CN101247819A - 治疗焦虑症和鉴定抗焦虑剂的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了治疗神经精神病症如焦虑症的方法。所述方法涉及通过利用血管紧张肽IV受体的拮抗剂调节血管紧张肽IV受体的表达或者调节血管紧张肽IV受体的生物活性。还公开了鉴定有效减轻受试者中焦虑症的血管紧张肽IV受体拮抗剂的方法。

Description

治疗焦虑症和鉴定抗焦虑剂的方法
相关申请的交互参考
本申请要求2005年8月23日提交的美国临时申请号60/710,385的优先权，将该临时申请完整引入本文作为参考。
发明领域
本发明一般涉及神经药理学领域。本发明描述了用于治疗神经精神病症如焦虑症的方法。还描述了鉴定减轻受试者中焦虑的化合物的方法。
发明背景
在本说明书全文引用多种出版物，包括专利、公布的申请、技术文章和学术文章。将这些引用的出版物的每个都完整引入本文作为参考。
血管紧张肽IV受体(AT4R)也称作胰岛素调节的膜氨肽酶(IRAP)，首先在1992年被描述为六肽血管紧张肽IV(AT4)的高亲和性结合位点(Swanson，GN等人Regul.Pept.(1992)40：409-19)。AT4R是锌金属肽酶的M1家族成员并且是II型跨膜蛋白，即它的活性位点是细胞外的(Keller，SR等人J.Biol.Chem.(1995)270：23612-18)。定位研究已经阐明AT4R在肾、心脏和肾上腺组织中被发现(Baker，KM等人Am.J.Physiol.(1990)259：H324-32；Slinker，BK等人Cardiovasc.Res.(1999)42：660-9；Hamilton，TA等人Peptides(2001)22：935-44；和Abrahamsen，CT等人J.Pharmacol.Exp.Ther.(2002)301：21-8)。在中枢神经系统中，蛋白质印迹和原位杂交实验表明在海马和内鼻、额叶前部和岛叶皮质中发现高水平的AT4R。黑质、下丘脑和边缘区如杏仁核中的水平也是适当高的(Thomas，WG等人Int.J.Biochem.Cell Biol.(2003)35：774-9)。AT4R在脑中的差别分布已经促使进行大量研究来鉴定这些受体在中枢神经系统功能中的生物学作用。
一些文献报告指出AT4R影响认知功能的多个方面。例如，一种AT4R配体AT4的中枢灌注促进啮齿动物被动回避模型中的记忆保留和恢复(Wright，JW等人Brain Res.Bull.(1993)32：497-502；和Braszko，JJ等人Pharmacol.Res.(1998)38：461-8)。类似地，发现长期AT4灌注提高Morris水迷宫(Morris Water Maze)中的表现(Pederson，ES等人Regul，Pept.(1998)74：97-103)。此外，发现AT4的合成类似物逆转莨菪胺或者双向穿通通路损伤诱导的记忆缺失(Perderson，ES(1998)；和Wright，JW等人J.Neurosci.(1999)19：3952-61)。与AT4R的认知增强作用一致的是，已经报道AT4R增强海马片层中的长程增强效应和钾引起的乙酰胆碱释放(Wayner，MJ等人Peptides(2001)22：1403-14)。
认为AT4影响认知过程的机制是通过关闭AT4R的组成型活性肽酶活性。AT4R活性的抑制导致参与认知过程的几种神经肽酶的升高的突触水平(Kovacs，GL和De Wied，D Pharmacol.Rev.(1994)46：269-291)。这些神经肽包括催产素、生长抑素、胆囊收缩素8、加压素和物质P(Herbst，J.J.等人Am.J.Physiol.(1997)272，E600-E606；和Matsumoto等人Eur.J.Biochem.(2000)267：46-52)。尽管肽酶活性的确切的认知序列还有待阐明，但是阻断AT4R肽酶活性似乎不影响其他神经肽如GnRH、神经肽Y、TRH、黑皮质素、α-MSH、甘丙肽或降钙素。此外，AT4似乎不通过结合AT4R的活性位点而抑制该酶。相反，AT4结合近膜区而诱导AT4R的构象改变。AT4与AT4R结合的结果是AT4R的肽酶活性的抑制(Albiston，AL等人Trends in Endo.Metabol.(2003)43：72-77)。
一些报告提出，由于AT4R抑制而升高的一种神经肽——催产素可以发挥抗焦虑效果。催产素敲除小鼠当在高架十字迷宫实验(EPM)中测试焦虑时相对于野生型小鼠显示出较高水平的焦虑相关的行为(Amico，JA等人J.Neuroendocrinal.(2004)16：319-24)。此外，对催产素敲除小鼠中枢施用合成催产素减轻了焦虑(如通过EPM测量)，在敲除小鼠模型中施用催产素受体拮抗剂以及催产素消除了催产素的抗焦虑效果(Mantella，RC(2003))。类似地，发现对大鼠中枢施用催产素减弱脑中压力诱导的神经内分泌和分子应答(Windle，RJ等人J，Neurosci.(2004)24：2974-82)。
相比，当AT4R被抑制时也升高的加压素是产生焦虑的神经肽(Bhattacharya，SK等人Biogenic Amines(1998)14：367-86)。考虑到AT4R切割加压素比它切割催产素更有效(Lew，RA等人J.Neurochem.(2003)86：344-50)，似乎中枢神经系统中AT4R的抑制将更可能发挥产生焦虑效果，而不是抗焦虑效果。然而，迄今报道的研究还没有解决AT4R活性和神经精神病状况如焦虑症之间的关系。
尽管多数个体在他们的生活中，特别是在新的或重要事件时经历焦虑的感觉，但是焦虑症的特征是担心和神经过敏的慢性和不间断的发作，其通常干扰个体的日常生活和经历。焦虑症是美国最常见的精神疾病，影响1900万，或者大约13％的18到54岁之间的成年人(来于：美国国家精神健康研究所(U.S.National Institute of Mental Health))。焦虑症分成几类：广泛性焦虑症，特征是对每天的日常生活的不断夸大的担心，和身体症状，如震颤、疲乏、失眠、头痛和恶心；惊恐症，特征是强烈惊悸的反复发作，和身体症状，如剧烈心跳、胸痛、轻度头痛、震颤、出汗，和热潮红或恶寒；恐怖症，特征是对特定目标或环境的失去能力的和无理性的恐惧，其可以导致个体不必要地避开此类目标或环境；强迫症，特征是反复的不必要的想法或强迫行为，其似乎不可能停止或控制；和创伤后精神紧张性障碍，其通常在作证或者参加恐怖事件如强奸、虐待、战争、灾难或者严重事故后出现，和身体症状，如失眠、梦魇、幻觉重现、抑郁和易怒。
