JP2018519263A - Ｃｄ３および腫瘍抗原に結合するヘテロ二量体抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規なヘテロ二量体抗体を対象とする。

Description

関連出願の相互参照
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）および§１２０の下で、２０１５年５月８日に出願された米国仮特許出願第６２／１５９，１１１号明細書、２０１５年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／２５１，００５号明細書および２０１５年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／２５０，９７１号明細書、２０１５年１１月１１日に出願された米国特許出願第１４／９５２，７１４号明細書および２０１５年１１月２５日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０６２７７２号明細書（これらのすべては、その中の図、説明文および特許請求の範囲に関する特定の参照とともに、その全体が参照により本明細書中に明示的に援用される）に対する優先権を主張する。

抗体に基づく治療薬は、がんおよび自己免疫／炎症性障害を含む種々の疾患を治療するのに用いられ、奏功している。しかし、このクラスの薬剤に対して、特にそれらの臨床有効性を増強することについて、依然として改善が必要とされている。探索されつつある１つの手段は、追加的かつ新規な抗原結合部位を、抗体に基づく薬剤に、単一の免疫グロブリン分子が２つの異なる抗原に共会合するように改変することである。２つの異なる抗原に会合するかかる非天然のまたは代替的な抗体形式は、二重特異体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）と称されることが多い。抗体可変領域（Ｆｖ）の著しい多様性により、任意の分子を実質的に認識するＦｖを作製することが可能になることから、二重特異体を作製するための典型的な手法は、新規な可変領域の抗体への導入である。

二重特異性を標的とした幾つかの代替的な抗体形式が探索されている（Ｃｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ １［６］：１−９；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３［９］：１１２６−１１３６；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ ４（２）：１８２（２０１２）、それらのすべてが参照により本明細書中に明示的に援用される）。当初、二重特異性抗体は、各々が単一のモノクローナル抗体を産生する２つの細胞株を融合することによって作製された（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５４０）。得られたハイブリッドハイブリドーマまたはクアドローマが二重特異性抗体を確かに産生したが、それらは少数集団にすぎず、所望される抗体を単離するため、大規模精製が要求された。これに対する工学的な解決策は、二重特異体を作製するための抗体断片の使用であった。かかる断片には全長抗体の複雑な四次構造が欠けていることから、可変軽鎖および可変重鎖は単一の遺伝的構築物中で連結可能である。二重特異性抗体、一本鎖二重特異性抗体、タンデムｓｃＦｖ型、およびＦａｂ２二重特異体を含む多くの異なる形態の抗体断片が作製されている（Ｃｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ １［６］：１−９；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３［９］：１１２６−１１３６；参照により本明細書中に明示的に援用される）。これらの形式が細菌中で高レベルに発現でき、それらのサイズが小型であるため、好ましい浸透性の利点を有し得るが、それらはインビボで迅速に排除され、それらの産生および安定性に関する作製上の障害を提示し得る。これらの欠点の主因は、抗体断片が典型的に血清中での長い半減期を維持する（すなわち、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎ）、または精製用の結合部位として役立つ（すなわち、プロテインＡおよびプロテインＧ）大きめのサイズ、高い安定性、ならびに様々なＦｃ受容体およびリガンドへの結合性を含む、その関連の機能的特性を有する抗体の定常領域が欠如していることである。

より最近の研究では、二重結合を全長抗体様形式に改変することにより、断片に基づく二重特異体の欠点に対処する試みがなされている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５［１１］：１２９０−１２９７；米国特許出願第１２／４７７，７１１号明細書；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，ｍＡｂｓ １［２］：１２８−１４１；ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００８／０７４６９３号明細書；Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １３［５］：３６１−３６７；米国特許出願第０９／８６５，１９８号明細書；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１［１６］：１０７０６−１０７１４；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０［２０］：１９６６５−１９６７２；ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００５／０２５４７２号明細書；参照により本明細書中に明示的に援用される）。これらの形式は、主にＦｃ領域を有することから、抗体断片の二重特異体の障害の一部を克服する。これらの形式の１つの顕著な欠点は、ホモ二量体定常鎖の最上部に新しい抗原結合部位を構築することから、新たな抗原への結合が常に二価である点である。

治療用の二重特異性形式における同時標的として興味深い多数の抗原では、所望される結合は二価ではなく一価である。多くの免疫受容体では、細胞活性化は、一価結合相互作用の架橋により達成される。架橋の機構は、典型的には、抗体／抗原免疫複合体により、または標的細胞の会合に対するエフェクター細胞を介して媒介される。例えば、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、およびＦｃγＲＩＩＩａなどの低親和性Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、抗体Ｆｃ領域に一価的に結合する。一価結合は、これらのＦｃγＲを発現する細胞を活性化しないが、免疫複合体形成または細胞と細胞との接触に際して、受容体は細胞表面上で架橋およびクラスター化され、活性化を引き起こす。細胞殺滅を媒介することに関与する受容体、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａの場合、受容体架橋および細胞活性化は、エフェクター細胞が標的細胞を極めて活発な形式で会合させる場合に生じる（Ｂｏｗｌｅｓ＆Ｗｅｉｎｅｒ，２００５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０４：８８−９９、参照により明示的に援用される）。同様に、Ｂ細胞上の阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂは、細胞表面Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）との免疫複合体に会合する場合に限ってＢ細胞活性化を下方制御するが、これは可溶性ＩｇＧとＢＣＲによって認識される同じ抗原との免疫複合体形成によって媒介される機構である（Ｈｅｙｍａｎ ２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８８［２］：１５７−１６１；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｃｌａｔｗｏｒｔｈｙ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０：３２８−３４３；参照により明示的に援用される）。別の例として、Ｔ細胞のＣＤ３活性化は、その関連のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が極めて活発な細胞間シナプスにおいて抗原提示細胞上の抗原が負荷されたＭＨＣと会合する場合に限って生じる（Ｋｕｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２４：１３３−１３９）。当然ながら、抗ＣＤ３抗体を用いるＣＤ３の非特異的二価架橋により、サイトカインストームおよび毒性が誘発される（Ｐｅｒｒｕｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３［２］：９５３−６１；Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ＆Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７：６２２-６３２；参照により明示的に援用される）。したがって、実用的な臨床用途では、再指示された標的細胞の殺滅のためのＣＤ３の共会合の好ましい様式は、共会合される標的との会合時に限って活性化をもたらす一価結合である。

サイクリックＡＤＰリボースヒドラーゼとしても公知のＣＤ３８は、長いＣ末端細胞外ドメインおよび短いＮ末端細胞質ドメインを有するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。造血細胞のなかで機能的効果の種別は、リンパ球増殖、サイトカイン放出、Ｂおよび骨髄系細胞の発生および生存の制御、ならびに樹状細胞成熟の誘導を含む、ＣＤ３８媒介性シグナル伝達に帰されている。ＣＤ３８は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、ＢおよびＴ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む、多数の造血器腫瘍中および様々な造血器腫瘍由来の細胞株中で制御されない。他方、造血系の大部分の未分化多能性幹細胞は、ＣＤ３８陰性である。抗がん剤の発見および開発における最近の進歩にもかかわらず、ＣＤ３８発現腫瘍を含む多数の形態のがんは依然として予後不良を有する。したがって、かかる形態のがんを治療するための改善された方法への需要がある。

