JP2018519797A - 第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）、カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）、及びキニノーゲン１（ＫＮＧ１）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法 - Google Patents

第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）、カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）、及びキニノーゲン１（ＫＮＧ１）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）遺伝子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子（Ｆ１２）遺伝子、又はキニノーゲン１（ＫＮＧ１）遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤、並びにかかるＲＮＡｉ剤を使用してＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、及び／又はＫＮＧ１遺伝子の発現を阻害する方法、及び遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）及び／又は接触活性化経路関連障害を有する対象を治療する方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年５月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１５７，８９０号明細書、２０１５年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６０，８８７号明細書、及び２０１５年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２６６，９５８号明細書に対する優先権の利益を主張する。前述の出願の各々の内容は全て、本明細書によって参照により本明細書に援用される。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は本明細書によって全体として参照により援用される。２０１６年５月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、名称１２１３０１−０３１２０＿ＳＬ．ｔｘｔ、及びサイズ７２１，８２７バイトである。
血液凝固系は止血に不可欠であり、血管外傷に対し、フィブリンメッシュと活性化血小板とで形成される凝血塊の局所生成によって応答する。血液凝固、トロンビン生成、及びフィブリン形成は、外因性経路及び内因性経路と称される２つの個別の経路によって開始され得る。
外因性経路は、血管外傷部位で血漿第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）が血管外組織因子（ＴＦ）と結合することを伴う。
内因性経路は、接触活性化と呼ばれるプロセスにおける血漿第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）からＦ１２ａへの表面依存的活性化によって開始される。接触活性化には、二分子複合体として循環する２つの他のタンパク質、プレカリクレイン及び高分子量キニノーゲンが関与する。まとめると、これらの３つのタンパク質、ＦＸＩＩ、プレカリクレイン及びＨＫは、「カリクレイン−キニン系」とも称される「接触活性化経路」を含む。Ｆ１２が負電荷表面（又は巨大分子）に結合することによって接触活性化経路が開始されると、Ｆ１２のコンホメーション変化が引き起こされ、活性型Ｆ１２（Ｆ１２ａ）が形成されることになる。Ｆ１２ａはプレカリクレインを切断して活性カリクレイン（α−カリクレイン）を生じさせ、ひいてはこれがＦ１２をレシプロカルに活性化して、更なるＦ１２ａが生成される。次に活性カリクレインは、高分子量キニノーゲンを消化してブラジキニンを遊離させる。接触活性化によって生成されるＦ１２ａはまた、第ＸＩ因子（Ｆ１１）もＦ１１ａに活性化させて一連のタンパク質分解切断イベントを惹起し、最終的にはこれがトロンビン生成及びフィブリン凝血塊形成に至る。
興味深いことに、この接触系は止血に必要ないことが示されている。接触活性化タンパク質が欠損しているヒト及び他の動物はほとんどが無症候であり、ホモ接合性Ｆ１２欠損はいかなる疾患又は障害とも関連付けられていない。しかしながら、種々のモデルにおいてＦ１２ａの薬理的阻害又はＦ１２若しくは高分子量キニノーゲン遺伝子の除去が実験的誘発血栓症からマウスを保護することができるとおり、接触系は血栓性疾患において重要な役割を果たすことが示されている。
健常対象においては、凝血促進力と抗凝固力及び線維素溶解力との間に恒常性バランスが存在する。しかしながら、数多くの遺伝的、後天的、及び環境的要因によってこのバランスが調節不全となり、凝固に有利に働く結果、病的血栓形成である血栓症に至り、生命を脅かすイベントが惹起され得る。例えば、静脈における血栓形成は、例えば深部静脈血栓症（ＤＶＴ）につながることもあり、動脈又は心室における血栓形成は、例えば心筋梗塞又は脳卒中につながることもある。血栓は形成部位の血流を妨げ、又は剥離して塞栓を生じることにより遠隔血管を詰まらせ得る（例えば、肺塞栓症又は塞栓性脳卒中）。
病的接触活性化及び接触経路媒介血栓症につながり得る後天的／環境的要因としては、心房細動、癌治療、不動化、中心静脈カテーテル、インプラント、及び体外酸素化などの様々な歯科的、外科的及び内科的セッティングが挙げられる。かかる内科的及び外科的セッティングの結果として、組織損傷が組織因子を放出し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リン酸、コラーゲン、及びラミニン）など、接触経路を活性化させて血栓症を招く接触経路の種々のトリガーを曝露させる。
凝血促進力と抗凝固力及び線維素溶解力との間の恒常性バランスを調節不全にする遺伝的障害が、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）である。ＨＡＥはまれな常染色体優性障害であり、患者の３分の１に四肢、顔面、喉頭、上気道、腹部、体幹、及び性器（ｇｅｎｅｔｉａｌｓ）の反復性浮腫及び腫脹並びに非そう痒性発疹を引き起こす。未治療のＨＡＥ患者は平均月１〜２回の血管浮腫発作を起こし、しかしエピソードの頻度及び重症度は大きく異なり得る。浮腫・腫脹は外観を損なうものであって生活に支障が及ぶことも多く、入院を繰り返すことになり、患者には疾患関連の不安を治療するための精神医学的ケアが必要となることもある。腹部発作は激痛、悪心嘔吐を引き起こし、時に不適切な手術につながり得る。更に、ＨＡＥ患者の半数以上は、生涯のうちに、窒息を防ぐため緊急気管切開が必要となり得る生命を脅かす喉頭浮腫も経験する。米国では推定６，０００〜１０，０００人の様々な人種集団がＨＡＥに罹患しており、年間１５，０００〜３０，０００人の受診数及び２０〜１００日の病気欠勤日数に達する深刻な経済的損害が患者に生じている。
ＨＡＥは、Ｃ１ＩＮＨタンパク質の欠損をもたらすＣ１インヒビター（Ｃ１ＩＮＨ、ＳＥＲＰＩＮＧ１）遺伝子の突然変異が原因で起こる。２５０を超える種々のＣ１ＩＮＨ突然変異がＨＡＥ臨床症状を引き起こすことが実証されている。これらのＣ１ＩＮＨ突然変異は、典型的には遺伝的に受け継がれるが、しかしながら最大２５％のＨＡＥ症例でＣ１ＩＮＨのデノボ突然変異が原因となっている。ＨＡＥ Ｉ型は、非効率的に分泌されるトランケートタンパク質又はミスフォールドタンパク質のレベルが低くなるＣ１ＩＮＨ突然変異によって引き起こされ、ＨＡＥ症例の約８５％を占める。ＨＡＥ ＩＩ型は症例の約１５％を占め、正常レベルの機能不全Ｃ１ＩＮＨタンパク質をもたらすＣ１ＩＮＨ活性部位近傍の突然変異によって引き起こされる。加えて、ＨＡＥ ＩＩＩ型が、この疾患のまれな第３の形態であり、凝固第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）（ハーゲマン因子）の機能獲得型突然変異に起因して起こる。
Ｃ１インヒビターは、セルピンファミリーのセリンプロテアーゼ阻害因子であり、補体及び接触活性化経路におけるプロテアーゼの主要な阻害因子であり、並びに線維素溶解プロテアーゼプラスミンのマイナーな阻害因子である。ＨＡＥ発作時はこれらの血漿タンパク質分解カスケードが活性化され、血管透過性を増加させる物質、例えばブラジキニンが生成される。研究によれば、血管を拡張させる炎症促進シグナル伝達経路を活性化させ、且つ好中球の走化性を誘発するブラジキニンペプチドが、血管内皮細胞上のブラジキニン受容体への結合によりＨＡＥ発作において血管透過性を亢進させる主要な物質であることが示されている。
典型的には、Ｃ１ＩＮＨは、Ｆ１２の自己活性化、Ｆ１２ａがプレカリクレイン（ｐｒｅｋａｌｌｉｌｒｅｉｎ）を活性化させる能力、カリクレインによる高分子量キニノーゲンの活性化、及びカリクレインによるＦ１２のフィードバック活性化を阻害する。結果的に、Ｃ１ＩＮＨ欠損又はＦ１２機能獲得型を引き起こす突然変異は、ブラジキニンの過剰産生及びＨＡＥ血管浮腫の発症につながる。
現在、ＨＡＥは、再発エピソードの可能性を低減するため１７α−アルキル化アンドロゲン類で予防的に治療されるか、又は急性発作の治療のため疾患特異的療法薬で治療され得る。ＨＡＥを有する人の約７０％がアンドロゲン類で治療されるか、又は未治療のままであり、及び約３０％が療法薬の投与を受ける。アンドロゲン類は効果を生じるまでに数日かかるため急性発作の短期治療には不適であり、且つアンドロゲン類は重度の副作用を伴い、成長及び発達に悪影響を及ぼし得る。結果として、アンドロゲン類は長期予防にのみ用いられ、一般に妊婦又は小児には投与されない。更に、急性発作の治療に用いられている現在の療法薬は週に何回も静脈内投与しなければならず、又は薬物投与及び続く入院下での患者モニタリングを必要とする副作用を引き起こし、これにより長期疾患管理のためのその予防的な定期使用が制限され得る。従って、安全、有効に、且つより簡便な経路によって投与されるレジメン並びに妊婦及び小児を含めた大多数の患者において急性血管浮腫発作を治療し及び反復性発作を予防的に管理するレジメンは存在せず、ＨＡＥに罹患している対象に向けた代替療法が必要とされている。
従って、当該技術分野においては、遺伝的、後天的、又は環境的に血栓形成リスクを有する対象など、血栓形成リスクのある対象の血栓症を阻害する組成物及び方法が必要とされている。
本発明は、カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）遺伝子のＲＮＡ転写物、第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）遺伝子のＲＮＡ転写物、又はキニノーゲン（ＫＮＧ１）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断を生じさせるｉＲＮＡ組成物を提供する。簡単にするため、及び特記されない限り、用語「接触活性化経路遺伝子」は、本明細書で使用されるとき、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子を指す。接触活性化経路遺伝子は、細胞内、例えばヒトなどの対象の体内にある細胞内にあり得る。
従って、一態様において、本発明は、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号９のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つアンチセンス鎖は、配列番号１０のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。
別の態様において、本発明は、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。
別の態様において、本発明は、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号９のヌクレオチド２０００〜２０６０と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号９のヌクレオチド２０００〜２０３０と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号９のヌクレオチド２０３０〜２０６０と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号９のヌクレオチド２０１０〜２０４０と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号９のヌクレオチド２０１０〜２０３５と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号９のヌクレオチド２０１５〜２０４０と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号９のヌクレオチド２０１５〜２０４５と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号９のヌクレオチド２０２０〜２０５０と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号９のヌクレオチド２０２０〜２０４５と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。なおも他の実施形態において、アンチセンス鎖は、表２４に提供される配列番号９の範囲のうちのいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は、配列番号９のヌクレオチド２０１８〜２０４０と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ−６７２４４のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列（５’−ＵＵＣＡＡＡＧＣＡＣＵＵＵＡＵＵＧＡＧＵＵＵＣ−３’）（配列番号２５）と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。一実施形態において、センス鎖はＡＤ−６７２４４のセンス鎖ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、相補性領域は、配列番号９のヌクレオチド２０１５〜２０４０と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、相補性領域は、配列番号９のヌクレオチド２０１５〜２０４５と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、相補性領域は、配列番号９のヌクレオチド２０１８〜２０４０と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、相補性領域は、配列番号９のヌクレオチド２０１８〜２０４５と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチドを含む。一実施形態において、本薬剤は少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、本薬剤のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、本薬剤は、リガンド、例えばセンス鎖の３’末端に結合したリガンドを更に含む。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、各々独立して、１５〜３０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、各々独立して、１９〜２５ヌクレオチド長である。
一態様において、本発明は、カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つアンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。
別の態様において、本発明は、カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、表３、４、１９Ａ、又は１９Ｂのいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。
一態様において、本発明は、キニノーゲン１（ＫＮＧ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１７のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つアンチセンス鎖は、配列番号１８のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。
別の態様において、本発明は、キニノーゲン１（ＫＮＧ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤はセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、表１５、１６、１９Ｅ、又は１９Ｆのいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。
一実施形態において、本明細書に提供される二本鎖ＲＮＡｉ剤は少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
一態様において、本発明は、カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つアンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、及びセンス鎖は、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされている。
別の態様において、本発明は、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号９のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つアンチセンス鎖は、配列番号１０のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、及びセンス鎖は、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされている。
更なる態様において、本発明は、キニノーゲン１（ＫＮＧ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１７のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つアンチセンス鎖は、配列番号１８のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、及びセンス鎖は、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされている。
特定の実施形態において、本ｄｓＲＮＡは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本ｄｓＲＮＡはセンス鎖に４つ以下（即ち、４、３、２、１つ、又は０の）非修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本ｄｓＲＮＡはアンチセンス鎖に４つ以下（即ち、４、３、２、１つ、又は０の）非修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本ｄｓＲＮＡはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に４つ以下（即ち、４、３、２、１つ、又は０の）非修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本ｄｓＲＮＡのセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態において、本ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態において、本ｄｓＲＮＡのセンス鎖のヌクレオチドの全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、デオキシ−ヌクレオチド、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定ヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’−ホスフェートを含むヌクレオチド、及び５’−ホスフェート模倣体を含む、例えばビニルホスフェートを含むヌクレオチドからなる群から選択される。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、２’−Ｏ−メチル及び２’フルオロ修飾からなる群から選択される。
特定の実施形態において、本発明のいずれかの二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｓｅｎｓｅ）鎖は、８つ以下の２’−フルオロ修飾、７つ以下の２’−フルオロ修飾、６つ以下の２’−フルオロ修飾、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、３つ以下の２’−フルオロ修飾、２つ以下の２’−フルオロ修飾、１つ以下の２’−フルオロ修飾、又は１つ以下の２’−フルオロ修飾を含む。他の実施形態において、本発明のいずれかの二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス（ｓｅｓｅｎｓｅ）鎖は、６つ以下の２’−フルオロ修飾、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、３つ以下の２’−フルオロ修飾、２つ以下の２’−フルオロ修飾、１つ以下の２’−フルオロ修飾、又は１つ以下の２’−フルオロ修飾を含む。
一実施形態において、本二本鎖ＲＮＡｉ剤は少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に含む。一実施形態において、本二本鎖ＲＮＡｉ剤は６〜８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
相補性領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、又は２１ヌクレオチド長であってもよい。
特定の実施形態において、相補性領域は１９〜２１ヌクレオチド長又は２１〜２３ヌクレオチド長であってもよい。
特定の実施形態において、本二本鎖ＲＮＡｉ剤の各鎖は３０ヌクレオチド長以下である。特定の実施形態において、本二本鎖ＲＮＡｉ剤は少なくとも１５ヌクレオチド長である。
特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖は少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。特定の実施形態において、少なくとも一方の鎖は少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
特定の実施形態において、本二本鎖ＲＮＡｉ剤はリガンドを更に含む。特定の実施形態において、リガンドはｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。特定の実施形態において、リガンドはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。特定の実施形態において、リガンドは、一価、二価、又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合した１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。特定の実施形態において、リガンドは、
Figure 2018519797
 である。
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、以下の概略図
Figure 2018519797
 に示されるとおりのリガンドにコンジュゲートされ、及び、式中ＸはＯ又はＳである。
一実施形態において、ＸはＯである。
一実施形態において、センス配列及びアンチセンス配列は、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに列挙される配列のうちのいずれか１つから選択される。
一実施形態において、相補性領域は、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つからなる。
一実施形態において、Ｆ１２の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤は、ＡＤ−６６１７０、ＡＤ−６６１７３、ＡＤ−６６１７６、ＡＤ−６６１２５、ＡＤ−６６１７２、ＡＤ−６６１６７、ＡＤ−６６１６５、ＡＤ−６６１６８、ＡＤ−６６１６３、ＡＤ−６６１１６、ＡＤ−６６１２６、及びＡＤ−６７２４４からなる群から選択される。別の実施形態において、Ｆ１２の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤はＡＤ−６７２４４である。
一実施形態において、ＫＬＫＢ１の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤は、ＡＤ−６５０７７、ＡＤ−６５１７０、ＡＤ−６５１０３、ＡＤ−６５０８３、ＡＤ−６５０８７、ＡＤ−６５１４９、ＡＤ−６４６５２、ＡＤ−６５１６２、ＡＤ−６５１５３、ＡＤ−６５０８４、ＡＤ−６５０９９、及びＡＤ−６６９４８からなる群から選択される。別の実施形態において、ＫＬＫＢ１の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤はＡＤ−６６９４８である。
一実施形態において、ＫＮＧ１の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤は、ＡＤ−６６２５９、ＡＤ−６６２６１、ＡＤ−６６２６２、ＡＤ−６６２６３、ＡＤ−６６３４、及びＡＤ−６７３４４からなる群から選択される。別の実施形態において、ＫＮＧ１の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤はＡＤ−６７３４４である。
一態様において、本発明は、ＫＬＫＢ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む細胞を提供する。一態様において、本発明は、Ｆ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む細胞を提供する。更なる態様において、本発明は、ＫＮＧ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む細胞を提供する。
一態様において、本発明は、ＫＬＫＢ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖をコードするベクターを提供する。別の態様において、本発明は、Ｆ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖をコードするベクターを提供する。更なる態様において、本発明は、ＫＮＧ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖をコードするベクターを提供する。
一態様において、本発明は、ＫＬＫＢ１遺伝子の発現を阻害するための、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤又はベクターを含む医薬組成物を提供する。別の態様において、本発明は、Ｆ１２遺伝子の発現を阻害するための、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤又はベクターを含む医薬組成物を提供する。更なる態様において、本発明は、ＫＮＧ１遺伝子の発現を阻害するための、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤又はベクターを含む医薬組成物を提供する。
本明細書に提供される医薬組成物は非緩衝液中、例えば生理食塩水又は水中で投与されてもよく、又は緩衝液で投与されてもよく、例えば、緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、又はリン酸塩又はそれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態において、緩衝液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるとおりの二本鎖ＲＮＡｉ剤と脂質製剤とを含む。
一態様において、本発明は、細胞におけるＫＬＫＢ１発現を阻害する方法を提供する。本方法は、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤又は医薬組成物に細胞を接触させる工程と；ＫＬＫＢ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって細胞を維持し、それによって細胞におけるＫＬＫＢ１遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。
別の態様において、本発明は、方法、細胞におけるＦ１２発現を提供する。本方法は、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤又は医薬組成物に細胞を接触させる工程と；Ｆ１２遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって細胞を維持し、それによって細胞におけるＦ１２遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。
更なる態様において、本発明は、方法、細胞におけるＫＮＧ１発現を提供する。本方法は、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤又は医薬組成物に細胞を接触させる工程と；ＫＮＧ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって細胞を維持し、それによって細胞におけるＫＮＧ１遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。
一実施形態において、細胞はヒト対象などの対象の体内にある細胞である。
一実施形態において、ＫＬＫＢ１発現は、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％阻害される。
一実施形態において、Ｆ１２発現は、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％阻害される。
一実施形態において、ＫＮＧ１発現は、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％阻害される。
一態様において、本発明は、接触活性化経路遺伝子の発現の低下から利益を受け得る疾患又は障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤又は医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療する工程を含む。
一実施形態において、この接触活性化経路遺伝子はＫＬＫＢ１である。別の実施形態において、この接触活性化経路遺伝子はＦ１２である。更に別の実施形態において、この接触活性化経路遺伝子はＫＮＧ１である。
別の態様において、本発明は、接触活性化経路遺伝子の発現の低下から利益を受け得る疾患又は障害を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤又は医薬組成物の予防有効量を対象に投与し、それによって接触活性化経路遺伝子の発現の低下から利益を受け得る障害を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。
一実施形態において、この接触活性化経路遺伝子はＫＬＫＢ１である。別の実施形態において、この接触活性化経路遺伝子はＦ１２である。更に別の実施形態において、この接触活性化経路遺伝子はＫＮＧ１である。一実施形態において、この接触活性化経路遺伝子はＦ１２であり、及び本方法は、ＫＬＫＢ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を更に含む。別の実施形態において、この接触活性化経路遺伝子はＦ１２であり、及び本方法は、ＫＮＧ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を更に含む。
一実施形態において、対象に二本鎖ＲＮＡｉを投与すると、ブラジキニンレベルの低下又は凝固第ＸＩＩ因子活性の低下が生じる。
一実施形態において、障害は、血栓形成傾向、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、フレッチャー（Ｆｌｅｃｔｃｈｅｒ）因子欠乏症、又は本態性高血圧症などの接触活性化経路関連疾患である。
特定の実施形態において、少なくとも１つの症状は血管浮腫発作又は血栓形成である。
一実施形態において、対象はヒトである。
一実施形態において、本方法は、抗ＫＬＫＢ１抗体、又はその抗原結合断片を対象に投与する工程を更に含む。
一実施形態において、本方法は、対象のブラジキニン及び／又は凝固第ＸＩＩ因子レベルを計測する工程を更に含む。
別の態様において、本発明は、対象におけるＦ１２の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、Ｆ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の治療有効量を対象に投与し、それによって対象におけるＦ１２の発現を阻害する工程を含む。
一態様において、本発明は、対象におけるＫＬＫＢ１の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、ＫＬＫＢ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の治療有効量を対象に投与し、それによって対象におけるＫＬＫＢ１の発現を阻害する工程を含む。
一態様において、本発明は、対象におけるＫＮＧ１の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、ＫＮＧ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の治療有効量を対象に投与し、それによって対象におけるＫＮＧ１の発現を阻害する工程を含む。
一態様において、本発明は、血栓形成傾向を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、Ｆ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、又はＦ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療する工程を含む。
別の態様において、本発明は、血栓形成傾向を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、Ｆ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、又はＦ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物の予防有効量を対象に投与し、それによって対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。
一実施形態において、本方法は、ＫＬＫＢ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を更に含む。別の実施形態において、本方法は、ＫＮＧ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を更に含む。
一態様において、本発明は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、Ｆ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、又はＦ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療する工程を含む。
別の態様において、本発明は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、Ｆ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、又はＦ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物の予防有効量を対象に投与し、それによって対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。
一実施形態において、本方法は、ＫＬＫＢ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を更に含む。別の実施形態において、本方法は、ＫＮＧ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を更に含む。
別の態様において、本発明は、血栓形成リスクのある対象の血栓形成を予防する方法を提供する。本方法は、Ｆ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、又はＦ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物の予防有効量を対象に投与し、それによって血栓形成リスクのある対象の血栓形成を阻害する工程を含む。
一実施形態において、血栓形成リスクのある対象は接触活性化経路関連疾患又は障害を有する。
一実施形態において、接触活性化経路関連疾患は血栓形成傾向である。別の実施形態において、接触活性化経路関連疾患は遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）である。
他の実施形態（ｅｍｂｏｄｍｅｎｔｓ）において、接触活性化経路関連疾患はフレッチャー（Ｆｌｅｃｔｃｈｅｒ）因子欠乏症又は本態性高血圧症である。
一実施形態において、血栓形成リスクのある対象は、外科患者；内科患者；妊娠中の対象；分娩後の対象；血栓の既往がある対象；ホルモン補充療法を受けている対象；長時間座っている対象；及び肥満の対象からなる群から選択される。
一実施形態において、本方法は、ＫＬＫＢ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を更に含む。別の実施形態において、本方法は、ＫＮＧ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を更に含む。
別の態様において、本発明は、遺伝性血管浮腫（ｈｅｒｉｄｉｔａｒｙ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ）（ＨＡＥ）を有する対象の血管浮腫発作を予防する方法を提供する。本方法は、Ｆ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、又はＦ１２を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物の予防有効量を対象に投与し、それによって血管浮腫発作を予防する工程を含む。
一実施形態において、本方法は、ＫＬＫＢ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を更に含む。別の実施形態において、本方法は、ＫＮＧ１を標的とする本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を更に含む。
野生型マウスにおける単回皮下１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ用量の指示薬剤の投与７〜１０日後のＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡ抑制を示すグラフである。 野生型マウスにおける単回皮下１ｍｇ／ｋｇ用量又は単回３ｍｇ／ｋｇ用量、又は単回１ｍｇ／ｋｇ用量又は単回１０ｍｇ／ｋｇ用量の指示薬剤の投与７〜１０日後のＦ１２ ｍＲＮＡ抑制を示すグラフである。 野生型マウスにおける単回皮下１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ用量の指示薬剤の投与７〜１０日後のＫＮＧ１ ｍＲＮＡ抑制を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６６９４８及びカプトプリルを投与したマウスの投与後７日目における血中エバンスブルー色素量を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６６９４８及びカプトプリルを投与したマウスの投与後７日目における腸内エバンスブルー色素量を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６６９４８及びカプトプリルを投与したマウスの投与後７日目における肝臓のＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡ抑制を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６６９４８及びカプトプリルを投与したマウスにおける投与後７日目の腸の相対透過性を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４及びカプトプリルを投与したマウスの投与後７日目における血中エバンスブルー色素量を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４及びカプトプリルを投与したマウスの投与後７日目における腸内エバンスブルー色素量を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４及びカプトプリルを投与したマウスの投与後７日目における肝臓のＦ１２ ｍＲＮＡ抑制を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４及びカプトプリルを投与したマウスにおける投与後７日目の腸の相対透過性を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７３４４及びカプトプリルを投与したマウスの投与後７日目における血中エバンスブルー色素量を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７３４４及びカプトプリルを投与したマウスの投与後７日目における腸内エバンスブルー色素量を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７３４４及びカプトプリルを投与したマウスの投与後７日目における肝臓のＫＮＧ１ ｍＲＮＡ抑制を示すグラフである。 単回０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７３４４及びカプトプリルを投与したマウスにおける投与後７日目の腸の相対透過性を示すグラフである。 ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする指示二本鎖ＲＮＡｉ剤の修飾ヌクレオチド配列を示す。Ｆは２’−フルオロヌクレオチド修飾である；ＯＭｅは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチド修飾である；及びｓはホスホロチオエート結合である。図は掲載順にそれぞれ配列番号２２８５〜２３０２を開示する。 Ｆ１２遺伝子を標的とする指示二本鎖ＲＮＡｉ剤の修飾ヌクレオチド配列を示す。Ｆは２’−フルオロヌクレオチド修飾である；ＯＭｅは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチド修飾である；及びｓはホスホロチオエート結合である。図は掲載順にそれぞれ配列番号２３０３〜２３２０を開示する。 ＫＮＧ１遺伝子を標的とする指示二本鎖ＲＮＡｉ剤の修飾ヌクレオチド配列を示す。Ｆは２’−フルオロヌクレオチド修飾である；ＯＭｅは２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチド修飾である；及びｓはホスホロチオエート結合である。図は掲載順にそれぞれ配列番号２３２１〜２３３２を開示する。 単回０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４を単回１０ｍｇ／ｋｇ用量のＣ１−ＩＮＨ標的化ｄｓＲＮＡ剤と併用して投与したマウスの投与後７日目における耳内エバンスブルー色素量を示すグラフである。エラーバー＝標準偏差。 単回皮下０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４を単回１０ｍｇ／ｋｇ用量のＣ１−ＩＮＨ標的化ｄｓＲＮＡ剤と併用した投与後７日目における用量依存的Ｆ１２ ｍＲＮＡ抑制を示すグラフである。 単回３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４を皮下（ｓｕｂｃｕｔａｅｏｕｌｓｙ）投与した雌カニクイザルの血漿中Ｆ１２タンパク質抑制を示すグラフである。示される血漿Ｆ１２レベルは、平均投与前ベースラインＦ１２タンパク質レベルに対して正規化した相対Ｆ１２タンパク質レベルである。エラーバー＝標準偏差。 単回０．５ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４又はＡＤ−７４８４１のいずれかを投与した野生型マウスの血漿中Ｆ１２タンパク質抑制を示すグラフである。 ５’末端修飾が指示薬剤のインビボ有効性に及ぼす効果を示すグラフである。
本発明は、接触活性化経路遺伝子（即ち、カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）遺伝子、“第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）遺伝子、又はキニノーゲン１（ＫＮＧ１）遺伝子）のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断を生じさせるｉＲＮＡ組成物を提供する。この遺伝子は、細胞内、例えばヒトなどの対象の体内にある細胞内にあり得る。これらのｉＲＮＡを使用すると、哺乳動物において対応する遺伝子（ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子）のｍＲＮＡを標的化して分解することが可能になる。
本発明のＲＮＡｉ剤は、ヒトＫＬＫＢ１遺伝子のタンパク質コード領域及び３’ＵＴＲ領域を、この遺伝子のうち他の哺乳類種のＫＬＫＢ１オルソログ（ｏｔｈｏｌｏｇｓ）で保存されている部分を含め、標的化するように設計されている。理論によって制限されることは意図しないが、前述の特性の組み合わせ又は部分的な組み合わせ並びにこれらのＲＮＡｉ剤における特定の標的部位及び／又は特定の修飾が、本発明のＲＮＡｉ剤に有効性、安定性、効力、持続性、及び安全性の向上を付与するものと考えられる。
本発明のｉＲＮＡは、約３０ヌクレオチド長以下、例えば、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含むことができ、この領域は、接触活性化経路遺伝子、即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。
特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、接触活性化経路遺伝子、即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な少なくとも１９連続ヌクレオチドの領域を有する、より長い長さ、例えば最長６６ヌクレオチド、例えば、３６〜６６、２６〜３６、２５〜３６、３１〜６０、２２〜４３、２７〜５３ヌクレオチド長を含み得るＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。より長い長さのアンチセンス鎖を有するこれらのｉＲＮＡは、好ましくは２０〜６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含み、これらのセンス鎖とアンチセンス鎖とは１８〜３０連続ヌクレオチドの二本鎖を形成する。
本発明者らは、インビトロ及びインビボアッセイを用いて、接触活性化経路遺伝子を標的とするｉＲＮＡがＲＮＡｉを強力に媒介し、接触活性化経路遺伝子、即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子の発現の大幅な阻害をもたらし得ることを実証した。本発明者らはまた、本発明のＲＮＡｉ剤が細胞質及びリソソーム（ｌｙｓｏｓｍｅ）で非常に安定していることも実証した。従って、これらのｉＲＮＡを含む方法及び組成物は、接触活性化経路関連疾患又は障害、例えば、血栓形成傾向、ＨＡＥを有する対象の治療、及び接触活性化経路関連疾患又は障害を有する対象又は接触活性化経路関連疾患又は障害を発症するリスクがある対象の少なくとも１つの症状の予防に有用である。
従って、本発明はまた、接触活性化経路遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断を生じさせるｉＲＮＡ組成物を使用した、接触活性化経路遺伝子の発現を阻害し又は低下させることから利益を受け得る障害、例えば、血栓形成傾向又は遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）などの接触活性化経路関連疾患を有する対象の治療方法も提供する。
本発明のｉＲＮＡの極めて低い投薬量は、特に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を特異的且つ効率的に媒介して対応する遺伝子（接触活性化経路遺伝子）の発現の十分な阻害をもたらすことができる。
以下の詳細な説明は、ｉＲＮＡを含有する組成物をどのように作製及び使用して接触活性化経路遺伝子（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子）の発現を阻害するか、並びに接触活性化経路遺伝子（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子）の発現の阻害及び／又は低下から利益を受け得る疾患及び障害を有する対象を治療するための組成物、使用、及び方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語がまず定義される。更に、変数の値又は値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されることに留意されたい。
冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（即ち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は２つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。
「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜を含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」という語句を意味するために本明細書において使用され、この語句と同義的に使用される。
「又は」という用語は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、「及び／又は」という用語を意味するために本明細書において使用され、この用語と同義的に使用される。
数値又は数値系列の前の用語「少なくとも」は、用語「少なくとも」の隣りの数、及び文脈から明らかなとおりの論理的に含まれ得る後続の全ての数又は整数を含むものと理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチドの核酸分子のうちの少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチドが指示される特性を有することを意味する。少なくともが数値系列又は範囲の前に存在する場合、「少なくとも」はその系列又は範囲にある数の各々を修飾し得ることが理解される。
本明細書で使用されるとき、範囲は上限及び下限の両方を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「プレカリクレイン」及び「ＫＬＫＢ１」と同義的に用いられる「カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１」は、チモーゲン型のカリクレイン、プレカリクレインをコードする天然に存在する遺伝子を指す。血漿プレカリクレインはＦ１２ａによって血漿カリクレイン（活性カリクレインとも称される）に変換され、タンパク質分解によって高分子量キニノーゲンからブラジキニンを放出し、Ｆ１２を活性化する。ブラジキニンは、血管透過性を促進するペプチドであり、ＨＡＥ患者に高レベルで存在する。ＫＬＫＢ１遺伝子の参照配列のアミノ酸及び完全コード配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７８１９１７９７（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿０００８９２．３；配列番号１；配列番号２）を参照し得る。ヒトＫＬＫＢ１遺伝子の哺乳類オルソログについては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５４４４３６０７２（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＸＭ＿００５５５６４８２、カニクイザル；配列番号７及び配列番号８）；ＧＩ：３８０８０２４７０（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＪＵ３２９３５５、アカゲザル）；ＧＩ：２３６４６５８０４（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿００８４５５、マウス；配列番号３及び配列番号４）；ＧＩ：１６２１３８９０４（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿０１２７２５、ラット；配列番号５及び配列番号６）を参照し得る。
ＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡ配列の更なる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、及びＯＭＩＭを用いて容易に利用可能である。
本明細書で使用されるとき、用語「凝固第ＸＩＩ因子」、「ＦＸＩＩ」、「Ｆ１２」、「活性Ｆ１２」、及び「Ｆ１２ａ」と同義的に用いられる「第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）」は、チモーゲン型のＦ１２ａをコードする天然に存在する遺伝子を指す。Ｆ１２ａは、セリンプロテアーゼ（又はセリンエンドペプチダーゼ）クラスの酵素（ＥＣ３．４．２１．３８）であり、プレカリクレインを切断してカリクレインを形成し、それが続いて高分子量キニノーゲンからブラジキニンを放出してＦ１２を活性化させる。Ｆ１２遺伝子の参照配列のアミノ酸及び完全コード配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：１４５２７５２１２（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿０００５０５；配列番号９；配列番号１０）を参照し得る。ヒトＦ１２遺伝子の哺乳類オルソログについては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５４４４４１２６７（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＸＭ＿００５５５８６４７、カニクイザル；配列番号１１及び配列番号１２）；ＧＩ：８０５２９９４７７（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿０２１４８９、マウス；配列番号１３及び配列番号１４）；ＧＩ：６２０７８７４０（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿００１０１４００６、ラット；配列番号１５及び配列番号１６）を参照し得る。
Ｆ１２ ｍＲＮＡ配列の更なる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、及びＯＭＩＭを用いて容易に利用可能である。
本明細書で使用されるとき、用語「フィツジェラルド因子」、「ウィリアムズ−フィッツジェラルド−フロジャック（Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ−Ｆｌａｕｊｅａｃ）因子」、「高分子量キニノーゲン」（「ＨＭＷＫ」又は「ＨＫ」）、「低分子量キニノーゲン」（「ＬＭＷＫ）」、及び「ＫＮＧ１」と同義的に用いられる「キニノーゲン１」は、選択的にスプライシングされてＨＭＷＫ及びＬＭＷＫを生成する天然に存在する遺伝子を指す。ＨＭＷＫが活性カリクレインによって切断されるとブラジキニンが放出される。ＫＮＧ１遺伝子の参照配列のアミノ酸及び完全コード配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：２６２０５０５４５（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿００１１６６４５１；配列番号１７；配列番号１８）を参照し得る。ヒトＫＮＧ１遺伝子の哺乳類オルソログについては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５４４４１０５５０（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＸＭ＿００５５４５４６３、カニクイザル；配列番号１９及び配列番号２０）；ＧＩ：１５６２３１０２８（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿００１１０２４０９、マウス；配列番号２１及び配列番号２２）；ＧＩ：８０８６１４００（ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＭ＿０１２６９６、ラット；配列番号２３及び配列番号２３）を参照し得る。
