JP2023030022A - 線維症の処置 - Google Patents

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Abstract

【課題】線維症を処置するための組成物、方法、およびキットの提供。【解決手段】個体における線維症を処置する方法であって、インスリン調節性アミノペプチダーゼ（ＩＲＡＰ）のインヒビタを投与することを含み、それによって、線維症を処置する方法。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、オーストラリア仮出願特許第２０１５９０３０３５号明細書の優先権を主張する。この出願の全体の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、線維症を処置するための組成物、方法、およびキットに関する。特に、該組成物、方法、およびキットは、臓器の線維症の処置に特に有用であるが、これに限定されない。
発明の背景
心血管疾患（ＣＶＤ）は、世界の罹患率および死亡率の主因であり続け、毎年１７００万人の死亡が公言されており、これは世界的に、２秒毎に１人の死亡に相当する。重要なことに、主要なＣＶＤの罹患率は、６０歳以降に指数関数的に増大しており、高齢の患者は大抵、心機能障害または慢性心不全（ＣＨＦ）を患っている。ＣＶＤは大抵、任意の心臓発作または心損傷の直後に始まり、これはその後、心臓リモデリングとして公知のプロセスにおいて、自然防衛機構および炎症性反応をトリガーして、損傷を逆調節し（counter-regulate）、かつ修復する。しかしながら、損傷が反復的であり、または反応リモデリングの調節が異常であると、最終的に、心臓内に過剰なコラーゲンが蓄積されて、次第に不可逆性の線維化反応に向かい、一生治らない瘢痕化または心線維症に至る。その後、心臓への血液供給が損なわれる一方、心臓のスティフネスが増大して、心収縮性をさらに妨害し、これが心筋梗塞（ＭＩ）、慢性心不全（ＣＨＦ）、または末端臓器障害の素因になる。そのような事象は高齢の集団で起こる見込みがより大きいので、心筋梗塞または損傷に増々罹り易くなり、加齢それ自体が、非効率な修復プロセスによって危うくなる。さらに、線維症に向けられる利用可能な処置は殆どない。このうち、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビタまたはアンギオテンシン受容体ブロッカ（ＡＲＢ）が、約７％しかＣＶ死亡率を引き下げなかった。
線維症は、種々の組織、例えば心臓（先で議論された）、肺、肝臓、皮膚、血管、および腎臓において発生し得る。
線維症を処置かつ／または予防する療法が必要とされている。
本明細書中での任意の先行技術の引用は、この先行技術が、任意の法域内で一般的な常識の一部を形成すること、またはこの先行技術が、当業者によって理解され、関連するとみなされ、かつ／もしくは先行技術の他の部分と組み合わされることが合理的に予想され得ることの、容認でも示唆でもない。
発明の概要
本発明は、個体における線維症を処置する方法であって、インスリン調節性アミノペプチダーゼ（ＩＲＡＰ）のインヒビタを投与することを含み、それによって、線維症を処置する方法を提供する。好ましくは、個体は、線維症を患っていると同定される。
本発明の任意の態様において、方法または使用は、線維症の、少なくとも１つの臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性の進行を遅らせることによって、線維症を処置する。
本発明の任意の態様において、方法または使用は、線維症の、少なくとも１つの臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性を逆転することによって、線維症を処置する。
臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性は、以下の臓器機能障害、瘢痕化、正常な細胞外マトリックスバランスの変化、コラーゲン沈着の増大、筋線維芽細胞への線維芽細胞の分化、マトリックスメタロプロテイナーゼレベルの下降、およびマトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビタレベルの上昇のいずれか１つまたは複数であってよい。好ましくは、コラーゲンは、１型コラーゲンα１の前駆体または成熟形態である。
本発明の任意の態様において、線維症は、年齢起因性であっても、損傷起因性であっても、ストレス起因性であってもよい。好ましくは、線維症は、心線維症、肝線維症、腎線維症、血管線維症、肺線維症、および真皮線維症からなる群より選択される。
本発明の任意の方法において、方法はさらに、線維症を患う個体を同定する工程を含む。
本発明の任意の態様において、ＩＲＡＰのインヒビタは、ＩＲＡＰ介在性シグナル伝達を阻害する。典型例として、ＩＲＡＰのインヒビタは、ＩＲＡＰの酵素活性を直接阻害する。好ましくは、インヒビタは、ＩＲＡＰの活性部位に結合する。より好ましくは、ＩＲＡＰのインヒビタは、ＩＲＡＰの基質の、ＩＲＡＰへの結合に競合し、または該結合を妨げる。
ＩＲＡＰのインヒビタは、本明細書において記載されるアッセイ、例えばアミノペプチダーゼ活性または基質分解を決定するアッセイによって決定される、１ｍＭ未満、好ましくは１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満のＫｉ値を示し得る。好ましくは、アッセイは、ヒトＩＲＡＰを包含する。典型例として、アミノペプチダーゼ活性のアッセイは、ＩＲＡＰ、好ましくはヒトＩＲＡＰによる蛍光性製品MCAの放出によって監視される合成基質Ｌ－ロイシン７－アミド－４－メチルクマリンヒドロクロリド（Ｌｅｕ－ＭＣＡ）の加水分解を含む。基質分解のアッセイは、ペプチド基質ＣＹＦＱＮＣＰＲＧまたはＹＧＧＦＬの分解であってもよい。
ＩＲＡＰのインヒビタは、小分子、抗体、ペプチド、または干渉ＲＮＡからなる群より選択されてよい。
本発明はまた、線維症の症候の緩和、または改善を必要とする対象に、これを実行する方法であって、これを必要とする対象に、治療有効量のＩＲＡＰインヒビタを投与することを含み、それによって、対象において線維症の症候を緩和しまたは改善する方法を提供する。好ましくは、線維症は、基礎組織損傷または基礎心血管疾患の結果として、年齢起因性である。
本発明はまた、線維症の処置または予防を必要とする対象において、これを施すための医薬の製造における、ＩＲＡＰインヒビタの使用を提供する。
本発明は、対象における線維症の処置方法であって、
線維症を患っている対象を同定する工程と；
それを必要とする対象に、治療有効量のＩＲＡＰインヒビタを投与する工程と
を含み、それによって、対象における線維症を処置する方法を提供する。
本発明は、臓器機能障害、瘢痕化、正常な細胞外マトリックスバランスの変化、コラーゲン沈着の増大、コラーゲン容量分率の増大、筋線維芽細胞への線維芽細胞の分化、マトリックスメタロプロテイナーゼレベルの下降およびマトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビタレベルの上昇、Ｉ型プロコラーゲンのＮ末端プロペプチドもしくはＣ末端プロペプチド（ＰＩＮＰまたはＰＩＣＰ）どちらかのレベルの上昇、Ｉ型コラーゲンのＣ末端テロペプチド（ＣＴＰまたはＣＩＴＰ）のレベルの下降、コラーゲン沈着の増大、ならびに種々の非侵襲性の撮像技術によって測定される心機能障害、タンパク尿およびアルブミン尿の増大によって測定される腎機能障害、糸球体濾過速度の低下、またはクレアチニンレベルの倍増を示す対象への特定の用途を有する。
本発明は、年齢起因性線維症、または組織損傷に関係する臓器線維症の処置方法であって、
年齢起因性線維症、または組織損傷に関係する臓器線維症を患っている対象を同定する工程と；
それを必要とする対象に、治療有効量のＩＲＡＰインヒビタを投与する工程と
を含み、それによって、年齢起因性線維症、または組織損傷に関係する臓器線維症を処置する方法を提供する。
本発明の任意の態様または実施形態において、年齢起因性線維症は、心臓、腎臓、血管、肝臓、膵臓、および肺の年齢起因性線維症を指し得る。
本発明は、線維症の処置または予防の方法であって、組成物を対象に、処置または予防のために投与する工程を含み、組成物は、ＩＲＡＰのインヒビタおよび薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、またはキャリアを含む、これらから本質的になる、またはこれらからなる、方法を提供する。
本明細書において記載される本発明の任意の方法または使用において、ＩＲＡＰのインヒビタは、全身的に、または直接的に、疾患の部位に投与されてよい。ＩＲＡＰのインヒビタは、経口投与用に製剤化されてよい。
本発明は、線維症を処置し、または予防する薬学的組成物であって、ＩＲＡＰのインヒビタおよび薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、またはキャリアを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、組成物中に存在する唯一の活性成分は、ＩＲＡＰのインヒビタである。
本発明は、線維症を処置し、または予防する薬学的組成物であって、活性成分としてＩＲＡＰのインヒビタ、および薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、またはキャリアを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、組成物中に存在する唯一の活性成分は、ＩＲＡＰのインヒビタである。
本発明は、線維症を処置し、または予防する薬学的組成物であって、主要成分としてＩＲＡＰのインヒビタ、および薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、またはキャリアを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、組成物中に存在する唯一の活性成分は、ＩＲＡＰのインヒビタである。
本発明はまた、線維症の処置に用いられる、ＩＲＡＰのインヒビタを提供する。
本発明はまた、線維症の処置に用いられる、ＩＲＡＰのインヒビタおよび薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、またはキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
本発明の一態様において、ＩＲＡＰのインヒビタは、式（Ｉ）
Figure 2023030022000002
（式中、
Ａは、
アリール、ヘテロアリールカルボシクリル、もしくはヘテロシクリルであり、これらはそれぞれ、Ｒ１がＮＨＣＯＲ８である場合、置換されていてもよく；
または、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、１，８－ナフチリジル、フタラジニル、もしくはプテリジニルであり、これらはそれぞれ、Ｒ１がＮＲ７Ｒ８、ＮＨＣＯＲ８、Ｎ（ＣＯＲ８）２、Ｎ（ＣＯＲ７）（ＣＯＲ８）、Ｎ＝ＣＨＯＲ８、もしくはＮ＝ＣＨＲ８である場合、置換されていてもよく；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ’、またはＳであり、Ｒ’は、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、または置換されていてもよいヘテロシクリルであり；
Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリールから選択され、またはＲ７およびＲ８は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい３～８員環を形成しており；
Ｒ２は、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ９、Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｏ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）Ｒ９、またはＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０であり、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル（これらはそれぞれ置換されていてもよい）、および水素から選択され；またはＲ９およびＲ１０は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい３～８員環を形成しており；
Ｒ３～Ｒ６は、独立して、水素、ハロ、ニトロ、シアノアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アミノ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシエステル、メチレンジオキシ、アミド、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、ヘテロシクリルチオ、カルボシクリルチオ、アシルチオ、およびアジドから選択され、これらはそれぞれ、適切な場合には置換されていてもよく、または、任意の２つの隣接するＲ３～Ｒ６は、これらが結合する原子と共に、置換されていてもよい３～８員環を形成しており；かつ
Ｙは、水素またはＣ１～１０アルキルである）
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を有する。
本発明の任意の態様において、ＩＲＡＰのインヒビタは、式（ＩＩ）
Figure 2023030022000003
（式中、
Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく；
ＲＡおよびＲＢは、独立して、水素、アルキル、およびアシルから選択され；
Ｒ１は、ＣＮまたはＣＯ２ＲＣから選択され；
Ｒ２は、ＣＯ２ＲＣおよびアシルから選択され；
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく；または
Ｒ２およびＲ３は共に、以下の５～６員の飽和ケト炭素環
Figure 2023030022000004
を形成しており、
式中、ｎは、１もしくは２であり；
該環は、Ｃ１～６アルキルによって１回もしくは複数回置換されていてもよく；または
Ｒ２およびＲ３は共に、以下の５員ラクトン環（ａ）もしくは６員ラクトン環（ｂ）
Figure 2023030022000005
を形成しており、
式中、
Figure 2023030022000006
は、任意選択の二重結合であり、Ｒ’はアルキルであり、
ＲＣは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよい）
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する。
本発明の任意の態様において、ＩＲＡＰのインヒビタは、式（ＩＩＩ）
Figure 2023030022000007
（式中、
Ｒ１は、ＨまたはＣＨ２ＣＯＯＨであり；
ｎは、０または１であり；
ｍは、１または２であり；
Ｗは、ＣＨまたはＮである）
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する。
一実施形態において、インヒビタは、以下の構造
Figure 2023030022000008
を有する。
本発明の別の実施形態において、ＩＲＡＰのインヒビタは、以下の配列のいずれか１つに従う構造を有する：
Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ、
ｃ［Ｃｙｓ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ］－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ、および
ｃ［Ｈｃｙ－Ｔｙｒ－Ｈｃｙ］－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ。
本発明のさらに別の実施形態において、インヒビタは、以下の化合物
Figure 2023030022000009
に従う構造を有する。
本発明の任意の態様において、ＩＲＡＰのインヒビタは、本明細書において記載される任意の化合物またはインヒビタであってよい。
本明細書において用いられるように、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「含む」および該用語の変形、例えば「含んでいる」、「含み」、および「含んだ」は、更なる添加剤、構成成分、整数、または工程を除外することが意図されない。
[本発明1001]
個体における線維症を処置する方法であって、インスリン調節性アミノペプチダーゼ（ＩＲＡＰ）のインヒビタを投与することを含み、それによって、線維症を処置する方法。
[本発明1002]
前記個体は、線維症を患っていると同定される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
線維症の、少なくとも1つの臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性の進行を遅らせることによって、線維症を処置する、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
線維症の、少なくとも1つの臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性を逆転することによって、線維症を処置する、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性は、臓器機能障害、瘢痕化、正常な細胞外マトリックスバランスの変化、コラーゲン沈着の増大、筋線維芽細胞への線維芽細胞の分化、マトリックスメタロプロテイナーゼレベルの下降、マトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビタレベルの上昇、Ｉ型プロコラーゲンのＮ末端プロペプチドもしくはＣ末端プロペプチド（ＰＩＮＰまたはＰＩＣＰ）どちらかのレベルの上昇、Ｉ型コラーゲンのＣ末端テロペプチド（ＣＴＰまたはＣＩＴＰ）のレベルの下降、コラーゲン沈着の増大、または種々の非侵襲性の撮像技術によって測定される心機能障害、ならびに、タンパク尿およびアルブミン尿の増大によって測定される腎機能障害、糸球体濾過速度の低下、血漿クレアチニンレベルの倍増のうちのいずれか1つを含む、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
コラーゲンは、1型コラーゲンα1の前駆体または成熟形態である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記線維症は、年齢起因性である、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記線維症は、ストレス起因性または損傷起因性である、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記線維症は、高血圧性心疾患、高血圧心筋症もしくは心不全、または、糖尿病を伴うもしくは伴わない腎症、または、基礎心血管疾患を伴うもしくは伴わない、線維化反応を包含してもよい他のストレス起因性もしくは損傷起因性の心血管後遺症を伴う、本発明1008の方法。
[本発明1010]
線維症を患う個体を同定する工程をさらに含む、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記線維症は、心線維症、肝線維症、腎線維症、血管線維症、肺線維症、および真皮線維症からなる群より選択される、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記線維症は、心線維症である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記線維症は、腎線維症である、本発明1011の方法。
[本発明1014]
前記線維症は、肝線維症である、本発明1011の方法。
[本発明1015]
前記線維症は、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
ＩＲＡＰの前記インヒビタは、ＩＲＡＰの酵素活性を直接的にまたは間接的に阻害する、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
ＩＲＡＰのインヒビタは、ＩＲＡＰの酵素活性を直接的に阻害する、本発明1001～1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記インヒビタは、ＩＲＡＰに結合する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記インヒビタは、ＩＲＡＰの活性部位に結合する、本発明1017または1018の方法。
[本発明1020]
ＩＲＡＰの前記インヒビタは、ＩＲＡＰへの結合について、ＩＲＡＰの基質と競合する、本発明1017または1018の方法。
[本発明1021]
ＩＲＡＰの前記インヒビタは、アミノペプチダーゼ活性または基質分解のアッセイによって決定される、1ｍＭ未満、好ましくは100μＭ未満、より好ましくは10μＭ未満のＫｉ値を示す、本発明1001～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
アミノペプチダーゼ活性の前記アッセイは、蛍光性製品MCAの放出によって監視される合成基質Ｌ－ロイシン7－アミド－4－メチルクマリンヒドロクロリド（Ｌｅｕ－ＭＣＡ）の加水分解を含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
基質分解の前記アッセイは、ペプチド基質ＣＹＦＱＮＣＰＲＧまたはＹＧＧＦＬの分解である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記インヒビタは、小分子、抗体、およびペプチドからなる群より選択される、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記インヒビタは、干渉ＲＮＡである、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記インヒビタは、式（Ｉ）
Figure 2023030022000010
（式中、
Ａは、
アリール、ヘテロアリールカルボシクリル、もしくはヘテロシクリルであり、これらはそれぞれ、Ｒ1がＮＨＣＯＲ8である場合、置換されていてもよく；
または、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、1，8－ナフチリジル、フタラジニル、もしくはプテリジニルであり、これらはそれぞれ、Ｒ1がＮＲ7Ｒ8、ＮＨＣＯＲ8、Ｎ（ＣＯＲ8）2、Ｎ（ＣＯＲ7）（ＣＯＲ8）、Ｎ＝ＣＨＯＲ8、もしくはＮ＝ＣＨＲ8である場合、置換されていてもよく；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ’、またはＳであり、Ｒ’は、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、または置換されていてもよいヘテロシクリルであり；
Ｒ7およびＲ8は、独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリールから選択され、またはＲ7およびＲ8は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい3～8員環を形成しており；
Ｒ2は、ＣＮ、ＣＯ2Ｒ9、Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｏ）Ｒ9、Ｃ（Ｏ）Ｒ9、またはＣ（Ｏ）ＮＲ9Ｒ10であり、Ｒ9およびＲ10は、独立して、それぞれ置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、および水素から選択され；またはＲ9およびＲ10は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい3～8員環を形成しており；
Ｒ3～Ｒ6は、独立して、水素、ハロ、ニトロ、シアノアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アミノ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシエステル、メチレンジオキシ、アミド、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、ヘテロシクリルチオ、カルボシクリルチオ、アシルチオ、およびアジドから選択され、これらはそれぞれ、適切な場合には置換されていてもよく、または、任意の2つの隣接するＲ3～Ｒ6は、これらが結合する原子と共に、置換されていてもよい3～8員環を形成しており；かつ
Ｙは、水素またはＣ1～10アルキルである）
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を有する、本発明1001～1024のいずれかの方法。
[本発明1027]
Ａは、Ｒ1がＮＨＣＯＲ8である場合、置換されていてもよいヘテロアリールである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
Ａはピリジニルである、本発明1026または1027の方法。
[本発明1029]
ＸはＯである、本発明1026～1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
Ｒ2はＣＯ2Ｒ9である、本発明1026～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
Ｒ5はヒドロキシルである、本発明1026～1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記インヒビタは、構造
Figure 2023030022000011
を有する、本発明1026～1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記インヒビタは、式（ＩＩ）
Figure 2023030022000012
（式中、
Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく；
ＲＡおよびＲＢは、独立して、水素、アルキル、およびアシルから選択され；
Ｒ1は、ＣＮまたはＣＯ2ＲＣから選択され；
Ｒ2は、ＣＯ2ＲＣおよびアシルから選択され；
Ｒ3は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく；または
Ｒ2およびＲ3は共に、5～6員の飽和ケト炭素環
Figure 2023030022000013
を形成しており、
式中、ｎは、1もしくは2であり；
前記環は、Ｃ1～6アルキルによって1回もしくは複数回置換されていてもよく；または
Ｒ2およびＲ3は共に、5員ラクトン環（ａ）もしくは6員ラクトン環（ｂ）
Figure 2023030022000014
を形成しており、
式中、
Figure 2023030022000015
は、任意選択の二重結合であり、Ｒ’はアルキルであり、
ＲＣは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよい）
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する、本発明1001～1024のいずれかの方法。
[本発明1034]
Ａは、置換されていてもよいアリールである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
Ａは、－ＣＯＯＨで置換されているアリール、またはその塩、エステル、もしくはプロドラッグである、本発明1033または1034の方法。
[本発明1036]
Ａは、－ＣＯ2 －ＮＨ4 ＋で置換されているアリールである、本発明1035の方法。
[本発明1037]
Ｒ1はＣＮである、本発明1033～1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
Ｒ2はアシルである、本発明1033～1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記インヒビタは、構造
Figure 2023030022000016
を有する、本発明1033～1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記インヒビタは、式（ＩＩＩ）
Figure 2023030022000017
（式中、
Ｒ1は、ＨまたはＣＨ2ＣＯＯＨであり；
ｎは、0または1であり；
ｍは、1または2であり；
Ｗは、ＣＨまたはＮである）
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する、本発明1001～1024のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記インヒビタは、構造
Figure 2023030022000018
を有する、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記インヒビタは、以下の配列：
Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ、
ｃ［Ｃｙｓ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ］－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ、および
ｃ［Ｈｃｙ－Ｔｙｒ－Ｈｃｙ］－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ
のいずれか1つに従う構造を有する、本発明1001～1024のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記インヒビタは、以下に従う構造
Figure 2023030022000019
を有する、本発明1001～1024のいずれかの方法。
本発明の更なる態様、および先の段落に記載される態様の更なる実施形態が、添付の図面を参照して、例示的に説明される以下の記載から明らかとなろう。
