KR20210110326A - 섬유증 질환의 치료를 위한 항-에프린-b2 차단 항체 - Google Patents

Abstract

가용성 에프린 B2 엑토도메인과 결합하고 이를 차단하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하여 기관 섬유증을 치료하기 위한 방법 및 조성물.

Description

섬유증 질환의 치료를 위한 항-에프린-B2 차단 항체

우선권 주장

본 출원은 2018년 12월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 62/785,873을 우선권 주장한다. 이러한 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

기술 분야

본원에는 가용성 에프린-B2 (s에프린-B2) 엑토도메인과 결합하고 이를 차단하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하여 기관 섬유증을 치료하기 위한 방법 및 조성물이 기재되어 있다.

손상 후 재생할 수 있는 기관의 능력은 나이가 들면서 감소한다. 노년층에서는, 만성 조직 손상이 흉터 조직 또는 섬유증의 발병 및 후속 기관 부전을 특징으로 하는 비정상적인 상처 치유 반응을 유발한다.

만성 조직 손상에 대한 부적응 상처 치유 반응은 기관 섬유증을 초래한다. 과도한 세포외 매트릭스 (ECM) 침착 및 활성화된 근섬유모세포에 의한 조직 리모델링을 수반하는 섬유증은 적절한 조직 구조 및 기관 기능의 손실을 유발한다. ADAM10-s에프린-B2 경로는 근섬유모세포 활성화의 주요 동인이다¹⁶. 본원에 나타낸 바와 같이, 섬유증의 발병에 관여하는 것 외에도, 이러한 경로는 구체적으로, 특히 중화 항체를 사용하여 s에프린-B2를 직접 차단하는 전략을 사용하여, 섬유증으로 진단된 대상체에서의 치료적 개입의 표적이 될 수 있다. 따라서 항-에프린-B2 항체는 섬유증, 예를 들어, 특발성 폐 섬유증 (IPF)이 있는 환자에서의 폐 섬유증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 진단 당시, 폐 섬유증은 정의상 확립되었지만 더 중요하게는 진행성이다. 항-에프린-B2 항체는 초기 및 말기 질환을 포함한 진행성 폐 섬유증뿐만 아니라 다른 기관에 존재하는 섬유증 (예를 들어, 특히 전신 섬유증/피부 경화증, 및 간 섬유증 또는 간경변)을 치료하는 데 사용될 수 있다.

따라서 본원에는 대상체에서의 기관 섬유증을 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 기관 섬유증이 있는 대상체를 확인하는 단계, 및 가용성 에프린-B2 엑토도메인과 결합하고 이를 차단하는 하나 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 치료상 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 기관 섬유증은 폐 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 피부, 신장 섬유증, 간 섬유증 또는 간경변, 전신 경화증, 또는 결합조직형성 종양이다.

일부 실시양태에서, 치료는 섬유증에서의 저하 및/또는 기관의 정상 기능으로의 복귀 또는 접근을 발생시킨다.

일부 실시양태에서, 대상체에게 폐 섬유증이 있고, 치료상 유효량은 감소된 폐 섬유증 및 개선된 폐 기능, 예를 들어 개선된 산소화 및/또는 강제 폐활량 (FVC)의 정상화를 발생시킨다.

일부 실시양태에서, 대상체에게 폐 섬유증이 있고, 예를 들어, 흉부 방사선 사진 또는 흉부 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 고 해상도 CT (HRCT) 스캔, 및 양측 기저의 흡기 수포음 상에서의 섬유증 패턴이 있다.

일부 실시양태에서, 대상체에게 전신 경화증 (SSc), 예를 들어, 손가락의 피부 비후, 손가락 끝 병변, 모세혈관확장증, 비정상적인 손톱주름 모세혈관, 간질성 폐 질환 또는 폐동맥 고혈압, 레이노 현상, 및 SSc-관련 자가항체가 있다.

일부 실시양태에서, 대상체에게 간 섬유증 또는 간경변이 있고, 예를 들어, 생검 또는 영상화, 예를 들어, 초음파 (US), 컴퓨터 단층촬영 (CT), 피브로스캔 또는 MR 영상화 (MRI)에서 검출된 섬유증이 있다.

일부 실시양태에서, 항체는 클론 B11 또는 2B1 항체이다.

일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 키메라, 탈면역화 또는 인간화 항체이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서의 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에 사용하기 위해 본원에 설명되어 있고; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 이들 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.

