EA045013B1

EA045013B1 - Композиции на основе irna для фактора xii (фактора хагемана) (f12), плазменного калликреина b (фактора флетчера) 1 (klkb1) и кининогена 1 (kng1) и способы их применения

Info

Publication number: EA045013B1
Application number: EA201792444
Authority: EA
Inventors: Акин Акинк; Грегори Хинкл; Мартин Майер; Джеймс Батлер; Дзингсюань Лю
Original assignee: Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2016-05-05
Publication date: 2023-10-26

Description

Родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 62/157890, поданной 6 мая 2015 года, предварительной заявки на выдачу патента США № 62/260887, поданной 30 ноября 2015 года, и предварительной заявки на выдачу патента США № 62/266958, поданной 14 декабря 2015 года. Полное содержание каждой из вышеупомянутых заявок тем самым включено в данный документ посредством ссылки.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка включает перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Указанная ASCIIкопия, созданная 3 мая 2016 года, имеет название 121301-03120_SL.txt, и ее размер составляет 721827 байт.

Уровень техники

Система свертывания крови является необходимой для гемостаза, проявляя при этом реакцию на повреждение сосуда в виде локального образования сгустка, образованного сетью фибрина и активированными тромбоцитами. Свертывание крови, продуцирование тромбина и образование фибрина могут инициироваться двумя различными путями, называемыми внешним и внутренним путями.

Внешний путь включает связывание плазменного фактора VIIa (FVIIa) с внесосудистым тканевым фактором (TF) в участке повреждения сосуда.

Внутренний путь инициируется за счет зависимой от контакта с поверхностью активации плазменного фактора XII (F12) с F12a в процессе, называемом контактной активацией. В контактную активацию вовлечены два других белка, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген, которые циркулируют в виде бимолекулярного комплекса. В совокупности эти три белка, FXII, прекалликреин и HK, образуют путь контактной активации свертывания крови, также называемый калликреин-кининовой системой. Когда путь контактной активации свертывания крови инициируется связыванием F12 с отрицательно заряженными поверхностями (или макромолекулами), происходит индуцирование конформационного изменения F12, что приводит к образованию активного F12 (F12a). F12a расщепляет прекалликреин с образованием активного калликреина (α-калликреина), который в свою очередь реципрокно активирует F12 для продуцирования дополнительного F12a. Активный калликреин затем расщепляет высокомолекулярный кининоген с высвобождением брадикинина. F12a, образующийся в результате контактной активации, также активирует фактор XI (F11) с образованием F11a, при этом запускается ряд событий протеолитического расщепления, который завершается образованием тромбина и образованием фибринового сгустка.

Что интересно, было показано, что контактная система активации не является необходимой для гемостаза. У людей и других животных с дефицитом по белку, вовлеченному в контактную активацию, практически не проявляются симптомы, и у гомозигот дефицит по F12 не ассоциируется с каким-либо заболеванием или нарушением. Однако было показано, что контактная система активации играет важную роль в развитии тромботического заболевания, поскольку фармакологическое ингибирование F12a или деструкция генов F12 или высокомолекулярного кининогена могут защищать мышей от экспериментально индуцируемого тромбоза в различных моделях.

У здоровых субъектов имеет место гомеостатический баланс между прокоагуляционной активностью и антикоагуляционной и фибринолитической активностью. Однако многочисленные генетические, приобретенные факторы и факторы окружающей среды могут смещать регуляцию этого баланса в сторону свертывания крови, что приводит к тромбозу, патологическому образованию тромбов, инициации событий, представляющих угрозу для жизни. Например, образование тромбов в вене может приводить в результате, например, к тромбозу глубоких вен (DVT), a образование тромбов в артерии или камере сердца может приводить в результате, например, к инфаркту миокарда или инсульту. Тромбы могут затруднять кровоток и в участке образования или отрываться и приводить к эмболизации с последующей закупоркой дистального кровеносного сосуда (например, эмболия сосудов легких или эмболический инсульт).

Приобретенные факторы/факторы окружающей среды, которые могут приводить к патологической контактной активации и тромбозу, опосредованному контактным путем активации, включают различные вмешательства стоматологического, хирургического и медицинского характера, такие как фибрилляция предсердий, лечение рака, обездвиживание, наличие центрального венозного катетера, имплантатов и экстракорпоральная оксигенация. Вследствие таких медицинских и хирургических вмешательств в результате повреждения тканей высвобождаются тканевые факторы и обеспечивается воздействие различных триггеров контактного пути активации, таких как ДНК, РНК, фосфат, коллаген и ламинин), которые активируют контактный путь активации, приводящий к тромбозу.

Наследственное нарушение, при котором происходит нарушение регуляции гомеостатического баланса между прокоагуляционной активностью и антикоагуляционной и фибринолитической активностями, представляет собой наследственный ангионевротический отек (HAE). HAE представляет собой редкое нарушение с аутосомно-доминантным наследованием, которое является причиной рецидивирующего отека и опухания конечностей, лица, гортани, верхних дыхательных путей, живота, туловища и половых

- 1 045013 органов и незудящей сыпи у одной трети пациентов. Пациенты с HAE, не получающие лечение, в среднем переносят от одного до двух приступов ангионевротического отека в месяц, но частота и тяжесть эпизодов может в значительной степени варьировать. Ангионевротический отек зачастую проявляется обезображиванием и потерей трудоспособности, что приводит в результате к частой госпитализации, а в некоторых случаях пациенты нуждаются в психиатрической помощи для лечения ассоциированной с заболеванием тревожности. Приступы в области брюшной полости могут вызывать сильную боль, тошноту и рвоту, а в некоторых случаях приводят к необходимости нештатных оперативных вмешательств. Кроме того, больше половины пациентов с HAE также на протяжении их жизни переносят опасный для жизни отек гортани, при котором может потребоваться неотложная трахеостомия для предупреждения асфиксии. Предположительно HAE поражено от 6000 до 10000 индивидуумов различных этнических групп в Соединенных Штатах, и он приводит к значительному материальному ущербу для пациентов, при этом он является причиной от 15000 до 30000 визитов в больницу и от 20 до 100 дней нетрудоспособности в год.

Причиной HAE является мутация в гене С1-ингибитора (C1INH, SERPING1), что приводит в результате к дефициту белка C1INH. Было показано, что свыше 250 различных мутаций C1INH обуславливают клинические проявления HAE. Эти мутации C1INH, как правило, наследуются генетически, однако до 25% случаев HAE являются результатом de novo мутаций C1INH. HAE I типа обусловлен мутациями C1INH, что приводит в результате к более низким уровням усеченных или неправильно уложенных белков, которые секретируются неэффективно, и составляет примерно 85% случаев HAE. HAE II типа составляет приблизительно 15% случаев, и он обусловлен мутациями вблизи активного сайта C1INH, что приводит к нормальным уровням неправильно функционирующего белка C1INH. В дополнение к этому HAE III типа, редкая третья форма заболевания, возникает вследствие мутации с приобретением функции фактора свертывания крови XII (F12) (фактора Хагемана).

С1-ингибитор представляет собой ингибитор сериновых протеаз из семейства серпинов и является основным ингибитором протеаз, вовлеченных в контактный путь активации свертывания крови и путь активации системы комплемента, а также минорным ингибитором фибринолитической протеазы плазмина. Эти протеолитические каскады активируются во время приступа HAE, опосредуя выработку веществ, которые повышают проницаемость сосудов, например брадикинина. Исследования показали, что пептид брадикинин, который активирует сигнальные пути провоспалительных реакций, которые опосредуют расширение сосудов и индуцируют хемотаксис нейтрофилов, является основным веществом, которое повышает проницаемость сосудов при приступе HAE посредством связывания с рецептором брадикинина на клетках эндотелия сосудов.

Как правило, C1INH ингибирует самоактивацию F12, способность F12a к активации прекалликреина, активацию высокомолекулярного кининогена с помощью калликреина и активацию F12 калликреином по типу обратной связи. Следовательно, мутации, обуславливающие дефицит C1INH или продуцирование F12 с приобретением функции, приводят в результате к избыточному продуцированию брадикинина и возникновению ангионевротического отека в форме HAE.

В настоящее время HAE можно лечить с помощью 17а-алкилированных андрогенов в профилактических целях для снижения вероятности повторных эпизодов, или с помощью специфических в отношении заболевания терапевтических средств для лечения острых приступов. Приблизительно 70% индивидуумов с HAE лечат с помощью андрогенов или они вовсе остаются без лечения, а приблизительно 30% получают терапевтические средства. Андрогены не подходят для краткосрочного лечения острых приступов, поскольку требуется несколько дней, чтобы проявилась их эффективность, при этом они могут характеризоваться значительными побочными эффектами и могут негативно влиять на рост и развитие. Вследствие этого андрогены применяют только для долгосрочной профилактики и обычно их не вводят беременным женщинам или детям. Кроме того, существующие терапевтические средства, применяемые для лечения острых приступов, должны вводиться внутривенно много раз в неделю, или они могут вызывать побочные эффекты, в случае которых требуется введение лекарственных средств и последующее наблюдение за пациентом в больнице, при этом ограничивается их регулярное профилактическое применение для долгосрочного контроля заболевания. Таким образом, в отсутствие схем, согласно которым препараты можно вводить безопасно, эффективно и с помощью более удобных путей, и схем для лечения приступов ангионевротического отека и профилактического контроля рецидивирующих приступов у большой части пациентов, в том числе беременных женщин и детей, существует потребность в альтернативных видах терапии для субъектов, страдающих HAE.

Соответственно, в данной области существует потребность в композициях и способах ингибирования тромбоза у субъекта с риском образования тромба, такого как субъект с наследственным, приобретенным или обусловленным факторами окружающей среды риском образования тромба.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении предусмотрены композиции на основе iRNA, которые обеспечивают опосредованное РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC) расщепление РНК-транскриптов гена плазменного калликреина В (фактора Флетчера) 1 (KLKB1), РНК-транскриптов гена фактора XII (F12) или РНК-транскриптов гена кининогена (KNG1). Если не указано иное и с целью упрощения тер- 2 045013 мин ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, используемый в данном документе, относится к гену KLKB1, гену F12 или гену KNG1. Ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, может находится в клетке, например в клетке организма такого субъекта, как человек.

Соответственно, в одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены средства (для RNAi) на основе двухнитевой рибонуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии фактора XII (фактора Хагемана) (F12), где двухнитевое средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, где смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 9, и антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 10.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены средства (для RNAi) на основе двухнитевой рибонуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии фактора XII (фактора Хагемана) (F12), где двухнитевое средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от любой из антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26 и 27.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены средства (для RNAi) на основе двухнитевой рибонуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии фактора XII (фактора Хагемана) (F12), где двухнитевое средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2000-2060 из SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2000-2030 из SEQ ID NO: 9. В других вариантах осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2030-2060 из SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 20102040 из SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2010-2035 из SEQ ID NO: 9. В другом варианте осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2015-2040 из SEQ ID NO: 9. В другом варианте осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2015-2045 из SEQ ID NO: 9. В другом варианте осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2020-2050 из SEQ ID NO: 9. В другом варианте осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 20202045 из SEQ ID NO: 9. В еще одних вариантах осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от любой из последовательностей в диапазонах SEQ ID NO: 9, представленных в табл. 24. В одном варианте осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2018-2040 из SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности антисмысловой нити AD-67244 (5'-UUCAAAGCACUUUAUUGAGUUUC-3') (SEQ ID NO: 25). В одном варианте осуществления смысловая нить содержит нуклеотидную последовательность смысловой нити AD-67244. В некоторых вариантах осуществления участок комплементарности содержит 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 нуклеотида, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2015-2040 из SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления участок комплементарности содержит 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 нуклеотида, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2015-2045 из SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления участок комплементарности содержит 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 нуклеотида, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 2018-2040 из SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления участок комплементарности содержит 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 нуклеотида, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидов 20182045 из SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления средство содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. В другом варианте осуществления все нуклеотиды указанного средства представляют собой модифицированные нуклеотиды. В одном варианте осуществления средство допол- 3 045013 нительно содержит лиганд, например, лиганд, присоединенный к З'-концу смысловой нити. В одном варианте осуществления длина каждой из смысловой нити и антисмысловой нити независимо составляет

15-30 нуклеотидов. В другом варианте осуществления длина каждой из смысловой нити и антисмысловой нити независимо составляет 19-25 нуклеотидов.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены средства (для RNAi) на основе двухнитевой рибонуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии плазменного калликреина В (фактора Флетчера) 1 (KLKB1), где двухнитевое средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, где смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 1, и антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены средства (для RNAi) на основе двухнитевой рибонуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии плазменного калликреина В (фактора Флетчера) 1 (KLKB1), где двухнитевое средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от любой из антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из табл. 3, 4, 19А или 19В.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены средства (для RNAi) на основе двухнитевой рибонуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии кининогена 1 (KNG1), где двухнитевое средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, где смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 17, и антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 18.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены средства (для RNAi) на основе двухнитевой рибонуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии кининогена 1 (KNG1), где двухнитевое средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от любой из антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из табл. 15, 16, 19Е или 19F.

В одном варианте осуществления антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от любой из антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27.

В одном варианте осуществления двухнитевые средства для RNAi, предусмотренные в данном документе, содержат по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены средства (для RNAi) на основе двухнитевой рибонуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии плазменного калликреина В (фактора Флетчера) 1 (KLKB1), где двухнитевое средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, образующие двухнитевой участок, где смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 1, и антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 2, где практически все нуклеотиды смысловой нити и практически все нуклеотиды антисмысловой нити представляют собой модифицированные нуклеотиды, и где смысловая нить конъюгирована с лигандом, присоединенным к 3'концу.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены средства (для RNAi) на основе двухнитевой рибонуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии фактора XII (фактора Хагемана) (F12), где двухнитевое средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, образующие двухнитевой участок, где смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 9, и антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 10, где практически все нуклеотиды смысловой нити и практически все нуклеотиды антисмысловой нити представляют собой модифицированные нуклеотиды, и где смысловая нить конъюгирована с лигандом, присоединенным к 3'-концу.

В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены средства (для RNAi) на основе двухнитевой рибонуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии кининогена 1 (KNG1), где двухнитевое средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить, образующие двухнитевой участок, где смысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 17, и антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 18, где практически все нуклеотиды смысловой

- 4 045013 нити и практически все нуклеотиды антисмысловой нити представляют собой модифицированные нуклеотиды, и где смысловая нить конъюгирована с лигандом, присоединенным к 3'-концу.

В определенных вариантах осуществления dsRNA содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. В определенных вариантах осуществления dsRNA содержит не более 4 (т.е. 4, 3, 2, 1 или 0) немодифицированных нуклеотидов в смысловой нити. В определенных вариантах осуществления dsRNA содержит не более 4 (т.е. 4, 3, 2, 1 или 0) немодифицированных нуклеотидов в антисмысловой нити. В определенных вариантах осуществления dsRNA содержит не более 4 (т.е. 4, 3, 2, 1 или 0) немодифицированных нуклеотидов как в смысловой нити, так и в антисмысловой нити. В определенных вариантах осуществления все нуклеотиды в смысловой нити dsRNA представляют собой модифицированные нуклеотиды. В определенных вариантах осуществления все нуклеотиды в антисмысловой нити dsRNA представляют собой модифицированные нуклеотиды. В определенных вариантах осуществления все нуклеотиды в смысловой нити dsRNA и все нуклеотиды антисмысловой нити представляют собой модифицированные нуклеотиды.

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из дезоксинуклеотида, 3'-концевого дезокситиминового (dT) нуклеотида, 2'-О-метил-модифицированного нуклеотида, 2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, запертого нуклеотида, незапертого нуклеотида, конформационно ограниченного нуклеотида, конформационно затрудненного этилом нуклеотида, нуклеотида с удаленным азотистым основанием, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-О-аллил-модифицированного нуклеотида, 2'-С-алкил-модифицированного нуклеотида, 2'-гидроксил-модифицированного нуклеотида, 2'метоксиэтил-модифицированного нуклеотида, 2'-O-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата, нуклеотида, содержащего не встречающееся в природе основание, тетрагидропиран-модифицированного нуклеотида, 1,5-ангидрогекситол-модифицированного нуклеотида, циклогексенил-модифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего фосфоротиоатную группу, нуклеотида, содержащего метилфосфонатную группу, нуклеотида, содержащего 5'-фосфат, и нуклеотида, содержащего миметик 5'-фосфата, например, винилфосфат.

В одном варианте осуществления по меньшей мере один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из 2'-O-метил- и 2'-фтор-модификаций.

В определенных вариантах осуществления антисмысловая нить двухнитевых средств для RNAi любого из аспектов настоящего изобретения содержит не более 8 2'-фтор-модификаций, не более 7 2'-фтормодификаций, не более 6 2'-фтор-модификаций, не более 5 2'-фтор-модификаций, не более 4 2'-фтормодификаций, не более 3 2'-фтор-модификаций, не более 2 2'-фтор-модификаций, не более 1 2'-фтормодификации или не более 1 2'-фтор-модификации. В других вариантах осуществления смысловая нить двухнитевых средств для RNAi любого из аспектов настоящего изобретения содержит не более 6 2'фтор-модификаций, не более 5 2'-фтор-модификаций, не более 4 2'-фтор-модификаций, не более 3 2'фтор-модификаций, не более 2 2'-фтор-модификаций, не более 1 2'-фтор-модификации или не более 1 2'фтор-модификации.

В одном варианте осуществления двухнитевое средство для RNAi дополнительно содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную межнуклеотидную связь. В одном варианте осуществления двухнитевое средство для RNAi содержит 6-8 фосфоротиоатных межнуклеотидных связей.

Длина участка комплементарности может составлять по меньшей мере 17 нуклеотидов, 18 нуклеотидов, 19 нуклеотидов, 20 нуклеотидов или 21 нуклеотид.

В определенном варианте осуществления длина участка комплементарности может составлять 1921 нуклеотид или 21-23 нуклеотида.

В определенных вариантах осуществления длина каждой нити двухнитевого средства для RNAi составляет не более 30 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления длина двухнитевого средства для RNAi составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов.

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна нить двухнитевого средства для RNAi содержит 3'-выступающий конец по меньшей мере из 1 нуклеотида. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна нить содержит 3'-выступающий конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов.

В определенных вариантах осуществления двухнитевое средство для RNAi дополнительно содержит лиганд. В определенных вариантах осуществления лиганд конъюгирован с 3'-концом смысловой нити dsRNA. В определенных вариантах осуществления лиганд представляет собой производное Nацетилгалактозамина (GalNAc). В определенных вариантах осуществления лиганд представляет собой одно или несколько производных GalNAc, присоединенных посредством одновалентного, двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. В определенных вариантах осуществления лиганд представляет собой

- 5 045013

В определенных вариантах осуществления dsRNA конъюгирована с лигандом, как показано на следующей схеме:

и где X представляет собой О или S.

В одном варианте осуществления X представляет собой О.

В одном варианте осуществления смысловая и антисмысловая последовательности выбраны из любой из таких последовательностей, приведенных в любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27.

В одном варианте осуществления участок комплементарности состоит из любой из антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27.

В одном варианте осуществления средство на основе dsRNA, которое ингибирует экспрессию F12, выбрано из группы, состоящей из AD-66170, AD-66173, AD-66176, AD-66125, AD-66172, AD-66167, AD66165, AD-66168, AD-66163, AD-66116, AD-66126 и AD-67244. В другом варианте осуществления средство на основе dsRNA, которое ингибирует экспрессию F12, представляет собой AD-67244.

В одном варианте осуществления средство на основе dsRNA, которое ингибирует экспрессию KLKB1, выбрано из группы, состоящей из AD-65077, AD-65170, AD-65103, AD-65083, AD-65087, AD65149, AD-64652, AD-65162, AD-65153, AD-65084, AD-65099 и AD-66948. В другом варианте осуществления средство на основе dsRNA, которое ингибирует экспрессию KLKB1, представляет собой AD66948.

В одном варианте осуществления средство на основе dsRNA, которое ингибирует экспрессию KNG1, выбрано из группы, состоящей из AD-66259, AD-66261, AD-66262, AD-66263, AD-6634 и AD67344. В другом варианте осуществления средство на основе dsRNA, которое ингибирует экспрессию KNG1, представляет собой AD-67344.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены клетки, содержащие двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на KLKB1. В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены клетки, содержащие двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на F12. В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены клетки, содержащие двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на KNG1.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены векторы, кодирующие по меньшей мере одну нить двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на KLKB1. В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены векторы, кодирующие по меньшей мере одну нить двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на F12. В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены векторы, кодирующие по меньшей мере одну нить двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на KNG1.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены фармацевтические композиции для ин

- 6 045013 гибирования экспрессии гена KLKB1, содержащие двухнитевое средство для RNAi или вектор по настоящему изобретению. В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены фармацевтические композиции для ингибирования экспрессии гена F12, содержащие двухнитевое средство для RNAi или вектор по настоящему изобретению. В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены фармацевтические композиции для ингибирования экспрессии гена KNG1, содержащие двухнитевое средство для RNAi или вектор по настоящему изобретению.

Фармацевтические композиции, предусмотренные в данном документе, можно вводить в незабуференном растворе, например, солевом растворе или воде, или вводить с буферным раствором, например, буферным раствором, содержащим ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. В одном варианте осуществления буферный раствор представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).

В одном варианте осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат двухнитевое средство для RNAi, описанное в данном документе, и липидный состав.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования экспрессии KLKB1 в клетке. Указанные способы предусматривают приведение клетки в контакт с двухнитевым средством для RNAi или фармацевтической композицией по настоящему изобретению и поддержание клетки в течение времени, достаточного для достижения разрушения мРНК-транскрипта гена KLKB1, за счет чего обеспечивается ингибирование экспрессии гена KLKB1 в клетке.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы экспрессии F12 в клетке. Указанные способы предусматривают приведение клетки в контакт с двухнитевым средством для RNAi или фармацевтической композицией по настоящему изобретению и поддержание клетки в течение времени, достаточного для достижения разрушения мРНК-транскрипта гена F12, за счет чего обеспечивается ингибирование экспрессии гена F12 в клетке.

В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы экспрессии KNG1 в клетке. Указанные способы предусматривают приведение клетки в контакт с двухнитевым средством для RNAi или фармацевтической композицией по настоящему изобретению и поддержание клетки в течение времени, достаточного для достижения разрушения мРНК-транскрипта гена KNG1, за счет чего обеспечивается ингибирование экспрессии гена KNG1 в клетке.

В одном варианте осуществления клетка находится в организме субъекта, такого как субъектчеловек.

В одном варианте осуществления экспрессию KLKB1 ингибируют по меньшей мере на приблизительно 30%, на приблизительно 40%, на приблизительно 50%, на приблизительно 60%, на приблизительно 70%, на приблизительно 80%, на приблизительно 90%, на приблизительно 95%, на приблизительно 98% или на приблизительно 100%.

В одном варианте осуществления экспрессию F12 ингибируют по меньшей мере на приблизительно 30%, на приблизительно 40%, на приблизительно 50%, на приблизительно 60%, на приблизительно 70%, на приблизительно 80%, на приблизительно 90%, на приблизительно 95%, на приблизительно 98% или на приблизительно 100%.

В одном варианте осуществления экспрессию KNG1 ингибируют по меньшей мере на приблизительно 30%, на приблизительно 40%, на приблизительно 50%, на приблизительно 60%, на приблизительно 70%, на приблизительно 80%, на приблизительно 90%, на приблизительно 95%, на приблизительно 98% или на приблизительно 100%.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения субъекта с заболеванием или нарушением, на которые будет оказывать благоприятное воздействие снижение уровня экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. Указанные способы предусматривают введение субъекту терапевтически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, за счет чего осуществляется лечение субъекта.

В одном варианте осуществления ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой ген KLKB1. В другом варианте осуществления ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой ген F12. В еще одном варианте осуществления ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой ген KNG1.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта с заболеванием или нарушением, на которые будет оказывать благоприятное воздействие снижение уровня экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. Указанные способы предусматривают введение субъекту профилактически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, за счет чего обеспечивается предупреждение по меньшей мере одного симптома у субъекта с нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие снижение уровня экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови.

В одном варианте осуществления ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой ген KLKB1. В другом варианте осуществления ген, вовлеченный в контактный

- 7 045013 путь активации свертывания крови, представляет собой ген F12. В еще одном варианте осуществления ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой ген KNG1. В одном варианте осуществления ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой ген F12, и способы дополнительно предусматривают введение субъекту двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на KLKB1. В другом варианте осуществления ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой ген F12, и способы дополнительно предусматривают введение субъекту двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на KNG1.

В одном варианте осуществления введение субъекту двухнитевого средства для RNAi приводит к снижению уровней брадикинина или снижению активности фактора свертывания крови XII.

В одном варианте осуществления нарушение представляет собой заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, такое как тромбофилия, наследственный ангионевротический отек (HAE), дефицит фактора Флетчера или первичная гипертензия.

В определенном варианте осуществления по меньшей мере один симптом представляет собой приступ ангионевротического отека или образование тромба.

В одном варианте осуществления субъектом является человек.

В одном варианте осуществления способы дополнительно предусматривают введение субъекту антитела к KLKB1 или его антигенсвязывающего фрагмента.

В одном варианте осуществления способы дополнительно предусматривают измерение уровней брадикинина и/или фактора свертывания крови XII у субъекта.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования экспрессии F12 у субъекта. Указанные способы предусматривают введение субъекту терапевтически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на F12, за счет чего обеспечивается ингибирование экспрессии F12 у субъекта.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования экспрессии KLKB1 у субъекта. Указанные способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на KLKB1, за счет чего обеспечивается ингибирование экспрессии KLKB1 у субъекта.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы ингибирования экспрессии KNG1 у субъекта. Указанные способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на KNG1, за счет чего обеспечивается ингибирование экспрессии KNG1 у субъекта.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения субъекта с тромбофилией. Указанные способы предусматривают введение субъекту терапевтически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на F12, или фармацевтической композиции, содержащей двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на F12, за счет чего осуществляется лечение субъекта.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта с тромбофилией. Указанные способы включают введение субъекту профилактически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на F12, или фармацевтической композиции, содержащей двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на F12, за счет чего обеспечивается предупреждение по меньшей мере одного симптома у субъекта.

В одном варианте осуществления способы дополнительно предусматривают введение субъекту двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на KLKB1. В другом варианте осуществления способы дополнительно предусматривают введение субъекту двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на KNG1.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения субъекта с наследственным ангионевротическим отеком (HAE). Указанные способы предусматривают введение субъекту терапевтически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на F12, или фармацевтической композиции, содержащей двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на F12, за счет чего осуществляется лечение субъекта.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта с наследственным ангионевротическим отеком (HAE). Указанные способы предусматривают введение субъекту профилактически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на F12, или фармацевтической композиции, содержащей двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на F12, за счет чего обеспечивается предупреждение по меньшей мере одного симптома у субъекта.

В одном варианте осуществления способы дополнительно предусматривают введение субъекту

- 8 045013 двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на

KLKB1. В другом варианте осуществления способы дополнительно предусматривают введение субъекту двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на

KNG1.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы предупреждения образования тромба у субъекта с риском образования тромба. Указанные способы включают введение субъекту профилактически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на F12, или фармацевтической композиции, содержащей двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на F12, за счет чего обеспечивается ингибирование образования тромба у субъекта с риском образования тромба.

В одном варианте осуществления у субъекта с риском образования тромба имеется заболевание или нарушение, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови.

В одном варианте осуществления заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, представляет собой тромбофилию. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, представляет собой наследственный ангионевротический отек (HAE).

В других вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, представляет собой дефицит фактора Флетчера или первичную гипертензию.

В одном варианте осуществления субъект с риском образования тромба выбран из группы, состоящей из пациента хирургического профиля; пациента, получающего терапию; субъекта с беременностью; субъекта в послеродовом периоде; субъекта, у которого ранее уже был тромб; субъекта, получающего гормонозаместительную терапию; субъекта, находящегося в сидячем положение в течение длительных периодов, и субъекта с ожирением.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы предупреждения приступа ангионевротического отека у субъекта с наследственным ангионевротическим отеком (HAE). Указанные способы предусматривают введение субъекту профилактически эффективного количества двухнитевого средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на F12, или фармацевтической композицией, содержащей двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на F12, за счет чего обеспечивается предупреждение приступа ангионевротического отека.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлен график, на котором показана супрессия мРНК KLKB1 у мышей дикого типа после одной подкожной дозы 1 или 3 мг/кг указанных средств в дни 7-10 после введения дозы.

На фиг. 2 представлен график, на котором показана супрессия мРНК F12 у мышей дикого типа после одной подкожной дозы 1 мг/кг, или одной дозы 3 мг/кг, или одной дозы 1 мг/кг, или одной дозы 10 мг/кг указанных средств в дни 7-10 после введения дозы.

На фиг. 3 представлен график, на котором показана супрессия мРНК KNG1 у мышей дикого типа после одной подкожной дозы 1 мг/кг или 3 мг/кг указанных средств в дни 7-10 после введения дозы.

На фиг. 4А представлен график, на котором показано количество синего красителя Эванса в крови мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг AD-66948 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 4В представлен график, на котором показано количество синего красителя Эванса в кишечнике мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг AD-66948 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 4С представлен график, на котором показана супрессия мРНК KLKB 1 в печени мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг AD-66948 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 4D представлен график, на котором показана относительная проницаемость кишечника у мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг AD-66948 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 5А представлен график, на котором показано количество синего красителя Эванса в крови мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,1, 0,3, 1 или 3 мг/кг AD-67244 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

- 9 045013

На фиг. 5В представлен график, на котором показано количество синего красителя Эванса в кишечнике мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,1, 0,3, 1 или 3 мг/кг AD-67244 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 5С представлен график, на котором показана супрессия мРНК F12 в печени мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,1, 0,3, 1 или 3 мг/кг AD-67244 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 5D представлен график, на котором показана относительная проницаемость кишечника у мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,1, 0,3, 1 или 3 мг/кг AD-67244 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 6А представлен график, на котором показано количество синего красителя Эванса в крови мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг AD-67344 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 6В представлен график, на котором показано количество синего красителя Эванса в кишечнике мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг AD-67344 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 6С представлен график, на котором показана супрессия мРНК KNG1 в печени мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг AD-67344 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 6D представлен график, на котором показана относительная проницаемость кишечника у мышей, которым вводили одну дозу 0, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг AD-67344 и каптоприла в день 7 после введения дозы.

На фиг. 7 показаны последовательности с модифицированными нуклеотидами в указанных двухнитевых средствах для RNAi, целенаправленно воздействующих на ген KLKB1. F представляет собой 2'фтор-модифицированный нуклеотид; OMe представляет собой 2'-O-метил- (2'-OMe) модифицированный нуклеотид; и s представляет собой фосфоротиоатную связь. На фигуре соответственно раскрываются SEQ ID NO: 2285-2302 в порядке упоминания.

На фиг. 8 показаны последовательности с модифицированными нуклеотидами в указанных двухнитевых средствах для RNAi, целенаправленно воздействующих на ген F12. F представляет собой 2'-фтормодифицированный нуклеотид; OMe представляет собой 2'-O-метил- (2'-OMe) модифицированный нуклеотид; и s представляет собой фосфоротиоатную связь. На фигуре соответственно раскрываются SEQ ID NO: 2303-2320 в порядке упоминания.

На фиг. 9 показаны последовательности с модифицированными нуклеотидами в указанных двухнитевых средствах для RNAi, целенаправленно воздействующих на ген KNG1. F представляет собой 2'фтор-модифицированный нуклеотид; OMe представляет собой 2'-O-метил- (2'-OMe) модифицированный нуклеотид; и s представляет собой фосфоротиоатную связь. На фигуре соответственно раскрываются SEQ ID NO: 2321-2332 в порядке упоминания.

На фиг. 10А представлен график, на котором показано количество синего красителя Эванса в тканях уха каждой из мышей, которым вводили одну дозу 0,1, 0,5 или 3 мг/кг AD-67244 в комбинации с одной дозой 10 мг/кг средства на основе dsRNA, целенаправленно воздействующего C1-INH, в день 7 после введения дозы. Планки погрешностей=стандартное отклонение.

На фиг. 10В представлен график, на котором показана дозозависимая супрессия мРНК F12 после введения одной дозы 0,1, 0,5 или 3 мг/кг AD-67244 в комбинации с одной дозой 10 мг/кг средства на основе dsRNA, целенаправленно воздействующего C1-INH, в день 7 после введения дозы.

На фиг. 11 представлен график, на котором показана супрессия белка F12 в плазме крови самок обезьян Cynomolgus, которым подкожно вводили одну дозу 3, 1, 0,3 или 0,1 мг/кг AD-67244. Приведенные уровни F12 в плазме крови представляют собой относительные уровни белка F12, которые нормализовали по среднему значению исходного уровня белка F12 до введения дозы. Планки погрешностей=стандартное отклонение.

На фиг. 12 представлен график, на котором показана супрессия белка F12 в плазме крови мышей дикого типа, которым подкожно вводили одну дозу 0,5 мг/кг AD-67244 или AD-74841.

На фиг. 13 представлен график, показывающий эффект 5'-концевых модификаций в отношении in vivo эффективности указанных средств.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предусмотрены композиции на основе iRNA, которые обеспечивают опосредованное РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC) расщепление РНК-транскриптов гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. гена плазменного калликреина В (фактора Флетчера) 1 (KLKB1), гена фактора XII (фактора Хагемана) (F12) или гена кининогена 1 (KNG1)). Ген может находиться в клетке, например, в клетке организма субъекта, такого как человек. Применение этих iRNA обеспечивает возможность целенаправленного разрушения мРНК соответствующего гена (гена KLKB1, гена F12 или гена KNG1) у млекопитающих.

Средства для RNAi по настоящему изобретению были разработаны для целенаправленного воздействия на кодирующие белок и 3'-UTR-участки гена KLKB1 человека, в том числе части гена, которые являются консервативными среди ортологов KLKB1 других видов млекопитающих. Не ограничиваясь какой-либо теорией, предполагают, что комбинация или субкомбинация вышеуказанных свойств, и кон- 10 045013 кретных целевых участков, и/или конкретных модификаций в таких средствах для RNAi придает средствам для RNAi по настоящему изобретению улучшенную эффективность, стабильность, активность, продолжительность действия и безопасность.

iRNA по настоящему изобретению могут предусматривать нить РНК (антисмысловую нить), содержащую участок, длина которого составляет приблизительно 30 нуклеотидов или меньше, например длина составляет 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 или 21-22 нуклеотида, при этом участок практически комплементарен по меньшей мере части мРНК-транскрипта гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, т.е. гена KLKB1, гена F12 или гена KNG1.

В определенных вариантах осуществления iRNA по настоящему изобретению содержат нить РНК (антисмысловую нить), которая может включать в себя более длинные отрезки, например, длиной до 66 нуклеотидов, например 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 нуклеотида, с участком по меньшей мере из 19 смежных нуклеотидов, который практически комплементарен по меньшей мере части мРНКтранскрипта гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, т.е. гена KLKB1, гена F12 или гена KNG1. Эти iRNA с антисмысловыми нитями большей длины предпочтительно содержат вторую нить РНК (смысловую нить) длиной 20-60 нуклеотидов, где смысловая и антисмысловая нити образуют дуплекс из 18-3 0 смежных нуклеотидов.

С помощью in vitro и in vivo анализов авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что iRNA, целенаправленно воздействующие на ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, могут эффективно опосредовать RNAi, что приводит в результате к значительному ингибированию экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, т.е. гена KLKB1, гена F12 или гена KNG1. Авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что средства для RNAi по настоящему изобретению исключительно стабильны в цитоплазме и лизосоме. Таким образом, способы и композиции, предусматривающие эти iRNA, применимы для лечения субъекта с заболеванием или нарушением, ассоциированными с контактным путем активации свертывания крови, например, тромбофилией, HAE, а также для предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта с заболеванием или нарушением, ассоциированных с контактным путем активации свертывания крови, или субъекта с риском развития заболевания или нарушения, ассоциированных с контактным путем активации свертывания крови.

Соответственно, в настоящем изобретении также предусмотрены способы лечения субъекта с нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие ингибирование или снижение уровня экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, например, заболеванием, ассоциированным с контактным путем активации свертывания крови, таким как тромбофилия или наследственный ангионевротический отек (HAE), с применением композиций на основе iRNA, которые обеспечивают опосредованное РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC) расщепление РНКтранскриптов гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови.

Очень низкие дозировки iRNA по настоящему изобретению могут, в частности, специфично и эффективно опосредовать РНК-интерференцию (RNAi), приводя в результате к значительному ингибированию экспрессии соответствующего гена (гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови).

В следующем подробном описании раскрывается, как получать и применять композиции, содержащие iRNA, для ингибирования экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. гена KLKB1, гена F12 или гена KNG1), а также композиции, пути применения и способы лечения субъектов с заболеваниями и нарушениями, на которые будет оказывать благоприятное воздействие ингибирование и/или снижение уровня экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. гена KLKB1, гена F12, или гена KNG1).

I. Определения.

Для более легкого понимания настоящего изобретения сперва приведены определения некоторых терминов. Кроме того, следует отметить, что во всех случаях перечисления значения или диапазона значений параметра подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.

Форму единственного числа используют в данном документе для обозначения одного или нескольких (т.е. по меньшей мере одного) грамматических объектов данной заявки. В качестве примера элемент означает один элемент или несколько элементов, например множество элементов.

Термин включающий используют в данном документе для обозначения фразы включающий без ограничения и используют взаимозаменяемо с ней.

Термин или используют в данном документе для обозначения термина и/или и используют взаимозаменяемо с ним, если контекст явно не указывает иное.

Термин по меньшей мере перед числовым значением или группой числовых значений понимают как включающий числовое значение, находящееся рядом с термином по меньшей мере, и все следую- 11 045013 щие числовые значения или целые числа, которые могут быть по логике включены, что ясно из контекста. Например, число нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты должно быть целым числом. Например, по меньшей мере 18 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты из 21 нуклеотида означает, что указанным свойством обладают нуклеотиды 18, 19, 20 или 21. Если по меньшей мере находится перед группой числовых значений или диапазоном, следует понимать, что по меньшей мере может модифицировать числовые значения в группе или диапазоне.

Используемые в данном документе диапазоны включают как верхний так и нижний пределы.

Как используется в данном документе, плазменный калликреин В (фактор Флетчера) 1, используемый взаимозаменяемо с терминами прекалликреин и KLKB1, относится к встречающемуся в природе гену, который кодирует зимогенную форму калликреина, прекалликреин. С помощью F12a плазменный прекалликреин превращается в плазменный калликреин (также называемый активным калликреином) и посредством протеолитического действия способствует высвобождению брадикинина из высокомолекулярного кининогена и активирует F12. Брадикинин представляет собой пептид, который повышает проницаемость сосудов и присутствует у пациентов с HAE при высоких уровнях. Аминокислотную и полную кодирующую последовательности эталонной последовательности гена KLKB1 можно найти, например, в GenBank с номером доступа GI:78191797 (эталонная последовательность с номером доступа NM_000892.3; SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2). Ортологи млекопитающих гена KLKB1 человека можно найти, например, в GenBank с номерами доступа GI:544436072 (эталонная последовательность с номером доступа ХМ_005556482, макака-крабоеда; SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8); GI:380802470 (эталонная последовательность с номером доступа JU329355, макака-резуса); GE236465804 (эталонная последовательность с номером доступа NM_008455, мыши; SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4); GI:162138904 (эталонная последовательность с номером доступа NM_012725, крысы; SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6).

Дополнительные примеры последовательностей мРНК KLKB1 всегда доступны в общедоступных базах данных, например, в GenBank, UniProt и OMIM.

Как используется в данном документе, фактор XII (фактор Хагемана), используемый взаимозаменяемо с терминами фактор свертывания крови XII, FXII, F12, активный F12 и F12a, относится к встречающемуся в природе гену, который кодирует зимогенную форму F12a. F12 представляет собой фермент (EC 3.4.21.38) класса сериновых протеаз (или сериновых эндопептидаз), который расщепляет прекалликреин с образованием калликреина, который затем способствует высвобождению брадикинина из высокомолекулярного кининогена и активирует F12. Аминокислотную и полную кодирующую последовательности эталонной последовательности гена F12 можно найти, например, в GenBank с номером доступа GI:145275212 (эталонная последовательность с номером доступа NM_000505; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10). Ортологи млекопитающих гена F12 человека можно найти, например, в GenBank с номерами доступа GI:544441267 (эталонная последовательность с номером доступа ХМ_005558647, макака-крабоеда SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12); GI:805299477 (эталонная последовательность с номером доступа NM_021489, мыши; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14); GI:62078740 (эталонная последовательность с номером доступа NM_001014006, крысы; SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16).

Дополнительные примеры последовательностей мРНК F12 всегда доступны в общедоступных базах данных, например, в GenBank, UniProt и OMIM.

Как используется в данном документе, кининоген 1, используемый взаимозаменяемо с терминами фактор Фитцджеральда, фактор Уильямса-Фитцджеральда-Фложе, высокомолекулярный кининоген (HMWK или НК), низкомолекулярный кининоген (LMWK) и KNG1, ОТНОСИТСЯ К встречающемуся в природе гену, который подвергается альтернативному сплайсингу с образованием HMWK и LMWK. За счет расщепления HMWK активным калликреином высвобождается брадикинин. Аминокислотную и полную кодирующую последовательности эталонной последовательности гена KNG1 можно найти, например, в GenBank с номером доступа GI:262050545 (эталонная последовательность с номером доступа NM 001166451; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18). Ортологи млекопитающих гена KNG1 человека можно найти, например, в GenBank с номерами доступа GI:544410550 (эталонная последовательность с номером доступа ХМ_005545463, макака-крабоеда SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20); GI:156231028 (эталонная последовательность с номером доступа NM_001102409, мыши; SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22); GI:80861400 (эталонная последовательность с номером доступа NM_012696, крысы; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 23).

Дополнительные примеры последовательностей мРНК KNG1 всегда доступны в общедоступных базах данных, например, в GenBank, UniProt и OMIM.

С целью упрощения используемый в данном документе термин ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови означает ген KLKB1, ген F12 или ген KNG1, если не указано иное.

Используемый в данном документе термин целевая последовательность относится к непрерывной части нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образующейся в процессе транскрипции гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, включая мРНК, которая является продуктом процессинга РНК первичного продукта транскрипции. В одном варианте осуществления целевая часть последовательности будет по меньшей мере достаточно длинной для того, чтобы служить в качестве субстрата для управляемого iRNA расщепления в этой части или рядом с этой частью нуклеотидной

- 12 045013 последовательности молекулы мРНК, образующейся в процессе транскрипции гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. В одном варианте осуществления целевая последовательность находится в пределах кодирующего белок участка гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. В другом варианте осуществления целевая последовательность находится в пределах 3'-UTR гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови.

Длина целевой последовательности может составлять приблизительно 9-36 нуклеотидов, например приблизительно 15-30 нуклеотидов. Например, длина целевой последовательности может составлять приблизительно 15-30 нуклеотидов, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 1519, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 1928, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,2023, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 или 21-22 нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления длина целевой последовательности составляет от приблизительно 19 до приблизительно 30 нуклеотидов. В других вариантах осуществления длина целевой последовательности составляет от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов. В еще одних вариантах осуществления длина целевой последовательности составляет от приблизительно 19 до приблизительно 23 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления длина целевой последовательности составляет от приблизительно 21 до приблизительно 23 нуклеотидов. Значения диапазона и длины, промежуточные по отношению к перечисленным выше значениям диапазона и длины, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.

Используемый в данном документе термин нить, содержащая последовательность относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь нуклеотидов, которая описывается последовательностью, обозначаемой с использованием стандартной номенклатуры нуклеотидов.

Каждый из G, C, A, T и U, как правило, обозначает нуклеотид, который соответственно содержит гуанин, цитозин, аденин, тимидин и урацил в качестве основания. Однако будет понятно, что термин рибонуклеотид или нуклеотид также может означать модифицированный нуклеотид, более подробно описанный ниже, или имитирующий заменяющий фрагмент (см., например, табл. 2). Специалисту в данной области хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть заменены другими фрагментами практически без изменения свойств образования пар оснований олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такой заменяющий фрагмент. Например, без ограничения нуклеотид, содержащий инозин в качестве основания, может образовывать пару оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Следовательно, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть заменены в нуклеотидных последовательностях dsRNA, представленных в настоящем изобретении, нуклеотидами, содержащими, например, инозин. В другом примере аденин и цитозин в любом месте олигонуклеотида могут быть соответственно заменены гуанином и урацилом с образованием неоднозначных пар оснований G-U с целевой мРНК. Последовательности, содержащие такие заменяющие фрагменты, подходят для композиций и способов, представленных в настоящем изобретении.

Термины iRNA, средство для RNAi, средство на основе iRNA, средство для РНК-интерференции, используемые в данном документе, взаимозаменяемо, относятся к средству, которое содержит РНК, в том значении, в котором этот термин определен в данном документе, и которое опосредует целенаправленное расщепление РНК-транскрипта посредством пути с участием РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC). iRNA управляет специфичным в отношении последовательности разрушением мРНК посредством процесса, который известен как РНК-интерференция (RNAi). iRNA модулирует, например ингибирует, экспрессию гена KLKB1 в клетке, например клетке субъекта, такого как субъектмлекопитающее.

В одном варианте осуществления средство для RNAi по настоящему изобретению предусматривает однонитевую РНК, которая взаимодействует с целевой последовательностью РНК, например, гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, т.е. целевой последовательности мРНК KLKB1, целевой последовательности мРНК F12 или целевой последовательности мРНК KNG1, управляя расщеплением целевой РНК. Не ограничиваясь какой-либо теорией, предполагают, что длинная двухнитевая РНК, введенная в клетки, разрушается до siRNA эндонуклеазой III типа, известной под названием Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, фермент, подобный рибонуклеазе III типа, обеспечивает процессинг dsRNA до коротких интерферирующих РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными 3'-выступами из двух оснований (Bernstein, et al. (2001) Nature 409:363). siRNA затем встраиваются в РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC), в котором одна или несколько хеликаз раскручивают дуплекс siRNA, что позволяет комплементарной антисмысловой нити управлять распознаванием мишени (Nykanen, et al. (2001) Cell 107:309). После связывания с соответствующей целевой мРНК одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляют мишень для индукции сайленсинга (Elbashir, et al. (2001) Genes Dev. 15:188). Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к однонитевой РНК (siRNA), образующейся внутри клетки и способствующей образованию RISC-комплекса для осуществления сайленсинга целевого гена, т.е. гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. Соответственно, термин siRNA также используют в данном документе для обозначения RNAi, описанной выше.

- 13 045013

В другом варианте осуществления средство для RNAi может быть однонитевой siRNA, которую вводят в клетку или организм для ингибирования целевой мРНК. Однонитевые средства для RNAi связываются с Argonaute 2, обладающим эндонуклеазной активностью в комплексе RISC, который затем отщепляет целевую мРНК. Однонитевые siRNA, как правило, содержат 15-30 нуклеотидов и являются химически модифицированными. Конструирование и тестирование однонитевых siRNA описаны в патенте США № 8101348 и в Lima et al. (2012) Cell 150:883-894, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ посредством ссылки. Любые антисмысловые нуклеотидные последовательности, описанные в данном документе, можно применять в качестве однонитевой siRNA, которая описана в данном документе, или которая химически модифицирована способами, описанными в Lima et al. (2012) Cell 150:883-894.

В другом варианте осуществления iRNA для применения в композициях, путях применения и способах по настоящему изобретению представляет собой двухнитевую РНК, и в данном документе ее называют двухнитевым средством для RNAi, молекулой двухнитевой РНК (dsRNA), средством на основе dsRNA или dsRNA. Термин dsRNA относится к комплексу молекул рибонуклеиновой кислоты с дуплексной структурой, содержащему две антипараллельные и практически комплементарные нити нуклеиновой кислоты, рассматриваемые как имеющие смысловую и антисмысловую ориентации по отношению к целевой РНК, т.е. гену, вовлеченному в контактный путь активации свертывания крови, т.е. гену KLKB1, гену F12 или гену KNG1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения двухнитевая РНК (dsRNA) запускает разрушение целевой РНК, например, мРНК, через посттранскрипционный механизм сайленсинга генов, называемый в данном документе РНК-интерференцией или RNAi.

Как правило, большинство нуклеотидов каждой нити молекулы dsRNA являются рибонуклеотидами, но, как подробно описано в данном документе, каждая нить или обе нити могут также содержать один или несколько нуклеотидов, не являющихся рибонуклеотидами, например, дезоксирибонуклеотид и/или модифицированный нуклеотид. Кроме того, используемый в настоящем описании термин средство для RNAi может включать рибонуклеотиды с химическими модификациями; средство для RNAi может включать значительные модификации множества нуклеотидов. Используемый в данном документе термин модифицированный нуклеотид относится к нуклеотиду, независимо имеющему модифицированный сахарный фрагмент, модифицированную межнуклеотидную связь и/или модифицированное нуклеотидное основание. Таким образом, выражение модифицированный нуклеотид охватывает замены, добавления или удаления, например функциональной группы или атома, в межнуклеозидных связях, сахарных фрагментах или нуклеотидных основаниях. Модификации, подходящие для применения в средствах по настоящему изобретению, включают все типы модификаций, раскрытых в данном документе или известных в данной области. Любые такие модификации, как используемые в молекуле типа siRNA, охвачены термином средство для RNAi в контексте данных описания и формулы изобретения.

Дуплексный участок может быть любой длины, которая позволяет осуществлять специфическое разрушение требуемой целевой РНК посредством пути с участием RISC, и может варьироваться по длине в диапазоне от приблизительно 9 до 36 пар оснований, например, его длина может составлять приблизительно 15-30 пар оснований, например, приблизительно 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36 пар оснований, как, например: приблизительно 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, или 21-22 пары оснований. Значения диапазона и длины, промежуточные по отношению к перечисленным выше значениям диапазона и длины, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.

Две нити, образующие дуплексную структуру, могут быть различными частями одной большей молекулы РНК, или они могут быть отдельными молекулами РНК. В тех случаях, если две нити являются частью одной более крупной молекулы и, следовательно, соединены непрерывающейся цепью нуклеотидов от 3'-конца одной нити к 5'-концу соответствующей другой нити, образующих дуплексную структуру, соединительную цепь РНК называют петлей типа шпилька. Петля типа шпилька может содержать по меньшей мере один неспаренный нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления петля типа шпилька может содержать по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 23 или больше неспаренных нуклеотидов.

Если две практически комплементарные нити dsRNA образованы отдельными молекулами РНК, то эти молекулы не обязательно должны, но могут быть соединены ковалентно. В тех случаях, если две нити соединены ковалентно иным образом, нежели непрерывающейся цепью нуклеотидов от 3'-конца одной нити к 5'-концу соответствующей другой нити, образующих дуплексную структуру, то соединительную структуру называют линкером. Нити РНК могут иметь одинаковое или разное число нуклеотидов. Максимальное число пар оснований представляет собой число нуклеотидов в самой короткой нити dsRNA за вычетом каких-либо выступающих концов, которые присутствуют в дуплексе. Помимо дуплекс- 14 045013 ной структуры средство для RNAi может содержать один или несколько нуклеотидных выступающих концов.

В одном варианте осуществления средство для RNAi по настоящему изобретению представляет собой dsRNA из 24-30 нуклеотидов, которая взаимодействует с целевой последовательностью РНК, например, гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, т.е. целевой последовательности мРНК KLKB1, целевой последовательности мРНК F12 или целевой последовательности мРНК KNG1, управляя расщеплением целевой РНК. Не ограничиваясь теорией, длинная двухнитевая РНК, введенная в клетки, разрезается на siRNA эндонуклеазой III типа, известной под названием Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, фермент, подобный рибонуклеазе III типа, обеспечивает процессинг dsRNA до коротких интерферирующих РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными 3'выступающими концами из двух оснований (Bernstein, et al. (2001) Nature 409:363). siRNA затем встраиваются в РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC), в котором одна или несколько хеликаз раскручивают дуплекс siRNA, что позволяет комплементарной антисмысловой нити управлять распознаванием мишени (Nykanen, et al. (2001) Cell 107:309). После связывания с соответствующей целевой мРНК одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляют мишень для индукции сайленсинга (Elbashir, et al. (2001) Genes Dev. 15:188).

Используемый в данном документе термин нуклеотидный выступающий конец относится по меньшей мере к одному неспаренному нуклеотиду, который выступает из дуплексной структуры iRNA, например dsRNA. Например, если 3'-конец одной нити dsRNA выходит за пределы 5'-конца другой нити или наоборот, то образуется нуклеотидный выступающий конец. dsRNA может содержать выступающий конец по меньшей мере из одного нуклеотида; альтернативно выступающий конец может содержать по меньшей мере два нуклеотида, по меньшей мере три нуклеотида, по меньшей мере четыре нуклеотида, по меньшей мере пять нуклеотидов или больше. Нуклеотидный выступающий конец может содержать аналог нуклеотида/нуклеозида, в том числе дезоксинуклеотид/нуклеозид, или состоять из него.

Выступающий(выступающие) конец(концы) может(могут) находиться в пределах смысловой нити, антисмысловой нити или их комбинации. Кроме того, нуклеотид(нуклеотиды) выступающего конца может(могут) присутствовать на 5'-конце, 3'-конце или на обоих концах антисмысловой или смысловой нити dsRNA.

В одном варианте осуществления антисмысловая нить dsRNA содержит 1-10 нуклеотидов, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов, выступающих на 3'-конце и/или 5'-конце. В одном варианте осуществления смысловая нить dsRNA содержит 1-10 нуклеотидов, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов, выступающих на 3'-конце и/или 5'-конце. В другом варианте осуществления один или несколько нуклеотидов выступающего конца заменены нуклеозидтиофосфатом.

В определенных вариантах осуществления выступающий конец в пределах смысловой нити или антисмысловой нити, или обеих, может содержать продленные отрезки длиной более 10 нуклеотидов, например, длиной 1-30 нуклеотидов, 2-30 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов или 10-15 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления продленный выступающий конец присутствует в пределах смысловой нити дуплекса. В определенных вариантах осуществления продленный выступающий конец присутствует на 3'-конце смысловой нити дуплекса. В определенных вариантах осуществления продленный выступающий конец присутствует на 5'-конце смысловой нити дуплекса. В определенных вариантах осуществления продленный выступающий конец присутствует в пределах антисмысловой нити дуплекса. В определенных вариантах осуществления продленный выступающий конец присутствует на 3'-конце антисмысловой нити дуплекса. В определенных вариантах осуществления продленный выступающий конец присутствует на 5'-конце антисмысловой нити дуплекса. В определенных вариантах осуществления один или несколько нуклеотидов выступающего конца заменены нуклеозидтиофосфатом. В определенных вариантах осуществления выступающий конец содержит самокомплементарную часть, так что выступающий конец способен образовывать шпилечную структуру, которая является стабильной в физиологических условиях.

Затупленный конец или тупой конец означают, что на конце двухнитевого средства для RNAi отсутствуют неспаренные нуклеотиды, т.е. отсутствует нуклеотидный выступающий конец. Средство для RNAi с тупыми концами представляет собой dsRNA, которая является двухнитевой по всей своей длине, т.е. не имеет нуклеотидного выступающего конца на любом конце молекулы. Средства для RNAi по настоящему изобретению предусматривают средства для RNAi с нуклеотидными выступающими концами на одном конце (т.е. средства с одним выступающим концом и одним тупым концом) или с нуклеотидными выступающими концами на обоих концах.

Термин антисмысловая нить или направляющая нить относится к нити iRNA, например dsRNA, которая содержит участок, практически комплементарный целевой последовательности, например мРНК KLKB1. Используемый в данном документе термин участок комплементарности относится к участку на антисмысловой нити, практически комплементарному последовательности, например целевой последовательности, например нуклеотидной последовательности гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, определенного в данном документе. В тех случаях, когда участок комплементарности не полностью комплементарен целевой последовательности, во внутренних или концевых уча- 15 045013 стках молекулы могут присутствовать ошибки спаривания. Как правило, наиболее допустимые ошибки спаривания находятся в концевых участках, например, в пределах 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотида 5'- и/или 3'конца iRNA. В одном варианте осуществления двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению предусматривает ошибочное спаривание нуклеотидов в антисмысловой нити. В другом варианте осуществления двухнитевое средство для RNAi по настоящему изобретению предусматривает ошибочное спаривание нуклеотидов в смысловой нити. В одном варианте осуществления ошибочное спаривание нуклеотидов происходит, например, в пределах 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотида от 3'-конца iRNA. В другом варианте осуществления ошибочное спаривание нуклеотидов происходит, например, по 3'-концевому нуклеотиду iRNA.

Термин смысловая нить или сопровождающая нить, используемый в данном документе, относится к нити iRNA, которая содержит участок, практически комплементарный участку антисмысловой нити, в том значении, в котором этот термин определен в данном документе.

Используемый в данном документе термин участок расщепления относится к участку, который непосредственно прилегает к сайту расщепления. Сайт расщепления является сайтом в мишени, по которому происходит расщепление. В некоторых вариантах осуществления участок расщепления содержит три основания на любом из концов сайта расщепления, который непосредственно прилегает к нему. В некоторых вариантах осуществления участок расщепления содержит два основания на любом из концов сайта расщепления, который непосредственно прилегает к нему. В некоторых вариантах осуществления сайт расщепления, в частности, находится в сайте, граничащем с нуклеотидами 10 и 11 антисмысловой нити, и участок расщепления содержит нуклеотиды 11, 12 и 13.

Используемый в данном документе термин комплементарный, если не указано иное, при использовании для описания первой нуклеотидной последовательности по отношению ко второй нуклеотидной последовательности означает способность олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизироваться и образовывать дуплексную структуру в определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, что будет понятно специалисту в данной области. Такие условия, например, могут быть жесткими условиями, при этом жесткие условия могут включать: 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES, pH 6,4, 1 мМ EDTA, 50 или 70°С в течение 12-16 ч с последующим отмыванием (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Можно использовать другие условия, такие как физиологически соответствующие условия, которые могут встречаться в организме. Специалист в данной области сможет определить набор условий, наиболее подходящих для тестирования комплементарности двух последовательностей в соответствии с конечным применением гибридизированных нуклеотидов.

Комплементарные последовательности в iRNA, например в dsRNA, описанной в данном документе, предусматривают образование пар оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую полинуклеотидную последовательность, и олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего вторую нуклеотидную последовательность, по всей длине одной или обеих нуклеотидных последовательностей. В данном документе такие последовательности могут называться полностью комплементарными по отношению друг к другу. Тем не менее, если в данном документе первую последовательность называют практически комплементарной по отношению ко второй последовательности, тогда две последовательности могут быть полностью комплементарными или в них может происходить ошибочное спаривание одной или нескольких, но, как правило, не более 5, 4, 3 или 2 пар оснований при гибридизации с образованием дуплекса размером до 30 пар оснований, сохраняя при этом способность к гибридизации в условиях, наиболее соответствующих их конечному применению, например ингибированию экспрессии гена посредством пути с участием RISC. Однако когда два олигонуклеотида сконструированы с тем, чтобы образовывать при гибридизации один или несколько однонитевых выступающих концов, то такие выступающие концы не будут считаться несовпадениями применительно к определению комплементарности. Например, dsRNA, содержащая один олигонуклеотид длиной 21 нуклеотид и другой олигонуклеотид длиной 23 нуклеотида, где более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая полностью комплементарна более короткому олигонуклеотиду, может при этом называться полностью комплементарной для целей, описанных в данном документе.

Комплементарные последовательности, используемые в данном документе, могут также содержать пары оснований или могут быть образованы полностью из таких пар, составленных не по модели Уотсона-Крика, и/или пар оснований, образованных из неприродных и модифицированных нуклеотидов, в той мере, в которой выполняются вышеуказанные требования по отношению к их способности к гибридизации. Такие пары оснований, образованные не по модели Уотсона-Крика, включают без ограничения неоднозначные G:U или Хугстиновские пары оснований.

Термины комплементарный, полностью комплементарный и практически комплементарный в данном документе можно применять по отношению к соответствию оснований между смысловой нитью и антисмысловой нитью dsRNA или между антисмысловой нитью средства на основе iRNA и целевой последовательностью, что будет понятно из контекста их применения.

Как используется в данном документе, полинуклеотид, который практически комплементарен по

- 16 045013 меньшей мере части матричной РНК (мРНК), относится к полинуклеотиду, который практически комплементарен непрерывной части представляющей интерес мРНК (например, мРНК, которую кодирует ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови). Например, полинуклеотид является комплементарным по меньшей мере части мРНК KLKB1, если последовательность практически комплементарна непрерывающейся части мРНК, кодирующей KLKB1.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды смысловой и антисмысловой нитей, раскрытые в данном документе, полностью комплементарны последовательности целевого гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови.

В одном варианте осуществления антисмысловые полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, полностью комплементарны целевой последовательности KLKB1. В других вариантах осуществления антисмысловые полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, практически комплементарны целевой последовательности KLKB1 и содержат непрерывную нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 80% комплементарна по всей своей длине эквивалентному участку нуклеотидной последовательности любой из SEQ ID NO: 1 и 2 или фрагмента любой из SEQ ID NO: 1 и 2, например, комплементарна на приблизительно 8 5%, на приблизительно 86%, на приблизительно 87%, на приблизительно 88%, на приблизительно 89%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98% или на приблизительно 99%.

В других вариантах осуществления антисмысловые полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, практически комплементарны целевой последовательности KLKB1 и содержат непрерывную нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 80% комплементарна по всей своей длине любой из нуклеотидных последовательностей смысловой нити в любой из табл. 3, 4, 19А или 19В, или фрагменту любой из нуклеотидных последовательностей антисмысловой нити в любой из табл. 3, 4, 19А или 19В, например, комплементарна на приблизительно 85%, на приблизительно 86%, на приблизительно 87%, на приблизительно 88%, на приблизительно 89%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98% или на приблизительно 99%.

В одном варианте осуществления средство для RNAi по настоящему изобретению содержит смысловую нить, которая практически комплементарна антисмысловому полинуклеотиду, который, в свою очередь, комплементарен целевой последовательности KLKB1 и содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 80% комплементарна по всей своей длине любой из нуклеотидных последовательностей антисмысловой нити в любой из табл. 3, 4, 19А или 19В, или фрагменту любой из нуклеотидных последовательностей антисмысловой нити в любой из табл. 3, 4, 19А или 19В, например, комплементарна на приблизительно 85%, на приблизительно 86%, на приблизительно 87%, на приблизительно 88%, на приблизительно 89%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98% или на приблизительно 99%.

В одном варианте осуществления антисмысловые полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, полностью комплементарны целевой последовательности F12. В других вариантах осуществления антисмысловые полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, практически комплементарны целевой последовательности F12 и содержат непрерывную нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 80% комплементарна по всей своей длине эквивалентному участку нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 9 или 10 или фрагмента из SEQ ID NO: 9 или 10, например, комплементарна на приблизительно 85%, на приблизительно 86%, на приблизительно 87%, на приблизительно 88%, на приблизительно 89%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98% или на приблизительно 99%.

В другом варианте осуществления полинуклеотиды антисмысловой нити практически комплементарны целевой последовательности F12 и содержат непрерывную нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 80% комплементарна по всей своей длине любой из нуклеотидных последовательностей смысловой нити в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26 и 27 или фрагменту любой из нуклеотидных последовательностей антисмысловой нити в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, например, комплементарна на приблизительно 85%, на приблизительно 86%, на приблизительно 87%, на приблизительно 88%, на приблизительно 89%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98% или на приблизительно 99%.

В одном варианте осуществления средство для RNAi по настоящему изобретению содержит смысловую нить, которая практически комплементарна антисмысловому полинуклеотиду, который, в свою очередь, комплементарен целевой последовательности F12 и содержит непрерывную нуклеотидную по- 17 045013 следовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 80% комплементарна по всей своей длине любой из нуклеотидных последовательностей антисмысловой нити в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26, и 27 или фрагменту любой из нуклеотидных последовательностей антисмысловой нити в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, например, комплементарна на приблизительно 85%, на приблизительно 86%, на приблизительно 87%, на приблизительно 88%, на приблизительно 89%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98% или на приблизительно 99%.

В одном варианте осуществления полинуклеотиды смысловой нити и полинуклеотиды антисмысловой нити, раскрытые в данном документе, полностью комплементарны целевой последовательности KNG1. В других вариантах осуществления полинуклеотиды смысловой нити и/или антисмысловые полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, практически комплементарны целевой последовательности KNG1 и содержат непрерывную нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 80% комплементарна по всей своей длине эквивалентному участку нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 17 или 18 или фрагмента из SEQ ID NO: 17 или 18, например, комплементарна на приблизительно 85%, на приблизительно 86%, на приблизительно 87%, на приблизительно 88%, на приблизительно 89%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98% или на приблизительно 99%.

В другом варианте осуществления полинуклеотиды антисмысловой нити практически комплементарны целевой последовательности KNG и содержат непрерывную нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 80% комплементарна по всей своей длине любой из нуклеотидных последовательностей смысловой нити в любой из табл. 15 или 16, например, комплементарна на приблизительно 85%, на приблизительно 86%, на приблизительно 87%, на приблизительно 88%, на приблизительно 89%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98% или на приблизительно 99%.

В одном варианте осуществления средство для RNAi по настоящему изобретению содержит смысловую нить, которая практически комплементарна антисмысловому полинуклеотиду, который, в свою очередь, комплементарен целевой последовательности KNG1 и содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 80% комплементарна по всей своей длине любой из нуклеотидных последовательностей антисмысловой нити в табл. 15 или 16 или фрагменту любой из нуклеотидных последовательностей антисмысловой нити в табл. 15 или 16, например комплементарна на приблизительно 85%, на приблизительно 86%, на приблизительно 87%, на приблизительно 88%, на приблизительно 89%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98% или на приблизительно 99%.

В целом большинство нуклеотидов каждой нити представляют собой рибонуклеотиды, но, как подробно описано в данном документе, каждая нить или обе нити могут также содержать один или несколько нуклеотидов, не являющихся рибонуклеотидами, например дезоксирибонуклеотид и/или модифицированный нуклеотид. Кроме того, iRNA может содержать рибонуклеотиды с химическими модификациями. Такие модификации могут предусматривать все типы модификаций, раскрытых в данном документе или известных в данной области. Любые такие модификации, которые используются в молекуле iRNA, охватываются термином iRNA в контексте данных описания и формулы изобретения.

В одном аспекте настоящего изобретения средство для применения в способах и композициях по настоящему изобретению представляет собой молекулу однонитевой антисмысловой РНК, которая ингибирует целевую мРНК посредством механизма антисмыслового ингибирования. Молекула однонитевой антисмысловой РНК комплементарна последовательности в целевой мРНК. Однонитевые антисмысловые олигонуклеотиды могут ингибировать трансляцию стехиометрическом образом путем спаривания оснований с мРНК и физического нарушения механизма трансляции, см. Dias, N. et al. (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Молекула однонитевой антисмысловой РНК может иметь длину, составляющую от приблизительно 15 до приблизительно 30 нуклеотидов, и иметь последовательность, комплементарную целевой последовательности. Например, молекула однонитевой антисмысловой РНК может содержать последовательность, которая содержит по меньшей мере приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше смежных нуклеотидов из какой-либо из антисмысловых последовательностей, описанных в данном документе.

Как используется в данном документе, субъект представляет собой животное, такое как млекопитающее, в том числе примата (такого как человек, примат, отличный от человека, например, обезьяна и шимпанзе), отличного от примата животного (такого как корова, свинья, верблюд, лама, лошадь, коза, кролик, овца, хомяк, морская свинка, кошка, собака, крыса, мышь, лошадь и кит) или птицу (например, утку или гуся). В одном варианте осуществления субъектом является человек, например, человек, подлежащий лечению или оцениваемый в отношении заболевания, нарушения или состояния, на которые

- 18 045013 будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии и/или репликации гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. экспрессии гена KLKB1, экспрессии гена F12 и/или экспрессии гена KNG1); человек с риском возникновения заболевания, нарушения или состояния, на которые будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови; человек с заболеванием, нарушением или состоянием, на которые будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови; и/или человек, подлежащий лечению от заболевания, нарушения или состояния, на которые будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, как описано в данном документе.

Используемые в данном документе термины осуществление лечения или лечение относятся к благоприятному или требуемому результату, включающему без ограничения облегчение или ослабление тяжести одного или нескольких симптомов, ассоциированных с экспрессией гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. экспрессии гена KLKB1, экспрессии гена F12 и/или экспрессии гена KNG1) и/или с продуцированием белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. продуцированием белка KLKB1, продуцированием белка F12 и/или продуцированием белка KNG1), например, тромбофилии, например, образования тромба, наличия повышенного уровня брадикинина, наследственного ангионевротического отека (HAE), такого как наследственный ангионевротический отек I типа; наследственный ангионевротический отек II типа; наследственный ангионевротический отек III типа; или любой другой наследственный ангионевротический отек, вызванный повышенными уровнями брадикинина, приступа ангионевротического отека, эдемы конечностей, лица, гортани, верхних дыхательных путей, живота, туловища и половых органов, продрома; опухания гортани; незудящей сыпи; тошноты; рвоты; боли в животе. Лечение также может означать продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью в отсутствии лечения.

Термин более низкий в контексте уровня экспрессии у субъекта гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, и/или продуцирования белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, или маркера или симптома заболевания относится к статистически значимому снижению такого уровня. Снижение может составлять, например, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или больше, и предпочтительно до уровня, принятого в качестве находящегося в диапазоне показателей в норме для индивидуума без такого нарушения.

Как используется в данном документе, предупреждение или осуществление предупреждения при использовании в отношении заболевания, нарушения или состояния, на которые будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, и/или продуцирования белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, относится к снижению вероятности того, что у субъект проявится симптом, ассоциированный с таким заболеванием, нарушением или состоянием, или снижению частоты и/или продолжительности симптома, ассоциированного с таким заболеванием, нарушением или состоянием, например, симптома, ассоциированного с экспрессией гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, такого как образование венозного тромба, артериального тромба, тромба в камере сердца, тромбоэмболия, наличие повышенного брадикинина, приступ ангионевротического отека, наследственный ангионевротический отек I типа; наследственный ангионевротический отек II типа; наследственный ангионевротический отек III типа; любой другой наследственный ангионевротический отек, вызванный повышенными уровнями брадикинина; эдема конечностей, лица, гортани, верхних дыхательных путей, живота, туловища и половых органов, продром; опухание гортани; незудящая сыпь; тошнота; рвота; боль в животе. Невозможность развития заболевания, нарушения или состояния, или ослабление развития симптома, ассоциированного с таким заболеванием, нарушением или состоянием (например, по меньшей мере на приблизительно 10% по принятой в клинической практике шкале для этого заболевания или нарушения), или отсрочивание проявления латентных симптомов (например, на несколько дней, недель, месяцев или лет) считается эффективным предупреждением.

Используемый в данном документе термин заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови представляет собой заболевание или нарушение, вызванные или ассоциированные с экспрессией гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (экспрессией гена KLKB1, экспрессией гена F12 и/или экспрессией гена KNG1), или продуцированием белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. продуцированием белка KLKB1, продуцированием белка F12 и/или продуцированием белка KNG1). Термин заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, включает заболевание, нарушение или состояние, на которые будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, и/или активности белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. Заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания

- 19 045013 крови, может представлять собой наследственное нарушение или приобретенное нарушение.

Неограничивающие примеры заболеваний, ассоциированных с контактным путем активации свертывания крови, включают, например, тромбофилию, наследственный ангионевротический отек (HAE) (такой как наследственный ангионевротический отек I типа; наследственный ангионевротический отек II типа; наследственный ангионевротический отек III типа; или любой другой наследственный ангионевротический отек, вызванный повышенными уровнями брадикинина), дефицит прекалликреина (наследственный или приобретенный), также известный как дефицит фактора Флетчера, злокачественная первичная гипертензия, гипертензия, терминальная стадия почечной недостаточности.

В одном варианте осуществления заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, представляет собой тромбофилию. Используемый в данном документе термин тромбофилия, также называемый гиперкоагуляцией или протромботическим состоянием, относится к любому заболеванию или нарушению, ассоциированному с аномальным свертыванием крови, которое обуславливает повышение риска тромбоза и развития тромба. Используемый в данном документе термин тромбоз относится к процессу локальной коагуляция или свертывания крови (образования тромба или сгустка) в части системы кровообращения. Тромбофилия может быть наследственной, приобретенной или быть следствием воздействия условия окружающей среды. Иллюстративные формы наследственной тромбофилии включают наследственный дефицит антитромбина, наследственный дефицит протеина С, наследственный дефицит протеина S, наследственную тромбофилию, связанную с фактором V Лейдена, и форму с протромбином (фактором II) G20210A. Иллюстративная приобретенная тромбофилия включает антифосфолипидный синдром.

Приобретенные/приобретенные в результате воздействия окружающей среды формы тромбофилии могут быть обусловлены, например, травмой, переломом, оперативным вмешательством, например, ор топедическим оперативным вмешательством, онкологическим оперативным вмешательством, применением пероральных контрацептивов, гормонозаместительной терапией, беременностью, послеродовым периодом, гиперкоагуляцией, предшествующим тромбом, возрастом, обездвиживанием (например, более трех дней постельного режима), длительным путешествием, метаболическим синдромом и загрязнением воздуха (см., например, Previtali, et al. (2011) Blood Transfus 9:120). Соответственно, субъекты с риском образования тромба включают пациентов хирургического профиля (например, субъектов, которые перенесли общее хирургическое вмешательство, стоматологическое хирургическое вмешательство, ортопедическое хирургическое вмешательство (например, хирургическое вмешательство по протезированию коленного сустава или тазобедренного сустава), хирургическое вмешательство в связи с травмой, онкологическое хирургическое вмешательство); пациентов, получающих терапию (например, субъектов с заболеванием, требующим обездвиживания, например, субъектов, соблюдающих постельный режим более трех дней, и/или субъектов с долгосрочным применением внутривенного катетера; субъектов с фибрилляцией предсердий; субъектов пожилого возраста; субъектов с нарушением функции почек; субъектов с искусственным клапаном сердца; субъектов с сердечной недостаточностью; субъектов с раком); беременных субъектов; субъектов в послеродовом периоде; субъектов, у которых ранее уже был тромб; субъектов, получающих гормонозаместительную терапию; субъектов, находящихся в сидячем положение в течение длительных периодов времени, например, в самолете или автомобиле; и субъектов с ожи рением.