通常用认知行为疗法和多种药疗法治疗焦虑症。然而，考虑到当前用于治疗焦虑症的许多药物的副作用，希望得到具有较低或者较少严重副作用的更新的药物和治疗方法。此外，还希望得到可以与现有的疗法协同作用以增强它们的功效或者可以靶定所述焦虑症的潜在分子的、生物化学的或者生理基础的药物。
发明概述
本发明描述了用于治疗神经精神病症如焦虑症的方法和鉴定用于治疗神经精神病症如焦虑症的化合物的方法。
本发明的一些方面描述了通过对需要此类治疗的受试者施用有效减小AT4R的生物学活性量的组合物来治疗受试者中神经精神病症的方法，所述组合物包含可药用载体和血管紧张肽IV受体激动剂。在详述的实施方案中，所述神经精神病症是焦虑症。在另一详述的实施方案中，所述拮抗剂是血管紧张肽IV、divalinal-血管紧张肽IV、LVV-血吗啡样肽7、Nle-血管紧张肽IV、norleucinal-血管紧张肽IV，或者其任一衍生物。
本发明还描述了治疗需要此类治疗的受试者中神经精神病症的方法，其通过调节该受试者中AT4R的表达而完成。在详述的实施方案中，所述神经神经病症是焦虑症。在另一详述的实施方案中，降低AT4R的表达。在一些实施方案中，降低细胞膜上AT4R的表达。在一些方面，通过寡核苷酸调节AT4R的表达，所述寡核苷酸与编码AT4R的核酸是反义的。在一些实施方案中，通过除去或者改变膜转运肽信号而防止AT4R定位在细胞表面或者通过将表达的AT4R靶向于蛋白酶体降解而降低AT4R的表达。
本发明还提供了治疗需要此类治疗的受试者中神经精神病症的方法，其包括用抗AT4R的抗体阻断AT4R的活性位点使得其他分子如AT4R底物不能接近AT4R的活性位点。在一些实施方案中，神经精神病症是焦虑症。
本发明的另一方面描述了鉴定AT4R拮抗剂的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及将受试化合物与AT4R接触并测定在所述受试化合物存在下AT4R的生物活性相对于不存在该受试化合物时AT4R生物活性的降低。在一些实施方案中，所述方法将利用纯化的AT4R。在其他实施方案中，所述方法将用包含AT4R的细胞膜进行。在其他实施方案中，该方法将用表达AT4R的全细胞进行。也设想通过本发明方法鉴定的化合物在本发明的范围内，以及药物组合物，其包含与可药用载体混合的通过本发明方法鉴定的化合物。
还提供了鉴定减轻受试者中焦虑症的化合物的方法，其包括对该受试者施用受试化合物并测定该受试者中焦虑症水平相对于不存在该受试化合物时受试者中焦虑症水平的降低。可以使用模型确定受试者中的焦虑症，所述模型为诸如四平板模型、高架0字迷宫(elevated zero maze)、高架十字迷宫、光暗转变测试、Geller型抗冲突测试(geller type anticonfilicttest)、Vogel型抗冲突测试、孔板测试(hole-board test)、Morris水迷宫测试、时间表诱导的烦渴模型、压力诱导的过高热模型、恐惧加强的惊恐模型、母亲分离测试(maternal separation test)、游泳-绝望测试或者微量透析。本发明的范围内还预期通过本发明方法鉴定的化合物，以及药物组合物，其包含与可药用载体混合的通过本发明鉴定的化合物。
本发明描述了鉴定减轻受试者中焦虑症的方法，其包括将受试化合物与AT4R接触并测定存在该受试化合物时AT4R的生物活性相对于不存在该受试化合物时AT4R的生物活性的降低，然后对该受试者施用受试化合物，并测定受试者中焦虑症水平相对于不存在该受试化合物时该受试者中焦虑症水平的降低。本发明还设想通过本发明方法鉴定的化合物，以及药物组合物，其包含与可药用载体混合的通过本发明鉴定的化合物。
附图简述
图1.条形图，其显示了在焦虑症的小鼠4平板模型中，AT4对AT4R阻断的抗焦虑样效果。急性AT4施用在小鼠中以剂量依赖性方式产生抗焦虑样效果。对小鼠施用全身皮下注射载体或者1、3和10mg/kg体重的AT4(X轴)，并在焦虑症的小鼠4平板模型中评估，测量被惩罚的穿越次数(Y轴)(＊与载体相比P＜0.05)。
图2.条形图，其显示了催产素受体拮抗剂对AT4施用的抗焦虑样效果的逆转。对小鼠施用载体、3mg/kg AT4、10mg/kg WAY-162720(催产素受体拮抗剂)，或者3mg/kg AT4和10mg/kg WAY-162720(X轴)，并用焦虑症的小鼠4平板模型评估，测量被惩罚的穿越次数(Y轴)(＊与载体相比P＜0.05)。
图3.条形图，显示了AT4受体拮抗剂对AT4施用的抗焦虑样效果的逆转。对小鼠施用载体、3mg/kg AT4、5nmol(icv)divalinal(AT4受体拮抗剂)，或者3mg/kg AT4和5nmol(icv)divalinal(X轴)，并用焦虑症的小鼠4平板模型评估，测量被惩罚的穿越次数(Y轴)(＊与载体相比P＜0.05)。
阐明性实施方案详述
如本文所述，发明人已经阐明AT4R的抑制在焦虑症的广泛使用的啮齿动物模型中产生抗焦虑效果，所述模型预测灵长类动物和人类中的效果。通过阻断AT4R活性观察到的抗焦虑效果与施用抗焦虑药物地西泮观察到的效果类似。此外，发明人已经观察到抗焦虑效果通过神经肽催产素介导，是因为如果对动物共同施用催产素拮抗剂，那么这些效果可以被逆转。
以前的体外研究表明AT4R的抑制抑制了催产素和加压素的切割(Herbst(1997)和Matsumoto(2000))。认为催产素是抗焦虑的，但是加压素是产生焦虑的(Bhattacharya，SK等人Biogenic Amines(1998)14：367-86)。因为AT4R切割加压素比它切割催产素更有效(Lew，RA等人J.Neurochem.(2003)86：344-50)，所以在本发明之前已经预期AT4R蛋白酶活性的抑制将导致加压素的升高的突触水平，从而诱导焦虑产生效果，或者至少抵消催产素水平升高可以引起的任何潜在的抗焦虑效果。本发明人观察到的效果与这些期望相反。
发明人发现AT4R的抑制发挥抗焦虑效果，这使得可以根据本发明实施一些方法。这些包括治疗个体焦虑症的方法，以及鉴定通过AT4R途径起作用的抗焦虑化合物，如下文更详细描述。
定义
在说明书和权利要求书全文中使用了涉及本发明的方法和其他方面的多个术语。除非另外指出，这些术语以它们在本领域中的普通含义给出。其他特别定义的术语将以与本文提供的定义相一致的方式构造。
术语“治疗”指在病理或状况的减轻或改善中的任何成功标志，包括任何客观或主观参数，如症状的减轻、减弱或减少；受试者对病理或状况的增加的耐受性；和受试者的改善的身体或者精神状况。病理或状况的减轻或改善中成功的标志可以基于任何客观或主观参数；包括体检、神经学检查，和/或心理学或精神病学评估的结果。
术语“减轻焦虑”或“焦虑的减轻”指任何可测量的减轻、减弱或改善，包括焦虑的症状消除或其潜在心理学、分子、生物化学、细胞或生理学基础的消除。