본 발명의 다른 특색 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1A-B. 에프린-B2는 IPF 섬유모세포에서 상향 조절된다. (A,B) 건강한 대조군 공여자 (n=3) 및 IPF가 있는 개인 (n=3)으로부터의 인간 폐 섬유모세포에서의 에프린-B2의 mRNA 및 단백질 발현 수준.
도 2A-C. 섬유모세포 특이적 에프린-B2 KO 마우스는 블레오마이신 유발 폐 섬유증으로부터 보호된다. (A) PBS 또는 블레오마이신 (BLM) 접종 후 14일에 대조군 야생형 (WT) 및 섬유모세포 특이적 에프린-B2 KO 마우스로부터의 폐 절편에 대한 마손(Masson)의 트리크롬 염색. (B) WT (왼쪽 막대) 및 KO (오른쪽)에서의 히드록시프롤린 함량. (C) α-SMA 및 유형 I 콜라겐 단백질 발현. n = 모든 군에 대해 6마리의 마우스.
도 3A-C. 에프린-B2 엑토도메인은 폐 손상 시 폐포 공간으로 유출된다. (A) PBS 또는 블레오마이신 접종 후 14일에 수거된 WT 마우스로부터의 전체 폐 균질물에서의 에프린-B2 발현 수준을 보여주는 웨스턴 블롯. 화살표는 저분자량 밴드 (약 50 kDa)의 출현을 나타낸다. (B) 처리 후 제14일에 PBS 접종된 마우스 (왼쪽 막대) 및 블레오마이신 접종된 마우스 (오른쪽 막대)로부터의 BAL 유체에서의 절단된 s에프린-B2 수준을 보여주는 웨스턴 블롯. (C) 본 모델에서 상이한 시점에 WT 마우스로부터의 BAL 유체에서의 에프린-B2 ELISA에 의해 결정된 바와 같은 s에프린-B2의 농도.
도 4A-F. 가용성 에프린-B2 엑토도메인은 근섬유모세포 형성 및 조직 섬유증을 구동시키기에 충분하다. (A) 전장 에프린-B2 단백질 및 Fc와 융합된 재조합 가용성 에프린-B2 엑토도메인의 도메인 구조. (B) 마우스 폐 섬유모세포에서의 α-SMA 및 유형 I 콜라겐 단백질 발현에 대한 에프린-B2-Fc 또는 IgG-Fc 대조군의 효과. (C) WT 마우스는 14일 동안 사전 클러스터링된 에프린-B2-Fc (n = 6) 또는 대조군으로서의 IgG-Fc (n = 6)의 매일 피하 주사로 처리되었다. H&E 및 마손의 트리크롬 염색이 도시된다. (D-F) 진피 섬유증 마커, 진피 두께 (D) 및 히드록시프롤린 (E)의 정량화 (왼쪽 막대, IgG-Fc; 오른쪽 막대, 에프린-B2-Fc), 및 피부에서의 α-SMA 및 유형 I 콜라겐 수준을 보여주는 웨스턴 블롯 (F).
도 5. 폐 섬유모세포에서의 TGF-β 유발 α-SMA 발현에 대한 대조군 (왼쪽 막대) 또는 항-에프린-B2 중화 항체 (B11, 오른쪽 막대)의 효과.
도 6. 항-에프린-B2 차단 항체를 사용한 치료 전략. WT 마우스는 기관내 점적 주입을 통해 블레오마이신 또는 식염수로 처리될 것이고, 표시된 바와 같이 항-에프린-B2 차단 항체 또는 대조군 항체로 처리될 것이다.
도 7A-C. 항-에프린-B2 항체는 마우스에서 근섬유모세포 활성화 및 블레오마이신 유발 폐 섬유증을 방지한다. (A) 항-에프린-B2 항체 (B11 클론) 또는 대조군 IgG2a 항체로 처리된 PBS 또는 블레오마이신 접종 후 21일에 마우스로부터의 폐 절편에 대한 마손의 트리크롬 염색 (콜라겐 유형 I)의 대표적인 영상 (군 당 n = 6마리 마우스로부터의 것). (B) 마우스의 폐에서 측정된 히드록시프롤린 함량 (콜라겐 수준) (모든 군에 대해 n = 6). (C) 전체 폐 균질물에서 실시간 PCR에 의해 평가된 α-SMA mRNA 발현 (모든 군에 대해 n = 6).
도 8A-C. 항-에프린-B2 항체는 TGF-β에 의해 구동된 근섬유모세포 활성화와 IPF 환자로부터의 폐 섬유모세포의 섬유증 표현형을 방지한다. (A) 대조군 (건강한) 공여자 (n = 5) 및 IPF가 있는 개인 (n = 5)으로부터의 1차 폐 섬유모세포로부터의 조건부 배지에서 ELISA에 의해 결정된 바와 같은 s에프린-B2의 농도. (B) 대조군 공여자 (n = 3)로부터의 1차 폐 섬유모세포 상에서의 TGF-β 유발 α-SMA 단백질 발현에 대한 항-에프린-B2 항체 (B11 클론)의 효과로, GAPDH가 부하 대조군으로 사용되었다. 모든 군에 대해 n = 3. 항-에프린-B2 항체는 TGF-β 유발 α-SMA 단백질 발현을 방지한다 (P < 0.05). (C) 대조군 공여자 (n = 3) 및 IPF가 있는 개인 (n = 3)으로부터의 1차 폐 섬유모세포 상에서의 α-SMA 단백질 발현 및 포스포-SMAD3에 대한 항-에프린-B2 항체 (B11 및 2B1 클론)의 효과로, GAPDH가 부하 대조군으로서 사용되었다. 모든 군에 대해 n = 3.
도 9A-B. s에프린-B2 수준은 IPF 환자로부터의 BAL 및 혈장에서 상향 조절된다. (A) ELISA에 의해 평가된 대조군 공여자 (n=30) 및 IPF 환자 (n=30)로부터의 BAL 유체 (A) 및 혈장 (B)에서의 s에프린-B2의 농도. **P < 0.01.
도 10. s에프린-B2 수준은 IPF 환자의 임상 결과와 상관이 있다. 증가된 혈장 s에프린-B2는 IPF 환자에서의 사망률 증가와 연관된다 (n=30, *P < 0.03).

조직 섬유증을 저하시키고 손상된 조직의 재생을 촉진하는 것을 목표로 하는 새로운 치료 전략의 확인은 재생 의학에서 충족되지 않은 주요 임상 요구이다. 본 개시내용은 조직 섬유발생의 새로운 분자 메커니즘을 밝혀내고 흉터 형성 근섬유모세포에서 ADAM10-가용성 에프린-B2 경로를 표적으로 하는 것이 확립된 폐 섬유증을 역전시키고 기관 기능을 회복시킨다는 것을 입증해준다. 본 연구 결과는 다양한 인간 섬유증 질환, 예컨대 특발성 폐 섬유증, 전신 경화증 (피부 경화증), 간경변, 신장 섬유증 및 결합조직형성 종양의 치료를 위한 새로운 치료 표적을 밝혀낸다.

폐 섬유증에서 ADAM10-s에프린-B2 경로를 표적으로 하는 것.

만성 폐 질환은 미국에서 주요 사망 원인 중 하나이다. 특발성 폐 섬유증 (IPF)은 변함 없이 폐 기능의 점진적인 감소를 유발하여 상당한 이환율과 사망률을 초래하는 흔한 폐 질환이다^1-3. IPF 환자는 궁극적으로 호흡 능력을 방해하는 진행성 폐 흉터 형성 (섬유증)을 특징으로 하는 비가역적이고 궁극적으로 치명적인 간질성 폐 질환을 앓고 있다^4,5. 최근 역학 연구에 따르면 IPF는 이전에 평가된 것보다 더 많은 사람들에게 영향을 미친다^6-8. 미국에서 IPF의 유병률은 최근 100,000명 당 10-60개 증례의 범위로 추정되며⁶, 이는 미국에서 IPF로 진단받은 사람이 130,000명에 이르고, IPF가 발병하는 사람이 매년 34,000명 정도로 많다는 것을 나타낸다⁹. IPF의 예후는 좋지 않다. 중앙값 생존 기간은 진단 시점으로부터 2년 내지 5년이다¹⁰. 현재의 요법은 주로, 최근에 허가된 2가지 항-섬유증 약물 (피르페니돈 및 닌테다닙) 또는 일부 IPF 환자에서 폐 기능의 감소를 완만하게 늦추지만^11,12, 질환 진행을 중지시키거나 역전시킬 수 없는 대증 치료제에 의존한다.

