KR20150028761A - 섬유증 치료용 안지오텐신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특히 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드 및 그의 유사체 또는 유도체에 기초한, 섬유화 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폐 섬유증, 폐 고혈압, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식, 낭성 섬유증, 신장 섬유증, 간 섬유증, 전신 경화증, 수술 후 유착을 치료 또는 예방하기 위한, 상처 치유를 가속화시키기 위한, 및 반흔 형성을 감소시키거나 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

섬유증 치료용 안지오텐신 {ANGIOTENSINS FOR TREATMENT OF FIBROSIS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2011년 12월 16일 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/576,673, 및 2011년 12월 23일 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/579,936을 우선권 주장하며, 이들 가출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

섬유증은 과도한 섬유 조직, 예컨대 결합 조직 형성을 특징으로 한다. 섬유증은 급성 또는 만성 손상 또는 질환으로부터 유발될 수 있다. 섬유증은 대개 기관 기능을 심하게 손상시킬 수 있는 비가역적인 조직 손상을 유발한다. 다수의 섬유화 장애는 현 치료법에는 반응하지 않으며; 따라서, 섬유증을 예방할 수 있는 신규한 치료법이 요구된다.

낭성 섬유증은 리모델링, 폐 기능 손상을 유발하고, 결국에는 호흡 부전에 이르게 하는, 기도 폐쇄, 감염 및 염증의 만성적 순환을 특징으로 하는 섬유증의 하위유형이다. 기도에서 만성 염증 반응은 과도한 프로테아제 (예컨대, 호중구 엘라스타제, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9)의 방출을 유발하는, 케모카인 (예컨대, CXCL8)에 대한 반응으로서의 과다 호중구 침윤에 의해 매개된다. 폐 생검을 통해 염증 세포 침윤 및 세기관지 상피 세포 소실과 함께, 기도 리모델링을 나타내는 망상 기저막 두께 증가가 관찰된다. 4개의 다기관 시험으로부터 입수한 모인 데이터를 통해 CF 환자로부터 얻은 객담 호중구 및 호중구 엘라스타제의 농도와, 폐 질환 중증도 사이에는 유의한 상관 관계가 있는 것이 입증되었다. 상기 데이터는 CF 폐 질환의 병리생리상태에서 만성 기도 염증의 유의한 역할을 입증하고, 폐 기능을 보존하는 치료학적 개입의 중요성을 강조한다.

개요

본 발명은 특히 섬유증 및 각종 섬유화 질환, 장애 또는 병태를 개선된 방식으로 더욱 효율적으로 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 하기 실시예 섹션에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명은 부분적으로는 선형 및 시클릭 안지오텐신 펩티드 둘 다를 비롯한, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체를 사용하면, 그 결과로 콜라겐 침착을 비롯한 섬유화 증상, 염증 세포 침윤이 감소될 수 있고, 제3형 콜라겐 및 α-SMA를 비롯한 섬유화유발(pro-fibrotic) 유전자의 발현이 감소될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다.

본 발명은 전신 경화증, 다초점성 섬유경화증, 경피증성 이식편-대-숙주-질환, 신성 전신 섬유증, 기관 특이적 섬유증 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 각종 섬유화 질환, 장애 및 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다고 여겨진다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 안지오텐신 (1-7), 그의 유사체 또는 유도체를 투여함으로써 섬유화 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 폐(lung) 섬유증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 치료될 수 있는 폐 섬유증은 폐(pulmonary) 섬유증, 폐 고혈압, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식, 낭성 섬유증 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 낭성 섬유증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 신장 섬유증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 간 섬유증, 예컨대 비알콜성 지방간염 (NASH)을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 심장 섬유증, 예를 들어 심내막심근 섬유증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 전신 경화증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 수술 후 유착 형성에 의해 유발되는 섬유화 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체를 투여함으로써 대상체에서 상처 치유를 가속화시키는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체를 투여함으로써 대상체에서 반흔 형성을 감소시키거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 피부 상의 반흔 형성을 감소시키거나 예방하는 데 사용될 수 있다.

다양한 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 섬유화 질환, 장애 또는 병태, 또는 다른 관련 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 강도, 중증도 또는 빈도를 감소시키거나 또는 그의 발병을 지연시키도록 하는 치료 유효량으로 투여된다.

다양한 실시양태는 상이한 양의 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체를 사용할 수 있다는 점이 고려된다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 약 0.0001-1,000 mg/kg/일 범위 (예컨대, 약 0.001-100 mg/kg/일, 약 0.001-10 mg/kg/일, 약 0.001-1 mg/kg/일, 약 1-900 ㎍/kg/일, 약 1-800 ㎍/kg/일, 약 1-700 ㎍/kg/일, 약 1-600 ㎍/kg/일, 약 1-500 ㎍/kg/일, 약 1-400 ㎍/kg/일, 약 1-300 ㎍/kg/일, 약 1-200 ㎍/kg/일, 약 1-100 ㎍/kg/일, 약 1-90 ㎍/kg/일, 약 1-80 ㎍/kg/일, 약 1-70 ㎍/kg/일, 약 1-60 ㎍/kg/일, 약 1-50 ㎍/kg/일, 약 1-40 ㎍/kg/일, 약 1-30 ㎍/kg/일, 약 1-20 ㎍/kg/일, 약 1-10 ㎍/kg/일)의 유효량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1,000 ㎍/kg/일로부터 선택되는 유효량으로 투여된다.

본원에서 사용되는 바, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 자연 발생 안지오텐신 (1-7), 그의 기능적 등가물, 및 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제를 비롯한 임의의 안지오텐신 (1-7) 효능제를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 자연 발생 안지오텐신 (1-7)의 기능적 등가물이란 자연 발생 안지오텐신 (1-7)과 아미노산 서열 동일성을 공유하고, 자연 발생 안지오텐신 (1-7)과 실질적으로 동일하거나 유사한 활성을 유지하는 임의의 펩티드를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "안지오텐신 (1-7) 수용체"라는 용어는 G 단백질 커플링된 Mas 수용체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "안지오텐신 (1-7) 효능제" 또는 "안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제"는 안지오텐신 (1-7) 또는 안지오텐신 (1-7) 수용체, 특히 G 단백질 커플링된 Mas 수용체의 기능에 긍정적 영향을 미치는 임의의 분자를 포함한다. 예를 들어, 안지오텐신 (1-7) 또는 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제는 안지오텐신 (1-7) 또는 안지오텐신 (1-7) 수용체 (즉, Mas 수용체) 활성을 직접 또는 간접적으로 증진, 강화, 활성화 및/또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제는 안지오텐신 (1-7) 수용체 (즉, Mas 수용체)와 직접적으로 상호작용한다. 상기 효능제는, 예컨대 단백질, 화학적 화합물, 소형 분자, 핵산, 항체, 약물, 리간드, 또는 다른 작용제를 비롯한, 펩티드성 또는 비-펩티드성일 수 있다.

다양한 실시양태에서, 본 발명에 적합한 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 Asp¹-Arg²- Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷ (서열 1)의 아미노산 서열을 가지는 자연 발생 안지오텐신 (1-7)이다.

다양한 실시양태에서, 본 발명에 적합한 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 Asp¹-Arg²-Nle³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷ (서열 2)의 아미노산 서열을 가지는 자연 발생 안지오텐신 (1-7)의 기능적 등가물이다.

다양한 실시양태에서, 본 발명에 적합한 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷ (서열 3)의 아미노산 서열을 가지는 자연 발생 안지오텐신 (1-7)의 기능적 등가물이다.

다양한 실시양태에서, 본 발명에 적합한 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 시클릭 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드인 자연 발생 안지오텐신 (1-7)의 기능적 등가물이다. 일부 실시양태에서, 시클릭 펩티드는 아미노산 사이에 연결을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결은 자연 발생 안지오텐신 (1-7)의 위치 Tyr⁴ 및 Pro⁷에 상응하는 잔기에 위치한다. 일부 실시양태에서, 연결은 티오에테르 가교이다. 일부 실시양태에서, 시클릭 펩티드는 다르게는 Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷ (서열 1)의 자연 발생 안지오텐신 (1-7) 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시클릭 펩티드는 자연 발생 안지오텐신 (1-7)에 위치 Val3을 대신하는 노르류신 (Nle)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시클릭 펩티드는 하기 식 Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷ (서열 3)을 가지는 4,7-고리화 안지오텐신 (1-7)이다. 특정 실시양태에서, 적합한 시클릭 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드는 하기 화학식을 가지는 4,7-고리화 안지오텐신 (1-7)이다:

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일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 프로테아제 내성, 혈청 안정성 및/또는 생체이용률을 증가시키기 위해 하나 이상의 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 화학적 변형은 PEG화를 포함한다.

일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제는 비-펩티드성 효능제이다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제는 1-(p-티에닐벤질)이미다졸이다. 일부 실시양태에서, 1-(p-티에닐벤질)이미다졸은 하기 화학식을 가진다:

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다양한 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 비경구로 투여된다. 예를 들어, 적합한 비경구 투여는 정맥내, 피내, 흡입, 경피 (국소), 피하 및/또는 경점막 투여일 수 있다.

다양한 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 경구로 투여된다.

일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 격월로, 매월, 3주마다, 격주로, 매주, 매일 또는 다양한 간격을 두고 투여된다.

본 출원에서 사용되는 바, "약" 및 "대략적으로"라는 용어는 동의 어구로 사용된다. 본 출원에서 약/대략적으로라는 용어와 함께, 또는 그 용어 없이 사용되는 임의의 수치는 관련 분야의 숙련가에 의해 이해되는 임의의 정상 변동을 포함하는 것으로 여겨진다.

본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 하기 상세한 설명에서 자명해진다. 그러나, 본 발명의 실시양태를 나타내는 상세한 설명은 제한하는 것이 아니라, 단지 예시적인 것으로 제공되는 것이다. 상세한 설명으로부터 본 발명의 범주 내에서 다양하게 변형 및 수정될 수 있다는 것이 당업자에게 자명해질 것이다.

도면은 제한하고자 하는 것이 아니라, 단지 예시를 목적으로 한다.
도 1은 비처리 마우스, 염수, 텔미사르탄, 또는 30, 100, 300 또는 1,000 ㎍/kg의 TXA127로 처리된 마우스에서 측정된 예시적인 A) 전혈 글루코스, B) 혈장 알라닌 트랜스아미나제 (ALT), C) 혈장 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST), 및 D) 혈장 알칼리성 포스파타제 (ALP)의 수준을 나타낸 그래프를 보여주는 것이다.
도 2는 비처리 마우스, 염수, 텔미사르탄, 또는 30, 100, 300 또는 1,000 ㎍/kg의 TXA127로 처리된 마우스의 간에서의 히드록시프롤린 수준을 나타낸 그래프를 보여주는 것이다.
도 3은 비처리 마우스, 염수, 텔미사르탄, 또는 30, 100, 300 또는 1,000 ㎍/kg의 TXA127로 처리된 마우스의 간에서의 시리우스(Sirius)-양성 영역의 비율(%)을 나타낸 그래프를 보여주는 것이다.
도 4는 비처리 마우스, 염수, 텔미사르탄, 또는 30, 100, 300 또는 1,000 ㎍/kg의 TXA127로 처리된 마우스의 간에서의 A) 제I형 콜라겐, B) 제3형 콜라겐, C) α-SMA, 및 D) TGF-β의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프를 보여주는 것이다.
도 5는 비처리 마우스, 염수, 텔미사르탄, 또는 30, 100, 300 또는 1,000 ㎍/kg의 TXA127로 처리된 마우스의 간에서의 A) CCR2, 및 B) TIMP-1의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프를 보여주는 것이다.

정의

본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어를 정의한다. 하기 용어 및 다른 용어에 대한 추가의 정의는 본 명세서 전역에 걸쳐 기술된다.

동물: 본원에서 사용되는 바, "동물"이라는 용어는 동물계의 임의의 구성원을 의미한다. 일부 실시양태에서, "동물"은 임의의 발생 단계의 인간을 의미한다. 일부 실시양태에서, "동물"은 임의의 발생 단계의 비-인간 동물을 의미한다. 특정 실시양태에서, 비-인간 동물은 포유동물 (예컨대, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 실시양태에서, 동물은 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충 및/또는 벌레를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 동물은 트랜스제닉 동물, 유전자 조작된 동물, 및/또는 클론일 수 있다.

대략적으로 또는 약: 본원에서 사용되는 바, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 바와 같이, "대략적으로" 또는 "약"이라는 용어는 언급된 참조 값과 유사한 값을 의미한다. 특정 실시양태에서, "대략적으로" 또는 "약"이라는 용어는 값의 범위가 달리 언급되지 않는 한, 또는 다르게는 문맥을 통해 명백해지지 않는 한, (수치가 가능한 값 100%를 초과하는 경우를 제외하면) 양 방향으로 언급된 참조 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 이내(로 그보다 크거나, 또는 작은 값)에 포함되어 있다는 것을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 바, "약" 및 "대략적으로"라는 용어는 동의 어구로 사용된다.

생물학적 활성인: 본원에서 사용되는 바, "생물학적 활성인"이라는 어구는 생물계, 및 특히 유기체에서 활성을 가지는 임의의 작용제의 특징을 의미한다. 예를 들어, 유기체에게 투여되었을 때, 상기 유기체에 생물학적으로 영향을 미치는 작용제가 생물학적 활성인 것으로 간주된다. 특정 실시양태에서, 펩티드가 생물학적 활성인 경우, 펩티드의 1개 이상의 생물학적 활성을 공유하는 상기 펩티드의 일부는 전형적으로 "생물학적 활성부"로서 지칭된다. 특정 실시양태에서, 펩티드는 고유 생물학적 활성을 가지지는 않지만, 하나 이상의 자연 발생 안지오텐신 화합물의 효과를 억제시키는 것은 생물학적 활성인 것으로 간주된다.

담체 또는 희석제: 본원에서 사용되는 바, "담체" 및 "희석제"라는 용어는 제약 제제를 제조하는 데 유용한, 제약상 허용되는 (예컨대, 인간에게 투여하기에 안전하고, 비-독성인) 담체 또는 희석 물질을 의미한다. 예시적인 희석제로는 멸균수, 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예컨대, 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.

포함한다: 본원에서 사용되는 바, "포함한다(comprise)"라는 용어, 및 상기 용어의 파생어, 예컨대 "포함하는," 및 "포함한다(comprises)"는 것은 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제시키고자 하는 것은 아니다.

투여 형태: 본원에서 사용되는 바, "투여 형태" 및 "단위 투여 형태"라는 용어는 치료하고자 하는 환자를 위한 치료제의 물리적 개별 단위를 의미한다. 각 단위는 원하는 치료 효과를 발휘하는 것으로 계산된, 사전 결정된 양의 활성 물질을 함유한다. 그러나, 조성물의 총 투여량은 현명한 의학적 판단 범주 내에서 주치의에 의해 결정될 것이라는 것을 이해할 것이다.

투여 요법: 본원에서 사용되는 바, "투여 요법" (또는 "치료 요법")이라는 용어는 전형적으로는 일정 시간을 두고 대상체에게 개별적으로 투여되는 (전형적으로 1개 초과의) 단위 용량 세트이다. 일부 실시양태에서, 주어진 치료제는 1회 이상의 투여를 포함할 수 있는, 권고되는 투여 요법을 가진다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 복수 회에 걸친 투여를 포함하며, 이들 각각은 서로 같은 시간 간격을 두고 이격되어 있다; 일부 실시양태에서, 투여 요법은 복수 회에 걸친 투여를 포함하며, 개별 투여는 2개 이상의 상이한 시간 간격을 두고 이격되어 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 사전 결정된 기간 동안에 걸쳐 연속적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 1일 1회 (QD) 또는 1일 2회 (BID)로 투여된다.

기능장애: 본원에서 사용되는 바, "기능장애"라는 용어는 비정상적인 기능을 의미한다. 분자 (예컨대, 단백질)의 기능장애는 상기 분자와 관련된 활성의 증가 또는 감소에 의해 유발될 수 있다. 분자의 기능장애는 분자 그 자체, 또는 직접적으로 또는 간접적으로 상기 분자와 상호작용하거나 또는 상기 분자를 조절하는 다른 분자와 관련된 결함에 의해 유발될 수 있다.

기능적 등가물 또는 유도체: 본원에서 사용되는 바, "기능적 등가물" 또는 "기능적 유도체"라는 용어는 아미노산 서열의 기능적 유도체와 관련하여 원래의 서열의 것과 실질적으로 유사한 (기능적 또는 구조적인) 생물학적 활성을 유지하는 분자를 의미한다. 기능적 유도체 또는 등가물은 천연 유도체일 수 있거나 또는 합성적으로 제조된 것이다. 예시적인 기능적 유도체는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 가지되, 단 단백질의 생물학적 활성은 보존되는 것인 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 치환을 통해 바람직하게는 치환되는 아미노산의 것과 유사한 화학-물리적 특성을 가진다. 바람직한 유사 화학-물리적 특성으로는 전하, 벌크성, 소수성, 친수성 등의 유사성을 포함한다.

개선시키다 , 증가시키다, 또는 감소시키다: 본원에서 사용되는 바, "개선시키다," "증가시키다," 또는 "감소시키다"라는 용어 또는 문법상 동의 어구는 기준선 측정치, 예컨대 본원에 기술된 치료를 개시하기 이전의 동일 개체에서의 측정치, 또는 본원에 기술된 치료 부재하의 대조군 대상체 (또는 다수의 대조군 대상체)에서의 측정치에 대해 상대적인 값을 나타낸다. "대조군 대상체"란 치료받는 대상체와 거의 같은 연령대인, 치료받는 대상체와 같은 형태의 질환을 앓는 대상체이다.

시험관내: 본원에서 사용되는 바, "시험관내"라는 용어는 사례가 다세포 유기체 내에서보다는 인공 환경에서, 예컨대 시험관 또는 반응 용기에서, 세포 배양물 등에서 발생한다는 것을 의미한다.

생체내: 본원에서 사용되는 바, "생체내"라는 용어는 사례가 다세포 유기체, 예컨대 인간 및 비-인간 동물 내에서 발생한다는 것을 의미한다. 세포 기반 시스템과 관련하여, 상기 용어는 사례가 (예를 들어, 시험관내 시스템과 대조적으로) 살아있는 세포 내에서 발생한다는 것을 의미할 수 있다.

단리된: 본원에서 사용되는 바, "단리된"이라는 용어는 물질 및/또는 엔티티가 (1) (자연에서든 및/또는 실험 환경에서든) 처음 제조되었을 때, 그와 회합하고 있는 성분들 중 적어도 일부로부터 분리되고/거나, (2) 인공으로 생산, 제조 및/또는 제작되었다는 것을 의미한다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 그와 처음 회합하고 있던 다른 성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100% 이상, 또는 100%로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100% 초과, 또는 100%로 순수하다. 본원에서 사용되는 바, 물질에 실질적으로 다른 성분이 없다면, 상기 물질은 "순수한" 것이다. 본원에서 사용되는 바, "단리된 세포"라는 용어는 다세포 유기체 내에는 함유되어 있지 않은 세포를 의미한다.

예방하다: 본원에서 사용되는 바, 질환, 장애 및/또는 병태 발생과 관련하여 사용될 때, "예방하다" 또는 "예방"이라는 용어는 질환, 장애 및/또는 병태가 발병될 위험을 감소시키는 것을 의미한다. "위험"의 정의를 참조할 수 있다.

폴리펩티드: 본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드" 또는 "펩티드"라는 용어는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 순차적 아미노산 쇄를 의미한다. 상기 용어는 임의의 길이의 아미노산 쇄를 의미하는 데 사용되지만, 당업자들은 상기 용어가 장쇄로 제한되지 않으며, 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 두 아미노산을 포함하는 최소의 쇄를 의미할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 폴리펩티드는 프로세싱될 수 있고/거나, 변형될 수 있다.

단백질: 본원에서 사용되는 바, "단백질"이라는 용어는 개별 단위로서 작용하는 하나 이상의 폴리펩티드를 의미한다. 단일 폴리펩티드가 개별 기능성 단위이며, 개별 기능성 단위 형성을 위해 다른 폴리펩티드와의 영구적 또는 일시적인 물리적 회합을 필요로 하지 않는다면, "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 개별 기능성 단위가 서로 물리적으로 회합된 1개 초과의 폴리펩티드로 구성되었다면, "단백질"이라는 용어는 물리적으로 커플링되고, 개별 단위로서 함께 작용하는 다중 폴리펩티드를 의미한다.

위험: 문맥으로부터 이해되는 바와 같이, 질환, 장애 및/또는 병태의 "위험"은 특정 개체에서 질환, 장애 및/또는 병태 (예컨대, 섬유증)가 발병될 가능성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 위험은 백분율(%)로서 표현된다. 일부 실시양태에서, 위험은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%에서부터 최대 100%까지이다. 일부 실시양태에서 위험은 참조 샘플, 또는 참조 샘플들로 이루어진 군과 관련된 위험에 대해 상대적인 위험 값으로서 표현된다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 또는 참조 샘플들로 이루어진 군은 질환, 장애, 병태 및/또는 사례 (예컨대, 당뇨병)의 공지된 위험을 가진다. 일부 실시양태에서, 참조 샘플, 또는 참조 샘플들로 이루어진 군은 특정 개체와 유사한 개체로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 상대적인 위험 값은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과이다.

대상체: 본원에서 사용되는 바, "대상체"라는 용어는 인간 또는 임의의 비-인간 동물 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 의미한다. 인간은 출생 전 및 출생 후의 형태를 포함한다. 많은 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 진찰을 받으러 가는 인간을 의미하는 환자일 수 있다. 본원에서 "대상체"라는 용어는 "개체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애를 앓고 있을 수 있거나, 그에 걸리기 쉽지만, 질환 또는 장애의 증상을 보일 수 있거나, 보이지 않을 수 있다.

실질적으로: 본원에서 사용되는 바, "실질적으로"라는 용어는 관심 특징 또는 특성을 전체적으로 또는 거의 전체에 가까운 규모 또는 정도로 보이는 정질적 상태를 의미한다. 생물학적 및 화학적 현상은 설사 있다 해도 완성되는 경우는 극히 드물고/거나, 완성될 때까지 진행되거나, 또는 절대적 결과를 달성 또는 회피할 때까지 진행된다는 것을 생물학 분야의 숙련가는 이해할 것이다. 그러므로, "실질적으로"라는 용어는 본원에서 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재하는 완성도의 잠재적인 부족을 포착하는 데 사용된다.