Ｂ細胞抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９、Ｂ細胞表面抗原Ｂ４、Ｌｅｕ−１２としても公知）は、形質細胞への末端分化を通じてプレＢ細胞発生の初期段階から発現されるヒトｐａｎ−Ｂ細胞表面マーカーである。ＣＤ１９は、成熟Ｂ細胞の増殖および生存を促進する。それは細胞表面上でＣＤ２１との複合体中で会合する。それはまた、ＣＤ８１およびＬｅｕ−１３と会合し、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達を増強する。ＢＣＲとともに、ＣＤ１９は、Ｂ細胞のクローン増殖および体液性免疫にとって重要な固有の抗原受容体誘導性シグナル伝達閾値を調節する。ＣＤ２１と共同して、それは適応免疫系と自然免疫系を関連付ける。活性化時、ＣＤ１９の細胞質側末端は、リン酸化されるに至り、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼによる結合およびＰＩ−３キナーゼの動員をもたらす。それは、大多数のＮＨＬ細胞および一部の白血病においても発現されることから、リンパ系由来のがんに対する興味深い免疫療法の標的である。

ＣＤ１９を標的化する幾つかの抗体または抗体複合体は、がんの治療に対する前臨床試験または臨床試験において評価されている。これらの抗ＣＤ１９抗体または抗体複合体としては、限定はされないが、ＭＴ−１０３（一本鎖二重特異性ＣＤ１９／ＣＤ３抗体；Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００５ Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１５：９８−１０４；Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ，２００６ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５５：５０３−５１４）、ＣＤ１９／ＣＤ１６二重特異性抗体（Ｓｃｈｌｅｎｚｋａ ｅｔ ａｌ，２００４ Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ １５：９１５−９１９；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ，２００２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：１３７−１４４）、ＢＵ１２−サポリン（Ｆｌａｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９５ Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７２：１３７３−１３７９）、および抗ＣＤ１９−イダルビシン（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５５：５０３−５１４）（すべてが参照により明示的に援用される）が挙げられる。

ＣＤ１２３（インターロイキン−３受容体α（ＩＬ−３Ｒα）としても公知）は、樹状細胞、単球、好酸球および好塩基球で発現される。ＣＤ１２３はまた、関与する造血幹細胞／前駆細胞により、大部分の骨髄系譜（ＣＤ１３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１５ｌｏｗ）により、また一部のＣＤ１９＋細胞により構成的に発現される。それはＣＤ３＋細胞に不在である。

したがって、抗体断片から作製される二重特異体が生物物理学的かつ薬物動態的な障壁の影響を受ける一方、全長抗体様形式で構築されるものの欠点は、それらが一次標的抗原の不在下で同時標的抗原に多価的に会合することで、非特異的活性化と潜在的に毒性とをもたらす点である。本発明は、ＣＤ３およびＣＤ３８に特異的な新規な二重特異性抗体を導入することにより、この課題を解決する。

したがって、一態様では、本発明は、ａ）第１の単量体であって、ｉ）第１の重鎖であって、１）第１の可変重鎖ドメイン；２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖；３）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＣ末端に共有結合されたｓｃＦｖを含む第１の重鎖を含む第１の単量体と；ｂ）第２の可変重鎖ドメイン、および第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む、第２の重鎖を含む第２の単量体と；ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖とを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）第１の単量体であって、ｉ）第１の重鎖であって、１）第１の可変重鎖ドメイン；２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメイン；および３）ドメインリンカーを用いて前記第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合された第１の可変軽鎖ドメインを含む第１の重鎖を含む第１の単量体と；ｂ）第２の単量体であって、ｉ）第２の可変重鎖ドメイン；ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメイン；およびｉｉｉ）前記第２の可変重鎖ドメインがドメインリンカーを用いて前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合されている、第３の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体と；ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖とを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）第１の単量体であって、ｉ）第１の重鎖であって、１）第１の可変重鎖ドメイン；２）第１のＣＨ１ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖；３）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合されたｓｃＦｖを含む第１の重鎖を含む第１の単量体と；ｂ）第２の可変重鎖ドメイン、および第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む、第２の重鎖を含む第２の単量体と；ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖とを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）第１の単量体であって、ｉ）第１の重鎖であって、１）第１の可変重鎖ドメイン；２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメイン；および３）前記第２の可変軽鎖ドメインがドメインリンカーを用いて前記第１の定常重鎖ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合されている、第１の可変軽鎖ドメインを含む第１の重鎖を含む第１の単量体と；ｂ）第２の単量体であって、ｉ）第２の可変重鎖ドメイン；ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメイン；およびｉｉｉ）前記第２の可変重鎖ドメインがドメインリンカーを用いて前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合されている、第３の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体と；ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖とを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）第１の単量体であって、ｉ）第１の重鎖であって、１）第１の可変重鎖ドメイン；２）第１のＣＨ１ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖；３）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合されたｓｃＦｖを含む第１の重鎖を含む第１の単量体と；ｂ）第２のＦｃドメインを含む第２の単量体と；ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖とを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。

一部の態様では、第１および第２のＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有する。さらに、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは第１の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し、ｓｃＦｖは第２のＴＴＡまたはヒトＣＤ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＴＡは、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ１２３からなる群から選択される。

さらなる態様では、本発明は、Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、Ｈ１．３３＿Ｌ．１．４７およびＨ１．３１＿Ｌ１．４７について図面で示されるＣＤＲおよび／または可変ドメインおよび／またはｓｃＦｖ配列を有する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを提供する。本発明はまた、核酸組成物、発現ベクター組成物および宿主細胞を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）第１の単量体であって、ｉ）第１のＦｃドメイン；ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む第１の単量体と；ｂ）第２の単量体であって、ｉ）重可変ドメイン；およびｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインを含む重鎖を含む第２の単量体と；ｃ）可変軽鎖ドメインおよび可変軽定常ドメインを含む軽鎖とを含み、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、抗ＣＤ Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７および抗ＣＤ３ Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）からなる群から選択される、ヘテロ二量体抗体を提供する。重可変ドメインおよび軽可変ドメインは、ＴＴＡ（限定はされないが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ１２３を含む）に結合する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）配列ＲＡＳＷＳＶＳＹＩＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＱＱＷＴＨＮＰＰＴ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメインと；ｂ）配列ＳＹＮＭＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＡＩＹＰＧＮＧＡＴＳＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＳＹＹＭＧＧＤＷＹＦＤＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメインとを含む抗ＣＤ２０抗体結合ドメインを提供する。一部の実施形態では、抗ＣＤ２０抗体結合ドメインはＣ２Ｂ８ Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３配列を有する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメインと；ｂ）配列ＳＹＮＭＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメインとを含む抗ＣＤ２０抗体結合ドメインを提供する。

一部の実施形態では、抗ＣＤ２０抗体結合ドメインはＣ２Ｂ８＿Ｈ１Ｌ１配列を有する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）第１の単量体であって、ｉ）第１のＦｃドメイン；ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む第１の単量体と；ｂ）第２の単量体であって、ｉ）重可変ドメイン；およびｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインを含む重鎖を含む第２の単量体と；ｃ）可変軽鎖ドメインおよび可変軽定常ドメインを含む軽鎖とを含み、可変重鎖および軽鎖は、Ｃ２Ｂ８ Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３またはＣ２Ｂ８＿Ｈ１Ｌ１結合ドメインを形成する、ヘテロ二量体抗体を提供する。