IPF는 허용될 수 없을 정도로 높은 이환율 및 사망률과 연관이 있다. 보다 효과적인 요법을 개발하려면 폐 섬유증의 발병기전에 관여한 생물학적 프로세스에 대한 이해를 개선시키고, 이러한 프로세스를 조절하는 분자 매개인자를 보다 완벽하게 확인해야 할 것이다. 흉터 형성 근섬유모세포의 활성화는 폐 섬유증의 발병과 진행의 기초가 되는 진행성 흉터 형성에 있어서 중요한 단계이다^3,13. 근섬유모세포는 증가된 콜라겐 합성 및 α-평활근 액틴 (α-SMA)의 발현을 명확하게 보여주며, 이는 ECM을 리모델링하기 위해 과수축 표현형을 부여한다¹⁴. 결과적으로, 근섬유모세포 활성화를 담당하는 분자 경로를 표적으로 하는 것이 IPF에 대한 치료 전략으로서 큰 잠재력을 가지고 있다^3,13-15.

ADAM10-s에프린-B2 경로는 최근 IPF 환자 및 폐 섬유증 마우스 모델에서 근섬유모세포 활성화의 주요 동인으로서 확인되었다¹⁶. 에프린-B2는 정지 폐 섬유모세포에서 고도로 발현되는 막횡단 리간드이지만^16,17, 그의 섬유증 유발성 효과는 폐 손상 시 발생하는 활성화 단계에 의해 조절된다. 최근 연구에 따르면 폐 손상 후 정지 폐 섬유모세포에서의 전장 에프린-B2의 엑토도메인이 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 ADAM10에 의해 단백질 분해적으로 절단되어, 생물학적으로 활성인 분자 가용성 에프린-B2 (s에프린-B2)가 생성된다는 것이 입증되었다. 일단 유출되면, s에프린-B2는 자가분비/주변분비 방식으로 EphB4 수용체 신호전달을 활성화함으로써 정지 섬유모세포에 대한 섬유증 유발성 신호전달을 생성한다. 본 발명의 연구는 s에프린-B2/EphB4 수용체 신호전달이, 정지 섬유모세포의 활성화된 근섬유모세포로의 분화를 촉진시키고 마우스에서 조직 섬유증을 구동시키기에 충분하다는 것을 명확하게 보여준다. 더욱이, 폐 섬유모세포에서 특이적으로 에프린-B2가 유전적으로 결여된 마우스는 블레오마이신 유발 폐 섬유증으로부터의 상당한 보호를 나타낸다. 놀랍게도, 항-s에프린-B2 항체의 투여는 확립된 섬유증을 역전시킨다. 결과적으로, s에프린-B2를 직접 차단함으로써 s에프린-B2의 동화를 방해하는 전략은 섬유증에 대한 새로운 치료 전략으로서 작용한다.

치료 방법

본원에서 입증된 바와 같이, 가용성 에프린-B2는 폐와 피부에서의 흉터 형성 근섬유모세포의 활성화를 구동시키기에 충분하다. 근섬유모세포 활성화에 관여한 병리학적 메커니즘이 기관 전반에 걸쳐 보존되어 있는 것으로 생각된다 (예를 들어, 문헌 [Rockey et al., N Engl J Med. 2015 Mar 19;372(12):1138-49] 참조). 따라서, 근섬유모세포의 섬유형성 상태를 유지하는 것에 관여한 경로를 표적으로 하는 것이 섬유증 장애에 대한 범 항-섬유증 표적을 나타낸다. 또한 문헌 [Zeisberg and Kalluri, Am J Physiol Cell Physiol. 2013 Feb 1;304(3):C216-25]을 참조한다.

본원에 기재된 방법은 기관 섬유증, 예를 들어, 폐 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 피부, 신장 섬유증, 간 섬유증 또는 간경변, 전신 경화증, 및 결합조직형성 종양을 치료하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 가용성 에프린-B2 엑토도메인과 결합하고 이를 차단하는 항체의 치료상 유효량을, 그러한 치료를 필요로 하거나 또는 그러한 치료를 필요로 하는 것으로 결정된 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 항체는 중화 항체 (예를 들어, 클론 B11) 및/또는 가용성 에프린 B2의 결합을 입체적으로 방해하는 항체 (예를 들어, 클론 2B1)일 수 있다.

이러한 맥락에서 사용된 바와 같은, "치료"는 기관 섬유증의 적어도 하나의 증상을 개선하는 것을 의미한다. 종종, 기관 섬유증은 조직의 흉터 형성 및 비후, 및 기능 상실 또는 기능에서의 저하를 초래하므로; 치료는 섬유증에서의 저하 및 기관의 정상 기능으로의 복귀 또는 접근을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 폐와 관련된 병태의 치료를 위한 본원에 기재된 화합물의 치료상 유효량의 투여는 감소된 폐 섬유증 및 개선된 폐 기능, 예를 들어, 개선된 산소화 및/또는 강제 폐활량 (FVC)의 정상화를 발생시킬 것이다.

상기 방법은 기관 섬유증이 있는 임의의 대상체에서 사용될 수 있다. 기관 섬유증이 있는 대상체을 확인하거나 진단하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 예를 들어, IPF에 대해서는, 문헌 [Raghu et al., Am J Respir Crit Care Med. 2018 Sep 1;198(5):e44-e68 및 Martinez et al., Lancet Respir Med. 2017 Jan;5(1):61-71]을 참조하고; 피부 경화증에 대해서는, 문헌 [van den Hoogen et al., Arthritis Rheum. 2013 Nov;65(11):2737-47]을 참조하며; 간 섬유증 및 간경변에 대해서는, 문헌 [Lurie et al., World J Gastroenterol. 2015 Nov 7;21(41):11567-83 및 Li et al., Cancer Biol Med. 2018 May; 15(2): 124-136]을 참조한다.

"유효량"은 유익하거나 원하는 결과에 영향을 미치기에 충분한 양이다. 예를 들어, 치료량은 원하는 치료 효과를 달성하는 양이다. 이러한 양은 질환 또는 질환 증상의 발병을 예방하는 데 필요한 양인 예방상 유효량과 동일하거나 상이할 수 있다. 그것은 또한 질환 또는 병태, 질환 또는 병태와 연관된 증상의 진행 위험을 지체, 지연 또는 저하시키거나 또는 그렇지 않으면 주어진 치료 프로토콜에 따라 투여될 때 질환 또는 병태의 허용되는 특징에서의 개선을 발생시키기에 충분한 항-에프린 B2 항체의 양을 지칭할 수 있다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 치료 화합물의 치료상 유효량 (즉, 유효 투여량)은 선택된 치료 화합물에 의존한다. 조성물은 격일에 한 번을 포함하여, 1일 1회 이상 내지 1주 1회 이상으로 투여될 수 있다. 통상의 기술자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 요인이, 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 더욱이, 본원에 기재된 치료 화합물의 치료상 유효량으로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.