ＩＲＡＰ欠失およびＩＲＡＰ阻害が、収縮期血圧（ＳＢＰ）の、アンギオテンシンＩＩ起因性の上昇を弱める。生理食塩水またはＡｎｇ ＩＩ（８００ｎｇ／ｋｇ／分）±ビヒクル／ＨＦＩ ４１９で処置した成体のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウスの収縮期血圧の平均データ（ｎ＝６～９）。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した。 ＩＲＡＰ発現が、アンギオテンシンＩＩを注入したＷＴマウスの大動脈および心臓において増大する。（ａ）Ａｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の５μｍの厚さの横断方向大動脈切片の内側領域および外膜領域におけるＩＲＡＰ発現の定量化（ｎ＝５）。（ｂ）Ａｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の５μｍの厚さの横断方向心臓切片におけるＩＲＡＰの定量化（ｎ＝５）。ＩＲＡＰの定量化を、陽性染色組織面積パーセントとして表す。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した。 ＩＲＡＰの遺伝的欠失および薬理学的阻害が、アンギオテンシンＩＩ介在性大動脈線維形成、および関連するマーカーを弱める。生理食塩水またはＡｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の胸部大動脈切片における陽性染色免疫蛍光の典型的な画像および定量化が、赤色のＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡの発現の低下を示す（緑色は、弾性薄膜（elastic lamina）の自家蛍光を示す）。ピクロシリウスレッド染色を用いたコラーゲン染色を判定してから、偏光顕微鏡観察により画像化した。データを、陽性染色面積パーセンテージの平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す（ｎ＝５～６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。 図3-1の続きの図である。 ＩＲＡＰの遺伝的欠失および薬理学的阻害が、大動脈におけるアンギオテンシンＩＩ介在性炎症を弱める。生理食塩水またはＡｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の胸部大動脈切片における陽性染色免疫蛍光の典型的な画像および定量化が、赤色のＰ－ＩκＢα（ＮＦκＢ活性化についてのマーカー）、ＭＣＰ－１、ＩＣＡＭ－１、およびＶＣＡＭ－１（血管細胞接着タンパク質－１）の発現を示す（緑色は、弾性薄膜の自家蛍光を示す）。データを、陽性染色面積パーセンテージの平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す（ｎ＝５～６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。 図4-1の続きの図である。 ＩＲＡＰの遺伝的欠失および薬理学的阻害が、アンギオテンシンＩＩ介在性の心肥大および線維症を弱める。（ａ）ＩＲＡＰ欠失またはＩＲＡＰ阻害が、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した横断方向心臓切片（ｎ＝６）における心筋細胞断面積を用いて評価した心肥大のＡｎｇ ＩＩ介在性増大を予防した。（ｂ）ＩＲＡＰの欠失または阻害が、ピクロシリウスレッドで染色した横断方向心臓切片（ｎ＝６）の明視野顕微鏡観察を介して判定した間質コラーゲンの発現を、有意に引き下げた。データを、陽性染色面積パーセンテージの平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す（ｎ＝５～６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。 図5-1の説明を参照のこと。 ＩＲＡＰの遺伝的欠失および薬理学的阻害が、心臓線維形成マーカーのアンギオテンシンＩＩ起因性増大を予防する。生理食塩水またはＡｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の横断方向心臓切片における陽性染色免疫蛍光の典型的な画像および定量化が、ビメンチン染色（線維芽細胞発現についてのマーカー）の変化なし、α－ＳＭＡ発現（筋線維芽細胞発現についてのマーカー）の引下げ、ＴＧＦ－β１（線維形成誘導性サイトカイン）の血管周囲発現の引下げ、およびＴＧＦ－β１のタンパク質発現の引下げを示した。データを、ＷＴ対照の平均±ｓ．ｅ．ｍに対する相対比率として表した、免疫蛍光についての陽性染色面積パーセンテージ、およびウェスタンブロットの濃度測定分析の平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；（ｎ＝５～６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。 図6-1の説明を参照のこと。 ＩＲＡＰの遺伝的欠失または薬理学的阻害が、ＤＨＥ染色によって評価した心臓活性酸素種（ＲＯＳ）、および炎症マーカーのアンギオテンシンＩＩ起因性増大を予防する。生理食塩水またはＡｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の横断方向心臓切片における陽性染色免疫蛍光またはウェスタンブロット分析を用いたタンパク質レベルの定量化の典型的な画像および定量化（ｎ＝５～６）。ＩＲＡＰ欠失またはＩＲＡＰ阻害が、スーパーオキシド生成のＡｎｇ ＩＩ起因性増大を予防し、ＮＯＸ－２（ＮＡＤＰＨアイソフォーム）の発現に影響を及ぼさず、Ｐ－ＩκＢα発現（ＮＦκＢ活性化についてのマーカー）を引き下げ、ＩＣＡＭ－１血管周囲発現および総タンパク質含有量の双方を引き下げ、そしてＭＣＰ－１およびマクロファージ（Ｆ４／８０）発現を引き下げた。データを、ＷＴ対照の平均±ｓ．ｅ．ｍに対する相対比率として表した、免疫蛍光についての陽性染色面積パーセンテージ、およびウェスタンブロットの濃度測定分析の平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；（ｎ＝５～６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。 図7-1の説明を参照のこと。 図7-1の説明を参照のこと。 ＩＲＡＰ発現が、約２０ヶ月齢の野生型（ＷＴ）マウスの老齢心臓において増大し、そしてＩＲＡＰインヒビタの処置後に減少した。（ａ）横断方向心臓切片におけるＩＲＡＰ発現（緑色）の典型的な画像；（ｂ）成体（４～６ヵ月齢）および老齢（１８～２２ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ欠失（ＩＲＡＰ－／－）マウス由来の５μｍの厚さの横断方向心臓切片におけるＩＲＡＰの定量化（ｎ＝５）。（ｃ）ビヒクルまたはＩＲＡＰインヒビタ、ＨＦＩ－４１９（５００ｎｇ／ｋｇ／分；ｓ．ｃ．；ｎ＝５～８）で４週間処置した老齢（１８～２２ヵ月齢）のＷＴマウス由来の５μｍの厚さの横断方向心臓切片におけるＩＲＡＰの定量化。ＩＲＡＰの定量化を、陽性染色組織面積パーセントとして表す。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１を、（ｂ）二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって、または（ｃ）対応のないｔ検定によって、決定した。 図8-1の説明を参照のこと。 ＩＲＡＰ欠失が、年齢起因性心線維症を予防する。（ａ）成体（４～６ヵ月齢）および老齢（１８～２２ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウスの横断方向心臓切片におけるピクロシリウスレッド染色コラーゲンの典型的な画像。（ｂ）陽性染色組織面積パーセントとして表される、明視野顕微鏡観察下での、間質コラーゲンの陽性染色面積の定量化（ｎ＝５～９）。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した。偏光光学顕微鏡下で測定した間質コラーゲンおよび血管周囲コラーゲンの類似したデータを、図１０ａ～図１０ｄに表す。 老齢のＩＲＡＰ欠失マウスが、年齢起因性心線維症から保護される。間質（ａ、ｂ）、そして血管周囲（ｃ、ｄ）のコラーゲン発現を、幼年、そして老齢のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の、ピクロシリウスレッド染色心臓切片における偏光顕微鏡観察により、定量化した。明視野顕微鏡観察（図２）と比較して、この分析は、コラーゲン発現に及ぼす作用は同じであるが、コラーゲンレベルが絶対的に低いことを明らかにした。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、間質線維形成について二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって、そして血管周囲線維形成について、対応のないｔ検定によって、決定した。幼年マウス：ＷＴ、ｎ＝８およびＩＲＡＰ－／－、ｎ＝１０；老齢マウス：ＷＴ、ｎ＝１４およびＩＲＡＰ－／－、ｎ＝１４。 ＩＲＡＰ欠失が、年齢起因性細胞外マトリックスバランスを変える。老齢のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の心臓組織における、ＴＧＦ－β１およびＩ型コラーゲンα１（ａ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）－２およびＭＭＰ－９（ｂ）、ＭＭＰ－８およびＭＭＰ－１３（ｃ）のタンパク質発現のウェスタンブロット、および、ＷＴ対照の平均±ｓ．ｅ．ｍに対する相対比率として表した濃度測定定量化；（老齢マウス：ＷＴ、ｎ＝４～８およびＩＲＡＰ－／－、ｎ＝５～１１）。＊＊Ｐ＜０．０１を、対応のないｔ検定によって決定した。 図11-1の続きの図である。 ＷＴマウスと比較して、ＩＲＡＰ－／－マウスには、ＴＧＦ－β１およびαＳＭＡ発現筋線維芽細胞の年齢起因性増大がない。（ａ）老齢のＷＴマウスまたはＩＲＡＰ－／－マウス由来の横断方向心臓切片の免疫蛍光染色による、ＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡ発現筋線維芽細胞の血管周囲発現の典型的な画像。（ｂ）陽性染色組織面積パーセントとして表した、ＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡの陽性染色面積の定量化（ｎ＝５～９）。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した。 ＩＲＡＰ欠失およびＩＲＡＰインヒビタ処置が、老齢マウスにおける炎症性マーカーを引き下げる。（ａ）老齢ＩＲＡＰ欠失マウスが、老齢ＷＴマウスから採った心臓切片において見られるものと比較した場合に、横断方向心臓切片における、スーパーオキシド発現（ＤＨＥ染色を用いた）の引下げ、ＮＦκＢ活性化（免疫蛍光染色を用いるホスホＩκＢα発現により測定した）の低下、単球化学誘引タンパク質－１（免疫蛍光によるＭＣＰ－１）の引下げ、マクロファージ発現（Ｆ４／８０免疫蛍光を用いた）の引下げ、および細胞間接着分子－１の血管周囲発現（免疫蛍光によるＩＣＡＭ－１）の引下げを実証した（ｎ＝６）；データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を、対応のないｔ検定によって決定した。（ｂ）老齢（約２０ヶ月）のＷＴマウスの４週の常習的ＩＲＡＰインヒビタ処置が、老齢のビヒクル処置ＷＴマウス由来の心臓切片に見られるものと比較した場合に、横断方向心臓切片において、スーパーオキシド発現（ＤＨＥ染色を用いた）を引き下げ、ＮＦκＢ活性化（免疫蛍光染色を用いるホスホＩκＢα発現により測定した）を低下させ、単球化学誘引タンパク質－１（免疫蛍光によるＭＣＰ－１）を引き下げ、マクロファージ発現（Ｆ４／８０免疫蛍光を用いた）を引き下げ、そして細胞間接着分子－１の血管周囲発現（免疫蛍光によるＩＣＡＭ－１）を引き下げた（ｎ＝６～８）；データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を、対応のないｔ検定によって決定した。 サイトカイン定量化を、老齢のＷＴ（ｎ＝９）マウスおよびＩＲＡＰ－／－（ｎ＝９）マウス由来の（ａ、ｂ）、そして老齢のビヒクル（ｎ＝６）処置マウスおよびＨＦＩ－４１９（ｎ＝９）処置マウス由来の（ｃ、ｄ）心臓において、Bio-Plex multiplexアッセイを用いて実行した。サイトカインを、炎症誘発表現型および抗炎症表現型に基づいてグループ化する。心臓におけるサイトカインの濃度を、老齢のＷＴ対照に対する相対比率として表す；正確な倍率変化を表１に示す。全データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を、対応のないｔ検定によって決定した。 常習的ＩＲＡＰインヒビタ処置が、年齢起因性心線維症を完全に逆転する。（ａ）ビヒクルまたはＨＦＩ－４１９（５００ｎｇ／ｋｇ／分；ｓ．ｃ．）で処置した老齢（１８～２２ヵ月齢）のＷＴマウスの横断方向心臓切片におけるピクロシリウスレッド染色コラーゲンの典型的な画像。（ｂ）陽性染色組織面積パーセントとして表される、明視野顕微鏡観察下での、間質コラーゲンの陽性染色面積の定量化（ｎ＝５～８）。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した。偏光光学顕微鏡下で測定した間質コラーゲンの類似したデータを、図１６ｆに表す。 老齢マウスにおける、ＨＦＩ４１９によるＩＲＡＰの常習的（４週）薬理学的阻害の作用。常習的ＩＲＡＰ阻害が、収縮期血圧、ＳＢＰ（ａ）、体重（ｂ）、および（ｃ）心室重量対体重比ＶＷ：ＢＷ、または（ｄ）心室重量対脛骨長比ＶＷ：ＴＬを用いて評価した心肥大のグロス尺度に、有意な作用を及ぼさなかったが、概して、加齢がこれらの変数を、幼年ＷＴマウスと比較して、増大させた。ＩＲＡＰ阻害は、Ｈ＆Ｅ染色心臓切片を用いて定量化した場合の心筋細胞断面積に作用を及ぼさなかった（ｅ）一方、ＩＲＡＰ阻害は、ピクロシリウスレッド染色心臓断面図の偏光顕微鏡観察によって判定して、間質コラーゲン発現を、幼年ＷＴマウスにおいて観察されるレベルにまで有意に引き下げた（ｆ）。老齢のビヒクル処置マウス：ｎ＝１０および老齢のＨＦＩ－４１９処置マウス、ｎ＝１０；データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１を、一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。 常習的ＩＲＡＰインヒビタ処置が、年齢起因性細胞外マトリックスバランスを変える。老齢の、ビヒクルで、そしてＨＦＩ－４１９で処置したＷＴマウス由来の心臓組織における、前駆体コラーゲンおよび成熟コラーゲン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）－２、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１３、およびＴＩＭＰ－１のタンパク質発現のウェスタンブロットおよび濃度測定定量化を、ビヒクル処置ＷＴ対照の平均±ｓ．ｅ．ｍに対する相対比率として表す；（全群においてｎ＝４）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１を、対応のないｔ検定によって決定した。 老齢ＷＴマウスにおけるＨＦＩ－４１９による常習的ＩＲＡＰ阻害が、ＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡ発現筋線維芽細胞レベルを、ビヒクル処置老齢ＷＴマウスと比較して、有意に引き下げた。ＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡの陽性染色面積の定量化を、陽性染色組織面積パーセントとして表す（ｎ＝５～８）。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した。 年齢起因性心線維症を逆転する、２つの構造的に異なるＩＲＡＰインヒビタの作用。老齢（約２０ヵ月齢）のＷＴマウスを、ビヒクル、化合物１（クラス１として表す）、または化合物２（クラス２として表す）で４週間、常習的に処置した。これらの群のそれぞれに由来する横断方向心臓切片のピクロシリウスレッド染色が、年齢起因性心線維症の明確な逆転を実証した（ｎ＝３）。データを、陽性染色面積パーセンテージの平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す。＊Ｐ＜０．０５を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。 ＩＲＡＰの遺伝的欠失および薬理学的阻害が、虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害の後に、心臓の機能を向上させ、かつ梗塞領域を縮小させる。心臓の機能測定を、Langendorff単離心臓標本を用いて、４０分の虚血／１時間の再灌流傷害（ＩＲ、虚血再灌流）で実行した。心臓を、高カリウム溶液（ＰＳＳ；１００ｍＭ）内に３分間入れることによって、拡張期で停止させた。その後、これをスライスして、ＴＴＺで染色した。各群由来の梗塞領域を示す典型的な画像を、（ａ）に示す。梗塞領域は白色の外観を呈し、破線領域内に示す。梗塞面積を、幼年ＷＴ（ｎ＝７）マウス、老齢のＩＲＡＰ－／－（ｎ＝１０）マウス、老齢のビヒクル処置（ｎ＝８）ＷＴマウスまたはＨＦＩ－４１９処置（ｎ＝８）ＷＴマウス由来の５～７枚の心臓スライスの上位表面および下位表面の双方の全体にわたって、染色面積パーセンテージとして定量化する。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す。＊＊Ｐ＜０．０１を、一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。ＩＲＡＰ欠失または常習的ＩＲＡＰ阻害が、虚血傷害後、左心室発生圧（ＬＶＤＰ）の回復（ｂ）、左心室収縮（＋ｄｐ／ｄｔ）速度（ｃ）、および左心室弛緩（－ｄｐ／ｄｔ）速度（ｄ）を向上させた。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１を、ＬＶＤＰおよび±ｄｐ／ｄｔについて、事後ボンフェローニ検定による二元配置ＡＮＯＶＡを用いて決定した。心エコー検査研究を、老齢（約２２ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウスに実行して、心機能を、幼年（３ヵ月齢）ＷＴマウスと比較した。老齢のＷＴマウス（ｎ＝５）は、幼年ＷＴマウス（ｎ＝５）と比較して、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）を有意に引き下げ（ｅ）、そしてＬＶ収縮性の引下げに向かう傾向があった（ｆ）。老齢ＩＲＡＰ－／－マウス（ｎ＝４）は、心機能におけるこれらの年齢起因性変化から保護された。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊＊Ｐ＜０．０１を、一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。 図20-1の説明を参照のこと。 ６ヵ月齢および約２２ヶ月齢のＷＴマウスとＩＲＡＰ欠失マウスとの表現型差異。収縮期血圧、ＳＢＰに及ぼす年齢および遺伝子型の作用は、幼年（約５ヵ月齢）、そして老齢（約２０ヵ月齢）の時点で比較して、最小であった（ａ）。予想されるように、ＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウスの体重増大が、加齢と関連して存在した（ｂ）。（ｃ）心室重量対体重比ＶＷ：ＢＷ、または（ｄ）心室重量対脛骨長比ＶＷ：ＴＬを用いた心肥大のグロス尺度が、ＩＲＡＰ－／－マウスにおいてＶＷ：ＢＷ比を、そして双方の系統においてＶＷ：ＴＬ比を増大させる加齢の有意な作用を見出し、これは大部分が、遺伝子型から独立していた。心肥大を、断面心筋細胞面積測定を用いて、さらに評価した。Ｈ＆Ｅ染色心臓切片における心筋細胞の典型的な画像を、（ｅ）に示す。心筋細胞断面積の定量化を、心臓の切片あたり６視野で実行した（ｆ）。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した（幼年マウス：ＷＴ、ｎ＝８およびＩＲＡＰ－／－、ｎ＝１０；老齢マウス：ＷＴ、ｎ＝１６およびＩＲＡＰ－／－、ｎ＝１６）。 ＩＲＡＰ発現が、老齢（約２０ヵ月齢）のＷＴマウス由来の腎臓において増大して、ＩＲＡＰインヒビタによる薬理学的阻害の後、低下する。（ａ）成体（４～６ヵ月齢）の、そして老齢（１８～２２ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウスに由来する５μｍの厚さの冠状腎臓切片におけるＩＲＡＰ発現の定量化（ｎ＝４）。（ｂ）ビヒクルまたはＨＦＩ－４１９（５００ｎｇ／ｋｇ／分；ｓ．ｃ．；ｎ＝４）で４週間処置した老齢（１８～２２ヵ月齢）のＷＴマウスに由来する５μｍの厚さの冠状腎臓切片におけるＩＲＡＰ発現の定量化。ＩＲＡＰインヒビタ処置は、ビヒクル処置老齢対照と比較して、ＩＲＡＰ発現を引き下げる傾向があった。ＩＲＡＰの定量化を、陽性染色組織面積パーセントとして表す。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊Ｐ＜０．０５を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（ａ）または対応のないｔ検定（ｂ）によって、決定した。 ＩＲＡＰ欠失またはＩＲＡＰ阻害の、年齢起因性腎線維症の進行に及ぼす作用。（ａ）ＩＲＡＰ欠失が、間質腎線維形成の年齢起因性増大を予防することを実証する、成体（４～６ヵ月齢）の、そして老齢（１８～２２ヵ月齢）のＷＴマウス、および老齢ＩＲＡＰ－／－マウスの冠状腎臓切片におけるピクロシリウスレッド染色間質コラーゲンの典型的な画像および定量化（ｎ＝４）。（ｂ）ＩＲＡＰ阻害が、間質腎線維形成の年齢起因性増大を逆転することを実証する、老齢（１８～２２ヵ月齢）の、ビヒクルそしてＨＦＩ－４１９で処置したＷＴマウスの冠状腎臓切片におけるピクロシリウスレッド染色間質コラーゲンの典型的な画像および定量化（ｎ＝４）。データを、陽性染色組織面積パーセントとして表す。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（ａ）または対応のないｔ検定（ｂ）によって、決定した。 ＩＲＡＰ欠失およびＩＲＡＰ阻害が、それぞれ、年齢がマッチした対照と比較して、α－ＳＭＡ発現筋線維芽細胞の年齢起因性増大を予防または逆転する。（ａ）成体（４～６ヵ月齢）の、そして老齢（１８～２２ヵ月齢）のＷＴマウス、およびＩＲＡＰ－／－マウス由来の冠状腎臓切片の免疫蛍光染色による、α－ＳＭＡ発現筋線維芽細胞についての陽性染色面積の定量化。α－ＳＭＡを、陽性染色組織面積パーセントとして表す。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す（ｎ＝４）；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した。（ｂ）老齢の（１８～２２ヵ月齢）、ビヒクル、そしてＨＦＩ－４１９で処置したＷＴマウス由来の冠状腎臓切片の免疫蛍光染色による、α－ＳＭＡ発現筋線維芽細胞についての陽性染色面積の定量化。α－ＳＭＡを、陽性染色組織面積パーセントとして表す。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す（ｎ＝４）。 アンギオテンシンＩＩにより刺激したヒト心臓線維芽細胞におけるＩＲＡＰ発現の増大。典型的な画像は、Ａｎｇ ＩＩの濃度の増大により刺激された一次ヒト心臓線維芽細胞が、ＩＲＡＰの発現の増大を誘導したことを示している。 ＩＲＡＰインヒビタが、ヒト心臓線維芽細胞において、α－ＳＭＡおよびコラーゲンの発現を用量依存的に引き下げた。（ａ）典型的な画像は、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）をＡｎｇ ＩＩ（０．１μＭ）で刺激した場合の、α－ＳＭＡ（赤色；筋線維芽細胞についてのマーカー）およびコラーゲン（緑色）の発現の増大を示している。Ａｎｇ ＩＩおよびＨＦＩ－４１９の併用処置（０．０１から１μＭ）が、α－ＳＭＡおよびコラーゲンの発現を引き下げた。（ｂ）ウェスタンブロット由来の定量データであり、ＨＣＦを、Ａｎｇ ＩＩ＋濃度を上げたＨＦＩ－４１９で共処置した場合、α－ＳＭＡおよびコラーゲンのタンパク質発現の用量依存的引下げを確認した（ｎ＝１０～１２）。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；ウェスタンブロットの濃度測定分析を、対照細胞の平均±ｓ．ｅ．ｍに対する相対比率として表す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。 図26-1の説明を参照のこと。 脂肪症を示すためにOilRedOで染色したＷＴマウス（上部パネル）およびＩＲＡＰ ＫＯマウス（下部パネル）由来の肝臓切片。ＷＴマウス由来の肝臓切片は、矢印によって示すより大きな大滴性脂肪変性（macrovesicular steatosis）を示した。 常習的ＩＲＡＰインヒビタ処置が、ＨＳＤ起因性肝線維症を逆転する。（ａ）標準的な食事（ＮＤ）または高塩分食（ＨＳＤ）＋ビヒクルまたはＨＦＩ－４１９（５００ｎｇ／ｋｇ／分；ｓ．ｃ．）で処置したＷＴマウスの肝臓切片における、マッソントリクローム染色したコラーゲンの典型的な画像。（ｂ）コラーゲンについての陽性染色面積の定量化を、明視野顕微鏡観察下で、陽性染色組織面積パーセントとして表す（ｎ＝３）。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；＊＊Ｐ＜０．０１を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した。
実施形態の詳細な説明
本明細書中で開示され、かつ定義される本発明は、言及され、または本文または図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の全ての代替組合せに及ぶことが理解されよう。これらの様々な組合せは全て、本発明の種々の代替態様を構成する。
次に、本発明の特定の実施形態を詳細に参照する。本発明は、実施形態と共に記載されるが、本発明を該実施形態に限定すると意図されないことが理解されよう。それどころか、本発明は、全ての選択肢、改変、および均等物をカバーすることが意図されており、これらは、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る。
当業者であれば、本明細書において記載される方法および材料に類似する、または等価の、多くの方法および材料を認識すると考えられ、これらは、本発明を実行するのに用いられ得る。本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。本明細書中で開示され、かつ定義される本発明は、言及され、または本文または図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の全ての代替組合せに及ぶことが理解されよう。これらの様々な組合せは全て、本発明の種々の代替態様を構成する。
本明細書において引用される特許および刊行物は全て、その全体が参照により組み入れられる。
本明細書を解釈する目的上、単数形で用いられる用語は複数形も含み、その逆も同様である。
本発明者らは、酵素インスリン調節性アミノペプチダーゼ（ＩＲＡＰ；アンギオテンシンサブタイプ４受容体（ＡＴ４Ｒ、胎盤ロイシンアミノペプチダーゼまたはオキシトシナーゼ）としても公知である）を、線維症に対抗する新規の標的として同定した。Ａｎｇ ＩＶがＩＲＡＰに結合して、この酵素の触媒活性を阻害するように作用すると提唱されている。しかしながら、今までのところ、心血管疾患の関連で、ＩＲＡＰ阻害の潜在的な利益を探究した長期間にわたる研究はない。本発明者らは、ＩＲＡＰ活性の除去または阻害が、心臓の線維症および炎症、または他の心血管疾患関連臓器線維症もしくは組織損傷関連臓器線維症の、年齢介在性の増加から保護して、心臓機能および血管機能を向上させるであろうと仮定した。本発明者らは、この仮説を、（ｉ）老齢の雄のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス（１８～２２ヵ月齢）の予防モデル、（ｉｉ）Ａｎｇ ＩＩ注入を用いて、複数の臓器において線維症および炎症を誘導した予防モデル、ならびに（ｉｉｉ）ＣＶＤを逆転させるために、ＩＲＡＰの小分子インヒビタを、心血管病理が確立された老齢ＷＴマウスに投与することによる介入モデルにおいて、試験した。本発明者らは、ＩＲＡＰの欠陥またはＩＲＡＰの薬理学的阻害が、部分的にコラーゲンの合成を阻害し、かつ分解を増強することによって、（例えば心臓および腎臓における）年齢起因性または損傷起因性の臓器線維症から保護し、そしてより重要なことに、幼年マウスにおいて示されるレベルにまで逆転させることを見出した。また、ＩＲＡＰ阻害は、心臓ＲＯＳ（活性酸素種）およびＮＦκＢの下流の炎症性メディエータを減少させて、抗炎症表現型に向かってまとまって進むことで、加齢における心臓および血管の全体的な改善に寄与した。類似した抗線維形成かつ抗炎症の表現型はまた、ＩＲＡＰ－／－マウスにおいて、そして心血管病理、例えば臓器の線維症および炎症を誘導するためにＡｎｇ ＩＩで処理したマウスにおける薬理学的ＩＲＡＰ阻害によって、示された。
本発明は、ＩＲＡＰの阻害が、線維性疾患、特に年齢起因性の線維性疾患において役割を有することが、ＩＲＡＰ欠失マウス、またはＩＲＡＰインヒビタによる薬理学的阻害を用いて確認された、本明細書において記載される結果に基づいている。本発明者らは、ＩＲＡＰ欠失マウスが、線維症から保護されることを、そしてさらに、ＩＲＡＰインヒビタを投与した、実験的に誘導した関連線維症を患う老齢のマウスが、線維症について首尾よく処置されることを実証した。これは、線維形成、および線維形成誘導性メディエータの発現を引き下げるＩＲＡＰインヒビタの一貫した能力によって実証されたものである。
本発明の利点は、線維性疾患の確立時点での、ＩＲＡＰのインヒビタによる処置により、線維症が逆転するという驚くべき発見である。したがって、ＩＲＡＰの薬理学的阻害は、線維症、例えば年齢起因性または損傷起因性の線維症の進行を休止させるだけでなく、既存の症候、例えばコラーゲン沈着を逆転させる作用を有する。したがって、本発明は、線維症、例えば年齢起因性の線維症、または臓器線維症を大抵伴う心血管疾患と診断される対象に、特に利用されることを見出す。さらに、年齢起因性の線維症の特質を逆転させることで、本発明は、線維症が進行した対象に利用され得ることが示される。
本明細書において用いられる「ＩＲＡＰインヒビタ」または「ＩＲＡＰのインヒビタ」は、ＩＲＡＰ（ＩＲＡＰ；アンギオテンシンサブタイプ４受容体（ＡＴ４Ｒ、胎盤ロイシンアミノペプチダーゼまたはオキシトシナーゼ）としても公知である）の活性を阻害する任意の化合物である。ＩＲＡＰの活性の阻害はまた、細胞中でのＩＲＡＰタンパク質、ＲＮＡ、またはＤＮＡのレベルまたは量の引下げを含んでもよい。化合物は、競合的な、非競合的な、オルソステリックな、アロステリックな、または部分的なインヒビタであり得る。好ましい形態において、化合物は、例えば、活性部位に結合することによって、または酵素基質、コエフェクタ、もしくはシグナル伝達機構と競合することによって、ＩＲＡＰの酵素活性を阻害する分子である。好ましい形態において、化合物は、シグナロソーム、またはＩＲＡＰの活性に必要とされる任意の他のタンパク質－タンパク質相互作用を中断させることによって、ＩＲＡＰの活性を阻害する分子である。
インヒビタは、ＩＲＡＰに特異的であり得、そして他の受容体に対して幾分低いレベルの阻害活性しか有し得ない（例えば、Ｋｉが、本明細書において記載されるアッセイを用いて測定されて、他の受容体に対して、約５０μＭまたは１００μＭ、好ましくは１ｍＭを超え、または例えば、他の受容体に対するＫｉが、ＩＲＡＰに対するＫｉよりも少なくとも１０倍大きい）。好ましくは、ＩＲＡＰのインヒビタは、対象と比較して、ＩＲＡＰの活性を１０％以下に制限する物質である。対照は、インヒビタが試験される溶媒であって、同じ量で用いられるが、インヒビタを含まない溶媒である。ＩＲＡＰの酵素活性は、合成基質Ｌｅｕ－ＭＣＡ（Sigma- Aldrich, Missouri, USA）の加水分解によって決定されてよく、これは、蛍光性製品MCAの、３８０ｎｍおよび４４０ｎｍのそれぞれ励起および放射波長での放出によって監視され、これらは、Albiston et al. 2008 The FASEB Journal 22:4209-4217、または本明細書において記載される他の方法に従うものである。好ましい形態において、インヒビタは、小分子化合物であっても干渉ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）であってもよい。インヒビタはまた、抗体、例えばモノクローナル抗体であってもよい。
好ましくは、抗体インヒビタは中和抗体インヒビタである。
用語「小分子」は、概して低い分子量の化合物を示しており、有機化合物および無機化合物を含む。一般に、小分子は、化学式が明確であり、単一の分子量を有するものである。好ましくは、小分子は、分子量が３０００ダルトン未満である。より好ましくは、小分子は、分子量が２０００ダルトン未満である。本発明の一部の実施形態において、小分子は、分子量が１０００ダルトン未満である。小分子の一部の非限定的な例として、脂質、例えば脂肪酸；糖類（モノ、ジ、またはポリ）；生体異物；有機金属化合物、および天然物が挙げられる。
ＩＲＡＰのインヒビタは、１ｍＭ未満、好ましくは１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満のＫｉ値を示し得、これらは、本明細書において記載される、例えばアミノペプチダーゼ活性または基質分解のアッセイによって決定される。典型例として、アミノペプチダーゼ活性のアッセイは、蛍光性製品MCAの放出によって監視される合成基質Ｌ－ロイシン７－アミド－４－メチルクマリンヒドロクロリド（Ｌｅｕ－ＭＣＡ）の加水分解を含む。基質分解のアッセイは、ペプチド基質ＣＹＦＱＮＣＰＲＧ、ＣＹＩＱＮＣＰＬＧ－ＮＨ２、またはＹＧＧＦＬの分解であってもよい。
ＩＲＡＰのインヒビタが、当技術分野において公知である。例えば、Albiston et al. (2008) The FASEB Journal 22:4209-4217；Albiston et al. (2011), British Journal of Pharmacology, 164:37-47；Albiston, et al. J. Biol. Chem. 276, 48263-48266；米国特許第６，０６６，６７２号明細書；Albiston, et al. Pharmacol. Ther. 116, 417-427；Axen, et al. (2006) J. Pept. Sci. 12, 705-713；Albiston et al. (2010) Molecular Pharmacology, 78(4): 600-607；Mountford, et al. (2014) J Med Chem 57(4): 1368-1377；Andersson et al. J Med Chem (2010) 53, 8059, Andersson et al. (2011) J Med Chem 54(11): 3779-3792；国際公開第２００９０６５１６９号明細書；国際公開第２０１０００１０７９号パンフレット；国際公開第２０００／０１２５４４号パンフレット；米国特許出願公開第２００４／００８６５１０号パンフレット；国際公開第２００３／０１１３０４号パンフレット；および国際公開第２００６０２６８３２号パンフレットに記載されるＩＲＡＰインヒビタが、本発明に有用であり得る。
本明細書において記載されるＩＲＡＰのインヒビタは、式（Ｉ）
Figure 2023030022000020
（式中、
Ａは、
アリール、ヘテロアリールカルボシクリル、もしくはヘテロシクリルであり、これらはそれぞれ、Ｒ１がＮＨＣＯＲ８である場合、置換されていてもよく；
または、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、１，８－ナフチリジル、フタラジニル、もしくはプテリジニルであり、これらはそれぞれ、Ｒ１がＮＲ７Ｒ８、ＮＨＣＯＲ８、Ｎ（ＣＯＲ８）２、Ｎ（ＣＯＲ７）（ＣＯＲ８）、Ｎ＝ＣＨＯＲ８、もしくはＮ＝ＣＨＲ８である場合、置換されていてもよく；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ’、またはＳであり、Ｒ’は、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、または置換されていてもよいヘテロシクリルであり；
Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリールから選択され、またはＲ７およびＲ８は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい３～８員環を形成しており；
Ｒ２は、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ９、Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｏ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）Ｒ９、またはＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０であり、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル（これらはそれぞれ置換されていてもよい）、および水素から選択され；またはＲ９およびＲ１０は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい３～８員環を形成しており；
Ｒ３～Ｒ６は、独立して、水素、ハロ、ニトロ、シアノアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アミノ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシエステル、メチレンジオキシ、アミド、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、ヘテロシクリルチオ、カルボシクリルチオ、アシルチオ、およびアジドから選択され、これらはそれぞれ、適切な場合には置換されていてもよく、または、任意の２つの隣接するＲ３～Ｒ６は、これらが結合する原子と共に、置換されていてもよい３～８員環を形成しており；かつ
Ｙは、水素またはＣ１～１０アルキルである）
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を有し得る。
好ましい一実施形態において、Ａは、Ｒ１がＮＨＣＯＲ８である場合、置換されていてもよいヘテロアリールである。より好ましくは、Ａはピリジニルである。
別の好ましい実施形態において、ＸはＯである。
さらに別の好ましい実施形態において、Ｒ２はＣＯ２Ｒ９である。
好ましい一実施形態において、Ｒ５はヒドロキシルである。
一実施形態において、インヒビタは以下の構造
Figure 2023030022000021
を有する。
本明細書において記載されるＩＲＡＰのインヒビタは、式（ＩＩ）
Figure 2023030022000022
（式中、
Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく；
ＲＡおよびＲＢは、独立して、水素、アルキル、およびアシルから選択され；
Ｒ１は、ＣＮまたはＣＯ２ＲＣから選択され；
Ｒ２は、ＣＯ２ＲＣおよびアシルから選択され；
Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく；または
Ｒ２およびＲ３は共に、以下の５～６員の飽和ケト炭素環
Figure 2023030022000023
を形成しており、
式中、ｎは、１もしくは２であり；