~을 앓는: 질환, 장애 및/또는 병태"를 앓는" 개체는 질환, 장애 및/또는 병태 진단을 받았거나, 또는 그의 하나 이상의 증상을 보이는 개체이다.

~에 걸리기 쉬운: 질환, 장애 및/또는 병태"에 걸리기 쉬운" 개체는 질환, 장애 및/또는 병태 진단을 받지 않은 개체이다. 일부 실시양태에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체는 질환, 장애 및/또는 병태의 증상을 보이지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 질환, 장애, 병태 또는 사례 (예를 들어, 허혈성 졸중)에 걸리기 쉬운 개체는 하기 중 하나 이상의 것을 특징으로 할 수 있다: (1) 질환, 장애 및/또는 병태 발병과 관련된 유전자 돌연변이; (2) 질환, 장애 및/또는 병태 발병과 관련된 유전자 다형성; (3) 질환, 장애 및/또는 병태와 관련된 단백질의 발현 및/또는 활성 증가 및/또는 감소; (4) 질환, 장애, 병태 및/또는 사례의 발병과 관련된 습관 및/또는 생활 방식; (5) 이식을 받은 경험이 있거나, 이식 계획이 있거나, 또는 이식이 필요한 경우. 일부 실시양태에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체에서는 질환, 장애 및/또는 병태가 발병될 것이다. 일부 실시양태에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬운 개체에서는 질환, 장애 및/또는 병태가 발병되지 않을 것이다. 섬유화 장애에 걸리기 쉬운 대상체는 또한 손상을 입었거나, 또는 외과 시술을 받은 경험이 있거나, 또는 외과 시술을 받을 예정인 대상체도 포함한다.

치료 유효량: 본원에서 사용되는 바, 치료제의 "치료 유효량"이라는 용어는 질환, 장애 및/또는 병태를 앓거나, 그에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여되었을 때, 질환, 장애 및/또는 병태를 치료, 진단, 예방 및/또는 그의 증상(들)의 발병을 지연시키는 데 충분한 양을 의미한다. 치료 유효량은 전형적으로 1개 이상의 단위 용량을 포함하는 투여 요법을 통해 투여된다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

치료하는: 본원에서 사용되는 바, "치료하다," "치료," 또는 "치료하는"이라는 용어는 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전하게 경감시키고/거나, 호전시키고/거나, 완화시키고/거나, 억제시키고/거나, 예방시키고/거나, 그의 발병을 지연시키고/거나, 그의 중증도를 감소시키고/거나, 그의 발병률을 감소시키는 데 사용되는 임의의 방법을 의미한다. 치료는 질환의 어떤 징후도 보이지 않고/거나, 상기 질환과 관련된 병리상태가 발병될 위험을 감소시키기 위한 목적으로 오직 조기에만 질환의 징후를 보이는 대상체에게 수행될 수 있다. 치료는 섬유화 장애에 걸리기 쉬운 대상체에서 섬유화 장애를 예방하기 위해 수행될 수 있다.

상세한 설명

본원에서는 특히 섬유화 또는 다른 관련 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 기술한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 본 발명의 방법은 필요로 하는 대상체에게 안지오텐신 (1-7), 그의 유사체 또는 유도체, 또는 상기를 함유하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특히, 안지오텐신 (1-7), 그의 유사체 또는 유도체는 섬유화 질환, 장애 또는 병태, 또는 다른 관련 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 강도, 중증도 또는 빈도를 감소시키거나 또는 그의 발병을 지연시키도록 하는 치료 유효량으로 투여된다.

본 발명의 다양한 측면이 하기 섹션에서 상세하게 기술된다. 섹션을 사용하는 것이 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 각 섹션은 본 발명의 임의의 측면에 적용될 수 있다. 본 출원에서 달리 언급되지 않는 한, "또는"이라고 사용되는 것은 "및/또는"을 의미한다.

섬유화 장애 및 병태

본원에서 사용되는 바, "섬유화 장애"라는 용어는 전신 경화증, 다초점성 섬유경화증, 경피증성 이식편-대-숙주-질환, 신성 전신 섬유증, 기관 특이적 섬유증 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 섬유증을 특징으로 하는 임의의 질환을 의미한다. 예시적인 기관 특이 섬유화 장애로는 폐 섬유증, 폐 고혈압, 낭성 섬유증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 간 섬유증, 신장 섬유증, NASH 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다수의 섬유화 질환, 장애 또는 병태는 이환 조직 중 세포외 매트릭스의 장애성 및/또는 과대 침착을 가진다. 섬유증은 염증과 관련될 수 있고/거나, 선행 질환의 증상에 따라 발생하고/거나, 외과 시술 또는 상처 치유 과정에 의해 유발될 수 있다. 섬유증을 억제시키지 않을 경우, 통상 반흔형성으로 지칭되는, 하부 기관 또는 조직의 구조 파괴가 일어날 수 있다.

본 발명은 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 각종 섬유화 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다.

예를 들어, 폐 섬유증은 쇠약성이고, 잠재적으로는 치명적 형태의 섬유증을 나타낸다. 폐 조직에서 섬유증을 치료하기 위한 치료 옵션은 매우 제한적이다. 반흔형성이 일단 발생되고 나면, 영구적이고, 폐 이식은 대개 이용가능한 유일의 치료학적 옵션이 된다.

폐 섬유증은 섬유모세포 증식, 세포외 매트릭스 단백질의 과도한 축적, 및 비정상적인 폐포 구조를 동반하는, 폐 조직의 진행성 반흔형성을 특징으로 한다. 비후된 및 경직성 조직으로 인해 폐가 적절하게 작용하기는 어려워지며, 이는 예컨대, 숨가쁨과 같은 호흡상의 문제로 이어질 수 있고, 결국 치명적일 수 있다. 폐 섬유증은 급성 폐 손상, 바이러스 감염, 독소에의 노출, 방사선, 만성 질환, 약물 치료에 의해 유발될 수 있거나, 특발성 (즉, 근본 원인이 발견되지 않는 것)일 수 있다.

특발성 폐 섬유증에 대한 고전적 연구 결과에서는 폐 표면의 바깥쪽 내층에 인접한, 대개는 폐 기저부의 (수포로 알려져 있는) 작은 기포와 함께 폐 주변부의 미만성 반흔형성을 나타낸다. 특발성 폐 섬유증은 대개 느리게 끊임없이 진행된다. 초기에 환자는 대개 원인 불명의 마른 기침을 호소한다. 이어서, 숨가쁨 (호흡곤란)이 시작되고 악화되고, 시간이 경과함에 따라 활동은 점점 감소하게 된다. 결국, 숨가쁨은 장애가 되고, 모든 활동은 제한적이게 되며, 심지어는 가만히 앉아 있는 동안에도 발생하게 된다. 보다 드문 경우로, 섬유증이 빠르게 진행됨에 따라 상기 질환이 발병된 후 수주에서 수개월 이내에 호흡곤란 및 장애가 발생할 수 있다. 이러한 형태의 폐 섬유증은 함만-리치 증후군(Hamman-Rich syndrome)으로 지칭되어 왔다.

폐 고혈압은 폐 동맥, 폐 정맥, 및/또는 폐 모세혈관을 비롯한, 폐 혈관계의 혈압 증가를 특징으로 한다. 비정상적으로 높은 혈압은 심장의 우심실을 긴장시키고, 이로써 우심실은 비대해진다. 시간이 경과함에 따라, 우심실은 약화될 수 있고, 폐에 충분한 혈액을 펌핑할 수 있는 그의 능력을 상실할 수 있으며, 이로써 심부전이 발병되게 된다. 폐 고혈압은 다른 의학적 병태, 예컨대 만성 간 질환 및 간 경변증; 류마티스 장애, 예컨대 공피증 또는 전신 홍반 루푸스 (루푸스); 및 종양, 기종, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 및 폐 섬유증을 비롯한 폐 병태의 결과로서도 발생할 수 있다. 폐 섬유증은 폐 혈관계를 협착시켜 그 결과로 폐 고혈압을 유발할 수 있다.

만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)은 대개 만성 기관지염 또는 기종과 관련된 일반 폐 질환이다. 증상은 대개 기침, 점액 축적, 피로, 천명, 및 기도 감염을 포함할 수 있다.

만성 기관지염 및 기종은 기도가 협착되는 폐 질환이다. 이로 인해 폐로의 및 폐로부터의 기류는 제한되며, 이는 숨가쁨 (호흡곤란)을 유발한다. 임상 실무에서 COPD는 폐 기능 검사에서 그의 특징적으로 낮은 기류에 의해 정의된다.

폐 손상 및 대기도 염증은 만성 기관지염을 유발한다. 폐 기도에서, 만성 기관지염의 특징은 기도의 배상 세포 및 점액선의 개수 증가 (과다형성) 및 크기 증가 (비대)이다. 그 결과, 기도내에는 평소보다 더 많은 점액이 존재하게 되며, 이는 기도 협착의 원인이 되고, 객담을 동반한 기침을 유발한다. 미시적으로는 염증 세포와 함께 기도 침윤이 존재한다. 염증 다음으로 반흔형성과 리모델링으로 이어지게 되는데, 이는 벽을 비후화시키며, 이 또한 기도 협착을 유발한다. 만성 기관지염이 진행되어 감에 따라, 편평상피 화생 (기도 안쪽에 내층을 형성하는 조직의 비정상적인 변화) 및 섬유증 (기도 벽의 추가의 비후 및 반흔형성)이 존재하게 된다. 상기와 같은 변화의 결과는 기류 제한 및 호흡곤란이다.

천식은 기도 염증 및 수축을 특징으로 하는 만성 폐 질환이다. 천식은 천명, 가슴 답답함, 숨가쁨, 및 기침의 재발 기간을 일으킨다. 팽윤 및 점액 과잉 생산은 추가의 기도 수축 및 증상 악화를 유발할 수 있다. 매트릭스 분해 증가는 천식에서 발생할 수 있고, 이는 천식에서 기도의 기계적 변화의 원인이 될 수 있다고 입증된 바 있다 (문헌 [Roberts et al., (1995) Chest 107:111S-117S], 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 세포외 매트릭스 분해를 치료하면 천식 증상을 호전시킬 수 있다.

낭성 섬유증은 폐, 췌장, 간, 소장, 및 생식관에서의 농후한 점성액 분비를 일으키는, 상피를 가로질러 일어나는 염화물과 나트륨의 비정상적인 수송을 특징으로 하는 전신 열성 유전병이다. 낭성 섬유증은 단백질 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자 (CFTR)에 대한 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다. 폐 질환은 점액 축정에 기인하는 기도 막힘, 점액 섬모 청소 감소, 및 그 결과로 인한 염증으로부터 유발되고, 이는 섬유화 손상 및 폐에의 구조적 변화를 일으킬 수 있다. 섬유화 폐 손상은 시간 경과에 따라 진행되며, 이로 인해 일부 낭성 섬유증 환자는 폐 이식을 필요로 할 수 있다.

낭성 섬유증을 언급할 때, 낭성 섬유증 (CF)을 "치료하기 위해" 또는 "치료하는"이라는 것은 하기 중 하나 이상의 것을 달성하는 것을 의미할 수 있다: (a) 대상체에서 염증을 감소시키는 것; (b) 대상체에서 임의의 염증 증가를 제한시키는 것; (c) 하나 이상의 CF 증상의 중증도를 감소시키는 것; (d) 하나 이상의 CF 증상의 발병을 제한하거나 예방하는 것; (e) 하나 이상의 CF 증상의 악화를 억제시키는 것; 및 (f) 앞서 관련 CF 증상의 징후를 보인 대상체에서 하나 이상의 CF 증상의 재발을 제한하거나 예방하는 것.

낭성 섬유증을 앓는 대상체의 공통 증상으로는 농후한 점액 축적, 다량의 점액질 생산, 잦은 가슴 감염, 잦은 기침, 잦은 숨가쁨, 염증, 운동 능력 감소, 폐 및 동(sinus)의 기회 감염 (스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 폐렴, 결핵, 기관지확장증, 객혈, 폐 고혈압 (및 그 결과로 심부전), 저산소증, 호흡 부전, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증, 부비동 점액, 축농증, 안면 통증, 열, 과도한 코 배농, 비용종 발생, 심폐 합병증, CF-관련 당뇨병, 직장 탈출증, 췌장염, 흡수장애, 장 차단, 외분비 췌장 기능부전, 담관 차단, 및 간 경변증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 실시양태에서, 낭성 섬유증의 증상은 염증을 포함한다. 상기 실시양태에서, 본 발명의 범주 내에 포함되는 일부 방법은 염증을 치료하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 치료의 유익한 효과는 예를 들어, 대상체로부터의 관련 샘플, 예컨대 기관지폐포 세척 (BAL) 액 중의 염증 세포 계수의 감소에 의해 평가될 수 있다. 비-제한적인 실시양태에서, 유익한 효과는 대상체로부터의 BAL 액 중의 호중구 계수의 감소를 입증함으로써 평가될 수 있다. CF 환자의 기도로의 호중구의 과도한 동원은 CF에서 폐 질환 중증도에 관한 유의한 예측 변수가 되며, 그러므로, 이는 중요한 치료 표적이 된다. FACS 기법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 상기 세포 계수를 측정하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 범주 내의 방법은 대상체에서 염증을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 대조군과 비교하여 대상체로부터의 BAL 액 중의 호중구 세포 계수를 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 대조군, 예컨대 본 펩티드로 치료받지 않은 낭성 섬유증 대상체는 비교를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 호중구 계수 감수는 대상체에게 임상적으로 유익한 이점을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 호중구 계수 감수는 대조군과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 또는 그 초과이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 치료 방법의 유익한 효과는 대상체로부터의 관련 샘플, 예컨대 BAL 액 중 하나 이상의 염증 바이오마커 감소에 의해 평가될 수 있다. 다양한 비-제한적인 실시양태에서, 염증 바이오마커는 BAL 액 중의 IL1β, KC, MIP2, IFNγ, TNFα, IL-6, MCP-1, 및 IL-10 중 하나 이상의 것을 포함하거나, 또는 그로 구성될 수 있다. ELISA를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 상기 바이오마커의 양을 측정하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 따라서, 본 실시양태에서, 본 방법은 추가로 대조군과 비교하여 대상체로부터의 BAL 샘플 중 하나 이상의 염증 바이오마커의 양을 감소시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.

수술 후 유착 형성은 수술의 일반적인 합병증이다. 기계적 손상, 허혈, 및 감염으로부터의 유착 형성은 수술 이후의 이환률 및 사망률을 감소시킬 수 있다. 비록 정교한 외과 시술이 유착 형성의 규모를 감소시킬 수는 있지만, 유착은 좀처럼 제거되지 못하며, 효과적인 보조 요법이 요구된다. 상기 과정과 관련된 섬유증을 감소시키는 것이 통증, 폐쇄, 수술의 다른 합병증을 감소시킬 수 있고, 치유 및 회복을 촉진시킬 수 있다.

포유동물 조직에서 상처 (즉, 열상, 개구)는 상처면의 조직 파괴 및 미세혈관계의 응고를 일으킨다. 상기 조직의 복구는 손상에 대한 정돈되고 제어된 세포 반응을 나타낸다. 크기와는 상관없이, 연조직 상처는 유사한 방식으로 치유된다. 조직 성장 및 복구는 산소 구배의 존재하에서 세포 증식 및 혈관신생이 일어나는 생물학적 시스템이다. 조직 복구 동안 일어나는 순차적인 형태학적 및 구조적 변화에 관한 특징은 상세하게 규명되어 있으며, 일부 경우에 이는 정량화되었다 (예컨대, 문헌 [Hunt, T.K., et al., "Coagulation and macrophage stimulation of angiogenesis and wound healing," in The Surgical Wound, pp. 1-18, ed. F. Dineen & G. Hildrick-Smith (Lea & Febiger, Philadelphia: 1981)] 참조). 세포 형태는 3가지 다른 구역으로 구성된다. 중앙의 무혈관 상처 공간은 산소 결핍이고, 산성 혈증성이고, 고탄산혈증성이며, 락테이트 수준이 높다. 분열 섬유모세포가 존재하는, 국소 빈혈 (허혈)의 구배 구역은 상처 공간에 인접해 있다. 성숙한 섬유모세포 및 다수의 새로 형성된 모세혈관 (즉, 신생혈관화)을 특징으로 하는 활성 콜라겐 합성 영역은 선도 구역 뒤에 존재한다. 미국 특허 번호 5,015,629 및 7,022,675 (상기 특허는 각각 본원에 참조로 포함된다)에는 상처 복구율을 증가시키는 방법 및 조성물이 개시되어 있다.

반흔 형성은 치유 과정의 자연스러운 한 부분이다. 상처에서 무질서한 콜라겐 합성 및 침착으로 과도, 비후, 또는 융기형의 반흔이 형성될 수 있다. 일반적으로, 상처가 클수록, 치유에 소요되는 시간은 더 장기화되며, 문제의 반흔 기회는 더 커진다.

여러 유형의 반흔이 존재한다. 비대성 반흔은 원래의 손상부 경계 안쪽에 위치하는 융기형의 적분홍색 영역이다. 이는 대개 소양성인 것으로 기술된다. 일부 경우에서, 비대성 반흔은 그 스스로 줄어들어 사라진다. 켈로이드는 원래의 손상부의 것보다 더 큰 영역을 피복시키는 경향이 있는, 융기형의 진홍색 영역이다. 심지어 수술로 제거된 때에도 켈로이드는 재발하는 경향이 있다. 위축성 반흔은 때로는 심각한 여드름으로부터 형성되는 것과 같은 피부 함몰이다. 이는 재건 과정 동안 콜라겐을 파괴시켜 함입 영역을 남기는 염증에 의해 유발된다.

전신 경화증은 미세혈관계의 변경, 면역계 장애, 및 결합 조직 중 콜라겐 및 다른 매트릭스 물질의 대량 침착을 특징으로 하는 전신 결합 조직 질환이다. 전신 경화증은 피부 및 내부 기관, 예컨대 위장관, 폐, 심장, 및 신장의 결합 조직을 이환시키는, 임상적으로 불균일한 전신 장애이다. 전신 경화증으로 인한 섬유증을 감소시키면 증상은 호전될 수 있고/거나, 이환 조직에서의 추가의 합병증은 예방될 수 있다.

비알콜성 지방간염 (NASH)은 일반 간 질환이다. 이는 알콜성 간 질환과 유사하지만, 거의 또는 전혀 음주를 하지 않는 사람에서도 발생한다. NASH의 주된 특징은 염증 및 손상과 함께, 간에 존재하는 지방이다. 그럼에도 불구하고, NASH는 중증일 수 있고, 경변증으로 이어질 수 있으며, 여기서 간은 영구적으로 손상되고, 반흔이 형성되고, 더 이상은 적절하게 작용할 수 없게 된다.

NASH는 보통 증상이 거의 또는 전혀 없는 침묵 질환이다. 일반적으로 환자는 조기 단계에서는 건강 상태가 좋고, 오직 일단 상기 질환이 더 진행되거나, 경변증이 발병되고 나면, 증상, 예컨대 피로, 체중 감소, 및 쇠약을 보이기 시작한다. NASH는 수년에 걸쳐, 심지어는 수십년에 걸쳐 진행될 수 있다. 진행은 중단될 수 있고, 일부 경우에는 특정의 요법 없이도 그 자력으로 심지어 역전되기 시작할 수도 있다. 또한, NASH는 서서히 악화될 수 있고, 이로써 반흔형성 또는 섬유증을 보이고, 간에 축적된다. 섬유증이 악화되어 감에 따라, 간에서는 중증의 반흔이 형성되고, 간은 경화되고, 정상적인 기능을 하지 못하게 되는 경변증이 발병하게 된다. NASH를 앓는 모든 사람에서 경변증이 발병되는 것은 아니지만, 일단 중증의 반흔형성 또는 경변증이 존재하고 나면, 진행을 중단시킬 수 있는 치료법은 거의 없다. 경변증을 앓는 사람은 체액 체류, 근 소모, 장 출혈, 및 간 부전을 경험한다. 간 이식이 간 부전을 동반한 진행성 경변증에 대한 유일의 치료법이며, NASH를 앓는 사람에서의 이식을 실시하는 것은 점점 더 증가하고 있다. 미국에서 경변증의 주요 원인 중 하나로 NASH가 C형 간염 및 알콜성 간 질환 다음의 순위를 차지하고 있다.

신장 (신장성) 섬유증은 신장에서 섬유 결합 조직의 과도한 형성으로부터 유발된다. 신장 섬유증은 유의한 이환율 및 사망률을 초래하고, 투석 또는 신장 이식을 필요하게 만든다. 섬유증은 신장의 기능성 단위인 네프론의 여과 또는 재흡수 성분에서 발생할 수 있다. 많은 인자, 특히 사구체 여과의 자동조절에 관여하는 생리학적 장애가 신장 반흔형성에 기여할 수 있다. 이로 인해 결국 정상 구조는 축적된 세포외 매트릭스로 대체된다. 개별 세포의 광범위한 생리학적 성질 변화로 인해 다수의 펩티드 및 비-펩티드 피브로겐이 생산되며, 이는 세포외 매트릭스 합성과 분해 사이의 균형 변경을 자극하여 반흔형성을 유리하게 만든다.

안지오텐신 (1-7) 및 그의 유사체 또는 유도체

안지오텐신은 레닌-안지오텐신계의 폴리펩티드이다. 순환 레닌-안지오텐신계 (RAS)는 순환 항상성에서 잘 기술되어 있는 역할을 가진다. 예컨대, 폐에서와 같이 국소 조직-기반 RAS 또한 존재하며, 이는 손상 및 복구 반응에서 역할을 가진다. 자연 발생 안지오텐신 (1-7)은 Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷의 아미노산 서열 (서열 1)을 가지는 선형 폴리펩티드이다. 레닌-안지오텐신계에서, 안지오텐신 (1-7)의 혈관확장 활성은 안지오텐신 II의 혈관 수축 활성을 상쇄시킨다. Ang-(1-7)은 Mas 수용체에 대한 내인성 리간드이다. Mas 수용체는 7개의 막횡단 관통 영역을 포함하는 G 단백질 커플링된 수용체이다. 어느 이론으로도 제한하고자 하지 않으면서, 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드 또는 그의 유사체 및 유도체를 투여하면 Mas 수용체의 활성화를 통해 항-섬유화 효과를 발휘할 수 있을 것으로 가정하였다.