치료 화합물의 투여량, 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50 (집단의 50%에 대해 치사인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료상 유효한 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 용량 비율이 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50의 비율로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화함으로써 부작용을 저하시키기 위해서는, 그러한 화합물을 병든 조직 부위로 표적화하는 전달 시스템을 설계하는 데 주의를 기울여야 한다.

세포 배양물 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에 사용할 투여량 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 투여량은 바람직하게 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 이용된 투여 형태 및 활용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물의 경우, 치료상 유효 용량은 초기에 세포 배양물 검정으로부터 추정될 수 있다. 세포 배양물에서 결정된 바와 같은 IC50 (즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 용량을 동물 모델에서 공식화할 수 있다. 이러한 정보는 인간에서의 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다. 혈장 내 수준은, 예를 들어, 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

s에프린 B2 (s에프린B2) 항체 - 제약 조성물 및 투여 방법

EphB 수용체에 대한 에프린-B2 결합은 최근에 그의 결정 구조가 확인된 에프린-B2 엑토도메인에서의 고도로 보존된 표면 영역에 의해 매개된다 (Toth et al., Dev Cell. 2001 Jul;1(1):83-92; Qin et al., J Biol Chem. 2010 Jan 1;285(1):644-54; Himanen et al., Nature. 2001 Dec 20-27;414(6866):933-8). 본 발명자들은 EphB 수용체를 활성화하는 데 필요한 에프린-B2 엑토도메인이 폐 손상 시 유출된다는 것과, 가용성 엑토도메인이 생물학적으로 활성이고 폐 섬유모세포에서 EphB 수용체 신호전달과 결합하여 이를 활성화할 수 있다는 것을 밝혀내었다. s에프린-B2 엑토도메인에 의한 EphB 수용체 활성화는 근섬유모세포 활성화를 유도하기 때문에, 이러한 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 것은 기관 섬유증의 치료를 위한 항-섬유증 요법으로서의 잠재적인 의학적 적용을 가질 수 있었다. s에프린-B2 신호전달을 억제하는 한 가지 접근 방식은 그와 EphB 수용체 (즉, EphB3 및 EphB4)의 결합 및 활성화를 중화시키는, 에프린-B2 엑토도메인에 대항한 차단 항체를 사용하는 것이다. 엑토도메인과 결합하면서 수용체 신호전달을 방지하는 고도로 특이적인 에프린-B2 차단 항체가 개발되었다²⁶. 따라서, 본 발명의 방법은 에프린B2 엑토도메인과 결합하고 수용체 신호전달을 방지하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 치료상 유효량을 포함하는 조성물의 투여를 포함할 수 있다.

본원에 기재된 방법은 활성 성분으로서 s에프린-B2 항체를 포함하는 제약 조성물의 사용을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 이뮤노글로불린 분자의 항원 결합 부분의 예는 항원과 결합할 수 있는 능력을 보유하는 F(ab) 및 F(ab')2 단편을 포함한다. 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 재조합, 키메라, 탈면역화 또는 인간화, 완전 인간, 비-인간 (예를 들어, 뮤린), 또는 단일 쇄 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서 항체는 이펙터 기능을 가지며 보체를 고정할 수 있다. 항체 또는 항체의 단편은 관련 기술분야에 공지되어 있고 항체에 통상적으로 적용되는 번역 후 변형 중 임의의 것을 포함하도록 처리될 수 있으며, 단 변형된 항체 또는 단편은 인간 또는 뮤린 에프린 B2와의 결합에 대한 특이성을 유지해야 한다. 변형은 PEG화, 인산화, 메틸화, 아세틸화, 유비퀴틴화, 니트로실화, 글리코실화, ADP-리보실화 또는 지질화를 포함할 수 있다. 또 다른 한편으론, 또는 또한, 항체 또는 단편은 면역검정에서 결합을 검출하는 데 사용될 수 있는 검출가능한 표지를 추가로 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 표지는 방사성 표지, 형광단, 화학발광 표지, 효소 표지 (예를 들어, 알칼리성 포스파타제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제); 비오틴; 아비딘; 및 중금속을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fc 수용체와 결합할 수 있는 능력이 저하되거나 전혀 없다. 예를 들어, 항체는 Fc 수용체에 대한 결합을 지지하지 않는, 이소형 또는 하위유형, 단편 또는 다른 돌연변이체일 수 있으며, 예를 들어, 그것은 돌연변이 유발되거나 또는 결실된 Fc 수용체 결합 영역을 갖는다. 상기 기재된 s에프린B2 항체 이외에, 다른 항체를 만들 수 있다. 항체 및 그의 단편을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Harlow et al., editors, Antibodies: A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, (N.Y. Academic Press 1983); Howard and Kaser, Making and Using Antibodies: A Practical Handbook (CRC Press; 1st edition, Dec 13, 2006); Kontermann and Duebel, Antibody Engineering Volume 1 (Springer Protocols) (Springer; 2nd ed., May 21, 2010); Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Humana Press; Nov 10, 2010); 및 Duebel, Handbook of Therapeutic Antibodies: Technologies, Emerging Developments and Approved Therapeutics, (Wiley-VCH; 1 edition September 7, 2010)]을 참조한다. 인간 에프린B2의 서열은 수탁 번호 NM_004093.3 (핵산) 및 NP_004084.1 (단백질)로 젠뱅크(GenBank)에 제공된다. 전장 인간 에프린B2 전구체의 예시적인 서열은 하기와 같다:

일부 실시양태에서, 에프린B2 엑토도메인은 서열식별번호: 1의 아미노산 29 내지 165를 포함하거나 이로 이루어진다 (상기 볼드체).

제약 조성물은 전형적으로 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여에 적합한 희석제, 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보조 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

제약 조성물은 전형적으로 그의 의도된 투여 경로와 상용성이 되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 복강내, 경구 (예를 들어, 흡입, 비강내), 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다.

적합한 제약 조성물을 제형화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005; 및 the books in the series Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)]을 참조한다. 예를 들어, 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 주사용 수, 식염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 인산염 및 등장성 조정을 위한 작용제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰풀, 일회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다수회 투여 바이알에 동봉될 수 있다.

주사 가능한 용도로 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor) EL™ (BASF; 미국 뉴저지주 파르시파니) 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균성이어야만 하고, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며, 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야만 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅제 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당, 다가알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 발생될 수 있다.

멸균 주사 가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 후, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조되며, 이러한 비히클은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유한다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이는 사전에 멸균 여과된 그의 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 부가의 원하는 성분의 분말을 생성한다.

