JP2018527330A - 線維症の処置 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、オーストラリア仮出願特許第2015903035号明細書の優先権を主張する。この出願の全体の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、線維症を処置するための組成物、方法、およびキットに関する。特に、該組成物、方法、およびキットは、臓器の線維症の処置に特に有用であるが、これに限定されない。
心血管疾患(CVD)は、世界の罹患率および死亡率の主因であり続け、毎年1700万人の死亡が公言されており、これは世界的に、2秒毎に1人の死亡に相当する。重要なことに、主要なCVDの罹患率は、60歳以降に指数関数的に増大しており、高齢の患者は大抵、心機能障害または慢性心不全(CHF)を患っている。CVDは大抵、任意の心臓発作または心損傷の直後に始まり、これはその後、心臓リモデリングとして公知のプロセスにおいて、自然防衛機構および炎症性反応をトリガーして、損傷を逆調節し(counter-regulate)、かつ修復する。しかしながら、損傷が反復的であり、または反応リモデリングの調節が異常であると、最終的に、心臓内に過剰なコラーゲンが蓄積されて、次第に不可逆性の線維化反応に向かい、一生治らない瘢痕化または心線維症に至る。その後、心臓への血液供給が損なわれる一方、心臓のスティフネスが増大して、心収縮性をさらに妨害し、これが心筋梗塞(MI)、慢性心不全(CHF)、または末端臓器障害の素因になる。そのような事象は高齢の集団で起こる見込みがより大きいので、心筋梗塞または損傷に増々罹り易くなり、加齢それ自体が、非効率な修復プロセスによって危うくなる。さらに、線維症に向けられる利用可能な処置は殆どない。このうち、アンジオテンシン変換酵素(ACE)インヒビタまたはアンギオテンシン受容体ブロッカ(ARB)が、約7%しかCV死亡率を引き下げなかった。
本発明は、個体における線維症を処置する方法であって、インスリン調節性アミノペプチダーゼ(IRAP)のインヒビタを投与することを含み、それによって、線維症を処置する方法を提供する。好ましくは、個体は、線維症を患っていると同定される。
線維症を患っている対象を同定する工程と;
それを必要とする対象に、治療有効量のIRAPインヒビタを投与する工程と
を含み、それによって、対象における線維症を処置する方法を提供する。
年齢起因性線維症、または組織損傷に関係する臓器線維症を患っている対象を同定する工程と;
それを必要とする対象に、治療有効量のIRAPインヒビタを投与する工程と
を含み、それによって、年齢起因性線維症、または組織損傷に関係する臓器線維症を処置する方法を提供する。
(式中、
Aは、
アリール、ヘテロアリールカルボシクリル、もしくはヘテロシクリルであり、これらはそれぞれ、R1がNHCOR8である場合、置換されていてもよく;
または、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、1,8−ナフチリジル、フタラジニル、もしくはプテリジニルであり、これらはそれぞれ、R1がNR7R8、NHCOR8、N(COR8)2、N(COR7)(COR8)、N=CHOR8、もしくはN=CHR8である場合、置換されていてもよく;
Xは、O、NR’、またはSであり、R’は、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、または置換されていてもよいヘテロシクリルであり;
R7およびR8は、独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリールから選択され、またはR7およびR8は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい3〜8員環を形成しており;
R2は、CN、CO2R9、C(O)O(O)R9、C(O)R9、またはC(O)NR9R10であり、R9およびR10は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル(これらはそれぞれ置換されていてもよい)、および水素から選択され;またはR9およびR10は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい3〜8員環を形成しており;
R3〜R6は、独立して、水素、ハロ、ニトロ、シアノアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アミノ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシエステル、メチレンジオキシ、アミド、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、ヘテロシクリルチオ、カルボシクリルチオ、アシルチオ、およびアジドから選択され、これらはそれぞれ、適切な場合には置換されていてもよく、または、任意の2つの隣接するR3〜R6は、これらが結合する原子と共に、置換されていてもよい3〜8員環を形成しており;かつ
Yは、水素またはC1〜10アルキルである)
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を有する。
(式中、
Aは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく;
RAおよびRBは、独立して、水素、アルキル、およびアシルから選択され;
R1は、CNまたはCO2RCから選択され;
R2は、CO2RCおよびアシルから選択され;
R3は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく;または
R2およびR3は共に、以下の5〜6員の飽和ケト炭素環
を形成しており、
式中、nは、1もしくは2であり;
該環は、C1〜6アルキルによって1回もしくは複数回置換されていてもよく;または
R2およびR3は共に、以下の5員ラクトン環(a)もしくは6員ラクトン環(b)
を形成しており、
式中、
は、任意選択の二重結合であり、R’はアルキルであり、
RCは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよい)
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する。
(式中、
R1は、HまたはCH2COOHであり;
nは、0または1であり;
mは、1または2であり;
Wは、CHまたはNである)
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する。
Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe、
c[Cys−Tyr−Cys]−His−Pro−Phe、および
c[Hcy−Tyr−Hcy]−His−Pro−Phe。
本明細書中で開示され、かつ定義される本発明は、言及され、または本文または図面から明らかな個々の特徴の2つ以上の全ての代替組合せに及ぶことが理解されよう。これらの様々な組合せは全て、本発明の種々の代替態様を構成する。
(式中、
Aは、
アリール、ヘテロアリールカルボシクリル、もしくはヘテロシクリルであり、これらはそれぞれ、R1がNHCOR8である場合、置換されていてもよく;
または、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、1,8−ナフチリジル、フタラジニル、もしくはプテリジニルであり、これらはそれぞれ、R1がNR7R8、NHCOR8、N(COR8)2、N(COR7)(COR8)、N=CHOR8、もしくはN=CHR8である場合、置換されていてもよく;
Xは、O、NR’、またはSであり、R’は、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、または置換されていてもよいヘテロシクリルであり;
R7およびR8は、独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリールから選択され、またはR7およびR8は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい3〜8員環を形成しており;
R2は、CN、CO2R9、C(O)O(O)R9、C(O)R9、またはC(O)NR9R10であり、R9およびR10は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル(これらはそれぞれ置換されていてもよい)、および水素から選択され;またはR9およびR10は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい3〜8員環を形成しており;
R3〜R6は、独立して、水素、ハロ、ニトロ、シアノアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アミノ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシエステル、メチレンジオキシ、アミド、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、ヘテロシクリルチオ、カルボシクリルチオ、アシルチオ、およびアジドから選択され、これらはそれぞれ、適切な場合には置換されていてもよく、または、任意の2つの隣接するR3〜R6は、これらが結合する原子と共に、置換されていてもよい3〜8員環を形成しており;かつ
Yは、水素またはC1〜10アルキルである)
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を有し得る。
(式中、
Aは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく;
RAおよびRBは、独立して、水素、アルキル、およびアシルから選択され;
R1は、CNまたはCO2RCから選択され;
R2は、CO2RCおよびアシルから選択され;
R3は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく;または
R2およびR3は共に、以下の5〜6員の飽和ケト炭素環
を形成しており、
式中、nは、1もしくは2であり;
該環は、C1〜6アルキルによって1回もしくは複数回置換されていてもよく;または
R2およびR3は共に、以下の5員ラクトン環(a)もしくは6員ラクトン環(b)
を形成しており、
式中、
は、任意選択の二重結合であり、R’はアルキルであり、
RCは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよい)
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有し得る。