ＫＮＧ１ ｍＲＮＡ配列の更なる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、及びＯＭＩＭを用いて容易に利用可能である。
簡単にするため、本明細書で使用されるとき、特記されない限り、「接触活性化経路遺伝子」は、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子を指す。
本明細書で使用されるとき、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含め、接触活性化経路遺伝子の転写時に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した一部分を指す。一実施形態において、配列の標的部分は、少なくとも、接触活性化経路遺伝子の転写時に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の当該部分又はその近傍におけるｉＲＮＡ介在性切断の基質として働くのに十分な長さであり得る。一実施形態において、標的配列は接触活性化経路遺伝子のタンパク質コード領域内にある。別の実施形態において、標的配列は接触活性化経路遺伝子の３’ＵＴＲ内にある。
標的配列は、約９〜３６ヌクレオチド長、例えば約１５〜３０ヌクレオチド長であってもよい。例えば、標的配列は、約１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、標的配列は約１９〜約３０ヌクレオチド長である。他の実施形態において、標的配列は約１９〜約２５ヌクレオチド長である。なおも他の実施形態において、標的配列は約１９〜約２３ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、標的配列は約２１〜約２３ヌクレオチド長である。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であると考えられる。
本明細書で使用されるとき、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて示される配列によって表されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」はそれぞれ、一般に、それぞれ、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語は、以下に更に詳述されるように、修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ）も指し得ることが理解されよう（例えば表２を参照）。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性をそれほど変化させずに他の部分によって置換されてもよいことを十分に認識している。例えば、限定はされないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドが、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明において特徴づけられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換されてもよい。別の例では、オリゴヌクレオチド中のいずれかの箇所のアデニン及びシトシンが、それぞれグアニン及びウラシルで置換されて、標的ｍＲＮＡとのＧ−Ｕゆらぎ塩基対合が形成され得る。このような置換部分を含有する配列は、本発明に取り上げられる組成物及び方法に好適である。
本明細書において同義的に使用される「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、ＲＮＡを含有し、且つＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的化された切断を仲介する剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスによってｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象中の細胞内でのＫＬＫＢ１遺伝子の発現を調節する（例えば阻害する）。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば接触活性化経路遺伝子、即ち、ＫＬＫＢ１標的ｍＲＮＡ配列、Ｆ１２標的ｍＲＮＡ配列、又はＫＮＧ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を誘導する一本鎖ＲＮＡを含む。理論に制約されるのを望むものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ここで、１つ又は複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖が、標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ中の１つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。ここで、一態様において、本発明は、細胞中で生成され、且つ標的遺伝子、即ち、接触活性化経路遺伝子のサイレンシングをもたらすＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上記のＲＮＡｉを指すために本明細書において使用される。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞又は生物に導入される一本鎖ｓｉＲＮＡであり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２に結合し、これが、次に、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５〜３０のヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計及び試験が、米国特許第８，１０１，３４８号明細書及びＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３−８９４に記載され、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれかが、本明細書に記載されるような又はＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０；：８８３−８９４に記載される方法によって化学的に修飾される一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。
別の実施形態において、本発明の組成物、使用及び方法に使用するための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書において「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、又は「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、即ち、接触活性化経路遺伝子、即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子に対する「センス」及び「アンチセンス」配向を有することが示される、２本の逆平行で且つ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明のある実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書においてＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと呼ばれる、転写後遺伝子サイレンシング機構による、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を引き起こす。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子のそれぞれの鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、それぞれの又は両方の鎖は、１つ又は複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡｉ剤」は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含んでいてもよく；ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。
本明細書で使用されるとき、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立して、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間結合、及び／又は修飾された核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分、又は核酸塩基に対する、例えば、官能基又は原子の置換、付加又は除去を包含する。本発明の剤に使用するのに好適な修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプの分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介した所望の標的ＲＮＡの特異的な分解を可能にする任意の長さのものであってもよく、約９〜３６塩基対の長さ、例えば、約１５〜３０塩基対の長さの範囲、例えば、約１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の長さなど、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対の長さであり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であると考えられる。
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、又はそれらは別個のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が、１つのより大きい分子の一部であり、したがって、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合された場合、結合するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個又はそれ以上の不対ヌクレオチドを含み得る。
ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子によって構成される場合、それらの分子は、共有結合され得るが、共有結合されていなくてもよい。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合された場合、結合構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同じか又は異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二本鎖に存在するオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉ剤は、１つ又は複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、接触活性化経路遺伝子、即ち、ＫＬＫＢ１標的ｍＲＮＡ配列、Ｆ１２標的ｍＲＮＡ配列、又はＫＮＧ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を導く、２４〜３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼ−ＩＩＩ様酵素のダイサーによってｄｓＲＮＡがプロセシングされると、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の低分子干渉性ＲＮＡになる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次にｓｉＲＮＡが組み込まれてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）となり、そこで１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖をほどき、相補アンチセンス鎖が標的認識をガイドすることが可能になる（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡと結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて延びるか又はその逆である場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得るか；或いはオーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチド又はそれ以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組み合わせであり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は両方の末端に存在し得る。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に、１〜１０個のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に、１〜１０のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハング中のヌクレオチドの１つ又は複数が、ヌクレオシドチオリン酸で置換される。
特定の実施形態において、センス鎖又はアンチセンス鎖、又は両方におけるオーバーハングは、１０ヌクレオチドよりも長い、例えば、１〜３０ヌクレオチド、２〜３０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、又は１０〜１５ヌクレオチド長の延長した長さを含み得る。特定の実施形態において、延長オーバーハングは二本鎖のセンス鎖にある。特定の実施形態において、延長オーバーハングは二本鎖のセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態において、延長オーバーハングは二本鎖のセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態において、延長オーバーハングは二本鎖のアンチセンス鎖にある。特定の実施形態において、延長オーバーハングは二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態において、延長オーバーハングは二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態において、オーバーハング中のヌクレオチドの１つ以上がヌクレオシドチオホスフェートに置換される。特定の実施形態において、オーバーハングは自己相補的な部分を含み、従ってオーバーハングは、生理的条件下で安定なヘアピン構造を形成することが可能である。
「平滑な」又は「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の該当する末端に不対ヌクレオチドが存在しない、即ち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」ＲＮＡｉ剤は、その全長にわたって二本鎖である、即ち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤（即ち、１つのオーバーハング及び１つの平滑末端を有する剤）又は両方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤を含む。
「アンチセンス鎖」又は「ガイド鎖」という用語は、例えば、標的配列、例えば、ＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡに実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用されるとき、「相補性の領域」という用語は、本明細書において定義されるように、配列、例えば標的配列、例えば、接触活性化経路遺伝子ヌクレオチド配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列と完全には相補的でない場合、その分子の内部領域又は末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、ほとんどの許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、ｉＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端の５、４、３、２又は１つのヌクレオチド中に存在する。一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤はアンチセンス鎖にヌクレオチドミスマッチを含む。別の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤はセンス鎖にヌクレオチドミスマッチを含む。一実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端から５、４、３、２、又は１ヌクレオチド以内にある。別の実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチドにある。
本明細書で使用されるときの「センス鎖」、又は「パッセンジャー鎖」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
本明細書で使用されるとき、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、標的における、切断が生じる部位である。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した３つの塩基を含む。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した２つの塩基を含む。ある実施形態において、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０及び１１によって結合される部位で特異的に生じ、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２及び１３を含む。
本明細書で使用されるとき、特に示されない限り、「相補的な」という用語は、当業者により理解されるように、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連して記載するのに使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、所定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ここで、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間と、それに続く洗浄を含み得る（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。生物の内部で起こり得る生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定することができるであろう。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ中、例えば、ｄｓＲＮＡ中の相補的な配列は、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的な」と称され得る。しかしながら、第１の配列が、本明細書において第２の配列に対して「実質的に相補的な」と称される場合、２つの配列は、完全に相補的であり得、又はそれらの最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路を介した遺伝子発現の阻害に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大で３０塩基対の二本鎖に対するハイブリダイゼーションを行うと、それらは、１つ又は複数であるが、一般に、５つ以下、４つ以下、３つ以下又は２つ以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション後に１つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してはミスマッチとみなされないものとする。例えば、本明細書に記載する目的のために、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む場合、「完全に相補的」と称されてもよい。
本明細書で使用されるときの「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関連した上記の要求が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対及び／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含むことができ、又はこのような塩基対から完全に形成され得る。このような非ワトソン−クリック塩基対としては、限定はされないが、Ｇ：Ｕゆらぎ又はフーグスティーン型塩基対が挙げられる。
本明細書における「相補的な」、「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」という用語は、それらの使用の状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間で、一致する塩基に関連して使用され得る。
本明細書で使用されるとき、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又は３’ＵＴＲを含む目的のｍＲＮＡ（例えば、接触活性化経路遺伝子をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＫＬＫＢ１遺伝子をコードするｍＲＮＡの連続する部分と実質的に相補的である場合、ＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
従って、一部の実施形態において、本明細書に開示されるセンス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチドは標的接触活性化経路遺伝子配列と完全に相補的である。
一実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは標的ＫＬＫＢ１配列と完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは標的ＫＬＫＢ１配列と実質的に相補的であり、配列番号１及び２のいずれか一方、又は配列番号１及び２のいずれか一方の断片のヌクレオチド配列の対応する領域とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは標的ＫＬＫＢ１配列と実質的に相補的であり、表３、４、１９Ａ、又は１９Ｂのいずれか１つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つ、又は表３、４、１９Ａ、又は１９Ｂのいずれか１つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの断片とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドと実質的に相補的なセンス鎖であって、次にはそのアンチセンスポリヌクレオチドが標的ＫＬＫＢ１配列と相補的であるセンス鎖を含み、表３、４、１９Ａ、又は１９Ｂのいずれか１つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つ、又は表３、４、１９Ａ、又は１９Ｂのいずれか１つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの断片とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは標的Ｆ１２配列と完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは標的Ｆ１２配列と実質的に相補的であり、配列番号９又は１０、又は配列番号９又は１０の断片のヌクレオチド配列の対応する領域とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態において、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドは標的Ｆ１２配列と実質的に相補的であり、表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つ、又は表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの断片とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドと実質的に相補的なセンス鎖であって、次にはそのアンチセンスポリヌクレオチドが標的Ｆ１２配列と相補的であるセンス鎖を含み、表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つ、又は表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの断片とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本明細書に開示されるセンス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチドは標的ＫＮＧ１配列と完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるセンス鎖ポリヌクレオチド及び／又はアンチセンスポリヌクレオチドは標的ＫＮＧ１配列と実質的に相補的であり、配列番号１７又は１８、又は配列番号１７又は１８の断片のヌクレオチド配列の対応する領域とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態において、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドは標的ＫＮＧ配列と実質的に相補的であり、１５又は１６のいずれか１つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つとその全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドと実質的に相補的なセンス鎖であって、次にはそのアンチセンスポリヌクレオチドが標的ＫＮＧ１配列と相補的であるセンス鎖を含み、表１５又は１６におけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つ、又は表１５又は１６におけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの断片とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
一般に、一部の実施形態において、それぞれの鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、それぞれの又は両方の鎖は、１つ又は複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、「ｉＲＮＡ」は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含み得る。このような修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。ｉＲＮＡ分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ｉＲＮＡ」によって包含される。
本発明の一態様において、本発明の方法及び組成物に使用するための薬剤は、アンチセンス阻害機構を介して標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ中の配列に相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに塩基対合し、翻訳機構を物理的に妨害することによって、化学量論的に翻訳を阻害し得る（Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７−３５５を参照）。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、約１５〜約３０ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な配列を有し得る。例えば、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるアンチセンス配列のいずれか１つからの少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドである配列を含み得る。
本明細書で使用されるとき、「対象」は、霊長類（ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、及びチンパンジーなど）、非霊長類（雌ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、及びクジラなど）、又はトリ（例えば、アヒル又はガチョウ）を含めた哺乳動物などの動物である。ある実施形態では、対象はヒト、例えば、本明細書に記載されるとおり、接触活性化経路遺伝子発現（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子発現、Ｆ１２遺伝子発現、及び／又はＫＮＧ１遺伝子発現）及び／又は複製の低下から利益を受け得る疾患、障害若しくは病態に関して治療又は評価されるヒト；接触活性化経路遺伝子発現の低下から利益を受け得る疾患、障害又は病態のリスクがあるヒト；接触活性化経路遺伝子発現の低下から利益を受け得る疾患、障害又は病態を有するヒト；及び／又は接触活性化経路遺伝子発現の低下から利益を受け得る疾患、障害又は病態に関して治療されるヒトである。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」又は「治療」は、限定はされないが、接触活性化経路遺伝子発現（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子発現、Ｆ１２遺伝子発現、及び／又はＫＮＧ１遺伝子発現）及び／又は接触活性化経路タンパク質産生（即ち、ＫＬＫＢ１タンパク質産生、Ｆ１２タンパク質産生、及び／又はＫＮＧ１タンパク質産生）に関連する１つ以上の症状、例えば、血栓形成傾向、例えば、血栓の形成、高ブラジキニンの存在、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、例えば遺伝性血管浮腫Ｉ型；遺伝性血管浮腫ＩＩ型；遺伝性血管浮腫ＩＩＩ型；又は高ブラジキニン値によって引き起こされる任意の他の遺伝性血管浮腫、血管浮腫発作、四肢、顔面、喉頭、上気道、腹部、体幹、及び性器（ｇｅｎｅｔｉａｌｓ）の浮腫・腫脹、前駆症状；喉頭腫脹；非そう痒性発疹；悪心；嘔吐；腹痛の軽減又は改善を含め、有益な又は所望の結果を指す。「治療」はまた、治療がない場合に予想される生存と比較したときの生存の延長も意味し得る。
対象の接触活性化経路遺伝子発現及び／又は接触活性化経路タンパク質産生或いは疾患マーカー又は症状のレベルの文脈における用語「より低い」は、かかるレベルの統計学的に有意な低下を指す。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上であってもよく、好ましくはかかる障害を有しない個体の正常範囲内として認められているレベルまで下がる。
本明細書で使用されるとき、「予防」又は「予防する」は、接触活性化経路遺伝子の発現及び／又は接触活性化経路タンパク質の産生の低下から利益を受け得る疾患、障害又はその病態に関連して使用されるとき、例えば、静脈血栓、動脈血栓、心室血栓の形成、血栓塞栓症、高ブラジキニンの存在、血管浮腫発作、遺伝性血管浮腫Ｉ型；遺伝性血管浮腫ＩＩ型；遺伝性血管浮腫ＩＩＩ型；高ブラジキニン値によって引き起こされる任意の他の遺伝性血管浮腫；四肢、顔面、喉頭、上気道、腹部、体幹、及び性器（ｇｅｎｅｔｉａｌｓ）の浮腫・腫脹、前駆症状；喉頭腫脹；非そう痒性発疹；悪心；嘔吐；腹痛などの接触活性化経路遺伝子発現の症状など、対象がかかる疾患、障害、又は病態に関連する症状を発症する可能性の低減、又はかかる疾患、障害、又は病態に関連する症状の頻度及び／又は持続期間の低減を指す。疾患、障害又は病態が発症しないこと、又はかかる疾患、障害又は病態に関連する症状の発症が（例えば、当該の疾患又は障害について臨床的に認められている尺度で少なくとも約１０％だけ）低下すること、又は症状の（例えば、数日、数週間、数ヵ月又は数年の）遅延を呈することは、有効な予防と見なされる。
本明細書で使用されるとき、用語「接触活性化経路関連疾患」は、接触活性化経路遺伝子発現（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子発現、Ｆ１２遺伝子発現、及び／又はＫＮＧ１遺伝子発現）又は接触活性化経路タンパク質産生（即ち、ＫＬＫＢ１タンパク質産生、Ｆ１２タンパク質産生、及び／又はＫＮＧ１タンパク質産生）によって引き起こされるか、又はそれに関連する疾患又は障害である。用語「接触活性化経路関連疾患」には、接触活性化経路遺伝子発現及び／又は接触活性化経路タンパク質活性の低下から利益を受け得る疾患、障害又は病態が含まれる。接触活性化経路関連疾患は遺伝的障害又は後天的障害であり得る。
接触活性化経路関連疾患の非限定的な例としては、例えば、血栓形成傾向、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）（遺伝性血管浮腫Ｉ型；遺伝性血管浮腫ＩＩ型；遺伝性血管浮腫ＩＩＩ型；又は高ブラジキニン値によって引き起こされる任意の他の遺伝性血管浮腫など）、フレッチャー因子欠乏症としても知られるプレカリクレイン欠乏症（遺伝性又は後天性）、悪性本態性高血圧症、高血圧症、末期腎疾患が挙げられる。
一実施形態において、接触活性化経路関連疾患は血栓形成傾向である。本明細書で使用されるとき、用語「血栓形成傾向」は、「凝固性亢進」又は「血栓形成促進状態」とも称され、血栓症及び血栓発生のリスクを増加させる血液凝固異常に関連する任意の疾患又は障害である。本明細書で使用されるとき、用語「血栓症」は、循環系の一部における血液の局所的凝固又は血餅化（「血栓」又は「凝血塊」の形成）の過程を指す。血栓形成傾向は、遺伝性、後天性、又は環境条件に基づく結果であり得る。例示的な遺伝性血栓形成傾向としては、遺伝性アンチトロンビン欠乏症、遺伝性プロテインＣ欠乏症、遺伝性プロテインＳ欠乏症、遺伝性第Ｖ因子ライデン血栓形成傾向、及びプロトロンビン（第ＩＩ因子）Ｇ２０２１０Ａが挙げられる。例示的な後天性血栓形成傾向としては、抗リン脂質症候群が挙げられる。後天性／環境による後天性の血栓形成傾向は、例えば、外傷、骨折、手術、例えば整形外科手術、腫瘍外科手術、経口避妊薬の使用、ホルモン補充療法、妊娠、産褥、凝固性亢進（ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕａｂｉｌｉｔｙ）、血栓既往、加齢、固定化（例えば、３日間を超える床上安静）、長時間移動、メタボリックシンドローム、及び大気汚染の結果であり得る（例えば、Ｐｒｅｖｉｔａｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ ９：１２０を参照のこと）。従って、「血栓形成リスクのある対象」には、外科患者（例えば、一般外科手術、口腔外科手術、整形外科手術（例えば、人工膝関節又は股関節置換術）、外傷外科手術、腫瘍外科手術を受ける対象）；内科患者（例えば、不動化疾患を有する対象、例えば、３日間を超える床上安静の対象及び／又は静脈内カテーテルの長期使用対象；心房細動を有する対象；高齢対象；腎機能障害を有する対象；人工心臓弁を有する対象；心不全を有する対象；癌を有する対象）；妊娠中の対象；分娩後の対象；血栓の既往を有する対象；ホルモン補充療法を受けている対象；飛行機又は自動車などで長時間座っている対象；及び肥満の対象が含まれる。
一実施形態において、接触活性化経路関連疾患は遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）である。本明細書で使用されるとき、「遺伝性血管浮腫」は、用語「ＨＡＥ」と同義的に用いられ、患者に反復性浮腫・腫脹を引き起こすＣ１インヒビター（Ｃ１ＩＮＨ）、ＳＥＲＰＩＮＧ１）遺伝子又は凝固第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）遺伝子の突然変異によって引き起こされる常染色体優性障害を指す。ＨＡＥの典型的な症状としては、腕、脚、手、足、顔、舌及び喉頭、腹部、体幹、性器の重篤な腫脹、悪心、嘔吐、腹痛、及び非そう痒性発疹（ｎｏｎｐｒｉｕｒｉｃ ｒａｓｈ）が挙げられる。ＨＡＥ発作又はエピソードの間はブラジキニンペプチド値の上昇が認められる。
別の実施形態において、接触活性化経路関連疾患はプレカリクレイン欠乏症である。
別の実施形態において、接触活性化経路関連疾患は悪性本態性高血圧症である。
別の実施形態において、接触活性化経路関連疾患は高血圧症である。
別の実施形態において、接触活性化経路関連疾患は末期腎疾患である。
「治療有効量」は、本明細書で使用されるとき、ＨＡＥ及び／又は接触活性化経路関連疾患を有する対象を治療するため患者に投与したとき、疾患の治療を（例えば既存の疾患又は疾患の１つ以上の症状を減弱させ、改善し又は維持することにより）生じさせるのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、この剤の投与方法、疾患及びその重症度並びに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、接触活性化経路遺伝子発現によって媒介される病理学的過程のステージ、存在する場合には先行又は併用治療の種類、及び治療しようとする患者の他の個別的な特性に応じて異なり得る。
「予防有効量」は、本明細書で使用されるとき、接触活性化経路関連疾患の症状をまだ起こしていない、又は示していないが、素因があり得る又はリスクがあり得る対象に投与したとき、疾患又は疾患の１つ以上の症状を予防し又は改善するのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。疾患の改善には、疾患の経過を減速させ、又は後に発症する疾患の重症度を低減することが含まれる。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、この剤の投与方法、疾患のリスクの程度、及び病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、存在する場合には先行又は併用治療の種類、及び治療しようとする患者の他の個別的な特性に応じて異なり得る。
「治療有効量」又は「予防有効量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」はまた、任意の治療に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で何らかの所望の局所作用又は全身作用を生じさせるＲＮＡｉ剤の量も含む。本発明の方法で用いられるＲＮＡｉ剤は、かかる治療に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比を生じさせるのに十分な量で投与され得る。
用語「試料」は、本明細書で使用されるとき、対象から採取された類似の体液、細胞、又は組織、並びに対象の体内に存在する体液、細胞、又は組織の集合を含む。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料には、組織、臓器又は局所領域からの試料が含まれ得る。例えば、試料は、特定の臓器、臓器の一部、又はそれらの臓器内にある体液若しくは細胞に由来し得る。特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓又は肝臓の特定の部分又は例えば肝細胞などの肝臓内の特定の種類の細胞）、網膜又は網膜の一部（例えば、網膜色素上皮）、中枢神経系又は中枢神経系の一部（例えば、脳室又は脈絡叢）、又は膵臓又は膵臓の特定の細胞又は一部に由来し得る。一部の実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得た脳脊髄液を指す。好ましい実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から採取した血液又は血漿を指す。更なる実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象に由来する肝組織（又はその部分的構成要素）又は網膜組織（又はその部分的構成要素）を指す。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、接触活性化経路遺伝子（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子）の発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。一実施形態において、本ｉＲＮＡ剤は、接触活性化経路関連疾患、例えば血栓形成傾向又は遺伝性血管浮腫を有するか、又は接触活性化経路関連疾患、例えば血栓形成傾向、又は血管浮腫発作を発症するリスクがある対象、例えばヒトなどの哺乳動物の体内の細胞など、細胞における接触活性化経路遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。このｄｓＲＮＡは、接触活性化経路遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。この相補性領域は約３０ヌクレオチド長以下（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、又は１８ヌクレオチド長以下）である。本ｉＲＮＡは、接触活性化経路遺伝子を発現する細胞と接触すると、例えばＰＣＲ又は分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法によるか、又は例えばウエスタンブロッティング法又はフローサイトメトリー法を用いた免疫蛍光分析によるなどのタンパク質ベースの方法によってアッセイしたとき、接触活性化経路遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、又はトリ接触活性化経路遺伝子）の発現を少なくとも約１０％阻害する。
ｄｓＲＮＡは、相補的な２本のＲＮＡ鎖であって、このｄｓＲＮＡが用いられることになる条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成するＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列と実質的に相補的な、概して完全に相補的な相補性領域を含む。標的配列は、接触活性化経路遺伝子（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子）の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、２本の鎖がハイブリダイズして、好適な条件下で組み合わされた際に二本鎖構造を形成するようになっている。本明細書のいずれかの箇所に記載されるように、及び当該技術分野において公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補的配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるのではなく、１つの核酸分子の自己相補的な領域として含まれることもある。
一般に、二本鎖構造は、１５〜３０塩基対の長さ、例えば、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の長さである。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であると考えられる。
同様に、標的配列の相補性の領域は、１５〜３０ヌクレオチド長、例えば、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長である。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であると考えられる。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約１５〜約２０ヌクレオチド長、又は約２５〜約３０ヌクレオチド長である。一般に、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質としての役割を果たすのに十分に長い。例えば、約２１〜２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒのための基質としての役割を果たし得ることが当該技術分野において周知である。当業者がやはり認識するように、切断のために標的化されたＲＮＡの領域は、ほとんどの場合、より大きいＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ分子であることが多い）の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向性の切断（即ち、ＲＩＳＣ経路を介した切断）のための基質であるのが可能であるほど十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。
二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能部分、例えば、約９〜３６塩基対、例えば、約１０〜３６、１１〜３６、１２〜３６、１３〜３６、１４〜３６、１５〜３６、９〜３５、１０〜３５、１１〜３５、１２〜３５、１３〜３５、１４〜３５、１５〜３５、９〜３４、１０〜３４、１１〜３４、１２〜３４、１３〜３４、１４〜３４、１５〜３４、９〜３３、１０〜３３、１１〜３３、１２〜３３、１３〜３３、１４〜３３、１５〜３３、９〜３２、１０〜３２、１１〜３２、１２〜３２、１３〜３２、１４〜３２、１５〜３２、９〜３１、１０〜３１、１１〜３１、１２〜３１、１３〜３２、１４〜３１、１５〜３１、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の二本鎖領域であることも当業者は認識するであろう。ここで、一実施形態において、所望のＲＮＡを切断のために標的とする例えば、１５〜３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる程度まで、ＲＮＡ分子又は３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子の複合体はｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡではない。別の実施形態において、接触活性化経路遺伝子の発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きいｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞中に生成されない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１つ又は複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１、２、３、又は４つのヌクレオチドを更に含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端の同等物と比べて予想外に優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組み合わせ上にあり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は両方の末端上に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されているものなど）の使用によって、更に後述されるように、当該技術分野において公知の標準的な方法によって合成され得る。
本発明のｉＲＮＡ化合物は、２工程の手順を用いて調製され得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が別個に調製される。次に、構成要素の鎖はアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。有機合成は、非天然又は修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製され得るという利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。
一態様において、本発明のｄｓＲＮＡは少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列とアンチセンス配列とを含む。センス鎖は、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに提供される配列の群から選択され、及びセンス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つの配列の群から選択される。
一実施形態において、センス鎖は、表３、４、１９Ａ、及び１９Ｂのいずれか１つに提供される配列の群から選択され、及びセンス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表３、４、１９Ａ、及び１９Ｂのいずれか１つの配列の群から選択される。この態様において、これらの２つの配列の一方は、これらの２つの配列の他方と相補的であり、これらの配列のうちの１つが、ＫＬＫＢ１遺伝子の発現において生成されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。従って、この態様では、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで一つのオリゴヌクレオチドは、表３、４、１９Ａ、及び１９Ｂのいずれか１つにおけるセンス鎖として記載され、及び第２のオリゴヌクレオチドは、表３、４、１９Ａ、及び１９Ｂのいずれか１つにおけるセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は別個のオリゴヌクレオチド上に含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は単一のオリゴヌクレオチド上に含まれる。
一実施形態において、センス鎖は、表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つのいずれか１つに提供される配列の群から選択され、及びセンス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つの配列の群から選択される。この態様において、これらの２つの配列の一方は、これらの２つの配列の他方と相補的であり、これらの配列のうちの１つが、Ｆ１２遺伝子の発現において生成されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。従って、この態様では、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで一つのオリゴヌクレオチドは、表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つにおけるセンス鎖として記載され、及び第２のオリゴヌクレオチドは、表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つにおけるセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は別個のオリゴヌクレオチド上に含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は単一のオリゴヌクレオチド上に含まれる。
一実施形態において、センス鎖は、表１５、１６、１９Ｅ、及び１９Ｆのいずれか１つに提供される配列の群から選択され、及びセンス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表１５、１６、１９Ｅ、及び１９Ｆのいずれか１つの配列の群から選択される。この態様において、これらの２つの配列の一方は、これらの２つの配列の他方と相補的であり、これらの配列のうちの１つが、ＫＮＧ１遺伝子の発現において生成されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。従って、この態様では、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで一つのオリゴヌクレオチドは、表１５、１６、１９Ｅ、及び１９Ｆのいずれか１つにおけるセンス鎖として記載され、及び第２のオリゴヌクレオチドは、表１５、１６、１９Ｅ、及び１９Ｆのいずれか１つにおけるセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は別個のオリゴヌクレオチド上に含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は単一のオリゴヌクレオチド上に含まれる。
表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７の配列の一部は修飾及び／又はコンジュゲートされた配列として記載されているが、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば本発明のｄｓＲＮＡは、修飾されていない、コンジュゲートされていない、及び／又はこれらの表に記載されるものと別様に修飾及び／又はコンジュゲートされている、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７に示される配列のいずれか１つを含み得ることは理解されるであろう。
当業者は、約２０〜約２３塩基対、例えば２１塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘導において特に有効であると認められていることを十分承知している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、他の者により、より短い又はより長いＲＮＡ二本鎖構造もまた有効であり得ることが見出されている（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４−１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２−２２６）。上記に記載した実施形態では、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のおかげで、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは最小２１ヌクレオチドの長さの少なくとも一方の鎖を含むことができる。表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つの配列の１つから一方又は両方の端部のほんの数ヌクレオチドを差し引いたより短い二本鎖が、上記に記載したｄｓＲＮＡと比べて同様に有効であり得ることは、当然予想することができる。従って、表３、４、１９Ａ、及び１９Ｂのいずれか１つの配列の１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０連続ヌクレオチド、又はそれ以上の配列を有し且つＫＬＫＢ１遺伝子の発現の阻害能が完全配列を含むｄｓＲＮＡと約５、１０、１５、２０、２５、又は３０％以下の阻害しか異ならないｄｓＲＮＡ、表９、１０，１９Ｃ、１９Ｄ、２０、及び２１のいずれか１つの配列の１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０連続ヌクレオチド、又はそれ以上の配列を有し且つＦ１２遺伝子の発現の阻害能が完全配列を含むｄｓＲＮＡと約５、１０、１５、２０、２５、又は３０％以下の阻害しか異ならないｄｓＲＮＡ、及び表１５、１６、１９Ｅ、及び１９Ｆのいずれか１つの配列の１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０連続ヌクレオチド、又はそれ以上の配列を有し且つＫＮＧ１遺伝子の発現の阻害能が完全配列を含むｄｓＲＮＡと約５、１０、１５、２０、２５、又は３０％以下の阻害しか異ならないｄｓＲＮＡが、本発明の範囲内にあるものと企図される。
加えて、表３、４、１９Ａ、及び１９Ｂのいずれか１つに提供されるＲＮＡは、ＫＬＫＢ１転写物においてＲＩＳＣ媒介性切断を受け易い部位を同定し、表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに提供されるＲＮＡは、Ｆ１２転写物においてＲＩＳＣ媒介性切断を受け易い部位を同定し、及び表１５、１６、１９Ｅ、及び１９Ｆのいずれか１つに提供されるＲＮＡは、ＫＮＧ１転写物においてＲＩＳＣ媒介性切断を受け易い部位を同定する。従って、本発明は、更に、これらの部位のうちの１つの範囲内で標的化するｉＲＮＡを特徴とする。本明細書で使用されるとき、ｉＲＮＡは、そのｉＲＮＡが当該の特定の部位の範囲内のいずれかで転写物の切断を促進する場合、ＲＮＡ転写物の特定の部位の範囲内で標的化すると言われる。かかるｉＲＮＡは、概して、接触活性化経路遺伝子における選択の配列と連続する領域から取られた追加のヌクレオチド配列とカップリングした、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに提供される配列のうちの１つに由来する少なくとも約１５連続ヌクレオチドを含むことになる。