В одном варианте осуществления заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, представляет собой наследственный ангионевротический отек (HAE). Используемый в данном документе термин наследственный ангионевротический отек, применяемый взаимозаменяемо с термином НАЕ, относится к нарушению с аутосомно-доминантным наследованием, обусловленному мутацией в гене С1-ингибитора (C1INH), SERPING1) или в гене фактора свертывания крови XII (F12), которое вызывает у пациентов рецидивирующую эдему. Типичные симптомы HAE включают сильное опухание рук, ног, кистей, стопы, лица, языка и гортани, живота, туловища, гениталий, тошноту, рвоту, боль в животе и незудящую сыпь. Во время приступов или эпизодов HAE выявляют повышенные уровни пептида брадикинина.

В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, представляет собой дефицит прекалликреина.

В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, представляет собой злокачественную первичную гипертензию.

В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, представляет собой гипертензию.

В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови, представляет собой терминальную стадию почечной недостаточности.

Подразумевается, что терапевтически эффективное количество, используемое в данном документе, включает количество средства для RNAi, которого, при введении пациенту для лечения субъекта с HAE и/или заболеванием, ассоциированным с контактным путем активации свертывания крови, достаточно для эффективного лечения заболевания (например, путем уменьшения, ослабления или поддержания текущего заболевания или одного или нескольких симптомов заболевания). Терапевтически эффек

- 20 045013 тивное количество может варьироваться в зависимости от средства для RNAi, пути введения средства, заболевания и его тяжести, а также анамнеза заболевания, возраста, веса, семейного анамнеза, генетической характеристики, стадии патологического процесса, опосредованного экспрессией гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, типов предшествующего или сопутствующего лечения, при наличии такового, и других индивидуальных особенностей пациента, который подлежит лечению.

Подразумевается, что профилактически эффективное количество, как используется в данном документе, включает количество средства для RNAi, которого, при введении субъекту, у которого еще не возникли или не проявились симптомы заболевания, ассоциированного с контактным путем активации свертывания крови, но у которого может иметься предрасположенность или риск развития заболевания, достаточно для предупреждения или ослабления тяжести заболевания или одного или нескольких симптомов заболевания. Ослабление тяжести заболевания включает замедление течения болезни или снижение тяжести заболевания, которое разовьется позже. Профилактически эффективное количество может варьироваться в зависимости от средства для RNAi, пути введения средства, степени риска развития заболевания и анамнеза заболевания, возраста, веса, семейного анамнеза, генетической характеристики, типов предшествующего или сопутствующего лечения, при наличии такового, и других индивидуальных особенностей пациента, который подлежит лечению.

Терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество также включает количество средства для RNAi, которое вызывает некоторый желательный локальный или системный эффект при приемлемом соотношении польза/риск, принятом по отношению к любому лечению. Средства для RNAi, применяемые в способах по настоящему изобретению, можно вводить в количестве, достаточном для достижения приемлемого соотношения польза/риск, принятого по отношению к такому лечению.

Термин образец, используемый в данном документе, предусматривает совокупность сходных жидкостей, клеток или тканей, выделенных из организма субъекта, а также жидкостей, клеток или тканей, присутствующих в организме субъекта. Примеры биологических жидкостей включают кровь, сыворотку крови и серозные жидкости, плазму крови, спинномозговую жидкость, внутриглазные жидкости, лимфу, мочу, слюну и им подобные. Образцы тканей могут включать образцы из тканей, органов или локальных участков. Например, образцы могут быть получены из конкретных органов, частей органов или жидкостей или клеток этих органов. В определенных вариантах осуществления образцы могут быть получены из печени (например, всей печени, или определенных сегментов печени, или определенных типов клеток печени, таких как, например, гепатоциты), сетчатки или частей сетчатки (например, пигментного эпителия сетчатки), центральной нервной системы или частей центральной нервной системы (например, желудочков или хороидного сплетения) или поджелудочной железы или определенных клеток или частей поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления образец, полученный от субъекта означает спинномозговую жидкость, полученную от субъекта. В предпочтительных вариантах осуществления образец, полученный от субъекта означает кровь или плазму крови, взятые у субъекта. В дополнительных вариантах осуществления образец, полученный от субъекта означает ткань печени (или ее составляющие компоненты) или ткань сетчатки (или ее составляющие компоненты), полученные от субъекта.

II. iRNA по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении предусмотрены iRNA, которые ингибируют экспрессию гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. гена KLKB1, гена F12 или гена KNG1). В одном варианте осуществления средство на основе iRNA предусматривает молекулы двухнитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA) для ингибирования экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, в клетке, такой как клетка субъекта, например, млекопитающего, такого как человек, с заболеванием, ассоциированным с контактным путем активации свертывания крови, например, тромбофилией или наследственным ангионевротическим отеком или с риском развития заболевания, ассоциированного с контактным путем активации свертывания крови, например, тромбофилии, или возникновения приступа ангионевротического отека. dsRNA содержит антисмысловую нить, имеющую участок комплементарности, который комплементарен по меньшей мере части мРНК, образующейся при экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. Длина участка комплементарности составляет приблизительно 30 нуклеотидов или меньше (например, длина составляет приблизительно 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 или 18 нуклеотидов или меньше). При контакте с клеткой, экспрессирующей ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, iRNA ингибирует экспрессию гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (например, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови гена человека, примата, отличного от примата животного или птицы) по меньшей мере на приблизительно 10%, что установлено с помощью анализа, например, с помощью ПЦР, или способа с гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов (bDNA), или с помощью способа на основе анализа белков, как, например, с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием, например, методик вестерн-блоттинга или проточной цитометрии.

- 21 045013 dsRNA содержит две нити РНК, которые являются комплементарными и гибридизируются с образованием дуплексной структуры при условиях, в которых dsRNA будет применяться. Одна нить dsRNA (антисмысловая нить) содержит участок комплементарности, который практически комплементарени обычно полностью комплементарен целевой последовательности. Целевую последовательность можно получить из последовательности мРНК, образующейся в процессе экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. гена KLKB1, гена F12 или гена KNG1). Другая нить (смысловая нить) содержит участок, который комплементарен антисмысловой нити таким образом, что две нити гибридизируются и образуют дуплексную структуру при объединении в подходящих условиях. Как описано в другом месте в данном документе и как известно в данной области, комплементарные последовательности dsRNA также могут содержаться в виде самокомплементарных участков одной молекулы нуклеиновой кислоты, а не располагаться на отдельных олигонуклеотидах.

Как правило, длина дуплексной структуры составляет от 15 до 30 пар оснований, например, длина составляет 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, или 21-22 пар оснований. Значения диапазона и длины, промежуточные по отношению к перечисленным выше значениям диапазона и длины, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.

Аналогично длина участка комплементарности для целевой последовательности составляет от 15 до 30 нуклеотидов, например, длина составляет 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, или 21-22 нуклеотида. Значения диапазона и длины, промежуточные по отношению к перечисленным выше значениям диапазона и длины, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления длина dsRNA составляет от приблизительно 15 до приблизительно 20 нуклеотидов или длина составляет от приблизительно 25 до приблизительно 30 нуклеотидов. Как правило, dsRNA является достаточно длинной, чтобы служить в качестве субстрата для фермента Dicer. Например, как хорошо известно в данной области, dsRNA, длина которых составляет более приблизительно 21-23 нуклеотидов, могут служить в качестве субстратов для Dicer. Специалисту в данной области также будет понятно, что участок РНК, являющийся целевым для расщепления, чаще всего будет частью более крупной молекулы РНК, зачастую молекулы мРНК. В соответствующих случаях частью целевой мРНК является непрерывная последовательность целевой мРНК, имеющая длину, достаточную для того, чтобы позволить ей быть субстратом для RNAi-направленного расщепления (т.е. расщепления посредством пути с участием RISC).

Специалисту в данной области также будет понятно, что дуплексный участок представляет собой основную функциональную часть dsRNA, например, дуплексный участок из приблизительно 9-36 пар оснований, например, из приблизительно 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 1235, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 1433, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 1530, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 1828, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 1923, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 2128, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, или 21-22 пар оснований. Таким образом, в одном варианте осуществления в той степени, в которой они становятся процессированными до функционального дуплекса из, например, 15-30 пар оснований, который целенаправленно воздействует на требуемую РНК для расщепления, молекула РНК или комплекс молекул РНК, имеющие дуплексный участок размером более 30 пар оснований, представляют собой dsRNA. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что в одном варианте осуществления miRNA представляет собой dsRNA. В другом варианте осуществления dsRNA представляет собой не встречающуюся в природе miRNA. В другом варианте осуществления средство на основе iRNA, применимое для целенаправленного воздействия на экспрессию гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, не образуется в целевой клетке при расщеплении более крупной dsRNA.

Описанная в данном документе dsRNA может дополнительно содержать один или несколько однонитевых нуклеотидных выступающих концов, например из 1, 2, 3 или 4 нуклеотидов. dsRNA, имеющие по меньшей мере один нуклеотидный выступающий конец, могут характеризоваться неожиданно более высокими ингибирующими свойствами по сравнению с их аналогами с тупыми концами. Нуклеотидный выступающий конец может содержать аналог нуклеотида/нуклеозида, в том числе дезоксинуклеотид/нуклеозид, или состоять из него. Выступающий(выступающие) конец(концы) может(могут) находиться в пределах смысловой нити, антисмысловой нити или их комбинации. Кроме того, нуклеотид(нуклеотиды) выступающего конца может(могут) присутствовать на 5'-конце, 3'-конце или на обоих концах антисмысловой или смысловой нити dsRNA.

- 22 045013 dsRNA можно синтезировать с помощью стандартных способов, известных в данной области, дополнительно обсуждаемых ниже, например, с применением автоматического синтезатора ДНК, такого как коммерчески доступный от, например, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.

Соединения на основе iRNA по настоящему изобретению можно получать с применением двухстадийной процедуры. Во-первых, отдельные нити молекулы двухнитевой РНК получают раздельно. Затем составляющие нити отжигают. Отдельные нити соединения на основе siRNA можно получать с применением жидкофазного или твердофазного органического синтеза или их обоих. Органический синтез дает преимущество в том, что можно легко получать олигонуклеотидные нити, содержащие не встречающиеся в природе или модифицированные нуклеотиды. Однонитевые олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно получать с применением жидкофазного или твердофазного органического синтеза или их обоих.

В одном аспекте dsRNA по настоящему изобретению содержит по меньшей мере две нуклеотидные последовательности, смысловую последовательность и антисмысловую последовательность. Смысловая нить выбрана из группы последовательностей, представленных в любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, и соответствующая смысловой нити антисмысловая нить выбрана из группы последовательностей, представленных в любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27.

В одном варианте осуществления смысловая нить выбрана из группы последовательностей, представленных в любой из табл. 3, 4, 19А, и 19В, и соответствующая смысловой нити антисмысловая нить выбрана из группы последовательностей, представленных в любой из табл. 3, 4, 19А и 19В. В этом аспекте одна из двух последовательностей комплементарна другой из двух последовательностей, при этом одна из последовательностей практически комплементарна последовательности мРНК, образующейся при экспрессии гена KLKB1. В связи с этим в данном аспекте dsRNA будет содержать два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан как смысловая нить в любой из табл. 3, 4, 19А и 19В, а второй олигонуклеотид описан как соответствующая смысловой нити антисмысловая нить в какой-либо из табл. 3, 4, 19А и 19В. В одном варианте осуществления практически комплементарные последовательности dsRNA содержатся в отдельных олигонуклеотидах. В другом варианте осуществления практически комплементарные последовательности dsRNA содержатся в одном олигонуклеотиде.

В одном варианте осуществления смысловая нить выбрана из группы последовательностей, представленных в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, и соответствующая смысловой нити антисмысловая нить выбрана из группы последовательностей, представленных в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26 и 27. В этом аспекте одна из двух последовательностей комплементарна другой из двух последовательностей, при этом одна из последовательностей практически комплементарна последовательности мРНК, образующейся при экспрессии гена F12. В связи с этим в данном аспекте dsRNA будет содержать два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан как смысловая нить в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, а второй олигонуклеотид описан как соответствующая смысловой нити антисмысловая нить в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26 и 27. В одном варианте осуществления практически комплементарные последовательности dsRNA содержатся в отдельных олигонуклеотидах. В другом варианте осуществления практически комплементарные последовательности dsRNA содержатся в одном олигонуклеотиде.

В одном варианте осуществления смысловая нить выбрана из группы последовательностей, представленных в любой из табл. 15, 16, 19Е и 19F, и соответствующая смысловой нити антисмысловая нить выбрана из группы последовательностей, представленных в любой из табл. 15, 16, 19Е и 19F. В этом аспекте одна из двух последовательностей комплементарна другой из двух последовательностей, при этом одна из последовательностей практически комплементарна последовательности мРНК, образующейся при экспрессии гена KNG1. В связи с этим в данном аспекте dsRNA будет содержать два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан как смысловая нить в любой из табл. 15, 16, 19Е и 19F, а второй олигонуклеотид описан как соответствующая смысловой нити антисмысловая нить в какой-либо из табл. 15, 16, 19Е и 19F. В одном варианте осуществления практически комплементарные последовательности dsRNA содержатся в отдельных олигонуклеотидах. В другом варианте осуществления практически комплементарные последовательности dsRNA содержатся в одном олигонуклеотиде.

Будет понятно, что хотя некоторые из последовательностей в табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27 описаны как модифицированные и/или конъюгированные последовательности, РНК из числа iRNA по настоящему изобретению, например dsRNA по настоящему изобретению, может содержать любую из последовательностей, изложенных в табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, которая является немодифицированной, неконъюгированной, и/или модифицированной, и/или конъюгированной иным образом, чем описано в них.

Специалисту в данной области хорошо известно, что dsRNA с дуплексной структурой из от приблизительно 20 до приблизительно 23 пар оснований, например из 21 пары оснований, были расценены как особенно эффективные в отношении индуцирования РНК-интерференции (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Тем не менее, другие авторы обнаружили, что более короткие или более длинные дуплексные структуры РНК также могут быть эффективными (Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719;

- 23 045013

Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). В вышеописанных вариантах осуществления в соответствии с природой олигонуклеотидных последовательностей, приведенных в любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, dsRNA, описанные в данном документе, могут содержать по меньшей мере одну нить, длина которой составляет минимально 21 нуклеотид. С достаточной вероятностью можно предположить, что более короткие дуплексы с одной из последовательностей из любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, за исключением лишь нескольких нуклеотидов на одном или обоих концах, могут быть эффективными, аналогично описанным выше dsRNA. Следовательно, dsRNA с последовательностью по меньшей мере из 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше смежных нуклеотидов, полученных из одной из последовательностей в любой из табл. 3, 4, 19А и 19В, и отличающиеся по своей способности ингибировать экспрессию гена KLKB1 не более чем на приблизительно 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования от dsRNA, содержащей полную последовательность, dsRNA с последовательностью по меньшей мере из 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше смежных нуклеотидов, полученных из одной из последовательностей в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20 и 21, и отличающиеся по своей способности ингибировать экспрессию гена F12 не более чем на приблизительно 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования от dsRNA, содержащей полную последовательность, и dsRNA с последовательностью по меньшей мере из 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше смежных нуклеотидов, полученных из одной из последовательностей в любой из табл. 15, 16, 19Е, и 19F, и отличающиеся по своей способности ингибировать экспрессию гена KNG1 не более чем на приблизительно 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования от dsRNA, содержащей полную последовательность, рассматриваются как находящиеся в пределах объема настоящего изобретения.

Кроме того, RNA, представленные в любой из табл. 3, 4, 19А и 19В, идентифицируют сайт(сайты) в транскрипте KLKB1, которые являются чувствительными к опосредованному RISC расщеплению, RNA, представленные в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, идентифицируют сайт (сайты) в транскрипте F12, которые являются чувствительными к опосредованному RISC расщеплению, и RNA, представленные в любой из табл. 15, 16, 19Е и 19F, идентифицируют сайт(сайты) в транскрипте KNG1, которые являются чувствительными к опосредованному RISC расщеплению. Таким образом, в настоящем изобретении дополнительно представлены iRNA, которые целенаправленно воздействуют на один из этих сайтов. Применимо к данному документу говорят, что iRNA целенаправленно воздействует на конкретный сайт РНК-транскрипта, если iRNA способствует расщеплению транскрипта в любом месте этого конкретного сайта. Такая iRNA будет, как правило, содержать по меньшей мере приблизительно 15 смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, представленных в любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, соединенных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, взятыми из участка, смежного с выбранной последовательностью в гене, вовлеченном в контактный путь активации свертывания крови.

При том что длина целевой последовательности, как правило, составляет приблизительно 15-30 нуклеотидов, существует широкий спектр пригодности конкретных последовательностей в этом диапазоне для управления расщеплением любой заданной целевой РНК. Различные пакеты программного обеспечения и принципы, изложенные в данном документе, предоставляют руководство по идентификации оптимальных целевых последовательностей для любого данного гена-мишени, но также можно принять эмпирический подход, в котором окно или маска данного размера (в качестве неограничивающего примера 21 нуклеотид) буквально или фигурально (в том числе, например, in silico), размещены на последовательности целевой РНК для идентификации последовательностей в диапазоне размеров, которые могут служить в качестве целевых последовательностей. Постепенно перемещая окно последовательности на один нуклеотид выше или ниже исходного положения целевой последовательности, можно идентифицировать следующую потенциальную целевую последовательность, пока не будет идентифицирован полный набор возможных последовательностей для любого заданного выбранного целевого размера. С помощью этого способа в сочетании с системным синтезом и тестированием идентифицированных последовательностей (с применением анализов, описанных в данном документе или известных в данной области) для идентификации последовательностей с оптимальными характеристиками можно идентифицировать те последовательности РНК, которые при нацеливании со средством на основе iRNA опосредуют наилучшее ингибирование экспрессии целевого гена. Таким образом, при том, что идентифицированные последовательности, например, в любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, представляют собой эффективные целевые последовательности, предполагается, что дополнительная оптимизация эффективности ингибирования может быть достигнута путем постепенного перемещения окна на один нуклеотид выше или ниже относительно заданных последовательностей для идентификации последовательностей с такими же или лучшими характеристиками ингибирования.

Кроме того, также предполагается, что для любой идентифицированной последовательности, например, в любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27, дополнительная оптимизация может быть достигнута путем систематического или добавления, или удаления нуклеотидов с получением более длинных или более коротких последовательностей и тестирования этих последовательностей, полученных путем перемещения окна, более длинного или более короткого по

- 24 045013 размеру, выше или ниже относительно целевой РНК в данной точке. Также результатом объединения этого подхода для получения новых мишеней-кандидатов вместе с тестированием эффективности iRNA на основе этих целевых последовательностей в анализе ингибирования, известном в данной области или описанном в данном документе, могут быть дополнительные улучшения в эффективности ингибирования. Более того, такие оптимизированные последовательности можно корректировать, например, посредством введения модифицированных нуклеотидов, описанных в данном документе или известных из уровня техники, добавления или изменений выступающего конца или других модификаций, известных из уровня техники и/или описанных в данном документе, для дополнительной оптимизации молекулы (например, для повышения стабильности в сыворотке крови или периода полужизни в кровотоке, повышения термостабильности, улучшения трансмембранной доставки, нацеливания на конкретное местоположение или тип клеток, повышения степени взаимодействия с ферментами пути сайленсинга, повышения высвобождения из эндосом) в качестве ингибитора экспрессии.

iRNA, как описано в данном документе, может содержать одну или несколько ошибок спаривания с целевой последовательностью. В одном варианте осуществления iRNA, описанная в данном документе, содержит не более 3 ошибок спаривания. Если антисмысловая нить iRNA содержит ошибки спаривания с целевой последовательностью, предпочтительно, чтобы область ошибочного спаривания находилась не в центре участка комплементарности. Если антисмысловая нить iRNA содержит ошибки спаривания с целевой последовательностью, предпочтительно, чтобы ошибка спаривания была ограничена в пределах последних 5 нуклеотидов либо от 5'-, либо от 3'-конца участка комплементарности. Например, в случае средства на основе iRNA из 23 нуклеотидов нить, комплементарная участку гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, обычно не содержит какой-либо ошибки спаривания в пределах центральных 13 нуклеотидов. Способы, описанные в данном документе, или способы, известные из уровня техники, можно применять для определения того, является ли iRNA, содержащая ошибку спаривания с целевой последовательностью, эффективной в ингибировании экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. Рассмотрение эффективности iRNA с ошибками спаривания при ингибировании экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, является важным, особенно, если известно, что конкретный участок комплементарности в гене, вовлеченном в контактный путь активации свертывания крови, характеризуется вариабельностью полиморфных последовательностей в популяции.

III. Модифицированные iRNA по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления РНК из числа iRNA по настоящему изобретению, например dsRNA, является немодифицированной и не содержит, например, химические модификации и/или конъюгации, известные в данной области и описанные в данном документе. В другом варианте осуществления РНК из числа iRNA по настоящему изобретению, например dsRNA, является химически модифицированной с целью улучшения стабильности или других полезных характеристик. В определенных вариантах осуществления по настоящему изобретению практически все из нуклеотидов iRNA по настоящему изобретению являются модифицированными. В других вариантах осуществления по настоящему изобретению все нуклеотиды в iRNA по настоящему изобретению являются модифицированными. iRNA по настоящему изобретению, в которых практически все нуклеотиды являются модифицированными, являются в значительной степени, но не полностью модифицированными и могут содержать не более 5, 4, 3, 2 или 1 немодифицированного нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления практически все нуклеотиды iRNA по настоящему изобретению являются модифицированными, и при этом iRNA содержит не более 8 2'-фтор-модификаций (например, не более 7 2'-фтор-модификаций, не более 6 2'-фтормодификаций, не более 5 2'-фтор модификаций, не более 4 2'-фтор-модификаций, не более 3 2'-фтормодификаций или не более 2 2'-фтор-модификаций) в смысловой нити и не более 6 2'-фтор-модификаций (например, не более 5 2'-фтор-модификаций, не более 4 2'-фтор-модификаций, не более 3 2'-фтормодификаций или не более 2 2'-фтор-модификаций) в антисмысловой нити. В других вариантах осуществления все нуклеотиды iRNA по настоящему изобретению являются модифицированными, и при этом iRNA содержит не более 8 2'-фтор-модификаций (например, не более 7 2'-фтор-модификаций, не более 6 2'-фтор-модификаций, не более 5 2'-фтор модификаций, не более 4 2'-фтор-модификаций, не более 3 2'фтор-модификаций или не более 2 2'-фтор-модификаций) в смысловой нити и не более 6 2'-фтормодификаций (например, не более 5 2'-фтор-модификаций, не более 4 2'-фтор-модификаций, не более 3 2'-фтор-модификаций или не более 2 2'-фтор-модификаций) в антисмысловой нити.

Нуклеиновые кислоты, представленные в настоящем изобретении, могут быть синтезированы и/или модифицированы способами, хорошо известными в данной области техники, такими как описанные в Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, который настоящим включен в данный документ посредством ссылки. Модификации предусматривают, например, концевые модификации, например, модификации 5'-конца (фосфорилирование, конъюгирование, инвертированные связи) или модификации 3'-конца (конъюгирование, нуклеотиды ДНК, инвертированные связи и. т.д.); модификации оснований, например, замену стабилизирующими основаниями, дестабилизирующими основаниями или основаниями, которые образуют пару оснований с расширенным репертуаром партнеров, удаление оснований (нуклеотиды с удаленным азотистым основа

- 25 045013 нием) или конъюгирование оснований; модификации Сахаров (например, в 2’-положении или 4’положении) или замену сахара и/или модификации остова, в том числе модификацию или замену фосфодиэфирных связей. Конкретные примеры соединений на основе iRNA, применимых в описанных в данном документе вариантах осуществления, включают без ограничения РНК, содержащие модифицированные остовы или не встречающиеся в природе межнуклеозидные связи. РНК с модифицированными остовами включают, среди прочего, такие, которые не содержат атом фосфора в остове. Для целей данного описания и как иногда упоминается в данной области модифицированные РНК, не содержащие атом фосфора в своем межнуклеозидном остове, также могут считаться олигонуклеозидами. В некоторых вариантах осуществления модифицированная iRNA будет содержать атом фосфора в своем межнуклеозидном остове.

Модифицированные остовы РНК включают, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфотриэфиры, сложные аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, в том числе З’-алкиленфосфонаты, и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, в том числе 3’-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, сложные тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты с нормальными 3’-5’-связями, их аналоги с 2’-5’-связями, а также таковые с инвертированной полярностью, где соседние пары нуклеозидных звеньев соединены в направлении от 3’-5’ к 5'-3’ или от 2’-5’ к 5'-2’. Также включены различные соли, смешанные соли и формы свободной кислоты.

Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения вышеуказанных фосфорсодержащих связей, включают без ограничения патенты США №

		3,687,808;	4,469,863;	4,476,301;
5,023,243;	5,177,195;	5, 188,897;	5,264,423;	5,276,019;
5, 278,302;	5,286,717;	5,321,131;	5,399,676;	5,405,939;
5,453,496;	5,455,233;	5,466,677;	5, 476, 925;	5,519,126;
5,536,821;	5,541,316;	5,550,111;	5,563,253;	5,571,799;
5,587,361;	5,625,050;	6,028,188;	6, 124,445;	6,160,109;
6,169,170;	6,172,209;	6, 239, 265;	6,277,603;	6, 326, 199;
6,346,614;	6,444,423;	6,531,590;	6,534,639;	6,608,035;
6,683,167;	6,858,715;	6, 867,294;	6,878,805;	7,015,315;
7,041,816;	7,273,933; 7,	321,029;

и патент США RE39464, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ посредством ссылки.

Модифицированные остовы РНК, которые не содержат атом фосфора в своем составе, представляют собой остовы, образованные короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают остовы с морфолиновыми связями (частично образованные из сахарной части нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие, содержащие смесь составляющих частей N, О, S и СН₂.

Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения вышеупомянутых олигонуклеозидов, включают без ограничения патенты США №

5034506; 5166315; 5185444; 5214134;

5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677;

5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046;

5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ посредством ссылки.

В других вариантах осуществления рассматриваются подходящие миметики РНК для применения в iRNA, в которых как сахар, так и межнуклеозидная связь, т.е остов нуклеотидных звеньев, заменены новыми группами. Структурные единицы в виде оснований сохраняются для гибридизации с соответствующим целевым соединением нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, миметик РНК, который, как было показано, обладает превосходными свойствами гибридизации, называется пептидной нуклеиновой кислотой (PNA). В соединениях PNA сахарный остов РНК заменен амидсодержащим остовом, в частности аминоэтилглициновым остовом. Нуклеотидные основания сохраняются и связываются непосредственно или опосредованно с атомами азота азагруппы амидной части остова. Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения соединений PNA, включают без ограни- 26 045013 чения патенты США № 5539082; 5714331 и 5719262, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ посредством ссылки. Дополнительные соединения PNA, подходящие для применения в iRNA по настоящему изобретению, описаны, например, в Nielsen et al., Science, 1991, 254,

1497-1500.

Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем изобретении, включают РНК с фосфоротиоатными остовами и олигонуклеозиды с остовами с гетероатомами и, в частности, -CH2-NHCH2-, --CH₂-N(CH3)-O-CH₂- [известный как метилен (метилиминовый) или MMI остов], --CH₂-O-N(СН₃)СН₂--, --CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂- и -N(CH₃)-CH₂-CH₂- [где нативный фосфодиэфирный остов представлен как -О-Р-О-СН2--] согласно вышеупомянутому патенту США № 5489677 и амидные остовы согласно вышеупомянутому патенту США № 5602240. В некоторых вариантах осуществления РНК, представленные в данном документе, имеют морфолиновые структуры остова согласно вышеупомянутому патенту США № 5034506.

Модифицированные РНК также могут содержать один или несколько замещенных сахарных фрагментов. iRNA, например dsRNA, представленные в данном документе, могут содержать одно из следующего в 2'-положении: ОН; F; О-, S- или N-алкил; О-, S- или N-алкенил; О-, S- или N-алкинил или Оалкил-О-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенными или незамещенными С1С₁₀алкилом или С₂-С₁₀алкенилом и алкинилом. Иллюстративные подходящие модификации включают О[(СН2)пО]_тСНз, О(СН2)пОСНз, O(CH2)nNH2, О(СН2)пСНз, O(CH2)nONH2 и ОССЩ^ОККСН^СЩЪ, где п и т составляют от 1 до приблизительно 10. В других вариантах осуществления dsRNA содержат одно из следующего в 2'-положении: низший С1-С₁₀алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, Oалкарил или О-аралкил, SH, SCHз, OCN, С1, Br, CN, СРз, OCFз, SOCHз, SONI N ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, расщепляющую РНК группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств iRNA или группу для улучшения фармакодинамических свойств iRNA и другие заместители с аналогичными свойствами. В некоторых вариантах осуществления модификация предусматривает 2'метоксиэтокси (2'-О-СН₂СН₂ОСН₃, также известный как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), т.е. алкокси-алкоксигруппу. Другой иллюстративной модификацией является 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е. группа О(СН₂)₂ON(CH₃)₂, также известная как 2'-DMAOE, описанная в примерах в данном документе ниже, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известная в уровне техники как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е. 2'-O-СН₂-О-СН₂-N(CH₂)₂.

Другие модификации включают 2'-метокси (2'-ОСН₃), 2'-аминопропокси (2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂) и 2'фтор (2'-F). Подобные модификации также могут быть осуществлены в других положениях в РНК из числа iRNA, в частности в З'-положении сахара в З'-концевом нуклеотиде или в dsRNA с 2'-5'-связями и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. iRNA также могут содержать миметики сахаров, такие как циклобутильные фрагменты, вместо пентофуранозильного сахара. Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения таких модифицированных сахарных структур, включают без ограничения патенты США №

4,981,957;

5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5, 446,137;

5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5, 576,427;

5, 591,722; 5, 597,909; 5, 610, 300; 5, 627,053; 5, 639,873;

5, 646, 265; 5, 658,873; 5, 670, 633; и 5, 700, 920, некоторые из которых имеют общего заявителя с настоящей заявкой. Полное содержание каждого из вышеупомянутых источников тем самым включено в данный документ посредством ссылки.

РНК из числа iRNA также может содержать модификации или замещения нуклеотидного основания (часто называемого в данной области просто как основание). Используемые в данном документе немодифицированные или природные нуклеотидные основания включают пуриновые основания аденин (A) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (T), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотидные основания включают в себя другие синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как дезокситимин (dT) , 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и -цитозин, 5-пропинилурацил и -цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5галоген-, в частности 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, а также Здеазагуанин и З-деазааденин.

Дополнительные нуклеотидные основания включают такие, которые раскрыты в патенте США № 3687808, такие, которые раскрытые в Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wi1ey-VCH, 2008; такие, которые раскрыты в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J.L., ed. John Wiley & Sons, 1990, такие, которые раскры- 27 045013 ты в Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, и такие, которые раскрыты в Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, В., Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеотидных оснований особенно применимы для повышения аффинности связывания олигомерных соединений, представленных в настоящем изобретении. Они включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и 0-6-замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что 5-метилцитозиновые замещения повышают стабильность дуплекса нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, В., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276278) и представляют собой иллюстративные замещения оснований, еще более конкретно в сочетании с 2'-О-метоксиэтиловыми модификациями сахаров.

Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения некоторых из вышеуказанных модифицированных нуклеотидных оснований, а также других модифицированных нуклеотидных оснований, включают без ограничения вышеуказанные патенты США №

3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066;

5,175,273;	5,367,066;	5,432,272;	5,457,187;	5, 459, 255,
5,484,908;	5,502,177;	5,525,711;	5,552,540;	5, 587,469,
5,594,121,	5,596,091;	5,614,617;	5,681,941;	5,750,692,
6,015,886;	6,147,200;	6,166,197;	6,222,025;	6,235,887
6,380,368;	6,528,640;	6,639,062;	6,617,438;	7,045,610

7,427,672; и 7,495,088, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ посредством ссылки.

РНК из числа iRNA также может быть модифицирована таким образом, чтобы она содержала один или несколько бициклических сахарных фрагментов. Бициклический сахар представляет собой фуранозильное кольцо, модифицированное путем формирования мостика между двумя атомами. Бициклический нуклеозид (BNA) представляет собой нуклеозид с сахарным фрагментом, содержащим мостик, соединяющий два атома углерода сахарного кольца, образуя таким образом бициклическую кольцевую систему. В определенных вариантах осуществления мостик соединяет 4'-атом углерода и 2'-атом углерода в сахарном кольце. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления средство по настоящему изобретению может содержать одну или несколько запертых нуклеиновых кислот (LNA). Запертая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотид, содержащий модифицированный рибозный фрагмент, где рибозный фрагмент содержит дополнительный мостик, соединяющий 2'- и 4'-атомы углерода. Другими словами, LNA представляет собой нуклеотид, содержащий бициклический сахарный фрагмент, содержащий мостик 4'-СН2-О-2'. Эта структура эффективно запирает рибозу в структурной конформации 3'-эндо. Было показано, что добавление запертых нуклеиновых кислот в siRNA повышает стабильность siRNA в сыворотке крови и снижает нецелевые эффекты (Elmen, J. et al. (2005) Nucleic Acids Research 33 (1): 439-447; Mook, O.R. et al. (2007) Mol Canc Ther 6 (3):833-843; Grunweller, A. et al. (2003) Nucleic Acids Research 31 (12):3185-3193). Примеры бициклических нуклеозидов для применения в полинуклеотидах по настоящему изобретению включают без ограничения нуклеозиды, содержащие мостик между 4'-и 2'-атомами кольца рибозильного остатка. В определенных вариантах осуществления средства на основе антисмысловых полинуклеотидов по настоящему изобретению содержат один или несколько бициклических нуклеозидов, содержащих мостик 4'-2'. Примеры таких бициклических нуклеозидов с мостиком 4'-2' включают без ограничения 4'-(СН₂)-О-2' (LNA); 4'-(CH₂)-S-2'; 4'-(СН₂)₂-О-2' (ENA); 4'СН(СН₃)-О-2' (также называемый конформационно затрудненный этилом или cEt) и 4'СН(СН2ОСНз)-О-2' (и его аналоги; см., например, патент США № 7399845); 4'-C(CH₃)(CH₃)-O-2' (и его аналоги; см., например, патент США № 8278283); 4'-CH2-N(OCH₃)-2' (и его аналоги; см., например, патент США № 8278425); 4'-CH2-O-N(CH₃)-2' (см., например, публикацию патента США № 2004/0171570); 4'-CH2-N(R)-O-2', где R представляет собой Н, С1-С₁₂алкил или защитную группу (см., например, патент США № 7427672); 4'-СН2-С(Н)(СНз)-2' (см., например, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118134); и 4'-CH₂-C(=CH₂)-2' (и его аналоги; см., например, патент США № 8278426). Полное содержание каждого из вышеупомянутых источников тем самым включено в данный документ посредством ссылки.

Дополнительные иллюстративные патенты США и публикации патентов США, в которых изложена идея получения нуклеотидов запертых нуклеиновых кислот, включают без ограничения следующие: патенты США №

6, 268,490; 6, 525, 191; 6, 670,461; 6,770,748;

6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133;7,084,125; 7,399,845;

7,427,672; 7,569,686; 7,741,457; 8,022,193; 8,030,467;

8,278,425; 8,278,426; 8,278,283; US 2008/0039618; и US

2009/0012281, полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ посредством

- 28 045013 ссылки.

Какой-либо из вышеизложенных бициклических нуклеозидов можно получить с имеющим одну или несколько стереохимических конфигураций сахаров, в том числе, например, a-L-рибофуранозой и βD-рибофуранозой (см. WO 99/14226).

РНК из числа iRNA также может быть модифицирована таким образом, чтобы она содержала один или несколько затрудненных этилом нуклеотидов. Используемый в данном документе затрудненный этилом нуклеотид или cEt представляет собой запертую нуклеиновую кислоту, содержащую бициклический сахарный фрагмент, содержащий мостик 4'-СН(СН₃)-О-2'. В одном варианте осуществления затрудненный этилом нуклеотид находится в S-конформации, называемой в данном документе S-cEt.

iRNA по настоящему изобретению может также содержать один или несколько конформационно ограниченных нуклеотидов (CRN). CRN представляют собой аналоги нуклеотидов с линкером, соединяющим С2'- и С4'-атомы углерода рибозы или С3- и С5'-атомы углерода рибозы. CRN запирает рибозное кольцо в стабильную конформацию и повышает аффинность гибридизации с мРНК. Линкер имеет достаточную длину для помещения атома кислорода в оптимальное положение для стабильности и аффинности, что приводит в результате к меньшему сморщиванию рибозного кольца.

Иллюстративные публикации, в которых изложена идея получения некоторых из вышеуказанных CRN, включают без ограничения публикацию патента США № 2013/0190383 и публикацию согласно PCT WO 2013/036868, полное содержание каждой из которых настоящим включено в данный документ посредством ссылки.

Один или несколько нуклеотидов iRNA по настоящему изобретению также могут включать гидроксиметилзамещенный нуклеотид. Гидроксиметилзамещенный нуклеотид представляет собой ациклический 2'-3'-секонуклеотид, также известный как модификация под названием незапертая нуклеиновая кислота (UNA).

Иллюстративные публикации США, в которых изложена идея получения UNA, включают без ограничения патент США № 8314227 и публикации патентов США № 2013/0096289; 2013/0011922 и 2011/0313020, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.

Потенциально стабилизирующие модификации на концах молекул РНК могут включать N(ацетиламинокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-NHAc), N-капроил-4-гидроксипролинол (Hyp-C6), N-ацетил-4-гидроксипролинол (Hyp-NHAc), тимидин-2'-O-дезокситимидин (простой эфир), N-(аминокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-амино), 2-докозаноилуридин-3-фосфат, инвертированное основание dT (idT) и другие. Раскрытие этой модификации можно найти в публикации согласно PCT № WO 2011/005861.

Другие модификации нуклеотидов iRNA по настоящему изобретению включают 5'-фосфат или миметик 5'-фосфата, например 5'-концевой фосфат или миметик фосфата на антисмысловой нити средства для RNAi. Подходящие миметики фосфатов раскрыты, например, в публикации патента США № 2012/0157511, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки.

А. Модифицированные iRNA, содержащие мотивы по настоящему изобретению В некоторых аспектах настоящего изобретения двухнитевые средства для RNAi по настоящему изобретению включают средства с химическими модификациями, раскрытыми, например, в предварительной заявке на патент США № 61/561710, поданной 18 ноября 2011 г., или в PCT/US2012/065691, поданной 16 ноября 2012 г., полное содержание каждой из которых настоящим включено в данный документ посредством ссылки.

Как показано в данном документе и в предварительной заявке № 61/561710 или в заявке согласно PCT/US2012/065691, превосходные результаты могут быть получены путем введения одного или нескольких мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов в смысловую нить и/или антисмысловую нить средства для RNAi, в частности в сайт расщепления или рядом с ним. В некоторых вариантах осуществления смысловая нить и антисмысловая нить средства для RNAi могут быть полностью модифицированы иным способом. Введение таких мотивов нарушает паттерн модификаций, если он имеется, смысловой и/или антисмысловой нити. Средство для RNAi, к примеру смысловая нить, может быть необязательно конъюгировано с лигандом, представляющим собой производное GalNAc. Полученные в результате средства для RNAi характеризуются превосходной активностью в отношении сайленсинга генов.

Более конкретно, неожиданно было обнаружено, что в тех случаях, когда смысловая нить и антисмысловая нить двухнитевого средства для RNAi полностью модифицированы так, что имеют один или несколько мотивов с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления по меньшей мере одной нити средства для RNAi или рядом с ним, тогда активность средства для RNAi в отношении сайленсинга генов была наилучшим образом повышена.

Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрены двухнитевые средства для RNAi, способные ингибировать экспрессию целевого гена (т.е. гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, т.е. гена KLKB1, гена F12 или гена KNG1) in vivo. Средство для RNAi содержит смысловую нить и антисмысловую нить. Длина каждой нити средства для RNAi может варьироваться от 12 до 30 нуклеотидов. Например, длина каждой нити может составлять 14-30 нуклеотидов, 17-30 нуклео- 29 045013 тидов, 25-30 нуклеотидов, 27-30 нуклеотидов, 17-23 нуклеотида, 17-21 нуклеотид, 17-19 нуклеотидов, 1925 нуклеотидов, 19-23 нуклеотида, 19-21 нуклеотид, 21-25 нуклеотидов или 21-23 нуклеотида.

Смысловая нить и антисмысловая нить, как правило, образуют двухнитевой РНК-дуплекс (dsRNA), также называемый в данном документе как средство для RNAi. Длина дуплексного участка средства для RNAi может составлять 12-30 пар нуклеотидов. Например, длина дуплексного участка может составлять 14-30 пар нуклеотидов, 17-30 пар нуклеотидов, 27-30 пар нуклеотидов, 17-23 пары нуклеотидов, 17-21 пару нуклеотидов, 17-19 пар нуклеотидов, 19-25 пар нуклеотидов, 19-23 пары нуклеотидов, 19-21 пару нуклеотидов, 21-25 пар нуклеотидов или 21-23 пары нуклеотидов. В другом примере дуплексный участок выбран по длине из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 и 27 нуклеотидов.

В одном варианте осуществления средство для RNAi может содержать один или несколько выступающих участков и/или кэпирующих групп на 3'-конце, 5'-конце или на обоих концах одной или обеих нитей. Длина выступающего конца может составлять 1-6 нуклеотидов, например 2-6 нуклеотидов, 1-5 нуклеотидов, 2-5 нуклеотидов, 1-4 нуклеотида, 2-4 нуклеотида, 1-3 нуклеотида, 2-3 нуклеотида или 1-2 нуклеотида. Наличие выступающих концов может быть обусловлено тем, что одна нить длиннее другой, или может быть обусловлено тем, что две нити одинаковой длины расположены со сдвигом. Выступающий конец может образовывать ошибочное спаривание с целевой мРНК или он может быть комплементарным целевым последовательностям генов или может иметь другую последовательность. Первая и вторая нити также могут быть соединены, например, дополнительными основаниями с образованием шпильки или при помощи других не содержащих основания линкеров.

В одном варианте осуществления каждый из нуклеотидов в участке выступающего конца средства для RNAi независимо может представлять собой модифицированный или немодифицированный нуклеотид, в том числе без ограничения с сахаром с 2'-модификацией, такой как 2-F, 2'-O-метил, тимидин (Т), 2-O-метоксиэтил-5-метилуридин (Teo), 2-О-метоксиэтиладенозин (Aeo), 2-O-метоксиэтил-5-метилцитидин (m5Ceo) и их любые комбинации. Например, последовательность выступающего конца на обоих концах каждой нити может представлять собой ТТ. Выступающий конец может образовывать ошибочное спаривание с целевой мРНК или он может быть комплементарным целевым последовательностям генов или может иметь другую последовательность.

5'- или 3'-выступающие концы смысловой нити, антисмысловой нити или обеих нитей средства для RNAi могут быть фосфорилированными. В некоторых вариантах осуществления участок(участки) выступающего(выступающих) конца(концов) содержит(содержат) два нуклеотида с фосфоротиоатом между двумя нуклеотидами, при этом два нуклеотида могут быть одинаковыми или отличающимися. В одном варианте осуществления выступающий конец присутствует на 3'-конце смысловой нити, антисмысловой нити или обеих нитей. В одном варианте осуществления этот 3'-выступающий конец присутствует в антисмысловой нити. В одном варианте осуществления этот 3'-выступающий конец присутствует в смысловой нити.

Средство для RNAi может содержать только один выступающий конец, который может повышать интерферирующую активность средства для RNAi без воздействия на его общую стабильность. Например, однонитевой выступающий конец может быть расположен на 3'-конце смысловой нити или в качестве альтернативы на 3'-конце антисмысловой нити. RNAi также может иметь тупой конец, расположенный на 5'-конце антисмысловой нити (или 3'-конце смысловой нити) или vice versa. Как правило, антисмысловая нить RNAi имеет нуклеотидный выступающий конец на 3'-конце, а 5'-конец является тупым концом. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, предполагают, что асимметричный тупой конец на 5'-конце антисмысловой нити и 3'-концевой выступающий конец антисмысловой нити способствуют включению направляющей нити в процесс с участием RISC.

В одном варианте осуществления средство для RNAi представляет собой олигонуклеотид с обоими тупыми концами, длина которого составляет 19 нуклеотидов, где смысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'Д-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 7, 8, 9 от 5'-конца. Антисмысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.

В другом варианте осуществления средство для RNAi представляет собой олигонуклеотид с обоими тупыми концами, длина которого составляет 20 нуклеотидов, где смысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'Д-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 8, 9, 10 от 5'-конца. Антисмысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.

В еще одном варианте осуществления средство для RNAi представляет собой олигонуклеотид с обоими тупыми концами, длина которого составляет 21 нуклеотид, где смысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца. Антисмысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метилмодификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца.

В одном варианте осуществления средство для RNAi содержит смысловую нить из 21 нуклеотида и антисмысловую нить из 23 нуклеотидов, где смысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-Р-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 9, 10, 11 от 5'-конца; анти- 30 045013 смысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положениях 11, 12, 13 от 5'-конца, где один конец средства для RNAi тупой, в то время как другой конец содержит выступ из 2 нуклеотидов. Предпочтительно выступ из 2 нуклеотидов находится на 3'-конце антисмысловой нити.

В тех случаях, когда выступ из 2 нуклеотидов находится на 3'-конце антисмысловой нити, между тремя концевыми нуклеотидами могут быть две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи, при этом два из трех нуклеотидов являются выступающими нуклеотидами, а третий нуклеотид является спаренным нуклеотидом, следующим за выступающим нуклеотидом. В одном варианте осуществления средство для RNAi дополнительно содержит две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи между концевыми тремя нуклеотидами как на 5'-конце смысловой нити, так и на 5'-конце антисмысловой нити. В одном варианте осуществления каждый нуклеотид в смысловой нити и антисмысловой нити средства для RNAi, в том числе нуклеотиды, которые являются частью мотивов, представляет собой модифицированный нуклеотид. В одном варианте осуществления каждый остаток независимо модифицирован 2'-О-метилом или 3'фтором, например, в чередующемся мотиве. Необязательно средство для RNAi дополнительно содержит лиганд (предпочтительно GalNAc₃).

В одном варианте осуществления средство для RNAi содержит смысловую и антисмысловую нить, где длина смысловой нити составляет 25-30 нуклеотидных остатков, в которой, начиная с 5'-концевого нуклеотида (положения 1), положения 1-23 первой нити содержат по меньшей мере 8 рибонуклеотидов; длина антисмысловой нити составляет 36-66 нуклеотидных остатков и, начиная с 3'-концевого нуклеотида, содержит по меньшей мере 8 рибонуклеотидов в положениях, спаренных с положениями 1-23 смысловой нити с образованием дуплекса; где по меньшей мере 3'-концевой нуклеотид антисмысловой нити является неспаренным со смысловой нитью и до 6 последовательных 3'-концевых нуклеотидов являются неспаренными со смысловой нитью, образуя тем самым 3'-однонитевой выступающий конец из 1-6 нуклеотидов; где 5'-конец антисмысловой нити содержит от 10-30 последовательных нуклеотидов, неспаренных со смысловой нитью, образуя тем самым 5'-однонитевой выступающий конец из 10-30 нуклеотидов; где по меньшей мере 5'-концевые и 3'-концевые нуклеотиды смысловой нити образуют пары оснований с нуклеотидами антисмысловой нити, при этом смысловая и антисмысловая нити выровнены для максимальной комплементарности, образуя тем самым практически дуплексный участок между смысловой и антисмысловой нитями; и антисмысловая нить в достаточной степени комплементарна целевой РНК на протяжении по меньшей мере 19 рибонуклеотидов антисмысловой нити в длину для снижения экспрессии целевого гена при введении двухнитевой нуклеиновой кислоты в клетку млекопитающего; и где смысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-F-модификаций трех последовательных нуклеотидов, где по меньшей мере один из мотивов находится в сайте расщепления или рядом с ним. Антисмысловая нить содержит по меньшей мере один мотив из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления или рядом с ним.

В одном варианте осуществления средство для RNAi содержит смысловую и антисмысловую нити, где средство для RNAi содержит первую нить, длина которой составляет по меньшей мере 25 и не более 29 нуклеотидов, и вторую нить, длина которой составляет не более 30 нуклеотидов, по меньшей мере с одним мотивом из трех 2'-О-метил-модификаций трех последовательных нуклеотидов в положении 11, 12, 13 от 5'-конца; где 3'-конец первой нити и 5'-конец второй нити образуют тупой конец, а вторая нить на своем 3'-конце на 1-4 нуклеотида длиннее, чем первая нить, где длина дуплексного участка составляет по меньшей мере 25 нуклеотидов, а вторая нить в достаточной степени комплементарна целевой мРНК на протяжении по меньшей мере 19 нуклеотидов длины второй нити, для снижения экспрессии целевого гена, где средство для RNAi вводят в клетку млекопитающего, и где расщепление средства для RNAi при помощи дайсера (Dicer) предпочтительно дает в результате siRNA, содержащую 3'-конец второй нити, за счет чего обеспечивается снижение экспрессии целевого гена у млекопитающего. Необязательно средство для RNAi дополнительно содержит лиганд.

В одном варианте осуществления смысловая нить средства для RNAi содержит по меньшей мере один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов, где один из мотивов находится в сайте расщепления в смысловой нити.

В одном варианте осуществления антисмысловая нить средства для RNAi может также содержать по меньшей мере один мотив с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов, где один из мотивов находится в сайте расщепления в смысловой нити или рядом с ним.

Для средства для RNAi с дуплексным участком, длина которого составляет 17-23 нуклеотида, сайт расщепления антисмысловой нити находится обычно около положений 10, 11 и 12 от 5'-конца. Таким образом, мотивы из трех одинаковых модификаций могут находиться в 9, 10, 11 положениях; 10, 11, 12 положениях; 11, 12, 13 положениях; 12, 13, 14 положениях или 13, 14, 15 положениях антисмысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца антисмысловой нити, или отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца антисмысловой нити. Сайт расщепления в антисмысловой нити может также изменяться в соответствии с длиной дуплексного участка средства для RNAi от 5'-конца.

Смысловая нить средства для RNAi может содержать по меньшей мере один мотив из трех одина- 31 045013 ковых модификаций трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления нити; а антисмысловая нить может иметь по меньшей мере один мотив с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов в сайте расщепления нити или рядом с ним. В тех случаях, когда смысловая нить и антисмысловая нить образуют дуплекс dsRNA, смысловая нить и антисмысловая нить могут быть выровнены так, что один мотив из трех нуклеотидов в смысловой нити и один мотив из трех нуклеотидов в антисмысловой нити имеют перекрытие по меньшей мере в один нуклеотид, т.е. по меньшей мере один из трех нуклеотидов мотива в смысловой нити образует пару оснований по меньшей мере с одним из трех нуклеотидов мотива в антисмысловой нити. В качестве альтернативы по меньшей мере два нуклеотида могут перекрываться или все три нуклеотида могут перекрываться.

В одном варианте осуществления смысловая нить средства для RNAi может содержать несколько мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов. Первый мотив может находиться в сайте расщепления нити или рядом с ним, а другие мотивы могут представлять собой фланкирующую модификацию. Термин фланкирующая модификация в данном документе относится к мотиву, находящемуся в другой части нити, который отделен от мотива в сайте расщепления той же нити или находится рядом с ним. Фланкирующая модификация либо прилегает к первому мотиву, либо отделена по меньшей мере одним или несколькими нуклеотидами. В тех случаях, когда мотивы непосредственно прилегают друг к другу, химическая структура мотивов отличается друг от друга, а если мотивы разделены одним или несколькими нуклеотидами, то химические структуры могут быть одинаковыми или разными. Могут присутствовать две или более фланкирующие модификации. Например, если присутствуют две фланкирующие модификации, то каждая фланкирующая модификация может встречаться на одном конце относительно первого мотива, который находится в сайте расщепления или рядом с ним, или с обеих сторон основного мотива.

Подобно смысловой нити, антисмысловая нить средства для RNAi может содержать несколько мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов, при этом по меньшей мере один из мотивов находится в сайте расщепления нити или рядом с ним. Данная антисмысловая нить может также содержать одну или несколько фланкирующих модификаций, при выравнивании подобных фланкирующим модификациям, которые могут присутствовать в смысловой нити.

В одном варианте осуществления фланкирующая модификация в смысловой нити или антисмысловой нити средства для RNAi обычно не содержит первый один или первые два концевых нуклеотида на 3'-конце, 5'-конце или на обоих концах нити.

В другом варианте осуществления фланкирующая модификация в смысловой нити или антисмысловой нити средства для RNAi обычно не содержит первый один или первые два спаренных нуклеотида в дуплексном участке на 3'-конце, 5'-конце или на обоих концах нити.

В тех случаях, если каждая из смысловой нити и антисмысловой нити средства для RNAi содержит по меньшей мере одну фланкирующую модификацию, тогда фланкирующие модификации могут попадать на один и тот же конец дуплексного участка и иметь перекрытие в один, два или три нуклеотида.

В тех случаях, если каждая из смысловой нити и антисмысловой нити средства для RNAi содержит по меньшей мере две фланкирующие модификации, тогда смысловая нить и антисмысловая нить могут быть выравнены так, что две модификации, каждая от одной нити, попадают на один конец дуплексного участка с перекрытием в один, два или три нуклеотида; две модификации, каждая от одной нити, попадают на другой конец дуплексного участка с перекрытием в один, два или три нуклеотида; две модификации одной нити попадают по обе стороны от основного мотива с перекрытием в один, два или три нуклеотида в дуплексном участке.

В одном варианте осуществления каждый нуклеотид в смысловой нити и антисмысловой нити средства для RNAi, в том числе нуклеотиды, которые являются частью мотивов, могут быть модифицированными. Каждый нуклеотид может быть модифицированным одинаковыми или разными модификациями, которые могут предусматривать одно или несколько изменений одного или обоих несвязанных с фосфатом атомов кислорода и/или одного или нескольких связанных с фосфатом атомов кислорода; изменение компонента рибозного сахара, например, 2'-гидроксила в рибозном сахаре; полную замену фосфатного фрагмента дефосфорилированными линкерами; модификацию или замену встречающегося в природе основания и замену или модификацию рибозофосфатного остова.

Поскольку нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры из субъединиц, то многие модификации встречаются в положении, которое повторяется в пределах нуклеиновой кислоты, например, модификация основания, или фосфатного фрагмента, или не образующего связь атома O фосфатного фрагмента. В некоторых случаях модификация будет находиться во всех рассматриваемых положениях в нуклеиновой кислоте, но во многих случаях не будет. В качестве примера модификация может находиться только в 3'- или 5'-концевом положении, может находиться только в концевом участке, например, в положении концевого нуклеотида или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах нити. Модификация может находиться в двухнитевом участке, в однонитевом участке или в обоих. Модификация может находиться только в двухнитевом участке РНК или может находиться только в однонитевом участке РНК. Например, фосфоротиоатная модификация в положении не образующего связь атома O может встречаться только на одном или обоих концах, может встречаться только в концевом участке, например, в поло- 32 045013 жении концевого нуклеотида или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах нити, или может встречаться в двухнитевом и однонитевом участках, в частности на концах. 5'-конец или концы могут быть фосфорилированными.

Это создает возможность, например, для повышения стабильности, для включения конкретных оснований в выступающие концы или для включения модифицированных нуклеотидов или имитаторов нуклеотидов в однонитевые выступающие концы, например, в 5'- или 3'-выступающий конец или в оба. Например, может быть желательно включить пуриновые нуклеотиды в выступающие концы. В некоторых вариантах осуществления все или некоторые основания в 3'- или 5'-выступающем конце могут быть модифицированы, например, с помощью модификации, описанной в данном документе. Модификации могут предусматривать, например, применение модификаций в 2'-положении рибозного сахара с помощью модификаций, известных в данной области, например, применение дезоксирибонуклеотидов, 2'дезокси-2'-фтор-(2'-Р)- или 2'-O-метил-модификаций вместо рибозного сахара нуклеинового основания, а также модификаций фосфатной группы, например, фосфоротиоатных модификаций. Выступающие концы необязательно должны быть гомологичными целевой последовательности.

В одном варианте осуществления каждый остаток смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован LNA, CRN, сЕТ, UNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-O-метилом, 2'-Oаллилом, 2'-С-аллилом, 2'-дезокси, 2'-гидроксилом или 2'-фтором. Нити могут содержать более одной модификации. В одном варианте осуществления каждый остаток смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован с помощью 2'-О-метила или 2'-фтора.

По меньшей мере две различные модификации, как правило, присутствуют в смысловой нити и антисмысловой нити. Эти две модификации могут быть 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификациями или другими.

В одном варианте осуществления Na и/или N_b содержат модификации чередующегося паттерна. Термин чередующийся мотив, используемый в данном документе, относится к мотиву с одной или несколькими модификациями, при этом каждая модификация встречается у чередующихся нуклеотидов одной нити. Чередующийся нуклеотид может относиться к каждому второму нуклеотиду или к каждому третьему нуклеотиду или аналогичному паттерну. Например, если каждый из A, B и C представляет собой один тип модификации нуклеотида, то чередующийся мотив может представлять собой

АВАВАВАВАВАВ..., ААВВААВВААВВ..., ААВААВААВААВ... ,

ΆΆΆΒΆΆΑΒΆΆΑΒ... , ΆΆΆΒΒΒΆΆΑΒΒΒ... или АВСАВСАВСАВС...

и т.д.

Тип модификаций, содержащихся в чередующемся мотиве, может быть одинаковым или разным. Например, если каждый из A, B, C, D представляет собой один тип модификации нуклеотида, то чередующиеся паттерны, т.е. модификации каждого второго нуклеотида, может быть одинаковым, но каждая из смысловой нити или антисмысловой нити может быть выбрана из нескольких возможных модификаций в чередующемся мотиве, как, например: ававав..., асасас..., bdbdbd... или cdcdcd... и т.д.

В одном варианте осуществления средство для RNAi по настоящему изобретению содержит паттерн модификаций для чередующегося мотива смысловой нити, сдвинутый относительно паттерна модификации для чередующегося мотива антисмысловой нити. Сдвиг может быть таким, что модифицированная группа нуклеотидов смысловой нити соответствует модифицированной другим способом группе нуклеотидов антисмысловой нити и vice versa. Например, при спаривании смысловой нити с антисмысловой нитью в дуплексе dsRNA чередующийся мотив в смысловой нити может начинаться с ABABAB от 5'- к 3'-концу нити, а чередующийся мотив в антисмысловой нити может начинаться с BABABA от 5'- к 3'-концу нити в дуплексном участке. В качестве другого примера чередующийся мотив в смысловой нити может начинаться с AABBAABB от 5'- к 3'-концу нити, а чередующийся мотив в антисмысловой нити может начинаться с BBAABBAA от 5'- к 3'-концу нити в дуплексном участке, так что между смысловой нитью и антисмысловой нитью имеется полный или частичный сдвиг паттернов модификаций.

В одном варианте осуществления средство для RNAi изначально имеет сдвиг паттерна чередующегося мотива 2'-О-метил-модификации и 2'-Р-модификации в смысловой нити относительно паттерна чередующегося мотива 2'-О-метил-модификации и 2'-Б-модификации в антисмысловой нити, т.е. 2'-Ометил-модифицированный нуклеотид смысловой нити образует пару оснований с 2'-F-модифицированным нуклеотидом в антисмысловой нити и наоборот. Положение 1 в смысловой нити может начинаться с 2'-F-модификации, а 1 положение в антисмысловой нити может начинаться с 2'-О-метил-модификации.

Введение одного или нескольких мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов в смысловую нить и/или антисмысловую нить нарушает исходный паттерн модификаций, присутствующий в смысловой нити и/или антисмысловой нити. Такое нарушение паттерна модификаций смысловой и/или антисмысловой нити путем введения одного или нескольких мотивов из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов в смысловую и/или антисмысловую нить неожиданно повышает активность сайленсинга генов в отношении целевого гена.

- 33 045013

В одном варианте осуществления в тех случаях, когда мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов вводят в любую из нитей, модификация нуклеотида, следующего после мотива, является модификацией, отличной от модификации мотива. Например, часть последовательности, содержащей мотив, представляет собой ...N_aYYYN_b..., где Y представляет собой модификацию мотива из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов, a N_a и N_b представляют собой модификацию нуклеотида, следующего после мотива YYY, которая отличается от модификации Y, и где N_a и N_b могут быть одинаковыми или разными модификациями. В качестве альтернативы N_a и/или N_b могут присутствовать или отсутствовать в том случае, если присутствует фланкирующая модификация.

Средство для RNAi может дополнительно содержать по меньшей мере одну фосфоротиоатную или метилфосфонатую межнуклеотидную связь. Модификация фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи может присутствовать у любого нуклеотида смысловой нити или антисмысловой нити или обеих нитей в любом положении нити. Например, модификация межнуклеотидной связи может присутствовать у каждого нуклеотида смысловой нити и/или антисмысловой нити; при этом каждая модификация межнуклеотидной связи может присутствовать в чередующемся паттерне в смысловой нити и/или антисмысловой нити; или смысловая нить или антисмысловая нить могут содержать обе модификации межнуклеотидной связи в чередующемся паттерне. Чередующийся паттерн модификаций межнуклеотидной связи в смысловой нити может быть таким же, как у антисмысловой нити, или отличным от него, и чередующийся паттерн модификаций межнуклеотидной связи в смысловой нити может иметь сдвиг относительно чередующегося паттерна модификаций межнуклеотидной связи в антисмысловой нити. В одном варианте осуществления двухнитевое средство для RNAi содержит 6-8 фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. В одном варианте осуществления антисмысловая нить содержит две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце и две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи на 3'-конце, а смысловая нить содержит по меньшей мере две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи либо на 5'-конце, либо на 3'-конце.

В одном варианте осуществления средство для RNAi имеет модификацию фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи в участке выступающего конца. Например, участок выступающего конца может содержать два нуклеотида с фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связью между двумя нуклеотидами. Модификации межнуклеотидной связи также могут быть выполнены для соединения выступающих нуклеотидов с концевыми спаренными нуклеотидами в пределах дуплексного участка. Например, по меньшей мере 2, 3, 4 или все выступающие нуклеотиды могут быть связаны посредством фосфоротиоатной или метилфосфонатной межнуклеотидной связи и необязательно могут присутствовать дополнительные фосфоротиоатные или метилфосфонатные межнуклеотидные связи, соединяющие выступающий нуклеотид со спаренным нуклеотидом, после которого следует выступающий нуклеотид. Например, между тремя концевыми нуклеотидами могут присутствовать по меньшей мере две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи, при этом два из трех нуклеотидов представляют собой выступающие нуклеотиды, а третий является спаренным нуклеотидом, следующим после выступающего нуклеотида. Эти три концевые нуклеотида могут быть на 3'-конце антисмысловой нити, 3'-конце смысловой нити, 5'-конце антисмысловой нити и/или 5'-конце антисмысловой нити.

В одном варианте осуществления выступающий конец из 2 нуклеотидов находится на 3'-конце антисмысловой нити и между тремя концевыми нуклеотидами присутствуют две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи, при этом два из трех нуклеотидов являются выступающими нуклеотидами, а третий нуклеотид является спаренным нуклеотидом, следующим после выступающего нуклеотида.

Необязательно средство для RNAi может дополнительно иметь две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи между концевыми тремя нуклеотидами как на 5'-конце смысловой нити, так и на 5'-конце антисмысловой нити.

В одном варианте осуществления средство для RNAi содержит ошибочное(ошибочные) спаривание(спаривания) с мишенью, в дуплексе или их комбинации. Ошибочное спаривание может встречаться в участке выступающего конца или в дуплексном участке. Пары оснований можно выстраивать на основе их способности содействовать диссоциации или плавлению (например, по свободной энергии ассоциации или диссоциации определенного спаривания, при этом наиболее простым подходом является изучение пар по отдельности для каждой пары оснований, однако также можно использовать анализ ближайшего соседа или подобный). С точки зрения содействия диссоциации: A:U более предпочтительна, чем G:C; G:U более предпочтительна, чем G:C; а Т:С более предпочтительна, чем G:C (1=инозин). Ошибочные спаривания, например неканонические или отличные от канонических типы спаривания (описанные в других частях данного документа), предпочтительнее канонических типов спаривания (A:T, A:U, G:C); и типы спаривания, которые включают универсальное основание, предпочтительнее канонических типов спаривания.

В одном варианте осуществления средство для RNAi содержит по меньшей мере одну из первых 1, 2, 3, 4 или 5 пар оснований в дуплексных участках от 5'-конца антисмысловой нити, независимо выбранную из группы, состоящей из: A:U, G:U, I:C и ошибочно спаренных пар, например, неканонических, или отличных от канонических типов спаривания, или типов спаривания, которые включают универсальное

- 34 045013 основание, для содействия диссоциации антисмысловой нити на 5'-конце дуплекса.

В одном варианте осуществления нуклеотид в положении 1 в пределах дуплексного участка, в направлении от 5'-конца антисмысловой нити, выбран из группы, состоящей из A, dA, dU, U и dT. В качестве альтернативы по меньшей мере одна из первых 1, 2 или 3 пар оснований в пределах дуплексного участка, в направлении от 5'-конца антисмысловой нити, представляет собой пару оснований AU. Например, первая пара оснований в пределах дуплексного участка, в направлении от 5'-конца антисмысловой нити, представляет собой пару оснований AU.

В другом варианте осуществления нуклеотид на 3'-конце смысловой цепи представляет собой дезокситимин (dT). В другом варианте осуществления нуклеотид на 3'-конце антисмысловой цепи представляет собой дезокситимин (dT). В одном варианте осуществления присутствует короткая последовательность дезокситиминовых нуклеотидов, например два dT нуклеотида на 3'-конце смысловой и/или антисмысловой цепи.

В одном варианте осуществления последовательность смысловой нити может быть представлена формулой (I)

5' n_p-N_a-(X X X)i-Nb-Y Y Y -N_b- (Ζ Ζ Z)_:-N_a-n_q 3' (I) где каждый из i и j независимо равняется 0 или 1;

каждый из p и q независимо равняется 0-6;

каждый N_a независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два неодинаково модифицированных нуклеотида;

каждый N_b независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

каждый n_p и n_q независимо представляет собой выступающий нуклеотид;

где N_b и Y имеют неодинаковую модификацию; и каждый из XXX, YYY и ZZZ независимо представляет собой один мотив с тремя одинаковыми модификациями трех последовательных нуклеотидов. Предпочтительно в YYY все нуклеотиды 2'-Fмодифицированы.

В одном варианте осуществления N_a и/или N_b содержит модификации чередующегося паттерна.

В одном варианте осуществления мотив YYY находится в сайте расщепления смысловой нити или рядом с ним. Например, если средство для RNAi содержит дуплексный участок, длина которого составляет 17-23 нуклеотида, то мотив YYY может находиться в сайте расщепления или около него (например, может находится в положениях 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 или 11, 12, 13) в смысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца; или необязательно отсчет начинается с 1го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца.

В одном варианте осуществления i равняется 1, a j равняется 0, или i равняется 0, a j равняется 1, или и i, и j равняются 1. Таким образом, смысловая нить может быть представлена следующими формулами:

5’ n_p-N_a-YYY-N_b-ZZZ-N_a-n_q 3’ (lb) ;

5¹ n_p-N_a-XXX-N_b-YYY-N_a-n_q 3' (1с) или

5’ n_p-N_a-XXX-N_b-YYY-N_b-ZZZ-N_a-n_q 3’ (Id) .

В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ib), тогда N_b представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ic), тогда N_b представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Id), каждый Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно N_b равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Каждый N_a независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

Каждый из X, Y и Z может быть одинаковым или отличным от остальных.

В других вариантах осуществления i равняется 0, a j равняется 0, и смысловая нить может быть представлена формулой

5' n_p-N_a-YYY- N_a-n_q 3’ (la) .

В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ia), каждый N_a независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

- 35 045013

В одном варианте осуществления последовательность антисмысловой нити для RNAi может быть представлена формулой (II)

5’ n_q.-N_a'-(Z ’ Z'Z ' ) _k-N_b'-Y'Y Ύ'-N_b'-(X'X'X ' ) i-N'_a-n_p' 3’ (II), где каждый из k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из р' и q' независимо равняется 0-6;

каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два неодинаково модифицированных нуклеотида;

каждый N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

каждый n_p' и n_q' независимо представляют собой выступающий нуклеотид;

где Nb' и Y' имеют неодинаковую модификацию; и каждый из X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех идентичных модификаций трех последовательных нуклеотидов.

В одном варианте осуществления Na' и/или N_b' содержит модификации чередующегося паттерна.

Мотив Y'Y'Y' находится в сайте расщепления антисмысловой нити или рядом с ним. Например, если средство для RNAi содержит дуплексный участок, длина которого составляет 17-23 нуклеотида, то мотив Y'Y'Y' может находится в положениях 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 или 13, 14, 15 антисмысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца; или необязательно отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца. Предпочтительно мотив Y'Y'Y' находится в положениях 11, 12, 13.

В одном варианте осуществления в мотиве Y'Y'Y' все нуклеотиды 2'-OMe-модифицированы.

В одном варианте осуществления k равняется 1, а l равняется 0, или k равняется 0, а l равняется 1, или и k, и l равняются 1.

Таким образом, антисмысловая нить может быть представлена следующими формулами:

5’ n_q.-N_a'-Z 'Z 'Z '-N_b'-Y Ύ Ύ'-N_a'-n_p. 3’ (lib) ;

5’ n_q.-N_a'-Y Ύ Ύ'-N_b'-X'X'X'-n_p. 3’ (lie) или

5’ n_q.-N_a'- Z 'Z 'Z '-N_b'-Y Ύ Ύ'-N_b'- X'X'X '-N_a '-n_p. 3’ (lid).

В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIb), N_b' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIc), N_b' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IId), каждый N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 02 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно N_b равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

В других вариантах осуществления k равняется 0, а l равняется 0, и антисмысловая нить может быть представлена формулой

5’ Пр.-N_a.-Υ' Υ' Y' - N_a.-n_q. 3’ (la).

В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIa), каждый Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

Каждый из X', Y' и Z' может быть одинаковым или отличным от остальных.

Каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити может быть независимо модифицирован LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-O-метилом, 2'-О-аллилом, 2'-С-аллилом, 2'гидроксилом или 2'-фтором. Например, каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован 2'-O-метилом или 2'-фтором. Каждый X, Y, Z, X', Y' и Z', в частности, может представлять собой 2'-О-метил-модификацию или 2'-фтор-модификацию.

В одном варианте осуществления смысловая нить средства для RNAi может содержать мотив YYY, находящийся в положениях 9, 10 и 11 нити, в тех случаях, когда дуплексный участок составляет 21 нуклеотид, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца, или необязательно отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y представляет собой 2'-Fмодификацию. Смысловая нить может дополнительно содержать мотив XXX или мотивы ZZZ в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка; и каждый из XXX и ZZZ независимо представляет собой 2'-OMe-модификацию или 2'-F-модификацию.

- 36 045013

В одном варианте осуществления антисмысловая нить может содержать мотив Y'Y'Y', находящийся в положениях 11, 12, 13 нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца, или необязательно отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y' представляет собой 2'-O-метил-модификацию. Антисмысловая нить может дополнительно содержать мотив X'X'X' или мотивы Z'Z'Z' в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка; и каждый из X'X'X' и Z'Z'Z' независимо представляет собой 2'-OMe-модификацию или 2'-Fмодификацию.

Смысловая нить, представленная любой из вышеприведенных формул (Ia), (Ib), (Ic) и (Id), образует дуплекс с антисмысловой нитью, представленной любой из формул (IIa), (IIb), (IIc) и (IId) соответствен но.

Соответственно, средства для RNAi для применения в способах по настоящему изобретению могут содержать смысловую нить и антисмысловую нить, при этом каждая нить содержит от 14 до 30 нуклеотидов, дуплекс для RNAi, представленный формулой (III):

смысловая нить: ⁵' ^пр <^{х X}L ^Ν»- ^{х х γ} ^{(z z} ' , , антисмысловая нить: ³ ’ ^пр ^-Na -(X'X'X') k-N_b -Υ Ύ Ύ ’-N_b - (Z'Z'Z') _b-N_a -n_q 5’ (in), где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;

каждый из p, p', q и q' независимо равняется 0-6;

каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два неодинаково модифицированных нуклеотида;

каждый N_b и N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

где каждый n_p', n_p, n_q' и n_q, каждый из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид; и каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех идентичных модификаций трех последовательных нуклеотидов.

В одном варианте осуществления i равняется 0, a j равняется 0; или i равняется 1, a j равняется 0; или i равняется 0, a j равняется 1; или и i, и j равняются 0; или и i, и j равняются 1. В другом варианте осуществления k равняется 0, а l равняется 0; или k равняется 1, а l равняется 0; k равняется 0, а l равняется 1; или как k, так и l равняется 0; или и k, и l равняются 1.

Иллюстративные комбинации смысловой нити и антисмысловой нити, образующих дуплекс для RNAi, включают формулы, приведенные ниже:

3’ n_p'-N_a'-Y'Y'Y' (Ша) ,

-N_a-n_q 3’

-N_a’n_q' 5'

5’ n_p -N_a -Y Y Y -N_b -Z Z Z -N_a-n_q 3’

3’ n_p'-N_a'-Υ Ύ ^Γ Y '-N_b'-Z ' Z ' Z '-N_a'n_q' 5' (Illb),

5’ n_p-N_a- X X X -N_b -Y Y Y - N_a-n_q 3’

3’ n_p'-N_a'-X 'X 'X '-N_b'-Y Ύ Ύ '-N_a'-n_q' 5’ (Hie) ,

5’ n_p -N_a -XXX -N_b-Y Y Y -N_b- Z Z Z -N_a-n_q 3'

3’ n_p'-N_a' -X 'X 'X ' -N_b'-Υ Ύ Ύ ' -N_b' - Z ' Z ' Z '-N_a-n_q' 5' (Hid) .