さらなる態様では、本発明は、ａ）第１の単量体であって、ｉ）第１のＦｃドメイン；ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含む第１の単量体と；ｂ）第２の単量体であって、ｉ）重可変ドメイン；およびｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメインを含む重鎖を含む第２の単量体と；ｃ）可変軽鎖ドメインおよび可変軽定常ドメインを含む軽鎖とを含む、ヘテロ二量体抗体を提供する。この実施形態では、可変ドメインはＣＤ１２３に結合し、７Ｇ３＿Ｈ１．１０９＿Ｌ１．４７の配列を有し得る。

さらなる態様では、本発明は、ＸＥＮＰ１５０４９、ＸＥＮＰ１５０５１；ＸＥＮＰ１５０５０、ＸＥＮＰ１３６７６、ＸＥＮＰ１４６９６、ＸＥＮＰ１５６２９、ＸＥＮＰ１５０５３、ＸＥＮＰ１５６３０、ＸＥＮＰ１５６３１、ＸＥＮＰ１５６３２、ＸＥＮＰ１５６３３、ＸＥＮＰ１５６３４、ＸＥＮＰ１５６３５、ＸＥＮＰ１５６３６、ＸＥＮＰ１５６３８、ＸＥＮＰ１５６３９、ＸＥＮＰ１３６７７、ＸＥＮＰ１４３８８、ＸＥＮＰ１４３８９、ＸＥＮＰ１４３９０、ＸＥＮＰ１４３９１、ＸＥＮＰ１４３９２、ＸＥＮＰ１４３９３、ＸＥＮＰ１６３６６、ＸＥＮＰ１６３６７、ＸＥＮＰ１６３６８、ＸＥＮＰ１６３６９、ＸＥＮＰ１６３７０、ＸＥＮＰ１６３７１、ＸＥＮＰ１６３７２、ＸＥＮＰ１６３７３、ＸＥＮＰ１６３７５、ＸＥＮＰ１６３７６、ＸＥＮＰ１６３７７、ＸＥＮＰ１４０４５、およびＸＥＮＰ１３９２８からなる群から選択されるヘテロ二量体抗体を提供する。核酸、発現ベクターおよび宿主細胞はすべて、これらのタンパク質を作製し、それらを有する患者を治療する方法に加えて同様に提供される。

さらなる態様では、本発明は、ＸＥＮＰ１５０４９、ＸＥＮＰ１５０５１；ＸＥＮＰ１５０５０、ＸＥＮＰ１３６７６、ＸＥＮＰ１４６９６、ＸＥＮＰ１５６２９、ＸＥＮＰ１５０５３、ＸＥＮＰ１５６３０、ＸＥＮＰ１５６３１、ＸＥＮＰ１５６３２、ＸＥＮＰ１５６３３、ＸＥＮＰ１５６３４、ＸＥＮＰ１５６３５、ＸＥＮＰ１５６３６、ＸＥＮＰ１５６３８、ＸＥＮＰ１５６３９、ＸＥＮＰ１３６７７、ＸＥＮＰ１４３８８、ＸＥＮＰ１４３８９、ＸＥＮＰ１４３９０、ＸＥＮＰ１４３９１，ＸＥＮＰ１４３９２、ＸＥＮＰ１４３９３、ＸＥＮＰ１６３６６、ＸＥＮＰ１６３６７、ＸＥＮＰ１６３６８、ＸＥＮＰ１６３６９、ＸＥＮＰ１６３７０、ＸＥＮＰ１６３７１、ＸＥＮＰ１６３７２、ＸＥＮＰ１６３７３、ＸＥＮＰ１６３７５、ＸＥＮＰ１６３７６、ＸＥＮＰ１６３７７、ＸＥＮＰ１４０４５、およびＸＥＮＰ１３９２８からなる群から選択されるヘテロ二量体抗体からの抗原結合ドメインの１つの可変領域からの６つのＣＤＲ（ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）のセットを含むヘテロ二量体抗体を提供する。核酸、発現ベクターおよび宿主細胞はすべて、これらのタンパク質を作製し、それらにより患者を治療する方法に加えて同様に提供される。

さらなる態様では、本発明は、ＣＤＲの２セット、ＸＥＮＰ１５０４９、ＸＥＮＰ１５０５１；ＸＥＮＰ１５０５０、ＸＥＮＰ１３６７６、ＸＥＮＰ１４６９６、ＸＥＮＰ１５６２９、ＸＥＮＰ１５０５３、ＸＥＮＰ１５６３０、ＸＥＮＰ１５６３１、ＸＥＮＰ１５６３２、ＸＥＮＰ１５６３３、ＸＥＮＰ１５６３４、ＸＥＮＰ１５６３５、ＸＥＮＰ１５６３６、ＸＥＮＰ１５６３８、ＸＥＮＰ１５６３９、ＸＥＮＰ１３６７７、ＸＥＮＰ１４３８８、ＸＥＮＰ１４３８９、ＸＥＮＰ１４３９０、ＸＥＮＰ１４３９１，ＸＥＮＰ１４３９２、ＸＥＮＰ１４３９３、ＸＥＮＰ１６３６６、ＸＥＮＰ１６３６７、ＸＥＮＰ１６３６８、ＸＥＮＰ１６３６９、ＸＥＮＰ１６３７０、ＸＥＮＰ１６３７１、ＸＥＮＰ１６３７２、ＸＥＮＰ１６３７３、ＸＥＮＰ１６３７５、ＸＥＮＰ１６３７６、ＸＥＮＰ１６３７７、ＸＥＮＰ１４０４５、ならびにＸＥＮＰ１３９２８からなる群から選択されるヘテロ二量体抗体の抗原結合ドメインの１つの可変領域からの６つのＣＤＲ（ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）のそれぞれの第１のセットならびに他の第２の抗原結合ドメインの可変領域からの第２のセットを含むヘテロ二量体抗体を提供する。核酸、発現ベクターおよび宿主細胞はすべて、これらのタンパク質を作製し、それらにより患者を治療する方法に加えて同様に提供される。

さらなる態様では、本発明は、ｖｈドメインおよびｖｌドメインの２セット、ＸＥＮＰ１５０４９、ＸＥＮＰ１５０５１；ＸＥＮＰ１５０５０、ＸＥＮＰ１３６７６、ＸＥＮＰ１４６９６、ＸＥＮＰ１５６２９、ＸＥＮＰ１５０５３、ＸＥＮＰ１５６３０、ＸＥＮＰ１５６３１、ＸＥＮＰ１５６３２、ＸＥＮＰ１５６３３、ＸＥＮＰ１５６３４、ＸＥＮＰ１５６３５、ＸＥＮＰ１５６３６、ＸＥＮＰ１５６３８、ＸＥＮＰ１５６３９、ＸＥＮＰ１３６７７、ＸＥＮＰ１４３８８、ＸＥＮＰ１４３８９、ＸＥＮＰ１４３９０、ＸＥＮＰ１４３９１，ＸＥＮＰ１４３９２、ＸＥＮＰ１４３９３、ＸＥＮＰ１６３６６、ＸＥＮＰ１６３６７、ＸＥＮＰ１６３６８、ＸＥＮＰ１６３６９、ＸＥＮＰ１６３７０、ＸＥＮＰ１６３７１、ＸＥＮＰ１６３７２、ＸＥＮＰ１６３７３、ＸＥＮＰ１６３７５、ＸＥＮＰ１６３７６、ＸＥＮＰ１６３７７、ＸＥＮＰ１４０４５、ならびにＸＥＮＰ１３９２８からなる群から選択されるヘテロ二量体抗体の抗原結合ドメインの１つの可変領域からの第１のセットならびに他の第２の抗原結合ドメインの可変領域からの第２のセットを含むヘテロ二量体抗体を提供する。核酸、発現ベクターおよび宿主細胞はすべて、これらのタンパク質を作製し、それらにより患者を治療する方法に加えて同様に提供される。