標的配列は、一般に、約１５〜３０ヌクレオチド長であるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を導くために、この範囲内の特定の配列の適合性は様々である。本明細書に記載される様々なソフトウェアパッケージ及び指針は、任意の所与の遺伝子標的のために最適な標的配列の特定のための指針を与えるが、所与のサイズ（非限定的な例として、２１ヌクレオチド）の「ウインドウ」又は「マスク」が、標的配列としての役割を果たし得るサイズ範囲内の配列を特定するために、標的ＲＮＡ配列上に文字通りに又は比喩的に（例えば、インシリコを含む）置かれる、経験的手法を取ることもできる。完全な一連の可能な配列が、選択された任意の所与の標的サイズについて特定されるまで、初期の標的配列位置の１ヌクレオチド上流又は下流に徐々に配列「ウインドウ」を移動させることによって、次の潜在的な標的配列を特定することができる。このプロセスは、最適に機能する配列を特定するために（本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知のアッセイを用いて）特定された配列の系統的合成及び試験とともに、ｉＲＮＡ剤を用いて標的化されるとき、標的遺伝子の発現の最良の阻害を仲介するＲＮＡ配列を特定することができる。したがって、例えば、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つ中で特定される配列が、有効な標的配列を表すが、同等の又はより良好な阻害特性を有する配列を特定するために、所与の配列の１ヌクレオチド上流又は下流に徐々に「ウインドウを移動させる」ことによって、阻害効率の更なる最適化が達成され得ると考えられる。
更に、例えば、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つ中で特定される任意の配列について、より長い又はより短い配列を生成するためにヌクレオチドを系統的に加えるか又は除去し、より長い又は短いサイズのウインドウをその点から標的ＲＮＡの上方又は下方に移動させることによって生成される配列を試験することによって、更なる最適化が達成され得ると考えられる。また、当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載される阻害アッセイにおいて、新規な候補標的を生成するためのこの手法を、それらの標的配列に基づいたｉＲＮＡの有効性の試験と結び付けることで、阻害の効率が更に向上され得る。更にまた、このような最適化された配列は、例えば、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの追加又は変更、或いは発現阻害因子として分子を更に最適化するための当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に説明される他の修飾（例えば、血清安定性の又は循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜透過送達の向上、特定の位置又は細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加）によって調整され得る。
本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つ又は複数のミスマッチを含み得る。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含む。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域が相補性の領域の中心に位置しないのが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチが、相補性の領域の５’末端又は３’末端のいずれかからの最後の５ヌクレオチド内に制限されるのが好ましい。例えば、２３個のヌクレオチドのｉＲＮＡ剤について、接触活性化経路遺伝子の領域に相補的な鎖は、一般に、中央の１３個のヌクレオチド内にミスマッチを全く含まない。本明細書に記載される方法又は当該技術分野において公知の方法を用いて、標的配列とのミスマッチを含むｉＲＮＡが接触活性化経路遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを決定することができる。接触活性化経路遺伝子の発現を阻害する際のミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することは、特に、接触活性化経路遺伝子における特定の相補性の領域が集団内に多型配列変異を有することが分かっている場合に重要である。
ＩＩＩ．本発明の修飾ｉＲＮＡ
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、修飾されておらず、例えば、当該技術分野において公知の及び本明細書に記載される化学的修飾及び／又はコンジュゲートを含まない。別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性又は他の有益な特性を向上させるために化学的に修飾される。本発明の特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾される。本発明の他の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾される。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾される」本発明のｉＲＮＡは、大部分は修飾されるが、完全に修飾されるわけではなく、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、又は１つ以下の非修飾ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾されており、本ｉＲＮＡはセンス鎖に８つ以下の２’−フルオロ修飾（例えば、７つ以下の２’−フルオロ修飾、６つ以下の２’−フルオロ修飾、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、３つ以下の２’−フルオロ修飾、又は２つ以下の２’−フルオロ修飾）及びアンチセンス鎖に６つ以下の２’−フルオロ修飾（例えば、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、３つ以下の２’−フルオロ修飾、又は２つ以下の２’−フルオロ修飾）を含む。他の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾されており、ｉＲＮＡは、センス鎖に８つ以下の２’−フルオロ修飾（例えば、７つ以下の２’−フルオロ修飾、６つ以下の２’−フルオロ修飾、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、３つ以下の２’−フルオロ修飾、又は２つ以下の２’−フルオロ修飾）及びアンチセンス鎖に６つ以下の２’−フルオロ修飾（例えば、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、３つ以下の２’−フルオロ修飾、又は２つ以下の２’−フルオロ修飾）を含む。
本発明に取り上げられる核酸は、参照により本明細書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲート、逆結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ））又は３’末端修飾（コンジュゲート、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）；塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基、又は広範なパートナーと塩基対合する塩基による置換、塩基の除去（非塩基性ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基；糖修飾（例えば、２’位又は４’位で）又は糖の置換；及び／又はホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む骨格修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態に有用なｉＲＮＡ化合物の具体例としては、限定はされないが、修飾された骨格を含むか又は天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとしては、特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、及び当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない、修飾ＲＮＡは、オリゴヌクレオシドであるとみなすこともできる。ある実施形態において、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、及びヌクレオシド単位の隣接する対が、３’−５’〜５’−３’又は２’−５’〜５’−２’に結合する、反転極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９５号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３１６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書；同第６，０２８，１８８号明細書；同第６，１２４，４４５号明細書；同第６，１６０，１０９号明細書；同第６，１６９，１７０号明細書；同第６，１７２，２０９号明細書；同第６、２３９，２６５号明細書；同第６，２７７，６０３号明細書；同第６，３２６，１９９号明細書；同第６，３４６，６１４号明細書；同第６，４４４，４２３号明細書；同第６，５３１，５９０号明細書；同第６，５３４，６３９号明細書；同第６，６０８，０３５号明細書；同第６，６８３，１６７号明細書；同第６，８５８，７１５号明細書；同第６，８６７，２９４号明細書；同第６，８７８，８０５号明細書；同第７，０１５，３１５号明細書；同第７，０４１，８１６号明細書；同第７，２７３，９３３号明細書；同第７，３２１，０２９号明細書；及び米国再発行特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
内部にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；５，同第２３５，０３３号明細書；同第５，６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；５，６７７，４３７号明細書；及び同第５，６７７，４３９号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
他の実施形態において、好適なＲＮＡ模倣体が、ｉＲＮＡにおける使用のために考えられ、ここで、糖及びヌクレオシド間結合の両方、即ち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、このようなオリゴマー化合物の１つであるＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本発明のｉＲＮＡに使用するのに好適な更なるＰＮＡ化合物が、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載されている。
本発明に取り上げられるある実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡ及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを含み、特に、上述した米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、−−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［式中、天然のホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−−として表される］、及び上述した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を含む。ある実施形態において、本明細書に取り上げられるＲＮＡは、上述した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。
修飾ＲＮＡは、１つ又は複数の置換された糖部分も含有し得る。本明細書に取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位において、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含むことができ、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、式中、ｎ及びｍが、１〜約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’位において、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ｉＲＮＡの薬力学的特性を向上させる基、又はｉＲＮＡの薬物動態特性を向上させる基、及び同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。ある実施形態において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）、即ち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、本明細書において以下の実施例に記載される、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、即ち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡにおける他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’−５’結合ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらのうちのいくつかは、本出願と所有者が同一である。上記のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ｉＲＮＡのＲＮＡは、核酸塩基（当該技術分野において多くの場合、単に「塩基」と称される）修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用されるとき、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、デオキシ−チミン（ｄＴ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されるもの；Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ．８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明に取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換基が、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例示的な塩基置換であり、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合は尚更である。
上記の修飾された核酸塩基並びに他の修飾された核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、同４，８４５，２０５号明細書；同５，１３０，３０号明細書；同５，１３４，０６６号明細書；同５，１７５，２７３号明細書；同５，３６７，０６６号明細書；同５，４３２，２７２号明細書；同５，４５７，１８７号明細書；同５，４５９，２５５号明細書；同５，４８４，９０８号明細書；同５，５０２，１７７号明細書；同５，５２５，７１１号明細書；同５，５５２，５４０号明細書；同５，５８７，４６９号明細書；同５，５９４，１２１号明細書、同５，５９６，０９１号明細書；同５，６１４，６１７号明細書；同５，６８１，９４１号明細書；同５，７５０，６９２号明細書；同６，０１５，８８６号明細書；同６，１４７，２００号明細書；同６，１６６，１９７号明細書；同６，２２２，０２５号明細書；同６，２３５，８８７号明細書；同６，３８０，３６８号明細書；同６，５２８，６４０号明細書；同６，６３９，０６２号明細書；同６，６１７，４３８号明細書；同７，０４５，６１０号明細書；同７，４２７，６７２号明細書；及び同第７，４９５，０８８号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、２個の原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２個の炭素原子を結合し、それによって、二環式環系を形成する架橋を含む糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施形態において、架橋は、糖環の４’−炭素及び２’−炭素を結合する。したがって、ある実施形態において、本発明の剤は、１つ又は複数の固定核酸（ＬＮＡ）を含み得る。固定核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を結合する追加の架橋を含む。言い換えると、ＬＮＡは、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３’−ｅｎｄｏ構造的立体配置におけるリボースを有効に「固定する」。ｓｉＲＮＡに固定核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．Ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５−３１９３）。本発明のポリヌクレオチドに使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’及び２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤としては、４’−２’架橋を含む１つ又は複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。このような４’−２’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’（「拘束エチル」又は「ｃＥｔ」とも呼ばれる）及び４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（ここで、Ｒが、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである）、又は保護基（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４を参照）；及び４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられる。これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
固定核酸ヌクレオチドの調製を教示する更なる代表的な米国特許及び米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同６，５２５，１９１号明細書；同６，６７０，４６１号明細書；同６，７７０，７４８号明細書；同６，７９４，４９９号明細書；同６，９９８，４８４号明細書；同７，０５３，２０７号明細書；同７，０３４，１３３号明細書；同７，０８４，１２５号明細書；同７，３９９，８４５号明細書；同７，４２７，６７２号明細書；同７，５６９，６８６号明細書；同７，７４１，４５７号明細書；同８，０２２，１９３号明細書；同８，０３０，４６７号明細書；同８，２７８，４２５号明細書；同８，２７８，４２６号明細書；同８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；及び米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
例えば、α−Ｌ−リボフラノース及びβ−Ｄ−リボフラノースを含む１つ又は複数の立体化学的糖配置を有する上記の二環式ヌクレオシドのいずれかが調製され得る（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書で使用されるとき、「拘束エチルヌクレオチド」又は「ｃＥｔ」は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−０−２’架橋を含む二環式糖部分を含む固定核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において「Ｓ−ｃＥｔ」と呼ばれるＳ立体配置にある。
本発明のｉＲＮＡは、１つ又は複数の「立体配座的に制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’及びＣ４’炭素又はリボースのＣ３及び−Ｃ５’炭素を結合するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定した立体配置へと固定し、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を高める。リンカーは、酸素を安定性及び親和性のために最適な位置に配置するのに十分な長さを有し、リボース環の歪み（ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ）を少なくする。
上記のＣＲＮのいくつかの調製を教示する代表的な公報としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；及びＰＣＴ公報の国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレットが挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの１つ又は複数はまた、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドも含み得る。「ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド」は、「アン固定（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）核酸」（「ＵＮＡ」）修飾とも呼ばれる非環式２’−３’−ｓｅｃｏ−ヌクレオチドである。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；同第２０１３／００１１９２２号明細書；及び同第２０１１／０３１３０２０号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
潜在的に安定した修飾は、ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的に安定した修飾は、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−（アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−０−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２−ドコサノイル−ウリジン−３”−ホスフェート、逆方向塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）ｄＴ（ｉｄＴ）などを含み得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見られる。
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾としては、５’ホスフェート又は５’ホスフェート模倣体、例えばＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に対する５’末端ホスフェート又はホスフェート模倣体が挙げられる。好適なホスフェート模倣体は、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号明細書（この内容は全て、参照により本明細書に援用される）に記載される。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤としては、例えば、それぞれ全内容が参照により本明細書に援用される、２０１１年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書、又は２０１２年１１月１６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１号明細書に開示される化学的修飾を有する薬剤が挙げられる。本明細書及び米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書又はＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１号明細書に示されるように、より優れた結果が、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖中、特に、切断部位又はその近傍に導入することによって得られる。ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、或いは完全に修飾され得る。これらのモチーフの導入により、存在する場合、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の修飾パターンが中断される。ＲＮＡｉ剤は、例えば、センス鎖上で、ＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドと任意選択でコンジュゲートされ得る。得られたＲＮＡｉ剤は、より優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
より詳細には、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖が、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを有するように完全に修飾される場合、ＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が優位に向上されたことが意外にも発見された。
したがって、本発明は、インビボでの標的遺伝子（即ち、接触活性化経路遺伝子、即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、又はＫＮＧ１遺伝子）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２〜３０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、１４〜３０ヌクレオチド長、１７〜３０ヌクレオチド長、２５〜３０ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長、又は２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。
センス鎖及びアンチセンス鎖は、典型的に、本明細書において「ｉＲＮＡ剤」とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、１２〜３０ヌクレオチド対長であり得る。例えば、二本鎖領域は、１４〜３０ヌクレオチド対長、１７〜３０ヌクレオチド対長、２７〜３０ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２１ヌクレオチド対長、１７〜１９ヌクレオチド対長、１９〜２５ヌクレオチド対長、１９〜２３ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、２１〜２５ヌクレオチド対長、又は２１〜２３ヌクレオチド対長であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、及び２７ヌクレオチド長から選択される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１つ又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は両方の末端において１つ又は複数のオーバーハング領域及び／又はキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド長、例えば、２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、又は１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、１つの鎖が他の鎖より長い結果であるか、又は同じ長さの２つの鎖が互い違いになっている結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。第１及び第２の鎖がまた、例えば、ヘアピンを形成するように更なる塩基によって、又は他の非塩基リンカーによって結合され得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、限定はされないが、２−Ｆ、２’−Ｏメチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、及びそれらの任意の組み合わせなどの２’−糖修飾を含む、修飾又は非修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖における５’−又は３’−オーバーハングは、リン酸化され得る。ある実施形態において、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで、２つのヌクレオチドは、同じか又は異なり得る。一実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態において、この３’−オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態において、この３’−オーバーハングは、センス鎖中に存在する。
ＲＮＡｉ剤は、その全体的安定性に影響を与えずに、ＲＮＡｉの干渉活性を強化し得る１つのみのオーバーハングを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、或いはアンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）又はその逆に位置する平滑末端も有し得る。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論に制約されるのを望むものではないが、アンチセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングにおける非対称の平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖導入に有利に作用する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端から７位、８位、９位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から８位、９位、１０位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
更に別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドセンス鎖及び２３ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ剤の一方の末端が平滑である一方、他方の末端は、２つのヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。
２つのヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があり得、３つのうちの２つのヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有する。一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、各残基が、独立して、例えば、交互のモチーフ中で、２’−Ｏ−メチル又は３’−フルオロで修飾される。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ３）を更に含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端ヌクレオチド（１位）を起点として、第１の鎖の１〜２３位が、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドを起点として、センス鎖の１〜２３位と対合される位置において少なくとも８つのリボヌクレオチドを含んで、二本鎖を形成し；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、最大で６連続の３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、それによって、１〜６つのヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合されない１０〜３０連続ヌクレオチドを含み、それによって、１０〜３０個のヌクレオチド一本鎖５’オーバーハングを形成し；少なくともセンス鎖５’末端及び３’末端ヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖が最大の相補性のために整列される場合、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対合される塩基であり、それによって、センス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二本鎖の領域を形成し；アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、アンチセンス鎖長の少なくとも１９個のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに十分に相補的であり；センス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、モチーフのうちの少なくとも１つが、切断部位又はその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５且つ２９以下のヌクレオチド長を有する第１の鎖と、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む、３０ヌクレオチド長以下を有する第２の鎖とを含み；第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端が、平滑末端を形成し、第２の鎖は、その３’末端で第１の鎖より１〜４ヌクレオチド長く、二本鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、第２の鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、第２の鎖長の少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに十分に相補的であり、ＲＮＡｉ剤のダイサー切断（ｄｉｃｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンドを更に含む。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖も、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含むことができ、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。
１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、５’末端から１０位、１１位及び１２位の付近である。したがって、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又はアンチセンス鎖の５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；又は１３位、１４位、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二本鎖領域の長さに応じて変化し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでいてもよく；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖及びアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、センス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフ及びアンチセンス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有し、即ち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列され得る。或いは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、又は全ての３つのヌクレオチドが重複してもよい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含み得る。第１のモチーフは、鎖の切断部位又はその近傍に存在してもよく、他のモチーフは、ウイング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であり得る。本明細書における「ウイング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位又はその近傍のモチーフから離れた鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、又は少なくとも１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている。モチーフが、互いに直接隣接している場合、モチーフの化学構造は、互いに異なり、モチーフが、１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている場合、化学構造は、同じか又は異なり得る。２つ以上のウイング修飾が存在し得る。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位又はその近傍の第１のモチーフに対して１つの端部に又はリードモチーフ（ｌｅａｄ ｍｏｔｉｆ）のいずれかの側に存在し得る。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含んでいてもよく、モチーフの少なくとも１つが、鎖の切断部位又はその近傍に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様の配列で１つ又は複数のウイング修飾を含み得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端又は両方の末端に第１の１つ又は２つの末端ヌクレオチドを含まない。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端又は両方の末端の二本鎖領域内に第１の１つ又は２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウイング修飾を含む場合、ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に位置してもよく、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウイング修飾を含む場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の１つの末端に位置して、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の他方の末端に位置して、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がリードモチーフの各側に位置して、二本鎖領域中に１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有するように整列され得る。
一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが修飾され得る。各ヌクレオチドは、同じ又は異なる修飾で修飾されてもよく、この修飾は、非結合リン酸酸素及び／又は結合リン酸酸素の１つ又は複数の一方又は両方の１つ又は複数の変更；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更；「脱リン（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換；天然の塩基の修飾又は置換；及びリボース−リン酸骨格の置換又は修飾を含み得る。
核酸が、サブユニットのポリマーであるため、例えば、塩基、又はリン酸部分、又はリン酸部分の非結合Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸中の目的の位置の全てに存在し得るが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３’又は５’末端位置のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、又はその両方に存在してもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在してもよく、又はＲＮＡの一本鎖領域のみに存在してもよい。例えば、非結合Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方又は両方の末端のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよく、又は二本鎖及び一本鎖領域、特に、末端に存在してもよい。５’末端又は両方の末端が、リン酸化され得る。
例えば、安定性を高めること、オーバーハング中に特定の塩基を含むこと、又は一本鎖オーバーハング、例えば、５’又は３’オーバーハング、又はその両方に修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を含むことが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましいことがある。ある実施形態において、３’又は５’オーバーハング中の塩基の全て又は一部が、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾されてもよい。修飾は、例えば、当該技術分野において公知の修飾によるリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）又は２’−Ｏ−メチル修飾の使用、及びリン酸基の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、又は２’−フルオロで修飾される。鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロで修飾される。
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的に、センス鎖及びアンチセンス鎖に存在する。それらの２つの修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾、又は他のものであり得る。
一実施形態において、Ｎａ及び／又はＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。本明細書で使用されるときの「交互のモチーフ」という用語は、１つ又は複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、１つの鎖の交互のヌクレオチドに存在する。交互のヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ又は３つおきのヌクレオチドに１つ、又は同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ及びＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」、又は「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであり得る。
交互のモチーフに含まれる修飾のタイプは、同じか又は異なり得る。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチド上の１つのタイプの修飾を表す場合、交互のパターン、即ち、１つおきのヌクレオチドにおける修飾は、同じであってもよいが、センス鎖又はアンチセンス鎖のそれぞれが、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」「ＢＤＢＤＢＤ・・・」又は「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などの交互のモチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖における交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトされた、センス鎖における交互のモチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾の基に対応するか、その逆であるようなシフトであり得る。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合される場合、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＢＡＢＡＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＡＢＡＢＡ」から開始され得る。別の例として、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」から開始してもよく、それにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な又は部分的なシフトが存在する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンを含み、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンに対するシフトを有し、即ち、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが、アンチセンス鎖における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、その逆も同様である。センス鎖の１位は、２’−Ｆ修飾から開始してもよく、アンチセンス鎖の１位は、２’−Ｏ−メチル修飾から開始してもよい。
センス鎖及び／又はアンチセンス鎖への、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフの導入は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンを中断する。センス鎖及び／又はアンチセンス鎖に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを導入することによる、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子の対する遺伝子サイレンシング活性を意外にも高める。
一実施形態において、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフが、鎖のいずれかに導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「・・・ＮａＹＹＹＮｂ・・・」であり、ここで、「Ｙ」は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」及び「Ｎｂ」は、Ｙの修飾と異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドの修飾を表し、Ｎａ及びＮｂは、同じか又は異なる修飾であり得る。或いは、Ｎａ及び／又はＮｂは、ウイング修飾が存在する場合、存在していても又は存在していなくてもよい。
ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含み得る。ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾は、鎖のいずれかの位置の、センス鎖又はアンチセンス鎖又は両方の鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖における全てのヌクレオチドに存在してもよく；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく；又はセンス鎖又はアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じか又は異なっていてもよく、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対するシフトを有し得る。一実施形態において、二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔａｎｄｅｄ）ＲＮＡｉ剤は６〜８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は５’末端又は３’末端のいずれかに少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉは、オーバーハング領域にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを、二本鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと結合するために形成され得る。例えば、少なくとも２、３、４、又は全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合によって結合されてもよく、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと結合する更なるホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在し得る。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、及び／又はアンチセンス鎖の５’末端に存在し得る。
一実施形態において、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方において、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ、二本鎖内のミスマッチ、又はそれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域又は二本鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離又は融解（例えば、特定の対合の結合又は解離の自由エネルギーに対してであり、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を調べることであるが、類似の又は同様の分析も使用され得る）を促進する傾向に基づいて評価され得る。解離の促進に関して：Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｇ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準又は正準以外の対合（本明細書の他の箇所に記載される）が、正準な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合が、正準な対合より好ましい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択されるアンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの塩基対のうちの少なくとも１つ、及び二本鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非正準又は正準以外の対合又はユニバーサル塩基を含む対合を含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、及びｄＴからなる群から選択される。或いは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２又は３塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の第１の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
別の実施形態において、センス鎖の３’末端のヌクレオチドはデオキシチミン（ｄＴ）である。別の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドはデオキシチミン（ｄＴ）である。一実施形態では、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端にデオキシチミンヌクレオチドの短い配列、例えば２つのｄＴヌクレオチドがある。
一実施形態において、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉ）
（式中：
ｉ及びｊがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ及びｑがそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａが、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂが、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ及びｎｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ及びＹが、同じ修飾を有さず；
ＸＸＸ、ＹＹＹ及びＺＺＺがそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。好ましくは、ＹＹＹが、全て２’−Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態において、Ｎａ及び／又はＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。
一実施形態において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在し得る（例えば：６位、７位、８位、７位、８位、９位、８位、９位、１０位、９位、１０位、１１位、１０位、１１位、１２位又は１１位、１２位、１３位に存在し得る）。
一実施形態において、ｉが１であり、ｊが０であり、又はｉが０であり、ｊが１であり、又はｉ及びｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｃ）；又は
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｄ）。
センス鎖が、式（Ｉｂ）によって表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｃ）として表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｄ）として表される場合、各Ｎｂは、独立して、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５又は６である。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、Ｙ及びＺのそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。
他の実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉａ）。
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ−Ｎ’ａ−ｎｐ’３’（ＩＩ）
（式中：
ｋ及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ’及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａ’が、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’が、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ’及びＹ’が、同じ修飾を有さず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。
一実施形態において、Ｎａ’及び／又はＮｂ’は、交互のパターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；又は１３位、１４位、１５位に存在し得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位に存在する。
一実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態において、ｋが１であり、ｌが０であり、又はｋが０であり、ｌが１であり、又はｋ及びｌの両方が１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；又は
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｄ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）によって表される場合、Ｎｂ ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５又は６である。
他の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’３’（Ｉａ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’及びＺ’のそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。
センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−ヒドロキシル、又は２’−フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、特に、２’−Ｏ−メチル修飾又は２’−フルオロ修飾を表し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１のヌクレオチドである場合、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の９位、１０位及び１１位に存在するＹＹＹモチーフを含んでいてもよく；Ｙは、２’−Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフ又はＺＺＺモチーフを更に含んでいてもよく；ＸＸＸ及びＺＺＺはそれぞれ、独立して、２’−ＯＭｅ修飾又は２’−Ｆ修飾を表す。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の１１位、１２位、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでいてもよく；Ｙ’は、２’−Ｏ−メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフ又はＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを更に含んでいてもよく；Ｘ’Ｘ’Ｘ’及びＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ、独立して、２’−ＯＭｅ修飾又は２’−Ｆ修飾を表す。
上の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、及び（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、及び（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。
したがって、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含んでいてもよく、各鎖は、１４〜３０のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ ’−ｎｑ ’５’
（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａ及びＮａ ’が、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ及びＮｂ ’が、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ここで、
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、及びｎｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上に３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される。
一実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり；又はｉが１であり、ｊが０であり；又はｉが０であり、ｊが１であり；又はｉ及びｊの両方が０であり；又はｉ及びｊの両方が１である。別の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり；又はｋが１であり、ｌが０であり；ｋが０であり、ｌが１であり；又はｋ及びｌの両方が０であり；又はｋ及びｌの両方が１である。
ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の例示的な組み合わせは、以下の式を含む：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ ’−ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ−ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｄ）
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立して、１〜１０、１〜７、１〜５又は１〜４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）によって表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ及びＮｂ’の各々は、独立して、交互のパターンの修飾を含む。
ｉＲＮＡ剤が、式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ及びＮｂ ’のそれぞれは、独立して、交互のパターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）中のＸ、Ｙ及びＺのそれぞれは、互いに同じか又は異なり得る。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＹヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）又は（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＺヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）又は（ＩＩＩｄ）として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＸヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
一実施形態において、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、及び／又はＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾である。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。更に別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる（以下に記載）。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端、及び３’末端の一方又は両方で互いに結合され、任意選択で、リガンドにコンジュゲートされる。ＲＮＡｉ剤のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又はＲＮＡｉ剤のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
様々な刊行物に、本発明の方法に使用され得る多量体ＲＮＡｉ剤が記載されている。このような刊行物としては、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレット及び国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられ、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
以下により詳細に説明されるとおり、ＲＮＡｉ剤に対する１つ又は複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含むＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の１つ又は複数の特性を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに結合される。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ又は複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物（好ましくは環状の）担体で置換され得る。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系であってもよく、即ち、全ての環原子が、炭素原子であり、又は複素環系、即ち、１つ又は複数の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環状担体は、単環系であってもよく、又は２つ以上の環、例えば縮合環を含み得る。環状担体は、完全に飽和した環系であってもよく、又は１つ又は複数の二重結合を含み得る。
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは、２つの「骨格結合点」及び（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー結合点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書で使用されるときの「骨格結合点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、又は一般に、骨格、例えば、リン酸塩、又は修飾リン酸塩、例えば、硫黄を含有する、リボ核酸の骨格中への担体の組み込みに利用可能であり且つそれに適した結合を指す。「テザー結合点」（ＴＡＰ）は、ある実施形態において、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子又はヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子と異なる）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在するテザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えば、アミノ基を含み、又は一般に、構成環への別の化学成分、例えば、リガンドの組み込み又は連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を提供する。
ｉＲＮＡ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートされてもよく、この担体は、環式基又は環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル（ｐｙｒｉｄａｚｉｎｏｎｙｌ）、テトラヒドロフリル及びデカリンから選択され；好ましくは、環式基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格から選択される。
特定の具体的な実施形態において、本発明の方法において使用されるＲＮＡｉ剤は、表３、４、９、１０、１５、１６、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、１９Ｅ、１９Ｆ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに列挙される薬剤の群から選択される薬剤である。一実施形態において、この薬剤は、表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに列挙される薬剤のいずれか１つである。これらの薬剤はリガンドを更に含み得る。
ＩＶ．リガンドにコンジュゲートされたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させる１つ又は複数のリガンド、部分又はコンジュゲートをＲＮＡに化学的に結合することを含む。このような部分としては、限定はされないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）などの脂質部分が挙げられる。
一実施形態において、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化又は寿命を変化させる。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドのない種と比較して、選択された標的（例えば、分子、細胞又は細胞型）、区画（例えば、細胞又は器官の区画）、身体の組織、器官又は領域に対する向上した親和性を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸における二本鎖の対合に関与しない。
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン又はヒアルロン酸）；又は脂質などの天然の物質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの組み換え又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸は、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンである。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はα−へリックスペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、標的基、例えば、細胞又は組織標的剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、又はＲＧＤペプチド、又はＲＧＤペプチド模倣体又はアプタマーであり得る。
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ又はキレート剤（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸（ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）、アクリジン−イミダゾール複合体、Ｅｕ３＋テトラアザ大員環複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、又はＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ−ｌｉｇａｎｄ）、又は抗体、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対する特異親和性を有する分子であり得る。リガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含んでもよい。リガンドはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、又は多価マンノース、多価フコース又はアプタマーなどの非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／又は中間径フィラメントを破壊することによって、例えば、細胞骨格を破壊することによって、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取り込みを向上させ得る物質、例えば、薬剤であり得る。薬剤は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、又はミオセルビンであり得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡに結合されたリガンドは、薬物動態学的調節剤（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）（ＰＫ調節剤）としての役割を果たす。ＰＫ調節剤としては、親油性物質（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ）、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節剤としては、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基又は２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンド（例えばＰＫ調節リガンド）として本発明に適している。更に、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載される実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに好適である。
本発明のリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドへの結合分子の結合から誘導されるものなどの反応性のペンダント官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成され得る（後述される）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のいずれかを有する、合成されたリガンド、又は結合部分が結合されたリガンドと直接反応されてもよい。
本発明のコンジュゲートに使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって好都合に及び日常的に作製され得る。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの業者によって販売されている。当該技術分野において公知のこのような合成のための任意の他の手段が、それに加えて又はその代わりに用いられてもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することも公知である。
本発明の配列特異的結合ヌクレオシドを有するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド及びリガンド分子において、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体、或いは結合部分を既に有するヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に有するリガンド−ヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、或いは非ヌクレオシドリガンド含有ビルディングブロックを用いて、好適なＤＮＡ合成装置において組み立てられ得る。
結合部分を既に有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体を用いる場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が、典型的に、完了されてから、リガンド分子が、結合部分と反応されて、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドが形成される。ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は結合ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド合成に通例使用される市販の、標準的なホスホロアミダイト及び非標準的なホスホロアミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートから誘導されるホスホロアミダイトを用いて、自動合成装置によって合成される。
Ａ．脂質コンジュゲート
一態様において、リガンド又はコンジュゲートは、脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ナプロキセン又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大し、（ｂ）標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大し、及び／又は（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するのに使用され得る。
脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織へのコンジュゲートの結合を阻害すること、例えば、制御することができる。例えば、より強くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性が低く、したがって、身体から除去される可能性が低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。
好ましい実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分配されるような十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が反転され得ないほど強力でないのが好ましい。
別の好ましい実施形態において、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分配されるように、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか又は全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに又はそれに加えて使用され得る。
別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性の望ましくない細胞増殖、例えば、癌細胞を特徴とする障害を処置するのに特に有用である。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫを含む。他の例示的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は他のビタミン或いは肝細胞などの標的細胞によって取り込まれる栄養素を含む。ＨＡＳ及び低比重リポタンパク（ＬＤＬ）も含まれる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤（ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、好ましくは、らせん状細胞透過剤である。好ましくは、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、ｔａｔ又はアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。この剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチド又は擬ペプチド結合、及びＤ−アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはα−へリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性及び疎油性相を有する。
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと類似した明確な三次元構造に折り畳まれることが可能な分子である。ペプチド及びペプチド模倣体のｉＲＮＡ剤への結合は、例えば細胞認識及び吸収を強化することにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチド又はペプチド模倣体部分は、約５〜５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のアミノ酸の長さであり得る。
ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２６）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号２７）も、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を介してペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大型極性分子を運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２８）及びショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２９）は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かっている。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、又は１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどのＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４、１９９１）。細胞標的の目的のために組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に結合されたペプチド又はペプチド模倣体の例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、又はＲＧＤ模倣体などのペプチドである。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸から約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性又は直接配座特性を高めるためなどの構造修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いられ得る。
本発明の組成物及び方法において使用するためのＲＧＤペプチド部分は、直鎖状又は環状であり得、特定の組織に対する標的化を促進するために、修飾、例えば、グリコシル化又はメチル化されてもよい。ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチド模倣体は、Ｄ−アミノ酸、並びに合成ＲＧＤ模倣体を使用し得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１又はＶＥＧＦを標的とする。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌又は真菌細胞などの微生物細胞、或いはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α−へリックス直鎖状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７又はＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン又はバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））、又は１つ若しくは２つの支配的アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９又はインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物及び方法のある実施形態において、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物を更に含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、本明細書に記載されるように、インビボでの核酸の送達に有利であり、また組成物は、インビボでの治療的使用に好適である。本明細書で使用されるとき、「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝鎖状又は環状であってもよい）を有し、各炭素原子に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物それ自体である化合物；又はその一部として、１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物部分を有し、単糖単位の各々が、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝鎖状又は環状であってもよい）を有し、各炭素原子に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している化合物のいずれかを指す。代表的な炭水化物としては、糖（単糖、二糖、三糖及び約４、５、６、７、８、又は９つの単糖単位を含むオリゴ糖）、並びにデンプン、グリコーゲン、セルロース及び多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖としては、ＨＢＶ以上（例えば、ＨＢＶ、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）の糖が挙げられ；二糖及び三糖としては、２つ又は３つの単糖単位（例えば、ＨＢＶ、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）を有する糖が挙げられる。
一実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。別の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、
Figure 2018519797
Figure 2018519797
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 からなる群から選択される。
一実施形態において、単糖は、
Figure 2018519797
 などのＮ−アセチルガラクトサミンである。
本明細書に記載される実施形態において使用される別の代表的な炭水化物コンジュゲートには、限定はされないが、
Figure 2018519797
 （式ＸＸＩＩＩ）［Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドであるとき、他方は水素である］が含まれる。
本発明の特定の実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は一価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合している。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は二価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合している。本発明の更に他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は三価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合している。
一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合した１つのＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。別の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、各々が独立に複数の一価のリンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合した複数の（例えば、２、３、４、５、又は６つの）ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
一部の実施形態において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端との間が途切れのないヌクレオチド鎖によって接続された、複数の非対合ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成している１つのより大型の分子の一部であるとき、ヘアピンループ内の各非対合ヌクレオチドが独立に、一価のリンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含み得る。
ある実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、限定はされないが、ＰＫ調節剤及び／又は細胞透過性ペプチドなどの上述したような１つ又は複数の更なるリガンドを更に含む。
本発明での使用に好適な更なる炭水化物コンジュゲートは、それぞれの全内容が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ公報の国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレット及び国際公開第２０１４／１７９６２７号パンフレットに記載されるものを含む。
Ｄ．リンカー
ある実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲート又はリガンドは、切断可能又は切断不可能であり得る様々なリンカーを用いて、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合され得る。
「リンカー」又は「結合基」という用語は、化合物の２つの部分を接続し、例えば、化合物の２つの部分を共有結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合又は酸素若しくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、又は限定はされないが、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（１つ又は複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換の複素環式により中断又は終端され得る）などの原子の鎖を含み；ここでＲ８は、水素、アシル、脂肪族又は置換された脂肪族である。一実施形態において、リンカーは、約１〜２４個の原子、２〜２４、３〜２４、４〜２４、５〜２４、６〜２４、６〜１８、７〜１８、８〜１８個の原子、７−１７、８〜１７、６〜１６、７〜１６、又は８〜１６個の原子である。
切断可能な結合基は、細胞の外部では十分安定であるが、標的細胞内に入った後、切断されて、リンカーが一緒に保持する２つの部分を解放するものである。好ましい実施形態において、切断可能な結合基は、標的細胞内又は第一の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下で、対象の血液中、又は第二の参照条件（例えば、血液又は血清に見出される条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下の少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍又はそれ以上、又は少なくとも約１００倍速く切断される。
切断可能な結合基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に敏感である。一般に、切断剤は、血清又は血液中と比較して細胞内部に広く存在し、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。このような分解剤の例としては、例えば、細胞内に存在する酸化若しくは還元酵素又は還元により酸化還元切断可能な結合基を分解できるメルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質用に選択され又は基質特異性を有さない酸化還元剤、；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を形成可能な薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらす薬剤；一般的な酸として作用することにより、酸切断可能な結合基を加水分解又は分解できる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能な結合基は、ｐＨに敏感であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４である一方、平均細胞内ｐＨは、僅かに低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲内のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、ほぼ５．０の、更により酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を有することによって、細胞内部でリガンドからカチオン性脂質を放出し、又は細胞の所望の区画内へ放出するであろう。
リンカーは、特定の酵素により切断可能な、切断可能な結合基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、カチオン性脂質に結合され得る。肝細胞はエステラーゼに富んでいるため、このリンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型内と比較して、肝細胞内でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富んだ他の細胞型としては、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含むリンカーは、肝細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的とする際に使用することができる。
一般に、切断可能な候補結合基の適切性は、分解剤（又は分解条件）の候補結合基を切断する能力を試験することにより評価することができる。血液中、又は他の非標的組織との接触の際に、切断可能な候補結合基が切断に抵抗する能力を試験することも望ましいであろう。したがって、第一の条件と第二の条件との間の、切断に対する相対的な感受性を決定することができ、第一の条件は標的細胞内での切断を示すよう選択され、第二の条件は他の組織内又は生体液、例えば血液又は血清中での切断を示すよう選択される。この評価は、無細胞系内、細胞内、細胞培養物中、器官内若しくは組織培養物中、又は全動物内で行うことができる。無細胞又は培養物条件内で最初の評価を行い、全動物内での更なる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く切断される。
ｉ．酸化還元切断可能な結合基
一実施形態において、切断可能な結合基は、還元又は酸化後に切断される酸化還元切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能な候補結合基が好適な「還元的に切断可能な結合基」であるか、又は例えば特定のｉＲＮＡ部分及び特定の標的化剤との使用に好適であるかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目し得る。例えば、候補は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、又は当該技術分野において公知の試薬を用いた他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができ、これは、細胞、例えば標的細胞内で観察され得る切断の速度を模倣する。候補は血液又は血清条件を模倣するよう選択された条件下でも評価され得る。その１つにおいて、候補化合物は、血液中で約１０％以下切断される。他の実施形態において、有用な候補化合物は、血液中（又は、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
ｉｉ．リン酸塩ベースの切断可能な結合基
別の実施形態において、切断可能なリンカーは、リン酸塩ベースの切断可能な結合基を含む。リン酸塩ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する薬剤の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸塩ベースの結合基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ｉｉｉ．酸切断可能な結合基
別の実施形態において、切断可能なリンカーは、酸切断可能な結合基を含む。酸切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態において、酸切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０、又はそれ以下）のｐＨを有する酸性環境内で、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨ小器官は、酸切断可能な結合基のための切断環境を提供し得る。酸切断可能な結合基の例には、限定はされないが、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は−ＯＣ（Ｏ）で表され得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはｔ−ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ｉｖ．エステルベースの結合基
別の実施形態において、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な結合基を含む。エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼ及びアミラーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例としては、限定はされないが、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な結合基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）−で表される。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ｖ．ペプチドベースの切断基
更に別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な結合基を含む。ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な基は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを与えるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−で表され、式中、ＲＡ及びＲＢは、隣接する２つのアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物とコンジュゲートされる。本発明の組成物及び方法のリンカーとのｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの非限定的な例としては、限定はされないが、
Figure 2018519797
Figure 2018519797
Figure 2018519797
 が挙げられ、Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である。
本発明の組成物及び方法の特定の実施形態において、リガンドは、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩＩ）〜（ＸＸＸＶ）：
Figure 2018519797
 のいずれかに示される構造の群から選択される二価又は三価の分枝鎖状リンカーにコンジュゲートされ、
式中：
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃが、出現するごとに独立して、０〜２０を表し、繰返し単位は、同一又は異なっていてもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃがそれぞれ、出現するごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃが、出現するごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで１つ又は複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ”）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）のうちの１つ又は複数により中断又は終端されてもよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃがそれぞれ、出現するごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2018519797
 又はヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃが、リガンドを表し；即ち、それぞれ、出現するごとに独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり；Ｒａが、Ｈ又はアミノ酸側鎖である。三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、ＲＮＡｉ剤とともに使用されて、式（ＸＸＸＶ）：
Figure 2018519797
 のものなどの標的遺伝子の発現を阻害するのに特に有用であり、
式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃが、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。
ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価及び三価の分枝鎖状結合基の例としては、限定はされないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、及びＸＩＩＩとして上に列挙される構造が挙げられる。
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な特許としては、限定はされないが、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同４，９４８，８８２号明細書；同５，２１８，１０５号明細書；同５，５２５，４６５号明細書；同５，５４１，３１３号明細書；同５，５４５，７３０号明細書；同５，５５２，５３８号明細書；同５，５７８，７１７号明細書、同５，５８０，７３１号明細書；同５，５９１，５８４号明細書；同５，１０９，１２４号明細書；同５，１１８，８０２号明細書；同５，１３８，０４５号明細書；同５，４１４，０７７号明細書；同５，４８６，６０３号明細書；同５，５１２，４３９号明細書；同５，５７８，７１８号明細書；同５，６０８，０４６号明細書；同４，５８７，０４４号明細書；同４，６０５，７３５号明細書；同４，６６７，０２５号明細書；同４，７６２，７７９号明細書；同４，７８９，７３７号明細書；同４，８２４，９４１号明細書；同４，８３５，２６３号明細書；同４，８７６，３３５号明細書；同４，９０４，５８２号明細書；同４，９５８，０１３号明細書；同５，０８２，８３０号明細書；同５，１１２，９６３号明細書；同５，２１４，１３６号明細書；同５，０８２，８３０号明細書；同５，１１２，９６３号明細書；同５，２１４，１３６号明細書；同５，２４５，０２２号明細書；同５，２５４，４６９号明細書；同５，２５８，５０６号明細書；同５，２６２，５３６号明細書；同５，２７２，２５０号明細書；同５，２９２，８７３号明細書；同５，３１７，０９８号明細書；同５，３７１，２４１号明細書、同５，３９１，７２３号明細書；同５，４１６，２０３号明細書、同５，４５１，４６３号明細書；同５，５１０，４７５号明細書；同５，５１２，６６７号明細書；同５，５１４，７８５号明細書；同５，５６５，５５２号明細書；同５，５６７，８１０号明細書；同５，５７４，１４２号明細書；同５，５８５，４８１号明細書；同５，５８７，３７１号明細書；同５，５９５，７２６号明細書；同５，５９７，６９６号明細書；同５，５９９，９２３号明細書；同５，５９９，９２８号明細書及び同５，６８８，９４１号明細書；同６，２９４，６６４号明細書；同６，３２０，０１７号明細書；同６，５７６，７５２号明細書；同６，７８３，９３１号明細書；同６，９００，２９７号明細書；同７，０３７，６４６号明細書；同８，１０６，０２２号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
所与の化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、上記の修飾のうちの２つ以上を、単一の化合物中に又は更にはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
本発明に関連して、「キメラ」ｉＲＮＡ化合物又は「キメラ」は、少なくとも１つのモノマー単位、即ち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからそれぞれ構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含むｉＲＮＡ化合物、好ましくは、ｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、少なくとも１つの領域を含み、ここで、ＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加をｉＲＮＡに与えるように修飾される。ｉＲＮＡの更なる領域は、ＲＮａ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素のための基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮａ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大幅に高める。その結果として、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡによって同等の結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、及び必要に応じて、当該技術分野において公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、通例検出され得る。
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させるためにｉＲＮＡにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲートを行うための手順は、科学文献で入手可能である。このような非リガンド部分は、コレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）などの脂質部分を含んでいた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許が上に列挙されている。典型的なコンジュゲートプロトコルは、配列の１つ又は複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を含む。次に、適切なカップリング剤又は活性化試薬を用いて、アミノ基をコンジュゲートされた分子と反応させる。コンジュゲート反応は、固体担体に依然として結合されたＲＮＡを用いて、又は溶液相中のＲＮＡの切断の後に行うことができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により、典型的に、純粋なコンジュゲートが得られる。
Ｖ．本発明のｉＲＮＡの送達
細胞、例えば、ヒト対象（例えば、接触活性化経路遺伝子発現に関連する疾病、障害、又は病態を有する対象などのｉＲＮＡ剤を必要とする対象）などの対象中の細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの様々な方法で行うことができる。例えば、送達は、細胞を、本発明のｉＲＮＡとインビトロ又はインビボのいずれかで接触させることによって行われ得る。インビボ送達はまた、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接行われ得る。或いは、インビボ送達は、ｉＲＮＡの発現をコードし、それを導く１つ又は複数のベクターを投与することによって、間接的に行われ得る。これらの代替例は、以下に更に説明される。
一般に、核酸分子を（インビトロ又はインビボで）送達する任意の方法は、本発明のｉＲＮＡとともに使用するために適合され得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４及び国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照）。インビボ送達の場合、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮される因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、及び標的組織における送達される分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与によって、例えば、組織への直接注入又は移植によって、或いは製剤を局所的に投与することによって、最小限に抑えられ得る。処置部位への局所投与は、剤の局所濃度を最大にし、剤によって悪影響を受け得るか又は剤を分解し得る、全身組織への剤の曝露を制限し、投与されるｉＲＮＡ分子の総投与量を少なくすることができる。いくつかの研究が、ｉＲＮＡが局所投与される場合の遺伝子産物のノックダウンの成功を示している。例えば、カニクイザルの硝子体内注射によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２−１３８）及びマウスの網膜下注射（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）は両方とも、加齢性黄斑変性症の実験モデルにおける新血管形成を防ぐことを示した。更に、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内投与が腫瘍容積を減少させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、担癌マウスの生存を延長することができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０；Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注入による中枢神経系への局所送達（Ｄｏｒｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１−５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）及び鼻腔内投与による肺への局所送達（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）による成功も示している。疾病の処置のためにｉＲＮＡを全身投与するために、ＲＮＡは、修飾され得るか、或いは薬剤送達システムを用いて送達され得；両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐ役割を果たす。ＲＮＡ又は医薬担体の修飾は、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取り込みを向上させ、分解を防ぐコレステロールなどの親油基への化学的結合によって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされるＡｐｏＢに対するｉＲＮＡを、マウスに全身投与し、肝臓及び空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを得た（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８）。アプタマーへのｉＲＮＡのコンジュゲートは、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退縮を仲介することが示されている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代替的な実施形態において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、又はカチオン性送達システムなどの薬剤送達システムを用いて送達され得る。正に帯電したカチオン性送達システムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電した）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜における相互作用を向上させて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、又はポリマーは、ｉＲＮＡに結合され得るか、又はｉＲＮＡを包む小胞又はミセル（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７−１１６を参照）を形成するように誘導され得る。小胞又はミセルの形成は、全身投与される場合のｉＲＮＡの分解を更に防ぐ。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製し、投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、ＤＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１−７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、上記参照；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）、上記を参照）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、及びポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。ある実施形態において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンとともに複合体を形成する。投与のための方法及びｉＲＮＡｓ及びシクロデキストリンの医薬組成物が、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，４２７，６０５号明細書に見出され得る。
Ａ．ベクターでコードされた本発明のｉＲＮＡ
接触活性化経路遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．らの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１３号パンフレット、Ｃｏｎｒａｄの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１４号パンフレット、及びＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照）。発現は、使用される特定の構築物及び標的組織又は細胞型に応じて、一時的（およそ数時間から数週間）であるか又は持続され得る（数週間から数カ月又はそれ以上）。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み又は非組み込みベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継承されるのを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