(式中、
R1は、HまたはCH2COOHであり;
nは、0または1であり;
mは、1または2であり;
Wは、CHまたはNである)
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する。
Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe、
c[Cys−Tyr−Cys]−His−Pro−Phe、および
c[Hcy−Tyr−Hcy]−His−Pro−Phe。
原子(例えば、1,2または1,3)の置換(式中、sは、1または2であり、各R’は、独立して、HまたはC1〜6アルキルである)、ならびにCおよびNから独立して選択される2つの隣接する、または隣接しない原子の、C2〜5アルキレン基またはC2〜5アルケニレン基による置換。
−前記創傷において、コラーゲン組織化を改善し、かつ/または創傷細胞(wound cellularity)を引き下げること;
−前記創傷において、線維芽細胞および上皮細胞によるコラーゲン生産過剰を引き下げること;
−前記創傷において、上皮間葉系の転移を引き下げること;
−前記創傷において、線維芽細胞の移動および活性化を引き下げること;
−前記創傷において、真皮の肥厚を引き下げ、かつ/または阻害すること;
−前記創傷に対する炎症性細胞の補充を引き下げ、かつ/または阻害すること。
−本明細書において記載されるIRAPの1つもしくは複数のインヒビタの形態の治療組成物、またはその薬学的に許容される塩、多形体、もしくはプロドラッグ、あるいは薬学的組成物を保持するコンテナ;
−使用説明書を備えたラベルまたはパッケージ内印刷物。
包括的IRAP欠失(IRAP−/−)マウスを、以前に記載されるように(Albiston, 2009)、Ozgene Pty Ltd,(Perth, Australia)によって作出した。オリゴヌクレオチド
(GeneticアクセッションNT_039643)を用いるPCRによって、子孫の遺伝子型を特定した。生じた野生型対立遺伝子PCR産物は384bpであり、ノックアウト対立遺伝子は1041bpであった。C57BL/6Jマウスを、野生型(WT)対照として用いた。4〜6ヵ月齢の幼年マウス、および18〜22ヵ月齢の老齢マウス(双方の系統とも35〜50gと秤量された)を、Monash Animal Research Laboratories(ARL)から得た。標準的な食事をマウスに不断給餌して、該マウスを、Pharmacology Animal House, Monash Universityにおいて、21±1〜5℃、12時間の明/暗室の標準的なマウスケージ内に収容した(ケージあたりおおよそマウス4頭)。全ての処理および実験手順は、Monash University Animal Ethics Committeeによって承認された(Ethics # SOBSB/PHAR/2010/23)。
異なる8セットのインビボ実験を、この研究において行った:
A)アンギオテンシン(Ang)II(800ng/kg/分;s.c.)で4週間処理した、包括的IRAPノックアウトマウスおよびそのWT対照の心臓および血管の表現型の特徴付け。マウスの心臓および血管を、生理食塩水で処理した幼年WTマウスおよびIRAP−/−マウスから得た組織と比較した。
B)IRAPインヒビタ処置後の心血管系における、Ang II起因性変化の予防。予防モデルにおいて、WTマウスを、Ang II(800ng/kg/分;s.c.)±IRAPインヒビタ(HFI−419;500ng/kg/分を28日間)、またはHFI−ビヒクル(1DMSO:3HBC)で処置した。
C)包括的IRAPノックアウトマウスにおける老齢の心臓、腎臓、および血管の表現型の特徴付け。老齢WTマウスおよびIRAP−/−マウスの心臓、腎臓、および血管を、幼年WTマウスおよびIRAP−/−マウスから得た組織と比較した。
D)IRAPインヒビタ処置後の、心血管系の年齢起因性変化の逆転。逆転モデルにおいて、老齢WTマウスを、生理食塩水、IRAPインヒビタ(500ng/kg/分のHFI−419;500ng/kg/分の化合物1;50ng/kg/分の化合物2)、またはHFI−ビヒクル(1DMSO:3HBC)のいずれかで4週間処置した。
E)老齢包括的IRAPノックアウトマウス、および老齢IRAPインヒビタ(500ng/kg/分のHFI−419;s.c.)処置WTマウスからとった単離心臓における虚血再灌流傷害の予防を、年齢がマッチするビヒクル処置(1DMSO:3HBC;s.c.)WT対照と比較した。
F)老齢包括的IRAPノックアウトマウスにおける、心エコー検査法を用いた心機能の表現型の、老齢WTマウスおよび幼年WTマウスと比較した特徴付け。
G)高脂肪食(HFD)モデルにおけるIRAPノックアウトマウスの肝臓脂肪症の表現型の特徴付け。
H)IRAPインヒビタ処置後の肝臓における塩起因性線維症の逆転。
コラーゲン沈着を測定するために、心臓、腎臓、または大動脈の凍結切片(全て5μmの厚さ)を、10分間空気乾燥させて、キシレンに3回(それぞれ2分)通して、3回無水アルコール洗浄してから、水道のH2O中で30秒間リンスした。ピクロシリウスレッドの最適濃度(この場合、飽和ピクリン酸中に希釈した0.05%ピクロシリウスレッド)での染色を実行して、1時間放置した。その後、切片を水中でリンスして、0.01M HCl中で2分間分化させてから、無水アルコールで3回洗浄して脱水した。その後、スライドを3回キシレン洗浄してから、封入媒質としてDPXを用いる標準的な組織学的技術に従って、カバーガラスをかけた。20×の倍率下で、明視野(Olympus, BX51)および円偏光光学顕微鏡(circularized polarized light microscopy)(DM IRB, Leica)を用いて撮像した一方、総視野あたりの陽性間質コラーゲン染色のパーセンテージを、ImageJ 1.46ソフトウェア(Java, NIH)を用いて定量化して、8視野の合計から、特定の動物におけるコラーゲン含有量の最終パーセンテージとして平均した。
心室重量(VW)を、体重(BW)と、VW:BW(mg/g)の比率として、そしてVWを、脛骨長(TL)と、VW:TL(mg/mm)の比率として、それぞれ比較した。OCT内に包埋して凍結させた心臓を、クリオスタット内で5μmの厚さに横断方向に切片化して、ヘマトキシリンおよびエオシン(Amber Scientific)で着色して、細胞構造を形態的に調査した。Image Jを用いて、心臓切片あたり平均100個の心筋細胞を、60×の倍率下で実行して、分析した。
免疫染色を、5μmの厚さの横断方向凍結心臓切片または5μmの厚さの凍結胸部大動脈に実行した。これらの切片を、空気乾燥させて、氷冷アセトン中でおおよそ15分間固定してから、0.01M PBSバッファで洗浄した(3×10分)。その後、切片を、0.01M PBS中10%ヤギ血清で30分間インキュベートして、非特異的結合を減らした。一次抗体がヤギにおいて産生されたら、この予めブロックした媒質を、PBSおよびトリトン−X中5%BSAで置換する。次に、ブロッキングバッファを除去して、それぞれのマーカーに対する一次抗体を、以下の希釈物および抗体の起源に基づいて、室温にて一晩処理した:IRAP(1:500、自社)、α−SMA(1:500、Abcam)、ビメンチン(1:500、Santa Cruz)、P−IκBα(1:200、Cell Signalling)、F4/80マクロファージ(1:100、Serotec)、MCP−1(1:100、Santa Cruz)、VWF(1:500、abcam)。第2日目に氷冷PBS中にて4連続で洗浄した後、適切な二次抗体をインキュベートした。主に、Alexa 488(InvitrogenまたはAbcam)、Alexa 594(Invitrogen)、およびFluorescein FI-5000(Vector)を用いた。マウスにおいて一次抗体を産生し、mouse on mouse (M.O.M)キット(Vector)を用いる別の免疫蛍光技術を、以下の希釈物および抗体の起源に基づいて、心臓切片に実行した:TGF−β(1:50、Santa Cruz)、ICAM−1(1:100、Santa Cruz)。全ての免疫蛍光切片を、Olympus、BX51顕微鏡で20×の倍率下で見て、Image Jを用いて画像を分析した。
ジヒドロエチジウム(DHE)を用いて、スーパーオキシドをインサイチューで位置特定した。5μmの心臓切片または10μmの胸部大動脈切片を、2μM DHEで37℃にて45分間インキュベートした。隣接する切片を、PEG−SOD(1000U/mL)と30分間プレインキュベートしてから、DHEと45分インキュベートして、スーパーオキシドについての蛍光シグナルの特異性を確認した。生成物2−ヒドロキシエチジウムの蛍光を、倒立型共焦点顕微鏡(Nikon, C1)を用いて、それぞれ568nmおよび585nmの励起放射スペクトル下で画像化した。レーザー設定は、得られた各画像について同一であった。蛍光の総密度を、Image Jを用いて定量化した。
ホモジナイズした心室由来の総タンパク質を、25%グリセロール、7.5%SDS、250mMトリス−HCl pH6.8、および0.001gブロモフェノールブルーを含有する1.5×Laemmliバッファを用いて、抽出した。ホモジナイズしたサンプルを超音波で破壊してから、37℃にて20分間加熱して、13,000rpmで4℃にて30分間、遠心分離した。RCDCアッセイを実行して、タンパク質含有量を、ProteinQuant-Lowryソフトウェア(SoftMax Pro)を750nmにて用いて、定量化した。最後に、サンプルを−20℃にて保存した。ウェスタンブロットを実行した。最初に、サンプル(10または25μg/μl/サンプル)を電気泳動にかけて、転写させて、一次抗体TGF−β(25kDa、1:2000、Santa Cruz)、MMP−2(72kDa、1:2000、Millipore)、MMP−8(65kDa、1:2000、Santa Cruz)、MMP−9(84kDa、1:1000、Chemicon)、MMP−13(54kDa、1:100、Abcam)、ICAM−1(85−110kDa、1:200、Santa Cruz)、GAPDH(36kDa、1:20000、Abcam)でプロービングした。二次抗体は、HRP結合ヤギ抗マウスIgG(1:10000、Jackson ImmunoResearch)または抗ウサギIgG(1:10000、DAKO)であった。その後、ECL試薬で現像した。メンブレンを、CLxPosureフィルム(Pierce, Rockford, IL)に曝した。その後、免疫反応バンドを、chemiDoc XRS撮影装置およびQuantity Oneソフトウェア(BioRad)を用いて、定量化した。個々のバンドを、面積あたりのバンド強度を用いて定量化してから、ハウスキーピング遺伝子GAPDHの面積あたりの強度に対して標準化した。