В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIa), каждый N_a независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифициро ванных нуклеотидов.

В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIb), каждый N_b независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-10, 1-7, 1-5 или 1-4 модифицированных нуклеотида. Каждый N_a независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIc), каждый N_b, N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 02 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), каждый N_b, N_b' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 02 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый N_a, N_a' независимо представляет собой олигонуклео- 37 045013 тидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Каждый из N_a, N_a', N_b и N_b' независимо содержит модификации чередующегося паттерна.

Каждый из X, Y и Z в формулах (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId) может быть одинаковым или отличным от остальных.

В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов Y может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Y'. В качестве альтернативы по меньшей мере два из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'; или все три из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'.

В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIb) или (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов Z может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Z'. В качестве альтернативы по меньшей мере два из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'; или все три из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'.

В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIc) или (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов X может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов X'. В качестве альтернативы по меньшей мере два из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'; или все три из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'.

В одном варианте осуществления модификация нуклеотида Y отличается от модификации нуклеотида Y', модификация нуклеотида Z отличается от модификации нуклеотида Z', и/или модификация нуклеотида X отличается от модификации нуклеотида X'.

В одном варианте осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификации N_a представляют собой 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации. В другом варианте осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификации Na представляют собой 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, и np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфоротиоатной связи. В еще одном варианте осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификации N_a представляют собой 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфоротиоатной связи, а смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера (описанного ниже). В другом варианте осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификации N_a представляют собой 2'-O-метил- или 2'-фтормодификации, np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфоротиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.

В одном варианте осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIa), модификации N_a представляют собой 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфоротиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.

В одном варианте осуществления средство для RNAi является мультимером, содержащим по меньшей мере два дуплекса, представленных формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может целенаправленно воздействовать на один и тот же ген или на два различных гена; или каждый из дуплексов может целенаправленно воздействовать на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.

В одном варианте осуществления средство для RNAi является мультимером, содержащим три, четыре, пять, шесть или более дуплексов, представленных формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может целенаправленно воздействовать на один и тот же ген или на два различных гена; или каждый из дуплексов может целенаправленно воздействовать на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.

В одном варианте осуществления два средства для RNAi, представленные формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), соединены друг с другом на 5'-конце, и один или оба 3'-конца необязательно конъюгированы с лигандом. Каждое из средств может целенаправленно воздействовать на один и тот же ген или на два различных гена; или каждое из средств может целенаправленно воздействовать на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.

В различных публикациях описаны мультимерные средства для RNAi, которые можно применять в способах по настоящему изобретению. Такие публикации включают WO 2007/091269, патент США №

- 38 045013

7858769, WO 2010/141511, WO 2007/117686, WO 2009/014887 и WO 2011/031520, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.

Как описано более подробно ниже, средство для RNAi, содержащее один или нескольких углеводных фрагментов, конъюгированных со средством для RNAi, может улучшать одно или несколько свойств средства для RNAi. Во многих случаях углеводный фрагмент будет присоединен к модифицированннй субъединице средства для RNAi. Например, рибозный сахар одной или нескольких рибонуклеотидных субъединиц средства на основе dsRNA можно заменять другими фрагментами, например отличным от углевода (предпочтительно циклическим) носителем, к которому присоединен углеводный лиганд. Рибонуклеотидную субъединицу, в которой рибозный сахар субъединицы был заменен таким образом, называют в данном документе субъединицей с модификацией путем замены рибозы (RRMS). Циклический носитель может быть карбоциклической кольцевой системой, т.е. все атомы в кольце являются атомами углерода, или гетероциклической кольцевой системой, т.е. один или несколько атомов в кольце могут быть гетероатомами, например, азотом, кислородом, серой. Циклический носитель может быть моноциклической кольцевой системой или может содержать два или более колец, например, конденсированных колец. Циклический носитель может представлять собой полностью насыщенную кольцевую систему или может содержать одну или несколько двойных связей.

Лиганд может быть присоединен к полинуклеотиду посредством носителя. Носители включают (i) по меньшей мере одну точку присоединения к остову, предпочтительно две точки присоединения к остову и (ii) по меньшей мере одну связывающую точку присоединения. Точка присоединения к остову, используемая в данном документе, относится к функциональной группе, например гидроксильной группе, или, как правило, связи, доступной для встраивания носителя в остов, например фосфатный или модифицированный фосфатный, например серосодержащий, остов, и подходящей для этого рибонуклеиновой кислоты. Связывающая точка присоединения (TAP) в некоторых вариантах осуществления относится к входящему в состав кольца атому циклического носителя, например атому углерода или гетероатому (отличному от атома, который обеспечивает точку присоединения к остову), с которым связывается выбранный фрагмент. Фрагмент может быть, например, углеводом, например моносахаридом, дисахаридом, трисахаридом, тетрасахаридом, олигосахаридом и полисахаридом. Необязательно выбранный фрагмент присоединен посредством промежуточного связывающего фрагмента к циклическому носителю. Таким образом, циклический носитель во многих случаях будет включать функциональную группу, например, аминогруппу, или, как правило, обеспечивать связь, подходящую для введения или связывания другого химического структурного элемента, например лиганда, в состав кольца.

Средства для RNAi можно конъюгировать с лигандом через носитель, где носитель может быть циклической группой или ациклической группой; при этом предпочтительно циклическая группа выбрана из пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, пиперидинила, пиперазинила, [1,3]-диоксолана, оксазолидинила, изоксазолидинила, морфолинила, тиазолидинила, изотиазолидинила, хиноксалинила, пиридазинонила, тетрагидрофурила и декалина; предпочтительно ациклическая группа выбрана из остова, представляющего собой серинол, или остова, представляющего собой диэтаноламин.

В некоторых конкретных вариантах осуществления средство для RNAi для применения в способах по настоящему изобретению представляет собой средство, выбранное из группы средств, приведенных в любой из табл. 3, 4, 9, 10, 15, 16, 19А, 19В, 19С, 19D, 19Е, 19F, 20, 21, 23, 24, 26 и 27. В одном варианте осуществления средство представляет собой любое из средств, приведенных в любой из табл. 9, 10, 19С, 19D, 20, 21, 23, 24, 26 и 27. Такие средства могут дополнительно содержать лиганд.

IV. iRNA, конгьюгированные с лигандами.

Другая модификация РНК из числа iRNA по настоящему изобретению предусматривает химическое связывание РНК с одним или несколькими лигандами, фрагментами или конъюгатами, которые повышают активность, распределение в клетках или поглощение iRNA клетками. Такие фрагменты включают без ограничения липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), холевая кислота (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), простой тиоэфир, например берил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), алифатическая цепь, например, додекандиоловые или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), фосфолипид, например ди-гексадецилрац-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), полиаминовая или полиэтиленгликолевая цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973) или адамантануксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237) или октадециламиновый или гексиламинокарбонилоксихолестериновый фрагмент (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).

В одном варианте осуществления лиганд изменяет распределение, нацеливание или время существования средства на основе iRNA, в которое он встроен. В предпочтительных вариантах осуществления

- 39 045013 лиганд обеспечивает повышенную аффинность в отношении выбранной мишени, например молекулы, клетки или типа клеток, компартмента, например клеточного компартмента или части органа, ткани, органа или участка тела, как, например, по сравнению с видами, у которых отсутствует такой лиганд.

Предпочтительные лиганды не будут принимать участие в спаривании дуплекса в дуплексной нуклеиновой кислоте.

Лиганды могут включать вещество, встречающееся в природе, такое как белок (например, сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеин низкой плотности (LDL) или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин, N-ацетилгалактозамин или гиалуроновую кислоту) или липид. Лиганд также может представлять собой рекомбинантную или синтетическую молекулу, такую как синтетический полимер, например синтетическая полиаминокислота. Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту, представляющую собой полилизин (PLL), поли-Lаспарагиновую кислоту, поли-L-глутаминовую кислоту, сополимер стирола и ангидрида малеиновой кислоты, сополимер L-лактида и гликолида, сополимер простого дивинилового эфира и малеинового ангидрида, N-(2-гидроксипропил)метакриламидный сополимер (НМРА), полиэтиленгликоль (PEG), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловую кислоту), N-изопропилакриламидные полимеры или полифосфазин. Примеры полиаминов включают полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, полиамин-псевдопептид, полиамин-пептидомиметик, полиаминдендример, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или альфа-спиральный пептид.

Лиганды также могут включают нацеливающие группы, например нацеливающее на клетку или ткань средство, например лектин, гликопротеин, липид или белок, например, антитело, которое связывается с определенным типом клеток, например клеткой почки. Нацеливающей группой может быть тиреотропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, поверхностно-активный белок А, углевод муцин, поливалентная лактоза, поливалентная галактоза, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентная манноза, поливалентная фукоза, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентная галактоза, трансферрин, бисфосфонат, полиглутамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчная кислота, фолат, витамин В12, витамин А, биотин, или RGD-пептид, или миметик RGD-пептида.

Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие средства (например, акридины), сшивающие средства (например, псорален, митомицин С), порфирины (ТРРС4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например, EDTA), липофильные молекулы, например холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бис-О-(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, O3-(олеоил)литохолевую кислоту, O3-(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин и пептидные конъюгаты (например, пептид antennapedia, Tat-пептид), алкилирующие средства, фосфат, амино, меркапто, PEG (например, PEG-40K), MPEG, [MPEG]₂, полиамино, алкил, замещенный алкил, меченные радиоизотопами маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), вещества, способствующие транспорту/абсорбции (например, аспирин, витамин Е, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеазы (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кластеры, конъюгаты акридин-имидазол, комплекс Eu3+ тетраазамакроциклов), динитрофенил, HRP или АР.

Лигандами могут быть белки, например, гликопротеины, или пептиды, например молекулы со специфической аффинностью в отношении ко-лиганда, или антитела, например антитело, которое связывается с определенным типом клеток, например клеткой печени. Лиганды также могут включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать непептидные соединения, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентная лактоза, поливалентная галактоза, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентная манноза или поливалентная фукоза. Например, лигандом может быть липополисахарид, активатор МАР-киназы p38 или активатор NF-кВ.

Лигандом может быть вещество, например лекарственное средство, которое может увеличивать поглощение средства на основе iRNA клеткой, например, путем разрушения цитоскелета клетки, например путем разрушения микротрубочек, микрофиламентов и/или промежуточных филаментов клетки. Лекарственным средством может быть, например, таксон, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, яплакинолид, латрункулин А, фаллоидин, свинхолид А, инданоцин или миосервин.

В некоторых вариантах осуществления лиганд присоединен к iRNA, как описано в данном документе, и действует как фармакокинетический модулятор (РК-модулятор). РК-модуляторы включают липофилы, желчные кислоты, стероиды, фосфолипидные аналоги, пептиды, белок-связывающие средства, PEG, витамины и т.д. Иллюстративные РК-модуляторы включают без ограничения холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицерид, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин E, биотин и т.д. Олигонуклеотиды, которые содержат некоторое количество фосфоротиоатных связей, также, как известно, связываются с сывороточным белком, следовательно, короткие олигонуклеотиды, например олигонуклеотиды из приблизительно 5 оснований, 10 оснований, 15 оснований или 20 оснований, содержащие множество фосфоротиоатных связей в

- 40 045013 остове, также пригодны в настоящем изобретении в качестве лигандов (например, в качестве РКмодулирующих лигандов). Кроме того, аптамеры, которые связываются сывороточными компонентами (например, сывороточными белками), также пригодны для применения в качестве РК-модулирующих лигандов в описанных в данном документе вариантах осуществления.

Конъюгированные с лигандами олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно синтезировать с применением олигонуклеотида, который несет боковую реакционноспособную функциональную группу, как, например, полученного в результате присоединения связывающей молекулы к олигонуклеотиду (описано ниже). Этот реакционноспособный олигонуклеотид может вступать в реакцию с коммерчески доступными лигандами, лигандами, которые синтезируют с наличием какой-либо из разнообразных защитных групп, или лигандами, которые имеют связывающий фрагмент, присоединенный к ним.

Олигонуклеотиды, применяемые в конъюгатах по настоящему изобретению, можно получать с помощью удобного и стандартного способа хорошо известного твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза реализуется несколькими фирмами-производителями, включая, например, Applied Biosystems (Фостер Сити, Калифорния). Дополнительно или альтернативно можно использовать любые другие средства для такого синтеза, известные в данной области. Также известно применение аналогичных методик для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоаты и алкилированные производные.

Конъюгированные с лигандом олигонуклеотиды и молекула-лиганд, несущая специфичные в отношении последовательности связанные нуклеозиды по настоящему изобретению, олигонуклеотиды и олигонуклеозиды могут быть собраны на подходящем синтезаторе ДНК с применением стандартных предшественников нуклеотида или нуклеозида, или предшественников конъюгатов с нуклеотидом или нуклеозидом, которые уже несут связывающий фрагмент, предшественников нуклеотида-лиганда или конъюгата с нуклеозидом, которые уже несут молекулу-лиганд, или структурных блоков, несущих лиганд, отличный от нуклеозида.

При применении предшественников конъюгата с нуклеотидом, которые уже несут связывающий фрагмент, синтез специфичных в отношении последовательности связанных нуклеозидов, как правило, завершают, а затем молекулу лиганда подвергают взаимодействию со связывающим фрагментом с образованием лиганд-конъюгированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды или связанные нуклеозиды по настоящему изобретению синтезируют с помощью автоматического синтезатора с применением фосфорамидитов, полученных из конъюгатов с нуклеозидом-лигандом, в дополнение к стандартным фосфорамидитам и нестандартным фосфорамидитам, которые коммерчески доступны и обычно применяются в синтезе олигонуклеотидов.

A. Конъюгаты с липидами.

В одном варианте осуществления лиганд или конъюгат представляет собой липидную молекулу или молекулу на основе липида. Такая липидная молекула или молекула на основе липида предпочтительно связывается с сывороточным белком, например сывороточным альбумином человека (HSA). Связывающийся с HSA лиганд обеспечивает распределение конъюгата в целевой ткани, например в отличной от ткани почек целевой ткани организма. Например, целевой тканью может быть печень, в том числе паренхиматозные клетки печени. Также в качестве лигандов можно использовать другие молекулы, которые могут связывать HSA. Например, можно использовать напроксен или аспирин. Липидный лиганд или лиганд на основе липида может (a) повышать устойчивость к разрушению конъюгата, (b) повышать нацеливающую способность или транспорт в целевую клетку или клеточную мембрану, и/или (с) может быть использован для корректировки связывания с сывороточным белком например, HSA.

Лиганд на основе липида можно применять для ингибирования, например, регулирования связывания конъюгата с целевой тканью. Например, липидный лиганд или лиганд на основе липида, который связывается с HSA более сильно, с меньшей вероятностью будет нацеливаться на почки и, следовательно, с меньшей вероятностью будет выводиться из организма. Липидный лиганд или лиганд на основе липида, который менее прочно связывается с HSA, можно применять для нацеливания конъюгата на почки.

В предпочтительном варианте осуществления лиганд на основе липида связывается с HSA. Предпочтительно он связывает HSA с аффинностью, достаточной для того, чтобы конъюгат предпочтительно распределялся в ткань, отличную от ткани почек. Однако предпочтительно, чтобы аффинность не была настолько сильной, чтобы связывание HSA-лиганд было необратимым.

В другом предпочтительном варианте осуществления лиганд на основе липида связывается с HSA слабо или вообще не связывается, так что конъюгат предпочтительно будет распределяться в почку. Другие фрагменты, которые нацеливаются на клетки почки, также можно использовать в дополнение к лиганду на основе липида или вместо него.

В другом аспекте лигандом является фрагмент, например витамин, который поглощается целевой клеткой, например пролиферирующей клеткой. Он является особенно применимым для лечения нарушений, характеризующихся нежелательной пролиферацией клеток, например злокачественного или доброкачественного типа, например раковых клеток. Иллюстративные витамины включают витамины A, E и K. Другие иллюстративные витамины включают витамины группы В, например, фолиевую кислоту, В12,

- 41 045013 рибофлавин, биотин, пиридоксаль, или другие витамины, или нутриенты, поглощаемые целевыми клетками, например, клетками печени. Также включены HAS и липопротеин низкой плотности (LDL).

B. Средства, обеспечивающие проникновение в клетку.

В другом аспекте лигандом является средство, обеспечивающее проникновение в клетку, предпочтительно спиральное средство, обеспечивающее проникновение в клетку. Предпочтительно средство является амфипатическим. Иллюстративным средством является пептид, такой как tat или antennopedia. Если средство представляет собой пептид, то он может быть модифицированным, в том числе представлять собой пептидилмиметик, инвертомеры, отличные от пептидных или псевдопептидные связи, а также в нем могут использоваться D-аминокислоты. Спиральное средство предпочтительно представляет собой альфа-спиральное средство, которое предпочтительно характеризуется липофильной и липофобной фазами.

Лигандом может быть пептид или пептидомиметик.

Пептидомиметик (также называемый в данном документе олигопептидомиметиком) является молекулой, способной укладываться в определенную трехмерную структуру, аналогичную природному пептиду. Присоединение пептида и пептидомиметиков к средствам на основе iRNA может повлиять на фармакокинетическое распределение iRNA, например путем повышения степени клеточного распознавания и абсорбции. Длина фрагмента пептида или пептидомиметика может составлять приблизительно 5-50 аминокислот, например, приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот.

Пептидом или пептидомиметиком может быть, например, пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, катионный пептид, амфипатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий, главным образом, из Tyr, Trp или Phe). Пептидным фрагментом может быть пептид-дендример, конформационно затрудненный пептид или перекрестно сшитый пептид. В другом альтернативном варианте пептидный фрагмент может включать гидрофобную последовательность, обеспечивающую перенос через мембрану (MTS). Иллюстративным содержащим гидрофобную MTS пептидом является RFGF с аминокислотной последовательностью AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 26). RFGF-аналог (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 27), содержащий гидрофобную MTS, также может быть нацеливающим фрагментом. Пептидный фрагмент может представлять собой доставляющий пептид, который может переносить большие полярные молекулы, в том числе пептиды, олигонуклеотиды и белки, через клеточные мембраны. Например, было обнаружено, что последовательности из Tat-белка HIV (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 28) и белка Antennapedia Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID no: 29) способны функционировать в качестве доставляющих пептидов. Пептид или пептидомиметик могут кодироваться случайными последовательностями ДНК, как, например, пептид, идентифицированный в библиотеке фагового дисплея или комбинаторной библиотеке одна гранула-одно соединение (ОВОС) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Примером пептида или пептидомиметика, связанного со средством на основе dsRNA посредством введенной мономерной единицы, является нацеливающий на клетку пептид, состоящий из аргинина-глицина-аспарагиновой кислоты (RGD), или RGD-миметик. Длина пептидного фрагмента может варьироваться от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 40 аминокислот. Пептидные фрагменты могут иметь структурную модификацию, как, например, для повышения стабильности или управления конформационными свойствами. Можно использовать любую из структурных модификаций, описанных ниже.

RGD-пептид для применения в композициях и способах по настоящему изобретению может быть линейным или циклическим, и может быть модифицированным, например гликозилированным или метилированным, для облегчения нацеливания на конкретную(конкретные) ткань(ткани). Содержащие RGD пептиды и пептидомиметики могут включать D-аминокислоты, а также синтетические RGDмиметики. В дополнение к RGD можно применять другие фрагменты, которые нацеливают лиганд интегрин. Предпочтительные конъюгаты с таким лигандом нацелены на РЕСАМ-1 или VEGF.

Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку способен проникать в клетку, например микробную клетку, такую как клетка бактерии или гриба, или в клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Пептидом, обеспечивающим проникновение в микробную клетку, например, может быть аспиральный линейный пептид (например, LL-37 или Ceropin P1), содержащий дисульфидную связь пептид (например, α-дефензин, β-дефензин или бактенецин) или пептид, содержащий только одну или две преобладающие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин). Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, также может включать клеточный сигнал внутриядерной локализации (NLS). Например, пептидом, обеспечивающим проникновение в клетку, может быть двухкомпонентный амфипатический пептид, такой как MPG, который получен из домена пептида слияния gp41 HIV-1 и NLS из большого Т-антигена SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).

С. Конъюгаты с углеводами.

В некоторых вариантах осуществления композиций и способов по настоящему изобретению предусматривается олигонуклеотид iRNA, дополнительно содержащий углевод. Конъюгированная с углеводом iRNA является предпочтительной для in vivo доставки нуклеиновых кислот, а также композиций, подходящих для in vivo терапевтического применения, описанного в данном документе. Используемый в данном документе термин углевод относится к соединению, которое представляет собой углевод per se,

- 42 045013 образованный из одного или нескольких моносахаридных звеньев, имеющих по меньшей мере 6 атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими) с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода; или к соединению, имеющему в качестве его части углеводный фрагмент, образованный из одного или нескольких моносахаридных звеньев, каждое из которых имеет по меньшей мере шесть атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими) с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода. Типичные углеводы включают сахара (моно-, ди-, три- и олигосахариды, содержащие приблизительно 4, 5, 6, 7, 8 или 9 моносахаридных звеньев) и полисахариды, такие как крахмалы, гликоген, целлюлоза и полисахаридные смолы. Определенные моносахариды включают HBV и выше (например, HBV, С6, С7 или С8) сахара; ди- и трисахариды включают сахара с двумя или тремя моносахаридными звеньями (например, HBV, С6, С7 или С8).

В одном варианте осуществления конъюгат с углеводом для применения в композициях и способах по настоящему изобретению представляет собой моносахарид. В другом варианте осуществления конъюгат с углеводом для применения в композициях и способах по настоящему изобретению выбран из группы, состоящей из

- 43 045013

- 44 045013

- 45 045013

- 46 045013

В одном варианте осуществления моносахарид представляет собой N-ацетилгалактозамин, такой как

О.

AcHN

о.

AcHN н .N.

Н N.

.о

О.

AcHN

V- Ν' IT н о

N О

Н формула II.

Другой типичный конъюгат с углеводом для применения в вариантах осуществления, описанных в данном документе, включает без ограничения

(формула XXIII), где один из X или Y представляет собой олигонуклеотид, при этом другой представляет собой водород.

- 47 045013

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения GalNAc или производное GalNAc присоединены к средству на основе iRNA по настоящему изобретению посредством одновалентного линкера. В некоторых вариантах осуществления GalNAc или производное GalNAc присоединены к средству на основе iRNA по настоящему изобретению посредством двухвалентного линкера. В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения GalNAc или производное GalNAc присоединены к средству на основе iRNA по настоящему изобретению посредством трехвалентного линкера.

В одном варианте осуществления двухнитевые средства для RNAi по настоящему изобретению содержат один GalNAc или производное GalNAc, присоединенные средству на основе iRNA. В другом варианте осуществления двухнитевые средства для RNAi по настоящему изобретению содержат множество (например, 2, 3, 4, 5 или 6) GalNAc или производных GalNAc, при этом каждый независимо присоединен к множеству нуклеотидов двухнитевого средства для RNAi посредством множества одновалентных линкеров.

В некоторых вариантах осуществления, например, если две нити средства на основе iRNA по настоящему изобретению являются частью одной более крупной молекулы и соединены непрерывающейся цепью нуклеотидов от 3'-конца одной нити до 5'-конца соответствующей другой нити, образующей петлю типа шпилька, содержащую множество неспаренных нуклеотидов, то каждый неспаренный нуклеотид в петле типа шпилька может независимо содержать GalNAc или производное GalNAc, присоединенные посредством одновалентного линкера.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат с углеводов дополнительно содержит один или несколько дополнительных лигандов, как описано выше, таких как без ограничения РК-модулятор и/или пептид, обеспечивающий проникновение в клетку.

Дополнительные конъюгаты с углеводом, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают такие, как описанные в публикациях согласно PCT № WO 2014/179620 и WO 2014/179627, полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки.

D. Линкеры.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат или лиганд, описанные в данном документе, могут быть присоединены к олигонуклеотиду iRNA различными линкерами, которые могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.

Термин линкер или линкерная группа означает органический фрагмент, который соединяет две части соединения, например, связывает ковалентными связями две части соединения. Линкеры, как правило, содержат прямую связь или атом, такой как кислород или сера, единицу, такую как NR8, С(О), C(O)NH, SO, SO₂, SO₂NH, или цепь из атомов, такую как без ограничения замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный алкинил, арилалкил, арилалкенил, арилалкинил, гетероарилалкил, гетероарилалкенил, гетероарилалкинил, гетероциклилалкил, гетероциклилалкенил, гетероциклилалкинил, арил, гетероарил, гетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил, алкиларилалкил, алкиларилалкенил, алкиларилалкинил, алкениларилалкил, алкениларилалкенил, алкениларилалкинил, алкиниларилалкил, алкиниларилалкенил, алкиниларилалкинил, алкилгетероарилалкил, алкилгетероарилалкенил, алкилгетероарилалкинил, алкенилгетероарилалкил, алкенилгетероарилалкенил, алкенилгетероарилалкинил, алкинилгетероарилалкил, алкинилгетероарилалкенил, алкинилгетероарилалкинил, алкилгетероциклилалкил, алкилгетероциклилалкенил, алкилгетероциклилалкинил, алкенилгетероциклилалкил, алкенилгетероциклилалкенил, алкенилгетероциклилалкинил, алкинилгетероциклилалкил, алкинилгетероциклилалкенил, алкинилгетероциклилалкинил, алкиларил, алкениларил, алкиниларил, алкилгетероарил, алкенилгетероарил, алкинилгетероарил, в котором один или несколько метиленов могут прерываться или оканчиваться О, S, S(O), SO₂, N(R8), С(О), замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенным или незамещенным гетероциклил; где R8 представляет собой водород, ацил, алифатический или замещенный алифатический компонент. В одном варианте осуществления линкер состоит из приблизительно 1-24 атомов, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 атомов, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 или 8-16 атомов.

Расщепляемая линкерная группа представляет собой группу, которая достаточно стабильна вне клетки, но которая при проникновении в целевую клетку расщепляется с высвобождением двух частей, которые линкер удерживает вместе. В предпочтительном варианте осуществления расщепляемая линкерная группа расщепляется в приблизительно 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или больше или по меньшей мере в приблизительно 100 раз быстрее в целевой клетке или при первом стандартном условии (которое можно, например, выбрать для имитации или моделирования внутриклеточных условий), чем в крови субъекта, или при втором стандартном условии (которое можно, например, выбрать для имитации или моделирования условий, свойственных крови или сыворотке крови).

Расщепляемые линкерные группы чувствительны к факторам расщепления, например, pH, окислительно-восстановительному потенциалу или присутствию разрушающих молекул. Как правило, факторы расщепления более распространены или встречаются на более высоких уровнях или обладают большей активностью внутри клеток, чем в сыворотке крови или крови. Примеры таких разрушающих средств включают окислительно-восстановительные средства, которые выбирают для конкретных субстратов

- 48 045013 или которые не обладают специфичностью к субстратам, в том числе, например, окислительные или восстановительные ферменты или восстановительные средства, такие как меркаптаны, присутствующие в клетках, которые могут разрушать расщепляемую с помощью окислительно-восстановительных реакций линкерную группу путем восстановления; эстеразы; эндосомы или средства, которые могут создавать кислую среду, например, такие, которые приводят к значению pH, равному пяти или ниже; ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать расщепляемую кислотой линкерную группу, действуя в качестве универсальной кислоты, пептидазы (которые могут быть субстрат-специфичными) и фосфатазы.

Расщепляемая линкерная группа, такая как дисульфидная связь, может быть чувствительной к значению pH. Значение pH сыворотки крови человека составляет 7,4, в то время как среднее значение pH внутри клетки немного ниже и находится в диапазоне приблизительно 7,1-7,3. Эндосомы характеризуются более кислым значением pH в диапазоне 5,5-6,0, а лизосомы характеризуются еще более кислым значением pH, составляющим приблизительно 5,0. Некоторые линкеры будут иметь расщепляемую связывающую группу, которая расщепляется в условиях предпочтительного pH, высвобождая тем самым катионный липид из лиганда внутри клетки или в требуемый компартмент клетки.

Линкер может включать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется под действием конкретного фермента. Тип расщепляемой линкерной группы, включенной в линкер, может зависеть от клетки, подлежащей нацеливанию. Например, лиганд, нацеливающий на печень, может быть связан с катионным липидом через линкер, который содержит сложноэфирную группу. Клетки печени характеризуются высоким содержанием эстераз и, следовательно, линкер будет расщепляться более эффективно в клетках печени, а не в типах клеток, для которых не характерно высокое содержание эстераз. Другие типы клеток с высоким содержанием эстераз включают клетки легкого, коркового вещества почки и яичка.

Линкеры, которые содержат пептидные связи, можно применять при нацеливании на типы клеток с высоким содержанием пептидаз, такие как клетки печени и синовиоциты.

Как правило, пригодность кандидатной расщепляемой линкерной группы может быть оценена с помощью тестирования способности разрушающего средства (или условия) расщеплять эту кандидатную линкерную группу. Кроме того, желательно также тестировать кандидатную расщепляемую линкерную группу в отношении способности противостоять расщеплению в крови или при приведении в контакт с другой нецелевой тканью. Таким образом, можно определить относительную чувствительность к расщеплению между первым и вторым условиями, где первое выбирают в качестве показателя расщепления в целевой клетке, а второе выбирают в качестве показателя расщепления в других тканях или биологических жидкостях, например, крови или сыворотке крови. Измерения можно проводить в бесклеточных системах, в клетках, в культуре клеток, в культуре органов или тканей или на животных в целом. Может быть полезно произвести первичные оценки в бесклеточных или культуральных условиях и подтвердить дальнейшими оценками на животных в целом. В предпочтительных вариантах осуществления применимые кандидатные соединения расщепляются по меньшей мере в приблизительно 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или в приблизительно 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью или сывороткой крови (или в условиях in vitro, выбранных для имитации внеклеточных условий).

i. Расщепляемые с помощью окислительно-восстановительных реакций линкерные группы.

В одном варианте осуществления расщепляемая линкерная группа представляет собой расщепляемую с помощью окислительно-восстановительных реакций связывающую группу, которая расщепляется при восстановлении или окислении. Примером расщепляемой при восстановлении линкерной группы является дисульфидная линкерная группа (-S-S-). Для определения того, является ли кандидатная расщепляемая линкерная группа подходящей расщепляемой при восстановлении линкерной группой или, например, подходящей для применения с конкретным фрагментом iRNA и конкретным нацеливающим средством, можно обратиться к способам, описанным в данном документе. Например, кандидат может быть оценен путем инкубирования с дитиотреитолом (DTT) или другим восстанавливающим средством с применением реагентов, известных в данной области, которые имитируют скорость расщепления, которая наблюдалась бы в клетке, например, целевой клетке. Кандидаты также могут быть оценены в условиях, которые выбирают для имитации условий в крови или сыворотке крови. В одном варианте осуществления кандидатные соединения расщепляются не более чем на приблизительно 10% в крови. В других вариантах осуществления применимые кандидатные соединения разрушаются по меньшей мере в приблизительно 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или в приблизительно 100 раз быстрее в клетке (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью (или in vitro условиями, выбранными для имитации внеклеточных условий). Степень расщепления кандидатных соединений можно определить с помощью стандартных анализов ферментативной кинетики в условиях, выбранных для имитации внутриклеточной среды, и сравнить с условиями, выбранными для имитации внеклеточной среды.

ii. Фосфатные расщепляемые линкерные группы.

В другом варианте осуществления расщепляемый линкер содержит фосфатную расщепляемую линкерную группу. Фосфатная расщепляемая линкерная группа расщепляется средствами, которые разрушают или гидролизуют фосфатную группу. Примером средства, которое расщепляет фосфатные группы

- 49 045013 в клетках, являются ферменты, такие как фосфатазы клетки. Примерами фосфатных линкерных групп являются -O-P(O)(ORk)-O-, -О-Р(S)(ORk)-О-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -SP(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -SP(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Предпочтительные варианты осуществления представляют собой -0-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -О-Р(О)(Н)-О-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительный вариант осуществления представляет собой -О-Р(О)(ОН)-О-. Эти кандидаты могут быть оценены с помощью способов, аналогичных описанным выше.

iii. Расщепляемые кислотой линкерные группы.

В другом варианте осуществления расщепляемый линкер содержит расщепляемую кислотой линкерную группу. Расщепляемая кислотой линкерная группа представляет собой линкерную группу, которая расщепляется в кислых условиях. В предпочтительных вариантах осуществления расщепляемые кислотой линкерные группы расщепляются в кислой среде с pH приблизительно 6,5 или ниже (например, приблизительно 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 или ниже) или с помощью средств, таких как ферменты, которые могут действовать как обычная кислота. В клетке определенные органеллы с низким значением pH, такие как эндосомы и лизосомы, могут обеспечить расщепляющую среду для расщепляемых кислотами линкерных групп. Примеры расщепляемых кислотами линкерных групп включают без ограничения гидразоны, сложные эфиры и сложные эфиры аминокислот. Расщепляемые кислотами группы могут характеризоваться общей формулой -C=NN-, С(О)О или -ОС(О). Предпочтительным вариантом осуществления является случай, когда атом углерода, присоединенный к кислороду сложноэфирной группы (в алкоксигруппе), входит в состав арильной группы, замещенной алкильной группы или четвертичной алкильной группы, такой как диметилпентил или трет-бутил. Эти кандидаты могут быть оценены с помощью способов, аналогичных описанным выше.

iv. Сложноэфирные линкерные группы.

В другом варианте осуществления расщепляемый линкер содержит сложноэфирную линкерную группу. Расщепляемая сложноэфирная линкерная группа расщепляется в клетках ферментами, такими как эстеразы и амидазы. Примеры сложноэфирных расщепляемых линкерных групп включают без ограничения сложные эфиры с алкиленовыми, алкениленовыми и алкиниленовыми группами. Сложноэфирные расщепляемые линкерные группы характеризуются общей формулой -С(О)О- или -ОС(О)-. Эти кандидаты могут быть оценены с помощью способов, аналогичных описанным выше.

v. Пептидные расщепляемые группы.

В еще одном варианте осуществления расщепляемый линкер содержит пептидную расщепляемую группу. Пептидная расщепляемая линкерная группа расщепляется в клетках ферментами, такими как пептидазы и протеазы. Пептидные расщепляемые линкерные группы представляют собой пептидные связи, образованные между аминокислотами с получением олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.д.) и полипептидов. Пептидные расщепляемые группы не включают амидную группу (-C(O)NH-). Амидная группа может быть образована между любым алкиленом, алкениленом или алкинеленом. Пептидная связь представляет собой особый тип амидной связи, образующейся между аминокислотами с образованием пептидов и белков. Пептидная расщепляемая группа, как правило, ограничена пептидной связью (т.е. амидной связью), образующейся между аминокислотами с образованием пептидов и белков, и не включает всю амидную функциональную группу. Пептидные расщепляемые линкерные группы характеризуются общей формулой -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, где RA и RB представляют собой R-группы двух соседних аминокислот. Эти кандидаты могут быть оценены с помощью способов, аналогичных описанным выше.

В одном варианте осуществления iRNA по настоящему изобретению конъюгирована с углеводом через линкер. Неограничивающие примеры углеводных конъюгатов iRNA с линкерами в композициях и способах по настоящему изобретению включают без ограничения

- 50 045013

(формула XXIX)

- 51 045013

где один из X или Y представляет собой олигонуклеотид, при этом другой представляет собой водород.

В определенных вариантах осуществления композиций и способов по настоящему изобретению лиганд представляет собой одно или несколько производных GalNAc (N-ацетилгалактозамина), присоединенных посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.

В одном варианте осуществления dsRNA по настоящему изобретению конъюгирована с двухвалентным или трехвалентным разветвленным линкером, выбранным из группы структур, показанных в любой из формул (XXXII)-(XXXV):

формула XXXII формула XXXIII

^р4А q4A р4А _____Т4А |_4А

P^4R-Q‘

ЛВо4В _____T4B__L4B

_p5B_q5B__r5B _p5A_Q5A__R5A η*5A |_5Α γ5Β_|_5Β _P5C_q5C._r5C _q5C формула XXXIV формула XXXV где q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B и q5C равняются независимо в каждом случае 0-20, и где повторяющиеся звенья могут быть одинаковыми или различными;

каждый из Р^2А, Р^2В, Р^3А, P^3B, Р^4А, Р^4В, Р^5А, Р^5В, Р^5С, Т^2А, Т^2В, Т^3А, T^3B, Т^4А, Т^4В, Т^4А, Т^5В, Т^5С независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой СО, NH, О, S, ОС(О), NHC(O), CH₂, CH2NH или СН₂О;

q²a, q^2b, q³a, q^3b, q⁴a, q^4b, q⁵a, q^5b, q^5c независимо для каждого случая отсутствуют, представляют собой алкилен, замещенный алкилен, где один или несколько метиленов могут прерываться или оканчиваться одним или несколькими из О, S, S(O), SO₂, N(Rⁿ), C(R')=C(R), С=С или С(О); каждый из R^2A, R^2b, R³a, R^3b, R⁴a, R^4b, R⁵a, R^5B, R^5C независимо в каждом случае отсутствует, представляет собой NH, О, S, СН2, С(О)О, C(O)NH, NHCH(R^a)C(O), -С(О)-СН(R^a)-NH-, СО, CH=N-O,

- 52 045013 или гетероциклил;

L^2A, L^2b, L^3A, L^3b, L^4A, L^4b, L^5A, L^5B и L^5C представляют собой лиганд; т.е. каждый из них независимо для каждого случая представляет собой моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид или полисахарид; и R^a представляет собой H или аминокислотную боковую цепь. Трехвалентно конъюгированные производные GalNAc особенно пригодны для применения со средствами для RNAi для ингибирования экспрессии целевого гена, например, такие, которые имеют формулу (XXXV):

формула XXXV

где L^5A, L^5B и L^5C представляют собой моносахарид, такой как производное GalNAc.

Примеры подходящих двухвалентных и трехвалентных разветвленных линкерных групп, конъюгированных с производными GalNac, включают без ограничения структуры, указанные выше как формулы II, VII, XI, X и XIII.

Иллюстративные патенты США, в которых изложена идея получения конъюгатов РНК, включают без ограничения патенты США

№№ 4,82 8,	.979; 4,948,	882; 5,218,105;	5,525,465;	5,541,313
5,545,730;	5, 552,538.	; 5,578,717,	5,580,731;	5,591,584
5,109,124;	5, 118,802.	; 5,138,045;	5,414,077;	5,486,603
5,512,439;	5, 578,718.	; 5, 608, 046;	4,587,044;	4,605,735
4,667,025;	4,762,779.	; 4,789,737;	4,824,941;	4,835,263
4,876,335;	4,904,582.	; 4,958,013;	5,082,830;	5, 112,963
5,214,136;	5, 082,830.	; 5,112,963;	5,214,136;	5,245,022
5,254,469;	5, 258,506.	; 5,262,536;	5,272,250;	5,292,873
5,317,098;	5, 371,241,	, 5,391,723;	5,416,203,	5,451,463
5,510,475;	5,512,667,	; 5,514,785;	5,565,552;	5,567,810
5,574,142;	5, 585, 481.	; 5,587,371;	5,595,726;	5,597,696
5,599,923;	5,599,928	и 5, 688,941;	6,294,664;	6,320,017
6,576,752;	6,783,931;	6, 900,297; 7,037.	,646; 8,106,	. 022,

Полное содержание каждого из которых настоящим включено в данный документ посредством ссылки.

Необязательно, чтобы все положения в данном соединении были однотипно модифицированными, а в действительности несколько из вышеуказанных модификаций могут быть включены в отдельное соединение или даже в отдельный нуклеозид в iRNA. Настоящее изобретение также включает соединения на основе iRNA, которые представляют собой химерные соединения.

Химерные соединения на основе iRNA или химеры в контексте настоящего изобретения представляют собой соединения на основе iRNA, предпочтительно dsRNA, которые содержат два или более химически отличающихся участка, каждый из которых состоит по меньшей мере из одного мономерного звена, т.е. нуклеотида, в случае соединения на основе dsRNA. Такие iRNA обычно содержат по меньшей мере один участок, где РНК модифицирована таким образом, чтобы наделить iRNA повышенной устойчивостью к разрушению нуклеазами, повышенным клеточным захватом и/или повышенной аффинностью связывания в отношении целевой нуклеиновой кислоты. Дополнительный участок iRNA может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера РНКаза H является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет нить РНК в РНК:ДНК-дуплексе. Активация РНКазы Н, следовательно, приводит к расщеплению целевой РНК, значительно повышая тем самым эффективность ингибирования экспрессии гена с помощью iRNA. Следовательно, сравнимые результаты зачастую можно получить с более короткими iRNA при применении химерных dsRNA по сравнению с фосфоротиоатными дезокси-гибридизациями dsRNA того же целевого участка. Расщепление РНК-мишени обычно можно обнаружить с помощью гель-электрофореза и при необходимости с помощью методик гибридизации ассоциированных нуклеиновых кислот, известных в данной области.

В некоторых случаях РНК из числа iRNA может быть модифицирована группой, не являющейся

- 53 045013 лигандом. Ряд молекул, не являющихся лигандами, конъюгировали с iRNA для усиления активности, распределения в клетке или клеточного поглощения iRNA, и процедуры для выполнения таких типов конъюгирования доступны в научной литературе. Такие фрагменты, не являющиеся лигандами, имеют включенные липидные фрагменты, такие как холестерин (Kubo, Т. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365 (1) :54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), холевую кислоту (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), простой тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рацглицерин или триэтил-аммоний 1,2-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-3-Н-фосфонат (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), полиамин или полиэтиленгликолевую цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229) или октадециламиновый или гексиламинокарбонилоксихолестериновый фрагмент (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Иллюстративные патенты Соединенных Штатов, в которых изложена идея получения таких конъюгатов РНК, были приведены выше. Типичные схемы конъюгирования предусматривают синтез РНК, несущих аминолинкер в одном или нескольких положениях последовательности. Аминогруппа затем вступает в реакцию с молекулой, подлежащей конъюгации, с применением соответствующего конденсирующих или активирующих реагентов. Реакцию конъюгирования можно выполнять с РНК, все еще связанной с твердой подложкой, либо после расщепления РНК, в фазе раствора. Очистка конъюгата РНК с помощью HPLC, как правило, обеспечивает получение чистого конъюгата.

V. Доставка iRNA по настоящему изобретению.

Доставку iRNA по настоящему изобретению к клетке, например, клетке субъекта, такого как субъект-человек (например, субъект, нуждающийся в этом, такой как субъект с заболеванием, нарушением или состоянием, ассоциированным с экспрессией гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови), можно осуществлять различными путями. Например, доставку можно осуществлять путем приведения клетки в контакт с iRNA по настоящему изобретению либо in vitro, либо in vivo. Доставку in vivo также можно осуществлять непосредственно путем введения субъекту композиции, содержащей iRNA, например dsRNA. В качестве альтернативы доставку in vivo можно осуществлять опосредованно путем введения одного или нескольких векторов, которые кодируют iRNA и управляют ее экспрессией. Такие альтернативные случаи дополнительно описаны ниже.

Обычно любой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты (in vitro или in vivo) может быть адаптирован для применения с iRNA по настоящему изобретению (см., например, Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 и WO94/02595, которые включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Что касается доставки in vivo, то факторы, которые учитывают в контексте доставки молекулы iRNA, включают, например, биологическую стабильность доставляемой молекулы, предупреждение неспецифических эффектов и накопление доставляемой молекулы в целевой ткани. Неспецифические эффекты iRNA могут быть сведены к минимуму путем локального введения, например путем прямой инъекции или вживления в ткань, или местного введения препарата. Локальное введение в место обработки максимально увеличивает локальную концентрацию средства, ограничивает воздействие средства на системные ткани, которые в ином случае могут быть повреждены средством или которые могут разрушить средство, и позволяет вводить более низкую общую дозу молекулы iRNA. Из результатов нескольких исследований виден эффективный нокдаун генных продуктов при локальном введении iRNA. Например, было показано, что внутриглазная доставка dsRNA к VEGF как путем инъекции в стекловидное тело макаков-крабоедов (Tolentino, M.J., et al. (2004) Retina 24:132-138), так и путем субретинальных инъекций мышам (Reich, S.J., et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216) предупреждают неоваскуляризацию в экспериментальной модели возрастной макулярной дистрофии. Кроме того, прямая внутриопухолевая инъекция dsRNA мышам снижает объем опухолей (Pille, J., et al. (2005) Mol. Ther. 11:267-274) и может продлевать время жизни мышей с опухолями (Kim, W.J., et al. (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al. (2007) Mol. Ther. 15:515-523). Также было показано, что РНК-интерференция была успешной при локальной доставке в CNS (ЦНС) путем прямой инъекции (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, P.H., et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, E.R., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:1727017275; Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) и в легкие путем интраназального введения (Howard, K.A., et al. (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al. (2005) Nat. Med. 11:50-55). Что касается системного введения iRNA для лечения заболевания, то РНК может быть модифицирована или альтернативно доставлена при помощи системы доставки лекарственного средства; оба способа служат для предупреждения быстрого разрушения dsRNA эндо- и экзонуклеазами 1л vivo. Модификация РНК или фармацевтический носитель также могут делать возможным нацеливание композиции с iRNA на целевую ткань, и с их помощью можно избежать нежела

- 54 045013 тельных нецелевых эффектов. Молекулы iRNA можно модифицировать с помощью химического конъюгирования с липофильными группами, такими как холестерин, для повышения поглощения клеткой и предупреждения разрушения. Например, направленную против ApoB iRNA, конъюгированную с липофильным фрагментом, представляющим собой холестерин, вводили системно мышам, что приводило к нокдауну мРНК ароВ как в печени, так и в тонкой кишке (Soutschek, J., et al. (2004) Nature 432:173-178). Как было показано, конъюгация iRNA с аптамером ингибирует рост опухоли и опосредует регресс опухоли на мышиных моделях рака предстательной железы (McNamara, J.O., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). В альтернативном варианте осуществления iRNA можно доставлять с помощью систем доставки лекарственных средств, таких как наночастица, дендример, полимер, липосомы или катионная система доставки. Положительно заряженные катионные системы доставки способствуют связыванию молекулы iRNA (отрицательно заряженной), а также усиливают взаимодействия на отрицательно заряженной клеточной мембране с обеспечением эффективного поглощения iRNA клеткой. Катионные липиды, дендримеры или полимеры могут быть либо связанными с iRNA, либо на них воздействуют с образованием везикулы или мицеллы (см., например, Kim S.H., et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116), которые заключают в себя iRNA. Образование везикул или мицелл также предупреждает разрушение iRNA при системном введении. Способы получения и введения катионных комплексов с iRNA находятся в пределах квалификации специалиста в данной области (см., например, Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, U.N., et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, A.S. et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205, которые включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Некоторые неограничивающие примеры систем доставки лекарственных средств, применимых для системной доставки iRNA, включают DOTAP (Sorensen, D.R., et al. (2003), выше; Verma, U.N., et al. (2003), выше), олигофектамин, твердые частицы с нуклеиновой кислотой-липидом (Zimmermann, T.S., et al. (2006) Nature 441:111-114), кардиолипин (Chien, P.Y., et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12:321328; Pal, A., et al. (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), полиэтиленимин (Bonnet ME., et al. (2008) Pharm. Res. электронная публикация перед подачей в печать 16 августа; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), содержащие Arg-Gly-Asp (RGD) пептиды (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487) и полиамидоамины (Tomalia, D.A., et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al. (1999) Pharm. Res. 16:17991804). В некоторых вариантах осуществления iRNA образует комплекс с циклодекстрином для системного введения. Способы введения и фармацевтические композиции с iRNA и циклодекстринами можно найти в патенте США № 7427605, который включен в данный документ посредством ссылки в полном его объеме.

А. Вектор, кодирующий iRNA по настоящему изобретению.

iRNA, целенаправленно воздействующая на ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, может экспрессироваться транскрипционными единицами, вставленными в ДНК- или РНК-векторы (см., например, Couture, A., et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., международную публикацию согласно PCT № WO 00/22113, Conrad, международную публикацию согласно PCT № WO 00/22114 и Conrad, патент США № 6054299). Экспрессия может быть временной (порядка от нескольких часов до недель) или длительной (от недель до месяцев или дольше) в зависимости от конкретной применяемой конструкции и целевых ткани или типа клеток. Такие трансгены можно вводить в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, который может быть интегрирующим или неинтегрирующим вектором. Трансген также может быть сконструирован с возможностью наследования его в виде экстрахромосомной плазмиды (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).

Отдельные нить или нити iRNA могут транскрибироваться с промотора вектора экспрессии. В целевую клетку можно совместно вводить два отдельных вектора экспрессии (например, путем трансфекции или инфицирования) для экспрессии двух отдельных нитей с получением, например, dsRNA. В альтернативном случае каждая отдельная нить dsRNA может транскрибироваться с участием промоторов, оба из которых расположены в одной и той же плазмиде экспрессии. В одном варианте осуществления dsRNA экспрессируется в виде полинуклеотидов с инвертированным повтором, соединенных линкерной полинуклеотидной последовательностью так, что dsRNA имеет структуру типа стебель-петля.

Векторы экспрессии iRNA, как правило, представляют собой ДНК-плазмиды или вирусные векторы. Векторы экспрессии, совместимые с эукариотическими клетками, предпочтительно совместимые с клетками позвоночных, можно использовать для получения рекомбинантных конструкций для экспрессии iRNA, которая описана в данном документе. Векторы экспрессии для эукариотических клеток хорошо известны в данной области и доступны из ряда коммерческих источников. Как правило, предусмотрено, что такие векторы содержат подходящие сайты рестрикции для вставки необходимого сегмента нуклеиновой кислоты. Доставка векторов, экспрессирующих iRNA, может быть системной, как например: путем внутривенного или внутримышечного введения, путем введения в целевые клетки, эксплантированные от пациента, с последующим обратным введением пациенту или с помощью любого другого способа, который обеспечивает возможность введения в необходимую целевую клетку.

Целевые клетки можно трансфицировать плазмидами экспрессии iRNA в виде комплекса с носителями-катионными липидами (например, олигофектамином) или носителями на основе некатионных липидов (например, Transit-TKO™). В настоящем изобретении также рассматриваются множественные

- 55 045013 трансфекции с помощью липидов для iRNA-опосредованных нокдаунов, целенаправленно воздействующих на различные участки целевой РНК, на протяжении недели или больше. Успешное введение векторов в клетки-хозяева можно контролировать с помощью разнообразных известных способов. Например, временную трансфекцию можно выявить с помощью репортера, такого как флуоресцентный маркер, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP). Стабильная трансфекция клеток ex vivo может быть подтверждена с применением маркеров, которые обеспечивают устойчивость трансфицированной клетки к определенным факторам окружающей среды (например, к антибиотикам и лекарственным средствам), как, например, устойчивость к гигромицину В.

Системы на основе вирусных векторов, которые можно использовать со способами и композициями, описанными в данном документе, включают без ограничения (а) аденовирусные векторы;

(b) ретровирусные векторы, в том числе без ограничения лентивирусные векторы, вирус мышиного лейкоза Молони и т. д; (с) векторы на основе аденоассоциированного вируса; (d) векторы на основе вируса простого герпеса; (е) векторы на основе SV40; (f) векторы на основе вируса полиомы; (g) векторы на основе вируса папилломы; (h) векторы на основе пикорнавируса; (i) векторы на основе поксвируса, такого как ортопокс, например, векторы на основе вируса осповакцины, или авипоксвирус, например, поксвируса канареек или оспы кур; и (j) хелпер-зависимый или слабый аденовирус. Также преимущественными могут быть вирусы, дефектные по репликации. Различные векторы будут встраиваться в геном клеток или не будут встраиваться в геном клеток. При необходимости конструкции могут включать в себя последовательности вирусов для трансфекции. В качестве альтернативы конструкция может быть встроена в векторы, способные к эписомальной репликации, например, векторы на основе EPV и EBV. В конструкциях для рекомбинантной экспрессии iRNA, как правило, будут необходимы регуляторные элементы, например, промоторы, энхансеры и т.д., для обеспечения экспрессии iRNA в целевых клетках. Другие аспекты, учитываемые в отношении векторов и конструкций, дополнительно описаны ниже.

Векторы, применимые для доставки iRNA, будут включать в себя регуляторные элементы (промотор, энхансер и т.д.), достаточные для экспрессии iRNA в требуемой целевой клетке или ткани. Регуляторные элементы можно выбирать для получения либо конститутивной, либо регулируемой/индуцируемой экспрессии.

Экспрессия iRNA может быть точно регулируемой, например, путем использования индуцируемой регуляторной последовательности, которая чувствительна к определенным физиологическим регуляторам, например, уровням циркулирующей глюкозы или гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Такие индуцируемые экспрессирующие системы, подходящие для управления экспрессией dsRNA в клетках или у млекопитающих, включают, например, регулирование с помощью экдизона, с помощью эстрогена, прогестерона, тетрациклина, химических индукторов димеризации и изопропил-бета-D1тиогалактопиранозида (IPTG). Специалист в данной области сможет выбрать соответствующую регуляторную/промоторную последовательность, опираясь на предполагаемое использование трансгена iRNA.

Можно применять вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие iRNA.

Например, можно применять ретровирусный вектор (см. Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Данные ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие iRNA, клонируют в один или несколько векторов, которые облегчают доставку нуклеиновой кислоты пациенту. Более подробное описание ретровирусных векторов можно найти, например, в Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), в котором описано применение ретровирусного вектора для доставки гена mdr1 в гемопоэтические стволовые клетки для придания стволовым клеткам большей устойчивости к химиотерапии. Другими источниками, иллюстрирующими применение ретровирусных векторов в генной терапии, являются: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); и Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Лентивирусные векторы, предусматриваемые для применения, включают, например, векторы на основе HIV (ВИЧ), описанные в патентах США № 6143520; 5665557 и 5981276, которые включены в данный документ посредством ссылки.

Также для применения в доставке iRNA по настоящему изобретению предусматриваются аденовирусы. Аденовирусы представляют собой особенно перспективные носители, например, для доставки генов в эпителий респираторного тракта. Аденовирусы естественным образом инфицируют эпителий респираторного тракта, где они вызывают заболевание с легким течением. Другими мишенями для систем доставки на основе аденовирусов являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышца. Аденовирусы обладают преимуществом в том, что способны инфицировать неделящиеся клетки. В Kozarsky и Wilson, Current Opinion in Genetics и Development 3:499-503 (1993) представлена обзорная статья о генной терапии на основе аденовирусов. В Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) было показано применение аденовирусных векторов для переноса генов в респираторный эпителий макаков-резусов. Дополнительные примеры применения аденовирусов в генной терапии можно найти в Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); публикации согласно PCT WO 94/12649 и Wang, et al., Gene Therapy 2:775- 56 045013

783 (1995). Подходящий AV-вектор для экспрессии iRNA, описанной в настоящем изобретении, способ конструирования рекомбинантного AV-вектора и способ доставки вектора в целевые клетки описаны в

Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.

Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) также можно применять для доставки iRNA по настоящему изобретению (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); патент США № 5436146). В одном варианте осуществления iRNA может экспрессироваться в виде двух отдельных комплементарных однонитевых молекул РНК при помощи рекомбинантного AAV-вектора, например, либо с РНК-промоторами, U6 или H1, либо с промотором цитомегаловируса (CMV). Подходящие AAV-векторы для экспрессии dsRNA, описанной в настоящем изобретении, способы конструирования рекомбинантного AAV-вектора и способы доставки векторов в целевые клетки описаны в Samulski R. et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K.J. et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R. et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; патенте США № 5252479; патенте США № 5139941; международной заявке на патент № WO 94/13788 и международной заявке на патент № WO 93/24641, полное раскрытие которых включено в данный документ посредством ссылки.

Другой вирусный вектор, подходящий для доставки iRNA по настоящему изобретению, представляет собой поксвирус, такой как вирус коровьей оспы, например, аттенуированный вирус коровьей оспы, как, например, модифицированный вирус Анкара (MVA) или NYVAC, авипоксвирус, как, например, оспа кур или оспа канареек.

В случае необходимости тропизм вирусных векторов может быть модифицирован путем псевдотипирования векторов белками оболочки или другими поверхностными антигенами других вирусов или путем замещения различных вирусных капсидных белков. Например, лентивирусные векторы можно подвергать псевдотипированию поверхностными белками вируса везикулярного стоматита (VSV), вируса бешенства, вируса Эбола, вируса Мокола и т.п. AAV-векторы можно получать для нацеливания на различные клетки путем конструирования векторов так, чтобы они экспрессировали различные серотипы капсидных белков; см., например, Rabinowitz J.E. et al. (2002), J. Virol. 76:791-801, полное раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки.

Фармацевтический препарат на основе вектора может включать вектор в приемлемом разбавителе, или может включать матрицу замедленного высвобождения, в которую включено средство доставки генов. В качестве альтернативы в том случае, когда вектор доставки целого гена может продуцироваться нативно рекомбинантными клетками, например, ретровирусными векторами, тогда фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, которые продуцируют систему доставки генов.

VI. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и составы, которые включают в себя iRNA по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления в данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие iRNA, которые описаны в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции, содержащие iRNA, применимы для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного с экспрессией или активностью гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. гена KLKB1, гена F12 и/или гена KNG1). Такие фармацевтические композиции составляют в зависимости от способа доставки. Одним примером являются композиции, которые составлены для системного введения посредством доставки парентеральным путем, например, путем подкожной (SC), внутримышечной (IM) или внутривенной (IV) доставки. Другим примером являются композиции, которые составлены для непосредственной доставки в паренхиму головного мозга, например, путем инфузии в головной мозг, как, например, непрерывной инфузии при помощи насоса. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить в дозах, достаточных для ингибирования экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови.

Такие фармацевтические композиции составляют в зависимости от способа доставки. Одним примером являются композиции, которые составлены для системного введения посредством доставки парентеральным путем, например, путем внутривенной (IV) или подкожной доставки. Другим примером являются композиции, которые составлены для непосредственной доставки в печень, например, путем инфузии в печень, как, например, непрерывной инфузии с помощью насоса.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить в дозах, достаточных для ингибирования экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. Как правило, приемлемая доза iRNA по настоящему изобретению будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 200,0 миллиграмм на килограмм веса тела реципиента в день, как правило, в диапазоне от приблизительно 1 до 50 мг на килограмм веса тела в день. Как правило, подходящая доза iRNA по настоящему изобретению будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 5,0 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 0,3 мг/кг до приблизительно 3,0 мг/кг. Схема с повторной дозой может включать введение терапевтического количества iRNA на регулярной основе, как, например, один раз в двое суток или один раз в год. В определенных вариантах осуществления iRNA вводят от приблизительно одного раза в месяц до приблизительно одного раза в квартал (т.е. приблизительно один раз каждые три месяца).

- 57 045013

По завершению режима начального лечения лекарственные препараты можно вводить с меньшей частотой.

Специалисту в данной области будет понятно, что определенные факторы могут влиять на дозу и временные рамки, необходимые для эффективного лечения субъекта, в том числе без ограничения тяжесть заболевания или нарушения, типы предшествующего лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие имеющиеся заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может предусматривать один период лечения или серию периодов лечения. Расчеты эффективных доз и периодов полужизни in vivo для отдельных iRNA, охваченных настоящим изобретением, можно проводить с применением традиционных методологий или на основе тестирования in vivo с применением соответствующей животной модели, как описано в другом месте в данном документе.

Достижения в области генетики мышей дали ряд мышиных моделей для изучения различных заболеваний человека, как, например, нарушений, на которые будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить различными путями в зависимости от того, необходимо ли локальное или системное лечение, и от области, подлежащей обработке. Введение может быть местным (например, с помощью трансдермального пластыря), легочным, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе с помощью ингалятора; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; субдермальное, например, посредством имплантированного устройства; или интракраниальное, например, интрапаренхиматозное, интратекальное или интравентрикулярное введение.

iRNA можно доставлять таким образом, чтобы происходило целенаправленное воздействие на конкретную ткань, такую как печень (например, гепатоциты печени).

Фармацевтические композиции и составы для местного введения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, распыляемые растворы, жидкости и порошки. Могут потребоваться или быть желательны традиционные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и т.п. Также могут быть применимы презервативы, перчатки с покрытием и т.п. Подходящие составы для местного введения включают составы, в которых iRNA, описанные в настоящем изобретении, находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие средства и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дистеароилфосфатидилхолин), отрицательно заряженные (например, димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG)) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил (DOTAP) и диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOTMA)). iRNA, описанные в настоящем изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомах или могут образовывать комплексы с ними, в частности с катионными липосомами. В качестве альтернативы iRNA могут образовывать комплексы с липидами, в частности с катионными липидами. Подходящие жирные кислоты и сложные эфиры включают без ограничения арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или сложные С1-₂₀алкильные эфиры (например, изопропилмиристат (IPM)), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль. Составы для местного введения подробно описаны в патенте США № 6747 014, который включен в данный документ посредством ссылки.

i. А. Составы на основе iRNA, содержащие мембранные молекулярные ансамбли.

iRNA для применения в композициях и способах по настоящему изобретению могут быть составлены для доставки в мембранном молекулярном ансамбле, например в липосоме или мицелле. Используемый в данном документе термин липосома относится к везикуле, состоящей из амфифильных липидов, расположенных в виде по меньшей мере одного бислоя, например одного бислоя или множества бислоев. Липосомы включают однослойные и многослойные везикулы, которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала, и водную внутреннюю среду. Водная часть содержит композицию на основе iRNA. Липофильный материал отделяет водную внутреннюю среду от водной внешней среды, которая, как правило, не включает композицию на основе iRNA, хотя в некоторых примерах может включать. Липосомы применимы для переноса и доставки активных ингредиентов к участку их действия. Благодаря тому, что мембрана липосомы структурно подобна биологическим мембранам, в случае введения липосом в ткань бислой липосомы сливается с бислоем клеточных мембран. По мере того как идет слияние липосомы и клетки, внутреннее водное содержимое, которое включает iRNA, доставляется в клетку, где iRNA может специфически связываться с целевой РНК и может опосредовать RNAi. В некоторых случаях липосомы также являются специфически нацеливающими, например, для направления iRNA в конкретные типы клеток.

- 58 045013

Липосомы, содержащие средство на основе iRNA, можно получать с помощью ряда способов. В одном примере липидный компонент липосомы растворяют в детергенте для образования мицелл из липидного компонента. Например, липидный компонент может представлять собой амфипатический катионный липид или липидный конъюгат. Детергент может характеризоваться высокой критической концентрацией мицеллообразования и может быть неионогенным. Иллюстративные детергенты включают холат, CHAPS, октилглюкозид, дезоксихолат и лауроилсаркозин. Препарат средства на основе iRNA затем добавляют к мицеллам, которые включают липидный компонент. Катионные группы липида взаимодействуют со средством на основе iRNA и конденсируются вокруг средства на основе iRNA с образованием липосомы. После конденсации моющее средство удаляют, например путем диализа, с получением липосомного препарата со средством на основе iRNA.

При необходимости соединение-носитель, которое содействует конденсации, можно добавлять в ходе реакции конденсации, например, путем контролируемого добавления. Например, соединениеноситель может быть полимером, отличным от нуклеиновой кислоты (например, спермином или спермидином). Также можно корректировать pH для содействия конденсации.

Способы получения стабильных средств для доставки полинуклеотидов, которые включают комплекс полинуклеотида/катионного липида в качестве структурных компонентов средств для доставки, дополнительно описаны, например, в WO 96/37194, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки. Образование липосом может также включать один или несколько аспектов иллюстративных способов, описанных в Feigner P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; в патенте США № 4897355; патенте США № 5171678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al., Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al., Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al., Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; и Fukunaga, et al., Endocrinol. 115:757, 1984. Широко применяемые методики получения липидных агрегатов с размером, соответствующим для использования в качестве средств для доставки, включают обработку ультразвуком и замораживание-оттаивание с экструзией (см., например, Mayer, et al., Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Микрофлюидизацию можно использовать в тех случаях, когда требуются стабильно малые (от 50 до 200 нм) и относительно однородные агрегаты (Mayhew, et al., Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Такие способы легко адаптировать для упаковки препаратов средства на основе iRNA в липосомы.

Липосомы делятся на два больших класса. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот с образованием стабильных комплексов. Положительно заряженный комплекс нуклеиновой кислоты/липосомы связывается с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализируется в эндосому. Вследствие того, что внутри эндосомы кислый pH, липосомы разрываются, высвобождая их содержимое в цитоплазму клетки (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980985).

Липосомы, которые являются чувствительными к pH или отрицательно заряженными, захватывают нуклеиновые кислоты вместо образования комплекса с ними. Поскольку и нуклеиновая кислота, и липид имеют одинаковый заряд, то происходит отталкивание вместо образования комплекса. Тем не менее, некоторая часть нуклеиновых кислот захватывается водной внутренней средой этих липосом. Чувствительные к pH липосомы использовали для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих ген тимидинкиназы, в монослои клеток в культуре. Экспрессию экзогенного гена выявляли в целевых клетках (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).

Один основной тип липосомных композиций включает фосфолипиды, отличные от фосфатидилхолина природного происхождения. Композиции для нейтральных липосом, например, могут быть образованы из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Композиции для анионных липосом, как правило, образованы из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные фузогенные липосомы образованы преимущественно из диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомных композиций образован из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, PC соевых бобов и PC яиц. Другой тип образован из смесей фосфолипида, и/или фосфатидилхолина, и/или холестерина.

Примеры других способов введения липосом в клетки in vitro и in vivo включают патент США № 5283185; патент США № 5171678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Feigner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; и Strauss EMBO J. 11:417, 1992.

Также исследовали неионогенные липосомные системы для определения их пригодности в доставке лекарственных средств в кожу, в частности системы, содержащие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионогенные липосомные составы, содержащие Novasome™ I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome™ II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), использовали для доставки циклоспорина-А в слой дермы кожи мышей. Результаты показали, что такие неионогенные липосомные системы были эффективны в

- 59 045013 обеспечении депонирования циклоспорина А в различных слоях кожи (Hu et al., S.T.P.Pharma. Sci., 1994,

4(6) 466).

Липосомы также включают пространственно стабилизированные липосомы, термин, используемый в данном документе, относится к липосомам, содержащим один или несколько специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к увеличению времени полужизни в кровотоке по сравнению с липосомами, у которых отсутствуют такие специализированные липиды. Примерами пространственно стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть образующей везикулу липидной составляющей липосомы (А) содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид GMi, или (В) получена из одного или нескольких гидрофильных полимеров, таких как полиэтиленгликолевый (PEG) фрагмент. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, в данной области предполагают, что, по меньшей мере, для пространственно стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или PEG-производные липиды, увеличенное время полужизни в кровотоке этих пространственно стабилизированных липосом является следствием сниженной степени захвата клетками ретикулоэндотелиальной системы (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).

Различные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов, известны в данной области. Papahadjopoulos et al. (Алл. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) описали способность моносиалоганглиозида G_M1, сульфата галактоцереброзида и фосфатидилинозитола увеличивать время полужизни липосом в крови. Эти полученные данные были прокомментированы Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). В патенте США № 4837028 и WO 88/04924, оба из которых принадлежат Allen et al., раскрыты липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид GM1 или сложный эфир сульфата галактоцереброзида. В патенте США № 5543152 (Webb et al.) раскрыты липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-sn-димиристоилфосфатидилхолин, раскрыты в WO 97/13499 (Lim et al).

В одном варианте осуществления применяют катионные липосомы. Преимущество катионных липосом заключается в том, что они способны сливаться с клеточной мембраной. Некатионные липосомы, хотя и не способны сливаться настолько эффективно с плазматической мембраной, поглощаются макрофагами in vivo, и их можно использовать для доставки средств на основе iRNA к макрофагам.

Дополнительные преимущества липосом включают следующие: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биосовместимыми и биоразрушаемыми; липосомы могут включать широкое разнообразие водо- и жирорастворимых лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные в их внутренних отделениях средства на основе iRNA от метаболизма и разрушения (Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). Важными факторами, которые необходимо учитывать при получении липосомных составов, являются поверхностный заряд липида, размер везикулы и водный объем липосом.

Положительно заряженный синтетический катионный липид, хлорид N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), можно применять для образования малых липосом, которые самопроизвольно взаимодействуют с нуклеиновой кислотой с образованием комплексов липиднуклеиновая кислота, которые способны сливаться с отрицательно заряженными липидами клеточных мембран клеток культуры тканей, что приводит к доставке средства на основе iRNA (см., например, Feigner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 и патент США № 4897355 касательно описания DOTMA и его применения с ДНК).

Аналог DOTMA, 1,2-бис(олеоилокси)-3-(триметиламмоний)пропан (DOTAP), можно применять в комбинации с фосфолипидом с образованием везикул, образующих комплекс с ДНК. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Гейтерсберг, Мэриленд) представляет собой эффективное средство для доставки высокоанионных нуклеиновых кислот в живые клетки культуры тканей, которое содержит положительно заряженные DOTMA-липосомы, которые самопроизвольно взаимодействуют с отрицательно заряженными полинуклеотидами с образованием комплексов. Суммарный заряд полученных комплексов является также положительным в тех случаях, когда используют липосомы с достаточным положительным зарядом. Положительно заряженные комплексы, полученные таким способом, самопроизвольно присоединяются к отрицательно заряженным клеточным поверхностям, сливаются с плазматической мембраной и эффективно доставляют функциональные нуклеиновые кислоты, например, в клетки культуры тканей. Другой коммерчески доступный катионный липид, 1,2-бис(олеоилокси)-3,3(триметиламмоний)пропан (DOTAP) (Boehringer Mannheim, Индианаполис, Индиана), отличается от DOTMA тем, что олеиловые фрагменты связаны сложноэфирными, а не простыми эфирными связями.

Другие опубликованные соединения с катионными липидами включают такие соединения, которые были конъюгированы с рядом фрагментов, в том числе, например, карбоксиспермин, который был конъюгирован с одним из двух типов липидов и включает такие соединения, как 5-карбоксиспермилглициндиоктаолеоиламид (DOGS) (Transfectam™, Promega, Мэдисон, Висконсин) и дипальмитоилфосфатидилэтаноламина 5-карбоксиспермил-амид (DPPES) (см., например, патент США № 5171678).

Другой конъюгат с катионным липидом предусматривает получение производных липида с помо- 60 045013 щью холестерина (DC-Choi), которые были составлены в виде липосом в комбинации с DOPE (см., Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Как сообщалось, липополилизин, полученный путем конъюгации полилизина с DOPE, является эффективным для трансфекции в присутствии сыворотки (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Сообщается, что в случае определенных клеточных линий такие липосомы, содержащие конъюгированные катионные липиды, характеризуются более низкой токсичностью и обеспечивают более эффективную трансфекцию, чем DOTMAсодержащие композиции. Другие коммерчески доступные продукты на основе катионных липидов включают DMRIE и DMRIE-HP (Vical, Ла-Хойя, Калифорния) и Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд). Другие катионные липиды, подходящие для доставки олигонуклеотидов, описаны в WO 98/39359 и WO 96/37194.

Липосомные составы особенно подходят для местного введения, при этом липосомы обладают некоторыми преимуществами по сравнению с другими составами. Такие преимущества включают сниженные побочные действия по отношению к высокой системной абсорбции вводимого лекарственного средства, повышенное накопление вводимого лекарственного средства в необходимой мишени и возможность введения средства на основе iRNA в кожу. В некоторых вариантах осуществления липосомы используют для доставки средства на основе iRNA к эпидермальным клеткам, а также для усиления проникновения средства на основе iRNA в дермальные ткани, например, в кожу. Например, липосомы можно вводить местно. Была описана местная доставка лекарственных средств, составленных в виде липосом, в кожу (см., например, Weiner et al., et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 и du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R.J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, С. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C.Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).

Также исследовали неионогенные липосомные системы для определения их пригодности в доставке лекарственных средств в кожу, в частности системы, содержащие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Для доставки лекарственного средства в дерму кожи мышей использовали неионогенные липосомные составы, содержащие Novasome I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен10-стеариловый эфир) и Novasome II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир). Такие составы со средством на основе iRNA применимы для лечения дерматологического нарушения.

Липосомы, которые включают iRNA, могут быть получены с высокой способностью к деформации. Такая способность к деформации может позволить липосомам проникать через пору, которая меньше среднего радиуса липосомы. Например, типом способных к деформации липосом являются трансферосомы. Трансферосомы можно получать путем добавления поверхностных пограничных активаторов, обычно поверхностно-активных веществ, в стандартную липосомную композицию. Трансферосомы, которые включают средство на основе iRNA, можно доставлять, например, подкожно путем инъекции для доставки средства на основе iRNA к кератиноцитам кожи. Для того чтобы пройти сквозь неповрежденную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны проникнуть через ряд мелких пор, каждая из которых имеет диаметр менее 50 нм, под воздействием подходящего трансдермального градиента. Кроме того, благодаря свойствам липидов, такие трансферосомы могут быть самооптимизирующимися (приспосабливаться к форме пор, например, в коже), самовосстанавливающимися и зачастую могут достигать свои мишени без разделения на фрагменты, и часто могут быть самозагружающимися.

Другие составы, пригодные в настоящем изобретении, описаны в предварительных заявках США с порядковыми № 61/018616, поданной 2 января 2008 г.; 61/018611, поданной 2 января 2008 г.; 61/039748, поданной 26 марта 2008 г.; 61/047087, поданной 22 апреля 2008 г., и 61/051528, поданной 8 мая 2008 г. В заявке согласно PCT с № PCT/US2007/080331, поданной 3 октября 2007 г., также описаны составы, применимые в настоящем изобретении.

Трансферосомы представляют собой еще один тип липосом и являются высокодеформируемыми липидными агрегатами, которые являются перспективными кандидатами как средства для доставки лекарственных средств Трансферосомы могут быть описаны как липидные капельки, которые обладают настолько высокой способностью деформироваться, что они легко могут проникать через поры, меньшие, чем капельки. Трансферосомы являются приспосабливаемыми к окружающей среде, в которой их используют, например, они являются самооптимизирующимися (приспосабливаются к форме пор кожи), самовосстанавливающимися, зачастую достигают своих мишеней без разделения на фрагменты и часто могут быть самозагружающимися. Для получения трансферосом можно добавлять поверхностные пограничные активаторы, обычно поверхностно-активные вещества, в стандартную липосомную композицию. Трансферосомы применяли для доставки сывороточного альбумина в кожу. Как было показано, опосредованная трансферосомами доставка сывороточного альбумина была такой же эффективной, как подкожная инъекция раствора, содержащего сывороточный альбумин.

Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в составах, таких как эмульсии (в том числе микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным способом классифицирования и ранжирования свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ, как естественных, так

- 61 045013 и синтетических, является применение гидрофильно-липофильного баланса (HLB).

Природа гидрофильной группы (также известной как головка) предоставляет наиболее эффективное средство для распределения по категориям различных поверхностно-активных веществ, применяемых в составах (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p.

285).

Если молекула поверхностно-активного вещества не ионизирована, то ее классифицируют как неионогенное поверхностно-активное вещество. Неионогенные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических и косметических продуктах, и их применяют при широком диапазоне значений pH. Обычно их значения HLB находятся в диапазоне от 2 до приблизительно 18 в зависимости от их структуры. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают неионогенные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, сложные глицериловые эфиры, сложные полиглицериловые эфиры, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Неионогенные алканоамиды и простые эфиры, как например: этоксилаты жирных спиртов, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блок-сополимеры, также включены в данный класс. Полиоксиэтиленовые поверхностноактивные вещества являются наиболее распространенными представителями класса неионогенных поверхностно-активных веществ.

Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как анионное. Анионные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, как например: омыляющие вещества, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты, и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными представителями класса анионных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и омыляющие вещества.

Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как катионное. Катионные поверхностно-активные вещества включают соли четвертичного аммония и этоксилированные амины. Соли четвертичного аммония являются наиболее используемыми представителями данного класса.

Если молекула поверхностно-активного вещества обладает способностью нести и положительный, и отрицательный заряд, то поверхностно-активное вещество классифицируют как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.

Было рассмотрено применение поверхностно-активных веществ в готовых лекарственных формах, составах и в эмульсиях (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

Для применения в способах по настоящему изобретению iRNA может также предусматриваться в виде мицеллярных составов. Мицеллы в данном документе определены как конкретный тип молекулярной сборки, в которой амфипатические молекулы расположены в виде сферической структуры так, что все гидрофобные части молекул направлены вовнутрь, оставляя гидрофильные части в контакте с окружающей водной фазой. Противоположное расположение имеет место, если окружающая среда гидрофобная.

Смешанный мицеллярный состав, подходящий для доставки через трансдермальные мембраны, может быть получен путем смешивания водного раствора композиции на основе siRNA, С₈С₂₂алкилсульфата щелочного металла и мицеллообразующих соединений. Иллюстративные мицеллообразующие соединения включают лецитин, гиалуроновую кислоту, фармацевтически приемлемые соли гиалуроновой кислоты, гликолевую кислоту, молочную кислоту, экстракт ромашки, экстракт огурца, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, моноолеин, моноолеаты, монолаураты, масло бурачника, масло первоцвета вечернего, ментол, тригидроксиоксохоланил-глицин и его фармацевтически приемлемые соли, глицерин, полиглицерин, лизин, полилизин, триолеин, простые эфиры полиоксиэтилена и их аналоги, простые полидоканол-алкильные эфиры и их аналоги, хенодезоксихолат, дезоксихолат и их смеси. Мицеллообразующие соединения можно добавлять одновременно или после добавления алкилсульфата щелочного металла. Смешанные мицеллы будут образовываться практически при любом типе смешивания ингредиентов, но для получения мицелл с меньшим размером требуется интенсивное перемешивание.

В одном способе получают первую мицеллярную композицию, которая содержит композицию на основе siRNA и по меньшей мере алкилсульфат щелочного металла. Первую мицеллярную композицию затем смешивают по меньшей мере с тремя мицеллообразующими соединениями с образованием смешанной мицеллярной композиции. В другом способе мицеллярную композицию получают путем смешивания композиции на основе siRNA, алкилсульфата щелочного металла и по меньшей мере одного из мицеллообразующих соединений с последующим добавлением оставшихся мицеллообразующих соединений при интенсивном перемешивании.

Фенол и/или м-крезол можно добавлять к смешанной мицеллярной композиции для стабилизации

- 62 045013 состава и защиты от роста бактерий. В качестве альтернативы фенол и/или м-крезол можно добавлять с мицеллообразующими ингредиентами.

Изотоническое средство, такое как глицерин, также можно добавлять после образования смешанной мицеллярной композиции.

Для доставки мицеллярного состава в виде распыляемого раствора состав можно поместить в аэрозольный распылитель и распылитель зарядить газом-вытеснителем. Газ-вытеснитель, который пребывает под давлением, находится в жидкой форме в распылителе. Соотношения ингредиентов корректируют так, что водная фаза и фаза газа-вытеснителя становятся единым целым, т.е. присутствует одна фаза. Если присутствуют две фазы, то необходимо встряхнуть распылитель перед распылением порции содержимого, например, через дозирующий клапан. Распыляемая доза фармацевтического средства вытесняется из дозирующего клапана в виде мелкодисперсного распыляемого раствора.

Газы-вытеснители могут включать водородсодержащие хлорфторуглероды, водородсодержащие фторуглероды, простой диметиловый эфир и простой диэтиловый эфир. В определенных вариантах осуществления можно применять HFA 134а (1,1,1,2-тетрафторэтан).

Конкретные концентрации основных ингредиентов могут быть определены путем проведения относительно простых экспериментов. Для абсорбции через ротовую полость часто требуется увеличить, например по меньшей мере удвоить или утроить, дозу, предназначенную для инъекции или введения через желудочно-кишечный тракт.

В. Липидные частицы.

iRNA, например dsRNA, по настоящему изобретению могут быть полностью инкапсулированы в липидном составе, например, в LNP или другой частице нуклеиновая кислота-липид.

Используемое в данном документе выражение LNP относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид. Как правило, LNP содержат катионный липид, некатионный липид и липид, который предупреждает агрегацию частиц (например, конъюгат PEG-липид). LNP исключительно пригодны для системных применений, поскольку они характеризуются длительным временем жизни в кровотоке после внутривенной (i.v.) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, участках, физически отделенных от участка введения). LNP включают pSPLP, которая включает инкапсулированный комплекс конденсирующее средство-нуклеиновая кислота, который изложен в публикации согласно PCT № WO 00/03683. Средний диаметр частиц по настоящему изобретению обычно составляет от приблизительно 50 нм до приблизительно 150 нм, чаще от приблизительно 60 нм до приблизительно 130 нм, чаще от приблизительно 70 нм до приблизительно 110 нм, наиболее часто от приблизительно 70 нм до приблизительно 90 нм, и они являются практически нетоксичными. Кроме того, нуклеиновые кислоты, когда присутствуют в частицах нуклеиновой кислоты-липида по настоящему изобретению, устойчивы в водном растворе к разрушению нуклеазой. Частицы нуклеиновая кислота-липид и способ их получения раскрыты, например, в патентах США № 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432; публикации США № 2010/0324120 и публикации согласно PCT № WO 96/40964.

В одном варианте осуществления соотношение липида и лекарственного средства (соотношение вес/вес) (например, соотношение липида и dsRNA) будет находится в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 1:1 до приблизительно 25:1, от приблизительно 3:1 до приблизительно 15:1, от приблизительно 4:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 5:1 до приблизительно 9:1 или от приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1. Диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным выше диапазонам, также рассматриваются как часть настоящего изобретения.

Катионный липид может представлять собой, например, хлорид N,N-диолеил-N,N-диметиламмония (DODAC), бромид N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония (DDAB), хлорид N-(I-(2,3-диолеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTAP), хлорид N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), N,N-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), 1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3 -диметиламинопропан (DLin-C-DAP), 1,2-дилинолеилокси-3-(диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC), 1,2-дилинолеилокси-3-морфолинопропан (DLin-MA), 1,2-дилинолеоил-3диметиламинопропан (DLinDaP), 1,2-дилинолеилтио-3-диметиламинопропан (DLin-S-DMA), 1-линолеоил-2-линолеилокси-3-диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), хлористую соль 1,2-дилинолеилокси-3триметиламинопропана (DLin-TMA-Cl), хлористую соль 1,2-дилинолеоил-3-триметиламинопропана (DLin-TAP-Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-(М-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ) или 3-(N,N-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(N,N-диолеиламино)-1,2-пропандиол (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо3-(2-N,N-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или его аналоги, (3aR,5s,6aS)-N,N-дuметuл-2,2-дu((9Z,12Z)-октадека-9,12-дuенил)тетрагuдро-3аН-цuклоnента[d][1,3]-дuоксол-5-амин (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (МС3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазандиил)дидодекан-2-ол (Tech G1) или их смесь. Катионный липид может содержать от приблизительно 20 мол.% до приблизительно 50 мол.% или приблизительно 40 мол.% от

- 63 045013 общего содержания липидов, присутствующих в частице.

В другом варианте осуществления можно использовать соединение 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан для получения наночастиц на основе липида-siRNA. Синтез 2,2-дилинолеил4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана описан в предварительной заявке на патент США номер

61/107998, поданной 23 октября 2008 г., которая включена в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления частица на основе липида-siRNA включает 40% 2,2-дилинолеил4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана: 10% DSPC: 40% холестерина: 10% PEG-C-DOMG (мольный процент) с размером частиц, составляющим 63,0±20 нм, и соотношением siRNA/липид, составляющим 0,027.

Ионизируемый/некатионный липид может представлять собой анионный липид или нейтральный липид, в том числе без ограничения дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоил-фосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин4-(N-малеимидометил)циклогексан-1 -карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), 16-Омонометил-РЕ, 16-О-диметил-РЕ, 18-1-транс-РЕ, 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE), холестерин или их смесь. Содержание некатионного липида может составлять от приблизительно 5 мол.% до приблизительно 90 мол.%, приблизительно 10 мол.% или приблизительно 58 мол.%, если холестерин включен, от общего содержания липидов, присутствующих в частице.

Конъюгированный липид, который препятствует агрегации частиц, может представлять собой, например, конъюгат полиэтиленгликоль (PEG)-липид, в том числе без ограничения PEG-диацилглицерин (DAG), PEG-диалкилоксипропил (DAA), PEG-фосфолипид, PEG-церамид (Cer) или их смесь. Конъюгат PEG-DAA может представлять собой, например, PEG-дилаурилоксипропил (Ci₂), PEG-димиристоилоксипропил (Ci₄), PEG-дипальмитилоксипропил (Ci₆) или PEG-дистеарилоксипропил (Ci₈). Содержание конъюгированного липида, который предупреждает агрегацию частиц, может составлять от 0 мол.% до приблизительно 20 мол.% или приблизительно 2 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.

В некоторых вариантах осуществления частица на основе нуклеиновой кислоты-липида дополнительно включает холестерин в количестве, составляющем, например, от приблизительно 10 мол.% до приблизительно 60 мол.% или приблизительно 48 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.

В одном варианте осуществления липидоид ND98-4HCl (MW 1487) (см. заявку на патент США № 12/056230, поданную 26 марта 2008 г., которая включена в данный документ посредством ссылки), холестерин (Sigma-Aldrich) и PEG-церамид С16 (Avanti Polar Lipids) можно использовать для получения наночастиц на основе липида-dsRNA (т.е. частиц LNP01). Маточные растворы в этаноле каждого из них могут быть получены следующим образом: ND98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, PEG-церамид С16, 100 мг/мл. Маточные растворы ND98, холестерина и PEG-церамида С16 можно затем объединять, например при молярном соотношении 42:48:10. Объединенный липидный раствор можно смешивать с водным раствором dsRNA (например, в ацетате натрия, pH 5) так, чтобы конечная концентрация этанола составляла приблизительно 35-45%, а конечная концентрация ацетата натрия составляла приблизительно 100-300 мМ. Наночастицы на основе липида-dsRNA обычно образуются самопроизвольно при смешивании. В зависимости от необходимого распределения частиц по размеру полученную смесь наночастиц можно продавливать через поликарбонатную мембрану (например, с отсечением по размеру в 100 нм) с использованием, например, экструдера с термоцилиндром, как например Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях стадию экструзии можно пропустить. Удаление этанола и одновременная замена буфера могут быть осуществлены, например, с помощью диализа или тангенциальной поточной фильтрации. Буфер можно заменить, например фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) со значением pH, составляющим приблизительно 7, например pH, составляющим приблизительно 6,9, pH, составляющим приблизительно 7,0, pH, составляющим приблизительно 7,1, pH, составляющим приблизительно 7,2, pH, составляющим приблизительно 7,3, или pH, составляющим приблизительно 7,4.

Формула 1

Изомер I XD98

Формула 1

Составы LNP01 описаны, например, в публикации международной заявки № WO 2008/042973, ко- 64 045013 торая включена в данный документ посредством ссылки.

Дополнительные иллюстративные составы на основе липида-dsRNA описаны в табл. 1.

SNALP-1 2-ХТС LNP05	Ионизируемый/катионный липид 1,2-Дилиноленилокси-П,Nдиметиламинопропан (DLinDMA) 2,2-Дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан (ХТС) 2,2-Дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан (ХТС)	Таблица 1 Катионный липид/некатионный липид/холестерин/ конъюгат PEG-липид Соотношение липид: siRNA DLinDMA/DPPC/холестерин/PEG-eDMA (57,1/7,1/34,4/1,4) Липид:siRNA ~ 7:1 ХТС/DPPC/холестерин/PEG-cDMA 57,1/7,1/34,4/1,4 Липид:siRNA ~ 7:1 XTC/DSPC/холестерин/PEG-DMG 57,5/7,5/31,5/3,5 Липид:siRNA ~ 6:1
LNP06	2,2-Дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан (ХТС)	XTC/DSPC/холестерин/PEG-DMG 57,5/7,5/31,5/3,5 Липид:siRNA ~ 11:1
LNP07	2,2-Дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан (ХТС)	XTC/DSPC/холестерин/PEG-DMG 60/7,5/31/1,5 Липид:siRNA ~ 6:1
LNP08	2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан (ХТС)	XTC/DSPC/холестерин/PEG-DMG 60/7,5/31/1,5 Липид:siRNA ~ 11:1
LNP09	2,2-Дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан (ХТС)	XTC/DSPC/холестерин/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA 10:1
LNP10	(3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2ди( ( 9Z,12Z)-октадека-9,12- диенил)тетрагидро-ЗаН- циклопента[d][1,3]диоксол-5- амин (ALN100)	ALNIOO/DSPC/холестерин/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA 10:1
LNP11	(6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта6,9,28,31-тетраен-19-ил-4- (диметиламино)бутаноат (МСЗ)	МС-З/ОЗРС/холестерин/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA 10:1
LNP12	1,1' - (2-(4-(2-( (2-(Бис(2гидроксидодецил)амино)этил)(2гидроксидодецил)амино)этил)пипе разин-1- ил)этилазандиил)дидодекан-2-ол (Tech G1)	Tech С1/ОЗРС/холестерин/РЕС-ОМС 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA 10:1
LNP13	ХТС	XTC/DSPC/холест./PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA: 33:1
LNP14	МСЗ	МСЗ/ОЗРС/холест./PEG-DMG 40/15/40/5 Липид:siRNA: 11:1
LNP15	МСЗ	МСЗ/ОЗРС/холест./PEG-DSG/GalNAc- PEG-DSG 50/10/35/4,5/0,5 Липид:siRNA: 11:1
LNP16	МСЗ	МСЗ/ОЗРС/холест./PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA: 7:1

- 65 045013

LNP17	МСЗ	МСЗ/ОЗРС/холест./PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA: 10:1
LNP18	МСЗ	МСЗ/ОЗРС/холест./PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA: 12:1
LNP19	МСЗ	МСЗ/ОЗРС/холест./PEG-DMG 50/10/35/5 Липид:siRNA: 8:1
LNP2 0	МСЗ	МСЗ/ОЗРС/холест./PEG-DPG 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA: 10:1
LNP21	С12-200	С12-20O/DSPC/холест./PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA: 7:1
LNP22	ХТС	XTC/DSPC/холест./PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 Липид:siRNA: 10:1

DSPC: дистеароилфосфатидилхолин;

DPPC: дипальмитоилфосфатидилхолин;

PEG-DMG: PEG-дидимиристоилглицерин (C14-PEG или PEG-C14) (PEG со средн. мол. массой 2000);

PEG-DSG: PEG-дистирилглицерин (C18-PEG или PEG-C18) (PEG со средн. мол. массой 2000);

PEG-cDMA: PEG-карбамоил-1,2-димиристоилоксипропиламин (PEG со средн. мол. массой 2000).

Составы, содержащие SNALP (1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA)), описаны в международной публикации № WO 2009/127060, поданной 15 апреля 2009 г., которая включена в данный документ посредством ссылки.

Составы, содержащие ХТС, описаны, например, в предварительной заявке США с порядковым № 61/148366, поданной 29 января 2009 г.; предварительной заявке США с порядковым № 61/156851, поданной 2 марта 2009 г.; предварительной заявке США с порядковым №, поданной 10 июня 2009 г.; предварительной заявке США с порядковым № 61/228373, поданной 24 июля 2009 г.; предварительной заявке США с порядковым № 61/23968 6, поданной 3 сентября 2009 г., и международной заявке № PCT/US2010/022614, поданной 29 января 2010 г., которые включены в данный документ посредством ссылки.

Составы, содержащие MC3, описаны, например, в публикации США № 2010/0324120, поданной 10 июня 2010 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Составы, содержащие ALNY-100, описаны, например, в международной заявке на выдачу патента с номером PCT/US09/63933, поданной 10 ноября 2009 г., которая включена в данный документ посредством ссылки.

Составы, содержащие С12-200, описаны в предварительной заявке США с порядковым № 61/175770, поданной 5 мая 2009 г., и международной заявке № PCT/US10/33777, поданной 5 мая 2010 г., которые включены в данный документ посредством ссылки.

Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, желатиновые капсулы, пакетики-саше, таблетки или минитаблетки. Могут потребоваться загустители, ароматизирующие вещества, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие средства или связующие вещества. В некоторых вариантах осуществления составы для перорального введения являются такими, в которых dsRNA, описанные в настоящем изобретении, вводят в сочетании с одним или несколькими веществами, способствующими проникновению, поверхностно-активными вещества и хелаторами. Подходящие поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Подходящие желчные кислоты/соли желчных кислот включают хенодезоксихолевую кислоту (CDCA) и урсодезоксихенодезоксихолевую кислоту (UDCA), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюкохолевую кислоту, гликохолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауро-24,25-дигидрофузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Подходящие жирные кислоты включают арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, натриевую). В некоторых вариантах осуществления используют комбинации веществ,

- 66 045013 способствующих проникновению, например, жирные кислоты/соли жирных кислот в комбинации с желчными кислотами/солями желчных кислот. Одной иллюстративной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA. Дополнительные вещества, способствующие проникновению, включают простой полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, простой полиоксиэтилен-2 0цетиловый эфир. Описанные в настоящем изобретении dsRNA могут быть доставлены перорально, в форме гранул, в том числе частиц, высушенных распылением, или в комплексе с образованием микроили наночастиц. Комплексообразующие средства для dsRNA включают полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, полиоксэтаны, полиалкилцианоакрилаты; катионизированные виды желатина, альбумины, виды крахмала, акрилаты, полиэтиленгликоли (PEG) и виды крахмала; полиалкилцианоакрилаты; DEAE-производные полиимины, поллуланы, виды целлюлозы и виды крахмала. Подходящие комплексообразующие средства включают хитозан, N-триметилхитозан, поли-L-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен (PTDAE), полиаминостирол (например, п-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианоакрилат), поли(изобутилцианоакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAEметакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAE-альбумин и DEAE-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(D,L-молочную кислоту), сополимер DL-молочной и гликолевой кислот (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (PEG). Составы для перорального введения для dsRNA и их получение описаны подробно в патенте США № 6887906, в публикации патента США № 20030027780 и патенте США № 6747014, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.

Композиции и составы для парентерального, интрапаренхиматозного (в головной мозг), интратекального, интравентрикулярного или внутрипеченочного введения могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие соответствующие добавки, такие как без ограничения вещества, способствующие проникновению, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают без ограничения растворы, эмульсии и содержащие липосомы составы. Такие композиции могут быть получены из ряда компонентов, которые включают без ограничения предварительно полученные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. В частности, предпочтительными являются составы, которые целенаправленно воздействуют на печень при лечении заболеваний печени, таких как гепатокарцинома.

Фармацевтические составы по настоящему изобретению, которые в целях удобства могут находиться в виде единичной лекарственной формы, можно получать согласно традиционным методикам, хорошо известным в фармацевтической промышленности. Такие методики включают стадию приведения активных ингредиентов во взаимодействие с фармацевтическим(фармацевтическими) носителем(носителями) или наполнителем(наполнителями). Обычно составы получают путем равномерного и тщательного приведения активных ингредиентов во взаимодействие с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или и первыми, и вторыми, а затем при необходимости придания продукту формы.

Композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в какой-либо из многих возможных лекарственных форм, как, например, без ограничения таблеток, капсул, желатиновых капсул, жидких сиропов, мягких гелей, суппозиториев и клизм. Композиции по настоящему изобретению также могут быть составлены в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии дополнительно могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.

С. Дополнительные составы.

i. Эмульсии.

Композиции по настоящему изобретению могут быть получены и составлены в виде эмульсий. Эмульсии, как правило, являются гетерогенными системами одной жидкости, диспергированной в другой в форме капелек, диаметр которых обычно превышает 0,1 мкм (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8^th ed.), New York, NY; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al. в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Эмульсии зачастую представляют собой двухфазные системы, содержащие две несмешиваемые жидкие фазы, тщательно перемешанные и диспергированные одна в другой. Как правило, эмульсии могут быть эмульсиями по типу либо вода в масле (w/o), либо масло в воде (o/w). В тех случаях, когда водная фаза является тонкораспыленной в общем объеме масляной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу вода в масле (w/o). В качестве альтернативы в тех случаях, когда масляная фаза является тонкораспы

- 67 045013 ленной в общем объеме водной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу масло в воде (o/w). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты в дополнение к диспергированным фазам и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора либо в водной фазе, масляной фазе, либо собственно в качестве отдельной фазы. Фармацевтические наполнители, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты, могут присутствовать в эмульсиях при необходимости. Фармацевтические эмульсии также могут представлять собой множественные эмульсии, которые состоят из более чем двух фаз, такие как например в случае эмульсий по типу масло-в-воде-в-масле (o/w/o) и вода-в-масле-вводе (w/o/w). Такие сложные составы часто обеспечивают определенные преимущества, которые не обеспечивают простые двухкомпонентные эмульсии. Множественные эмульсии, в которых отдельные масляные капельки эмульсии по типу o/w включают маленькие водные капельки, составляют эмульсию по типу w/o/w. Аналогично этому система масляных капелек, заключенная в каплях воды, стабилизированных в масляной диспергирующей фазе, обеспечивает эмульсию по типу o/w/o.

Эмульсии характеризуются малой термодинамической стабильностью либо ее отсутствием. Часто диспергированная или дисперсная фаза эмульсии хорошо диспергирована в дисперсионной или диспергирующей фазе и поддерживается в такой форме с помощью эмульгаторов или за счет вязкости состава. Любая из фаз эмульсии может быть полутвердой или твердой, как и в случае подобных эмульсии мазевых основ и кремов. Другие способы стабилизации эмульсий охватывают применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу эмульсии. Эмульгаторы в целом могут быть разделены на четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества, встречающиеся в природе эмульгаторы, абсорбционные базы и тонкодисперные твердые вещества (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8^th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).

Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как сурфактанты, нашли широкое применение в составе эмульсий, и они рассмотрены в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8^th ed.), New York, NY; Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Поверхностно-активные вещества обычно являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную части. Соотношение гидрофильной и гидрофобной природы поверхностно-активного вещества называют гидрофильно-липофильным балансом (HLB), и оно является ценным инструментом в распределении на категории и выборе поверхностно-активных веществ при получении составов. Поверхностноактивные вещества могут быть разделены на различные классы, исходя из природы гидрофильной группы: неионогенные, анионные, катионные и амфотерные (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8^th ed.), New York, NY Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).

Встречающиеся в природе эмульгаторы, используемые в эмульсионных составах, включают ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и гуммиарабик. Абсорбирующие основы, такие как безводный ланолин и гидрофильный вазелин, обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду с образованием эмульсий по типу w/o, сохраняя при этом свою полутвердую консистенцию. Тонкоизмельченные твердые вещества также использовали в качестве подходящих эмульгаторов, в особенности в комбинации с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Они включают полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, ненабухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный алюмосиликат магния, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как углерод или тристеарат глицерина.

Большое разнообразие неэмульгирующих материалов также включают в эмульсионные составы, и они обуславливают определенные свойства эмульсий. Они включают жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).

Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают встречающиеся в природе смолы и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, гуммиарабик, агар, альгиновую кислоту, каррагенан, гуаровую камедь, камедь карайи и трагакант), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу и карбоксипропилцеллюлозу) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Они диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии путем образования прочных межфазных пленок вокруг капелек диспергированной фазы и путем повышения вязкости дисперсионной фазы.

- 68 045013

Поскольку эмульсии зачастую содержат некоторое количество ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые могут легко поддерживать рост микроорганизмов, то такие составы часто включают консерванты. Широко используемые консерванты, включенные в эмульсионные составы, включают метилпарабен, пропилпарабен, соли четвертичного аммония, бензалкония хлорид, сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты и борную кислоту. Антиоксиданты также обычно добавляют в эмульсионные составы для предупреждения ухудшения качества состава. Используемые антиоксиданты могут быть акцепторами свободных радикалов, как например: токоферолы, алкил галлаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстановителями, такими как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, и синергистами антиоксидантов, такими как лимонная кислота, винная кислота и лецитин.

Применение эмульсионных составов посредством дерматологического, перорального и парентерального путей и способы их получения были рассмотрены в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Эмульсионные составы для пероральной доставки очень широко применяют из-за удобства составления, а также с позиции эффективности при абсорбции и биодоступности (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms и Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., и Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8^th ed.), New York, NY; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger и Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Слабительные средства на основе минеральных масел, жирорастворимые витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира находятся в числе материалов, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий по типу o/w.

ii. Микроэмульсии.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции на основе iRNA и нуклеиновых кислот составлены в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система воды, масла и амфифильного вещества, которая является отдельным оптически изотропным и термодинамически устойчивым жидким раствором (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8^th ed.), New York, NY; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Обычно микроэмульсии являются системами, которые получают сперва путем диспергирования масла в водном растворе поверхностно-активного вещества, а затем добавления достаточного количества четвертого компонента, как правило, спирта со средней длиной цепи для образования прозрачной системы. Таким образом, микроэмульсии также были описаны как термодинамически устойчивые, изотропически чистые дисперсии двух несмешиваемых жидкостей, которые стабилизируются межфазными пленками поверхностно-активных молекул (Leung and Shah, в Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Микроэмульсии обычно получают путем объединения от трех до пяти компонентов, которые включают масло, воду, поверхностно-активное вещество, вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. Является ли микроэмульсия эмульсией по типу вода в масле (w/o) или по типу масло в воде (o/w), зависит от свойств используемого масла и поверхностно-активного вещества и от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов молекул поверхностноактивного вещества (Schott, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).

Активно изучался феноменологический подход с использованием фазовых диаграмм, и с его помощью специалистами в данной области были получены обширные данные о том, как составлять микроэмульсии (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, L.V., Popovich N.G., and Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). По сравнению с традиционными эмульсиями микроэмульсии имеют преимущество солюбилизации водонерастворимых лекарственных средств в составе термодинамически стабильных капелек, которые образуются самопроизвольно.

Поверхностно-активные вещества, используемые в получении микроэмульсий, включают без ограничения ионные поверхностно-активные вещества, неионогенные поверхностно-активные вещества, Brij 96, простые полиоксиэтиленолеиловые эфиры, сложные эфиры жирных кислот и полиглицерина, тетраглицерина монолаурат (ML310), тетраглицерина моноолеат (МО310), гексаглицерина моноолеат (РО310), гексаглицерина пентаолеат (РО500), декаглицерина монокапрат (МСА750), декаглицерина моноолеат (МО750), декаглицерина секвиолеат (SO750), декаглицерина декаолеат (DAO7 50) отдельно или в комбинации с вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, обычно являющееся спиртом с короткой цепью, таким как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для увеличения межфазной текучести путем проникновения в пленку из поверхностно-активного веще

- 69 045013 ства и соответственно создания неупорядоченной пленки из-за пустого пространства, образующегося между молекулами поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть получены без использования вторичных поверхностно-активных веществ, и в данной области известны самоэмульгирующиеся системы микроэмульсий без спирта. Водной фазой, как правило, без ограничения может быть вода, водный раствор лекарственного средства, глицерин, PEG300, PEG400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может включать в себя без ограничения такие материалы, как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, сложные эфиры жирных кислот, среднецепочечные (С₈-С₁₂)моно-, ди- и триглицериды, сложные полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и глицерина, жирные спирты, полигликолизированные глицериды, насыщенные полигликолизированные С₈С1₀глицериды, растительные масла и силиконовое масло.

Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения растворимости лекарственного средства и повышенной абсорбции лекарственных средств. Липидные микроэмульсии (и масло в воде, и вода в масле) были предложены для увеличения пероральной биодоступности лекарственных средств, включая пептиды (см., например, патенты США № 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Микроэмульсии обеспечивают преимущества в виде улучшенной растворимости лекарственного средства, защиты лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможного увеличения абсорбции лекарственного средства за счет индуцированных поверхностно-активным веществом изменений текучести мембран и проницаемости, удобства получения, удобства перорального введения по сравнению с твердой лекарственной формой, улучшенной клинической действенности и пониженной токсичности (см., например, патент США № 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться самопроизвольно, когда их компоненты объединяют при температуре окружающей среды. Это может быть в особенности преимущественным, когда составляют термолабильные лекарственные средства, пептиды или iRNA. Микроэмульсии также были эффективными в трансдермальной доставке активных компонентов как в применениях в косметологии, так и в фармации. Предполагается, что композиции и составы микроэмульсий по настоящему изобретению будут способствовать повышенной системной абсорбции iRNA и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также улучшать локальное клеточное поглощение iRNA и нуклеиновых кислот.

Микроэмульсии по настоящему изобретению также могут содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как сорбитанмоностеарат (Grill 3), Labrasol и вещества, способствующие проникновению, для улучшения свойств состава и для повышения абсорбции iRNA и нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Вещества, способствующие проникновению, используемые в микроэмульсиях по настоящему изобретению, могут классифицироваться, как принадлежащие к одной из пяти основных категорий: поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатирующие вещества, отличные от поверхностно-активных веществ (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из этих классов рассмотрен выше.

iii. Микрочастицы.

Средство на основе iRNA по настоящему изобретению может быть включено в частицу, например. микрочастицу. Микрочастицы можно получать при помощи высушивания распылением, но также можно получать другими способами, в том числе лиофилизацией, выпариванием, сушкой в псевдоожиженном слое, сушкой в вакууме или при помощи комбинации этих методик.

iv. Вещества, способствующие проникновению.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении применяют разнообразные вещества, способствующие проникновению, для воздействия на эффективную доставку нуклеиновых кислот, в частности iRNA, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствуют в растворе как в ионизированной, так и в неионизированной формах. Однако, как правило, только жирорастворимые или липофильные лекарственные средства легко проходят через клеточные мембраны. Было установлено, что даже нелипофильные лекарственные средства могут проходить через клеточные мембраны, если мембрана, через которую необходимо пройти, обработана веществом, способствующим проникновению. Вдобавок к содействию диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны вещества, способствующие проникновению, также повышают проницаемость для липофильных лекарственных средств.

Вещества, способствующие проникновению, можно классифицировать как принадлежащие к одной из пяти основных категорий, т.е. поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатриующие вещества, отличные от поверхностно-активных веществ (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Каждый из вышеуказанных классов веществ, способствующих проникновению, описан более подробно ниже.

Поверхностно-активные вещества (или сурфактанты) являются химическими структурными единицами, которые при растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или межфазное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, в результате чего повышается аб

- 70 045013 сорбция iRNA через слизистую. Вдобавок к солям желчных кислот и жирным кислотам, эти вещества, способствующие проникновению, включают, например, лаурилсульфат натрия, простой полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и простой полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92) и перфорированные эмульсии, такие как FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).

Разнообразные жирные кислоты и их производные, которые действуют как вещества, способствующие проникновению, включают, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рац-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерин-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их сложные С1_₂₀алкиловые эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и их моно- и диглицериды (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.д.) (см. например, Touitou, E., et al., Enhancement в Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews в Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).

Физиологическая роль желчи включает содействие в распределении и всасывании липидов и жирорастворимых витаминов (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 в Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9^th Ed., Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Разные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют как вещества, способствующие проникновению. Таким образом, термин соли желчных кислот включает любые встречающиеся в природе компоненты желчи, а также любые из их синтетических производных. Подходящие соли желчных кислот включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюкохолевую кислоту (глюкохолат натрия), гликохолевую кислоту (гликохолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидро-фузидат (STDHF) натрия, гликодигидрофузидат натрия и простой полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (РОЕ) (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 в: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).

Хелатирующие средства, используемые применительно к настоящему изобретению, можно определить как соединения, которые удаляют ионы металла из раствора путем образования комплексов с ними, в результате чего повышается абсорбция iRNA через слизистую оболочку. В отношении их применения в качестве веществ, способствующих проникновению, в настоящем изобретении хелатирующие средства обладают дополнительным преимуществом, также выступая в качестве ингибиторов ДНКазы, поскольку большинство охарактеризованных ДНК-нуклеаз требуют двухвалентный ион металла для катализа и таким образом ингибируются хелатирующими средствами (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатирующие средства включают без ограничения двунатриевый этилендиаминтетраацетат (EDTA), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомовалинат), N-ацилпроизводные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацилпроизводные бета-дикетонов (енамины) (см., например, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).

Как используется в данном документе, нехелатирующие соединения, отличные от поверхностноактивных веществ, способствующие проникновению, могут быть определены как соединения, которые проявляют небольшую активность в качестве хелатирующих средств или в качестве поверхностноактивных веществ, но которые тем не менее повышают абсорбцию iRNA через слизистую оболочку пищеварительного тракта (см., например, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Этот класс веществ, способствующих проникновению, включает, например, ненасыщенные цикломочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазацикло-алканона (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92) и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак натрия, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).

Средства, которые повышают поглощение iRNA на клеточном уровне, также можно добавлять к фармацевтическим и другим композициям по настоящему изобретению. Например, катионные липиды,

- 71 045013 такие как липофектин (Junichi et al., патент США № 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo et al., заявка согласно PCT WO 97/30731), также, как известно, усиливают поглощение dsRNA клетками. Примеры коммерчески доступных реагентов для трансфекции включают среди прочего, например, Lipofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), 293fectin™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Cellfectin™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), DMRIE-C™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Freestyle™ MAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), iRNAMAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Oligofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Optifect™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), реагент для трансфекции X-tremeGENE Q2 (Roche; Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOTAP (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOSPER (Грензахерштрассе, Швейцария) или Fugene (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент Transfectam® (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент для трансфекции TransFast™ (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx™-20 (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx™-50 (Promega; Мэдисон, Висконсин), DreamFect™ (OZ Biosciences; Марсель, Франция), EcoTransfect (OZ Biosciences; Марсель, Франция), реагент для трансфекции TransPassa D1 (New England Biolabs; Ипсвич, Массачусетс, США), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции PerFectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции NeuroPORTER (Genlantis; СанДиего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER 2 (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции Cytofectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции BaculoPORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции TroganPORTER™ (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), RiboFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), PlasFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), UniFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США), SureFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США) или HiFect™ (B-Bridge International, Маунтин-Вью, Калифорния, США).

Для повышения проникновения введенных нуклеиновых кислот можно использовать другие средства, в том числе гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.

v. Носители.

Определенные композиции по настоящему изобретению также содержат в составе соединенияносители. Используемый в данном документе термин соединение-носитель или носитель может относится к нуклеиновой кислоте или ее аналогу, которые являются инертными (т.е. не обладают биологической активностью per se), но распознаются в качестве нуклеиновой кислоты in vivo процессами, которые снижают биодоступность нуклеиновой кислоты с биологической активностью, например, путем разрушения биологически активной нуклеиновой кислоты или путем содействия ее удалению из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, как правило, с избытком последнего вещества, может привести к существенному сокращению количества нуклеиновой кислоты, извлекаемого в печени, почках или других внесосудистых депо, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. Например, извлечение частично фосфоротиоатной dsRNA тканью печени может быть сокращено при ее совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо-4'-изотиоцианостильбен-2,2'-дисульфокислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).

vi. Наполнители.

В отличие от соединения-носителя фармацевтический носитель или наполнитель представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующее средство или любую другую фармакологически инертную среду для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм животного. Наполнитель может быть жидким или твердым веществом и его выбирают с учетом предполагаемого способа введения с тем, чтобы обеспечить необходимый объем, консистенцию и т.д. при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители включают без ограничения связывающие средства (например, прежелатинизированный маисовый крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или вторичный кислый фосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, кремнезем, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); разрыхлители (например, крахмал, натрия крахмалгликолат и т.д.) и смачивающие средства (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).

Также для составления композиций по настоящему изобретению можно применять фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного

- 72 045013 от парентерального, которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами.

Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.

Составы для местного введения нуклеиновых кислот могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в обычных растворителях, в таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Растворы также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Можно использовать фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами.

Подходящие фармацевтически приемлемые наполнители включают без ограничения воду, солевые растворы, спирт, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.

vii. Другие компоненты.

Композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, традиционно встречающиеся в фармацевтических композициях, при уровнях применения, установленных в данной области. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные материалы, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или могут содержать дополнительные материалы, применимые для физического составления композиций по настоящему изобретению в различных лекарственных формах, такие как красители, ароматизирующие вещества, консерванты, антиоксиданты, замутнители, загустители и стабилизаторы. Однако такие материалы при добавлении не должны в значительной степени препятствовать проявлению биологической активности компонентов композиций по настоящему изобретению. Составы могут быть стерильными и при необходимости их можно смешивать со вспомогательными средствами, например, смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, эмульгаторами, солями для воздействия на осмотическое давление, буферами, красящими веществами, ароматизаторами и/или отдушками и им подобными, которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновой(нуклеиновыми) кислотой(кислотами) состава.

Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, натрий карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, включают (а) одно или несколько соединений на основе iRNA и (b) одно или несколько средств, которые действуют по механизму, отличному от iRNA, и которые применимы в лечении гемолитического нарушения. Примеры таких средств включают без ограничения противовоспалительное средство, средства против стеатоза, противовирусное средство и/или средство против фиброза.

Кроме того, другие вещества, обычно используемые для защиты печени, такие как силимарин, также можно использовать в сочетании с iRNA, описанными в данном документе. Другие средства, применимые для лечения заболеваний печени, включают телбивудин, энтекавир и ингибиторы протеазы, такие как телапревир и другие, раскрытые, например, в публикациях заявок на патент США № 2005/0148548, 2004/0167116 и 2003/0144217, Tung et al., и в публикации заявки на патент США № 2004/0127488, Hale et al.

Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение доз для токсических и терапевтических эффектов представляет собой терапевтический индекс и его можно выразить как соотношение LD₅₀/ED₅₀. Предпочтительными являются соединения, которые характеризуются высоким терапевтическим индексом.

Данные, полученные в анализах с клеточными культурами и в исследованиях на животных, можно использовать при подборе диапазона доз для применения у людей. В настоящем изобретении доза композиций, описанных в данном документе, как правило, находится в диапазоне циркулирующих концентраций, который включает ED₅₀ с малой токсичностью или без таковой. Доза может варьироваться в этом диапазоне в зависимости от применяемых лекарственной формы и пути введения. Для любого соединения, применяемого в способах, описанных в настоящем изобретении, терапевтически эффективную дозу можно первоначально установить по результатам анализов с клеточными культурами. Доза может быть составлена для животных моделей с целью получения диапазона циркулирующей концентрации в плазме крови соединения или при необходимости полипептидного продукта целевой последовательности (например, достижения уменьшенной концентрации полипептида), что включает IC₅₀ (т.е. концентрацию исследуемого соединения, при которой достигается полумаксимальное ингибирование симптомов), определенную на клеточной культуре. Такую информацию можно использовать для более точного определения применимых у людей доз. Уровни в плазме крови можно измерять, например, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии.

- 73 045013

В дополнении к их введению, рассматриваемому выше, iRNA, описанные в настоящем изобретении, можно вводить в комбинации с другими известными средствами, эффективными в лечении патологических процессов, которые опосредованы экспрессией гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. экспрессией гена KLKB1, экспрессией гена F12 и/или экспрессии гена KNG1). В любом случае курирующий врач может корректировать количество и временные рамки введения iRNA, исходя из результатов, наблюдаемых при использовании стандартных средств для измерения эффективности, известных в данной области или описанных в данном документе.

VII. Способы ингибирования экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови.

В настоящем изобретении также предусмотрены способы ингибирования экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. гена KLKB1, гена F12 и/или гена KNG1), в клетке.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы ингибирования экспрессии гена KLKB1 в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт со средством для RNAi, например, двухнитевым средством для RNAi, в количестве, эффективном для ингибирования экспрессии KLKB1 в клетке, за счет чего осуществляется ингибирование экспрессии KLKB1 в клетке.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы ингибирования экспрессии гена F12 в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт со средством для RNAi, например, двухнитевым средством для RNAi, в количестве, эффективном для ингибирования экспрессии F12 в клетке, за счет чего осуществляется ингибирование экспрессии F12 в клетке.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы ингибирования экспрессии гена KNG1 в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт со средством для RNAi, например, двухнитевым средством для RNAi, в количестве, эффективном для ингибирования экспрессии KNG1 в клетке, за счет чего осуществляется ингибирование экспрессии KNG1 в клетке.

Приведение клетки в контакт с двухнитевым средством для RNAi, например, двухнитевым средством для RNAi, можно выполнять in vitro или in vivo. In vivo приведение клетки в контакт со средством для RNAi включает приведение клетки или группы клеток в организме субъекта, например субъектачеловека, в контакт со средством для RNAi. Также возможны комбинации способов приведения клетки в контакт in vitro и in vivo. Приведение клетки в контакт может быть непосредственным или опосредованным, как рассматривалось выше. Более того, приведение клетки в контакт можно выполнять посредством нацеливающего лиганда, в том числе любого лиганда, описанного в данном документе или известного в уровне техники. В предпочтительных вариантах осуществления нацеливающий лиганд представляет собой углеводный фрагмент, например лиганд, представляющий собой GalNAc₃, или любой другой лиганд, который направляет средство для RNAi к участку, представляющему интерес.

Термин ингибирование, используемый в данном документе, используют взаимозаменяемо со снижением, сайленсингом, подавлением, супрессией и другими подобными терминами, и он включает любой уровень ингибирования.

Подразумевается, что фраза ингибирование экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови относится к ингибированию экспрессии любого гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (такого как, например, ген мыши, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, ген крысы, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, ген обезьяны, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, или ген человека, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови), а также вариантов или мутантов гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови.

Подразумевается, что фраза ингибирование экспрессии KLKB1 относится к ингибированию экспрессии любого гена KLKB1 (такого как, например, ген KLKB1 мыши, ген KLKB1 крысы, ген KLKB1 обезьяны или ген KLKB1 человека), а также вариантов или мутантов гена KLKB1. Таким образом, ген KLKB1 может представлять собой ген KLKB1 дикого типа, мутантный ген KLKB1 (такой как мутантный ген KLKB1, который является причиной амилоидного отложения) или трансгенный ген KLKB1 в контексте клетки, группы клеток или организма, подвергнутых генетической манипуляции.

Ингибирование экспрессии гена KLKB1 включает любой уровень ингибирования гена KLKB1, например, по меньшей мере, частичную супрессию экспрессии гена KLKB1. Экспрессию гена KLKB1 можно оценивать исходя из уровня или изменения уровня любой переменной, ассоциированной с экспрессией гена KLKB1, например, уровня мРНК KLKB1, уровня белка KLKB1 или количества или степени амилоидных отложений. Данный уровень можно оценивать в отдельной клетке или в группе клеток, в том числе, например, в образце, полученном от субъекта.

Подразумевается, что фраза ингибирование экспрессии F12 относится к ингибированию экспрессии любого гена F12 (такого как, например, гена F12 мыши, гена F12 крысы, гена F12 обезьяны или гена F12 человека), а также вариантов или мутантов гена F12. Таким образом, ген F12 может представлять собой ген F12 дикого типа, мутантный ген F12 (такой как мутантный ген F12) или трансгенный ген F12 в контексте клетки, группы клеток или организма, подвергнутых генетической манипуляции.

Ингибирование экспрессии гена F12 включает любой уровень ингибирования гена F12, например,

- 74 045013 по меньшей мере, частичную супрессию экспрессии гена F12. Экспрессию гена F12 можно оценивать исходя из уровня или изменения уровня любой переменной, ассоциированной с экспрессией гена F12, например, уровня мРНК F12, уровня белка F12 или количества или степени амилоидных отложений.

Данный уровень можно оценивать в отдельной клетке или в группе клеток, в том числе, например, в образце, полученном от субъекта.

Подразумевается, что фраза ингибирование экспрессии KNG1 относится к ингибированию экспрессии любого гена KNG1 (такого как, например, гена KNG1 мыши, гена KNG1 крысы, гена KNG1 обезьяны или гена KNG1 человека), а также вариантов или мутантов гена KNG1. Таким образом, ген KNG1 может представлять собой ген KNG1 дикого типа, мутантный ген KNG1 (такой как мутантный ген KNG1) или трансгенный ген KNG1 в контексте клетки, группы клеток или организма, подвергнутых генетической манипуляции.

Ингибирование экспрессии гена KNG1 включает любой уровень ингибирования гена KNG1, например, по меньшей мере, частичную супрессию экспрессии гена KNG1. Экспрессию гена KNG1 можно оценивать исходя из уровня или изменения уровня любой переменной, ассоциированной с экспрессией гена KNG1, например, уровня мРНК KNG1, уровня белка KNG1 или количества или степени амилоидных отложений. Данный уровень можно оценивать в отдельной клетке или в группе клеток, в том числе, например, в образце, полученном от субъекта.

Ингибирование можно оценивать по снижению абсолютного или относительного уровня одной или нескольких переменных, которые ассоциированы с экспрессией гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольным уровнем может быть любой тип контрольного уровня, который используют в данной области, например исходный уровень до введения дозы или уровень, определенный у подобного субъекта, клетки или образца, которые не обработаны или обработаны контролем (таким как, например, контроль только с буфером или контроль с неактивным средством).

В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению экспрессия гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. гена KLKB1, гена F12 и/или гена KNG1), ингибируется по меньшей мере на приблизительно 5%, по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 15%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 25%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 35%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 45%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 55%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 65%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 75%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 85%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 91%, по меньшей мере на приблизительно 92%, по меньшей мере на приблизительно 93%, по меньшей мере на приблизительно 94%, по меньшей мере на приблизительно 95%, по меньшей мере на приблизительно 96%, по меньшей мере на приблизительно 97%, по меньшей мере на приблизительно 98% или по меньшей мере на приблизительно 99%.

Доказательством ингибирования экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, может служить снижение количества мРНК, экспрессируемой первой клеткой или первой группой клеток (такие клетки могут присутствовать, например, в образце, полученном от субъекта), в которых транскрибируется ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, и которую или которые обрабатывали (например, посредством приведения клетки или клеток в контакт со средством для RNAi по настоящему изобретению или посредством введения средства для RNAi по настоящему изобретению субъекту, в организме которого клетки находятся или находились) так, что экспрессия гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, ингибируется по сравнению со второй клеткой или второй группой клеток, по сути, идентичных первой клетке или группе клеток, но которую или которые не обрабатывали (контрольная(контрольные) клетка(клетки)). В предпочтительных вариантах осуществления ингибирование оценивают посредством выражения уровня мРНК в обработанных клетках как процент от уровня мРНК в контрольных клетках с помощью следующей формулы:

(мРНК в контрольных клетках) - (мРНК в обработанных клетках) * (мРНК в контрольных клетках)

В качестве альтернативы ингибирование экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, можно оценивать по снижению показателя, который функционально связан с экспрессией гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, например, с экспрессией белка KLKB1, экспрессией белка F12, экспрессией белка KNG1, отложением фибрина, образованием тромба или уровнем брадикинина. Сайленсинг гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, можно выявить в любой клетке, экспрессирующей ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, либо конститутивно, либо с помощью генной инженерии, и с помощью любого анализа, известного в данной области.

- 75 045013

Доказательством ингибирования экспрессии белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, может служить снижение уровня белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, который экспрессируется клеткой или группой клеток (например, уровня белка, экспрессируемого в образце, полученном от субъекта). Как объяснялось выше в отношении оценки супрессии мРНК, ингибирование уровней экспрессии белка в обработанной клетке или обработанной группе клеток можно аналогично выражать как процент от уровня белка в контрольной клетке или группе контрольных клеток.

Контрольная клетка или контрольная группа клеток, которые можно использовать для оценки ингибирования экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, включают клетку или группу клеток, которые еще не были в контакте со средством для RNAi по настоящему изобретению. Например, контрольная клетка или контрольная группа клеток могут быть получены от отдельного субъекта (например, субъекта-человека или субъекта-животного) перед лечением субъекта средством для RNAi.

Уровень мРНК гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, которая экспрессируется клеткой или группой клеток, или уровень циркулирующей мРНК гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, можно определять с применением любого способа, известного в данной области, для оценки экспрессии мРНК. В одном варианте осуществления уровень экспрессии в образце гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, определяют путем выявления транскрибируемого полинуклеотида или его части, например мРНК гена KLKB1, мРНК гена F12 и/или мРНК гена KNG1. РНК можно извлекать из клеток с помощью методик извлечения РНК, включая, например, извлечение с помощью кислого фенола/гуанидинизотиоцианата (RNAzol В; Biogenesis), наборы для получения РНК RNeasy (Qiagen) или PAXgene (PreAnalytix, Швейцария). Типичные форматы анализов, в которых используется гибридизация рибонуклеиновых кислот, включают ядерные run-on анализы, RT-PCR, анализы с защитой от РНКаз (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), нозернблоттинг, гибридизацию in situ и анализы с использованием микрочипов. Циркулирующую мРНК KLKB1 можно выявить с помощью способов, описанных в PCT/US2012/043584, полное содержание которой настоящим включено в данный документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления уровень экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, определяют с помощью зонда для нуклеиновой кислоты. Термин зонд, используемый в данном документе, относится к любой молекуле, которая способна избирательно связываться со специфичным геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови. Зонды могут быть синтезированы специалистом в данной области или получены из соответствующих биологических препаратов. Специально можно сконструировать зонды, содержащие метку. Примеры молекул, которые можно использовать в качестве зондов, включают без ограничения РНК, ДНК, белки, антитела и органические молекулы.

Выделенные мРНК можно использовать в анализах на основе гибридизации или амплификации, которые включают без ограничения блоттинг по Саузерну или нозерн-блот-анализы, анализы на основе полимеразной цепной реакции (PCR) и анализы с применением матриц с зондами. Один способ определения уровней мРНК включает приведение выделенной мРНК в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты (зондом), которая может гибридизоваться с мРНК KLKB1. В одном варианте осуществления мРНК иммобилизуют на твердой поверхности и приводят в контакт с зондом, например, путем разделения выделенной мРНК в агарозном геле и переноса мРНК из геля на мембрану, например, нитроцеллюлозную. В альтернативном варианте осуществления зонд(зонды) иммобилизуют на твердой поверхности и мРНК приводят в контакт с зондом(зондами), например на матрице GeneChip от Affymetrix. Специалист в данной области может легко адаптировать известные способы выявления мРНК для применения в определении уровня мРНК гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови.

Альтернативный способ определения уровня экспрессии в образце гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, включает способ амплификации нуклеиновой кислоты и/или обратной транскрипции (с получением кДНК), например мРНК, в образце, например, с помощью RT-PCR (экспериментальный вариант осуществления, изложенный в Mullis, 1987, патенте США № 4683202), лигазной цепной реакции (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), самоподдерживающейся репликации последовательности (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), системы транскрипционной амплификации (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), репликазы Q-бета (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), репликации по типу катящегося кольца (Lizardi et al., патент США № 5854033), или любой другой способ амплификации нуклеиновой кислоты с последующим обнаружением амплифицированных молекул при помощи методик, хорошо известных специалисту в данной области. Такие схемы выявления особенно применимы для выявления молекул нуклеиновой кислоты, если такие молекулы присутствуют в очень малых количествах. В конкретных аспектах настоящего изобретения уровень экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, определяют с помощью количественной флюорогенной RT-PCR (т.е. системы TaqMan™).

Уровни экспрессии мРНК гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, можно контролировать с применением мембранного блота (как, например, используемого в анализе на

- 76 045013 основе гибридизации, такого как нозерн, Саузерн, дот и т.п.) или микролунок, опытных пробирок, гелей, гранул или волокон (или любой твердой подложки, содержащей связанные нуклеиновые кислоты). См.

патенты США № 5770722, 5874219, 5744305, 5677195 и 5445934, которые включены в данный документ посредством ссылки. Определение уровня экспрессии KLKB1 также может включать использование зондов для нуклеиновой кислоты в растворе.

В предпочтительных вариантах осуществления уровень экспрессии мРНК оценивают с применением анализов с разветвленной ДНК (bDNA) или ПЦР в режиме реального времени (qPCR). Применение таких способов описано и проиллюстрировано в разделе Примеры, представленном в данном документе.

Уровень экспрессии белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, можно определять с помощью любого способа, известного в данной области, для измерения уровней белка. Такие способы предусматривают, например, электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), тонкослойную хроматографию (TLC), гипердиффузионную хроматографию, реакции преципитации в жидкости или геле, абсорбционную спектроскопию, колориметрические анализы, спектрофотометрические анализы, проточную цитометрию, иммунодиффузию (одиночную или двойную), иммуноэлектрофорез, вестерн-блоттинг, радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), иммунофлюоресцентные анализы, электрохемилюминисцентные анализы и им подобные.

В некоторых вариантах осуществления эффективность способов по настоящему изобретению можно наблюдать путем выявления или отслеживания ослабления симптома заболевания, ассоциированного с внутренним путем активации свертывания крови, как, например: ослабления эдемы конечностей, лица, гортани, верхних дыхательных путей, живота, туловища и половых органов, продрома; опухания гортани; незудящей сыпи; тошноты; рвоты; боли в животе. Эти симптомы можно оценивать in vitro или in vivo с помощью любого способа, известного в данной области.

Термин образец, используемый в данном документе, относится к отбору схожих жидкостей, клеток или тканей, выделенных из организма субъекта, а также жидкостей, клеток или тканей, присутствующих в организме субъекта. Примеры биологических жидкостей включают кровь, сыворотку крови и серозные жидкости, плазму крови, лимфу, мочу, спинномозговую жидкость, слюну, внутриглазные жидкости и им подобные. Образцы тканей могут включать образцы из тканей, органов или локальных участков. Например, образцы можно получить из конкретных органов, частей органов или жидкостей или клеток в этих органах. В определенных вариантах осуществления образцы могут быть получены из печени (например, всей печени, или из определенных сегментов печени, или определенных типов клеток печени, таких как, например, гепатоциты), сетчатки или части сетчатки (например, пигментного эпителия сетчатки), центральной нервной системы или частей центральной нервной системы (например, желудочков или хороидного сплетения) или поджелудочной железы или определенных клеток или частей поджелудочной железы. В предпочтительных вариантах осуществления образец, полученный от субъекта означает кровь или плазму крови, взятые у субъекта. В дополнительных вариантах осуществления образец, полученный от субъекта относится к ткани печени или ткани сетчатки, полученных от субъекта.

В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению средство для RNAi вводят субъекту так, что средство для RNAi доставляется к конкретному участку в организме субъекта. Ингибирование экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, можно оценивать с помощью измерения уровня или изменения уровня мРНК гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, или белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, в образце, полученном из жидкости или ткани из конкретного участка в организме субъекта. В предпочтительных вариантах осуществления участок выбран из группы, состоящей из печени, хороидного сплетения, сетчатки и поджелудочной железы. Участок также может представлять собой группу или подгруппу клеток из любого из указанных выше участков. Участок также может включать клетки, которые экспрессируют конкретный тип рецептора.

VIII. Способы лечения или предупреждения заболеваний, ассоциированных с контактным путем активации свертывания крови.

В настоящем изобретении предусмотрены терапевтические и профилактические способы, которые включают введение субъекту с заболеванием, нарушением и/или состоянием, связанными с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, или с предрасположенностью к развитию заболевания, нарушения и/или состояния, ассоциированных с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, композиций, содержащих средство на основе iRNA (т.е. средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген F12, средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KNG1, или комбинация любого из вышеперечисленных, т.е. комбинация средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, или комбинация средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинация средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинация средства на основе iRNA, целенаправленно воз- 77 045013 действующего на ген KLKB1, средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1), или фармацевтических композиций, содержащих средство на основе iRNA (т.е. средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген F12, средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KNG1, или комбинация любого из вышеперечисленных), или векторов, содержащих iRNA (т.е. средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген F12, средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KNG1, или комбинация любого из вышеперечисленного) по настоящему изобретению. Неограничивающие примеры заболеваний, ассоциированных с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, включают, например, тромбофилию, наследственный ангионевротический отек (HAE) (такой как наследственный ангионевротический отек I типа; наследственный ангионевротический отек II типа; наследственный ангионевротический отек III типа; или любой другой наследственный ангионевротический отек, вызванный повышенными уровнями брадикинина), дефицит прекалликреина, злокачественную первичную гипертензию, гипертензию, терминальную стадию почечной недостаточности, дефицит фактора Флетчера, эдему конечностей, лица, гортани, верхних дыхательных путей, живота, туловища и половых органов, продром; опухание гортани; незудящую сыпь; тошноту; рвоту; боль в животе.

В одном варианте осуществления заболевание, ассоциированное с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой тромбофилию. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой HAE. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой дефицит прекалликреина. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой злокачественную первичную гипертензию. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой гипертензию. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой терминальную стадию почечной недостаточности. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, представляет собой дефицит фактора Флетчера.

Способы по настоящему изобретению для лечения субъекта с заболеванием, ассоциированным с геном, вовлеченным в контактный путь активации свертывания крови, например, субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие снижение уровня экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, и/или продуцирования белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы снижения уровня экспрессии гена плазменного калликреина В1 (фактора Флетчера) (KLKB1) у субъекта с наследственным ангионевротическим отеком (HAE). В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы снижения уровня белка KLKB1 у субъекта с HAE. В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы снижения уровня экспрессии гена фактора XII (фактора Хагемана) (F12) у субъекта с наследственным ангионевротическим отеком (HAE). В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы снижения уровня белка F12 у субъекта с HAE. В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы снижения уровня экспрессии гена кининогена 1 (KNG1) у субъекта с наследственным ангионевротическим отеком (HAE). В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы снижения уровня белка KNG1 у субъекта с HAE.

В настоящем изобретении также предусмотрены способы снижения уровня брадикинина у субъекта с заболеванием, ассоциированным с внутренним путем активации свертывания крови, например с тромбофилией или наследственным ангионевротическим отеком. Например, в одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы снижения уровня брадикинина у субъекта с наследственным ангионевротическим отеком, которые включают введение субъекту терапевтически эффективного количества или профилактически эффективного количества средства на основе dsRNA по настоящему изобретению, (т.е. средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации любого из вышеперечисленных, т.е. комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1), или фармацевтической композиции или вектора, содержащих такие средства, или комбинации таких средств.

- 78 045013

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения субъекта с заболеванием, ассоциированным с контактным путем активации свертывания крови, например, с тромбофилией, наследственным ангионевротическим отеком I типа; наследственным ангионевротическим отеком II типа; наследственным ангионевротическим отеком III типа; любым другим наследственным ангионевротическим отеком, вызванным повышенными уровнями брадикинина. В одном варианте осуществления способы лечения (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1. В другом варианте осуществления способы лечения (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген F12, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген F12, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген F12. В еще одном варианте осуществления способы лечения (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KNG1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KNG1. В других вариантах осуществления способы лечения (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например, человеку, терапевтически эффективного количества комбинации средств на основе dsRNA по настоящему изобретению, (т.е. комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1), или фармацевтической композиции или вектора, содержащих такие средства, или комбинации таких средств.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения субъекта с HAE. В одном варианте осуществления способы (и применения) по настоящему изобретению для лечения субъекта с HAE включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген F12, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген F12, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген F12. В другом варианте осуществления способы (и применения) по настоящему изобретению для лечения субъекта с HAE включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1. В еще одном варианте осуществления способы (и применения) по настоящему изобретению для лечения субъекта с HAE включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KNG1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KNG1. В других вариантах осуществления способы (и применения) по настоящему изобретению для лечения субъекта с HAE включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества комбинации средств на основе dsRNA по настоящему изобретению, (т.е. комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1), или фармацевтической композиции или вектора, со

- 79 045013 держащих такие средства, или комбинации таких средств.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения субъекта с тромбофилией. В одном варианте осуществления способы (и применения) по настоящему изобретению для лечения субъекта с тромбофилией включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген F12, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген F12, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген F12. В другом варианте осуществления способы (и применения) по настоящему изобретению для лечения субъекта с тромбофилией включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1. В еще одном варианте осуществления способы (и применения) по настоящему изобретению для лечения субъекта с тромбофилией включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KNG1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KNG1. В других вариантах осуществления способы (и применения) по настоящему изобретению для лечения субъекта с тромбофилией включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества комбинации средств на основе dsRNA по настоящему изобретению, (т.е. комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1), или фармацевтической композиции или вектора, содержащих такие средства, или комбинации таких средств.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта с заболеванием, ассоциированным с контактным путем активации свертывания крови, например, с тромбофилией, наследственным ангионевротическим отеком (HAE), например с наличием повышенного брадикинина, эдемы конечностей, лица, гортани, верхних дыхательных путей, живота, туловища и половых органов, продрома; опухания гортани; незудящей сыпи; тошноты; рвоты; боли в животе. Способы включают введение субъекту профилактически эффективного количества средства на основе iRNA, например dsRNA, фармацевтических композиций или векторов по настоящему изобретению, за счет чего обеспечивается предупреждение по меньшей мере одного симптома у субъекта с заболеванием, ассоциированным с контактным путем активации свертывания крови. В одном варианте осуществления способы профилактики (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1. В другом варианте осуществления профилактические способы (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген F12, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген F12, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген F12. В еще одном варианте осуществления профилактические способы (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KNG1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KNG1. В других вариантах осуществления профилактические способы (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества комбинации средств на основе dsRNA по настоящему изобретению (т.е. комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно

- 80 045013 воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1), или фармацевтической композиции или вектора, содержащих такие средства, или комбинации таких средств.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы предупреждения образования тромба у субъекта с риском образования тромба. Способы включают введение субъекту профилактически эффективного количества средства на основе iRNA, например dsRNA, фармацевтических композиций или векторов по настоящему изобретению, за счет чего обеспечивается предупреждение образования тромба у субъекта с риском образования тромба. В одном варианте осуществления способы профилактики (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB 1. В другом варианте осуществления профилактические способы (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген F12, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген F12, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген F12. В еще одном варианте осуществления профилактические способы (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KNG1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KNG1. В других вариантах осуществления профилактические способы (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества комбинации средств на основе dsRNA по настоящему изобретению (т.е. комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1), или фармацевтической композиции или вектора, содержащих такие средства, или комбинации таких средств.

Субъекты с риском образования тромба включают пациентов хирургического профиля (например, субъектов, которые перенесли общее хирургическое вмешательство, стоматологическое хирургическое вмешательство, ортопедическое хирургическое вмешательство (например, хирургическое вмешательство по протезированию коленного сустава или тазобедренного сустава), хирургическое вмешательство в связи с травмой, онкологическое хирургическое вмешательство); пациентов, получающих терапию (например, субъектов с заболеванием, требующим обездвиживания, например, субъектов, соблюдающих постельный режим более трех дней, и/или субъектов с долгосрочным применением внутривенного катетера; субъектов с фибрилляцией предсердий; субъектов пожилого возраста; субъектов с нарушением функции почек; субъектов с искусственным клапаном сердца; субъектов с сердечной недостаточностью; субъектов с раком); беременных субъектов; субъектов в послеродовом периоде; субъектов, у которых ранее уже был тромб; субъектов, получающих гормонозаместительную терапию; субъектов, находящихся в сидячем положение в течение длительных периодов времени, например, в самолете или автомобиле; и субъектов с ожирением.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы предупреждения приступа ангионевротического отека у субъекта с HAE. Способы включают введение субъекту профилактически эффективного количества средства на основе iRNA, например dsRNA, фармацевтических композиций или векторов по настоящему изобретению, за счет чего обеспечивается предупреждение образования тромба у субъекта с риском образования тромба. В одном варианте осуществления способы профилактики (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, или век

- 81 045013 тора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1. В другом варианте осуществления профилактические способы (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген F12, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген F12, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген F12. В еще одном варианте осуществления профилактические способы (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген KNG1, или вектора по настоящему изобретению, содержащего средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KNG1. В других вариантах осуществления профилактические способы (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, профилактически эффективного количества комбинации средств на основе dsRNA по настоящему изобретению (т.е. комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или комбинации средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген F12, и средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующего на ген KNG1), или фармацевтической композиции или вектора, содержащих такие средства, или комбинации таких средств.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению для лечения субъекта, например, субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена KLKB1.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению для лечения субъекта, например, субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена F12.

В еще одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения терапевтически эффективного количества средства на основе iRNA по настоящему изобретению для лечения субъекта, например, субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена KNG1.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения средства на основе iRNA, например dsRNA, по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KLKB1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, в изготовлении лекарственного препарата для лечения субъекта, например, субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена KLKB1 и/или продуцирования белка KLKB1, такого как субъект с нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии гена KLKB1, например, с заболеванием, ассоциированным с внутренним путем активации свертывания крови.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения средства на основе iRNA, например dsRNA, по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген F12, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген F12, в изготовлении лекарственного препарата для лечения субъекта, например субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена F12 и/или продуцирования белка F12, такого как субъект с нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии гена F12, например, с заболеванием, ассоциированным с внутренним путем активации свертывания крови.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения средства на основе iRNA, например dsRNA, по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген KNG1, или фармацевтической композиции, содержащей средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KNG1, в изготовлении лекарственного препарата для лечения субъекта, например субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена KNG1 и/или продуцирования белка KNG1, такого как субъект с нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии гена KNG1, например, с заболеванием, ассоциированным с внутренним путем активации свертывания крови.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения iRNA, например dsRNA, по настоящему изобретению, для предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдаю- 82 045013 щего нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена KLKB1 и/или продуцирования белка KLKB1.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения iRNA, например dsRNA, по настоящему изобретению, для предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена F12 и/или продуцирования белка F12.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения iRNA, например dsRNA, по настоящему изобретению, для предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена KNG1 и/или продуцирования белка KNG1.

В дополнительном аспекте в изобретении предусмотрены применения средства на основе iRNA по настоящему изобретению в изготовлении лекарственного препарата для предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена KLKB1 и/или продуцирования белка KLKB1, таким как заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови.

В одном варианте осуществления средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на KLKB1, вводят субъекту с наследственным ангионевротическим отеком (HAE) и/или ассоциированным с KLKB1 заболеванием так, что экспрессия гена KLKB1, например, в клетке, ткани, крови или другой ткани или жидкости субъекта, снижается по меньшей мере на приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,

48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,

78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или по меньшей мере на при- близительно 99% или больше при введении субъекту средства на основе dsRNA.

Способы и применения по настоящему изобретению включают введение композиции, описанной в данном документе, так, что экспрессия целевого гена KLKB1 понижается, как, например, на приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76 или на приблизительно 80 ч. В одном варианте осуществления экспрессия целевого гена KLKB1 понижается на длительный срок, например, по меньшей мере на приблизительно два, три, четыре, пять, шесть, семь дней или дольше, например, на приблизительно одну неделю, две недели, три недели или на приблизительно четыре недели или дольше.

В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения средства на основе iRNA по настоящему изобретению в изготовлении лекарственного препарата для предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена F12 и/или продуцирования белка F12, таким как заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови.

В одном варианте осуществления средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на F12, вводят субъекту с наследственным ангионевротическим отеком (HAE) и/или заболеванием, ассоциированным с контактным путем активации свертывания крови, так, что экспрессия гена F12, например, в клетке, ткани, крови или другой ткани или жидкости субъекта, снижается по меньшей мере на приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,

35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64,

65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,

95, 96, 97, 98% или по меньшей мере на приблизительно 99% или больше при введении субъекту средст- ва на основе dsRNA.

Способы и применения по настоящему изобретению включают введение композиции, описанной в данном документе, так, что экспрессия целевого гена F12 понижается, как, например, на приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76 или приблизительно 80 ч. В одном варианте осуществления экспрессия целевого гена F12 понижается на длительный срок, например, по меньшей мере на приблизительно два, три, четыре, пять, шесть, семь дней или дольше, например, на приблизительно одну неделю, две недели, три недели или на приблизительно четыре недели или дольше.

В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены применения средства на основе iRNA по настоящему изобретению в изготовлении лекарственного препарата для предупреждения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, на которое будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена KNG1 и/или продуцирования белка KNG1, таким как заболевание, ассоциированное с контактным путем активации свертывания крови.

В одном варианте осуществления средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на KNG1, вводят субъекту с наследственным ангионевротическим отеком (HAE) и/или заболеванием, ассоциированным с внутренним путем активации свертывания крови, так, что экспрессия гена KNG1, например, в клетке, ткани, крови или другой ткани или жидкости субъекта, снижается по меньшей мере на приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64,

- 83 045013

95, 96, 97, 98%, или по меньшей мере на приблизительно 99% или больше при введении субъекту средства на основе dsRNA.

Способы и применения по настоящему изобретению включают введение композиции, описанной в данном документе, так, что экспрессия целевого гена KNG1 понижается, как, например, на приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76 или на приблизительно 80 ч. В одном варианте осуществления экспрессия целевого гена KNG1 понижается на длительный срок, например, по меньшей мере на приблизительно два, три, четыре, пять, шесть, семь дней или дольше, например, на приблизительно одну неделю, две недели, три недели или на приблизительно четыре недели или дольше.

Введение dsRNA в соответствии со способами и применениями по настоящему изобретению может приводить в результате к снижению тяжести, ослаблению выраженности признаков, симптомов и/или маркеров таких заболеваний или нарушений у пациента с наследственным ангионевротическим отеком (HAE) и/или заболеванием, ассоциированным с контактным путем активации свертывания крови. Под снижением в данном контексте подразумевается статистически значимое снижение такого уровня. Снижение может составлять, например, по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или приблизительно 1о0%.

Эффективность лечения или предупреждения заболевания можно оценивать, например, путем измерения прогрессирования заболевания, ремиссии заболевания, тяжести симптомов, уменьшения боли, оценки качества жизни, дозы лекарственного препарата, необходимой для поддержания эффекта лечения, уровня маркера заболевания или любого другого измеряемого параметра, соответствующего указанному заболеванию, лечение которого осуществляют или предупреждение которого предусматривают. Контролирование эффективности лечения или предупреждения путем измерения любого из таких параметров или любой комбинации параметров находится в компетенции специалиста в данной области. Например, эффективность лечения HAE можно оценивать, к примеру, с помощью периодического контроля симптомов HAE или уровней брадикинина. Путем сравнения последующих данных с исходными данными врач получает указание того, является ли лечение эффективным. Контролирование эффективности лечения или предупреждения путем измерения любого из таких параметров или любой комбинации параметров находится в компетенции специалиста в данной области. Что касается введения iRNA, целенаправленно воздействующей на ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, или содержащей ее фармацевтической композиции, то эффективная в отношении заболевания, ассоциированного с контактным путем активации свертывания крови, указывает на то, что введение клинически приемлемым способом приводит в результате к благоприятному эффекту, по меньшей мере, у статистически значимой доли пациентов, к такому как ослабление симптомов, излечение, уменьшение выраженности заболевания, увеличение продолжительности жизни, улучшение качества жизни или к другому эффекту, обычно считающемуся положительным врачом, имеющим представление о лечении HAE и/или заболевания, ассоциированного с контактным путем активации свертывания крови, и подобными случаями.

Лечебный или превентивный эффект является очевидным, когда наблюдается статистически значимое улучшение одного или нескольких параметров патологического состояния, или когда отсутствует усугубление или развитие симптомов в тех случаях, когда их прогнозировали при иных обстоятельствах. В качестве примера показателем эффективного лечения может служить благоприятное изменение измеряемого параметра заболевания по меньшей мере на 10% и предпочтительно по меньшей мере на 20%, на 30, на 40, на 50% или больше. Об эффективности данного лекарственного средства на основе iRNA или состава с таким лекарственным средством можно также судить при помощи экспериментальной животной модели данного заболевания, которая известна в данной области. При использовании экспериментальной животной модели эффективность лечения доказана в том случае, когда наблюдают статистически значимое снижение маркера или ослабление симптома.