ｉＲＮＡの個々の１つ又は複数の鎖は、発現ベクターにおけるプロモーターから転写され得る。２本の別個の鎖が発現されて、例えば、ｄｓＲＮＡを生成する場合、２つの別個の発現ベクターが、（例えば、トランスフェクション又は感染によって）標的細胞中に共導入され得る。或いは、ｄｓＲＮＡの各個々の鎖が、同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ステム・ループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合する発現ベクターを用いて、本明細書に記載されるｉＲＮＡの発現のための組み換え構築物を産生することができる。真核細胞の発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、多くの商業的供給源から入手可能である。通常、所望の核酸セグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含むこのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内又は筋肉内投与によるか、患者から移植された標的細胞に投与した後に患者に再導入することによるか、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段などによる全身送達であり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）又は非カチオン性の脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞中にトランスフェクトされ得る。１週間以上の期間にわたる標的ＲＮＡの異なる領域を標的とするｉＲＮＡを介したノックダウンのための複数回の脂質のトランスフェクションも、本発明によって想定される。宿主細胞中へのベクターの導入の成功は、様々な公知の方法を用いて監視され得る。例えば、一過性のトランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなどのレポーターを用いて示され得る。エクスビボでの細胞の安定したトランスフェクションは、トランスフェクト細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの、特定の環境因子（例えば、抗生物質及び薬剤）に対する耐性を与えるマーカーを用いて確実にすることができる。
本明細書に記載される方法及び組成物とともに用いられ得るウイルスベクター系としては、限定はされないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれらに限定されないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックス（ｏｒｔｈｏｐｏｘ）、例えば、ワクシニアウイルスベクター又は鳥ポックス、例えばカナリア痘又は鶏痘などのポックスウイルスベクター；及び（ｊ）ヘルパー依存性又は弱毒アデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターが、細胞のゲノムに組み込まれるか又は組み込まれないであろう。構築物は、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。或いは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組み換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞内でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクター及び構築物について考慮される他の態様が、更に後述される。
ｉＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞又は組織におけるｉＲＮＡの発現に十分な調節要素（プロモーター、エンハンサーなど）を含むであろう。調節要素は、構成的発現又は調節性／誘導性発現のいずれかを提供するように選択され得る。
ｉＲＮＡの発現は、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、血中グルコースレベル、又はホルモンに対して感受性がある誘導性調節配列を使用することによって、正確に調節され得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞又は哺乳動物におけるｄｓＲＮＡの発現の制御に好適なこのような誘導性発現系は、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘導物質、及びイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節を含む。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の目的とする使用に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができるであろう。
ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用され得る。例えば、レトロウイルスベクターが使用され得る（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの適切なパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な構成要素を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を促進する、１つ又は複数のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターについての更なる詳細は、例えば、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）に見出すことができ、これには、造血幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、造血幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を示す他の参照文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；及びＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）である。使用のために考えられるレンチウイルスベクターとしては、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；同第５，６６５，５５７号明細書；及び同第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶに基づいたベクターが挙げられる。
アデノウイルスも、本発明のｉＲＮＡの送達における使用のために考えられる。アデノウイルスは、例えば、呼吸上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、本来、呼吸上皮に感染し、軽度の疾病を引き起こす。アデノウイルスに基づいた送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスには、非分裂細胞に感染することが可能であるという利点がある。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）には、アデノウイルスに基づいた遺伝子療法の概説が示されている。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を移送するアデノウイルスベクターの使用を示した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；ＰＣＴ公報の国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出すことができる。本発明に取り上げられるｉＲＮＡを発現するのに好適なＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞中に送達するための方法が、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも、本発明のｉＲＮＡを送達するのに使用され得る（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態において、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡプロモーター、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組み換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明に取り上げられるｄｓＲＮＡを発現するのに好適なＡＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞中に送達するための方法が、全開示内容が参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際特許出願番号国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；及び国際特許出願番号国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載されている。
本発明のｉＲＮＡの送達に好適な別のウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、例えば、改変ウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）又はＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニア、鶏痘又はカナリア痘などの鳥ポックスなどのポックスウイルスである。
ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質又は他のウイルスからの他の表面抗原を用いてベクターをシュードタイピングする（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）ことによって、又は異なるウイルスカプシドタンパク質を必要に応じて置換することによって、改変され得る。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質を用いてシュードタイピングされ得る。ＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにこのベクターを操作することによって、異なる細胞を標的とするように作製され得る。例えば、全開示内容が参照により本明細書に援用されるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照。
ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中のベクターを含むことができ、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。或いは、組み換え細胞から、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターが無傷で産生され得る場合、医薬製剤は、遺伝子送達システムを産生する１つ又は複数の細胞を含むことができる。
ＶＩ．本発明の医薬組成物
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物及び製剤も含む。一実施形態において、本明細書には、本明細書に記載されるとおりのｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物が提供される。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、接触活性化経路遺伝子（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、及び／又はＫＮＧ１遺伝子）の発現又は活性に関連する疾患又は障害の治療に有用である。かかる医薬組成物は、送達方法に基づき製剤化される。一例は、例えば、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、又は静脈内（ＩＶ）送達による非経口送達を介した全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ注入によるなどの脳内注入により、脳実質に直接送達するように製剤化される組成物である。本発明の医薬組成物は、接触活性化経路遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与されてもよい。
かかる医薬組成物は送達方法に基づき製剤化される。一例は、例えば静脈内（ＩＶ）送達による非経口送達による全身投与用、又は皮下送達用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ注入によるなどの肝内注入により、肝臓に直接送達するように製剤化される組成物である。
本発明の医薬組成物は、接触活性化経路遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与されてもよい。一般に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、レシピエントの体重１キログラム当たり１日約０．００１〜約２００．０ミリグラムの範囲、概して体重１キログラム当たり１日約１〜５０ｍｇの範囲であり得る。典型的には、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。反復投与レジメン（ｒｅｇｉｍｉｎｅ）は、隔日又は年１回など、治療量のｉＲＮＡの定期的な投与を含み得る。特定の実施形態において、ｉＲＮＡは約月１回〜約年４回（即ち約３ヵ月毎）に投与される。
初期治療レジメンの後、治療は頻度を減らして投与することができる。
当業者は、非限定的に疾病又は疾患の重篤さ、以前の処置、対象の全体的な健康及び／又は年齢、並びに存在する他の疾病を含む所定の因子が対象を効果的に処置するのに必要な投与量及び時間に影響し得ることを認識するであろう。更に、治療的有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置又は一連の処置を含み得る。本発明により包含される個々のｉＲＮＡに関する有効な投与量、及びインビボでの半減期は、従来の方法論を用いて、又は本明細書の他の箇所に記載されるような適切な動物モデルを使用したインビボでの試験に基づいて概算することができる。
マウス遺伝学の進歩により、接触活性化経路遺伝子の発現の低下から利益を受け得る障害など、様々なヒト疾患の研究用に幾つものマウスモデルが作成されている。
本発明の医薬組成物は、局所的又は全身的処置が必要かどうか及び処置される部位に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所投与（例えば、経皮パッチによる）、例えば、噴霧器などによる、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による経肺投与；気管内、鼻腔内、表皮及び経皮、経口又は非経口投与であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；例えば、埋め込みデバイスによる皮下投与；又は例えば、実質内、髄腔内若しくは脳室内投与による頭蓋内投与が挙げられる。
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定の組織を標的とするように送達され得る。
局所投与用の医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、噴霧剤、液剤及び散剤が挙げられる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であり、又は所望され得る。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤は、本発明を特徴付けるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤などの局所送達薬剤との混合物であるものを含む。好適な脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰イオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及び陽イオン性（例えば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、リポソーム中に封入されることができ、又はリポソームに対して、特に陽イオン性リポソームに対して錯体を形成することができる。代替的に、ｉＲＮＡは、脂質に対して、特に陽イオン性脂質に対して錯体化されてもよい。好適な脂肪酸及びエステルには、非限定的にアラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、又はジグリセリド；又はこれらの薬学的に許容され得る塩が挙げられる）。局所製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されている。
Ａ．膜分子集合体を含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物及び方法に使用するためのｉＲＮＡは、膜分子集合体、例えば、リポソーム又はミセル中の送達用に製剤化され得る。本明細書で使用されるとき、「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層又は複数の二重層に配置された両親媒性の脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料及び水性内部から形成される膜を有する単層及び多層小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性外部から水性内部を分離し、通常、ｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては、含むことがある。リポソームは、作用部位への活性成分の移送及び送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造が類似しているため、リポソームが組織に付着されると、リポソームの二重層が、細胞膜の二重層と融合する。リポソーム及び細胞の融合が進むにつれて、ｉＲＮＡを含む内部の水性内容物が、細胞に送達され、ここで、ｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ｉＲＮＡを仲介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、ｉＲＮＡを特定の細胞型に指向するように、特異的に標的化される。
ｉＲＮＡ剤を含有するリポソームは、様々な方法によって調製され得る。一例において、リポソームの脂質成分は、ミセルが脂質成分で形成されるように、洗剤に溶解される。例えば、脂質成分は、両親媒性のカチオン性脂質又は脂質コンジュゲートであり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、及びラウロイルサルコシンが挙げられる。次に、ｉＲＮＡ剤の調製物は、脂質成分を含むミセルに加えられる。脂質におけるカチオン性基は、ｉＲＮＡ剤と相互作用し、ｉＲＮＡ剤の周りで縮合して、リポソームを形成する。縮合の後、洗剤は、例えば透析によって除去されて、ｉＲＮＡ剤のリポソーム製剤が得られる。
必要に応じて、縮合を補助する担体化合物が、例えば、制御添加によって、縮合反応中に加えられ得る。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミン又はスペルミジン）であり得る。縮合を補助するためにｐＨも調整され得る。
送達ビヒクルの構成成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成するための方法が、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに更に記載されている。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３−７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；及びＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載される例示的な方法の１つ又は複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適切なサイズの脂質集合体を調製するための一般的に使用される技術としては、超音波処理並びに凍結融解及び押し出しが挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照）。一貫して小さく（５０〜２００ｎｍ）且つ比較的均一な集合体が所望される場合、顕微溶液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が使用され得る（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。これらの方法は、ｉＲＮＡ剤の調製物をリポソームにパッケージングするのに容易に適合される。
リポソームは、２つの大きなクラスに分かれる。陽イオン性リポソームは、負に帯電された核酸分子と相互作用して安定な複合体を形成する正に帯電されたリポソームである。正に帯電された核酸／リポソーム複合体は負に帯電された細胞表面に結合し、エンドソーム内に移行される。エンドソーム内の酸性ｐＨによって、リポソームが破裂され、それらの内容物を細胞質内に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
ｐＨ感受性且つ負に帯電されたリポソームは、核酸と複合するのではなく、核酸を捕捉する。核酸及び脂質の両方は同様に帯電されるため、複合体形成ではなく反発が起こる。それにも係わらず、いくつかの核酸はこれらのリポソームの水性内部内に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養物中の細胞単層に送達するよう使用されている。標的細胞内で外来遺伝子の発現が検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９〜２７４）。
リポソーム組成物の主要な一タイプは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。陰イオン性リポソーム組成物は一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方、陰イオン性膜融合リポソームは、主としてジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。他のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣ、及び卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。他のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
リポソームを細胞中にインビトロ及びインビボで導入するための他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；及びＳｔｒａｕｓｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系も試験されて、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性が決定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮に送達した。結果はそのような非イオン性リポソーム系が皮膚の異なる層中へのシクロスポリン−Ａの堆積を促進するのに有効であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４（６）４６６）。
リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、本明細書で使用されるこの用語は、１つ又は複数の特定化脂質を含むリポソームを指し、その特定化脂質は、リポソームに組み込まれた際、そのような特定化脂質を欠いたリポソームと比較して増強された循環寿命をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ又は複数の糖脂質を含むもの、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ又は複数の親水性ポリマーにより誘導体化されているものである。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、当技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ−誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームに関しては、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの低下に由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つ又は複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野にて既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、リポソームの血中半減期を改善するモノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールの能力を報告している。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．により詳説されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）。両方ともＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第４，８３７，０２８号明細書及び国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１又は硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。
一実施形態において、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームには、細胞膜に融合することができるという利点がある。非カチオン性リポソームは、それほど効率的に細胞膜と融合することができないが、インビボでマクロファージによって取り込まれ、ｉＲＮＡ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。
リポソームの更なる利点としては以下が挙げられる：天然のリン脂質から得られるリポソームは、生体適合性があり且つ生分解性可能であり；リポソームは、広範囲の水溶性及び脂溶性薬剤を組み込むことができ；リポソームは、その内部の区画中に封入されたｉＲＮＡ剤を代謝及び分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面電荷、小胞サイズ及びリポソームの水性容積である。
正に帯電した合成カチオン性脂質である、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を用いて、核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、ｉＲＮＡ剤の送達をもたらすことが可能な脂質−核酸複合体を形成する、小さいリポソームを形成することができる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３−７４１７，１９８７、及びＤＯＴＭＡ及びＤＮＡとのその使用の説明については米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照）。
ＤＯＴＭＡ類似体である、１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡ複合小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して、複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む生体組織培養細胞中に高度にアニオン性の核酸を送達するための効果的な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームが使用される場合、得られる複合体の正味電荷も正である。このように調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に付着し、細胞膜と融合し、機能性核酸を、例えば、組織培養細胞中に効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である、１，２−ビス（オレイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合ではなく、エステルによって結合された点でＤＯＴＭＡとは異なる。
他の報告されているカチオン性脂質化合物としては、２つのタイプの脂質のうちの１つにコンジュゲートされ、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物を含む、例えば、カルボキシスペルミンを含む様々な部分にコンジュゲートされたものが挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照）。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤化されたコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．及びＨｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートすることによって作製されるリポポリリジンは、血清の存在下におけるトランスフェクションに有効であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞株では、コンジュゲートされたカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的なトランスフェクションを提供するとされている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質が、国際公開第９８／３９３５９号パンフレット及び国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与される薬剤の高い全身性吸収率に関連する副作用の減少、所望の標的における投与される薬剤の蓄積の増加、及びｉＲＮＡ剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。ある実施において、ｉＲＮＡ剤を表皮細胞に送達するために、また、真皮組織、例えば、皮膚へのｉＲＮＡ剤の浸透を促進するために、リポソームが使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用され得る。リポソームとして製剤化される薬剤の皮膚への局所送達が報告されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０及びｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２：２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５６：２６７−２７６，１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照）。
また、非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系は、皮膚への薬剤の送達におけるそれらの有用性を決定するために調べられた。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウス皮膚の真皮に薬剤を送達するのに使用された。ｉＲＮＡ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を処置するのに有用である。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に作製され得る。このような変形性は、リポソームが、リポソームの平均半径より小さい孔を透過するのを可能にし得る。例えば、トランスフェルソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、変形可能なリポソームの一種である。トランスフェルソームは、表面縁活性化因子、通常、界面活性剤を、標準的なリポソーム組成物に加えることによって作製され得る。ＲｉＮＡ剤を含むトランスフェルソームは、皮膚のケラチノサイトにｉＲＮＡ剤を送達するために、例えば、皮下感染によって送達され得る。無傷の哺乳動物皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、５０ｎｍ未満の直径をそれぞれ有する一連の微細孔を透過しなければならない。更に、脂質特性のため、これらのトランスフェロソームは、自己最適化（例えば、毛穴の形状に適応可能）、自己修復性であり得、多くの場合、破砕せずにそれらの標的に到達し、多くの場合、自己充填性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。
本発明に適した他の製剤が、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された同第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された同第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された同第６１／０４７，０８７号明細書及び２００８年５月８日に出願された同第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号明細書もまた、本発明に適した製剤を記載している。
トランスファーソームは、リポソームの更なる別の一タイプであり、薬物送達ビヒクルの候補として魅力的な、高く変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、脂質小滴として記載することもでき、この脂質小滴は、高く変形可能であるため、小滴よりも小さい孔内を容易に透過することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば自己最適性（皮膚内の孔の形状に適応する）であり、自己修復性であり、しばしば細分化することなくそれらの標的に到達し、また多くの場合、自己負荷性である。トランスファーソームを作製するためには、通常は界面活性剤である表面縁部活性化因子を標準的なリポソーム組成物に加えることが可能である。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するのに使用されている。トランスファーソーム仲介による血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソームなどの製剤に広い用途を見出している。天然及び合成の両方の多数の異なるタイプの界面活性剤を分類及び順位付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部」としても既知）の性質は、製剤中に使用される異なる界面活性剤を類別する最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、この界面活性剤は非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬及び美容製品に広い用途を見出し、広い範囲のｐＨ値に亘って使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル、及びエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミド、及び脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどのエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も人気のあるメンバーである。
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散した際に負電荷を保有する場合、この界面活性剤は陰イオン性に分類される。陰イオン性界面活性剤には、せっけんなどのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルスルフェート及びエトキシル化アルキルスルフェートなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、並びにホスフェートが挙げられる。陰イオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、アルキルスルフェート及びせっけんである。
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散した際に正電荷を保有する場合、この界面活性剤は陽イオン性に分類される。陽イオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、最も使用されているこのクラスのメンバーである。
界面活性剤分子が正又は負電荷のいずれかを保有する能力を有する場合、この界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドが挙げられる。
薬物製品、製剤及びエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
本発明の方法に使用するためのｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」は、分子の全ての疎水性部分が内側を向いて、親水性部分を周囲の水相と接触したままにするように、両親媒性分子が球体構造で配置される、特定のタイプの分子集合体として本明細書において定義される。環境が疎水性である場合、逆の配置が存在する。
経皮膜を介した送達に好適な混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩、及びミセル形成化合物を混合することによって調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容され得る塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシン及びその薬学的に許容され得る塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテル及びその類似体、ポリドカノールアルキルエーテル及びその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、及びそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に又はその後に加えられてもよい。混合ミセルは、成分の実質的に任意の種類の混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには激しい混合で形成される。
一方法において、ｓｉＲＮＡ組成物及び少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物が調製される。次に、第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成される。別の方法において、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩及びミセル形成化合物の少なくとも１つを混合し、続いて、激しく混合しながら残りのミセル形成化合物を加えることによって調製される。
フェノール及び／又はｍ−クレゾールが、混合ミセル組成物に加えられて、製剤を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。或いは、フェノール及び／又はｍ−クレゾールは、ミセル形成成分とともに加えられてもよい。グリセリンなどの等張剤も、混合ミセル組成物の形成後に加えられてもよい。
スプレーとしてのミセル製剤の送達では、製剤は、エアロゾルディスペンサーに入れることができ、ディスペンサーに噴射剤が充填される。圧力下にある噴射剤は、ディスペンサー中で液体形態である。成分の比率は、水相及び噴射剤相が１つになるように、即ち、１つの相が存在するように調整される。２つの相が存在する場合、例えば、定量弁によって、内容物の一部を投薬する前にディスペンサーを振とうする必要がある。医薬品の投薬用量は、微細なスプレー状で定量弁から噴射される。
噴射剤は、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル及びジエチルエーテルを含み得る。特定の実施形態において、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用されてもよい。
必須成分の特定の濃度は、比較的単純な実験によって決定され得る。口腔を介した吸収では、注射又は胃腸管を介した投与のための投与量の、例えば、少なくとも２倍又は３倍に増加させることが望ましいことが多い。
Ｂ．脂質粒子
本発明のｉＲＮＡ、即ちｄｓＲＮＡは、脂質製剤中、例えばＬＮＰ中に完全に封入されてもよく、又は他の核酸−脂質粒子を形成してもよい。
本明細書で使用される用語「ＬＮＰ」は、安定な核酸−脂質粒子を指す。ＬＮＰは、典型的には、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、及び粒子の凝集を防止する脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含む。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に延長された循環寿命を有し、且つ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離された部位）に蓄積するため、全身適用に極めて有用である。ＬＮＰは「ｐＳＰＬＰ」を含み、ｐＳＰＬＰは、ＰＣＴ公開第国際公開第００／０３６８３号パンフレットに示されているように、封入された縮合剤−核酸複合体を含む。本発明の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均粒径を有し、且つ実質的に無毒である。加えて、核酸は、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合、水性溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸−脂質粒子、及びそれらの調製方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書及びＰＣＴ公開国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。
一実施形態において、脂質対薬物の比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡの比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、又は約６：１〜約９：１の範囲内であろう。上記の範囲の中間の範囲も、本発明の一部であるものと考えられる。
陽イオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（Ｄｌｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤａＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰｚ）、又は３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）又はその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、又はこれらの混合物であってもよい。陽イオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、又は約４０ｍｏｌ％からなり得る。
別の実施形態において、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランが、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するのに使用され得る。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、参照により本明細書に援用される、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載されている。
一実施形態において、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、６３．０±２０ｎｍの粒度及び０．０２７ｓｉＲＮＡ／脂質比を有する。
イオン性／非陽イオン性脂質は、非限定的にジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ）エタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はこれらの混合物を含む陰イオン性脂質又は中性脂質とすることができる。非陽イオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、又は約５８ｍｏｌ％であってもよい。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、非限定的にＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質とすることができる。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、又はＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）とすることができる。粒子の凝集を防止するコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する全脂質の０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、又は２ｍｏｌ％とすることができる。
いくつかの実施形態において、核酸−脂質粒子は更に、粒子中に存在する全脂質の例えば約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％又は約４８ｍｏｌ％のコレステロールを含む。
一実施形態において、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（参照により本明細書に援用される、２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）が、脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子（即ち、ＬＮＰ０１粒子）を調製するのに使用され得る。エタノール中のそれぞれの原液が、以下のとおりに調製され得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次に、ＮＤ９８、コレステロール、及びＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６原液は、例えば、４２：４８：１０のモル比で組み合わせられ得る。組み合わされた脂質溶液は、最終的なエタノール濃度が約３５〜４５％であり、最終的な酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭであるようにｄｓＲＮＡ水溶液（例えば酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中）と混合され得る。脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子は、通常、混合時に自然に形成される。所望の粒度分布に応じて、得られるナノ粒子混合物が、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を用いて、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍのカットオフ）を通して押し出され得る。場合によっては、押し出し工程は省略され得る。エタノール除去及び同時の緩衝液交換は、例えば、透析又は接線流ろ過によって達成され得る。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換され得る。
Figure 2018519797
ＬＮＰ０１製剤が、例えば、参照により本明細書に援用される国際出願公開番号国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載されている。
更なる例示的な脂質−ｄｓＲＮＡ製剤が、表１に記載される。
Figure 2018519797
Figure 2018519797
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ−ＤＭＧ：ＰＥＧ−ジジミリストイル（ｄｉｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）グリセロール（Ｃ１４−ＰＥＧ、又はＰＥＧ−Ｃ１４）（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＰＥＧ−ＤＳＧ：ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（Ｃ１８−ＰＥＧ、又はＰＥＧ−Ｃ１８）（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＰＥＧ−ｃＤＭＡ：ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＳＮＡＬＰ（ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤が、参照により本明細書に援用される、２００９年４月１５日に出願された国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載されている。
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、２００９年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／１４８，３６６号明細書；２００９年３月２日に出願された米国仮特許出願第６１／１５６，８５１号明細書；２００９年６月１０日に出願された米国仮特許出願；２００９年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／２２８，３７３号明細書；２００９年９月３日に出願された米国仮特許出願第６１／２３９，６８６号明細書、及び２０１０年１月２９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号明細書（これらは本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
ＭＣ３を含む製剤は、例えば、２０１０年６月１０日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書（この内容は全て、本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
ＡＬＮＹ−１００を含む製剤は、例えば、２００９年１１月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号明細書（本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
Ｃ１２−２００を含む製剤は、２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書及び２０１０年５月５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号明細書（これらは本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
経口投与用の組成物及び製剤には、散剤又は顆粒、微粒子、ナノ粒子、縣濁剤、又は水若しくは非水性媒体中の液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、薬袋、錠剤又は小型錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤は、所望され得る。いくつかの実施形態では、経口製剤は、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡが、１種又は複数種の透過促進剤界面活性剤及びキレート剤とともに投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸及び／若しくはエステル又はその塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、若しくはモノグリセリド、ジグリセリド、又はこれらの薬学的に許容され得る塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明を特徴付けるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子、又はマイクロ若しくはナノ粒子を形成するために錯体化されたものを含む顆粒形態で経口的に送達され得る。ｄｓＲＮＡ錯体化剤には、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、澱粉、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び澱粉；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロース及び澱粉が挙げられる。好適な錯体化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノ（ｃｙｎａｏ）アクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン及びＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤、及びそれらの製剤は、その各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書及び米国特許第６，７４７，０１４号明細書に記載されている。
非経口、実質内（脳内へ）、くも膜下腔内、脳室内又は肝内投与用の組成物及び製剤には、無菌水性溶液を挙げることができ、その無菌水性溶液は、緩衝液、希釈剤、並びに非限定的に浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容され得る担体又は賦形剤などの他の好適な添加剤も含み得る。
本発明の医薬組成物は、非限定的に、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、非限定的に予め形成された液剤、自己乳化型固体及び自己乳化型半固体を含む多様な構成成分から生成され得る。肝癌腫などの肝疾患を処置する際、肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。
単位剤形にて都合よく存在し得る本発明の医薬製剤は、医薬産業にて周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体又は賦形剤と関連させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体又は微粉化固体担体又は両方と均一且つ親密に関連させた後、必要であれば、製品を成形することにより調製される。
本発明の組成物は、非限定的に錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐薬、及び浣腸などの多数の可能な剤形のいずれかに処方され得る。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒体中の懸濁液として処方され得る。水性縣濁液は、更に、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。縣濁液はまた、安定剤を含み得る。