本発明の幾つかの形式を表す。「ボトルオープナー」形式の２つの形態、すなわちｓｃＦｖを含む抗ＣＤ３抗原結合ドメインおよびＦａｂを含む抗ＴＴＡ抗原結合ドメインを有するものと、これらを逆にして有するものとが表される。ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、Ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖおよびＣｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式がすべて表される。それらは、本明細書で考察されるように、ｓｃＦｖとして抗ＣＤ３を有するとして表されるが、任意のＦｖ配列を切り離し、組み合わせることができ、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ、およびｃｅｎｔｒａｌ−Ｆｖの抗ＣＤ３ドメインおよび抗ＴＴＡドメインは切り替えることができる。さらに、１つの単量体が単にＦｃドメインを含む場合の「単一アーム」形式、すなわち単一アームＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖおよび単一アームＣｅｎｔｒａｌ−Ｆｖの両方が示される。二重ｓｃＦｖ形式も示される。 同上 同上 可変重および可変軽鎖ドメイン（ＣＤＲに下線）、ならびに個別のｖｌＣＤＲおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖ構築物を含む、「Ｈｉｇｈ ＣＤ３」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７構築物の配列を表す。この荷電リンカーは、図面に表されるすべての配列に当てはまるように、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーと交換してもよい。 可変重および可変軽鎖ドメイン（ＣＤＲに下線）、ならびに個別のｖｌＣＤＲおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖ構築物を含む、「Ｈｉｇｈ−Ｉｎｔ＃１」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７構築物の配列を表す。この荷電リンカーは、図面に表されるすべての配列に当てはまるように、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーと交換してもよい。 可変重および可変軽鎖ドメイン（ＣＤＲに下線）、ならびに個別のｖｌＣＤＲおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖ構築物を含む、「Ｈｉｇｈ−Ｉｎｔ＃２」抗ＣＤ３＿Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７構築物の配列を表す。この荷電リンカーは、図面に表されるすべての配列に当てはまるように、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーと交換してもよい。 可変重および可変軽鎖ドメイン（ＣＤＲに下線）、ならびに個別のｖｌＣＤＲおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖ構築物を含む、「Ｈｉｇｈ−Ｉｎｔ＃３」抗ＣＤ３＿Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７構築物の配列を表す。この荷電リンカーは、図面に表されるすべての配列に当てはまるように、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーと交換してもよい。 可変重および可変軽鎖ドメイン（ＣＤＲに下線）、ならびに個別のｖｌＣＤＲおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖ構築物を含む、「Ｉｎｔ」抗ＣＤ３＿Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７構築物の配列を表す。この荷電リンカーは、図面に表されるすべての配列に当てはまるように、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーと交換してもよい。 可変重および可変軽鎖ドメイン（ＣＤＲに下線）、ならびに個別のｖｌＣＤＲおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖ構築物を含む、「Ｌｏｗ」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７構築物の配列を表す。この荷電リンカーは、図面に表されるすべての配列に当てはまるように、必要に応じて非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーと交換してもよい。 可変重および可変軽鎖ドメイン（ＣＤＲに下線）、ならびに個別のｖｌＣＤＲおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖ構築物を含む、Ｈｉｇｈ ＣＤ３８：ＯＫＴ１０＿Ｈ１．７７＿Ｌ１．２４構築物の配列を表す。 可変重および可変軽鎖ドメイン（ＣＤＲに下線）、ならびに個別のｖｌＣＤＲおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖ構築物を含む、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ＣＤ３８：ＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１．２４構築物の配列を表す。 可変重および可変軽鎖ドメイン（ＣＤＲに下線）、ならびに個別のｖｌＣＤＲおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線）を有するｓｃＦｖ構築物を含む、Ｌｏｗ ＣＤ３８：ＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１構築物の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５３３１の配列を表す。 ＸＥＮＰ１３２４３の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４７０２の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４２６の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４７０１の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４７０３の配列を表す。 ＸＥＮＰ１３２４３の配列を表す。 ＸＥＮＰ１８９６７の配列を表す。 ＸＥＮＰ１８９７１の配列を表す。 ＸＥＮＰ１８９６９の配列を表す。 ＸＥＮＰ１８９７０の配列を表す。 ＸＥＮＰ１８９７２の配列を表す。 ＸＥＮＰ１８９７３の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５０５５の配列を表す。 ＸＥＮＰ１３５４４の配列を表す。 ＸＥＮＰ１３６９４の配列を表す。 ヒトＣＤ３εの配列を表す。 ヒトＣＤ３８タンパク質の全長（配列番号１３０）および細胞外ドメイン（ＥＣＤ；配列番号１３１）を表す。 （歪曲（ｓｋｅｗ）およびｐＩ変異体を含む）ヘテロ二量体化変異体セットの有用な対を表す。図２９Ｅでは、対応する「単量体２」変異体がない変異体がある。これらは、一方の単量体上に単独で使用することができるまたは例えばボトルオープナーのＦａｂ側に含むことができるｐＩ変異体であり、適切な荷電ｓｃＦｖリンカーは、第２の抗原結合ドメインとしてｓｃＦｖを利用する第２の単量体上に使用することができる。好適な荷電リンカーを図３３に示す。 同上 同上 同上 同上 同種立体変異体抗体の定常領域およびそれら各々の置換のリストを表す。ｐＩ＿（−）はより低いｐＩ変異体を示す一方、ｐＩ＿（＋）はより高いｐＩ変異体を示す。これらは、任意選択でかつ独立して本発明の他のヘテロ二量体化変異体（および同様に本明細書で概説されるような他の変異体型）と結合され得る。 ＦｃγＲ結合を切断する有用な切断変異体（「ノックアウト」または「ＫＯ」変異体と称される場合がある）を表す。 本発明の２つの特に有用な実施形態を示す。 成分として１つ以上のｓｃＦｖを利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを増加または低下させる場合に用途が見出される幾つかの荷電ｓｃＦｖリンカーを表す。（＋Ｈ）正リンカーは、特に、本明細書に示される抗ＣＤ３ ｖｌおよびｖｈ配列で、本明細書において特定用途が見出される。単一電荷を有する単一の先行技術のｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（８）：９８９−９９５（１９９３）から「Ｗｈｉｔｌｏｗ」として参照される。このリンカーがｓｃＦｖにおける凝集を低減し、タンパク質分解安定性を増強するために用いられたことは注目されるべきである。 同上 ヘテロ二量体収率（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸにより測定）および熱安定性（ＤＳＣにより測定）とともに改変されたヘテロ二量体歪曲Ｆｃ変異体のリストを表す。測定されなかった熱安定性は「ｎ．ｄ．」で表示される。 プロテインＡアフィニティー精製後の二重特異体の発現収率である。 陽イオン交換精製クロマトグラムである。 再誘導されたＴ細胞細胞傷害性アッセイ（２４時間のインキュベーション、１０ｋのＲＰＭＩ８２２６細胞、４００ｋのＴ細胞）である。被験物は抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異体である。ＬＤＨにより検出がなされた。 再誘導されたＴ細胞細胞傷害性アッセイ（２４時間のインキュベーション、１０ｋのＲＰＭＩ８２２６細胞、５００ｋのヒトＰＢＭＣ）である。被験物は抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異体である。ＬＤＨにより検出がなされた。 ＸＥＮＰ１４４１９の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４４２０の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４４２１の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４４２２の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４４２３の配列を表す。 再誘導されたＴ細胞細胞傷害性アッセイ（９６時間のインキュベーション、４０ｋのＲＰＭＩ８２２６細胞、４００ｋのヒトＰＢＭＣ）である。被験物は抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。フローサイトメトリー、具体的にはＣＤ３８＋細胞の消失により検出がなされた。 図１に記載される再誘導されたＴ細胞細胞傷害性アッセイのさらなる分析である。１行目は、フローサイトメトリーにより検出された、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対する活性化マーカーＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。２行目は、細胞増殖の尺度としての、Ｋｉ−６７＋であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す。３行目は、フローサイトメトリーにより検出された、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対するグランザイムＢ阻害剤ＰＩ−９の細胞内平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異体の抗腫瘍活性を検討するためのマウス試験の設計である。 時間および処理の関数としてのＩＶＩＳ（登録商標）によって測定された腫瘍サイズである。 ＩＶＩＳ（登録商標）生物発光画像（１０日目）である。 カニクイザルにおける表示される被験物の単回投与後のＣＤ３８＋細胞の枯渇である。 カニクイザルにおけるＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されたＴ細胞活性化（図４９のように色分けしている）である。 