Субъектам можно вводить терапевтическое количество iRNA, как, например: приблизительно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 мг/кг dsRNA, 2,6 мг/кг dsRNA, 2,7 мг/кг dsRNA, 2,8 мг/кг dsRNA, 2,9 мг/кг dsRNA, 3,0 мг/кг dsRNA, 3,1 мг/кг dsRNA, 3,2 мг/кг dsRNA, 3,3 мг/кг dsRNA, 3,4 мг/кг dsRNA, 3,5 мг/кг dsRNA, 3,6 мг/кг dsRNA, 3,7 мг/кг dsRNA, 3,8 мг/кг dsRNA, 3,9 мг/кг dsRNA, 4,0 мг/кг dsRNA, 4,1 мг/кг dsRNA, 4.2 мг/кг dsRNA, 4,3 мг/кг dsRNA, 4,4 мг/кг dsRNA, 4,5 мг/кг dsRNA, 4,6 мг/кг dsRNA, 4,7 мг/кг dsRNA, 4,8 мг/кг dsRNA, 4,9 мг/кг dsRNA, 5,0 мг/кг dsRNA, 5,1 мг/кг dsRNA, 5,2 мг/кг dsRNA, 5,3 мг/кг dsRNA, 5,4 мг/кг dsRNA, 5,5 мг/кг dsRNA, 5,6 мг/кг dsRNA, 5,7 мг/кг dsRNA, 5,8 мг/кг dsRNA, 5,9 мг/кг dsRNA, 6,0 мг/кг dsRNA, 6,1 мг/кг dsRNA, 6,2 мг/кг dsRNA, 6,3 мг/кг dsRNA, 6,4 мг/кг dsRNA, 6,5 мг/кг dsRNA, 6,6 мг/кг dsRNA, 6,7 мг/кг dsRNA, 6,8 мг/кг dsRNA, 6,9 мг/кг dsRNA, 7,0 мг/кг dsRNA, 7,1 мг/кг dsRNA, 7,2 мг/кг dsRNA, 7,3 мг/кг dsRNA, 7,4 мг/кг dsRNA, 7,5 мг/кг dsRNA, 7,6 мг/кг dsRNA, 7,7 мг/кг dsRNA, 7,8 мг/кг dsRNA, 7,9 мг/кг dsRNA, 8,0 мг/кг dsRNA, 8,1 мг/кг dsRNA, 8,2 мг/кг dsRNA, 8,3 мг/кг dsRNA, 8,4 мг/кг dsRNA, 8,5 мг/кг dsRNA, 8,6 мг/кг dsRNA, 8,7 мг/кг dsRNA, 8,8 мг/кг dsRNA, 8,9 мг/кг dsRNA, 9,0 мг/кг dsRNA, 9,1 мг/кг dsRNA, 9,2 мг/кг dsRNA, 9,3 мг/кг

- 84 045013 dsRNA, 9,4 мг/кг dsRNA, 9,5 мг/кг dsRNA, 9,6 мг/кг dsRNA, 9,7 мг/кг dsRNA, 9,8 мг/кг dsRNA, 9,9 мг/кг dsRNA, 9,0 мг/кг dsRNA, 10 мг/кг dsRNA, 15 мг/кг dsRNA, 20 мг/кг dsRNA, 25 мг/кг dsRNA, 30 мг/кг dsRNA, 35 мг/кг dsRNA, 40 мг/кг dsRNA, 45 мг/кг dsRNA или приблизительно 50 мг/кг dsRNA. В одном варианте осуществления субъектам можно вводить 0,5 мг/кг dsRNA. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также считаются частью настоящего изобретения.

В определенных вариантах осуществления, например, если композиция по настоящему изобретению содержит описанную в данном документе dsRNA и липид, субъектам можно вводить терапевтическое количество iRNA, как например: от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,2 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,2 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,3 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,3 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,4 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,4 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 1,5 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 1,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 2,5 мг/кг, от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 3 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 3 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 3,5 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 4 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 4,5 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 4 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 4,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 5,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно б мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 6,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 7 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 7,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 8 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 8,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 9 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 9,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также считаются частью настоящего изобретения.

Например, dsRNA можно вводить в дозе, составляющей приблизительно

0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9

или приблизительно 10 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также считаются частью настоящего изобретения.

В других вариантах осуществления, например, где композиция по настоящему изобретению содержит описанную в данном документе dsRNA и N-ацетилгалактозамин, субъектам можно вводить терапевтическое количество iRNA, как, например: дозу, составляющую от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 30 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 45 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизи- 85 045013 тельно 45 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 30 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 4 0 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 30 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 35 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 3 0 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 15 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 25 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,25 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,75 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 2 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 2,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 3 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 3,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 4 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 4,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 7,5 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 10 до приблизительно 20 мг/кг или от приблизительно 15 до приблизительно 20 мг/кг. В одном варианте осуществления, где композиция по настоящему изобретению содержит описанную в данном документе dsRNA и N-ацетилгалактозамин, субъекту можно вводить терапевтическое количество, составляющее от приблизительно 10 до приблизительно 30 мг/кг dsRNA. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также считаются частью настоящего изобретения.

Например, субъектам можно вводить терапевтическое количество iRNA, как, например, приблизи тельно

0,1, 0,2,0,3,

0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5,1,6,

1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9,

3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1,4,2,

4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4,5,5,

5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7,6,8,

6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,8,1,

8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3,9,4,

9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5,

14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20,

20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25, 5, 26,

26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35,

36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или приблизительно 50 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также считаются частью настоящего изобретения.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения, например, когда двухнитевое средство для RNAi включает в себя модификацию (например, один или несколько мотивов из трех иден

- 86 045013 тичных модификаций трех последовательных нуклеотидов), включающую один такой мотив в сайте расщепления средства или рядом с ним, шесть фосфоротиоатных связей и лиганд, такое средство вводят в дозе, составляющей от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,4 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,3 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,2 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 0,09 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 0,08 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 0,07 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 0,06 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,4 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,3 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,2 мг/кг, от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,1 мг/кг, от приблизительно 0,02 мг/кг до приблизительно 0,09 мг/кг, от приблизительно 0,02 мг/кг до приблизительно 0,08 мг/кг, от приблизительно 0,02 мг/кг до приблизительно 0,07 мг/кг, от приблизительно 0,02 мг/кг до приблизительно 0,06 мг/кг, от приблизительно 0,02 мг/кг до приблизительно 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,4 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,3 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,2 мг/кг, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,1 мг/кг, от приблизительно 0,03 мг/кг до приблизительно 0,09 мг/кг, от приблизительно 0,03 мг/кг до приблизительно 0,08 мг/кг, от приблизительно 0,03 мг/кг до приблизительно 0,07 мг/кг, от приблизительно 0,03 мг/кг до приблизительно 0,06 мг/кг, от приблизительно 0,03 мг/кг до приблизительно 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,4 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,3 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,2 мг/кг, от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,1 мг/кг, от приблизительно 0,04 мг/кг до приблизительно 0,09 мг/кг, от приблизительно 0,04 мг/кг до приблизительно 0,08 мг/кг, от приблизительно 0,04 мг/кг до приблизительно 0,07 мг/кг, от приблизительно 0,04 мг/кг до приблизительно 0,06 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,4 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,3 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,2 мг/кг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мг/кг, от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 0,09 мг/кг, от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 0,08 мг/кг или от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 0,07 мг/кг. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к вышеупомянутым значениям, также считаются частью настоящего изобретения, например, средство для RNAi можно вводить субъекту в дозе, составляющей от приблизительно 0,015 мг/кг до приблизительно 0,45 мг/кг.

Например, средство для RNAi, например средство для RNAi в фармацевтической композиции, можно вводить в дозе, составляющей приблизительно 0,01, 0,0125, 0,015, 0,0175, 0,02, 0,0225, 0,025, 0,0275, 0,03, 0,0325, 0,035, 0,037 5, 0,04, 0,0425, 0,045, 0,0475, 0,05, 0,0525, 0,055, 0,0575, 0,06, 0,0625, 0,065, 0,0675, 0,07, 0,0725, 0,075, 0,0775, 0,08, 0,0825, 0,085, 0,0875, 0,09, 0,0925, 0,095, 0,0975, 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,225, 0,25, 0,275, 0,3, 0,325, 0,35, 0,375, 0,4, 0,425, 0,45, 0,475 мг/кг или приблизительно 0,5 мг/кг. Значения, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также считаются частью настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi вводят в фиксированной дозе, составляющей от приблизительно 100 мг до приблизительно 90 0 мг, например, от приблизительно 100 мг до приблизительно 850 мг, от приблизительно 100 мг до приблизительно 800 мг, от приблизительно 100 мг до приблизительно 750 мг, от приблизительно 100 мг до приблизительно 700 мг, от приблизительно 100 мг до приблизительно 650 мг, от приблизительно 100 мг до приблизительно 600 мг, от приблизительно 100 мг до приблизительно 550 мг, от приблизительно 100 мг до приблизительно 500 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 850 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 800 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 750 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 700 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 650 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 600 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 550 мг, от приблизительно 200 мг до приблизительно 500 мг, от приблизительно 300 мг до приблизительно 850 мг, от приблизительно 300 мг до приблизительно 800 мг, от приблизительно 300 мг до приблизительно 750 мг, от приблизительно 300 мг до приблизительно 700 мг, от приблизительно 300 мг до приблизительно 650 мг, от приблизительно 300 мг до приблизительно 600 мг, от приблизительно 300 мг до приблизительно 550 мг, от приблизительно 300 мг до приблизительно 500 мг, от приблизительно 400 мг до приблизительно 850 мг, от приблизительно 400 мг до приблизительно 800 мг, от приблизительно 400 мг до приблизительно 750 мг, от приблизительно 400 мг до приблизительно 700 мг, от приблизительно 400 мг до приблизительно 650 мг, от приблизительно 400 мг до приблизительно 600 мг, от приблизительно 400 мг до приблизительно 550 мг или от приблизительно 400 мг до приблизительно 500 мг.

В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi вводят в фиксированной дозе, составляющей приблизительно 100 мг, приблизительно 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг, 200 мг, приблизительно 225 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 275 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 325 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 375 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 425 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 475 мг, приблизительно 500 мг, приблизитель- 87 045013 но 525 мг, приблизительно 550 мг, приблизительно 575 мг, приблизительно 600 мг, приблизительно 625 мг, приблизительно 650 мг, приблизительно 675 мг, приблизительно 700 мг, приблизительно 725 мг, приблизительно 750 мг, приблизительно 775 мг, приблизительно 800 мг, приблизительно 825 мг, приблизительно 850 мг, приблизительно 875 мг или приблизительно 900 мг.

iRNA может быть введена путем внутривенной инфузии в течение некоторого периода времени, например, в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или примерно 25минутного периода. Введение можно повторять, например, регулярно, как например: один раз в неделю, один раз в две недели (т.е. каждые две недели) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или дольше. По завершению режима начального лечения лекарственные препараты можно вводить с меньшей частотой. Например, после введения один раз в неделю или один раз в две недели в течение трех месяцев введение можно повторять один раз в месяц в течение шести месяцев, или года, или дольше.

Введение iRNA может обеспечить уменьшение количества присутствующего белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. белка KLKB1, белка F12 и/или белка KNG1), и/или уровней брадикинина, например, в клетке, ткани, крови, моче или другой части организма пациента, по меньшей мере на приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,

27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,

57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86,

87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или по меньшей мере на приблизительно 99% или больше.

Перед введением полной дозы iRNA пациентам можно вводить меньшую дозу, такую как 5% инфузионную дозу и наблюдать у них отрицательные эффекты, как, например, аллергическую реакцию. В другом примере у пациента можно наблюдать нежелательные иммуностимулирующие эффекты, такие как повышенные уровни цитокинов (например, TNF-альфа или INF-альфа).

Благодаря ингибиторным эффектам в отношении экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, композиция в соответствии с настоящим изобретением или полученная из нее фармацевтическая композиция могут повышать качество жизни.

iRNA по настоящему изобретению можно вводить в голой форме, где модифицированное или немодифицированное средство на основе iRNA суспендируют непосредственно в водном или подходящем буферном растворителе, в виде свободной iRNA. Свободную iRNA вводят в отсутствие фармацевтической композиции. Свободная iRNA может находиться в подходящем буферном растворе. Буферный раствор может содержать ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. В одном варианте осуществления буферный раствор представляет собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Значение pH и осмолярность буферного раствора, содержащего iRNA, можно корректировать с тем, чтобы он подходил для введения субъекту.

В качестве альтернативы iRNA по настоящему изобретению можно вводить в виде фармацевтической композиции, такой как липосомный состав с dsRNA.

Субъекты, на которых будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, представляют собой субъектов с наследственным ангионевротическим отеком (HAE) и/или заболеванием или нарушением, ассоциированными с внутренним путем активации свертывания крови, описанными в данном документе.

Лечение субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, включает лечение в терапевтических и профилактических целях.

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены способы и применения средства на основе iRNA или фармацевтической композиции на его основе для лечения субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие снижение и/или ингибирование экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, например, субъекта с заболеванием, ассоциированным с контактным путем активации свертывания крови, в комбинации с другими фармацевтическими препаратами и/или другими способами терапии, например, с помощью известных фармацевтических препаратов и/или известных способов терапии, таких как, например, применяемые в настоящее время для лечения данных нарушений.

Например, в определенных вариантах осуществления iRNA, целенаправленно воздействующая на ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, вводят в комбинации, например, со средством, применимым в лечении заболевания, ассоциированного с контактным путем активации свертывания крови, которое описано в другом месте данного документа. Например, дополнительные терапевтические средства и терапевтические способы, подходящие для лечения субъекта, на которого будет оказывать благоприятное воздействие снижение экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, например, субъекта с заболеванием, ассоциированным с контактным путем активации свертывания крови, включают средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на другую часть гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, андроген или терапевтическое средство, например, белок, замещающий C1INH, пептидный ингибитор калликреина, пептидный антагонист рецептора брадикинина В2 или другие терапевтические средства и/или процедуры

- 88 045013 для лечения заболевания, ассоциированного с контактным путем активации свертывания крови, или комбинацию любого из вышеперечисленных. В одном варианте осуществления дополнительное терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из андрогена, такого как даназол или оксандролон,

Berinert®, Cinryze™, Rhuconest®, Ecallantide, Firazyr®, Kalbitor®, и комбинации любого из вышеперечисленных.

В определенных вариантах осуществления первое средство на основе iRNA целенаправленно воздействующее на ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, вводят в комбинации со вторым средством на основе iRNA, целенаправленно воздействующим на другую часть гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. Например, первое средство для RNAi содержит первую смысловую нить и первую антисмысловую нить, образующие двухнитевой участок, где практически все нуклеотиды указанной первой смысловой нити и практически все нуклеотиды указанной первой антисмысловой нити представляют собой модифицированные нуклеотиды, где первая смысловая нить конъюгирована с лигандом, присоединенным к 3'-концу, и где лиганд представляет собой одно или несколько производных GalNAc, присоединенных посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера; а второе средство для RNAi содержит вторую смысловую нить и вторую антисмысловую нить, образующие двухнитевой участок, где практически все нуклеотиды второй смысловой нити и практически все нуклеотиды указанной второй антисмысловой нити представляют собой модифицированные нуклеотиды, где вторая смысловая нить конъюгирована с лигандом, присоединенным к 3'-концу, и где лиганд представляет собой одно или несколько производных GalNAc, присоединенных посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.

В одном варианте осуществления все нуклеотиды первой и второй смысловой нити и/или все нуклеотиды первой и второй антисмысловой нити имеют модификацию.

В одном варианте осуществления по меньшей мере один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из 3'-концевого дезокситиминового (dT) нуклеотида, 2'-О-метил-модифицированного нуклеотида, 2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, запертого нуклеотида, незапертого нуклеотида, конформационно ограниченного нуклеотида, конформационно затрудненного этилом нуклеотида, нуклеотида с удаленным азотистым основанием, 2'амино-модифицированного нуклеотида, 2'-О-аллил-модифицированного нуклеотида, 2'-С-алкил-модифицированного нуклеотида, 2'-гидроксил-модифицированного нуклеотида, 2'-метоксиэтил-модифицированного нуклеотида, 2'-О-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата, нуклеотида, содержащего не встречающееся в природе основание, тетрагидропиранмодифицированного нуклеотида, 1,5-ангидрогекситол-модифицированного нуклеотида, циклогексенилмодифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего фосфоротиоатную группу, нуклеотида, содержащего метилфосфонатную группу, нуклеотида, содержащего 5'-фосфат, и нуклеотида, содержащего миметик 5'-фосфата.

В определенных вариантах осуществления первое средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, вводят в комбинации со вторым средством на основе iRNA, целенаправленно воздействующим на ген, отличный от гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. Например, средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, можно вводить в комбинации со средством на основе iRNA, целенаправленно воздействующим на ген фактора свертывания крови XII (F12). Первое средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, и второе средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген, отличный от гена KLKB1, например ген фактора свертывания крови XII (F12), можно вводить как части одной фармацевтической композиции. В качестве альтернативы первое средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген KLKB1, и второе средство на основе iRNA, целенаправленно воздействующее на ген, отличный от гена KLKB1, например ген фактора свертывания крови XII (F12), можно вводить как части разных фармацевтических композиций.

Средство на основе iRNA и дополнительное терапевтическое средство и/или препарат можно вводить одновременно и/или в одной комбинации, например парентерально, или дополнительное терапевтическое средство можно вводить как часть отдельной композиции, или в разные моменты времени, и/или с помощью другого способа, известного в данной области или описанного в данном документе.

В настоящем изобретении также предусмотрены способы применения средства на основе iRNA по настоящему изобретению и/или композиции, содержащей средство на основе iRNA по настоящему изобретению, для снижения и/или ингибирования экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. экспрессии KLKB1, экспрессии F12 или экспрессии KNG1), в клетке. В других аспектах в настоящем изобретении предусмотрены iRNA по настоящему изобретению и/или композиция, содержащая iRNA по настоящему изобретению, для применения в снижении и/или ингибировании экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. экспрессии KLKB1, экспрессии F12 или экспрессии KNG1), в клетке. В еще одних аспектах предусмотрено применение iRNA по настоящему изобретению и/или композиции, содержащей iRNA по настоящему изобретению, для изготовления лекарственного препарата для снижения и/или ингибирования экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. экспрессии KLKB1, экспрессии F12

- 89 045013 или экспрессии KNG1), в клетке. В еще одних аспектах в настоящем изобретении предусмотрены iRNA по настоящему изобретению и/или композиция, содержащая iRNA по настоящему изобретению, для применения в снижении и/или ингибировании продуцирования белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. продуцирования белка KLKB1, продуцирования белка F12 или продуцирования белка KNG1), в клетке. В еще одних аспектах предусмотрено применение iRNA по настоящему изобретению и/или композиции, содержащей iRNA по настоящему изобретению, для изготовления лекарственного препарата для снижения и/или ингибирования продуцирования белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови (т.е. продуцирования белка KLKB1, продуцирования белка F12 или продуцирования белка KNG1), в клетке. Способы и применения включают приведение клетки в контакт с iRNA, например dsRNA по настоящему изобретению, и поддержание клетки в течение времени, достаточного для достижения разрушения мРНК-транскрипта гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, за счет чего обеспечивается ингибирование экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, или ингибирование продуцирования белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, в клетке.

Снижение экспрессии гена можно оценить с помощью любых способов, известных в данной области. Например, снижение экспрессии KLKB1 можно определить путем определения уровня экспрессии мРНК KLKB1 с помощью способов, рутинных для специалиста в данной области, например, нозернблоттинга, qRT-PCR, путем определения уровня белка KLKB1 с помощью способов, рутинных для специалиста в данной области, таких как вестерн-блоттинг, иммунологические методики, способы проточной цитометрии, ELISA, и/или путем определения биологической активности KLKB1.

В способах и применениях по настоящему изобретению клетка может находится в контакте in vitro или in vivo, т.е. клетка может находится в организме субъекта.

Клетка, подходящая для лечения с применением способов по настоящему изобретению, может представлять собой любую клетку, которая экспрессирует ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, например, клетку от субъекта с наследственным ангионевротическим отеком (HAE) или клетку, содержащую вектор экспрессии, содержащий ген, вовлеченный в контактный путь активации свертывания крови, или часть гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови. Клетка, подходящая для применения в способах и применениях по настоящему изобретению, может представлять собой клетку млекопитающего, например, клетку примата (такую как клетка человека или клетка отличного от человека примата, например, клетку обезьяны или клетку шимпанзе), клетку отличного от примата животного (такую как клетка коровы, клетка свиньи, клетка верблюда, клетка ламы, клетка лошади, клетка козы, клетка кролика, клетка овцы, клетка хомячка, клетка морской свинки, клетка кота, клетка собаки, клетка крысы, клетка мыши, клетка льва, клетка тигра, клетка медведя или клетка буйвола), клетку птицы (например, клетку утки или клетку гуся) или клетку кита. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку человека.

Экспрессию гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, можно ингибировать в клетке по меньшей мере на приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,

22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,

52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,

82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или приблизительно 100%.

Продуцирование белка, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, можно ингибировать в клетке по меньшей мере на приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,

50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,

80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или приблизительно 100%.

In vivo способы и применения по настоящему изобретению могут включать введение субъекту композиции, содержащей iRNA, где iRNA включает в себя нуклеотидную последовательность, которая комплементарна по меньшей мере части РНК-транскрипта гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, млекопитающего, подлежащего лечению. В тех случаях, когда подлежащим лечению организмом является человек, тогда композицию можно вводить при помощи любых способов, известных в данной области, в том числе без ограничения подкожным, внутривенным, пероральным, внутрибрюшинным или парентеральным путями, включая интракраниальное (например, интравентрикулярное, интрапаренхиматозное и интратекальное), внутримышечное, трансдермальное, через верхние дыхательные пути (аэрозольное), назальное, ректальное и местное (в том числе трансбуккальное и сублингвальное) введение. В определенных вариантах осуществления композиции вводят при помощи подкожной или внутривенной инфузии или инъекции. В одном варианте осуществления композиции вводят путем подкожной инъекции.

В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством инъекции депопрепарата. Благодаря инъекции депо-препарата, iRNA может постоянно высвобождаться в течение длительного периода времени. Таким образом, при инъекции депо-препарата можно снизить частоту введения доз, необходимых для достижения требуемого эффекта, например, требуемого ингибирования KLKB1 или терапевтического или профилактического эффекта. Инъекция депо-препарата может также

- 90 045013 обеспечивать более устойчивые концентрации в сыворотке крови. Инъекции депо-препарата могут включать подкожные инъекции или внутримышечные инъекции. В предпочтительных вариантах осуществления инъекция депо-препарата является подкожной инъекцией.

В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством насоса. Насос может быть внешним насосом или насосом, имплантируемым хирургическим путем. В определенных вариантах осуществления насос является подкожно имплантируемым осмотическим насосом. В других вариантах осуществления насос является инфузионным насосом. Инфузионный насос можно применять для внутривенных, подкожных, артериальных или эпидуральных инфузий. В предпочтительных вариантах осуществления инфузионный насос является инфузионным насосом для подкожных введений. В других вариантах осуществления насос является насосом, имплантируемым хирургическим путем, который доставляет iRNA в организм субъекта.

Способ введения можно выбрать, исходя из того, необходимо ли местное или системное лечение, и исходя из области, подлежащей лечению. Путь и место введения можно выбрать для усиления целенаправленного воздействия.

В одном аспекте в настоящем изобретении также предусмотрены способы ингибирования экспрессии гена KLKB1 у млекопитающего, например у человека. В настоящем изобретении также предусмотрена композиция, содержащая iRNA, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген KLKB1 в клетке млекопитающего, для применения в ингибировании экспрессии гена KLKB1 у млекопитающего. В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение iRNA, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген KLKB1 в клетке млекопитающего, в изготовлении лекарственного препарата для ингибирования экспрессии гена KLKB1 у млекопитающего.

Способы и применения включают введение млекопитающему, например человеку, композиции, содержащей iRNA, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген KLKB1 в клетке млекопитающего, и поддержание млекопитающего в течение времени, достаточного для достижения разрушения мРНК-транскрипта гена KLKB1, за счет чего обеспечивается ингибирование экспрессии гена KLKB1 у млекопитающего.

В другом аспекте в настоящем изобретении также предусмотрены способы ингибирования экспрессии гена F12 у млекопитающего, например человека. В настоящем изобретении также предусмотрена композиция, содержащая iRNA, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген F12 в клетке млекопитающего, для применения в ингибировании экспрессии гена F12 у млекопитающего. В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение iRNA, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген F12 в клетке млекопитающего, в изготовлении лекарственного препарата для ингибирования экспрессии гена F12 у млекопитающего.

Способы и применения включают введение млекопитающему, например человеку, композиции, содержащей iRNA, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген F12 в клетке млекопитающего, и поддержание млекопитающего в течение времени, достаточного для достижения разрушения мРНК-транскрипта гена F12, за счет чего обеспечивается ингибирование экспрессии гена F12 у млекопитающего.

В другом аспекте в настоящем изобретении также предусмотрены способы ингибирования экспрессии гена KNG1 у млекопитающего, например человека. В настоящем изобретении также предусмотрена композиция, содержащая iRNA, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген KNG1 в клетке млекопитающего, для применения в ингибировании экспрессии гена KNG1 у млекопитающего. В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение iRNA, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген KNG1 в клетке млекопитающего, в изготовлении лекарственного препарата для ингибирования экспрессии гена KNG1 у млекопитающего.

Способы и применения включают введение млекопитающему, например человеку, композиции, содержащей iRNA, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген KNG1 в клетке млекопитающего, и поддержание млекопитающего в течение времени, достаточного для достижения разрушения мРНК-транскрипта гена KNG1, за счет чего обеспечивается ингибирование экспрессии гена KNG1 у млекопитающего.

Снижение экспрессии гена можно оценивать в образце периферической крови субъекта, которому вводят iRNA, с помощью каких-либо способов, известных в данной области, например qRT-PCR, описанной в данном документе. Снижение продуцирования белка можно оценивать с помощью любых способов, известных в данной области, и с помощью способов, например, ELISA или вестерн-блоттинга, описанных в данном документе. В одном варианте осуществления образец ткани служит в качестве тканевого материала для контроля снижения экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, и/или белка. В другом варианте осуществления образец крови служит в качестве тканевого материала для контроля снижения экспрессии гена, вовлеченного в контактный путь активации свертывания крови, и/или белка.

В одном варианте осуществления подтверждение RISC-опосредованного расщепления мишени in vivo после введения средства на основе iRNA осуществляют путем выполнения 5'-RACE или модификаций протокола, известного в данной области (Lasham A et al. (2010) Nucleic Acid Res., 38 (3) p-e19) (Zim- 91 045013 mermann et al. (2006) Nature 441:111-4).

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не должны быть истолкованы как ограничивающие. Полное содержание всех источников, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых в данной заявке, а также фигур и перечня последовательностей таким образом включено в данный документ посредством ссылки.

Примеры

b. Пример 1. Синтез iRNA для KLKB1.

i. Источники получения реагентов.

Если источник получения реагента конкретно не приведен в данном документе, такой реагент можно приобрести у любого поставщика реагентов для использования в молекулярной биологии со стандартными качеством/чистотой для применения в молекулярной биологии.

Транскрипты.

Конструирование siRNA.

Набор siRNA, целенаправленно воздействующих на KLKB1, плазменный калликреин В1 (фактор Флетчера) человека (эталонная последовательность с номером доступа NM_000892.3, GI:78191797, GeneID: 3818, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2) и ортологи KLKB1 из исследований видовой токсичности (яванский макак: эталонная последовательность с номером доступа XM_005556482, GI:544436072; макак-резус: эталонная последовательность JU329355, GI:380802470; мышь: эталонная последовательность NM_008455, GI:236465804; крыса: эталонная последовательность NM_012725, GI:162138904) были сконструированы с помощью специально разработанных скриптов на языках R и Python. Длина эталонной последовательности мРНК KLKB1 человека составляет 2252 оснований. Логическое обоснование и способ применения набора конструкций siRNA заключались в следующем: прогнозированную эффективность для каждой потенциальной 19-мерной siRNA от положения 72 до положения 2252 включительно мРНК KLKB1 человека (содержащей кодирующий участок и 3'-UTR) определяли с использованием линейной модели, с помощью которой прогнозировали непосредственный показатель нокдауна мРНК, исходя из данных по более чем 20000 различных конструкций siRNA, целенаправленно воздействующих на большое количество генов позвоночных. Поднаборы siRNA для KLKB1 конструировали с идеальными или почти идеальными совпадениями между человеком, яванским макаком и макаком-резусом. Дополнительный поднабор конструировали с идеальными или почти идеальными совпадениями с ортологами KLKB1 мыши или крысы. Для каждой нити siRNA в полном переборе использовали сделанный по индивидуальному заказу скрипт на языке Python для измерения количества и определения положений ошибок спаривания между siRNA и всеми потенциальными выравниваниями в транскриптоме целевого вида. Дополнительные баллы присваивали за ошибки спаривания в затравочном участке, определенном в данном случае как положения 2-9 антисмыслового олигонуклеотида, равно как и в сайте расщепления siRNA, определенном в данном случае как положения 10-11 антисмыслового олигонуклеотида.

Относительные баллы за ошибки спаривания составляли 2,8 для ошибок спаривания в затравочном участке, 1,2 для ошибок спаривания в сайте расщепления и 1 для ошибок спаривания в других положениях вплоть до положения 19 антисмыслового олигонуклеотида. Ошибки спаривания в первом положении игнорировали. Балл за специфичность рассчитывали для каждой нити путем суммирования значений каждой взвешенной ошибки спаривания. Предпочтение отдавали тем siRNA, антисмысловой балл которых для человека и яванского макака равнялся 3,0 или больше, и прогнозированная эффективность представляла собой нокдаун транскрипта KLKB1, равный 70% или больше. Конструировали, синтезировали и подвергали скринингу один набор siRNA, содержащих влияющие на активность структурные модификации, включая различные паттерны с заместителями 2'-O-метил и 2'-фтор.

Подробный перечень немодифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей для KLKB1 показан в табл. 3. Подробный перечень модифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей для KLKB1 показан в табл. 4.

Синтез siRNA.

Последовательности siRNA для KLKB1 синтезировали в масштабе 1 мкмоль на синтезаторе Mermade 192 (BioAutomation) с применением фосфорамидитной химии, используя твердую подложку. Твердая подложка представляла собой стеклянную подложку с заданным размером пор (500 А), нагруженную созданным по индивидуальному заказу лигандом GalNAc, или универсальную твердую подложку (AM biochemical). Вспомогательные реагенты для синтеза, 2'-F- и 2'-О-метил-РНК и дезоксо-фосфорамидиты, получали от Thermo-Fisher (Милуоки, Висконсин) и Hongene (Китай). 2'F, 2'-О-метил, GNA (гликольнуклеиновые кислоты), 5'-фосфат и другие модификации вводили с использованием соответствующих фосфорамидитов. Синтез отдельных нитей, конъюгированных с GalNAc по З'-концу, выполняли на модифицированной GalNAc CPG-подложке. Сделанную по индивидуальному заказу универсальную твердую CPG-подложку использовали для синтеза отдельных антисмысловых нитей. Время связывания для всех фосфорамидитов (100 мМ в ацетонитриле) составляло 5 мин при использовании 5-этилтио-1Нтетразола (ЕТТ) в качестве активатора (0,6 М в ацетонитриле). Фосфоротиоатные связи получали с использованием 50 мМ раствора 3-((диметиламино-метилиден)амино)-3Н-1,2,4-дитиазол-3-тиона (DDTT, получали от Chemgenes (Уилмингтон, Массачусетс, США)) в безводном ацетонитриле/пиридине (1:1

- 92 045013 объем/объем). Время окисления составляло 3 мин. Все последовательности синтезировали с удалением в конечном итоге группы DMT (без DMT).

По завершении твердофазного синтеза олигорибонуклеотиды отщепляли от твердой подложки и с них снимали защитную группу в запечатанных планшетах с 96 глубокими лунками с использованием 200 мкл реагента в виде водного метиламина при 60°С в течение 20 мин. Для последовательностей, содержащих 2'-рибозные остатки (2'-ОН), которые были защищены группой трет-бутилдиметилсилила (TBDMS), вторую стадию снятия защиты выполняли с применением реагента TEA-3HF (триэтиламина тригидрофторида). Для удаления защитных групп в раствор метиламина добавляли 200 мкл диметилсульфоксида (DMSO) и 300 мкл реагента TEA-3HF и раствор инкубировали в течение дополнительных 20 мин при 60°С. В конце стадии отщепления и удаления защитных групп планшету для синтеза давали достичь комнатной температуры и в нем проводили осаждение путем добавления 1 мл смеси ацетонитрил:этанол (9:1). Планшеты охлаждали при -80°С в течение 2 ч и супернатант аккуратно удаляли при помощи многоканальной пипетки. Осадок с олигонуклеотидами ресуспендировали в 20 мМ буфера NaOAc и обессоливали с использованием 5 мл колонки для эксклюзионной хроматографии HiTrap (GE Healthcare) на АКТА Purifier System, оснащенной устройством автоматической подачи образцов А905 и коллектором фракций Frac 950. Обессоленные образцы собирали в 96-луночные планшеты. Образцы из каждой последовательности анализировали при помощи LC-MS для подтверждения идентичности, УФ (260 нм) для количественного определения, а выбранный набор образцов анализировали при помощи IEX-хроматографии для определения чистоты.

Гибридизацию отдельных нитей KLKB1 осуществляли на автоматическом устройстве Тесап для манипуляции с жидкостями. Эквимолярную смесь смысловых и антисмысловых отдельных нитей объединяли и гибридизовали в 96-луночных планшетах. После объединения отдельных комплементарных нитей 96-луночный планшет плотно запечатывали и нагревали в печи при 100°С в течение 10 мин, и позволяли ему медленно достичь комнатной температуры за период 2-3 ч. Концентрацию каждого дуплекса нормализовали к 10 мкМ в 1X PBS и затем подвергали скрининговым анализам in vitro.

Пример 2. Скрининг дуплексов siRNA для KLKB1 in vitro.

Культура клеток и трансфекции.

Клетки Cos7 (ATCC, Манассас, Вирджиния) выращивали практически до конфлюентности при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в DMEM (АТСС), дополненной 10% FBS, до отделения от планшета путем трипсинизации. Конструкции с использованием системы люцифераз Dual-Glo® создавали в плазмиде psiCHECK2, содержащей либо геномную последовательность KLKB1 человека размером примерно 2,2 т. о, либо геномную последовательность ортолога KLKB1 мыши размером 2,5 т.о. Каждую плазмиду с люциферазами из двух источников совместно трансфицировали с siRNA в примерно 15х10⁴ клеток с применением Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по каталогу 11668-019). В каждой лунке 96-луночного планшета добавляли 0,2 мкл Lipofectamine к 10 нг плазмидного вектора и одной siRNA (табл. 3 и 4) в 14,8 мкл Opti-MEM и оставляли для образования комплексов при комнатной температуре на 15 мин. Затем смесь добавляли к клеткам, которые ресуспендировали в 80 мкл свежей полной среды. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед измерением активности люциферазы.

Эксперименты с однократной дозой выполняли при конечной концентрации дуплекса 10 и 0,01 нМ и эксперименты в отношении дозозависимого эффекта проводили в пределах диапазона конечной концентрации дуплекса от 10 нМ до 36 фМ с использованием 8-, 6-кратных разведений.

Анализ с использованием системы люцифераз Dual-Glo®.

Через сорок восемь часов после трансфекции с использованием siRNA измеряли активность люциферазы светлячка (контроль трансфекции) и Rinella (слитой с целевой последовательностью KLKB1). Сначала отделяли клетки от среды. Затем измеряли активность люциферазы светлячка путем добавления в каждую лунку 75 мкл реагента люциферазы Dual-Glo®, что равно объему культуральной среды, и перемешивали. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин перед измерением люминесценции (при 500 нм) на Spectramax (Molecular Devices) для выявления сигнала от люциферазы светлячка. Активность люциферазы Renilla измеряли путем добавления в каждую лунку 75 мкл реагента Dual-Glo® Stop & Glo® комнатной температуры и планшеты инкубировали в течение 10-15 мин перед повторным измерением люминесценции для определения сигнала люциферазы Renilla. Реагент DualGlo® Stop & Glo® гасит сигнал от люциферазы светлячка и поддерживает люминесценцию реакции люциферазы Renilla. Активность siRNA определяли путем нормализации в каждой лунке сигнала от Renilla (KLKB1) к сигналу от люциферазы светлячка (контроль). Затем оценивали величину активности siRNA относительно клеток, которые трансфицировали одним и тем же вектором, но их не обрабатывали siRNA или обрабатывали siRNA, не оказывающей целенаправленного воздействия. Все трансфекции выполняли в трех повторностях.

В табл. 5 приведены результаты скрининга в отношении однократной дозы в клетках Cos7, трансфицированных указанными iRNA для KLKB1 человека. В табл. 6 приведены результаты скрининга в отношении однократной дозы в клетках Cos7, трансфицированных указанными iRNA для KLKB1 мыши. Данные выражены в виде процента остаточной мРНК в сравнении с отрицательным контролем.

- 93 045013

Таблица 2. Сокращения нуклеотидных мономеров, используемые в представлении последовательности нуклеиновой кислоты. Следует понимать, что эти мономеры, если они присутствуют в олигонуклеотиде, взаимно связаны собой 5'-3'-фосфодиэфирными связями

Сокращение А Af	Нуклеотид(нуклеотиды) Аденозин-3'-фосфат 2'-Фтораденозин-3'-фосфат
Afs	2'-Фтораденозин-3'-фосфоротиоат
As	Аденозин-3'-фосфоротиоат
С	Цитидин-3'-фосфат
Cf	2'-Фторцитидин-3'-фосфат
Cfs	2'-Фторцитидин-3'-фосфоротиоат
Cs	Цитидин-3'-фосфоротиоат
G	Гуанозин-3'-фосфат
Gf	2'-Фторгуанозин-3'-фосфат
G f s	2'-Фторгуанозин-3'-фосфоротиоат
Gs	Гуанозин-3'-фосфоротиоат
T	5'-Метилуридин-3'-фосфат
Tf	2'-Фтор-5-метилуридин-З'-фосфат
Tfs	2'-Фтор-5-метилуридин-З'-фосфоротиоат
Ts	5-Метилуридин-З'-фосфоротиоат
U	Уридин-3'-фосфат
Uf	2'-Фторуридин-3'-фосфат
Ufs	2'-Фторуридин-3'-фосфоротиоат
Us	Уридин-3'-фосфоротиоат
N	Любой нуклеотид (G, А, С, Т или U)
a	2'-0-Метиладенозин-З'-фосфат
as	2'-0-Метиладенозин-З'-фосфоротиоат
c	2'-О-Метилцитидин-3'-фосфат
cs	2'-О-Метилцитидин-3'-фосфоротиоат
g	2'-0-Метилгуанозин-З'-фосфат
gs	2'-0-Метилгуанозин-З'-фосфоротиоат
t	2'-О-Метил-5-метилуридин-З'-фосфат
ts	2'-О-Метил-5-метилуридин-З'-фосфоротиоат
u	2'-О-Метилуридин-3'-фосфат
US	2'-О-Метилуридин-3'-фосфоротиоат
s	Фосфоротиоатная связь
	N-[трис(GalNAc-алкил)-амидодеканоил)]-4-
L96
	гидроксипролинол-Нур-(GalNAc-алкил)3
(dt)	Дезокситимин
	2-Гидроксиметилтетрагидрофуран-4-метокси-3-фосфат
Y34
	(лишенная азотистого основания 2'-ОМе-фураноза)
Y44	2-Гидроксиметилтетрагидрофуран-5-фосфат
(Agn)	Аденозин-гликоль нуклеиновая кислота (GNA)
(Tgn)	Тимидин-гликоль-нуклеиновая кислота (GNA), 3-изомер
(Cgn)	Цитидин-гликоль-нуклеиновая кислота (GNA)
P	Фосфат
VP	Винилфосфат

- 94 045013

Таблица 3. Немодифицированные последовательности смысловой и антисмысловой нитей dsRNA KLKB1

Название дуплекса AD-65077 AD-65170 AD-65103 AD-65083 AD-65087 AD-65149 AD-64652 AD-65162 AD-65153 AD-65084 AD-65099 AD-65100 AD-65090 AD-65 0 8 5 AD-65062 AD-65164 AD-65139 AD-65151 AD-65158 AD-65078 AD-65161 AD-65076	Название смыслового олигонуклеотида А-129940 А-130248 А-130010 А-129942 А-130004 А-130178 А-129275 А-130198 А-130242 А-129958 А-129948 А-129962 А-129960 А-129972 А-129980 А-130230 А-130206 А-130210 А-130228 А-129956 А-130182 А-130016	Смысловая последовательность, от 5' к 3' AAU С CAAAAUAUU CUACAAAA CU G GU CAU CAAAUAAGU GCUU GU G GU CAU CAAAUAAGU GCUU CAUGGACUGGAUUUUAGAGAA АС СAAAGU С G CU GAGUACAUА GAUGGACUGGAUUUUAGAGAA UAU GAGAGGAGU CAAUUUUAA AAU GAGAGGAGU CAAUUUUAA U С СAAAGU С G CU GAGUACAUА AUU CUACAAAAGGUAAAUAUU UUU CU CACAAAUAAAAGAGAU UAU CAAGAUUAUAAAAUAACA CUUCUUGAAAGAUAGUGUUAA GAAU GUUU GC CAAGAGACUUA AUAUU С CUUU GGUAACAAAUA С GU CAU CAAAUAAGU GCUU GA UСCUGCAAAAGAACUUUACCU CAAUGUUUGCCAAGAGACUUA AGACACAAGCACAAUUUAUAA C GAGU CACAAAGAAAU GUUUA AU CUU GAAAGAUAGU GUUACA AAU GU G GU CAU CAAAUAAGUA	SEQ ID NO: 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51	Название антисмыслового олигонуклеотида A-129941 A-130249 A-130011 A-129943 A-130005 A-130179 A-129276 A-130199 A-130243 A-129959 A-129949 A-129963 A-129961 A-129973 A-129981 A-130231 A-130207 A-130211 A-130229 A-129957 A-130183 A-130017	Антисмысловая последовательность, от 5' к 3' UUUUGUAGAAUAUUUUGGAUUUC AAGCACUUAUUU GAU GAC CAGAU AAGCACUUAUUU GAU GAC CACAU UU CU CUAAAAU C CAGU C CAU GUA UAU GUACU CAGC GACUUU GGU GU UU CU CUAAAAU C CAGU C CAU CUA UUAAAAUU GACU C CU CU CAU AU C UUAAAAUU GACU C CU CU CAUUU C UAU GUACU CAGC GACUUU GGAGU AAUAUUUAC CUUUU GUAGAAUAU AUCUCUUUUAUUUGUGAGAAAGG U GUUAUUUUAUAAU CUU GAUAU C UUAACACUAU CUUU CAAGAAGCA UAAGUCUCUUGGCAAACAUUCAC UAUUU GUUAC CAAAGGAAUAUUU U CAAGCACUUAUUU GAU GAC GAC AGGUAAAGUUCUUUUGCAGGAUA UAAGUCUCUUGGCAAACAUUGAC UUAUAAAUUGUGCUUGUGUCUCC UAAACAUUUCUUUGUGACUCGAU U GUAACACUAU CUUU CAAGAU GC UACUUAUUU GAU GAC CACAUU GC	SEQ ID NC 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138	Position NM_000892 1661-1682 382-403 382-403 1922-1943 1905-1926 1922-1943 431-452 431-452 1905-1926 1671-1692 1457-1478 1725-1746 302-323 1016-1037 1687-1708 384-405 918-939 1016-1037 1595-1616 818-839 303-324 379-400
AD-65093	А-130006	GUUACU CUUU GAGAUU GU GUA	52	A-130007	UACACAAU CU CAAAGAGUAAC CA	139	1177-1198
AD-65156	А-130196	GUUCUUGAAAGAUAGUGUUAA	53	A-130197	UUAACACUAU CUUU CAAGAAC CA	140	302-323
AD-65059	А-129934	GACUUUGGAGGAGAAGAAUUA	54	A-129935	UAAUU CUUCUCCUC CAAAGU CAA	141	972-993
AD-65073	А-129968	ACCUGCAAAAGAACUUUACCU	55	A-129969	AGGUAAAGUUCUUUUGCAGGUUA	142	918-939
AD-65074	А-129984	AU C GAGU CACAAAGAAAU GUU	56	A-129985	AACAUUUCUUUGUGACUCGAUUU	143	816-837
AD-65092	А-129990	UGACACAAGCACAAUUUAUAA	57	A-129991	UUAUAAAUU GU GCUU GU GU САС C	144	1595-1616
AD-65097	А-129992	GGUCAUCAAAUAAGUGCUUGA	58	A-129993	U CAAGCACUUAUUU GAU GAC CAC	145	384-405
AD-65101	А-129978	UGGUCAUCAAAUAAGUGCUUA	59	A-129979	UAAGCACUUAUUU GAU GAC CACA	146	383-404
AD-65131	А-130172	AG С CAGAAAAGAUAU CAAGAU	60	A-130173	AUCUUGAUAUCUUUUCUGGCUUU	147	1713-1734
AD-65159	А-130244	CUUACU CUUU GAGAUU GU GUA	61	A-130245	UACACAAU CU CAAAGAGUAAG CA	148	1177-1198
AD-65150	А-130194	UUUCUACAAAAGGUAAAUAUU	62	A-130195	AAUAUUUACCUUUUGUAGAAAAU	149	1671-1692
AD-65060	А-129950	CACAAUGGAAUGUGGCGUUUA	63	A-129951	UAAAC GC CACAUU C CAUU GU GUU	150	1827-1848
AD-65098	А-130008	UUACUCUUUGAGAUUGUGUAA	64	A-130009	UUACACAAU CU CAAAGAGUAAC C	151	1178-1199
AD-65067	А-129966	UACUCUUUGAGAUUGUGUAAA	65	A-129967	UUUACACAAU CU CAAAGAGUAAC	152	1179-1200
AD-65 0 65	А-129936	U G С CAGAAAAGAUAU CAAGAU	66	A-129937	AUCUUGAUAUCUUUUCUGGCAUU	153	1713-1734
AD-65095	А-129946	UU CUU GAAAGAUAGU GUUACA	67	A-129947	U GUAACACUAU CUUU CAAGAAGC	154	303-324
AD-65126	А-130186	GACAAUGGAAUGUGGCGUUUA	68	A-130187	UAAACGCCACAUUCCAUUGUCUU	155	1827-1848
AD-65157	А-130212	AAUAAAAUAACССAACGGAUA	69	A-130213	UAUCCGUUGGGUUAUUUUAUUAU	156	1734-1755
AD-65086	А-129988	CUUAAAACAU CU GAAAGU GGA	70	A-129989	UCGACUUUCAGAUGUUUUAAGAA	157	843-864
AD-65167	А-130200	AAU CAAGAUUAUAAAAUAACA	71	A-130201	UGUUAUUUUAUAAUCUUGAUUUC	158	1725-1746
AD-65071	А-129938	AGUAACGUGGAAUCUGGAUUA	72	A-129939	UAAU C CAGAUU C CAC GUUACU CA	159	618-639
AD-65066	А-129952	UAUAAAG GAGUU GAUAU GAGA	73	A-129953	U CU CAUAU CAACU C CUUUAUAAA	160	417-438
AD-65165	А-130246	AUACU CUUU GAGAUU GU GUAA	74	A-130247	UUACACAAU CU CAAAGAGUAU С C	161	1178-1199
AD-65132	А-130188	AAUAAAG GAGUU GAUAU GAGA	75	A-130189	U CU CAUAU CAACU C CUUUAUUAA	162	417-438
AD-65125	А-130170	GACUUUGGAGGAGAAGAAUUA	76	A-130171	UAAUUCUUCUCCUCCAAAGUGAA	163	972-993
AD-65091	А-129974	UAUAAAAUAAC С CAAC G GAUA	77	A-129975	UAU С C GUU GGGUUAUUUUAUAAU	164	1734-1755

- 95 045013

AD-65136	A-130252	GAAU GU G GU GAU CAAAUAAGU	78	A-130253	ACUUAUUU GAU GAC CACAUU C CU	165	378-399
AD-65137	A-130174	UGUAACGUGGAAUCUGGAUUA	79	A-130175	UAAU C CAGAUU С CAC GUUACACA	166	618-639
AD-65140	A-130222	UU C GAGU CACAAAGAAAU GUU	80	A-130223	AACAUUUCUUUGUGACUCGAAUU	167	816-837
AD-65128	A-130218	UUAUUCCUUUGGUAACAAAUA	81	A-130219	UAUUU GUUAC CAAAGGAAUAAUU	168	1687-1708
AD-65088	A-130020	ACACAAGCACAAUUUAUACCA	82	A-130021	UGGUAUAAAUUGUGCUUGUGUCA	169	1597-1618
AD-65160	A-130260	GU G GAAU GU GGAUU GU CACUA	83	A-130261	UAGU GAGAAU C CAGAUU С CAG GU	170	624-645
AD-65152	A-130226	GUUAAAACAU GU GAAAGU GGA	84	A-130227	U C CACUUU CAGAU GUUUUAACAA	171	843-864
AD-65133	A-130204	AAGUCUUUGAGAUUGUGUAAA	85	A-130205	UUUACACAAU CU CAAAGAGUUAC	172	1179-1200
AD-65082	A-130018	GCAAUGUGGUCAUCAAAUAAA	86	A-130019	UUUAUUU GAU GAC CACAUU GCUU	173	377-398
AD-65094	A-130022	GU G GAAU CU GGAUU CU CACUA	87	A-130023	UAGU GAGAAU C CAGAUU C CAC GU	174	624-645
AD-65155	A-130180	GGCAUUGUUGGAGGAACAAAA	88	A-130181	UUUUGUUCCUCCAACAAUGCCUG	175	1239-1260
AD-65163	A-130214	UUUGUUGGAGGAACAAACUCU	89	A-130215	AGAGUUU GUU C CU C CAACAAAGC	176	1242-1263
AD-65144	A-130192	GGAGU CACAAAGAAAUGUUUA	90	A-130193	UAAACAUUUCUUUGU GACUC CAU	177	818-839
AD-65096	A-129976	AUUGUUGGAGGAACAAACUCU	91	A-129977	AGAGUUU GUU C CU C CAACAAU GC	178	1242-1263
AD-65142	A-130254	UAU GU G GU CAU CAAAUAAGUA	92	A-130255	UACUUAUUU GAU GAC CACAUAGC	179	379-400
AD-65141	A-130238	CAAAAGAUGCUUGUAAGGGAA	93	A-130239	UUCCCUUACAAGCAUCUUUUGCC	180	1780-1801
AD-65079	A-129970	GUCUGUGCUGGCUAUAAAGAA	94	A-129971	UU CUUUAUAGC CAGCACAGAC CA	181	1755-1776
AD-65102	A-129994	AGCAGUGUUGAAGAAUGCCAA	95	A-129995	UUGGCAUUCUUCAACACUGCUAA	182	465-486
AD-65138	A-130190	GUGUGUGGAGGGUCACUCAUA	96	A-130191	UAU GAGU GAC C CU С CACACAC GU	183	1323-1344
AD-65075	A-130000	GAAAAGAUGCUUGUAAGGGAA	97	A-130001	UUCCCUUACAAGCAUCUUUUGCC	184	1780-1801
AD-65080	A-129986	ACAUCUGAAAGUGGСACACCA	98	A-129987	U GGU GU GC CACUUU CAGAU GUUU	185	849-870
AD-65145	A-130208	GUCUGUGCUGGCUAUAAAGAA	99	A-130209	UUCUUUAUAGCCAGCACAGAGCA	186	1755-1776
AD-65169	A-130232	UGCAGUGUUGAAGAAUGCCAA	100	A-130233	UUGGCAUUCUUCAACACUGCAAA	187	465-486
AD-65061	A-129964	UUGUUAAAACAUCUGAAAGUA	101	A-129965	UACUUUCAGAUGUUUUAAGAAGA	188	841-862
AD-65135	A-130236	UAG CACAAUUUAUAC CAACUA	102	A-130237	UAGUU GGUAUAAAUU GU G CUAGU	189	1601-1622
AD-65068	A-129982	UGGAAUGUGGCGUUUGGUGGA	103	A-129983	U С CAC CAAAC GC CACAUU C CAUU	190	1832-1853
AD-65148	A-130256	С CAAU GU G GU CAU CAAAUAAA	104	A-130257	UUUAUUU GAU GAC CACAUU GGUU	191	377-398
AD-65072	A-129954	GUGUGUGGAGGGUCACUCAUA	105	A-129955	UAU GAGU GAC C CU С CACACAG GU	192	1323-1344
AD-65146	A-130224	UCAUCUGAAAGUGGСACACCA	106	A-130225	U GGU GU GC CACUUU CAGAU GAUU	193	849-870
AD-65129	A-130234	CCACAAUUUAUACCAACUGUU	107	A-130235	AACAGUUGGUAUAAAUUGUGGUU	194	1603-1624
AD-65064	A-130012	CACAAGCACAAUUUAUACCAA	108	A-130013	UUGGUAUAAAUUGUGCUUGUGUC	195	1598-1619
AD-65134	A-130220	AGGAAUGUGGCGUUUGGUGGA	109	A-130221	U C CAC CAAAC GC CACAUU C CUUU	196	1832-1853
AD-65063	A-129996	GCACAAUUUAUACCAACUGUU	110	A-129997	AACAGUUGGUAUAAAUUGUGCUU	197	1603-1624
AD-65089	A-129944	GGCAUUGUUGGAGGAACAAAA	111	A-129945	UUUUGUUCCUC CAACAAU GC GU G	198	1239-1260
AD-65069	A-129998	AAG CACAAUUUAUAC CAACUA	112	A-129999	UAGUU GGUAUAAAUU GU G CUU GU	199	1601-1622
AD-65130	A-130250	GACAAGCACAAUUUAUACCAA	113	A-130251	UUGGUAUAAAUUGUGCUUGUCUC	200	1598-1619
AD-65147	A-130240	UUUUACCCGGGAGUUGACUUU	114	A-130241	AAAGUCAACUССCGGGUAAAAUU	201	957-978
AD-65081	A-130002	AUUUACCCGGGAGUUGACUUU	115	A-130003	AAAGUCAACUССCGGGUAAAUUU	202	957-978
AD-65154	A-130258	U CACAAGCACAAUUUAUAC CA	116	A-130259	U GGUAUAAAUU GU GCUU GU GACA	203	1597-1618

- 96 045013

Таблица 4. Модифицированные последовательности смысловой и антисмысловой нитей dsRNA KLKB1

Название дуплекса	Название смыслового олигонуклеотида	Смысловая последовательность, от 5' к 3'	SEQ NO:	Название антисмыслового олигонуклеотида	Антисмысловая последовательность , от 5' к 3 '	SEQ ID NO:
AD-65077	А-129940	AfsasUfcCfaAfaAfUfAfuUfcUfaCfaAfaAfL96	204	A-129941	usUfsuUfgUfaGfaAfuauUfuUfgGfaUfusus с	291
AD-65170	А-130248	CfsusGfgUfcAfuCfAfAfaUfaAfgU fgCfuUfL96	205	A-130249	asAfsgCfaCfuU faUfuugAfuGfaCfcAfgsasu	292
AD-65103	А-130010	GfsusGfgUfcAfuCfAfAfaUfaAfgUfgCfuUfL96	206	A-130011	asAfsgCfaCfuU faUfuugAfuGfaCfcAfcsasu	293
AD-65083	А-129942	CfsasUfgGfaCfuGfGfAfuUfuUfaGfaGfaAfL96	207	A-129943	usUfscUfcUfaAfaAfuccAfgUfcCfaUfgsusa	294
AD-65087	А-130004	Af scsCfaAfaGfuCfGfCfuGfaGfuAfcAfuAfL96	208	A-130005	usAfsuGfuAfcUfcAfgcgAfcUfuUfgGfusgsu	295
AD-65149	А-130178	GfsasU fgGfaCfuGfGfAfuU fuUfaGfaGfaAfL96	209	A-130179	usUfs cUfcUfaAfaAfuccAfgUfcCfaUfcsus a	296
AD-64652	А-129275	UfsasUfgAfgAfgGfAfGfuCfaAfuUfuUfaAfL96	210	A-129276	usUfsaAfaAfuU fgAfcucCfuCfuCfaUfasus c	297
AD-65162	А-130198	AfsasUfgAfgAfgGfAfGfuCfaAfuUfuUfaAfL96	211	A-130199	usUfsaAfaAfuU fgAfcucCfuCfuCfaUfusus c	298
AD-65153	А-130242	UfscsCfaAfaGfuCfGfCfuGfaGfuAfcAfuAfL96	212	A-130243	usAfsuGfuAfcUfcAfgcgAfcUfuUfgGfasgsu	299
AD-65084	А-129958	AfsusUfcUfaCfaAfAfAfgGfuAfaAfuAfuUfL96	213	A-129959	asAfsuAfuUfuAfcCfuuuUfgUfaGfaAfusasu	300
AD-65099	А-129948	UfsusUfcUfcAfcAfAfAfuAfaAfaGfaGfaUfL96	214	A-129949	asUfscUfcUfuUfuAfuuuGfuGfaGfaAfasgsg	301
AD-65100	А-129962	UfsasUfcAfaGfaUfUfAfuAfaAfaUfaAfcAfL96	215	A-129963	usGfsuUfaUfuUfuAfuaaUfcUfuGfaUfasus c	302
AD-65090	А-129960	CfsusUfcUfuGfaAfAfGfaU faGfuGfuUfaAfL96	216	A-129961	usUfsaAfcAfcU faUfcuuUfcAfaGfaAfgs cs a	303
AD-65085	А-129972	GfsasAfuGfuU fuGfCfCfaAfgAfgAfcUfuAfL96	217	A-129973	usAfsaGfuCfuCfuUfggcAfaAfcAfuUfcsas c	304
AD-65062	А-129980	AfsusAfuUfcCfuUfUfGfgU faAfcAfaAfuAfL96	218	A-129981	usAfsuUfuGfuU faCfcaaAfgGfaAfuAfususu	305
AD-65164	А-130230	CfsgsUfcAfuCfaAfAfUfaAfgUfgCfuUfgAfL96	219	A-130231	usCfsaAfgCfaCfuUfauuUfgAfuGfaCfgsas c	306
AD-65139	А-130206	UfscsCfuGfcAfaAfAfGfaAfcUfuU faCfcUfL96	220	A-130207	asGfsgU faAfaGfuUfcuuU fuGfcAfgGfasusa	307
AD-65151	А-130210	CfsasAfuGfuUfuGfCfCfaAfgAfgAfcUfuAfL96	221	A-130211	usAfsaGfuCfuCfuUfggcAfaAfcAfuUfgsas c	308
AD-65158	А-130228	AfsgsAfcAfcAfaGfCfAfcAfaUfuUfaUfaAfL96	222	A-130229	usUfsaUfaAfaU fuGfugcUfuGfuGfuCfuscs c	309
AD-65078	А-129956	CfsgsAfgUfcAfcAfAfAfgAfaAfuGfuUfuAfL96	223	A-129957	usAfsaAfcAfuU fuCfuuuGfuGfaCfuCfgsasu	310
AD-65161	А-130182	AfsusCfuUfgAfaAfGfAfuAfgUfgUfuAfcAfL96	224	A-130183	usGfsuAfaCfaCfuAfucuUfuCfaAfgAfusgs c	311
AD-65076	А-130016	AfsasUfgUfgGfuCfAfUfcAfaAfuAfaGfuAfL96	225	A-130017	usAfscUfuAfuUfuGfaugAfcCfaCfaUfusgs c	312
AD-65093	А-130006	GfsusU faCfuCfuUfUfGfaGfaUfuGfuGfuAfL96	226	A-130007	usAfs cAfcAfaU fcUfcaaAfgAfgUfaAfcs cs a	313
AD-65156	А-130196	GfsusUfcUfuGfaAfAfGfaUfaGfuGfuUfaAfL96	227	A-130197	usUfsaAfcAfcUfaUfcuuUfcAfaGfaAfcscsa	314
AD-65059	А-129934	GfsasCfuUfuGfgAfGfGfaGfaAfgAfaUfuAfL96	228	A-129935	usAfsaUfuCfuUfcUfccuCfcAfaAfgUfcsasa	315
AD-65073	А-129968	AfscsCfuGfcAfaAfAfGfaAfcUfuUfaCfcUfL96	229	A-129969	asGfsgUfaAfaGfuUfcuuUfuGfcAfgGfususa	316
AD-65074	А-129984	AfsusCfgAfgUfcAfCfAfaAfgAfaAfuGfuUfL96	230	A-129985	asAfscAfuUfuCfuUfuguGfaCfuCfgAfususu	317
AD-65092	А-129990	UfsgsAfcAfcAfaGfCfAfcAfaUfuUfaUfaAfL96	231	A-129991	usUfsaUfaAfaUfuGfugcUfuGfuGfuCfascsc	318
AD-65097	А-129992	GfsgsUfcAfuCfaAfAfUfaAfgUfgCfuUfgAfL96	232	A-129993	usCfsaAfgCfaCfuUfauuU fgAfuGfaCfcsas c	319
AD-65101	А-129978	UfsgsGfuCfaUfcAfAfAfuAfaGfuGfcUfuAfL96	233	A-129979	usAfsaGfcAfcUfuAfuuuGfaUfgAfcCfascsa	320
AD-65131	А-130172	AfsgsCfcAfgAfaAfAfGfaUfaUfcAfaGfaUfL96	234	A-130173	asUfscUfuGfaUfaUfcuuUfuCfuGfgCfususu	321
AD-65159	А-130244	CfsusUfaCfuCfuUfUfGfaGfaUfuGfuGfuAfL96	235	A-130245	usAfscAfcAfaUfcUfcaaAfgAfgUfaAfgscsa	322
AD-65150	А-130194	UfsusUfcUfaCfaAfAfAfgGfuAfaAfuAfuUfL96	236	A-130195	asAfsuAfuUfuAfcCfuuuUfgUfaGfaAfasasu	323
AD-65060	А-129950	CfsasCfaAfuGfgAfAfUfgU fgGfcGfuUfuAfL96	237	A-129951	usAfsaAfcGfcCfaCfauuCfcAfuUfgUfgsusu	324
AD-65098	А-130008	UfsusAfcUfcUfuUfGfAfgAfuUfgUfgUfaAfL96	238	A-130009	usUfsaCfaCfaAfuCfucaAfaGfaGfuAfascsc	325
AD-65067	А-129966	UfsasCfuCfuUfuGfAfGfaUfuGfuGfuAfaAfL96	239	A-129967	usUfsuAfcAfcAfaUfcucAfaAfgAfgUfasasc	326
AD-65065	А-129936	UfsgsCfcAfgAfaAfAfGfaUfaUfcAfaGfaUfL96	240	A-129937	asUfscUfuGfaUfaUfcuuUfuCfuGfgCfasusu	327
AD-65095	А-129946	UfsusCfuUfgAfaAfGfAfuAfgUfgUfuAfcAfL96	241	A-129947	usGfsuAfaCfaCfuAfucuUfuCfaAfgAfasgsc	328
AD-65126	А-130186	GfsasCfaAfuGfgAfAfUfgU fgGfcGfuUfuAfL96	242	A-130187	usAfsaAfcGfcCfaCfauuCfcAfuU fgUfcsusu	329
AD-65157	А-130212	AfsasUfaAfaAfuAfAfCfcCfaAfcGfgAfuAfL96	243	A-130213	usAfsuCfcGfuUfgGfguuAfuUfuUfaUfusasu	330
AD-65086	А-129988	CfsusUfaAfaAfcAfUfCfuGfaAfaGfuGfgAfL96	244	A-129989	usCfscAfcUfuUfcAfgauGfuUfuUfaAfgsasa	331
AD-65167	А-130200	AfsasUfcAfaGfaUfUfAfuAfaAfaUfaAfcAfL96	245	A-130201	usGfsuUfaUfuUfuAfuaaUfcUfuGfaUfususc	332
AD-65071	А-129938	AfsgsUfaAfcGfuGfGfAfaUfcUfgGfaUfuAfL96	246	A-129939	usAfsaUfcCfaGfaUfuccAfcGfuUfaCfuscsa	333
AD-65066	А-129952	UfsasU faAfaGfgAfGfUfuGfaUfaU fgAfgAfL96	247	A-129953	usCfsuCfaUfaUfcAfacuCfcUfuUfaUfasasa	334
AD-65165	А-130246	AfsusAfcUfcUfuUfGfAfgAfuUfgUfgUfaAfL96	248	A-130247	usUfsaCfaCfaAfuCfucaAfaGfaGfuAfuscsc	335
AD-65132	А-130188	AfsasUfaAfaGfgAfGfUfuGfaUfaUfgAfgAfL96	249	A-130189	usCfsuCfaUfaUfcAfacuCfcUfuUfaUfusasa	336
AD-65125	А-130170	CfsasCfuUfuGfgAfGfGfaGfaAfgAfaUfuAfL96	250	A-130171	usAfsaUfuCfuUfcUfccuCfcAfaAfgUfgsasa	337
AD-65091	А-129974	UfsasUfaAfaAfuAfAfCfcCfaAfcGfgAfuAfL96	251	A-129975	usAfsuCfcGfuUfgGfguuAfuUfuUfaUfasasu	338
AD-65136	А-130252	GfsasAfuGfuGfgUfCfAfuCfaAfaU faAfgU fL96	252	A-130253	asCfsuUfaUfuU fgAfugaCfcAfcAfuUfcscsu	339
AD-65137	А-130174	UfsgsUfaAfcGfuGfGfAfaUfcUfgGfaUfuAfL96	253	A-130175	usAfsaUfcCfaGfaUfuccAfcGfuUfaCfascsa	340
AD-65140	А-130222	UfsusCfgAfgUfcAfCfAfaAfgAfaAfuGfuU fL96	254	A-130223	asAfs cAfuUfuCfuUfuguGfaCfuCfgAfasusu	341
AD-65128	А-130218	UfsusAfuUfcCfuUfUfGfgUfaAfcAfaAfuAfL96	255	A-130219	usAfsuUfuGfuUfaCfcaaAfgGfaAfuAfasusu	342
AD-65088	А-130020	AfscsAfcAfaGfcAfCfAfaUfuUfaUfaCfcAfL96	256	A-130021	usGfsgUfaUfaAfaUfuguGfcUfuGfuGfuscsa	343
AD-65160	А-130260	CfsusGfgAfaUfcUfGfGfaUfuCfuCfaCfuAfL96	257	A-130261	usAfsgU fgAfgAfaUfccaGfaUfuCfcAfgsgsu	344

-97045013

AD-65152	A-130226	GfsusUfaAfaAfcAfUfCfuGfaAfaGfuGfgAfL96	258	A-130227	usCfscAfcUfuUfcAfgauGfuUfuUfaAfcsasa	345
AD-65133	A-130204	AfsasCfuCfuUfuGfAfGfaUfuGfuGfuAfaAfL96	259	A-130205	usUfsuAfcAfcAfaUfcucAfaAfgAfgUfusasc	346
AD-65082	A-130018	GfscsAfaUfgUfgGfUfCfaUfcAfaAfuAfaAfL96	260	A-130019	usUfsuAfuUfuGfaUfgacCfaCfaUfuGfcsusu	347
AD-65094	A-130022	GfsusGfgAfaUfcUfGfGfaUfuCfuCfaCfuAfL96	261	A-130023	usAfsgUfgAfgAfaUfccaGfaUfuCfcAfcsgsu	348
AD-65155	A-130180	GfsgsCfaUfuGfuUfGfGfaGfgAfaCfaAfaAfL96	262	A-130181	usUfsuU fgUfuCfcUfccaAfcAfaU fgCfcsusg	349
AD-65163	A-130214	UfsusUfgUfuGfgAfGfGfaAfcAfaAfcUfcUfL96	263	A-130215	asGfsaGfuUfuGfuUfccuCfcAfaCfaAfasgsc	350
AD-65144	A-130192	GfsgsAfgUfcAfcAfAfAfgAfaAfuGfuUfuAfL96	264	A-130193	usAfsaAfcAfuUfuCfuuuGfuGfaCfuCfcsasu	351
AD-65096	A-129976	AfsusUfgUfuGfgAfGfGfaAfcAfaAfcUfcUfL96	265	A-129977	asGfsaGfuUfuGfuUfccuCfcAfaCfaAfusgsc	352
AD-65142	A-130254	UfsasUfgUfgGfuCfAfUfcAfaAfuAfaGfuAfL96	266	A-130255	usAfscUfuAfuUfuGfaugAfcCfaCfaUfasgsc	353
AD-65141	A-130238	CfsasAfaAfgAfuGfCfUfuGfuAfaGfgGfaAfL96	267	A-130239	usUfs cCfcUfuAfcAfagcAfuCfuU fuUfgs esc	354
AD-65079	A-129970	GfsusCfuGfuGfcUfGfGfcUfaUfaAfaGfaAfL96	268	A-129971	usUfscUfuUfaUfaGfccaGfcAfcAfgAfcscsa	355
AD-65102	A-129994	Af sgsCfaGfuGfuUfGfAfaGfaAfuGfcCfaAfL96	269	A-129995	usUfsgGfcAfuUfcUfucaAfcAfcUfgCfusasa	356
AD-65138	A-130190	GfsusGfuGfuGfgAfGfGfgUfcAfcUfcAfuAfL96	270	A-130191	usAfsuGfaGfuGfaCfccuCfcAfcAfcAfcsgsu	357
AD-65075	A-130000	GfsasAfaAfgAfuGfCfUfuGfuAfaGfgGfaAfL96	271	A-130001	usUfscCfcUfuAfcAfagcAfuCfuUfuUfcscsc	358
AD-65080	A-129986	AfscsAfuCfuGfaAfAfGfuGfgCfaCfaCfcAfL96	272	A-129987	usGfsgU fgUfgCfcAfcuuUfcAfgAfuGfususu	359
AD-65145	A-130208	CfsusCfuGfuGfcUfGfGfcUfaUfaAfaGfaAfL96	273	A-130209	usUfscUfuUfaUfaGfccaGfcAfcAfgAfgscsa	360
AD-65169	A-130232	UfsgsCfaGfuGfuUfGfAfaGfaAfuGfcCfaAfL96	274	A-130233	usUfsgGfcAfuUfcUfucaAfcAfcUfgCfasasa	361
AD-65061	A-129964	UfsusCfuUfaAfaAfCfAfuCfuGfaAfaGfuAfL96	275	A-129965	usAfscUfuUfcAfgAfuguUfuUfaAfgAfasgsa	362
AD-65135	A-130236	UfsasGfcAfcAfaUfUfUfaUfaCfcAfaCfuAfL96	276	A-130237	usAfsgUfuGfgUfaUfaaaUfuGfuGfeUfasgsu	363
AD-65068	A-129982	UfsgsGfaAfuGfuGfGfCfgU fuUfgGfuGf gAfL96	277	A-129983	usCfs cAfcCfaAfaCfgccAfcAfuUfcCfasusu	364
AD-65148	A-130256	CfscsAfaUfgUfgGfUfCfaUfcAfaAfuAfaAfL96	278	A-130257	usUfsuAfuUfuGfaUfgacCfaCfaUfuGfgsusu	365
AD-65072	A-129954	CfsusGfuGfuGfgAfGfGfgUfcAfcUfcAfuAfL96	279	A-129955	usAfsuGfaGfuGfaCfccuCfcAfcAfcAfgsgsu	366
AD-65146	A-130224	UfscsAfuCfuGfaAfAfGfuGfgCfaCfaCfcAfL96	280	A-130225	usGfsgUfgUfgCfcAfcuuUfcAfgAfuGfasusu	367
AD-65129	A-130234	CfscsAfcAfaUfuUfAfUfaCfcAfaCfuGfuUfL96	281	A-130235	asAfscAfgUfuGfgUfauaAfaUfuGfuGfgsusu	368
AD-65064	A-130012	CfsasCfaAfgCfaCfAfAfuU fuAfuAfcCfaAfL96	282	A-130013	usUfsgGfuAfuAfaAfuugU fgCfuUfgUfgsusc	369
AD-65134	A-130220	AfsgsGfaAfuGfuGfGfCfgUfuUfgGfuGfgAfL96	283	A-130221	usCfscAfcCfaAfaCfgccAfcAfuUfcCfususu	370
AD-65063	A-129996	GfscsAfcAfaU fuUfAfUfaCfcAfaCfuGfuU fL96	284	A-129997	asAfs cAfgUfuGfgUfauaAfaUfuGfuGfcsusu	371
AD-65089	A-129944	CfsgsCfaUfuGfuUfGfGfaGfgAfaCfaAfaAfL96	285	A-129945	usUfsuUfgUfuCfcUfccaAfcAfaUfgCfgsusg	372
AD-65069	A-129998	AfsasGfcAfcAfaUfUfUfaUfaCfcAfaCfuAfL96	286	A-129999	usAfsgUfuGfgUfaUfaaaUfuGfuGfeUfusgsu	373
AD-65130	A-130250	GfsasCfaAfgCfaCfAfAfuU fuAfuAfcCfaAfL96	287	A-130251	usUfsgGfuAfuAfaAfuugU fgCfuUfgUfcsusc	374
AD-65147	A-130240	UfsusUfuAfcCfcGfGfGfaGfuUfgAfcUfuUfL96	288	A-130241	asAfsaGfuCfaAfcUfcccGfgGfuAfaAfasusu	375
AD-65081	A-130002	AfsusU fuAf cCfcGfGfGfaGfuUfgAfcUfuU fL96	289	A-130003	asAfsaGfuCfaAfcUfcccGfgGfuAfaAfususu	376
AD-65154	A-130258	UfscsAfcAfaGfcAfCfAfaUfuUfaUfaCfcAfL96	290	A-130259	usGfsgUfaUfaAfaUfuguGfcUfuGfuGfascsa	377

- 98 045013

Таблица 5. Скрининг в отношении однократной дозы для KLKB1 человека с помощью анализа с использованием системы Dual-Glo Luciferase®

ID дуплекса	10 нМ, средн.	0,1 нМ, средн.	10 нМ, станд. отклон.	0,1 нМ, станд. отклон.
AD-65077	15, 04	36, 85	1,97	0, 94
AD-65170	11,72	37,36	1, 61	3,43
AD-65103	11,77	40,29	1,72	2,58
AD-65083	14,90	46, 32	1, 64	3,59
AD-65087	14,83	47,05	0, 93	3, 15
AD-65149	15, 68	47,95	1,10	5, 95
AD-64652	17,40	48,15	0, 98	2,10
AD-65162	20,26	48,59	0, 11	6, 03
AD-65153	13,45	49, 10	0, 80	3,51
AD-65084	16, 25	49, 14	1,79	4, 63
AD-65099	14,44	49, 82	2,09	1,40
AD-65100	19, 10	50,71	0,37	1,49
AD-65090	18,90	50, 81	1,95	7,82
AD-65085	15, 98	52,77	0,74	3, 97
AD-65062	16,20	54,87	0, 06	3,28
AD-65164	14,22	55, 83	0, 13	5,41
AD-65139	14,30	56, 04	0, 82	4,47
AD-65151	15,78	56, 12	2,34	8,24
AD-65158	22, 09	56, 30	2, 11	4,24
AD-65078	16, 43	56, 83	2,21	4,52
AD-65161	20,86	56, 93	1,98	2,35
AD-65076	15, 06	57,79	1,13	3, 90
AD-65093	18,51	58,48	1, 65	2,72
AD-65156	21,88	58,48	1,23	5, 06
AD-65059	23, 66	59,20	2,39	9,41
AD-65073	14,96	59, 62	0, 84	4,37
AD-65074	20,38	59, 64	1,70	4,26
AD-65092	25,49	59, 65	1, 13	5, 25
AD-65097	16, 10	59, 84	1,05	6, 04

- 99 045013

AD-65101	17,79	60, 00	1,09	7,50
AD-65131	26, 32	60, 83	3, 13	4,22
AD-65159	20,30	60, 84	1,29	5, 93
AD-65150	26, 14	60, 87	2,74	5, 87
AD-65060	21,85	61,24	2, 64	8, 69
AD-65098	21,82	61,42	1,59	2,06
AD-65067	14,78	61, 63	1,49	1, 15
AD-65065	30,49	61,91	1,08	3, 88
AD-65095	20,31	62,19	0, 93	3,55
AD-65126	22, 68	62,58	2,00	3, 65
AD-65157	37,47	63, 14	1,23	3, 92
AD-65086	32,28	63, 19	2,00	6, 01
AD-65167	26, 43	63,54	1, 61	3, 80
AD-65071	26, 58	64,16	2,30	2, 64
AD-65066	22,13	64,20	1,26	3,77
AD-65165	21,89	64,31	2,14	3,57
AD-65132	21,03	64,52	2, 67	2,21
AD-65125	25, 73	64,78	3, 64	10,30
AD-65091	35, 66	65,28	3, 85	0, 92
AD-65136	19, 19	65, 74	1,46	2, 65
AD-65137	28,04	65,76	1, 12	4,54
AD-65140	27,71	65, 90	2,52	2,03
AD-65128	24,33	66, 14	3, 88	6,36
AD-65088	38,37	66,28	0,75	4,58
AD-65160	25, 02	66, 42	1,10	2,11
AD-65152	48, 65	66,46	2,84	2,02
AD-65133	14,03	66, 60	1,79	1,76
AD-65082	28,29	66, 66	3,48	4,83
AD-65094	26, 65	66,78	0,56	1,41
AD-65155	40,50	66, 99	2,70	1,23
AD-65163	35, 04	67,16	3, 15	4,42
AD-65144	22,23	67,27	1,79	0, 87
AD-65096	36, 47	67,31	2, 64	1,97
AD-65142	19, 07	67,32	3, 01	1,34

- 100 045013

AD-65141	15,21	67,58	1, 60	3,45
AD-65079	29, 27	67,76	2,80	3, 80
AD-65102	30,46	68,54	2,45	1, 65
AD-65138	41,51	68, 68	2,13	5, 34
AD-65075	16, 72	69, 00	1,04	1,14
AD-65080	36,41	69, 03	4,21	3, 96
AD-65145	34,78	69, 34	2, 61	2,95
AD-65169	30, 06	69, 63	2,17	4,29
AD-65061	41,00	70, 18	4,34	3,71
AD-65135	67,86	70,58	2,28	5, 97
AD-65068	30, 14	71,51	3,78	4,08
AD-65148	37,81	71, 67	7,51	2,54
AD-65072	43,46	71,73	1,45	6,71
AD-65146	55, 99	71,80	5, 50	3, 07
AD-65129	34, 09	71, 81	1,22	2,86
AD-65064	37,23	71,84	4, 61	2,50
AD-65134	34,90	71,86	3, 14	2,91
AD-65063	32,52	72,21	2,92	4,47
AD-65089	34,88	73,21	0, 07	0,46
AD-65069	59, 34	73,27	4,47	4,89
AD-65130	38,52	73, 89	1, 69	2,78
AD-65147	69, 27	76, 69	7,33	4,28
AD-65081	55, 75	77,78	4,77	5, 96
AD-65154	45, 69	79, 81	2,01	7,82

Таблица 6. Скрининг в отношении однократной дозы для KLKB1 мыши с помощью анализа с использованием системы Dual-Glo Luciferase®

ID дуплекса	10 hM, средн.	0, 1 hM, средн.	10 hM, станд. отклон.	0,1 hM, станд. отклон.
AD-65077	8, 67	44,09	0, 45	0, 12
AD-65103	13,99	52,56	1, 01	0, 70
AD-65087	11,03	55, 15	0, 53	0, 44
AD-65101	18,50	57,32	1,40	5, 05
AD-65151	13,94	58,04	0, 90	1, 91

- 101 045013

AD-65097	17,04	58,72	1,99	3, 06
AD-65170	25, 69	59, 35	1,72	3,72
AD-65062	32,25	60,50	3,49	0,75
AD-65064	34,48	61, 67	1,44	0, 10
AD-65085	13, 68	61, 86	1,70	3, 87
AD-65063	17,43	61, 92	1, 12	2,56
AD-65153	23,75	62, 67	2,17	2,36
AD-65089	30,93	62,79	0,75	2,15
AD-65074	43,09	63, 07	1,73	4,37
AD-650 67	18,02	63,49	2,41	2,86
AD-65099	48,62	63,58	2,12	4,44
AD-65091	67,51	64, 14	8,48	2,38
AD-65086	41,17	64,14	4,31	2, 61
AD-65059	75, 31	64,20	2,59	3,27
AD-65158	59,18	64,32	3,51	2,00
AD-65095	65, 59	64,35	6, 12	5, 81
AD-65083	32,77	64,54	1,99	3,38
AD-65169	66,29	64,54	3,45	4,37
AD-65125	71,21	64,58	3,75	2,19
AD-65141	34,27	64, 65	2,11	5, 10
AD-65073	47,93	64, 68	2,48	1,94
AD-65142	49, 73	64,74	4,36	5, 42
AD-65128	37,04	64,86	3, 14	0, 92
AD-6507 5	34,53	65, 38	3, 98	1,48
AD-650 68	75, 01	65, 42	1,57	3,56
AD-65148	54,43	65, 52	3, 04	1,57
AD-650 65	110,49	65, 55	4,29	2,79
AD-65071	54,17	65, 62	3, 09	2,92
AD-65061	112,26	65, 87	2,27	2,26
AD-65060	63, 69	65, 90	5, 04	0, 97
AD-6507 6	27,86	65, 98	2,99	3,32
AD-65098	51,86	66, 08	3, 95	6, 10
AD-64652	70,91	66, 42	5, 35	3,70
AD-65154	65, 58	66, 44	3,77	1,79

- 102 045013

AD-65131	104,49	66, 84	3, 11	3,42
AD-65152	46, 64	66, 91	2,11	2,46
AD-65160	18,79	67,16	0, 67	4,48
AD-65133	23,73	67,16	1, 62	3,56
AD-65096	55,79	67,18	3, 11	4,26
AD-65163	62,97	67,20	4,28	0, 88
AD-65157	66, 01	67,22	4,10	3, 60
AD-65092	51,19	67,53	3,56	1,95
AD-65093	52,08	67,55	2,16	1,72
AD-65130	57,52	67,76	6, 66	1,12
AD-65100	74,97	67,91	6, 18	2,73
AD-65102	63,88	67,94	2,90	2,22
AD-65159	59, 98	67,94	6,46	4,35
AD-65165	62,31	67,95	1,86	3, 06
AD-65150	81,30	68,12	8, 66	0,38
AD-65164	34,95	68,44	0, 63	3,58
AD-65136	50,50	68,53	3, 84	0,44
AD-65161	71,46	68, 64	3, 85	1, 88
AD-65088	48,15	68, 68	3,38	1, 80
AD-65134	68,99	68,91	2,75	1,56
AD-65078	63,09	69, 05	4,57	3, 85
AD-65129	18,28	69, 24	1,92	0,72
AD-65155	45, 01	69, 32	3, 93	1,78
AD-65079	47,09	69, 38	0,79	3,42
AD-65126	67,47	69, 39	3,54	7,01
AD-65144	65, 85	69,71	2,58	4,73
AD-65084	81,65	69, 74	4,96	3,77
AD-65162	74,13	69, 80	5,71	3,24
AD-65140	54,32	69, 81	1, 87	3, 84
AD-65139	46, 64	69, 97	6, 00	2,50
AD-65147	66,48	69, 99	4,21	3,72
AD-65069	67,61	70, 00	2,85	2,74
AD-65149	45, 54	70, 01	2, 63	2,08
AD-65072	73,76	70,21	3,59	1,93
AD-65146	79,06	70,25	5, 25	2, 65
AD-65145	41,44	70,43	1,00	3, 89
AD-65132	72,39	70,57	2,20	1, 67
AD-65090	112,31	70,73	6, 67	2,16
AD-65094	35, 82	70, 81	2,77	0, 09
AD-65066	75, 47	70, 83	3,28	4,93
AD-65137	57,80	71,08	2,54	3, 10
AD-65081	62,66	71,12	4,17	6, 09
AD-65082	42,77	71,30	1, 68	1,58
AD-65138	72,87	71,49	1,82	2,34
AD-65080	68,06	72,17	3,20	0,58
AD-65167	73,30	72,47	5, 89	3,39
AD-65135	76, 47	72,83	0,50	2,14
AD-65156	104,49	73, 62	4,93	2,80
AD-65077	15, 04	36, 85	1,97	0, 94
AD-65170	11,72	37,36	1, 61	3,43
AD-65103	11,77	40,29	1,72	2,58

Набор дуплексов также анализировали в отношении дозозависимого эффекта в отношении сайленсинга мРНК KLKB1 человека и KLKB1 мыши с помощью анализа с использованием системы люцифераз Dual-Glo®, описанного выше. Результаты скрининга в отношении KLKB1 человека на клетках Cos7, трансфицированных указанными iRNA для KLKB1, показаны в табл. 7. Результаты скрининга в отноше- 103 045013 нии KLKB1 мыши на клетках Cos7, трансфицированных указанными iRNA для KLKB1, показаны в табл.

