上流側流路１３と、マイクロパターン１１の下流側に形成された下流側流路１５とを有している。粗破砕部本体１０ａにおいて、マイクロパターン１１の外周側には、図示しないチャンバー外流路が形成されている。

マイクロパターン１１は、図３（Ａ）に示されるように、生体組織との接触部としての微細有底孔部１１ａと、濾過部としてのピラー構造部１１ｂとから構成されている。微細有底孔部１１ａは、図３（Ｂ）に示されるように、同心円状に複数列配置された複数個の微細有底孔１０１から構成されている。このように、微細有底孔部１１ａは、複数個の微細有底孔１０１を有しているので、生体試料に含まれる生体組織と微細有底孔部１１ａとが接触した状態で微細有底孔部１１に対して生体組織が相対的に移動することにより、摩擦力によって生体組織が粗破砕される。微細有底孔部１１に対する生体組織の相対的な移動は、例えば、図示しないスターラーと撹拌子とを用いることによって行なうことができる。微細有底孔１０１の直径Ｄ１は、粗破砕後に下流側流路１５内に導入できる大きさの組織断片を得る観点から、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは５０μｍ以下である。なお、微細有底孔１０１の直径Ｄ１の下限は、生体組織を粗破砕するのに適したマイクロパターンの微細加工精度が得られる範囲であればよい。通常、微細有底孔１０１の直径Ｄ１は、微細加工精度の観点から、好ましくは３０μｍ以上、より好ましくは２０μｍ以上である。ピラー構造部１１ｂは、図３（Ｃ）に示されるように、微細有底孔部１１ａの外周側に周方向に沿って形成された３列のピラー列１６，１７，１８から構成されている。これにより、微細有底孔部１１ａで粗破砕された生体組織を含む生体試料は、微細有底孔部１１ａからピラー構造部１１ｂを経て図示しないチャンバー外流路に向けて流れる。ピラー列１６，１７，１８は、それぞれ、周方向に沿って等間隔に形成された複数個の四角柱状のピラー１０２からなる。ピラー１０２の形状は、粗破砕されていない生体組織を捕捉することができる形状であればよい。ピラー１０２の高さは、粗破砕されていない生体組織を効率よく捕捉する観点から、粗破砕部本体１０ａと天板１０ｂとを接合させたときに、ピラー１０２の頂端が天板１０ｂに接合可能な高さであることが好ましい。ピラー列１６，１７，１８それぞれにおけるピラー１０２間の周方向間隔Ｌ_１，Ｌ_２，Ｌ_３は、例えば、マイクロパターン１１の直径Ｄ１とマイクロパターン１１によって粗破砕されることによって得られる組織片の大きさなどに応じて適宜決定することができる。前記周方向間隔は、粗破砕されていない生体組織を効率よく捕捉する観点から、通常、Ｌ_１、Ｌ_２およびＬ_３の順で小さくなるように設定されていることが好ましい。これにより、複数個のピラー１０２は、隣接するピラー１０２の間の配置間隔が前記生体試料の流れ方向上流から下流に向かって漸次密となるように配置される。周方向間隔Ｌ_１は、粗破砕されていない生体組織を効率よく捕捉する観点から、好ましくは３００μｍ以上であり、下流側流路１５内に導入できる大きさの組織片によるピラー１０２間の流通が、ピラー１０２間の周方向間隔よりも大きな組織片によって妨げられるのを抑制する観点から、好ましくは５００μｍ以下である。周方向間隔Ｌ_２は、周方向間隔Ｌ_１のピラー１０２間の間隙から周方向間隔Ｌ_２のピラー１０２間の間隙を経て周方向間隔Ｌ_３のピラー１０２間の間隙に向かって生体組織が流通するのにしたがって捕捉される組織片の大きさが徐々に小さくなるようにする観点から、好ましくは２００μｍ以上であり、好ましくは４００μｍ以下である。周方向間隔Ｌ_３は、ピラー１０２間の周方向間隔よりも大きな組織片によって分離部流路２１全体を完全に閉塞することを防ぐ観点から、好ましくは１００μｍ以上であり、周方向間隔Ｌ_１のピラー１０２間の間隙から周方向間隔Ｌ_２のピラー１０２間の間隙を経て周方向間隔Ｌ_３のピラー１０２間の間隙に向かって生体組織が流通するのにしたがって捕捉される組織片の大きさが徐々に小さくなるようにする観点から、好ましくは２５０μｍ以下である。ピラー構造部１１ｂは、ピラー１０２間で粗破砕後の組織のうち、前記周方向間隔を超える粒径を有する組織を捕捉して除去する物理フィルタとして機能することができる。

天板１０ｂは、流体デバイス１の天板４の一部からなる。天板１０ｂは、粗破砕部本体１０ａのマイクロパターン１１に対応する位置に形成された貫通孔部１０ｂ１と、インレット１２に対応する貫通孔部１０ｂ２とを有している（図２参照）。貫通孔部１０ｂ１の内径は、粗破砕されていない生体組織をピラー構造部１１ｂで効率よく捕捉する観点からマイクロパターン１１のピラー構造部１１ｂの内周よりも小さい径であることが好ましい。

円筒部１０ｃは、図３（Ｂ）に示されるように、粗破砕部本体１０ａのマイクロパターン１１の部分と、天板１０ｂの貫通孔部１０ｂ１とともに、有底円筒状のチャンバー１４を形成している。粗破砕部１０の使用時には、チャンバー１４内に撹拌子が収容される。円筒部１０ｃの内径は、天板１０ｂの貫通孔部１０ｂ１の内径と同様である。円筒部１０ｃの材料としては、例えば、ガラス、高硬度シリコーン樹脂、汎用透明エンジニアリングプラスチックなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

［分離部］
分離部２０は、生体組織を捕捉するとともに生体試料の流通によって前記生体組織を破砕し、当該生体組織に含まれる核酸含有成分を当該生体組織から分離する。分離部２０は、図４に示されるように、分離部流路２１と、突出構造体アレイ２２とを含む。