“有效量”指如本文所述的有效实现特定生物学结果的化合物、物质或组合物的量。此类结果可以包括，但不限于，治疗受试者中神经精神病症，如焦虑症。
“体内”指在活的生物内。
“体外”指在人工环境中。
“焦虑症”指一种情绪状态，其包括对恐惧的心理学的、分子的、生物化学的、细胞的或者生理学应答或者害怕虚幻的或者想像的危险。焦虑症包括，但不限于广泛性焦虑症、惊恐焦虑症、强迫症、社交恐怖症、行为焦虑症、创伤后精神紧张性障碍、急性应激性反应、适应障碍、疑病障碍、分离焦虑障碍、广场恐怖症和特异恐怖症。可以用本发明的方法治疗的特定焦虑相关的恐怖症是在临床实践中通常经历的那些，包括但不限于，恐惧动物、昆虫、风暴、开车、飞行、恐高或者过桥、封闭或者狭窄空间、水、血或者受伤，以及极度恐惧接种或者其他侵入性医学或者牙科操作。
“抗焦虑的”指任何减轻焦虑的趋势。
“产生焦虑的”指任何诱导焦虑的趋势。
“神经肽”指在来自外周或中枢神经系统的组织中发现的由至少两个氨基酸组成的任一分子。
“突触”指神经元之间功能并列的部位，在此部位脉冲从一个神经元传递到另一神经元。
“可药用的”指从药理学/毒理学观点患者可接受的和从物理/化学观点在组合物、制剂、稳定性、患者接受性和生物利用度方面是制造药物化学家可接受的那些性质和/或物质。“可药用载体”指不干扰活性成分的生物学活性的效率并且对于其所施用的宿主无毒的介质。
术语“AT4R拮抗剂”以最广义使用，并且包括部分或者完全阻断、抑制、减小或者中和血管紧张肽IV受体的生物学活性的分子。
“生物学活性”指分子的任何功能或者作用或者在体外或体内产生效果的能力。关于AT4R，此类活性包括蛋白酶/肽酶活性和其所有下游效果，包括但不限于，抗焦虑或者产生焦虑的效果、信号传递、葡萄糖转运、记忆增强、健忘症的逆转，等等。
如本文所用的，“受试化合物”指任何纯化的分子、基本上纯化的分子、为化合物混合物的一种或多种组分的分子，或者化合物与任何其他物质的混合物，其可以使用本发明的方法分析。受试化合物可以是有机或无机化学品或者生物分子，和其所有片段、类似物、同系物、缀合物和衍生物。生物分子包括蛋白质、多肽、核酸、脂类、多糖和其所有片段、类似物、同系物、缀合物和衍生物。受试化合物可以是天然或者合成来源的，并且可以从它们的天然存在的来源分离或纯化，或者可以从头合成。受试化合物可以按照结构或组成定义，或者可以是不确定的。化合物可以是未知结构的分离产物、几种已知产物的混合物，或者包含一种或多种化合物的不确定的组合物。不确定的组合物的实例包括细胞和组织提取物、生长培养基，其中已经培养了原核细胞、真核细胞和古细菌细胞、发酵液、蛋白质表达文库等等。
如本文使用的，“测量”或“测定”指任何定性或定量测定。
“稳定细胞”或“稳定细胞系”指任何细胞，其中可以表达AT4R的任何亚单位或其组合，包括完整AT4R，从而可以鉴定和测试AT4R的拮抗剂，并可以检查AT4R在神经精神病症如焦虑症中的作用。
如本文所用的“抗体”包括多克隆和单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体，以及抗体片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv)，包括Fab或其他免疫球蛋白表达文库的产物。关于抗体，术语“免疫学特异的”或“特异的”指抗体，其结合目的蛋白的一个或多个表位，但是不实质上识别和结合含有抗原性生物分子的混合群体的样品中的其他分子。用于测定抗体的结合特异性的筛选测定法是本领域公知的和常规实践的。关于这种测定法的详细讨论，见Harlow等人(Eds.)，ANTIBODIES ALABORATORY MANUAL；Cold Spring Harbor Laboratory；ColdSpring Harbor，NY(1988)，第6章。
治疗方法
本发明的一方面描述了治疗需要此类治疗的受试者中的神经精神病症的方法。在一些实施方案中，该方法涉及对受试者施用有效降低血管紧张肽IV受体的生物学活性的量的组合物，其包含可药用载体和血管紧张肽IV受体拮抗剂。在一个优选实施方案中，所述神经精神病症是焦虑症。
AT4R拮抗剂可以通过抑制AT4R的活性位点或者通过诱导AT4R的构象改变而调节AT4R的活性。所述拮抗剂可以是任何有机或无机化学品、或生物分子或者其任何片段、类似物、同系物、缀合物或衍生物。AT4R拮抗剂的优选实例包括，但不限于，血管紧张肽IV(Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)(SEQ ID NO：1)、Divalinal-血管紧张肽IV、NIe-血管紧张肽IV、Norleucinal血管紧张肽IV、LVV-血吗啡样肽-7(Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe)(SEQ ID NO：2)、LVV-血吗啡样肽-7的肽类似物，包括Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg(SEQID  NO：3)、Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln  (SEQ ID NO：4)、Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr(SEQ ID NO：5)、Val-Val-Tyr-Pro-Trp(SEQ IDNO：6)、Val-Val-Tyr-Pro，Val-Val-Tyr(SEQ ID NO：7)、Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe(SEQ ID NO：8)、Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe(SEQ ID NO：9)、Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe(SEQ ID NO：10)、Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg(SEQ ID NO：11)、Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln(SEQ ID NO：12)、Val-Tyr-Pro-Trp-Thr(SEQID NO：13)、Val-Tyr-Pro-Trp(SEQ ID NO：14)、Val-Tyr-Pro，Leu-Val-Val-Ala-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe(SEQ ID NO：15)、Leu-Val-Val-Tyr-Ala-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe(SEQ ID NO：16)、Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Ala-Thr-Gln-Arg-Phe(SEQ ID NO：17)、Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Ala-Gln-Arg-Phe(SEQ ID NO：18)、Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln(SEQ ID NO：19)、Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr(SEQ ID NO：20)、Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp(SEQ ID NO：21)、Leu-Val-Val-Tyr-Pro(SEQ ID NO：22)或Leu-Val-Val-Tyr(SEQ ID NO：23)(Lee，J等人J.Pharmacol.Exp.Therapeutics(2003)305：205-11；和Lew，RA..(2003))。AT4R的抗体也可以用作拮抗剂。此类抗体可以是单克隆或多克隆的，或者可以为抗血清的形式。
受试者可以是任何动物，并且优选为哺乳动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猴、奶牛、马、猪、等等。最优选地，所述哺乳动物是人。
优选的拮抗剂是这样的拮抗剂，其在特定浓度的拮抗剂下将AT4R的肽酶活性减小至少约5％、更优选至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或AT4R的肽酶活性减小大于95％。在一个优选实施方案中，AT4R的肽酶活性的减小调节突触中抗焦虑或者产生焦虑的神经肽的浓度。在详述的实施方案中，受试者中抗焦虑神经肽的突触浓度升高。在另一详述的实施方案中，受试者中产生焦虑的神经肽的突触浓度降低。在更优选的实施方案中，受试者中抗焦虑神经肽的突触浓度升高并且产生焦虑的神经肽的突触浓度降低。抗焦虑神经肽的非限制性实例包括催产素、甘丙肽和神经肽Y。产生焦虑的神经肽的非限制性实例包括加压素、生长抑素、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)，和物质P。
降低AT4R的肽酶活性所需的拮抗剂的浓度可以随着受试者的物种、品种、大小、高度、体重、年龄、总体健康、使用的拮抗剂类型，或者神经精神病症的严重性而变。测定具体情况所需的拮抗剂的适当浓度在本领域技术之内。在本发明方法中，组合物包含约0.001％到约90％组合物干重，或者约1pM到约1M范围内的拮抗剂浓度。剂量范围可以例如从约1Pg/kg受试者体重到约1g/kg受试者体重而变。在一些实施方案中使用约1μg/kg受试者体重到约100mg/kg受试者体重的日剂量范围，而在其他实施方案中使用至少约0.01mg/kg的日剂量范围。治疗可以以较小剂量启动，其小于拮抗剂的最佳剂量，接着在治疗过程中增加剂量，直到在所述情况下达到最佳效果。如果需要，可以将总日剂量分份并且在一天中按份施用。
可以根据本领域中用于制备给定剂型的任何合适的方法以多种剂型制备组合物。可药用载体可以是固体或液体。固体形式制剂的非限制性实例包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂、扁囊剂、栓剂、可分散的粒剂，等等。固体载体可以包括一种或多种物质，其也可以作为稀释剂、调味剂、缓冲剂、黏合剂、防腐剂、片剂崩解剂，或者包衣材料。合适的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂，等等。液体形式制剂的非限制性实例包括溶液剂、混悬剂，和乳剂，例如，水、醇、水丙二醇溶液，等等。
组合物的施用可以通过灌注、注射(静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内、腹膜内，等等)、鼻内、直肠、经口、或者经皮途径。优选地，经口施用组合物。
为了有效治疗焦虑症，本领域技术人员可以推荐对于所治疗的受试者足够的剂量方案和剂量。优选只要需要，给药可以每天进行1到4次。如果用持续递送载体配制组合物，那么给药频率可以较低。剂量方案还可以取决于活性药物浓度而变，活性药物浓度可以取决于受试者的需要。
本发明的另一方面描述了通过调节受试者中AT4R的表达而治疗需要此类治疗的受试者中神经精神病症的方法。在一个优选实施方案中，神经精神病症是焦虑症。在一些实施方案中，在分子水平上，例如通过减小AT4R蛋白质的表达调节AT4R的表达。
通过利用反义核酸或者RNA干扰(RNAi)可以在分子水平上特异抑制AT4R的表达。RNAi的综述见Marx，J.(2000)Science，288：1370-1372。简言之，使用反义RNA或DNA对基因抑制的常规方法通过结合目的基因的反向序列从而结合干扰随后的细胞过程并阻断对应蛋白质的合成而发生作用。用于控制或修饰基因表达的示例性方法在WO 99/49029、WO 99/53050和WO 01/75164中提供，将其公开为了所有目的在本文中引入作为参考。在这些方法中，通过序列特异性RNA降解过程引起翻译后基因沉默，所述过程导致序列相关的基因转录物的快速降解。研究已经表明双链RNA可以作为序列特异性基因沉默的介体(见例如，Montgomery和Fire，Trends in Genetics，14：255-258，1998)。产生具有自身互补区的转录物的基因构建体在基因沉默中尤其有效。
已经阐明一种或多种核糖核酸酶特异结合并切割双链RNA成为短的片段。核酸酶保持与这些片段结合，其又特异结合互补mRNA，即特异结合目的基因的转录的mRNA链。该基因的mRNA也可以被核糖核酸酶降解为短片段，从而避免了对基因的翻译和表达的需要。此外，RNA聚合酶可以用于方便短片段的许多拷贝的合成，其以指数方式增加该系统的效率。基因沉默可以延伸到它所启动的细胞之外，从而该抑制可以导致生物中其他细胞和系统中的生物化学、分子的、生理学的或者表型改变。