該環は、Ｃ１～６アルキルによって１回もしくは複数回置換されていてもよく；または
Ｒ２およびＲ３は共に、以下の５員ラクトン環（ａ）もしくは６員ラクトン環（ｂ）
Figure 2023030022000024
を形成しており、
式中、
Figure 2023030022000025
は、任意選択の二重結合であり、Ｒ’はアルキルであり、
ＲＣは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよい）
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有し得る。
好ましい実施形態において、Ａは、置換されていてもよいアリールである。より好ましくは、Ａは、－ＣＯＯＨで置換されているアリール、またはその塩、エステル、もしくはプロドラッグである。例えば、Ａは、－ＣＯ２ －ＮＨ４ ＋で置換されているアリールであってよい。
別の好ましい実施形態において、Ｒ１はＣＮである。
さらに別の好ましい実施形態において、Ｒ２はアシルである。
一実施形態において、インヒビタは、以下の構造
Figure 2023030022000026
を有する。
他の実施形態において、インヒビタは、以下からなる群より選択される構造：
Figure 2023030022000027
Figure 2023030022000028
および／またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する。
本発明の別の実施形態において、インヒビタは、式（ＩＩＩ）
Figure 2023030022000029
（式中、
Ｒ１は、ＨまたはＣＨ２ＣＯＯＨであり；
ｎは、０または１であり；
ｍは、１または２であり；
Ｗは、ＣＨまたはＮである）
に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する。
一実施形態において、インヒビタは、以下の構造
Figure 2023030022000030
を有する。
本発明の別の実施形態において、インヒビタは、以下の配列のいずれか１つに従う構造を有する：
Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ、
ｃ［Ｃｙｓ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ］－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ、および
ｃ［Ｈｃｙ－Ｔｙｒ－Ｈｃｙ］－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ。
本発明のさらに別の実施形態において、インヒビタは、以下の化合物
Figure 2023030022000031
に従う構造を有する。
本明細書において単独で、または複合語において用いられる用語「アルキル」または「ａｌｋ」は、直鎖アルキルまたは分枝アルキル、好ましくはＣ１～２０アルキル、例えばＣ１～１０またはＣ１～６を示す。直鎖アルキルおよび分枝アルキルの例として、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，２－ジメチルプロピル、１，１－ジメチル－プロピル、ヘキシル、４－メチルペンチル、１－メチルペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２－トリメチルプロピル、ヘプチル、５－メチルヘキシル、１－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、３，３－ジメチルペンチル、４，４－ジメチルペンチル、１，２－ジメチルペンチル、１，３－ジメチルペンチル、１，４－ジメチル－ペンチル、１，２，３－トリメチルブチル、１，１，２－トリメチルブチル、１，１，３－トリメチルブチル、オクチル、６－メチルヘプチル、１－メチルヘプチル、１，１，３，３－テトラメチルブチル、ノニル、１－、２－、３－、４－、５－、６－、または７－メチル－オクチル、１－、２－、３－、４－、または５－エチルヘプチル、１－、２－、または３－プロピルヘキシル、デシル、１－、２－、３－、４－、５－、６－、７－、および８－メチルノニル、１－、２－、３－、４－、５－、または６－エチルオクチル、１－、２－、３－、または４－プロピルヘプチル、ウンデシル、１－、２－、３－、４－、５－、６－、７－、８－、または９－メチルデシル、１－、２－、３－、４－、５－、６－、または７－エチルノニル、１－、２－、３－、４－、または５－プロピルオクチル、１－、２－、または３－ブチルヘプチル、１－ペンチルヘキシル、ドデシル、１－、２－、３－、４－、５－、６－、７－、８－、９－、または１０－メチルウンデシル、１－、２－、３－、４－、５－、６－、７－、または８－エチルデシル、１－、２－、３－、４－、５－、または６－プロピルノニル、１－、２－、３－、または４－ブチルオクチル、１－２－ペンチルヘプチル等が挙げられる。アルキル基が、一般に「プロピル」、「ブチル」その他と呼ばれる場合、これは、適切な場合には任意の直線異性体または分枝異性体を指し得ることが理解されよう。アルキル基は、本明細書において定義される１つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されていてもよい。
本明細書において用いられる用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素対炭素二重結合を含有する直鎖炭化水素残基または分枝炭化水素残基から形成される基を示し、先で定義されるエチレン性モノ、ジ、またはポリ不飽和アルキル基、好ましくはＣ２～２０アルケニル（例えばＣ２～１０またはＣ２～６）が挙げられる。アルケニルの例として、ビニル、アリル、１－メチルビニル、ブテニル、イソ－ブテニル、３－メチル－２－ブテニル、１－ペンテニル、１－ヘキセニル、３－ヘキセニル、１－ヘプテニル、３－ヘプテニル、１－オクテニル、１－ノネニル、２－ノネニル、３－ノネニル、１－デセニル、３－デセニル、１，３－ブタジエニル、１，４－ペンタジエニル、１，３－ヘキサジエニル、および１，４－ヘキサジエニルが挙げられる。アルケニル基は、本明細書において定義される１つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されていてもよい。
本明細書において用いられる用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を含有する直鎖炭化水素残基または分枝炭化水素残基から形成される基を示し、先で定義されるエチン性モノ、ジ、またはポリ不飽和アルキル基が挙げられる。炭素原子の数が特定されない限り、該用語は好ましくは、Ｃ２～２０アルキニル（例えばＣ２～１０またはＣ２～６）を指す。例として、エチニル、１－プロピニル、２－プロピニル、ならびにブチニル異性体およびペンチニル異性体が挙げられる。アルキニル基は、本明細書において定義される１つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されていてもよい。
「［基］オキシ」と記載される用語は、酸素によって連結された場合の特定の基を指し、例えば、用語「アルコキシ」、「アルケノキシ」、「アルキノキシ」、「アリールオキシ」、および「アシルオキシ」はそれぞれ、酸素原子によって連結された場合の、先に定義されるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、およびアシル基を示す。「［基］チオ」と記載される用語は、硫黄によって連結された場合の特定の基を指し、例えば、用語「アルキルチオ」、「アルケニルチオ」、「アルキニルチオ」、および「アリールチオ」はそれぞれ、硫黄原子によって連結された場合の、先に定義されるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基を示す。同様に、「［基Ａ］基Ｂ」と記載される用語は、二価の形態の基Ｂによって連結された場合の基Ａを指すことが意図され、例えば、「ヒドロキシアルキル」は、アルキレン基によって連結された場合のヒドロキシ基である。
用語「ハロゲン」（「ハロ」）は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）を示す。
「アラルキル」等の複合語において用いられる用語「アリール」（または「カルボアリール」）または省略形「ａｒ」は、芳香族残基を含有する一環、二環、または多環（共役および縮合を含む）の任意の炭化水素環系を示す。アリールの例として、フェニル、ビフェニル、テルフェニル、クアテルフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル（テトラリニル）、アントラセニル、ジヒドロアントラセニル、ベンズアントラセニル、ジベンズアントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、ピレニル、イデニル、イソインデニル、インダニル、アズレニル、およびクリセニルが挙げられる。アリールの特定の例として、フェニルおよびナフチルが挙げられる。アリール基は、本明細書において定義される１つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されていてもよい。
用語「カルボシクリル」は、非芳香族の単環式、二環式、および多環式（縮合、架橋、または共役を含む）の任意の炭化水素残基、例えばＣ３～２０（例えば、Ｃ３～１０、Ｃ３～８、またはＣ５～６）を含む。環は、飽和していてもよいし（例えばシクロアルキル）、１つもしくは複数の二重結合（シクロアルケニル）および／または１つもしくは複数の三重結合（シクロアルキニル）を有してもよい。特定のカルボシクリルの例として、単環式の５～６員の、または二環式の９～１０員の環系がある。適切な例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロオクテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキサジエニル、シクロオクタテトラエニル、およびデカリニルが挙げられる。カルボシクリル基は、本明細書において定義される１つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されていてもよい。特に、モノカルボシクリル基は、架橋基によって置換されて、二環式架橋基を形成していてもよい。
用語「カルボシクリル」は、非芳香族の単環式、二環式、および多環式（縮合、架橋、または共役を含む）の任意の炭化水素残基、例えばＣ３～２０（例えば、Ｃ３～１０、Ｃ３～８、またはＣ５～６）を含む。環は、飽和していてもよいし（例えばシクロアルキル）、１つもしくは複数の二重結合（シクロアルケニル）および／または１つもしくは複数の三重結合（シクロアルキニル）を有してもよい。カルボシクリルの例として、単環式の５～６員の、または二環式の９～１０員の環系が挙げられる。適切な例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロオクテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキサジエニル、シクロオクタテトラエニル、およびデカリニルが挙げられる。カルボシクリル基は、本明細書において定義される１つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されていてもよい。モノカルボシクリル基は、架橋基によって置換されて、二環式架橋基を形成していてもよい。
単独で、または複合語において用いられる場合の用語「ヘテロシクリル」は、単環式、二環式、または多環式（縮合、架橋、または共役を含む）の任意の炭化水素残基、例えばＣ３～２０（例えば、Ｃ３～１０またはＣ３～８）を含み、１つまたは複数の炭素原子が、独立して、ヘテロ原子によって置き換えられて、非芳香族ヘテロ原子含有環を含有する基を提供する。適切なヘテロ原子として、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、およびＳｅ、特にＯ、Ｎ、およびＳが挙げられる。２個以上の炭素原子が置き換えられている場合、これは、２個以上の同じヘテロ原子によってもよいし、異なるヘテロ原子によってもよい。ヘテロシクリル基は、飽和していてもよいし、部分的に不飽和であってもよく、例えば、１つまたは複数の二重結合を有する。特に好ましいヘテロシクリルは、単環式５～６員のヘテロシクリル、および二環式の９～１０員のヘテロシクリルである。ヘテロシクリル基の例として、アズリジニル、オキシラニル、チイラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、２Ｈ－ピロリル、ピロリジニル、１－、２－、および３－ピロリニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、インドリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、チオモルホリニル、ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピロリル、テトラヒドロチオフェニル（硫化テトラメチレン）、ピラゾリニル、ジオキサラニル、チアゾリジニル、イソキサゾリジニル、ジヒドロピラニル、オキサジニル、チアジニル、チオモルホリニル、オキサチアニル、ジチアニル、トリオキサニル、チアジアジニル、ジチアジニル、トリチアニル、アゼピニル、オキセピニル、チエピニル、インデニル、インダニル、３Ｈ－インドリル、イソインドリニル、４Ｈ－キノラジニル、クロメニル、クロマニル、イソクロマニル、ベンズオキサジニル（２Ｈ－１，３－、２Ｈ－１，４－、１Ｈ－２，３－、４Ｈ－３，１－、４Ｈ－１，４－）ピラニル、ならびにジヒドロピラニルが挙げられ得る。ヘテロシクリル基は、本明細書において定義される１つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されていてもよい。
用語「ヘテロアリール」は、単環式、二環式、多環式の、任意の縮合炭化水素残基、架橋炭化水素残基、または共役炭化水素残基を含み、１つまたは複数の炭素原子は、ヘテロ原子によって置き換えられて、少なくとも１つの芳香族ヘテロ原子含有環を有する残基を提供する。例示的なヘテロアリールは、３～２０個、例えば３～１０個の環原子を有する。特に好ましいヘテロアリールは、５～６員の単環式環系、および９～１０員の二環式環系である。適切なヘテロ原子として、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、およびＳｅ、特にＯ、Ｎ、およびＳが挙げられる。２個以上の炭素原子が置き換えられている場合、これは、２個以上の同じヘテロ原子によってもよいし、異なるヘテロ原子によってもよい。ヘテロアリール基の適切な例として、ピリジル、ピロリル、チエニル、イミダゾリル、フラニル、ベンゾチエニル、イソベンゾチエニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、インドリル、イソインドリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、１，５－ナフチリジニル、キノザリニル、キナゾリニル、キノリニル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、およびフラザニルが挙げられ得る。ヘテロアリール基は、本明細書において定義される１つまたは複数の任意選択の置換基によって置換されていてもよい。
用語「アシル」は、単独で、または複合語において、部分Ｃ＝Ｏを含有する基を示す。一部の実施形態において、アシルは、カルボン酸、エステル、またはアミドを含まない。アシルは、Ｃ（Ｏ）－Ｚを含み、式中、Ｚは、水素、またはアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリルアルキル、もしくはヘテロシクリルアルキル残基である。アシルの例として、ホルミル、直鎖アルカノイルまたは分枝アルカノイル（例えばＣ１～２０）、例えば、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、２－メチルプロパノイル、ペンタノイル、２，２－ジメチルプロパノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、ノナデカノイル、およびイコサノイル；シクロアルキルカルボニル、例えば、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、およびシクロヘキシルカルボニル；アロイル、例えば、ベンゾイル、トルオイル、およびナフトイル；アラルカノイル、例えば、フェニルアルカノイル（例えば、フェニルアセチル、フェニルプロパノイル、フェニルブタノイル、フェニルイソブチリル、フェニルペンタノイル、およびフェニルヘキサノイル）およびナフチルアルカノイル（例えば、ナフチルアセチル、ナフチルプロパノイル、およびナフチルブタノイル）；アラルケノイル、例えば、フェニルアルケノイル（例えば、フェニルプロペノイル、フェニルブテノイル、フェニルメタクリロイル、フェニルペンテノイル、およびフェニルヘキセノイル）およびナフチルアルケノイル（例えば、ナフチルプロペノイル、ナフチルブテノイル、およびナフチルペンテノイル）；アリールオキシアルカノイル、例えば、フェノキシアセチルおよびフェノキシプロピオニル；アリールチオカルバモイル、例えばフェニルチオカルバモイル；アリールグリオキシロイル、例えば、フェニルグリオキシロイルおよびナフチルグリルオキシロイル；アリールスルホニル、例えば、フェニルスルホニルおよびナフチルスルホニル；複素環式カルボニル；複素環式アルカノイル、例えば、チエニルアセチル、チエニルプロパノイル、チエニルブタノイル、チエニルペンタノイル、チエニルヘキサノイル、チアゾリルアセチル、チアジアゾリルアセチル、およびテトラゾリルアセチル；複素環式アルケノイル、例えば、複素環式プロペノイル、複素環式ブテノイル、複素環式ペンテノイル、および複素環式ヘキセノイル；ならびに複素環式グリオキシロイル、例えば、チアゾリグリオキシロイルおよびチエニルグリオキシロイルが挙げられる。Ｒ残基およびＺ残基は、本明細書において記載されるように、置換されていてもよい。
本明細書中で、「置換されていてもよい」は、基が、置換されていなくてもよいし、さらに、有機基および無機基の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上で置換されていてもよいし、これと（縮合二環式基または縮合多環式基を形成するように）縮合していてもよいことを意味すると捉えられ、該有機基および該無機基として、以下から選択されるものが挙げられる：アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アシル、アラルキル、アルキルアリール、アルキルヘテロシクリル、アルキルへテロアリール、アルキルカルボシクリル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、ハロアリール、ハロカルボシクリル、ハロヘテロシクリル、ハロヘテロアリール、ハロアシル、ハロアリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ヒドロキシカルボシクリル、ヒドロキシアリール、ヒドロキシヘテロシクリル、ヒドロキシヘテロアリール、ヒドロキシアシル、ヒドロキシアラルキル、アルコキシアルキル、アルコキシアルケニル、アルコキシアルキニル、アルコキシカルボシクリル、アルコキシアリール、アルコキシヘテロシクリル、アルコキシヘテロアリール、アルコキシアシル、アルコキシアラルキル、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、カルボシクリルオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アシルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ハロアルキニルオキシ、ハロアリールオキシ、ハロカルボシクリルオキシ、ハロアラルキルオキシ、ハロヘテロアリールオキシ、ハロヘテロシクリルオキシ、ハロアシルオキシ、ニトロ、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、ニトロヘテロアリール、ニトロカルボシクリル、ニトロアシル、ニトロアラルキル、アミノ（ＮＨ２）、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アラルキルアミノ、ジアラルキルアミノ、アシルアミノ、ジアシルアミノ、ヘテロシクルアミノ、ヘテロアリールアミノ、カルボキシ、カルボキシエステル、アミド、アルキルスルホニルオキシ、アリールスルフェニルオキシ、アルキルスルフェニル、アリールスルフェニル、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、カルボシクリルチオ、ヘテロシクリルチオ、ヘテロアリールチオ、アシルチオ、スルホキシド、スルホニル、スルホンアミド、アミノアルキル、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミノカルボシクリル、アミノアリール、アミノへテロシクリル、アミノへテロアリール、アミノアシル、アミノアラルキル、チオアルキル、チオアルケニル、チオアルキニル、チオカルボシクリル、チオアリール、チオへテロシクリル、チオへテロアリール、チオアシル、チオアラルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアルケニル、カルボキシアルキニル、カルボキシカルボシクリル、カルボキシアリール、カルボキシへテロシクリル、カルボキシへテロアリール、カルボキシアシル、カルボキシアラルキル、カルボキシエステルアルキル、カルボキシエステルアルケニル、カルボキシエステルアルキニル、カルボキシエステルカルボシクリル、カルボキシエステルアリール、カルボキシエステルへテロシクリル、カルボキシエステルへテロアリール、カルボキシエステルアシル、カルボキシエステルアラルキル、アミドアルキル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、アミドカルボシクリル、アミドアリール、アミドへテロシクリル、アミドへテロアリール、アミドアシル、アミドアラルキル、ホルミルアルキル、ホルミルアルケニル、ホルミルアルキニル、ホルミルカルボシクリル、ホルミルアリール、ホルミルへテロシクリル、ホルミルへテロアリール、ホルミルアシル、ホルミルアラルキル、アシルアルキル、アシルアルケニル、アシルアルキニル、アシルカルボシクリル、アシルアリール、アシルへテロシクリル、アシルへテロアリール、アシルアシル、アシルアラルキル、スルホキシドアルキル、スルホキシドアルケニル、スルホキシドアルキニル、スルホキシドカルボシクリル、スルホキシドアリール、スルホキシドへテロシクリル、スルホキシドへテロアリール、スルホキシドアシル、スルホキシドアラルキル、スルホニルアルキル、スルホニルアルケニル、スルホニルアルキニル、スルホニルカルボシクリル、スルホニルアリール、スルホニルへテロシクリル、スルホニルへテロアリール、スルホニルアシル、スルホニルアラルキル、スルホンアミドアルキル、スルホンアミドアルケニル、スルホンアミドアルキニル、スルホンアミドカルボシクリル、スルホンアミドアリール、スルホンアミドへテロシクリル、スルホンアミドへテロアリール、スルホンアミドアシル、スルホンアミドアラルキル、ニトロアルキル、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロカルボシクリル、ニトロアリール、ニトロヘテロシクリル、ニトロヘテロアリール、ニトロアシル、ニトロアラルキル、シアノ、サルフェート、スルホネート、ホスホネート、およびホスフェート基。任意選択の置換はまた、鎖または環中のＣＨ２基が、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）またはチオカルボニル基（Ｃ＝Ｓ）によって置き換えられており、２つの隣接する、または隣接しない炭素原子（例えば、１，２－または１，３－）が、－Ｏ－（ＣＨ２）Ｓ－Ｏ－基または－ＮＲＸ－（ＣＨ２）Ｓ－ＮＲＸ－基のそれぞれの一方端によって置換されており、ｓが、１または２であり、かつ各Ｒｘが、独立して、ＨまたはＣ１～６アルキルであり、ＣおよびＮから独立して選択される２つの隣接する、または隣接しない原子が、Ｃ１～５アルキレン基またはＣ２～５アルケニレン基のそれぞれの一方端によって（架橋基を形成するように）置換されていることを指すと捉えられてもよい。
例示的な任意選択の置換基として、以下から選択されるものが挙げられる：アルキル（例えばＣ１～６アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）、シクロアルキル（例えばＣ３～６シクロアルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシル）、ヒドロキシアルキル（例えばヒドロキシＣ１～６アルキル、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル）、アルコキシアルキル（例えばＣ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、例えば、メトキシメチル、メトキシエチル、メトキシプロピル、エトキシメチル、エトキシエチル、エトキシプロピル）、アルコキシ（例えばＣ１～６アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、アルコキシアルコキシ（例えばＣ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、例えば、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ、プロポキシメトキシ、プロポキシエトキシ、プロポキシプロポキシ）、シクロアルコキシ（例えば、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペントキシル、シクロヘキシルオキシ）、ハロ、ハロアルキル（例えばハロＣ１～６アルキル、例えば、クロロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチル）、ハロアルコキシ（例えばハロＣ１～６アルコキシ）、ヒドロキシ、チオ（－ＳＨ）、スルホニル、スルホンアミド、フェニル（それ自体さらに、例えば、１つまたは複数のＣ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルによって置換されていてもよい）、ベンジル（ベンジルはそれ自体さらに、例えば、Ｃ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルの１つまたは複数によって置換されていてもよい）、フェノキシ（フェニルはそれ自体さらに、例えば、Ｃ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルの１つまたは複数によって置換されていてもよい）、ベンジルオキシ（ベンジルはそれ自体さらに、例えば、Ｃ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルの１つまたは複数によって置換されていてもよい）、ＮＨ２、アルキルアミノ（例えば－ＮＨＣ１～６アルキル、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノその他）、ジアルキルアミノ（例えば－ＮＨ（Ｃ１～６アルキル）２、例えばジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ）、アシルアミノ（例えば－ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、例えば－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３）、フェニルアミノ（すなわち－ＮＨフェニル（フェニルはそれ自体さらに、例えば、Ｃ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、ヒドロキシＣ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルの１つまたは複数によって置換されていてもよい））、ニトロ、シアノ、ホルミル、－Ｃ（Ｏ）－アルキル（例えば－Ｃ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、例えばアセチル）、Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アルキル（例えば－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、例えばアセチルオキシ）、ベンゾイル（ベンジルはそれ自体さらに、例えば、Ｃ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルの１つまたは複数によって置換されていてもよい）、ベンゾイルオキシ（ベンジルはそれ自体さらに、例えば、Ｃ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルの１つまたは複数によって置換されていてもよい）、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２アルキル（例えばＣＯ２Ｃ１～６アルキル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル）、ＣＯ２フェニル（フェニルはそれ自体さらに、例えば、Ｃ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルの１つまたは複数によって置換されていてもよい）、ＣＯ２ベンジル（ベンジルはそれ自体さらに、例えば、Ｃ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルの１つまたは複数によって置換されてもよい）、ＣＯＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨフェニル（フェニルはそれ自体さらに、例えば、Ｃ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルの１つまたは複数によって置換されていてもよい）、Ｃ（Ｏ）ＮＨベンジル（ベンジルはそれ自体さらに、例えば、Ｃ１～６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシＣ１～６アルコキシ、ハロＣ１～６アルキル、ハロＣ１～６アルコキシ、シアノ、ニトロ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、ＮＨ２、ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～６アルキル、およびＮＣ１～６アルキルＣ１～６アルキルの１つまたは複数によって置換されていてもよい）、Ｃ（Ｏ）ＮＨアルキル（例えばＣ（Ｏ）ＮＨＣ１～６アルキル、例えば、メチルアミド、エチルアミド、プロピルアミド、ブチルアミド）、Ｃ（Ｏ）Ｎジアルキル（例えばＣ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１～６アルキル）２）、アミノアルキル（例えば、ＨＮＣ１～６アルキル－、Ｃ１～６アルキルＨＮ－Ｃ１～６アルキル－、および（Ｃ１～６アルキル）２Ｎ－Ｃ１～６アルキル－）、チオアルキル（例えばＨＳＣ１～６アルキル－）、カルボキシアルキル（例えばＨＯ２ＣＣ１～６アルキル－）、カルボキシエステルアルキル（例えばＣ１～６アルキルＯ２ＣＣ１～６アルキル－）、アミドアルキル（例えば、Ｈ２Ｎ（Ｏ）ＣＣ１～６アルキル－、Ｈ（Ｃ１～６アルキル）Ｎ（Ｏ）ＣＣ１～６アルキル－）、ホルミルアルキル（例えばＯＨＣＣ１～６アルキル－）、アシルアルキル（例えばＣ１～６アルキル（Ｏ）ＣＣ１～６アルキル－）、ニトロアルキル（例えばＯ２ＮＣ１～６アルキル－）、Ｃ＝ＯによるＣＨ２の置換、Ｃ＝ＳによるＣＨ２の置換、－Ｏ－（ＣＨ２）Ｓ－Ｏ－基または－ＮＲ’－（ＣＨ２）Ｓ－ＮＲ’－基のそれぞれの一方端による、２つの隣接する、または隣接しない炭素
原子（例えば、１，２または１，３）の置換（式中、ｓは、１または２であり、各Ｒ’は、独立して、ＨまたはＣ１～６アルキルである）、ならびにＣおよびＮから独立して選択される２つの隣接する、または隣接しない原子の、Ｃ２～５アルキレン基またはＣ２～５アルケニレン基による置換。
用語「スルホキシド」は、単独で、または複合語において、基－Ｓ（Ｏ）Ｒを指し、式中、Ｒは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、およびアラルキルから選択される。Ｒの例として、水素、Ｃ１～２０アルキル、フェニル、およびベンジルが挙げられる。
用語「スルホニル」は、単独で、または複合語において、基Ｓ（Ｏ）２－Ｒを指し、式中、Ｒは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、アシル、およびアラルキルから選択される。Ｒの例として、水素、Ｃ１～２０アルキル、フェニル、およびベンジルが挙げられる。
用語「スルホンアミド」、または「スルホンアミド」の「スルホンアミル」は、単独で、または複合語において、基Ｓ（Ｏ）２ＮＲＲを指し、式中、各Ｒは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、アシル、およびアラルキルから選択される。Ｒの例として、水素、Ｃ１～２０アルキル、フェニル、およびベンジルが挙げられる。一実施形態において、少なくとも１つのＲが水素である。別の形態において、双方のＲが水素である。
用語「スルファメート」は、単独で、または複合語において、基－ＯＳ（Ｏ）２ＮＲＲを指し、式中、各Ｒは、独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、アシル、およびアラルキルから選択される。Ｒの例として、水素、Ｃ１～２０アルキル、フェニル、およびベンジルが挙げられる。一実施形態において、少なくとも１つのＲが水素である。別の形態において、双方のＲが水素である。
用語「スルファミド」は、単独で、または複合語において、基－ＮＲＳ（Ｏ）２ＮＲＲを指し、式中、各Ｒは、独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、アシル、およびアラルキルから選択される。Ｒの例として、水素、Ｃ１～２０アルキル、フェニル、およびベンジルが挙げられる。一実施形態において、少なくとも１つのＲが水素である。別の形態において、双方のＲが水素である。
「サルフェート」基は、基－ＯＳ（Ｏ）２ＯＲを指し、式中、各Ｒは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、アシル、およびアラルキルから選択される。Ｒの例として、水素、Ｃ１～２０アルキル、フェニル、およびベンジルが挙げられる。
用語「スルホネート」は、基ＳＯ３Ｒを指し、式中、各Ｒは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、アシル、およびアラルキルから選択される。Ｒの例として、水素、Ｃ１～２０アルキル、フェニル、およびベンジルが挙げられる。