表示される被験物の単回投与後のＩＬ−６の血清レベルである。 ＸＥＮＰ１５４２７の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４２８の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４２９の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４３０の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４３１の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４３２の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４３３の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４３４の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４３５の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４３６の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４３７の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５４３８の配列を表す。 ビアコアアッセイにおける結合親和性を示す。 変動する軽鎖、Ｆａｂ−Ｆｃ、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ比を用いて安定なプールを作製する間でのヘテロ二量体の純度を示す。 ｈｕＰＢＭＣマウスモデルにおける抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異体によるヒトＩｇＭおよびＩｇＧ２の枯渇である。 安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖを表す。置換は、Ｈ１＿Ｌ１．４ ｓｃＦｖ配列に対して与えられる。アミノ酸付番はＫａｂａｔ付番である。 同上 安定性が最適化されたヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。ＣＤＲに下線が引かれる。各重鎖／軽鎖の組み合わせについては、４つの配列：（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）ｓｃＦｖ単独、（ｉｉｉ）ＶＨ単独、（ｉｖ）ＶＬ単独が列挙される。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 再誘導されたＴ細胞細胞傷害性アッセイ（２４時間のインキュベーション、１０ｋのＲＰＭＩ８２２６細胞、５００ｋのＰＢＭＣ）である。被験物は、抗ＣＤ３８（ＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１、ＯＫＴ１０＿Ｈ１．７７＿Ｌ１．２４）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。ＬＤＨにより検出がなされた。 ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ Ｉｇ枯渇試験である。被験物は、ＰＢＭＣの移植後８日目に０．０３、０．３、もしくは３ｍｇ／ｋｇで投与された。投与経路は腹腔内であった。血液試料は、ＰＢＭＣの移植後１４日目に採取され、血清に加工され、ヒトＩｇＭおよびＩｇＧ２についてアッセイされた。 ＸＥＮＰ１５０４９の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５０５１の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５０５０の配列を表す。 ＸＥＮＰ１３６７６の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４６９６の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５６２９の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５０５３の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５６３０の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５６３１の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５６３２の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５６３３の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５６３４の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５６３５の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５６３６の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５６３８の配列を表す。 ＸＥＮＰ１５６３９の配列を表す。 ＸＥＮＰ１３６７７の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４３８８の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４３８９の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４３９０の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４３９１の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４３９２の配列を表す。 ＸＥＮＰ１４３９３の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３６６の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３６７の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３６８の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３６９の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３７０の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３７１の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３７２の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３７３の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３７４の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３７５の配列を表す。 ＸＥＮＰ１６３７６の配列を表す。抗ＣＤ２０ ＦａｂアームのＣＤＲ配列、ｖｈ配列、およびｖｌ配列を図１２１に示す。 ＸＥＮＰ１６３７７の配列を表す。 ＣＤ２０およびＣＤ１２３抗原の配列を表す。 ＣＤ３親和性の表面プラズモン共鳴測定である。被験物は、抗ＣＤ２０（Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。ヒトＣＤ３δε−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）はチップ表面に共有結合された。被験物は、３．１２５、１２．５、５０、および２００ｎＭで通過させた。 ＣＤ３親和性の表面プラズモン共鳴測定である。被験物は、抗ＣＤ２０（Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。カニクイザルＣＤ３δε−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）はチップ表面に共有結合された。被験物は、３．１２５、１２．５、５０、および２００ｎＭで通過させた。 ＣＤ３親和性の表面プラズモン共鳴測定である。被験物は、抗ＣＤ２０（Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。ヒトＣＤ３δε−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）はチップ表面に共有結合された。被験物は、３１．２５、１２５、５００、および２０００ｎＭで通過させた。 ＣＤ３親和性の表面プラズモン共鳴測定である。被験物は、抗ＣＤ２０（Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。カニクイザルＣＤ３δε−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）はチップ表面に共有結合された。被験物は、３１．２５、１２５、５００、および２０００ｎＭで通過させた。 ＣＤ３親和性の表面プラズモン共鳴測定である。被験物は、抗ＣＤ２０（Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。カニクイザルＣＤ３δε−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）はチップ表面に共有結合された。被験物は、３１．２５、１２５、５００、および２０００ｎＭで通過させた。 再誘導されたＴ細胞細胞傷害性アッセイ（２４時間のインキュベーション、１０ｋのＲａｍｏｓ細胞、２５０ｋのＰＢＭＣ）である。被験物は、抗ＣＤ２０（Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。ＬＤＨにより検出がなされた。 再誘導されたＴ細胞細胞傷害性アッセイ（２４時間のインキュベーション、２０ｋのＪｅｋｏ細胞、２００ｋのＰＢＭＣ（ＣＤ１９が枯渇））である。被験物は、抗ＣＤ２０（Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。フローサイトメトリー、具体的にはＣＤ１９＋細胞の消失により検出がなされた。 図１１３に記載の実験における２４時間後のＩＬ−６産生である。 再誘導されたＴ細胞細胞傷害性アッセイ（５時間のインキュベーション、２０ｋのＪｅｋｏ細胞、５００ｋのＰＢＭＣ（ＣＤ１９が枯渇））である。被験物は、抗ＣＤ２０（Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１Ｌ１）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。フローサイトメトリー、具体的にはＣＤ１９＋細胞の消失により検出がなされた。 同上 再誘導されたＴ細胞細胞傷害性アッセイ（２４時間のインキュベーション、２０ｋのＪｅｋｏ細胞、５００ｋのＰＢＭＣ（ＣＤ１９が枯渇））である。被験物は、抗ＣＤ２０（Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。フローサイトメトリー、具体的にはＣＤ１９＋細胞の消失により検出がなされた。 同上 図１１３に記載の実験における２４時間後のＩＬ−６産生である。 再誘導されたＴ細胞細胞傷害性アッセイ（２４時間のインキュベーション、１０ｋのＲＰＭＩ８２２６細胞、５００ｋのＰＢＭＣ）である。被験物は、抗ＣＤ３８（ＯＫＴ１０＿Ｈ１Ｌ１、ＯＫＴ１０＿Ｈ１．７７＿Ｌ１．２４）×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃである。ＬＤＨにより検出がなされた。 ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ Ｉｇ枯渇試験である。被験物は、ＰＢＭＣの移植後１日目および８日目に５ｍｇ／ｋｇで投与された。投与経路は腹腔内であった。血液試料は、ＰＢＭＣの移植後１４日目に採取され、血清に加工され、ヒトＩｇＭおよびＩｇＧ２についてアッセイされた。 ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ Ｉｇ枯渇試験である。