从而，AT4R的可利用的遗传信息，如核苷酸序列等可以用于产生基因沉默构建体和/或基因特异性自身互补的双链RNA序列，其可以通过常规的本领域已知的方法递送。基因构建体可以用于表达自身互补的RNA序列。备选地，将细胞与基因特异性双链RNA分子接触，从而RNA分子被内化到细胞质中以发挥基因沉默作用。双链RNA必须与被靶定的基因具有足够同源性以介导RNAi而不影响非靶基因的表达。双链DNA长为至少20个核苷酸，并且优选长为21-23个核苷酸。优选地，双链RNA特异对应于本发明的多核苷酸。使用长为21-23个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)分子抑制哺乳动物细胞中的基因表达在WO 01/75164中描述。用于设计最佳的抑制性siRNA的工具包括可以从DNAengine Inc.(Seattle，Wash.)得到的工具。见WO 01/68836。也见：Bernstein等人，RNA(2001)7：1509-1521；Bernstein等人，Nature(2001)409：363-366；Billy等人，Proc.Nat′l Acad.Sci USA(2001)98：14428-33；Caplan等人，Proc.Nat’lAcad.Sci USA(2001)98：9742-7；Carthew等人，Curr.Opin.Cell Biol(2001)13：244-8；Elbashir等人，Nature(2001)411：494-498；Hammond等人，Science(2001)293：1146-50；Hammond等人，Nat.Ref.Genet.(2001)2：110-119；Hammond等人，Nature(2000)404：293-296；McCaffrrey等人，Nature(2002)：418-38-39；和McCaffrey等人，Mol Ther.(2002)5：676-684；Paddison等人，Genes Dev.(2002)16：948-958；Paddison等人，Proc.Nat’lAcad.Sci USA(2002)99：1443-48；Sui等人，Proc.Nat’l Acad.Sci USA(2002)99：5515-20。重要的美国专利包括美国专利号5,985,847和5,922,687。还重要的是WO/11092。额外的重要参考文献包括：Acsadi等人，New Biol.(1991年1月)3：71-81；Chang等人，J.Virol.(2001)75：3469-3473；Hickman等人，Hum.Gen.Titer.(1994)5：1477-1483；Liu等人，Gene Ther.(1999)6：1258-1266；Wolff等人，Science(1990)247：1465-1468；和Zhang等人，Hum.Gene Ther.(1999)10：1735-1737：和Zhang等人，Gene Ther.(1999)7：1344-1349。将这些公开为了所有目的完整引入本文作为参考。
在基因疗法应用中，将基因导入细胞中以实现体内合成治疗有效的基因产物，例如，用于缺陷基因的替代。“基因疗法”包括常规的基因疗法，其中通过单次治疗实现持久作用，和施用基因治疗剂，其涉及一次或者反复施用治疗有效的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可以用作在体内阻断某些基因表达的治疗剂。已经表明可以将短的反义寡核苷酸输入细胞中，尽管由于细胞膜对它们的有限的摄入导致低的细胞内浓度，但是它们在所述细胞中作为抑制剂(Zamecnik等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，83：4143-4146(1986))。可以修饰寡核苷酸以增强它们的摄入，例如，通过用不带电的基团取代它们的带负电荷的磷脂基团。
有多种技术可以用于向活细胞中导入核酸。这些技术取决于该核酸被转移到体外、先体外后体内培养的细胞中还是体内转移到预期宿主的细胞中而不同。适于将核酸体外转移到细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、EDAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀方法，等等。当前优选的体内基因转移技术包括用病毒载体转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等人，1993，Trends in Biotechnology，11：205-210)。病毒载体介导的技术可以在构建用于递送目的基因的构建体中使用多种病毒。使用的病毒载体的类型取决于许多因素，包括免疫原性和组织向性。用于基因疗法的病毒载体的一些非限制性实例包括逆转录病毒载体(见例如，美国专利6,312,682、6,235,522、5,672,510和5,952,225)、腺病毒(Ad)载体(见例如，美国专利6,482,616、5,846,945)和腺伴随病毒(AAV)载体(见，例如，美国专利6,566,119、6,392,858、6,468,524和WO 99/61601)。在一些情况下，希望为核酸来源提供靶定靶细胞的物质，如对细胞表面膜蛋白或者靶细胞特异的抗体，或者靶细胞上受体的配体，等等。当使用脂质体时，结合与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可以用于靶定和/或促进摄入，例如，对特定细胞类型向性的壳体蛋白质或者其片段、在周期中经历内化的蛋白质的抗体，和靶定细胞内定位和增强细胞内半寿期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术例如由Wu等人，J.Biol.Chem.，262：4429-4432(1987)；和Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，87：3410-3414(1990)描述。当前已知的基因标记和基因疗法方案的综述见Anderson等人，Science，256：808-813(1992)。
本发明的另一方面描述了通过调节AT4R的细胞表面定位而治疗需要这种治疗的受试者中神经精神病症的方法。在一个优选实施方案中，所述神经精神病症是焦虑症。在一些实施方案中，通过靶定表达的AT4R用于蛋白酶降解，调节AT4R的细胞表面定位。例如，可以用AT4R的泛蛋白化将表达的AT4R靶向蛋白酶体。在一些实施方案中，通过除去细胞表面易位信号肽调节AT4R的细胞表面定位。此类信号肽可以在转录前或翻译后被除去。