心室および心尖におけるサイトカインのレベルを、Bio-Plex multiplexアッセイ(Bio-rad)を用いて検出した。組織を急速凍結させて、Bio-Plex細胞溶解キット(Biorad)により、メーカーの説明書に従って、ホモジナイズした。簡潔に、組織を300μlの洗浄バッファで1回洗浄して、Tissue Lyser(Qiagen)を用いて溶解溶液中でホモジナイズした。サンプルを30分間氷上に放置して、6,000×gにて4℃にて20分間遠心分離した。上澄みを収集して、タンパク質含有量を、Biorad proteinアッセイ(Biorad)を用いて決定した。500μg/mlのタンパク質を用いて、サイトカインのレベルを検出した。Bio-Plex Pro(商標)Mouse Cytokine Standard 23-Plex、グループIのパネル(IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−9、IL−10、IL−12(p40)、IL−12(p70)、IL−13、IL−17A、エオタキシン、G−CSF、GM−CSF、IFN−γ、KC、MCP−1、MIP−1α、MIP−1β、RANTES、TNFα)を用いた(ビーズに共有結合する23の異なる抗体を含有した)。サンプル(500μg/ml)または公知の標準品(200〜900μg/ml)の50μlを、各抗体に特異的な希釈結合ビーズで予めコーティングした96ウェルプレートのウェルに加えて、RTにて、暗所において300rpmで30分間振盪させながらインキュベートした。結合していない物質を洗浄除去した後に、ビオチン化した検出抗体を加えて、サンドイッチ錯体を作製して、プレートを、暗所においてRTにて300rpmで振盪させながら、30分間インキュベートした。3回の洗浄後、最終検出錯体を、ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体の付加により形成して、300rpmで振盪させながら、暗所においてRTにて10分間インキュベートした。100μl洗浄バッファによる3回の洗浄後、ビーズを125μlのアッセイバッファ中に再懸濁させた。サンプルを、Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader(Bio-Plex Suspension System)を用いて読みとった。データを、Bio-Plex Managerソフトウェアによって計算した。
0.25%トリトンX−100中でホモジナイズした心尖を、10mM CaCl2中に溶解させて、6000rpmで2℃にて30分間、遠心分離した。ペレットを、0.1M CaCl2中で、60℃にて4分間の熱抽出に曝してから、氷中で冷やして、20000rpmで4℃にて30分間、遠心分離した。上澄みを、コンセントレータ(企業)を用いて篩分けて、−20℃にて保存した。MMPザイモグラフィを実行した。最初に、サンプル(25μg/μl/サンプル)を電気泳動にかけた。その後、ゲルを0.25%トリトンX−100で2回、それぞれ15分間洗浄してから、37℃のインキュベーションバッファ中で一晩、インキュベーションさせたままにした。ゲルを、0.1クマシーブルーで1時間染色してから、翌日、7%酢酸で脱色した。その後、バンドの光学密度を、chemiDoc XRS撮影装置およびQuantity Oneソフトウェア(BioRad)を用いて定量化した。
マウスにヘパリン(500IU)を注射し、20分後に頚椎脱臼により死亡させた。心臓を迅速に摘出して、氷冷した生理食塩水溶液(PSS)中に浸漬した。解剖顕微鏡下で、心臓および大動脈弓の疎性組織(loose tissue)を取り除き、肺の静脈を穿孔して、心臓のフリー灌流を可能にして、心臓を、20ゲージ針を介してLangendorff装置(ML870B2, ADInstruments, Bella Vista, NSW, Australia)上に載せた。心臓を、以下を含有する予め温めたPSSで、連続的に灌流し(mM):NaCl 118;KCl 4.7;NaHCO3 25;グルコース 11;KH2PO4 1.2;MgSO4 1.2;CaCl2 1.2mM、そしてO2 95%およびCO2 5%(カルボゲン)で37℃にてガス処理した。使用の前に、PSSを、0.22μm酢酸セルロースフィルタ(Millipore)で濾過した。心臓の灌流チャンバを、温度を37℃に維持したサーモスタット制御水ジャケット系で取り囲んだ。細い、200μmカニューレを、薬物送達用のPSSライン内に存在させた(1:10薬物希釈、心臓まで1分のタイムラグ)。Millar圧力カテーテル(Millar instruments Inc.)を、左心房および左心室の接合部にて、穿刺を介して左心室中に導入して、Power lab system(ADInstruments)に連結した。灌流圧力を80mmHgに維持して、標本を、20〜30分間、平衡させたままにした。左心室発生圧(LVDP);拡張終期圧(EDP)、心拍数(HR)、左心室収縮性(+dP/dt)および左心室弛緩(−dP/dt)、ならびに冠状動脈流を、継続的に記録した。
虚血を、心臓の灌流を40分間停止することによって、誘導した。この後に60分の再灌流を続けた。左心室発生圧(LVDP)、拡張終期圧(EDP)、および収縮性(±dP/dt)を、60分間記録した。心臓をLangendorff装置から取り出して、高カリウム(100mM)PSS内に3分間入れることによって、拡張期で停止させた。その後、これをマウンティングブロックに(心房を介して)接着させて、アガーブロックによって支持して、1mm厚のスライスにカットした(Integraslice 7550MM(Campden Instruments, UK))。スライスを、2,3,5−トリフェニルテトラヒドロゾリウム(2,3,5-triphenyltetrahydrozolium)(TTZ 10mg/ml)内に入れて、37℃にて15分間インキュベートした。スライスを、リン酸緩衝食塩水中4%パラホルムアルデヒド内に保存して、24時間以内に写真を撮った。梗塞領域を、Image Jソフトウェア(Centre for Information Technology, NIH, Bethesda, MA, USA)を用いて決定した。梗塞面積を、以下のように算出した:
梗塞面積(%)=(総梗塞面積×100)/(総スライス面積−内腔面積)。
心エコー検査法を、浅い鎮静(酸素中1%イソフルラン)下で、幼年(3ヵ月齢)、そして老齢の(約22ヵ月齢)WT、および老齢の(約22ヵ月齢)包括的IRAP欠失マウスに実行した。心エコー検査法を、デジタル超音波系(Vevo 2100 Imaging System, VisualSonics, Toronto, Canada)により、18から38MHzの直線配列振動子を用いて実行した。標準的な傍胸骨の長軸画像および短軸画像を、各心エコー調査の間に得て、従来の心エコー測定を、盲検化された観察者によってオフラインで実行した(VisualSonics, Toronto, Canada)。
市販のヒト心臓線維芽細胞(HCF、Catalog #6300, Sciencell, CA, USA)を、37℃、5%CO2のインキュベータ内で維持したT75フラスコ内で増殖させた。完全培地組成:M199培地(#11150-059, life technologies)+10%FBS(#10437-028, life technologies)+1%Fibroblast Growth Supplement-2(#2382, ScienCell)+1%ペニシリン/ストレプトマイシン10,000U/ml抗生物質(#15140-122, Life Technologies)。新鮮な完全培地を、培養体が70%のコンフルエンスに達するまで、隔日で補充した。ここで、継代培養するために、培地を、おおよそ90%のコンフルエンスに達するまで、毎日補充した。継代培養するために、培地を破棄して、培養体を、温かいPBSでリンスした。その後、温かい0.05%トリプシン+EDTAを用いて、フラスコを穏やかにかき回しながら、培養体を剥離させて、フラスコの表面に細胞が付着していないことを確実にした。その後、トリプシンを完全培地で中和してから、懸濁液を新しいファルコンチューブ中に移して、1000rpmにて5分間、遠心分離した。上澄みを破棄して、細胞のペレットを5mlの完全培地で再懸濁させてから、細胞を計数した。継代培養用に、100万個のHCFを、T75フラスコ中に入れる。ピクロシリウスレッド(PSR)染色または免疫蛍光実験用に、丸いカバースリップに沿って並ぶ24ウェルプレートにおいて、ウェルあたり10万個の細胞をロードした。ウェスタンブロット分析実験用に、12ウェルプレートにおいて、ウェルあたり10万個の細胞をロードした。3〜6継代細胞を実験に用いた。完全培地中に、線維化促進剤アンギオテンシンII(Ang II;10−8M 10−7M 10−6M)を、細胞を継代してプレーティングする時点にて加えた。処置の全期間は、おおよそ72時間であった。一旦処置がなされると、培地を収集して、細胞を、以下の実験タイプに応じて異なるように、処置した:
細胞を最初にカバースリップ上で増殖させて、温かいPBSで1回洗浄して、氷冷メタノール中で−20℃にて一晩固定した。その翌日、メタノールを破棄して、細胞を、低温PBSで1回洗浄して、0.1%PSR溶液と、室温にて1時間インキュベートした。この後、色素を除去して、細胞を0.1%酢酸で3回洗浄してから、100%エタノールで3回(それぞれ5分)、そしてキシレンで3回(それぞれ10分)交換して、脱水した。カバースリップを取り外して、DPX封入媒質を用いて、スライド上に載せた。
細胞をカバースリップ上で増殖させて、温かいPBSで1回洗浄して、氷冷アセトン中で−20℃にて5分間固定した。アセトンを破棄して、細胞を、PBS中で、室温にて3×10分リンスした。その後、細胞を、10%ヤギ血清で室温にて30分間ブロックしてから、一次抗体(1:500希釈)で4℃にて一晩インキュベートした。その翌日、一次抗体を除去して、細胞を、PBSで、室温にて3×10分リンスした。その後、細胞を、二次抗体(1:500の希釈)と室温にて2時間、インキュベートした。その後、細胞を再度、PBSで、室温にて3×10分リンスした。カバースリップを24ウェルプレートから取り外して、DAPIを有するVectashield封入媒質を用いてスライド上に載せて、乾燥させたままにしてから、共焦点顕微鏡下で撮像した。
i.タンパク質抽出:
処置が完了すると、細胞を、温かいPBSで洗浄して、Accutase(A6964, Sigma)を用いて剥離させて、37℃にて5分インキュベートした。その後、細胞を収集して、7000rpmで4℃にて5分間、遠心分離した。この間に、1×RIPA溶解バッファカクテルを新規調製した。遠心分離後、上澄みを破棄した。その後、細胞ペレットを、20μlの1×RIPA溶解バッファカクテル中に溶解させて、氷上で30分間維持した。その後、細胞溶解液を、13200rpmで4℃にて10分間、遠心分離して、核および不溶性の細胞残渣をペレット化させた。上澄み(約20μl)を新しいチューブに移して、タンパク質濃度を、Biorad Lowry proteinアッセイを用いて測定した。それぞれのマーカーのタンパク質の定量化を、標準的なウェスタンブロット分析によって実行した。