Ｃ．更なる製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして、調製され、製剤化され得る。エマルションは、典型的に、１つの液体が、通常、直径が０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに親密に混合され及び分散された２つの非混和性液体相を含む二層系である。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）の種類のいずれかであり得る。水性相が微小液滴として塊の油相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。代替的に、油相が微小液滴として塊の水性相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬物に加えて追加の構成成分を含むことができ、その構成成分は、水性相、油相中の溶液として、又はそれ自体が別個の相として存在し得る。必要に応じてエマルション中に乳化剤、安定剤、染料、及び抗酸化剤などの医薬賦形剤も存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合など、３つ以上の相からなる多エマルションであり得る。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二成分エマルションが提供しない所定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油小滴が小さい水小滴を囲い込む多エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球中に囲い込まれた油小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性を殆ど又は全く有さないことにより特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散又は不連続相は、外部又は連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段、又は製剤の粘度を介してこの形態に維持される。エマルションの相のいずれかは、エマルション型軟膏ベース及びクリームの場合のように半固体又は固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段には、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用が含まれる。乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、及び微細に分散した固体の４つのカテゴリーに大きく分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。
表面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルションの製剤化に広範な適用性が見出されており、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製の際の界面活性剤の分類及び選択の際の貴重な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なる種類、即ち、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照）。
エマルション製剤中に使用される、天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸収ベースは、無水ラノリン及び親水性ワセリンのように、水を取り入れてｗ／ｏエマルションを形成するが、尚それらの半固体稠度を維持する親水性特性を所有する。微粉化固体は、特に界面活性剤の組み合わせ中、及び粘稠な製剤中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤粘土、顔料、及び炭素などの非極性固体又はトリステアリン酸グリセリルが挙げられる。
非常に多様な非乳化材料もエマルション製剤中に含まれ、エマルションの特性に寄与する。それらには、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤及び抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイド又は親水コロイドには、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グァーガム、カラヤガム、及びトラガカント）などの天然に存在するゴム及び合成ポリマー、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは水中に分散し又は水中で膨潤して、分散相の小滴の周囲に強力な界面フィルムを形成することにより、また、外部相の粘度を増大させることにより、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支持し得る炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多数の成分を含むため、これらの製剤は、多くの場合、保存剤を組み込んでいる。製剤に含まれる、通常使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も、通常、エマルション製剤に加えられて、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの遊離基スカベンジャー、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、並びにクエン酸、酒石酸及びレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口及び非経口経路を介したエマルション製剤の適用並びにそれらの製造方法は、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤化の容易さ、並びに吸収及び生物学的利用能の観点からの有効性のため、非常に広範に使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。鉱油基剤の緩下剤、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養製剤が、ｏ／ｗ型エマルションとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態において、ｉＲＮＡ及び核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で且つ熱力学的に安定した液体溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散した後、十分な量の第四の構成成分、一般に中間の鎖長のアルコールを加えて透明系を形成することにより調製される。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムにより安定化されている２つの非混和性液体からなる熱力学的に安定な、等方的に透明な分散物として記載されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１８５−２１５）。マイクロエマルションは通常、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤及び電解質を含む３〜５つの構成成分の組み合わせを用いて調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）タイプ又は水中油（ｏ／ｗ）タイプのいずれのものであるかは、使用される油及び界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｐａｃｋｉｎｇ）とに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を用いる現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルションを製剤化する方法についての広範な知識を当業者に与えている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、自発的に形成する熱力学的に安定な小滴の製剤中で水不溶性薬物を可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤には、単独で又は補助界面活性剤との組み合わせで、非限定的に、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）デカグリセロール（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。通常、エタノール、１−プロパノール、及び１−ブタノールなどの短鎖アルコールである補助界面活性剤は、界面活性剤フィルム中に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生成された空隙空間によって不規則フィルムを形成することにより、界面流動性を増大させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を使用することなく調製されることができ、アルコールフリー自己乳化型マイクロエマルション系は、当技術分野にて既知である。水性相は、典型的には、非限定的に水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールの誘導体とすることができる。油相は、非限定的にＣａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、及びトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油などの材料を含むことができる。
マイクロエマルションは、薬物可溶化及び薬物吸収向上の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティの向上に提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬物可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤誘導による膜流動性及び透過性の変更に起因する薬物吸収の可能な向上、調製の容易さ、固体剤形を超える経口投与の容易さ、臨床的効能の改善、及び毒性の低下の利点を提供する（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照されたい）。多くの場合、マイクロエマルションは、マイクロエマルションの構成成分が周囲温度で一緒にされた際に自発的に形成され得る。このことは、易熱性薬物、ペプチド又はｉＲＮＡを処方する際に特に有利であり得る。マイクロエマルションはまた美容及び医薬用途の両方において活性構成成分の経費送達に有効である。本発明のマイクロエマルション組成物及び製剤が胃腸管からのｉＲＮＡ及び核酸の全身吸収の増大、並びにｉＲＮＡ及び核酸の局部細胞取り込みの改善を促進することが期待される。
本発明のマイクロエマルションはまた、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、及び透過促進剤などの追加の構成成分及び添加剤を含んで、製剤の特性を改善し、且つ本発明のｉＲＮＡ及び核酸の吸収を向上させ得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、５つの広いカテゴリーの１つに属するものとして分類され得る−−界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、及び非キレート化非界面活性剤（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々は、上記に論じられている。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のｉＲＮＡ剤は、粒子、例えば、微粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって生成され得るが、凍結乾燥、蒸発、流体床乾燥、真空乾燥、又はこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によって生成されてもよい。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への、核酸、特にｉＲＮＡの効率的な送達を行うために様々な浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬剤が、イオン化及び非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤でも細胞膜を横断することができることが発見されている。細胞膜をわたる非親油性薬剤の拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬剤の浸透性も向上させる。
浸透促進剤は、即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤の５つの大きいカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類され得る（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）。浸透促進剤の上記の種類のそれぞれが、以下により詳細に記載される。
界面活性剤（又は「表面活性剤」）は、水溶液に溶解されると、溶液の表面張力又は水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化学物質である。胆汁塩及び脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）；及びＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物エマルション（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸及びそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）、並びにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（即ち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照）。
胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照）。様々な天然の胆汁塩、及びそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれか並びにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸（又はその薬学的に許容され得るナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデート（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐｐ．７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照）。
本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化合物として定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのキレート剤の使用に関して、ほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても作用するという更なる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤としては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート及びホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照）。
本明細書で使用されるとき、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤又は界面活性剤としてのわずかな活性を示すが、それにもかかわらず、消化器粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を促進する化合物として定義され得る（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３を参照）。この種類の浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）；並びにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。
細胞レベルにおけるｉＲＮＡの取り込みを促進する剤も、本発明の医薬組成物及び他の組成物に加えられ得る。例えば、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）などのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらの米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリジンなどのポリカチオン性分子（ＬｏｌｌｏらのＰＣＴ出願の国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを促進することが知られている。市販のトランスフェクション試薬の例としては、特に、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｉＲＮＡＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、又はＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、又はＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
エチレングリコール及びプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、並びにリモネン及びメントンなどのテルペンを含む、他の剤を用いて、投与される核酸の浸透を促進することができる。
ｖ．担体
本発明の所定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込んでいる。本明細書で使用される「担体化合物」又は「担体」は、不活性（即ち、生物学的活性ｐｅｒｓｅを所有しない）であり得るが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解し、又は循環からの核酸の除去を促進することによる、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボでのプロセスによって、核酸であると認識される核酸又はその類似体を指すことができる。核酸及び担体化合物の共投与、典型的には過剰な後者の物質による共投与により、おそらくは共通の受容体に対する担体化合物と核酸との競合に起因して、肝臓、腎臓又は他の循環外リザーバ（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）中で回収される核酸の量が実質的に低下し得る。例えば、肝組織内での部分的ホスホロチオエートの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸塩、ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）又は４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与された際、低下され得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ＆Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、動物に１つ又は複数の核酸を送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体又は固体とすることができ、計画された投与方法を考慮に入れて、核酸及び医薬組成物の他の所定の構成成分と組み合わされた際に、所望の嵩、稠度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、非限定的に、結合剤（例えば、α化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、乳糖及び他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；錠剤崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤も本発明の組成物の処方に使用され得る。薬学的に許容され得る好適な担体には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与用の製剤には、アルコールなどの通常の溶媒中の無菌及び非無菌水性溶液、非水性溶液、又は液体若しくは固体油ベース中の核酸溶液を挙げることができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤も含み得る。核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤を使用し得る。
薬学的に許容され得る好適な賦形剤には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
ｖｉｉ．他の構成成分
本発明の組成物は更に、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分も、当技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬剤など、更なる適合可能な医薬的に活性な材料を含有することができ、又は染料、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な更なる材料を含有することができる。しかしながら、それらの材料は、加えられた際、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望の場合、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、調味料及び／又は芳香性物質などと混合される。
水性縣濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。縣濁液は、安定剤も含み得る。
一部の実施形態において、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つ以上のｉＲＮＡ化合物と、（ｂ）非ｉＲＮＡ機構によって機能する、且つ溶血性障害の治療に有用な１つ以上の薬剤とを含む。かかる薬剤の例としては、限定はされないが、抗炎症剤、抗脂肪症剤、抗ウイルス薬、及び／又は抗線維症剤が挙げられる。
加えて、シリマリンなど、一般に肝臓の保護に用いられる他の物質もまた、本明細書に記載されるｉＲＮＡと併用して使用することができる。肝疾患の治療に有用な他の薬剤としては、テルビブジン、エンテカビル、及びプロテアーゼ阻害薬、例えばテラプレビル、及び例えばＴｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、同第２００４／０１６７１１６号明細書、及び同第２００３／０１４４２１７号明細書；及びＨａｌｅ ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書に開示される他のものが挙げられる。
このような化合物の毒性及び処置効果は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％の致死量）及びＥＤ５０（個体群の５０％に治療に有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性作用と処置効果との間の用量比は、処置指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。高い処置指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投与量を製剤化するのに使用され得る。本発明における本明細書に取り上げられる組成物の投与量は、一般に、ほとんど又は全く毒性を伴わずにＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明に取り上げられる方法に使用される任意の化合物では、治療に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推測され得る。用量は、細胞培養物中で測定して、ＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、又は適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を動物モデル内で達成する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）ように処方され得る。そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
上記で考察したとおり、それらの投与に加え、本発明で取り上げるｉＲＮＡは、接触活性化経路遺伝子発現（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子発現、Ｆ１２遺伝子発現、及び／又はＫＮＧ１遺伝子発現）によって媒介される病的プロセスの治療に有効な他の公知の薬剤と併用して投与することができる。いずれにしろ、投与する医師は、当該技術分野において公知の又は本明細書に記載される標準的な有効性尺度を用いて観察される結果に基づきｉＲＮＡ投与の量及びタイミングを調整することができる。
ＶＩＩ．接触活性化経路遺伝子発現の阻害方法
本発明はまた、細胞における接触活性化経路遺伝子（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、及び／又はＫＮＧ１遺伝子）の発現を阻害する方法も提供する。
一実施形態において、本発明は、細胞におけるＫＬＫＢ１遺伝子の発現の阻害方法を提供する。本方法は、細胞におけるＫＬＫＢ１の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させ、それによって細胞におけるＫＬＫＢ１の発現を阻害する工程を含む。
一実施形態において、本発明は、細胞におけるＦ１２遺伝子の発現の阻害方法を提供する。本方法は、細胞におけるＦ１２の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させ、それによって細胞におけるＦ１２の発現を阻害する工程を含む。
一実施形態において、本発明は、細胞におけるＫＮＧ１遺伝子の発現の阻害方法を提供する。本方法は、細胞におけるＫＮＧ１の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させ、それによって細胞におけるＫＮＧ１の発現を阻害する工程を含む。
ＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させる工程は、インビトロ又はインビボで行われ得る。インビボで細胞をＲＮＡｉ剤と接触させる工程は、対象、例えばヒト対象の体内の細胞又は細胞集団をＲＮＡｉ剤と接触させる工程を含む。細胞を接触させるインビトロ方法とインビボ方法との組み合わせもまた可能である。細胞を接触させる工程は、上記で考察したとおり、直接であっても又は間接的であってもよい。更に、細胞を接触させる工程は、本明細書に記載される又は当該技術分野において公知の任意のリガンドを含め、標的リガンドを介して達成されてもよい。好ましい実施形態において、標的リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンド、又はＲＮＡｉ剤を目的の部位に誘導する任意の他のリガンドである。
用語「阻害する」は、本明細書で使用されるとき、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、及び他の類似の用語と同義的に用いられ、任意のレベルの阻害を含む。
語句「接触活性化経路遺伝子の発現を阻害する」は、任意の接触活性化経路遺伝子（例えば、マウス接触活性化経路遺伝子、ラット接触活性化経路遺伝子、サル接触活性化経路遺伝子、又はヒト接触活性化経路遺伝子など）並びに接触活性化経路遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を指すことが意図される。
語句「ＫＬＫＢ１の発現を阻害する」は、任意のＫＬＫＢ１遺伝子（例えば、マウスＫＬＫＢ１遺伝子、ラットＫＬＫＢ１遺伝子、サルＫＬＫＢ１遺伝子、又はヒトＫＬＫＢ１遺伝子など）並びにＫＬＫＢ１遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を指すことが意図される。従って、ＫＬＫＢ１遺伝子は、野生型ＫＬＫＢ１遺伝子、突然変異ＫＬＫＢ１遺伝子（アミロイド沈着を引き起こす突然変異ＫＬＫＢ１遺伝子など）、又は遺伝的に操作された細胞、細胞集団、又は生物のコンテクストにおけるトランスジェニックＫＬＫＢ１遺伝子であってもよい。
「ＫＬＫＢ１遺伝子の発現を阻害する」には、ＫＬＫＢ１遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＫＬＫＢ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制が含まれる。ＫＬＫＢ１遺伝子の発現は、ＫＬＫＢ１遺伝子発現に関連する任意の可変量のレベル、又はレベルの変化、例えば、ＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡレベル、ＫＬＫＢ１タンパク質レベル、又はアミロイド沈着の数若しくは程度に基づき評価し得る。このレベルは、例えば対象から得られた試料を含め、個々の細胞又は細胞集団で評価し得る。
語句「Ｆ１２の発現を阻害する」は、任意のＦ１２遺伝子（例えば、マウスＦ１２遺伝子、ラットＦ１２遺伝子、サルＦ１２遺伝子、又はヒトＦ１２遺伝子など）並びにＦ１２遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を指すことが意図される。従って、Ｆ１２遺伝子は、野生型Ｆ１２遺伝子、突然変異Ｆ１２遺伝子（突然変異Ｆ１２遺伝子など）、又は遺伝的に操作された細胞、細胞集団、若しくは生物のコンテクストにおけるトランスジェニックＦ１２遺伝子であってもよい。
「Ｆ１２遺伝子の発現を阻害する」には、Ｆ１２遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、Ｆ１２遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制が含まれる。Ｆ１２遺伝子の発現は、Ｆ１２遺伝子発現に関連する任意の可変量のレベル、又はレベルの変化、例えば、Ｆ１２ ｍＲＮＡレベル、Ｆ１２タンパク質レベル、又はアミロイド沈着の数若しくは程度に基づき評価し得る。このレベルは、例えば対象から得られた試料を含め、個々の細胞又は細胞集団で評価し得る。
語句「ＫＮＧ１の発現を阻害する」は、任意のＫＮＧ１遺伝子（例えば、マウスＫＮＧ１遺伝子、ラットＫＮＧ１遺伝子、サルＫＮＧ１遺伝子、又はヒトＫＮＧ１遺伝子など）並びにＫＮＧ１遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を指すことが意図される。従って、ＫＮＧ１遺伝子は、野生型ＫＮＧ１遺伝子、突然変異ＫＮＧ１遺伝子（突然変異ＫＮＧ１遺伝子など）、又は遺伝的に操作された細胞、細胞集団、若しくは生物のコンテクストにおけるトランスジェニックＫＮＧ１遺伝子であってもよい。
「ＫＮＧ１遺伝子の発現を阻害する」には、ＫＮＧ１遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＫＮＧ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制が含まれる。ＫＮＧ１遺伝子の発現は、ＫＮＧ１遺伝子発現に関連する任意の可変量のレベル、又はレベルの変化、例えば、ＫＮＧ１ ｍＲＮＡレベル、ＫＮＧ１タンパク質レベル、又はアミロイド沈着の数若しくは程度に基づき評価し得る。このレベルは、例えば対象から得られた試料を含め、個々の細胞又は細胞集団で評価し得る。
阻害は、対照レベルと比較した接触活性化経路遺伝子発現に関連する１つ以上の可変量の絶対又は相対レベルの低下によって評価し得る。対照レベルは、当該技術分野で利用されている任意の種類の対照レベル、例えば、投与前ベースラインレベル、又は未処置又は対照（例えば、緩衝液単独対照又は不活性薬剤対照など）で処置した類似の対象、細胞、又は試料から決定されるレベルであってよい。
本発明の方法の一部の実施形態において、接触活性化経路遺伝子（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子、Ｆ１２遺伝子、及び／又はＫＮＧ１遺伝子）の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％。少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％阻害される。
接触活性化経路遺伝子の発現の阻害は、接触活性化経路遺伝子が転写される第１の細胞又は細胞集団（かかる細胞は例えば対象から得られた試料中に存在し得る）であって、且つ接触活性化経路遺伝子の発現が阻害されるように（例えば、それらの１つ又は複数の細胞を本発明のＲＮＡｉ剤と接触させることによるか、又は細胞が存在する又は存在していた対象に本発明のＲＮＡｉ剤を投与することにより）処置されている第１の細胞又は細胞集団が発現するｍＲＮＡ量の、第１の細胞又は細胞集団と実質的に同一であるが、そのような処置は受けていない第２の細胞又は細胞集団（対照細胞）と比較したときの減少によって明らかになり得る。好ましい実施形態において、阻害は、以下の式を用いて処置細胞のｍＲＮＡレベルを対照細胞のｍＲＮＡレベルに対するパーセンテージとして表すことにより評価される：
Figure 2018519797
或いは、接触活性化経路遺伝子の発現の阻害は、接触活性化経路遺伝子発現と機能上関連付けられるパラメータ、例えば、ＫＬＫＢ１タンパク質発現、Ｆ１２タンパク質発現、ＫＮＧ１タンパク質発現、フィブリン沈着、血栓発生、又はブラジキニンレベルの低下の観点で評価し得る。接触活性化経路遺伝子サイレンシングは、構成的に、或いはゲノム工学によって接触活性化経路遺伝子を発現する任意の細胞で、及び当該技術分野において公知の任意のアッセイにより決定し得る。
接触活性化経路タンパク質の発現の阻害は、細胞又は細胞集団が発現する接触活性化経路タンパク質のレベル（例えば、対象から得られた試料中におけるタンパク質の発現レベル）の低下によって明らかになり得る。上記に説明したとおり、ｍＲＮＡ抑制の評価には、処置した細胞又は細胞集団におけるタンパク質発現レベルの阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｏｎ）を同様に対照細胞又は細胞集団におけるタンパク質レベルのパーセンテージとして表し得る。
接触活性化経路遺伝子の発現の阻害を評価するために使用し得る対照細胞又は細胞集団としては、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触させていない細胞又は細胞集団が挙げられる。例えば、対照細胞又は細胞集団は、対象をＲＮＡｉ剤で治療する前の個々の対象（例えば、ヒト又は動物対象）から得ることができる。
細胞又は細胞集団が発現する接触活性化経路ｍＲＮＡのレベル、又は循環接触活性化経路ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当該技術分野において公知の任意の方法を用いて決定し得る。一実施形態において、試料中の接触活性化経路遺伝子の発現レベルは、転写ポリヌクレオチド、又はその一部分、例えば、ＫＬＫＢ１遺伝子のｍＲＮＡ、Ｆ１２遺伝子のｍＲＮＡ、及び／又はＫＮＧ１遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって決定される。例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、スイス）を用いることを含め、ＲＮＡ抽出技法を用いてＲＮＡを細胞から抽出し得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイフォーマットとしては、核ランオンアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ解析が挙げられる。循環ＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４３５８４号明細書（この内容は全て、本明細書によって参照により本明細書に援用される）に記載される方法を用いて検出し得る。
一実施形態において、接触活性化経路遺伝子の発現レベルは核酸プローブを用いて決定される。用語「プローブ」は、本明細書で使用されるとき、特異的な接触活性化経路遺伝子との選択的結合能を有する任意の分子を指す。プローブは当業者によって合成されてもよく、又は適切な生物学的調製物から誘導されてもよい。プローブは標識されるように特別に設計されてもよい。プローブとして利用することのできる分子の例としては、限定はされないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられる。
限定はされないが、サザン又はノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析及びプローブアレイを含むハイブリダイゼーション又は増幅アッセイにおいて、単離ｍＲＮＡを使用することができる。ｍＲＮＡレベルを決定する一つの方法は、ＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡとハイブリダイズすることのできる核酸分子（プローブ）に単離ｍＲＮＡを接触させることを伴うものである。一実施形態では、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、例えば単離ｍＲＮＡをアガロースゲルに泳動させて、そのｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に転写することによってプローブと接触させる。代替的実施形態では、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘジーンチップアレイにおいて、１つ又は複数のプローブを固体表面上に固定化し、ｍＲＮＡをその１つ又は複数のプローブに接触させる。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を接触活性化経路遺伝子ｍＲＮＡレベルの決定における利用に容易に適合させることができる。
試料中における接触活性化経路遺伝子の発現レベルの代替的決定方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号明細書に示される実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）又は任意の他の核酸増幅法と、続く当業者に周知の技法を用いた増幅された分子の検出による、試料中の例えばｍＲＮＡの核酸増幅及び／又は逆転写酵素プロセス（ｃＤＮＡを調製するため）を伴うものである。これらの検出スキームは、かかる分子が極めて少数しか存在しない場合の核酸分子の検出に特に有用である。本発明の詳細な態様において、接触活性化経路遺伝子の発現レベルは、定量的蛍光ＲＴ−ＰＣＲ（即ち、ＴａｑＭａｎ（商標）システム）によって決定される。
接触活性化経路ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析で用いられるものなど）、又はマイクロウェル、試料管、ゲル、ビーズ又は繊維（又は結合した核酸を含む任意の固体支持体）を用いてモニタし得る。米国特許第５，７７０，７２２号明細書、同第５，８７４，２１９号明細書、同第５，７４４，３０５号明細書、同第５，６７７，１９５号明細書及び同第５，４４５，９３４号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）を参照のこと。ＫＬＫＢ１発現レベルの決定はまた、溶液中の核酸プローブの使用も含み得る。
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ発現レベルは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。これらの方法の使用については、本明細書に提供される実施例に記載及び例示する。
接触活性化経路タンパク質発現レベルは、タンパク質レベルを計測するための当該技術分野において公知の任意の方法を用いて決定し得る。かかる方法としては、例えば、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー、流体又はゲル沈降反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法（単一又は二元）、免疫電気泳動法、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。
一部の実施形態において、本発明の方法の有効性は、四肢、顔面、喉頭、上気道、腹部、体幹、及び性器の浮腫・腫脹、前駆症状；喉頭腫脹；非そう痒性発疹；悪心；嘔吐；又は腹痛の低下など、接触活性化経路関連疾患の症状の低下を検出し又はモニタすることによってモニタし得る。これらの症状は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いてインビトロ又はインビボで評価し得る。
用語「試料」は、本明細書で使用されるとき、対象から単離した同様の体液、細胞、又は組織の収集物、並びに対象の体内に存在する体液、細胞、又は組織を指す。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、眼液などが挙げられる。組織試料としては、組織、器官又は局所領域からの試料を挙げることができる。例えば、試料は、特定の器官、器官の一部、又はそれらの器官（ｏｒｇａｎｉｓ）内の体液若しくは細胞から得られてもよい。特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓又は肝臓の特定のセグメント又は例えば肝実質細胞などの肝臓内の特定の種類の細胞）、網膜又は網膜の一部（例えば、網膜色素上皮）、中枢神経系又は中枢神経系の一部（例えば、脳室又は脈絡叢）、又は膵臓又は膵臓の特定の細胞又は一部から得られてもよい。好ましい実施形態において、「対象から得られた試料」は、対象から抜き取られた血液又は血漿を指す。更なる実施形態において、「対象から得られた試料」は、対象から得られた肝組織又は網膜組織を指す。
本発明の方法の一部の実施形態において、本ＲＮＡｉ剤は、対象体内の特定の部位にＲＮＡｉ剤が送達されるように対象に投与される。接触活性化経路遺伝子の発現の阻害は、対象体内の特定の部位の体液又は組織から得られた試料中における接触活性化経路遺伝子ｍＲＮＡ又は接触活性化経路タンパク質のレベル又はレベルの変化の計測を用いて評価し得る。好ましい実施形態において、この部位は、肝臓、脈絡叢、網膜、及び膵臓からなる群から選択される。部位はまた、前述の部位のいずれか１つに由来するサブセクション又は細胞のサブグループであってもよい。部位にはまた、特定の種類の受容体を発現する細胞も含まれ得る。
ＶＩＩＩ．接触活性化経路関連疾患を治療又は予防する方法
本発明は、接触活性化経路遺伝子関連疾患、障害、及び／又は病態を有するか、又は接触活性化経路遺伝子関連疾患、障害、及び／又は病態を発症し易い対象に対し、本発明のｉＲＮＡ剤（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、又は前述のいずれかの組み合わせ、即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ）を含む組成物、又はｉＲＮＡ剤（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、又は前述のいずれかの組み合わせ）を含む医薬組成物、又はｉＲＮＡ（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、又は前述のいずれかの組み合わせ）を含むベクターを投与する工程を含む治療及び予防方法を提供する。接触活性化経路遺伝子関連疾患の非限定的な例としては、例えば、血栓形成傾向、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）（遺伝性血管浮腫Ｉ型；遺伝性血管浮腫ＩＩ型；遺伝性血管浮腫ＩＩＩ型；又は高ブラジキニン値によって引き起こされる任意の他の遺伝性血管浮腫など）、プレカリクレイン欠乏症、悪性本態性高血圧症、高血圧症、末期腎疾患、フレッチャー因子欠乏症、四肢、顔面、喉頭、上気道、腹部、体幹、及び性器の浮腫・腫脹、前駆症状；喉頭腫脹；非そう痒性発疹；悪心；嘔吐；腹痛が挙げられる。
一実施形態において、接触活性化経路遺伝子関連疾患は血栓形成傾向である。別の実施形態において、接触活性化経路遺伝子関連疾患はＨＡＥである。別の実施形態において、接触活性化経路遺伝子関連疾患はプレカリクレイン欠乏症である。別の実施形態において、接触活性化経路遺伝子関連疾患は悪性本態性高血圧症である。別の実施形態において、接触活性化経路遺伝子関連疾患は高血圧症である。別の実施形態において、接触活性化経路遺伝子関連疾患は末期腎疾患である。別の実施形態において、接触活性化経路遺伝子関連疾患はフレッチャー因子欠乏症である。
本発明の方法は、接触活性化経路遺伝子関連疾患を有する対象、例えば、接触活性化経路遺伝子発現及び／又は接触活性化経路タンパク質産生の低下から利益を受け得る対象を治療するのに有用である。一態様において、本発明は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有する対象におけるカリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）遺伝子発現のレベルを低下させる方法を提供する。別の態様において、本発明は、ＨＡＥを有する対象のＫＬＫＢ１タンパク質レベルを低下させる方法を提供する。一態様において、本発明は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有する対象における第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）遺伝子発現のレベルを低下させる方法を提供する。別の態様において、本発明は、ＨＡＥを有する対象のＦ１２タンパク質レベルを低下させる方法を提供する。一態様において、本発明は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有する対象におけるキニノーゲン１（ＫＮＧ１）遺伝子発現のレベルを低下させる方法を提供する。別の態様において、本発明は、ＨＡＥを有する対象のＫＮＧ１タンパク質レベルを低下させる方法を提供する。
本発明はまた、接触活性化経路関連疾患、例えば血栓形成傾向又は遺伝性血管浮腫を有する対象のブラジキニンレベルを低下させる方法も提供する。例えば、一実施形態において、本発明は、遺伝性血管浮腫を有する対象のブラジキニンレベルを低下させる方法を提供し、この方法は、本発明のｄｓＲＮＡ剤（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、又は前述のいずれかの組み合わせ、即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ）、又はかかる薬剤を含む医薬組成物若しくはベクター、又はかかる薬剤の組み合わせの治療有効量又は予防有効量を対象に投与する工程を含む。
一態様において、本発明は、接触活性化経路関連疾患、例えば、血栓形成傾向、遺伝性血管浮腫Ｉ型；遺伝性血管浮腫ＩＩ型；遺伝性血管浮腫ＩＩＩ型；高ブラジキニン値によって引き起こされる任意の他の遺伝性血管浮腫を有する対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、本発明のこの治療方法（及び使用）は、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。別の実施形態において、本発明の治療方法（及び使用）は、Ｆ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＦ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。更に別の実施形態において、本発明の治療方法（及び使用）は、ＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。他の実施形態において、本発明の治療方法（及び使用）は、本発明のｄｓＲＮＡ剤の組み合わせ（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ）、又はかかる薬剤を含む医薬組成物若しくはベクター、又はかかる薬剤の組み合わせの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。
別の態様において、本発明は、ＨＡＥを有する対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、ＨＡＥを有する対象を治療するための本発明の方法（及び使用）は、Ｆ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＦ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。別の実施形態において、ＨＡＥを有する対象を治療するための本発明の方法（及び使用）は、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。更に別の実施形態において、ＨＡＥを有する対象を治療するための本発明の方法（及び使用）は、ＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。他の実施形態において、ＨＡＥを有する対象を治療するための本発明の方法（及び使用）は、本発明のｄｓＲＮＡ剤の組み合わせ（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ）、又はかかる薬剤を含む医薬組成物若しくはベクター、又はかかる薬剤の組み合わせの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。
別の態様において、本発明は、血栓形成傾向を有する対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、血栓形成傾向を有する対象を治療するための本発明の方法（及び使用）は、Ｆ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＦ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。別の実施形態において、血栓形成傾向を有する対象を治療するための本発明の方法（及び使用）は、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。更に別の実施形態において、血栓形成傾向を有する対象を治療するための本発明の方法（及び使用）は、ＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。他の実施形態において、血栓形成傾向を有する対象を治療するための本発明の方法（及び使用）は、本発明のｄｓＲＮＡ剤の組み合わせ（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ）、又はかかる薬剤を含む医薬組成物若しくはベクター、又はかかる薬剤の組み合わせの治療有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。
一態様において、本発明は、接触活性化経路関連疾患、例えば、血栓形成傾向、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、例えば、高ブラジキニンの存在、四肢、顔面、喉頭、上気道、腹部、体幹、及び性器の浮腫・腫脹、前駆症状；喉頭腫脹；非そう痒性発疹；悪心；嘔吐；腹痛を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、医薬組成物、又はベクターの予防有効量を対象に投与し、それによって接触活性化経路関連疾患を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。一実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。別の実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、Ｆ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＦ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。更に別の実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、ＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。他の実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、本発明のｄｓＲＮＡ剤の組み合わせ（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ）、又はかかる薬剤を含む医薬組成物若しくはベクター、又はかかる薬剤の組み合わせの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。
一態様において、本発明は、血栓形成リスクのある対象の血栓形成を予防する方法を提供する。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、医薬組成物、又はベクターの予防有効量を対象に投与し、それによって血栓形成リスクのある対象における血栓の形成を予防する工程を含む。一実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。別の実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、Ｆ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＦ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。更に別の実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、ＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。他の実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、本発明のｄｓＲＮＡ剤の組み合わせ（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ）、又はかかる薬剤を含む医薬組成物若しくはベクター、又はかかる薬剤の組み合わせの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。
「血栓形成リスクのある対象」には、外科患者（例えば、一般外科手術、口腔外科手術、整形外科手術（例えば、人工膝関節又は股関節置換術）、外傷外科手術、腫瘍外科手術を受ける対象）；内科患者（例えば、不動化疾患を有する対象、例えば、３日間を超える床上安静の対象及び／又は静脈内カテーテルの長期使用対象；心房細動を有する対象；高齢対象；腎機能障害を有する対象；人工心臓弁を有する対象；心不全を有する対象；癌を有する対象）；妊娠中の対象；分娩後の対象；血栓の既往を有する対象；ホルモン補充療法を受けている対象；飛行機又は自動車などで長時間座っている対象；及び肥満の対象が含まれる。
一態様において、本発明は、ＨＡＥを有する対象の血管浮腫発作を予防する方法を提供する。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ、医薬組成物、又はベクターの予防有効量を対象に投与し、それによって血栓形成リスクのある対象における血栓の形成を予防する工程を含む。一実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。別の実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、Ｆ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＦ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。更に別の実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、ＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤又はＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物又はＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。他の実施形態において、本発明の予防方法（及び使用）は、本発明のｄｓＲＮＡ剤の組み合わせ（即ち、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤とＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ、又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、Ｆ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と、ＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤との組み合わせ）、又はかかる薬剤を含む医薬組成物若しくはベクター、又はかかる薬剤の組み合わせの予防有効量を対象、例えばヒトに投与する工程を含む。
一態様において、本発明は、対象、例えば、ＫＬＫＢ１遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を受け得る対象を治療するための本発明のｉＲＮＡ剤の治療有効量の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、対象、例えば、Ｆ１２遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を受け得る対象を治療するための本発明のｉＲＮＡ剤の治療有効量の使用を提供する。
更に別の態様において、本発明は、対象、例えば、ＫＮＧ１遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を受け得る対象を治療するための本発明のｉＲＮＡ剤の治療有効量の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、対象、例えば、ＫＬＫＢ１遺伝子発現の低下から利益を受け得る障害、例えば接触活性化経路関連疾患を有する対象など、ＫＬＫＢ１遺伝子発現及び／又はＫＬＫＢ１タンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受け得る対象の治療用医薬の製造における、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ又はＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