本发明的另一方面描述了通过阻断AT4R的活性位点在需要此类治疗的受试者中治疗神经精神病症的方法。“阻断AT4R的活性位点”指用化学品或者生物分子阻塞AT4R的活性位点从而AT4R的底物不能接近AT4R的活性位点从而不被AT4R切割。在一个优选实施方案中，所述神经精神病症是焦虑症。在一些实施方案中，通过AT4R的抗体阻断AT4R的活性位点。
筛选化合物的方法
本发明的另一方面描述了鉴定AT4R拮抗剂的方法，其包括将受试化合物与AT4R接触并测定在受试化合物存在下AT4R的生物活性相对于不存在该受试化合物时AT4R的生物活性的减小。
对于筛选测定法，可以从本领域合适的任何来源得到AT4R。AT4R可以是被纯化的或者结合到细胞膜或膜碎片。经纯化的AT4R或者其亚基可以从头合成，或者从天然表达AT4R的任何哺乳动物细胞如肾脏、心脏、肾上腺或者脑组织得到。用于纯化膜结合的蛋白质的方法在本领域中是成熟的，并且也可以利用商业试剂盒，如ProteoPrep提取试剂盒(ProteoPrepExtraction Kit)(Sigma，St.Louis，MO)和Qprotome细胞区域试剂盒(Qprotome Cell Compartment Kit)(Qiagen，Valencia，CA)。经纯化的AT4R还可以从表达AT4R的稳定细胞或细胞系，如经转染的HEK 293T细胞的细胞膜得到(Lew，RA(2003))。经纯化的AT4R还可以从重组表达系统，如细菌、酵母、昆虫细胞系统等等得到。可以用仍然结合细胞膜的AT4R进行筛选测定法。重组克隆和蛋白质表达和纯化的技术是本领域成熟的。
从表达AT4R或者其亚基的任何细胞可以得到膜结合的AT4R或者其亚基。细胞可以天然表达AT4R，如哺乳动物肾细胞、心细胞、肾上腺细胞，或者脑细胞。细胞可以是经诱导表达AT4R的稳定细胞或稳定细胞系，如经转化的HEK 293T细胞(Lew，RA(2003))。可通过本领域中用于克隆和重组基因表达的任何方法产生稳定的细胞。可以根据本领域任何合适的方法进行含有AT4R的细胞膜或膜碎片的分离，所述方法包括Mustafa等人(Mustafa，T等人J.Neurochem.(2001)76：1679-87)所述的膜提取方法。在备选方案中，可以使用其膜含有AT4R的全细胞。
在一个实施方案中，通过本领域已知的任何定性或定量技术测定受试化合物与AT4R的相互作用。受试化合物是否与AT4R相互作用的测定可以使用结合测定法进行，其中标记受试化合物。标记可以是本领域合适的任何标记，如放射性同位素，包括3H、125I、35S、33P、32P、177Lu、90y等等；荧光团，包括FITC、藻红蛋白、罗丹明、Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5、别藻蓝蛋白、AlexaFluor
Figure A20068003072100191
染料(Invitrogen，Carlsbad，CA)、荧光蛋白，等等；或者酶标记，包括磷酸酶、萤光素酶、脲酶、过氧化物酶、氧化酶、β-半乳糖苷酶，等等。结合测定法可以测定平衡常数、解离常数、结合常数。结合测定可以通过本领域任何合适的方法进行，包括但不限于，显微术、平衡透析、超滤、光谱分析、层析法和量热法，如等温滴定量热法。也可以用竞争测定法测定受试化合物与AT4R的相互作用，如Mustafa等人(Mustafa，T.(2001))，Lee等人(Lee，J(2003))，和Lew等人(Lew，RA(2003))所述。
可以通过本领域任何可接受的方法测定受试化合物对AT4R的生物学活性的影响。可以在多种浓度下评估受试化合物。可以根据AT4R的底物Leu-β-NA切割产生的荧光相对于不存在受试化合物时或者AT4R与阴性对照化合物接触时观察到的荧光水平的降低，来测量AT4R的生物学活性的降低(Lew，RA(2003))。备选地，可以按照AT4R的任何其他底物的切割的降低来测量AT4R的生物学活性的降低。可以通过本领域的任何合适的方法进行此类测量，如层析法/HPLC、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或者质谱法(Zhu，L，等人J.Biol，Chem.(2003)278：22418-23)。通过测量已知为AT4R底物的神经肽的浓度的调节，也可以测定AT4R的生物活性的调节。可以测量突触中此类神经肽浓度的调节。
本发明的另一方面描述了鉴定减轻受试者焦虑的化合物的方法，其包括对受试者施用受试化合物并测定受试者中焦虑水平相对于不存在该受试化合物时受试者中焦虑水平的降低。
可以用本领域中任何合适的方法测量焦虑的基线水平和对受试者施用受试化合物引起的焦虑的任何减轻。此类方法可以对受试者使用或不使用惩罚。本领域中用于测量焦虑的测定法的非限制性实例包括四平板模型、高架0字迷宫、高架十字迷宫、光暗转变测试、Geller型抗冲突测试、Vogel型抗冲突测试、孔板测试、Morris水迷宫测试、时间表诱导的烦渴模型、压力诱导的过高热模型、恐惧加强的惊恐模型、母亲分离测试、游泳-绝望测试、微量透析，等等。
本发明的额外方面描述了通过体外和体内筛选测定法的组合鉴定减轻受试者中焦虑的化合物的方法。在一个实施方案中，首先在体外筛选受试化合物以测定它的生理、细胞、生物化学或分子效应，然后进一步在体内筛选以确定该化合物是否可以减轻焦虑。在另一实施方案中，首先在体内筛选受试化合物以确定该化合物是否可以减轻焦虑，然后进一步在体外筛选确定它的生理、细胞、生物化学或分子效应。
在详述的实施方案中，所述体外筛选测定法包括鉴定AT4R的拮抗剂，其包括将受试化合物与AT4R接触并测定在受试化合物存在下AT4R的生物活性相对于不存在该受试化合物时AT4R的生物活性的降低。可以根据本文描述的细节实施该实施方案。在进一步详述的实施方案中，体内筛选测定法包括鉴定减轻受试者中焦虑的化合物，其包括对受试者施用受试化合物并测定受试者中焦虑的水平相对于不存在该受试化合物时受试者中焦虑水平的降低。可以根据本文描述的细节实施该实施方案。
预期通过前述发明筛选方法的任一种鉴定的化合物在本发明的范围内。此类化合物优选是抗焦虑的。可以将此类化合物配制为药物组合物，通过将此类化合物以有效减轻它所施用的受试者中焦虑的量与如本文所述的可药用载体混合进行所述配制。可以根据本发明的方法将此类药物组合物施用于受试者以便治疗受试者中的焦虑症。
提供下面的实施例以更详细阐明本发明。这些实施例意在阐明而不是限制本发明。
实施例1
AT4受体阻断对小鼠4平板模型中焦虑症行为的影响
用焦虑症的小鼠4平板模型研究了AT4对AT4受体阻断的影响。