10%ゲル(15ウェル)を、TGX Stain-Free FastCast Acrylamideスターターキット、10%(#161-0183, Biorad)を用いて作製した。3部のサンプルを4×サンプルバッファの一部で希釈することによって、すなわち、抽出したタンパク質サンプルの10μl(総抽出タンパク質の半分)を、3.3μlの4×Laemliサンプルバッファ(#161-0747, Biorad)中に加えることによって、サンプルを調製した。この工程に至るまでは、サンプルを常に氷上で維持した。サンプルを95℃にて5分間沸騰させた。15ウェルゲル上に全サンプルをロードした。タンパク質ラダーも加えた。1×ランニングバッファを10×バッファ(#161-0732, Biorad)から作製した。タンクを一杯にして、約40分〜1時間、200Vでサンプルをランした。所望のタンパク質バンドが適切に分離したならば、ゲル電気泳動を終了した。サンドイッチスタックおよびメンブレン(メンブレンは約10秒間、メタノール中に予め浸した)を用意してから、それらを全て、1×Trans-Blot Turbo Transferバッファ(#170-4272)中に浸漬した。濡らした大量のスタックを、カセットの底部に置いてから(底部イオンリザーバスタック)、濡らしたメンブレン、その次にゲルを、そして最後に、別の濡らしたトランスファスタックを上部に置いた(上部イオンリザーバスタック)。トラップした気泡を放出するために、まとめたサンドイッチをブロットローラでロールした。カセット蓋を閉じてロックし、そしてカセットをTransfer-Blot Turbo転写システム内に挿入して、転写を開始した。転写が完了すると、メンブレンをTBS−T(1×TBS中0.1%トゥイーン−20)中で簡単に洗浄した。メンブレンをブロッキングバッファ(TBS−T/5%スキムミルク;5g/100ml)中で室温にて少なくとも1時間、機械シェーカ上でブロックした。メンブレンを入れ換えて、一次抗体と4℃にて一晩、インキュベートした。その翌日、メンブレンをTBS−T中で3×15分洗浄した。二次抗体を、5%スキムミルク中で室温にて1時間、シェーカ上でインキュベートした。TBS−T中で3×15分洗浄した。メンブレンをECL基質と5分間インキュベートした。メンブレンを、デジタル撮影装置ChemiDoc MPイメージングシステムで画像化した。バンドを、Image Labソフトウェアを用いて分析した。α−平滑筋アクチン(α−SMA)およびI型コラーゲン等の関心対象のマーカーを、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して定量化した。全てのタンパク質発現を、対照群に対する相対比率として評価した。
動物
30〜40グラムを秤量したおおよそ4から6ヶ月齢の雄C57BL/6J野生型(WT)マウスを、Monash Animal Research Laboratoryから得た。動物を、Department of Pharmacology, Monash University内のAnimal Houseにおいて、標準的なケージ内に収容し、そこで最初に、標準的な食事を維持した。収容部を、おおよそ21℃±5℃に維持し、マウスを12時間の明/暗サイクルに曝して、食物および水を自由に摂らせた。着手した実験手順は、School of Biomedical Sciences (SOBS) Animal Ethics Committee of Monash University (2013/118)によって承認かつ認定された。
高塩分食(5%塩)モデルが、臨床的に関連した疾患−逆転モデルであり、これは、先進国において現在拡大中の問題である、ヒトによる高塩分摂取量を再現し得る。高塩分摂取量は、心血管系の変化を誘導して、心臓および肝臓におけるリモデリングおよび線維形成を誘導する。
ホルマリン固定した、パラフィン包埋肝臓を、4μmの厚さに切片化して、肝線維症の分析について標準的な手順に従って、マッソントリクロームで染色した。最初に、切片を脱パラフィンして、100%アルコール、95%アルコール、および75%アルコールの洗浄によって再水和させてから、蒸留水中で洗浄した。切片を、ブアン溶液中で56℃にて1時間再固定して、染色品質を向上させてから、水道の流水中で5〜10分間リンスして、黄色を除去した。この後、切片を10分間のワイゲルト鉄ヘマトキシリン実験溶液中で着色した。水道の温かい流水中で10分間リンスした。蒸留水中で洗浄した。Biebrich scarlet-acid fuchsin solution中で10〜15分間染色した。蒸留水中で洗浄した。リンモリブデンリン−タングステン酸溶液中で10〜15分間、コラーゲンがもはや赤色でなくなるまで、分化させた。切片をアニリンブルー溶液に直接(リンスなしで)移して、5〜10分間染色した。蒸留水中で簡単にリンスして、1%酢酸溶液中で2〜5分間分化させた。蒸留水中で洗浄した。95%エチルアルコール、無水エチルアルコールに非常に迅速に通して脱水させて、キシレン中でクリアにした。DPX封入媒質で封入した。
結果を、平均±平均の標準誤差(SEM)として表した。全ての統計プロットおよび統計分析を、Prismプログラム(GraphPad Software Inc. SanDiego, CA, USA)を用いて実行した。老齢WTと、老齢モデルにおけるIRAP KOマウスとの統計学的比較(心肥大、コラーゲン沈着、全てのIHC定量化、およびウェスタンブロット分析)、または逆転モデルにおけるビヒクル処置老齢WTとHFI−419処置老齢WTとの比較を全て、t検定を用いて行った。幼年WTまたはIRAP−/−と老齢のWTまたはIRAP−/−とを比較するデータセット、および内皮血管拡張機能のデータ全てについて、二元配置分散分析(ANOVA)の後に、必要に応じて、事後ボンフェローニ補正を用いて、比較した。Langendorff単離心臓灌流実験において、標準偏差の同一性およびガウス分布を、コルモゴロフ/スミルノフ法を用いて試験した。事後ボンフェローニ検定による一元配置ANOVAおよび二元配置ANOVAを、LVDP、EDP、HR、±dP/dtの基礎的な記録に実行した一方、LVDPおよびEDPの虚血後再灌流を、二元配置ANOVAを用いて評価した。
HFI−419、化合物1、および化合物2を、それぞれ国際公開第2009065169号パンフレット、オーストラリア国特許第2015901676号明細書、およびAndersson et al J. Med. Chem., (2010) 53, 8059に従って合成した。一部の化合物の合成を以下に記載し、それらの阻害活性は、国際出願PCT/AU2016/050332号明細書に記載されている。
全ての試薬および溶媒は、受け取ったままの状態で用いた。プロトン核磁気共鳴(1H n.m.r.)スペクトルを、300MHzにて、Bruker Advance DPX-300により、または400MHzにて、Bruker Ultrashield-Advance III NMR分光計を用いて、記録した。1H n.m.r.スペクトルは、示すように、重水素化溶媒中の溶液に言及する。残りの溶媒のピークを、内部基準として用いた。各共鳴を、以下の規則に従って割り当てた:化学シフト(δ)を、残りの溶媒のピークに対する100万分の1(ppm)で測定した。高分解能質量分析値を、エレクトロスプレーイオン源(ESI)を装備するBruker Apex II Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometerで収集した。低分解能質量分析を、大気圧(ESI/APCI)イオン源を備えたMicromass Platform IIシングル四重極質量スペクトロメータを用いて、実行した。
ピペリジン(cat.)を、マロノニトリル(1.1eq.)およびアルデヒド(1eq.)のEtOH(3〜5mL)溶液に加えて、周囲温度にて15分間撹拌した。アセト酢酸エチル(1.1eq.)を加えて、混合液を、周囲温度にて4時間撹拌した。溶媒の容量を減らして、生じた沈殿物を収集して、低温EtOHで洗浄して、表題の化合物が得られた。必要であれば、化合物を、高温EtOHから再結晶化させ、またはDCMで摩砕した。
一般的な方法に従って、4−カルボキシベンズアルデヒド(1.0g、6.6mmol)、マロノニトリル(0.48g、7.3mmol)、アセト酢酸エチル(0.95g、7.3mmol)、ピペリジン(8滴)、およびエタノール(20mL)により、表題の化合物が白色の固体として得られた(1.7g、78%)。
一般的な方法に従って、3−カルボキシベンズアルデヒド(100mg、0.66mmol)、マロノニトリル(48mg、0.73mmol)、アセト酢酸エチル(95mg、0.73mmol)、ピペリジン(滴)、およびエタノール(3mL)により、表題の化合物が、EtOHからの再結晶後に、白色の固体として得られた(41mg、19%)。
一般的な方法に従って、4−ホルミル−2−メチルフェニルアセテート(100mg、0.56mmol)、マロノニトリル(41mg、0.67mmol)、アセト酢酸エチル(80mg、0.67mmol)、ピペリジン(3滴)、およびエタノール(5mL)により、表題の化合物が白色の固体として得られた(87mg、44%)。
一般的な方法に従って、4−ホルミル−2,6−ジメチルフェニルアセテート(85mg、0.44mmol)、マロノニトリル(32mg、0.49mmol)、アセト酢酸エチル(63mg、0.49mmol)、ピペリジン(2滴)、およびエタノール(3mL)により、表題の化合物が白色の固体として得られた(146mg、90%)。
一般的な方法に従って、4−(2−ピリジル)ベンズアルデヒド(250mg、1.36mmol)、マロノニトリル(99mg、1.50mmol)、アセト酢酸エチル(195mg、1.50mmol)、ピペリジン(3滴)、およびエタノール(5mL)により、表題の化合物が白色の固体として得られた(410mg、83%)。
一般的な方法に従って、2−キノリンカルボキサルデヒド(250mg、1.59mmol)、マロノニトリル(115mg、1.75mmol)、アセト酢酸エチル(228mg、1.75mmol)、ピペリジン(3滴)、およびエタノール(5mL)により、表題の化合物が、再結晶後に、白色の固体として得られた(302mg、57%)。
一般的な方法に従って、3−キノリンカルボキサルデヒド(50mg、0.32mmol)、マロノニトリル(23mg、0.35mmol)、アセト酢酸エチル(45mg、0.35mmol)、ピペリジン(1滴)、およびエタノール(3mL)により、表題の化合物が白色の固体として得られた(85mg、79%)。