경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고 정제, 트로키제 또는 캅셀제, 예를 들어, 젤라틴 캅셀제의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세정제로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 제약상 상용성인 결합제, 및/또는 아주반트 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캅셀제, 트로키제 등은 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스; 붕해제 예컨대 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스; 활탁제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료.

흡입에 의한 투여의 경우, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어, 기체 예컨대 이산화탄소, 또는 분무기를 함유하는 가압 용기 또는 분배기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달될 수 있다. 이러한 방법은 미국 특허 번호 6,468,798에 기재된 것을 포함한다.

본원에 기재된 바와 같은 치료 화합물의 전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과되는 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투여를 위한 세제, 담즙염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약을 사용하여 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 바와 같은 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화된다.

제약 조성물은 또한 좌약 (예를 들어, 통상적인 좌약 기제 예컨대 코코아 버터 및 다른 글리세리드를 수반함) 또는 직장 전달을 위한 정체 관장제의 형태로 제조될 수 있다.

한 실시양태에서, 치료 화합물은 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제형과 같이, 신체로부터의 신속한 제거에 대항하여 치료 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체 적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형은 표준 기술을 사용하여 제조되거나, 또는 예를 들어, 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼즈, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 수득될 수 있다. 리포솜 현탁액 (세포성 항원에 대한 모노클로날 항체로 선택된 세포를 표적으로 하는 리포솜 포함)이 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

제약 조성물은 투여에 대한 지침과 함께, 용기, 팩 또는 분배기에 포함될 수 있다. 따라서, 또한 본원에는, 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 s에프린B2 항체를 포함하는 장치, 예컨대 흡입기가 포함된다.

실시예

본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.

에프린-B2는 IPF 섬유모세포에서 상향 조절된다. 본 발명자들은 이전에, 신속하게 진행되는 IPF 환자의 폐에서 섬유모세포의 이동 및 활성화와 연관된 유전자의 증가된 발현을 보여주었다¹⁸. IPF 섬유모세포에서의 활성화 및 이동을 조절하는 추정 유전자를 확인하기 위해, 본 발명자들은 IPF가 있는 개인으로부터 단리된 폐 섬유모세포의 유전자 발현을, 대조군으로서 사용된 건강한 폐 섬유모세포의 유전자 발현과 비교하는 공개적으로 이용 가능한 마이크로어레이 데이터 세트를 분석하고^19,20, 막횡단 단백질 에프린-B2를 코딩하는 유전자인 EFNB2가 IPF 폐 섬유모세포에서 유의미하게 증가하였다는 것을 밝혀내었다. EFNB2 (유전자 발현 옴니버스 수탁 번호 GSE1724)¹⁹는 인접 세포의 표면에서 Eph 수용체와 결합하는 에프린 리간드 패밀리에 속하는 막횡단 단백질 에프린-B2를 코딩한다²¹. 리간드의 에프린 패밀리는 구조에 따라 포스파티딜이노시톨-연결된 에프린-A 리간드 (에프린-A1-6)와 막횡단 에프린-B 리간드 (에프린-B1-3)로 나누어진다^17,21. 에프린-A 리간드와 에프린-B 리간드 둘 다는 인접 세포의 표면에서 Eph 수용체와 결합하여 생화학적 신호전달을 개시한다²¹. 모든 에프린-A 및 -B 리간드 중에서, 에프린-B2는 폐 섬유모세포에서 발현되는 가장 높은 에프린 리간드이며, 그의 발현은 IPF 환자로부터의 폐 섬유모세포에서 상향 조절된다¹⁹. 본 발명자들은 또한 mRNA 및 단백질 분석에 의해 입증된 바와 같이, 리간드의 에프린 패밀리의 다른 구성원이 아닌 에프린-B2의 발현이, 대조군 대상체로부터 단리된 폐 섬유모세포와 비교하여 폐 IPF 섬유모세포에서 현저히 더 높다는 것을 확인하였다 (도 1A,B).

섬유모세포 특이적 에프린-B2 결핍 마우스는 블레오마이신 유발 폐 섬유증으로부터 보호된다. 이어서, 본 발명자들은 섬유모세포 에프린-B2가 생체 내에서 섬유증의 발병에 필요한지의 여부를 조사하였다. 전반적으로 에프린-B2가 결핍된 마우스는 심혈관 발달 결함으로 인해 임신 중기에 사망함에 따라, 본 발명자들은 콜라겐 발현 세포, 예컨대 섬유모세포에서 Efnb2를 조건부로 결실시킬 수 있는 마우스를 생성하였다. 본 발명자들은 loxP 부위에 의해 플랭킹된 Efnb2가 있는 마우스 (Efnb2loxP/loxP 마우스)를, Col1a2 (콜라겐, 유형 I, 알파 2)의 마우스 프로모터에 의해 구동되는 타목시펜 유도성 Cre 재조합효소를 발현하는 마우스 (Col1a2-CreERT 마우스)와 교배하였다. PCR에 의해 확인된 바와 같이, '플록스트(floxed)' Efnb2 대립유전자에 대해 동형접합성이고 Col1a2-Cre 트랜스진에 대해 반접합성인 자손 (Efnb2loxP/loxP; Col1a2-CreERT 마우스)의 타목시펜 처리는 섬유모세포에서의 Efnb2 유전자의 결실 및 Efnb2 조건부 녹아웃 마우스의 생성을 발생시켰다. 옥수수 오일 비히클 단독으로 처리된 한배 새끼를 대조군으로서 사용하였다. 에프린-B2 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅은 대조군 마우스와 비교하여 에프린-B2 KO 마우스의 폐 섬유모세포로부터의 추출물에서 현저히 더 낮은 발현을 명확하게 보여주었다. 본 발명자들의 연구는 조직학적 (콜라겐 축적에 대한 마손의 트리크롬 염색), 생화학적 (콜라겐 함량에 대한 히드록시프롤린 수준) 및 분자적 (유형 I 콜라겐 및 α-SMA, 근섬유모세포 분화 마커) 평가에 의해 입증된 바와 같이, 섬유모세포 특이적 에프린-B2 결핍 마우스가 야생형 (WT) 마우스와 비교하여 블레오마이신에 의해 유발된 폐 섬유증의 발병으로부터 현저한 보호를 나타냈다는 것을 입증해주었다 (도 2A-C).