分離部流路２１は、流路２の一部であり、基板３上に形成されている。分離部流路２１は、上部が天板４によって塞がれており、断面中空形状とされている。分離部流路２１の幅Ｗ_１は、通常、流体デバイスの製造時における微細加工の容易性を確保するとともに、送液に必要な印加圧力が小さくして送液を容易に行なう観点から、好ましくは５００μｍ以上、より好ましくは７５０μｍ以上であり、流路の容積を小さくして必要な資料の量を低減させる観点から、好ましくは１５００μｍ以下、より好ましくは１０００μｍ以下である。また、分離部流路２１の深さは、通常、送液に要する印加圧力を小さくして送液を容易に行なう観点から、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１００μｍ以上であり、流体デバイスの製造時における微細加工の容易性を確保する観点から、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは２５０μｍ以下である。

突出構造体アレイ２２は、分離部流路２１の中途に設けられている。突出構造体アレイ２２においては、１または複数個の四角柱状の突出構造体２２ａが、分離部流路２１における生体試料の流れ方向に沿って複数列配置される。また、突出構造体２２ａは、分離部流路２１における生体試料の流れ方向に隣接する列において、分離部流路２１の幅方向に互いにずれて配置されている。流体デバイス１に生体試料を流すと、生体試料に含まれる生体組織の一部が、突出構造体アレイ２２の突出構造体２２ａに接触して破砕される。一方、突出構造体２２ａの一部の間に、生体試料に含まれる生体組織の一部が捕捉され、生体試料の流通に伴なって生体組織が破砕される。また、上流側の列の突出構造体２２ａの間を通過した生体組織の一部は、下流側の突出構造体２２ａに接触するか、当該下流側の突出構造体２２ａの間をさらに通過する。これにより、突出構造体アレイ２２においては、一部の突出構造体２２ａの間で生体組織が適度に目詰まりを起こす一方、一部の突出構造体２２ａの間で生体試料を適度に流通させることができる。このように、流体デバイス１の分離部２０においては、上流側に配置された突出構造体２２ａの間または流路２の壁部２ａ（分離部流路２１の壁部２１ａ）と当該上流側に配置された突出構造体２２ａとの間を通過する生体組織が接触するように、下流側の突出構造体２２ａが配置されていればよい。

本実施形態においては、突出構造体２２ａは、基板３における流路２の内面に相当する部分から流路２の軸心に向かって垂直方向に延びるように突き出した構造を有している。また、突出構造体２２ａの上端面は、天板４に接合されている。このように、突出構造体２２ａの両端は、流路２の内面に接している。したがって、流体デバイス１の強度を確保することができる。

突出構造体２２ａの対角線長さは、突出構造体２２ａの強度を確保し、かつ天板４との接合面積を十分に確保する観点から、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１００μｍ以上であり、生体組織を捕捉するとともに生体試料の流通によって前記生体組織を破砕するのに十分な個数の突出構造体２２ａをマイクロ流路内に設ける観点から、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以下である。

複数個の突出構造体２２ａは、分離部流路２１の流れ方向に沿って等間隔になるように配置されている。分離部流路２１の流れ方向における突出構造体２２ａ間の間隔は、流体デバイスの製造時における微細加工の容易性を確保する観点から、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１００μｍ以上であり、生体試料を下流側に流通させやすくする観点から、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは２５０μｍ以下である。

また、突出構造体２２ａは、分離部流路２１の幅方向に沿って等間隔に配置されている。また、突出構造体アレイ２２において、突出構造体２２ａは、分離部流路２１の上流から下流に向かって分離部流路２１の幅方向における複数個の突出構造体２２ａの配置間隔が漸次密となるように配置されている。これにより、生体試料が流路２の下流側に流れるにしたがって当該生体試料に含まれる生体組織が徐々に破砕される。また、流路２の下流側の突出構造体２２ａの間から順に、破砕された生体組織による目詰まりが生じる。したがって、流体デバイス１によれば、突出構造体アレイ２２における上流側の突出構造体２２ａの間における粗大な生体組織の目詰まりによって生体試料の流通が短時間で停止するのを抑制することができるので、生体組織をより確実に破砕することができる。

突出構造体アレイ２２の流れ方向最下流側において、分離部流路２１の幅方向に隣接する突出構造体２２ａの間の間隔Ｗ_２は、生体組織の破砕後の残渣の除去を容易にすることができ、生体組織から核酸をより確実に分離することができることから、生体組織に含まれる細胞の大きさよりも小さい間隔であることが好ましい。なお、細胞の大きさは、粒度分布画像解析装置を用いて細胞１００個の面積を求め、円面積相当径を算出することによって求めることができる。分離部流路２１の幅方向における突出構造体２２ａ間の間隔Ｗ_２は、通常、流体デバイスの製造時における微細加工の容易性を確保するとともに、送液に必要な印加圧力が小さくして送液を容易に行なう観点から、好ましくは５μｍ以上、より好ましくは１０μｍ以上であり、生体組織の破砕をより確実に行ない、生体組織から核酸をより確実に分離する観点から、好ましくは２０μｍ以下、より好ましくは１５μｍ以下である。

突出構造体２２ａは、生体試料の流れ方向の上流側に向かって尖った尖頭形状を有する。これにより、突出構造体２２ａとの接触によって破砕される生体組織の量を向上させることができ、生体組織からの核酸の回収率をより向上させることができる。突出構造体２２ａの流路軸方向に沿った断面形状は、四角形状に限定されるものではない。突出構造体２２ａの断面形状が四角形状である場合、生体組織の捕捉を行なうとともに、生体試料に含まれる液体成分の流通を円滑に行うことができることが期待される。

［回収部］
以下において、第１層基材６１、第２層基材６２、フィルタ６６、第３層基材６３、第４層基材６４および第５層基材６５から構成された回収部３０を例として挙げて説明するが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。本実施形態において、回収部３０は、第１層基材６１、第２層基材６２、フィルタ６６、第３層基材６３、フィルタ６６、第４層基材６４および第５層基材６５がこの順に積層された構造を有している。なお、第４層基材６４は、天板４の一部である。また、第５層基材６５は、基板３の一部である。

回収部３０は、図１および図５に示されるように、破砕物流路３１と、第２インレット流路３２と、マイクロカラム部３３と、回収流路３５と、回収口３６と、担体充填口３７と、担体充填流路３８とを有している。