본 발명에 적합한 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 자연 발생 안지오텐신 (1-7), 그의 기능적 등가물, 및 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제를 비롯한 임의의 안지오텐신 (1-7) 효능제를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 자연 발생 안지오텐신 (1-7)의 기능적 등가물이란 자연 발생 안지오텐신 (1-7)과 아미노산 서열 동일성을 공유하고, 자연 발생 안지오텐신 (1-7)과 실질적으로 동일하거나 유사한 활성을 유지하는 임의의 펩티드를 의미한다. "펩티드" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바, "안지오텐신 (1-7) 수용체"라는 용어는 G 단백질 커플링된 Mas 수용체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "안지오텐신 (1-7) 효능제" 또는 "안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제"는 안지오텐신 (1-7) 또는 안지오텐신 (1-7) 수용체, 특히 G 단백질 커플링된 Mas 수용체의 기능에 긍정적 영향을 미치는 임의의 분자를 포함한다. 예를 들어, 안지오텐신 (1-7) 또는 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제는 안지오텐신 (1-7) 또는 안지오텐신 (1-7) 수용체 (즉, Mas 수용체) 활성을 직접 또는 간접적으로 증진, 강화, 활성화 및/또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제는 안지오텐신 (1-7) 수용체 (즉, Mas 수용체)와 직접적으로 상호작용한다. 상기 효능제는 예컨대, 단백질, 화학적 화합물, 소형 분자, 핵산, 항체, 약물, 리간드, 또는 다른 작용제를 비롯한, 펩티드성 또는 비-펩티드성일 수 있다.

특정 실시양태에서, Ang(1-7) 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 7개 초과의 연속된 아미노산을 포함하도록 Ang(1-7) 폴리펩티드에 추가의 아미노산이 연결된 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, Ang(1-7) 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 7개 미만의 연속된 아미노산을 포함하도록 Ang(1-7) 폴리펩티드로부터 하나 이상의 아미노산이 결핍된 것을 포함한다.

특정 실시양태에서, Ang(1-7) 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 프로테아제 내성, 혈청 안정성 및/또는 생체이용률을 증가시키기 위해 Ang(1-7) 폴리펩티드에 대해 하나 이상의 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 변형은 아세틸화, 글리코실화, 비오티닐화, PEG화, D-아미노산 및/또는 비천연 아미노산으로의 치환, 및/또는 폡티드의 고리화로부터 선택된다.

Ang(1-7) 폴리펩티드 유도체는 원하는 바에 따라 기능적으로 등가인 분자 또는 기능적으로 증진된 또는 감소된 분자를 제공하기 위해 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 아미노산 서열을 변경시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 유도체는 1차 아미노산 서열로서, 기능적으로 등가인 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 변경된 서열을 포함하는, 서열 1의 아미노산 서열 모두 또는 그의 일부를 포함하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능적 등가물로서 작용하는, 극성이 유사한 또 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있고, 이로써 침묵 변경이 이루어진다. 서열 내의 아미노산에 대한 치환은 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함한다. 비극성 (소수성) 아미노산으로는 류신, 이소류신, 알라닌, 페닐알라닌, 발린, 프롤린, 트립토판, 및 메티오닌을 포함한다. 비하전된 극성 아미노산으로는 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 아미노산 글리신은 비극성 아미노산 패밀리 또는 비하전된 (중성) 극성 아미노산 패밀리에 포함될 수 있다. 아미노산 패밀리 내에서의 치환은 일반적으로 보존적 치환인 것으로 이해된다. 예를 들어, 펩티드 억제제의 아미노산 서열은 변형 또는 치환될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "아미노산"이라는 용어는 가장 넓은 의미로 폴리펩티드 쇄 내로 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 의미한다. 특정 실시양태에서, 아미노산은 일반 구조 H₂N-C(H(R)-COOH를 가진다. 특정 실시양태에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 아미노산은 합성 또는 비천연 아미노산 (예컨대, α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산)이고; 일부 실시양태에서, 아미노산은 D-아미노산이고; 특정 실시양태에서, 아미노산은 L-아미노산, D- 및 L-아미노산의 조합, 및/또는 특별한 특성을 전달하는 각종 "디자이너" 아미노산 (예컨대, β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, 및 Nα-메틸 아미노산 등)이다. 일부 실시양태에서, N-말단은 아세틸화될 수 있고/거나, C-말단은 아미드화될 수 있다. "표준 아미노산"이란 둘 다 자연상에서 펩티드에 도입되어 있는 것인 L- 및 D- 아미노산 둘 다를 비롯한, 자연 발생 펩티드에서 통상 발견되는 20종의 표준 아미노산 중 임의의 것을 의미한다. "비표준" 또는 "비정규 아미노산"이란, 그가 합성적으로 제조되었건 또는 천연 공급원으로부터 수득되었건 간에 그와는 상관없이, 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "합성 또는 비천연 아미노산"은 염, 아미노산 유도체 (예컨대, 아미드) 및/또는 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 화학적으로 변형된 아미노산을 포함한다.

펩티드 중 카르복시- 및/또는 아미노-말단의 아미노산을 비롯한 아미노산은 그의 활성에는 불리한 영향을 미치지 않으면서, 펩티드의 순환 반감기를 바꿀 수 있는 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 및/또는 다른 화학 기로의 치환에 의해 변형될 수 있다. 비정규 또는 비천연 아미노산의 예로는 시트룰린, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 4-(E)-부테닐-4(R)-메틸-N-메틸트레오닌 (MeBmt), N-메틸-류신 (MeLeu), 아미노이소부티르산, 스타틴, 및 N-메틸-알라닌 (MeAla)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아미노산은 디술피드 결합에 참여할 수 있다. "아미노산"이라는 용어는 "아미노산 잔기"와 상호교환적으로 사용되고, 유리 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 의미할 수 있다. 상기 용어가 유리 아미노산인지 또는 펩티드의 잔기인지 여부는 그 용어가 사용되는 문맥으로부터 자명해질 것이다.

특정 실시양태에서, Ang(1-7) 폴리펩티드는 하나 이상의 L-아미노산, D-아미노산, 및/또는 비천연 아미노산을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "역-D 펩티드"라는 용어는 L-아미노산을 포함하는 펩티드에 대해 역순으로 배열된, D-아미노산을 포함하는 펩티드를 의미한다. 예를 들어, L-아미노산 펩티드의 C-말단 잔기는 D-아미노산 펩티드의 경우, N-말단이 되는 것 등이 있다. 역 D-펩티드는 바람직하게는 L-아미노산 펩티드와 동일한 3차 구조를 유지하며, 따라서, 동일한 활성도 유지하지만, 바람직하게는 시험관내 및 생체내에서 효소 분해에 대해 더욱 안정적이며, 따라서, 원래의 펩티드보다 더욱 큰 치료 효능을 가질 수 있다 (문헌 [Brady and Dodson, Nature 368:692-693, 1994]; 및 [Jameson and McDonnel, Nature 368:744-746, 1994]).

본원에서 사용되는 바, "역-L 펩티드"라는 용어는 모 펩티드에 대해 역순으로 배열된, L-아미노산을 포함하는 펩티드를 의미한다. 모 펩티드의 C-말단 잔기는 역-L 펩티드의 경우, N-말단이 되는 것 등이다.

오직 자연 발생 아미노산만을 포함하는 펩티드 이외에도, 펩티드모방체 또는 펩티드 유사체 또한 본 발명에 포함된다. 펩티드 유사체는 보통 주형 펩티드의 것과 유사한 특성을 가지는 비-펩티드 약물로서 제약 업계에서 사용된다. 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 펩티드모방체로 명명된다 (문헌 [Fauchere et al., Infect . Immun . 54:283-287 (1986)]; [Evans et al., J. Med . Chem. 30: 1229-1239 (1987)]). 치료학상 유용한 펩티드와 구조적으로 관련된 펩티드 모방체는 등가의 또는 증진된 치료 또는 예방 효과를 일으키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티드모방체는 패러다임 폴리펩티드 (즉, 생물학적 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예컨대 자연 발생 수용체-결합 폴리펩티드와 구조적으로 유사하지만, 임의로, 당업계에 주지된 방법에 의해 연결, 예컨대 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -CH₂SO- -CH(OH)CH₂- -COCH₂- 등에 의해 대체된 하나 이상의 펩티드 연결을 가진다 (문헌 [Spatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1(3):267 (1983)]; [Spatola et al., Life Sci. 38: 1243-1249 (1986)]; [Hudson et al., Int . J. Pept. Res . 14: 177-185 (1979)]; 및 [Weinstein. B., 1983, Chemistry and Biochemistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein eds, Marcel Dekker, New-York,]). 상기 펩티드 모방체는 자연 발생 폴리펩티드보다, 더욱 경제적으로 제조된다는 점, 화학적 안정성이 더 크다는 점, 약리학적 특성 (예컨대, 반감기, 흡수, 효능, 효율 등)이 증진되어 있다는 점, 항원성이 감소되어 있다는 점 등을 비롯한 유의한 이점을 가질 수 있다.

펩티드는 시험관내에서 생물학적 활성을 유도하는 데 효과적일 수 있지만, 생체내에서의 그의 효과는 프로테아제의 존재에 의해 감소될 수 있다. 혈청 프로테아제는 특이적인 기질 요건을 가진다. 기질은 절단에 대한 펩티드 결합 및 L-아미노산 둘 다를 가져야 한다. 추가로, 혈청에서 프로테아제 활성의 가장 중요한 성분을 나타내는 엑소펩티다제는 보통 펩티드의 제1 펩티드 결합에 대해 작용하고, 유리 N-말단을 필요로 한다 (문헌 [Powell et al., Pharm . Res . 10: 1268-1273 (1993)]). 이를 고려해 볼 때, 대개는 변형된 버전의 펩티드를 사용하는 것이 이롭다. 변형된 펩티드는 Ang(1-7)의 원하는 생물학적 활성을 부여하는, 원래의 L-아미노산 펩티드의 구조적 특징은 유지하지만, 이롭게도 프로테아제 및/또는 엑소펩티다제에 의해 쉽게 절단되지는 않는다.

컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산을 같은 유형의 D-아미노산 (예컨대, L-리신 대신 D-리신)으로 체계적으로 치환시키는 것을 사용함으로써 더욱 안정적인 펩티드를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드 유도체 또는 펩티드모방체는 정방향 또는 역방향의 모든 L, 모든 D, 또는 혼합된 D, L 펩티드일 수 있다. N-말단 또는 C-말단 D-아미노산이 존재하면, 펩티다제가 기질로서 D-아미노산을 이용할 수 없기 때문에 펩티드의 생체내 안정성은 증가하게 된다 (문헌 [Powell et al., Pharm. Res . 10:1268-1273 (1993)]). 역-D 펩티드는 L-아미노산을 포함하는 펩티드에 대해 역순으로 배열된, D-아미노산을 포함하는 펩티드이다. 따라서, L-아미노산 펩티드의 C-말단 잔기는 D-아미노산 펩티드의 경우, N-말단이 되는 것 등이다. 역 D-펩티드는 L-아미노산 펩티드와 동일한 2차 구조를 유지하며, 따라서, 유사한 활성도 유지하지만, 시험관내 및 생체내에서 효소 분해에 대해서는 더 큰 내성을 띠고, 따라서, 원래의 펩티드보다 더욱 큰 치료 효능을 가질 수 있다 (문헌 [Brady and Dodson, Nature 368:692-693 (1994)]; [Jameson et al., Nature 368:744-746 (1994)]). 유사하게, 역-L 펩티드는, 모 펩티드의 C-말단이 역-L 펩티드의 N-말단을 대신하는 표준 방법을 사용함으로써 생성될 수 있다. 유의한 2차 구조 (예컨대, 단쇄 아미드)를 가지지 않는 L-아미노산 펩티드의 역 L-펩티드는 L-아미노산 펩티드의 측쇄의 동일한 이격 간격 및 구조를 유지하며, 따라서, 대개는 원래의 L-아미노산 펩티드와 유사한 활성을 가지는 것으로 고려된다. 또한, 역 펩티드는 L- 및 D-아미노산의 조합을 포함할 수 있다. 측쇄의 구조 및 아미노산 사이의 이격 간격은 유지될 수 있고, 이로써, 원래의 L-아미노산 펩티드와 유사한 활성을 가지게 된다.

추가로, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변형을 포함하는 구속형(constrained) 펩티드는 당업계에 주지된 방법에 의해 생성될 수 있다 (문헌 [Rizo and Gierasch, Ann . Rev . Biochem . 61 :387-418 (1992)]). 예를 들어, 구속형 펩티드는 디술피드 가교를 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 첨가함으로써, 그리고 이를 통해 시클릭 펩티드를 형성함으로써 생성될 수 있다. 시클릭 펩티드는 어떤 유리 N- 또는 C-말단도 가지지 않도록 구축될 수 있다. 따라서, 펩티드 말단에서는 절단하지 않는 엔도펩티다제에 의해서는 쉽게 영향을 받을 수 있지만, 엑소펩티다제에 의해서는 쉽게 단백질 분해되지 않는다. N-말단 또는 C-말단 D-아미노산을 가지는 펩티드, 및 시클릭 펩티드의 아미노산 서열은 보통 각각 N-말단 또는 C-말단 D-아미노산 잔기의 존재, 또는 그의 환형 구조를 제외하면, 그와 상응하는 펩티드의 서열과 동일하다.

본 발명은 또한 고리화 펩티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 시클릭 펩티드는 2개의 비-인접한 잔기 사이에 분자내 공유 결합을 가진다. 분자내 결합은 골격 대 골격, 측쇄 대 골격 또는 측쇄 대 측쇄 결합일 수 있다 (즉, 선형 펩티드의 말단 관능기 및/또는 말단 또는 내부 잔기의 측쇄 관능기가 연결을 통해 고리화될 수 있다). 전형적인 분자내 결합으로는 디술피드, 아미드, 및 티오에테르 결합을 포함한다. 상기 펩티드에 대한 많은 다른 변형과 같이, 폴리펩티드를 고리화시키는 다양한 수단이 당업계에 주지되어 있다. 일반적인 논의를 위해, 국제 특허 공개 번호 WO 01/53331 및 WO 98/02452 (상기 특허의 내용은 본원에 참조로 포함된다)를 참조할 수 있다. 상기 시클릭 결합 및 다른 변형 또한 본 발명의 시클릭 펩티드 및 유도체 화합물에 적용될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이 시클릭 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 그의 임의의 조합의 잔기를 포함할 수 있다. 아미노산은 천연 또는 비-천연 공급원으로부터의 것일 수 있되, 단 1개 이상의 아미노 기 및 1개 이상의 카르복실 기가 분자 내에 존재하며; α- 및 β-아미노산이 일반적으로 바람직하다. 시클릭 펩티드는 또한 매우 다양한 측쇄 변형 및/또는 치환 (예컨대, 메틸화, 벤질화, t-부틸화, 토실화, 알콕시카르보닐화 등) 중 임의의 것을 포함하거나, 또는 포함하지 않으면서, 하나 이상의 희귀 아미노산 (예컨대, 4-히드록시프롤린 또는 히드록시 리신), 유기산 또는 아미드 및/또는 일반 아미노산의 유도체, 예컨대 C-말단 카르복실레이트가 에스테르화된 (예컨대, 벤질, 메틸 또는 에틸 에스테르) 또는 아미드화된 아미노산, 및/또는 N-말단 아미노 기가 변형된 (예컨대, 아세틸화 또는 알콕시카르보닐화됨) 아미노산을 포함할 수 있다. 적합한 유도체로는 (고리화 이전에 선형 펩티드의 N-말단을 나타내는 아미노 기가 아세틸화되도록) N-아세틸 기를 가지고/거나, C-말단 아미드 기를 가지는 (즉, 고리화 이전에 선형 펩티드의 카르복시 말단이 아미드화되는) 아미노산을 포함한다. 시클릭 펩티드와 함께 존재할 수 있는 일반 아미노산 이외의 잔기로는 페니실라민, β,β-테트라메틸렌 시스테인, β,β-펜타메틸렌 시스테인, β-메르캅토프로피온산, β,β-펜타메틸렌-β-메르캅토프로피온산, 2-메르캅토벤젠, 2-메르캅토아닐린, 2-메르캅토프롤린, 오르니틴, 디아미노부티르산, α-아미노아디프산, m-아미노메틸벤조산 및 α,β-디아미노프로피온산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

N-아세틸화 및/또는 C-아미드화를 수행하거나, 수행하지 않으면서, 선형 펩티드의 합성법에 따라, 당업계에 주지된 다양한 기법 중 임의의 것에 의해 고리화를 달성할 수 있다. 한 실시양태 내에서, 반응성 아미노산 측쇄 사이에 결합이 생성될 수 있다. 예를 들어, 다양한 방법 중 임의의 것을 사용하여 펩티드를 산화시킴으로써 2개의 티올을 함유하는 잔기를 포함하는 선형 펩티드로부터 디술피드 가교가 형성될 수 있다. 상기 한 방법 내에서, 티올의 공기 산화는 염기성 또는 중성의 수성 매질을 사용하여 수일 동안에 걸쳐 디술피드 연결을 생성할 수 있다. 응집 및 분자간 부반응을 최소화시키기 위해 펩티드는 높은 희석률로 사용된다. 대안적으로, 강력한 산화제, 예컨대 I₂ 및 K₃Fe(CN)₆은 디술피드 연결을 형성하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 Met, Tyr, Trp 또는 His의 감수성을 띤 측쇄가 산화되지 않도록 주의를 기울여야 한다는 것을 이해할 것이다. 추가의 실시양태 내에서, 고리화는 아미드 결합 형성에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 결합은 말단 관능기 (즉, 고리화 이전의 선형 펩티드의 아미노 및 카르복시 말단) 사이에서 형성될 수 있다. 또 다른 상기 실시양태 내에서, 선형 펩티드는 D-아미노산을 포함한다. 대안적으로, 고리화는 N-말단 아세틸 기 및/또는 C-말단 아미드를 사용하거나, 사용하지 않고, 한 말단과 잔기 측쇄를 연결함으로써, 또는 두 측쇄를 사용함으로써 달성될 수 있다. 락탐 결합을 형성할 수 있는 잔기로는 리신, 오르니틴 (Orn), α-아미노 아디프산, m-아미노메틸벤조산, α,β-디아미노프로피온산, 글루타메이트 또는 아스파르테이트를 포함한다. 아미드 결합을 형성하는 방법은 일반적으로 당업계에 주지되어 있다. 상기의 한 방법 내에서, 카르보디이미드-매개 락탐 형성은 카르복실산과 DCC, DIC, EDAC 또는 DCCI의 반응에 의해 달성될 수 있고, 이를 통해 O-아실우레아가 형성되며, 이는 유리 아미노 기와 즉시 반응함으로써 고리화를 완성할 수 있다. 대안적으로, 고리화는 반응성 아지드 중간체가 히드라지드를 통해 알킬 에스테르로부터 생성되는 것인, 아지드 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 고리화는 활성화된 에스테르를 사용하여 달성될 수 있다. 에스테르의 알콕시 탄소 상에 전자 흡인 치환기가 존재하면, 아미노분해에 대한 그의 감수성은 증가하게 된다. p-니트로페놀, N-히드록시 화합물 및 폴리할로겐화된 페놀의 에스테르의 높은 반응성을 통해 아미드 결합의 합성에 유용한 상기 "활성 에스테르"가 제조되었다. 추가의 실시양태 내에서, 티오에테르 연결은 티올 함유 잔기의 측쇄와 적절하게 유도체화된 α-아미노산의 측쇄 사이에서 형성될 수 있다. 일례로, 리신 측쇄는 카르보디이미드 커플링 방법 (DCC, EDAC)을 통해 브로모아세트산에 커플링될 수 있고, 이어서 상기 언급된 티올 함유 잔기 중 임의의 것의 측쇄와 반응함으로써 티오에테르 연결을 형성할 수 있다. 디티오에테르를 형성하기 위해, 임의의 두 티올 함유 측쇄를 DMF 중에서 디브로모에탄 및 디이소프로필아민과 반응시킬 수 있다.

펩티드의 하위서열 중 천연 아미노산을 비-자연 발생 아미노산으로 치환시키는 것 또한 단백질 분해에 대한 내성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 치환은 생물학적 활성에는 영향을 미치지 않으면서 N-말단에 작용하는 엑소펩티다제에 의한 단백질 분해에 대한 내성을 부여할 수 있다. 비-자연 발생 아미노산의 예로는 α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, C-α-메틸 아미노산, β-아미노산, 및 β- 메틸 아미노산을 포함한다. 본 발명에 유용한 아미노산 유사체로는 β-알라닌, 노르발린, 노르류신, 4-아미노부티르산, 오르니틴, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 시스테산, 시클로헥실알라닌, 2-아미노이소부티르산, 6-아미노헥산산, t-부틸글리신, 페닐글리신, o-포스포세린, N-아세틸 세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘 및 다른 비정규 아미노산을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 비-자연 발생 아미노산을 이용하여 펩티드를 합성하는 것은 당업계에서 통상적인 것이다.

펩티드의 N-말단 또는 C-말단 잔기에 작용하는 펩티다제에 대한 내성을 부여하는 또 다른 효과적인 접근법은 펩티드 말단에 화학기를 부가하여 변형된 펩티드가 더 이상 상기 펩티다제에 대한 기질이 되지 않도록 하는 것이다. 상기와 같은 화학적 변형은 한쪽 말단 또는 양 말단 모두에서의 펩티드 글리코실화이다. 특정의 화학적 변형, 특히 N-말단 글리코실화는 인간 혈청에서 펩티드의 안정성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Powell et al., Pharm . Res. 10: 1268-1273 (1993)]). 혈청 안정성을 증진시키는 다른 화학적 변형으로는 1 내지 20개의 탄소로 이루어진 저급 알킬로 구성된 N-말단 알킬 기, 예컨대 아세틸 기의 부가, 및/또는 C-말단 아미드 또는 치환된 아미드 기의 부가를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히, 본 발명은 N-말단 아세틸 기 및/또는 C-말단 아미드 기를 보유하는 펩티드로 구성된 변형된 펩티드를 포함한다.