8. Данные выражены в виде процента остаточной мРНК в сравнении с отрицательным контролем через

ч.

Таблица 7. Скрининг в отношении дозозависимого эффекта для KLKB1 человека на клетках Cos7 с применением анализа с использованием системы Dual-Glo Luciferase®

KLKB1 мыши на клетках Cos7 > ual-Glo Luciferase®

i. Источники получения реагентов.

Транскрипты.

Конструирование siRNA.

Набор siRNA, целенаправленно воздействующих на F12 человека, фактор свертывания крови XII (человек: ID эталонной последовательности в NCBI NM_000505; ID гена в NCBI:2161), а также на ортологи F12 в исследованиях видовой токсичности (яванский макак: ХМ_005558647; мышь: NM_021489; крыса, NM_001014006) были сконструированы с помощью специально разработанных скриптов на языке R и Python. Эталонная последовательность мРНК F12 человека имеет длину 2060 оснований. Логическое обоснование и способ применения набора конструкций siRNA заключались в следующем: прогнозированную эффективность для каждой потенциальной 19-мерной siRNA от положения 50 до положения 2060 включительно (кодирующий участок и 3'-UTR) мРНК F12 человека (содержащей кодирующий участок и 3'-UTR) определяли с помощью линейной модели, с помощью которой прогнозировали непосредственный показатель нокдауна мРНК, исходя из данных по более чем 20000 различных конструкций siRNA, целенаправленно воздействующих на большое количество генов позвоночных. Поднаборы siRNA для F12 конструировали с идеальными или почти идеальными совпадениями между человеком, яванским макаком и макаком-резусом. Дополнительный поднабор конструировали с идеальными или почти идеальными совпадениями с ортологами F12 мыши или крысы. Для каждой нити siRNA в полном переборе использовали сделанный по индивидуальному заказу скрипт на языке Python для измерения количества и определения положений ошибок спаривания между siRNA и всеми потенциальными выравниваниями в

- 104 045013 транскриптоме целевого вида. Дополнительные баллы присваивали за ошибки спаривания в затравочном участке, определенном в данном случае как положения 2-9 антисмыслового олигонуклеотида, равно как и в сайте расщепления siRNA, определенном в данном случае как положения 10-11 антисмыслового олигонуклеотида.

Относительные баллы за ошибки спаривания составляли 2,8 для ошибок спаривания в затравочном участке, 1,2 для ошибок спаривания в сайте расщепления и 1 для ошибок спаривания в других положениях вплоть до положения 19 антисмыслового олигонуклеотида. Ошибки спаривания в первом положении игнорировали. Балл за специфичность рассчитывали для каждой нити путем суммирования значений каждой взвешенной ошибки спаривания. Предпочтение отдавали тем siRNA, антисмысловой балл которых для человека и макака-крабоеда составлял >3,0, и прогнозированная эффективность представляла собой >70% нокдаун транскрипта F12.

Подробный перечень немодифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей F12 показан в табл. 9. Подробный перечень модифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей F12 показан в табл. 10.

Синтез siRNA.

Последовательности siRNA для F12 синтезировали в масштабе 1 мкмоль на синтезаторе Mermade 192 (BioAutomation) с применением фосфорамидитной химии, используя твердую подложку. Твердая подложка представляла собой стеклянную подложку с заданным размером пор (500 А), нагруженную созданным по индивидуальному заказу лигандом GalNAc, или универсальную твердую подложку (AM biochemical). Вспомогательные реагенты для синтеза, 2'-F- и 2'-О-метил-РНК и дезоксо-фосфорамидиты, получали от Thermo-Fisher (Милуоки, Висконсин) и Hongene (Китай). 2' F, 2'-О-метил, GNA (гликольнуклеиновые кислоты), 5'-фосфат и другие модификации вводили с использованием соответствующих фосфорамидитов. Синтез отдельных нитей, конъюгированных с GalNAc по 3'-концу, выполняли на модифицированной GalNAc CPG-подложке. Сделанную по индивидуальному заказу универсальную твердую CPG-подложку использовали для синтеза отдельных антисмысловых нитей. Время связывания для всех фосфорамидитов (100 мМ в ацетонитриле) составляло 5 мин при использовании 5-этилтио-1Нтетразола (ЕТТ) в качестве активатора (0,6М в ацетонитриле). Фосфоротиоатные связи получали с использованием 50 мМ раствора 3-((диметиламинометилиден)амино)-3Н-1,2,4-дитиазол-3-тиона (DDTT, получали от Chemgenes (Уилмингтон, Массачусетс, США)) в безводном ацетонитриле/пиридине (1:1 объем/объем). Время окисления составляло 3 мин. Все последовательности синтезировали с удалением в конечном итоге группы DMT (без DMT).

По завершении твердофазного синтеза олигорибонуклеотиды отщепляли от твердой подложки и с них снимали защитную группу в запечатанных планшетах с 96 глубокими лунками с использованием 200 мкл реагента в виде водного метиламина при 60°С в течение 20 мин. Для последовательностей, содержащих 2'-рибозные остатки (2'-ОН), которые были защищены группой трет-бутилдиметилсилила (TBDMS), вторую стадию снятия защиты выполняли с применением реагента TEA-3HF (триэтиламина тригидрофторида). В раствор метиламина для удаления защитных групп добавляли 200 мкл диметилсульфоксида (DMSO) и 300 мкл реагента TEA. Добавляли реагент 3HF и раствор инкубировали в течение дополнительных 20 мин при 60°С. В конце стадии отщепления и удаления защитных групп планшету для синтеза давали достичь комнатной температуры и в нем проводили осаждение путем добавления 1 мл смеси ацетонитрил:этанол (9:1). Планшеты охлаждали при -80°С в течение 2 ч и супернатант аккуратно удаляли при помощи многоканальной пипетки. Осадок с олигонуклеотидами ресуспендировали в 20 мМ буфера NaOAc и обессоливали с использованием 5 мл колонки для эксклюзионной хроматографии HiTrap (GE Healthcare) на АКТА Purifier System, оснащенной устройством автоматической подачи образцов А905 и коллектором фракций Frac 950. Обессоленные образцы собирали в 96-луночные планшеты. Образцы из каждой последовательности анализировали при помощи LC-MS для подтверждения идентичности, УФ (260 нм) для количественного определения, а выбранный набор образцов анализировали при помощи IEX-хроматографии для определения чистоты.

Отжиг отдельных нитей F12 осуществляли на автоматическом устройстве Tecan для манипуляции с жидкостями. Эквимолярную смесь смысловых и антисмысловых отдельных нитей объединяли и гибридизовали в 96-луночных планшетах. После объединения отдельных комплементарных нитей 96луночный планшет плотно запечатывали и нагревали в печи при 100°С в течение 10 мин и позволяли ему медленно достичь комнатной температуры за период 2-3 ч. Концентрацию каждого дуплекса нормализовали к 10 мкМ в IX PBS и затем подвергали скрининговым анализам in vitro.

- 105 045013

Таблица 9. Немодифицированные последовательности F12

Название дуплекса	Название смыслового олигонуклеотида	Смысловая последовательность, от 5' к 3'	SEQ ID NO:	Название антисмыслового олигонуклеотида	Антисмысловая последовательность , от 5' к 3'	Положение в NM_000505	SEQ ID NO:
AD-66186	А-132464	GGUGAGCUUGGAGUCAACACU	378	A-132465	AGU GUU GACU C CAAGCU CAC CAG	79_102	428
AD-66157	А-132406	GAGCUUGGAGUCAACACUUUA	379	A-132407	UAAAGU GUU GACU C CAAGCU CAC	82_105	429
AD-66118	А-132326	CUUGGAGUCAACACUUUCGAU	380	A-132327	AUCGAAAGUGUUGACUCCAAGCU	85_108	430
AD-66115	А-132320	UUGGAGUCAACACUUUCGAUU	381	A-132321	AAU C GAAAGU GUU GACU C CAAGC	86_109	431
AD-66170	А-132432	AACACUUUCGAUUCCACCUUA	382	A-132433	UAAGGUGGAAUCGAAAGUGUUGA	94_117	432
AD-66166	А-132424	AGGAGCAUAAGUACAAAGCUA	383	A-132425	UAGCUUUGUACUUAUGCUCCUUG	126_149	433
AD-66173	А-132438	GAGCAUAAGUACAAAGCUGAA	384	A-132439	UUCAGCUUUGUACUUAUGCUCCU	128_151	434
AD-66177	А-132446	UAAGUACAAAGCUGAAGAGCA	385	A-132447	UGCUCUUCAGCUUUGUACUUAUG	133_156	435
AD-66161	А-132414	AAGUACAAAGCUGAAGAGCAA	386	A-132415	UUGCUCUUCAGCUUUGUACUUAU	134_157	436
AD-66114	А-132318	UАС СACAAAU GUАС С САСААА	387	A-132319	UUUGUGGGUACAUUUGUGGUACA	218_241	437
AD-66179	А-132450	С СACAAAU GUАС С СACAAG GA	388	A-132451	UCCUUGUGGGUACAUUUGUGGUA	220_243	438
AD-66160	А-132412	UACUGUUUGGAGCCCAAGAAA	389	A-132413	UUUCUUGGGCUCCAAACAGUAUC	305_328	439
AD-66171	А-132434	ACUGUUUGGAGCCCAAGAAAA	390	A-132435	UUUUCUUGGGCUCCAAACAGUAU	306_329	440
AD-66189	А-132470	CUGUUUGGAGCCCAAGAAAGU	391	A-132471	ACUUUCUUGGGCUCCAAACAGUA	307_330	441
AD-66122	А-132334	GGAGСССAAGAAAGUGAAAGA	392	A-132335	UCUUUCACUUUCUUGGGCUCCAA	313_336	442
AD-66176	А-132444	GAGСССAAGAAAGUGAAAGAA	393	A-132445	UUCUUUCACUUUCUUGGGCUCCA	314_337	443
AD-66125	А-132340	AG С С СAAGAAAGU GAAAGACА	394	A-132341	UGUCUUUCACUUUCUUGGGCUCC	315_338	444
AD-66112	А-132314	G С С СAAGAAAGU GAAAGAC СА	395	A-132315	UGGUCUUUCACUUUCUUGGGCUC	316_339	445
AD-66172	А-132436	С С СAAGAAAGU GAAAGAC САА	396	A-132437	UUGGUCUUUCACUUUCUUGGGCU	317_340	446
AD-66127	А-132344	CAAGAAAGU GAAAGAC CAUUA	397	A-132345	UAAUGGUCUUUCACUUUCUUGGG	319_342	447
AD-66162	А-132416	GAAAGU GAAAGAC СACU G САА	398	A-132417	UUGCAGUGGUCUUUCACUUUCUU	322_345	448
AD-66181	А-132454	AAAGU GAAAGAC СACU G СAGA	399	A-132455	UCUGCAGUGGUCUUUCACUUUCU	323_346	449
AD-66184	А-132460	UCACUGGAAACCACUGCCAGA	400	A-132461	UCUGGCAGUGGUUUCCAGUGAGG	420_443	450
AD-66182	А-132456	ACUGCCAGAAAGAGAAGUGCU	401	A-132457	AGCACUUCUCUUUCUGGCAGUGG	432_455	451
AD-66167	А-132426	CUGCCAGAAAGAGAAGUGCUU	402	A-132427	AAGCACUUCUCUUUCUGGCAGUG	433_456	452
AD-66165	А-132422	CAGAAAGAGAAGU GCUUU GAA	403	A-132423	UUCAAAGCACUUCUCUUUCUGGC	437_460	453
AD-66155	А-132402	AGAAAGAGAAGU GCUUU GAGA	404	A-132403	UCUCAAAGCACUUCUCUUUCUGG	438_461	454
AD-66159	А-132410	AGUGCUUUGAGCCUCAGCUUA	405	A-132411	UAAGCUGAGGCUCAAAGCACUUC	447_470	455
AD-66168	А-132428	UU C CACAAGAAU GAGAUAU GA	406	A-132429	U CAUAU CU CAUU CUU GU GGAAAA	476_499	456
AD-66185	А-132462	U C CACAAGAAU GAGAUAU G GU	407	A-132463	AC CAUAU CU CAUU CUU GU GGAAA	477_500	457
AD-66156	А-132404	C CACAAGAAU GAGAUAU G GUA	408	A-132405	UAC CAUAU CU CAUU CUU GU GGAA	478_501	458
AD-66113	А-132316	AAGAAU GAGAUAU G GUAUAGA	409	A-132317	U CUAUAC CAUAU CU CAUU CUU GU	482_505	459
AD-66188	А-132468	UGGUAUAGAACUGAGCAAGCA	410	A-132469	UGCUUGCU CAGUU CUAUAC CAUA	494_517	460
AD-66190	А-132472	GUAUAGAACUGAGCAAGCAGA	411	A-132473	UCUGCUUGCU CAGUU CUAUAC CA	496_519	461
AD-66180	А-132452	AUAGAACUGAGCAAGCAGCUA	412	A-132453	UAGCU GCUU GCU CAGUU CUAUAC	498_521	462
AD-66117	А-132324	CCAGAUGCCAGUGCAAGGGUA	413	A-132325	UACCCUUGCACUGGCAUCUGGCC	522_545	463
AD-66169	А-132430	GCCAGUGCAAGGGUCCUGAUA	414	A-132431	UAUCAGGACCCUUGCACUGGCAU	528_551	464
AD-66174	А-132440	CAGUGCAAGGGUCCUGAUGCA	415	A-132441	UGCAUCAGGACCCUUGCACUGGC	530_553	465
AD-66175	А-132442	ACCAAGGCAAGCUGCUAUGAU	416	A-132443	AUCAUAGCAGCUUGCCUUGGUGU	683_706	466
AD-66158	А-132408	CCAAGGCAAGCUGCUAUGAUA	417	A-132409	UAUCAUAGCAGCUUGCCUUGGUG	684_707	467
AD-66119	А-132328	AGGCUUCAUGUCCCACUCAUA	418	A-132329	UAUGAGUGGGACAUGAAGCCUAG	974_997	468
AD-66187	А-132466	GGCUCCGCAAGAGUCUGUCUU	419	A-132467	AAGACAGACUCUUGCGGAGCCGC	1131_1154	469
AD-66163	А-132418	GCUCCGCAAGAGUCUGUCUUA	420	A-132419	UAAGACAGACUCUUGCGGAGCCG	1132_1155	470
AD-66116	А-132322	СCGCAAGAGUCUGUCUUCGAU	421	A-132323	AU C GAAGACAGACU CUU GC GGAG	1135_1158	471
AD-66137	А-132364	GUUCGAGGGGGCUGAAGAAUA	422	A-132365	UAUUCUUCAGCCCCCUCGAACUG	1570_1593	472
AD-66183	А-132458	GGAAGGCAAGAUUGUGUCCCA	423	A-132459	UGGGACACAAUCUUGCCUUCCAU	1956_1979	473
AD-66164	А-132420	AGGCAAGAUUGUGUCCCAUUA	424	A-132421	UAAUGGGACACAAUCUUGCCUUC	1959_1982	474
AD-66121	А-132332	AACUCAAUAAAGUGCUUUGAA	425	A-132333	UUCAAAGCACUUUAUUGAGUUUC	2017_2040	475
AD-66126	А-132342	AAUAAAGU GCUUU GAAAAC GU	426	A-132343	AC GUUUU CAAAGCACUUUAUU GA	2022_2045	476
AD-66178	А-132448	AGUGCUUUGAAAAUGCUGAGA	427	A-132449	UCUCAGCAUUUUCAAAGCACUUU	2027_2050	477

- 106045013

Таблица 10. Модифицированные последовательности F12

				Название
	Название		SEQ	антисмыс-		SEQ
Название	СМЫСЛОВОГО	Смысловая последовательность,	ID	лового	Антисмысловая последовательность, от	ID
дуплекса	олигонук-	от 5' к 3'	NO:	олигонук-	5' к 3'	NO:
	леотида			леотида
AD-66186	А-132464	GfsgsUfgAfgCfuUfGfGfaGfuCfaAfcAfcUfL96	478	A-132465	asGfsuGfuUfgAfcUfccaAfgCfuCfaCfcsasg	528
AD-66157	А-132406	GfsasGfcUfuGfgAfGfUfcAfaCfaCfuUfuAfL96	479	A-132407	usAfsaAfgUfgUfuGfacuCfcAfaGfcUfcsasc	529
AD-66118	А-132326	CfsusU fgGfaGfuCfAfAfcAfcUfuUfcGfaU fL96	480	A-132327	asUfs cGfaAfaGfuGfuugAfcUfcCfaAfgscsu	530
AD-66115	А-132320	UfsusGfgAfgUfcAfAfCfaCfuUfuCfgAfuUfL96	481	A-132321	asAfsuCfgAfaAfgUfguuGfaCfuCfcAfasgsc	531
AD-66170	А-132432	AfsasCfaCfuUfuCfGfAfuUfcCfaCfcUfuAfL96	482	A-132433	usAfsaGfgUfgGfaAfucgAfaAfgUfgUfusgsa	532
AD-66166	А-132424	AfsgsGfaGfcAfuAfAfGfuAfcAfaAfgCfuAfL96	483	A-132425	usAfsgCfuUfuGfuAfcuuAfuGfcUfcCfususg	533
AD-66173	А-132438	GfsasGfcAfuAfaGfUfAfcAfaAfgCfuGfaAfL96	484	A-132439	usUfscAfgCfuUfuGfuacUfuAfuGfcUfcscsu	534
AD-66177	А-132446	UfsasAfgUfaCfaAfAfGfcUfgAfaGfaGfcAfL96	485	A-132447	usGfscUfcUfuCfaGfcuuUfgUfaCfuUfasusg	535
AD-66161	А-132414	AfsasGfuAfcAfaAfGfCfuGfaAfgAfgCfaAfL96	486	A-132415	usUfsgCfuCfuUfcAfgcuUfuGfuAfcUfusasu	536
AD-66114	А-132318	UfsasCfcAfcAfaAfUfGfuAfcCfcAfcAfaAfL96	487	A-132319	usUfsuGfuGfgGfuAfcauU fuGfuGfgUfascsa	537
AD-66179	А-132450	CfscsAfcAfaAfuGfUfAfcCfcAfcAfaGfgAfL96	488	A-132451	usCfs cU fuGfuGfgGfuacAfuUfuGfuGfgsusa	538
AD-66160	А-132412	UfsasCfuGfuUfuGfGfAfgCfcCfaAfgAfaAfL96	489	A-132413	usUfsuCfuUfgGfgCfuccAfaAfcAfgUfasusc	539
AD-66171	А-132434	AfscsU fgUfuU fgGfAfGfcCfcAfaGfaAfaAfL96	490	A-132435	usUfsuUfcUfuGfgGfcucCfaAfaCfaGfusasu	540
AD-66189	А-132470	CfsusGfuUfuGfgAfGfCfcCfaAfgAfaAfgU fL96	491	A-132471	asCfsuUfuCfuU fgGfgcuCfcAfaAfcAfgsusa	541
AD-66122	А-132334	GfsgsAfgCfcCfaAfGfAfaAfgUfgAfaAfgAfL96	492	A-132335	usCfsuU fuCfaCfuUfucuU fgGfgCfuCfcsasa	542
AD-66176	А-132444	GfsasGfcCfcAfaGfAfAfaGfuGfaAfaGfaAfL96	493	A-132445	usUfscUfuUfcAfcUfuucUfuGfgGfcUfcscsa	543
AD-66125	А-132340	Af sgsCfcCfaAfgAfAfAfgU fgAfaAfgAfcAfL96	494	A-132341	usGfsuCfuUfuCfaCfuuuCfuUfgGfgCfus esc	544
AD-66112	А-132314	GfscsCfcAfaGfaAfAfGfuGfaAfaGfaCfcAfL96	495	A-132315	usGfsgUfcUfuUfcAfcuuUfcUfuGfgGfcsusc	545
AD-66172	А-132436	CfscsCfaAfgAfaAfGfUfgAfaAfgAfcCfaAfL96	496	A-132437	usUfsgGfuCfuUfuCfacuUfuCfuUfgGfgscsu	546
AD-66127	А-132344	CfsasAfgAfaAfgUfGfAfaAfgAfcCfaUfuAfL96	497	A-132345	usAfsaUfgGfuCfuUfucaCfuUfuCfuUfgsgsg	547
AD-66162	А-132416	GfsasAfaGfuGfaAfAfGfaCfcAfuUfgCfaAfL96	498	A-132417	usUfsgCfaAfuGfgUfcuuUfcAfcUfuUfesusu	548
AD-66181	А-132454	AfsasAfgUfgAfaAfGfAfcCfaUfuGfcAfgAfL96	499	A-132455	usCfsuGfcAfaU fgGfucuU fuCfaCfuUfus csu	549
AD-66184	А-132460	UfscsAfcUfgGfaAfAfCfcAfcUfgCfcAfgAfL96	500	A-132461	usCfsuGfgCfaGfuGfguuUfcCfaGfuGfasgsg	550
AD-66182	А-132456	AfscsUfgCfcAfgAfAfAfgAfgAfaGfuGfcUfL96	501	A-132457	asGfscAfcUfuCfuCfuuuCfuGfgCfaGfusgsg	551
AD-66167	А-132426	CfsusGfcCfaGfaAfAfGfaGfaAfgUfgCfuUfL96	502	A-132427	asAfsgCfaCfuUfcUfcuuUfcUfgGfcAfgsusg	552
AD-66165	А-132422	CfsasGfaAfaGfaGfAfAfgU fgCfuUfuGfaAfL96	503	A-132423	usUfs cAfaAfgCfaCfuucUfcUfuUfcUfgsgs c	553
AD-66155	А-132402	AfsgsAfaAfgAfgAfAfGfuGfcUfuUfgAfgAfL96	504	A-132403	usCfsuCfaAfaGfcAfcuuCfuCfuUfuCfusgsg	554
AD-66159	А-132410	AfsgsU fgCfuU fuGfAfGfcCfuCfaGfcUfuAfL96	505	A-132411	usAfsaGfcUfgAfgGfcucAfaAfgCfaCfusus c	555
AD-66168	А-132428	UfsusCfcAfcAfaGfAfAfuGfaGfaUfaUfgAfL96	506	A-132429	usCfsaUfaUfcUfcAfuucUfuGfuGfgAfasasa	556
AD-66185	А-132462	UfscsCfaCfaAfgAfAfUfgAfgAfuAfuGfgUfL96	507	A-132463	asCfscAfuAfuCfuCfauuCfuUfgUfgGfasasa	557
AD-66156	А-132404	CfscsAfcAfaGfaAfUfGfaGfaUfaU fgGfuAfL96	508	A-132405	usAfscCfaUfaUfcUfcauUfcUfuGfuGfgsasa	558
AD-66113	А-132316	AfsasGfaAfuGfaGfAfUfaUfgGfuAfuAfgAfL96	509	A-132317	usCfsuAfuAfcCfaUfaucUfcAfuUfcUfusgsu	559
AD-66188	А-132468	UfsgsGfuAfuAfgAfAfCfuGfaGfcAfaGfcAfL96	510	A-132469	usGfs cU fuGfcUfcAfguuCfuAfuAfcCfasusa	560
AD-66190	А-132472	GfsusAfuAfgAfaCfUfGfaGfcAfaGfcAfgAfL96	511	A-132473	usCfsuGfcUfuGfcUfcagUfuCfuAfuAfesesa	561
AD-66180	А-132452	AfsusAfgAfaCfuGfAfGfcAfaGfcAfgCfuAfL96	512	A-132453	usAfsgCfuGfcUfuGfcucAfgUfuCfuAfusasc	562
AD-66117	А-132324	CfscsAfgAfuGfcCfAfGfuGfcAfaGfgGfuAfL96	513	A-132325	usAfscCfcUfuGfcAfcugGfcAfuCfuGfgsesc	563
AD-66169	А-132430	GfscsCfaGfuGfcAfAfGfgGfuCfcUfgAfuAfL96	514	A-132431	usAfsuCfaGfgAfcCfcuuGfcAfcUfgGfcsasu	564
AD-66174	А-132440	CfsasGfuGfcAfaGfGfGfuCfcUfgAfuGfcAfL96	515	A-132441	usGfscAfuCfaGfgAfcccUfuGfcAfcUfgsgsc	565
AD-66175	А-132442	AfscsCfaAfgGfcAfAfGfcU fgCfuAfuGfaU fL96	516	A-132443	asUfs cAfuAfgCfaGfcuuGfcCfuUfgGfusgsu	566
AD-66158	А-132408	CfscsAfaGfgCfaAfGfCfuGfcUfaUfgAfuAfL96	517	A-132409	usAfsuCfaUfaGfcAfgcuUfgCfcUfuGfgsusg	567
AD-66119	А-132328	AfsgsGfcUfuCfaUfGfUfcCfcAfcUfcAfuAfL96	518	A-132329	usAfsuGfaGfuGfgGfacaU fgAfaGfcCfusasg	568
AD-66187	А-132466	GfsgsCfuCfcGfcAfAfGfaGfuCfuGfuCfuUfL96	519	A-132467	asAfsgAfcAfgAfcUfcuuGfcGfgAfgCfesgs c	569
AD-66163	А-132418	GfscsUfcCfgCfaAfGfAfgUfcUfgUfcUfuAfL96	520	A-132419	usAfsaGfaCfaGfaCfucuUfgCfgGfaGfesesg	570
AD-66116	А-132322	CfscsGfcAfaGfaGfUfCfuGfuCfuUfcGfaU fL96	521	A-132323	asUfs cGfaAfgAfcAfgacUfcUfuGfcGfgsasg	571
AD-66137	А-132364	GfsusUfcGfaGfgGfGfGfcU fgAfaGfaAfuAfL96	522	A-132365	usAfsuUfcUfuCfaGfcccCfcUfcGfaAfesusg	572
AD-66183	А-132458	GfsgsAfaGfgCfaAfGfAfuUfgUfgUfcCfcAfL96	523	A-132459	usGfsgGfaCfaCfaAfucuU fgCfcUfuCfcsasu	573
AD-66164	А-132420	AfsgsGfcAfaGfaUfUfGfuGfuCfcCfaUfuAfL96	524	A-132421	usAfsaUfgGfgAfcAfcaaUfcUfuGfcCfususc	574
AD-66121	А-132332	AfsasCfuCfaAfuAfAfAfgUfgCfuUfuGfaAfL96	525	A-132333	usUfscAfaAfgCfaCfuuuAfuUfgAfgUfususc	575
AD-66126	А-132342	AfsasUfaAfaGfuGfCfUfuUfgAfaAfaCfgUfL96	526	A-132343	asCfsgUfuUfuCfaAfagcAfcUfuUfaUfusgsa	576
AD-66178	А-132448	AfsgsUfgCfuUfuGfAfAfaAfuGfcUfgAfgAfL96	527	A-132449	usCfsuCfaGfcAfuUfuucAfaAfgCfaCfususu	577

Пример 4. Скрининг дуплексов siRNA для F12 in vitro.

Культура клеток и трансфекции.

Hep3b или клетки, представляющие собой первичные гепатоциты мыши (РМН) (MSCP10, № партии МС613), трансфицировали путем добавления 4,9 мкл Opti-MEM с 0,1 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по каталогу 13778-150) d 5 мкл дуплексов siRNA в каждой лунке в 384-луночном планшете и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем сорок мкл DMEM (Hep3b) в среде Е по Уильямсу (РМН), содержащей приблизительно 5х10³ клеток, добавляли в смесь siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК.

- 107 045013

Выделение общей РНК с применением набора DYNABEADS mRNA Isolation Kit.

РНК выделяли при помощи автоматизированного протокола на платформе BioTek-EL406 с применением парамагнитных микрочастиц DYNABEADS (Invitrogen, № по каталогу 61012). Вкратце, 50 мкл смеси лизирующего/связывающего буфера и 25 мкл лизирующего буфера, содержащего 3 мкл магнитных гранул, вносили в планшет с клетками. Планшеты инкубировали на электромагнитном шейкере в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем магнитные гранулы фиксировали и удаляли супернатант. Связанную с гранулами РНК затем промывали 2 раза 150 мкл промывочного буфера А и однократно промывочным буфером В. Гранулы затем промывали 150 мкл элюирующего буфера, повторно фиксировали и удаляли супернатант.

Синтез кДНК с использованием набора для обратной транскрипции ABI High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Форстер-Сити, Калифорния, № по кат. 4368813)

Десять мкл мастер-микса, содержащего 1 мкл 10х буфера, 0,4 мкл 25 х dNTP, 1 мкл 10х случайных праймеров, 0,5 мкл обратной транскриптазы, 0,5 мкл ингибитора РНКазы и 6, 6 мкл Н₂О на реакцию, добавляли в РНК, выделенную как описано выше. Планшеты запечатывали, перемешивали и инкубировали на электромагнитном шейкере в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего в течение 2 ч при 37°С. Планшеты затем инкубировали при 81°С в течение 8 мин.

ПЦР в режиме реального времени.

Два мкл кДНК добавляли в мастер-микс, содержащий 0,5 мкл зонда TaqMan для GAPDH (Hs99999905_ml или 4352339Е), 0,5 мкл зонда для F12 (Hs00166821 или Mm00491349) и 5 мкл мастермикса с зондом Lightcycler 480 (Roche, № по каталогу 04887301001) на лунку в 384-луночные планшеты (Roche, № по каталогу 04887301001). ПЦР в режиме реального времени выполняли с применением системы LightCycler480 для ПЦР в режиме реального времени (Roche) с применением ΔΔCt (RQ)-анализа. Каждый дуплекс исследовали в четырех независимых трансфекциях.

Для расчета относительного кратного изменения данные в реальном времени анализировали с использованием способа AACt и нормализовали относительно анализов, выполненных с клетками, трансфицированными с помощью 10 нМ AD-1955, или ложно-трансфицированными клетками. Значения IC₅₀рассчитывали с применением модели согласования по 4 параметрам с использованием XLFit и нормализовали относительно данных для клеток, трансфицированных AD-1955, контролем, не осуществляющим целенаправленное воздействие, или интактных клеток.

Смысловая и антисмысловая последовательности AD-1955 представляют собой:

Смысловая: ' ™ ^N0:

Антисмысловая: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 2344) .

В табл. 11 приведены результаты скрининга в отношении однократной дозы в клетках Hep3b, трансфицированных указанными iRNA для F12 человека. В табл. 12 приведены результаты скрининга в отношении ответа на однократную дозу в клетках Hep3b, трансфицированных указанными iRNA для F12 человека. В табл. 13 приведены результаты скрининга в отношении однократной дозы в первичных гепатоцитах мыши, трансфицированных указанными iRNA для F12 мыши. В табл. 14 приведены результаты скрининга в отношении дозозависимого эффекта в первичных гепатоцитах мыши, трансфицированных указанными iRNA для F12 человека. Данные выражены в виде процента остаточной мРНК в сравнении с AD-1955.

- 108 045013

Таблица 11. Скрининг в отношении однократной дозы для F12 в клетках НерЗЬ

ID дуплекса	10 нМ, средн.	0,1 нМ, средн.	10 нМ, станд. отклон.	0,1 нМ, станд. отклон.
AD-66186	33, 1	88,4	5, 3	12, 6
AD-66157	62,2	85, 3	9, 6	13,2
AD-66118	47,4	59, 4	2,9	10, 6
AD-66115	54,8	73, 9	4,8	3
AD-66170	31, 6	57,3	3, 9	12,5
AD-66166	74,7	88,8	14,3	15, 8
AD-66173	22,3	58,5	7, 6	11,8
AD-66177	52,9	86, 7	6, 9	6, 3
AD-66161	50,3	59, 9	7,9	10
AD-66114	42,1	82,3	5, 3	8,5
AD-66179	78,4	101,4	14,3	16, 1
AD-66160	45, 4	82,3	13,4	18,5
AD-66171	74,8	126, 2	12,1	28,2
AD-66189	49, 3	78,1	16, 6	9, 1
AD-66122	47,2	94,9	7,4	7,5
AD-66176	42,7	69, 4	5, 2	7
AD-66125	46	91,8	7,5	17,4
AD-66112	60,4	136, 8	11,4	14,4
AD-66172	34,9	70,2	13, 1	11,1
AD-66127	39, 5	73,3	8,5	12,4
AD-66162	79, 1	93, 6	13	24,7
AD-66181	59, 8	101,7	1,2	5, 4
AD-66184	34	72,9	7,8	14,9
AD-66182	47	101	8,8	7,9
AD-66167	30,3	60,2	2, 6	5, 9
AD-66165	44,3	63,2	11,4	22,3
AD-66155	45, 3	72,8	13,5	16, 1
AD-66159	49, 6	98	8,4	31,2
AD-66168	25, 5	52,9	5, 8	16, 6
AD-66185	40, 8	81,7	3, 8	11,5

- 109045013

AD-66156	30, 8	75, 6	4,4	5, 4
AD-66113	42,1	76	8,1	5, 9
AD-66188	43, 9	82,1	9, 1	15,4
AD-66190	40,2	74,9	9	8,3
AD-66180	34, 6	83, 1	6, 6	23,3
AD-66117	48,9	108, 1	4,1	9, 5
AD-66169	64,9	89, 4	9, 8	1, 9
AD-66174	55, 4	107, 6	7,9	23
AD-66175	37,9	104,7	4	19,7
AD-66158	55	107,3	14,7	31,7
AD-66119	27, 6	69, 8	3,4	4,3
AD-66187	53,3	105	19, 6	9, 6
AD-66163	33, 6	53, 9	5, 1	4, 9
AD-66116	33, 9	57,4	10,4	12, 6
AD-66137	103, 4	136, 7	6, 6	15, 9
AD-66183	36, 5	91,9	8	12,7
AD-66164	31,3	78,2	5, 1	6, 4
AD-66121	26, 5	72,1	2,7	18,3
AD-66126	33,2	56, 7	2, 6	12,6
AD-66178	51,1	72,1	6, 3	16,5

Таблица 12. Скрининг в отношении дозозависимого эффекта для F12 в клетках Hep3b

ID дуплекса	IC₅₀ (hM)
AD-66170	0, 085
AD-66173	0,244
AD-66176	нет данных
AD-66125	нет данных
AD-66172	0,398
AD-66167	0,457
AD-66165	0, 058
AD-66168	0, 657
AD-66163	0,481
AD-66116	0, 089
AD-66126	0, 086

- 110 045013

Таблица 13. Скрининг в отношении однократной дозы для F12 в первичных гепатоцитах мыши

ID дуплекса	10 нМ, средн.	0,1 нМ, средн.	10 нМ, станд. отклон.	0,1 нМ, станд. отклон.
AD-66186	93, 1	102, 6	2	6, 6
AD-66157	97,4	114,5	16, 5	17
AD-66118	65, 9	93	11, 6	11,9
AD-66115	61, 8	89	5, 5	8,9
AD-66170	88	98,5	11,7	8,4
AD-66166	106, 8	98,5	8,8	5, 2
AD-66173	106, 8	106	11,2	14,8
AD-66177	87,5	103	3, 6	3,2
AD-66161	94,4	103, 1	7	15, 9
AD-66114	38, 6	79, 1	4,1	5
AD-66179	71,1	105, 7	6, 8	18,2
AD-66160	14, 6	106, 8	1,2	8,7
AD-66171	17,7	102,5	2,3	6, 1
AD-66189	9, 1	90,2	1,3	6, 1
AD-66122	14,4	95, 7	0,7	13, 9
AD-66176	10, 9	85, 8	2,1	4, 6
AD-66125	12, 6	80,5	2,1	6, 2
AD-66112	19, 1	82	7,2	3,5
AD-66172	4,2	75, 3	0,4	6, 7
AD-66127	7,4	48,4	3,7	7,3
AD-66162	3, 9	30, 6	1,9	4,9
AD-66181	7,2	69, 2	0, 9	4,1
AD-66184	93, 6	110, 9	4,1	6, 8
AD-66182	13,4	89, 9	1,3	2
AD-66167	4,8	55, 5	0,5	2, 6
AD-66165	2,1	18,7	0,3	3, 6
AD-66155	5, 7	48	0,7	5, 1
AD-66159	7,2	88,7	0,5	3,7
AD-66168	65, 6	105, 6	1, 6	11,3
AD-66185	96	108,9	3, 1	16

- 111 045013

AD-66156	56, 8	107,2	3,5	8,8
AD-66113	72,8	88,7	4,8	5, 5
AD-66188	117,5	95, 5	17,3	4,9
AD-66190	118,3	96, 5	5, 8	8,4
AD-66180	121,4	109, 3	15, 2	6, 6
AD-66117	72,3	89, 1	7,4	8,5
AD-66169	89, 4	103,7	8,8	4,2
AD-66174	92	103,4	18,1	8,4
AD-66175	89, 5	112,9	13,7	8,9
AD-66158	103, 9	105, 3	11,5	15, 2
AD-66119	66, 5	92	8,9	9
AD-66187	109, 1	107	16, 4	10,3
AD-66163	89, 9	106	6, 8	6, 1
AD-66116	69, 8	97	8,2	10, 6
AD-66137	17, 6	94,1	2,1	8,7
AD-66183	100, 1	109, 6	7, 6	8,4
AD-66164	84	98,8	10,2	9, 8
AD-66121	2,5	30,5	0,4	3,2
AD-66126	4,1	22,3	0,3	2,3
AD-66178	79, 6	112,8	6, 8	16, 5

Таблица 14. Скрининг в отношении дозозависимого эффекта для F12 в первичных гепатоцитах мыши

ID дуплекса	1С₅₀ (нМ)
AD-66170	нет данных
AD-66173	нет данных
AD-66176	3,571
AD-66125	14,962
AD-66172	1, 104
AD-66167	1, 013
AD-66165	0,231
AD-66168	нет данных
AD-66163	нет данных
AD-66116	нет данных
AD-66121	0, 119
AD-66126	0, 045

Пример 5. Синтез iRNA для KNG1.

Источники получения реагентов.

Транскрипты.

Конструирование siRNA.

Набор siRNA, целенаправленно воздействующих на KNG1 человека, кининоген 1 (человек: ID эталонной последовательности в NCBI NM_001166451; ID гена в NCBI: 3827), а также на ортологи KNG1 в исследованиях видовой токсичности (яванский макак: ХМ_0055454бЗ; мыши: NM_001102409; крыса, NM_012 696) были сконструированы с помощью специально разработанных скриптов на языке R и Python. Эталонная последовательность NM_001166451 мРНК человека имеет длину 2035 оснований. Логическое обоснование и способ применения набора конструкций siRNA заключались в следующем: прогнозированную эффективность для каждой потенциальной 19-мерной siRNA от положения 235 до положения 2035 включительно (кодирующий участок и 3'-UTR) определяли с помощью линейной модели, с помощью которой прогнозировали непосредственный показатель нокдауна мРНК, исходя из данных по более чем 20000 различных конструкций siRNA, целенаправленно воздействующих на большое количество генов позвоночных. Поднаборы siRNA для KNG1 конструировали с идеальными или почти

- 112 045013 идеальными совпадениями между человеком и яванским макаком. Дополнительный поднабор конструировали с идеальными или почти идеальными совпадениями с ортологами KNG1 мыши или крысы. Для каждой нити siRNA в полном переборе использовали сделанный по индивидуальному заказу скрипт на языке Python для измерения количества и определения положений ошибок спаривания между siRNA и всеми потенциальными выравниваниями в транскриптоме целевого вида. Дополнительные баллы присваивали за ошибки спаривания в затравочном участке, определенном в данном случае как положения 29 антисмыслового олигонуклеотида, равно как и в сайте расщепления siRNA, определенном в данном случае как положения 10-11 антисмыслового олигонуклеотида.

Относительные баллы за ошибки спаривания составляли 2,8 для ошибок спаривания в затравочном участке, 1,2 для ошибок спаривания в сайте расщепления и 1 для ошибок спаривания в других положениях вплоть до положения 19 антисмыслового олигонуклеотида. Ошибки спаривания в первом положении игнорировали. Балл за специфичность рассчитывали для каждой нити путем суммирования значений каждой взвешенной ошибки спаривания. Предпочтение отдавали тем siRNA, антисмысловой балл которых для человека и макака-крабоеда составлял >3,0, и прогнозированная эффективность представляла собой >70% нокдаун транскрипта NM_001166451.

Подробный перечень немодифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей KNG1 показан в табл. 15. Подробный перечень модифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей KNG1 показан в табл. 16.

Синтез siRNA.

Последовательности siRNA для KNG1 синтезировали в масштабе 1 мкмоль на синтезаторе Mermade 192 (BioAutomation) с применением фосфорамидитной химии при посредстве твердой подложки. Твердая подложка представляла собой стеклянную подложку с заданным размером пор (500 А), нагруженную созданным по индивидуальному заказу лигандом GalNAc, или универсальную твердую подложку (AM biochemical). Вспомогательные реагенты для синтеза, 2'-F- и 2'-О-метил-РНК и дезоксо-фосфорамидиты, получали от Thermo-Fisher (Милуоки, Висконсин) и Hongene (Китай). 2'F, 2'-О-метил, GNA (гликольнуклеиновые кислоты), 5'-фосфат и другие модификации вводили с использованием соответствующих фосфорамидитов. Синтез отдельных нитей, конъюгированных с GalNAc по 3'-концу, выполняли на модифицированной GalNAc CPG-подложке. Сделанную по индивидуальному заказу универсальную твердую CPG-подложку использовали для синтеза отдельных антисмысловых нитей. Время связывания для всех фосфорамидитов (100 мМ в ацетонитриле) составляло 5 мин при использовании 5-этилтио-1Нтетразола (ЕТТ) в качестве активатора (0,6М в ацетонитриле). Фосфоротиоатные связи получали с использованием 50 мМ раствора 3-((диметиламино-метилиден)амино)-3Н-1,2,4-дитиазол-3-тиона (DDTT, получали от Chemgenes (Уилмингтон, Массачусетс, США) ) в безводном ацетонитриле/пиридине (1:1 объем/объем). Время окисления составляло 3 мин. Все последовательности синтезировали с удалением в конечном итоге группы DMT (без DMT).

По завершении твердофазного синтеза олигорибонуклеотиды отщепляли от твердой подложки и с них снимали защитную группу в запечатанных планшетах с 96 глубокими лунками с использованием 200 мкл реагента в виде водного метиламина при 60°С в течение 20 мин. Для последовательностей, содержащих 2'-рибозные остатки (2'-ОН), которые были защищены группой трет-бутилдиметилсилила (TBDMS), вторую стадию снятия защиты выполняли с применением реагента TEA-3HF (триэтиламина тригидрофторида). Для удаления защитных групп в раствор метиламина добавляли 200 мкл диметилсульфоксида (DMSO) и 300 мкл реагента TEA-3HF, и раствор инкубировали в течение дополнительных 20 мин при 60°С. В конце стадии отщепления и удаления защитных групп планшету для синтеза давали достичь комнатной температуры, и в нем проводили осаждение путем добавления 1 мл смеси ацетонитрил:этанол (9:1). Планшеты охлаждали при -80°С в течение 2 ч и супернатант аккуратно удаляли при помощи многоканальной пипетки. Осадок с олигонуклеотидами ресуспендировали в 20 мМ буфера NaOAc и обессоливали с использованием 5 мл колонки для эксклюзионной хроматографии HiTrap (GE Healthcare) на АКТА Purifier System, оснащенной устройством автоматической подачи образцов А905 и коллектором фракций Frac 950. Обессоленные образцы собирали в 96-луночные планшеты. Образцы из каждой последовательности анализировали при помощи LC-MS для подтверждения идентичности, УФ (260 нм) для количественного определения, а выбранный набор образцов анализировали при помощи IEX-хроматографии для определения чистоты.

Отжиг отдельных нитей KNG1 осуществляли на автоматическом устройстве Тесап для манипуляции с жидкостями. Эквимолярную смесь смысловых и антисмысловых отдельных нитей объединяли и гибридизовали в 96-луночных планшетах. После объединения отдельных комплементарных нитей 96луночный планшет плотно запечатывали и нагревали в печи при 100°С в течение 10 мин, и позволяли ему медленно достичь комнатной температуры за период 2-3 ч. Концентрацию каждого дуплекса нормализовали к 10 мкМ в 1х PBS и затем подвергали скрининговым анализам in vitro.

- 113 045013

Таблица 15. Немодифицированные последовательности KNG1

Название дуплекса	Название смыслового олигонуклеотида	Смысловая последовательность, от 5' к 3'	SEQ ID NO:	Название антисмыслового олигонуклеотида	Антисмысловая последовательность , от 5' к 3'	SEQ ID NO:	Положение в NM_001166451
AD-66259	А-132506	GAGGAAAUUGACUGCAAUGAA	578	A-132507	UUCAUUGCAGUCAAUUUCCUCGG	647	301_324
AD-66261	А-132510	САС GUUUUAUU С CUU CAAGUA	579	A-132511	UACUU GAAGGAAUAAAAC GU GU C	648	438_461
AD-66262	А-132512	UAC CUACU CAAUU GU GCAAAA	580	A-132513	UUUUGCACAAUUGAGUAGGUAAU	649	822_845
AD-66263	А-132514	CUUUCUAUUUCAAGAUUGACA	581	A-132515	U GU CAAU CUU GAAAUAGAAAGUU	650	1118_1141
AD-66260	А-132508	ААС СACAU GUU С СAAG GAAAA	582	A-132509	UUUUCCUUGGAACAUGUGGUUUC	651	1206_1229
AD-66341	А-132670	AAUAAAAGAAGAAACAACU GU	583	A-132671	ACAGUU GUUU CUU CUUUUAUUU C	652	1416_1439
AD-66345	А-132678	AGAAGAAACAACU GUAAGU СА	584	A-132679	U GACUUACAGUU GUUUCUUCUUU	653	1422_1445
AD-66328	А-132644	CGGGAUUCAGGAAAAGAACAA	585	A-132645	UUGUUCUUUUCCUGAAUCCCGCU	654	1480_1503
AD-66317	А-132622	GGGAUUCAGGAAAAGAACAAA	586	A-132623	UUUGUUCUUUUCCUGAAUCCCGC	655	1481_1504
AD-66333	А-132654	GGAUUCAGGAAAAGAACAAGA	587	A-132655	UCUUGUUCUUUUCCUGAAUCCCG	656	1482_1505
AD-66338	А-132664	GAUUCAGGAAAAGAACAAGGA	588	A-132665	UCCUUGUUCUUUUCCUGAAUCCC	657	1483_1506
AD-66343	А-132674	AUUCAGGAAAAGAACAAGGGA	589	A-132675	UCCCUUGUUCUUUUCCUGAAUCC	658	1484_1507
AD-66319	А-132626	АААСAU GAAC GU GAC СAAG GA	590	A-132627	U C CUU GGU CAC GUU CAU GUUUAU	659	1567_1590
AD-66346	А-132680	CACGAACAACAGCAUGGUCUU	591	A-132681	AAGAC CAU GCU GUU GUU C GU GU C	660	1624_1647
AD-66329	А-132646	GGUCUUGGUCAUGGACAUAAA	592	A-132647	UUUAU GU C CAU GAC CAAGAC CAU	661	1639_1662
AD-66270	А-132528	CUUGGUCAUGGACAUAAGUUA	593	A-132529	UAACUUAU GU C CAU GAC CAAGAC	662	1642_1665
AD-66279	А-132546	UUGGUСAUGGACAUAAGUUСА	594	A-132547	U GAACUUAU GU C CAU GAC CAAGA	663	1643_1666
AD-66273	А-132534	GGUCAUGGACAUAAGUUCAAA	595	A-132535	UUU GAACUUAU GU C CAU GAC CAA	664	1645_1668
AD-66264	А-132516	AU GGACAUAAGUU CAAACUUA	596	A-132517	UAAGUUU GAACUUAU GU C CAU GA	665	1649_1672
AD-66342	А-132672	GGACAUAAGUU CAAACUU GAU	597	A-132673	AU CAAGUUU GAACUUAU GU C CAU	666	1651_1674
AD-66278	А-132544	CAUAAGUU CAAACUU GAU GAU	598	A-132545	AU CAU CAAGUUU GAACUUAU GU C	667	1654_1677
AD-66277	А-132542	AUAAGUU CAAACUU GAU GAUA	599	A-132543	UAU CAU CAAGUUU GAACUUAU GU	668	1655_1678
AD-66267	А-132522	UU CAAACUU GAU GAU GAU CUU	600	A-132523	AAGAU CAU CAU CAAGUUU GAACU	669	1660_1683
AD-66325	А-132638	U CAAACUU GAU GAU GAU CUUA	601	A-132639	UAAGAU CAU CAU CAAGUUU GAAC	670	1661_1684
AD-66320	А-132628	AACUU GAU GAU GAU CUU GAAA	602	A-132629	UUU CAAGAU CAU CAU CAAGUUU G	671	1664_1687
AD-66336	А-132660	GU C CUU GAC CAU GGACAUAAA	603	A-132661	UUUAU GU C CAU GGU CAAG GACAU	672	1699_1722
AD-66280	А-132548	GACCAUGGACAUAAGCAUAAA	604	A-132549	UUUAU GCUUAU GU C CAU GGU CAA	673	1705_1728
AD-66272	А-132532	AUGGACAUAAGCAUAAGCAUA	605	A-132533	UAUGCUUAUGCUUAUGUCCAUGG	674	1709_1732
AD-66275	А-132538	GAAUGGAAAGCACAAUGGUUA	606	A-132539	UAACCAUUGUGCUUUCCAUUCUU	675	1767_1790
AD-66348	А-132684	GAAAGCACAAUGGUUGGAAAA	607	A-132685	UUUU С CAAC CAUU GU GCUUU C CA	676	1772_1795
AD-66340	А-132668	AAGCACAAUGGUUGGAAAACA	608	A-132669	UGUUUUCCAACCAUUGUGCUUUC	677	1774_1797
AD-66330	А-132648	AUGGUUGGAAAACAGAGCAUU	609	A-132649	AAUGCUCUGUUUUCCAACCAUUG	678	1781_1804
AD-66306	А-132600	GGUUGGAAAACAGAGCAUUUA	610	A-132601	UAAAUGCUCUGUUUUCCAACCAU	679	1783_1806
AD-66322	А-132632	AUUUGGCAAGCUCUUCUGAAA	611	A-132633	UUUCAGAAGAGCUUGCCAAAUGC	680	1799_1822
AD-66274	А-132536	U CUU CU GAAGACAGUACUACA	612	A-132537	U GUAGUACU GU CUU CAGAAGAGC	681	1810_1833
AD-66271	А-132530	CAGAGU GAU GAC GAUU G GAUA	613	A-132531	UAU C CAAUC GUCAUCACUCUGUA	682	1975_1998
AD-66339	А-132666	CUUU CAUUUAAC C CAAUAU CA	614	A-132667	UGAUAUUGGGUUAAAUGAAAGGC	683	2023_2046
AD-66276	А-132540	UUU CAUUUAAC C CAAUAU CAA	615	A-132541	UUGAUAUUGGGUUAAAUGAAAGG	684	2024_2047
AD-66281	А-132550	UUUAAC C CAAUAUCAGAUUUU	616	A-132551	AAAAUCUGAUAUUGGGUUAAAUG	685	2029_2052
AD-66313	А-132614	UUAAC C CAAUAU CAGAUUUUA	617	A-132615	UAAAAUCUGAUAUUGGGUUAAAU	686	2030_2053
AD-66307	А-132602	GUGGCUAUGGGUAUUUCUUUA	618	A-132603	UAAAGAAAUAC C CAUAGC CACUU	687	2172_2195
AD-66309	А-132606	UUUCUUUCAUACUUUAUUAAA	619	A-132607	UUUAAUAAAGUAUGAAAGAAAUA	688	2185_2208
AD-66316	А-132620	UUCUUUCAUACUUUAUUAAAA	620	A-132621	UUUUAAUAAAGUAU GAAAGAAAU	689	2186_2209
AD-66321	А-132630	UCUUUCAUACUUUAUUAAAGU	621	A-132631	ACUUUAAUAAAGUAU GAAAGAAA	690	2187_2210
AD-66323	А-132634	UU CAUACUUUAUUAAAGUAUA	622	A-132635	UAUACUUUAAUAAAGUAU GAAAG	691	2190_2213
AD-66315	А-132618	CUUUAUUAAAGUAU CAAUAUA	623	A-132619	UAUAUU GAUACUUUAAUAAAGUA	692	2196_2219
AD-662 68	А-132524	UUUAUUAAAGUAU CAAUAU CA	624	A-132525	U GAUAUU GAUACUUUAAUAAAGU	693	2197_2220
AD-66332	А-132652	AAGUAU CAAUAU CCCUCUCUA	625	A-132653	UAGAGAGGGAUAUUGAUACUUUA	694	2204_2227

- 114 045013

AD-66303	А-132594	CAUU GU С CAGAU GAAAAUAUA	626	A-132595	UAUAUUUU CAU CU GGACAAU GGA	695	2225_2248
AD-66334	А-132656	AU GAAAAUAU С CU GAUAUAAU	627	A-132657	AUUAUAU CAGGAUAUUUU CAU CU	696	2235_2258
AD-66331	А-132650	U CU С САС GGACU GCAUAAAAU	628	A-132651	AUUUUAUGCAGUCCGUGGAGACU	697	2327_2350
AD-66326	А-132640	CACGGACUGCAUAAAAUUGUA	629	A-132641	UACAAUUUUAU GCAGU С C GU GGA	698	2331_2354
AD-66312	А-132612	CUGCAAUUGGCUUCUCUGAUA	630	A-132613	UAUCAGAGAAGCCAAUUGCAGCA	699	2441_2464
AD-66304	А-132596	U GAUAACAAAUAU GUAC CUUA	631	A-132597	UAAGGUACAUAUUU GUUAU CAGA	700	2457_2480
AD-66324	А-132636	UAC CUUACAACAUAU GU CAUA	632	A-132637	UAU GACAUAU GUU GUAAG GUACA	701	2471_2494
AD-66266	А-132520	UACAACAUAU GU CAU GAAUUU	633	A-132521	AAAUU CAU GACAUAU GUU GUAAG	702	2476_2499
AD-66311	А-132610	AUUCUUGUCAUUCUUAAUAAA	634	A-132611	UUUAUUAAGAAU GACAAGAAU CU	703	2507_2530
AD-66335	А-132658	UU CUU GU CAUU CUUAAUAAAA	635	A-132659	UUUUAUUAAGAAU GACAAGAAU C	704	2508_2531
AD-66344	А-132676	UCUUGUCAUUCUUAAUAAACU	636	A-132677	AGUUUAUUAAGAAU GACAAGAAU	705	2509_2532
AD-66305	А-132598	AUUU GAAU GU GU GU GAAAAUA	637	A-132599	UAUUUU CACACACAUU CAAAUAC	706	2542_2565
AD-66318	А-132624	GAAU GU GU GU GAAAAUAAG GA	638	A-132625	U C CUUAUUUU CACACACAUU CAA	707	2546_2569
AD-66308	А-132604	AUGUGUGUGAAAAUAAGGGAA	639	A-132605	UU С C CUUAUUUU CACACACAUU C	708	2548_2571
AD-66327	А-132642	GUGUGUGAAAAUAAGGGAAGU	640	A-132643	ACUU С C CUUAUUUU CACACACAU	709	2550_2573
AD-66337	А-132662	GUGUGAAAAUAAGGGAAGUCA	641	A-132663	U GACUU С C CUUAUUUU CACACAC	710	2552_2575
AD-66347	А-132682	UGUGAAAAUAAGGGAAGUCAA	642	A-132683	UU GACUU С C CUUAUUUU CACACA	711	2553_2576
AD-66269	А-132526	GUGAAAAUAAGGGAAGUCAAA	643	A-132527	UUU GACUU С C CUUAUUUU CACAC	712	2554_2577
AD-66314	А-132616	AAUAAGGGAAGUCAAGAGAUU	644	A-132617	AAUCUCUUGACUUCCCUUAUUUU	713	2559_2582
AD-66265	А-132518	GGGAAGUCAAGAGAUUAAAUA	645	A-132519	UAUUUAAUCUCUUGACUUCCCUU	714	2564_2587
AD-66310	А-132608	UAAAU GCU GAACUUAUUAAUA	646	A-132609	UAUUAAUAAGUUCAGCAUUUAAU	715	2579_2602

Таблица 16. Модифицированные последовательности KNG1

Название дуплекса	Название смыслового олигонуклеотида	Смысловая последовательность, от 5' к 3'	SEQ ID NO:	Название антисмыслового олигонуклеотида	Антисмысловая последовательность, от 5' к 3'	SEQ ID NO:
AD-66259	A-132506	GfsasGfgAfaAfuU fGfAfcUfgCfaAfuGfaAfL96	716	A-132507	usUfscAfuUfgCfaGfucaAfuUfuCfcUfcsgsg	785
AD-66261	A-132510	CfsasCfgUfuUfuAfUfUfcCfuUfcAfaGfuAfL96	717	A-132511	usAfscUfuGfaAfgGfaauAfaAfaCfgUfgsusc	786
AD-66262	A-132512	UfsasCfcUfaCfuCfAfAfuUfgUfgCfaAfaAfL96	718	A-132513	usUfsuUfgCfaCfaAfuugAfgUfaGfgUfasasu	787
AD-66263	A-132514	CfsusUfuCfuAfuUfUfCfaAfgAfuUfgAfcAfL96	719	A-132515	usGfsuCfaAfuCfuUfgaaAfuAfgAfaAfgsusu	788
AD-66260	A-132508	AfsasCfcAfcAfuGfUfUfcCfaAfgGfaAfaAfL96	720	A-132509	usUfsuUfcCfuUfgGfaacAfuGfuGfgUfususc	789
AD-66341	A-132670	AfsasUfaAfaAfgAfAfGfaAfaCfaAfcUfgUfL96	721	A-132671	asCfsaGfuUfgUfuUfcuuCfuUfuUfaUfususc	790
AD-66345	A-132678	AfsgsAfaGfaAfaCfAfAfcUfgU faAfgUfcAfL96	722	A-132679	usGfsaCfuUfaCfaGfuugU fuUfcU fuCfususu	791
AD-66328	A-132644	CfsgsGfgAfuUfcAfGfGfaAfaAfgAfaCfaAfL96	723	A-132645	usUfsgUfuCfuU fuUfccuGfaAfuCfcCfgs csu	792
AD-66317	A-132622	GfsgsGfaUfuCfaGfGfAfaAfaGfaAfcAfaAfL96	724	A-132623	usUfsuGfuUfcUfuUfuccUfgAfaUfcCfcsgsc	793
AD-66333	A-132654	GfsgsAfuUfcAfgGfAfAfaAfgAfaCfaAfgAfL96	725	A-132655	usCfsuU fgUfuCfuUfuucCfuGfaAfuCfcs csg	794
AD-66338	A-132664	GfsasUfuCfaGfgAfAfAfaGfaAfcAfaGfgAfL96	726	A-132665	usCfscUfuGfuUfcUfuuuCfcUfgAfaUfcscsc	795
AD-66343	A-132674	AfsusUfcAfgGfaAfAfAfgAfaCfaAfgGfgAfL96	727	A-132675	usCfs cCfuUfgU fuCfuuuUfcCfuGfaAfus cs c	796
AD-66319	A-132626	AfsasAfcAfuGfaAfCfGfuGfaCfcAfaGfgAfL96	728	A-132627	usCfs cU fuGfgUfcAfcguUfcAfuGfuUfusasu	797
AD-66346	A-132680	CfsasCfgAfaCfaAfCfAfgCfaU fgGfuCfuUfL96	729	A-132681	asAfsgAfcCfaUfgCfuguUfgUfuCfgUfgsusc	798
AD-66329	A-132646	GfsgsUfcUfuGfgUfCfAfuGfgAfcAfuAfaAfL96	730	A-132647	usUfsuAfuGfuCfcAfugaCfcAfaGfaCfcsasu	799
AD-66270	A-132528	CfsusUfgGfuCfaUfGfGfaCfaU faAfgU fuAfL96	731	A-132529	usAfsaCfuUfaUfgUfccaUfgAfcCfaAfgsasc	800
AD-66279	A-132546	UfSUSGfgUfcAfuGfGfAfcAfuAfaGfuUfcAfL96	732	A-132547	usGfsaAfcUfuAfuGfuccAfuGfaCfcAfasgsa	801
AD-66273	A-132534	GfsgsUfcAfuGfgAfCfAfuAfaGfuUfcAfaAfL96	733	A-132535	usUfsuGfaAfcU fuAfuguCfcAfuGfaCfcsasa	802
AD-66264	A-132516	Af sus Gf gAf cAf uAfAf GfuUf cAf aAf cUfuAf L9 6	734	A-132517	usAfsaGfuUfuGfaAfcuuAfuGfuCfcAfusgsa	803
AD-66342	A-132672	Gf sgsAf cAfuAfaGfU fUfcAf aAfcUfuGfaUfL9 6	735	A-132673	asUfscAfaGfuUfuGfaacU fuAfuGfuCfcsasu	804
AD-66278	A-132544	CfsasUfaAfgUfuCfAfAfaCfuUfgAfuGfaUfL96	736	A-132545	asUfscAfuCfaAfgUfuugAfaCfuUfaUfgsusc	805
AD-66277	A-132542	AfsusAfaGfuUfcAfAfAfcUfuGfaUfgAfuAfL96	737	A-132543	usAfsuCfaUfcAfaGfuuuGfaAfcU fuAfusgsu	806
AD-66267	A-132522	UfsusCfaAfaCfuUfGfAfuGfaUfgAfuCfuUfL96	738	A-132523	asAfsgAfuCfaUfcAfucaAfgUfuU fgAfas csu	807

-115045013

AD-66325	A-132638	Ufs csAfaAfcUfuGfAfU fgAfuGfaUf cU fuAfL96	739	A-132639	usAfsaGfaUfcAfuCfaucAfaGfuUfuGfasasc	808
AD-66320	A-132628	AfsasCfuUfgAfuGfAfUfgAfuCfuUfgAfaAfL96	740	A-132629	usUfsuCfaAfgAfuCfaucAfuCfaAfgUfususg	809
AD-66336	A-132660	GfsusCfcUfuGfaCfCfAfuGfgAfcAfuAfaAfL96	741	A-132661	usUfsuAfuGfuCfcAfuggUfcAfaGfgAfcsasu	810
AD-66280	A-132548	GfsasCfcAfuGfgAfCfAfuAfaGfcAfuAfaAfL96	742	A-132549	usUfsuAfuGfcUfuAfuguCfcAfuGfgUfcsasa	811
AD-66272	A-132532	AfsusGfgAfcAfuAfAfGfcAfuAfaGfcAfuAfL96	743	A-132533	usAfsuGfcUfuAfuGfcuuAfuGfuCfcAfusgsg	812
AD-66275	A-132538	GfsasAfuGfgAfaAfGfCfaCfaAfuGfgUfuAfL96	744	A-132539	usAfsaCfcAfuUfgUfgcuUfuCfcAfuUfcsusu	813
AD-66348	A-132684	GfsasAfaGfcAfcAfAfUfgGfuUfgGfaAfaAfL96	745	A-132685	usUfsuUfcCfaAfcCfauuGfuGfcUfuUfcscsa	814
AD-66340	A-132668	AfsasGfcAfcAfaUfGfGfuUfgGfaAfaAfcAfL96	746	A-132669	usGfsuUfuUfcCfaAfccaUfuGfuGfcUfususc	815
AD-66330	A-132648	AfsusGfgUfuGfgAfAfAfaCfaGfaGfcAfuUfL96	747	A-132649	asAfsuGfcUfcUfgUfuuuCfcAfaCfcAfususg	816
AD-66306	A-132600	GfsgsUfuGfgAfaAfAfCfaGfaGfcAfuUfuAfL96	748	A-132601	usAfsaAfuGfcUfcUfguuUfuCfcAfaCfcsasu	817
AD-66322	A-132632	AfsusUfuGfgCfaAfGfCfuCfuUfcUfgAfaAfL96	749	A-132633	usUfsuCfaGfaAfgAfgcuUfgCfcAfaAfusgsc	818
AD-66274	A-132536	UfscsUfuCfuGfaAfGfAfcAfgUfaCfuAfcAfL96	750	A-132537	usGfsuAfgUfaCfuGfucuUfcAfgAfaGfasgsc	819
AD-66271	A-132530	CfsasGfaGfuGfaUfGfAfcGfaU fuGfgAfuAfL96	751	A-132531	usAfsuCfcAfaUfcGfucaUfcAfcUfcUfgsusa	820
AD-66339	A-132666	CfsusUfuCfaUfuUfAfAfcCfcAfaUfaUfcAfL96	752	A-132667	usGfsaUfaUfuGfgGfuuaAfaUfgAfaAfgsgsc	821
AD-66276	A-132540	UfsusUfcAfuUfuAfAfCfcCfaAfuAfuCfaAfL96	753	A-132541	usUfsgAfuAfuUfgGfguuAfaAfuGfaAfasgsg	822
AD-66281	A-132550	UfsusUfaAfcCfcAfAfUfaUfcAfgAfuUfuUfL96	754	A-132551	asAfsaAfuCfuGfaUfauuGfgGfuU faAfasusg	823
AD-66313	A-132614	UfsusAfaCfcCfaAfU fAfuCfaGfaUfuU fuAfL96	755	A-132615	usAfsaAfaUfcU fgAfuauU fgGfgU fuAfasasu	824
AD-66307	A-132602	GfsusGfgCfuAfuGfGfGfuAfuUfuCfuUfuAfL96	756	A-132603	usAfsaAfgAfaAfuAfcccAfuAfgCfcAfcsusu	825
AD-66309	A-132606	UfsusUfcUfuUfcAfUfAfcUfuUfaUfuAfaAfL96	757	A-132607	usUfsuAfaUfaAfaGfuauGfaAfaGfaAfasusa	826
AD-66316	A-132620	UfsusCfuUfuCfaUfAfCfuUfuAfuUfaAfaAfL96	758	A-132621	usUfsuU faAfuAfaAfguaU fgAfaAfgAfasasu	827
AD-66321	A-132630	UfscsUfuUfcAfuAfCfUfuUfaUfuAfaAfgUfL96	759	A-132631	asCfsuUfuAfaUfaAfaguAfuGfaAfaGfasasa	828
AD-66323	A-132634	UfsusCfaUfaCfuUfU fAfuUfaAfaGfuAfuAfL96	760	A-132635	usAfsuAfcUfuUfaAfuaaAfgUfaUfgAfasasg	829
AD-66315	A-132618	CfsusUfuAfuUfaAfAfGfuAfuCfaAfuAfuAfL96	761	A-132619	usAfsuAfuUfgAfuAfcuuUfaAfuAfaAfgsusa	830
AD-66268	A-132524	UfsusUfaUfuAfaAfGfUfaUfcAfaUfaUfcAfL96	762	A-132525	usGfsaUfaUfuGfaUfacuUfuAfaUfaAfasgsu	831
AD-66332	A-132652	AfsasGfuAfuCfaAfUfAfuCfcCfuCfuCfuAfL96	763	A-132653	usAfsgAfgAfgGfgAfuauUfgAfuAfcUfususa	832
AD-66303	A-132594	CfsasUfuGfuCfcAfGfAfuGfaAfaAfuAfuAfL96	764	A-132595	usAfsuAfuUfuUfcAfucuGfgAfcAfaUfgsgsa	833
AD-66334	A-132656	AfsusGfaAfaAfuAfUfCfcUfgAfuAfuAfaUfL96	765	A-132657	asUfsuAfuAfuCfaGfgauAfuUfuUfcAfus csu	834
AD-66331	A-132650	Ufs csUfcCfaCfgGfAfCfuGfcAfuAfaAfaUfL96	766	A-132651	asUfsuU fuAfuGfcAfgucCfgUfgGfaGfas csu	835
AD-66326	A-132640	CfsasCfgGfaCfuGfCfAfuAfaAfaUfuGfuAfL96	767	A-132641	usAfscAfaUfuUfuAfugcAfgUfcCfgUfgsgsa	836
AD-66312	A-132612	CfsusGfcAfaUfuGfGfCfuUfcUfcUfgAfuAfL96	768	A-132613	usAfsuCfaGfaGfaAfgccAfaUfuGfcAfgscsa	837
AD-66304	A-132596	UfsgsAfuAfaCfaAfAfUfaUfgUfaCfcUfuAfL96	769	A-132597	usAfsaGfgUfaCfaUfauuUfgUfuAfuCfasgsa	838
AD-66324	A-132636	UfsasCfcUfuAfcAfAfCfaUfaUfgUfcAfuAfL96	770	A-132637	usAfsuGfaCfaU faUfguuGfuAfaGfgUfas csa	839
AD-66266	A-132520	UfsasCfaAfcAfuAfUfGfuCfaUfgAfaUfuUfL96	771	A-132521	asAfsaUfuCfaUfgAfcauAfuGfuUfgUfasasg	840
AD-66311	A-132610	AfsusUfcUfuGfuCfAfUfuCfuUfaAfuAfaAfL96	772	A-132611	usUfsuAfuUfaAfgAfaugAfcAfaGfaAfuscsu	841
AD-66335	A-132658	UfsusCfuUfgUfcAfUfUfcUfuAfaUfaAfaAfL96	773	A-132659	usUfsuU faUfuAfaGfaauGfaCfaAfgAfasusc	842
AD-66344	A-132676	UfscsUfuGfuCfaUfUfCfuUfaAfuAfaAfcUfL96	774	A-132677	asGfsuUfuAfuUfaAfgaaUfgAfcAfaGfasasu	843
AD-66305	A-132598	AfsusUfuGfaAfuGfU fGfuGfuGfaAfaAfuAfL96	775	A-132599	usAfsuUfuUfcAfcAfcacAfuUfcAfaAfusasc	844
AD-66318	A-132624	GfsasAfuGfuGfuGfU fGfaAfaAfuAfaGfgAfL96	776	A-132625	usCfscUfuAfuUfuUfcacAfcAfcAfuUfcsasa	845
AD-66308	A-132604	AfsusGfuGfuGfuGfAfAfaAfuAfaGfgGfaAfL96	777	A-132605	usUfscCfcUfuAfuUfuucAfcAfcAfcAfususc	846
AD-66327	A-132642	GfsusGfuGfuGfaAfAfAfuAfaGfgGfaAfgUfL96	778	A-132643	asCfsuUfcCfcUfuAfuuuUfcAfcAfcAfcsasu	847
AD-66337	A-132662	GfsusGfuGfaAfaAfUfAfaGfgGfaAfgUfcAfL96	779	A-132663	usGfsaCfuUfcCfcUfuauUfuUfcAfcAfcsasc	848
AD-66347	A-132682	UfsgsUfgAfaAfaUfAfAfgGfgAfaGfuCfaAfL96	780	A-132683	usUfsgAfcUfuCfcCfuuaUfuUfuCfaCfascsa	849
AD-66269	A-132526	GfsusGfaAfaAfuAfAfGfgGfaAfgUfcAfaAfL96	781	A-132527	usUfsuGfaCfuUfcCfcuuAfuUfuUfcAfcsas c	850
AD-66314	A-132616	AfsasUfaAfgGfgAfAfGfuCfaAfgAfgAfuUfL96	782	A-132617	asAfsuCfuCfuUfgAfcuuCfcCfuUfaUfususu	851
AD-66265	A-132518	GfsgsGfaAfgUfcAfAfGfaGfaU fuAfaAfuAfL96	783	A-132519	usAfsuU fuAfaUfcUfcuuGfaCfuUfcCfcsusu	852
AD-66310	A-132608	UfsasAfaUfgCfuGfAfAfcUfuAfuUfaAfuAfL96	784	A-132609	usAfsuU faAfuAfaGfuucAfgCfaU fuUfasasu	853

Пример 6. Скрининг дуплексов siRNA для KNG1 in vitro.