破砕物流路３１は、分離部２０から導出された破砕物をマイクロカラム部３３に搬送する流路である。破砕物流路３１は、第５層基材６５に形成された溝部である。破砕物流路３１は、分離部２０の分離部流路２１およびマイクロカラム部３３に接続されている。

第２インレット流路３２は、第１層基材６１に形成された第２インレット６から第２層基材６２、フィルタ６６、第３層基材６３、フィルタ６６および第４層基材６４を厚さ方向に貫通する貫通孔と、第５層基材６５に形成された溝部とから構成されている。第２インレット流路３２は、流体デバイス１の第２インレット６、マイクロカラム部３３に接続されている。

マイクロカラム部３３は、核酸回収用担体３４と、マイクロカラム本体３９と、フィルタ６６とを含む。

核酸回収用担体３４は、マイクロカラム本体３９内に配置されている。本実施形態では、核酸回収用担体３４は、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度などの条件に応じて核酸に可逆的に結合または吸着し、かつ他の物質には結合または吸着しない性質を有している。核酸回収用担体３４としては、例えば、オリゴ（ｄＴ）を含む担体、シリカで表面がコーティングされた担体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。マイクロカラム本体３９の容積に対する核酸回収用担体３４の実体体積は、核酸を含む流体の流通時にマイクロカラム本体３９内で核酸回収用担体３４が流動する状態となる体積であることが好ましい。この場合、核酸の回収量を向上させることができる。

マイクロカラム本体３９は、図５において、第３層基材６３の厚さ方向に貫通した開口部である。マイクロカラム本体３９は、核酸を含む液体を内部に流通させて核酸と核酸回収用担体との接触を行なうことができる内径および高さを有していればよい。マイクロカラム本体３９の上側の開口部および下側の開口部は、それぞれ、フィルタ６６で閉じられている。

フィルタ６６は、破砕された生体試料内に含まれる不要物、例えば、細胞膜、神経、血管などを除去する。したがって、フィルタ６６は、最小間隔のマイクロピラー間を通過してきた不要物、例えば、細胞膜、神経、血管などを濾別可能な内径を有する微細孔を有しているものであればよい。微細孔の内径は、通常、核酸を含む液体を容易に送液する観点から、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは０．２μｍ以上であり、マイクロカラム本体３９内の核酸回収用担体を確実に封止するとともに、不要物を確実に除去する観点から、好ましくは１μｍ以下、より好ましくは０．５μｍ以下である。フィルタ６６の材料としては、例えば、ポリカーボネート、ニトロセルロース、セルロースアセテートなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。マイクロカラム部３３において、フィルタ６６は、マイクロカラム本体３９の上側の開口部および下側の開口部を閉じるようにマイクロカラム本体３９に接合されている。

回収流路３５は、マイクロカラム部３３で捕捉されなかった夾雑物質およびマイクロカラム部３３で捕捉された核酸を回収口３６に搬送する流路である。回収流路３５は、第１層基材６１に形成された溝部と第２層基材６２とによって形成されている。回収流路３５は、マイクロカラム部３３および回収口３６に接続されている。

回収口３６は、流体デバイス１のアウトレット７として用いられる。

担体充填口３７は、マイクロカラム本体３９内への核酸回収用担体３４の充填の際に用いられる。

担体充填流路３８は、担体充填口３７から投入された核酸回収用担体３４をマイクロカラム部３３に搬送する流路である。担体充填流路３８は、基材６３ａに形成されている。

［生体組織からの核酸の単離方法］
つぎに、前述の流体デバイス１を用いて生体組織から核酸を単離する方法について、説明する。本実施形態に係る方法は、
（Ａ）流体デバイス１の粗破砕部１０において、生体試料に含まれる生体組織を粗破砕するステップ、
（Ｂ）流体デバイス１の分離部２０において、粗破砕後の生体組織をさらに破砕するとともに生体組織から核酸を分離するステップ、および
（Ｃ）流体デバイス１の回収部３０において、核酸を回収するステップ
を含む。生体組織からの核酸の単離は、具体的には、例えば、以下のプロセスによって行なわれる。

まず、粗破砕部１０のチャンバー１４内に、生体試料と、撹拌子と、必要により、前記生体組織を溶解させるための試薬（以下、「組織溶解試薬」ともいう）とを入れる。生体試料が溶媒を含まず、生体組織のみからなる試料である場合、チャンバー１４内に適切な溶媒をさらに入れることができる。このように、チャンバー１４内に生体組織と溶媒とを存在させることにより、粗破砕時の摩擦熱の発生を抑制し、熱による核酸の不必要な変性を抑制することができる。

前記溶媒としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、滅菌水、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

前記組織溶解試薬としては、例えば、タンパク質の溶解性を高める界面活性剤、タンパク質変性剤、酵素溶液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記組織溶解試薬を用いる場合、当該組織溶解試薬の使用量は、生体組織の種類および量によって異なる。したがって、前記組織溶解試薬の使用量は、生体組織の種類および量に応じて適宜決定することが好ましい。

つぎに、例えば、スターラーなどを用いることによってチャンバー１４内の撹拌子を回転させ、撹拌子の回転時に当該撹拌子との間に生じる摩擦力によって生体組織を粗く破砕する。このとき、粗破砕後の組織の残渣の一部は、微細有底孔部１１ａの微細有底孔１０１内に蓄積される。また、粗破砕後の組織のうち、ピラー１０２間の周方向間隔を超える粒径を有する組織は、ピラー構造部１１ｂによって捕捉される。