Ang(1-7) 폴리펩티드는 또한 일반적으로는 펩티드의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티를 포함하는 다른 유형의 펩티드 유도체를 포함하되, 단 상기 유도체는 펩티드의 원하는 기능적 활성을 유지하는 것이다. 상기 유도체의 일례로 (1) 아실 기가 알카노일 기 (예컨대, 아세틸, 헥사노일, 옥타노일), 아로일 기 (예컨대, 벤조일) 또는 차단 기 예컨대, F-moc (플루오레닐메틸-O-CO-)일 수 있는, 아미노 말단의, 또는 또 다른 유리 아미노 기의 N-아실 유도체; (2) 카르복시 말단의, 또는 또 다른 유리 카르복시 또는 히드록실 기의 에스테르; (3) 암모니아 또는 적합한 아민과의 반응에 의해 제조된 카르복시-말단의, 또는 또 다른 유리 카르복실 기의 아미드; (4) 인산화된 유도체; (5) 항체 또는 다른 생물학적 리간드 및 다른 유형의 유도체에 접합된 유도체; 및 (6) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 쇄에 접합된 유도체를 포함한다.

Ang(1-7) 폴리펩티드 또는 Ang(1-7) 폴리펩티드의 유사체 또는 유도체는 합성 (예컨대, 전용 고체상 합성법, 부분적 고체상 합성법, 단편 축합법, 고전적 용액 합성법, 천연-화학적 라이게이션법) 및 재조합 기법을 비롯한, 당업자에게 공지된 임의의 펩티드 합성 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 펩티드 유도체는 고체상 펩티드 합성법에 의해 수득될 수 있는데, 상기 합성법은 간략하면, C-말단 아미노산의 카르복실 기를 수지 (예컨대, 벤즈히드릴아민 수지, 클로로메틸화된 수지, 히드록시메틸 수지)에 커플링시킨 후, 연속하여 N-알파 보호된 아미노산을 첨가하는 것으로 구성된다. 보호기는 당업계에 공지되어 있는 것과 같은 임의의 기일 수 있다. 각각의 새 아미노산을 성장 쇄에 첨가하기 전, 쇄에 첨가된 이전 아미노산의 보호기를 제거한다. 상기 고체상 합성은 예를 들어, 문헌 [Lubell et al. "Peptides" Science of Synthesis 21.11, Chemistry of Amides. Thieme, Stuttgart, 713-809 (2005)]에 의해 리뷰된 기법에 의해 [Merrifield, J. Am. Chem . Soc . 85: 2149 (1964)]; [Vale et al., Science 213: 1394-1397 (1981)], 미국 특허 번호 4,305, 872 및 4,316,891, [Bodonsky et al., Chem . Ind. (London), 38: 1597 (1966)]; 및 [Pietta and Marshall, Chem . Comm . 650 (1970)]에 의해 개시되어 있다. 아미노산을 적절한 수지에 커플링시키는 것 또한 당업계에 주지되어 있고, 이는 미국 특허 번호 4,244,946 (문헌 [Houver-Weyl, Methods of Organic Chemistry. Vol E22a. Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Murray Goodman, Editor-in-Chief, Thieme. Stuttgart. New York 2002]에 리뷰)에 개시되어 있다

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 과학 용어 및 기술 용어, 및 명명법은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상 이해하는 것과 같은 의미를 가진다. 일반적으로, 세포 배양법, 감염, 분자 생물학 방법 등은 당업계에서 사용되는 일반적인 방법이다. 상기 표준 기법은 참조 매뉴얼, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2001]에서 살펴볼 수 있다.

Ang(1-7) 폴리펩티드 또는 유사체 또는 유도체를 제조하는 임의의 공정 동안, 임의의 관심 분자 상의 감수성인 반응성 기를 보호하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 종래 보호기, 예컨대 문헌 [Protective Groups In Organic Synthesis by T.W. Greene & P.G.M. Wuts, 1991, John Wiley and Sons, New-York]; 및 [Peptides: chemistry and Biology by Sewald and Jakubke, 2002, Wiley-VCH, Wheinheim p.142]에 기술되어 있는 것에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 알파 아미노 보호기로는 아실형 보호기 (예컨대, 트리플루오로아세틸, 포르밀, 아세틸), 지방족 우레탄 보호기 (예컨대, t-부틸옥시카르보닐 (BOC), 시클로헥실옥시카르보닐), 방향족 우레탄형 보호기 (예컨대, 플루오레닐-9-메톡시-카르보닐 (Fmoc), 벤질옥시카르보닐 (Cbz), Cbz 유도체 및 알킬형 보호기 (예컨대, 트리페닐 메틸, 벤질)를 포함한다. 아미노산 측쇄 보호기로는 벤질 (Thr 및 Ser에 대해), Cbz (Tyr, Thr, Ser, Arg, Lys), 메틸 에틸, 시클로헥실 (Asp, His), Boc (Arg, His, Cys) 등을 포함한다. 보호기는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 편리한 후속 단계에서 제거될 수 있다.

추가로, Ang(1-7) 폴리펩티드, 또는 Ang (1-7) 폴리펩티드 유사체 또는 유도체는 유기상에서 FMOC 프로토콜에 따라 보호기를 이용하여 합성될 수 있다. 바람직하게, 펩티드를 C18 크로마토그래피 칼럼 상에서의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 70% 수율로 정제하고, 10-60%의 아세토니트릴 구배로 용리시킨다. 펩티드의 분자량은 (문헌 [Fields, G.B. "Solid-Phase Peptide Synthesis" Methods in Enzymology . Vol. 289, Academic Press, 1997]에 리뷰됨) 질량 분광측정법에 의해 확인할 수 있다.

대안적으로, Ang(1-7) 폴리펩티드, 또는 Ang(1-7) 폴리펩티드 유사체 또는 유도체는 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 재조합 시스템에서 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 동일의 폴리펩티드 내에 상기 기술된 변형 중 1개 초과의 것을 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

본원에 기술된 Ang(1-7) 폴리펩티드, 유사체 또는 유도체는 또한 섬유화 장애를 앓는 대상체, 또는 섬유증에 걸리기 쉬운 대상체를 치료하기 위한 제약 조성물로 제제화될 수 있다.

예시적인 안지오텐신 (1-7), 유사체 및/또는 유도체

선형 안지오텐신 (1-7) 펩티드 및 펩티드 유사체 및 유도체

본원에서 사용되는 바, "안지오텐신 (1-7) 펩티드"라는 용어는 자연 발생 안지오텐신 (1-7) 및 자연 발생 안지오텐신 (1-7)의 임의의 기능적 등가물, 유사체 또는 유도체 둘 다를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "펩티드" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 선형 및 시클릭 펩티드 둘 다를 포함한다. "안지오텐신 (1-7)," "안지오텐신 (1-7)," 및 "Ang-(1-7)"이라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.

자연 발생 안지오텐신 (1-7)

(Ang-(1-7)로도 지칭되는) 자연 발생 안지오텐신 (1-7)은 하기 제시된 7개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다:

Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷ (서열 1).

이는 레닌-안지오텐신계의 일부이며, 주로 간에 의해 구성적으로 생산되고 순환 내로 방출되는 α-2-글로불린인, 안지오텐시노겐으로도 알려져 있는 전구체로부터 전환된 것이다. 안지오텐시노겐은 세르핀 패밀리의 구성원이고, 이는 레닌 기질로서도 알려져 있다. 인간 안지오텐시노겐의 길이는 452개의 아미노산 길이이지만, 다른 종은 다양한 크기의 안지오텐시노겐을 가진다. 전형적으로, 처음 12개의 아미노산이 안지오텐신 활성에 가장 중요하다:

Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷-Phe⁸-His⁹-Leu¹⁰-Val¹¹-Ile¹² (서열 4).

상이한 유형의 안지오텐신은 다양한 효소의 작용에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 안지오텐신 (1-7)은 안지오텐신-전환 효소 2 (ACE2)의 작용에 의해 생성된 것이다.

Ang-(1-7)은 Mas 수용체에 대한 내인성 리간드이다. Mas 수용체는 7개의 막횡단 관통 영역을 포함하는 G 단백질 커플링된 수용체이다. 본원에서 사용되는 바, "안지오텐신 (1-7) 수용체"라는 용어는 G 단백질 커플링된 Mas 수용체를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "자연 발생 안지오텐신 (1-7)"이라는 용어는 천연 공급원으로부터 정제된 임의의 안지오텐신 (1-7) 펩티드, 및 자연 발생 안지오텐신 (1-7)과 동일한 아미노산 서열을 가지는, 임의의 재조합적으로 제조된 또는 화학적으로 합성된 펩티드를 포함한다.

다양한 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 안지오텐신 (1-7) 펩티드는 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile, Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His, 또는 Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro일 수 있다. A(1-7)은 예컨대, 4 및 7번 위치 사이에 티오에테르 가교를 포함하는 A(1-7)을 포함하나, 이에 한정되지 않는, WO2008/018792에 기술된 것과 같이 선형일 수 있거나, 임의의 적합한 방식으로 고리화될 수 있다.

Ang -(1-7)의 기능적 등가물, 유사체 또는 유도체

일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 안지오텐신 (1-7) 펩티드는 자연 발생 Ang-(1-7)의 기능적 등가물이다. 본원에서 사용되는 바, 자연 발생 Ang-(1-7)의 기능적 등가물이란 자연 발생 Ang-(1-7)과 아미노산 서열 동일성을 공유하고, 자연 발생 Ang-(1-7)과 실질적으로 동일하거나 유사한 활성을 유지하는 임의의 펩티드를 의미한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 자연 발생 Ang-(1-7)의 기능적 등가물은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정되는 혈관신생촉진 활성, 또는 혈관신생에 긍정적인 영향을 미치는 활성, 예컨대 일산화질소 방출, 혈관확장, 내피 기능 개선, 항이뇨, 또는 본원에서 논의된 다른 특성들 중 하나를 가진다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 자연 발생 Ang-(1-7)의 기능적 등가물은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 다양한 검정법을 사용하여 측정되는 바, 안지오텐신 (1-7) 수용체 (예컨대, G 단백질-커플링된 Mas 수용체)에 결합할 수 있거나, 그를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, Ang-(1-7)의 기능적 등가물은 또한 안지오텐신 (1-7) 유사체 또는 유도체, 또는 기능적 유도체로도 지칭된다.

전형적으로, 안지오텐신 (1-7)의 기능적 등가물은 자연 발생 Ang-(1-7)와 아미노산 서열 유사성을 공유한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 Ang-(1-7)의 기능적 등가물은 자연 발생 Ang-(1-7)에 있는 7개의 아미노산으로부터 3개 이상 (예컨대, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상)의 아미노산을 포함하는 서열을 포함하며, 여기서 3개 이상 (예컨대, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상)의 아미노산은 그가 자연 발생 Ang-(1-7)에 존재하는 것과 같이 그의 상대적인 위치 및/또는 이격 간격을 유지한다.

일부 실시양태에서, Ang-(1-7)의 기능적 등가물은 또한 자연 발생 Ang-(1-7)의 아미노산 서열과 약 50% 이상 (예컨대, 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 그 초과) 동일한 서열을 포함하는 임의의 펩티드를 포함한다. 아미노산 서열 동일성(%)은 아미노산 서열을 정렬함으로써 측정될 수 있다. 당업계의 기술 범위 내에 포함되는 각종 방식으로, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 아미노산 서열을 정렬시킬 수 있다. 당업자는 비교되는 전장의 서열에 걸쳐 최대로 정렬될 수 있도록 하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한, 정렬을 측정하는 데 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 바람직하게, 아미노산 서열 동일성을 측정하는 데 WU-BLAST-2 소프트웨어가 사용된다 (문헌 [Altschul et al, Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)]; http://blast.wustl/edu/blast/README.html). WU-BLAST-2는 수개의 검색 파라미터를 사용하는 데, 그들 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 조정가능한 파라미터는 하기 값으로 설정된다: 오버랩 길이=1, 오버랩 분율=0.125, 워드 역치 (T)=11. HSP 점수 (S) 및 HSP S2 파라미터는 동적 값이고, 특정 서열의 조성물에 따라 프로그램 그 자체에 의해 확립되지만, 최소 값은 조정가능할 수 있고, 상기 명시된 바와 같이 설정된다.

일부 실시양태에서, Ang-(1-7)의 기능적 등가물, 유사체 또는 유도체는 자연 발생 Ang-(1-7)의 단편이다. 일부 실시양태에서, Ang-(1-7)의 기능적 등가물, 유사체 또는 유도체는 자연 발생 Ang-(1-7)에 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함한다. Ang-(1-7) 기능적 등가물, 유사체 또는 유도체는 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 아미노산 서열을 변경시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 Ang-(1-7) (서열 1)의 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능적 등가물로서 작용하는, 극성이 유사한 또 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있고, 이로써 침묵 변경이 이루어진다. 서열 내의 아미노산에 대한 치환은 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함한다. 비극성 (소수성) 아미노산으로는 류신, 이소류신, 알라닌, 페닐알라닌, 발린, 프롤린, 트립토판, 및 메티오닌을 포함한다. 비하전된 극성 아미노산으로는 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 아미노산 글리신은 비극성 아미노산 패밀리 또는 비하전된 (중성) 극성 아미노산 패밀리에 포함될 수 있다. 아미노산 패밀리 내에서의 치환은 일반적으로 보존적 치환인 것으로 이해된다. 예를 들어, 펩티드 억제제의 아미노산 서열은 변형 또는 치환될 수 있다.

Ang-(1-7) 기능적 등가물, 유사체 및 유도체의 예는 하기 표제 "예시적인 안지오텐신(1-7) 펩티드" 섹션에 기술되어 있다.

안지오텐신 (1-7) 펩티드의 길이는 임의의 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 안지오텐신 (1-7) 펩티드는 예를 들어, 4-25개의 아미노산 (예컨대, 4-20, 4-15, 4-14, 4-13, 4-12, 4-11, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선형 펩티드는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 아미노산을 포함한다.

일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 펩티드는 프로테아제 내성, 혈청 안정성 및/또는 생체이용률을 증가시키기 위해 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 변형은 PEG화, 아세틸화, 글리코실화, 비오티닐화, D-아미노산 및/또는 비천연 아미노산으로의 치환, 및/또는 폡티드의 고리화로부터 선택된다.

예시적인 안지오텐신 (1-7) 펩티드

특정 측면에서, 본 발명은 선형 안지오텐신 (1-7) 펩티드를 제공한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 자연 발생 Ang-(1-7)의 구조는 하기와 같다:

Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷ (서열 1).

본 발명의 펩티드 및 펩티드 유사체, 또는 그의 제약상 허용되는 염은 일반적으로 하기 서열로 제시될 수 있다:

Xaa¹-Xaa²-Xaa³-Xaa⁴-Xaa⁵-Xaa⁶-Xaa⁷ (서열 5).

Xaa¹은 임의의 아미노산 또는 디카르복실산이다. 특정 실시양태에서, Xaa¹은 Asp, Glu, Asn, Acpc (1-아미노시클로펜탄 카르복실산), Ala, Me₂Gly (N,N-디메틸글리신), Pro, Bet (베타인, 1-카르복시-N,N,N-트리메틸메탄아미늄 히드록시드), Glu, Gly, Asp, Sar (사르코신) 또는 Suc (숙신산)이다. 특성 실시양태에서, Xaa¹은 음으로 하전된 아미노산, 예컨대 Asp 또는 Glu, 전형적으로 Asp이다.

Xaa²는 Arg, Lys, Ala, Cit (시트룰린), Orn (오르니틴), 아세틸화된 Ser, Sar, D-Arg 및 D-Lys이다. 특정 실시양태에서, Xaa²는 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 Arg 또는 Lys, 전형적으로 Arg이다.

Xaa³은 Val, Ala, Leu, Nle (노르류신), Ile, Gly, Lys, Pro, 히드록시Pro (히드록시프롤린), Aib (2-아미노이소부티르산), Acpc 또는 Tyr이다. 특정 실시양태에서, Xaa³은 지방족 아미노산, 예컨대 Val, Leu, Ile 또는 Nle, 전형적으로 Val 또는 Nle이다.

Xaa⁴는 Tyr, Tyr(PO₃), Thr, Ser, 호모Ser (호모세린), azaTyr (aza-α¹-호모-L-티로신) 또는 Ala이다. 특정 실시양태에서, Xaa⁴는 히드록실-치환된 아미노산, 예컨대 Tyr, Ser 또는 Thr, 전형적으로 Tyr이다.

Xaa⁵는 Ile, Ala, Leu, 노르Leu, Val 또는 Gly이다. 특정 실시양태에서, Xaa⁵는 지방족 아미노산, 예컨대 Val, Leu, Ile 또는 Nle, 전형적으로 Ile이다.

Xaa⁶은 His, Arg 또는 6-NH₂-Phe (6-아미노페닐알라닌)이다. 특정 실시양태에서, Xaa⁶은 전체적으로 또는 부분적으로 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 Arg 또는 His이다.

Xaa⁷은 Cys, Pro 또는 Ala이다.

특정 실시양태에서, Xaa¹-Xaa⁷ 중 1개 이상의 것은 자연 발생 Ang-(1-7) 중의 상응하는 아미노산과 동일하다. 특성 실시양태에서, Xaa¹-Xaa⁷ 중 1개 또는 2개를 제외한 나머지는 모두 자연 발생 Ang-(1-7) 중의 상응하는 아미노산과 동일하다. 다른 실시양태에서, Xaa¹-Xaa⁶ 모두 자연 발생 Ang-(1-7) 중의 상응하는 아미노산과 동일하다.

특정 실시양태에서, Xaa³은 Nle이다. Xaa³이 Nle일 때, Xaa¹-Xaa² 및 Xaa^{4 -7} 중 1개 이상의 것은 임의로 자연 발생 Ang-(1-7) 중의 상응하는 아미노산과 동일하다. 특성 실시양태에서, Xaa¹-Xaa² 및 Xaa^{4 -7} 중 1개 또는 2개를 제외한 나머지는 모두 자연 발생 Ang-(1-7) 중의 상응하는 아미노산과 동일하다. 다른 실시양태에서, Xaa¹-Xaa² 및 Xaa^{4 -7} 모두 자연 발생 Ang-(1-7) 중의 상응하는 아미노산과 동일하며, 이로써, 아미노산 서열: Asp-Arg-Nle-Tyr-Ile-His-Pro (서열 2)이 생성된다.

특정 실시양태에서, 펩티드는 아미노산 서열 Asp-Arg-Val-Ser-Ile-His-Cys (서열 3) 또는 Asp-Arg-Val-Ser-Ile-His-Cys (서열 6)를 가진다.

예시적인 시클릭 안지오텐신 (1-7) 펩티드

특정 측면에서, 본 발명은 예컨대, Ang 중 위치 Tyr⁴ 및 Pro⁷에 상응하는 아미노산 측쇄 사이에 연결을 포함하는 시클릭 안지오텐신 (1-7) (Ang-(1-7)) 펩티드 유사체를 제공한다. 상기 펩티드 유사체는 전형적으로 7개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있지만, 이는 또한 절단가능한 서열도 포함할 수 있다. 하기에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명은 단편, 및 하나 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 치환된 유사체 (단편 포함)를 포함한다. 상기 단편 또는 유사체의 일례는, 연결이 Ser⁴와 Cys⁷ 사이에 형성된 것인, Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷ (서열 3)이다.

비록 하기 섹션은 4 및 7번 위치의 잔기를 연결하는 티오에테르 결합에 의해 본 발명의 측면을 기술하지만, (상기 기술된 바와 같은) 다른 연결이 티오에테르 가교를 대신할 수 있고, 다른 잔기는 고리화될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 티오에테르 가교는 또한 모노술피드 가교로, 또는 Ala-S-Ala의 경우, 란티오닌 가교로 지칭된다. 티오에테르 가교 함유 펩티드는 하기 화학식 I 내지 화학식 III 중 하나를 가지는 2개의 아미노산에 의해 형성될 수 있다:

<화학식 I>

<화학식 II>

<화학식 III>

상기 식에서,

R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 -H, 알킬 (예컨대, C₁-C₆ 알킬, C₁-C₄ 알킬) 또는 아르알킬 기이고, 여기서 알킬 및 아르알킬 기는 임의로 하나 이상의 할로겐, -OH 또는 -NRR' 기 (여기서, R 및 R'은 독립적으로 -H 또는 C₁-C₄ 알킬이다)로 치환된다. 특정 실시양태에서, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 각각 독립적으로 -H 또는 -CH₃이고, 예컨대 모두 -H이다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 화학식 I에 따른 티오에테르 가교를 포함하는 Ang 유사체 또는 유도체를 제공한다. 전형적으로, R¹, R², R³ 및 R⁴는 독립적으로 -H 및 -CH₃으로부터 선택된다. 화학식 I에 따른 티오에테르 가교를 포함하는 펩티드는 란티바이오틱 효소에 의해, 또는 디술피드의 황 압출에 의해 제조될 수 있다. 일례에서, 황이 압출되는 디술피드는 4번 위치의 D-시스테인과 7번 위치의 L-시스테인에 의해, 또는 4번 위치의 D-시스테인과 7번 위치의 L-페니실라민에 의해 형성될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Galande, Trent and Spatola (2003) Biopolymers 71, 534-551] 참조).