被験物は、ＰＢＭＣの移植後８日目に０．０３、０．３、もしくは３ｍｇ／ｋｇで投与された。投与経路は腹腔内であった。血液試料は、ＰＢＭＣの移植後１４日目に採取され、血清に加工され、ヒトＩｇＭおよびＩｇＧ２についてアッセイされた。 Ｈｉｇｈ ＣＤ２０ Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１．２０２＿Ｌ１．１１３の配列を表す。表される荷電リンカーは（＋Ｈ）であるが、図３３において表されるものなどのような他の荷電リンカーまたは非荷電リンカーを使用することができる。 Ｌｏｗ ＣＤ２０ Ｃ２Ｂ８＿Ｈ１Ｌ１の配列を表す。表される荷電リンカーは（＋Ｈ）であるが、図３３において表されるものなどのような他の荷電リンカーまたは非荷電リンカーを使用することができる。 ＣＤ１２３ ７Ｇ３＿Ｈ１．１０９＿Ｌ１．５７の配列を表す。表される荷電リンカーは（＋Ｈ）であるが、図３３において表されるものなどのような他の荷電リンカーまたは非荷電リンカーを使用することができる。 本発明における可能な組み合わせのマトリックスを示す。「Ａ」は、参照されるＣＤ３配列のＣＤＲが右側のＴＴＡのＣＤＲと組み合わされ得ることを意味する。すなわち、可変重鎖ＣＤ３ Ｈ１．３０配列からのｖｈＣＤＲおよびＣＤ３ Ｌ１．５７配列の可変軽鎖からのｖｌＣＤＲは、ＣＤ３８ ＯＫＴ１０ Ｈ１．７７配列からのｖｈＣＤＲおよびＯＫＴ１０Ｌ１．２４配列からのｖｌＣＤＲと組み合わされ得る。「Ｂ」は、ＣＤ３構築物からのＣＤＲがＴＴＡからの可変重および可変軽鎖ドメインと組み合わされ得ることを意味する。すなわち、可変重鎖ＣＤ３ Ｈ１．３０配列からのｖｈＣＤＲおよびＣＤ３ Ｌ１．５７配列の可変軽鎖からのｖｌＣＤＲは、可変重鎖ドメインＣＤ３８ ＯＫＴ１０ Ｈ１．７７配列およびＯＫＴ１０Ｌ１．２４配列と組み合わされ得る。「Ｃ」を逆にすることで、ＣＤ３配列からの可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインがＴＴＡのＣＤＲとともに用いられる。「Ｄ」は、各々からの可変重鎖および可変軽鎖の両方が組み合わされる場合である。「Ｅ」は、ＣＤ３のｓｃＦｖがＴＴＡのＣＤＲとともに用いられる場合であり、また「Ｆ」は、ＣＤ３のｓｃＦｖがＴＴＡ抗原結合ドメインの可変重および可変軽鎖ドメインとともに用いられる場合である。これらの組み合わせはすべて、例えば、図１６２に示される骨格形式のいずれかを有するボトルオープナー形式において、または図１３１および１３２に示される形式の骨格を含む、図１のｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、Ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ、Ｃｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ、もしくは二重ｓｃＦｖ形式などのような代替の形式において行うことができる。しかしながら、一般に、ＣＤ３の二価の結合を含むであろう形式は好ましくない。すなわち、「Ａ」（ＣＤ３ ＣＤＲ×ＴＴＡ ＣＤＲ）をボトルオープナー配列に（図１６２のものを含むもしくは異なるヘテロ二量体化変異体を含む）または図１３２のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格、ｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ、ｍＡｂ−Ｆｖ形式、もしくはｃｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式に追加することができる。 抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異体の概略図である。 ７Ｇ３＿Ｈ１Ｌ１の親和性および安定性を増加させるように操作された変異体を示す表である。 ７Ｇ３の最終的な親和性および安定性最適化ヒト化変異体の特性を示す表である。 ＣＤ１２３ポジティブＡＭＬ細胞株ＫＧ−１ａに結合するＸＥＮＰ１４０４５（抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３）二重特異体の結合である。 ＫＧ−１ａ細胞を死滅させるＸＥＮＰ１４０４５のＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）の再誘導である。 ＸＥＮＰ１４０４５によって生成されるＴ細胞による「連続的に起こる死滅」を実証する様々な比のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞を使用する、ＫＧ−１ａ細胞を用いるＸＥＮＰ１４０４５のＲＴＣＣである。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＩＶで与えた２ｍｇ／ｋｇ ＸＥＮＰ１４０４５の薬剤血清レベルである。二重特異体の半減期は６．２日であった。 ０．０１、０．１、または１ｍｇ／ｋｇ ＸＥＮＰ１４０４５の単回ＩＶ投与を与えたカニクイザルにおけるＣＤ１２３＋血中好塩基球および形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）の死滅である。 ０．０１、０．１、または１ｍｇ／ｋｇ ＸＥＮＰ１４０４５の単回ＩＶ投与を与えたカニクイザルの骨髄におけるＣＤ１２３＋好塩基球および形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）の死滅である。 カニクイザルにおけるＸＥＮＰ１４０４５の単回ＩＶ投与後のＴ細胞の再分布である。 カニクイザルにおけるＸＥＮＰ１４０４５の単回ＩＶ投与後のＴ細胞のＣＤ６９誘導である。 本発明の配列である。ＣＤＲ領域に下線を引く。 同上 同上 様々な軽鎖、Ｆａｂ−Ｆｃ、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ比を使用する安定したプール生成中のヘテロ二量体純度（上）である。プールＦ２の様々な条件のヘテロ二量体純度（下）である。 ツーステップ精製後の高純度のＸＥＮＰ１４０４５細胞株物質を示すＳＥＣである。 ＣＤ１２３＋細胞のＴ細胞による死滅を表す。 ＡＭＬ幹細胞および芽球を死滅させる細胞傷害性Ｔ細胞を動員するための二重特異体メカニズムを表す。 ＸＥＮＰ１４０４５二重特異体の効率的な産生を表す。 ＸＥＮＰ１４０４５二重特異性抗体がヒトＣＤ３に８．１ｎＭのＫＤでヒトＡＭＬに結合することを示す。 ＸＥＮＰ１４０４５二重特異性抗体が霊長動物細胞と交差反応性であり、カニクイザルＣＤ３に対して５．７ｎＭのＫＤを有することを示す。 抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３がヒトＡＭＬ細胞株を死滅させることを示す。 抗ＣＤ１２３×抗ＣＤ３がヒトＡＭＬ細胞株を死滅させることを示す。 マウスにおける二重特異体の長い半減期を示す。 サルにおける単回投与を示す。 血中好塩基球におけるサルのＣＤ１２３＋細胞の枯渇を示す。好塩基球ゲート、フローサイトメトリーは、ＣＤ２０− ＣＤ１６＋ ＣＤ１４− ＣＤ４− ＣＤ８− ＦｃｅＲ１＋とする。 同じゲーティングを使用する骨髄好塩基球の枯渇を示す。 サルにおけるＣＤ１２３＋細胞を枯渇させる繰り返し投与を示す。 サルにおけるＣＤ１２３＋細胞の枯渇を示す。好塩基球ゲート、フローサイトメトリーは、ＣＤ２０− ＣＤ１６＋ ＣＤ１４− ＣＤ４− ＣＤ８− ＦｃｅＲ１＋とする。形質細胞様樹状細胞ゲート、フローサイトメトリー：ＣＤ２０− ＣＤ１６− ＣＤ１４− Ｃｄ４− ＣＤ８− ＣＤ３０３＋。 サルの骨髄における枯渇を示す。図１５１と同様のゲーティングである。 ＣＤ１２３＋細胞枯渇がＴ細胞再分布および活性化と相関することを示す。図１５３はＴ細胞再分布である。 ＣＤ１２３＋細胞枯渇がＴ細胞再分布および活性化と相関することを示す。図１５４はＴ細胞活性化である。 ＣＤ１２３＋細胞枯渇がＴ細胞再分布および活性化と相関することを示す。図１５５はサイトカイン放出である。 実施例３において記載されるように、抗ＣＤ１２３マウス配列をヒト化する難しさに関連するデータを表す。図１２５Ａ〜Ｃは、１３７６０がＨ０Ｌ０出発マウス抗体のＦａｂであるときのヒト化（主としてｖＨによる）による親和性の損失を示し、１３７６３は第１のヒト化ｖＨ候補であり、１３７６１はヒト化重鎖および軽鎖Ｆａｂを有する。図１２５Ｄは、ヒト化の結果としてのＲＴＣＣの効力における約１０倍の損失を示す。 Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＤ１２３チップ上においてＦａｂ形式で親和性スクリーニングした、ＬＤＡ、標的、および復帰置換を含む１０８の変異体を生成し、中性かつより高度な親和性の変異体の安定性をＤＳＦでスクリーニングした、ヒト化の第１ラウンドの結果を表す（「ライブラリー１」）。 実施例３において考察されるＴｍの増加を示す。 詳細に説明されるようにＣＤ３に対するｓｃＦｖおよびＦａｂを使用してＦａｂをボトルオープナー形式に変えた結果を示す。図１５９Ａは結合アッセイを示し、図１５９ＢはＲＴＣＣアッセイを示す。 同上 実施例３において概説されるようにヒト化の「ラウンド２」からの結果を示す。ＸＥＮＰ１３９６７は、ＣＤ１２３側でＸＥＮＰ１４０４５と均等物であることに注目されたい。１３９６７は配列中に示されるように異なるＣＤ３ ｓｃＦｖを有する。 実施例３のラウンド２ Ｔｍアッセイの結果を示す。 Ｆｖ配列なしの幾つかの有用なボトルオープナー形式骨格の配列を示す（例えば、ｓｃＦｖならびにＦａｂ側のｖｈおよびｖｌ）。当業者によって理解されかつ下記に概説されるように、これらの配列は、本明細書で概説される任意のｖｈおよびｖｌの対を用いて使用することができ、一方の単量体はｓｃＦｖを含み（任意選択で荷電ｓｃＦｖリンカーを含む）、他方の単量体はＦａｂ配列を含む（例えば、ｖｈは「Ｆａｂ側重鎖」に付着され、ｖｌは「定常軽鎖」に付着される）。ｓｃＦｖは抗ＣＤ３または抗ＴＴＡとし、Ｆａｂは他のものとすることができる。すなわち、ＣＤ３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１９、またはＣＤ２０に対する本明細書で概説される任意のＦｖ配列を任意の組み合わせでこれらの図１６２の骨格中に組み込むことができる。これらのボトルオープナー骨格が、第１のＦａｂと同じ抗原結合を有するさらなる第２のＦａｂ（ｖｈ−ＣＨ１およびｖｌ−定常軽鎖）が「ボトルオープナー側」のｓｃＦｖのＮ末端に追加される図１ＢのＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式で用途が見出されることに注目されたい。 同上 同上 同上 本発明のＦｖ配列が追加される、本発明において使用されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格の配列を示す。当業者によって理解されかつ下記に概説されるように、これらの配列は、本明細書で概説される任意のｖｈおよびｖｌの対を用いて使用することができる。一方の単量体はＦａｂおよびｓｃＦｖの両方を含み（任意選択で荷電ｓｃＦｖリンカーを含む）、他方の単量体はＦａｂ配列を含む（例えば、ｖｈは「Ｆａｂ側重鎖」に付着され、ｖｌは「定常軽鎖」に付着される）。単量体１側はＦａｂ−ｓｃＦｖ ｐＩ負側であり、ヘテロ二量体化変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、同種立体ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む（すべてＩｇＧ１に関して）。単量体２側はｓｃＦｖ ｐＩ正側であり、ヘテロ二量体化変異体３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む。しかしながら、他の歪曲変異体の対、特に［Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ］；［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］；［Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］；［Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ］；［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ］、および［Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ］を代わりに用いることができる。