用語「チオ」は、式「－ＳＲ」の基を含むことが意図されており、式中、Ｒは、水素（チオール）、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アラルキル、およびアシルであってよい。Ｒの例として、水素、Ｃ１～２０アルキル、フェニル、およびベンジルが挙げられる。
用語「アミノ」は、本明細書において、当技術分野において理解されている最も広い意味で用いられ、式－ＮＲＡＲＢの基を含み、式中、ＲＡおよびＲＢは、独立して、水素、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アシル、およびアミドから選択され得、これらはそれぞれ、本明細書において記載されるように、置換されていてもよい。ＲＡおよびＲＢはまた、これらが結合する窒素と共に、単環式、または縮合多環式の環系、例えば３～１０員環、特に５～６および９～１０員の系を形成していてもよい。「アミノ」の例として、－ＮＨ２、－ＮＨアルキル（例えば－ＮＨＣ１～２０アルキル）、－ＮＨアルコキシアルキル、－ＮＨアリール（例えば－ＮＨフェニル）、－ＮＨアラルキル（例えば－ＮＨベンジル）、－ＮＨアシル（例えば、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～２０アルキル、－ＮＨＣ（Ｏ）フェニル）、－ＮＨアミド（例えば、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ１～６アルキル、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨフェニル）、－Ｎジアルキル（各アルキル、例えばＣ１～２０は、同じであっても異なっていてもよい）、および５員環または６員環（１つまたは複数の同じ、または異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、およびＳ）を含有していてもよい）が挙げられる。「［基］アミノ」として記載される基への言及は、ＲＡ基およびＲＢ基の性質（ｎａｔｕｒｅ）を反映することが意図されている。例えば、「アルキルアミノ」は、ＲＡまたはＲＢの一方がアルキルである－ＮＲＡＲＢを指す。「ジアルキルアミノ」は、ＲＡおよびＲＢがそれぞれ（独立して）アルキル基である－ＮＲＡＲＢを指す。
用語「アミド」は、本明細書において、当技術分野において理解されている最も広い意味で用いられ、式Ｃ（Ｏ）ＮＲＡＲＢを有する基を含み、式中、ＲＡおよびＲＢは、先で定義される通りである。アミドの例として、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨアルキル（例えばＣ１～２０アルキル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨアリール（例えばＣ（Ｏ）ＮＨフェニル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨアラルキル（例えばＣ（Ｏ）ＮＨベンジル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨアシル（例えば、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１～２０アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）フェニル）、Ｃ（Ｏ）Ｎアルキルアルキル、（各アルキル、例えばＣ１～２０は、同じであっても異なっていてもよい）、および５員環または６員環（１つまたは複数の同じ、または異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、およびＳ）を含有していてもよい）が挙げられる。
用語「カルボキシエステル」は、本明細書において、当技術分野において理解されている最も広い意味で用いられ、式－ＣＯ２Ｒを有する基を含み、式中、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、カルボシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アラルケニル、ヘテロアリールアルケニル、カルボシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルケニル、アラルキニル、ヘテロアリールアルキニル、カルボシクリルアルキニル、ヘテロシクリルアルキニル、およびアシルを含む群より選択され得、これらはそれぞれ、置換されていてもよい。カルボキシエステルの一部の例として、－ＣＯ２Ｃ１～２０アルキル、－ＣＯ２アリール（例えば－ＣＯ２フェニル）、－ＣＯ２ａｒＣ１～２０アルキル（例えば－ＣＯ２ベンジル）が挙げられる。
用語「ホスホネート」は、基－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）を指し、式中、Ｒは、独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、アシル、およびアラルキルから選択される。Ｒの例として、水素、Ｃ１～２０アルキル、フェニル、およびベンジルが挙げられる。
用語「ホスフェート」は、基－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）２を指し、式中、Ｒは、独立して、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、アシル、およびアラルキルから選択される。Ｒの例として、水素、Ｃ１～２０アルキル、フェニル、およびベンジルが挙げられる。
カルボン酸イソスターは、カルボキシル基と同じ、または類似の特性を示すことができる基である。カルボン酸イソスターの一部の例として：－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨＲ、－ＰＯ２Ｒ２、－ＣＮ、－ＰＯ２Ｒ２、－ＯＨ、－ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨＣＯＲ、－ＮＲ２、－ＣＯＮＲ２、－ＣＯＮＨ（Ｏ）Ｒ、－ＣＯＮＨＮＨＳＯ２Ｒ、－ＣＯＨＮＳＯ２Ｒ、および－ＣＯＮＲ－ＣＮが挙げられ、式中、Ｒは、Ｈ、アルキル（例えばＣ１～６アルキル）、フェニル、およびベンジルから選択される。他のカルボン酸イソスターとして、炭素環基および複素環基が挙げられ、例えば以下がある。
Figure 2023030022000032
Figure 2023030022000033
本明細書において用いられる、ＩＲＡＰインヒビタまたはＩＲＡＰのインヒビタへの言及はまた、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形体、またはプロドラッグを含む。
用語「薬学的に許容される塩」は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触して、過度の毒性、炎症、アレルギー反応等なく用いられるのに適しており、かつ妥当なベネフィット／リスク比に相応しい塩を指す。薬学的に許容される塩は、当技術分野において周知である。S. M. Berge et al.は、薬学的に許容される塩を、J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66:1-19において詳細に記載している。該塩として、それぞれに見合った、任意の小分子インヒビタの、比較的毒性のない無機酸塩および有機酸塩が挙げられる。
そのような無機酸の例として、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、およびリン酸がある。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、複素環、カルボン酸、およびスルホン酸のクラスの有機酸から選択されてよく、これらの例として、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、フマル酸、マレイン酸、ピルビン酸、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、アンボン酸、パモ酸、パントテン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β－ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸がある。本発明の化合物の適切な、薬学的に許容される塩基付加塩として、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、および亜鉛から形成される金属塩、ならびに有機塩基、例えばコリン、ジエタノールアミン、モルホリンから形成される有機塩が挙げられる。代わりに、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎメチルグルカミン）、プロカインから形成される有機塩、アンモニウム塩、四級塩、例えばテトラメチルアンモニウム塩、アミノ酸付加塩、例えば、グリシンおよびアルギニンによる塩がある。
例えば、アルカリ金属塩（Ｋ、Ｎａ）およびアルカリ土金属塩（Ｃａ、Ｍｇ）が、構造に適切であると考えられるならば、用いられてよいが、ここでも、任意の、薬学的に許容される、毒性のない塩が、適切である場合に用いられてよい。Ｎａ－塩およびＣａ－塩が好ましい。
そのような化合物およびそのような塩の、薬学的に許容される溶媒和物（水和物を含む）もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
固体である小分子インヒビタの場合、当業者であれば、化合物、剤、および塩は、様々な結晶形態または多形形態で存在し得ることを理解すると考えられ、それらの全てが、本発明および特定の式の範囲内にあることが意図される。
用語「多形体」は、本明細書において記載される任意の化合物の任意の結晶形態、例えば、無水形態、含水形態、溶媒和物形態、および混合溶媒和物形態を含む。
ＩＲＡＰの抗体インヒビタが、当技術分野において公知の、ＩＲＡＰに対する抗体を生じさせる技術によって生産され得、該抗体は、本明細書において記載されるアッセイを用いて、ＩＲＡＰ阻害活性の有無に関してスクリーニングされてよい。例えば、モノクローナル抗体が、以下のように調製され得る。ＩＲＡＰまたはそのフラグメントによるマウスまたは他の適切な宿主動物の免疫化。ＩＲＡＰもしくはそのフラグメントおよび／またはアジュバントによる免疫化は、多点注射によってよく、通常、皮下注射または腹腔内注射である。ＩＲＡＰまたはそのフラグメントは、インヒビタ上で、キャリア、例えば血清アルブミンまたはダイズトリプシンに結合されてよい（宿主内で免疫原性を増強する抗原）。ハイブリドーマを生じさせるのに好ましい動物系は、マウス系である。融合用に免疫化された脾細胞の単離のための免疫化プロトコルおよび免疫化技術が、当技術分野において周知である。融合細胞パートナ（例えば、マウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１、ラット骨髄腫Ｙ３、ウサギ骨髄腫２４０Ｅ １、ヒトＫ６Ｈ６）、融合手順、およびスクリーニング手順もまた、当技術分野において周知である（Galfre et al., 1977；Gefter et al., 1977；Galfre et al., 1979；Dangl et al., 1982；Spieker-Polet et al., 1995）。
句「治療的有効量」は、一般に、本発明の１つもしくは複数のインヒビタ、または、小分子インヒビタならば、その薬学的に許容される塩、多形体、もしくはプロドラッグの、（ｉ）本明細書において記載される特定の疾患、症状、もしくは障害を処置し、（ｉｉ）特定の疾患、症状、もしくは障害の１つもしくは複数の症候を弱め、改善し、もしくは除外し、または（ｉｉｉ）特定の疾患、症状、もしくは障害の１つもしくは複数の症候の開始を遅らせる量を指す。
「線維症（線維形成）」、「線維性疾患」、または「線維増殖疾患」は、損傷直後の修復プロセスにおける過剰な線維性結合組織の形成を意味する。瘢痕化は、冒された臓器または組織の構造を壊滅させる、連続的な線維形成の結果である。形成された瘢痕組織を一掃しない異常な修復プロセスの結果として、線維症はさらに進行する。線維症は、心臓、肺、肝臓、皮膚、血管、および腎臓が挙げられる種々の組織において見出され得る。線維症の例が、本明細書において記載されており、種々の心血管疾患と関連する、肺線維症、肝硬変、全身性硬化症、進行性腎疾患、および心線維症が挙げられる。
個体は、対象が、臓器機能障害、瘢痕化、正常な細胞外マトリックスバランスの変化、コラーゲン沈着の増大、コラーゲン容量分率の増大、筋線維芽細胞への線維芽細胞の分化、マトリックスメタロプロテイナーゼレベルの下降およびマトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビタレベルの上昇、Ｉ型プロコラーゲンのＮ末端プロペプチドもしくはＣ末端プロペプチド（ＰＩＮＰまたはＰＩＣＰ）どちらかのレベルの上昇およびＩ型コラーゲンのＣ末端テロペプチド（ＣＴＰまたはＣＩＴＰ）のレベルの下降、コラーゲン沈着の増大、ならびに種々の非侵襲性の撮像技術によって測定される心機能障害、タンパク尿およびアルブミン尿の増大によって測定される腎機能障害、糸球体濾過速度の低下、血漿クレアチニンレベルの倍増を示すかを判定することによって、線維症を患っていると同定され得る。
好ましくは、線維性疾患は、ＩＲＡＰの発現および／または活性と関連した上方制御である。ＩＲＡＰの発現または活性は、本明細書において記載される任意のアッセイによって測定され得る。
組織損傷に関係する臓器線維症として、心血管疾患と関連した線維症、および臓器移植、例えば腎移植または肝移植の後に生じた線維症が挙げられる。
本発明の好ましい実施形態に従えば、肺線維症は、特発性肺線維症、サルコイドーシス、嚢胞性線維症、家族性肺線維症、珪肺症、石綿症、炭坑夫塵肺症、炭素塵肺、過敏症肺炎、無機ダストの吸入によって引き起こされる肺線維症、感染作用物質によって引き起こされた肺線維症、有害なガス、エーロゾル、化学ダスト、フューム、または蒸気の吸入によって引き起こされた肺線維症、薬物性間質性肺疾患、または肺高血圧症である。
本発明の好ましい実施形態に従えば、肝線維症は、慢性肝疾患、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、Ｄ型肝炎ウィルス感染、住血吸虫症、アルコール性肝疾患または非アルコール性脂肪肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患、肥満、糖尿病、タンパク質栄養失調、冠動脈疾患、自己免疫肝炎、嚢胞性線維症、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、原発性胆汁性肝硬変、薬物反応、および毒素への曝露に由来する。
本発明の好ましい実施形態に従えば、皮膚線維症は、瘢痕化、肥厚性瘢痕、ケロイド瘢痕、真皮線維形成障害、乾癬、または硬皮症である。前記瘢痕化は、熱傷、外傷、外科的損傷、放射線、または潰瘍に由来し得る。前記潰瘍は、糖尿病性足部潰瘍、静脈脚部潰瘍、または圧迫潰瘍であり得る。
本明細書において用いられる「予防する」または「予防」は、少なくとも、疾患または障害を被る（または、これに影響される）リスクの見込みの引下げ（すなわち、疾患に曝されている可能性があり、またはこの体質である可能性があるが、疾患の症候をまだ経験していない、または示していない患者において、疾患の臨床症候の少なくとも１つを進行させないこと）を指すことが意図される。そのような患者を同定するための生物学的パラメータおよび生理学的パラメータが、本明細書において提供されており、そしてまた、内科医によって周知されている。例えば、年齢起因性の心線維症、高血圧性心疾患、高血圧心筋症もしくは心不全と関連した心臓もしくは腎臓の線維症、または糖尿病を伴うまたは伴わない腎症の予防は、コラーゲン沈着が対象において既に検出可能であるならば、間質コラーゲン沈着の不在、または間質コラーゲン沈着の増大の不在によって、特徴付けられ得る。
対象の「処置」または「処置する」という用語は、疾患もしくは症状、疾患もしくは症状の症候、または疾患もしくは症状の（または、これに影響される）リスクを遅らせ、減速させ、安定化させ、治療し、治し、緩和し、和らげ、変更し、改善し、より悪化させず、良くし、向上させ、またはこれに影響を及ぼす目的での、対象への、本発明の化合物の付与または投与（または対象由来の細胞または組織への、本発明の化合物の付与または投与）を含む。用語「処置する」は、損傷、病理、または症状の処置または改善における成功の任意の徴候を指し、該徴候として、任意の客観的パラメータまたは主観的パラメータが挙げられ、例えば、減退；寛解；悪化速度の低下；疾患の重篤度の引下げ；安定化、症候の減弱、または損傷、病理、もしくは症状の、対象にとっての更なる許容化；衰退または衰弱の減速；衰退の最終点の弱体化；あるいは対象の身体的または精神的健康の向上がある。
線維性疾患の存在、改善、処置、または予防は、対象の、臨床的にもしくは生化学的に関連した任意の方法、または対象由来の生検によるものであり得る。例えば、測定されるパラメータとして、線維症の存在、コラーゲン、フィブロネクチン、もしくは別の細胞外マトリックスタンパク質の含有量、ホスファチジン酸レベルもしくはコリンレベル、細胞の増殖速度、細胞中のいずれかの細胞外マトリックス構成成分、または、筋線維芽細胞への細胞の分化転換があり得る。例えば、腎線維症の阻害は、アルブミン尿またはタンパク尿、血清クレアチニンの増大、活性線維形成の低下（尿サンプル中のコラーゲンフラグメントレベルの引下げによって測定される）によって測定される腎機能の更なる喪失を妨げることによって、そして腎臓生検組織上での筋線維芽細胞の存在の減少によって、検出され得る。さらに、例えば、肺線維症において、療法に対する好反応が、肺活量測定、体プレチスモグラフ使用、および肺拡散能によって測定される肺機能における更なる衰弱を予防することであろう。また、コラーゲンフラグメントの血中レベルもまた、引き下げられるであろう。
本明細書において記載される線維症を逆転させるとは、コラーゲンの合成を阻害すること、かつ／または分解を増強することを含む。線維症の逆転の、臨床的にまたは生化学的に観察可能な結果として、加齢または組織損傷に対する反応として形成される線維性組織の減少がある。線維症の逆転はまた、処置が始まる前の時点と比較した、処置が始まった後の時点での、本明細書において記載される線維症の任意の特性または症候の、臨床的にまたは生化学的に観察可能な引下げを含んでもよい。
本明細書において用いられる用語「拮抗」は、「減少」または「引下げ」を意味することが意図される。十分な期間は、１週間、または１週間から１ヵ月間、１から２ヵ月間、または２ヵ月間以上であり得る。慢性症状について、本発明の化合物は、生存期間の間、有利に投与され得る。
用語「肺線維症」は、肺における過剰な線維性結合組織の形成または進行（線維形成）によって、瘢痕化された（線維性の）組織が進行することを意味する。より正確には、肺線維症は、肺胞および肺間質組織の肥大および瘢痕化を引き起こす慢性疾患である。瘢痕組織は、健康な組織にとって代わって、炎症を引き起こす。この慢性炎症は、逆に、線維症の前兆である。肺組織へのこの損傷により、肺は硬くなり、その後呼吸が増々困難となる。
用語「肝線維症」は、肝臓における過剰な線維性結合組織の形成または進行（線維形成）によって、瘢痕化した（線維性の）組織が進行することを意味する。瘢痕化した組織は、線維形成プロセスによって、健康な組織にとって代わって、肝臓のその後の肝硬変が導かれる。
用語「皮膚線維症」または「真皮線維症」は、上皮細胞または線維性結合組織の過剰な増殖（線維形成）によって、瘢痕化した（線維性の）組織が進行することを意味する。瘢痕化した組織は、線維形成プロセスによって、健康な組織にとって代わって、全身性硬皮症の前兆となり得る。皮膚線維症は、任意の皮膚組織および上皮細胞の線維症をカバーすることが意図され、該皮膚組織および該上皮細胞として、非限定的に、血管および静脈、臓器または腺、例えば顎下腺の管、胆嚢、甲状腺濾胞、汗腺管、卵巣、腎臓の内部空洞；歯茎の上皮細胞、舌、口蓋、鼻、喉頭、食道、胃、腸、直腸、肛門、および膣；真皮、瘢痕、皮膚、および頭皮が挙げられる。本発明の化合物は、創傷の治癒を促進する活性があり得、以下の活性の１つまたは複数がある：
－前記創傷において、コラーゲン組織化を改善し、かつ／または創傷細胞（wound cellularity）を引き下げること；
－前記創傷において、線維芽細胞および上皮細胞によるコラーゲン生産過剰を引き下げること；
－前記創傷において、上皮間葉系の転移を引き下げること；
－前記創傷において、線維芽細胞の移動および活性化を引き下げること；
－前記創傷において、真皮の肥厚を引き下げ、かつ／または阻害すること；
－前記創傷に対する炎症性細胞の補充を引き下げ、かつ／または阻害すること。
用語「心線維症」は、心臓線維芽細胞の不適当な増殖に起因する心臓弁の異常な肥厚を意味するが、より一般的には、心筋における線維芽細胞の増殖を指す。線維細胞は、通常、コラーゲンを分泌し、そして心臓の構造的支持を実現するように機能する。過度に活性化される場合、このプロセスは、弁および心筋それ自体の肥厚および線維症を引き起こして、白色の組織が、主に三尖弁または僧帽弁上に蓄積するが、肺動脈弁または大動脈弁上にも出現する。肥厚、および可撓性の喪失は最終的に、弁機能障害、ならびに右側心不全および左側心不全に至る虞がある。一般に、予防的使用および治療的使用は、本明細書において記載される化合物の、これを必要とする対象、好ましくはヒト患者への投与を含む。
「特発性肺線維症（ＩＰＦ）」は、特発性間質肺炎（ＩＩＰ）（間質肺疾患のタイプ）の特定の徴候である。間質肺疾患は、びまん性実質性肺疾患（ＤＰＬＤ）としても公知であり、間質に影響を及ぼす一群の肺疾患を指す。顕微鏡的に、ＩＰＦ患者由来の肺組織は、通常の間質肺炎（ＵＩＰ）として公知である組織学的特徴の特徴的セットを示す。したがって、ＵＩＰは、ＩＰＦの病理学的提示である。
線維症の例示的な形態として、以下に限定されないが、心線維症、肝線維症、腎線維症、肺線維症、血管線維症、真皮の瘢痕およびケロイド、ならびにアルツハイマー病が挙げられる。更なる実施形態において、心線維症は、高血圧、高血圧性心疾患（ＨＨＤ）、高血圧性心筋症（ＨＣＭ）、心筋梗塞（ＭＩ）、および再狭窄を伴い、または腎線維症に由来する腎機能障害の結果としてある。
好ましくは、線維症は腎線維症である。腎線維症として、以下に限定されないが、糖尿病性腎症、膀胱尿管逆流、尿細管間質性腎線維症、糸球体腎炎（ＧＮ）、巣状分節性糸球体硬化症、膜様糸球体腎炎、または膜性増殖性ＧＮが挙げられ得る。肝線維症として、以下に限定されないが、肝硬変、および関連する症状、例えば慢性ウィルス肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎が挙げられ得る。肺線維症として、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または原因不明の線維性肺胞炎、慢性線維性間質性肺炎、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、およびびまん性実質性肺疾患（ＤＰＬＤ）が挙げられ得る。心線維症、鬱血性心不全、心筋症、心機能の心筋梗塞後欠陥；周縁血管疾患；慢性関節リウマチ；緑内障；加齢による黄斑変性（ｗｅｔ ＡＭＤおよびｄｒｙ ＡＭＤ）；肺気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；多発性硬化症；および慢性喘息もまた、本明細書において記載される組成物、方法、または使用により、予防、処置、または改善され得る。
本明細書において記載される任意の方法または使用の結果として、ＩＲＡＰの阻害は、虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害の後に、心臓の機能を向上させ、かつ梗塞領域を縮小させ得る。
好ましい形態において、線維性疾患は、心線維症、腎線維症、肝線維症、または間質性線維症である。
硬皮症（全身性硬化症）は、皮膚（真皮）および内部臓器（重篤な場合）の硬化（ｓｃｌｅｒｏ）によって特徴付けられる慢性全身性自己免疫疾患である。臨床的に、患者の層別化、および薬物有効性は、皮膚病変の縮小の生検／視覚化、ならびに２４週および４８週にわたって評価される他の客観的尺度により、測定され得る。したがって、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、または硬皮症はまた、処置および／または予防についての線維形成状態でもある。
心血管系において、血管壁内の、そして心間質および血管周囲腔内のコラーゲンの進行性の、加齢による沈着、または心血管疾患もしくは腎疾患に関係するコラーゲン沈着は、心筋コンプライアンスおよび動脈コンプライアンスの低下に至る。
投与の頻度は、１日１回であってもよいし、１日２回または３回であってもよい。処置期間は、疾患が検出可能な期間であってもよい。
典型例として、治療的有効投薬量は、少なくとも約０．１％から最大約５０％以上、そしてその中の範囲の全ての組合せおよび部分的組合せの濃度（重量による）を含有するように配合される。組成物は、式Ｉに従う１つもしくは複数の化合物、またはその薬学的に許容される塩、多形体、もしくはプロドラッグを、約０．１から約５０％未満、例えば、約４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、または４０％の濃度で含有するように配合されてよい（濃度は、約０．１％超、例えば、約０．２、０．３、０．４、または０．５％から、約４０％未満、例えば、約３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、または３０％までである）。例示的な組成物は、約０．５％から約３０％未満、例えば、約２９、２８、２７、２６、２５、２５、２４、２３、２２、２１、または２０％まで含有してよい（濃度は、約０．５％超、例えば、約０．６、０．７、０．８、０．９、または１％から、約２０％未満、例えば、約１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０％までである）。組成物は、約１％超、例えば約２％から、約１０％未満、例えば約９または８％まで含有してよい（濃度として、約２％超、例えば、約３または４％から、約８％未満、例えば、約７または６％までが挙げられる）。活性作用物質は、例えば、約５％の濃度で存在してよい。全ての場合において、量は、処置される細胞または組織に実際に送達される活性成分の量の差異を補正するように調整されてよい。
本発明はヒトにおける用途を見出すが、本発明はまた、動物の治療目的にも有用である。本発明は、家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ウマ、および家禽；ペット、例えば、ネコおよびイヌ；ならびに動物園の動物に有用である。
薬学的組成物は、任意の適切な投与経路（例えば、局所投与（例えば、経皮投与または眼投与）、経口投与、口腔内投与、鼻投与、膣投与、直腸投与、または非経口投与が挙げられる）用に製剤化されてよい。本明細書において用いられる非経口という用語は、皮下、皮内、脈管内（例えば静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、眼内、眼球周囲、眼窩内、滑液嚢内、そして腹膜内の注射、および類似した任意の注射技術または注入技術が挙げられる。特定の実施形態において、経口用途または非経口用途に適した形態の組成物が好ましい。適切な経口形態として、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁液、分散性の粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬カプセルもしくは軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシルが挙げられる。さらに他の実施形態内で、本明細書において提供される組成物は、凍結乾燥物として製剤化されてよい。
種々の投薬量単位はそれぞれ、好ましくは、別々の投薬量の錠剤、カプセル、ロゼンジ、ドラジェ、ゴム、または他のタイプの固体製剤として提供される。カプセルは、粉末、液体、またはゲルをカプセル化してよい。固体製剤は、嚥下されてもよいし、吸引可能な、または噛み砕けるタイプ（脆い、またはゴム様）であってもよい。本発明は、ブリスターパックではない投薬量単位保持デバイス；例えばパッケージ、例えば、ボトル、チューブ、キャニスタ、パケットを意図する。投薬量単位はさらに、薬学的製剤の実施において周知の、そして吸引可能な、または噛み砕ける製剤用の、従来の賦形剤を含んでよく、例えば、結合剤、ジェラン、充填剤、錠剤成形潤滑剤、崩壊剤、界面活性剤、および着色剤がある。
経口使用が意図される組成物はさらに、１つまたは複数の構成成分、例えば、甘味剤、賦香剤、着色剤、および／または保存剤を含んでよく、魅力的かつ口に合う調製物を提供することができる。錠剤は、活性成分を、錠剤の製造に適した、生理的に許容される賦形剤と混合して、含有する。そのような賦形剤として、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム、造粒剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチまたはアルギン酸、結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム、ならびに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクが挙げられる。錠剤は、コーティングされていなくてもよいし、消化管内での崩壊および吸収を遅延させることによって、より長期間にわたって作用を持続させるように、公知の技術によってコーティングされてもよい。例えば、遅延材料、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが使用されてもよい。
経口使用用の製剤はまた、硬ゼラチンカプセルと形容されてもよく、この中で活性成分が、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリンと混合されており、または軟ゼラチンカプセルと形容されてもよく、この中で活性成分が、水媒質または油媒質、例えばピーナッツ油、液体パラフィン、もしくはオリーブ油と混合されている。
水性懸濁液は、活性成分を、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して含有する。そのような賦形剤として、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアラビアゴム、ならびに分散剤または湿潤剤、例えば、天然に存在するリン脂質（例えばレシチン）、アルキレンオキシドの、脂肪酸との縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、エチレンオキシドの、長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、エチレンオキシドの、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドの、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。水性懸濁液はまた、１つまたは複数の防腐剤、例えば、エチルまたはｎ－プロピルｐ－ヒドロキシヒドロキシベンゾエート、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の賦香剤、および１つまたは複数の甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリンを含んでもよい。
油性の懸濁液は、活性成分を、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはココヤシ油中に、または鉱油、例えば流動パラフィン中に懸濁させることによって、製剤化されてよい。油性の懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、またはセチルアルコールを含有してよい。甘味剤、例えば先で示されるもの、および／または賦香剤は、口に合う経口調製物を提供するために加えられてよい。そのような懸濁液は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸の付加によって、保存され得る。
水の付加による水性懸濁液の調製に適した分散性の粉末および顆粒は、活性成分を、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、および１つまたは複数の防腐剤との混合物で提供する。適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤は、先で既に言及されたものによって例示される。更なる賦形剤、例えば甘味剤、賦香剤、および着色剤もまた、存在してもよい。
薬学的組成物はまた、水中油エマルジョンの形態であってもよい。油性相は、植物油、例えばオリーブ油もしくはラッカセイ油、鉱油、例えば流動パラフィン、またはそれらの混合物であってよい。適切な乳化剤として、天然に存在するゴム、例えばアラビアゴムまたはトラガカントゴム、天然に存在するリン脂質、例えばダイズレシチン、脂肪酸およびヘキシトールに由来するエステルまたは部分エステル、無水物、例えばソルビタンモノオレエート、ならびに脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルの、エチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。エマルジョンはまた、１つまたは複数の甘味剤および／または賦香剤を含んでもよい。
シロップおよびエリキシルは、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、またはスクロースで製剤化されてよい。そのような製剤はまた、１つまたは複数の粘滑剤、防腐剤、賦香剤、および／または着色剤を含んでもよい。
化合物は、局所投与用に、例えば皮膚への局所塗布用に、製剤化されてよい。局所投与用の製剤は、典型的に、活性剤と組み合わせた局所ビヒクルを含み、更なる任意選択の構成成分があってもなくてもよい。
本明細書において記載される任意の線維性疾患について、本発明の化合物がヒトに局所投与される場合、化合物の治療的有効量は、好ましくは、約０．０１から約１０％（ｗ／ｗ）、約０．１から１０％（ｗ／ｗ）、約１．０から約１０％（ｗ／ｗ）、約０．１から約５％（ｗ／ｗ）、または約１．０から約５％（ｗ／ｗ）に相当する。本明細書において記載される任意の線維性疾患において、本発明の化合物が対象に経口投与される場合、化合物の治療的有効量は、好ましくは、約１から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１から３５ｍｇ／ｋｇ、約１から２５ｍｇ／ｋｇ、約１から約１０ｍｇ／ｋｇ、約５から約２５ｍｇ／ｋｇ、または約１０から約２０ｍｇ／ｋｇに相当する。