Культура клеток и трансфекции.

Клетки Hep3b трансфицировали путем добавления 4,9 мкл Opti-МЕМ с 0,1 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по каталогу 13778-150) к 5 мкл дуплексов siRNA в каждой лунке в 384-луночном планшете и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем сорок мкл DMEM (Hep3b) в среде Е по Уильямсу (РМН), содержащей приблизительно 5 х10³клеток, добавляли в смесь siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК.

Эксперименты с однократной дозой выполняли при конечной концентрации дуплекса 10 нМ и 0,01 нМ и эксперименты в отношении дозозависимого эффекта проводили в пределах диапазона конечной концентрации дуплекса от 10 нМ до 36 фМ с использованием 8-, 6-кратных разведений.

Синтез кДНК с использованием набора для обратной транскрипции ABI High capacity cDNA reverse

- 116 045013 transcription kit (Applied Biosystems, Форстер-Сити, Калифорния, № по кат. 4368813).

Десять мкл мастер-микса, содержащего 1 мкл 10х буфера, 0,4 мкл 25х dNTP, 1 мкл 10х случайных праймеров, 0,5 мкл обратной транскриптазы, 0,5 мкл ингибитора РНКазы и 6,6 мкл Н₂О на реакцию, добавляли к РНК, выделенной как описано выше. Планшеты запечатывали, перемешивали и инкубировали на электромагнитном шейкере в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего в течение 2 ч при 37°С. Планшеты затем инкубировали при 81°С в течение 8 мин.

ПЦР в режиме реального времени.

Для расчета относительного кратного изменения данные Е реальном времени анализировали с использованием способа AACt и нормализовали относительно анализов, выполненных с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или с ложно-трансфицированными клетками. Значения IC₅₀ рассчитывали с применением модели подбора по 4 параметрам с использованием XLFit и нормализовали относительно данных для клеток, трансфицированных AD-1955, контролем, не осуществляющим целенаправленное воздействие, или интактных клеток.

Смысловая и антисмысловая последовательности AD-1955 представляют собой

Смысловая: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 2343);

Антисмысловая: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 2344).

В табл. 17 приведены результаты скрининга в отношении однократной дозы в клетках Hep3b, трансфицированных указанными iRNA для KNG1 человека. В табл. 18 приведены результаты скрининга в отношении дозозависимого эффекта в клетках Hep3b, трансфицированных указанными iRNA для KNG1 человека. Данные выражены в виде процента остаточной мРНК в сравнении с AD-1955.

Таблица 17. Скрининг в отношении однократной дозы для KNG1 в Hep3b

ID дуплекса	10 нМ, средн.	0,1 нМ, средн.	10 нМ, станд. отклон.	0,1 нМ, станд. отклон.
AD-66259	5	30, 8	1,4	12, 6
AD-66261	14,5	74,9	4,5	37,1
AD-66262	14,4	40,4	12,7	19, 8
AD-66263	23, 8	87,4	33, 9	20, 6

- 117 045013

AD-66260	42,4	78,7	12,8	20,7
AD-66341	30	88,9	11,8	20, 6
AD-66345	79, 5	180	9, 2	57,7
AD-66328	75, 1	74,5	16,8	13,5
AD-66317	30,4	71,5	6, 4	19, 6
AD-66333	66	90,7	23,5	31,4
AD-66338	74,2	123,7	30,4	35, 3
AD-66343	69	86, 9	27,3	24
AD-66319	70, 9	93, 6	10,7	26, 8
AD-66346	68,2	184,8	5, 5	55, 7
AD-66329	73,5	104, 6	15, 6	15, 5
AD-66270	96, 1	80,5	51,4	22,4
AD-66279	54,7	75, 7	28, 6	21,5
AD-66273	141,2	71,9	26, 9	12,9
AD-66264	82, 6	92,3	43,5	25, 1
AD-66342	55, 9	91, 6	12,4	8,5
AD-66278	77,4	62,2	23, 9	17,4
AD-66277	56, 5	86	41,7	31,8
AD-66267	56, 1	68,7	22,4	15, 6
AD-66325	40,3	60, 8	13,5	19, 2
AD-66320	70,4	99, 5	16, 5	6, 2
AD-66336	102,7	94,4	26, 6	21,3
AD-66280	71,9	94,8	32,4	19, 9
AD-66272	150, 9	241, 6	43,7	195, 8
AD-66275	49, 3	100,4	12	40, 6
AD-66348	64,8	117,2	17,2	21,5
AD-66340	56, 7	85, 1	15, 7	26, 4
AD-66330	61,5	97,1	12,4	24,9
AD-66306	36, 1	68,4	8,2	14
AD-66322	59, 9	84,4	14,4	28,8
AD-66274	109, 6	88,2	48	17,3
AD-66271	130, 9	70, 1	25, 3	20, 9
AD-66339	68,4	107,4	29, 3	27,7
AD-66276	40, 6	85	8,8	31

- 118 045013

AD-66281	111, 1	89, 8	54,8	27,2
AD-66313	57,1	112, 6	8,5	35, 9
AD-66307	37,2	70,4	10	5, 4
AD-66309	42,7	58,8	9, 4	11,5
AD-66316	42,2	75, 3	10,3	9, 9
AD-66321	63, 8	106, 1	28	32,4
AD-66323	68,7	89	16,3	21,4
AD-66315	41,4	87,5	7,2	10, 8
AD-66268	81,1	55	34,2	5, 6
AD-66332	59, 6	74, 6	22,8	22,8
AD-66303	63,3	52,3	9, 6	7,1
AD-66334	47,7	72,7	11,9	36, 2
AD-66331	51,1	98,1	13, 6	33,5
AD-66326	53	58,9	5, 7	11,7
AD-66312	76	90, 8	16, 2	19, 8
AD-66304	85, 5	54,3	12,4	4,3
AD-66324	49, 5	63,4	8,2	4,7
AD-66266	118,3	185, 1	21,2	42,8
AD-66311	59	68, 6	4,3	15, 5
AD-66335	65, 8	74,3	9, 6	28,2
AD-66344	113,2	110, 1	41,2	37,7
AD-66305	62,5	100, 6	18,1	32,7
AD-66318	56, 5	60,4	12,5	5, 2
AD-66308	43,7	65, 6	12	12,9
AD-66327	58,5	65, 8	11,9	9, 2
AD-66337	102,8	156, 4	41, 6	32,7
AD-66347	78,4	105, 7	25, 9	24,3
AD-66269	66, 2	85, 1	20,4	15
AD-66314	49, 6	98,3	8,9	25, 3
AD-66265	109, 9	177,7	40, 1	57,8
AD-66310	42,1	73,4	7	27,5

Таблица 18. Скрининг в отношении дозозависимого эффекта для KNG1 в НерЗЬ

ID дуплекса	1С₅₀ (нМ)
AD-66259	0,035
AD-66261	1,02
AD-66262	0,04
AD-66263	0,299
AD-66341	9,181

Пример 7. In vivo сайленсинг KLKB1, F12 и KNG1 у мышей дикого типа.

Для дополнительной оценки были выбраны три наиболее активных средства, целенаправленно воздействующих на KLKB1, описанных выше, три наиболее активных средства, целенаправленно воздействующих на F12, описанных выше, и два наиболее активных средства, целенаправленно воздействующих на KNG1, описанных выше. В частности, дополнительные средства, целенаправленно воздействующие на нуклеотиды 1661-1682, или нуклеотиды 1905-1926, или нуклеотиды 382-403 NM_000892 (ген KLKB1) (фиг. 7), дополнительные средства, целенаправленно воздействующие на нуклеотиды 2017-2040, или нуклеотиды 315-338, или нуклеотиды 438-459 NM_000505 (ген F12) (фиг. 8), и дополнительные средства, целенаправленно воздействующие на нуклеотиды 301-324 или нуклеотиды 822-845 NM_001166451 (ген KNG1) (фиг. 9), синтезировали как описано выше. In vivo эффективность этих дополнительных средств оценивали путем введения однократной подкожной дозы средства мышам C57BL/6 дикого типа и определения уровня мРНК в дни 7-10 после введения дозы. Немодифицированные нуклеотидные последова

- 119 045013 тельности смысловой и антисмысловой нитей средств, представленных на фиг. 7, целенаправленно воздействующих на KLKB1, приведены в табл. 19А, а модифицированные нуклеотидные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, представленных на фиг. 7, приведены в табл. 19В. Немодифицированные нуклеотидные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, представленных на фиг. 8, целенаправленно воздействующих на F12, приведены в табл. 19С, а модифицированные нуклеотидные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, представленных на фиг. 8, приведены в табл. 19D. Немодифицированные нуклеотидные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, представленных на фиг. 9, целенаправленно воздействующих на KNG1, приведены в табл. 19Е, а модифицированные нуклеотидные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, представленных на фиг. 9, приведены в табл. 19F.

В частности, в отношении дополнительных средств, целенаправленно воздействующих на ген KLKB1, мышам C57BL/6 дикого типа вводили однократную дозу 1 или 3 мг/кг средства и определяли уровень мРНК KLKB1 в дни 7-10 после введения дозы. Результаты этих анализов приведены на фиг. 1, на которой продемонстрировано, что AD-66948 был наиболее эффективным средством, целенаправленно воздействующим на тестируемый ген KLKB1.

В отношении дополнительных средств, целенаправленно воздействующих на F12, мышам C57BL/6 дикого типа вводили или однократную дозу 1 мг/кг, или однократную дозу 3 мг/кг, или однократную дозу 1 мг/кг, или однократную дозу 10 мг/кг средства и определяли уровень мРНК F12 в дни 7-10 после введения дозы. Результаты этих анализов приведены на фиг. 2, на которой продемонстрировано, что AD67244 был наиболее эффективным средством, целенаправленно воздействующим на тестируемый ген F12.

В отношении дополнительных средств, целенаправленно воздействующих на ген KNG1, мышам C57BL/6 дикого типа вводили однократную дозу 1 или 3 мг/кг средства и определяли уровень мРНК KNG1 в дни 7-10 после введения дозы. Результаты этих анализов приведены на фиг. 3, на которой продемонстрировано, что AD-67344 был наиболее эффективным средством, целенаправленно воздействующим на тестируемый ген KNG1.

Таблица 19А. Немодифицированные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, целенаправленно воздействующих на KLKB1

Название дуплекса	Мишень	1 я \| s ® 1 в : * '3 Н ОЙО щ Й о § ь § I * § 5 я	Положение смысловой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью из GenBank	Положение антисмысловой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью из GenBank	Последовательность смысловой нити	SEQ ID NO	Последовательность антисмысловой нити	SEQ ID NO
AD-65077	KLKB1	1659	NM_000892,3_1661-1681_s	NM_000892,3_1659-1681_as	AAU С CAAAAUAU U C U ACAAAA	854	UUUUGUAGAAUAUUUUGGAUUUC	863
AD-66944	KLKB1	1659	NM_000892,3_1661-168l_s	NM_000892,3_1659-168l_as	AAU С C AAAAU AU U C U ACAAAA	855	UUUUGUAGAAUAUUUUGGAUUUC	864
AD-66945	KLKB1	1659	NM_000892,3_1661-168 l_s	NM_000892,3_1659-168l_as	AAU С C AAAAU AU U C U ACAAAA	856	UUUUGUAGAAUAUUUUGGAUUUC	865
AD-65087	KLKB1	1903	NM_000892,3_1905-1925_s	NM_000892,3_1903-1925_as	AC CAAAGU C GCU GAGUACAUA	857	UAUGUACUCAGCGACUUUGGUGU	866
AD-66946	KLKB1	1903	NM_000892,3_1905-1925_s	NM_000892,3_1903-1925_as	AC CAAAGU C GCU GAGUACAUA	858	UAUGUACUCAGCGACUUUGGUGU	867
AD-66947	KLKB1	1903	NM_000892,3_1905-1925_s	NM_000892,3_1903-1925_as	AC CAAAGU C GCU GAGUACAUA	859	UAUGUACUCAGCGACUUUGGUGU	868
AD-65103	KLKB1	380	NM_000892,3_382-402_s	NM_000892,3_380-402_as	GUGGUCAUCAAAUAAGUGCUU	860	AAGCACUUAUUUGAUGACCACAU	869
AD-66948	KLKB1	380	NM_000892,3_382-402_s	NM_000892,3_380-402_as	GUGGUCAUCAAAUAAGUGCUU	861	AAGCACUUAUUUGAUGACCACAU	870
AD-66949	KLKB1	380	NM_000892,3_382-402_s	NM_000892,3_380-402_as	GUGGUCAUCAAAUAAGUGCUU	8 62	AAGCACUUAUUUGAUGACCACAU	871

- 120 045013

Таблица 19В. Модифицированные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, целенаправленно воздействующих на KLKB1

(б υ к ф я 0) 1 tn ί) ri К	Мишень	I i I J Hi ri § И ОЙО iH a s О в § 5 E	Положение смысловой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью ид GenBank	Положение антисмысловой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью ид GenBank	Последовательность смысловой нити	SEQ ID NO	Последовательность антисмысловой нити	SEQ ID NO
AD-65077	KLKB1	1659	NM_000892,3_1 661-1681_s	NM_0008 92,3_165 9-1681_as	Af sasUfcCfaAfaAfUfAfuUfcUfaCfaAfa AfL96	872	usUfsuUfgUfaGfaAfuauUfuUfgGfaUfususc	881
AD-66944	KLKB1	1659	NM_000892,3_1 661-1681_s	NM_000892,3_165 9-1681_as	asasuccaAfaAfUfAfuucuacaaaaL96	873	usUfsuugUfaGfAfauauUfuUfggauususc	882
AD-66945	KLKB1	1659	NM_000892,3_1 661-1681_s	NM_000892,3_165 9-1681_as	asasuccaAfaAfUfAfuucuacaaaaL96	874	UfsUfsuugUfaGfAfauauUfuUfggauususc	883
AD-65087	KLKB1	1903	NM_000892,3_1 905-1925_s	NM_000892,3_190 3-1925_as	AfscsCfaAfaGfuCfGfCfuGfaGfuAfcAfu AfL96	875	usAfsuGfuAfcU fcAfgcgAfcUfuUfgGfusgsu	884
AD-66946	KLKB1	1903	NM_00 08 92,3_1 905-1925_s	NM_000892,3_190 3-1925_as	ascscaaaGfuCfGfCfugaguacauaL96	876	usAf suguAf cUfCfagcgAfcUfuuggusgsu	885
AD-66947	KLKBl	1903	NM_000892,3_1 905-1925_s	NM_000892,3_190 3-1925_as	ascscaaaGfuCfGfCfugaguacauaL96	877	UfsAfsuguAfcUfCfagcgAfcUfuuggusgsu	886
AD-65103	KLKB1	380	NM_000892,3_3 82-402_s	NM_000892,3_380 -402_as	GfsusGfgUfcAfuCfAfAfaUfaAfgUfgCfu UfL96	878	asAfsgCfaCfuUfaUfuugAfuGfaCfcAfcsasu	887
AD-66948	KLKBl	380	NM_000892,3_3 82-402_s	NM_000892,3_380 -402_as	gsusggucAfuCfAfAfauaagugcuuL96	879	asAf sgcaCfuUfAfuuugAfuGfaccacsasu	888
AD-66949	KLKBl	380	NM_000892,3_3 82-402_s	NM_000892,3_380 -402_as	gsusggucAfuCfAfAfauaagugcuuL96	880	AfsAfsgcaCfuUfAfuuugAfuGfaccacsasu	889

Таблица 19С. Немодифицированные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, целенаправленно воздействующих на F12

Название дуплекса	Мишень	Положение сайта инициации транскрипции антисмысловой нити мРНК	Положение смысловой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью ИЗ GenBank	Положение антисмысл ов ой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью ИЗ GenBank	Последовательность смысловой нити	SEQ ID NO	Последовательность антисмысловой нити	SEQ ID NO
AD- 66121	F12	2018	NM_000505,3_2020 -2040_s	NM_000505,3_2018 -2040_as	AACUCAAUAAAGUGCUUUGAA	890	UUCAAAGCACUUUAUUGAGUUUС	898
AD- 67244	F12	2018	NM_000505,3_2020 -2040_s	NM_000505,3_2018 -2040_as	AACUCAAUAAAGUGCUUUGAA	891	UUCAAAGCACUUUAUUGAGUUUC	899
AD- 67245	F12	2018	NM_000505,3_2020 -2040_s	NM_000505,3_2018 -2 04 0_as	AACUCAAUAAAGUGCUUUGAA	892	UUCAAAGCACUUUAUUGAGUUUC	900
AD- 66125	F12	316	NM_000505,3_318338_s	NM_000505,3_316338_as	AGCCCAAGAAAGUGAAAGACA	893	UGUCUUUCACUUUCUUGGGCUCC	901
AD- 67246	F12	2023	NM_000505,3_2025 -2045_s	NM_000505,3_2023 -2045_as	AAUAAAGUG CUUU GAAAAC GU	894	ACGUUUUCAAAGCACUUUAUUGA	902
AD- 67247	F12	2023	NM_000505,3_2025 -2045_s	NM_000505,3_2023 -2045_as	AAUAAAGUG CUUU GAAAAC GU	895	ACGUUUUCAAAGCACUUUAUUGA	903
AD- 67248	F12	438	NM_000029,3_440460_s	NM_000029,3_438460_as	CAGAAAGAGAAGUGCUUUGAA	896	UUCAAAGCACUUCUCUUUCUGGC	904
AD- 67249	F12	438	NM_000029,3_440460_s	NM_000029,3_438460_as	CAGAAAGAGAAGUGCUUUGAA	897	UUCAAAGCACUUCUCUUUCUGGC	905

- 121 045013

Таблица 19D. Модифицированные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, целенаправленно воздействующих на F12

Название дуплекса	Мишень	Положение сайта инициации транс крипции антисмысловой нити мРНК	Положение смысловой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью ИЗ GenBank	Положение антисмысл ов ой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью ИЗ GenBank	Последовательность смысловой нити	SEQ ID NO	Последовательность антисмысловой нити	SEQ ID NO
AD- 66121	F12	2018	NM_000505,3_20 20-2040_s	NM_000505,3_2 018-2040_as	AfsasCfuCfaAfuAfAfAfgUfgC fuUfuGfaAfL96	906	usUf s cAfaAf gCfaCfuuuAfuUf gAfgUfus use	914
AD- 67244	F12	2018	NM_000505,3_20 20-2040_s	NM_000505,3_2 018-2040_as	asascucaAfuAfAfAfgugcuuug aaL96	907	usUfs caaAfgCfAfcuuuAfuU fgaguusus c	915
AD- 67245	F12	2018	NM_000505,3_20 20-2040_s	NM_000505,3_2 018-2040_as	asascucaAfuAfAfAfgugcuuug aaL96	908	UfsUfscaaAfgCfAfcuuuAfuUfgaguusus c	916
AD- 66125	F12	316	NM_000505,3_31 8-338_s	NM_000505,3_3 16-338_as	AfsgsCfcCfaAfgAfAfAfgUfgA faAfgAfcAfL96	909	usGfsuCfuUfuCfaCfuuuCfuUfgGfgCfus CSC	917
AD- 67246	F12	2023	NM_000505,3_20 25-2045_s	NM_000505,3_2 023-2045_as	asasuaaaGfuGfCfUfuugaaaac guL96	910	asCfsguuUfuCfAfaagcAfcUfuuauusgsa	918
AD- 67247	F12	2023	NM_000505,3_20 25-2045_s	NM_000505,3_2 023-2045_as	asasuaaaGfuGfCfUfuugaaaac guL96	911	AfsCfsguuUfuCfAfaagcAfcUfuuauusgs a	919
AD- 67248	F12	438	NM_000029,3_44 0-460_s	NM_000029,3_4 38-460_as	cs asgaaaGfaGfAfAfgugcuuug aaL96	912	usUfs caaAfgCfAfcuucUfcUfuucugsgsc	920
AD- 67249	F12	438	NM_000029,3_44 0-460_s	NM_000029,3_4 38-460_as	csasgaaaGfaGfAfAfgugcuuug aaL96	913	UfsUfscaaAfgCfAfcuucUfcUfuucugsgs	921

Таблица 19Е. Немодифицированные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, целенаправленно воздействующих на KNG1

Название дуплекса	Мишень	Положение сайта инициации транскрипции антисмысловой нити мРНК	Положение смысловой последовательности в соответствии с эталонной последоватеЛЬНОСТЬЮ ИЗ GenBank	Положение антисмысл ов ой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью из GenBank	Последовательность смысловой нити	SEQ ID NO	Последовательность антисмысловой нити	SEQ ID NO
AD- 66259	KNG1	302	NM_000893,3_304324_s	NM_000893,3_302324_as	GAGGAAAUUGACUGCAAUGAA	922	UUCAUUGCAGUCAAUUUCCUCGG	928
AD- 67344	KNG1	302	NM_000893,3_304324_s	NM_000893,3_302324_as	GAGGAAAUUGACUGCAAUGAA	923	UUCAUUGCAGUCAAUUUCCUCGG	929
AD- 67345	KNG1	302	NM_000893,3_304324_s	NM_000893,3_302- 324 as	GAGGAAAUUGACUGCAAUGAA	924	UUCAUUGCAGUCAAUUUCCUCGG	930
AD- 66262	KNG1	823	NM_000893,3_825- 8 4 5_s	NM_000893,3_823845_as	UACCUACUCAAUUGUGCAAAA	925	UUUUGCACAAUUGAGUAGGUAAU	931
AD- 67346	KNG1	823	NM_000893,3_825- 8 4 5_s	NM_000893,3_823845_as	UACCUACUCAAUUGUGCAAAA	926	UUUUGCACAAUUGAGUAGGUAAU	932
AD- 67347	KNG1	823	NM_000893,3_825- 8 4 5_s	NM_000893,3_823845_as	UACCUACUCAAUUGUGCAAAA	927	UUUUGCACAAUUGAGUAGGUAAU	933

- 122 045013

Таблица 19F. Модифицированные последовательности смысловой и антисмысловой нитей средств, целенаправленно воздействующих на KNG1

Название дуплекса	Мишень	Положение сайта инициации транскрипции антисмысловой нити мРНК	Положение смысловой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью из GenBank	Положение антисмысловой последовательности в соответствии с эталонной последовательностью из GenBank	Последовательность смысловой нити	SEQ ID NO	Последовательность антисмысловой нити	SEQ ID NO
AD- 66259	KNG1	302	NM_000893,3_ 304-324_s	NM_000893,3_ 302-324_as	GfsasGfgAfaAfuUfGfAfcU fgCfa AfuGfaAfL96	934	usUfscAfuUfgCfaGfucaAfuUfuCfcUf csgsg	940
AD- 67344	KNG1	302	NM_000893,3_ 304-324_s	NM_000893, 3_ 302-324_as	gsasggaaAfuU fGfAfcugcaaugaa L96	935	usUfscauUfgCfAfgucaAfuUfuccucsg sg	941
AD- 67345	KNG1	302	NM_000893,3_ 304-324_s	NM_000893,3_ 302-324_as	gsasggaaAfuUfGfAfcugcaaugaa L96	936	UfsUfscauUfgCfAfgucaAfuUfuccucs gsg	942
AD- 66262	KNG1	823	NM_000893,3_ 825-845_s	NM_000893, 3_ 823-845_as	UfsasCfcUfaCfuCfAfAfuUfgUfg CfaAfaAfL96	937	usUfsuUfgCfaCfaAfuugAfgUfaGfgUf asasu	943
AD- 67346	KNG1	823	NM_000893,3_ 825-845_s	NM_000893,3_ 823-845_as	usas ccuaCfuCfAfAfuugugcaaaa L96	938	usUfsuugCfaCfAfauugAfgUfagguasa SU	944
AD- 67347	KNG1	823	NM_000893,3_ 825-845_s	NM_000893,3_ 823-845_as	usas ccuaCfuCfAfAfuugugcaaaa L96	939	UfsUfsuugCfaCfAfauugAfgUfagguas asu	945

Пример 8. In vivo сайленсинг KLKB1, F12 и KNG1 в мышиной модели, проницаемости сосудов, индуцируемой ингибитором АСЕ

Для определения in vivo эффективности однократной дозы поднабора описанных выше средств для снижения уровней мРНК KLKB1, F12 или KNG1 человека самкам мышей C57BL/6 дикого типа подкожно вводили однократную дозу 0, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг AD-66948 (целенаправленно воздействующего на KLKB1), или однократную дозу 0, 0,1, 0,3, 1 или 3 мг/кг AD-67244 (целенаправленно воздействующего на F12), или однократную дозу 0, 0,3, 1, 3 или 10 мг/кг AD-67344 (целенаправленно воздействующего на KNG1). В день 7 после введения дозы животным внутривенно вводили 2,5 мг/кг ингибитора ангиотензин-конвертирующего фермента (АСЕ), каптоприла, с целью индуцирования проницаемости сосудов. Через пятнадцать минут после введения каптоприла животным внутривенно вводили 30 мг/кг синего красителя Эванса. Через пятнадцать минут после введения синего красителя Эванса животных умерщвляли и собирали образцы крови, кишечника и печени. Синий краситель Эванса выделяли и количественно определяли в образцах крови и кишечника и в образцах печени определяли уровни целевой мРНК.

Результаты этих анализов с применением средства, целенаправленно воздействующего на KLKB1 (AD-66948), показаны на фиг. 4. Результаты этих анализов с применением средства, целенаправленно воздействующего на F12 (AD-AD-67244), показаны на фиг. 5. Результаты этих анализов с применением средства, целенаправленно воздействующего на KNG1 (AD-AD-67344), показаны на фиг. 6.

Пример 9. Синтез и in vitro скрининг дуплексов siRNA для F12.

Дополнительные средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующие на F12, конструировали, синтезировали и подвергали скринингу в отношении in vitro эффективности, как описано выше. Подробный перечень дополнительных немодифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей F12 показан в табл. 20. Подробный перечень дополнительных модифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей F12 показан в табл. 21. В табл. 22 приведены результаты скрининга в отношении однократной дозы в клетках Hep3b, трансфицированных дополнительными iRNA для F12. Данные выражены в виде процента остаточной мРНК в сравнении с AD-1955.

- 123 045013

Таблица 20. Немодифицированные последовательности F12

Название дуплекса	Смысловая последовательность, от 5' к 3 '	SEQ ID NO	Положение в NM_000505.3	Антисмысловая последовательность, от 5' к 3'	SEQ ID NO	Положение в NM_000505.3
AD-70653	GACUCCUGGAUAGGCAGCU	946	12-30	AGCUGCCUAUCCAGGAGUC	ИЗО	12-30
AD-70654	UAGGCAGCUGGACCAACGA	947	22-40	UCGUUGGUCCAGCUGCCUA	1131	22-40
AD-70655	ACCAACGGACGGAUGCCAU	948	33-51	AUGGCAUCCGUCCGUUGGU	1132	33-51
AD-70656	AUGCCAUGAGGGCUCUGCU	949	45-63	AGCAGAGCCCUCAUGGCAU	1133	45-63
AD-70657	GCUCUGCUGCUCCUGGGGU	950	56-74	ACCCCAGGAGCAGCAGAGC	1134	56-74
AD-7 0 65 8	UCCUGGGGUUCCUGCUGGU	951	66-84	ACCAGCAGGAACCCCAGGA	1135	66-84
AD-70659	CUGCUGGUGAGCUUGGAGU	952	77-95	ACUCCAAGCUCACCAGCAG	1136	77-95
AD-70660	CUU GGAGU CAACACUUU СА	953	88-106	U GAAAGU GUU GACU С CAAG	1137	88-106
AD-70661	ACUUUCGAUUCCACCUUGA	954	100-118	UCAAGGUGGAAUCGAAAGU	1138	100-118
AD-70662	CCACCUUGGGAAGCCCCCA	955	110-128	UGGGGGCUUCCCAAGGUGG	1139	110-128
AD-70663	GCCCCCAAGGAGCAUAAGU	956	122-140	ACUUAUGCUCCUUGGGGGC	1140	122-140
AD-70664	CAUAAGUACAAAGCUGAAA	957	134-152	UUU CAGCUUU GUACUUAU G	1141	134-152
AD-70665	AAGCUGAAGAGCACACAGU	958	144-162	ACUGUGUGCUCUUCAGCUU	1142	144-162
AD-70666	ACACAGU С GUU CU CACU GU	959	156-174	ACAGU GAGAAC GACU GU GU	1143	156-174
AD-70667	UUCUCACUGUCACCGGGGA	960	165-183	UCCCCGGUGACAGU GAGAA	1144	165-183
AD-7 0 6 68	ACCGGGGAGCCCUGCCACU	961	176-194	AGUGGCAGGGCUCCCCGGU	1145	176-194
AD-70669	UGCCACUUCCCCUUCCAGU	962	188-206	ACUGGAAGGGGAAGUGGCA	1146	188-206
AD-70670	UUCCAGUACCACCGGCAGA	963	200-218	UCUGCCGGUGGUACUGGAA	1147	200-218
AD-70671	ACCGGCAGCUGUACCACAA	964	210-228	UUGUGGUACAGCUGCCGGU	1148	210-228
AD-70672	UАС СACAAAU GUАС С САСА	965	221-239	UGUGGGUACAUUUGUGGUA	1149	221-239
AD-70673	UACCCACAAGGGCCGGCCA	966	232-250	UGGCCGGCCCUUGUGGGUA	1150	232-250
AD-70674	GCCGGCCAGGCCCUCAGCA	967	243-261	UGCUGAGGGCCUGGCCGGC	1151	243-261
AD-70675	CUCAGCCCUGGUGUGCUAA	968	255-273	UUAGCACACCAGGGCUGAG	1152	255-273
AD-70676	U GU GCUAC САС С С С CAACU	969	266-284	AGUUGGGGGUGGUAGCACA	1153	266-284
AD-70677	АС С С С CAACUUU GAU CAGA	970	275-293	UCUGAUCAAAGUUGGGGGU	1154	275-293
AD-70678	AUCAGGACCAGCGAUGGGA	971	288-306	UCCCAUCGCUGGUCCUGAU	1155	288-306
AD-70679	AGCGAUGGGGAUACUGUUU	972	297-315	АААСAGUAU С С С СAU С G CU	1156	297-315
AD-70680	UACUGUUUGGAGCCCAAGA	973	308-326	UCUUGGGCUCCAAACAGUA	1157	308-326
AD-70681	С СAAGAAAGU GAAAGAC СА	974	321-339	UGGUCUUUCACUUUCUUGG	1158	321-339
AD-70682	AAAGACCACUGCAGCAAAC	975	332-350	GUUUGCUGCAGUGGUCUUU	1159	332-350
AD-70683	UGCAGCAAACACAGCCCCU	976	341-359	AGGGGCUGUGUUUGCUGCA	1160	341-359
AD-70684	AGCCCCUGCCAGAAAGGAA	977	353-371	UUCCUUUCUGGCAGGGGCU	1161	353-371
AD-70685	AGAAAGGAGGGACCUGUGU	978	363-381	ACACAGGU CCCUCCUUUCU	1162	363-381
AD-70686	ACCUGUGU GAACAU G С САА	979	374-392	UUGGCAUGUUCACACAGGU	1163	374-392
AD-70687	AUGCCAAGCGGCCCCCACU	980	386-404	AGUGGGGGCCGCUUGGCAU	1164	386-404
AD-70688	GCCCCCACUGUCUCUGUCA	981	396-414	UGACAGAGACAGUGGGGGC	1165	396-414
AD-70689	САС CU CACU GGAAAC CACU	982	419-437	AGUGGUUUCCAGUGAGGUG	1166	419-437
AD-70690	ААС СACU G С СAGAAAGAGA	983	431-449	UCUCUUUCUGGCAGUGGUU	1167	431-449
AD-70691	CAGAAAGAGAAGUGCUUUA	984	440-458	UAAAGCACUUCUCUUUCUG	1168	440-458
AD-70692	UGCUUUGAGCCUCAGCUUA	985	452-470	UAAGCUGAGGCUCAAAGCA	1169	452-470
AD-70693	CAGCUUCUCCGGUUUUUCA	986	464-482	UGAAAAACCGGAGAAGCUG	1170	464-482
AD-70694	СGGUUUUUСCACAAGAAUA	987	473-491	UAUU CUU GU GGAAAAAC С G	1171	473-491
AD-70695	СAAGAAU GAGAUAU G GUAU	988	484-502	AUAC CAUAU CU CAUU CUU G	1172	484-502
AD-70696	UAUGGUAUAGAACUGAGCA	989	495-513	U GCU CAGUU CUAUAC CAUA	1173	495-513
AD-70697	UGAGCAAGCAGCUGUGGCA	990	508-526	UGCCACAGCUGCUUGCUCA	1174	508-526
AD-70698	GCUGUGGCCAGAUGCCAGU	991	518-536	ACUGGCAUCUGGCCACAGC	1175	518-536
AD-70699	AUGCCAGUGCAAGGGUCCU	992	529-547	AGGACCCUUGCACUGGCAU	1176	529-547
AD-70700	AAGGGUCCUGAUGCCCACU	993	539-557	AGUGGGCAUCAGGACCCUU	1177	539-557
AD-70701	UGCCCACUGCCAGCGGCUA	994	550-568	UAGCCGCUGGCAGUGGGCA	1178	550-568
AD-70702	CGGCUGGCCAGCCAGGCCU	995	563-581	AGGCCUGGCUGGCCAGCCG	1179	563-581

- 124 045013

AD-70703	AGCCAGGCCUGCCGCACCA	996	572-590	UGGUGCGGCAGGCCUGGCU	1180	572-590
AD-70704	CGCACCAACCCGUGCCUCA	997	584-602	UGAGGCACGGGUUGGUGCG	1181	584-602
AD-70705	UGCCUCCAUGGGGGUCGCU	998	596-614	AGCGACCCCCAUGGAGGCA	1182	596-614
AD-70706	GGGGUCGCUGCCUAGAGGU	999	606-624	ACCUCUAGGCAGCGACCCC	1183	606-624
AD-70707	CUAGAGGUGGAGGGCCACA	1000	617-635	UGUGGCCCUCCACCUCUAG	1184	617-635
AD-70708	AGGGCCACCGCCUGUGCCA	1001	627-645	UGGCACAGGCGGUGGCCCU	1185	627-645
AD-70709	UGUGCCACUGCCCGGUGGA	1002	639-657	UCCACCGGGCAGUGGCACA	1186	639-657
AD-70710	CGGUGGGCUACACCGGAGA	1003	651-669	UCUCCGGUGUAGCCCACCG	1187	651-669
AD-70711	ACCGGAGCCUUCUGCGACA	1004	662-680	UGUCGCAGAAGGCUCCGGU	1188	662-680
AD-70712	UUCUGCGACGUGGACACCA	1005	671-689	UGGUGUCCACGUCGCAGAA	1189	671-689
AD-70713	GACACCAAGGCAAGCUGCU	1006	683-701	AGCAGCUUGCCUUGGUGUC	1190	683-701
AD-70714	CAAGCUGCUAUGAUGGCCA	1007	693-711	UGGCCAUCAUAGCAGCUUG	1191	693-711
AD-70715	GAUGGCCGCGGGCUCAGCU	1008	704-722	AGCUGAGCCCGCGGCCAUC	1192	704-722
AD-70716	UCAGCUACCGCGGCCUGGA	1009	717-735	UCCAGGCCGCGGUAGCUGA	1193	717-735
AD-70717	CGGCCUGGCCAGGACCACA	1010	727-745	UGUGGUCCUGGCCAGGCCG	1194	727-745
AD-70718	AGGACCACGCUCUCGGGUA	1011	737-755	UACCCGAGAGCGUGGUCCU	1195	737-755
AD-70719	UCGGGUGCGCCCUGUCAGA	1012	749-767	UCUGACAGGGCGCACCCGA	1196	749-767
AD-70720	CUGUCAGCCGUGGGCCUCA	1013	760-778	UGAGGCCCACGGCUGACAG	1197	760-778
AD-70721	UGGGCCUCGGAGGCCACCU	1014	770-788	AGGUGGCCUCCGAGGCCCA	1198	770-788
AD-70722	С CAC CUAC C G GAAC GU GAA	1015	783-801	UUCACGUUCCGGUAGGUGG	1199	783-801
AD-70723	AACGUGACUGCCGAGCAAA	1016	794-812	UUUGCUCGGCAGUCACGUU	1200	794-812
AD-70724	CGAGCAAGCGCGGAACUGA	1017	805-823	UCAGUUCCGCGCUUGCUCG	1201	805-823
AD-70725	CGGAACUGGGGACUGGGCA	1018	815-833	UGCCCAGUCCCCAGUUCCG	1202	815-833
AD-70726	GACUGGGCGGCCACGCCUU	1019	825-843	AAGGCGUGGCCGCCCAGUC	1203	825-843
AD-70727	ACGCCUUCUGCCGGAACCA	1020	837-855	UGGUUCCGGCAGAAGGCGU	1204	837-855
AD-70728	CGGAACCCGGACAACGACA	1021	848-866	UGUCGUUGUCCGGGUUCCG	1205	848-866
AD-70729	AACGACAUCCGCCCGUGGU	1022	860-878	ACCACGGGCGGAUGUCGUU	1206	860-878
AD-70730	GCCCGUGGUGCUUCGUGCU	1023	870-888	AGCACGAAGCACCACGGGC	1207	870-888
AD-70731	UUCGUGCUGAACCGCGACA	1024	881-899	UGUCGCGGUUCAGCACGAA	1208	881-899
AD-70732	ACCGCGACCGGCUGAGCUA	1025	891-909	UAGCUCAGCCGGUCGCGGU	1209	891-909
AD-70733	CUGAGCUGGGAGUACUGCA	1026	902-920	UGCAGUACUCCCAGCUCAG	1210	902-920
AD-70734	UACUGCGACCUGGCACAGU	1027	914-932	ACUGUGCCAGGUCGCAGUA	1211	914-932
AD-70735	UGGCACAGUGCCAGACCCA	1028	924-942	UGGGUCUGGCACUGUGCCA	1212	924-942
AD-70736	AGACCCCAACCCAGGCGGA	1029	936-954	UCCGCCUGGGUUGGGGUCU	1213	936-954
AD-70737	AGGCGGCGCCUCCGACCCA	1030	948-966	UGGGUCGGAGGCGCCGCCU	1214	948-966
AD-70738	UCCGACCCCGGUGUCCCCU	1031	958-976	AGGGGACACCGGGGUCGGA	1215	958-976
AD-70739	UGUCCCCUAGGCUUCAUGU	1032	969-987	ACAUGAAGCCUAGGGGACA	1216	969-987
AD-70740	UU CAU GU С C CACU CAU GCA	1033	981-999	UGCAUGAGUGGGACAUGAA	1217	981-999
AD-70741	ACUCAUGCCCGCGCAGCCA	1034	991-1009	UGGCUGCGCGGGCAUGAGU	1218	991-1009
AD-70742	CGCAGCCGGCACCGCCGAA	1035	1002-1020	UUCGGCGGUGCCGGCUGCG	1219	1002-1020
AD-70743	ACCGCCGAAGCCUCAGCCA	1036	1012-1030	UGGCUGAGGCUUCGGCGGU	1220	1012-1030
AD-70744	UCAGCCCACGACCCGGACA	1037	1024-1042	UGUCCGGGUCGUGGGCUGA	1221	1024-1042
AD-70745	ACCCGGACCCCGCCUCAGU	1038	1034-1052	ACUGAGGCGGGGUCCGGGU	1222	1034-1052
AD-70562	C CU CAGU С C CAGAC С С C GA	1039	1046-1064	UCGGGGUCUGGGACUGAGG	1223	1046-1064
AD-70563	AGACCCCGGGAGCCUUGCA	1040	1056-1074	UGCAAGGCUCCCGGGGUCU	1224	1056-1074
AD-70564	CCUUGCCGGCGAAGCGGGA	1041	1068-1086	UCCCGCUUCGCCGGCAAGG	1225	1068-1086
AD-70565	AAGCGGGAGCAGCCGCCUU	1042	1079-1097	AAGGCGGCUGCUCCCGCUU	1226	1079-1097
AD-70566	AGCCGCCUUCCCUGACCAA	1043	1089-1107	UUGGUCAGGGAAGGCGGCU	1227	1089-1107
AD-70567	UGACCAGGAACGGCCCACU	1044	1101-1119	AGUGGGCCGUUCCUGGUCA	1228	1101-1119
AD-70568	CGGCCCACUGAGCUGCGGA	1045	1111-1129	UCCGCAGCUCAGUGGGCCG	1229	1111-1129
AD-70569	UGCGGGCAGCGGCUCCGCA	1046	1124-1142	UGCGGAGCCGCUGCCCGCA	1230	1124-1142
AD-70570	CGGCUCCGCAAGAGUCUGU	1047	1133-1151	ACAGACUCUUGCGGAGCCG	1231	1133-1151
AD-70571	AGU CU GU CUU C GAU GAC CA	1048	1145-1163	U G GU CAU C GAAGACAGACU	1232	1145-1163
AD-70572	CGAUGACCCGCGUCGUUGA	1049	1155-1173	UCAACGACGCGGGUCAUCG	1233	1155-1173

- 125 045013

AD-70573	UCGUUGGCGGGCUGGUGGA	1050	1167-1185	UCCACCAGCCCGCCAACGA	1234	1167-1185
AD-70574	UGGUGGCGCUACGCGGGGA	1051	1179-1197	UCCCCGCGUAGCGCCACCA	1235	1179-1197
AD-70575	UACGCGGGGCGCACCCCUA	1052	1188-1206	UAGGGGUGCGCCCCGCGUA	1236	1188-1206
AD-70576	ACCCCUACAUCGCCGCGCU	1053	1200-1218	AGCGCGGCGAUGUAGGGGU	1237	1200-1218
AD-70577	GCCGCGCUGUACUGGGGCA	1054	1211-1229	UGCCCCAGUACAGCGCGGC	1238	1211-1229
AD-70578	CUGGGGCCACAGUUUCUGA	1055	1222-1240	UCAGAAACUGUGGCCCCAG	1239	1222-1240
AD-70579	UUUCUGCGCCGGCAGCCUA	1056	1234-1252	UAGGCUGCCGGCGCAGAAA	1240	1234-1252
AD-70580	CGGCAGCCUCAUCGCCCCA	1057	1243-1261	UGGGGCGAUGAGGCUGCCG	1241	1243-1261
AD-70581	UCGCCCCCUGCUGGGUGCU	1058	1254-1272	AGCACCCAGCAGGGGGCGA	1242	1254-1272
AD-70582	UGGGUGCUGACGGCCGCUA	1059	1265-1283	UAGCGGCCGUCAGCACCCA	1243	1265-1283
AD-70583	GCCGCUCACUGCCUGCAGA	1060	1277-1295	UCUGCAGGCAGUGAGCGGC	1244	1277-1295
AD-70584	CUGCAGGACCGGCCCGCAA	1061	1289-1307	UUGCGGGCCGGUCCUGCAG	1245	1289-1307
AD-70585	GGCCCGCACCCGAGGAUCU	1062	1299-1317	AGAUCCUCGGGUGCGGGCC	1246	1299-1317
AD-70586	CGAGGAUCUGACGGUGGUA	1063	1309-1327	UAC САС C GU CAGAU C CU C G	1247	1309-1327
AD-70587	GUGGUGCUCGGCCAGGAAA	1064	1322-1340	UUUCCUGGCCGAGCACCAC	1248	1322-1340
AD-70588	GCCAGGAACGCCGUAACCA	1065	1332-1350	UGGUUACGGCGUUCCUGGC	1249	1332-1350
AD-70589	C GUAAC CACAG CU GU GAGA	1066	1343-1361	UCUCACAGCUGUGGUUACG	1250	1343-1361
AD-70590	UGUGAGCCGUGCCAGACGU	1067	1355-1373	ACGUCUGGCACGGCUCACA	1251	1355-1373
AD-70591	UGCCAGACGUUGGCCGUGA	1068	1364-1382	UCACGGCCAACGUCUGGCA	1252	1364-1382
AD-70592	GCCGUGCGCUCCUACCGCU	1069	1376-1394	AGCGGUAGGAGCGCACGGC	1253	1376-1394
AD-70593	UACCGCUUGCACGAGGCCU	1070	1388-1406	AGGCCUCGUGCAAGCGGUA	1254	1388-1406
AD-70594	ACGAGGCCUUCUCGCCCGU	1071	1398-1416	ACGGGCGAGAAGGCCUCGU	1255	1398-1416
AD-70595	UCGCCCGUCAGCUACCAGA	1072	1409-1427	UCUGGUAGCUGACGGGCGA	1256	1409-1427
AD-70596	CUACCAGCACGACCUGGCU	1073	1420-1438	AGCCAGGUCGUGCUGGUAG	1257	1420-1438
AD-70597	ACCUGGCUCUGUUGCGCCU	1074	1431-1449	AGGCGCAACAGAGCCAGGU	1258	1431-1449
AD-70598	UUGCGCCUUCAGGAGGAUA	1075	1442-1460	UAUCCUCCUGAAGGCGCAA	1259	1442-1460
AD-70599	GAGGAUGCGGACGGCAGCU	1076	1454-1472	AGCUGCCGUCCGCAUCCUC	1260	1454-1472
AD-70600	ACGGCAGCUGCGCGCUCCU	1077	1464-1482	AGGAGCGCGCAGCUGCCGU	1261	1464-1482
AD-70601	CGCUCCUGUCGCCUUACGU	1078	1476-1494	ACGUAAGGCGACAGGAGCG	1262	1476-1494
AD-70602	CCUUACGUUCAGCCGGUGU	1079	1487-1505	ACACCGGCUGAACGUAAGG	1263	1487-1505
AD-70603	AGCCGGUGUGCCUGCCAAA	1080	1497-1515	UUUGGCAGGCACACCGGCU	1264	1497-1515
AD-70604	UGCCAAGCGGCGCCGCGCA	1081	1509-1527	UGCGCGGCGCCGCUUGGCA	1265	1509-1527
AD-70605	GCGCCGCGCGACCCUCCGA	1082	1518-1536	UCGGAGGGUCGCGCGGCGC	1266	1518-1536
AD-70606	CCCUCCGAGACCACGCUCU	1083	1529-1547	AGAGCGUGGUCUCGGAGGG	1267	1529-1547
AD-70607	CGCUCUGCCAGGUGGCCGA	1084	1542-1560	UCGGCCACCUGGCAGAGCG	1268	1542-1560
AD-70608	AGGUGGCCGGCUGGGGCCA	1085	1551-1569	UGGCCCCAGCCGGCCACCU	1269	1551-1569
AD-70609	UGGGGCCACCAGUUCGAGA	1086	1562-1580	UCUCGAACUGGUGGCCCCA	1270	1562-1580
AD-70610	UUCGAGGGGGCGGAGGAAU	1087	1574-1592	AUUCCUCCGCCCCCUCGAA	1271	1574-1592
AD-70611	CGGAGGAAUAUGCCAGCUU	1088	1584-1602	AAGCUGGCAUAUUCCUCCG	1272	1584-1602
AD-70612	CAGCUUCCUGCAGGAGGCA	1089	1597-1615	UGCCUCCUGCAGGAAGCUG	1273	1597-1615
AD-70613	AGGAGGCGCAGGUACCGUU	1090	1608-1626	AACGGUACCUGCGCCUCCU	1274	1608-1626
AD-70614	AGGUACCGUUCCUCUCCCU	1091	1617-1635	AGGGAGAGGAACGGUACCU	1275	1617-1635
AD-70615	CUCUCCCUGGAGCGCUGCU	1092	1628-1646	AGCAGCGCUCCAGGGAGAG	1276	1628-1646
AD-70616	CGCUGCUCAGCCCCGGACA	1093	1640-1658	UGUCCGGGGCUGAGCAGCG	1277	1640-1658
AD-70617	CCGGACGUGCACGGAUCCU	1094	1652-1670	AGGAUCCGUGCACGUCCGG	1278	1652-1670
AD-70618	CGGAUCCUCCAUCCUCCCA	1095	1663-1681	UGGGAGGAUGGAGGAUCCG	1279	1663-1681
AD-70619	CAUCCUCCCCGGCAUGCUA	1096	1672-1690	UAGCAUGCCGGGGAGGAUG	1280	1672-1690
AD-70620	CAUGCUCUGCGCAGGGUUA	1097	1684-1702	UAACCCUGCGCAGAGCAUG	1281	1684-1702
AD-70621	AGGGUUCCUCGAGGGCGGA	1098	1696-1714	UCCGCCCUCGAGGAACCCU	1282	1696-1714
AD-70622	GAGGGCGGCACCGAUGCGU	1099	1706-1724	ACGCAUCGGUGCCGCCCUC	1283	1706-1724
AD-70623	GAUGCGUGCCAGGGUGAUU	1100	1718-1736	AAUCACCCUGGCACGCAUC	1284	1718-1736
AD-70624	AGGGUGAUUCCGGAGGCCA	1101	1728-1746	UGGCCUCCGGAAUCACCCU	1285	1728-1746
AD-70625	CGGAGGCCCGCUGGUGUGU	1102	1738-1756	ACACACCAGCGGGCCUCCG	1286	1738-1756
AD-70626	GGUGUGUGAGGACCAAGCU	1103	1750-1768	AGCUUGGUCCUCACACACC	1287	1750-1768

- 126 045013

AD-70627	CCAAGCUGCAGAGCGCCGA	1104	1762-1780	UCGGCGCUCUGCAGCUUGG	1288	1762-1780
AD-70628	AGAGCGCCGGCUCACCCUA	1105	1771-1789	UAGGGUGAGCCGGCGCUCU	1289	1771-1789
AD-70629	UCACCCUGCAAGGCAUCAU	1106	1782-1800	AUGAUGCCUUGCAGGGUGA	1290	1782-1800
AD-70630	GGCAUCAUCAGCUGGGGAU	1107	1793-1811	AUCCCCAGCUGAUGAUGCC	1291	1793-1811
AD-70631	CUGGGGAUCGGGCUGUGGU	1108	1804-1822	ACCACAGCCCGAUCCCCAG	1292	1804-1822
AD-70632	UGUGGUGACCGCAACAAGA	1109	1817-1835	UCUUGUUGCGGUCACCACA	1293	1817-1835
AD-70633	CAACAAGCCAGGCGUCUAA	1110	1828-1846	UUAGACGCCUGGCUUGUUG	1294	1828-1846
AD-70634	AGGCGUCUACACCGAUGUA	1111	1837-1855	UACAUCGGUGUAGACGCCU	1295	1837-1855
AD-70635	GAUGUGGCCUACUACCUGA	1112	1850-1868	UCAGGUAGUAGGCCACAUC	1296	1850-1868
AD-70636	UACUACCUGGCCUGGAUCA	1113	1859-1877	UGAUCCAGGCCAGGUAGUA	1297	1859-1877
AD-70637	CUGGAUCCGGGAGCACACA	1114	1870-1888	UGUGUGCUCCCGGAUCCAG	1298	1870-1888
AD-70638	AGCACACCGUUUCCUGAUU	1115	1881-1899	AAUCAGGAAACGGUGUGCU	1299	1881-1899
AD-70639	UCCUGAUUGCUCAGGGACU	1116	1892-1910	AGUCCCUGAGCAAUCAGGA	1300	1892-1910
AD-70640	CAGGGACUCAUCUUUCCCU	1117	1903-1921	AGGGAAAGAUGAGUCCCUG	1301	1903-1921
AD-70641	UUUCCCUCCUUGGUGAUUA	1118	1915-1933	UAAUCACCAAGGAGGGAAA	1302	1915-1933
AD-70642	UGGUGAUUCCGCAGUGAGA	1119	1925-1943	UCUCACUGCGGAAUCACCA	1303	1925-1943
AD-70643	AGUGAGAGAGUGGCUGGGA	1120	1937-1955	U С С CAGC CACU CU CU CACU	1304	1937-1955
AD-70644	GCUGGGGCAUGGAAGGCAA	1121	1949-1967	UUGCCUUCCAUGCCCCAGC	1305	1949-1967
AD-70645	UGGAAGGCAAGAUUGUGUA	1122	1958-1976	UACACAAU CUU GC CUU С СА	1306	1958-1976
AD-70646	UUGUGUCCCAUUCCCCCAA	1123	1970-1988	UUGGGGGAAUGGGACACAA	1307	1970-1988
AD-70647	UCCCCCAGUGCGGCCAGCU	1124	1981-1999	AGCUGGCCGCACUGGGGGA	1308	1981-1999
AD-70648	GCCAGCUCCGCGCCAGGAU	1125	1993-2011	AUCCUGGCGCGGAGCUGGC	1309	1993-2011
AD-70649	GCCAGGAUGGCGCAGGAAA	1126	2004-2022	UUUCCUGCGCCAUCCUGGC	1310	2004-2022
AD-70650	GCAGGAACUCAAUAAAGUA	1127	2015-2033	UACUUUAUUGAGUUCCUGC	1311	2015-2033
AD-70651	AAUAAAGUGCUUUGAAAAU	1128	2025-2043	AUUUUCAAAGCACUUUAUU	1312	2025-2043
AD-70652	UUGAAAAUGCUGAGAAAAA	1129	2036-2054	UUUUUCUCAGCAUUUUCAA	1313	2036-2054

Таблица 21. Модифицированные последовательности F12

Название дуплекса	Смысловая последовательность, от 5' к 3'	SEQ ID NO	Антисмысловая последовательность , от 5' к 3'	SEQ ID NO	Целевая последовательность мРНК	SEQ ID NO
AD-70653	GACUCCUGGAUAGGCAGCUdTdT	1314	AGCUGCCUAUCCAGGAGUCdTdT	1498	GACUCCUGGAUAGGCAGCU	1682
AD-70654	UAGGCAGCUGGACCAACGAdTdT	1315	UCGUUGGUCCAGCUGCCUAdTdT	1499	UAGGCAGCUGGACCAACGG	1683
AD-70655	ACCAACGGACGGAUGCCAUdTdT	1316	AUGGCAUCCGUCCGUUGGUdTdT	1500	ACCAACGGACGGAUGCCAU	1684
AD-70656	AUGCCAUGAGGGCUCUGCUdTdT	1317	AGCAGAGCCCUCAUGGCAUdTdT	1501	AUGCCAUGAGGGCUCUGCU	1685
AD-70657	GCUCUGCUGCUCCUGGGGUdTdT	1318	ACCCCAGGAGCAGCAGAGCdTdT	1502	GCUCUGCUGCUCCUGGGGU	1686
AD-70658	UCCUGGGGUUCCUGCUGGUdTdT	1319	ACCAGCAGGAACCCCAGGAdTdT	1503	UCCUGGGGUUCCUGCUGGU	1687
AD-70659	CUGCUGGUGAGCUUGGAGUdTdT	1320	ACU C CAAGCU CAC CAGCAGdT dT	1504	CUGCUGGUGAGCUUGGAGU	1688
AD-70660	CUU GGAGU CAACACUUU CAdT dT	1321	U GAAAGU GUU GACU C CAAGdT dT	1505	CUU GGAGU CAACACUUU C G	1689
AD-70661	ACUUUCGAUUCCACCUUGAdTdT	1322	UCAAGGUGGAAUCGAAAGUdTdT	1506	ACUUUCGAUUCCACCUUGG	1690
AD-70662	CCACCUUGGGAAGCCCCCAdTdT	1323	UGGGGGCUUCCCAAGGUGGdTdT	1507	CCACCUUGGGAAGCCCCCA	1691
AD-70663	GCCCCCAAGGAGCAUAAGUdTdT	1324	ACUUAUGCUCCUUGGGGGCdTdT	1508	GCCCCCAAGGAGCAUAAGU	1692
AD-70664	CAUAAGUACAAAGCU GAAAdT dT	1325	UUUCAGCUUUGUACUUAUGdTdT	1509	CAUAAGUACAAAGCUGAAG	1693
AD-70665	AAGCUGAAGAGCACACAGUdTdT	1326	ACUGUGUGCUCUUCAGCUUdTdT	1510	AAGCUGAAGAGCACACAGU	1694
AD-70666	ACACAGU C GUU CU CACU GUdT dT	1327	ACAGU GAGAAC GACU GU GUdT dT	1511	ACACAGU C GUU CU CACU GU	1695
AD-70667	UUCUCACUGUCACCGGGGAdTdT	1328	U С С С C GGU GACAGU GAGAAdT dT	1512	UUCUCACUGUCACCGGGGA	1696
AD-70668	ACCGGGGAGCCCUGCCACUdTdT	1329	AGUGGCAGGGCUCCCCGGUdTdT	1513	ACCGGGGAGCCCUGCCACU	1697
AD-70669	UGCCACUUCCCCUUCCAGUdTdT	1330	ACUGGAAGGGGAAGUGGCAdTdT	1514	UGCCACUUCCCCUUCCAGU	1698
AD-70670	UU C CAGUAC САС C GGCAGAdT dT	1331	UCUGCCGGUGGUACUGGAAdTdT	1515	UUCCAGUACCACCGGCAGC	1699
AD-70671	ACCGGCAGCUGUACCACAAdTdT	1332	UUGUGGUACAGCUGCCGGUdTdT	1516	ACCGGCAGCUGUACCACAA	1700
AD-70672	UAC CACAAAU GUAC C CACAdT dT	1333	UGUGGGUACAUUUGUGGUAdTdT	1517	UAC CACAAAUGUACСCACA	1701
AD-70673	UACCCACAAGGGCCGGCCAdTdT	1334	UGGCCGGCCCUUGUGGGUAdTdT	1518	UACCCACAAGGGCCGGCCA	1702
AD-70674	GCCGGCCAGGCCCUCAGCAdTdT	1335	UGCUGAGGGCCUGGCCGGCdTdT	1519	GCCGGCCAGGCCCUCAGCC	1703
AD-70675	CUCAGCCCUGGUGUGCUAAdTdT	1336	UUAGCACACCAGGGCUGAGdTdT	1520	CUCAGCCCUGGUGUGCUAC	1704

- 127 045013

AD-70676	UGUGCUACСАСССCCAACUdTdT	1337	AGUUGGGGGUGGUAGCACAdTdT	1521	U GU GCUAC САС С С C CAACU	1705
AD-70677	ACССCCAACUUUGAUCAGAdTdT	1338	UCUGAUCAAAGUUGGGGGUdTdT	1522	ACССCCAACUUUGAUCAGG	1706
AD-70678	AUCAGGACCAGCGAUGGGAdTdT	1339	UCCCAUCGCUGGUCCUGAUdTdT	1523	AUCAGGACCAGCGAUGGGG	1707
AD-70679	AGCGAUGGGGAUACUGUUUdTdT	1340	AAACAGUAUCCCCAUCGCUdTdT	1524	AGCGAUGGGGAUACUGUUU	1708
AD-70680	UACU GUUU GGAGC C CAAGAdT dT	1341	UCUUGGGCUCCAAACAGUAdTdT	1525	UACUGUUUGGAGCCCAAGA	1709
AD-70681	C CAAGAAAGU GAAAGAC CAdT dT	1342	UGGUCUUUCACUUUCUUGGdTdT	1526	C CAAGAAAGU GAAAGAC CA	1710
AD-70682	AAAGACCACUGCAGCAAACdTdT	1343	GUUUGCUGCAGUGGUCUUUdTdT	1527	AAAGACCACUGCAGCAAAC	1711
AD-70683	UGCAGCAAACACAGCCCCUdTdT	1344	AGGGGCUGUGUUUGCUGCAdTdT	1528	UGCAGCAAACACAGCCCCU	1712
AD-70684	AGCCCCUGCCAGAAAGGAAdTdT	1345	UUCCUUUCUGGCAGGGGCUdTdT	1529	AGCCCCUGCCAGAAAGGAG	1713
AD-70685	AGAAAGGAGGGACCUGUGUdTdT	1346	ACACAGGUCCCUCCUUUCUdTdT	1530	AGAAAGGAGGGACCUGUGU	1714
AD-7 0 68 6	AC CU GU GU GAACAU GC CAAdT dT	1347	UUGGCAUGUUCACACAGGUdTdT	1531	ACCUGUGU GAACAU G С СAA	1715
AD-70687	AUGCCAAGCGGCCCCCACUdTdT	1348	AGUGGGGGCCGCUUGGCAUdTdT	1532	AUGCCAAGCGGCCCCCACU	1716
AD-70688	GCCCCCACUGUCUCUGUCAdTdT	1349	UGACAGAGACAGUGGGGGCdTdT	1533	GCCCCCACUGUCUCUGUCC	1717
AD-70689	CACCUCACUGGAAACCACUdTdT	1350	AGU GGUUU C CAGU GAGGU GdT dT	1534	CAC CU CACU GGAAAC CACU	1718
AD-70690	AAC CACU GC CAGAAAGAGAdT dT	1351	UCUCUUUCUGGCAGUGGUUdTdT	1535	AAC CACU G С CAGAAAGAGA	1719
AD-70691	CAGAAAGAGAAGUGCUUUAdTdT	1352	UAAAGCACUUCUCUUUCUGdTdT	1536	CAGAAAGAGAAGUGCUUUG	1720
AD-70692	UGCUUUGAGCCUCAGCUUAdTdT	1353	UAAGCUGAGGCUCAAAGCAdTdT	1537	UGCUUUGAGCCUCAGCUUC	1721
AD-70693	CAGCUUCUCCGGUUUUUCAdTdT	1354	UGAAAAACCGGAGAAGCUGdTdT	1538	CAGCUUCUCCGGUUUUUCC	1722
AD-70694	CGGUUUUUCCACAAGAAUAdTdT	1355	UAUUCUUGUGGAAAAACCGdTdT	1539	CGGUUUUUCCACAAGAAUG	1723
AD-70695	CAAGAAUGAGAUAUGGUAUdTdT	1356	AUACCAUAUCUCAUUCUUGdTdT	1540	CAAGAAU GAGAUAU G GUAU	1724
AD-70696	UAU GGUAUAGAACU GAGCAdT dT	1357	U GCU CAGUU CUAUAC CAUAdT dT	1541	UAUGGUAUAGAACUGAGCA	1725
AD-70697	UGAGCAAGCAGCUGUGGCAdTdT	1358	UGCCACAGCUGCUUGCUCAdTdT	1542	UGAGCAAGCAGCUGUGGCC	1726
AD-70698	GCUGUGGCCAGAUGCCAGUdTdT	1359	ACUGGCAUCUGGCCACAGCdTdT	1543	GCUGUGGCCAGAUGCCAGU	1727
AD-70699	AUGCCAGUGCAAGGGUCCUdTdT	1360	AGGACCCUUGCACUGGCAUdTdT	1544	AUGCCAGUGCAAGGGUCCU	1728
AD-70700	AAGGGUCCUGAUGCCCACUdTdT	1361	AGUGGGCAUCAGGACCCUUdTdT	1545	AAGGGUCCUGAUGCCCACU	1729
AD-70701	UGCCCACUGCCAGCGGCUAdTdT	1362	UAGCCGCUGGCAGUGGGCAdTdT	1546	UGCCCACUGCCAGCGGCUG	1730
AD-70702	CGGCUGGCCAGCCAGGCCUdTdT	1363	AGGCCUGGCUGGCCAGCCGdTdT	1547	CGGCUGGCCAGCCAGGCCU	1731
AD-70703	AGCCAGGCCUGCCGCACCAdTdT	1364	UGGUGCGGCAGGCCUGGCUdTdT	1548	AGCCAGGCCUGCCGCACCA	1732
AD-70704	CGCACCAACCCGUGCCUCAdTdT	1365	UGAGGCACGGGUUGGUGCGdTdT	1549	CGCACCAACCCGUGCCUCC	1733
AD-70705	UGCCUCCAUGGGGGUCGCUdTdT	1366	AGCGACCCCCAUGGAGGCAdTdT	1550	UGCCUCCAUGGGGGUCGCU	1734
AD-70706	GGGGUCGCUGCCUAGAGGUdTdT	1367	ACCUCUAGGCAGCGACCCCdTdT	1551	GGGGUCGCUGCCUAGAGGU	1735
AD-70707	CUAGAGGUGGAGGGCCACAdTdT	1368	UGUGGCCCUCCACCUCUAGdTdT	1552	CUAGAGGUGGAGGGCCACC	1736
AD-70708	AGGGCCACCGCCUGUGCCAdTdT	1369	UGGCACAGGCGGUGGCCCUdTdT	1553	AGGGCCACCGCCUGUGCCA	1737
AD-70709	UGUGCCACUGCCCGGUGGAdTdT	1370	UCCACCGGGCAGUGGCACAdTdT	1554	UGUGCCACUGCCCGGUGGG	1738
AD-70710	CGGUGGGCUACACCGGAGAdTdT	1371	UCUCCGGUGUAGCCCACCGdTdT	1555	CGGUGGGCUACACCGGAGC	1739
AD-70711	ACCGGAGCCUUCUGCGACAdTdT	1372	UGUCGCAGAAGGCUCCGGUdTdT	1556	ACCGGAGCCUUCUGCGACG	1740
AD-70712	UU CU GC GAC GU GGACAC CAdT dT	1373	UGGUGUCCACGUCGCAGAAdTdT	1557	UUCUGCGACGUGGACACCA	1741
AD-70713	GACACCAAGGCAAGCUGCUdTdT	1374	AGCAGCUUGCCUUGGUGUCdTdT	1558	GACACCAAGGCAAGCUGCU	1742
AD-70714	CAAGCUGCUAUGAUGGCCAdTdT	1375	UGGCCAUCAUAGCAGCUUGdTdT	1559	CAAGCUGCUAUGAUGGCCG	1743
AD-70715	GAUGGCCGCGGGCUCAGCUdTdT	1376	AGCUGAGCCCGCGGCCAUCdTdT	1560	GAUGGCCGCGGGCUCAGCU	1744
AD-70716	UCAGCUACCGCGGCCUGGAdTdT	1377	UCCAGGCCGCGGUAGCUGAdTdT	1561	UCAGCUACCGCGGCCUGGC	1745
AD-70717	CGGCCUGGCCAGGACCACAdTdT	1378	UGUGGUCCUGGCCAGGCCGdTdT	1562	CGGCCUGGCCAGGACCACG	1746
AD-70718	AGGACCACGCUCUCGGGUAdTdT	1379	UACCCGAGAGCGUGGUCCUdTdT	1563	AGGACCACGCUCUCGGGUG	1747
AD-70719	UCGGGUGCGCCCUGUCAGAdTdT	1380	UCUGACAGGGCGCACCCGAdTdT	1564	UCGGGUGCGCCCUGUCAGC	1748
AD-70720	CUGUCAGCCGUGGGCCUCAdTdT	1381	UGAGGCCCACGGCUGACAGdTdT	1565	CUGUCAGCCGUGGGCCUCG	1749
AD-70721	UGGGCCUCGGAGGCCACCUdTdT	1382	AGGUGGCCUCCGAGGCCCAdTdT	1566	UGGGCCUCGGAGGCCACCU	1750
AD-70722	С CAC CUAC C GGAAC GU GAAdT dT	1383	UUCACGUUCCGGUAGGUGGdTdT	1567	C CAC CUAC C G GAAC GU GAC	1751
AD-70723	AACGUGACUGCCGAGCAAAdTdT	1384	UUUGCUCGGCAGUCACGUUdTdT	1568	AACGUGACUGCCGAGCAAG	1752
AD-70724	CGAGCAAGCGCGGAACUGAdTdT	1385	UCAGUUCCGCGCUUGCUCGdTdT	1569	CGAGCAAGCGCGGAACUGG	1753
AD-70725	CGGAACUGGGGACUGGGCAdTdT	1386	UGCCCAGUCCCCAGUUCCGdTdT	1570	CGGAACUGGGGACUGGGCG	1754
AD-70726	GACUGGGCGGCCACGCCUUdTdT	13Θ7	AAGGCGUGGCCGCCCAGUCdTdT	1571	GACUGGGCGGCCACGCCUU	1755
AD-70727	ACGCCUUCUGCCGGAACCAdTdT	1388	UGGUUCCGGCAGAAGGCGUdTdT	1572	ACGCCUUCUGCCGGAACCC	1756
AD-70728	CGGAACСCGGACAACGACAdTdT	1389	UGUCGUUGUCCGGGUUCCGdTdT	1573	CGGAACCCGGACAACGACA	1757
AD-70729	AACGACAUCCGCCCGUGGUdTdT	1390	ACCACGGGCGGAUGUCGUUdTdT	1574	AACGACAUCCGCCCGUGGU	1758