에프린-B2 엑토도메인은 폐 손상 시 유출된다. 본 발명자들은 블레오마이신 접종이 전장 막횡단 에프린-B2 (약 60 kDa)의 발현을 증가시키지 않았지만, 대조군 폐에는 없는 저 분자량 밴드 (약 50 kDa)의 생성을 발생시켰다는 것을 발견하였다 (도 3A, 화살표는 50 kDa 밴드를 나타낸다). 에프린-B 리간드는 활성 단백질을 방출하기 위해 엑토도메인 유출을 겪는 것으로 나타났기 때문에^22-25, 본 발명자들은 블레오마이신 손상 후 에프린-B2의 단백질 분해적 절단이, 폐 섬유증의 발병기전에 기여할 수 있는 s에프린-B2로서 본원에 지칭된 50 kDa 가용성 형태의 에프린-B2의 생성을 발생시켰다고 가정하였다. 본 발명자들의 결과는 웨스턴 블롯팅에 의해, 및 엑토도메인 특이적 항-에프린-B2 모노클로날 항체를 사용하는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 입증된 바와 같이, 블레오마이신 접종 후 WT 마우스의 기관지폐포 세척 (BAL) 유체로부터의 무세포 상청액에서 s에프린-B2에서의 상당한 증가를 입증해주었다 (도 3B,C). 취합하면, 본 발명자들의 결과는 폐 손상 후 에프린-B2 엑토도메인이 유출된다는 것을 입증해주었다.

가용성 에프린-B2 엑토도메인은 근섬유모세포 활성화 및 조직 섬유증을 구동시키기에 충분하다. s에프린-B2가 섬유증 유발성 매개인자로서 직접적으로 기능하였는지의 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 섬유모세포를 재조합 에프린-B2 엑토도메인-Fc로 처리하였으며, 이는 전장 에프린-B2 단백질의 막횡단 및 C-말단 도메인을 대체하는 Fc 도메인과 융합된 에프린-B2의 엑토도메인을 함유한다 (도 4A). 사전 클러스터링된 에프린-B2-Fc로 1차 마우스 폐 섬유모세포를 처리하면 대조군 IgG-Fc 처리와 비교하여 α-SMA 및 유형 I 콜라겐 단백질 발현이 현저하게 증가하였으며, 이는 직접적인 섬유증 유발성 효과를 뒷받침해준다 (도 4B). 다음으로, 본 발명자들은 사전 클러스터링된 에프린-B2-Fc (100 μg/kg) 또는 대조군 IgG-Fc를 2주 동안 매일 피하 투여하였고, 대조군과 비교하여 증가된 진피 두께, 히드록시프롤린 함량 및 α-SMA 및 유형 I 콜라겐 발현에 의해 평가된 바와 같이 진피 섬유증에서의 현저한 증가를 확인하였다 (도 4C-F). 취합하면, 이들 데이터는 에프린-B2 엑토도메인이 생체 내에서 근섬유모세포 활성화 및 조직 섬유증을 구동시키기에 충분하다는 것을 보여준다.

IPF에서의 폐 섬유증의 치료를 위한 s에프린-B2에 대항한 치료 항체. 본 발명자들의 연구는 s에프린-B2 엑토도메인의 피하 주사가 근섬유모세포 활성화를 유도함으로써 마우스 생체 내에서 조직 섬유증을 유발시키기에 충분하다는 것을 입증해준다. 취합하면, 본 발명자들의 결과는 s에프린-B2 신호전달의 치료적 억제가 근섬유모세포 활성화를 방지함으로써 폐 섬유증을 완화하는 새로운 전략을 나타낼 수 있다는 것을 시사한다. 에프린-B2 신호전달 차단을 목표로 하는 치료 전략은 이전에 암 치료를 위해 개발되었지만^26,27, 항-섬유증 효과는 연구된 적이 없었다.

s에프린-B2 엑토도메인에 의한 EphB4 수용체 활성화가 근섬유모세포 활성화를 유도하기 때문에, 이러한 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 것은 IPF의 치료를 위한 항-섬유증 요법으로서의 잠재적인 의학적 적용을 가질 수 있었다. s에프린-B2 신호전달을 억제하는 한 가지 접근 방식은 EphB4 수용체의 결합 및 활성화를 중화시키는 에프린-B2 엑토도메인에 대항한 차단 항체를 개발하는 것이다. 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여, EphB4 수용체에 대한 에프린-B2 결합을 중화시키는 강력한 항-에프린-B2 항체 (클론 B11)를 확인하였다²⁶. 최근 연구에서는 B11이 흑색종 및 유방암의 전임상 모델^26,27 뿐만 아니라 이종이식편 모델²⁶에서 강력한 연구 도구로서 검증되었다.

B11 중화 항체로 s에프린-B2를 차단하면 TGF-β 유발 근섬유모세포 형성이 방지된다. 시험관 내에서 s에프린-B2 차단 항체의 치료 효능을 조사하기 위해, 본 발명자들은 48시간 동안 B11 항-에프린-B2 차단 항체 (100 μg/mL = 3 μM)의 존재 또는 부재하에 TGF-β로 처리된 1차 인간 폐 섬유모세포에서의 α-SMA 발현에 의한 근섬유모세포 활성화를 평가하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, B11 전처리는 폐 섬유모세포에서의 TGF-β 유발 α-SMA 발현을 유의미하게 저하시킨다.

B11 중화 항체로 s에프린-B2를 차단하면 마우스 모델에서 폐 섬유증이 역전된다. 상기 본 발명자들의 연구 결과에 기초하여, 본 발명자들은 중화 항체를 사용한 s에프린-B2의 치료적 억제가 생체 내에서 근섬유모세포 활성화를 억제함으로써 폐 섬유증을 치료할 수 있었다고 가정하였다. 생체 내에서 s에프린-B2 차단 항체의 치료 효능을 조사하기 위해, 본 발명자들은 블레오마이신 유발 폐 섬유증 모델에서 폐 섬유증을 역전시킬 수 있는 에프린-B2 차단 항체 (클론 B11)의 능력을 조사하였다. 이러한 폐 섬유증의 마우스 모델에서, C57Bl/6 마우스 계통은 블레오마이신 접종 후 제21일에 강력한 폐 섬유증을 발생시킨다. 성별에 따른 차이를 해결하기 위해 동일한 수의 수컷 마우스와 암컷 마우스가 사용되었다. 블레오마이신 [겐시아 시코르 파마슈티칼즈(Gensia Sicor Pharmaceuticals)]은 본 발명자들의 실험실의 표준 방법에 따라 마우스에 기관내로 (i.t.) 투여되었다. 1.2 단위/k의 거의 치사량에 가까운 용량이 사용되었으며, 이는 사망을 일으키지 않고 폐 섬유증을 유발하기에 충분하다.