「プロドラッグ」は、代謝手段によって（例えば加水分解、還元、または酸化によって）、本発明の化合物にインビボ可変である化合物を意味する。例えば、ヒドロキシル基を含有する本発明の化合物のエステルプロドラッグは、加水分解によって親分子にインビボ可変であってよい。エステルが形成され得る場合、適切なエステルとして、例えば、酢酸エステル、クエン酸エステル、乳酸エステル、酒石酸エステル、マロン酸エステル、シュウ酸エステル、サリチル酸エステル、プロピオン酸エステル、コハク酸エステル、フマル酸エステル、マレイン酸エステル、メチレン－ビス－β－ヒドロキシナフトエ酸エステル、ゲスチジン酸エステル、イセチオン酸エステル、ジ－ｐ－トルオイル酒石酸エステル、メタンスルホン酸エステル、エタンスルホン酸エステル、ベンゼンスルホン酸エステル、ｐ－トルエンスルホン酸エステル、シクロヘキシルスルファミン酸エステル、およびキナ酸エステルがある。
式Ｉ、式ＩＩ、もしくは式ＩＩＩ、またはその薬学的に許容される塩、多形体、もしくはプロドラッグに従う１つまたは複数の化合物の構造に、共通した変化を介して調製されるプロドラッグは、当業者に周知であると考えられ、そして本明細書において含まれる。例えば、Zawilska, J. B. et al. Pharmacological Reports, 2013, 65, 1-14に記載されるプロドラッグのタイプが、本出願に包含され、該タイプは、関連する化合物の構造および投与経路に関連する。
適切な局所ビヒクルおよび更なる構成成分が、当技術分野において周知であり、ビヒクルの選択は、特定の物理的形態および送達モードによって決まると考えられることが明らかであろう。局所ビヒクルとして、有機溶媒、例えばアルコール（例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、またはグリセリン）、グリコール、例えば、ブチレン、イソプレン、またはプロピレングリコール、脂肪族アルコール、例えばラノリン、水および有機溶媒の混合液、有機溶媒、例えばアルコールおよびグリセリンの混合液、脂質ベースの材料、例えば脂肪酸、油、例えば鉱油を含むアシルグリセロール、天然起源の、または合成起源の脂肪、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質およびワックス、タンパク質ベースの材料、例えばコラーゲンおよびゼラチン、シリコーンベースの材料（不揮発性および揮発性の双方）、ならびに炭化水素ベースの材料、例えば、マイクロスポンジおよびポリマーマトリックスが挙げられる。
組成物はさらに、与えられる製剤の安定性または有効性を向上させるように適合される１つまたは複数の構成成分を含んでよく、例えば、安定化剤、懸濁化剤、乳化剤、粘度調整剤、ゲル化剤、防腐剤、抗酸化剤、皮膚浸透エンハンサ、モイスチャライザ、および持続放出材料がある。そのような構成成分の例が、Martindale - The Extra Pharmacopoeia (Pharmaceutical Press, London 1993)およびMartin (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されている。製剤は、マイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン－マイクロカプセル、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、またはナノカプセルを含んでよい。
局所製剤が、種々の物理的形態で調製されてよく、例えば、固体、ペースト、クリーム、フォーム、ローション、ゲル、粉末、水性液体、エマルジョン、スプレー、およびスキンパッチが挙げられる。そのような形態の物理的外観および粘度は、製剤中に存在する乳化剤および粘度調整剤の存在および量によって決定され得る。固体は、概して堅く、注ぐことができず、そして一般的に、バーもしくはスティックとして、または微粒子の形態で製剤化される。固体は、不透明であっても透明であってもよく、そして任意で、溶媒、乳化剤、モイスチャライザ、皮膚軟化剤、芳香剤、色素／着色剤、防腐剤、および最終生成物の有効性を増大させ、または増強する他の活性成分を含有してもよい。クリームおよびローションは大抵、互いに類似しているが、主にそれらの粘度が異なる。ローションおよびクリームは双方とも、不透明であっても半透明であっても透明であってもよく、大抵、乳化剤、溶媒、粘度調整剤、モイスチャライザ、皮膚軟化剤、芳香剤、色素／着色剤、防腐剤、および最終生成物の有効性を増大させ、または増強する他の活性成分を含有してもよい。ゲルは、濃い、または高い粘度から、薄い、または低い粘度の広範な粘度で、調製され得る。該製剤もまた、ローションおよびクリームのように、溶媒、乳化剤、モイスチャライザ、皮膚軟化剤、芳香剤、色素／着色剤、防腐剤、および最終生成物の有効性を増大させ、または増強する他の活性成分を含有してもよい。液体は、クリーム、ローション、またはゲルよりも薄く、そして大抵、乳化剤を含有しない。液体局所生成物は、大抵、溶媒、乳化剤、モイスチャライザ、皮膚軟化剤、芳香剤、色素／着色剤、防腐剤、および最終生成物の有効性を増大させ、または増強する他の活性成分を含有する。
局所製剤に用いられる乳化剤として、以下に限定されないが、イオン性乳化剤、セテアリルアルコール、非イオン乳化剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテル、ＰＥＧ－４０ステアレート、セテアレス－１２、セテアレス－２０、セテアレス－３０、セテアレスアルコール、ＰＥＧ－１００ステアレート、およびグリセリルステアレートが挙げられる。適切な粘度調整剤として、以下に限定されないが、保護コロイドまたは非イオンゴム、例えばヒドロキシエチルセルロース、キサンタンゴム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、シリカ、微結晶ワックス、蜜蝋、パラフィン、およびパルミチン酸セチルが挙げられる。ゲル組成物は、ゲル化剤、例えばキトサン、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリクオタニウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマー、またはアンモニア化グリチルリジネートの付加によって、形成されてよい。適切な界面活性剤として、以下に限定されないが、非イオン界面活性剤、両性界面活性剤、イオン性界面活性剤、および陰イオン界面活性剤が挙げられる。例えば、ジメチコンコポリオール、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ラウラミドＤＥＡ、コカミドＤＥＡ、およびコカミドＭＥＡ、オレイルベタイン、コカミドプロピルホスファチジルＰＧ－ジモニウムクロリド、ならびにラウレス硫酸アンモニウムの１つまたは複数が、局所製剤内で用いられてよい。
防腐剤として、以下に限定されないが、抗菌物質、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸、安息香酸、およびホルムアルデヒド、ならびに物理的安定化剤および抗酸化剤、例えば、ビタミンＥ、アスコルビン酸ナトリウム／アスコルビン酸、および没食子酸プロピルが挙げられる。適切なモイスチャライザとして、以下に限定されないが、乳酸および他のヒドロキシ酸、ならびにそれらの塩、グリセリン、プロピレングリコール、ならびにブチレングリコールが挙げられる。適切な皮膚軟化剤として、ラノリンアルコール、ラノリン、ラノリン誘導体、コレステロール、ペトロラタム、ネオペンタン酸イソステアリル、および鉱油が挙げられる。適切な芳香剤および着色剤として、以下に限定されないが、FD&C Red No. 40およびFD&C Yellow No. 5が挙げられる。局所製剤中に含まれてよい他の適切な更なる成分として、以下に限定されないが、研磨剤、吸収剤、固化防止剤、消泡剤、帯電防止剤、アストリンゼン（例えばウィッチへーゼル）、アルコール、ハーブ抽出物、例えばカモミール抽出物、結合剤／賦形剤、緩衝剤、キレート剤、フィルム形成剤、品質改良剤、推進剤、乳白剤、ｐＨ調整剤、および保護剤が挙げられる。
局所組成物用の典型的な送達モードとして、指による塗布、物理的アプリケータ、例えば布、ティシュー、綿棒、スティック、またはブラシを用いる塗布、ミストを含む噴霧、エーロゾル噴霧またはフォーム噴霧、点滴（dropper application）、振掛け、浸漬、およびリンスが挙げられる。放出制御ビヒクルが用いられてもよく、組成物が、経皮投与用に（例えば経皮的パッチとして）製剤化されてもよい。
薬学的組成物は、吸入製剤として製剤化されてよく、スプレー、ミスト、またはエーロゾルが挙げられる。これは、肺線維症の処置に特に好ましいであろう。吸入製剤について、本明細書において提供される組成物または組合せは、当業者に公知の任意の吸入方法を介して送達されてよい。そのような吸入方法および吸入デバイスとして、以下に限定されないが、推進剤、例えばＣＦＣもしくはＨＦＡ、または生理的に、かつ環境的に許容される推進剤による定量吸入器が挙げられる。他の適切なデバイスとして、吸気駆動型吸入器、マルチドーズ型乾燥粉末吸入器、およびエーロゾルネビュライザがある。対象方法に用いられるエーロゾル製剤として、典型的に、推進剤、界面活性剤、および共溶媒が挙げられ、該エーロゾル製剤は、適切な計量弁によって閉じられる従来のエーロゾルコンテナ中に充填されてよい。
吸入組成物は、噴霧化および気管支内使用に適した活性成分を含有する液体組成物もしくは粉末組成物、または計測用量を分配するエーロゾルユニットを介して投与されるエーロゾル組成物を含んでよい。適切な液体組成物は、活性成分を、水性の、薬学的に許容される吸入溶媒、例えば等張生理食塩水または静菌水中に含む。溶液は、ポンプもしくはスクイーズ作動型噴霧スプレーディスペンサによって、または任意の他の従来の、液体組成物の必要な投薬量を患者の肺中に吸入させ、もしくは該吸入を可能にする手段によって、投与される。キャリアが液体である、例えば、鼻スプレーとしての、または点鼻薬としての投与に適した製剤として、活性成分の水性溶液または油性溶液が挙げられる。
薬学的組成物は、例えば直腸投与用に、坐薬の形態で調製されてもよい。そのような組成物は、薬物を、常温で固体であるが、直腸温にて液体であることで、直腸内で溶融して薬物を放出する、適切な非刺激性賦形剤と混合することによって、調製されてよい。適切な賦形剤として、例えば、カカオバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
薬学的組成物は、持続放出製剤、例えば、投与後にモジュレータの徐放をもたらすカプセルとして製剤化されてよい。そのような製剤は、一般に、周知の技術を用いて調製されてよく、そして、例えば、経口、直腸、もしくは皮下移植によって、または所望の標的部位での移植によって投与されてよい。そのような製剤内に用いられるキャリアは、生物学的適合性がある。そしてまた、生物分解性であってもよい。好ましくは、製剤は、比較的一定のモジュレータ放出レベルを実現する。持続放出製剤内に含有されるモジュレータの量は、例えば、移植の部位、放出の速度および予想される期間、ならびに処置され、または予防されることとなる症状の性質によって決まる。
別の実施形態において、本明細書において記載されるＩＲＡＰの１つもしくは複数のインヒビタ、またはその薬学的に許容される塩、多形体もしくはプロドラッグ、および／あるいは先で記載される薬学的組成物を含む製造キットまたは製造品が提供される。
他の実施形態において、先で言及した治療用途または予防用途に用いられるキットが提供され、該キットは、以下を含む：
－本明細書において記載されるＩＲＡＰの１つもしくは複数のインヒビタの形態の治療組成物、またはその薬学的に許容される塩、多形体、もしくはプロドラッグ、あるいは薬学的組成物を保持するコンテナ；
－使用説明書を備えたラベルまたはパッケージ内印刷物。
特定の実施形態において、キットは、線維性疾患の処置用の、１つまたは複数の更なる活性成分を含有してよい。
キットまたは「製造品」は、コンテナを、そしてコンテナ上に、またはコンテナに付随して、ラベルまたはパッケージ内印刷物を備えてよい。適切なコンテナとして、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスターパックその他が挙げられる。コンテナは、ガラスまたはプラスチック等の種々の材料から形成されてよい。コンテナは、症状を処置するのに有効な治療組成物を保持している。そして、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、コンテナは、皮下注射針で突き刺すことのできるストッパを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい）。ラベルまたはパッケージ内印刷物は、治療組成物が、選択した症状を処置するのに用いられることを示す。一実施形態において、ラベルまたはパッケージ内印刷物は、使用説明書を含み、治療組成物または予防組成物が、本明細書において記載される線維性疾患を処置するのに用いられ得ることを示す。
キットは、（ａ）治療組成物または予防組成物；および（ｂ）第２のコンテナであって、その中に第２の活性成分が含有される第２のコンテナを備えてよい。本発明のこの実施形態におけるキットはさらに、組成物および他の活性成分が、障害を処置し、または本明細書において記載される線維性疾患に由来する合併症を予防するのに用いられ得ることを示すパッケージ内印刷物を含んでよい。代わりに、または追加的に、キットはさらに、薬学的に許容されるバッファ、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液を含む第２の（または第３の）コンテナを備えてよい。キットはさらに、商業的な見地およびユーザーの見地から所望される他の材料を含んでよく、他のバッファ、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジが挙げられる。
特定の実施形態において、治療組成物は、使い捨て可能な、または再使用可能なデバイスの形態で提供されてよく、該デバイスとして、治療組成物、予防組成物、または薬学的組成物を保持するレセプタクルが挙げられる。一実施形態において、デバイスはシリンジである。デバイスは、１～２ｍＬの治療組成物を保持してよい。治療組成物または予防組成物は、直ぐに使える状態で、または更なる構成成分の混合もしくは付加を必要とする状態で、デバイス内に提供されてよい。
特定の任意の患者についての具体的な用量レベルは、使用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与の時間、投与経路、排泄速度、薬物の組合せ（すなわち、患者を処置するのに用いられることになる他の薬物）、および治療を受ける特定の障害の重篤度が挙げられる種々の要因によって決まることが理解されよう。
本明細書中で開示され、かつ定義される本発明は、言及され、または本文または図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の全ての代替組合せに及ぶことが理解されよう。これらの様々な組合せは全て、本発明の種々の代替態様を構成する。
これらの例は、本発明のこれらの態様および他の態様を実証することが意図されることが理解されよう。そして、該例は、本発明の特定の実施形態を記載するが、該例は、これらの実施形態をこれらのものに限定しないことが理解されよう。先で言及した本発明の態様および／または原理を逸脱しない範囲で、種々の変更が加えられてよく、均等物が置換されてよく、かつ改変が行われてよい。そのような変更、均等物、および改変は全て、本出願において示される特許請求の範囲内であることが意図される。
ＩＲＡＰノックアウトマウスの作出
包括的ＩＲＡＰ欠失（ＩＲＡＰ－／－）マウスを、以前に記載されるように（Albiston, 2009）、Ozgene Pty Ltd,（Perth, Australia）によって作出した。オリゴヌクレオチド
Figure 2023030022000034
（GeneticアクセッションNT_039643）を用いるＰＣＲによって、子孫の遺伝子型を特定した。生じた野生型対立遺伝子ＰＣＲ産物は３８４ｂｐであり、ノックアウト対立遺伝子は１０４１ｂｐであった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、野生型（ＷＴ）対照として用いた。４～６ヵ月齢の幼年マウス、および１８～２２ヵ月齢の老齢マウス（双方の系統とも３５～５０ｇと秤量された）を、Monash Animal Research Laboratories（ＡＲＬ）から得た。標準的な食事をマウスに不断給餌して、該マウスを、Pharmacology Animal House, Monash Universityにおいて、２１±１～５℃、１２時間の明／暗室の標準的なマウスケージ内に収容した（ケージあたりおおよそマウス４頭）。全ての処理および実験手順は、Monash University Animal Ethics Committeeによって承認された（Ethics # SOBSB/PHAR/2010/23）。
薬物処置および外科的手順
異なる８セットのインビボ実験を、この研究において行った：
Ａ）アンギオテンシン（Ａｎｇ）ＩＩ（８００ｎｇ／ｋｇ／分；ｓ．ｃ．）で４週間処理した、包括的ＩＲＡＰノックアウトマウスおよびそのＷＴ対照の心臓および血管の表現型の特徴付け。マウスの心臓および血管を、生理食塩水で処理した幼年ＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウスから得た組織と比較した。
Ｂ）ＩＲＡＰインヒビタ処置後の心血管系における、Ａｎｇ ＩＩ起因性変化の予防。予防モデルにおいて、ＷＴマウスを、Ａｎｇ ＩＩ（８００ｎｇ／ｋｇ／分；ｓ．ｃ．）±ＩＲＡＰインヒビタ（ＨＦＩ－４１９；５００ｎｇ／ｋｇ／分を２８日間）、またはＨＦＩ－ビヒクル（１ＤＭＳＯ：３ＨＢＣ）で処置した。
Ｃ）包括的ＩＲＡＰノックアウトマウスにおける老齢の心臓、腎臓、および血管の表現型の特徴付け。老齢ＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウスの心臓、腎臓、および血管を、幼年ＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウスから得た組織と比較した。
Ｄ）ＩＲＡＰインヒビタ処置後の、心血管系の年齢起因性変化の逆転。逆転モデルにおいて、老齢ＷＴマウスを、生理食塩水、ＩＲＡＰインヒビタ（５００ｎｇ／ｋｇ／分のＨＦＩ－４１９；５００ｎｇ／ｋｇ／分の化合物１；５０ｎｇ／ｋｇ／分の化合物２）、またはＨＦＩ－ビヒクル（１ＤＭＳＯ：３ＨＢＣ）のいずれかで４週間処置した。
Ｅ）老齢包括的ＩＲＡＰノックアウトマウス、および老齢ＩＲＡＰインヒビタ（５００ｎｇ／ｋｇ／分のＨＦＩ－４１９；ｓ．ｃ．）処置ＷＴマウスからとった単離心臓における虚血再灌流傷害の予防を、年齢がマッチするビヒクル処置（１ＤＭＳＯ：３ＨＢＣ；ｓ．ｃ．）ＷＴ対照と比較した。
Ｆ）老齢包括的ＩＲＡＰノックアウトマウスにおける、心エコー検査法を用いた心機能の表現型の、老齢ＷＴマウスおよび幼年ＷＴマウスと比較した特徴付け。
Ｇ）高脂肪食（ＨＦＤ）モデルにおけるＩＲＡＰノックアウトマウスの肝臓脂肪症の表現型の特徴付け。
Ｈ）ＩＲＡＰインヒビタ処置後の肝臓における塩起因性線維症の逆転。
外科手術を受けた全てのマウスを、イソフルラン（Isorrane）（誘導５％、そして維持２．５％）で麻酔して、肩甲中央（midscapular）領域を切開して、そこを通して浸透圧ミニポンプ（Alzet model 2004, Alza Corp）を、皮下薬物投与用に挿入した。切開領域を、6/0 DY silk（Dynek Pty Ltd）で縫合して、抗生作用粉末（Cicatrin, Pfizer）を掛けてから、鎮痛剤Cartrophenを筋肉内注射した（１．５ｍｇ／ｍｌのストック溶液；Biopharm Australiaの０．１ｍｌ）。非侵襲性の尾部カフ（tail-cuff）プレチスモグラフ使用装置（MC4000 Blood Pressure Analysis System, Hatteras Instrument Inc）を用いて、収縮期血圧（ＳＢＰ）を隔週で、薬物処置前（０週目）、処置の２週目、そして処置の最後（４週目）に測定した。薬物処置の終了後、マウスの体重を記録した。イソフルラン吸入を用いてマウスを麻酔して、頚椎脱臼によって殺した。臓器（心臓、大動脈、腎臓、脳、血液、および脛骨）を収集して、心臓および大動脈を、以下に記載するように適切に解剖した。全ての臓器を、液体窒素中で急速に凍結させて、マウスを殺した日に血管反応性研究に用いないのであれば、－８０℃にて保存した。
以下の手順を、先の実験群から収穫した臓器に行った：
心線維症分析
コラーゲン沈着を測定するために、心臓、腎臓、または大動脈の凍結切片（全て５μｍの厚さ）を、１０分間空気乾燥させて、キシレンに３回（それぞれ２分）通して、３回無水アルコール洗浄してから、水道のＨ２Ｏ中で３０秒間リンスした。ピクロシリウスレッドの最適濃度（この場合、飽和ピクリン酸中に希釈した０．０５％ピクロシリウスレッド）での染色を実行して、１時間放置した。その後、切片を水中でリンスして、０．０１Ｍ ＨＣｌ中で２分間分化させてから、無水アルコールで３回洗浄して脱水した。その後、スライドを３回キシレン洗浄してから、封入媒質としてＤＰＸを用いる標準的な組織学的技術に従って、カバーガラスをかけた。２０×の倍率下で、明視野（Olympus, BX51）および円偏光光学顕微鏡（circularized polarized light microscopy）（DM IRB, Leica）を用いて撮像した一方、総視野あたりの陽性間質コラーゲン染色のパーセンテージを、ImageJ 1.46ソフトウェア（Java, NIH）を用いて定量化して、８視野の合計から、特定の動物におけるコラーゲン含有量の最終パーセンテージとして平均した。
心肥大のグロス分析
心室重量（ＶＷ）を、体重（ＢＷ）と、ＶＷ：ＢＷ（ｍｇ／ｇ）の比率として、そしてＶＷを、脛骨長（ＴＬ）と、ＶＷ：ＴＬ（ｍｇ／ｍｍ）の比率として、それぞれ比較した。ＯＣＴ内に包埋して凍結させた心臓を、クリオスタット内で５μｍの厚さに横断方向に切片化して、ヘマトキシリンおよびエオシン（Amber Scientific）で着色して、細胞構造を形態的に調査した。Image Jを用いて、心臓切片あたり平均１００個の心筋細胞を、６０×の倍率下で実行して、分析した。
線維症マーカーおよび炎症マーカーの免疫組織化学的位置特定
免疫染色を、５μｍの厚さの横断方向凍結心臓切片または５μｍの厚さの凍結胸部大動脈に実行した。これらの切片を、空気乾燥させて、氷冷アセトン中でおおよそ１５分間固定してから、０．０１Ｍ ＰＢＳバッファで洗浄した（３×１０分）。その後、切片を、０．０１Ｍ ＰＢＳ中１０％ヤギ血清で３０分間インキュベートして、非特異的結合を減らした。一次抗体がヤギにおいて産生されたら、この予めブロックした媒質を、ＰＢＳおよびトリトン－Ｘ中５％ＢＳＡで置換する。次に、ブロッキングバッファを除去して、それぞれのマーカーに対する一次抗体を、以下の希釈物および抗体の起源に基づいて、室温にて一晩処理した：ＩＲＡＰ（１：５００、自社）、α－ＳＭＡ（１：５００、Abcam）、ビメンチン（１：５００、Santa Cruz）、Ｐ－ＩκＢα（１：２００、Cell Signalling）、Ｆ４／８０マクロファージ（１：１００、Serotec）、ＭＣＰ－１（１：１００、Santa Cruz）、ＶＷＦ（１：５００、abcam）。第２日目に氷冷ＰＢＳ中にて４連続で洗浄した後、適切な二次抗体をインキュベートした。主に、Alexa 488（InvitrogenまたはAbcam）、Alexa 594（Invitrogen）、およびFluorescein FI-5000（Vector）を用いた。マウスにおいて一次抗体を産生し、mouse on mouse (M.O.M)キット（Vector）を用いる別の免疫蛍光技術を、以下の希釈物および抗体の起源に基づいて、心臓切片に実行した：ＴＧＦ－β（１：５０、Santa Cruz）、ＩＣＡＭ－１（１：１００、Santa Cruz）。全ての免疫蛍光切片を、Olympus、BX51顕微鏡で２０×の倍率下で見て、Image Jを用いて画像を分析した。
心臓スーパーオキシドおよび血管スーパーオキシドの組織化学的位置特定
ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）を用いて、スーパーオキシドをインサイチューで位置特定した。５μｍの心臓切片または１０μｍの胸部大動脈切片を、２μＭ ＤＨＥで３７℃にて４５分間インキュベートした。隣接する切片を、ＰＥＧ－ＳＯＤ（１０００Ｕ／ｍＬ）と３０分間プレインキュベートしてから、ＤＨＥと４５分インキュベートして、スーパーオキシドについての蛍光シグナルの特異性を確認した。生成物２－ヒドロキシエチジウムの蛍光を、倒立型共焦点顕微鏡（Nikon, C1）を用いて、それぞれ５６８ｎｍおよび５８５ｎｍの励起放射スペクトル下で画像化した。レーザー設定は、得られた各画像について同一であった。蛍光の総密度を、Image Jを用いて定量化した。
ウェスタンブロット分析による組織タンパク質の発現の決定
ホモジナイズした心室由来の総タンパク質を、２５％グリセロール、７．５％ＳＤＳ、２５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ６．８、および０．００１ｇブロモフェノールブルーを含有する１．５×Laemmliバッファを用いて、抽出した。ホモジナイズしたサンプルを超音波で破壊してから、３７℃にて２０分間加熱して、１３，０００ｒｐｍで４℃にて３０分間、遠心分離した。ＲＣＤＣアッセイを実行して、タンパク質含有量を、ProteinQuant-Lowryソフトウェア（SoftMax Pro）を７５０ｎｍにて用いて、定量化した。最後に、サンプルを－２０℃にて保存した。ウェスタンブロットを実行した。最初に、サンプル（１０または２５μｇ／μｌ／サンプル）を電気泳動にかけて、転写させて、一次抗体ＴＧＦ－β（２５ｋＤａ、１：２０００、Santa Cruz）、ＭＭＰ－２（７２ｋＤａ、１：２０００、Millipore）、ＭＭＰ－８（６５ｋＤａ、１：２０００、Santa Cruz）、ＭＭＰ－９（８４ｋＤａ、１：１０００、Chemicon）、ＭＭＰ－１３（５４ｋＤａ、１：１００、Abcam）、ＩＣＡＭ－１（８５－１１０ｋＤａ、１：２００、Santa Cruz）、ＧＡＰＤＨ（３６ｋＤａ、１：２００００、Abcam）でプロービングした。二次抗体は、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００００、Jackson ImmunoResearch）または抗ウサギＩｇＧ（１：１００００、DAKO）であった。その後、ＥＣＬ試薬で現像した。メンブレンを、CLxPosureフィルム（Pierce, Rockford, IL）に曝した。その後、免疫反応バンドを、chemiDoc XRS撮影装置およびQuantity Oneソフトウェア（BioRad）を用いて、定量化した。個々のバンドを、面積あたりのバンド強度を用いて定量化してから、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの面積あたりの強度に対して標準化した。
Bioplex Multiplex Systemによるサイトカイン発現プロフィールの定量化
心室および心尖におけるサイトカインのレベルを、Bio-Plex multiplexアッセイ（Bio-rad）を用いて検出した。組織を急速凍結させて、Bio-Plex細胞溶解キット（Biorad）により、メーカーの説明書に従って、ホモジナイズした。簡潔に、組織を３００μｌの洗浄バッファで１回洗浄して、Tissue Lyser（Qiagen）を用いて溶解溶液中でホモジナイズした。サンプルを３０分間氷上に放置して、６，０００×ｇにて４℃にて２０分間遠心分離した。上澄みを収集して、タンパク質含有量を、Biorad proteinアッセイ（Biorad）を用いて決定した。５００μｇ／ｍｌのタンパク質を用いて、サイトカインのレベルを検出した。Bio-Plex Pro（商標）Mouse Cytokine Standard 23-Plex、グループＩのパネル（ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、エオタキシン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＫＣ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα）を用いた（ビーズに共有結合する２３の異なる抗体を含有した）。サンプル（５００μｇ／ｍｌ）または公知の標準品（２００～９００μｇ／ｍｌ）の５０μｌを、各抗体に特異的な希釈結合ビーズで予めコーティングした９６ウェルプレートのウェルに加えて、ＲＴにて、暗所において３００ｒｐｍで３０分間振盪させながらインキュベートした。結合していない物質を洗浄除去した後に、ビオチン化した検出抗体を加えて、サンドイッチ錯体を作製して、プレートを、暗所においてＲＴにて３００ｒｐｍで振盪させながら、３０分間インキュベートした。３回の洗浄後、最終検出錯体を、ストレプトアビジン－フィコエリトリン結合体の付加により形成して、３００ｒｐｍで振盪させながら、暗所においてＲＴにて１０分間インキュベートした。１００μｌ洗浄バッファによる３回の洗浄後、ビーズを１２５μｌのアッセイバッファ中に再懸濁させた。サンプルを、Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader（Bio-Plex Suspension System）を用いて読みとった。データを、Bio-Plex Managerソフトウェアによって計算した。
ゲルザイモグラフィによるゲラチナーゼ活性の決定
０．２５％トリトンＸ－１００中でホモジナイズした心尖を、１０ｍＭ ＣａＣｌ２中に溶解させて、６０００ｒｐｍで２℃にて３０分間、遠心分離した。ペレットを、０．１Ｍ ＣａＣｌ２中で、６０℃にて４分間の熱抽出に曝してから、氷中で冷やして、２００００ｒｐｍで４℃にて３０分間、遠心分離した。上澄みを、コンセントレータ（企業）を用いて篩分けて、－２０℃にて保存した。ＭＭＰザイモグラフィを実行した。最初に、サンプル（２５μｇ／μｌ／サンプル）を電気泳動にかけた。その後、ゲルを０．２５％トリトンＸ－１００で２回、それぞれ１５分間洗浄してから、３７℃のインキュベーションバッファ中で一晩、インキュベーションさせたままにした。ゲルを、０．１クマシーブルーで１時間染色してから、翌日、７％酢酸で脱色した。その後、バンドの光学密度を、chemiDoc XRS撮影装置およびQuantity Oneソフトウェア（BioRad）を用いて定量化した。
Langendorff単離心臓標本による心機能の決定
マウスにヘパリン（５００ＩＵ）を注射し、２０分後に頚椎脱臼により死亡させた。心臓を迅速に摘出して、氷冷した生理食塩水溶液（ＰＳＳ）中に浸漬した。解剖顕微鏡下で、心臓および大動脈弓の疎性組織（loose tissue）を取り除き、肺の静脈を穿孔して、心臓のフリー灌流を可能にして、心臓を、２０ゲージ針を介してLangendorff装置（ML870B2, ADInstruments, Bella Vista, NSW, Australia）上に載せた。心臓を、以下を含有する予め温めたＰＳＳで、連続的に灌流し（ｍＭ）：ＮａＣｌ １１８；ＫＣｌ ４．７；ＮａＨＣＯ３ ２５；グルコース １１；ＫＨ２ＰＯ４ １．２；ＭｇＳＯ４ １．２；ＣａＣｌ２ １．２ｍＭ、そしてＯ２ ９５％およびＣＯ２ ５％（カルボゲン）で３７℃にてガス処理した。使用の前に、ＰＳＳを、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルタ（Millipore）で濾過した。心臓の灌流チャンバを、温度を３７℃に維持したサーモスタット制御水ジャケット系で取り囲んだ。細い、２００μｍカニューレを、薬物送達用のＰＳＳライン内に存在させた（１：１０薬物希釈、心臓まで１分のタイムラグ）。Ｍｉｌｌａｒ圧力カテーテル（Millar instruments Inc.）を、左心房および左心室の接合部にて、穿刺を介して左心室中に導入して、Power lab system（ADInstruments）に連結した。灌流圧力を８０ｍｍＨｇに維持して、標本を、２０～３０分間、平衡させたままにした。左心室発生圧（ＬＶＤＰ）；拡張終期圧（ＥＤＰ）、心拍数（ＨＲ）、左心室収縮性（＋ｄＰ／ｄｔ）および左心室弛緩（－ｄＰ／ｄｔ）、ならびに冠状動脈流を、継続的に記録した。
Langendorff単離心臓標本における虚血再灌流傷害の決定
虚血を、心臓の灌流を４０分間停止することによって、誘導した。この後に６０分の再灌流を続けた。左心室発生圧（ＬＶＤＰ）、拡張終期圧（ＥＤＰ）、および収縮性（±ｄＰ／ｄｔ）を、６０分間記録した。心臓をLangendorff装置から取り出して、高カリウム（１００ｍＭ）ＰＳＳ内に３分間入れることによって、拡張期で停止させた。その後、これをマウンティングブロックに（心房を介して）接着させて、アガーブロックによって支持して、１ｍｍ厚のスライスにカットした（Integraslice 7550MM（Campden Instruments, UK））。スライスを、２，３，５－トリフェニルテトラヒドロゾリウム（2,3,5-triphenyltetrahydrozolium）（ＴＴＺ １０ｍｇ／ｍｌ）内に入れて、３７℃にて１５分間インキュベートした。スライスを、リン酸緩衝食塩水中４％パラホルムアルデヒド内に保存して、２４時間以内に写真を撮った。梗塞領域を、Image Jソフトウェア（Centre for Information Technology, NIH, Bethesda, MA, USA）を用いて決定した。梗塞面積を、以下のように算出した：
梗塞面積（％）＝（総梗塞面積×１００）／（総スライス面積－内腔面積）。
心エコー検査法による心機能の決定
心エコー検査法を、浅い鎮静（酸素中１％イソフルラン）下で、幼年（３ヵ月齢）、そして老齢の（約２２ヵ月齢）ＷＴ、および老齢の（約２２ヵ月齢）包括的ＩＲＡＰ欠失マウスに実行した。心エコー検査法を、デジタル超音波系（Vevo 2100 Imaging System, VisualSonics, Toronto, Canada）により、１８から３８ＭＨｚの直線配列振動子を用いて実行した。標準的な傍胸骨の長軸画像および短軸画像を、各心エコー調査の間に得て、従来の心エコー測定を、盲検化された観察者によってオフラインで実行した（VisualSonics, Toronto, Canada）。
ヒト心臓線維芽細胞の培養研究
市販のヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ、Catalog #6300, Sciencell, CA, USA）を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ内で維持したＴ７５フラスコ内で増殖させた。完全培地組成：Ｍ１９９培地（#11150-059, life technologies）＋１０％ＦＢＳ（#10437-028, life technologies）＋１％Fibroblast Growth Supplement-2（#2382, ScienCell）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン１０，０００Ｕ／ｍｌ抗生物質（#15140-122, Life Technologies）。新鮮な完全培地を、培養体が７０％のコンフルエンスに達するまで、隔日で補充した。ここで、継代培養するために、培地を、おおよそ９０％のコンフルエンスに達するまで、毎日補充した。継代培養するために、培地を破棄して、培養体を、温かいＰＢＳでリンスした。その後、温かい０．０５％トリプシン＋ＥＤＴＡを用いて、フラスコを穏やかにかき回しながら、培養体を剥離させて、フラスコの表面に細胞が付着していないことを確実にした。その後、トリプシンを完全培地で中和してから、懸濁液を新しいファルコンチューブ中に移して、１０００ｒｐｍにて５分間、遠心分離した。上澄みを破棄して、細胞のペレットを５ｍｌの完全培地で再懸濁させてから、細胞を計数した。継代培養用に、１００万個のＨＣＦを、Ｔ７５フラスコ中に入れる。ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色または免疫蛍光実験用に、丸いカバースリップに沿って並ぶ２４ウェルプレートにおいて、ウェルあたり１０万個の細胞をロードした。ウェスタンブロット分析実験用に、１２ウェルプレートにおいて、ウェルあたり１０万個の細胞をロードした。３～６継代細胞を実験に用いた。完全培地中に、線維化促進剤アンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ；１０－８Ｍ １０－７Ｍ １０－６Ｍ）を、細胞を継代してプレーティングする時点にて加えた。処置の全期間は、おおよそ７２時間であった。一旦処置がなされると、培地を収集して、細胞を、以下の実験タイプに応じて異なるように、処置した：