在该4平板模型中使用重为18-24g的雄性Swiss Webster小鼠。将小鼠以15只一组喂养在AAALAC-认可的设施(Wyeth Research，Princeton，NJ)中，可无限制地获得食物和水。将动物保持在12小时光/暗周期(0600的灯光)，所有研究都在光照期进行。在实验当天，研究开始前30分钟用AT4(0、1、3和10mg/kg)注射小鼠。最初，将小鼠单独放置于有机玻璃笼子(18×25×16cm)中，底部由四个长方形金属平板(8×11cm)组成，它们连线到休克产生器(Med Associates)。在每次实验中，将小鼠放置在室内并给予18秒的适应期，接着是1分钟的测试期。适应期后，当小鼠从一个平板穿越到另一平板时，递送3.0秒的电休克(0.8mA)。从一个平板穿越到下一个平板被称作“被惩罚的穿越”。通过计算机记录1分钟的测试期内被惩罚的穿越次数。每组的被惩罚的穿越的平均数表达为在对照动物中观察到的值的百分比。将数据进行总体单向方差分析法(ANOVA)，并使用最小二乘法通过对比进行事后比较。当与载体相比p＜0.05时发生处理的显著差异。
结果在图1中显示。如可以看到的，用3和10mg/kg AT4急性处理与仅用载体处理的动物相比显著(p＜0.05)增加了被惩罚的穿越次数。结果类似于在该模型中用已知的抗焦虑症药物如地西泮观察到的结果。
实施例2
通过催产素的拮抗剂逆转AT4的抗焦虑样作用
为了确定AT4受体阻断的抗焦虑样效果是否至少部分由催产素介导，在已知的催产素受体拮抗剂WAY-162720存在下重复实施例1中给出的步骤。
对于这些研究，使用与如上面实施例1中所述的相同的4平板程序。唯一的不同是用10mg/kg催产素受体拮抗剂WAY-162720注射动物。该注射与AT4(3mg/kg)以相同的时间给予，在将小鼠置于4平板笼子之前30分钟施用AT4。18秒的适应期后，当小鼠从一个平板穿越到另一平板时，递送3.0秒的电休克(0.8mA)。递送每次休克后接着是3秒的时间，并在1分钟的测试期内计算机记录被惩罚的穿越次数。每组的被惩罚的穿越的平均数表达为在对照动物中观察到的值的百分比。将数据进行总体单向方差分析法(ANOVA)，并使用最小二乘法通过对比进行事后比较。当与载体相比p＜0.05时发生处理的显著差异。
结果在图2中显示。如可以看到的，当单独测试时，用WAY-162720的急性处理对行为没有影响，并且与施用载体对照的动物相比，用AT4的急性处理增加了被惩罚的穿越次数。用WAY-162720和AT4的急性处理表明该催产素受体拮抗剂完全阻断了4平板模型中AT4的抗焦虑作用。
实施例3
AT4受体阻断对大鼠杏仁核中催产素水平的影响
在体外，AT4抑制AT4受体的肽酶活性，导致包括催产素的几种肽水平的升高。为了在体内证实该观察，将偶联免疫测定法技术的微量透析用于监测大鼠杏仁核中催产素的细胞外水平的基线和AT4诱导的改变。
关于微量透析方案，将重量为280到350g的雄性Sprague-Dawley大鼠分组喂养在AAALC认可的设施中并保持12小时光/暗周期。在光照期(0600h光照)进行所有程序。使用2-3％卤烷(Fluothane；Zeneca，Cheshire，UK)麻醉，用耳和门牙条(David Kopf，Tujunga，CA)将动物固定在立体定位架中。使用下面的坐标将微量透析引导插管(CMA/12；CMAMicrodialysis，Stockholm，瑞典)导向大鼠杏仁核：A/P-2.7mm M/L-4.6mm和D/V-7.2mm(Paxinos，G和Watson，C.The Rat Brain inStereotaxic coordinates，1986，Academic Press)。用两个不锈钢螺丝钉(Small Parts，Roanoke，VA)和牙科丙烯酸-乙烯(acrylic)(Plastics One，Roanoke，VA)将引导插管固定在头盖骨。手术后，将动物分别喂养在有机树脂笼子(45cm2)中约24小时并无限制地获得食物和水。手术后恢复24小时后，在实验前，用人工CSF(aCSF；125mM NaCl，3mM KCl，0.75mMMgSO4和1.2mM CaCl2，pH 7.4)以0.2ml/分钟的流速充满预先洗涤的微量透析探针(CMA/12；OD 0.5mm，膜长度2mm，20kD截断)。在程序当天，通过引导插管将微量透析探针插入到杏仁核中并以lμl/分钟的流速用aCSF充满。探针插入后，在测量任何神经化学物质之前允许3小时的稳定期。收集30分钟样品2小时以建立稳定的基线。将这些样品立即置于干冰上。接着，通过探针将AT4直接灌注到杏仁核中60分钟。一旦注射完成，就在灌注后收集样品3小时以评估AT4效应的时间过程。收集后，将所有样品在干冰上保存。通过催产素免疫测定法(批号DE1900；R&D Systems，Inc)根据生产商指定的条件定量来自透析样品的催产素水平。
1和10uM Nle-AT4的杏仁核内灌注(60分钟)导致催产素的杏仁核水平的依赖浓度的增加(分别高于基线83％和128％)。此外，Nle-AT4的全身注射(0.5mg/kg，皮下)与注射载体的动物相比导致催产素的杏仁核水平显著升高(5倍)，提示该肽容易进入中枢神经系统。
实施例4
AT4受体激动剂divalinal阻断血管紧张肽IV的抗焦虑性质
为了确定AT4受体是否介导AT4的抗焦虑样性质，在已知的AT4受体激动剂divalinal存在下重复实施例2中给出的步骤。
对于这些研究，使用与上面实施例1中所示相同的4平板步骤。唯一的不同是用5nmol的AT4受体激动剂divalinal脑室内(icv)注射动物。在被放置在4平板笼子中以适应之前，分别施用AT4(3mg/kg)和divalinal30和20分钟。18秒的适应期后，当小鼠从一个平板穿越到另一平板时，递送3.0秒的电休克(0.8mA)。在1分钟的测试期内计算机记录被惩罚的穿越次数。每组的被惩罚的穿越的平均数表达为在对照动物中观察到的值的百分比。将数据进行总体单向方差分析法(ANOVA)，并使用最小二乘法通过对比进行事后比较。当与载体相比p＜0.05时发生处理的显著差异。
结果在图3中显示。当单独测试时，用5nmol(icv)AT4受体拮抗剂divalinal的急性处理对于行为没有影响。然而，在4平板模型中，divalinal完全阻断了血管紧张肽IV的抗焦虑样作用。这些数据表明AT4受体部分介导血管紧张肽IV的抗焦虑样作用。
本发明不局限于上文所述和示例的实施方案，而是能够在所附权利要求范围内变通和修饰。
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<211>6
<212>PRT
<213>人
<400>1
Val Tyr Ile His Pro Phe
1               5
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>绵羊(Ovis sp.)