Ｉ．定義
本願がより十分に理解され得るように、幾つかの定義が以下に示される。かかる定義は、文法的均等物を包含することが意図される。

本明細書中の「切断」は、活性の低下または除去を意味する。したがって、例えば「ＦｃγＲ結合を切断する」は、Ｆｃ領域のアミノ酸変異体が特定の変異体を有しないＦｃ領域と比べて５０％低い開始結合を有することを意味するが、７０〜８０〜９０〜９５〜９８％より低い活性低下が好ましく、また一般的に活性はビアコアアッセイにおける検出可能な結合レベルを下回る。ＦｃγＲ結合の切断における特定用途は、図１６に示されるものである。

「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞傷害」は、本明細書で用いられるとき、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を意味する。ＡＤＣＣはＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。

「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞食作用は、本明細書で用いられるとき、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介性反応を意味する。

本明細書中の「修飾」は、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換、挿入、および／もしくは欠失またはタンパク質に化学的に連結された部分に対する改変を意味する。例えば、修飾は、改変された炭水化物またはタンパク質に付着されたＰＥＧ構造であってもよい。本明細書中の「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確にするため、特に断りのない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ中にコドンを有する２０のアミノ酸を対象とする。

本明細書中の「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列内の特定の位置にあるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味する。特に、一部の実施形態では、置換は、特定の位置に天然に存在しない、その生物または任意の生物のいずれにも天然に存在しないアミノ酸を対象とする。例えば、置換Ｅ２７２Ｙは、２７２位のグルタミン酸がチロシンと置き換えられた変異体ポリペプチド、この場合にはＦｃ変異体を指す。明確にするため、核酸コード配列を変化させても開始アミノ酸を変化させない（例えば、宿主生物の発現レベルを高めるため、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（やはりアルギニンをコードする）と交換する）ように設計されているタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない、すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の創出にもかかわらず、タンパク質が、それが開始する特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。

「アミノ酸挿入」または「挿入」は、本明細書で用いられるとき、親ポリペプチド配列内の特定の位置でのアミノ酸配列の付加を意味する。例えば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは、２３３位の後および２３４位の前でのグルタミン酸の挿入を指す。加えて、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後および２３４位の前でのＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を指す。

「アミノ酸欠失」または「欠失」は、本明細書で用いられるとき、親ポリペプチド配列内の特定の位置でのアミノ酸配列の除去を意味する。例えば、Ｅ２３３−またはＥ２３３＃またはＥ２３３（）は、位置２３３でのグルタミン酸の欠失を指す。加えて、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、位置２３３で開始する配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を指す。