Ａ）ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色
細胞を最初にカバースリップ上で増殖させて、温かいＰＢＳで１回洗浄して、氷冷メタノール中で－２０℃にて一晩固定した。その翌日、メタノールを破棄して、細胞を、低温ＰＢＳで１回洗浄して、０．１％ＰＳＲ溶液と、室温にて１時間インキュベートした。この後、色素を除去して、細胞を０．１％酢酸で３回洗浄してから、１００％エタノールで３回（それぞれ５分）、そしてキシレンで３回（それぞれ１０分）交換して、脱水した。カバースリップを取り外して、ＤＰＸ封入媒質を用いて、スライド上に載せた。
Ｂ）免疫蛍光：
細胞をカバースリップ上で増殖させて、温かいＰＢＳで１回洗浄して、氷冷アセトン中で－２０℃にて５分間固定した。アセトンを破棄して、細胞を、ＰＢＳ中で、室温にて３×１０分リンスした。その後、細胞を、１０％ヤギ血清で室温にて３０分間ブロックしてから、一次抗体（１：５００希釈）で４℃にて一晩インキュベートした。その翌日、一次抗体を除去して、細胞を、ＰＢＳで、室温にて３×１０分リンスした。その後、細胞を、二次抗体（１：５００の希釈）と室温にて２時間、インキュベートした。その後、細胞を再度、ＰＢＳで、室温にて３×１０分リンスした。カバースリップを２４ウェルプレートから取り外して、ＤＡＰＩを有するVectashield封入媒質を用いてスライド上に載せて、乾燥させたままにしてから、共焦点顕微鏡下で撮像した。
Ｃ）ウェスタンブロット分析：
ｉ．タンパク質抽出：
処置が完了すると、細胞を、温かいＰＢＳで洗浄して、Accutase（A6964, Sigma）を用いて剥離させて、３７℃にて５分インキュベートした。その後、細胞を収集して、７０００ｒｐｍで４℃にて５分間、遠心分離した。この間に、１×ＲＩＰＡ溶解バッファカクテルを新規調製した。遠心分離後、上澄みを破棄した。その後、細胞ペレットを、２０μｌの１×ＲＩＰＡ溶解バッファカクテル中に溶解させて、氷上で３０分間維持した。その後、細胞溶解液を、１３２００ｒｐｍで４℃にて１０分間、遠心分離して、核および不溶性の細胞残渣をペレット化させた。上澄み（約２０μｌ）を新しいチューブに移して、タンパク質濃度を、Biorad Lowry proteinアッセイを用いて測定した。それぞれのマーカーのタンパク質の定量化を、標準的なウェスタンブロット分析によって実行した。
ｉｉ．ウェスタンブロッティング：
１０％ゲル（１５ウェル）を、TGX Stain-Free FastCast Acrylamideスターターキット、１０％（#161-0183, Biorad）を用いて作製した。３部のサンプルを４×サンプルバッファの一部で希釈することによって、すなわち、抽出したタンパク質サンプルの１０μｌ（総抽出タンパク質の半分）を、３．３μｌの４×Laemliサンプルバッファ（#161-0747, Biorad）中に加えることによって、サンプルを調製した。この工程に至るまでは、サンプルを常に氷上で維持した。サンプルを９５℃にて５分間沸騰させた。１５ウェルゲル上に全サンプルをロードした。タンパク質ラダーも加えた。１×ランニングバッファを１０×バッファ（#161-0732, Biorad）から作製した。タンクを一杯にして、約４０分～１時間、２００Ｖでサンプルをランした。所望のタンパク質バンドが適切に分離したならば、ゲル電気泳動を終了した。サンドイッチスタックおよびメンブレン（メンブレンは約１０秒間、メタノール中に予め浸した）を用意してから、それらを全て、１×Trans-Blot Turbo Transferバッファ（#170-4272）中に浸漬した。濡らした大量のスタックを、カセットの底部に置いてから（底部イオンリザーバスタック）、濡らしたメンブレン、その次にゲルを、そして最後に、別の濡らしたトランスファスタックを上部に置いた（上部イオンリザーバスタック）。トラップした気泡を放出するために、まとめたサンドイッチをブロットローラでロールした。カセット蓋を閉じてロックし、そしてカセットをTransfer-Blot Turbo転写システム内に挿入して、転写を開始した。転写が完了すると、メンブレンをＴＢＳ－Ｔ（１×ＴＢＳ中０．１％トゥイーン－２０）中で簡単に洗浄した。メンブレンをブロッキングバッファ（ＴＢＳ－Ｔ／５％スキムミルク；５ｇ／１００ｍｌ）中で室温にて少なくとも１時間、機械シェーカ上でブロックした。メンブレンを入れ換えて、一次抗体と４℃にて一晩、インキュベートした。その翌日、メンブレンをＴＢＳ－Ｔ中で３×１５分洗浄した。二次抗体を、５％スキムミルク中で室温にて１時間、シェーカ上でインキュベートした。ＴＢＳ－Ｔ中で３×１５分洗浄した。メンブレンをＥＣＬ基質と５分間インキュベートした。メンブレンを、デジタル撮影装置ChemiDoc MPイメージングシステムで画像化した。バンドを、Image Labソフトウェアを用いて分析した。α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）およびＩ型コラーゲン等の関心対象のマーカーを、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して定量化した。全てのタンパク質発現を、対照群に対する相対比率として評価した。
肝線維症－実験設計
動物
３０～４０グラムを秤量したおおよそ４から６ヶ月齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型（ＷＴ）マウスを、Monash Animal Research Laboratoryから得た。動物を、Department of Pharmacology, Monash University内のAnimal Houseにおいて、標準的なケージ内に収容し、そこで最初に、標準的な食事を維持した。収容部を、おおよそ２１℃±５℃に維持し、マウスを１２時間の明／暗サイクルに曝して、食物および水を自由に摂らせた。着手した実験手順は、School of Biomedical Sciences (SOBS) Animal Ethics Committee of Monash University (2013/118)によって承認かつ認定された。
実験モデル
高塩分食（５％塩）モデルが、臨床的に関連した疾患－逆転モデルであり、これは、先進国において現在拡大中の問題である、ヒトによる高塩分摂取量を再現し得る。高塩分摂取量は、心血管系の変化を誘導して、心臓および肝臓におけるリモデリングおよび線維形成を誘導する。
ＷＴマウスを、対照として機能する標準的な齧歯類食（ＮＤ；０．５％ＮａＣｌ）に、または高塩分食（ＨＳＤ；５％ＮａＣｌ）に、４週間配置した。４週後、ＨＳＤのマウスを無作為化して、ビヒクル（ＤＭＳＯ／３０％ＨＢＣ溶液）またはＩＲＡＰインヒビタ（ＨＦＩ４１９；０．７２ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を受けさせた。ビヒクルおよびＩＲＡＰインヒビタは双方とも、ｓ．ｃ．浸透圧ミニポンプを介して投与した。マウスにＨＳＤを与え続けながら、これらの処置を受けさせた。８週の処置期間の終了後、マウスを秤量してから、過量のイソフルラン吸入によって殺した。肝臓を摘出して、切片化した。肝臓の半分を１０％ホルマリン中に入れ、残りを液体窒素中で凍結させてから、今後の使用のために－８０℃フリーザ内で保存した。
肝線維症の評価
ホルマリン固定した、パラフィン包埋肝臓を、４μｍの厚さに切片化して、肝線維症の分析について標準的な手順に従って、マッソントリクロームで染色した。最初に、切片を脱パラフィンして、１００％アルコール、９５％アルコール、および７５％アルコールの洗浄によって再水和させてから、蒸留水中で洗浄した。切片を、ブアン溶液中で５６℃にて１時間再固定して、染色品質を向上させてから、水道の流水中で５～１０分間リンスして、黄色を除去した。この後、切片を１０分間のワイゲルト鉄ヘマトキシリン実験溶液中で着色した。水道の温かい流水中で１０分間リンスした。蒸留水中で洗浄した。Biebrich scarlet-acid fuchsin solution中で１０～１５分間染色した。蒸留水中で洗浄した。リンモリブデンリン－タングステン酸溶液中で１０～１５分間、コラーゲンがもはや赤色でなくなるまで、分化させた。切片をアニリンブルー溶液に直接（リンスなしで）移して、５～１０分間染色した。蒸留水中で簡単にリンスして、１％酢酸溶液中で２～５分間分化させた。蒸留水中で洗浄した。９５％エチルアルコール、無水エチルアルコールに非常に迅速に通して脱水させて、キシレン中でクリアにした。ＤＰＸ封入媒質で封入した。
肝線維症の定量化を、Aperioスキャナ（Monash Histology Platform, Monash University）で５×の倍率でキャプチャした画像を用いて、実行した。各肝臓切片を、この倍率にて５つの異なる視野で写真を撮った。Image J 1.48ソフトウェア（Java, NIH）を用いて、間質コラーゲンおよび血管周囲コラーゲンのパーセンテージを分析かつ定量化して、５つのランダムな視野のパーセンテージを、その特定の動物についてのコラーゲンの最終パーセンテージについて、平均した。コラーゲン発現の全分析を、盲検化して行った。
統計分析
結果を、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。全ての統計プロットおよび統計分析を、Prismプログラム（GraphPad Software Inc. SanDiego, CA, USA）を用いて実行した。老齢ＷＴと、老齢モデルにおけるＩＲＡＰ ＫＯマウスとの統計学的比較（心肥大、コラーゲン沈着、全てのＩＨＣ定量化、およびウェスタンブロット分析）、または逆転モデルにおけるビヒクル処置老齢ＷＴとＨＦＩ－４１９処置老齢ＷＴとの比較を全て、ｔ検定を用いて行った。幼年ＷＴまたはＩＲＡＰ－／－と老齢のＷＴまたはＩＲＡＰ－／－とを比較するデータセット、および内皮血管拡張機能のデータ全てについて、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後に、必要に応じて、事後ボンフェローニ補正を用いて、比較した。Langendorff単離心臓灌流実験において、標準偏差の同一性およびガウス分布を、コルモゴロフ／スミルノフ法を用いて試験した。事後ボンフェローニ検定による一元配置ＡＮＯＶＡおよび二元配置ＡＮＯＶＡを、ＬＶＤＰ、ＥＤＰ、ＨＲ、±ｄＰ／ｄｔの基礎的な記録に実行した一方、ＬＶＤＰおよびＥＤＰの虚血後再灌流を、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて評価した。
化合物
Figure 2023030022000035
ＨＦＩ－４１９、化合物１、および化合物２を、それぞれ国際公開第２００９０６５１６９号パンフレット、オーストラリア国特許第２０１５９０１６７６号明細書、およびAndersson et al J. Med. Chem., (2010) 53, 8059に従って合成した。一部の化合物の合成を以下に記載し、それらの阻害活性は、国際出願ＰＣＴ／ＡＵ２０１６／０５０３３２号明細書に記載されている。
一般的な情報
全ての試薬および溶媒は、受け取ったままの状態で用いた。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ｎ．ｍ．ｒ．）スペクトルを、３００ＭＨｚにて、Bruker Advance DPX-300により、または４００ＭＨｚにて、Bruker Ultrashield-Advance III ＮＭＲ分光計を用いて、記録した。１Ｈ ｎ．ｍ．ｒ．スペクトルは、示すように、重水素化溶媒中の溶液に言及する。残りの溶媒のピークを、内部基準として用いた。各共鳴を、以下の規則に従って割り当てた：化学シフト（δ）を、残りの溶媒のピークに対する１００万分の１（ｐｐｍ）で測定した。高分解能質量分析値を、エレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）を装備するBruker Apex II Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometerで収集した。低分解能質量分析を、大気圧（ＥＳＩ／ＡＰＣＩ）イオン源を備えたMicromass Platform IIシングル四重極質量スペクトロメータを用いて、実行した。
液体クロマトグラフィ質量スペクトル（ＬＣＭＳ）を、エレクトロスプレーイオン化源およびシングル四重極質量アナライザに直接連結したフォトダイオードアレイ検出器（特に明記しない限り、２１４ｎｍ）を組み込んだ島津2020 LCMSシステムで、測定した。標準的なＲＰ－ＨＰＬＣを、室温にて、Phenomenex Luna C8（１００×２．０ｍｍＩ．Ｄ．）カラムを使用して実行した。溶出は、特に明記しない限り、０．０５％水性トリフルオロ酢酸中０～６４％ＣＨ３ＣＮの勾配により、流量０．２ｍｌ／分にて１０分にわたった。質量スペクトルを、ポジティブモードで得た。走査範囲は２００～２０００ｍ／ｚであった。分析ＨＰＬＣを、ダイオードアレー検出器（２５４ｎｍ）を組み込んだWaters 2690 HPLCシステムで、Phenomenexカラム（Luna C8(2)、１００×４．５ｍｍＩ．Ｄ．）を使用して、実行した。溶出は、０．１％水性トリフルオロ酢酸中１６～８０％アセトニトリルの勾配により、流量１ｍｌ／分にて１０分にわたった。分析薄層クロマトグラフィ（ｔ．ｌ．ｃ．）を、シリカゲル60 F254でコーティングしたMerckアルミニウムシート上で実行した。視覚化を、ＵＶランプで達成した。カラムクロマトグラフィを、シリカゲル60（Merck）を用いて実行した。化合物の純度（≧９５％）を、逆相ＨＰＬＣまたは１Ｈ ｎ．ｍ．ｒによって確立した。
一般的な方法
ピペリジン（ｃａｔ．）を、マロノニトリル（１．１ｅｑ．）およびアルデヒド（１ｅｑ．）のＥｔＯＨ（３～５ｍＬ）溶液に加えて、周囲温度にて１５分間撹拌した。アセト酢酸エチル（１．１ｅｑ．）を加えて、混合液を、周囲温度にて４時間撹拌した。溶媒の容量を減らして、生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＨで洗浄して、表題の化合物が得られた。必要であれば、化合物を、高温ＥｔＯＨから再結晶化させ、またはＤＣＭで摩砕した。
４－（２－アミノ－３－シアノ－５－（エトキシカルボニル）－６－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
Figure 2023030022000036
一般的な方法に従って、４－カルボキシベンズアルデヒド（１．０ｇ、６．６ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．４８ｇ、７．３ｍｍｏｌ）、アセト酢酸エチル（０．９５ｇ、７．３ｍｍｏｌ）、ピペリジン（８滴）、およびエタノール（２０ｍＬ）により、表題の化合物が白色の固体として得られた（１．７ｇ、７８％）。
Figure 2023030022000037
３－（２－アミノ－３－シアノ－５－（エトキシカルボニル）－６－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
Figure 2023030022000038
一般的な方法に従って、３－カルボキシベンズアルデヒド（１００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（４８ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）、アセト酢酸エチル（９５ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）、ピペリジン（滴）、およびエタノール（３ｍＬ）により、表題の化合物が、ＥｔＯＨからの再結晶後に、白色の固体として得られた（４１ｍｇ、１９％）。
Figure 2023030022000039
エチル４－（４－アセトキシ－３－メチルフェニル）－６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４Ｈ－ピラン－３－カルボキシレート
Figure 2023030022000040
一般的な方法に従って、４－ホルミル－２－メチルフェニルアセテート（１００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（４１ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）、アセト酢酸エチル（８０ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）、ピペリジン（３滴）、およびエタノール（５ｍＬ）により、表題の化合物が白色の固体として得られた（８７ｍｇ、４４％）。
Figure 2023030022000041
エチル４－（４－アセトキシ－３，５－ジメチルフェニル）－６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４Ｈ－ピラン－３－カルボキシレート
Figure 2023030022000042
一般的な方法に従って、４－ホルミル－２，６－ジメチルフェニルアセテート（８５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（３２ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）、アセト酢酸エチル（６３ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）、ピペリジン（２滴）、およびエタノール（３ｍＬ）により、表題の化合物が白色の固体として得られた（１４６ｍｇ、９０％）。
Figure 2023030022000043
エチル６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４－（４－（ピリジン－２－イル）フェニル）－４Ｈ－ピラン－３－カルボキシレート
Figure 2023030022000044
一般的な方法に従って、４－（２－ピリジル）ベンズアルデヒド（２５０ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（９９ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）、アセト酢酸エチル（１９５ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）、ピペリジン（３滴）、およびエタノール（５ｍＬ）により、表題の化合物が白色の固体として得られた（４１０ｍｇ、８３％）。
Figure 2023030022000045
エチル６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４－（キノリン－２－イル）－４Ｈ－ピラン－３－カルボキシレート
Figure 2023030022000046
一般的な方法に従って、２－キノリンカルボキサルデヒド（２５０ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１１５ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）、アセト酢酸エチル（２２８ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）、ピペリジン（３滴）、およびエタノール（５ｍＬ）により、表題の化合物が、再結晶後に、白色の固体として得られた（３０２ｍｇ、５７％）。
Figure 2023030022000047
エチル６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４－（キノリン－３－イル）－４Ｈ－ピラン－３－カルボキシレート
Figure 2023030022000048
一般的な方法に従って、３－キノリンカルボキサルデヒド（５０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（２３ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、アセト酢酸エチル（４５ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、ピペリジン（１滴）、およびエタノール（３ｍＬ）により、表題の化合物が白色の固体として得られた（８５ｍｇ、７９％）。
Figure 2023030022000049
エチル６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４－（キノリン－４－イル）－４Ｈ－ピラン－３－カルボキシレート
Figure 2023030022000050
一般的な方法に従って、４－キノリンカルボキサルデヒド（２５０ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１１５ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）、アセト酢酸エチル（２２８ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）、ピペリジン（２滴）、およびエタノール（５ｍＬ）により、表題の化合物が白色の固体として得られた（３９５ｍｇ、７４％）。
Figure 2023030022000051
４－（２－アミノ－３－シアノ－５－（メトキシカルボニル）－６－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
Figure 2023030022000052
ピペリジン（２滴）を、４－（２，２－ジシアノビニル）安息香酸（２００ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）およびアセト酢酸メチル（１１７ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（３ｍＬ）懸濁液に加えた。混合物を周囲温度にて６時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＨで洗浄して、白色の固体が得られた（１１７ｍｇ）。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９：１））により、表題の化合物が白色の固体として得られた（７８ｍｇ、２５％）。
Figure 2023030022000053
４－（２－アミノ－５－（ベンジルオキシカルボニル）－３－シアノ－６－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
Figure 2023030022000054
（ｉ）４－（２，２－ジシアノビニル）安息香酸
Figure 2023030022000055
ピペリジン（６６μＬ、０．６７ｍｍｏｌ）を、マロノニトリル（４８０ｍｇ、７．２７ｍｍｏｌ）および４－カルボキシベンズアルデヒド（１．０ｇ、６．６５ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（５ｍＬ）混合液に加えた。懸濁液を加熱して、１８時間還流させた。冷却した後に、溶媒を真空内で除去して、トルエン中に入れた。生じた沈殿物を収集して、トルエンおよび低温ＥｔＯＨで洗浄して、中間体が淡い黄色の固体として得られた（１．２８ｇ、８５％）。
Figure 2023030022000056
（ｉｉ）４－（２－アミノ－５－（ベンジルオキシカルボニル）－３－シアノ－６－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
ピペリジン（５μＬ、０．０５ｍｍｏｌ）を、４－（２，２－ジシアノビニル）安息香酸（１００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびアセト酢酸ベンジル（８７μＬ、０．５ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（３ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて６時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＨで洗浄して、白色の固体が得られた（５５ｍｇ）。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ）により、表題の化合物が淡褐色の固体として得られた（３１ｍｇ、１６％）。
Figure 2023030022000057
ベンジル６－アミノ－５－シアノ－４－（４－シアノフェニル）－２－メチル－４Ｈ－ピラン－３－カルボキシレート
Figure 2023030022000058
（ｉ）２－（４－シアノベンジリデン）マロノニトリル
Figure 2023030022000059
マロノニトリル（１１１ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）および４－シアノベンズアルデヒド（２００ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１０ｍＬ）懸濁液を、１００℃にて８時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、Ｈ２Ｏで洗浄して、表題の化合物がクリーム状の固体として得られた（２２８ｍｇ、８３％）。
Figure 2023030022000060
（ｉｉ）ベンジル６－アミノ－５－シアノ－４－（４－シアノフェニル）－２－メチル－４Ｈ－ピラン－３－カルボキシレート
ピペリジン（３μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ）を、中間体２－（４－シアノベンジリデン）マロノニトリル（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）およびアセト酢酸ベンジル（４８μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を、周囲温度にて１時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＨで洗浄して、表題の化合物が白色の固体として得られた（７７ｍｇ、７４％）。
Figure 2023030022000061
ベンジル６－アミノ－５－シアノ－４－（３－シアノフェニル）－２－メチル－４Ｈ－ピラン－３－カルボキシレート
Figure 2023030022000062
（ｉ）２－（３－シアノベンジリデン）マロノニトリル
Figure 2023030022000063
マロノニトリル（１１１ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）および３－ホルミルベンゾニトリル（２００ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５ｍＬ）懸濁液を、マイクロ波加熱により１００℃にて、３分間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、Ｈ２Ｏで洗浄して、表題の化合物が白色の固体として得られた（２２５ｍｇ、８２％）。
Figure 2023030022000064
（ｉｉ）ベンジル６－アミノ－５－シアノ－４－（３－シアノフェニル）－２－メチル－４Ｈ－ピラン－３－カルボキシレート
ピペリジン（３μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ）を、２－（３－シアノベンジリデン）マロノニトリル（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）およびアセト酢酸ベンジル（４８μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて１時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＨで洗浄して、表題の化合物が白色の固体として得られた（８２ｍｇ、７９％）。
Figure 2023030022000065
４－（３－アセチル－６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
Figure 2023030022000066
ピペリジン（３８μＬ、０．３８ｍｍｏｌ）を、４－（２，２－ジシアノビニル）安息香酸（７５０ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ）およびアセチルアセトン（３７９ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（５ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて１８時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＨで洗浄して、表題の化合物が白色の固体として得られた（８４０ｍｇ、７５％）。
Figure 2023030022000067
Figure 2023030022000068
４－（３－アセチル－６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸のサンプルを、ＮＨ４ＨＣＯ３（２ｅｑ．）の水溶液中に溶解させて、凍結乾燥して、化合物１が得られた。
Figure 2023030022000069
３－（３－アセチル－６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
Figure 2023030022000070
ピペリジン（２滴）を、マロノニトリル（４８ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）および３－カルボキシベンズアルデヒド（１００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３ｍＬ）溶液に加えて、周囲温度にて１時間撹拌した。アセチルアセトン（７５μＬ、０．７３ｍｍｏｌ）を加えて、混合液を周囲温度にて４時間撹拌した。溶媒の容量を減らして、生じた残留物を、カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ＣＨＣｌ３：ＡＣＮ：ＡｃＯＨ、９：０．７：０．３）によって精製した。生成物が、淡褐色の固体として得られた（１３ｍｇ、７％）。
Figure 2023030022000071
５－アセチル－２－アミノ－６－メチル－４－（キノリン－２－イル）－４Ｈ－ピラン－３－カルボニトリル
Figure 2023030022000072
（ｉ）２－（キノリン－２－イルメチレン）マロノニトリル
Figure 2023030022000073
マロノニトリル（９２ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）および２－キノリンカルボキサルデヒド（２００ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５ｍＬ）懸濁液を、周囲温度にて７時間撹拌した。沈殿物を収集して、Ｈ２Ｏで洗浄して、表題の化合物が緑色の固体として得られた（２４０ｍｇ、９２％）。
Figure 2023030022000074
（ｉｉ）５－アセチル－２－アミノ－６－メチル－４－（キノリン－２－イル）－４Ｈ－ピラン－３－カルボニトリル
ピペリジン（２．４μＬ、０．０２４ｍｍｏｌ）を、２－（キノリン－２－イルメチレン）マロノニトリル（５０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）およびアセチルアセトン（２５μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（０．５ｍＬ）溶液に加えた。混合液を周囲温度にて６時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＨで洗浄して、淡い茶色の固体が得られた（２４ｍｇ、３３％）。
Figure 2023030022000075
５－アセチル－２－アミノ－４－（３－シアノフェニル）－６－メチル－４Ｈ－ピラン－３－カルボニトリル
Figure 2023030022000076
ピペリジン（３μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ）を、２－（３－シアノベンジリデン）マロノニトリル（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）およびアセチルアセトン（２８ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて１時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＨで洗浄して、白色の固体が得られた（６４ｍｇ）。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、１：２に続いて１００％ＥｔＯＨ）により、表題の化合物が白色の固体として得られた（３６ｍｇ、４６％）。
Figure 2023030022000077
５－アセチル－２－アミノ－６－メチル－４－（４－（チオフェン－２－イル）フェニル）－４Ｈ－ピラン－３－カルボニトリル
Figure 2023030022000078
（ｉ）２－（４－（チオフェン－２－イル）ベンジリデン）マロノニトリル
Figure 2023030022000079
ピペリジン（２．６μＬ、０．０２７ｍｍｏｌ）を、マロノニトリル（１９ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）および４－（２－チエニル）ベンズアルデヒド（５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１．５ｍＬ）溶液に加えた。混合液を周囲温度にて１時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＨで洗浄して、中間体が黄色の固体として得られた（５３ｍｇ、８３％）。
Figure 2023030022000080
（ｉｉ）５－アセチル－２－アミノ－６－メチル－４－（４－（チオフェン－２－イル）フェニル）－４Ｈ－ピラン－３－カルボニトリル