<400>2
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe
1               5                   10
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>绵羊
<400>3
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg
1               5
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>绵羊
<400>4
Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln
1               5
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>绵羊
<400>5
Val Val Tyr Pro Trp
1               5
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>绵羊
<400>6
Val Val Tyr Pro Trp
1               5
<210>7
<211>4
<212>PRT
<213>绵羊
<400>7
Val Val Tyr Pro
1
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>绵羊
<400>8
Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe
1               5
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>绵羊
<400>9
Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe
1           5
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>绵羊
<400>10
Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe
1               5
<210>11
<211>7
<212>PRT
<213>绵羊
<400>11
Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg
1               5
<210>12
<211>6
<212>PRT
<213>绵羊
<400>12
Val Tyr Pro Trp Thr Gln
1               5
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>绵羊
<400>13
Val Tyr Pro Trp Thr
1               5
<210>14
<211>4
<212>PRT
<213>绵羊
<400>14
Val Tyr Pro Trp
1
<210>15
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LVV-血吗啡样肽-7的肽类似物
<400>15
Leu Val Val Ala Pro Trp Thr Gln Arg Phe
1               5                   10
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LVV-样-7的肽类似物
<400>16
Leu Val Val Tyr Ala Trp Thr Gln Arg Phe
1               5                   10
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LVV-样-7的肽类似物
<400>17
Leu Val Val Tyr Pro Ala Thr Gln Arg Phe
1               5                   10
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>LVV-样-7的肽类似物
<400>18
Leu Val Val Tyr Pro Trp Ala Gln Arg Phe
1               5                   10
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>绵羊
<400>19
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln
1               5
<210>20
<211>7
<212>PRT
<213>绵羊
<400>20
Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr
1               5
<210>21
<211>6
<212>PRT
<213>绵羊
<400>21
Leu Val Val Tyr Pro Trp
1               5
<210>22
<211>5
<212>PRT
<213>绵羊
<400>22
Leu Val Val Tyr Pro
1               5
<210>23
<211>4
<212>PRT
<213>绵羊
<400>23
Leu Val Val Tyr
1

Claims (26)

1. 治疗需要此类治疗的受试者中神经精神病症的方法，其包括对该受试者施用有效降低AT4R的生物活性的量的包含可药用载体和血管紧张肽IV受体(AT4R)拮抗剂的组合物。
2. 权利要求1的方法，其中所述AT4R拮抗剂诱导AT4R的构象改变。
3. 权利要求1的方法，其中所述AT4R拮抗剂抑制AT4R的活性位点。
4. 权利要求1到3任一项的方法，其中所述AT4R拮抗剂是血管紧张肽IV、Divalinal-血管紧张肽IV、LVV-血吗啡样肽1、NIe-血管紧张肽IV或Norleucinal血管紧张肽IV。
5. 治疗需要此类治疗的受试者中神经精神病症的方法，其包括调节该受试者中AT4R的表达。
6. 权利要求5的方法，其中通过利用寡核苷酸分子降低AT4R的表达，所述寡核苷酸分子与编码AT4R的核酸是反义的。
7. 权利要求6的方法，其中所述与编码AT4R的核酸是反义的分子是siRNA。
8. 权利要求1到7任一项的方法，其中所述神经精神病症是焦虑症。
9. 治疗需要此类治疗的受试者中焦虑症的方法，其包括调节AT4R向细胞膜的定位。
10. 治疗需要此类治疗的受试者中焦虑症的方法，其包括调节受试者中抗焦虑或产生焦虑的神经肽的浓度。
11. 权利要求10的方法，其中抗焦虑神经肽的浓度增加。
12. 权利要求11的方法，其中所述抗焦虑神经肽是催产素。
13. 权利要求10的方法，其中产生焦虑的神经肽的浓度减小。
14. 权利要求13的方法，其中所述产生焦虑的神经肽是加压素。
15. 权利要求10到14任一项的方法，其中抗焦虑或者产生焦虑的神经肽的浓度是突触中的浓度。
16. 鉴定减轻受试者中焦虑症的化合物的方法，其包括对该受试者施用受试化合物并测定受试者中焦虑症水平相对于不存在该受试化合物时受试者中焦虑症水平的降低。
17. 鉴定减轻受试者中焦虑症的化合物的方法，其包括将受试化合物与AT4R接触并测定存在该受试化合物时AT4R的生物活性相对于不存在该受试化合物时AT4R的生物活性的降低，和对该受试者施用该受试化合物并测定受试者中焦虑症水平相对于不存在该受试化合物时受试者中焦虑症水平的降低。
18. 权利要求1到17任一项的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
19. 权利要求18的方法，其中所述哺乳动物是人。
20. 鉴定AT4R的拮抗剂的方法，其包括将受试化合物与AT4R接触并测定存在该受试化合物时AT4R的生物活性相对于不存在该受试化合物时AT4R的生物活性的降低。
21. 权利要求17或20的方法，其中所述AT4R结合到细胞膜或者细胞膜碎片。
22. 权利要求21的方法，其中所述细胞膜或者细胞膜碎片来自哺乳动物细胞。
23. 权利要求22的方法，其中所述哺乳动物细胞是肾细胞、心细胞、肾上腺细胞，或者脑细胞。
24. 权利要求22的方法，其中所述哺乳动物细胞是表达AT4R的稳定的细胞或者稳定的细胞系。
25. 通过权利要求16、17或20到24任一项的方法鉴定的化合物。
26. 包含权利要求25的化合物和可药用载体的药物组合物。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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