이러한 "치료 전략"에서, 에프린-B2 차단 항체는 블레오마이신 접종 후 제14일에 투여되었고, 제21일까지 실험 지속 기간 동안 계속되었다. 이들 실험을 위해, 에프린-B2 차단 항체를 20 mg/kg의 총 용량에 도달할 때까지 매주 2회 0.2 ml PBS에서 4 mg/kg으로 정맥내 주사하였다. 대조군 C57Bl 마우스는 대조군 IgG2a 항체 (클론 C1.18.4, BioXCell)를 받게 될 것이다. 군 당 10마리의 마우스가 사용되었다. 블레오마이신 및 에프린-B2 차단 항체 투여 시기가 도 6에 도시되어 있다.

맹검 조직학적 분석에 따르면 대조군 IgG2a 항체를 받은 마우스에서 블레오마이신 접종 후 21일에 야기된 폐 실질 섬유증이 에프린-B2 차단 항체 (클론 B11)로 처리된 마우스에서 완화되었으며 (도 7A), 이는 폐 히드록시프롤린 수준에서의 현저한 저하와 연관이 있는 것으로 밝혀졌다 (도 7B). 이러한 폐 섬유증 모델에서 에프린-B2 차단 항체의 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해, 본 발명자들은 qPCR에 의해 생체 내에서 근섬유모세포 형성을 평가하였다. 에프린-B2 차단 항체가 폐 섬유모세포에서 TGF-β 유발 α-SMA 발현을 억제한다는 것을 입증해주는 본 발명자들의 시험관내 연구에 따르면, 에프린-B2 차단 항체로 마우스를 치료적 처치하면, α-SMA의 발현을 하향 조절함으로써 확립된 폐 섬유증을 역전시키며, 이는 폐 섬유증에서의 근섬유모세포의 활성화된 세포성 상태가 s에프린-B2 신호전달에 의해 제어된다는 것을 나타낸다.

통계 분석. 다른 모든 결과 조치에서의 차이는 상기 기재된 바와 같이 무작위화 블록 ANOVA에 의해 통계적 유의성에 대해 시험될 것이다. P < 0.05는 모든 비교에서 유의미한 것으로 간주될 것이다.

중화 항체로 s에프린-B2를 차단하면 IPF 환자로부터의 인간 폐 섬유모세포의 활성화된 표현형이 역전된다. 인간 질환에 대한 본 발명자들의 연구의 관련성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 IPF가 있는 개인 및 건강한 대조군의 폐로부터 단리된 섬유모세포에서의 ADAM10-s에프린-B2 신호전달의 역할을 조사하였다. IPF 폐 섬유모세포는 시험관 내에서의 정상 폐 섬유모세포와 비교하여 배양 배지에서의 s에프린-B2의 농도가 실질적으로 더 높았으며 (도 8A), 이는 이러한 경로가 인간 질환에서 활성화되고 치료적 개입의 표적이 될 수 있다는 것을 나타낸다. 인간에서 에프린-B2 차단 항체의 치료 잠재력을 특징 규명하기 위해, 본 발명자들은 먼저 1차 인간 폐 섬유모세포에서 TGF-β에 의해 구동되는 근섬유모세포 활성화에 대한 B11 에프린-B2 항체의 효과를 조사하였다. 도 8B에 도시된 바와 같이, 항-에프린-B2 항체는 건강한 1차 폐 섬유모세포에서의 TGF-β 유발 α-SMA 단백질 발현을 방지한다. 본 발명자들은 다음으로 항-에프린-B2 항체가 IPF 환자로부터 단리된 섬유증 폐 섬유모세포의 활성화된 표현형을 역전시킬 수 있었는지의 여부를 조사하였다. 도 8C에 도시된 바와 같이, α-SMA는 건강한 대조군 섬유모세포와 비교하여 IPF 섬유모세포 상에서 상향 조절되며, 48시간 동안 항-에프린-B2 항체 (클론 B11)로 IPF 섬유모세포를 처리하면 α-SMA 수준이 유의미하게 저하되며 (도 8C), 이는 항-에프린-B2 요법이 IPF 환자로부터의 섬유증 섬유모세포에서 섬유증 유발성 메커니즘을 직접적으로 하향 조절한다는 것을 나타낸다. 추가로, IPF 섬유모세포는 이전에 입증된 바와 같이, 에프린-B2 엑토도메인과 결합하지만 EphB4 수용체에 대한 그의 결합을 방지하지 않는 제2의 항-에프린-B2 항체 (클론 2B1)로 처리되었다. 도 8C에 도시된 바와 같이, 섬유증 IPF 섬유모세포를 항-에프린-B2 항체 (클론 2B1)로 처리하면 유사하게, 클론 B11과 동일한 정도로 α-SMA 수준이 감소된다. 주목할 만하게, 항-에프린-B2 요법에 의해 조정되는 분자 경로를 조사하는 동안, 본 발명자들은 B11 에프린-B2 항체가 표준 TGF-β 경로의 대리 마커인 건강한 섬유모세포와 비교하여 IPF 섬유모세포에서 증가된 포스포-SMAD3 수준에 영향을 미치지 않았다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 B11 에프린-B2 항체의 항-섬유증 효과가 표준 TGF-β 경로의 조정으로 인한 것이 아님을 나타낸다. 반대로, 2B1 에프린-B2 항체는 IPF 섬유모세포에서의 포스포-SMAD3 수준을 하향 조절하였는데, 이는 이러한 항체의 항-섬유증 효과가 표준 TGF-β 경로의 직접적인 조정으로부터 비롯된다는 것을 나타낸다. 취합하면, B11 및 2B1 에프린-B2 항체 둘 다는 별개인 것으로 보이는 작용 메커니즘이 있음에도 불구하고 인간 IPF 섬유모세포의 항-섬유증 활성을 갖는다.

s에프린-B2 수준은 IPF 환자에서의 혈장 및 기관지폐포 세척 유체에서 상향 조절된다. IPF의 자연 역사는 매우 가변적이며 개별 환자에서의 질환 진행 속도를 예측하기 어렵다²⁸. 임상적, 조직병리학적 및 방사선학적 분석이 IPF 환자의 사망률을 예측할 수 있었지만¹⁰, 질환 진행을 예측할 수 있는 임상적으로 활용되는 바이오마커는 없다. IPF에서의 혈액 바이오마커는 질환 진행을 예측할 수 있는 본 발명자들의 능력을 개선시키고자 하는 희망을 가지고 조사되고 있다^29-32. 상피 손상의 바이오마커 예컨대 KL-6^33,34 및 내피 활성화의 바이오마커 예컨대 VEGF³⁵ 또는 VCAM-1^36,37이 IPF에서 불량한 생존을 예측하는 것으로 밝혀졌지만, IPF에서의 근섬유모세포 활성화의 바이오마커는 아직 확인되지 않았다. 본 발명자들의 결과는 s에프린-B2 수준이 8명의 건강한 지원자로부터의 샘플과 비교하여 IPF가 있는 16명의 개인의 BAL 유체에서 현저하게 증가된 농도를 보여준다는 것을 나타낸다 (도 9A). 그런 다음 본 발명자들은 IPF가 있는 30명의 개인과 30명의 성별이 매칭되는 비흡연 대조군에서의 혈장 s에프린-B2 농도를 비교하였고, 대조군으로부터의 샘플과 비교하여 IPF가 있는 개인에서 현저하게 더 높은 혈장 s에프린-B2 농도를 관찰하였다 (도 9B). 취합하면, 본 발명자들의 데이터는 혈장 s에프린-B2가 IPF에서 새로운 근섬유모세포 예후 바이오마커로서 제공될 수 있다는 것을 나타낸다.