つぎに、流体デバイス１の第１インレット５から流路２を介して粗破砕部１０のチャンバー１４内に陽圧を負荷するか、または第２インレット６から流路２を介して粗破砕部１０のチャンバー１４内に陰圧を負荷する。これにより、粗破砕部１０のチャンバー１４内の粗破砕後の生体組織のうち、マイクロパターン１１中のピラー１０２間の周方向間隔以下の粒径を有する生体組織を含む液体（以下、「粗破砕組織含有液」ともいう）を、図示しないチャンバー外流路を介して分離部２０内に搬送させることができる。分離部２０内に搬送された粗破砕後の生体組織の一部は、分離部２０内を通過する際に、突出構造体アレイ２２の突出構造体２２ａに接触して破砕される。また、粗破砕後の生体組織の一部は、一部の突出構造体２２ａの間に捕捉される。ここでは、生体試料の流通に伴なって生体組織が破砕される。一方、上流側の列の突出構造体２２ａの間を通過した生体組織の一部は、下流側の突出構造体２２ａに接触するか、当該下流側の突出構造体２２ａの間をさらに通過する。これにより、突出構造体アレイ２２においては、生体試料を適度に流通させることができる程度に生体組織が適度に目詰まりを起こす。ここでは、生体試料の流通に伴なって、粗破砕後の生体組織が破砕され、生体組織から核酸が分離される。

つぎに、担体充填口３７から担体充填流路３８を介してマイクロカラム本体３９内に核酸回収用担体３４を充填する。その後、流体デバイス１の第２インレット６から流路２に陽圧を負荷する。このとき、突出構造体アレイ２２では破砕された組織が目詰まりを起こしているため、分離された核酸を含む液体は、主に、回収部３０内に導入される。これにより、核酸をマイクロカラム部３３の核酸回収用担体３４に捕捉される。一方、分離された核酸を含む液体に核酸以外の夾雑物質が含まれる場合には、当該夾雑物質は、核酸回収用担体３４に捕捉されない。したがって、分離された核酸を含む液体を回収部３０内に導入させた後、第２インレット６から回収部３０に洗浄液を流すことにより、当該夾雑物質をアウトレット７（回収部３０の回収口３６）から排出させることができる。その後、核酸回収用担体３４から所望の核酸を解離させるのに適した解離試薬を第２インレット６から回収部３０に流すことにより、核酸回収用担体３４に捕捉された所望の核酸をアウトレット７（回収部３０の回収口３６）から回収することができる。

（製造例１）
シリコン製ウェハ〔直径：７．６２ｃｍ、厚さ：０．５ｍｍ〕の片面にネガ型フォトレジスト〔マイクロケム（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）製、商品名：ＳＵ−８ ２０７５〕を所望の塗り厚になるように前記ネガ型フォトレジストの取扱説明書に記載の手順にしたがってスピンコーターで塗布してレジスト塗布基材を得た。前記レジスト塗布基材を取扱説明書に記載の手順にしたがって加熱して前記レジスト塗布基材のフォトレジストを固化させた。その後、前記レジスト塗布基材のフォトレジストに対し、図６に示されるマイクロパターン５１に対応するパターンを有するフォトマスクを介して紫外線を照射した。

紫外線照射後の基材をレジスト現像液〔マイクロケム（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）製、商品名：ＳＵ−８ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ〕中に浸漬させることにより、現像を行なった。現像後の基材を水で洗浄後、乾燥させ、前記パターンを有するウエハを得た。前記パターンを有するウエハに離型処理を施し、レプリカモールドを得た。

一方、東レ・ダウコーニング（株）製の商品名：Ｓｉｌｐｏｔ １８４の主剤と硬化剤とを主剤／硬化剤（体積比）が１０／１となるように混合した。得られた混合物を前記レプリカモールドに流し込んだ。レプリカモールド中の混合物を１２０℃で１時間加熱して硬化させ、ポリジメチルシロキサン製の成型体を形成させた。前記成型体をレプリカモールドから離型させた。

プラズマリアクター〔ヤマト科学（株）製、商品名：ＰＲ−５００〕を用いて前記成型体の酸素プラズマ処理を行なって成形体の表面を活性化させた。

シリコン製ウェハ〔直径：７．６２ｃｍ、厚さ：０．５ｍｍ〕にマイクロパターン１１に対応する位置に形成された孔部と、インレット５２に対応する位置に形成された孔部とアウトレット５６に対応する孔部とを形成させ、天板を得た。

表面が活性化された前記成型体と、天板と、円筒状基材〔内径１２ｍｍ〕とを接合させ、図６に示される粗破砕部５０ａを得た。粗破砕部５０ａは、微細有底孔部５１ａおよびピラー構造部５１ｂを有するマイクロパターン５１、インレット５２、インレット流路５３、チャンバー５４、アウトレット流路５５およびアウトレット５６を含む。微細有底孔部５１ａの微細有底孔１０１の直径は、８０μｍである。ピラー構造部５１ｂは、図３に示されるマイクロパターン１１のピラー構造部１１ｂと同様に、３列のピラー列から構成されている。最内列のピラー列におけるピラー間の周方向間隔〔図３（Ｃ）のＬ_１に相当〕は３００μｍ、中間列のピラー列におけるピラー間の周方向間隔〔図３（Ｃ）のＬ_２に相当〕は２００μｍ、最外列のピラー列におけるピラー間の周方向間隔〔図３（Ｃ）のＬ_３に相当〕は１００μｍである。

（製造例２）
ガラス製基材〔直径：７．６２ｃｍ、厚さ：１ｍｍ〕の片面にネガ型フォトレジスト〔マイクロケム（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）社製、商品名：ＳＵ−８ ２０７５〕を所望の塗り厚になるように、前記ネガフォトレジストに添付の取扱説明書の記載の手順にしたがってスピンコーターで塗布してレジスト塗布基材を得た。前記レジスト塗布基材を前記ネガ型フォトレジストに添付の取扱説明書に記載の手順にしたがって加熱して前記レジスト塗布基材のフォトレジストを固化させた。その後、前記レジスト塗布基材のフォトレジストを、図７に示される分離部２０ａに対応するパターンを有するフォトマスクを介して紫外線を照射した。

紫外線照射後の基材をレジスト現像液〔マイクロケム（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）製、商品名：ＳＵ−８ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ〕に浸漬させることにより、現像を行なった。現像後の基材を水で洗浄後、乾燥させ、マイクロ流路および突出構造体アレイを有する第１の中間基板を得た。

つぎに、プラズマ装置〔ヤマト科学（株）製、商品名：プラズマリアクターＰＲ−５００〕を用いて第１の中間基板のマイクロパターン形成側の表面に酸素プラズマ処理を施して当該表面に水酸基を生成させた。酸素プラズマ処理後の表面の水酸基を、シランカップリング剤である３−アミノプロピルトリメトキシシランを用いてアミノプロピル基に置換した。