一般的な方法に従って、4−キノリンカルボキサルデヒド(250mg、1.59mmol)、マロノニトリル(115mg、1.75mmol)、アセト酢酸エチル(228mg、1.75mmol)、ピペリジン(2滴)、およびエタノール(5mL)により、表題の化合物が白色の固体として得られた(395mg、74%)。
ピペリジン(2滴)を、4−(2,2−ジシアノビニル)安息香酸(200mg、1.01mmol)およびアセト酢酸メチル(117mg、1.01mmol)のEtOH(3mL)懸濁液に加えた。混合物を周囲温度にて6時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温EtOHで洗浄して、白色の固体が得られた(117mg)。カラムクロマトグラフィ(SiO2、EtOAc:MeOH(9:1))により、表題の化合物が白色の固体として得られた(78mg、25%)。
(i)4−(2,2−ジシアノビニル)安息香酸
ピペリジン(66μL、0.67mmol)を、マロノニトリル(480mg、7.27mmol)および4−カルボキシベンズアルデヒド(1.0g、6.65mmol)のEtOH(5mL)混合液に加えた。懸濁液を加熱して、18時間還流させた。冷却した後に、溶媒を真空内で除去して、トルエン中に入れた。生じた沈殿物を収集して、トルエンおよび低温EtOHで洗浄して、中間体が淡い黄色の固体として得られた(1.28g、85%)。
ピペリジン(5μL、0.05mmol)を、4−(2,2−ジシアノビニル)安息香酸(100mg、0.5mmol)およびアセト酢酸ベンジル(87μL、0.5mmol)のEtOH(3mL)懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて6時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温EtOHで洗浄して、白色の固体が得られた(55mg)。カラムクロマトグラフィ(SiO2、EtOAc)により、表題の化合物が淡褐色の固体として得られた(31mg、16%)。
(i)2−(4−シアノベンジリデン)マロノニトリル
マロノニトリル(111mg、1.68mmol)および4−シアノベンズアルデヒド(200mg、1.53mmol)のH2O(10mL)懸濁液を、100℃にて8時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、H2Oで洗浄して、表題の化合物がクリーム状の固体として得られた(228mg、83%)。
ピペリジン(3μL、0.028mmol)を、中間体2−(4−シアノベンジリデン)マロノニトリル(50mg、0.28mmol)およびアセト酢酸ベンジル(48μL、0.28mmol)のEtOH(2mL)懸濁液に加えた。混合液を、周囲温度にて1時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温EtOHで洗浄して、表題の化合物が白色の固体として得られた(77mg、74%)。
(i)2−(3−シアノベンジリデン)マロノニトリル
マロノニトリル(111mg、1.68mmol)および3−ホルミルベンゾニトリル(200mg、1.53mmol)のH2O(5mL)懸濁液を、マイクロ波加熱により100℃にて、3分間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、H2Oで洗浄して、表題の化合物が白色の固体として得られた(225mg、82%)。
ピペリジン(3μL、0.028mmol)を、2−(3−シアノベンジリデン)マロノニトリル(50mg、0.28mmol)およびアセト酢酸ベンジル(48μL、0.28mmol)のEtOH(2mL)懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて1時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温EtOHで洗浄して、表題の化合物が白色の固体として得られた(82mg、79%)。
ピペリジン(38μL、0.38mmol)を、4−(2,2−ジシアノビニル)安息香酸(750mg、3.78mmol)およびアセチルアセトン(379mg、3.78mmol)のEtOH(5mL)懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて18時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温EtOHで洗浄して、表題の化合物が白色の固体として得られた(840mg、75%)。
ピペリジン(2滴)を、マロノニトリル(48mg、0.73mmol)および3−カルボキシベンズアルデヒド(100mg、0.66mmol)のアセトニトリル(3mL)溶液に加えて、周囲温度にて1時間撹拌した。アセチルアセトン(75μL、0.73mmol)を加えて、混合液を周囲温度にて4時間撹拌した。溶媒の容量を減らして、生じた残留物を、カラムクロマトグラフィ(SiO2、CHCl3:ACN:AcOH、9:0.7:0.3)によって精製した。生成物が、淡褐色の固体として得られた(13mg、7%)。
(i)2−(キノリン−2−イルメチレン)マロノニトリル
マロノニトリル(92mg、1.39mmol)および2−キノリンカルボキサルデヒド(200mg、1.27mmol)のH2O(5mL)懸濁液を、周囲温度にて7時間撹拌した。沈殿物を収集して、H2Oで洗浄して、表題の化合物が緑色の固体として得られた(240mg、92%)。
ピペリジン(2.4μL、0.024mmol)を、2−(キノリン−2−イルメチレン)マロノニトリル(50mg、0.24mmol)およびアセチルアセトン(25μL、0.24mmol)のEtOH(0.5mL)溶液に加えた。混合液を周囲温度にて6時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温EtOHで洗浄して、淡い茶色の固体が得られた(24mg、33%)。
ピペリジン(3μL、0.028mmol)を、2−(3−シアノベンジリデン)マロノニトリル(50mg、0.28mmol)およびアセチルアセトン(28mg、0.28mmol)のEtOH(2mL)懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて1時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温EtOHで洗浄して、白色の固体が得られた(64mg)。カラムクロマトグラフィ(SiO2、EtOAc:ヘキサン、1:2に続いて100%EtOH)により、表題の化合物が白色の固体として得られた(36mg、46%)。
(i)2−(4−(チオフェン−2−イル)ベンジリデン)マロノニトリル
ピペリジン(2.6μL、0.027mmol)を、マロノニトリル(19mg、0.29mmol)および4−(2−チエニル)ベンズアルデヒド(50mg、0.27mmol)のEtOH(1.5mL)溶液に加えた。混合液を周囲温度にて1時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温EtOHで洗浄して、中間体が黄色の固体として得られた(53mg、83%)。
ピペリジン(2.2μL、0.022mmol)を、中間体2−(4−(チオフェン−2−イル)ベンジリデン)マロノニトリル(53mg、0.22mmol)およびアセチルアセトン(23μL、0.22mmol)のトルエン(1mL)懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて4時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、トルエンで洗浄して、淡い黄色の固体が得られた。カラムクロマトグラフィ(SiO2、CH2Cl2:Et2O、95:5)により、表題の化合物が白色の固体として得られた(40mg、77%)。HRMS(ESI+):実測値:m/z337.1008(M+H)+,C19H17N2O2S理論値m/z337.1001.
(i)2−(キノキサリン−6−イルメチレン)マロノニトリル
ピペリジン(4.7μL、0.047mmol)を、マロノニトリル(34mg、0.52mmol)およびキノキサリン−6−カルバルデヒド(75mg、0.47mmol)のEtOH(1mL)溶液に加えた。混合液を周囲温度にて1時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温EtOHで洗浄して、中間体が淡褐色の固体として得られた(66mg、68%)。
ピペリジン(1.4μL、0.015mmol)を、中間体2−(キノキサリン−6−イルメチレン)マロノニトリル(30mg、0.145mmol)およびアセチルアセトン(15μL、0.145mmol)のトルエン(1mL)懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて4時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温Et2Oで洗浄して、表題の化合物が淡褐色の固体として得られた(38mg、86%)。HRMS(ESI+):実測値:m/z307.1190(M+H)+,C17H15N4O2理論値m/z307.1195.
(i)2−(2,2−ジシアノビニル)安息香酸
マロノニトリル(48mg、0.73mmol)および2−カルボキシベンズアルデヒド(100mg、0.67mmol)のH2O(4mL)懸濁液を、マイクロ波加熱により100℃にて、3分間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、H2Oで洗浄して、表題の化合物が白色の固体として得られた(34mg、55%)。
ピペリジン(12.5μL、0.125mmol)を、2−(2,2−ジシアノビニル)安息香酸(50mg、0.25mmol)およびアセチルアセトン(25mg、0.25mmol)のEtOH(3mL)懸濁液に加えた。混合液を3日間撹拌した。溶媒を真空内で除去して、残留物をEtOAc内に入れて、18時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温EtOAcで洗浄して、淡い黄色の固体が得られた(76mg)。カラムクロマトグラフィ(SiO2、ACN:CHCl3、2:1に続いてEtOAc:MeOH、95:5)により、黄色の残留物が得られた(33mg)。
4−(3−アセチル−6−アミノ−5−シアノ−2−メチル−4H−ピラン−4−イル)安息香酸(250mg、0.84mmol)の無水酢酸(3mL)溶液を加熱して、3時間還流させた。混合液をN2流下で濃縮してから、氷冷したH2O中に注いだ。水溶液をEtOAcで抽出して(3×20mL)、組み合わせた有機抽出物をブライン(20mL)で洗浄して、乾燥させて(MgSO4)、濾過して、真空内で減らして、黄色の油が得られた。黄色の油をEtOH(5mL)中に溶解させて、ヒドラジン水和物(1.3eq.)を加えた。30分間の撹拌後、懸濁液を真空内で減らして、H2O(10mL)内に入れて、EtOAc(3×10mL)で抽出した。組み合わせた有機抽出物を乾燥させて(MgSO4)、濾過して、溶媒を真空内で除去して、黄色の油が得られた。カラムクロマトグラフィ(SiO2、EtOAc:MeOH、95:5に続いて100%EtOH)により、表題の化合物が得られた(20mg、7%)。