- 128045013

AD-70730	GCCCGUGGUGCUUCGUGCUdTdT	1391	AGCACGAAGCACCACGGGCdTdT	1575	GCCCGUGGUGCUUCGUGCU	1759
AD-70731	UUCGUGCUGAACCGCGACAdTdT	1392	UGUCGCGGUUCAGCACGAAdTdT	1576	UUCGUGCUGAACCGCGACC	1760
AD-70732	ACCGCGACCGGCUGAGCUAdTdT	1393	UAGCUCAGCCGGUCGCGGUdTdT	1577	ACCGCGACCGGCUGAGCUG	1761
AD-70733	CUGAGCUGGGAGUACUGCAdTdT	1394	U GCAGUACU С C CAGCU CAGdT dT	1578	CUGAGCUGGGAGUACUGCG	1762
AD-70734	UACUGCGACCUGGCACAGUdTdT	1395	ACUGUGCCAGGUCGCAGUAdTdT	1579	UACUGCGACCUGGCACAGU	1763
AD-70735	UGGCACAGUGCCAGACCCAdTdT	1396	UGGGUCUGGCACUGUGCCAdTdT	1580	UGGCACAGUGCCAGACCCC	1764
AD-70736	AGACCCCAACCCAGGCGGAdTdT	1397	UCCGCCUGGGUUGGGGUCUdTdT	1581	AGACCCCAACCCAGGCGGC	1765
AD-70737	AGGCGGCGCCUCCGACCCAdTdT	1398	UGGGUCGGAGGCGCCGCCUdTdT	1582	AGGCGGCGCCUCCGACCCC	1766
AD-70738	UCCGACCCCGGUGUCCCCUdTdT	1399	AGGGGACACCGGGGUCGGAdTdT	1583	UCCGACCCCGGUGUCCCCU	1767
AD-70739	UGUCCCCUAGGCUUCAUGUdTdT	1400	ACAUGAAGCCUAGGGGACAdTdT	1584	UGUCCCCUAGGCUUCAUGU	1768
AD-70740	UU CAU GU С C CACU CAU GCAdT dT	1401	UGCAUGAGUGGGACAUGAAdTdT	1585	UUCAUGUCCCACUCAUGCC	1769
AD-70741	ACUCAUGCCCGCGCAGCCAdTdT	1402	UGGCUGCGCGGGCAUGAGUdTdT	1586	ACUCAUGCCCGCGCAGCCG	1770
AD-70742	CGCAGCCGGCACCGCCGAAdTdT	1403	UUCGGCGGUGCCGGCUGCGdTdT	1587	CGCAGCCGGCACCGCCGAA	1771
AD-70743	ACCGCCGAAGCCUCAGCCAdTdT	1404	UGGCUGAGGCUUCGGCGGUdTdT	1588	ACCGCCGAAGCCUCAGCCC	1772
AD-70744	UCAGCCCACGACCCGGACAdTdT	1405	UGUCCGGGUCGUGGGCUGAdTdT	1589	UCAGCCCACGACCCGGACC	1773
AD-70745	ACCCGGACCCCGCCUCAGUdTdT	1406	ACUGAGGCGGGGUCCGGGUdTdT	1590	ACCCGGACCCCGCCUCAGU	1774
AD-70562	C CU CAGU С C CAGAC С С C GAdT dT	1407	UCGGGGUCUGGGACUGAGGdTdT	1591	CCUCAGUCCCAGACCCCGG	1775
AD-70563	AGACCCCGGGAGCCUUGCAdTdT	1408	UGCAAGGCUCCCGGGGUCUdTdT	1592	AGACCCCGGGAGCCUUGCC	1776
AD-70564	CCUUGCCGGCGAAGCGGGAdTdT	1409	UCCCGCUUCGCCGGCAAGGdTdT	1593	CCUUGCCGGCGAAGCGGGA	1777
AD-70565	AAGCGGGAGCAGCCGCCUUdTdT	1410	AAGGCGGCUGCUCCCGCUUdTdT	1594	AAGCGGGAGCAGCCGCCUU	1778
AD-70566	AGCCGCCUUCCCUGACCAAdTdT	1411	UUGGUCAGGGAAGGCGGCUdTdT	1595	AGCCGCCUUCCCUGACCAG	1779
AD-70567	UGACCAGGAACGGCCCACUdTdT	1412	AGUGGGCCGUUCCUGGUCAdTdT	1596	UGACCAGGAACGGCCCACU	1780
AD-70568	CGGCCCACUGAGCUGCGGAdTdT	1413	UCCGCAGCUCAGUGGGCCGdTdT	1597	CGGCCCACUGAGCUGCGGG	1781
AD-70569	UGCGGGCAGCGGCUCCGCAdTdT	1414	UGCGGAGCCGCUGCCCGCAdTdT	1598	UGCGGGCAGCGGCUCCGCA	1782
AD-70570	CGGCUCCGCAAGAGUCUGUdTdT	1415	ACAGACUCUUGCGGAGCCGdTdT	1599	CGGCUCCGCAAGAGUCUGU	1783
AD-70571	AGUCUGUCUUCGAUGACCAdTdT	1416	U GGU CAU C GAAGACAGACUdT dT	1600	AGUCUGUCUUCGAUGACCC	1784
AD-70572	CGAUGACCCGCGUCGUUGAdTdT	1417	UCAACGACGCGGGUCAUCGdTdT	1601	CGAUGACCCGCGUCGUUGG	1785
AD-70573	UCGUUGGCGGGCUGGUGGAdTdT	1418	UCCACCAGCCCGCCAACGAdTdT	1602	UCGUUGGCGGGCUGGUGGC	1786
AD-70574	UGGUGGCGCUACGCGGGGAdTdT	1419	UCCCCGCGUAGCGCCACCAdTdT	1603	UGGUGGCGCUACGCGGGGC	1787
AD-70575	UACGCGGGGCGCACCCCUAdTdT	1420	UAGGGGUGCGCCCCGCGUAdTdT	1604	UACGCGGGGCGCACCCCUA	1788
AD-70576	ACCCCUACAUCGCCGCGCUdTdT	1421	AGCGCGGCGAUGUAGGGGUdTdT	1605	ACCCCUACAUCGCCGCGCU	1789
AD-70577	GCCGCGCUGUACUGGGGCAdTdT	1422	UGCCCCAGUACAGCGCGGCdTdT	1606	GCCGCGCUGUACUGGGGCC	1790
AD-70578	CUGGGGCCACAGUUUCUGAdTdT	1423	UCAGAAACUGUGGCCCCAGdTdT	1607	CUGGGGCCACAGUUUCUGC	1791
AD-70579	UUUCUGCGCCGGCAGCCUAdTdT	1424	UAGGCUGCCGGCGCAGAAAdTdT	1608	UUUCUGCGCCGGCAGCCUC	1792
AD-70580	CGGCAGCCUCAUCGCCCCAdTdT	1425	UGGGGCGAUGAGGCUGCCGdTdT	1609	CGGCAGCCUCAUCGCCCCC	1793
AD-70581	UCGCCCCCUGCUGGGUGCUdTdT	1426	AGCACCCAGCAGGGGGCGAdTdT	1610	UCGCCCCCUGCUGGGUGCU	1794
AD-70582	UGGGUGCUGACGGCCGCUAdTdT	1427	UAGCGGCCGUCAGCACCCAdTdT	1611	UGGGUGCUGACGGCCGCUC	1795
AD-70583	GCCGCUCACUGCCUGCAGAdTdT	1428	UCUGCAGGCAGUGAGCGGCdTdT	1612	GCCGCUCACUGCCUGCAGG	1796
AD-70584	CUGCAGGACCGGCCCGCAAdTdT	1429	UUGCGGGCCGGUCCUGCAGdTdT	1613	CUGCAGGACCGGCCCGCAC	1797
AD-70585	GGCCCGCACCCGAGGAUCUdTdT	1430	AGAUCCUCGGGUGCGGGCCdTdT	1614	GGCCCGCACCCGAGGAUCU	1798
AD-70586	CGAGGAUCUGACGGUGGUAdTdT	1431	UAC CAC C GU CAGAU C CU C GdT dT	1615	CGAGGAUCUGACGGUGGUG	1799
AD-70587	GUGGUGCUCGGCCAGGAAAdTdT	1432	UUUCCUGGCCGAGCACCACdTdT	1616	GUGGUGCUCGGCCAGGAAC	1800
AD-70588	GCCAGGAACGCCGUAACCAdTdT	1433	UGGUUACGGCGUUCCUGGCdTdT	1617	GCCAGGAACGCCGUAACCA	1801
AD-70589	C GUAAC CACAGCU GU GAGAdT dT	1434	U CU CACAGCU GU GGUUAC GdT dT	1618	CGUAACCACAGCUGUGAGC	1802
AD-70590	UGUGAGCCGUGCCAGACGUdTdT	1435	ACGUCUGGCACGGCUCACAdTdT	1619	UGUGAGCCGUGCCAGACGU	1803
AD-70591	UGCCAGACGUUGGCCGUGAdTdT	1436	UCACGGCCAACGUCUGGCAdTdT	1620	UGCCAGACGUUGGCCGUGC	1804
AD-70592	GCCGUGCGCUCCUACCGCUdTdT	1437	AGCGGUAGGAGCGCACGGCdTdT	1621	GCCGUGCGCUCCUACCGCU	1805
AD-70593	UACCGCUUGCACGAGGCCUdTdT	1438	AGGCCUCGUGCAAGCGGUAdTdT	1622	UACCGCUUGCACGAGGCCU	1806
AD-70594	ACGAGGCCUUCUCGCCCGUdTdT	1439	ACGGGCGAGAAGGCCUCGUdTdT	1623	ACGAGGCCUUCUCGCCCGU	1807
AD-70595	UCGCCCGUCAGCUACCAGAdTdT	1440	UCUGGUAGCUGACGGGCGAdTdT	1624	UCGCCCGUCAGCUACCAGC	1808
AD-70596	CUACCAGCACGACCUGGCUdTdT	1441	AGCCAGGUCGUGCUGGUAGdTdT	1625	CUACCAGCACGACCUGGCU	1809
AD-70597	ACCUGGCUCUGUUGCGCCUdTdT	1442	AGGCGCAACAGAGCCAGGUdTdT	1626	ACCUGGCUCUGUUGCGCCU	1810
AD-70598	UUGCGCCUUCAGGAGGAUAdTdT	1443	UAUCCUCCUGAAGGCGCAAdTdT	1627	UUGCGCCUUCAGGAGGAUG	1811
AD-70599	GAGGAUGCGGACGGCAGCUdTdT	1444	AGCUGCCGUCCGCAUCCUCdTdT	1628	GAGGAUGCGGACGGCAGCU	1812

- 129045013

AD-70600	ACGGCAGCUGCGCGCUCCUdTdT	1445	AGGAGCGCGCAGCUGCCGUdTdT	1629	ACGGCAGCUGCGCGCUCCU	1813
AD-70601	CGCUCCUGUCGCCUUACGUdTdT	1446	ACGUAAGGCGACAGGAGCGdTdT	1630	CGCUCCUGUCGCCUUACGU	1814
AD-70602	CCUUACGUUCAGCCGGUGUdTdT	1447	ACACCGGCUGAACGUAAGGdTdT	1631	CCUUACGUUCAGCCGGUGU	1815
AD-70603	AGCCGGUGUGCCUGCCAAAdTdT	1448	UUUGGCAGGCACACCGGCUdTdT	1632	AGCCGGUGUGCCUGCCAAG	1816
AD-70604	UGCCAAGCGGCGCCGCGCAdTdT	1449	UGCGCGGCGCCGCUUGGCAdTdT	1633	UGCCAAGCGGCGCCGCGCG	1817
AD-70605	GCGCCGCGCGACCCUCCGAdTdT	1450	UCGGAGGGUCGCGCGGCGCdTdT	1634	GCGCCGCGCGACCCUCCGA	1818
AD-70606	CCCUCCGAGACCACGCUCUdTdT	1451	AGAGCGUGGUCUCGGAGGGdTdT	1635	CCCUCCGAGACCACGCUCU	1819
AD-70607	CGCUCUGCCAGGUGGCCGAdTdT	1452	UCGGCCACCUGGCAGAGCGdTdT	1636	CGCUCUGCCAGGUGGCCGG	1820
AD-70608	AGGUGGCCGGCUGGGGCCAdTdT	1453	UGGCCCCAGCCGGCCACCUdTdT	1637	AGGUGGCCGGCUGGGGCCA	1821
AD-70609	UGGGGCCACCAGUUCGAGAdTdT	1454	UCUCGAACUGGUGGCCCCAdTdT	1638	UGGGGCCACCAGUUCGAGG	1822
AD-70610	UUCGAGGGGGCGGAGGAAUdTdT	1455	AUUCCUCCGCCCCCUCGAAdTdT	1639	UUCGAGGGGGCGGAGGAAU	1823
AD-70611	CGGAGGAAUAUGCCAGCUUdTdT	1456	AAGCUGGCAUAUUCCUCCGdTdT	1640	CGGAGGAAUAUGCCAGCUU	1824
AD-70612	CAGCUUCCUGCAGGAGGCAdTdT	1457	UGCCUCCUGCAGGAAGCUGdTdT	1641	CAGCUUCCUGCAGGAGGCG	1825
AD-70613	AGGAGGCGCAGGUACCGUUdTdT	1458	AACGGUACCUGCGCCUCCUdTdT	1642	AGGAGGCGCAGGUACCGUU	1826
AD-70614	AGGUACCGUUCCUCUCCCUdTdT	1459	AGGGAGAGGAACGGUACCUdTdT	1643	AGGUACCGUUCCUCUCCCU	1827
AD-70615	CUCUCCCUGGAGCGCUGCUdTdT	1460	AGCAGCGCUCCAGGGAGAGdTdT	1644	CUCUCCCUGGAGCGCUGCU	1828
AD-70616	CGCUGCUCAGCCCCGGACAdTdT	1461	UGUCCGGGGCUGAGCAGCGdTdT	1645	CGCUGCUCAGCCCCGGACG	1829
AD-70617	CCGGACGUGCACGGAUCCUdTdT	1462	AGGAUCCGUGCACGUCCGGdTdT	1646	CCGGACGUGCACGGAUCCU	1830
AD-70618	CGGAUCCUCCAUCCUCCCAdTdT	1463	UGGGAGGAUGGAGGAUCCGdTdT	1647	CGGAUCCUCCAUCCUCCCC	1831
AD-70619	CAUCCUCCCCGGCAUGCUAdTdT	1464	UAGCAUGCCGGGGAGGAUGdTdT	1648	CAUCCUCCCCGGCAUGCUC	1832
AD-70620	CAUGCUCUGCGCAGGGUUAdTdT	1465	UAACCCUGCGCAGAGCAUGdTdT	1649	CAUGCUCUGCGCAGGGUUC	1833
AD-70621	AGGGUUCCUCGAGGGCGGAdTdT	1466	UCCGCCCUCGAGGAACCCUdTdT	1650	AGGGUUCCUCGAGGGCGGC	1834
AD-70622	GAGGGCGGCACCGAUGCGUdTdT	1467	ACGCAUCGGUGCCGCCCUCdTdT	1651	GAGGGCGGCACCGAUGCGU	1835
AD-70623	GAUGCGUGCCAGGGUGAUUdTdT	1468	AAUCACCCUGGCACGCAUCdTdT	1652	GAUGCGUGCCAGGGUGAUU	1836
AD-70624	AGGGUGAUUCCGGAGGCCAdTdT	1469	UGGCCUCCGGAAUCACCCUdTdT	1653	AGGGUGAUUCCGGAGGCCC	1837
AD-70625	CGGAGGCCCGCUGGUGUGUdTdT	1470	ACACACCAGCGGGCCUCCGdTdT	1654	CGGAGGCCCGCUGGUGUGU	1838
AD-70626	GGUGUGUGAGGACCAAGCUdTdT	1471	AGCUUGGUCCUCACACACCdTdT	1655	GGUGUGUGAGGACCAAGCU	1839
AD-70627	CCAAGCUGCAGAGCGCCGAdTdT	1472	UCGGCGCUCUGCAGCUUGGdTdT	1656	CCAAGCUGCAGAGCGCCGG	1840
AD-70628	AGAGCGCCGGCUCACCCUAdTdT	1473	UAGGGUGAGCCGGCGCUCUdTdT	1657	AGAGCGCCGGCUCACCCUG	1841
AD-70629	UCACCCUGCAAGGCAUCAUdTdT	1474	AUGAUGCCUUGCAGGGUGAdTdT	1658	UCACCCUGCAAGGCAUCAU	1842
AD-70630	GGCAUCAUCAGCUGGGGAUdTdT	1475	AUCCCCAGCUGAUGAUGCCdTdT	1659	GGCAUCAUCAGCUGGGGAU	1843
AD-70631	CUGGGGAUCGGGCUGUGGUdTdT	1476	AC CACAGC С C GAU С С C CAGdT dT	1660	CUGGGGAUCGGGCUGUGGU	1844
AD-70632	UGUGGUGACCGCAACAAGAdTdT	1477	UCUUGUUGCGGU CAC CACAdT dT	1661	UGUGGUGACCGCAACAAGC	1845
AD-70633	CAACAAGCCAGGCGUCUAAdTdT	1478	UUAGACGCCUGGCUUGUUGdTdT	1662	CAACAAGCCAGGCGUCUAC	1846
AD-70634	AGGC GU CUACAC C GAU GUAdT dT	1479	UACAUCGGUGUAGACGCCUdTdT	1663	AGGCGUCUACACCGAUGUG	1847
AD-70635	GAUGUGGCCUACUACCUGAdTdT	1480	UCAGGUAGUAGGCCACAUCdTdT	1664	GAUGUGGCCUACUACCUGG	1848
AD-70636	UACUACCUGGCCUGGAUCAdTdT	1481	UGAUCCAGGCCAGGUAGUAdTdT	1665	UACUACCUGGCCUGGAUCC	1849
AD-70637	CUGGAUCCGGGAGCACACAdTdT	1482	UGUGUGCUCCCGGAUCCAGdTdT	1666	CUGGAUCCGGGAGCACACC	1850
AD-70638	AGCACACCGUUUCCUGAUUdTdT	1483	AAUCAGGAAACGGUGUGCUdTdT	1667	AGCACACCGUUUCCUGAUU	1851
AD-70639	UCCUGAUUGCUCAGGGACUdTdT	1484	AGU С C CU GAGCAAU CAGGAdT dT	1668	UCCUGAUUGCUCAGGGACU	1852
AD-70640	CAGGGACUCAUCUUUCCCUdTdT	1485	AGGGAAAGAU GAGU CCCUGdTdT	1669	CAGGGACUCAUCUUUCCCU	1853
AD-70641	UUUCCCUCCUUGGUGAUUAdTdT	1486	UAAUCACCAAGGAGGGAAAdTdT	1670	UUUCCCUCCUUGGUGAUUC	1854
AD-70642	U GGU GAUU С C GCAGU GAGAdT dT	1487	UCUCACUGCGGAAUCACCAdTdT	1671	UGGUGAUUCCGCAGUGAGA	1855
AD-70643	AGUGAGAGAGUGGCUGGGAdTdT	1488	U С C CAGC CACU CU CU CACUdT dT	1672	AGUGAGAGAGUGGCUGGGG	1856
AD-70644	GCUGGGGCAUGGAAGGCAAdTdT	1489	UUGCCUUCCAUGCCCCAGCdTdT	1673	GCUGGGGCAUGGAAGGCAA	1857
AD-70645	UGGAAGGCAAGAUUGUGUAdTdT	1490	UACACAAU CUUGCCUUC CAdT dT	1674	UGGAAGGCAAGAUUGUGUC	1858
AD-70646	UUGUGUCCCAUUCCCCCAAdTdT	1491	UUGGGGGAAUGGGACACAAdTdT	1675	UUGUGUCCCAUUCCCCCAG	1859
AD-70647	UCCCCCAGUGCGGCCAGCUdTdT	1492	AGCUGGCCGCACUGGGGGAdTdT	1676	UCCCCCAGUGCGGCCAGCU	1860
AD-70648	GCCAGCUCCGCGCCAGGAUdTdT	1493	AUCCUGGCGCGGAGCUGGCdTdT	1677	GCCAGCUCCGCGCCAGGAU	1861
AD-70649	GCCAGGAUGGCGCAGGAAAdTdT	1494	UUUCCUGCGCCAUCCUGGCdTdT	1678	GCCAGGAUGGCGCAGGAAC	1862
AD-70650	GCAGGAACUCAAUAAAGUAdTdT	1495	UACUUUAUUGAGUUCCUGCdTdT	1679	GCAGGAACUCAAUAAAGUG	1863
AD-70651	AAUAAAGUGCUUUGAAAAUdTdT	1496	AUUUUCAAAGCACUUUAUUdTdT	1680	AAUAAAGUGCUUUGAAAAU	1864
AD-70652	UU GAAAAU GCU GAGAAAAAdT dT	1497	UUUUU CU CAGCAUUUU CAAdT dT	1681	UU GAAAAU GCU GAGAAAAA	1865

- 130 045013

Таблица. 22. Скрининг в отношении однократной дозы для F12 в клетках Hep3b

Название дуплекса	СРЕДН.	СТАНД. ОТКЛОН.
AD-70653	75, 05	21,99
AD-70654	59, 86	17,07
AD-70655	49, 58	5, 13
AD-7 0 65 6	42,85	9,76
AD-70657	40,2	6,21
AD-70658	52,43	13, 02
AD-70659	34, 67	3,33
AD-70660	33,59	8,28
AD-70661	53, 13	11,32
AD-70662	61,89	7,76
AD-70663	48,43	6, 92
AD-70664	34,42	4,01
AD-70665	33,22	4,21
AD-70666	33,44	5, 89
AD-70667	47, 6	10, 96
AD-70668	125,01	38,32
AD-70669	64,78	12,71
AD-70670	57,49	5, 4
AD-70671	30, 06	7,8
AD-70672	54,95	2,39
AD-70673	79,79	10,29
AD-70674	88,3	12, 07
AD-70675	55, 83	14,88
AD-70676	61,99	12,96
AD-70677	50,27	9, 84
AD-70678	65, 84	10,37
AD-70679	51,1	8,97
AD-70680	64,71	10,54
AD-70681	41,02	6, 75
AD-70682	60, 65	9, 01
AD-70683	96, 74	6,29
AD-70684	71,16	13,22

- 131 045013

AD-70685	99, 97	12,48
AD-70686	45, 51	6,21
AD-70687	68,37	5,36
AD-70688	65, 68	6, 4
AD-70689	63,41	5, 72
AD-70690	54,1	7,23
AD-70691	43,79	11,91
AD-70692	51,36	8, 64
AD-70693	43,25	7,81
AD-70694	51,13	4,52
AD-70695	47,38	4,76
AD-70696	63, 08	3, 96
AD-70697	49, 53	6, 44
AD-70698	56, 12	8,22
AD-70699	53, 68	4, 62
AD-70700	68,45	12, 64
AD-70701	94,45	11,32
AD-70702	70, 82	8,36
AD-70703	93,79	7,87
AD-70704	35, 84	4,09
AD-70705	87,79	5, 74
AD-70706	59,21	9, 08
AD-70707	64,22	10, 1
AD-70708	49, 55	3
AD-70709	87,37	7,17
AD-70710	76, 54	11,55
AD-70711	62,4	4, 69
AD-70712	80,45	8, 12
AD-70713	76, 68	16,28
AD-70714	61,92	15, 07
AD-70715	85,76	8,24
AD-70716	97, 67	8,1
AD-70717	70, 83	2,72
AD-70718	50, 19	9, 69

- 132 045013

AD-70719	77,23	4,82
AD-70720	69, 02	6, 52
AD-70721	84,91	12,03
AD-70722	42, 64	6, 44
AD-70723	56, 77	6, 73
AD-70724	50,28	7,37
AD-70725	73, 06	14,77
AD-70726	69,29	8,43
AD-70727	68,98	5, 88
AD-70728	59, 51	5,26
AD-70729	77,31	11,18
AD-70730	48,22	9, 04
AD-70731	63,52	3,78
AD-70732	60, 89	6,26
AD-70733	55, 56	13, 83
AD-70734	110,37	7,09
AD-70735	70, 96	1,41
AD-70736	72,71	4,28
AD-70737	66, 94	4,75
AD-70738	104,61	9, 8
AD-70739	87,48	8,44
AD-70740	69, 08	9, 31
AD-70741	67,82	3,49
AD-70742	92,93	14, 66
AD-70743	59, 32	9, 95
AD-70744	81,97	6, 05
AD-70745	54,96	7,81
AD-70562	46,21	8,44
AD-70563	44,88	5, 69
AD-70564	67,82	20,32
AD-70565	52,32	12,39
AD-7 05 6 6	53,22	10,43
AD-70567	46,28	10,21
AD-70568	41,84	3, 91

- 133 045013

AD-70569	46, 27	10,51
AD-70570	37,31	7, 6
AD-70571	55, 84	13, 93
AD-70572	64,38	6, 03
AD-70573	75, 03	17,72
AD-70574	61,2	7, 6
AD-70575	55, 54	18,99
AD-70576	48, 67	7,52
AD-70577	34,12	10,23
AD-70578	56, 62	6, 22
AD-70579	58,22	17,32
AD-70580	64,99	8, 66
AD-70581	86, 55	15,76
AD-70582	72,76	11,98
AD-70583	47,99	20,51
AD-70584	54	14,12
AD-70585	43,72	6, 69
AD-70586	55, 96	12,05
AD-70587	64,82	18,43
AD-70588	66, 06	13, 08
AD-70589	56, 65	10,27
AD-70590	77,82	4,75
AD-70591	68, 65	9, 93
AD-70592	37,1	9, 84
AD-70593	50, 14	17,24
AD-70594	50,16	13, 61
AD-70595	60, 63	13,54
AD-70596	80,78	12,29
AD-70597	60,74	21,94
AD-70598	70,51	8,48
AD-70599	67,75	7,59
AD-70600	68,09	31,51
AD-70601	53,28	21,16
AD-70602	44,03	10,56

- 134 045013

AD-70603	87,08	40,51
AD-70604	69, 39	9, 62
AD-70605	86, 92	27,74
AD-70606	62,19	7,28
AD-70607	67,55	19, 57
AD-70608	98,46	10,23
AD-70609	77, 67	10,72
AD-70610	108,45	21,97
AD-70611	73, 02	19, 12
AD-70612	97,49	26,26
AD-70613	65, 22	19, 24
AD-70614	96, 69	21,51
AD-70615	76, 53	7,96
AD-70616	69, 73	12,06
AD-70617	58,38	10, 85
AD-70618	73, 89	22,5
AD-70619	85, 32	25, 92
AD-70620	72,03	33, 04
AD-70621	83,22	24,59
AD-70622	108,98	14,93
AD-70623	71,28	32,49
AD-70624	67,8	25, 27
AD-70625	52,08	10, 91
AD-70626	40, 94	13,75
AD-70627	33,55	3,35
AD-70628	52,37	10,46
AD-70629	53,46	4,07
AD-70630	47	8,42
AD-70631	64,51	42,23
AD-70632	30, 66	4,32
AD-70633	33, 64	12,21
AD-70634	65, 42	6, 92
AD-70635	45, 84	6,76
AD-70636	47,83	6, 63

- 135 045013

AD-70637	64,39	8,42
AD-70638	38,91	8,35
AD-70639	40, 87	7,79
AD-70640	50, 87	13,34
AD-70641	49, 64	5, 85
AD-70642	44,04	8,02
AD-70643	61,04	11,12
AD-70644	50, 03	9, 07
AD-70645	67,35	28,98
AD-70646	50, 93	6
AD-70647	83,29	5, 96
AD-70648	53,57	15, 44
AD-70649	46, 35	8,99
AD-70650	52,06	7,83
AD-70651	64, 65	9, 04
AD-70652	100, 8	9,21

Пример 11. In vivo сайленсинг F12 в мышиной модели проницаемости сосудов, индуцируемой горчичным маслом.

Как обсуждалось выше и продемонстрировано на фиг. 2 и 5, AD-67244 являлся наиболее эффективным средством, целенаправленно воздействующим на тестируемый ген F12, которое приводило в результате к устойчивому, дозозависимому снижению мРНК F12 и белка F12 в плазме крови у мышей дикого типа, и нормализации проницаемости сосудов в мышиной модели HAE с выходом жидкости из сосудов, индуцируемым брадикинином (мышиная модель с индуцированием ингибитором АСЕ).

In vivo эффективность AD-67244 также оценивали во второй мышиной модели HAE. В частности, способность AD-67244 обеспечивать восстановление проницаемости сосудов, индуцируемой горчичным маслом, у мышей с дефицитом по C1-INH определяли путем подкожного введения самкам мышей CD-1 (п=10/группу) однократной дозы 3, 0,5 или 0,1 AD-67244 в комбинации с однократной дозой 10 мг/кг двухнитевого средства на основе РНК, целенаправленно воздействующего на C1-INH в день -7. В день 0 синий краситель Эванса (30 мг/кг) вводили путем инъекции в хвостовую вену животных и 5% раствор горчичного масла наносили местно на правое ухо каждого животного (левое ухо оставалось необработанным и служило в качестве контроля). Через тридцать минут животных умерщвляли, каждое ухо отбирали для оценки экстравазации красителя с целью определения проницаемости сосудов, а печень отбирали для измерений мРНК F12 и C1-INH.

Как показано на фиг. 10А, введение однократной дозы 3, 0,5 или 0,1 мг/кг AD-67244 обеспечивало нормализацию проницаемости сосудов у этих мышей, и как показано на фиг. 10В, данное введение приводило в результате к устойчивому, дозозависимому снижению мРНК F12 в печени у этих животных. Уровень C1-INH в печени у этих животных составлял менее 0,01% от уровня C1-INH в печени группы, которой вводили контроль. Эти данные демонстрируют, что AD-67244 может уменьшать избыточную стимуляцию брадикинином.

Пример 12. In vivo сайленсинг F12 у отличных от человека приматов.

Для определения эффективности AD-67244 у отличных от человека приматов самкам яванского макака (п=3 на группу) подкожно вводили однократную дозу 3, 1, 0,3 или 0,1 мг/кг AD-67244. Уровни белка F12 в плазме крови яванского макака измеряли с помощью ELISA в дни -5, -3, -1, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 98, 112, 126 и 140 после введения дозы. На фиг. 11 продемонстрировано, что введение однократной дозы 0,3 мг/кг AD-67244 приводило в результате к более чем 85% снижению уровня белка F12. На фиг. 11 также продемонстрировано, что снижение уровня белка F12 было продолжительным с более чем 70% и 50% снижением в месяцы 2 и 3 после введения дозы соответственно.

Пример 13. Эффект 5'-модификации AD-67244 в отношении активности у мышей.

Эффект модификации 5'-фосфата антисмысловой нити AD-67244 в виде винилфосфата (VP) в отношении активности средства определяли у мышей. Мышам дикого типа (п=3/группу) вводили однократную дозу 0,5 мг/кг либо AD-67244

5ι_asascucaAfuAfAfAfgugcuuugaa-3' (SEQ ID NO: 1866);

(смысловая антисмысловая нить:

нить:

5'-usUfscaaAfgCfAfcuuuAfuUfgaguususc-3' (SEQ ID NO: 1867); ALN-F12), либо AD-74841 (смысловая нить: 5’-asascucaAfuAfAfAfgugcuuugaa-3 ’ (SEQ ID NO: 1868); антисмысловая нить: 5'-VP-usUfscaaAfgCfAfcuuuAfuUfgaguususc-3’ (SEQ ID NO: 1869); ALN-F12-VP).

Уровень белка F12 в плазме крови определяли с помощью ELISA в дни 0, 3, 7, 15 и 21 после введения

- 136 045013 дозы. На фиг. 12 продемонстрировано, что 5'-модификация фосфатной группы антисмысловой нити в виде винилфосфата обеспечивает умеренное повышение активности AD-67244.

Пример 14. Синтез и In vitro скрининг дуплексов siRNA для F12.

Дополнительные средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующие на F12, например целенаправленно воздействующие в пределах нуклеотидов 2000-2060 SEQ ID NO: 9, конструировали, синтезировали и подвергали скринингу в отношении in vitro эффективности, как описано выше. Подробный перечень дополнительных немодифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей F12 показан в табл. 23. Подробный перечень дополнительных модифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей F12 показан в табл. 24. В табл. 25 представлены результаты скрининга в отношении однократной дозы в клетках Hep3b, трансфицированных дополнительными iRNA для F12. Данные выражены в виде процента остаточной мРНК в сравнении с AD-1955.

Таблица 23. Немодифицированные последовательности F12

Название дуплекса	Смысловая последовательность , от 5' к 3'	SEQ ID NO	Диапазон в SEQ ID NO:9	Антисмысловая последовательность , от 5' к 3'	SEQ ID NO	Диапазон в SEQ ID NO: 9
AD-70649,2	GCCAGGAUGGCGCAGGAAA	1870	2004-2022	UUUCCUGCGCCAUCCUGGC	1908	2004-2022
AD-75921,1	CCAGGAUGGCGCAGGAACU	1871	2005-2023	AGUUCCUGCGCCAUCCUGG	1909	2005-2023
AD-75920,1	CAGGAUGGCGCAGGAACUA	1872	2006-2024	UAGUUCCUGCGCCAUCCUG	1910	2006-2024
AD-75919,1	AGGAUGGCGCAGGAACUCA	1873	2007-2025	UGAGUUCCUGCGCCAUCCU	1911	2007-2025
AD-75918,1	GGAUGGCGCAGGAACUCAA	1874	2008-2026	UUGAGUUCCUGCGCCAUCC	1912	2008-2026
AD-75917,1	GAUGGCGCAGGAACUCAAU	1875	2009-2027	AUUGAGUUCCUGCGCCAUC	1913	2009-2027
AD-75916,1	AUGGCGCAGGAACUCAAUA	1876	2010-2028	UAUUGAGUUCCUGCGCCAU	1914	2010-2028
AD-75915,1	UGGCGCAGGAACUCAAUAA	1877	2011-2029	UUAUUGAGUUCCUGCGCCA	1915	2011-2029
AD-75914,1	GGCGCAGGAACUCAAUAAA	1878	2012-2030	UUUAUUGAGUUCCUGCGCC	1916	2012-2030
AD-75913,1	GCGCAGGAACUCAAUAAAA	1879	2013-2031	UUUUAUUGAGUUCCUGCGC	1917	2013-2031
AD-75912,1	CGCAGGAACUCAAUAAAGU	1880	2014-2032	ACUUUAUUGAGUUCCUGCG	1918	2014-2032
AD-70650,2	GCAGGAACUCAAUAAAGUA	1881	2015-2033	UACUUUAUUGAGUUCCUGC	1919	2015-2033
AD-75911,1	CAGGAACUCAAUAAAGUGA	1882	2016-2034	UCACUUUAUUGAGUUCCUG	1920	2016-2034
AD-75910,1	AGGAACUCAAUAAAGUGCU	1883	2017-2035	AGCACUUUAUUGAGUUCCU	1921	2017-2035
AD-75909,1	GGAACUCAAUAAAGUGCUU	1884	2018-2036	AAGCACUUUAUUGAGUUCC	1922	2018-2036
AD-75908,1	GAACUCAAUAAAGUGCUUU	1885	2019-2037	AAAGCACUUUAUUGAGUUC	1923	2019-2037
AD-75907,1	AACUCAAUAAAGUGCUUUA	1886	2020-2038	UAAAGCACUUUAUUGAGUU	1924	2020-2038
AD-75906,1	ACUCAAUAAAGUGCUUUGA	1887	2021-2039	UCAAAGCACUUUAUUGAGU	1925	2021-2039
AD-75922,1	UCAAUAAAGUGCUUUGAAA	1888	2023-2041	UUUCAAAGCACUUUAUUGA	1926	2023-2041
AD-75923,1	CAAUAAAGUGCUUUGAAAA	1889	2024-2042	UUUUCAAAGCACUUUAUUG	1927	2024-2042
AD-70651,2	AAUAAAGUGCUUUGAAAAU	1890	2025-2043	AUUUUCAAAGCACUUUAUU	1928	2025-2043
AD-75924,1	AUAAAGUGCUUUGAAAAUA	1891	2026-2044	UAUUUUCAAAGCACUUUAU	1929	2026-2044
AD-75925,1	UAAAGUGCUUUGAAAAUGA	1892	2027-2045	UCAUUUUCAAAGCACUUUA	1930	2027-2045
AD-75926,1	AAAGUGCUUUGAAAAUGCU	1893	2028-2046	AGCAUUUUCAAAGCACUUU	1931	2028-2046
AD-75927,1	AAGUGCUUUGAAAAUGCUA	1894	2029-2047	UAGCAUUUUCAAAGCACUU	1932	2029-2047
AD-75928,1	AGUGCUUUGAAAAUGCUGA	1895	2030-2048	UCAGCAUUUUCAAAGCACU	1933	2030-2048
AD-75929,1	GUGCUUUGAAAAUGCUGAA	1896	2031-2049	UUCAGCAUUUUCAAAGCAC	1934	2031-2049
AD-75930,1	UGCUUUGAAAAUGCUGAGA	1897	2032-2050	UCUCAGCAUUUUCAAAGCA	1935	2032-2050
AD-75931,1	GCUUUGAAAAUGCUGAGAA	1898	2033-2051	UUCUCAGCAUUUUCAAAGC	1936	2033-2051
AD-75932,1	CUUUGAAAAUGCUGAGAAA	1899	2034-2052	UUUCUCAGCAUUUUCAAAG	1937	2034-2052
AD-75933,1	UUUGAAAAUGCUGAGAAAA	1900	2035-2053	UUUUCUCAGCAUUUUCAAA	1938	2035-2053
AD-70652,2	UUGAAAAUGCUGAGAAAAA	1901	2036-2054	UUUUUCUCAGCAUUUUCAA	1939	2036-2054
AD-75934,1	UGAAAAUGCUGAGAAAAAA	1902	2037-2055	UUUUUUCUCAGCAUUUUCA	1940	2037-2055
AD-75935,1	GAAAAUGCUGAGAAAAAAA	1903	2038-2056	UUUUUUUCUCAGCAUUUUC	1941	2038-2056
AD-75936,1	AAAAUGCUGAGAAAAAAAA	1904	2039-2057	UUUUUUUUCUCAGCAUUUU	1942	2039-2057
AD-75937,1	AAAUGCUGAGAAAAAAAAA	1905	2040-2058	UUUUUUUUUCUCAGCAUUU	1943	2040-2058
AD-75938,1	AAUGCUGAGAAAAAAAAAA	1906	2041-2059	UUUUUUUUUUCUCAGCAUU	1944	2041-2059
AD-75939,1	AUGCUGAGAAAAAAAAAAA	1907	2042-2060	UUUUUUUUUUUCUCAGCAU	1945	2042-2060

- 137 045013

Таблица 24. Модифицированные последовательности F12

Название дуплекса	Смысловая последовательность, от 5' к 3'	SEQ ID NO	Антисмысловая последовательность , от 5' к 3'	SEQ ID NO	Целевая последовательность мРНК, 5' к 3'	SEQ ID NO	Целевой участок мРНК в SEQ ID NO:9
AD-70649	GCCAGGAUGGCGCAGGAAAdTdT	1946	UUUCCUGCGCCAUCCUGGCdTdT	1984	GCCAGGAUGGCGCAGGAAC	2022	2004-2022
AD-75921	CCAGGAUGGCGCAGGAACUdTdT	1947	AGUUCCUGCGCCAUCCUGGdTdT	1985	CCAGGAUGGCGCAGGAACU	2023	2005-2023
AD-75920	CAGGAUGGCGCAGGAACUAdTdT	1948	UAGUUCCUGCGCCAUCCUGdTdT	1986	CAGGAUGGCGCAGGAACUC	2024	2006-2024
AD-75919	AGGAUGGCGCAGGAACUCAdTdT	1949	UGAGUUCCUGCGCCAUCCUdTdT	1987	AGGAUGGCGCAGGAACUCA	2025	2007-2025
AD-75918	GGAUGGCGCAGGAACUCAAdTdT	1950	UUGAGUUCCUGCGCCAUCCdTdT	1988	GGAUGGCGCAGGAACUCAA	2026	2008-2026
AD-75917	GAUGGCGCAGGAACUCAAUdTdT	1951	AUUGAGUUCCUGCGCCAUCdTdT	1989	GAUGGCGCAGGAACUCAAU	2027	2009-2027
AD-75916	AUGGCGCAGGAACUCAAUAdTdT	1952	UAUUGAGUUCCUGCGCCAUdTdT	1990	AUGGCGCAGGAACUCAAUA	2028	2010-2028
AD-75915	UGGCGCAGGAACUCAAUAAdTdT	1953	UUAUUGAGUUCCUGCGCCAdTdT	1991	UGGCGCAGGAACUCAAUAA	2029	2011-2029
AD-75914	GGCGCAGGAACUCAAUAAAdTdT	1954	UUUAUUGAGUUCCUGCGCCdTdT	1992	GGCGCAGGAACUCAAUAAA	2030	2012-2030
AD-75913	GCGCAGGAACUCAAUAAAAdTdT	1955	UUUUAUUGAGUUCCUGCGCdTdT	1993	GCGCAGGAACUCAAUAAAG	2031	2013-2031
AD-75912	CGCAGGAACUCAAUAAAGUdTdT	1956	ACUUUAUUGAGUUCCUGCGdTdT	1994	CGCAGGAACUCAAUAAAGU	2032	2014-2032
AD-70650	GCAGGAACUCAAUAAAGUAdTdT	1957	UACUUUAUUGAGUUCCUGCdTdT	1995	GCAGGAACUCAAUAAAGUG	2033	2015-2033
AD-75911	CAGGAACU CAAUAAAGU GAdT dT	1958	U CACUUUAUU GAGUU CCUGdTdT	1996	CAGGAACUCAAUAAAGUGC	2034	2016-2034
AD-75910	AGGAACUCAAUAAAGUGCUdTdT	1959	AGCACUUUAUUGAGUUCCUdTdT	1997	AGGAACUCAAUAAAGUGCU	2035	2017-2035
AD-75909	GGAACUCAAUAAAGUGCUUdTdT	1960	AAGCACUUUAUUGAGUUCCdTdT	1998	GGAACUCAAUAAAGUGCUU	2036	2018-2036
AD-75908	GAACUCAAUAAAGUGCUUUdTdT	1961	AAAGCACUUUAUUGAGUUCdTdT	1999	GAACUCAAUAAAGUGCUUU	2037	2019-2037
AD-75907	AACU CAAUAAAGU GCUUUAdT dT	1962	UAAAGCACUUUAUUGAGUUdTdT	2000	AACUCAAUAAAGUGCUUUG	2038	2020-2038
AD-75906	ACUCAAUAAAGUGCUUUGAdTdT	1963	UCAAAGCACUUUAUUGAGUdTdT	2001	ACUCAAUAAAGUGCUUUGA	2039	2021-2039
AD-75922	UCAAUAAAGUGCUUUGAAAdTdT	1964	UUUCAAAGCACUUUAUUGAdTdT	2002	UCAAUAAAGUGCUUUGAAA	2040	2023-2041
AD-75923	CAAUAAAGUGCUUUGAAAAdTdT	1965	UUUUCAAAGCACUUUAUUGdTdT	2003	CAAUAAAGUGCUUUGAAAA	2041	2024-2042
AD-70651	AAUAAAGUGCUUUGAAAAUdTdT	1966	AUUUUCAAAGCACUUUAUUdTdT	2004	AAUAAAGUGCUUUGAAAAU	2042	2025-2043
AD-75924	AUAAAGUGCUUUGAAAAUAdTdT	1967	UAUUUUCAAAGCACUUUAUdTdT	2005	AUAAAGUGCUUUGAAAAUG	2043	2026-2044
AD-75925	UAAAGUGCUUUGAAAAUGAdTdT	1968	UCAUUUUCAAAGCACUUUAdTdT	2006	UAAAGUGCUUUGAAAAUGC	2044	2027-2045
AD-75926	AAAGUGCUUUGAAAAUGCUdTdT	1969	AGCAUUUUCAAAGCACUUUdTdT	2007	AAAGUGCUUUGAAAAUGCU	2045	2028-2046
AD-75927	AAGUGCUUUGAAAAUGCUAdTdT	1970	UAGCAUUUUCAAAGCACUUdTdT	2008	AAGUGCUUUGAAAAUGCUG	2046	2029-2047
AD-75928	AGUGCUUUGAAAAUGCUGAdTdT	1971	UCAGCAUUUUCAAAGCACUdTdT	2009	AGUGCUUUGAAAAUGCUGA	2047	2030-2048
AD-75929	GUGCUUUGAAAAUGCUGAAdTdT	1972	UUCAGCAUUUUCAAAGCACdTdT	2010	GUGCUUUGAAAAUGCUGAG	2048	2031-2049
AD-75930	UGCUUUGAAAAUGCUGAGAdTdT	1973	UCUCAGCAUUUUCAAAGCAdTdT	2011	UGCUUUGAAAAUGCUGAGA	2049	2032-2050
AD-75931	GCUUUGAAAAUGCUGAGAAdTdT	1974	UUCUCAGCAUUUUCAAAGCdTdT	2012	GCUUUGAAAAUGCUGAGAA	2050	2033-2051
AD-75932	CUUU GAAAAU GCU GAGAAAdT dT	1975	UUUCUCAGCAUUUUCAAAGdTdT	2013	CUUU GAAAAU GCU GAGAAA	2051	2034-2052
AD-75933	UUUGAAAAUGCUGAGAAAAdTdT	1976	UUUU CU CAGCAUUUU CAAAdT dT	2014	UUUGAAAAUGCUGAGAAAA	2052	2035-2053
AD-70652	UU GAAAAU GCU GAGAAAAAdT dT	1977	UUUUUCUCAGCAUUUUCAAdTdT	2015	UUGAAAAUGCUGAGAAAAA	2053	2036-2054
AD-75934	UGAAAAUGCUGAGAAAAAAdTdT	1978	UUUUUUCUCAGCAUUUUCAdTdT	2016	UGAAAAUGCUGAGAAAAAA	2054	2037-2055
AD-75935	GAAAAU GCU GAGAAAAAAAdT dT	1979	UUUUUUUCUCAGCAUUUUCdTdT	2017	GAAAAUGCUGAGAAAAAAA	2055	2038-2056
AD-75936	AAAAU GCU GAGAAAAAAAAdT dT	1980	UUUUUUUUCUCAGCAUUUUdTdT	2018	AAAAUGCUGAGAAAAAAAA	2056	2039-2057
AD-75937	AAAU GCU GAGAAAAAAAAAdT dT	1981	UUUUUUUUUCUCAGCAUUUdTdT	2019	AAAUGCUGAGAAAAAAAAA	2057	2040-2058
AD-75938	AAU GCU GAGAAAAAAAAAAdT dT	1982	UUUUUUUUUUCUCAGCAUUdTdT	2020	AAUGCUGAGAAAAAAAAAA	2058	2041-2059
AD-75939	AU GCU GAGAAAAAAAAAAAdT dT	1983	UUUUUUUUUUUCUCAGCAUdTdT	2021	AUGCUGAGAAAAAAAAAAA	2059	2042-2060

- 138 045013

Таблица 25. Скрининг в отношении однократной дозы для F12 в клетках Hep3b

ID дуплекса	10 нМ_средн.	10пМ_станд. отклон.	0, 1 нМ_средн.	0,1 нМ, станд. отклон.
AD-70649,2	28, 65	6,26	41,38	9, 60
AD-75921,1	29, 32	7,31	41,14	10,86
AD-75920,1	30, 91	5, 90	45, 92	15, 18
AD-75919,1	32,12	14,45	66, 98	17,31
AD-75918,1	28,51	14,34	57,71	21,51
AD-75917,1	22,80	1,02	33,45	5, 13
AD-75916,1	27,48	7,88	34, 62	6, 73
AD-75915,1	50,58	28,39	56, 95	39, 88
AD-75914,1	28,22	5, 74	54,70	9, 80
AD-75913,1	38,35	11,58	32,08	9, 74
AD-75912,1	27,06	9, 92	39,41	14,48
AD-70650,2	31,86	12, 64	40,42	11,08
AD-75911,1	28,50	5, 83	53,54	9, 61
AD-75910,1	34,12	6, 44	47,93	22,85
AD-75909,1	35, 13	13,76	51,88	42,23
AD-75908,1	38,17	7 , 67	66, 18	59, 34
AD-75907,1	40, 80	20,27	62,36	20, 96
AD-75906,1	49,29	8, 64	58,20	26, 56
AD-75922,1	25, 51	3,58	45, 53	20, 00
AD-75923,1	49, 08	13, 60	49, 27	11,54
AD-70651,2	55, 60	32,34	94,24	39, 01
AD-75924,1	46, 27	14,11	53,33	11, 68
AD-75925,1	37,21	8,81	46, 28	17,48
AD-75926,1	27,13	6, 82	39,29	8,19
AD-75927,1	47,80	14, 67	62,71	21,77
AD-75928,1	34,40	6, 27	70, 89	29, 90
AD-75929,1	43, 65	16, 80	54,91	4, 67
AD-75930,1	72, 67	33, 09	81,86	17, 63
AD-75931,1	85, 60	17,39	88,98	12, 61
AD-75932,1	46, 69	3, 04	68,57	12,35
AD-75933,1	75, 04	4,59	97,52	8,55
AD-70652,2	104,50	12,08	84,12	4,74
AD-75934,1	83,25	19, 97	82,77	10, 51
AD-75935,1	65, 87	3,46	84,47	11, 66
AD-75936,1	97,74	3, 66	93,48	10, 33
AD-75937,1	112,45	30, 62	98,91	29, 75
AD-75938,1	125,12	33, 83	110,47	33, 87
AD-75939,1	112,95	24,79	93, 19	18,21

Пример 15. Оценка 5'-концевых модификаций дуплексов siRNA для F12.

Дополнительные средства на основе iRNA, целенаправленно воздействующие на F12, содержащие нуклеотид, содержащий миметик 5'-фосфата, т.е. винилфосфат, конструировали, синтезировали и подвергали скринингу в отношении in vitro эффективности, как описано выше. Также конструировали, синтезировали и подвергали скринингу средства, содержащие одинаковые немодифицированные и модифицированные нуклеотидные последовательности этих средств, но без 5'-модификации в виде винилфосфата в антисмысловой нити, как описано выше. Подробный перечень всех этих дополнительных немодифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей F12 показан в табл. 26. Подроб- 139 045013 ный перечень всех этих дополнительных модифицированных последовательностей смысловой и антисмысловой нитей F12 показан в табл. 27. В табл. 28 представлены результаты скрининга в отношении однократной дозы в клетках, представляющих собой первичные гепатоциты мыши, трансфицированных указанными средствами на основе dsRNA для F12.

In vivo эффективность поднабора этих соединений также оценивали путем подкожного введения мышам дикого типа однократной дозы 0,5 мг/кг средства и определения уровня белка F12 в плазме крови животных в дни 3, 7 и 15 после введения дозы. На фиг. 13 показаны результаты этих анализов и продемонстрировано, что добавление 5'-винилфосфата к антисмысловым нитям оказывает умеренный эффект в отношении in vivo эффективности указанных средств.

Таблица 26. F12 Немодифицированные последовательности F12

Название дуплекса	Смысловая последовательность, от 5' к 3'	SEQ ID NO	Антисмысловая последовательность, от 5' к 3'	SEQ ID NO	Диапазон в SEQ ID NO: 9
AD-73610	GGAGCCCAAGAAAGUGAAAGA	2060	UCUUUCACUUUCUUGGGCUCCAA	2105	299-321
AD-73633	GGAGCCCAAGAAAGUGAAAGA	2061	UCUUUCACUUUCUUGGGCUCCAA	2106	299-321
AD-73604	GAGCСCAAGAAAGUGAAAGAA	2062	UUCUUUCACUUUCUUGGGCUCCA	2107	300-322
AD-73627	GAGCСCAAGAAAGUGAAAGAA	2063	UUCUUUCACUUUCUUGGGCUCCA	2108	300-322
AD-73595	GC С CAAGAAAGUGAAAGAC СА	2064	UGGUCUUUCACUUUCUUGGGCUC	2109	302-324
AD-73617	GC С CAAGAAAGUGAAAGAC СА	2065	UGGUCUUUCACUUUCUUGGGCUC	2110	302-324
AD-73606	С С CAAGAAAGUGAAAGAC САА	2066	UUGGUCUUUCACUUUCUUGGGCU	2111	303-325
AD-73629	С С CAAGAAAGUGAAAGAC САА	2067	UUGGUCUUUCACUUUCUUGGGCU	2112	303-325
AD-73609	AAAGAGAAAUGCUUUGAGCCA	2068	UGGCUCAAAGCAUUUCUCUUUCU	2113	426-448
AD-73632	AAAGAGAAAUGCUUUGAGCCA	2069	UGGCUCAAAGCAUUUCUCUUUCU	2114	426-448
AD-73599	AAGAGAAAUGCUUUGAGCCUA	2070	UAGGCUCAAAGCAUUUCUCUUUC	2115	427-449
AD-73621	AAGAGAAAUGCUUUGAGCCUA	2071	UAGGCUCAAAGCAUUUCUCUUUC	2116	427-449
AD-73597	AGAGAAAUGCUUUGAGCCUCA	2072	UGAGGCUCAAAGCAUUUCUCUUU	2117	428-450
AD-73619	AGAGAAAUGCUUUGAGCCUCA	2073	UGAGGCUCAAAGCAUUUCUCUUU	2118	428-450
AD-73596	GAGAAAUGCUUUGAGCCUCAA	2074	UUGAGGCUCAAAGCAUUUCUCUU	2119	429-451
AD-73618	GAGAAAUGCUUUGAGCCUCAA	2075	UUGAGGCUCAAAGCAUUUCUCUU	2120	429-451
AD-73614	AGAAAUGCUUUGAGCCUCAGA	2076	UCUGAGGCUCAAAGCAUUUCUCU	2121	430-452
AD-73637	AGAAAUGCUUUGAGCCUCAGA	2077	UCUGAGGCUCAAAGCAUUUCUCU	2122	430-452
AD-73611	AAAUGCUUUGAGCCUCAGCUA	2078	UAGCUGAGGCUCAAAGCAUUUCU	2123	432-454

- 140 045013

AD-73634	AAAUGCUUUGAGCCUCAGCUA	2079	UAGCUGAGGCUCAAAGCAUUUCU	2124	432-454
AD-73605	AUGCUUUGAGCCUCAGCUUCA	2080	UGAAGCUGAGGCUCAAAGCAUUU	2125	434-456
AD-73628	AUGCUUUGAGCCUCAGCUUCA	2081	UGAAGCUGAGGCUCAAAGCAUUU	2126	434-456
AD-73601	UGCUUUGAGCCUCAGCUUCUA	2082	UAGAAGCUGAGGCUCAAAGCAUU	2127	435-457
AD-73624	UGCUUUGAGCCUCAGCUUCUA	2083	UAGAAGCUGAGGCUCAAAGCAUU	2128	435-457
AD-73613	GCUUUGAGCCUCAGCUUCUCA	2084	UGAGAAGCUGAGGCUCAAAGCAU	2129	436-458
AD-73636	GCUUUGAGCCUCAGCUUCUCA	2085	UGAGAAGCUGAGGCUCAAAGCAU	2130	436-458
AD-73616	ACUC САС CUUC CUGCAGGAGA	2086	UCUCCUGCAGGAAGGUGGAGUAU	2131	1522-1544
AD-73639	ACUC САС CUUC CUGCAGGAGA	2087	UCUCCUGCAGGAAGGUGGAGUAU	2132	1522-1544
AD-73603	CACAGAAACUCAAUAAAGUGA	2088	UCACUUUAUUGAGUUUCUGUGCC	2133	1927-1949
AD-73626	CACAGAAACUCAAUAAAGUGA	2089	UCACUUUAUUGAGUUUCUGUGCC	2134	1927-1949
AD-73607	ACAGAAACUCAAUAAAGUGCA	2090	UGCACUUUAUUGAGUUUCUGUGC	2135	1928-1950
AD-73630	ACAGAAACUCAAUAAAGUGCA	2091	UGCACUUUAUUGAGUUUCUGUGC	2136	1928-1950
AD-73600	CAGAAACUCAAUAAAGUGCUA	2092	UAGCACUUUAUUGAGUUUCUGUG	2137	1929-1951
AD-73622	CAGAAACUCAAUAAAGUGCUA	2093	UAGCACUUUAUUGAGUUUCUGUG	2138	1929-1951
AD-73615	AGAAACUCAAUAAAGUGCUUA	2094	UAAGCACUUUAUUGAGUUUCUGU	2139	1930-1952
AD-73638	AGAAACUCAAUAAAGUGCUUA	2095	UAAGCACUUUAUUGAGUUUCUGU	2140	1930-1952
AD-73598	GAAACUCAAUAAAGUGCUUUA	2096	UAAAGCACUUUAUUGAGUUUCUG	2141	1931-1953
AD-73620	GAAACUCAAUAAAGUGCUUUA	2097	UAAAGCACUUUAUUGAGUUUCUG	2142	1931-1953
AD-73602	AAACUCAAUAAAGUGCUUUGA	2098	UCAAAGCACUUUAUUGAGUUUCU	2143	1932-1954
AD-73625	AAACUCAAUAAAGUGCUUUGA	2099	UCAAAGCACUUUAUUGAGUUUCU	2144	1932-1954
AD-73608	ACUCAAUAAAGUGCUUUGAAA	2100	UUUCAAAGCACUUUAUUGAGUUU	2145	1934-1956
AD-73631	ACUCAAUAAAGUGCUUUGAAA	2101	UUUCAAAGCACUUUAUUGAGUUU	2146	1934-1956
AD-73612	UCAAUAAAGUGCUUUGAAAAA	2102	UUUUUCAAAGCACUUUAUUGAGU	2147	1936-1958
AD-73635	UCAAUAAAGUGCUUUGAAAAA	2103	UUUUUCAAAGCACUUUAUUGAGU	2148	1936-1958
AD-73623	AACUCAAUAAAGUGCUUUGAA	2104	UUCAAAGCACUUUAUUGAGUUUC	2149	1933-1955
AD-74838	AAUAAAGUGCUUUGAAAACGA	2333	UCGUUUUCAAAGCACUUUAUUGA	2335	1938-1960
AD-74842	AAUAAAGUGCUUUGAAAACGA	2334	UCGUUUUCAAAGCACUUUAUUGA	2336	1938-1960

Таблица 27. Модифицированные последовательности F12

Название дуплекса	Смысловая последовательность, от 5’ к 3'	SEQ ID NO	Антисмысловая последовательность , от 5’ к 3’	SEQ ID NO	Целевая последовательность мРНК	SEQ ID NO
AD-73610	gsgsagccCfaAfGLAfaagugaaagaL96	2150	usCfsuuuCfaCfUfuucuUfgGfgcuccsasa	2195	U U G GAG С С С AAGAAAGU GAAAGA	2240
AD-73633	gsgsagccCfaAf GfAfaagugaaagaL96	2151	PusCfsuuuCfaCfUfuucuUfgGfgcuccsasa	2196	U U G GAG С С С AAGAAAGU GAAAGA	2241
AD-73604	gsasgcccAfaGfAfAfagugaaagaaL96	2152	usUfscuuUfcAfCfuuucUfuGfggcucscsa	2197	U GGAGC С CAAGAAAGU GAAAGAC	2242
AD-73627	gsasgcccAfaGfAfAfagugaaagaaL96	2153	PusUfscuuUfcAfCfuuucUfuGfggcucscsa	2198	U GGAGC С CAAGAAAGU GAAAGAC	2243
AD-73595	gscsccaaGfaAfAfGfugaaagaccaL96	2154	usGfsgucUfuUfCfacuuUfcUfugggcsusc	2199	GAGC С CAAGAAAGU GAAAGAC CA	2244
AD-73617	gscsccaaGfaAfAfGfugaaagaccaL96	2155	PusGfsgucUfuUfCfacuuUfcUfugggcsusc	2200	GAGC C CAAGAAAGU GAAAGAC CA	2245
AD-73606	cscscaagAfaAfGfUfgaaagaccaaL96	2156	usUfsgguCfuUfUfcacuUfuCfuugggscsu	2201	AGC C CAAGAAAGU GAAAGAC CAU	2246
AD-73629	cscscaagAfaAfGfUfgaaagaccaaL96	2157	PusUfsgguCfuUfUfcacuUfuCfuugggscsu	2202	AGC C CAAGAAAGU GAAAGAC CAU	2247
AD-73609	asasagagAfaAfUfGfcuuugagccaL96	2158	usGfsgcuCfaAfAfgcauUfuCfucuuuscsu	2203	AGAAAGAGAAAUGCUUUGAGCCU	2248
AD-73632	asasagagAfaAfUfGfcuuugagccaL96	2159	PusGfsgcuCfaAfAfgcauUfuCfucuuuscsu	2204	AGAAAGAGAAAUGCUUUGAGCCU	2249
AD-73599	asasgagaAfaUfGfCfuuugagccuaL96	2160	usAfsggcUfcAfAfagcaUfuUfcucuususc	2205	GAAAGAGAAAUGCUUUGAGCCUC	2250
AD-73621	asasgagaAfaUfGfCfuuugagccuaL96	2161	PusAfsggcUfcAfAfagcaUfuUfcucuususc	2206	GAAAGAGAAAUGCUUUGAGCCUC	2251
AD-73597	asgsagaaAfuGfCfUfuugagccucaL96	2162	usGfsaggCfuCLAfaagcAfuUfucucususu	2207	AAAGAGAAAUGCUUUGAGCCUCA	2252
AD-73619	asgsagaaAfuGfCfUfuugagccucaL96	2163	PusGfsaggCfuCfAfaagcAfuUfucucususu	2208	AAAGAGAAAUGCUUUGAGCCUCA	2253
AD-73596	gsasgaaaUfgCfUfUfugagccucaaL96	2164	usUfsgagGfcUfCfaaagCfaUfuucucsusu	2209	AAGAGAAAUGCUUUGAGCCUCAG	2254
AD-73618	gsasgaaaUfgCfUfUfugagccucaaL96	2165	PusUfsgagGfcUfCfaaagCfaUfuucucsusu	2210	AAGAGAAAUGCUUUGAGCCUCAG	2255
AD-73614	asgsaaauGfcUfUfUfgagccucagaL96	2166	usCfsugaGfgCfUfcaaaGfcAfuuucuscsu	2211	AGAGAAAUGCUUUGAGCCUCAGC	2256
AD-73637	asgsaaauGfcUfUfUfgagccucagaL96	2167	PusCfsugaGfgCfUfcaaaGfcAfuuucuscsu	2212	AGAGAAAUGCUUUGAGCCUCAGC	2257
AD-73611	asasaugcUfuUfGfAfgccucagcuaL96	2168	usAfsgcuGfaGfGfcucaAfaGfcauuuscsu	2213	AGAAAUGCUUUGAGCCUCAGCUU	2258
AD-73634	asasaugcUfuUfGfAfgccucagcuaL96	2169	PusAf sgcuGfaGfGfcucaAfaGfcauuuscsu	2214	AGAAAUGCUUUGAGCCUCAGCUU	2259
AD-73605	asusgcuuUfgAfGfCfcucagcuucaL96	2170	usGfsaagCfuGfAfggcuCfaAfagcaususu	2215	AAAUGCUUUGAGCCUCAGCUUCU	2260

- 141 045013

AD-73628	asusgcuuUfgAfGfCfcucagcuucaL96	2171	PusGfsaagCfuGfAfggcuCfaAfagcaususu	2216	AAAUGCUUUGAGCCUCAGCUUCU	2261
AD-73601	usgscuuuGfaGfCfCfucagcuucuaL96	2172	usAf sgaaGfcUfGfaggcUfcAfaagcasusu	2217	AAUGCUUUGAGCCUCAGCUUCUC	2262
AD-73624	usgscuuuGfaGfCfCfucagcuucuaL96	2173	PusAfsgaaGfcUfGfaggcUfcAfaagcasusu	2218	AAUGCUUUGAGCCUCAGCUUCUC	2263
AD-73613	gscsuuugAf gCfCfUfcagcuucucaL96	2174	usGfsagaAfgCfUfgaggCfuCfaaagcsasu	2219	AUGCUUUGAGCCUCAGCUUCUCA	2264
AD-73636	gscsuuugAfgCfCfUfcagcuucucaL96	2175	PusGfsagaAfgCfUfgaggCfuCfaaagcsasu	2220	AUGCUUUGAGCCUCAGCUUCUCA	2265
AD-73616	ascsuccaCfcUfUfCfcugcaggagaL96	2176	usCfsuccUfgCfAfggaaGfgUfggagusasu	2221	AUACUCCACCUUCCUGCAGGAGG	2266
AD-73639	ascsuccaCfcUfUfCfcugcaggagaL96	2177	PusCfsuccUfgCfAfggaaGfgUfggagusasu	2222	AUACUCCACCUUCCUGCAGGAGG	2267
AD-73603	csascagaAfaCfUfCfaauaaagugaL96	2178	usCfSacuUfuAfUfugagUfuUfcugugscsc	2223	GGCACAGAAACUCAAUAAAGUGC	2268
AD-73626	csascagaAf aCfUfCfaauaaagugaL96	2179	PusCfsacuUfuAfUfugagUfuUfcugugscsc	2224	GGCACAGAAACUCAAUAAAGUGC	2269
AD-73607	ascsagaaAfcUfCfAfauaaagugcaL96	2180	usGfscacUfuUfAfuugaGfuUfucugusgsc	2225	GCACAGAAACUCAAUAAAGUGCU	2270
AD-73630	ascsagaaAf cUfCfAf auaaagugcaL96	2181	PusGfscacUfuUfAfuugaGfuUfucugusgsc	2226	GCACAGAAACUCAAUAAAGUGCU	2271
AD-73600	csasgaaaCfuCfAfAfuaaagugcuaL96	2182	usAfsgcaCfuUfUfauugAfgUfuucugsusg	2227	CACAGAAACUCAAUAAAGUGCUU	2272
AD-73622	csasgaaaCfuCfAfAf uaaagugcuaL96	2183	PusAf sgcaCfuUfUfauugAfgUfuucugsusg	2228	CACAGAAACUCAAUAAAGUGCUU	2273
AD-73615	asgsaaacUfcAfAfUfaaagugcuuaL96	2184	usAf sagcAfcUfUfuauuGfaGfuuucusgsu	2229	ACAGAAACUCAAUAAAGUGCUUU	2274
AD-73638	asgsaaacUfcAfAfUfaaagugcuuaL96	2185	PusAf sagcAfcUfUfuauuGfaGfuuucusgsu	2230	ACAGAAACUCAAUAAAGUGCUUU	2275
AD-73598	gsasaacuCfaAfUfAfaagugcuuuaL96	2186	usAfsaagCfaCfUfuuauUfgAfguuucsusg	2231	CAGAAACUCAAUAAAGUGCUUUG	2276
AD-73620	gsasaacuCfaAfUfAf aagugcuuuaL96	2187	PusAf saagCfaCfUfuuauUfgAfguuucsusg	2232	CAGAAACUCAAUAAAGUGCUUUG	2277
AD-73602	asasacucAfaUfAfAf agugcuuugaL96	2188	usCfsaaaGfcAfCfuuuaUfuGfaguuuscsu	2233	AGAAACUCAAUAAAGUGCUUUGA	2278
AD-73625	asasacucAf aUfAfAf agugcuuugaL96	2189	PusCfsaaaGfcAfCfuuuaUfuGfaguuuscsu	2234	AGAAACUCAAUAAAGUGCUUUGA	2279
AD-73608	ascsucaaUfaAfAfGfugcuuugaaaL96	2190	usUfsucaAfaGfCfacuuUfaUfugagususu	2235	AAACUCAAUAAAGUGCUUUGAAA	2280
AD-73631	ascsucaaUfaAfAfGfugcuuugaaaL96	2191	PusUfsucaAfaGfCfacuuUfaUfugagususu	2236	AAACUCAAUAAAGUGCUUUGAAA	2281
AD-73612	uscsaauaAfaGfUfGfcuuugaaaaaL96	2192	usUfsuuuCfaAfAfgcacUfuUfauugasgsu	2237	ACUCAAUAAAGUGCUUUGAAAAC	2282
AD-73635	uscsaauaAfaGfUfGfcuuugaaaaaL96	2193	PusUfsuuuCfaAfAfgcacUfuUfauugasgsu	2238	ACUCAAUAAAGUGCUUUGAAAAC	2283
AD-73623	asascucaAfuAfAfAfgugcuuugaaL96	2194	PusUfscaaAfgCfAf cuuuAfuUfgaguususe	2239	GAAACUCAAUAAAGUGCUUUGAA	2284
AD-74838	asasuaaaGfuGfCfUfuugaaaacgaL96	2337	usCfsguuUfuCfAfaagcAfcUfuuauusgsa	2339	UCAAUAAAGUGCUUUGAAAACGA	2341
AD-74842	asasuaaaGfuGfCfUfuugaaaacgaL96	2338	PusCfsguuUfuCfAfaagcAfcUfuuauusgsa	2340	UCAAUAAAGUGCUUUGAAAACGA	2342

- 142 045013

Таблица 28. Скрининг в отношении однократной дозы для F12 в первичных гепатоцитах мыши

	Активность
10 нМ	0,1 нМ*
ID дуплекса	Средн.	Станд. отклон.	Средн.	Станд. отклон.
AD-67244	7,5	2,3	69, 5	4, 6
AD-73610	46, 8	14,1	104,7	10, 1
AD-73633	18, 0	6, 8	69, 2	13,3
AD-73604	21,0	6, 3	100,3	10, 0
AD-73627	10,5	3,2	55, 5	5, 7
AD-73595	29, 0	7, 6	96, 1	4,8
AD-73617	12,4	4,9	66, 1	10,5
AD-73606	11,8	3, 6	93,2	4,1
AD-73629	14,9	4, 6	57,8	6, 4
AD-73609	35,2	4,7	89, 6	5, 0
AD-73632	3,3	0, 6	46, 5	8,0
AD-73599	11,7	2,2	84,4	10, 9
AD-73621	5, 9	1,7	34,8	4,4
AD-73597	9, 4	1,8	60, 6	3, 0
AD-73619	5, 0	1,7	21,0	7,4
AD-73596	7,3	3, 1	53,2	10, 9
AD-73618	4, 6	2,4	29, 4	8,2
AD-73614	24,0	8,8	96, 0	4,8
AD-73637	7,1	2,2	47,3	6, 9
AD-73611	17,3	3, 8	92,5	4,0
AD-73634	7,1	3,5	54,5	12,5
AD-73605	10,2	2,1	88,7	6, 0
AD-73628	5, 7	0,4	23,5	8, 1
AD-73601	6, 4	2,4	67,4	9, 9
AD-73624	3, 0	0,5	28,0	5, 9
AD-73613	16, 4	5, 3	92, 6	8,8
AD-73636	4,8	1,5	22,5	7,2
AD-73616	99, 7	8,0	97,3	3,2
AD-73639	35, 5	4,8	100,3	6, 7
AD-73603	12,8	5, 0	87,7	7,2
AD-73626	2,2	0, 8	19, 8	4,3
AD-73607	17,4	5, 6	90, 0	6, 4
AD-73630	3, 9	1,2	25, 0	7,3
AD-73600	2,7	1,5	24,9	4,9
AD-73622	1,5	0,2	16,2	2,3
AD-73615	7, 6	3, 6	51,9	4,8
AD-73638	3,7	1,5	17, 6	5, 6
AD-73598	2,0	0,5	18,7	7,5
AD-73620	2,0	0,3	9, 5	3,4
AD-73602	4,4	1,9	48,7	8,4
AD-73625	3,3	1,4	9, 8	2,0
AD-73608	5, 5	1,3	65, 4	10,7
AD-73631	2,1	0,4	11, 1	1,9
AD-73612	5, 4	1,4	49, 1	7,3
AD-73635	3,5	0,7	13, 0	2,5
AD-73623	2,5	0,4	7,2	1,2

- 143 -

Claims

Эквиваленты.

Специалистам в данной области будет понятно, или они способны определить с применением лишь обычного экспериментирования наличие многих эквивалентов конкретных вариантов осуществления и способов настоящего изобретения, описанного в данном документе. Предполагается, что такие эквиваленты охвачены объемом следующей формулы изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Двухнитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии фактора XII (фактора Хагемана) (F12), где указанная dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, образующие двухнитевой участок, где указанная смысловая нить содержит по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из нуклеотидов 144-174 нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 9, и указанная антисмысловая нить содержит по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из соответствующей части нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 10, где смысловая нить составляет 19-21 нуклеотидов в длину и антисмысловая нить составляет 21-23 нуклеотидов в длину, где все нуклеотиды смысловой цепи содержат нуклеотидную модификацию, выбранную из группы, состоящей из 2'-O-метил-модификации и 2'-фтор-модификации, где смысловая нить содержит две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце, где все нуклеотиды антисмысловой цепи содержат нуклеотидную модификацию, выбранную из группы, состоящей из 2'-O-метил-модификации, 2'-фтор-модификации и 2'-дезокси-нуклеотидной модификации, где антисмысловая нить содержит две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи или на 5'-конце и две фосфоротиоатные межнуклеотидные связи или на 3'-конце, и где 3'-конец смысловой нити конъюгирован с лигандом, который представляет собой
2. dsRNA по п.1, где средство на основе dsRNA конъюгировано с лигандом, как показано на следующей схеме:

и где X представляет собой О или S.
3. dsRNA по п.2, где X представляет собой О.
4. dsRNA по любому из пп.1-3, где смысловая и антисмысловая нити содержат смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из

5'-AAGCUGAAGAGCACACAGU-3' (SEQ ID NO: 958); и

5'-ACUGUGUGCUCUUCAGCUU-3' (SEQ ID NO: 1142); и

5'-ACACAGUCGUUCUCACUGU-3' (SEQ ID NO: 959); и

5'-ACAGUGAGAACGACUGUGU-3' (SEQ ID NO: 1143).

- 144 -