また、プラズマ装置〔ヤマト科学（株）製、商品名：プラズマリアクターＰＲ−５００〕を用いてシリコーン樹脂（ポリジメチルシロキサン）からなる天板用基材〔サイズ：２０×７０ｍｍ、厚さ：１ｍｍ〕の表面に酸素プラズマ処理を施した。

つぎに、プラズマ処理後の天板用基材とアミノプロピル基導入後の基板とを９０℃で１時間加熱しながら接触させて接合させた。その後、マイクロ流路のインレットおよびアウトレットの部分にリザーバーを接着剤で取り付けることにより、分離部２０ａを得た。

なお、分離部２０ａは、図７に示されるように、分離部流路２１と、突出構造体アレイ２２と、インレット２３と、アウトレット２４とを含む。分離部流路２１の幅（図４のＷ_１参照）は、１２００μｍである。また、分離部流路２１の深さは、１００μｍである。突出構造体アレイ２２において、突出構造体２２ａの対角線長さは、１００μｍである。分離部流路２１の流れ方向における突出構造体２２ａ間の間隔（図４のＬ_４参照）は、２００μｍである。複数個の突出構造体２２ａは、分離部流路２１の幅方向に沿って等間隔に配置されている。また、突出構造体アレイ２２においては、分離部流路２１の上流から下流に向かって分離部流路２１の幅方向における複数個の突出構造体２２ａの配置間隔が漸次密となるように、複数個の突出構造体２２ａが配置されている。突出構造体アレイ２２の流れ方向最下流側において、分離部流路２１の幅方向における突出構造体２２ａ間の間隔（図４のＷ_２参照）は、８μｍである。

（製造例３）
シリコン製ウェハ〔直径：７．６２ｃｍ、厚さ：1ｍｍ〕の片面にネガ型フォトレジスト〔マイクロケム（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）製、商品名：ＳＵ−８ ２０７５〕を所望の塗り厚になるように前記ネガ型フォトレジストに添付の取扱説明書に記載の手順にしたがってスピンコーターで塗布してレジスト塗布基材を得た。前記レジスト塗布基材を前記ネガ型フォトレジストに添付の取扱説明書に記載の手順にしたがって加熱して前記レジスト塗布基材のフォトレジストを固化させた。その後、前記レジスト塗布基材のフォトレジストに対し、図８（Ａ）に示される第１層基材６１ａの流路に対応するパターンを有するフォトマスクを介して紫外線を照射した。

紫外線照射後の基材をレジスト現像液〔マイクロケム（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）製、商品名：ＳＵ−８ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ〕に取扱説明書の記載にしたがって浸漬させることにより、現像を行なった。現像後の基材を水で洗浄後、乾燥させ、前記流路に対応するパターンを有するウエハを得た。前記パターンを有するウエハに離型処理を施し、レプリカモールドを得た。

一方、東レ・ダウコーニング（株）製の商品名：Ｓｉｌｐｏｔ １８４の主剤と硬化剤とを主剤／硬化剤（体積比）が１０／１となるように混合した。得られた混合物を前記レプリカモールドに流し込んだ。レプリカモールド中の混合物を１２０℃で１時間加熱して硬化させ、ポリジメチルシロキサン製の成型体を形成させた。前記成型体をレプリカモールドから離型させ、第１層基材６１ａを得た。

得られた第１層基材６１ａは、インレット３１ａに対応する位置に形成された貫通孔部３１ａ１と、マイクロカラム部３３ａに対応する位置に形成された有底孔部３３ａ１と、下流側流路３５ａと、アウトレット３６ａと、担体充填口３７ａに対応する位置に形成された貫通孔部３７ａ１とを含む。第１層基材６１ａの厚さｔ１は、１ｍｍである。

また、前記において、第１層基材６１ａの流路に対応するパターンを有するフォトマスクを用いる代わりに、図５（Ａ）の第３層基材６３ａの流路に対応するパターンを有するフォトマスクを用いたことを除き、第３層基材６３ａを得た。

得られた第３層基材６３ａは、インレット３１ａに対応する位置に形成された貫通孔部３１ａ３と、マイクロカラム部３３ａに対応する位置に形成された貫通孔部３３ａ３と、担体充填口３７ａに対応する位置に形成された有底孔部３７ａ３と、担体充填流路３８ａと、アウトレット３６ａとを含む。第３層基材６３ａの厚さｔ３は、５．５ｍｍである。

さらに、前記において、第１層基材６１ａの流路に対応するパターンを有するフォトマスクを用いる代わりに、図５（Ａ）の第５層基材６５ａの流路に対応するパターンを有するフォトマスクを用いたことを除き、第５層基材６５ａを得た。

得られた第５層基材６５ａは、インレット３１ａに対応する位置に形成された有底孔部３１ａ５と、上流側流路３２ａと、マイクロカラム部３３ａに対応する位置に形成された有底孔部３３ａ５とを含む。なお、第５層基材６５ａの厚さｔ５は、１ｍｍである。

一方、両面接着フィルム〔サイズ：２０×７０ｍｍ、厚さ：０．１ｍｍ〕に、図８（Ａ）に示されるように、貫通孔部３１ａ２，３３ａ２，３７ａ２を形成し、第２層基材６２ａを得た。また、両面接着フィルムに、図８（Ａ）に示されるように、貫通孔部３１ａ４および３３ａ４を形成し、第４層基材６４ａを得た。貫通孔部３１ａ２，３１ａ４は、インレット３１ａに対応する位置に形成されている。貫通孔部３３ａ２，３３ａ４は、マイクロカラム部３３ａに対応する位置に形成されている。貫通孔部３７ａ２は、担体充填口３７ａに対応する位置に形成されている。

メンブレンフィルタ〔厚さ：０．０１ｍｍ、孔径：０．８μｍ〕から４．５ｍｍの直径の円板を切り抜き、フィルタ６６ａ，６６ａを得た。

上から、第１層基材６１ａ、第２層基材６２ａ、フィルタ６６ａ、第３層基材６３ａ、フィルタ６６ａ、第４層基材６４ａおよび第５層基材６５ａをこの順に積層し、回収部３０ａを得た〔図８（Ｂ）参照〕。