(i)(Z)−4−(2−シアノ−3−エトキシ−3−オキソプロプ−1−エニル)安息香酸
ピペリジン(13μL、0.13mmol)を、エチルシアノアセテート(151mg、1.33mmol)および4−カルボキシベンズアルデヒド(200mg、1.33mmol)のEtOH(3mL)懸濁液に加えた。混合液を加熱して、3時間還流させた。混合液を真空内で濃縮した。トルエンを加えて、生じた沈殿物を収集して、トルエンで洗浄して、中間体が白色の固体として得られた(278mg、85%)。
ピペリジン(20μL、0.2mmol)を、(Z)−4−(2−シアノ−3−エトキシ−3−オキソプロプ−1−エニル)安息香酸(50mg、0.2mmol)およびアセト酢酸エチル(26mg、0.2mmol)のEtOH(3mL)懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて2日間撹拌した。ピペリジン(10μL、0.1mmol)を加えて、溶液をさらに1日間撹拌した。混合液を真空内で濃縮して、残留物をカラムクロマトグラフィ(SiO2、EtOAc:ヘキサン、2:1)によって精製して、黄色の油が得られた。EtOHからの再結晶により、白色の固体が得られた(>5mg)。
ピペリジン(30μL、0.3mmol)を、(Z)−4−(2−シアノ−3−エトキシ−3−オキソプロプ−1−エニル)安息香酸(50mg、0.2mmol)およびアセチルアセトン(20mg、0.2mmol)のEtOH(3mL)懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて24時間撹拌した。分析HPLCにより、出発材料の、生成物に対する比率が1:1であると示される。しかしながら、更なる反応時間により変質する。カラムクロマトグラフィ(SiO2、EtOAc)による精製により、表題の化合物が得られた(2mg、3%)。
粗膜を、完全長ヒトIRAPまたは空のベクターでトランスフェクションしたHEK 293T細胞から調製してから、50mMトリス−HCl、1%トリトンX−100からなるバッファpH7.4中での4℃での5時間にわたる撹拌下で、可溶化させる。可溶化の後、膜を、23,100gでの4℃15分間の遠心分離によってペレット化して、上澄みを、IRAP活性源として保存する。IRAPの酵素活性を、380および440nmのそれぞれ励起および放射波長での、蛍光性製品MCAの放出によって監視される合成基質Leu−MCA(Sigma- Aldrich, Missouri, USA)の加水分解によって、決定する。アッセイを、96ウェルプレート内で実行する;各ウェルに、50mMトリス−HClバッファ(pH7.4)の100μLの最終容量中0.2〜10μgの可溶化膜タンパク質、広範な濃度の基質を含有させる。放射を、空のベクターでトランスフェクションした膜とのインキュベーションから減算することによって、基質の非特異的加水分解を補正する。反応を37℃にて30分間続行して、IRAP阻害活性を、96ウェルマイクロタイタープレート内で、吸光度をWallac Victor 3分光光度計で監視して、決定する。動態パラメータ(KmおよびV)を、ミカエリス−メンテン式の非線形フィッティング(GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., CA, USA);Leu−MCAの最終濃度15.6μM〜1mMによって、決定する。競合インヒビタについてのインヒビタ定数(Kj)を、関係IC50=K;(1+[S]/Km)から算出する;式中、IC50値を、広範なインヒビタ濃度(10〜9から10”4M)にわたって決定する。Leu−MCAについてのIRAPのKm値を、動態研究から決定する。化合物の、IRAPに対する結合親和性を、化合物の濃度を増大させながら(10*8から10〜3M)存在させて、Leu−MCAの加水分解の阻害を監視することによって、調査した。
線維症のアンギオテンシンII起因性マウスモデルの心臓および血管におけるIRAP特異的作用を調査する研究を、最初の原理実証研究として実行した。遺伝的欠失モデルにおいて、雄の幼年成体のWTマウスおよびIRAP KOマウス(4〜6ヵ月齢)を、Ang IIまたは生理食塩水で皮下に4週間、浸透圧ミニポンプを介して処理した。血圧を隔週に測った。薬理学的阻害モデルにおいて、WTマウスを、合成IRAPインヒビタHFI−419で、Ang II−注入と併せて4週間、皮下に共処置した。インヒビタを、1:3の比率のジメチルスルホキシド(DMSO)および2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(HBC)中に溶解させた。
IRAP欠失、またはHFI419による常習的IRAPインヒビタ処置は、血圧の、Ang II起因性の上昇を弱める(図1)。データを、平均±s.e.mとして表す;P値を、反復測定二元配置分散分析(ANOVA)によって決定する。
IRAP発現は、Ang IIを注入したWTマウスの大動脈(図2a)および心臓(図2b)において、増大する。これは、Ang II±ビヒクル/HFI−419で処置した成体(4〜6ヵ月齢)のWTマウスおよびIRAP−/−マウス(n=5)由来の5μmの厚さの横断方向大動脈切片の内側領域および外膜領域におけるIRAP発現の定量化によって、示される。さらに、図2bにおけるデータは、Ang II±ビヒクル/HFI−419で処置した成体(4〜6ヵ月齢)のWTマウスおよびIRAP−/−マウス(n=5)由来の5μmの厚さの横断方向心臓切片におけるIRAPの定量化に由来した。IRAPの定量化を、陽性染色組織面積パーセントとして表す。データを、平均±s.e.mとして表す;P値を、二元配置分散分析(ANOVA)によって決定する。
生理食塩水またはAng II±ビヒクル/HFI−419で処置した成体(4〜6ヵ月齢)のWTマウスおよびIRAP−/−マウス由来の胸部大動脈切片における陽性染色免疫蛍光の典型的な画像および定量化は、赤色のTGF−β1およびα−SMAの発現の低下を実証した(緑色は、弾性薄膜の自家蛍光を示す)(図3)。ピクロシリウスレッドを用いたコラーゲン染色を決定してから、偏光顕微鏡観察により画像化した。データを、陽性染色面積パーセンテージの平均±s.e.mとして表す(n=5〜6)。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ANOVAによって決定した。これらの発見は、AngII起因性血管線維症および線維化促進マーカーが上昇すること、そしてこれらの上昇は、IRAP−/−マウスにおいて、またはHFI−419処置によって、予防されたことを示す。
生理食塩水またはAng II±ビヒクル/HFI−419で処置した成体(4〜6ヵ月齢)のWTマウスおよびIRAP−/−マウス由来の胸部大動脈切片における陽性染色免疫蛍光の典型的な画像および定量化は、赤色のP−IκBα(NFκB活性化についてのマーカー)、MCP−1、ICAM−1、およびVCAM−1(血管細胞接着タンパク質−1)の発現の低下を示した(緑色は、弾性薄膜の自家蛍光を示す)(図4)。データを、陽性染色面積パーセンテージの平均±s.e.mとして表す(n=5〜6)。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ANOVAによって決定した。
IRAP欠失またはIRAP阻害(HFI−419を用いる)が、図5aに示すように、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した横断方向心臓切片(n=6)における心筋細胞断面積を用いて評価した心肥大のAng II介在性増大を、予防した。IRAPの欠失または阻害が、図5bに示すように、ピクロシリウスレッドで染色した横断方向心臓切片(n=6)の明視野顕微鏡観察を介して判定した間質コラーゲンの発現を、有意に引き下げた。データを、陽性染色面積パーセンテージの平均±s.e.mとして表す(n=5〜6)。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ANOVAによって決定した。
図6は、生理食塩水またはAng II±ビヒクル/HFI−419で処置した成体(4〜6ヵ月齢)のWTマウスおよびIRAP−/−マウス由来の横断方向心臓切片における陽性染色免疫蛍光の典型的な画像および定量化を示しており、ビメンチン染色(線維芽細胞発現についてのマーカー)の変化なし、α−SMA染色(筋線維芽細胞発現についてのマーカー)の減少、TGF−β1(線維形成誘導性サイトカイン)の血管周囲発現の引下げ、およびTGF−β1のタンパク質発現(ウェスタンブロットにより分析した)の引下げを示した。データを、WT対照の平均±s.e.mに対する相対比率として表した、免疫蛍光についての陽性染色面積パーセンテージ、およびウェスタンブロットの濃度測定分析の平均±s.e.mとして表す;(n=5〜6)。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ANOVAによって決定した。
図7は、生理食塩水またはAng II±ビヒクル/HFI−419で処置した成体(4〜6ヵ月齢)のWTマウスおよびIRAP−/−マウス由来の横断方向心臓切片における陽性染色免疫蛍光またはウェスタンブロット分析を用いたタンパク質レベルの定量化の典型的な画像および定量化を示す(n=5〜6)。IRAP欠失またはIRAP阻害が、スーパーオキシド生成のAng II起因性増大を予防し、NADPHオキシダーゼアイソフォーム、NOX−2の発現に影響を及ぼさず、P−IκBα発現(NFκB活性化についてのマーカー)を引き下げ、ICAM−1発現およびタンパク質含有量の双方を引き下げ、そしてMCP−1およびマクロファージ発現を引き下げた。データを、WT対照の平均±s.e.mに対する相対比率として表した、免疫蛍光についての陽性染色面積パーセンテージ、およびウェスタンブロットの濃度測定分析の平均±s.e.mとして表す;(n=5〜6)。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ANOVAによって決定した。
IRAPの欠失およびIRAPの直接的な薬理学的阻害が、アンギオテンシンII介在性の、心臓および血管の線維症および炎症を予防するのに有効であったことを示す原理実証研究(実施例1)に続いて、この実施例は次に、IRAPを標的とする臨床有効性の潜在性を強調する。これは、包括的IRAP欠失マウスが、心線維症および炎症の年齢起因性増大から保護される一方、直接的なIRAP阻害が、年齢起因性心臓リモデリングを完全に逆転する、心血管線維症の老齢モデルを用いて、実証される。