다른 실시양태에서, 두 아미노산의 연결이 화학식 II 또는 화학식 III에 도시된 가교일 수 있다. 화학식 II에 따른 티오에테르 가교를 포함하는 펩티드는 예를 들어, 4번 위치의 D-호모시스테인과 7번 위치의 L-시스테인에 의해 형성된 디술피드의 황 압출에 의해 제조될 수 있다. 유사하게, 화학식 III의 티오에테르 가교를 포함하는 펩티드는 예를 들어, 4번 위치의 D-시스테인과 7번 위치의 L-호모시스테인에 의해 형성된 디술피드의 황 압출에 의해 제조될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 Ang 유사체 및 유도체는 다양한 길이 및 아미노산 조성을 가진다. 본 발명의 Ang 유사체 및 유도체는 바람직하게 생물학적 활성을 가지거나, (예컨대, 10개의 아미노산을 가지는 안지오텐신(I)이 2개의 아미노산 절단에 의해 활성 단편으로 전환되는 것과 같은) 단백질 분해 방식으로 활성화될 수 있는 불활성 전구체 분자이다. Ang 유사체 또는 유도체의 길이는 다양할 수 있지만, 전형적으로는 3-7개의 Nle-티오에테르-고리 구조를 포함하는 "코어" 오량체 절편이 포함되는 한, 약 5 내지 10개의 아미노산 길이이다. 본 발명의 유사체 또는 유도체의 아미노산 서열은, 전형적으로는 생물학적 활성이거나, 단백질 분해 방식으로 활성화될 수 있는 한, 달라질 수 있다. 유사체 또는 유도체의 생물학적 활성은 방사성리간드 결합 연구, 시험관내 세포 활성화 검정법 및 생체내 실험을 비롯한, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Godeny and Sayeski, (2006) Am . J. Physiol . Cell . Physiol . 291:C1297-1307]; [Sarr et al., Cardiovasc . Res . (2006) 71:794-802]; 및 [Koziarz et al., (1933) Gen . Pharmacol. 24:705-713]을 참조할 수 있다.

대표적인 시클릭 Ang(1-7) 유사체는 천연 Ang(1-7)로부터 유도된, [Cyc^{4 -7}]Ang(1-7)로 지정된 4,7-고리화 유사체 (Asp¹-Arg²-Val³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷, 서열 7)를 포함한다. 상기 유사체는 예를 들어, Cyc⁴ 및 Cyc⁷이 함께 화학식 I에 제시되어 있는 경우, 예컨대 R¹-R⁴가 각각 -H 또는 -CH₃, 전형적으로 -H인 경우와 같이, 화학식 I-III에 Cyc^{4 -7} 모이어티로서 제시된 티오에테르 가교 중 하나를 가질 수 있다.

4 및 7번 위치의 아미노산은 자연 발생 펩티드와 동일하거나 상이할 수 있지만, 단 전형적으로 유사체는 생물학적 기능은 유지한다. 일례는 Asp-Arg-Val-Ser-Ile-His-Cys (서열 3)이다. 불활성 전구체의 경우, 생물학적 기능이란 상기 전구체를 생물학적 활성인 단편(예컨대, Ang(1-7))으로 절단할 수 있는 안지오텐신-전환 효소에 대한 유사체의 감수성, 또는 단편 그 자체의 생물학적 활성 중 하나 또는 그 둘 다를 의미한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 Ang 유사체는 하나 이상의 자연 발생 안지오텐신 화합물의 고유 기능을 가지지는 않지만, 그의 효과는 억제시킨다.

오직 펩티드의 길이만 다른 Ang 유사체 및 유도체는 하기를 포함한다:

천연 Ang-(1-7)로부터 유도된, [Cyc^{4 -7}]Ang-(1-7)로 지정된 4,7-고리화 유사체 (Asp¹-Arg²-Val³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷, 서열 7),

천연 안지오텐신 I (Ang-(1-10))로부터 유도된, [Nle³, Cyc^{4 -7}]Ang-(1-10)으로 지정된 4,7-고리화 유사체 (Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸-His⁹-Leu¹⁰, 서열 8);

천연 안지오텐신 II (Ang-(1-8))로부터 유도된, [Nle³, Cyc^{4 -7}]Ang-(1-8)로 지정된 4,7-고리화 유사체 (Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸, 서열 9);

천연 안지오텐신 III (Ang-(2-8))로부터 유도된, [Nle³, Cyc^{4 -7}]Ang-(2-8)로 지정된 4,7-고리화 유사체 (Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸, 서열 10);

천연 안지오텐신 IV (Ang-(3-8))로부터 유도된, [Nle³, Cyc^{4 -7}]Ang-(3-8)로 지정된 4,7-고리화 유사체 (Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸, 서열 11);

천연 Ang-(1-7)로부터 유도된, [Nle³, Cyc^{4 -7}]Ang-(1-7)로 지정된 4,7-고리화 유사체 (Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷, 서열 12); 및

천연 Ang-(1-9)로부터 유도된, [Nle³, Cyc^{4 -7}]Ang-(1-9)로 지정된 4,7-고리화 유사체 (Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸-His⁹, 서열 13).

상기 유사체는 예를 들어, Cyc⁴ 및 Cyc⁷이 화학식 I에 제시되어 있는 경우, 예컨대 R¹-R⁴가 각각 -H 또는 -CH₃, 전형적으로 -H인 경우와 같이, 화학식 I-III에 Cyc^4-7 모이어티로서 제시된 티오에테르 가교 중 하나를 가질 수 있다.

천연 안지오텐신 펩티드의 아미노산 서열과 비교하였을 때, Cyc^{4 -7} 유사체의 4 및 7번에 있는 아미노산은 상기 제시된 티오에테르 고리 구조가 도입될 수 있도록 변형된다. Ang 유사체의 길이 이외에도, 3, 4 및 7번 이외의 위치에 있는 아미노산은 자연 발생 펩티드와 동일하거나 상이할 수 있지만, 단 전형적으로 유사체는 생물학적 기능은 유지한다. [Cyc^{4 -7} ]Ang-(1-10)과 같이, 유사체가 불활성 전구체인 경우, 생물학적 기능이란 상기 전구체를 생물학적 활성인 단편(예컨대, Ang-(1-8) 또는 Ang-(1-7))으로 절단할 수 있는 안지오텐신-전환 효소에 대한 유상체의 감수성, 또는 단편 그 자체의 생물학적 활성 중 하나 또는 그 둘 다를 의미한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 Ang 유사체 또는 유도체는 하나 이상의 자연 발생 안지오텐신 화합물의 고유 기능을 가지지는 않지만, 그의 효과는 억제시킨다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 Ang 유사체는 하기 화학식 IV로 제시된다:

<화학식 IV>

Xaa¹-Xaa²-Xaa³-Cyc⁴-Xaa⁵-Xaa⁶-Cyc⁷ (서열 14)

Xaa¹은 임의의 아미노산이지만, 전형적으로는 음으로 하전된 아미노산, 예컨대 Glu 또는 Asp, 더욱 전형적으로는 Asp이다.

Xaa²는 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 Arg 또는 Lys, 전형적으로 Arg이다.

Xaa³은 지방족 아미노산, 예컨대 Leu, Ile 또는 Val, 전형적으로 Val이다.

Cyc⁴는 Cyc⁷과 함께 티오에테르 가교를 형성한다. Cyc⁴는 D-입체이성질체 및/또는 L-입체이성질체, 전형적으로는 D-입체이성질체일 수 있다. (Cyc⁷과 함께) Cyc⁴의 예가 화학식 I, II 및 III에 제시되어 있다. 전형적으로, 화학식 I, II 및 III 중의 R 기는 -H 또는 -CH₃, 특히 -H이다.

Xaa⁵는 지방족 아미노산, 예컨대 Leu, Ile 또는 Val, 전형적으로 Ile이다.

Xaa⁶은 His이다.

Cyc⁷은 예컨대, 화학식 I, II 및 III에서와 같이 Cyc⁴와 함께 티오에테르 가교를 형성한다. Cyc⁷은 D-입체이성질체 및/또는 L-입체이성질체, 전형적으로는 L-입체이성질체일 수 있다. (Cyc⁴와 함께) Cyc⁷의 예가 화학식 I, II, III 및 IV에 제시되어 있다. 전형적으로, 화학식 I, II, III 및 IV 중의 R 기는 -H 또는 -CH₃, 특히 -H이다.

특정 실시양태에서, (Cyc⁴ 및 Cyc⁷을 제외한) Xaa¹-Xaa⁶ 중 1개 이상의 것은 자연 발생 Ang-(1-7) 중의 상응하는 아미노산과 동일하다. 특성 실시양태에서, Xaa¹-Xaa⁶ 중 1개 또는 2개를 제외한 나머지는 모두 자연 발생 Ang-(1-7) 중의 상응하는 아미노산과 동일하다. 다른 실시양태에서, Xaa¹-Xaa⁶ 모두 자연 발생 Ang-(1-7) 중의 상응하는 아미노산과 동일하다.

특정 실시양태에서, Cyc⁴ 및 Cyc⁷은 독립적으로 Abu (2-아미노부티르산) 및 Ala (알라닌)로부터 선택되며, 여기서 Ala는 1개 이상의 위치에 존재한다. 따라서, 시클릭 유사체는 -Ala⁴-S-Ala⁷- (화학식 I, 여기서 R¹-R⁴는 각각 -H이다); -Ala⁴-S-Abu⁷- (화학식 I: R¹-R³은 -H이고, R⁴는 -CH₃이다) 또는 -Abu⁴-S-Ala⁷- (화학식 I: R¹, R³ 및 R⁴는 -H이고, R²는 -CH₃이다)에 의해 형성된 티오에테르 연결을 가질 수 있다. 시클릭 유사체의 구체적인 예로는 -Abu⁴-S-Ala⁷- 또는 -Ala⁴-S-Ala⁷- 연결을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조 다이어그램에 의해 제시되어 있는, 아미노산 서열 Asp-Arg-Val-Abu-Ile-His-Ala (서열 15) 또는 아미노산 서열 Asp-Arg-Val-Ala-Ile-His-Ala (서열 16)를 가지는, 4번 위치 및 7번 위치 사이에 티오에테르-가교를 가지는 Ang-(1-7) 유사체를 제공한다:

.

특정 실시양태에서, 본 발명의 Ang 유사체 또는 유도체는 하기 화학식 V로 제시된다:

<화학식 V>

Xaa¹-Xaa²-Nle³-Cyc⁴-Xaa⁵-Xaa⁶-Cyc⁷-Xaa⁸-Xaa⁹-Xaa¹⁰ (V, 서열 17).

상기 논의된 바와 같이, 특정 실시양태에서, Xaa^{1 ,} Xaa², Xaa⁸, Xaa⁹ 및 Xaa¹⁰ 중 1개 이상의 것이 존재하지 않는다. 예를 들어, (1) Xaa¹⁰은 존재하지 않거나, (2) Xaa⁹ 및 Xaa¹⁰은 존재하지 않거나, (3) Xaa⁸, Xaa⁹ 및 Xaa¹⁰은 존재하지 않거나, (4) Xaa¹은 존재하지 않거나, (5) Xaa¹ 및 Xaa¹⁰은 존재하지 않거나, (6) Xaa¹, Xaa⁹ 및 Xaa¹⁰은 존재하지 않거나, (7) Xaa¹, Xaa⁸, Xaa⁹ 및 Xaa¹⁰은 존재하지 않거나, (8) Xaa¹ 및 Xaa²는 존재하지 않거나, (9) Xaa¹, Xaa² 및 Xaa¹⁰은 존재하지 않거나, (10) Xaa¹, Xaa², Xaa⁹ 및 Xaa¹⁰은 존재하지 않거나, (11) Xaa¹, Xaa², Xaa⁸, Xaa⁹ 및 Xaa¹⁰은 존재하지 않는다. 상기 각 실시양태의 경우, 나머지 아미노산 값은 하기 기술되는 바와 같다.

존재할 경우, Xaa¹은 임의의 아미노산이지만, 전형적으로는 음으로 하전된 아미노산, 예컨대 Glu 또는 Asp, 더욱 전형적으로는 Asp이다.

존재할 경우, Xaa²는 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 Arg 또는 Lys, 전형적으로 Arg이다.

Nle³은 노르류신이다.

Cyc⁴는 Cyc⁷과 함께 티오에테르 가교를 형성한다. Cyc⁴는 D-입체이성질체 및/또는 L-입체이성질체, 전형적으로는 D-입체이성질체일 수 있다. (Cyc⁷과 함께) Cyc⁴의 예가 화학식 I, II 및 III에 제시되어 있다. 전형적으로, 화학식 I, II 및 III 중의 R 기는 -H 또는 -CH₃, 특히 -H이다.

Xaa⁵는 지방족 아미노산, 예컨대 Leu, Nle, Ile 또는 Val, 전형적으로 Ile이다.

Xaa⁶은 His이다.

Cyc⁷은 예컨대, 화학식 I, II 및 III에서와 같이 Cyc⁴와 함께 티오에테르 가교를 형성한다. Cyc⁷은 D-입체이성질체 및/또는 L-입체이성질체, 전형적으로는 L-입체이성질체일 수 있다. (Cyc⁴와 함께) Cyc⁷의 예가 화학식 I, II 및 III에 제시되어 있다. 전형적으로, 화학식 I, II 및 III 중의 R 기는 -H 또는 -CH₃, 특히 -H이다.

존재할 경우, Xaa⁸은 Pro 이외의 아미노산, 전형적으로는 Phe 또는 Ile이다. 특정 실시양태에서, Ile를 통해 Ang(1-8)의 억제제가 생성된다. 특정 실시양태에서, Phe는 Ang(1-8) 또는 Ang(1-10)의 생물학적 활성을 유지한다.

존재할 경우, Xaa⁹는 His이다.

존재할 경우, Xaa¹⁰은 지방족 잔기, 예를 들어 Ile, Val 또는 Leu, 전형적으로는 Leu이다.

특정 실시양태에서, Xaa¹-Xaa¹⁰ 중 1개 이상의 것 (Nle³, Cyc⁴ 및 Cyc⁷ 제외)은 자연 발생 Ang (Ang-(1-7), Ang(1-8), Ang(1-9), Ang(1-10), Ang(2-7), Ang(2-8), Ang(2-9), Ang(2-10), Ang(3-8), Ang(3-9) 및 Ang(3-10) 포함) 중의 상응하는 아미노산과 동일하다. 특성 실시양태에서, (존재하는 것에 대해) Xaa¹-Xaa¹⁰ 중 1개 또는 2개를 제외한 나머지는 모두 자연 발생 Ang 중의 상응하는 아미노산과 동일하다. 다른 실시양태에서, (존재하는 것에 대해) Xaa¹-Xaa¹⁰ 모두 자연 발생 Ang 중의 상응하는 아미노산과 동일하다.

특정 실시양태에서, Cyc⁴ 및 Cyc⁷은 독립적으로 Abu (2-아미노부티르산) 및 Ala (알라닌)로부터 선택되며, 여기서 Ala는 1개 이상의 위치에 존재한다. 따라서, -Ala⁴-S-Ala⁷- (화학식 I, 여기서 R¹-R⁴는 각각 -H이다); -Ala⁴-S-Abu⁷- (화학식 I: R¹-R³은 -H이고, R⁴는 -CH₃이다) 또는 -Abu⁴-S-Ala⁷- (화학식 I: R¹, R³ 및 R⁴는 -H이고, R²는 -CH₃이다)에 의해 형성된 티오에테르 연결을 포함하는 시클릭 유사체가 포함된다. 구체적인 시클릭 유사체는 -Abu⁴-S-Ala⁷- 또는 -Ala⁴-S-Ala⁷- 연결을 포함한다.

특히, 본 발명은 아미노산 서열 Asp-Arg-Nle-Abu-Ile-His-Ala (서열 18) 또는 아미노산 서열 Asp-Arg-Nle-Ala-Ile-His-Ala (서열 19)를 가지는, 4번 위치 및 7번 위치 사이에 티오에테르-가교를 가지는 Ang-(1-7) 유사체 또는 유도체를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 Ang-(1-8) 길항 활성을 가지는, 4번 위치 및 7번 위치 사이에 티오에테르-가교를 가지는 Ang-(1-8) 유사체 또는 유도체, 특히 아미노산 서열 Asp-Arg-Nle-Abu-Ile-His-Ala-Ile (서열 20), 아미노산 서열 Asp-Arg-Nle-Ala-Ile-His-Ala-Ile (서열 21) 또는 아미노산 서열 Asp-Arg-Nle-Abu-Ile-His-Ala-Ile (서열 22)를 가지는 Ang(1-8) 유사체 또는 유도체를 제공한다.

알킬 기는 완전하게 포화된, 직쇄 또는 분지형 비-방향족 탄화수소이다. 전형적으로, 직쇄 또는 분지형 알킬 기는 1 내지 약 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 약 10개를 가진다. 직쇄 또는 분지형 알킬 기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 헥실, 펜틸 및 옥틸을 포함한다. C₁-C₄ 직쇄 또는 분지형 알킬 기는 또한 "저급 알킬" 기로도 지칭된다.

아르알킬 기는 아릴 기에 의해 치환된 알킬 기이다. 방향족 (아릴) 기로는 카르보시클릭 방향족 기, 예컨대 페닐, 나프틸, 및 안트라실, 및 헤테로아릴 기, 예컨대 이미다졸릴, 티에닐, 푸릴, 피리딜, 피리미딜, 피라닐, 피라졸릴, 피롤릴, 피라지닐, 티아졸릴, 옥사졸릴, 및 테트라졸릴을 포함한다. 방향족 기는 또한 카르보시클릭 방향족 고리 또는 헤테로아릴 고리가 하나 이상의 다른 헤테로아릴 고리에 융합되어 있는 융합된 폴리시클릭 방향족 고리계를 포함한다. 그 예로는 벤조티에닐, 벤조푸릴, 인돌릴, 퀴놀리닐, 벤조티아졸, 벤족사졸, 벤즈이미다졸, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 및 이소인돌릴을 포함한다.

알케닐 기는 하나 이상의 이중 결합이 포함된 직쇄 또는 분지형 비-방향족 탄화수소이다. 전형적으로, 직쇄 또는 분지형 알케닐 기는 2 내지 약 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 2 내지 약 10개를 가진다. 직쇄 및 분지형 알케닐 기의 예로는 에테닐, n-프로페닐, 및 n-부테닐을 포함한다.

방향족 (아릴) 기는 카르보시클릭 방향족 기, 예컨대 페닐, 나프틸, 및 안트라실, 및 헤테로아릴 기, 예컨대 이미다졸릴, 티에닐, 푸릴, 피리딜, 피리미딜, 피라닐, 피라졸릴, 피롤릴, 피라지닐, 티아졸릴, 옥사졸릴, 및 테트라졸릴을 포함한다. 방향족 기는 또한 카르보시클릭 방향족 고리 또는 헤테로아릴 고리가 하나 이상의 다른 헤테로아릴 고리에 융합되어 있는 융합된 폴리시클릭 방향족 고리계를 포함한다. 그 예로는 벤조티에닐, 벤조푸릴, 인돌릴, 퀴놀리닐, 벤조티아졸, 벤족사졸, 벤즈이미다졸, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 및 이소인돌릴을 포함한다.

비-펩티드 유사체

본 발명은 또한 Ang(1-7)의 비-펩티드 유사체를 포함한다. 상기 유사체는 Ang(1-7)의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 일산화질소 방출, 혈관확장, 내피 기능 개선, 항이뇨, 또는 본원에서 논의된 다른 특성들 중 하나를 가진다.

비-펩티드 유사체 부류의 예로는 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제가 있다. 본원에서 사용되는 바, "안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제"라는 용어는 안지오텐신 (1-7) 수용체, 특히 G 단백질 커플링된 Mas 수용체의 기능에 긍정적 영향을 미치는 임의의 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제는 안지오텐신 (1-7) 수용체 (즉, Mas 수용체) 활성을 직접 또는 간접적으로 증진, 강화, 활성화 및/또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제는 안지오텐신 (1-7) 수용체 (즉, Mas 수용체)와 직접적으로 상호작용한다. 상기 효능제는 예컨대, 단백질, 화학적 화합물, 소형 분자, 핵산, 항체, 약물, 리간드, 또는 다른 작용제를 비롯한, 펩티드성 또는 비-펩티드성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제는 비-펩티드성 효능제이다.

안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제 부류의 일례는 1-(p-티에닐벤질)이미다졸이다. 상기 비-펩티드 안지오텐신 (1-7) 수용체, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 예는 하기 화학식 VI에 제시되어 있다:

<화학식 VI>

상기 식에서,

R¹은 할로겐, 히드록실, (C₁-C₄)-알콕시, (C₁-C₈)-알콕시 (여기서, 1 내지 6개의 탄소 원자가 헤테로원자 O, S, 또는 NH (바람직하게, O)로 치환), 포화된 시클릭 에테르로 치환된 (C₁-C₄)-알콕시, 테트라히드로피란 또는 테트라히드로푸란, O-(C₁-C₄)-알케닐, O-(C₁-C₄)-알킬아릴, 또는 할로겐, (C₁-C₃)-알킬, (C₁-C₃)-알콕시 및 트리플루오로메틸로부터 선택되는 치환기로 치환 또는 비치환된 아릴옥시이고;

R²는 CHO, COOH, 또는 (3) CO-O-(C₁-C₄)-알킬이고;

R³은 (C₁-C₄)-알킬 또는 아릴이고;

R⁴는 수소, 할로겐 (클로로, 브로모, 플루오로), 또는 (C₁-C₄)-알킬이고;

X는 산소 또는 황이고;

Y는 산소 또는 -NH-이고;

R⁵는 수소, (C₁-C₆)-알킬, 또는 (C₁-C₄)-알킬아릴이며, 여기서 Y가 -NH-일 때, R⁵는 수소이고;

R⁶은 (C₁-C₅)-알킬이다.

특정 실시양태에서, R²가 COOH 또는 CO-O-(C₁-C₄)- 알킬일 때, R¹은 할로겐이 아니다.

일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제는 하기 구조식으로 제시되는, AVE 0991, 5-포르밀-4-메톡시-2-페닐-1[[4-[2-(에틸아미노카르보닐술폰아미도)-5-이소부틸-3-티에닐]-페닐]-메틸]-이미다졸이다:

.