回収部３０ａは、インレット３１ａと、上流側流路３２ａと、マイクロカラム部３３ａと、下流側流路３５ａと、アウトレット３６ａと、アウトレット３６ａと、担体充填口３７ａと、担体充填流路３８ａとを含む。

（試験例１）
ラットの腹直筋塊から、筋組織片２０ｍｇを分取した。得られた筋組織片を製造例１で得られた粗破砕部５０ａのチャンバー５４内に入れた。その後、チャンバー５４内に撹拌子を置いた。チャンバー５４内に純水３ｍＬを入れた後、粗破砕部５０ａをマグネチックスターラ上に載置した。マグネチックスターラを用いてチャンバー５４中の撹拌子を５００ｒｐｍで３０秒間回転させ、筋組織片の粗破砕を行ない、組織粗破砕液を得た。得られた組織粗破砕液に含まれる組織を観察した。また、組織の粒径は、破砕組織を顕微鏡下で観察することによって測定した。また、粗破砕後の組織の平均粒径を求めた。なお、平均粒径は、同顕微鏡の同倍率下で得たスケール画像から換算することによって得られた値である。

試験例１において、粗破砕前の筋組織片を観察した結果を図９（Ａ）、粗破砕後の組織を観察した結果を図９（Ｂ）、図９（Ｂ）の粗破砕後の組織を光学顕微鏡で観察した結果を図９（Ｃ）に示す。図９（Ａ）および（Ｂ）中、スケールバーは、５ｍｍを示す。また、図９（Ｃ）中、スケールバーは、５０μｍを示す。また、粗破砕後の組織の粒径分布を調べた結果を図１０に示す。

図９に示された結果から、粗破砕後の筋組織片は、直径１００μｍ未満に破砕されていることがわかる。また、図１０に示された結果から、粗破砕後の組織の粒径は、３０μｍ以上４０μｍが最も多くなっていることがわかる。粗破砕後の組織の平均粒径は、４９．７μｍであった。

（試験例２）
試験例１で得られた組織粗破砕液４００μＬを製造例２で得られた分離部２０ａのインレット２３から流速０．２７ｍＬ／ｍｉｎで分離部流路２１に送液し、アウトレット２４から回収した（送液１回目）。回収された試料を前記と同じインレット２３に戻し、流速０．２７ｍＬ／ｍｉｎで分離部流路２１に送液し、アウトレット２４から回収した（送液２回目）。さらに、２回目の送液後に回収された試料を前記と同じインレット２３に戻し、分離部流路２１に流速０．２７ｍＬ／ｍｉｎで送液し、アウトレット２４から回収した（送液３回目）。１回目の送液時、２回目の送液時および３回目の送液時の分離部２０ａの突出構造体アレイ２２における組織の状態を観察した。また、送液前の組織粗破砕液、１回目送液後の試料、２回目の送液後の試料および３回目送液後の試料それぞれのｍＲＮＡ濃度を、超微量分光光度計〔サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製、商品名：Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ ２０００〕を用いて測定した。回収された試料に含まれる組織の粒径を試験例１と同様の操作を行なうことによって測定した。さらに、３回目の送液後に回収された試料に含まれる組織の平均粒径を求めた。

試験例２において、１回目の送液時の分離部２０ａの突出構造体アレイ２２における組織の状態を観察した結果を図１１（Ａ）、２回目の送液時の分離部２０ａの突出構造体アレイ２２における組織の状態を観察した結果を図１１（Ｂ）、３回目の送液時の分離部２０ａの突出構造体アレイ２２における組織の状態を観察した結果を図１１（Ｃ）に示す。図１１中、スケールバーは１００μｍを示す。また、試験例２において、３回目の送液後の試料に含まれる組織の粒径分布を調べた結果を図１２に示す。さらに、試験例２において、分離部への送液回数と得られた試料におけるｍＲＮＡ濃度との関係を調べた結果を図１３に示す。

図１１に示された結果から、送液回数が増えるほど、突出構造体アレイ２２の突出構造体２２ａの間に捕捉される破砕組織の量が増えることがわかる。また、図１１に示された結果から、１回目の送液時における圧力は２０ｋＰａ、２回目の送液時における圧力は１００ｋＰａ、３回目の送液時における圧力は２５０ｋＰａであることがわかる。したがって、これらの結果から、分離部２０ａへの送液回数が増えるほど、送液の際に要する圧力が増えることがわかる。

また、図１２に示された結果から、組織破砕液を分離部２０ａに供することにより、組織破砕液を分離部２０ａに供する前と比べ、粒径３０μｍ以上の組織が減り、粒径１５μｍ以下の組織が増加していることがわかる。

さらに、図１３に示された結果から、分離部２０ａへの送液回数が増えるほど、ｍＲＮＡ濃度が増加していることがわかる。

（試験例３）
（１）ｍＲＮＡ含有試料の調製
ｍＲＮＡ精製用ビーズ〔（株）ベリタス製、商品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）〕付属の緩衝液〔Ｔｒｉｓ ｂｉｎｄｉｎｇ／ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ〕４００μＬにラットの腹直筋２０ｍｇとジルコニアビーズ〔アズワン（株）製、商品名：ジルコニアボール、直径２．８ｍｍ〕１０個とを入れた。得られた混合物を３０００ｒｐｍで１分間振動させることにより腹直筋を破砕し、ｍＲＮＡ含有試料を得た。