一態様において、本発明は、対象、例えば、Ｆ１２遺伝子発現の低下から利益を受け得る障害、例えば接触活性化経路関連疾患を有する対象など、Ｆ１２遺伝子発現及び／又はＦ１２タンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受け得る対象の治療用医薬の製造における、Ｆ１２遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ又はＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、対象、例えば、ＫＮＧ１遺伝子発現の低下から利益を受け得る障害、例えば接触活性化経路関連疾患を有する対象など、ＫＮＧ１遺伝子発現及び／又はＫＮＧ１タンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受け得る対象の治療用医薬の製造における、ＫＮＧ１遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ又はＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、ＫＬＫＢ１遺伝子発現及び／又はＫＬＫＢ１タンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受け得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。
別の態様において、本発明は、Ｆ１２遺伝子発現及び／又はＦ１２タンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受け得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。
別の態様において、本発明は、ＫＮＧ１遺伝子発現及び／又はＫＮＧ１タンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受け得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。
更なる態様において、本発明は、接触活性化経路関連疾患など、ＫＬＫＢ１遺伝子発現及び／又はＫＬＫＢ１タンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受け得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状の予防用医薬の製造における本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。
一実施形態において、ＫＬＫＢ１を標的とするｉＲＮＡ剤が、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）及び／又はＫＬＫＢ１関連疾患を有する対象に対し、そのｄｓＲＮＡ剤を対象に投与したとき例えば対象の細胞、組織、血液又は他の組織若しくは体液におけるＫＬＫＢ１遺伝子の発現が少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％又はそれ以上低下するように投与される。
本発明の方法及び使用は、標的ＫＬＫＢ１遺伝子の発現が約１、２、３、４ ５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、又は約８０時間などにわたって低下するように本明細書に記載される組成物を投与する工程を含む。一実施形態において、標的ＫＬＫＢ１遺伝子の発現は、長期間、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７日間又はそれ以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、又は約４週間又はそれ以上にわたって低下する。
更なる態様において、本発明は、接触活性化経路関連疾患など、Ｆ１２遺伝子発現及び／又はＦ１２タンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受け得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状の予防用医薬の製造における本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。
一実施形態において、Ｆ１２を標的とするｉＲＮＡ剤が、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）及び／又は接触活性化経路関連疾患を有する対象に対し、そのｄｓＲＮＡ剤を対象に投与したとき例えば対象の細胞、組織、血液又は他の組織若しくは体液におけるＦ１２遺伝子の発現が少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％又はそれ以上低下するように投与される。
本発明の方法及び使用は、標的Ｆ１２遺伝子の発現が約１、２、３、４ ５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、又は約８０時間などにわたって低下するように本明細書に記載される組成物を投与する工程を含む。一実施形態において、標的Ｆ１２遺伝子の発現は、長期間、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７日間又はそれ以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、又は約４週間又はそれ以上にわたって低下する。
更なる態様において、本発明は、接触活性化経路関連疾患など、ＫＮＧ１遺伝子発現及び／又はＫＮＧ１タンパク質産生の低下及び／又は阻害から利益を受け得る障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状の予防用医薬の製造における本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。
一実施形態において、ＫＮＧ１を標的とするｉＲＮＡ剤が、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）及び／又は接触活性化経路関連疾患を有する対象に対し、そのｄｓＲＮＡ剤を対象に投与したとき例えば対象の細胞、組織、血液又は他の組織若しくは体液におけるＫＮＧ１遺伝子の発現が少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％又はそれ以上低下するように投与される。
本発明の方法及び使用は、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、又は約８０時間などにわたって標的ＫＮＧ１遺伝子の発現が低下するように本明細書に記載される組成物を投与する工程を含む。一実施形態において、標的ＫＮＧ１遺伝子の発現は、長時間、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７日間又はそれ以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、又は約４週間又はそれ以上にわたって低下する。
本発明の方法及び使用に係るｄｓＲＮＡの投与は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）及び／又は接触活性化経路関連疾患を有する患者におけるかかる疾患又は障害の重症度、徴候、症状、及び／又はマーカーの低減をもたらし得る。これに関連して「低減」とは、かかるレベルの統計学的に有意な低下を意味する。低減は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は約１００％であり得る。
疾病の処置又は予防の有効性は、例えば、疾病の進行、疾病の寛解、症状の重症度、痛みの減少、クオリティオブライフ、処置効果を持続させるのに必要な薬剤の用量、疾病マーカーのレベル、又は処置されている若しくは予防の対象となる所定の疾病に適切な測定可能な任意の他のパラメータを測定することによって評価され得る。このようなパラメータのいずれか１つ、又はパラメータの任意の組み合わせを測定することによって処置又は予防の有効性を監視することは、十分当業者の能力の範囲内である。例えば、脂質異常症の処置の有効性は、例えば、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール及びトリグリセリドレベルの定期的な監視によって評価され得る。更なる例では、グルコースコントロールの異常の処置の有効性は、例えば、インスリン及びグルコースレベルの定期的な監視によって評価され得る。別の例では、肥満の処置の有効性は、例えば、ボディーマスインデックスの定期的な監視によって評価され得る。更に別の例では、ＨＡＥ症の処置の有効性は、例えば、ＨＡＥ症状又はブラジキニンの定期的な監視によって評価され得る。初期の読み取り値と後の読み取り値との比較は、処置が有効かどうかの指標を医師に与える。このようなパラメータのいずれか１つ、又はパラメータの任意の組み合わせを測定することによって処置又は予防の有効性を監視することは、十分当業者の能力の範囲内である。接触活性化経路遺伝子を標的とするｉＲＮＡ又はその医薬組成物の投与と関連して、接触活性化経路に関連する疾病「に対して有効」は、臨床的に適切な方法での投与が、症状の改善、治癒、疾病の軽減、寿命の延長、クオリティオブライフの改善、又はＨＡＥ及び／又は接触活性化経路に関連する疾病及び関連する原因の処置に精通した医師によって好ましいと一般に認識される他の効果など、少なくとも統計的に有意な割合の患者に対する有益な効果をもたらすことを示す。
処置又は予防の効果は、疾病状態の１つ又は複数のパラメータの統計的に有意な改善がある場合、又は悪化若しくは本来予想されていた症状が発生しないことにより明らかである。一例として、疾病の測定可能なパラメータの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上の好ましい変化は、有効な処置を示し得る。所定のｉＲＮＡ薬剤又はその薬剤の製剤の有効性も、当該技術分野において公知であるように、所定の疾病に関して実験動物モデルを用いて判断することができる。実験動物モデルを用いる場合、処置の有効性は、マーカー又は症状の統計的に有意な低下が観察された場合に証明される。
対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、６．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、７．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、８．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．１ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．２ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．３ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．４ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．６ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．７ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．８ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．９ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、２５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、３５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、４５ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡ、又は約５０ｍｇ／ｋｇ ｄｓＲＮＡなどの治療量のｉＲＮＡが投与され得る。一実施形態において、対象には、０．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
特定の実施形態において、例えば、本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ及び脂質を含む場合、対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約９．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
他の実施形態において、例えば、本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ及びＮ−アセチルガラクトサミンを含む場合、対象には、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量などの治療量のｉＲＮＡが投与され得る。一実施形態において、本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ及びＮ−アセチルガラクトサミンを含む場合、対象には、治療量の約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
例えば、対象には、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
本発明の特定の実施形態において、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤が修飾（例えば、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフ）、例えば、本剤の切断部位又はその近傍にある１つのかかるモチーフ、６つのホスホロチオエート結合、及びリガンドを含む場合、かかる剤は、約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。前述の記載される値の中間の値及び範囲も本発明の一部であることが意図され、例えば、ＲＮＡｉ剤は、約０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜約０．４５ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与され得る。
例えば、ＲＮＡｉ剤、例えば医薬組成物中のＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１７５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２７５ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０３２５ｍｇ／ｋｇ、０．０３５ｍｇ／ｋｇ、０．０３７５ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４５ｍｇ／ｋｇ、０．０４７５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５５ｍｇ／ｋｇ、０．０５７５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０６５ｍｇ／ｋｇ、０．０６７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０７２５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７７５ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８５ｍｇ／ｋｇ、０．０８７５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．０９２５ｍｇ／ｋｇ、０．０９５ｍｇ／ｋｇ、０．０９７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１７５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．２７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３２５ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．３７５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４２５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．４７５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。前述の記載される値の中間の値も、本発明の一部であることが意図される。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、約１００ｍｇ〜約９００ｍｇ、例えば、約１００ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約６００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約２００ｍｇ〜約８００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約２００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約２００ｍｇ〜約６００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約５５０ｍｇ、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約３００ｍｇ〜約８００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約３００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約５５０ｍｇ、約３００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約４００ｍｇ〜約８００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約４００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約４００ｍｇ〜約６００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約５５０ｍｇ、又は約４００ｍｇ〜約５００ｍｇの間の一定用量として投与される。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８７５ｍｇ、又は約９００ｍｇの一定用量として投与される。
ｉＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は約２５分間などの所定の期間にわたって、静脈内注入によって投与され得る。投与は、例えば、毎週、隔週（即ち、２週間ごと）で１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間又はそれ以上などにわたって、定期的に繰り返され得る。最初の処置計画の後、治療剤は、より少ない頻度で投与され得る。例えば、毎週又は隔週で３ヶ月間の投与後、投与は、月に１回で６ヶ月間又は１年間又はそれ以上にわたって繰り返され得る。
本ｉＲＮＡを投与すると、例えば患者の細胞、組織、血液、尿又は他のコンパートメントにおける接触活性化経路タンパク質（即ち、ＫＬＫＢ１タンパク質、Ｆ１２タンパク質、及び／又はＫＮＧ１タンパク質）の存在及び／又はブラジキニンレベルを少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも約９９％又はそれ以上低下させることができる。
ｉＲＮＡの完全用量を投与する前に、５％の注入などのより少ない用量を患者に投与し、アレルギー反応などの有害作用を監視してもよい。別の例では、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α又はＩＮＦ−α）レベルの増大などの好ましくない免疫賦活作用に関して患者を観察してもよい。
接触活性化経路遺伝子発現の阻害効果により、本発明に係る組成物又はそれから調製される医薬組成物は、クオリティオブライフを向上させ得る。
本発明のｉＲＮＡは、「裸の（ｎａｋｅｄ）」形態で投与されてもよく、修飾又は非修飾ｉＲＮＡ剤は、「遊離ｉＲＮＡ」として、水性溶媒又は好適な緩衝液溶媒中で直接懸濁される。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物の非存在下で投与される。遊離ｉＲＮＡは、好適な緩衝液中にあり得る。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、若しくはリン酸塩又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。一実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨ及び浸透圧は、対象に投与するのに好適なように調整され得る。
或いは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。
接触活性化経路遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を受け得る対象は、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）及び／又は本明細書に記載されるとおりの接触活性化経路関連疾患若しくは障害を有する対象である。
接触活性化経路遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を受け得る対象の治療には、治療的処置及び予防的処置が含まれる。
本発明は更に、接触活性化経路遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を受け得る対象、例えば、接触活性化経路関連疾患を有する対象を、他の医薬品及び／又は他の治療法、例えば、公知の医薬品及び／又は公知の治療法、例えば、現在これらの障害の治療に用いられているものなどと併用して治療するための、ｉＲＮＡ剤又はその医薬組成物の方法及び使用を提供する。
例えば、特定の実施形態において、接触活性化経路遺伝子を標的とするｉＲＮＡが、例えば、本明細書の他の部分に記載されるとおりの接触活性化経路関連疾患の治療において有用な薬剤と併用して投与される。例えば、接触活性化経路遺伝子発現の低下から利益を受け得る対象、例えば、接触活性化経路関連疾患を有する対象を治療するのに好適な追加的な療法薬及び治療法としては、接触活性化経路遺伝子の異なる部分を標的とするｉＲＮＡ剤、アンドロゲン、又は療法剤、例えば、Ｃ１ＩＮＨ置換タンパク質、カリクレイン阻害薬ペプチド、ブラジキニン（ｂｒａｄｋｉｎｉｎ）Ｂ２受容体拮抗薬ペプチド、又は接触活性化経路関連疾患を治療するための他の療法剤及び／又は手法又は前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。一実施形態において、追加的な療法薬は、アンドロゲン、例えばダナゾール又はオキサンドロロン、Ｂｅｒｉｎｅｒｔ（登録商標）、Ｃｉｎｒｙｚｅ（商標）、Ｒｈｕｃｏｎｅｓｔ（登録商標）、エカランチド、Ｆｉｒａｚｙｒ（登録商標）、Ｋａｌｂｉｔｏｒ（登録商標）、及び前述のいずれかの組み合わせからなる群から選択される。
特定の実施形態において、接触活性化経路遺伝子を標的とする第１のｉＲＮＡ剤が、接触活性化経路遺伝子の異なる部分を標的とする第２のｉＲＮＡ剤と併用して投与される。例えば、第１のＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成する第１のセンス鎖と第１のアンチセンス鎖とを含み、前記第１のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び第１のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、ここで前記第１のセンス鎖は、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされ、及びリガンドは、二価又は三価分枝鎖状リンカーを介して結合する１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体であり；及び第２のＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成する第２のセンス鎖と第２のアンチセンス鎖とを含み、第２のセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び第２のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、ここで第２のセンス鎖は、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされ、及びリガンドは、二価又は三価分枝鎖状リンカーを介して結合する１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一実施形態において、第１及び第２のセンス鎖のヌクレオチドの全て及び／又は第１及び第２のアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定ヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’−ホスフェートを含むヌクレオチド、及び５’−ホスフェート模倣体を含むヌクレオチドからなる群から選択される。
特定の実施形態において、接触活性化経路遺伝子を標的とする第１のｉＲＮＡ剤が、接触活性化経路遺伝子と異なる遺伝子を標的とする第２のｉＲＮＡ剤と併用して投与される。例えば、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤が、凝固第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と併用して投与されてもよい。ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする第１のｉＲＮＡ剤と、ＫＬＫＢ１遺伝子と異なる遺伝子、例えば凝固第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）遺伝子を標的とする第２のｉＲＮＡ剤とは、同じ医薬組成物の一部として投与されてもよい。或いは、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする第１のｉＲＮＡ剤と、ＫＬＫＢ１遺伝子と異なる遺伝子、例えば凝固第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）遺伝子を標的とする第２のｉＲＮＡ剤とは、異なる医薬組成物の一部として投与されてもよい。
ｉＲＮＡ剤と追加的な療法剤及び／又は治療とは、同時に及び／又は同じ組み合わせで、例えば非経口的に投与されてもよく、又は追加的な療法剤は、別個の組成物の一部として又は別々の時点で及び／又は当該技術分野において公知の又は本明細書に記載される別の方法によって投与することができる。
本発明はまた、細胞における接触活性化経路遺伝子発現（即ち、ＫＬＫＢ１発現、Ｆ１２発現、又はＫＮＧ１発現）を低下させ及び／又は阻害するための本発明のｉＲＮＡ剤及び／又は本発明のｉＲＮＡ剤を含有する組成物の使用方法も提供する。他の態様において、本発明は、細胞における接触活性化経路遺伝子発現（即ち、ＫＬＫＢ１発現、Ｆ１２発現、又はＫＮＧ１発現）の低下及び／又は阻害において使用される本発明のｉＲＮＡ及び／又は本発明のｉＲＮＡを含む組成物を提供する。更に他の態様において、細胞における接触活性化経路遺伝子発現（即ち、ＫＬＫＢ１発現、Ｆ１２発現、又はＫＮＧ１発現）を低下させ及び／又は阻害する医薬の製造のための本発明のｉＲＮＡ及び／又は本発明のｉＲＮＡを含む組成物の使用が提供される。更に他の態様において、本発明は、細胞における接触活性化経路タンパク質産生（即ち、ＫＬＫＢ１タンパク質産生、Ｆ１２タンパク質産生、又はＫＮＧ１タンパク質産生）の低下及び／又は阻害において使用される本発明のｉＲＮＡ及び／又は本発明のｉＲＮＡを含む組成物を提供する。更に他の態様において、細胞における接触活性化経路タンパク質産生（即ち、ＫＬＫＢ１タンパク質産生、Ｆ１２タンパク質産生、又はＫＮＧ１タンパク質産生）を低下させ及び／又は阻害する医薬の製造のための本発明のｉＲＮＡ及び／又は本発明のｉＲＮＡを含む組成物の使用が提供される。これらの方法及び使用は、本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡに細胞を接触させる工程と、接触活性化経路遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって細胞を維持し、それによって接触活性化経路遺伝子の発現を阻害する又は細胞における接触活性化経路タンパク質産生を阻害する工程とを含む。
遺伝子発現の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法によって評価することができる。例えば、ＫＬＫＢ１の発現の低下は、当業者にとってルーチンの方法、例えば、ノーザンブロッティング、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＫＬＫＢ１のｍＲＮＡ発現レベルを決定することにより、ウエスタンブロッティング、免疫学的技法、フローサイトメトリー法、ＥＬＩＳＡなどの当業者にとってルーチンの方法を用いてＫＬＫＢ１のタンパク質レベルを決定することにより、及び／又はＫＬＫＢ１の生物学的活性を決定することにより、決定し得る。
本発明の方法及び使用において、細胞はインビトロ又はインビボで接触させてもよく、即ち、細胞は対象体内にあってもよい。
本発明の方法を用いた治療に好適な細胞は、接触活性化経路遺伝子を発現する任意の細胞、例えば、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有する対象の細胞、又は接触活性化経路遺伝子若しくは接触活性化経路遺伝子の一部分を含む発現ベクターを含む細胞であってよい。本発明の方法及び使用において用いるのに好適な細胞は、哺乳類細胞、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞又はチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（雌ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、又はスイギュウ細胞など）、トリ細胞（例えば、アヒル細胞又はガチョウ細胞）、又はクジラ細胞であってもよい。一実施形態において、細胞はヒト細胞である。
接触活性化経路遺伝子発現は、細胞において少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％まで阻害され得る。
接触活性化経路タンパク質生成は、細胞において少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％まで阻害され得る。
本発明のインビボ方法及び使用は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与することを含んでいてもよく、ｉＲＮＡは、処置される哺乳動物の接触活性化経路遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。処置される生物がヒトである場合、組成物は、限定はされないが、皮下、静脈内、経口、腹腔内、又は頭蓋内（例えば、脳室内、実質内及びくも膜下腔内）、筋肉内、経皮、気道（エアゾール）、経鼻、直腸、及び局所（口腔及び舌下を含む）投与を含む非経口経路を含む、当該技術分野において公知の任意の手段によって投与され得る。特定の実施形態において、組成物は、皮下又は静脈内注入又は注射によって投与される。一実施形態において、組成物は皮下注射によって投与される。
ある実施形態において、投与は、デポー注射による。デポー注射は、長時間にわたってｉＲＮＡを一貫して放出することができる。したがって、デポー注射は、所望の効果、例えば、ＫＬＫＢ１の所望の阻害、又は治療又は予防効果を得るのに必要な投与の頻度を低減し得る。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度を提供することができる。デポー注射は、皮下注射又は筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態において、デポー注射は、皮下注射である。
ある実施形態において、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプ又は手術により埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施形態において、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈内、又は硬膜外注入に使用され得る。好ましい実施形態において、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、ｉＲＮＡを対象に送達する、手術により埋め込まれたポンプである。
投与方法は、局所又全身処置のいずれが所望されるかに基づいて、及び処置される領域に基づいて選択され得る。投与の経路及び部位は、標的化を向上させるように選択され得る。
一態様において、本発明は、哺乳動物、例えば、ヒトにおけるＫＬＫＢ１遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本発明は、哺乳動物におけるＫＬＫＢ１遺伝子の発現を阻害するのに使用するための、哺乳動物の細胞内でのＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物も提供する。別の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＫＬＫＢ１遺伝子の発現を阻害するための薬剤の製造における、哺乳動物の細胞内でのＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの使用を提供する。
本方法及び使用は、哺乳動物の細胞におけるＫＬＫＢ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物を哺乳動物、例えばヒトに投与する工程と、ＫＬＫＢ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって哺乳動物を維持し、それによって哺乳動物におけるＫＬＫＢ１遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。
別の態様において、本発明はまた、哺乳動物、例えばヒトにおけるＦ１２遺伝子の発現の阻害方法も提供する。本発明はまた、哺乳動物におけるＦ１２遺伝子の発現の阻害に使用される、哺乳動物の細胞におけるＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物も提供する。別の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＦ１２遺伝子の発現を阻害するための医薬の製造における、哺乳動物の細胞におけるＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。
本方法及び使用は、哺乳動物の細胞におけるＦ１２遺伝子を標的とするｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物を哺乳動物、例えばヒトに投与する工程と、Ｆ１２遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって哺乳動物を維持し、それによって哺乳動物におけるＦ１２遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。
更に別の態様において、本発明はまた、哺乳動物、例えばヒトにおけるＫＮＧ１遺伝子の発現の阻害方法も提供する。本発明はまた、哺乳動物におけるＫＮＧ１遺伝子の発現の阻害に使用される、哺乳動物の細胞におけるＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物も提供する。別の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＫＮＧ１遺伝子の発現を阻害するための医薬の製造における、哺乳動物の細胞におけるＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。
方法及び使用は、哺乳動物の細胞内でのＫＮＧ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を、哺乳動物、例えば、ヒトに投与する工程と、ＫＮＧ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって哺乳動物を維持し、それによって、哺乳動物におけるＫＮＧ１遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。
遺伝子の発現の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば、本明細書に記載されるｑＲＴ−ＰＣＲによって、ｉＲＮＡを投与された対象中の末梢血試料中で評価され得る。タンパク質産生の減少は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、及び例えば、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット法といった方法によって評価され得る。一実施形態において、組織試料が、接触活性化経路遺伝子及び／又はタンパク質の発現の低下を監視するための組織材料として役立つ。別の実施形態において、血液試料が、接触活性化経路遺伝子及び／又はタンパク質の発現の低下を監視するための組織材料として役立つ。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤の投与後のインビボの標的のＲＩＳＣによる切断の確認が、５’−ＲＡＣＥ又は当該技術分野において公知のプロトコルの変更によって行われる（Ｌａｓｈａｍ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３８（３）ｐ−ｅ１９）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−４）。
本発明は以下の例によって更に例示され、これらの例は限定するものと解釈されてはならない。本願全体を通じて引用される全ての参考文献、特許及び公開特許出願の内容全体、並びに図及び配列表は、本明細書によって参照により本明細書に援用される。
実施例１．ＫＬＫＢ１ ｉＲＮＡ合成
試薬の供給元
試薬の供給元が本明細書に具体的に示されない場合、かかる試薬は、任意の分子生物学試薬供給業者から分子生物学的適用の品質／純度基準で入手することができる。
転写物
ｓｉＲＮＡ設計
ヒトＫＬＫＢ１、「カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１」（ＲＥＦＳｅｑ受託番号ＮＭ＿０００８９２．３、ＧＩ：７８１９１７９７、ＧｅｎｅＩＤ：３８１８、配列番号１及び配列番号２）及び毒性学的種のＫＬＫＢ１オルソログ（カニクイザル：ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＸＭ＿００５５５６４８２、ＧＩ：５４４４３６０７２；アカゲザル：ＲｅｆＳｅｑ ＪＵ３２９３５５、ＧＩ：３８０８０２４７０；マウス：ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００８４５５、ＧＩ：２３６４６５８０４；ラット：ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０１２７２５、ＧＩ：１６２１３８９０４）を標的とする一組のｓｉＲＮＡを、カスタムＲ及びＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ヒトＫＬＫＢ１ ＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡは２２５２塩基の長さを有する。この一組のｓｉＲＮＡ設計の理論的根拠及び方法は以下のとおりである：多数の脊椎動物遺伝子を標的とする２０，０００を超える個別的なｓｉＲＮＡ設計のデータに基づきｍＲＮＡノックダウンの直接的な尺度を予測する線形モデルを使用して、ヒトＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡの７２位〜２２５２位（コード領域及び３’ＵＴＲを含む）におけるあらゆる可能な１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡの予想される有効性を決定した。ヒト、カニクイザル及びアカゲザルの間で完全一致又はほぼ完全一致を示すＫＬＫＢ１ ｓｉＲＮＡのサブセットを設計した。マウス及びラットＫＬＫＢ１オルソログと完全一致又はほぼ完全一致を示す更なるサブセットを設計した。ｓｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを力まかせ探索で使用して、そのｓｉＲＮＡと標的種トランスクリプトームにおける全ての可能なアラインメントとの間のミスマッチの数及び位置を計測した。シード領域（ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの２〜９位として定義される）のミスマッチ、更にｓｉＲＮＡの切断部位（ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０〜１１位として定義される）に追加の重み付けを与えた。ミスマッチの相対重み付けは、シードミスマッチについて２．８、切断部位ミスマッチについて１．２であり、及びアンチセンス１９位までの他の位置におけるミスマッチ１であった。最初の位置のミスマッチは無視した。各鎖について、重み付けした各ミスマッチの値を合計することにより特異性スコアを計算した。ヒト及びカニクイザルにおけるアンチセンススコアが３．０以上であり、且つ予測有効性がＫＬＫＢ１転写物の７０％以上のノックダウンであったｓｉＲＮＡを優先した。様々な２’−Ｏ−メチル及び２’−フルオロ置換パターンを含めた構造活性修飾を含む一組のｓｉＲＮＡもまた設計し、合成し、及びスクリーニングした。
非修飾ＫＬＫＢ１センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表３に示す。修飾ＫＬＫＢ１センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表４に示す。
ｓｉＲＮＡ合成
固体支持体媒介ホスホラミダイト化学を用いてＭｅｒｍａｄｅ １９２シンセサイザー（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）で１μｍｏｌスケールのＫＬＫＢ１ ｓｉＲＮＡ配列を合成した。固体支持体は、カスタムのＧａｌＮＡｃリガンドをロードしたコントロールド・ポア・グラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（５００Ａ）又は汎用固体支持体（ＡＭ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）であった。補助的合成試薬、２’−Ｆ及び２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及びデオキシホスホラミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及びＨｏｎｇｅｎｅ（中国）から入手した。対応するホスホラミダイトを用いて２’Ｆ２’−Ｏ−メチル、ＧＮＡ（グリコール核酸）、５’ホスフェート及び他の修飾を導入した。３’ＧａｌＮＡｃコンジュゲート一本鎖の合成は、ＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ支持体で実施した。アンチセンス一本鎖の合成にはカスタムＣＰＧ汎用固体支持体を使用した。全てのホスホラミダイト（アセトニトリル中１００ｍＭ）のカップリング時間を５分とし、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）をアクチベータ（アセトニトリル中０．６Ｍ）として用いた。無水アセトニトリル／ピリジン（１：１ｖ／ｖ）中の３−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した）の５０ｍＭ溶液を用いてホスホロチオエート結合を作成した。酸化時間は３分とした。配列は全て、最終的にＤＭＴ基を除去して合成した（「ＤＭＴオフ」）。
固相合成の完了後、オリゴリボヌクレオチドを固体支持体から切断し、密閉した９６ディープウェルプレートにおいて２００μＬメチルアミン水溶液試薬を６０℃で２０分間使用して脱保護した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護されている２’リボ残基（２’−ＯＨ）を含有する配列について、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミン三フッ化水素酸塩）試薬を使用して第２の脱保護工程を実施した。このメチルアミン脱保護溶液に、２００ｕＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び３００ｕｌ ＴＥＡ．３ＨＦ試薬を添加し、この溶液を６０℃で更に２０分間インキュベートした。切断及び脱保護工程の終了時に合成プレートを室温に至らせ、１ｍＬのアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｔｉｌｅ）：エタノール混合物（９：１）を添加することによって沈殿させた。プレートを−８０℃で２時間冷却し、マルチチャンネルピペットを用いて上清（ｓｕｐｅｒａｎａｔａｎｔ）を慎重にデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁し、Ａ９０５オートサンプラー及びＦｒａｃ ９５０フラクションコレクターを備えたＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで５ｍＬ ＨｉＴｒａｐサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して脱塩した。脱塩した試料を９６ウェルプレートに収集した。各配列からの試料をＬＣ−ＭＳによって分析してアイデンティティを確認し、ＵＶ（２６０ｎｍ）で定量化し、及びＩＥＸクロマトグラフィーによって選択の試料セットの純度を決定した。
Ｔｅｃａｎ液体ハンドリングロボットでＫＬＫＢ１一本鎖のアニーリングを実施した。９６ウェルプレートにおいてセンス及びアンチセンス一本鎖の等モル混合物を合わせ、アニールした。相補的な一本鎖を合わせた後、９６ウェルプレートをしっかりと密閉し、１００℃のオーブンで１０分間加熱し、２〜３時間の時間をかけてゆっくりと室温に至らせた。各二本鎖の濃度は１×ＰＢＳ中１０μＭに標準化し、次にインビトロスクリーニングアッセイにかけた。
実施例２．ＫＬＫＢ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖のインビトロスクリーニング
細胞培養及びトランスフェクション
１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中においてＣｏｓ７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でほぼコンフルエンスになるまで成長させた後、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。約２．２ｋｂのヒトＫＬＫＢ１ゲノム配列又は２．５ｋｂのオルソロガスマウスＫＬＫＢ１ゲノム配列のいずれかを含有するｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドに、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼコンストラクトを作成した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１１６６８−０１９）を使用して各ｄｕａｌ−ルシフェラーゼプラスミドを約１５×１０４細胞となるようにｓｉＲＮＡとコトランスフェクトした。９６ウェルプレートの各ウェルにつき、０．２μｌのリポフェクタミンを１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中１０ｎｇのプラスミドベクター及び単一のｓｉＲＮＡ（表３及び表４）に加え、室温で１５分間複合体化させた。次にこの混合物を、８０μｌの新鮮完全培地中に再懸濁した細胞に加えた。細胞を２４時間インキュベートした後、ルシフェラーゼを計測した。
１０ｎＭ及び０．０１ｎＭ最終二本鎖濃度で単回投与実験を実施し、１０ｎＭ〜３６ｆＭ最終二本鎖濃度の用量範囲にわたって８つの６倍希釈で用量反応実験を行った。
Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後４８時間に、ホタルルシフェラーゼ（トランスフェクション対照）及びウミシイタケ（Ｒｉｎｅｌｌａ）ルシフェラーゼ（ＫＬＫＢ１標的配列に融合している）を計測した。初めに、細胞から培地を除去した。次に、各ウェルに培養培地容積と等しい７５μｌのＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ試薬を添加してホタルルシフェラーゼ活性を計測し、混合した。この混合物を室温で３０分間インキュベートした後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でルミネセンス（ｌｕｎｉｍｅｓｃｅｎｓｅ）（５００ｎｍ）を計測してホタルルシフェラーゼシグナルを検出した。各ウェルに７５μｌの室温のＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬を添加してウミシイタケルシフェラーゼ活性を計測し、プレートを１０〜１５分間インキュベートした後、ルミネセンスを再び計測してウミシイタケルシフェラーゼシグナルを決定した。Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬はホタルルシフェラーゼシグナルをクエンチし、ウミシイタケルシフェラーゼ反応のルミネセンスを維持する。各ウェル内でウミシイタケ（ＫＬＫＢ１）シグナルをホタル（対照）シグナルで正規化することにより、ｓｉＲＮＡ活性を決定した。次に、同じベクターをトランスフェクトしたがｓｉＲＮＡで処理しなかったか又は非標的化ｓｉＲＮＡで処理した細胞と比べて、ｓｉＲＮＡ活性の大きさを評価した。全てのトランスフェクションは３通りで行った。
表５は、指示されるヒトＫＬＫＢ１ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞における単回投与スクリーンの結果を示す。表６は、指示されるマウスＫＬＫＢ１ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞における単回投与スクリーンの結果を示す。データは、陰性対照と比べた残存ｍＲＮＡのパーセントとして表す。
Figure 2018519797
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一部の二本鎖はまた、上記に記載したとおりＤｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイを用いて、ヒトＫＬＫＢ１及びマウスＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡのサイレンシングに関する用量反応についてもアッセイした。指示されるＫＬＫＢ１ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞におけるヒトＫＬＫＢ１スクリーンの結果を表７に示す。指示されるＫＬＫＢ１ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞におけるマウスＫＬＫＢ１スクリーンの結果を表８に示す。データは、４８時間における陰性対照と比べた残存ｍＲＮＡのパーセントとして表す。
Figure 2018519797
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実施例３．Ｆ１２ ｉＲＮＡ合成
試薬の供給元
試薬の供給元が本明細書に具体的に示されない場合、かかる試薬は、任意の分子生物学試薬供給業者から分子生物学的適用の品質／純度基準で入手することができる。
転写物
ｓｉＲＮＡ設計
ヒトＦ１２、「凝固第ＸＩＩ因子」（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿０００５０５；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：２１６１）、並びに毒性学的種Ｆ１２オルソログ（カニクイザル：ＸＭ＿００５５５８６４７；マウス：ＮＭ＿０２１４８９；ラット、ＮＭ＿００１０１４００６）を標的とする一組のｓｉＲＮＡを、カスタムＲ及びＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ヒトＦ１２ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは２０６０塩基の長さを有する。この一組のｓｉＲＮＡ設計の理論的根拠及び方法は以下のとおりである：多数の脊椎動物遺伝子を標的とする２０，０００を超える個別的なｓｉＲＮＡ設計のデータに基づきｍＲＮＡノックダウンの直接的な尺度を予測する線形モデルを使用して、ヒトＦ１２ ｍＲＮＡ（コード領域及び３’ＵＴＲを含む）の５０位〜２０６０位（コード領域及び３’ＵＴＲ）におけるあらゆる可能な１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡの予想される有効性を決定した。ヒト、カニクイザル及びアカゲザルの間で完全一致又はほぼ完全一致を示すＦ１２ ｓｉＲＮＡのサブセットを設計した。マウス及びラットＦ１２オルソログと完全一致又はほぼ完全一致を示す更なるサブセットを設計した。ｓｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを力まかせ探索で使用して、そのｓｉＲＮＡと標的種トランスクリプトームにおける全ての可能なアラインメントとの間のミスマッチの数及び位置を計測した。シード領域（ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの２〜９位として定義される）のミスマッチ、更にｓｉＲＮＡの切断部位（ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０〜１１位として定義される）に追加の重み付けを与えた。ミスマッチの相対重み付けは、シードミスマッチについて２．８、切断部位ミスマッチについて１．２であり、及びアンチセンス１９位までの他の位置におけるミスマッチ１であった。最初の位置のミスマッチは無視した。各鎖について、重み付けした各ミスマッチの値を合計することにより特異性スコアを計算した。ヒト及びカニクイザルにおけるアンチセンススコアが≧３．０であり、且つ予測有効性がＦ１２転写物の≧７０％ノックダウンであったｓｉＲＮＡを優先した。
非修飾Ｆ１２センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表９に示す。修飾Ｆ１２センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表１０に示す。
ｓｉＲＮＡ合成
Ｍｅｒｍａｄｅ １９２シンセサイザー（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）で固体支持体媒介ホスホラミダイトケミストリーを用いて１μｍｏｌスケールのＦ１２ ｓｉＲＮＡ配列を合成した。固体支持体は、カスタムのＧａｌＮＡｃリガンドをロードしたコントロールド・ポア・グラス（５００Ａ）又は汎用固体支持体（ＡＭ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）であった。補助的合成試薬、２’−Ｆ及び２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及びデオキシホスホラミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及びＨｏｎｇｅｎｅ（中国）から入手した。対応するホスホラミダイトを用いて２’Ｆ ２’−Ｏ−メチル、ＧＮＡ（グリコール核酸）、５’リン酸及び他の修飾を導入した。３’ＧａｌＮＡｃコンジュゲート一本鎖の合成はＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ支持体で実施した。アンチセンス一本鎖の合成にはカスタムのＣＰＧ汎用固体支持体を使用した。全てのホスホラミダイト（アセトニトリル中１００ｍＭ）のカップリング時間を５分とし、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）をアクチベーター（アセトニトリル中０．６Ｍ）として用いた。無水アセトニトリル／ピリジン（１：１ｖ／ｖ）中の３−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した）の５０ｍＭ溶液を用いてホスホロチオエート結合を作成した。酸化時間は３分とした。配列は全て、最終的にＤＭＴ基を除去して合成した（「ＤＭＴオフ」）。