안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제 부류의 또 다른 일례는 p-티에닐벤질아미드이다. 상기 비-펩티드 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 예는 하기 구조식 VII로 제시된다:

<화학식 VII>

상기 식에서,

R¹은 NH₂, 할로겐, O-(C₁-C₃)-알킬, CO-O-(C₁-C₃)-알킬 및 CO₂H로부터 선택되는 라디칼에 의해 치환 또는 비치환된 (C₁-C₅)-알킬, (C₃-C₈)-시클로알킬, (C₁-C₃)-알킬-(C₃-C₈)-시클로알킬, 할로겐 및 O-(C₁-C₃)-알킬로부터 선택되는 라디칼에 의해 치환 또는 비치환된 (C₆-C₁₀)-아릴, 아릴 라디칼이 할로겐 및 O-(C₁-C₃)-알킬로부터 선택되는 라디칼에 의해 치환 또는 비치환된 (C₁-C₃)-알킬-(C₆-C₁₀)-아릴, (C₁-C₅)-헤테로아릴, 또는 (C₁-C₃)-알킬-(C₁-C₅)-헤테로아릴이고;

R²는 수소, 할로겐 및 O-(C₁-C₃)-알킬로부터 선택되는 라디칼에 의해 치환 또는 비치환된 (C₁-C₆)-알킬, (C₃-C₈)-시클로알킬, (C₁-C₃)-알킬-(C₃-C₈)-시클로알킬, 할로겐, O-(C₁-C₃)-알킬 및 CO-O-(C₁-C₃)-알킬로부터 선택되는 라디칼에 의해 치환 또는 비치환된 (C₆-C₁₀)-아릴, 또는 할로겐 및 O-(C₁-C₃)-알킬로부터 선택되는 라디칼에 의해 치환 또는 비치환된 (C₁-C₃)-알킬-(C₆-C₁₀)-아릴이고;

R³은 수소, COOH, 또는 COO-(C₁-C₄)-알킬이고;

R⁴는 수소, 할로겐, 또는 (C₁-C₄)-알킬이고;

R⁵는 수소 또는 (C₁-C₆)-알킬이고;

R⁶은 수소, (C₁-C₆)-알킬, (C₁-C₃)-알킬-(C₃-C₈)-시클로알킬, 또는 (C₂-C₆)-알케닐이고;

X는 산소 또는 NH이다.

안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제의 추가의 예는 미국 특허 번호 6,235,766 (상기 특허의 내용은 본원에 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.

상기 기술된 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 제약상 허용되는 염으로서 존재할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 염"이란 펩티드 또는 등가 화합물의 원하는 활성을 유지하지만, 바람직하게는 펩티드, 또는 펩티드를 이용하는 시스템의 다른 성분의 활성에는 불리하게 영향을 미치지 않는 염을 의미한다. 상기 염의 예로는 무기산, 예를 들어 염산, 브로민화수소산, 황산, 인산, 질산 등과의 것으로 형성된 산 부가 염이 있다. 염은 또한 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 타닌산, 팜산, 알긴산, 폴리글루탐산 등과의 것으로 형성될 수 있다. 양이온성 물질로부터 형성된 염은 상기 무기산 및 유기산의 짝염기를 이용할 수 있다. 염은 또한 다가 금속 양이온, 예컨대 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈 등으로, 또는 N,N'-디벤질에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온으로, 또는 그의 조합 (예컨대, 타닌산 아연 염)으로 형성될 수 있다. 비-독성의 생리학상 허용되는 염이 바람직하다.

다양한 실시양태에서, 유도체 및 유사체를 비롯한, 안지오텐신 (1-7) 펩티드의 치료 유효 투여량은 다양한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 펩티드의 치료 유효량은 약 10-1,000 mg 범위 (예컨대, 약 20 mg-1,000 mg, 30 mg-1,000 mg, 40 mg-1,000 mg, 50 mg-1,000 mg, 60 mg-1,000 mg, 70 mg-1,000 mg, 80 mg-1,000 mg, 90 mg-1,000 mg, 약 10-900 mg, 10-800 mg, 10-700 mg, 10-600 mg, 10-500 mg, 100-1,000 mg, 100-900 mg, 100-800 mg, 100-700 mg, 100-600 mg, 100-500 mg, 100-400 mg, 100-300 mg, 200-1,000 mg, 200-900 mg, 200-800 mg, 200-700 mg, 200-600 mg, 200-500 mg, 200-400 mg, 300-1,000 mg, 300-900 mg, 300-800 mg, 300-700 mg, 300-600 mg, 300-500 mg, 400 mg-1,000 mg, 500 mg-1,000 mg, 100 mg-900 mg, 200 mg-800 mg, 300 mg-700 mg, 400 mg-700 mg, 및 500 mg-600 mg)의 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 펩티드는 약 10 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg인 양, 또는 그 초과인 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 펩티드는 약 1,000 mg, 950 mg, 900 mg, 850 mg, 800 mg, 750 mg, 700 mg, 650 mg, 600 mg, 550 mg, 500 mg, 450 mg, 400 mg, 350 mg, 300 mg, 250 mg, 200 mg, 150 mg, 또는 100 mg인 양, 또는 그 미만인 양으로 존재한다.

다른 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 예를 들어, 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 500 mg/kg (체중), 예컨대 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 400 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 300 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 200 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 100 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 90 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 80 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 70 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 60 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 50 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 40 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 30 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 25 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 20 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 15 mg/kg (체중), 약 0.001 mg/kg (체중) 내지 10 mg/kg (체중)일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 예를 들어, 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.1 mg/kg (체중), 예컨대 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.09 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.08 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.07 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.06 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.05 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 약 0.04 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.03 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.02 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.019 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.018 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.017 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.016 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.015 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.014 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.013 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.012 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.011 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.01 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.009 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.008 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.007 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.006 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.005 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.004 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.003 mg/kg (체중), 약 0.0001 mg/kg (체중) 내지 0.002 mg/kg (체중)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 0.0001 mg/kg (체중), 0.0002 mg/kg (체중), 0.0003 mg/kg (체중), 0.0004 mg/kg (체중), 0.0005 mg/kg (체중), 0.0006 mg/kg (체중), 0.0007 mg/kg (체중), 0.0008 mg/kg (체중), 0.0009 mg/kg (체중), 0.001 mg/kg (체중), 0.002 mg/kg (체중), 0.003 mg/kg (체중), 0.004 mg/kg (체중), 0.005 mg/kg (체중), 0.006 mg/kg (체중), 0.007 mg/kg (체중), 0.008 mg/kg (체중), 0.009 mg/kg (체중), 0.01 mg/kg (체중), 0.02 mg/kg (체중), 0.03 mg/kg (체중), 0.04 mg/kg (체중), 0.05 mg/kg (체중), 0.06 mg/kg (체중), 0.07 mg/kg (체중), 0.08 mg/kg (체중), 0.09 mg/kg (체중), 또는 0.1 mg/kg (체중)일 수 있다. 특정 개체에 대한 유효량은, 개체의 요구에 따라서 시간이 경과함에 따라 달라질 수 있다 (예컨대, 증가 또는 감소).

일부 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 10 ㎍/kg/일, 50 ㎍/kg/일, 100 ㎍/kg/일, 250 ㎍/kg/일, 500 ㎍/kg/일, 1,000 ㎍/kg/일 또는 그 초과의 투여량일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체, 또는 그의 제약 염의 양은 환자에게 0.01 ㎍/kg 내지 10 mg/kg; 0.1 ㎍/kg 내지 5 mg/kg; 0.1 ㎍/kg 내지 1,000 ㎍/kg; 0.1 ㎍/kg 내지 900 ㎍/kg; 0.1 ㎍/kg 내지 900 ㎍/kg; 0.1 ㎍/kg 내지 800 ㎍/kg; 0.1 ㎍/kg 내지 700 ㎍/kg; 0.1 ㎍/kg 내지 600 ㎍/kg; 0.1 ㎍/kg 내지 500 ㎍/kg; 또는 0.1 ㎍/kg 내지 400 ㎍/kg의 투여량을 제공하는 데 충분하다.

본 발명에 따라 투여되는 특정의 투여 용량 또는 투여량은 예를 들어, 원하는 결과의 성질 및/또는 정도, 특정 투여 경로 및/또는 투여 시간, 및/또는 하나 이상의 특징 (예컨대, 체중, 연령, 개인 병력, 유전적 특징, 생활 방식 파라미터, 심장 결함의 중증도 및/또는 심장 결함의 위험 수준 등, 또는 그의 조합)에 따라 달라질 수 있다. 상기 투여 용량 또는 투여량은 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표준 임상 기법에 따라 적절한 투여 용량 또는 투여량이 결정된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 적절한 투여 용량 또는 투여량은 질환 중증도 지수 점수를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% 또는 그 초과만큼 감소시키는 데 충분한 투여 용량 또는 투여량이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 적절한 투여 용량 또는 투여량은 질환 중증도 지수 점수를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%만큼 감소시키는 데 충분한 투여 용량 또는 투여량이다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 적절한 투여 용량 또는 투여량은 투여되는 바람직한 또는 최적의 투여량 범위 또는 투여량을 확인하는 것을 지원하는 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 검정법을 사용함으로써 결정된다.

투여 스케줄

다양한 실시양태는 상이한 투여 요법을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 연속 주입을 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 연속 주입은 정맥내 주입이다. 다른 실시양태에서, 연속 주입은 피하 주입이다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 격월로, 매월, 매월 2회씩, 3주마다, 격주로, 매주, 주 2회씩, 주 3회씩, 매일, 매일 2회씩, 또는 임상적으로 바람직한 또 다른 투여 스케줄로 투여된다. 단일 대생체에 대한 투여 요법은 고정된 간격일 필요는 없지만, 이는 대상체의 요구에 따라 시간이 경과함에 따라 달라질 수 있다.

조합 요법

일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체는 조합 요법의 일부로서 사용될 것이다. 하나 이상의 뇌 병태에 대한 임의의 공지된 치료제 또는 치료법이 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체와 함께 사용될 수 있다는 점이 고려된다. 조합 요법으로서 하나 이상의 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체와 함께 사용될 수 있는 예시적인 화합물로는 코르티코스테로이드, 시클로포스파미드 (시톡산(Cytoxan)), 아자티오프린 (이뮤란(Imuran)), N-아세틸시스테인 (NAC), 칼리데코(KALYDECO)™ (N-(2,4-디-tert-부틸-5-히드록시페닐)-1,4-디히드로-4-옥소퀴놀린-3-카르복스아미드), 풀모자임(PULMOZYME)^® (재조합 인간 데옥시리보뉴클레아제 I), 토비(TOBI)^® (토브라마이신(Tobramycin)), 및 토브라마이신 염수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

전달

다양한 전달 시스템은 공지되어 있으며, 이는 펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드모방체, 비-펩티드 효능제, 또는 폴리펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드모방체, 및/또는 비-펩티드 효능제를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 제약 조성물은 정맥내 또는 근육내 주사, (중추 신경계 투여의 경우) 뇌실내 또는 경막내 주사, 경구로, 국소적으로, 피하로, 점막 피부로, 폐내 (예컨대, 흡입), 결막하로, 안구내로, 또는 비내, 피내, 설하, 질, 직장, 또는 경막외 경로를 통하는 것을 비롯한, 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다.

예를 들어, 수용액, 마이크로입자내 캡슐화, 또는 마이크로캡슐을 통해 이루어지는 것과 같은, 당업계에 주지되어 있는 다른 전달 시스템이 본원에 기술된 제약 조성물을 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 중합체 물질이 사용될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Smolen and Ball, Controlled Drug Bioavailability, Drug product design and performance, 1984, John Wiley & Sons]; [Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems, pharmacology and toxicology series, 2003, 2^nd edition, CRRC Press] 참조). 대안적으로, 펌프가 사용될 수 있다 (문헌 [Saudek et al., N. Engl. J. Med . 321 :574 (1989)]). 본원 발명에 기술된 조성물은 또한 약물을 제어 방출하는 데 유용한 생분해성 중합체 부류, 예를 들어 폴리락트산, 폴리오르토에스테르, 가교된 양친매성 블록 공중합체 및 히드로겔, 폴리히드록시 부티르산, 및 폴리디히드로피란에 커플링될 수 있다.

일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체, 또는 그의 염은 에어로졸 제제로 제조된다. 에어로졸 제제는 기체 매질 중 고체 물질 및 액체 소적의 안정된 분산액 또는 현탁액이다. 상기 제제를 통해 전달되는 펩티드는 중력 침강, 관성 충돌, 및 확산에 의해 기도에 침착된다. 에어로졸 제제를 투여하는 데 사용될 수 있는 예시적인 에어로졸 장치 유형으로는 제트 또는 초음파 분무기 및 계량 용량 흡입기 (MDI)를 포함한다. 계량 용량 흡입기가 가장 빈번하게 사용되는 에어로졸 전달 시스템이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 에어로졸화된 제제로 안지오텐신 (1-7) 펩티드, 또는 A(1-7)의 5개 이상의 연속된 아미노산으로 이루어진 그의 유사체 또는 유도체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체, 또는 그의 염은 분말로서 제조되고, 이는 폐로 약물/부형제 분말을 전달하기 위한 것으로 디자인된 건식 분말 흡입기 (DPI)에 의해, 또는 시린지 또는 유사 장치를 사용하는 취입에 의해 폐 경로를 통해 투여될 수 있다.

제약 조성물

제약 조성물은 경구 투여용 형태, 국소용 크림제, 국소용 패치, 이온영동 형태, 좌제, 비강용 스프레이, 및 흡입기, 점안제, 안구내 주사 형태, 데포 형태 뿐만 아니라, 주사액 및 주입액을 비롯한, 다양한 형태일 수 있다. 제약 조성물을 제조하는 방법은 당업계에 주지되어 있다.

제약 조성물은 전형적으로 유해한 부작용을 막거나, 최소화시키면서, 원하는 치료 효과를 달성하는 데 효과적인 양으로 활성제 (예컨대, 펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드모방체, 또는 비-펩티드 유사체)를 포함할 수 있다. 활성제의 제약상 허용되는 제제 및 염이 본원에서 제공되며, 이는 당업계에 주지되어 있다. 폴리펩티드 등을 투여하기 위해, 투여된 양은 바람직하게는 유해한 부작용이 거의 없거나, 전혀 없이, 치료 유효량이 되도록 선택된다. 특정 질환, 장애 또는 병태 치료에 효과적인 치료제 또는 제약 조성물의 양은 질환의 성질 및 중증도, 작용의 표적 부위, 대상체의 체중, 대상체가 따르는 특별식, 동시에 사용되는 약물 치료, 투여 경로, 및 당업자의 기술자가 이해하고 있는 것과 같은 다른 인자에 따라 달라진다. 투여량은 종래 인자, 예컨대 질환 정도, 및 대상체로부터의 상이한 파라미터에 따라 임상의에 의해 적합화될 수 있다. 전형적으로, 0.0001 내지 1,000 mg/kg/일이 대상체에게 투여된다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 도출된 용량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.

일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물은 고체 형태 (과립, 분말, 또는 좌제 포함)로, 에어로졸화된 형태로, 또는 액체 형태 (예컨대, 용액, 현탁액, 또는 에멀젼)로 구성될 수 있다. 제약 조성물은 각종 용액에 적용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 용액은 멸균성이고, 충분량의 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체를 용해시키며, 제안된 적용에 유해하지 않다.

상기 기술된 바와 같이, 제약 조성물은 바람직하게 제약상 허용되는 담체와 함께 안지오텐신 (1-7) 펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드모방체, 및/또는 비-펩티드 효능제를 포함한다. 담체라는 용어는 펩티드, 펩티드 유도체, 펩티드모방체, 및/또는 비-펩티드 효능제와 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 상기 제약 담체로는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 미네랄 오일, 식물성 오일 (예컨대, 대두 오일 또는 옥수수 오일), 동물성 오일 또는 합성 기원의 오일을 비롯한 오일을 포함한다. 수성 글리세롤 및 덱스트로스 용액 뿐만 아니라, 염수 용액 또한 본 발명의 제약 조성물의 액체 담체로서 사용될 수 있다. 담체 선택은 당업계에 잘 알려져 있는 인자, 예컨대 펩티드, 펩티드 유도체 또는 펩티드모방체의 성질, 그의 가용성 및 다른 생리학적 특성 뿐만 아니라, 전달 및 적용 표적 부위에 따라 달라진다. 적합한 제약 담체의 예는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy by Alfonso R. Gennaro, 2003, 21^th edition, Mack Publishing Company]에 기술되어 있다. 또한, 경구 투여에 적합한 담체는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 6,086,918, 6,673,574, 6,960,355, 및 7,351,741 및 WO2007/131286 (상기 특허의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.

제약 제제에 혼입될 수 있는 제약상 적합한 추가 물질로는 세포주위 흡수를 증가시키기 위한 것을 비롯한 흡수 증진제, 부형제, pH 조절제 및 완충제, 오스몰 농도 조절제, 보존제, 안정화제, 항산화제, 계면활성제, 증점제, 연화제, 분산제, 향미제, 착색제 및 습윤제를 포함한다.

적합한 제약 부형제의 예로는 물, 글루코스, 수크로스, 락토스, 글리콜, 에탄올, 글리세롤 모노스테아레이트, 젤라틴, 전분 가루 (예컨대, 쌀가루), 초크, 스테아르산나트륨, 맥아, 염화나트륨 등을 포함한다. Ang(1-7) 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물은 용액, 캡슐, 정제, 크림, 겔, 분말의 지속 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 종래 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세리드를 이용하여 좌제로서 제제화될 수 있다 (문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy by Alfonso R. Gennaro, 2003, 21^th edition, Mack Publishing Company] 참조). 상기 조성물은 대상체에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 담체와 함께, 치료 유효량의 치료 조성물을 포함한다. 제제는 투여 모드 및 표적 작용 부위 (예컨대, 특정 기관 또는 세포 유형)에 적합하도록 디자인된다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 충전제 또는 결합제의 예로는 아카시아, 알긴산, 인산칼슘 (이염기성), 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 덱스트린, 덱스트레이트, 수크로스, 크실로스, 예비젤라틴화 전분, 황산칼슘, 아밀로스, 글리신, 벤토나이트, 말토스, 소르비톨, 에틸셀룰로스, 인산수소이나트륨, 디소듐 포스페이트, 디소듐 피로술파이트, 폴리비닐 알콜, 젤라틴, 글루코스, 구아 검, 액상 글루코스, 압축 당, 규산알루미늄마그네슘, 말토덱스트린, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리메타크릴레이트, 포비돈, 알긴산나트륨, 트라가칸트 미세결정질 셀룰로스, 전분, 및 제인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 충전제 또는 결합제는 미세결정질 셀룰로스이다.

사용될 수 있는 붕해제의 예로는 알긴산, 카르복시메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 히드록시프로필셀룰로스 (저 치환), 미세결정질 셀룰로스, 분말화 셀룰로스, 콜로이드성 이산화규소, 소듐 크로스카르멜로스, 크로스포비돈, 메틸셀룰로스, 폴라크릴린 칼륨, 포비돈, 알긴산나트륨, 소듐 전분 글리콜레이트, 전분, 디소듐 디술파이트, 디소듐 에다타밀, 디소듐 에데테이트, 디소듐에틸렌디아민테트라아세테이트 (EDTA) 가교된 폴리비닐피롤리딘, 예비젤라틴화 전분, 카르복시메틸 전분, 소듐 카르복시메틸 전분, 미세결정질 셀룰로스를 포함한다.

윤활제의 예로는 스테아르산칼슘, 카놀라 오일, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 수소화 식물성 오일 (I형), 산화마그네슘, 스테아르산마그네슘, 미네랄 오일, 폴록사머, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트, 소듐 스테아레이트 푸마레이트, 스테아르산, 활석 및, 스테아르산아연, 글리세릴 베헤네이트, 마그네슘 라우릴 술페이트, 붕산, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 벤조산나트륨/아세트산나트륨 (조합), DL-류신을 포함한다.

실리카 유동 조절제의 예로는 콜로이드성 이산화규소, 규산알루미늄마그네슘 및 구아 검을 포함한다. 가장 바람직한 또 다른 실리카 유동 조절제는 이산화규소로 구성된다.

안정화제의 예로는 아카시아, 알부민, 폴리비닐 알콜, 알긴산, 벤토나이트, 인산이칼슘, 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 콜로이드성 이산화규소, 시클로덱스트린, 글리세릴 모노스테아레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 삼규산마그네슘, 규산알루미늄마그네슘, 프로필렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 알긴산나트륨, 카르나우바 왁스, 크산탄 검, 전분, 스테아레이트(들), 스테아르산, 스테아르산 모노글리세리드 및 스테아릴 알콜을 포함한다.

안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물은 또한 중성 또는 염 형태로 제제화된 조성물을 포함한다. 제약상 허용되는 염은 유리 아미노 기와 형성하는 것, 및 유리 카르복실 기와 반응하는 것을 포함한다. 제약 산업에서 통상 사용되는 비-독성 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 및 암모늄 염으로는 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 바륨, 암모늄, 및 프로타민 아연 염을 포함하며, 이는 당업계에 주지된 방법에 의해 제조된다. 일반적으로 본 발명의 화합물과 적합한 유기산 또는 무기산과의 반응에 의해 제조되는, 비-독성 산 부가 염 또한 포함한다. 대표적인 염으로 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 발레레이트, 옥살레이트, 올레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 술페이트, 비술페이트, 아세테이트, 포스페이트, 티솔레이트, 시트레이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 숙시네이트, 나프실레이트 염 등을 포함한다.

일부 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체와 염을 형성할 수 있는 적합한 산으로는 무기산, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 인산 등; 유기산, 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말로산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 안트라닐산, 신남산, 나프탈렌 술폰산, 술파닐산 등을 포함한다. A(1-7)과 염을 형성할 수 있는 적합한 염기로는 무기 염기, 예컨대 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨 등; 및 유기 염기, 예컨대 모노-, 디- 및 트리-알킬 및 아릴 아민 (예컨대, 트리에틸아민, 디이소프로필 아민, 메틸 아민, 디메틸 아민 등) 및 임의로 치환된 에탄올-아민 (예컨대, 에탄올아민, 디에탄올아민 등)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 지시된 투여 경로에 적절한 하나 이상의 아주반트와 조합된다. 화합물은 락토스, 수크로스, 전분 분말, 알칸산의 셀룰로스 에스테르, 스테아르산, 활석, 스테아르산마그네슘, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 아카시아, 젤라틴, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리딘, 및/또는 폴리비닐 알콜과 혼합될 수 있고, 통상의 투여를 위해 정제화 또는 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 카르복시메틸 셀룰로스 콜로이드성 용액, 히드록시에틸 셀룰로스 콜로이드성 용액, 에탄올, 옥수수 오일, 땅콩 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 트라가칸트 검, 및/또는 각종 완충제 중에 용해될 수 있다. 다른 아주반트 및 투여 모드는 제약 업계에 주지되어 있다. 담체 또는 희석제는 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로, 또는 왁스, 또는 당업계에 주지된 다른 물질과 함께 포함할 수 있다.