（２）ｍＲＮＡの回収
前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ〔濃度：５μｇビーズ／μＬ〕３μＬを製造例３で得られた回収部３０ａの担体充填口３７ａから担体充填流路３８ａを介してマイクロカラム部３３ａ内に充填した。つぎに、インレット３１ａおよびアウトレット３６ａのそれぞれに送液用チューブを挿入し、当該送液用チューブをマイクロチューブポンプ〔アズワン（株）製、商品名：ＳＭＰ−２１ＡＳ〕にセットした。その後、試験例３（１）で得られたｍＲＮＡ含有試料１００μＬをインレット３１ａから流速２０μＬ／ｍｉｎで５分間（分離時間）送液し、ｍＲＮＡ含有試料に含まれるｍＲＮＡをｍＲＮＡ精製用ビーズに吸着させた。つぎに、前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ付属の洗浄緩衝液１００μＬをインレット３１ａから流速２０μＬ／ｍｉｎで５分間送液し、マイクロカラム部３３ａ内のｍＲＮＡ精製用ビーズを洗浄した。その後、前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ付属の解離緩衝液１００μＬをインレット３１ａから流速２０μＬ／ｍｉｎで５分間送液することにより、マイクロカラム部３３ａ内のｍＲＮＡ精製用ビーズからｍＲＮＡを解離させ、アウトレット３６ａからｍＲＮＡ溶液を回収した。

また、前記において、マイクロカラム部３３ａ内に充填されるｍＲＮＡ精製用ビーズの量を３μＬとする代わりに、マイクロカラム部３３ａ内に充填されるｍＲＮＡ精製用ビーズの量を１０μＬ、２０μＬ、３５μＬまたは５０μＬとしたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ｍＲＮＡ溶液を回収した。

また、前記において、マイクロカラム部３３ａ内に充填されるｍＲＮＡ精製用ビーズの量を３μＬとし、分離時間を５分間とする代わりに、マイクロカラム部３３ａ内に充填されるｍＲＮＡ精製用ビーズの量を２０μＬとし、かつ３分間、５分間または１０分間としたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ｍＲＮＡ溶液を回収した。

回収されたｍＲＮＡ溶液１００μＬに含まれるｍＲＮＡ量を、前記超微量分光光度計を用いて測定した。

試験例３において、ビーズ充填量とＲＮＡ回収量との関係を調べた結果を図１４（Ａ）、試験例３において、分離時間とＲＮＡ回収量との関係を調べた結果を図１４（Ｂ）に示す。

図１４（Ａ）に示された結果から、ビーズ充填量が多いほど、ＲＮＡ回収量が増加することがわかる。また、図１４（Ｂ）に示された結果から、分離時間が長いほど、ＲＮＡ回収量が増加することがわかる。

（試験例４）
（１）ｍＲＮＡ含有試料の調製
ｍＲＮＡ精製用ビーズ〔（株）ベリタス製、商品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）〕付属の緩衝液〔Ｔｒｉｓ ｂｉｎｄｉｎｇ／ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ〕４００μＬに筋組織２０ｍｇとジルコニアビーズ〔アズワン（株）製、商品名：ジルコニアボール、直径２．８ｍｍ〕１０個とを入れた。得られた混合物を３０００ｒｐｍで１０分間振動させた。さらに、得られた混合物を２００×ｇで１０分間の遠心分離に供してｍＲＮＡ含有試料として上澄み液を得た。

（２）静置下でのｍＲＮＡの吸着
ウェルプレートのウェルに前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ〔濃度：５μｇビーズ／μＬ〕３５μＬと試験例４（１）で得られたｍＲＮＡ含有試料４００μＬとを入れた。得られた混合物を１０分間静置させた後、前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ付属の洗浄緩衝液１００μＬでｍＲＮＡ精製用ビーズを２回洗浄した。その後、前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ付属の解離緩衝液１００μＬをｍＲＮＡ精製用ビーズに接触させ、当該ｍＲＮＡ精製用ビーズからｍＲＮＡを解離させて、ｍＲＮＡ溶液を回収した。

（３）流動下でのｍＲＮＡの吸着
前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ〔濃度：５μｇビーズ／μＬ〕３５μＬを製造例３で得られた回収部３０ａの担体充填口３７ａから担体充填流路３８ａを介してマイクロカラム部３３ａ内に充填した。つぎに、インレット３１ａおよびアウトレット３６ａのそれぞれに送液用チューブを挿入し、当該送液用チューブをマイクロチューブポンプ〔アズワン（株）製、商品名：ＳＭＰ−２１ＡＳ〕にセットした。その後、インレット３１ａおよびアウトレット３６ａの間において、試験例４（１）で得られたｍＲＮＡ含有試料４００μＬを流速２４０μＬ／ｍｉｎで１０分間循環させ、ｍＲＮＡ含有試料に含まれるｍＲＮＡをｍＲＮＡ精製用ビーズに吸着させた。つぎに、前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ付属の洗浄緩衝液１００μＬをインレット３１ａから流速２０μＬ／ｍｉｎで５分間送液し、マイクロカラム部３３ａ内のｍＲＮＡ精製用ビーズを洗浄した。洗浄は、２回行なった。その後、前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ付属の解離緩衝液１００μＬをインレット３１ａから流速２０μＬ／ｍｉｎで５分間送液することにより、マイクロカラム部３３ａ内のｍＲＮＡ精製用ビーズからｍＲＮＡを解離させ、アウトレット３６ａからｍＲＮＡ溶液を回収した。

（３）ｍＲＮＡ回収量の測定
試験例４（２）および試験例４（３）で回収されたｍＲＮＡ溶液１００μＬに含まれるｍＲＮＡ量を、前記超微量分光光度計を用いて測定した。

試験例４において、静置下でｍＲＮＡ精製用ビーズにＲＮＡを吸着させたときのｍＲＮＡ回収量および灌流下でｍＲＮＡ精製用ビーズにＲＮＡを吸着させたときのｍＲＮＡ回収量を調べた結果を図１５に示す。図中、レーン１は灌流下でｍＲＮＡ精製用ビーズにＲＮＡを吸着させたときのｍＲＮＡ回収量、レーン２は静置下でｍＲＮＡ精製用ビーズにＲＮＡを吸着させたときのｍＲＮＡ回収量を示す。

図１５に示された結果から、灌流下でｍＲＮＡ精製用ビーズにＲＮＡを吸着させたときのｍＲＮＡ回収量は、静置下でｍＲＮＡ精製用ビーズにＲＮＡを吸着させたときのｍＲＮＡ回収量と比べて顕著に多いことがわかる。したがって、流体デバイスにおいて、回収部へのｍＲＮＡ含有試料の送液および回収部外への排出を行なうことができる流路を設けて、回収部内におけるｍＲＮＡ含有試料を流動させることにより、ＲＮＡ回収量を向上させることができることが示唆される。