ピペリジン（２．２μＬ、０．０２２ｍｍｏｌ）を、中間体２－（４－（チオフェン－２－イル）ベンジリデン）マロノニトリル（５３ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）およびアセチルアセトン（２３μＬ、０．２２ｍｍｏｌ）のトルエン（１ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて４時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、トルエンで洗浄して、淡い黄色の固体が得られた。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ２Ｏ、９５：５）により、表題の化合物が白色の固体として得られた（４０ｍｇ、７７％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：実測値：ｍ／ｚ３３７．１００８（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ１９Ｈ１７Ｎ２Ｏ２Ｓ理論値ｍ／ｚ３３７．１００１．
Figure 2023030022000081
５－アセチル－２－アミノ－６－メチル－４－（キノキサリン－６－イル）－４Ｈ－ピラン－３－カルボニトリル
Figure 2023030022000082
（ｉ）２－（キノキサリン－６－イルメチレン）マロノニトリル
Figure 2023030022000083
ピペリジン（４．７μＬ、０．０４７ｍｍｏｌ）を、マロノニトリル（３４ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）およびキノキサリン－６－カルバルデヒド（７５ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１ｍＬ）溶液に加えた。混合液を周囲温度にて１時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＨで洗浄して、中間体が淡褐色の固体として得られた（６６ｍｇ、６８％）。
Figure 2023030022000084
（ｉｉ）５－アセチル－２－アミノ－６－メチル－４－（キノキサリン－６－イル）－４Ｈ－ピラン－３－カルボニトリル
ピペリジン（１．４μＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）を、中間体２－（キノキサリン－６－イルメチレン）マロノニトリル（３０ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ）およびアセチルアセトン（１５μＬ、０．１４５ｍｍｏｌ）のトルエン（１ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて４時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温Ｅｔ２Ｏで洗浄して、表題の化合物が淡褐色の固体として得られた（３８ｍｇ、８６％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：実測値：ｍ／ｚ３０７．１１９０（Ｍ＋Ｈ）＋，Ｃ１７Ｈ１５Ｎ４Ｏ２理論値ｍ／ｚ３０７．１１９５．
Figure 2023030022000085
２－（３－アセチル－６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
Figure 2023030022000086
（ｉ）２－（２，２－ジシアノビニル）安息香酸
Figure 2023030022000087
マロノニトリル（４８ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）および２－カルボキシベンズアルデヒド（１００ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（４ｍＬ）懸濁液を、マイクロ波加熱により１００℃にて、３分間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、Ｈ２Ｏで洗浄して、表題の化合物が白色の固体として得られた（３４ｍｇ、５５％）。
Figure 2023030022000088
２－（３－アセチル－６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
ピペリジン（１２．５μＬ、０．１２５ｍｍｏｌ）を、２－（２，２－ジシアノビニル）安息香酸（５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびアセチルアセトン（２５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（３ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を３日間撹拌した。溶媒を真空内で除去して、残留物をＥｔＯＡｃ内に入れて、１８時間撹拌した。生じた沈殿物を収集して、低温ＥｔＯＡｃで洗浄して、淡い黄色の固体が得られた（７６ｍｇ）。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ＡＣＮ：ＣＨＣｌ３、２：１に続いてＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ、９５：５）により、黄色の残留物が得られた（３３ｍｇ）。
Figure 2023030022000089
４－（２－アセトアミド－５－アセチル－３－シアノ－６－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
Figure 2023030022000090
４－（３－アセチル－６－アミノ－５－シアノ－２－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸（２５０ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の無水酢酸（３ｍＬ）溶液を加熱して、３時間還流させた。混合液をＮ２流下で濃縮してから、氷冷したＨ２Ｏ中に注いだ。水溶液をＥｔＯＡｃで抽出して（３×２０ｍＬ）、組み合わせた有機抽出物をブライン（２０ｍＬ）で洗浄して、乾燥させて（ＭｇＳＯ４）、濾過して、真空内で減らして、黄色の油が得られた。黄色の油をＥｔＯＨ（５ｍＬ）中に溶解させて、ヒドラジン水和物（１．３ｅｑ．）を加えた。３０分間の撹拌後、懸濁液を真空内で減らして、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）内に入れて、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物を乾燥させて（ＭｇＳＯ４）、濾過して、溶媒を真空内で除去して、黄色の油が得られた。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ、９５：５に続いて１００％ＥｔＯＨ）により、表題の化合物が得られた（２０ｍｇ、７％）。
Figure 2023030022000091
４－（２－アミノ－３，５－ビス（エトキシカルボニル）－６－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
Figure 2023030022000092
（ｉ）（Ｚ）－４－（２－シアノ－３－エトキシ－３－オキソプロプ－１－エニル）安息香酸
Figure 2023030022000093
ピペリジン（１３μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を、エチルシアノアセテート（１５１ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）および４－カルボキシベンズアルデヒド（２００ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（３ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を加熱して、３時間還流させた。混合液を真空内で濃縮した。トルエンを加えて、生じた沈殿物を収集して、トルエンで洗浄して、中間体が白色の固体として得られた（２７８ｍｇ、８５％）。
Figure 2023030022000094
（ｉｉ）４－（２－アミノ－３，５－ビス（エトキシカルボニル）－６－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
ピペリジン（２０μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を、（Ｚ）－４－（２－シアノ－３－エトキシ－３－オキソプロプ－１－エニル）安息香酸（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびアセト酢酸エチル（２６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（３ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて２日間撹拌した。ピペリジン（１０μＬ、０．１ｍｍｏｌ）を加えて、溶液をさらに１日間撹拌した。混合液を真空内で濃縮して、残留物をカラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、２：１）によって精製して、黄色の油が得られた。ＥｔＯＨからの再結晶により、白色の固体が得られた（＞５ｍｇ）。
Figure 2023030022000095
（ｖ）４－（３－アセチル－６－アミノ－５－（エトキシカルボニル）－２－メチル－４Ｈ－ピラン－４－イル）安息香酸
Figure 2023030022000096
ピペリジン（３０μＬ、０．３ｍｍｏｌ）を、（Ｚ）－４－（２－シアノ－３－エトキシ－３－オキソプロプ－１－エニル）安息香酸（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびアセチルアセトン（２０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（３ｍＬ）懸濁液に加えた。混合液を周囲温度にて２４時間撹拌した。分析ＨＰＬＣにより、出発材料の、生成物に対する比率が１：１であると示される。しかしながら、更なる反応時間により変質する。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２、ＥｔＯＡｃ）による精製により、表題の化合物が得られた（２ｍｇ、３％）。
Figure 2023030022000097
ＩＲＡＰの酵素アッセイ
粗膜を、完全長ヒトＩＲＡＰまたは空のベクターでトランスフェクションしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から調製してから、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１％トリトンＸ－１００からなるバッファｐＨ７．４中での４℃での５時間にわたる撹拌下で、可溶化させる。可溶化の後、膜を、２３，１００ｇでの４℃１５分間の遠心分離によってペレット化して、上澄みを、ＩＲＡＰ活性源として保存する。ＩＲＡＰの酵素活性を、３８０および４４０ｎｍのそれぞれ励起および放射波長での、蛍光性製品MCAの放出によって監視される合成基質Ｌｅｕ－ＭＣＡ（Sigma- Aldrich, Missouri, USA）の加水分解によって、決定する。アッセイを、９６ウェルプレート内で実行する；各ウェルに、５０ｍＭトリス－ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）の１００μＬの最終容量中０．２～１０μｇの可溶化膜タンパク質、広範な濃度の基質を含有させる。放射を、空のベクターでトランスフェクションした膜とのインキュベーションから減算することによって、基質の非特異的加水分解を補正する。反応を３７℃にて３０分間続行して、ＩＲＡＰ阻害活性を、９６ウェルマイクロタイタープレート内で、吸光度をWallac Victor 3分光光度計で監視して、決定する。動態パラメータ（ＫｍおよびＶ）を、ミカエリス－メンテン式の非線形フィッティング（GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., CA, USA）；Ｌｅｕ－ＭＣＡの最終濃度１５．６μＭ～１ｍＭによって、決定する。競合インヒビタについてのインヒビタ定数（Ｋｊ）を、関係ＩＣ５０＝Ｋ；（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）から算出する；式中、ＩＣ５０値を、広範なインヒビタ濃度（１０～９から１０”４Ｍ）にわたって決定する。Ｌｅｕ－ＭＣＡについてのＩＲＡＰのＫｍ値を、動態研究から決定する。化合物の、ＩＲＡＰに対する結合親和性を、化合物の濃度を増大させながら（１０＊８から１０～３Ｍ）存在させて、Ｌｅｕ－ＭＣＡの加水分解の阻害を監視することによって、調査した。
インヒビタ、例えば小分子または抗体が、ＩＲＡＰについて選択的であるか特異的であるかを見るために、他の亜鉛依存性メタロペプチダーゼについてのインヒビタの阻害活性を、９６ウェルマイクロタイタープレート内で、吸光度をWallac Victor 3分光光度計で監視して、決定することができる。そのようなアッセイが、国際公開第２００９／０６５１６９号パンフレットに記載されており、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼおよびヘキソキナーゼの活性、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼアッセイ、アミノペプチダーゼＮアッセイ、ならびにアンジオテンシン変換酵素アッセイが挙げられる。
全体的に、以下の実施例における研究は、ＩＲＡＰ活性の除去または阻害が、心線維症および血管組織線維症に劇的な作用を及ぼし、そしてＩＲＡＰを、ＣＶＤにおける新規の標的として同定したことを示す。
実施例１
線維症のアンギオテンシンＩＩ起因性マウスモデルの心臓および血管におけるＩＲＡＰ特異的作用を調査する研究を、最初の原理実証研究として実行した。遺伝的欠失モデルにおいて、雄の幼年成体のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ ＫＯマウス（４～６ヵ月齢）を、Ａｎｇ ＩＩまたは生理食塩水で皮下に４週間、浸透圧ミニポンプを介して処理した。血圧を隔週に測った。薬理学的阻害モデルにおいて、ＷＴマウスを、合成ＩＲＡＰインヒビタＨＦＩ－４１９で、Ａｎｇ ＩＩ－注入と併せて４週間、皮下に共処置した。インヒビタを、１：３の比率のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＢＣ）中に溶解させた。
Ａｎｇ ＩＩ注入を、心血管系に「ストレスを加える」ための従来モデルとして用いた。というのも、この内因性ホルモンは、本明細書において言及した以前の心血管疾患の全てについて周知のリスク要因である、高血圧、心不全、腎不全、および血管硬化が挙げられる広範な心血管疾患の発症および進行に寄与するからである。このモデルの、自然に年老いたモデルに勝る利点は、本明細書において既に注目した生化学的特徴および臨床的特徴が、より迅速に表されるような、臓器線維症の迅速な進行があることである。特に臓器線維症および高血圧における、そのような迅速な変化は、４週間にわたる遺伝子型および薬理学的阻害の試験を容易にし、このこともまた、異なる臨床前モデルにおける本発明者らの発見の普遍性を確認する目的に適う。ゆえに、Ａｎｇ ＩＩ注入モデルは、加齢で見られるよりも高速で、臓器線維症および機能障害の悪化に至り、複数の心血管病理を伴う高血圧の、よく認識されたモデルである。
ＩＲＡＰ欠失またはＩＲＡＰインヒビタ処置の、アンギオテンシンＩＩ注入後の血圧に及ぼす影響
ＩＲＡＰ欠失、またはＨＦＩ４１９による常習的ＩＲＡＰインヒビタ処置は、血圧の、Ａｎｇ ＩＩ起因性の上昇を弱める（図１）。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；Ｐ値を、反復測定二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定する。
アンギオテンシンＩＩ注入マウスの大動脈および心臓におけるＩＲＡＰ発現
ＩＲＡＰ発現は、Ａｎｇ ＩＩを注入したＷＴマウスの大動脈（図２ａ）および心臓（図２ｂ）において、増大する。これは、Ａｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス（ｎ＝５）由来の５μｍの厚さの横断方向大動脈切片の内側領域および外膜領域におけるＩＲＡＰ発現の定量化によって、示される。さらに、図２ｂにおけるデータは、Ａｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス（ｎ＝５）由来の５μｍの厚さの横断方向心臓切片におけるＩＲＡＰの定量化に由来した。ＩＲＡＰの定量化を、陽性染色組織面積パーセントとして表す。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；Ｐ値を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定する。
ＩＲＡＰの遺伝的欠失および薬理学的阻害が、アンギオテンシンＩＩ介在性大動脈線維形成、および関連マーカーを弱める。
生理食塩水またはＡｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の胸部大動脈切片における陽性染色免疫蛍光の典型的な画像および定量化は、赤色のＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡの発現の低下を実証した（緑色は、弾性薄膜の自家蛍光を示す）（図３）。ピクロシリウスレッドを用いたコラーゲン染色を決定してから、偏光顕微鏡観察により画像化した。データを、陽性染色面積パーセンテージの平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す（ｎ＝５～６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。これらの発見は、ＡｎｇＩＩ起因性血管線維症および線維化促進マーカーが上昇すること、そしてこれらの上昇は、ＩＲＡＰ－／－マウスにおいて、またはＨＦＩ－４１９処置によって、予防されたことを示す。
ＩＲＡＰの遺伝的欠失および薬理学的阻害が、大動脈におけるアンギオテンシンＩＩ介在性炎症を弱める。
生理食塩水またはＡｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の胸部大動脈切片における陽性染色免疫蛍光の典型的な画像および定量化は、赤色のＰ－ＩκＢα（ＮＦκＢ活性化についてのマーカー）、ＭＣＰ－１、ＩＣＡＭ－１、およびＶＣＡＭ－１（血管細胞接着タンパク質－１）の発現の低下を示した（緑色は、弾性薄膜の自家蛍光を示す）（図４）。データを、陽性染色面積パーセンテージの平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す（ｎ＝５～６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。
ＩＲＡＰの遺伝的欠失および薬理学的阻害が、アンギオテンシンＩＩ介在性の心肥大および線維症を弱める。
ＩＲＡＰ欠失またはＩＲＡＰ阻害（ＨＦＩ－４１９を用いる）が、図５ａに示すように、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した横断方向心臓切片（ｎ＝６）における心筋細胞断面積を用いて評価した心肥大のＡｎｇ ＩＩ介在性増大を、予防した。ＩＲＡＰの欠失または阻害が、図５ｂに示すように、ピクロシリウスレッドで染色した横断方向心臓切片（ｎ＝６）の明視野顕微鏡観察を介して判定した間質コラーゲンの発現を、有意に引き下げた。データを、陽性染色面積パーセンテージの平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す（ｎ＝５～６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。
ＩＲＡＰの遺伝的欠失および薬理学的阻害が、心臓線維形成マーカーのアンギオテンシンＩＩ起因性増大を予防する。
図６は、生理食塩水またはＡｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の横断方向心臓切片における陽性染色免疫蛍光の典型的な画像および定量化を示しており、ビメンチン染色（線維芽細胞発現についてのマーカー）の変化なし、α－ＳＭＡ染色（筋線維芽細胞発現についてのマーカー）の減少、ＴＧＦ－β１（線維形成誘導性サイトカイン）の血管周囲発現の引下げ、およびＴＧＦ－β１のタンパク質発現（ウェスタンブロットにより分析した）の引下げを示した。データを、ＷＴ対照の平均±ｓ．ｅ．ｍに対する相対比率として表した、免疫蛍光についての陽性染色面積パーセンテージ、およびウェスタンブロットの濃度測定分析の平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；（ｎ＝５～６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。
ＩＲＡＰの遺伝的欠失または薬理学的阻害が、心臓活性酸素種（ＲＯＳ）および炎症マーカーのアンギオテンシンＩＩ起因性増大を予防する。
図７は、生理食塩水またはＡｎｇ ＩＩ±ビヒクル／ＨＦＩ－４１９で処置した成体（４～６ヵ月齢）のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス由来の横断方向心臓切片における陽性染色免疫蛍光またはウェスタンブロット分析を用いたタンパク質レベルの定量化の典型的な画像および定量化を示す（ｎ＝５～６）。ＩＲＡＰ欠失またはＩＲＡＰ阻害が、スーパーオキシド生成のＡｎｇ ＩＩ起因性増大を予防し、ＮＡＤＰＨオキシダーゼアイソフォーム、ＮＯＸ－２の発現に影響を及ぼさず、Ｐ－ＩκＢα発現（ＮＦκＢ活性化についてのマーカー）を引き下げ、ＩＣＡＭ－１発現およびタンパク質含有量の双方を引き下げ、そしてＭＣＰ－１およびマクロファージ発現を引き下げた。データを、ＷＴ対照の平均±ｓ．ｅ．ｍに対する相対比率として表した、免疫蛍光についての陽性染色面積パーセンテージ、およびウェスタンブロットの濃度測定分析の平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；（ｎ＝５～６）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。
実施例２
ＩＲＡＰの欠失およびＩＲＡＰの直接的な薬理学的阻害が、アンギオテンシンＩＩ介在性の、心臓および血管の線維症および炎症を予防するのに有効であったことを示す原理実証研究（実施例１）に続いて、この実施例は次に、ＩＲＡＰを標的とする臨床有効性の潜在性を強調する。これは、包括的ＩＲＡＰ欠失マウスが、心線維症および炎症の年齢起因性増大から保護される一方、直接的なＩＲＡＰ阻害が、年齢起因性心臓リモデリングを完全に逆転する、心血管線維症の老齢モデルを用いて、実証される。
包括的ＩＲＡＰ遺伝子欠失が、年齢起因性心線維症から保護する
本研究において、ＩＲＡＰ免疫蛍光が、心臓の間質領域および血管周囲領域の双方に存在し、そして、幼年遺伝子型対照と比較して、老齢ＷＴマウスの心臓において二倍であった（図８ａ、図８ｂ）。この作用の正確度は、幼年成体および老齢のＩＲＡＰ－／－マウスから得た心臓における染色の不在によって確認された（図８ａ）。さらに、ＩＲＡＰ発現は、間質領域および血管周囲領域の双方において、α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）発現と共局在しており、このことはそれが、ＶＳＭＣ上に位置決めされ、かつ筋線維芽細胞を分化させたことを示唆している。ピクロシリウスレッド染色を用いたコラーゲン含有量、ならびに明視野および円偏光光学顕微鏡を用いた定量化によって評価した心線維症を、幼年ＷＴマウスおよび老齢ＷＴマウス、ならびに幼年ＩＲＡＰ－／－マウスおよび老齢ＩＲＡＰ－／－マウスにおいて評価した。予想されるように、加齢が、心臓間質線維形成を有意に、約７５％増大させ（図９ａ、図９ｂ；図１０ａ、図１０ｂ）、そしてまた、血管周囲線維形成を増大させ、老齢心臓におけるＥＣＭの既知の上昇と同調していた（図１０ｃ、図１０ｄ）。そのような発見は、ＣＶＤの自然な進行に従う動物モデルを用いることの重要性を強調する。本発明者らの老齢ＷＴマウス由来の心臓において見られるコラーゲンの増大と対照的に、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスは、幼年成体ＷＴマウスにおいて見られるのと類似したＥＣＭ沈着を示し（図９ａ、図９ｂ；図１０ａ～図１０ｄ）、これは、ＩＲＡＰがない場合の抗線維化作用を示しており、このことは、Ｉ型コラーゲンα１タンパク質レベルの成熟形態の減少によって確認された（図１１）。
線維形成誘導性サイトカインＴＧＦ－β１は、線維芽細胞の、より多くの合成タイプの筋線維芽細胞への分化を促進することが周知である。この文脈では、ＩＲＡＰ－／－マウスは、ウェスタンブロットによって、心臓における有意に低いＴＧＦ－β１タンパク質を（図１１）、そしてより顕著には、免疫蛍光によって、老齢ＷＴマウスと比較して、ＴＧＦ－β１の４倍低い血管周囲発現を示した（図１２ａ、図１２ｂ）。加齢が、ＷＴ遺伝子型とＩＲＡＰ遺伝子型との間で、ビメンチン陽性の線維芽細胞発現の程度に影響を及ぼさなかった一方、老齢のＷＴマウス由来の心臓における筋線維芽細胞発現（αＳＭＡ－陽性）が増大した（図１２ａ、図１２ｂ）。それに対して、老齢のＩＲＡＰ－／－マウス由来の心臓は、この年齢依存性の筋線維芽細胞の上方制御を示さず、幼年ＷＴマウス由来の心臓において見出されるのと類似した筋線維芽細胞発現に終わった（図１２ａ、図１２ｂ）。これらの結果は、合成筋線維芽細胞活性の増大に起因する、異常に多いコラーゲン生産が、老齢ＷＴの心臓において注目される心線維形成の増大に寄与したことを、そしてこの現象が、老齢のＩＲＡＰ－／－マウス由来の心臓において高度に弱められたことを示唆している。二重標識ＩＨＣを用いたこの概念と一致して、ＩＲＡＰが、筋線維芽細胞と共局在することが明らかにされた。このことはさらに、筋線維芽細胞の機能的活性を変更する、ＩＲＡＰの潜在的な役割を意味している。
ＥＣＭのホメオスタシスは、コラーゲン合成とコラーゲン分解とのバランスによって維持されている。本研究において、老齢のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウスにおける、ゲラチナーゼＭＭＰ－２およびＭＭＰ－９の、そしてコラゲナーゼＭＭＰ－８の類似したタンパク質レベルまたは酵素活性を、ウェスタンブロットおよびザイモグラフィによって実証したところ（図１１）、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスにおいて、年齢マッチＷＴ対照と比較して、ＭＭＰ－１３タンパク質発現の約５０％の増大があった（図１１ｃ）。ＭＭＰ－１３は、心臓内に存在する主なコラゲナーゼであるので、タンパク質発現の増大は、老齢のＩＲＡＰ欠失マウスにおけるより多くのコラーゲン分解を示す。全体的に、これらの結果は、ＩＲＡＰ欠失が、コラーゲン合成を下方制御し、かつコラーゲン分解を上方制御することによって、年齢介在性心線維症から保護することを示す。
ＩＲＡＰ欠失が、スーパーオキシド生産を減少させて、炎症を調節する
心臓におけるジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）染色は、老齢ＷＴ対照と比較して、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスにおける心臓スーパーオキシド（・Ｏ２ －）生産が約４０％少ないことを明らかにした（図１３ａ）。ＩＲＡＰ－／－マウス心臓はまた、より少ないホスホＩκＢαの発現（ＮＦκＢ活性化の低下（図１３ａ）を示す）、および炎症の低下を、血管周囲免疫組織化学、およびウェスタンブロット分析による、単球化学誘引タンパク質－１（ＭＣＰ－１）発現の引下げ、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）発現の著しい引下げによって実証し、これにより心臓におけるマクロファージ浸潤が引き下げられた（図１３）。心臓から放出されるサイトカインのパターンも調査した。老齢ＩＲＡＰ－／－マウスの心臓において、炎症誘発サイトカインＩＬ－１β、ＩＬ－１７Ａ、およびＴＮＦ－αの僅かな増大があった（図１４）。しかしながら、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１２ｐ４０が挙げられるいくつかの抗炎症サイトカインのより著しい増大があり（図１４；表１）、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスにおける抗炎症表現型の証拠が得られた。
（表１）心臓サイトカインタンパク質レベル。老齢WTマウス、老齢IRAP-/-マウス、ビヒクル処散老齢WTマウス、およびHFI-419処置老齢WTマウス由来の心臓における心臓サイトカインタンパク質レベルを、Bioplex cytokineアッセイ(Bio-rad)キットを用いて定量化し、サイトカインレベルを、pg/mlの平均±s.e.mとして表した。サイトカインを、炎症誘発因子、抗炎症因子、コロニー刺激因子、およびCCケモカインリガンド表現型に基づいてグループ化する。IRAP-/-マウスにおける心臓サイトカインの濃度を、老齢WT対照の平均濃度に対する相対比率として表す；一方、HFI-419処置老齢WTの心臓におけるサイトカインレベルを、ビヒクル処置老齢WTの平均濃度に対する相対比率として表す。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.0001をt検定によって決定した；各群中n=9。
Figure 2023030022000098
ＩＲＡＰの薬理学的阻害が、年齢介在性心臓疾患を逆転する
ＩＲＡＰを欠く老齢マウスが、心臓表現型について、年齢マッチＷＴ対照と比較して、幼年成体の対応動物に似るように、ＥＣＭ、炎症、および酸化ストレスの引下げを示すことを考えれば、本発明者らは、小分子ＩＲＡＰインヒビタによるＩＲＡＰの薬理学的阻害が、心血管疾患の確立時に、心線維症を逆転し得るか否かに関心をもった。この目的で、合成ＩＲＡＰインヒビタＨＦＩ－４１９を、心線維症を確立した４週から約２０ヶ月齢のＷＴマウスに投与した。実際に、ＨＦＩ－４１９は有意に、ＩＲＡＰ発現を引き下げ（図８ｃ）、年齢起因性コラーゲン沈着を、幼年成体マウス（図１５および図１６）または老齢のＩＲＡＰ－／－マウス（図９）において見られるのと同じレベルに逆転し、そしてまた、Ｉ型コラーゲンα１の前駆体および成熟形態を著しく引き下げた（図１７）；全て、ＩＲＡＰ阻害後の線維形成誘導性メディエータ、例えば合成筋線維芽細胞（図１８）およびＴＧＦ－β１発現（図１８）の下方制御と整合した。ＩＲＡＰ阻害は、コラゲナーゼＭＭＰ－８のタンパク質発現の増大に傾くＩＲＡＰ欠失マウスにおいて見られるものと僅かにしか異ならない、コラーゲン分解に及ぼす作用を有した一方、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、またはＭＭＰ－１３のタンパク質レベルにおいては、変化がなかった。しかしながら、ＨＦＩ－４１９処置は、ＴＩＭＰ－１タンパク質レベルを有意に減少させた（図１７）ので、ＭＭＰの活性増大を可能にすることで、ＩＲＡＰの阻害によるコラーゲン分解の全体的な増大が実現した。
ＨＦＩ－４１９によるＩＲＡＰ阻害はまた、ＩＲＡＰ－／－マウスにおいて示される炎症性メディエータに及ぼす作用を再生して、強炎症状態を通常示す老齢ＷＴマウスにおける、スーパーオキシド生産の減弱、ＮＦκＢ活性化、ＩＣＡＭ－１の引下げ、ＭＣＰ－１およびマクロファージの発現を伴う（図１３）。さらに、炎症誘発サイトカインおよび抗炎症サイトカインを、ＨＦＩ－４１９処置ＷＴマウスにおいて、区別して調節した（表１）。ＩＲＡＰ－／－マウス由来の炎症誘発サイトカインプロフィールと比較して、直接的なＩＲＡＰ阻害は、いかなる炎症誘発サイトカインも増大させなかった（図１４および表１）。しかしながら、ＩＬ－４、ＩＬ－９、およびＩＬ－１２ｐ４０が挙げられるいくつかの抗炎症サイトカインの著しい増大があり（表１）、ＩＲＡＰ阻害によって媒介された抗炎症作用の証拠が得られ、これは、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスにおいて明らかな表現型を代表するものである。
ＩＲＡＰインヒビタの構造的に異なるクラスが、年齢起因性心線維症を逆転するのに、等しく有効である
ＨＦＩ４１９に加えて、ＩＲＡＰインヒビタの２つの構造的に異なる化学クラスが、図１９に示すように、心臓において、年齢起因性コラーゲン発現を逆転する。クラス１インヒビタは、化合物１であり、本明細書において示す構造を有する一方、クラス２は、本明細書において示す構造を有する化合物２である。これらのデータは、ＩＲＡＰの３つの異なる小分子インヒビタが、年齢起因性モデルにおいて、コラーゲン発現（線維症の特質）を逆転することを示したことを示している。
ＩＲＡＰ阻害および心機能
細胞外マトリックス沈着の引下げが、心機能の向上に変換されたかを判定するために、２つのプロトコルを研究した。第１のプロトコルにおいて、心臓を、幼年ＷＴマウス、老齢ＩＲＡＰ－／－マウス、およびビヒクルまたはＨＦＩ－４１９で４週間処置した老齢ＷＴマウスから単離して、虚血再灌流（ＩＲ）傷害にしてから、ＩＲ後の心機能を評価し、かつＩＲ起因性梗塞を分析した。ベースラインにて、老齢ＷＴマウス（ビヒクルおよびＨＦＩ－４１９で処置）または老齢ＩＲＡＰ－／－マウスにおいて、ＨＲ、ＬＶＤＰ、またはＬＶＥＤＰに差異はなかった。ビヒクル処置老齢ＷＴマウス由来の心臓におけるＬＶＤＰおよびＬＶ±ｄＰ／ｄｔ双方の回復は、幼年ＷＴマウス由来の心臓におけるＩＲ傷害の作用と比較して、虚血および再灌流の時間経過と共に有意に損なわれ（図２０ｂ～図２０ｄ）、ＬＶ機能のこれらのマーカーは、それらの前虚血ベースラインレベルと比較して、有意に引き下げられた。ＩＲＡＰ欠失または常習的ＩＲＡＰインヒビタ処置は、再灌流の最初の１０分において、ＬＶＤＰの回復に影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＬＶＤＰおよびＬＶ±ｄＰ／ｄｔにおける再灌流の後の方のステージにおける有意な改善が、２０分の再灌流から明らかであり、幼年ＷＴマウス由来の心臓と、老齢のＩＲＡＰ－／－マウスまたはＩＲＡＰインヒビタ処置マウス由来の心臓とにおけるＬＶＤＰの回復に、有意差はなかった（図２０ｂ～図２０ｄ）。ＩＲＡＰ欠失または常習的ＩＲＡＰインヒビタ処置の、ＩＲ傷害から保護する能力もまた、梗塞面積を測定して明らかとなった；ＩＲＡＰ欠失およびＩＲＡＰ阻害は双方とも、老齢ＷＴ対照と比較して、梗塞面積を約５０％減少させた（図２０ａ）。第２のプロトコルにおいて、心エコー検査研究を用いて、ＷＴマウスにおける心機能の年齢起因性変化が、ＩＲＡＰを包括的に欠失した老齢マウスにおいて軽減したかを判定した。心臓を、いくつかの解剖学的外観、および心エコー検査を介したイメージングモードを用いて、画像化した。幼年ＷＴマウスおよび老齢ＷＴマウスのベースライン心臓機能測定基準は、高齢のマウスの以前の心エコー検査研究において報告したものと類似していた（Dai et al, Circulation. 2009; 119:2789-2797）。しかしながら、ＩＲ傷害後のＩＲＡＰ－／－マウスから単離した心臓において実証された保護作用と同様に、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスは、年齢マッチＷＴマウス（ｎ＝４～５）と比較した場合に、駆出率の年齢起因性の低下なく、心機能の向上を（図２０ｅ）、そして左心室収縮性（面積変化率；ＦＡＣにより評価）の向上傾向を（図２０ｆ）示し、これは、老齢ＩＲＡＰ－／－マウス由来の心臓における明らかな線維形成の引下げと相関しており、ＩＲＡＰを標的とすることが確認される。