固相合成の完了後、オリゴリボヌクレオチドを固体支持体から切断し、密閉した９６ディープウェルプレートにおいて２００μＬメチルアミン水溶液試薬を使用して６０℃で２０分間脱保護した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護されている２’リボ残基（２’−ＯＨ）を含有する配列について、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミン三フッ化水素酸塩）試薬を使用して第２の脱保護工程を実施した。このメチルアミン脱保護溶液に、２００ｕＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び３００ｕｌ ＴＥＡ．３ＨＦ試薬を添加し、この溶液を６０℃で更に２０分間インキュベートした。切断及び脱保護工程の終了時に合成プレートを室温に至らせ、１ｍＬのアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｔｉｌｅ）：エタノール混合物（９：１）を添加することによって沈殿させた。プレートを−８０℃で２時間冷却し、マルチチャンネルピペットを用いて上清（ｓｕｐｅｒａｎａｔａｎｔ）を慎重にデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁し、Ａ９０５オートサンプラー及びＦｒａｃ ９５０フラクションコレクターを備えたＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで５ｍＬ ＨｉＴｒａｐサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して脱塩した。脱塩した試料を９６ウェルプレートに収集した。各配列からの試料をＬＣ−ＭＳによって分析してアイデンティティを確認し、ＵＶ（２６０ｎｍ）で定量化し、及びＩＥＸクロマトグラフィーによって選択の試料セットの純度を決定した。
Ｔｅｃａｎ液体ハンドリングロボットでＦ１２一本鎖のアニーリングを実施した。９６ウェルプレートにおいてセンス及びアンチセンス一本鎖の等モル混合物を合わせ、アニールした。相補的な一本鎖を合わせた後、９６ウェルプレートをしっかりと密閉し、１００℃のオーブンで１０分間加熱し、２〜３時間かけてゆっくりと室温に至らせた。各二本鎖の濃度を１×ＰＢＳ中１０μＭに標準化し、次にインビトロスクリーニングアッセイにかけた。
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実施例４．Ｆ１２ ｓｉＲＮＡ二本鎖のインビトロスクリーニング
細胞培養及びトランスフェクション
３８４ウェルプレート中４．９μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）を５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖／ウェルに加えることによりＨｅｐ３ｂ又は初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）（ＭＳＣＰ１０、ロット番号ＭＣ６１３）をトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次に、このｓｉＲＮＡ混合物に、約５×１０３細胞を含有するウィリアムＥ培地（ＰＭＨ）の４０μｌのＤＭＥＭ（Ｈｅｐ３ｂ）を加えた。細胞を２４時間インキュベートした後、ＲＮＡを精製した。
１０ｎＭ及び０．０１ｎＭ最終二本鎖濃度で単回投与実験を実施し、１０ｎＭ〜３６ｆＭ最終二本鎖濃度の用量範囲にわたって８つの６倍希釈で用量反応実験を行った。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを使用した全ＲＮＡ単離：
ＤＹＮＡＢＥＡＤｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１０１２）を使用してＢｉｏＴｅｋ−ＥＬ４０６プラットフォームで自動プロトコルを用いてＲＮＡを単離した。簡潔に言えば、３μｌの磁気ビーズを含有する５０μｌの溶解／結合緩衝液及び２５μｌの溶解緩衝液を細胞と共にプレートに加えた。プレートを電磁振盪機において室温で１０分間インキュベートし、次に磁気ビーズを捕捉して上清を取り除いた。次にビーズに結合したＲＮＡを１５０μｌ洗浄緩衝液Ａで２回、及び洗浄緩衝液Ｂで１回洗浄した。次にビーズを１５０μｌ溶出緩衝液で洗浄し、再び捕捉し、上清を取り除いた。
ＡＢＩハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成：
上記に記載したとおり単離したＲＮＡに、反応当たり１μｌ １０×緩衝液、０．４μｌ ２５×ｄＮＴＰ、１μｌ １０×ランダムプライマー、０．５μｌ逆転写酵素、０．５μｌ ＲＮアーゼ阻害薬及び６．６μｌのＨ２Ｏを含有する１０μｌのマスターミックスを加えた。プレートを密閉し、混合し、電磁振盪機において室温で１０分間、続いて３７℃で２時間インキュベートした。次にプレートを８１℃で８分間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ：
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）においてウェル当たり０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１又は４３５２３３９Ｅ）、０．５μｌ Ｆ１２プローブ（Ｈｓ００１６６８２１又はＭｍ００４９１３４９）及び５μｌ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに２μｌのｃＤＮＡを加えた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。４つの独立したトランスフェクションで各二本鎖を試験した。
相対倍数変化を計算するため、ΔΔＣｔ法を用いてリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭ ＡＤ−１９５５をトランスフェクトした細胞、又はモックトランスフェクト細胞で実施したアッセイに対して正規化した。ＸＬＦｉｔを使用して４パラメータフィットモデルを用いてＩＣ５０を計算し、ＡＤ−１９５５をトランスフェクトした細胞、非標的化対照、又はナイーブ細胞に対して正規化した。
ＡＤ−１９５５のセンス及びアンチセンス配列は以下である：
センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号２３４３）；
アンチセンス：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号２３４４）。
表１１は、指示されるヒトＦ１２ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における単回投与スクリーンの結果を示す。表１２は、指示されるヒトＦ１２ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における単回用量反応スクリーンの結果を示す。表１３は、指示されるマウスＦ１２ ｉＲＮＡをトランスフェクトした初代マウス肝細胞における単回投与スクリーンの結果を示す。表１４は、指示されるヒトＦ１２ ｉＲＮＡをトランスフェクトした初代マウス肝細胞における用量反応スクリーンの結果を示す。データは、ＡＤ−１９５５と比べた残存ｍＲＮＡのパーセントとして表す。
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実施例５．ＫＮＧ１ ｉＲＮＡ合成
試薬の供給元
試薬の供給元が本明細書に具体的に示されない場合、かかる試薬は、任意の分子生物学試薬供給業者から分子生物学的適用の品質／純度基準で入手することができる。
転写物
ｓｉＲＮＡ設計
ヒトＫＮＧ１、「キニノーゲン１」（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿００１１６６４５１；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：３８２７）、並びに毒性学的種ＫＮＧ１オルソログ（カニクイザル：ＸＭ＿００５５４５４６３；マウス：ＮＭ＿００１１０２４０９；ラット、ＮＭ＿０１２６９６）を標的とする一組のｓｉＲＮＡを、カスタムＲ及びＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ヒトＮＭ＿００１１６６４５１ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは２０３５塩基の長さを有する。この一組のｓｉＲＮＡ設計の理論的根拠及び方法は以下のとおりである：多数の脊椎動物遺伝子を標的とする２０，０００を超える個別的なｓｉＲＮＡ設計のデータに基づきｍＲＮＡノックダウンの直接的な尺度を予測する線形モデルを使用して、２３５位〜２０３５位（コード領域及び３’ＵＴＲにおけるあらゆる可能な１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡの予想される有効性を決定した。ヒト及びカニクイザルの間で完全一致又はほぼ完全一致を示すＫＮＧ１ ｓｉＲＮＡのサブセットを設計した。マウス及びラットＫＮＧ１オルソログと完全一致又はほぼ完全一致を示す更なるサブセットを設計した。ｓｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを力まかせ探索で使用して、そのｓｉＲＮＡと標的種トランスクリプトームにおける全ての可能なアラインメントとの間のミスマッチの数及び位置を計測した。シード領域（ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの２〜９位として定義される）のミスマッチ、更にｓｉＲＮＡの切断部位（ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０〜１１位として定義される）に追加の重み付けを与えた。ミスマッチの相対重み付けは、シードミスマッチについて２．８、切断部位ミスマッチについて１．２であり、及びアンチセンス１９位までの他の位置におけるミスマッチ１であった。最初の位置のミスマッチは無視した。各鎖について、重み付けした各ミスマッチの値を合計することにより特異性スコアを計算した。ヒト及びカニクイザルにおけるアンチセンススコアが≧３．０であり、且つ予測有効性がＮＭ＿００１１６６４５１転写物の≧７０％ノックダウンであったｓｉＲＮＡを優先した。
非修飾ＫＮＧ１センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表１５に示す。修飾ＫＮＧ１センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表１６に示す。
ｓｉＲＮＡ合成
Ｍｅｒｍａｄｅ １９２シンセサイザー（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）で固体支持体媒介ホスホラミダイトケミストリーを用いて１μｍｏｌスケールのＫＮＧ１ ｓｉＲＮＡ配列を合成した。固体支持体は、カスタムのＧａｌＮＡｃリガンドをロードしたコントロールド・ポア・グラス（５００Ａ）又は汎用固体支持体（ＡＭ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）であった。補助的合成試薬、２’−Ｆ及び２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及びデオキシホスホラミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及びＨｏｎｇｅｎｅ（中国）から入手した。対応するホスホラミダイトを用いて２’Ｆ ２’−Ｏ−メチル、ＧＮＡ（グリコール核酸）、５’リン酸及び他の修飾を導入した。３’ＧａｌＮＡｃコンジュゲート一本鎖の合成はＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ支持体で実施した。アンチセンス一本鎖の合成にはカスタムのＣＰＧ汎用固体支持体を使用した。全てのホスホラミダイト（アセトニトリル中１００ｍＭ）のカップリング時間を５分とし、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）をアクチベーター（アセトニトリル中０．６Ｍ）として用いた。無水アセトニトリル／ピリジン（１：１ｖ／ｖ）中の３−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した）の５０ｍＭ溶液を用いてホスホロチオエート結合を作成した。酸化時間は３分とした。配列は全て、最終的にＤＭＴ基を除去して合成した（「ＤＭＴオフ」）。
固相合成の完了後、オリゴリボヌクレオチドを固体支持体から切断し、密閉した９６ディープウェルプレートにおいて２００μＬメチルアミン水溶液試薬を使用して６０℃で２０分間脱保護した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護されている２’リボ残基（２’−ＯＨ）を含有する配列について、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミン三フッ化水素酸塩）試薬を使用して第２の脱保護工程を実施した。このメチルアミン脱保護溶液に、２００ｕＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び３００ｕｌ ＴＥＡ．３ＨＦ試薬を添加し、この溶液を６０℃で更に２０分間インキュベートした。切断及び脱保護工程の終了時に合成プレートを室温に至らせ、１ｍＬのアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｔｉｌｅ）：エタノール混合物（９：１）を添加することによって沈殿させた。プレートを−８０℃で２時間冷却し、マルチチャンネルピペットを用いて上清（ｓｕｐｅｒａｎａｔａｎｔ）を慎重にデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁し、Ａ９０５オートサンプラー及びＦｒａｃ ９５０フラクションコレクターを備えたＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで５ｍＬ ＨｉＴｒａｐサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して脱塩した。脱塩した試料を９６ウェルプレートに収集した。各配列からの試料をＬＣ−ＭＳによって分析してアイデンティティを確認し、ＵＶ（２６０ｎｍ）で定量化し、及びＩＥＸクロマトグラフィーによって選択の試料セットの純度を決定した。
Ｔｅｃａｎ液体ハンドリングロボットでＫＮＧ１一本鎖のアニーリングを実施した。９６ウェルプレートにおいてセンス及びアンチセンス一本鎖の等モル混合物を合わせ、アニールした。相補的な一本鎖を合わせた後、９６ウェルプレートをしっかりと密閉し、１００℃のオーブンで１０分間加熱し、２〜３時間かけてゆっくりと室温に至らせた。各二本鎖の濃度を１×ＰＢＳ中１０μＭに標準化し、次にインビトロスクリーニングアッセイにかけた。
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実施例６．ＫＮＧ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖のインビトロスクリーニング
細胞培養及びトランスフェクション
３８４ウェルプレート中４．９μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）を５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖／ウェルに加えることによりＨｅｐ３ｂをトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次に、このｓｉＲＮＡ混合物に、約５×１０３細胞を含有するウィリアムＥ培地（ＰＭＨ）の４０μｌのＤＭＥＭ（Ｈｅｐ３ｂ）を加えた。細胞を２４時間インキュベートした後、ＲＮＡを精製した。
１０ｎＭ及び０．０１ｎＭ最終二本鎖濃度で単回投与実験を実施し、１０ｎＭ〜３６ｆＭ最終二本鎖濃度の用量範囲にわたって８つの６倍希釈で用量反応実験を行った。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを使用した全ＲＮＡ単離：
ＤＹＮＡＢＥＡＤｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１０１２）を使用してＢｉｏＴｅｋ−ＥＬ４０６プラットフォームで自動プロトコルを用いてＲＮＡを単離した。簡潔に言えば、３μｌの磁気ビーズを含有する５０μｌの溶解／結合緩衝液及び２５μｌの溶解緩衝液を細胞と共にプレートに加えた。プレートを電磁振盪機において室温で１０分間インキュベートし、次に磁気ビーズを捕捉して上清を取り除いた。次にビーズに結合したＲＮＡを１５０μｌ洗浄緩衝液Ａで２回、及び洗浄緩衝液Ｂで１回洗浄した。次にビーズを１５０μｌ溶出緩衝液で洗浄し、再び捕捉し、上清を取り除いた。
ＡＢＩハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成：
上記に記載したとおり単離したＲＮＡに、反応当たり１μｌ １０×緩衝液、０．４μｌ ２５×ｄＮＴＰ、１μｌ １０×ランダムプライマー、０．５μｌ逆転写酵素、０．５μｌ ＲＮアーゼ阻害薬及び６．６μｌのＨ２Ｏを含有する１０μｌのマスターミックスを加えた。プレートを密閉し、混合し、電磁振盪機において室温で１０分間、続いて３７℃で２時間インキュベートした。次にプレートを８１℃で８分間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ：
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）においてウェル当たり０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１又は４３５２３３９Ｅ）、０．５μｌ Ｆ１２プローブ（Ｈｓ００１６６８２１又はＭｍ００４９１３４９）及び５μｌ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに、２μｌのｃＤＮＡを加えた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。４つの独立したトランスフェクションで各二本鎖を試験した。
相対倍数変化を計算するため、ΔΔＣｔ法を用いてリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭ ＡＤ−１９５５をトランスフェクトした細胞、又はモックトランスフェクト細胞で実施したアッセイに対して正規化した。ＸＬＦｉｔを使用して４パラメータフィットモデルを用いてＩＣ５０を計算し、ＡＤ−１９５５をトランスフェクトした細胞、非標的化対照、又はナイーブ細胞に対して正規化した。
ＡＤ−１９５５のセンス及びアンチセンス配列は以下である：
センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号２３４３）；
アンチセンス：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号２３４４）。
表１７は、指示されるヒトＫＮＧ１ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における単回投与スクリーンの結果を示す。表１８は、指示されるヒトＫＮＧ１ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における用量反応スクリーンの結果を示す。データは、ＡＤ−１９５５と比べた残存ｍＲＮＡのパーセントとして表す。
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実施例７．野生型マウスにおけるインビボＫＬＫＢ１、Ｆ１２、及びＫＮＧ１サイレンシング
上記に記載した、ＫＬＫＢ１を標的とする最も活性な薬剤のうちの３つ、上記に記載した、Ｆ１２を標的とする最も活性な薬剤のうちの３つ、及び上記に記載した、ＫＮＧ１を標的とする最も活性な薬剤のうちの２つを更なる評価用に選択した。詳細には、ＮＭ＿０００８９２（ＫＬＫＢ１遺伝子）のヌクレオチド１６６１〜１６８２、又はヌクレオチド１９０５〜１９２６、又はヌクレオチド３８２〜４０３を標的とする更なる薬剤（図７）、ＮＭ＿０００５０５（Ｆ１２遺伝子）のヌクレオチド２０１７〜２０４０、又はヌクレオチド３１５〜３３８、又はヌクレオチド４３８〜４５９を標的とする更なる薬剤（図８）、及びＮＭ＿００１１６６４５１（ＫＮＧ１遺伝子）のヌクレオチド３０１〜３２４又はヌクレオチド８２２〜８４５を標的とする更なる薬剤（図９）を上記に記載したとおり合成した。これらの更なる薬剤のインビボ有効性を、薬剤を野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに単回皮下用量で投与し、投与７〜１０日後のｍＲＮＡレベルを決定することによって評価した。ＫＬＫＢ１を標的とする図７に示される薬剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の非修飾ヌクレオチド配列を表１９Ａに提供し、及び図７に示される薬剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチド配列を表１９Ｂに提供する。Ｆ１２を標的とする図８に示される薬剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の非修飾ヌクレオチド配列を表１９Ｃに提供し、及び図８に示される薬剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチド配列を表１９Ｄに提供する。ＫＮＧ１を標的とする図９に示される薬剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の非修飾ヌクレオチド配列を表１９Ｅに提供し、及び図９に示される薬剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチド配列を表１９Ｆに提供する。
詳細には、ＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする更なる薬剤に関して、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに単回１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ用量の薬剤を投与し、投与７〜１０日後のＫＬＫＢ１ ｍＲＮＡレベルを決定した。これらのアッセイの結果を図１に提供し、これは、ＡＤ−６６９４８が、試験したＫＬＫＢ１遺伝子を標的とする薬剤で最も効果的（ｅｆｆｉｃｉａｃｉｏｕｓ）あったことを実証している。
Ｆ１２を標的とする更なる薬剤に関して、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに単回１ｍｇ／ｋｇ用量又は単回３ｍｇ／ｋｇ用量、又は単回１ｍｇ／ｋｇ用量又は単回１０ｍｇ／ｋｇ用量のいずれかの薬剤を投与し、投与７〜１０日後のＦ１２ ｍＲＮＡレベルを決定した。これらのアッセイの結果を図２に提供し、これは、ＡＤ−６７２４４が、試験したＦ１２遺伝子を標的とする薬剤で最も効果的（ｅｆｆｉｃｉａｃｉｏｕｓ）あったことを実証している。
ＫＮＧ１遺伝子を標的とする更なる薬剤に関して、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに単回１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ用量の薬剤を投与し、投与７〜１０日後のＫＮＧ１ ｍＲＮＡレベルを決定した。これらのアッセイの結果を図３に提供し、これは、ＡＤ−６７３４４が、試験したＫＮＧ１遺伝子を標的とする薬剤で最も効果的（ｅｆｆｉｃｉａｃｉｏｕｓ）あったことを実証している。
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実施例８．ＡＣＥ阻害薬誘発性血管透過性マウスモデルにおけるインビボＫＬＫＢ１、Ｆ１２、及びＫＮＧ１サイレンシング
ヒトＫＬＫＢ１、Ｆ１２、又はＫＮＧ１ ｍＲＮＡレベルを低下させる上記に記載される薬剤のサブセットの単回投与のインビボ有効性を決定するため、野生型Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに単回０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６６９４８（ＫＬＫＢ１を標的とする）、又は単回０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４（Ｆ１２を標的とする）、又は単回０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７３４４（ＫＮＧ１を標的とする）を皮下投与した。投与後７日目、動物に２．５ｍｇ／ｋｇのアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カプトプリルを静脈内投与して血管透過性を誘発した。カプトプリルの投与後１５分で動物に３０ｍｇ／ｋｇエバンスブルー色素を静脈内投与した。エバンスブルー色素投与後１５分で動物を犠牲にし、血液、腸、及び肝臓試料を採取した。血液及び腸試料からエバンスブルー色素を抽出して定量化し、肝臓試料中の標的ｍＲＮＡレベルを決定した。
ＫＬＫＢ１を標的とする薬剤（ＡＤ−６６９４８）を使用したこれらのアッセイの結果を図４に示す。Ｆ１２を標的とする薬剤（ＡＤ−ＡＤ−６７２４４）を使用したこれらのアッセイの結果を図５に示す。ＫＮＧ１を標的とする薬剤（ＡＤ−ＡＤ−６７３４４）を使用したこれらのアッセイの結果を図６に示す。
実施例９．Ｆ１２ ｓｉＲＮＡ二本鎖の合成及びインビトロスクリーニング
Ｆ１２を標的とする更なるｉＲＮＡ剤を設計し、合成し、及びインビトロ有効性に関して上記に記載したとおりスクリーニングした。更なる非修飾Ｆ１２センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表２０に示す。更なる修飾Ｆ１２センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表２１に示す。表２２は、指示される更なるＦ１２ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における単回投与スクリーンの結果を示す。データは、ＡＤ−１９５５と比べた残存ｍＲＮＡのパーセントとして表す。
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実施例１１．マスタードオイル誘発性血管透過性マウスモデルにおけるインビボＦ１２サイレンシング
上記で考察し、図２及び図５で実証されたとおり、ＡＤ−６７２４４は、試験したＦ１２遺伝子を標的とする薬剤で最も効果的であり、野生型マウスにおけるＦ１２ ｍＲＮＡ及び血漿Ｆ１２タンパク質のロバストな用量依存的低下、及びブラジキニン誘発性血管漏出マウスＨＡＥモデル（ＡＣＥ阻害薬誘発性マウスモデル）における血管透過性の正常化をもたらした。
第２のマウスＨＡＥモデルでＡＤ−６７２４４のインビボ有効性もまた評価した。詳細には、−７日目にＣＤ−１雌マウス（ｎ＝１０／群）に単回３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４を単回１０ｍｇ／ｋｇ用量のＣ１−ＩＮＨ標的化二本鎖ＲＮＡ剤と併用して皮下投与することにより、Ｃ１−ＩＮＨ欠損マウスにおいてＡＤ−６７２４４がマスタードオイル誘発性血管透過性をレスキューする能力を決定した。０日目、エバンスブルー色素（３０ｍｇ／ｋｇ）を動物の尾静脈に注射し、各動物の右耳に５％マスタードオイル溶液を局所適用した（左耳は未治療のままとし、対照として供した）。３０分後、動物を犠牲にし、色素を遊出させるため各耳を採取して血管透過性を決定し、Ｆ１２及びＣ１−ＩＮＨ ｍＲＮＡの計測のため肝臓を採取した。
図１０Ａに示すとおり、単回３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４の投与により、これらのマウスにおいて血管透過性が正常化し、図１０Ｂに示されるとおり、この投与はこれらの動物の肝臓におけるＦ１２ ｍＲＮＡのロバストな用量依存的低下をもたらした。これらの動物の肝内Ｃ１−ＩＮＨレベルは、対照投与群の肝内Ｃ１−ＩＮＨレベルの０．０１％未満であった。これらのデータは、ＡＤ−６７２４４が過剰なブラジキニン刺激を緩和し得ることを実証している。
実施例１２．非ヒト霊長類におけるインビボＦ１２サイレンシング
非ヒト霊長類におけるＡＤ−６７２４４の有効性を決定するため、雌カニクイザル（ｎ＝３／群）に、単回３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４を皮下投与した。投与の−５、−３、−１、３、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８４、９１、９８、１１２、１２６、及び１４０日後にカニクイザルＦ１２血漿タンパク質レベルのレベルをＥＬＩＳＡによって計測した。図１１は、単回０．３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４を投与すると、Ｆ１２タンパク質の８５％を超える低下がもたらされたことを実証している。図１１はまた、Ｆ１２タンパク質のこの低下が持続的であり、それぞれ投与後２ヵ月及び３ヵ月に７０％及び５０％を超える低下があったことも実証している。
実施例１３．マウスにおいてＡＤ−６７２４４の５’修飾が効力に及ぼす効果
ビニルホスフェート（ＶＰ）によるＡＤ−６７２４４の５’アンチセンスリン酸の修飾が薬剤の効力に及ぼす効果をマウスで決定した。野生型マウス（ｎ＝３／群）に単回０．５ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６７２４４（センス：５’−ａｓａｓｃｕｃａＡｆｕＡｆＡｆＡｆｇｕｇｃｕｕｕｇａａ−３’（配列番号１８６６）；アンチセンス：５’−ｕｓＵｆｓｃａａＡｆｇＣｆＡｆｃｕｕｕＡｆｕＵｆｇａｇｕｕｓｕｓｃ−３’（配列番号１８６７）；ＡＬＮ−Ｆ１２）又はＡＤ−７４８４１（センス：５’−ａｓａｓｃｕｃａＡｆｕＡｆＡｆＡｆｇｕｇｃｕｕｕｇａａ−３’（配列番号１８６８）；アンチセンス：５’−ＶＰ−ｕｓＵｆｓｃａａＡｆｇＣｆＡｆｃｕｕｕＡｆｕＵｆｇａｇｕｕｓｕｓｃ−３’（配列番号１８６９）；ＡＬＮ−Ｆ１２−ＶＰ）のいずれかを投与した。投与後０、３、７、１５、及び２１日目にＦ１２タンパク質の血漿濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。図１２は、ビニルホスフェートによるアンチセンスリン酸基の５’修飾によってＡＤ−６７２４４の効力がやや増加したことを実証している。
実施例１４．Ｆ１２ ｓｉＲＮＡ二本鎖の合成及びインビトロスクリーニング
Ｆ１２を標的とする、例えば、配列番号９のヌクレオチド約２０００〜２０６０を標的とする更なるｉＲＮＡ剤を設計し、合成し、及び上記に記載したとおりインビトロ有効性に関してスクリーニングした。更なる非修飾Ｆ１２センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表２３に示す。更なる修飾Ｆ１２センス鎖及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表２４に示す。表２５は、指示される更なるＦ１２ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞における単回投与スクリーンの結果を提供する。データは、ＡＤ−１９５５と比べた残存ｍＲＮＡのパーセントとして表す。
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実施例１５．Ｆ１２ ｓｉＲＮＡ二本鎖の５’末端修飾の評価
５’−ホスフェート模倣体、即ちビニルホスフェートを含むヌクレオチドを含むＦ１２を標的とする更なるｉＲＮＡ剤を設計し、合成し、及び上記に記載したとおりインビトロ有効性に関してスクリーニングした。これらの薬剤の同じ非修飾及び修飾ヌクレオチド配列を含むが５’−アンチセンス鎖ビニルホスフェート修飾を有しない薬剤もまた設計し、合成し、及び上記に記載したとおりスクリーニングした。これらの更なる非修飾Ｆ１２センス鎖及びアンチセンス鎖配列の全ての詳細なリストを表２６に示す。これらの更なる修飾Ｆ１２センス鎖及びアンチセンス鎖配列の全ての詳細なリストを表２７に示す。表２８は、Ｆ１２ ｄｓＲＮＡ剤をトランスフェクトした初代マウス肝細胞における単回投与スクリーンの結果を提供する。
野生型マウスに単回０．５ｍｇ／ｋｇ用量の薬剤を皮下投与し、投与後３、７、及び１５日目に動物の血漿中のＦ１２タンパク質レベルを決定することにより、これらの化合物のサブセットのインビボ有効性もまた評価した。図１３はこれらのアッセイの結果を示し、アンチセンス鎖に５’ビニルホスフェートを加えると、指示薬剤のインビボ有効性に対して中程度の効果があったことを実証している。
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均等物
当業者は、本明細書に記載される具体的な実施形態及び方法の多くの均等物を認識し、又は常法の域を越えない実験を用いて確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (96)

  1. 第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号９のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つ前記アンチセンス鎖が、配列番号１０のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ剤。
  2. 第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表９、１０、１９Ｃ、１９Ｄ、２０、２１、２３、２４、２６、及び２７のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む、ｄｓＲＮＡ剤。
  3. 第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号９のヌクレオチド２０００〜２０６０と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む、ｄｓＲＮＡ剤。
  4. カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つ前記アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ剤。
  5. カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表３、４、１９Ａ、又は１９Ｂのいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む、ｄｓＲＮＡ剤。
  6. キニノーゲン１（ＫＮＧ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１７のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つ前記アンチセンス鎖が、配列番号１８のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ剤。
  7. キニノーゲン１（ＫＮＧ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤がセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表１５、１６、１９Ｅ又は１９Ｆのいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む、ｄｓＲＮＡ剤。
  8. 前記ｄｓＲＮＡ剤が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  9. 第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）（Ｆ１２）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖が、配列番号９のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つ前記アンチセンス鎖が、配列番号１０のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、且つ
    前記センス鎖が、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされている、ｄｓＲＮＡ剤。
  10. カリクレインＢ、血漿（フレッチャー因子）１（ＫＬＫＢ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つ前記アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、且つ
    前記センス鎖が、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされている、ｄｓＲＮＡ剤。
  11. キニノーゲン１（ＫＮＧ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖が、配列番号１７のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、且つ前記アンチセンス鎖が、配列番号１８のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、且つ
    前記センス鎖が、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートされている、ｄｓＲＮＡ剤。
  12. 前記センス鎖のヌクレオチドの全て及び前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  13. 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ−ヌクレオチド、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定ヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’−ホスフェートを含むヌクレオチド、及び５’−ホスフェート模倣体を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  14. 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、２’−Ｏ−メチル及び２’フルオロ修飾からなる群から選択される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  15. 少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に含む、請求項１３又は１４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  16. ６〜８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  17. 前記相補性領域が少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  18. 前記相補性領域が１９〜３０ヌクレオチド長である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  19. 前記相補性領域が２１ヌクレオチド長である、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  20. 前記相補性領域が２１〜２３ヌクレオチド長である、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  21. 前記相補性領域が１９ヌクレオチド長である、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  22. 各鎖が３０ヌクレオチド長以下である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  23. 各鎖が独立して１９〜３０ヌクレオチド長である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  24. 各鎖が独立して１９〜２５ヌクレオチド長である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  25. 少なくとも一方の鎖が少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  26. 少なくとも一方の鎖が少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  27. リガンドを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  28. 前記リガンドが前記ｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる、請求項２７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  29. 前記リガンドがＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項９〜１１及び２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  30. 前記リガンドが、
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     である、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  31. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、以下の概略図
    Figure 2018519797
     に示されるとおりのリガンドにコンジュゲートされ、及び、式中ＸはＯ又はＳである、請求項３０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  32. 前記ＸがＯである、請求項３１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  33. 前記薬剤が、ＡＤ−６６１７０、ＡＤ−６６１７３、ＡＤ−６６１７６、ＡＤ−６６１２５、ＡＤ−６６１７２、ＡＤ−６６１６７、ＡＤ−６６１６５、ＡＤ−６６１６８、ＡＤ−６６１６３、ＡＤ−６６１１６、ＡＤ−６６１２６、及びＡＤ−６７２４４からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  34. 前記薬剤が、ＡＤ−６５０７７、ＡＤ−６５１７０、ＡＤ−６５１０３、ＡＤ−６５０８３、ＡＤ−６５０８７、ＡＤ−６５１４９、ＡＤ−６４６５２、ＡＤ−６５１６２、ＡＤ−６５１５３、ＡＤ−６５０８４、ＡＤ−６５０９９、及びＡＤ−６６９４８からなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  35. 前記薬剤が、ＡＤ−６６２５９、ＡＤ−６６２６１、ＡＤ−６６２６２、ＡＤ−６６２６３、ＡＤ−６６３４、及びＡＤ−６７３４４からなる群から選択される、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  36. 請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する細胞。
  37. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤の少なくとも一方の鎖をコードするベクター。
  38. 請求項４又は５に記載のｄｓＲＮＡ剤の少なくとも一方の鎖をコードするベクター。
  39. 請求項６又は７に記載のｄｓＲＮＡ剤の少なくとも一方の鎖をコードするベクター。
  40. 請求項４、５、及び１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項３８に記載のベクターを含む、ＫＬＫＢ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  41. 請求項１〜３及び９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項３７に記載のベクターを含む、Ｆ１２遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  42. 請求項６、７、及び１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤又は請求項３９に記載のベクターを含む、ＫＮＧ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  43. ｄｓＲＮＡ剤が非緩衝液中で投与される、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  44. 前記非緩衝液が生理食塩水又は水である、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 前記ｄｓＲＮＡ剤が緩衝液で投与される、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  46. 前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、又はリン酸塩又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４５に記載の医薬組成物。
  47. 前記緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項４５に記載の医薬組成物。
  48. 請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤と脂質製剤とを含む医薬組成物。
  49. 細胞におけるＫＬＫＢ１発現を阻害する方法であって、
    （ａ）請求項４、５、及び１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４０及び４３〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物に前記細胞を接触させる工程と；
    （ｂ）ＫＬＫＢ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって工程（ａ）で産生された前記細胞を維持し、それによって前記細胞における前記ＫＬＫＢ１遺伝子の発現を阻害する工程と、を含む方法。
  50. 細胞におけるＦ１２発現を阻害する方法であって、
    （ａ）請求項１〜３及び９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４１及び４３〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物に前記細胞を接触させる工程と；
    （ｂ）Ｆ１２遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって工程（ａ）で産生された前記細胞を維持し、それによって前記細胞における前記Ｆ１２遺伝子の発現を阻害する工程と、を含む方法。
  51. 細胞におけるＫＮＧ１発現を阻害する方法であって、
    （ａ）請求項６、７、及び１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４２〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物に前記細胞を接触させる工程と；
    （ｂ）ＫＮＧ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって工程（ａ）で産生された前記細胞を維持し、それによって前記細胞における前記ＫＮＧ１遺伝子の発現を阻害する工程と、を含む方法。
  52. 前記細胞が対象の体内にある、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記対象がヒトである、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記ＫＬＫＢ１発現が、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％阻害される、請求項４９、５２、及び５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記Ｆ１２発現が、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％阻害される、請求項５０、５２、及び５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ＫＮＧ１発現が、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％阻害される、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  57. 接触活性化経路遺伝子の発現の低下から利益を受け得る疾患又は障害を有する対象を治療する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象を治療する工程を含む方法。
  58. 接触活性化経路遺伝子の発現の低下から利益を受け得る疾患又は障害を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の予防有効量を前記対象に投与し、それによって接触活性化経路遺伝子の発現の低下から利益を受け得る障害を有する前記対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む方法。
  59. 前記対象への前記ｄｓＲＮＡの投与により、ブラジキニンレベルの低下又は凝固第ＸＩＩ因子活性の低下が生じる、請求項５７又は５８に記載の方法。
  60. 前記障害が接触活性化経路関連疾患である、請求項５７又は５８に記載の方法。
  61. 前記接触活性化経路関連疾患が血栓形成傾向である、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記接触活性化経路関連疾患が遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）である、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記接触活性化経路関連疾患がフレッチャー因子欠乏症である、請求項６０に記載の方法。
  64. 前記接触活性化経路関連疾患が本態性高血圧症である、請求項６０に記載の方法。
  65. 前記少なくとも１つの症状が血管浮腫発作である、請求項５８に記載の方法。
  66. 前記少なくとも１つの症状が血栓形成である、請求項５８に記載の方法。
  67. 前記対象がヒトである、請求項５７又は５８に記載の方法。
  68. 抗ＫＬＫＢ１抗体、又はその抗原結合断片を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項５７〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記方法が、請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤の治療有効量を前記対象に投与する工程を含み、及び前記方法が、請求項４、５、及び１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項５７に記載の方法。
  70. 前記方法が、請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤の治療有効量を前記対象に投与する工程を含み、及び前記方法が、請求項６、７、及び１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項５７に記載の方法。
  71. 前記方法が、請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤の予防有効量を前記対象に投与する工程を含み、及び前記方法が、請求項４、５、及び１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項５８に記載の方法。
  72. 前記方法が、請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤の予防有効量を前記対象に投与する工程を含み、及び前記方法が、請求項６、７、及び１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項５８に記載の方法。
  73. 前記対象のブラジキニン及び／又は凝固第ＸＩＩ因子レベルを計測する工程を更に含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
  74. 血栓形成傾向を有する対象を治療する方法であって、前記方法が、請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４１及び４３〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって前記対象を治療する工程を含む方法。
  75. 血栓形成傾向を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法であって、請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４１及び４３〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の予防有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む方法。
  76. 請求項４、５、又は１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項７２又は７３に記載の方法。
  77. 請求項６、７、又は１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項７２又は７３に記載の方法。
  78. 遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有する対象を治療する方法であって、請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４１及び４３〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象を治療する工程を含む方法。
  79. 遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法であって、請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４１及び４３〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の予防有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む方法。
  80. 請求項４、５、又は１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項７６又は７７に記載の方法。
  81. 請求項６、７、又は１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項７６又は７７に記載の方法。
  82. 対象におけるＫＬＫＢ１の発現を阻害する方法であって、
    請求項４、５、又は１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象におけるＫＬＫＢ１の発現を阻害する工程を含む方法。
  83. 対象におけるＦ１２の発現を阻害する方法であって、
    請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象におけるＦ１２の発現を阻害する工程を含む方法。
  84. 対象におけるＫＮＧ１の発現を阻害する方法であって、
    請求項６、７、又は１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象におけるＫＮＧ１の発現を阻害する工程を含む方法。
  85. 血栓形成リスクのある対象の血栓形成を予防する方法であって、請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４１及び４３〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の予防有効量を前記対象に投与し、それによって血栓形成リスクのある対象の血栓形成を阻害する工程を含む方法。
  86. 前記血栓形成リスクのある対象が接触活性化経路関連疾患又は障害を有する、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記接触活性化経路関連疾患が血栓形成傾向である、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記接触活性化経路関連疾患が遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）である、請求項８６に記載の方法。
  89. 前記接触活性化経路関連疾患がフレッチャー因子欠乏症である、請求項８６に記載の方法。
  90. 前記接触活性化経路関連疾患が本態性高血圧症である、請求項８６に記載の方法。
  91. 前記血栓形成リスクのある対象が、外科患者；内科患者；妊娠中の対象；分娩後の対象；血栓の既往がある対象；ホルモン補充療法を受けている対象；長時間座っている対象；及び肥満の対象からなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
  92. 請求項４、５、又は１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項８３に記載の方法。
  93. 請求項６、７、又は１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項８３に記載の方法。
  94. 遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）を有する対象の血管浮腫発作を予防する方法であって、請求項１〜３又は９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、又は請求項４１及び４３〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の予防有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象の血管浮腫発作を予防する工程を含む方法。
  95. 請求項４、５、又は１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項９４に記載の方法。
  96. 請求項６、７、又は１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項９４に記載の方法。
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