증가된 혈장 s에프린-B2 수준은 IPF 환자의 사망률 증가와 연관이 있다. IPF의 진행에 대한 본 발명자들의 바이오마커 연구의 관련성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 혈장 s에프린-B2 수준이 질병의 중증도 및 IPF에서의 결과와 상관이 있는지를 조사하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, IPF 환자에서의 혈장 수준은 이들 환자의 임상 결과와 상관이 있다. 본 발명자들의 데이터는 진단 당시 혈장 s에프린-B2 수준의 기준선이 더 높았던 환자가 폐 기능이 급격히 감소하여 환자의 사망을 초래한다는 것을 명확하게 보여준다.

참고문헌

다른 실시양태

본 발명이 상세한 설명과 연계해서 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위에 의해 규정되는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 예시하기 위한 것임을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> The General Hospital Corporation <120> ANTI-EPHRIN-B2 BLOCKING ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF FIBROTIC DISEASES <130> 40978-0028WO1 <140> PCT/US2019/068746 <141> 2019-12-27 <150> 62/785,873 <151> 2018-12-28 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 333 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Val Arg Arg Asp Ser Val Trp Lys Tyr Cys Trp Gly Val Leu 1 5 10 15 Met Val Leu Cys Arg Thr Ala Ile Ser Lys Ser Ile Val Leu Glu Pro 20 25 30 Ile Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Ser Lys Phe Leu Pro Gly Gln Gly Leu 35 40 45 Val Leu Tyr Pro Gln Ile Gly Asp Lys Leu Asp Ile Ile Cys Pro Lys 50 55 60 Val Asp Ser Lys Thr Val Gly Gln Tyr Glu Tyr Tyr Lys Val Tyr Met 65 70 75 80 Val Asp Lys Asp Gln Ala Asp Arg Cys Thr Ile Lys Lys Glu Asn Thr 85 90 95 Pro Leu Leu Asn Cys Ala Lys Pro Asp Gln Asp Ile Lys Phe Thr Ile 100 105 110 Lys Phe Gln Glu Phe Ser Pro Asn Leu Trp Gly Leu Glu Phe Gln Lys 115 120 125 Asn Lys Asp Tyr Tyr Ile Ile Ser Thr Ser Asn Gly Ser Leu Glu Gly 130 135 140 Leu Asp Asn Gln Glu Gly Gly Val Cys Gln Thr Arg Ala Met Lys Ile 145 150 155 160 Leu Met Lys Val Gly Gln Asp Ala Ser Ser Ala Gly Ser Thr Arg Asn 165 170 175 Lys Asp Pro Thr Arg Arg Pro Glu Leu Glu Ala Gly Thr Asn Gly Arg 180 185 190 Ser Ser Thr Thr Ser Pro Phe Val Lys Pro Asn Pro Gly Ser Ser Thr 195 200 205 Asp Gly Asn Ser Ala Gly His Ser Gly Asn Asn Ile Leu Gly Ser Glu 210 215 220 Val Ala Leu Phe Ala Gly Ile Ala Ser Gly Cys Ile Ile Phe Ile Val 225 230 235 240 Ile Ile Ile Thr Leu Val Val Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Arg Arg His 245 250 255 Arg Lys His Ser Pro Gln His Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ser Thr Leu 260 265 270 Ala Thr Pro Lys Arg Ser Gly Asn Asn Asn Gly Ser Glu Pro Ser Asp 275 280 285 Ile Ile Ile Pro Leu Arg Thr Ala Asp Ser Val Phe Cys Pro His Tyr 290 295 300 Glu Lys Val Ser Gly Asp Tyr Gly His Pro Val Tyr Ile Val Gln Glu 305 310 315 320 Met Pro Pro Gln Ser Pro Ala Asn Ile Tyr Tyr Lys Val 325 330

Claims (13)

1. 기관 섬유증이 있는 대상체를 확인하는 단계, 및
   가용성 에프린-B2 엑토도메인과 결합하고 이를 차단하는 하나 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 치료상 유효량을 투여하는 단계
   를 포함하는, 대상체에서 기관 섬유증을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 기관 섬유증이 폐 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 피부, 신장 섬유증, 간 섬유증 또는 간경변, 전신 경화증, 또는 결합조직형성 종양인 방법.
3. 제1항에 있어서, 치료가 섬유증에서의 저하 및/또는 기관의 정상 기능으로의 복귀 또는 접근을 발생시키는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 대상체에게 폐 섬유증이 있고, 치료상 유효량이 감소된 폐 섬유증 및 개선된 폐 기능, 예를 들어, 개선된 산소화를 발생시키는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 대상체에게 폐 섬유증이 있는 방법.
6. 제5항에 있어서, 대상체에게 흉부 방사선 사진 또는 흉부 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 고 해상도 CT (HRCT) 스캔, 및 양측 기저의 흡기 수포음 상에서의 섬유증 패턴이 있는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 대상체에게 전신 경화증이 있는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 대상체에게 손가락의 피부 비후, 손가락 끝 병변, 모세혈관확장증, 비정상적인 손톱주름 모세혈관, 간질성 폐 질환 또는 폐동맥 고혈압, 레이노 현상, 및 SSc-관련 자가항체가 있는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 대상체에게 간 섬유증 또는 간경변이 있는 것인 방법.
10. 제9항에 있어서, 대상체에게 생검 또는 영상화, 예를 들어, 초음파 (US), 컴퓨터 단층촬영 (CT), 피브로스캐닝 또는 MR 영상화 (MRI)에서 검출된 섬유증이 있는 것인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 클론 B11 항체인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 클론 2B1 항체인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 키메라, 탈면역화 또는 인간화 항체인 방법.

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