ＩＲＡＰの欠失または阻害が、収縮期血圧、心肥大、心筋細胞肥大、および中膜肥大を変えなかった
収縮期血圧（ＳＢＰ）に関して、僅かな差異が、老齢ＷＴマウスと老齢ＩＲＡＰ－／－マウスとの間に（図２１）、またはＨＦＩ－４１９処置老齢ＷＴマウスとの間に（図１６）存在した。心室重量対体重（ＶＷ：ＢＷ）比、および心室重量対脛骨長（ＶＷ：ＴＬ）比によって評価した心肥大、ならびにＨ＆Ｅで染色した心筋細胞の断面積として定量化した心筋細胞肥大は、多くの場合、加齢に起因して増大したが、ＩＲＡＰの欠失または薬理学的阻害によって大きく影響されなかった（図２１および図１６）。したがって、ＨＦＩ－４１９の著しい抗線維化作用および抗炎症作用は、血圧および心臓サイズの変化から独立していた。
本発明者らは初めて、ＩＲＡＰ欠失およびＩＲＡＰの薬理学的阻害の双方が、心臓疾患から保護することを実証した。本研究の強みは、遺伝子欠失が、年齢起因性心線維症を予防しただけでなく、ＩＲＡＰの薬理学的阻害が、年齢起因性心線維症を完全に逆転したことの実証であり、この後者の作用は、臨床重要性が大きい。実際に、この有益な心臓リモデリングは、コラーゲン合成の減少およびコラーゲン分解の増大を、心臓および血管の炎症の引下げと一緒に伴った。さらに、ＩＲＡＰの薬理学的阻害は、心臓および血管の機能的な向上に変換された。本研究は、ＩＲＡＰの除去または阻害が、線維症の進行を抑えて、特に加齢集団における、ＣＶＤに対する新規の治療戦略としてのＩＲＡＰの阻害を強調することを示している。
老化は、不可逆性の線維症に終わる、長期間にわたる反応性心臓リモデリングに起因するＣＶＤの主要な危険因子である。コラーゲンの過剰蓄積に起因する心臓スティフネスの増大およびコンプライアンスの低下は、心機能障害を悪化させて、ＣＨＦに至り、ＭＩからの回復を妨げ、または腎機能の悪化に寄与する虞がある。実際に、動物の老化は、心線維症および慢性炎症が確立した、臨床的に関連するモデルを示す。そのような年齢介在性心線維症の原因は、多元的であり、心臓損傷が、線維化促進サイトカイン、例えばＴＧＦ－βと他の炎症性メディエータとの複雑な相互作用を包含して、これが次に、相乗的に作用して、心線維症を悪化させる。しかしながら、既存のＥＣＭおよび臓器機能障害を逆転する薬理学的処置は現在、臨床ニーズが満たされていない。というのも、抗線維形成治療の成功は、いくつかの重要なメディエータを同時に標的とする必要があるからである。したがって、ＩＲＡＰのＡｎｇ ＩＶ処置または遺伝的除去によるＩＲＡＰ阻害によって媒介される血管保護表現型または神経保護表現型を考えれば、本発明者らは今回、予防パラダイムおよび介入パラダイムの双方による、老齢マウスにおけるＩＲＡＰ欠失および薬理学的ＩＲＡＰ阻害の役割を正確に概説した。
この文脈において、本発明者らの本研究は、酵素ＩＲＡＰが、ＣＶＤにおいて上方制御されること、そしてＩＲＡＰの阻害が、いくつかの機構によって、加齢による心臓の線維症および機能障害を逆調節することを同定した。全体的に、本研究の結果は、ＣＶＤの処置における新規の治療戦略を同定した。
加齢が心機能障害を引き起こして、慢性炎症および過剰なＥＣＭ生産が、瘢痕化または心線維症をもたらすことが十分に確立されている。線維形成は主に、強力な線維化促進サイトカインＴＧＦ－β１の上方制御を介して起こり、これが、ビメンチン発現線維芽細胞の、αＳＭＡ発現筋線維芽細胞への分化を促進して、コラーゲン生産を増大させる。しかしながら、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスは、ＷＴマウスにおいて見られる間質コラーゲン沈着の年齢起因性増大から保護された。機構的に、これは、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスが、「幼年成体の」心臓表現型を示し、筋線維芽細胞分化およびＴＧＦ－β１発現が、老齢ＷＴマウス由来の心臓と比較して有意に小さいという事実によって、説明され得る。さらに、線維芽細胞の増殖および線維形成は、心臓内で、血管周囲領域から生じて、隣接する間質空間中に次第に達する。これは、マウスにおいて、老齢ＷＴ心臓におけるＴＧＦ－β１およびコラーゲンの血管周囲発現の増大によって明示されたが、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスにおいては消滅した。
治療標的としてのＩＲＡＰの臨床関連性は、ＨＦＩ－４１９が、心線維症を確立した老齢ＷＴマウスに与えられたときに、確認された。というのも、この介入は、上流の線維形成誘導性機構、例えば筋線維芽細胞の分化およびＴＧＦ－βの発現を排除することによって、遺伝的欠失と同じようにして、心線維症を完全に逆転したからである。さらに、ＩＲＡＰは、心臓の間質領域および血管周囲領域の双方において、筋線維芽細胞と共局在したので、筋線維芽細胞発現およびＥＣＭ合成を調節するための、ＩＲＡＰについての解剖学的フレームワークが提供された。同時に、ＥＣＭは、プロテアーゼ、例えばＭＭＰによって分解される。老齢マウスにおいて、ＩＲＡＰの欠失または薬理学的阻害は、ＭＭＰ－１３および／またはＭＭＰ－８を増大させ、かつＴＩＭＰ－１を減少させるので、コラーゲン分解が、コラーゲン合成の減少と共に、ＩＲＡＰがない場合の老齢心臓の抗線維化表現型に寄与したことが示唆される。
線維症は多くの場合、炎症が先行する。これは、損傷の初期相の間の炎症性細胞の浸潤、およびその後の、複数のサイトカインの生産に起因する。加齢もまた、ＲＯＳを高め、これが炎症を悪化させる。ＮＦκＢ活性化は、化学誘引物質、例えばＭＣＰ－１およびＩＣＡＭ－１を増大させて、疾患のある心臓中への炎症性細胞浸潤を促進することによって、単球がマクロファージに分化して、これがまた、スーパーオキシドおよびＴＧＦ－β１を生産して、これらが筋線維芽細胞分化を誘導し、かつ心線維症を悪化させる。老齢ＩＲＡＰ－／－マウスは、抗炎症心臓表現型を示し、そして、注目すべきことに、ＨＦＩ－４１９による処置は、双方の実験モデルにおいて、心臓における既存の炎症を逆転して、同様に、スーパーオキシド、ホスホ－ＩκＢα、ＭＣＰ－１、ＩＣＡＭ－１発現を引き下げ、かつマクロファージ浸潤を軽減した。これらの発見は概して、ＩＲＡＰ欠失に起因して、炎症誘発サイトカインよりも、いくつかの抗炎症サイトカインの増大が比較的大きいことを示す心臓サイトカイン分析と、一致した。より顕著には、ＨＦＩ－４１９は、抗炎症サイトカインのみを高めた。ゆえに、炎症経路と線維形成経路との間のクロストークを考えれば、老齢心臓におけるＩＲＡＰの欠失または阻害に起因する蔓延抗炎症状態が、双方の実験パラダイムにおける心線維症の標準化におそらく寄与するであろう。重要なことに、ＨＦＩ－４１９およびＩＲＡＰ欠失の抗炎症作用はまた、血管組織においても注目された。
組織形態学的な考慮点から導き出されるＩＲＡＰ阻害のための心血管保護作用を考えれば、本発明者らはまた、これらの有益な作用が、心臓機能の向上に変換され得るかも調査した。心筋は、虚血再灌流（ＩＲ）傷害に応じて損傷を受けて、ＩＲ傷害後にＬＶＤＰが低下する虞があることが十分に確立されており、これは、ＩＲ後の本発明者らの老齢ＷＴマウスにおいて明らかで、線維化した心臓の収縮性が損なわれたことを示している。ＩＲＡＰ－／－マウス、またはＨＦＩ－４１９で４週間常習的に処置したＷＴマウス由来の心臓は、ＬＶＤＰの虚血後の回復において、有意な向上を示した。機能的作用の向上はまた、ＩＲ傷害後の梗塞面積の縮小ともかなり相関した。
結論として、ＩＲＡＰの遺伝的欠失または薬理学的阻害は、実質的に、心線維症を消滅させた。そして、常習的ＩＲＡＰインヒビタ処置が、約２ヵ年齢のマウスにおける年齢起因性の心線維症を完全に逆転したという重要な発見があった。ＩＲＡＰ阻害の心臓、腎臓、および血管の保護作用の基礎となる機構は、多元的である可能性が高い。これらの作用として、線維症の引下げを、種々の抗炎症作用と一緒に支持するＥＣＭのバランスの変更（生産の低下および分解の増大）が挙げられる；それらの全てまたは一部が、ＩＲＡＰ基質レベルの変化および／またはＩＲＡＰシグナル伝達経路の変更に起因し得る。全体的に、これらの発見は、特に加齢および／または高血圧関連損傷もしくは心血管関連損傷で起こる、処置が困難な末端臓器障害について、ＩＲＡＰが、心血管疾患の病因において重要な役割を果たすことを示唆しており、そしてＩＲＡＰの薬理学的阻害の潜在性を、新規の治療戦略として強調している。
全体的に、これらの研究は、ＩＲＡＰ活性の除去または阻害が、心臓、腎臓、および血管組織の線維症に劇的な作用を及ぼし、かつＩＲＡＰを、ＣＶＤにおける新規の標的として同定した、説得力に富む原理実証を提供する。
実施例３
おおよそ１７０万人のオーストラリア人および２６００万人のアメリカ人は、腎機能が低下した慢性腎疾患を患っている。慢性腎疾患（ＣＫＤ）の最終徴候は、尿細管間質性線維症および糸球体硬化症によって特徴付けられる腎線維症である。
この実施例における本研究は、ＩＲＡＰ活性の除去または阻害が、腎線維症に劇的な作用を及ぼし、そしてＣＫＤにおける新規の標的としてＩＲＡＰを同定したことを示す。
老齢マウスの腎臓におけるＩＲＡＰ発現および線維症の調節
心線維症に関する先の実施例２と同様に、２つの具体的な実験パラダイムを用いた。それゆえに、本発明者らは、老齢のＷＴマウスと、包括的ＩＲＡＰノックアウトマウス（１８～２２ヵ月齢）と、幼年ＷＴマウス（４～６ヵ月齢）との間で、腎臓表現型を比較して、加齢による腎線維症の進行の予防を判定した。本発明者らはまた、ＷＴ老齢マウスの処置を、ビヒクルと、またはＩＲＡＰの小分子インヒビタと比較して、確立された線維症の治療処置を決定し、そして加齢による腎線維症の逆転に及ぼすＩＲＡＰ阻害の作用を確立した。
ＩＲＡＰ発現は、幼年ＷＴマウス由来の腎臓において発現されるレベルと比較して、老齢ＷＴマウスの腎臓において、増大した（図２２ａ）。ＩＲＡＰ発現は、ＩＲＡＰのインヒビタ（ＨＦＩ－４１９）による処置の４週後の老齢ＷＴマウスの腎臓において、減少する傾向があった。心臓における免疫蛍光研究と同様に、ＩＲＡＰ抗体の特異性が、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスから得た腎臓における染色の不在によって確認された（図２２ａ）。
年齢起因性腎線維症におけるＩＲＡＰ欠失およびＩＲＡＰインヒビタ処置
ピクロシリウスレッド染色を用いてコラーゲン含有量によって評価し、かつ明視野顕微鏡観察を用いて定量化した腎臓間質線維形成を、幼年ＷＴマウス、老齢のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウス、ならびにビヒクルまたはＨＦＩ－４１９（５００ｎｇ／ｋｇ／分；ｓ．ｃ．）で４週間処置した老齢ＷＴマウスにおいて、評価した。予想されるように、加齢は、腎臓間質線維形成を有意に増大させた（図２３ａ）。本発明者らの老齢ＷＴマウス由来の腎臓において見られるコラーゲンの増大と対照的に、老齢ＩＲＡＰ－／－マウスは、幼年成体ＷＴマウスにおいて見られるのと類似したＥＣＭ沈着を示し（図２３ａ）、これは、ＩＲＡＰがない場合の抗線維化作用を示し、そして、老齢ＩＲＡＰ－／－マウス由来の心臓において見られる抗線維化作用と一致した（実施例２）。老齢ＷＴマウスが腎線維形成の有意な増大を有し、そしてＩＲＡＰを欠いている老齢マウスが、幼年成体の対応動物に類似したコラーゲン発現の引下げの腎臓表現型を実証することを考えれば、本発明者らは、小分子ＩＲＡＰインヒビタによるＩＲＡＰの薬理学的阻害が、心血管／腎臓疾患の確立時に、腎線維症を逆転することができるか否かに関心をもった。この目的で、合成ＩＲＡＰインヒビタＨＦＩ－４１９を、腎線維症を確立した４週から約２０ヶ月齢のＷＴマウスに投与した。実際に、ＨＦＩ－４１９は、年齢起因性コラーゲン沈着を、幼年成体のＷＴマウスおよびＩＲＡＰ－／－マウスにおいて見られるのと類似したレベルに完全に逆転する有意な作用を示した（図２３ａおよび図２３ｂ）。
線維症の増大は、線維芽細胞の、より多くの合成タイプの筋線維芽細胞への、より多くの分化に起因し得る。この文脈において、老齢ＷＴマウス由来の腎臓は、幼年ＷＴ対照由来の腎臓よりも有意に多くのαＳＭＡ－陽性筋線維芽細胞発現を示した（図２４ａ）。それに対して、老齢ＩＲＡＰ－／－マウス由来の腎臓は、この年齢依存性の筋線維芽細胞の上方制御を示さず、幼年ＷＴマウス由来の腎臓において見いだされるのと類似した筋線維芽細胞発現に終わった（図２４ａ）。これらの結果は、合成筋線維芽細胞活性の増大に起因する、異常に多いコラーゲン生産が、老齢ＷＴの腎臓において注目される線維形成の増大に寄与したことを、そしてこの現象が、老齢のＩＲＡＰ－／－マウス由来の腎臓において高度に弱められたことを示唆している。老齢ＷＴマウスにおける、ＨＦＩ－４１９による４週間のＩＲＡＰ阻害は、年齢マッチビヒクル処置対照マウスと比較した場合、腎臓におけるαＳＭＡ－陽性筋線維芽細胞発現の引下げに向かう傾向を実証した（図２４ｂ）。
実施例４
臨床的に関連したヒトモデルにおけるＩＲＡＰ阻害の心臓保護作用の基礎となる機構を解明するために、ヒト心臓線維芽細胞の一次細胞株を研究した。研究は、以下の疑問に答えるために実行した：ＩＲＡＰがこれらの細胞中に存在し、そして線維化促進刺激因子がＩＲＡＰ発現を増大させるのか？ＩＲＡＰ阻害が、筋線維芽細胞発現／コラーゲン生産を引き下げることができるのか？
アンギオテンシンＩＩにより刺激したヒト心臓線維芽細胞におけるＩＲＡＰ発現の増大
典型的な画像は、Ａｎｇ ＩＩの濃度の増大により刺激された一次ヒト心臓線維芽細胞が、ＩＲＡＰの発現の増大を誘導したことを示している（図２５）。ヒト心臓線維芽細胞におけるＩＲＡＰ発現の用量依存性の増大が明確である。
ＩＲＡＰインヒビタが、ヒト心臓線維芽細胞において、α－ＳＭＡおよびコラーゲンの発現を用量依存的に引き下げた
小分子ＨＦＩ－４１９による薬理学的ＩＲＡＰ阻害は、筋線維芽細胞発現（α－ＳＭＡ染色）およびコラーゲン生産を用量依存的に引き下げた。典型的な画像は、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）をＡｎｇ ＩＩ（０．１μＭ）で刺激した場合の、α－ＳＭＡ（赤色；筋線維芽細胞についてのマーカー）およびコラーゲン（緑色）の発現の増大を示している（図２６ａ）。Ａｎｇ ＩＩおよびＨＦＩ－４１９の併用処置（０．０１から１μＭ）は、α－ＳＭＡおよびコラーゲンの発現を引き下げた。図２６ｂは、ウェスタンブロット由来の定量データであり、ＨＣＦを、Ａｎｇ ＩＩ＋濃度を上げたＨＦＩ－４１９で共処置した場合、α－ＳＭＡおよびコラーゲンのタンパク質発現の用量依存的引下げを確認した（ｎ＝１０～１２）。データを、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表す；ウェスタンブロットの濃度測定分析を、対照細胞の平均±ｓ．ｅ．ｍに対する相対比率として表す；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１を、多重比較についてボンフェローニ補正した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。
実施例５
肝臓脂肪症に及ぼすＩＲＡＰ遺伝子欠失の作用
雄ＩＲＡＰノックアウトマウス（ＩＲＡＯ ＫＯ：インスリン調節性アミノペプチダーゼについての遺伝子の包括的欠失）６ヵ月齢、およびそれらの野生型対応動物に、高脂肪食（ＨＦＤ）または標準的な食事（ＮＤ）のいずれかを給餌した。４週の食事操作の後、全身の代謝を、Oxymax Lab Animal Monitoring System（Columbus Instruments, OH, U.S.A.）を用いて、マウスの全群において測定した。予想されるように、ＨＦＤを給餌したマウスは、ＮＤ給餌マウスと比較した場合、呼吸交換比（代謝において生産された二酸化炭素の量と、用いられた酸素の量との比率）が低下し、かつ熱発生量が増大したが、４８時間にわたり、遺伝子型間で差異はなかった。
１２週の食事操作の後、マウスを殺して組織を収集した。血液、脳、肝臓、腎臓、生殖腺の白色脂肪組織（内蔵脂肪）、鼠径部の白色脂肪組織（皮下脂肪）、褐色脂肪組織（熱発生脂肪）、腸、心臓、および大動脈を収集した。組織重量は、鼠径部の白色脂肪組織においてのみ異なり、ＨＦＤを給餌した野生型マウスは、鼠径部の白色脂肪組織沈着が、他の全ての群よりも有意に重かった。
肝臓重量は、群間で異ならなかったが、この組織の組織学的調査は、ＮＤ給餌マウスと比較して、ＨＦＤ給餌マウスにおいてより高いレベルの脂肪形成を示し、そしてＨＦＤのＩＲＡＰ ＫＯマウスは、ＨＦＤのＷＴマウスと比較して、脂肪形成の低下を示した（図２７）。このことは、ＨＦＤ給餌マウスが、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、または初期ステージの非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を示した一方、これらのマウスにおけるＩＲＡＰの阻害が、小胞における過剰な脂質蓄積を予防したことを示す。
実施例６
ＩＲＡＰの薬理学的阻害が、肝線維症における高塩誘導増大を逆転する
塩は、メタボリックシンドロームの進行の促進要因であることが周知であり、そして心血管疾患の進行に関与する。これはおそらく、その酸化促進特性に起因する。最近の証拠は、高塩分食（ＨＳＤ）が、ＨＦＤ給餌レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体－１（ＬＯＸ－１）トランスジェニック（Ｔｇ）ａｐｏＥノックアウト（ＫＯ）（ＴｇＫＯ）マウス（メタボリックシンドロームを調査する研究において用いられるモデル）の肝臓における脂肪および線維形成の蓄積を悪化させる虞があることを示している（Uetake et al, Lipids in Health and Disease (2015) 14:6）。したがって、本発明者らは、ＨＳＤが単独で、肝線維症の有意な変化を誘導するか、そしてＩＲＡＰインヒビタ処置が、これらの線維形成変化を逆転するかに関心をもった。ＨＳＤをＷＴ（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ）マウスに８週間給餌することで、肝臓における線維形成および小胞数が有意に増大し、このことは、このモデルが、線維症の悪化が挙げられるＮＡＳＨの特質の全てを有することを示している。合成ＩＲＡＰインヒビタＨＦＩ－４１９を、約２０週齡のＷＴマウスに４週間投与した。これには既に、肝臓における変化を誘導するために、初期の４週間、ＨＳＤを給餌していた。実際に、ＨＦＩ－４１９は、ＨＳＤ起因性コラーゲン沈着を、標準的な食事を給餌したマウスにおいて見られるのと同じレベルにまで有意に逆転し（図２８）、そして肝臓における脂肪症の指標を著しく引き下げた（図２８）。これらの抗線維化作用は、合成ＩＲＡＰインヒビタＨＦＩ－４１９が、確立された心線維症を逆転する明確な能力を示す、以前の発見と一致している。
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> Monash University
<120> Fibrotic treatment
<150> AU 2015903035
<151> 2015-07-30
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Val Tyr Ile His Pro Phe
1 5

<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Cys Tyr Cys His Pro Phe
1 5

<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is HCY
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is HCY
<400> 3
Xaa Tyr Xaa His Pro Phe
1 5

<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly
1 5

<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu Gly
1 5

<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Tyr Gly Gly Phe Leu
1 5

<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Murine
<400> 7
gataagatag taggggaga 19

<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Murine
<400> 8
caatagaggt acagtcacca 20

<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Murine
<400> 9
ggagaataag ggctgtgaga ga 22

Claims (43)

  1. 個体における線維症を処置する方法であって、インスリン調節性アミノペプチダーゼ（ＩＲＡＰ）のインヒビタを投与することを含み、それによって、線維症を処置する方法。
  2. 前記個体は、線維症を患っていると同定される、請求項１に記載の方法。
  3. 線維症の、少なくとも１つの臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性の進行を遅らせることによって、線維症を処置する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 線維症の、少なくとも１つの臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性を逆転することによって、線維症を処置する、請求項１または２に記載の方法。
  5. 臨床的にまたは生化学的に観察可能な特性は、臓器機能障害、瘢痕化、正常な細胞外マトリックスバランスの変化、コラーゲン沈着の増大、筋線維芽細胞への線維芽細胞の分化、マトリックスメタロプロテイナーゼレベルの下降、マトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビタレベルの上昇、Ｉ型プロコラーゲンのＮ末端プロペプチドもしくはＣ末端プロペプチド（ＰＩＮＰまたはＰＩＣＰ）どちらかのレベルの上昇、Ｉ型コラーゲンのＣ末端テロペプチド（ＣＴＰまたはＣＩＴＰ）のレベルの下降、コラーゲン沈着の増大、または種々の非侵襲性の撮像技術によって測定される心機能障害、ならびに、タンパク尿およびアルブミン尿の増大によって測定される腎機能障害、糸球体濾過速度の低下、血漿クレアチニンレベルの倍増のうちのいずれか１つを含む、請求項３または４に記載の方法。
  6. コラーゲンは、１型コラーゲンα１の前駆体または成熟形態である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記線維症は、年齢起因性である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記線維症は、ストレス起因性または損傷起因性である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記線維症は、高血圧性心疾患、高血圧心筋症もしくは心不全、または、糖尿病を伴うもしくは伴わない腎症、または、基礎心血管疾患を伴うもしくは伴わない、線維化反応を包含してもよい他のストレス起因性もしくは損傷起因性の心血管後遺症を伴う、請求項８に記載の方法。
  10. 線維症を患う個体を同定する工程をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記線維症は、心線維症、肝線維症、腎線維症、血管線維症、肺線維症、および真皮線維症からなる群より選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記線維症は、心線維症である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記線維症は、腎線維症である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記線維症は、肝線維症である、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記線維症は、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１４に記載の方法。
  16. ＩＲＡＰの前記インヒビタは、ＩＲＡＰの酵素活性を直接的にまたは間接的に阻害する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ＩＲＡＰのインヒビタは、ＩＲＡＰの酵素活性を直接的に阻害する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記インヒビタは、ＩＲＡＰに結合する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記インヒビタは、ＩＲＡＰの活性部位に結合する、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. ＩＲＡＰの前記インヒビタは、ＩＲＡＰへの結合について、ＩＲＡＰの基質と競合する、請求項１７または１８に記載の方法。
  21. ＩＲＡＰの前記インヒビタは、アミノペプチダーゼ活性または基質分解のアッセイによって決定される、１ｍＭ未満、好ましくは１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満のＫｉ値を示す、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. アミノペプチダーゼ活性の前記アッセイは、蛍光性製品MCAの放出によって監視される合成基質Ｌ－ロイシン７－アミド－４－メチルクマリンヒドロクロリド（Ｌｅｕ－ＭＣＡ）の加水分解を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 基質分解の前記アッセイは、ペプチド基質ＣＹＦＱＮＣＰＲＧまたはＹＧＧＦＬの分解である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記インヒビタは、小分子、抗体、およびペプチドからなる群より選択される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記インヒビタは、干渉ＲＮＡである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記インヒビタは、式（Ｉ）
    Figure 2023030022000099
    （式中、
    Ａは、
    アリール、ヘテロアリールカルボシクリル、もしくはヘテロシクリルであり、これらはそれぞれ、Ｒ１がＮＨＣＯＲ８である場合、置換されていてもよく；
    または、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、１，８－ナフチリジル、フタラジニル、もしくはプテリジニルであり、これらはそれぞれ、Ｒ１がＮＲ７Ｒ８、ＮＨＣＯＲ８、Ｎ（ＣＯＲ８）２、Ｎ（ＣＯＲ７）（ＣＯＲ８）、Ｎ＝ＣＨＯＲ８、もしくはＮ＝ＣＨＲ８である場合、置換されていてもよく；
    Ｘは、Ｏ、ＮＲ’、またはＳであり、Ｒ’は、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアシル、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、または置換されていてもよいヘテロシクリルであり；
    Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアリールから選択され、またはＲ７およびＲ８は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい３～８員環を形成しており；
    Ｒ２は、ＣＮ、ＣＯ２Ｒ９、Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｏ）Ｒ９、Ｃ（Ｏ）Ｒ９、またはＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０であり、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、それぞれ置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、および水素から選択され；またはＲ９およびＲ１０は、これらが結合する窒素原子と共に、置換されていてもよい３～８員環を形成しており；
    Ｒ３～Ｒ６は、独立して、水素、ハロ、ニトロ、シアノアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、カルボシクリル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アミノ、アシル、アシルオキシ、カルボキシ、カルボキシエステル、メチレンジオキシ、アミド、チオ、アルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、ヘテロシクリルチオ、カルボシクリルチオ、アシルチオ、およびアジドから選択され、これらはそれぞれ、適切な場合には置換されていてもよく、または、任意の２つの隣接するＲ３～Ｒ６は、これらが結合する原子と共に、置換されていてもよい３～８員環を形成しており；かつ
    Ｙは、水素またはＣ１～１０アルキルである）
    に従う構造、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. Ａは、Ｒ１がＮＨＣＯＲ８である場合、置換されていてもよいヘテロアリールである、請求項２６に記載の方法。
  28. Ａはピリジニルである、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. ＸはＯである、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. Ｒ２はＣＯ２Ｒ９である、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. Ｒ５はヒドロキシルである、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記インヒビタは、構造
    Figure 2023030022000100
    を有する、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記インヒビタは、式（ＩＩ）
    Figure 2023030022000101
    （式中、
    Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく；
    ＲＡおよびＲＢは、独立して、水素、アルキル、およびアシルから選択され；
    Ｒ１は、ＣＮまたはＣＯ２ＲＣから選択され；
    Ｒ２は、ＣＯ２ＲＣおよびアシルから選択され；
    Ｒ３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよく；または
    Ｒ２およびＲ３は共に、５～６員の飽和ケト炭素環
    Figure 2023030022000102
    を形成しており、
    式中、ｎは、１もしくは２であり；
    前記環は、Ｃ１～６アルキルによって１回もしくは複数回置換されていてもよく；または
    Ｒ２およびＲ３は共に、５員ラクトン環（ａ）もしくは６員ラクトン環（ｂ）
    Figure 2023030022000103
    を形成しており、
    式中、
    Figure 2023030022000104
    は、任意選択の二重結合であり、Ｒ’はアルキルであり、
    ＲＣは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキルから選択され、これらはそれぞれ置換されていてもよい）
    に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  34. Ａは、置換されていてもよいアリールである、請求項３３に記載の方法。
  35. Ａは、－ＣＯＯＨで置換されているアリール、またはその塩、エステル、もしくはプロドラッグである、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. Ａは、－ＣＯ２ －ＮＨ４ ＋で置換されているアリールである、請求項３５に記載の方法。
  37. Ｒ１はＣＮである、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. Ｒ２はアシルである、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記インヒビタは、構造
    Figure 2023030022000105
    を有する、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記インヒビタは、式（ＩＩＩ）
    Figure 2023030022000106
    （式中、
    Ｒ１は、ＨまたはＣＨ２ＣＯＯＨであり；
    ｎは、０または１であり；
    ｍは、１または２であり；
    Ｗは、ＣＨまたはＮである）
    に従う構造、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記インヒビタは、構造
    Figure 2023030022000107
    を有する、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記インヒビタは、以下の配列：
    Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ、
    ｃ［Ｃｙｓ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ］－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ、および
    ｃ［Ｈｃｙ－Ｔｙｒ－Ｈｃｙ］－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ
    のいずれか１つに従う構造を有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記インヒビタは、以下に従う構造
    Figure 2023030022000108
    を有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
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