本研究において、IRAP免疫蛍光が、心臓の間質領域および血管周囲領域の双方に存在し、そして、幼年遺伝子型対照と比較して、老齢WTマウスの心臓において二倍であった(図8a、図8b)。この作用の正確度は、幼年成体および老齢のIRAP−/−マウスから得た心臓における染色の不在によって確認された(図8a)。さらに、IRAP発現は、間質領域および血管周囲領域の双方において、α−平滑筋アクチン(α−SMA)発現と共局在しており、このことはそれが、VSMC上に位置決めされ、かつ筋線維芽細胞を分化させたことを示唆している。ピクロシリウスレッド染色を用いたコラーゲン含有量、ならびに明視野および円偏光光学顕微鏡を用いた定量化によって評価した心線維症を、幼年WTマウスおよび老齢WTマウス、ならびに幼年IRAP−/−マウスおよび老齢IRAP−/−マウスにおいて評価した。予想されるように、加齢が、心臓間質線維形成を有意に、約75%増大させ(図9a、図9b;図10a、図10b)、そしてまた、血管周囲線維形成を増大させ、老齢心臓におけるECMの既知の上昇と同調していた(図10c、図10d)。そのような発見は、CVDの自然な進行に従う動物モデルを用いることの重要性を強調する。本発明者らの老齢WTマウス由来の心臓において見られるコラーゲンの増大と対照的に、老齢IRAP−/−マウスは、幼年成体WTマウスにおいて見られるのと類似したECM沈着を示し(図9a、図9b;図10a〜図10d)、これは、IRAPがない場合の抗線維化作用を示しており、このことは、I型コラーゲンα1タンパク質レベルの成熟形態の減少によって確認された(図11)。
心臓におけるジヒドロエチジウム(DHE)染色は、老齢WT対照と比較して、老齢IRAP−/−マウスにおける心臓スーパーオキシド(・O2 −)生産が約40%少ないことを明らかにした(図13a)。IRAP−/−マウス心臓はまた、より少ないホスホIκBαの発現(NFκB活性化の低下(図13a)を示す)、および炎症の低下を、血管周囲免疫組織化学、およびウェスタンブロット分析による、単球化学誘引タンパク質−1(MCP−1)発現の引下げ、細胞間接着分子1(ICAM−1)発現の著しい引下げによって実証し、これにより心臓におけるマクロファージ浸潤が引き下げられた(図13)。心臓から放出されるサイトカインのパターンも調査した。老齢IRAP−/−マウスの心臓において、炎症誘発サイトカインIL−1β、IL−17A、およびTNF−αの僅かな増大があった(図14)。しかしながら、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、およびIL−12p40が挙げられるいくつかの抗炎症サイトカインのより著しい増大があり(図14;表1)、老齢IRAP−/−マウスにおける抗炎症表現型の証拠が得られた。
IRAPを欠く老齢マウスが、心臓表現型について、年齢マッチWT対照と比較して、幼年成体の対応動物に似るように、ECM、炎症、および酸化ストレスの引下げを示すことを考えれば、本発明者らは、小分子IRAPインヒビタによるIRAPの薬理学的阻害が、心血管疾患の確立時に、心線維症を逆転し得るか否かに関心をもった。この目的で、合成IRAPインヒビタHFI−419を、心線維症を確立した4週から約20ヶ月齢のWTマウスに投与した。実際に、HFI−419は有意に、IRAP発現を引き下げ(図8c)、年齢起因性コラーゲン沈着を、幼年成体マウス(図15および図16)または老齢のIRAP−/−マウス(図9)において見られるのと同じレベルに逆転し、そしてまた、I型コラーゲンα1の前駆体および成熟形態を著しく引き下げた(図17);全て、IRAP阻害後の線維形成誘導性メディエータ、例えば合成筋線維芽細胞(図18)およびTGF−β1発現(図18)の下方制御と整合した。IRAP阻害は、コラゲナーゼMMP−8のタンパク質発現の増大に傾くIRAP欠失マウスにおいて見られるものと僅かにしか異ならない、コラーゲン分解に及ぼす作用を有した一方、MMP−2、MMP−9、またはMMP−13のタンパク質レベルにおいては、変化がなかった。しかしながら、HFI−419処置は、TIMP−1タンパク質レベルを有意に減少させた(図17)ので、MMPの活性増大を可能にすることで、IRAPの阻害によるコラーゲン分解の全体的な増大が実現した。
HFI419に加えて、IRAPインヒビタの2つの構造的に異なる化学クラスが、図19に示すように、心臓において、年齢起因性コラーゲン発現を逆転する。クラス1インヒビタは、化合物1であり、本明細書において示す構造を有する一方、クラス2は、本明細書において示す構造を有する化合物2である。これらのデータは、IRAPの3つの異なる小分子インヒビタが、年齢起因性モデルにおいて、コラーゲン発現(線維症の特質)を逆転することを示したことを示している。
細胞外マトリックス沈着の引下げが、心機能の向上に変換されたかを判定するために、2つのプロトコルを研究した。第1のプロトコルにおいて、心臓を、幼年WTマウス、老齢IRAP−/−マウス、およびビヒクルまたはHFI−419で4週間処置した老齢WTマウスから単離して、虚血再灌流(IR)傷害にしてから、IR後の心機能を評価し、かつIR起因性梗塞を分析した。ベースラインにて、老齢WTマウス(ビヒクルおよびHFI−419で処置)または老齢IRAP−/−マウスにおいて、HR、LVDP、またはLVEDPに差異はなかった。ビヒクル処置老齢WTマウス由来の心臓におけるLVDPおよびLV±dP/dt双方の回復は、幼年WTマウス由来の心臓におけるIR傷害の作用と比較して、虚血および再灌流の時間経過と共に有意に損なわれ(図20b〜図20d)、LV機能のこれらのマーカーは、それらの前虚血ベースラインレベルと比較して、有意に引き下げられた。IRAP欠失または常習的IRAPインヒビタ処置は、再灌流の最初の10分において、LVDPの回復に影響を及ぼさなかった。しかしながら、LVDPおよびLV±dP/dtにおける再灌流の後の方のステージにおける有意な改善が、20分の再灌流から明らかであり、幼年WTマウス由来の心臓と、老齢のIRAP−/−マウスまたはIRAPインヒビタ処置マウス由来の心臓とにおけるLVDPの回復に、有意差はなかった(図20b〜図20d)。IRAP欠失または常習的IRAPインヒビタ処置の、IR傷害から保護する能力もまた、梗塞面積を測定して明らかとなった;IRAP欠失およびIRAP阻害は双方とも、老齢WT対照と比較して、梗塞面積を約50%減少させた(図20a)。第2のプロトコルにおいて、心エコー検査研究を用いて、WTマウスにおける心機能の年齢起因性変化が、IRAPを包括的に欠失した老齢マウスにおいて軽減したかを判定した。心臓を、いくつかの解剖学的外観、および心エコー検査を介したイメージングモードを用いて、画像化した。幼年WTマウスおよび老齢WTマウスのベースライン心臓機能測定基準は、高齢のマウスの以前の心エコー検査研究において報告したものと類似していた(Dai et al, Circulation. 2009; 119:2789-2797)。しかしながら、IR傷害後のIRAP−/−マウスから単離した心臓において実証された保護作用と同様に、老齢IRAP−/−マウスは、年齢マッチWTマウス(n=4〜5)と比較した場合に、駆出率の年齢起因性の低下なく、心機能の向上を(図20e)、そして左心室収縮性(面積変化率;FACにより評価)の向上傾向を(図20f)示し、これは、老齢IRAP−/−マウス由来の心臓における明らかな線維形成の引下げと相関しており、IRAPを標的とすることが確認される。
収縮期血圧(SBP)に関して、僅かな差異が、老齢WTマウスと老齢IRAP−/−マウスとの間に(図21)、またはHFI−419処置老齢WTマウスとの間に(図16)存在した。心室重量対体重(VW:BW)比、および心室重量対脛骨長(VW:TL)比によって評価した心肥大、ならびにH&Eで染色した心筋細胞の断面積として定量化した心筋細胞肥大は、多くの場合、加齢に起因して増大したが、IRAPの欠失または薬理学的阻害によって大きく影響されなかった(図21および図16)。したがって、HFI−419の著しい抗線維化作用および抗炎症作用は、血圧および心臓サイズの変化から独立していた。
おおよそ170万人のオーストラリア人および2600万人のアメリカ人は、腎機能が低下した慢性腎疾患を患っている。慢性腎疾患(CKD)の最終徴候は、尿細管間質性線維症および糸球体硬化症によって特徴付けられる腎線維症である。
心線維症に関する先の実施例2と同様に、2つの具体的な実験パラダイムを用いた。それゆえに、本発明者らは、老齢のWTマウスと、包括的IRAPノックアウトマウス(18〜22ヵ月齢)と、幼年WTマウス(4〜6ヵ月齢)との間で、腎臓表現型を比較して、加齢による腎線維症の進行の予防を判定した。本発明者らはまた、WT老齢マウスの処置を、ビヒクルと、またはIRAPの小分子インヒビタと比較して、確立された線維症の治療処置を決定し、そして加齢による腎線維症の逆転に及ぼすIRAP阻害の作用を確立した。
ピクロシリウスレッド染色を用いてコラーゲン含有量によって評価し、かつ明視野顕微鏡観察を用いて定量化した腎臓間質線維形成を、幼年WTマウス、老齢のWTマウスおよびIRAP−/−マウス、ならびにビヒクルまたはHFI−419(500ng/kg/分;s.c.)で4週間処置した老齢WTマウスにおいて、評価した。予想されるように、加齢は、腎臓間質線維形成を有意に増大させた(図23a)。本発明者らの老齢WTマウス由来の腎臓において見られるコラーゲンの増大と対照的に、老齢IRAP−/−マウスは、幼年成体WTマウスにおいて見られるのと類似したECM沈着を示し(図23a)、これは、IRAPがない場合の抗線維化作用を示し、そして、老齢IRAP−/−マウス由来の心臓において見られる抗線維化作用と一致した(実施例2)。老齢WTマウスが腎線維形成の有意な増大を有し、そしてIRAPを欠いている老齢マウスが、幼年成体の対応動物に類似したコラーゲン発現の引下げの腎臓表現型を実証することを考えれば、本発明者らは、小分子IRAPインヒビタによるIRAPの薬理学的阻害が、心血管/腎臓疾患の確立時に、腎線維症を逆転することができるか否かに関心をもった。この目的で、合成IRAPインヒビタHFI−419を、腎線維症を確立した4週から約20ヶ月齢のWTマウスに投与した。実際に、HFI−419は、年齢起因性コラーゲン沈着を、幼年成体のWTマウスおよびIRAP−/−マウスにおいて見られるのと類似したレベルに完全に逆転する有意な作用を示した(図23aおよび図23b)。
臨床的に関連したヒトモデルにおけるIRAP阻害の心臓保護作用の基礎となる機構を解明するために、ヒト心臓線維芽細胞の一次細胞株を研究した。研究は、以下の疑問に答えるために実行した:IRAPがこれらの細胞中に存在し、そして線維化促進刺激因子がIRAP発現を増大させるのか?IRAP阻害が、筋線維芽細胞発現/コラーゲン生産を引き下げることができるのか?