（試験例５）
（１）流体デバイスの作製
製造例１で得られた粗破砕部５０ａの下流に製造例２で得られた分離部２０ａを接続した流体デバイスを作製した。

（２）生体組織からのｍＲＮＡの回収およびｍＲＮＡ回収量の測定
筋組織片２０ｍｇおよびｍＲＮＡ精製用ビーズ〔（株）ベリタス製、商品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）〕付属の緩衝液〔Ｔｒｉｓ ｂｉｎｄｉｎｇ／ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ〕３００μＬを試験例５（１）で得られた流体デバイスの粗破砕部５０ａのチャンバー５４内に入れた。つぎに、チャンバー５４内に撹拌子を置いた後、粗破砕部５０ａをマグネチックスターラ上に載置した。マグネチックスターラを用いてチャンバー５４中の撹拌子を５００ｒｐｍで３０秒間回転させ、筋組織片の粗破砕を行なった。粗破砕部５０ａで得られた組織破砕液をそのまま分離部２０ａに送液した。分離部２０ａの下流側で試料を回収した。得られた試料１００μＬに前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ〔濃度：５μｇビーズ／μＬ〕２０μＬを添加した。得られた混合物を１０分間静置させた後、前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ付属の洗浄緩衝液１００μＬでｍＲＮＡ精製用ビーズを２回洗浄した。その後、前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ付属の解離緩衝液１００μＬをｍＲＮＡ精製用ビーズに接触させ、溶液を回収した（実験番号：１）。

一方、筋組織片２０ｍｇおよびｍＲＮＡ精製用ビーズ〔（株）ベリタス製、商品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）〕付属の緩衝液〔Ｔｒｉｓ ｂｉｎｄｉｎｇ／ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ〕３００μＬを製造例２で得られた分離部２０のインレット２３から流速０．２７ｍＬ／ｍｉｎで分離部流路２１に送液し、アウトレット２４から試料を回収した。得られた試料１００μＬに前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ〔濃度：５μｇビーズ／μＬ〕２０μＬを添加した。得られた混合物を１０分間静置させた後、前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ付属の洗浄緩衝液１００μＬでｍＲＮＡ精製用ビーズを２回洗浄した。その後、前記ｍＲＮＡ精製用ビーズ付属の解離緩衝液１００μＬをｍＲＮＡ精製用ビーズに接触させ、溶液を回収した（実験番号：２）。

粗破砕部と分離部とを併用することによって得られた実験番号：１の溶液１００μＬおよび粗破砕部を用いず、分離部を単独で用いることによって得られた実験番号：２の溶液１００μＬそれぞれに含まれるｍＲＮＡ量を、前記超微量分光光度計を用いて測定した。その結果を表１に示す。

表１に示された結果から、粗破砕部と分離部とを併用した場合には、２５０ｎｇのｍＲＮＡを回収できたのに対し、粗破砕部を用いず、分離部を単独で用いた場合には、検出可能な量のｍＲＮＡを得ることができないことがわかる。したがって、流体デバイスにおいて、粗破砕部と分離部とを併用することにより、ＲＮＡ回収量を格段に向上させることができることが示唆される。

１ 流体デバイス
２，２１ 流路
２ａ，２１ａ 壁部
１０，５０ａ 粗破砕部
２０，２０ａ 分離部
２２ 突出構造体アレイ
２２ａ 突出構造体
３０，３０ａ 回収部

Claims (10)

1. 生体組織から核酸を単離するための流体デバイスであって、
   壁部と当該壁部によって囲まれた流路空間とを含み、前記生体組織を含む生体試料を流通可能な流路と、
   前記流路の中途に設けられ、前記生体組織との接触部に凹凸構造を有し、前記生体組織と前記接触部とが接触した状態での当該接触部に対する生体組織の相対的な移動によって当該生体組織を粗破砕する粗破砕部と、
   前記流路の壁部から前記流路空間に突き出した複数個の突出構造体が、前記流路における生体試料の流れ方向に沿って、当該流路の前記粗破砕部の下流側に配置された突出構造体アレイと、
   を備えており、
   前記突出構造体アレイにおいて、前記流路における生体試料の流れ方向に沿って、上流側に配置された突出構造体の間または前記流路の壁部と当該上流側に配置された突出構造体との間を通過する生体組織が接触するように、下流側の突出構造体が配置されていることを特徴とする流体デバイス。
2. 前記流路は、前記突出構造体アレイを流通した生体試料を当該突出構造体アレイに循環させる循環流路をさらに有している請求項１に記載の流体デバイス。
3. 前記流路において、前記突出構造体アレイよりも下流側に、生体組織から分離された核酸を回収する回収部をさらに備える請求項１または２に記載の流体デバイス。
4. 前記粗破砕部の凹凸構造は、前記生体組織との接触面に複数個の微細有底孔からなる凹凸構造である請求項１〜３のいずれかに記載の流体デバイス。
5. 前記流路における前記粗破砕部の下流側で、かつ前記突出構造体アレイの上流側に、粗破砕されていない生体組織を濾別する濾過部をさらに有している請求項１〜４のいずれかに記載の流体デバイス。
6. 前記濾過部は、複数個のピラーからなる複数列のピラー列を有しており、前記複数個のピラーは、隣接するピラーの間の配置間隔が前記生体試料の流れ方向上流から下流に向かって漸次密となるように配置されている請求項５に記載の流体デバイス。
7. 前記複数個の突出構造体は、隣接する突出構造体の間の配置間隔が前記生体試料の流れ方向上流から下流に向かって漸次密となるように配置されている請求項１〜６のいずれかに記載の流体デバイス。
8. 前記流路において、前記生体試料の流れ方向最下流に配置された前記流路の幅方向に隣接する突出構造体の間の配置間隔は、前記生体組織に含まれる細胞の大きさよりも小さい間隔である請求項１〜７のいずれかに記載の流体デバイス。
9. 前記突出構造体は、前記生体試料の流れ方向の上流側に向かって尖った尖頭形状を有する請求項１〜８のいずれかに記載の流体デバイス。
10. 前記複数個の突出構造体の両端は、前記流路の内面に接している請求項１〜９のいずれかに記載の流体デバイス。