본원에 기술된 제약 조성물은 일단 대상체에게 투여되고 나면, 더욱 안정화되도록 (즉, 일단 투여되고 나면, 변형되지 않은 형태와 비교하여 보다 장기간의 반감기를 가지거나, 더욱 장기간 동안 유효성을 가지도록) Ang(1-7) 펩티드 또는 유사체 또는 유도체의 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 주지되어 있다 (예컨대, PEG화로도 알려져 있는 폴리에틸렌 글리콜 유도체화, 마이크로캡슐화 등).

특정 실시양태에서, 폐 조직 (즉, 폐)에 존재하는 섬유증을 치료하는 방법을 기술한다. 본 방법은 폐의 섬유화 장애를 앓고 있거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 대상체에게 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

본원에 기술된 방법의 특정 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체의 투여에 의해 치료하고자 하는 장애는 폐 섬유증, 폐 고혈압, COPD, 천식, 및/또는 낭성 섬유증이다. 특정 실시양태에서, 섬유증을 감소시키거나 예방하는 방법을 기술한다. 본 방법은 섬유증에 걸리기 쉬운 대상체에게 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드 또는 그의 유사체 또는 유도체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 수술 후 유착 형성에 의해 유발된 섬유증에 걸리기 쉬운 대상체이다.

본원에 기술된 방법의 특정 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드 유사체 또는 유도체는 선형이다. 본원에 기술된 방법의 특정 실시양태에서, 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드 유사체 또는 유도체는 시클릭이다. 특성 시클릭 안지오텐신 폴리펩티드의 합성법 및 구조는 미국 특허 공개 번호 2010055146 (상기 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.

키트

일부 실시양태에서, 본 발명은 Ang (1-7) 펩티드, 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제, 또는 상기를 함유하는 제제를 포함하고, (동결 건조된 경우) 그의 재구성 및/또는 사용에 관한 설명서를 제공하는 키트 또는 다른 제조품을 추가로 제공한다. 키트 또는 다른 제조품은 용기, 시린지, 바이알 및 (예컨대, 피하, 흡입에 의한) 투여에 유용한 임의의 다른 물품, 장치, 또는 장비를 포함할 수 있다. 적합한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 (예컨대, 사전 충전된 시린지), 앰플, 카트리지, 저장소, 또는 리오-젝트(lyo-ject)를 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 사전 충전된 시린지이다. 적합한 사전 충전된 시린지로는 베이킹된 실리콘 코팅이 있는 보로실리케이트 유리 시린지, 분무된 실리콘이 있는 보로실리케이트 유리 시린지, 또는 실리콘을 포함하지 않는 플라스틱 수지 시린지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

전형적으로, 용기는 제제, 및 재구성 및/또는 사용 설명이 명시되어 있을 수 있는, 용기 상의, 또는 그에 결합된 라벨을 수용할 수 있다. 예를 들어, 라벨에는 제제가 상기 기술된 바와 같은 농도로 재구성된다는 것이 명시되어 있을 수 있다. 라벨에는 추가로 제제가 예를 들어, 피하 투여에 유용하거나, 피하 투여용이라는 것이 명시되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 Ang (1-7) 펩티드 또는 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제를 함유하는 안정한 제제를 단일 용량으로 함유할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 안정한 제제의 단일 용량은 약 15 ml, 10 ml, 5.0 ml, 4.0 ml, 3.5 ml, 3.0 ml, 2.5 ml, 2.0 ml, 1.5 ml, 1.0 ml, 또는 0.5 ml 미만의 부피로 존재한다. 대안적으로, 제제를 수용하는 용기는 다회용 바이알일 수 있으며, 이를 통해 제제를 반복 투여 (예컨대, 2-6회 투여)할 수 있다. 키트 또는 다른 제조품은 추가로 적합한 희석제 (예컨대, BWFI, 염수, 완충 염수)를 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 희석제와 제제를 혼합할 때, 재구성된 제제 중 최종 단백질의 농도는 일반적으로 1 mg/ml 이상 (예컨대, 5 mg/m 이상, 10 mg/m 이상, 20 mg/m 이상, 30 mg/m 이상, 40 mg/m 이상, 50 mg/m 이상, 75 mg/m 이상, 100 mg/ml 이상)이 될 것이다. 키트 또는 다른 제조품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘, 시린지, 및 사용 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 비롯한, 상업적 관점 및 사용자의 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트 또는 다른 제조품은 자가 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다.

실시예

실시예 1. 낭성 섬유증 치료

본 실시예는 안지오텐신 (1-7) 펩티드가 낭성 섬유증을 치료하는 데 사용될 수 있다는 점을 입증한다.

문헌 [Hoffman et al., (2005) Infection and Immunity (73)4: 2540-2514] (상기 문헌의 물질 및 방법 및 결과 섹션은 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)의 만성 폐 감염을 앓는 마우스 모델을 이용하여 실험을 수행하였다. 만성 피. 아에루기노사의 마우스 모델로부터의 폐의 조직병리학은 낭성 섬유증 환자의 폐와 유사하고, 이는 낭성 섬유증에 대한 동물 모델이 된다. 간략하면, 정족수 감지 인자를 발현하는 뮤코이드 박테리아의 안정적인 감염을 폐에 도입하였다. 1% 글리세롤로 보충된 ox 브로쓰에서 뮤코이드 박테리아를 배양하였다. 이어서, 세포를 수거하고, 콜로니 형성 단위를 계수하고, 정제된 알기네이트 용액 중에서의 희석에 의해 적절한 시험 접종물로 조정하였다.

잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories)로부터 이용가능한 암컷 및 수컷인 동형접합체성 (CFTR^-/-) 트랜스제닉 Cftr^{tm1Unc _}TgN(FABPCFTR) 마우스를 사용하여 낭성 섬유증에 대한 안지오텐신의 치료 효과를 시험하였다. 시험 시작 시점에서 마우스의 나이는 대략 12 내지 20주령이었다. 마우스를 마취시키고, 기관을 절개한 후, 40 ㎕의 부유성 뮤코이드 (예컨대, NH57388A), 비뮤코이드 (예컨대, NH57388C) 피. 아에루기노사 균주로 기관내 시험접종하여 약 4 x 10⁶ 내지 약 4 x 10⁷ CFU/폐를 수득하였다. 시험접종은 비드 곡선형 바늘을 이용하여 수행하였다.

각 마우스의 폐 전체를 무균 절개하고, 5 ml의 멸균 0.9% 염수 중에서 균질화시키고, 100 ㎕의 적절하게 일련으로 희석된 폐 균질액 샘플을 혈액 아가 플레이트 (BAP) 상에 플레이팅하고, 37℃에서 인큐베이션시키고, 35 내지 40시간 경과 후, 피. 아에루기노사 콜로니 (즉, CFU)를 검사하였다.

폐 조직병리학에 대해서 무작위로 선택된 마우스를 사용하였다. 폐를 1주 이상 동안 포르말린 완충제 중에 고정시킨 후, 파라핀 왁스에 포매시킨 다음, 5 ㎛ 절편으로 절단하였다. 엑소폴리사카라이드를 위한 알시안 블루-과아이오딘산-쉬프 염색(Alcian blue-periodic acid-Schiff stain)과 함께 조합된, 헤마톡실린 및 에오신 (HE)으로, 탑재시킨 절편을 염색하였다. 염증 병소 중의 다형핵 백혈구 (PMN) 및 단핵 백혈구 (MN)의 비율에 기초하여 시스템을 점수화함으로써 세포 변화를 급성 또는 만성 염증 군으로 지정하였다. 급성 염증은 지배적으로 PMN에 영향을 미치는 반면, 만성 염증은 지배적으로 MN에 영향을 미쳤다.

알기네이트 함량을 측정하기 위해, 빙냉 에탄올 (2 ml)을 이용하여 마우스 폐 균질액 (500 ㎕)을 추출하고, 멸균 0.9% 염수 (500 ㎕) 중에 재현탁시켰다. 카르바졸-보레이트 검정법에 의해 우론산 (알기네이트)의 함량을 정량하였다. 정제된 알기네이트 중 0.9% 염수로 시험접종된 마우스로부터의 폐 균질액을 블랭크로 사용하였다.

피. 아에루기노사를 접종하기 전, 그와 동시에, 및/또는 그 이후에 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드 및/또는 그의 유사체 및 유도체를 포함하는 조성물을 투여하여 낭성 섬유증의 증상을 감소시켰다.

실시예 2. 폐 섬유증 치료

블레오마이신 (BLEO) 투여는 폐 섬유증을 유도하고, 인간에서의 폐 섬유증에 대한 동물 모델이 된다. Ang 1-7은 래트에서 BLEO에 의해 유도된, 폐의 역학, 폐의 혈류역학, 및 우심실 리모델링 변경에 영향을 미쳤다.

위스타(Wistar) 래트에 일반 사료를 제공하고, 표준 실험실 조건하에서 하우징하였다. 미니펌프 삽입, BLEO 점적주입, 및 연구 등록을 수행하기 전 7일 이상 동안 모든 동물을 순응시켰다. 비히클 (0.9% NaCl) 또는 비히클에 용해된 4가지 용량 (20.83, 69.44, 208.33, 625 ng/kg/min) 중 한 용량의 TXA127을 함유하는 정맥 카테터와 연결된, 사전 로딩된 삼투성 미니펌프 (알제트(Alzet) 2ML2)를 각 동물에 이식하였다.

카테터를 대퇴 정맥 내로 삽입하고, 흉부 대정맥으로 진행시키고, 그 자리에 고정시켰다. 개통성을 확인한 후, 동물 등쪽 피하 위치에 미니펌프를 고정시켰다. 다음날, 비히클에 용해된 BLEO (1.25 mpk, i.t; 0.133 ml/100 g BW), 또는 그의 비히클 (0.9% NaCl)을 기관내 점적주입하여 각 동물에 제공하였다. 투여 개시점부터 연구를 진행하는 동안 내내 매일 동물의 체중을 측정하고, 건강 상태를 평가하였다.

연구 마지막날, 100% 산소를 보유하는 폐쇄된 챔버에서 5% 이소플루란으로 래트를 마취시켰다. 이어서, 직접적인 경동맥 캐뉼라 삽입술을 통해 수득되는 동맥혈 가스를 측정하기 위하여 래트를 노즈콘 마취 시스템으로 옮기고, 표준 기압, 정상 산소 (79% N₂, 21% O₂) 가스를 들이마시게 하였다. 이어서, 래트에 판쿠로늄 브로마이드 (1.5%, i.p.)를 투여하여 수의적인 호흡 노력을 억제시킨 후, 폐의 역학 (압력 부피 관계)을 직접 평가하기 위해 플렉시벤트(FlexiVent) 벤틸레이터로 옮겨 놓았다. 폐 기능 측정에 대해 결론을 지은 후, 직접적인 폐 동맥 카테터 삽입에 의해 항정 상태의 폐 동맥 혈류역학을 측정하기 위해 정압 벤틸레이터에 래트를 배치시켰다. 혈류역학에 대한 평가를 완료한 후, 10 ml의 멸균 PBS를 동물에 점적주입하고, BALF를 수집하였다. 마지막으로, 종말 혈액을 획득하고, 얼음 위에 놓았다.

심장 및 폐를 수거하고, 즉시 빙냉 (4℃) 0.9% NaCl에 침지시킨 후, 형태적 분석을 수행하였다. 우심실, 폐 동맥 줄기, 및 폐 조직 생검을 수득하고, 즉시 액체 질소 중에서 급냉시키고, 차후 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다. 폐의 엽 전체 및 우심실 중간 횡단면을 수득하고 고정시켰다. 각각 종점 Ang(1-7) 및 바이오마커 평가를 위한 혈장 및 혈청을 제조하기 위하여 혈액을 적절하게 프로세싱하기로 하였다.

별개의 전혈 샘플을 동맥 헤마토크릿에 대하여 평가하였다. 후속되는 파라핀 포매, 절편화, 및 염색을 위해 고정시킨 폐 절편을 70% EtOH로 옮겨 놓았다. 마손 트리크롬(Masson's Trichrome) 염색 및 영상 분석을 사용하여 폐 섬유증을 정량 분석하였다.

폐 조직 중의 섬유화유발 마커인 CTGF, 콜라겐 1a1, TGF-β₁, 및 TIMP-1의 발현 수준을 분석하고, 기관지폐포 세척액 중의 TNFα 수준을 측정하였다. 콜라겐 침착의 대리 마커인 종래 히드록시프롤린 검정에 의해 폐 섬유증을 측정하였다.

실시예 3. 비알콜성 지방간염 ( NASH ) 치료

스트렙토조토신 (STZ)의 단일 주사가 마우스에서 비알콜성 지방간염 (NASH) 유사 병태를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이는 인간 대상체에서의 상기 질환에 대한 모델로서의 역할을 한다.

본 실시예에서는, 48마리의 수컷 마우스에서 생후 2일째에 스트렙토조토신 (STZ, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국)) 용액을 단일 피하 주사하여 NASH를 유도하고, 4주령째 이후에는 고지방식 (HFD, 57 kcal% 지방, 카탈로그 번호 HFD32, CLEA 재팬(CLEA Japan: 일본))을 공급하였다. 마우스가 7주령되었을 때, 이를 하기 표 1에 따라 8마리로 이루어진 6개의 군으로 무작위화하였다. STZ 처리되지 않는 정상식을 공급받은 8마리의 수컷 한배새끼를 정상군으로 사용하였다.

군에 관한 설명

1군 (정상군)은 어떤 처리도 되지 않은 정상식을 임의대로 제공받은 8마리의 정상 마우스로 구성되었다. 2군 (비히클)은 7 내지 10주령째에 1일 1회에 걸쳐 5 mL/kg 부피의 비히클을 피하로 투여받은 8마리의 NASH 마우스로 구성되었다. 3군 (TXA127-30 ㎍)은 7 내지 10주령째에 1일 1회에 걸쳐 30 ㎍/5 mL/kg 용량의 TXA127로 보충된 비히클을 피하로 투여받은 8마리의 NASH 마우스로 구성되었다. 4군 (TXA127-100 ㎍)은 7 내지 10주령째에 1일 1회에 걸쳐 100 ㎍/5 mL/kg 용량의 TXA127로 보충된 비히클을 피하로 투여받은 8마리의 NASH 마우스로 구성되었다. 5군 (TXA127-300 ㎍)은 7 내지 10주령째에 1일 1회에 걸쳐 300 ㎍/5 mL/kg 용량의 TXA127로 보충된 비히클을 피하로 투여받은 8마리의 NASH 마우스로 구성되었다. 6군 (TXA127-1,000 ㎍)은 7 내지 10주령째에 1일 1회에 걸쳐 1,000 ㎍/5 mL/kg 용량의 TXA127로 보충된 비히클을 피하로 투여받은 8마리의 NASH 마우스로 구성되었다. 7군 (TXA127-100 ㎍)은 8 내지 10주령째에 1일 1회에 걸쳐 15 mg/10 mL/kg 용량의 텔미사르탄으로 보충된 순수 물을 경구로 투여받은 8마리의 NASH 마우스로 구성되었다.

비히클 (염수) 및 TXA127을 5 mL/kg (체중) 부피로 마우스에 피하 투여를 통해 투여하였다. 텔미사르탄은 10 mL/kg (체중) 부피로 마우스에 경구 경로에 의해 투여하였다. TXA127은 염수에 용해시켰고, 텔미사르탄 (미카르디스(MICARDIS)®)은 베링거 인겔하임 게엠베하(Boehringer Ingelheim GmbH)로부터 구입하고, 이를 순수 물에 용해시켰다. TXA127을 30, 100, 300 또는 1,000 ㎍/kg (체중)의 용량으로 1일 1회에 걸쳐 투여하였다. 텔미사르탄은 15 mg/kg (체중)의 용량으로 1일 1회에 걸쳐 투여하였다.

C57BL/6 마우스 (임신일수가 15일인 암컷)를 찰스 리버 래보러토리즈 재팬(Charles River Laboratories Japan: 일본 가나가와)로부터 입수하였다. 본 연구에서 사용된 모든 동물을 일본 약리 학회의 동물 사용 지침(Japanese Pharmacological Society Guidelines for Animal Use)에 따라 하우징하고, 보살펴 주었다. 온도 (23±2℃), 습도 (45±10%), 조광 (12시간씩의 인공광 및 암주기; 8:00부터 20:00까지 조광) 및 환기 조건이 조절되는 SPF 설비에서 동물을 유지시켰다. 설비내 오염을 막이 위해 실험실을 고압 (20±4 Pa)으로 유지시켰다. 멸균된 고형 HFD를 우리 상단의 금속제 뚜껑에 놓아 두고 임의대로 제공하였다. 고무 마개 및 시퍼 튜브(sipper tube)가 장착된 물병으로부터 증류수를 임의대로 제공하였다. 물병은 주 1회 교체하여, 오토클레이브에서 세척 및 멸균시키고, 재사용하였다.

혈액 글루코스 측정

G 체커(G Checker) (산코 주냐쿠(Sanko Junyaku: 일본))를 사용하여 전혈 샘플 중 비-공복시 전혈 글루코스 수준을 측정하였다. 혈장의 생화학을 위해, 항응고제 (노보-헤파린(Novo-Heparin), 모치다 파마슈티칼(Mochida Pharmaceutical: 일본))를 포함하는 폴리프로필렌 튜브에 혈액을 수집하고, 4℃에서 15분 동안 1,000xg로 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 사용시까지 -80℃에서 보관하였다. 후지 드라이-켐 7000(FUJI DRI-CHEM 7000) (후지 필름(Fuji Film: 일본))에 의해 혈장 ALT, AST, 및 ALP 수준을 측정하였다.

간 히드록시프롤린 측정

간 히드록시프롤린 함량을 정량하기 위해, 냉동 간 (40-60 mg)을 민스하고(minced), 실온에서 30분 동안 아세톤 중에서 지방제거하였다. 원심분리한 후, 펠릿을 공기 건조시키고, 65℃에서 400 ㎕의 2 N NaOH에 용해시켰다. 간 용해물을 121℃에서 20분 동안 오토클레이브시켰다. 이어서, 샘플을 121℃에서 20분 동안 400 ㎕의 6 N HCl로 산 가수분해시키고, 4 N NaOH 중 400 ㎕의 10 mg/mL 활성탄으로 중화시켰다. 중화된 샘플을 2.2 M 아세트산/0.48 M 시트르산 완충제로 완충처리하고, 원심분리하여 상청액을 수득하였다. 히드록시프롤린 표준 곡선을 작성하기 위해, 16 ㎍/mL에서 출발하여 트랜스-4-히드록시-L-프롤린 표준물 (시그마(Sigma: 미국))의 일련의 희석액을 제조하였다. 500 ㎕의 상청액 및 표준물을 10% n-프로판올/아세테이트-시트레이트 완충제 중 500 ㎕ 클로라민 T에 첨가하고, 실온에서 25분 동안 인큐베이션시켰다. 500 ㎕의 에리히 용액(Ehrlich's solution)을 첨가하고, 혼합하고, 65℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 얼음 상에서 냉각시키고, 원심분리하여 상청액을 수집한 후, 560 nm에서 각 상청액 및 표준물의 광학 밀도를 측정하고, 히드록시프롤린 표준 곡선으로부터 간 히드록시프롤린의 농도를 계산하였다. BCA 단백질 검정용 키트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific: 미국))를 사용하여 각 상청액의 단백질 농도를 측정하였다. 간내 전체 단백질에 의해 간 히드록시프롤린 함량을 정규화하였다.

시리우스 레드 -염색

섬유증 영역에 대한 정량 분석을 위해, 디지털 카메라 (DFC280, 라이카(Leica: 독일))를 사용하여 200배 확대 배율로 중심 정맥 주변의 시리우스 레드-염색된 절편의 명시야 영상을 포착하고, 이미지 J(Image J) 소프트웨어 (미국 국립 보건원(National Institute of Health: 미국))를 사용하여 절편당 5개의 시야내 양성 영역을 정량하였다.

혈액 글루코스 결과

도 1A에 제시되어 있는 바와 같이, 전혈 중 비-공복 혈액 글루코스 수준은 정상군과 비교하여 비히클 군에서 유의하게 증가하였다 (정상: 154±15 mg/dL, 비히클: 695±71 mg/dL). 텔미사르탄 군은 비히클 군과 비교하여 혈액 글루코스 수준의 유의한 증가를 보였다 (텔미사르탄: 900±0 mg/dL). 텔미사르탄 군 중의 모든 샘플의 값은 900 mg/dL의 검출 한계보다 컸다. 혈액 글루코스 수준은 비히클 군과 비교하였을 때, TXA127-100 ㎍, TXA127-300 ㎍, 및 TXA127-1,000 ㎍에서 감소하는 경향을 보였다 (TXA127-100 ㎍: 590±131 mg/dL, TXA127-300 ㎍: 639±76 mg/dL, TXA127-1,000 ㎍: 632±92 mg/dL). 혈액 글루코스 수준에 있어 비히클 군과 TXA127-30 ㎍ 군 사이에는 유의한 차이는 없었다 (TXA127-30 ㎍: 675±103 mg/dL).

혈장 알라닌 트랜스아미나제 ( ALT ) 결과

도 1B에 제시되어 있는 바와 같이, 비히클 군의 혈장 ALT 수준은 정상군과 비교하여 증가하는 경향이 있었다 (정상: 23±5 U/L, 비히클: 47±14 U/L). ALT 수준에 있어서는 비히클 군과 텔미사르탄 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (텔미사르탄: 41±10 U/L). TXA127-100 ㎍ 군은 비히클 군과 비교하여 ALT 수준에 있어 유의한 증가를 보였다 (TXA127-100 ㎍: 89±56 U/L). ALT 수준에 있어서는 비히클 군과 다른 군 중 임의의 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (TXA127-30 ㎍: 46±15 U/L, TXA127-300 ㎍: 43±17 U/L, TXA127-1,000 ㎍: 41±10 U/L).

혈장 아스파르테이트 트랜스아미나제 ( AST ) 결과

도 1C에 제시되어 있는 바와 같이, 비히클 군의 혈장 AST 수준은 정상군과 비교하여 증가하는 경향이 있었다 (정상: 103±29 U/L, 비히클: 220±129 U/L). AST 수준에 있어서 비히클 군과 텔미사르탄 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (텔미사르탄: 232±141 U/L). TXA127-100 ㎍ 군의 AST 수준은 비히클 군과 비교하여 증가하는 경향이 있었다 (TXA127-100 ㎍: 352±174 U/L). AST 수준에 있어서 비히클 군과 다른 군 중 임의의 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (TXA127-30 ㎍: 160±94 U/L, TXA127-300 ㎍: 149±50 U/L, TXA127-1,000 ㎍: 142±32 U/L).