典型的な画像は、Ang IIの濃度の増大により刺激された一次ヒト心臓線維芽細胞が、IRAPの発現の増大を誘導したことを示している(図25)。ヒト心臓線維芽細胞におけるIRAP発現の用量依存性の増大が明確である。
小分子HFI−419による薬理学的IRAP阻害は、筋線維芽細胞発現(α−SMA染色)およびコラーゲン生産を用量依存的に引き下げた。典型的な画像は、ヒト心臓線維芽細胞(HCF)をAng II(0.1μM)で刺激した場合の、α−SMA(赤色;筋線維芽細胞についてのマーカー)およびコラーゲン(緑色)の発現の増大を示している(図26a)。Ang IIおよびHFI−419の併用処置(0.01から1μM)は、α−SMAおよびコラーゲンの発現を引き下げた。図26bは、ウェスタンブロット由来の定量データであり、HCFを、Ang II+濃度を上げたHFI−419で共処置した場合、α−SMAおよびコラーゲンのタンパク質発現の用量依存的引下げを確認した(n=10〜12)。データを、平均±s.e.mとして表す;ウェスタンブロットの濃度測定分析を、対照細胞の平均±s.e.mに対する相対比率として表す;*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ANOVAによって決定した。
肝臓脂肪症に及ぼすIRAP遺伝子欠失の作用
雄IRAPノックアウトマウス(IRAO KO:インスリン調節性アミノペプチダーゼについての遺伝子の包括的欠失)6ヵ月齢、およびそれらの野生型対応動物に、高脂肪食(HFD)または標準的な食事(ND)のいずれかを給餌した。4週の食事操作の後、全身の代謝を、Oxymax Lab Animal Monitoring System(Columbus Instruments, OH, U.S.A.)を用いて、マウスの全群において測定した。予想されるように、HFDを給餌したマウスは、ND給餌マウスと比較した場合、呼吸交換比(代謝において生産された二酸化炭素の量と、用いられた酸素の量との比率)が低下し、かつ熱発生量が増大したが、48時間にわたり、遺伝子型間で差異はなかった。
IRAPの薬理学的阻害が、肝線維症における高塩誘導増大を逆転する
塩は、メタボリックシンドロームの進行の促進要因であることが周知であり、そして心血管疾患の進行に関与する。これはおそらく、その酸化促進特性に起因する。最近の証拠は、高塩分食(HSD)が、HFD給餌レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体−1(LOX−1)トランスジェニック(Tg)apoEノックアウト(KO)(TgKO)マウス(メタボリックシンドロームを調査する研究において用いられるモデル)の肝臓における脂肪および線維形成の蓄積を悪化させる虞があることを示している(Uetake et al, Lipids in Health and Disease (2015) 14:6)。したがって、本発明者らは、HSDが単独で、肝線維症の有意な変化を誘導するか、そしてIRAPインヒビタ処置が、これらの線維形成変化を逆転するかに関心をもった。HSDをWT(C57Bl/6J)マウスに8週間給餌することで、肝臓における線維形成および小胞数が有意に増大し、このことは、このモデルが、線維症の悪化が挙げられるNASHの特質の全てを有することを示している。合成IRAPインヒビタHFI−419を、約20週齡のWTマウスに4週間投与した。これには既に、肝臓における変化を誘導するために、初期の4週間、HSDを給餌していた。実際に、HFI−419は、HSD起因性コラーゲン沈着を、標準的な食事を給餌したマウスにおいて見られるのと同じレベルにまで有意に逆転し(図28)、そして肝臓における脂肪症の指標を著しく引き下げた(図28)。これらの抗線維化作用は、合成IRAPインヒビタHFI−419が、確立された心線維症を逆転する明確な能力を示す、以前の発見と一致している。
Claims (43)
- 個体における線維症を処置する方法であって、インスリン調節性アミノペプチダーゼ(IRAP)のインヒビタを投与することを含み、それによって、線維症を処置する方法。
- 前記個体は、線維症を患っていると同定される、請求項1に記載の方法。
- 線維症の、少なくとも1つの臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性の進行を遅らせることによって、線維症を処置する、請求項1または2に記載の方法。
- 線維症の、少なくとも1つの臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性を逆転することによって、線維症を処置する、請求項1または2に記載の方法。
- 臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性は、臓器機能障害、瘢痕化、正常な細胞外マトリックスバランスの変化、コラーゲン沈着の増大、筋線維芽細胞への線維芽細胞の分化、マトリックスメタロプロテイナーゼレベルの下降、マトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビタレベルの上昇、I型プロコラーゲンのN末端プロペプチドもしくはC末端プロペプチド(PINPまたはPICP)どちらかのレベルの上昇、I型コラーゲンのC末端テロペプチド(CTPまたはCITP)のレベルの下降、コラーゲン沈着の増大、または種々の非侵襲性の撮像技術によって測定される心機能障害、ならびに、タンパク尿およびアルブミン尿の増大によって測定される腎機能障害、糸球体濾過速度の低下、血漿クレアチニンレベルの倍増のうちのいずれか1つを含む、請求項3または4に記載の方法。
- コラーゲンは、1型コラーゲンα1の前駆体または成熟形態である、請求項5に記載の方法。
- 前記線維症は、年齢起因性である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記線維症は、ストレス起因性または損傷起因性である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記線維症は、高血圧性心疾患、高血圧心筋症もしくは心不全、または、糖尿病を伴うもしくは伴わない腎症、または、基礎心血管疾患を伴うもしくは伴わない、線維化反応を包含してもよい他のストレス起因性もしくは損傷起因性の心血管後遺症を伴う、請求項8に記載の方法。
- 線維症を患う個体を同定する工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記線維症は、心線維症、肝線維症、腎線維症、血管線維症、肺線維症、および真皮線維症からなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記線維症は、心線維症である、請求項11に記載の方法。
- 前記線維症は、腎線維症である、請求項11に記載の方法。
- 前記線維症は、肝線維症である、請求項11に記載の方法。
- 前記線維症は、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)である、請求項14に記載の方法。
- IRAPの前記インヒビタは、IRAPの酵素活性を直接的にまたは間接的に阻害する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- IRAPのインヒビタは、IRAPの酵素活性を直接的に阻害する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インヒビタは、IRAPに結合する、請求項17に記載の方法。
- 前記インヒビタは、IRAPの活性部位に結合する、請求項17または18に記載の方法。
- IRAPの前記インヒビタは、IRAPへの結合について、IRAPの基質と競合する、請求項17または18に記載の方法。
- IRAPの前記インヒビタは、アミノペプチダーゼ活性または基質分解のアッセイによって決定される、1mM未満、好ましくは100μM未満、より好ましくは10μM未満のKi値を示す、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- アミノペプチダーゼ活性の前記アッセイは、蛍光性製品MCAの放出によって監視される合成基質L−ロイシン7−アミド−4−メチルクマリンヒドロクロリド(Leu−MCA)の加水分解を含む、請求項21に記載の方法。
- 基質分解の前記アッセイは、ペプチド基質CYFQNCPRGまたはYGGFLの分解である、請求項22に記載の方法。
- 前記インヒビタは、小分子、抗体、およびペプチドからなる群より選択される、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インヒビタは、干渉RNAである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インヒビタは、式(I)
(式中、
Aは、
アリール、ヘテロアリールカルボシクリル、もしくはヘテロシクリルであり、これらはそれぞれ、R1がNHCOR8である場合、置換されていてもよく;
または、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、1,8−ナフチリジル、フタラジニル、もしくはプテリジニルであり、これらはそれぞれ、R1がNR7R8、NHCOR8、N(COR8)2、N(COR7)(COR8)、N=CHOR8、もしくはN=CHR8である場合、置換されていてもよく;
Xは、O、NR’、またはSであり、R’は、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、または置換されていてもよいヘテロシクリルであり;
R7およびR8は、独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリールから選択され、またはR7およびR8は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい3〜8員環を形成しており;
R2は、CN、CO2R9、C(O)O(O)R9、C(O)R9、またはC(O)NR9R10であり、R9およびR10は、独立して、それぞれ置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、および水素から選択され;またはR9およびR10は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい3〜8員環を形成しており;
R3〜R6は、独立して、水素、ハロ、ニトロ、シアノアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アミノ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシエステル、メチレンジオキシ、アミド、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、ヘテロシクリルチオ、カルボシクリルチオ、アシルチオ、およびアジドから選択され、これらはそれぞれ、適切な場合には置換されていてもよく、または、任意の2つの隣接するR3〜R6は、これらが結合する原子と共に、置換されていてもよい3〜8員環を形成しており;かつ
Yは、水素またはC1〜10アルキルである)
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を有する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。 - Aは、R1がNHCOR8である場合、置換されていてもよいヘテロアリールである、請求項26に記載の方法。
- Aはピリジニルである、請求項26または27に記載の方法。
- XはOである、請求項26〜28のいずれか一項に記載の方法。
- R2はCO2R9である、請求項26〜29のいずれか一項に記載の方法。
- R5はヒドロキシルである、請求項26〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インヒビタは、式(II)
(式中、
Aは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく;
RAおよびRBは、独立して、水素、アルキル、およびアシルから選択され;
R1は、CNまたはCO2RCから選択され;
R2は、CO2RCおよびアシルから選択され;
R3は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく;または
R2およびR3は共に、5〜6員の飽和ケト炭素環
を形成しており、
式中、nは、1もしくは2であり;
前記環は、C1〜6アルキルによって1回もしくは複数回置換されていてもよく;または
R2およびR3は共に、5員ラクトン環(a)もしくは6員ラクトン環(b)
を形成しており、
式中、
は、任意選択の二重結合であり、R’はアルキルであり、
RCは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよい)
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。 - Aは、置換されていてもよいアリールである、請求項33に記載の方法。
- Aは、−COOHで置換されているアリール、またはその塩、エステル、もしくはプロドラッグである、請求項33または34に記載の方法。
- Aは、−CO2 −NH4 +で置換されているアリールである、請求項35に記載の方法。
- R1はCNである、請求項33〜36のいずれか一項に記載の方法。
- R2はアシルである、請求項33〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インヒビタは、以下の配列:
Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe、
c[Cys−Tyr−Cys]−His−Pro−Phe、および
c[Hcy−Tyr−Hcy]−His−Pro−Phe
のいずれか1つに従う構造を有する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
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