혈장 알칼리성 포스파타제 ( ALP ) 결과

도 1D에 제시되어 있는 바와 같이, 혈장 ALP 수준에 있어서 비히클 군과 정상군 사이에 유의한 차이는 없었다 (정상: 368±36 U/L, 비히클: 360±53 U/L). 텔미사르탄 군은 비히클 군과 비교하여 ALP 수준에 있어 유의한 증가를 보였다 (텔미사르탄: 605±130 U/L). TXA127-30 ㎍ 및 TXA127-300 ㎍ 군의 ALP 수준은 비히클 군과 비교하여 증가하는 경향이 있었다 (TXA127-30 ㎍: 428±61 U/L, TXA127-300 ㎍: 472±100 U/L). ALP 수준에 있어서 비히클 군과 다른 군 중 임의의 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (TXA127-100 ㎍: 358±75 U/L, TXA127-1,000 ㎍: 397±96 U/L).

간 히드록시프롤린 결과

간 히드록시프롤린 수준은 간 섬유증과 관련이 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 특히 콜라겐에서 발견된다. 도 2에 제시된 바와 같이, 비히클 군의 간 히드록시프롤린 함량은 정상군과 비교하여 증가하는 경향이 있었다 (정상: 0.92±0.16 ㎍/mg, 비히클: 1.72±1.04 ㎍/mg). 히드록시프롤린 함량에 있어서 비히클 군과 텔미사르탄 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (텔미사르탄: 1.46±0.69 ㎍/mg). TXA127-100 ㎍ 군은 히드록시프롤린 함량에 있어 비히클 군과 비교하여 유의한 감소를 보였다 (TXA127-100 ㎍: 0.88±0.17 ㎍/mg). 히드록시프롤린 함량에 있어 비히클 군과 다른 군 중 임의의 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (TXA127-30 ㎍: 1.22±0.29 ㎍/mg, TXA127-300 ㎍: 1.24±0.51 ㎍/mg, TXA127-1,000 ㎍: 1.34±0.69 ㎍/mg).

시리우스 레드 결과

도 3에 제시된 바와 같이, 비히클 군의 시리우스 레드-염색된 간 절편은 정상군과 비교하여 간 엽의 주변 영역에서 콜라겐 침착을 보였다. 섬유증 영역 (시리우스 레드-양성 영역)의 비율(%)은 정상군과 비교하여 비히클 군에서 유의하게 증가하였다 (정상: 0.22±0.06%, 비히클: 0.88±1.10%). 섬유증 영역은 비히클 군과 비교하여 텔미사르탄 군에서 유의하게 감소하였다 (텔미사르탄: 0.44±0.12%). 섬유증 영역은 비히클 군과 비교하여 TXA127-100 ㎍, TXA127-300 ㎍ 및 TXA127-1,000 ㎍ 군에서 유의하게 감소하였다 (TXA127-100 ㎍: 0.55±0.29%, TXA127-300 ㎍: 0.54±0.18%, TXA127-1,000 ㎍: 0.51±0.09%). 시리우스 레드-양성 영역의 비율(%)에 있어서 비히클 군과 TXA127-30 ㎍ 군 사이는 유의한 차이는 없었다 (TXA127-30 ㎍: 0.88±0.33%).

요약 - 텔미사르탄

본 NASH 모델에서 항-염증 및 항-섬유증 효과를 보인 것으로 알려진 텔미사르탄을 본 연구에서 양성 대조군으로서 사용하였다. 텔미사르탄으로 처리한 결과, 스텔릭(Stelic's) 이력 데이터와 일치하여, 비히클 군과 비교하였을 때, 간 중량 및 NAS 및 섬유증 영역은 유의하게 감소하였다.

요약 - TXA127

100, 300 및 1,000 ㎍/kg 용량의 TXA127로 처리한 결과, 중심주위 영역에서 콜라겐 침착은 용량에 의존하는 방식으로 유의하게 감소하였다는 것이 시리우스 레드 염색을 통해 밝혀졌다 (도 3 참조). 한편, 히드록시프롤린 함량에 있어서, TXA127을 100 ㎍/kg의 용량으로 처리하였을 때에는 유의한 감소가 관찰되었다. 추가로, TXA127로 처리한 결과, 모든 용량에서 염증 세포 침윤은 감소하였다. TXA127을 100 ㎍/kg의 용량으로 처리하였을 때에는 ALT 및 AST 수준이 증가하였고, 30 및 300 ㎍/kg의 용량으로 처리하였을 때에는 ALP 수준이 증가하였다. 종합하면, 본 연구에서 TXA127은 잠재적인 항-염증 효과는 30 ㎍/kg 초과의 용량에서 나타났고, 항-섬유증 효과는 100 ㎍/kg 초과의 용량에서 나타났다.

실시예 4. 비알콜성 지방간염 ( NASH ) 치료에 관한 유전자 분석

동물, 군, 처리 조건 및 시점은 상기 실시예 3에 대한 것과 동일하였다. 실시예 3의 동물로부터 간을 수거하고, 그에 대해 하기 분석을 수행하였다.

정량적 RT - PCR

제조사의 설명서에 따라 RNA이소(RNAiso) (다카라 바이오(Takara Bio: 일본))를 사용하여 간 샘플로부터 전체 RNA를 추출하였다. 총 20 ㎕의 부피로 4.5 mM MgCl₂ (로슈(Roche: 스위스)), 40 U RN아제 억제제 (도요보(Toyobo: 일본)), 0.5 mM dNTP (프로메가(Promega: 미국)), 6.28 μM 랜덤 헥사머 (프로메가), 5 x 제1 가닥 완충제 (프로메가), 6.6 mM 디티오트레이톨 (인비트로젠(Invitrogen: 미국)) 및 MMLV-RT (인비트로젠)를 함유하는 반응 혼합물을 사용하여 1 ㎍의 RNA를 역전사시켰다. 반응은 37℃에서 1시간, 이어서 99℃에서 5분 동안 수행하였다. 실시간 PCR DICE 및 SYBR 프리믹스 Taq (다카라 바이오)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 상대적인 mRNA 발현 수준을 계산하기 위해, 각 유전자의 발현을 참조 유전자 36B4 (유전자 기호: Rplp0)의 것으로 정규화하였다. 프리즘 소프트웨어 4(Prism Software 4)에서 본페르니 다중 비교 검정(Bonferroni Multiple Comparison Test)을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. P 값이 < 0.05인 것을 통계학상 유의한 것으로 간주하였다. 제I형 콜라겐, 제3형 콜라겐, α-SMA, TGF-β, CCR2, 및 TIMP-1 mRNA의 발현 수준을 평가하였다.

제I형 콜라겐 mRNA 의 발현

도 4A에 제시되어 있는 바와 같이, 제1형 콜라겐 mRNA 발현 수준은 정상군과 비교하여 비히클 군에서 유의하게 상향 조절되었다 (정상: 1.00±0.34, 비히클: 3.03±0.82). 제1형 콜라겐 mRNA 발현 수준에 있어 비히클 군과 텔미사르탄 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (텔미사르탄: 3.14±0.59). 제1형 콜라겐 mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 TXA127-30 ㎍ 군에서 유의하게 상향 조절되었다 (TXA127-30 ㎍: 4.48±0.91). 제1형 콜라겐 mRNA 발현 수준에 있어 비히클 군과 다른 군 중 임의의 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (TXA127-100 ㎍: 3.37±1.58, TXA127-300 ㎍: 3.06±1.12, TXA127-1,000 ㎍: 2.77±0.77).

제3형 콜라겐 mRNA 의 발현

도 4B에 제시된 바와 같이, 제3형 콜라겐 mRNA 발현 수준은 정상군과 비교하여 비히클 군에서 유의하게 상향 조절되었다 (정상: 1.00±0.30, 비히클: 2.64±0.60). 제3형 콜라겐 mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 텔미사르탄 군에서 하향 조절되는 경향이 있었다 (텔미사르탄: 2.09±0.50). 제3형 콜라겐 mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 TXA127-30 ㎍ 군에서 상향 조절되는 경향이 있었다 (TXA127-30 ㎍: 3.23±0.54). 제3형 콜라겐 mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 TXA127-1,000 ㎍ 군에서 하향 조절되는 경향이 있었다 (TXA127-1,000 ㎍: 2.24±0.68). 제3형 콜라겐 mRNA 발현 수준에 있어서 비히클 군과 다른 군 중 임의의 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (TXA127-100 ㎍: 2.82±1.50, TXA127-300 ㎍: 2.81±0.89).

α- SMA mRNA 의 발현

도 4C에 제시된 바와 같이, α-SMA mRNA 발현 수준은 정상군과 비교하여 비히클 군에서 상향 조절되는 경향이 있었다 (정상: 1.00±0.67, 비히클: 2.69±1.53). α-SMA mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 텔미사르탄 군에서 하향 조절되는 경향이 있었다 (텔미사르탄: 2.07±0.87). α-SMA mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 TXA127-1,000 ㎍ 군에서 하향 조절되는 경향이 있었다 (TXA127-1,000 ㎍: 1.92±0.67). α-SMA mRNA 발현 수준에 있어서 비히클 군과 다른 군 중 임의의 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (TXA127-30 ㎍: 2.88±1.08, TXA127-100 ㎍: 2.65±2.46, TXA127-300 ㎍: 2.49±0.98).

TGF -β mRNA 의 발현

도 4D에 제시된 바와 같이, TGF-β mRNA 발현 수준은 정상군과 비교하여 비히클 군에서 유의하게 상향 조절되었다 (정상: 1.00±0.28, 비히클: 1.94±0.31). TGF-β mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 텔미사르탄 군에서 하향 조절되는 경향이 있었다 (텔미사르탄: 1.58±0.23). TGF-β mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 TXA127-30 ㎍ 군에서 상향 조절되는 경향이 있었다 (TXA127-30 ㎍: 2.35±0.44). TGF-β mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 TXA127-300 ㎍ 및 TXA127-1,000 ㎍ 군에서 하향 조절되는 경향이 있었다 (TXA127- 300 ㎍: 1.69±0.49, TXA127-1,000 ㎍: 1.70±0.35). α-SMA mRNA 발현 수준에 있어서 비히클 군과 TXA127-100 ㎍ 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (TXA127-100 ㎍: 1.93±0.44).

CCR2 mRNA 의 발현

도 5A에 제시된 바와 같이, CCR2 mRNA 발현 수준은 정상군과 비교하여 비히클 군에서 유의하게 상향 조절되었다 (정상: 1.00±0.35, 비히클: 3.22±0.73). CCR2 mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 텔미사르탄 군에서 하향 조절되는 경향이 있었다 (텔미사르탄: 1.94±0.37). CCR2 mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 TXA127-30 ㎍ 군에서 하향 조절되는 경향이 있었다 (TXA127-30 ㎍: 2.60±0.60). CCR2 mRNA 발현 수준에 있어서 비히클 군과 다른 군 중 임의의 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (TXA127-100 ㎍: 3.26±2.01, TXA127-300 ㎍: 2.82±0.88, TXA127-1,000 ㎍: 3.10±1.55).

TIMP -1 mRNA 의 발현

도 5B에 제시된 바와 같이, TIMP-1 mRNA 발현 수준은 정상군과 비교하여 비히클 군에서 유의하게 상향 조절되었다 (정상: 1.00±1.07, 비히클: 7.46±3.66). TIMP-1 mRNA 발현 수준은 비히클 군과 비교하여 텔미사르탄 군에서 하향 조절되는 경향이 있었다 (텔미사르탄: 4.22±1.52). TIMP-1 mRNA 발현 수준에 있어서 비히클 군과 다른 군 중 임의의 군 사이에 유의한 차이는 없었다 (TXA127-30 ㎍: 6.74±1.93, TXA127-100 ㎍: 9.80±8.93, TXA127-300 ㎍: 7.54±3.05, TXA127-1,000 ㎍: 8.54±6.41).

요약

본 연구에서, 텔미사르탄으로 처리한 결과, 제3형 콜라겐, α-SMA, TGF-β, CCR2 및 TIMP-1 mRNA의 발현 수준은 하향 조절된 것으로 나타났다. 실시예 3에서 텔미사르탄 처리는 섬유증 영역을 유의하게 감소시켰는 바, 상기 결과는 텔미사르탄의 항-섬유증 효과, 및 그의 양성 대조군으로서의 용도를 입증한다.

TXA127은 실시예 3에서 항-섬유증 및 항-염증 효과를 보였다. 본 연구에서, TXA127로 처리한 결과, TGF-β 유전자 발현 수준은 용량에 의존하는 방식으로 감소되었고, TXA127을 1,000 ㎍/kg의 용량으로 처리한 결과, 제3형 콜라겐 및 α-SMA mRNA 발현 수준은 하향 조절되는 경향이 있었다. 특정 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 상기 결과는 TXA127이 TGF-β에 의해 유도되는 간 성상 세포의 활성화 억제를 통해 섬유증을 호전시킨다는 것을 나타낼 수 있다. 안지오텐신 (1-7) 펩티드가 mas 수용체를 통해 대식세포 (TGF-β 생산 세포) 및 간 성상 세포의 활성화를 억제시킨다고 보고되었다. 한 가능한 작용 기전은 TXA127이 대식세포의 활성화, 및 TGF-β-자극 α-SMA 양성 세포의 개수를 감소시키며, 이로써 섬유증은 감소하게 된다는 것이다.

실시예 5. 선형 또는 시클릭 A(1-7)을 이용한 낭성 섬유증 치료

슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (NH57388A)의 뮤코이드 균주를 10-12주령된 BALB/c 마우스 (찰스 리버)의 기도로 기관내 점적주입함으로써 낭성 섬유증을 모사하는 만성 기도 감염 모델을 확립하였다. NH57388A는 숙주 면역에 대한 내성을 부여하는 알기네이트를 과잉 생산하는 mucA 녹아웃 돌연변이체이다. 두 제약 제제를 사용하여 Ang (1-7) 및 시클릭 A(1-7)을 투여하였다. 감염 24시간 후, 7일 동안 이식형 펌프 (알제트)를 통해 선형 Ang (1-7) (100 또는 300 mcg/kg) 또는 시클릭 Ang (1-7) (10 또는 30 mcg/kg)로 동물을 처리하였다. 8일째에 20 mg 소듐 펜토바르비탈을 i.p. 주사하여 처리된 마우스 및 대조군을 안락사시켰다. 기관에 캐뉼라를 삽입하고, 0.8 mL 멸균 염수를 이용하여 3회에 걸쳐 세척함으로써 기관지폐포 세척 (BAL)을 수행하였다. 상청액을 분취하고, 추가의 생물화학적 측정을 위해 -70℃에 보관하였다. 디프퀵(DIFFQUICK)™ 염색을 이용하여 시토스핀 제제 상에서 전체 분별 세포 계수를 수행하였다. 폐 손상 정도를 측정하기 위해 폐 조직에 대하여 조직병리학을 수행하였다. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 수행하여 폐 조직 내로의 호중구 침윤을 조사하였다. 다중 ELISA를 이용하여 BAL 액 중 염증 바이오마커 농도 (예컨대, IL1β, KC, MIP2, IFNγ, TNFα, IL-6, MCP-1, IL-10)를 측정하였다. 폐 조직 상에서 수행되는 qRT-PCR에 의해 Mas mRNA를 분석하였다.

각 군당 8마리인 샘플 크기는 Ang (1-7)로 처리된 동물과 대조군 동물 사이에 BAL 중 호중구 계수의 2 로그 하락을 검출할 수 있는 90%의 기회를 제공하였다 (95% 신뢰). 호중구 계수 및 시토카인/케모카인 농도를 만-휘트니 U(Mann-Whitney U) 검정에 의해 분석하였다. 귀무 가설은 p < 0.05에서 거절되었다. Mac 버전 5.0b의 그래프패드™ 프리즘(GRAPHPAD™ Prism) (그래프패드(GRAPHPAD)™, 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 상기 예비 연구를 통해, A(1-7)에 의해 CF 치료 CF의 유익함을 증명할 것이다. 예를 들어, A(1-7)에 의해 유도되는 항-염증 용량 반응의 크기 및 지속 기간을 증명할 것이다.

등가물

당업자는 통상의 실험 그 이상의 것을 사용하지 않고서도 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 이해하거나, 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 상세한 설명으로 제한하고자 하는 것은 아니며, 대신 이는 첨부된 특허청구범위에 기재된다. 본 명세서에서 및 특허청구범위의 본원에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 관사는 명백하게 그에 반하지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 군을 이루는 하나 이상의 구성원들 사이에 "또는"을 포함하는 특허청구범위 또는 상세한 설명은 반대로 명시되지 않는 한, 또는 다르게는 문맥상 명백하지 않는 한, 1개, 1개 초과의 또는 모든 군의 구성원들이 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 사용되거나, 다르게는 관련된다면, 만족스러운 것으로 간주된다. 본 발명은 정확하게 군을 이루는 한 구성원이 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 사용되거나, 다르게는 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 또한 1개 초과의 또는 모든 군의 구성원들이 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 사용되거나, 다르게는 관련되는 실시양태를 포함한다. 추가로, 본 발명은 달리 명시되지 않는 한, 또는 명백히 당업자에게 반박 또는 모순이 일어날 것으로 예상되지 않는 한, 하나 이상의 특허청구항으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항, 기술 용어 등은 동일의 기본 특허청구항의 종속항인 (또는 관련된 임의의 다른 특허청구항과 같은) 또 다른 특허청구항에 도입된 변형, 조합, 및 치환을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 요소가 목록처럼, 예컨대 마쿠쉬(Markush) 군 또는 유사 포맷으로 제시되는 경우, 상기 요소의 각 하위군 또한 개시되고, 임의의 요소(들)는 그 군으로부터 제거될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 일반적으로, 본 발명, 본 발명의 측면(들)이 특정 요소, 특징 등을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 발명 또는 본 발명의 측면의 특정 실시양태는 상기 요소, 특징 등으로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 것으로 이해하여야 한다. 단순화시키기 위한 목적으로 상기 실시양태들은 본원에서 모든 경우에 대해 구체적으로 기술되지는 않았다. 본 발명의 임의의 실시양태, 예컨대 선행 기술 내에서 발견된 임의의 실시양태는 구체적인 배제 내용이 본 명세서에서 언급되었는지 여부와는 상관없이, 본 특허청구범위로부터 명확하게 배제될 수 있다는 것 또한 이해하여야 한다.

명백하게 반대로 명시되지 않는 한, 1개 초과의 조치를 포함하는 본원에서 주장하는 임의의 방법에서 방법의 조치들의 순서는 반드시 방법 조치가 언급된 순서로 제한될 필요는 없지만, 본 발명은 그 순서가 매우 제한적인 실시양태를 포함한다는 것 또한 이해하여야 한다. 추가로, 특허청구범위가 조성물을 언급하는 경우, 본 발명은 상기 조성물을 사용하는 방법, 및 상기 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 특허청구범위가 조성물을 언급하는 경우, 본 발명은 상기 조성물을 사용하는 방법, 및 상기 조성물을 제조하는 방법을 포함한다는 것을 이해하여야 한다.

참고문헌 인용

본 출원에서 인용된 모든 공개 문헌 및 특허 문헌은 각각의 개별 공개 문헌 및 특허 문헌의 내용이 본원에 포함된 것과 같은 정도로 그 전문이 참조로 포함된다.

Claims (26)

1. 치료를 필요로 하는 대상체에게 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 섬유화 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 섬유화 질환, 장애 또는 병태가 폐(lung) 섬유증을 포함하는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 폐 섬유증이 폐(pulmonary) 섬유증, 폐 고혈압, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식, 낭성 섬유증 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
4. 제3항에 있어서, 폐 섬유증이 낭성 섬유증인 방법.
5. 제1항에 있어서, 섬유화 질환, 장애 또는 병태가 신장 섬유증을 포함하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 섬유화 질환, 장애 또는 병태가 간 섬유증을 포함하는 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 간 섬유증이 비알콜성 지방간염인 방법.
8. 제1항에 있어서, 섬유화 질환, 장애 또는 병태가 심장 섬유증을 포함하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 섬유화 질환, 장애 또는 병태가 전신 경화증인 방법.
10. 제1항에 있어서, 섬유화 질환, 장애 또는 병태가 수술 후 유착 형성에 의해 유발된 것인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체가, 섬유화 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 강도, 중증도 또는 빈도를 감소시키거나 또는 그의 발병을 지연시키도록 하는 치료 유효량으로 투여되는 것인 방법.
12. 치료를 필요로 하는 대상체에게 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 상처 치유를 가속화시키는 방법.
13. 치료를 필요로 하는 대상체에게 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 반흔 형성을 감소시키거나 예방하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 피부 상의 반흔 형성을 감소시키거나 예방하는 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체가 Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷ (서열 1)의 아미노산 서열을 가지는 안지오텐신 (1-7)인 방법.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체가 Asp¹-Arg²-Nle³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷ (서열 2)의 아미노산 서열을 가지는 것인 방법.
17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체가 Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷ (서열 3)의 아미노산 서열을 가지는 것인 방법.
18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체가 시클릭 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드인 방법.
19. 제18항에 있어서, 시클릭 안지오텐신 (1-7) 폴리펩티드가 하기 화학식을 가지는 4,7-고리화 안지오텐신 (1-7)인 방법.
    

    
20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체가 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제인 방법.
21. 제20항에 있어서, 안지오텐신 (1-7) 수용체 효능제가 1-(p-티에닐벤질)이미다졸인 방법.
22. 제21항에 있어서, 1-(p-티에닐벤질)이미다졸이 하기 화학식을 가지는 것인 방법.
    

    
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체가 비경구로 투여되는 것인 방법.
24. 제23항에 있어서, 비경구 투여가 정맥내, 피내, 흡입, 경피 (국소), 피하 및/또는 경점막 투여로부터 선택되는 것인 방법.
25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체가 경구로 투여되는 것인 방법.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 안지오텐신 (1-7) 또는 그의 유사체 또는 유도체가 격월로, 매월, 3주마다, 격주로, 매주, 매일 또는 다양한 간격을 두고 투여되는 것인 방법.

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