「変異体タンパク質」または「タンパク質変異体」、または「変異体」は、本明細書で用いられるとき、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親タンパク質と異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指し得る。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば親タンパク質と比べて、約１〜約７０のアミノ酸修飾、また好ましくは約１〜約５つのアミノ酸修飾を有する。下記のように、一部の実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ヒト野生型配列、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４由来のＦｃ領域であるが、変異体を有するヒト配列、例えば図１９のＩｇＧ１／２ハイブリッドは、「親ポリペプチド」としても役立ち得る。本明細書中のタンパク質変異体配列は、親タンパク質配列と、好ましくは少なくとも約８０％の同一性、また最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５〜９８〜９９％の同一性を有することになる。変異体タンパク質は、変異体タンパク質自体、タンパク質変異体を含む組成物、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指し得る。したがって、「抗体変異体」または「変異体抗体」は、本明細書で用いられるとき、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親抗体と異なる抗体を意味し、「ＩｇＧ変異体」または「変異体ＩｇＧ」は、本明細書で用いられるとき、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親ＩｇＧ（再び多くの場合、ヒトＩｇＧ配列由来）と異なる抗体を意味し、また「免疫グロブリン変異体」または「変異体免疫グロブリン」は、本明細書で用いられるとき、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親免疫グロブリン配列の場合と異なる免疫グロブリン配列を意味する。「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は、本明細書で用いられるとき、Ｆｃドメイン内にアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃ変異体は、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位に置換基セリンを有するＦｃ変異体であり、ここで付番はＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対する置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを有するＦｃ変異体を規定する。ＷＴアミノ酸の同一性は不特定であってもよく、この場合、上記の変異体は４２８Ｌ／４３４Ｓと称される。置換が提供される順序が任意である、すなわち、例えば４２８Ｌ／４３４ＳがＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同じＦｃ変異体であるなどが認められる。抗体に関して本発明で考察されるあらゆる位置については、特に断りのない限り、アミノ酸位置の付番はＥＵインデックスに従う。ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔもしくはＥＵ付番スキームなどのＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の付番を指す（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ６３：７８−８５、本明細書で全体として参照により援用される）。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。置換は、天然アミノ酸、また場合により合成アミノ酸を含み得る。例として、米国特許第６，５８６，２０７号明細書；国際公開第９８／４８０３２号パンフレット；国際公開第０３／０７３２３８号パンフレット；米国特許出願公開第２００４−０２１４９８８Ａ１号明細書；国際公開第０５／３５７２７Ａ２号パンフレット；国際公開第０５／７４５２４Ａ２号パンフレット；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ１２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００２）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １１：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．，（２００２）、ＰＩＣＡＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９９：１１０２０−１１０２４；およびＬ．Ｗａｎｇ，＆Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００２）、Ｃｈｅｍ．１−１０（すべてが全体として参照により援用される）が挙げられる。

本明細書で用いられるとき、本明細書中の「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合されたアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。ペプチジル基は、天然アミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣薬構造、すなわち「類似体」、例えばペプトイドを含んでもよい（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９（２０）：９３６７（１９９２）、全体として参照により援用される）。アミノ酸は、当業者によって理解されるように、天然または合成（例えば、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸ではない）のいずれかであってもよい。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、オルニチンおよびノレロイシンは、本発明を意図からして合成アミノ酸と考えられ、Ｄ−およびＬ−（ＲまたはＳ）で設計されたアミノ酸の両方を用いてもよい。本発明の変異体は、例えばＳｃｈｕｌｔｚおよび同僚らによって開発された技術、例えば限定はされないが、Ｃｒｏｐｐ＆Ｓｈｕｌｔｚ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２０（１２）：６２５−３０，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０１（２）：７５６６−７１，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，３０３（５６５６）：３７１−３、およびＣｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１（５６３５）：９６４−７（すべてが全体として参照により援用される）によって記載された方法を用いて組み込まれた合成アミノ酸の使用を含む修飾を含んでもよい。さらに、ポリペプチドは、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、環状変異（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質もしくはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグもしくは標識の付加を含んでもよい。

「残基」は、本明細書で用いられるとき、タンパク質における位置およびその関連するアミノ酸の識別を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７もしくはＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１における２９７位の残基である。

「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、本明細書で用いられるとき、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、この領域を単独で指してもよいか、または全長抗体、抗体断片もしくはＦａｂ融合タンパク質と関連してこの領域を指してもよい。「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」は、本明細書で用いられるとき、単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者によって理解されるように、これらは一般に２つの鎖からなる。

「ＩｇＧサブクラス修飾」または「アイソタイプ修飾」は、本明細書で用いられるとき、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を異なる整列されたＩｇＧアイソタイプ中の対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧ１がチロシンおよびＩｇＧ２を含むことから、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換であるＥＵ位置２９６のフェニルアラニンは、ＩｇＧサブクラス修飾と考えられる。

「非天然修飾」は、本明細書で用いられるとき、アイソタイプでないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧのいずれも４３４位にセリンを含まないことから、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（またはそのハイブリッド）における置換４３４Ｓは非天然修飾と考えられる。

「アミノ酸」および「アミノ酸識別」は、本明細書で用いられるとき、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされる天然に存在する２０個のアミノ酸のうちの１つを意味する。

「エフェクター機能」は、本明細書で用いられるとき、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用に起因する生化学的事象を意味する。エフェクター機能は、限定はされないが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣを含む。

「ＩｇＧ Ｆｃリガンド」は、本明細書で用いられるとき、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合する任意の生物に由来する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドは、限定はされないが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲを含む。Ｆｃリガンドはまた、ＦｃγＲに対して相同性のＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）を含む（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９０：１２３−１３６、全体として参照により援用される）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見分子を含んでもよい。特定のＩｇＧ Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃγ受容体である。「Ｆｃリガンド」は、本明細書で用いられるとき、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、抗体のＦｃ領域に結合する任意の生物に由来する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。

「Ｆｃγ受容体」、「ＦｃγＲ」または「ＦｃｑａｍｍａＲ」は、本明細書で用いられるとき、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合するタンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされる。ヒトでは、このファミリーは、限定はされないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、例えばアイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃ；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、例えばアイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃ；ならびにＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、例えばアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５、全体として参照により援用される）とともに、任意の未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプを含む。ＦｃγＲは、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む任意の生物に由来してもよい。マウスＦｃγＲは、限定はされないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）とともに、任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプを含む。

「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」は、本明細書で用いられるとき、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合するタンパク質を意味し、少なくとも一部にはＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。ＦｃＲｎは、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む任意の生物に由来してもよい。当該技術分野で公知であるように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、重鎖および軽鎖と称されることが多い２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ−２−ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。本明細書で特に断りのない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ−２−ミクログロブリンの複合体を指す。ＦｃＲｎ受容体への結合を増強する、また場合により血清半減期を延ばすために用いられる種々のＦｃＲｎ変異体が図８３の説明文中に示される。

「親ポリペプチド」は、本明細書で用いられるとき、変異体を作製するために後に修飾される開始ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは改変版であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。したがって、「親免疫グロブリン」は、本明細書で用いられるとき、変異体を作製するために修飾される未修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、また「親抗体」は、本明細書で用いられるとき、変異体抗体を作製するために修飾される未修飾抗体を意味する。「親抗体」が下記に概説されるような公知の市販の組換え産生抗体を含むことは注目されるべきである。

「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、本明細書で用いられるとき、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチド、また場合によりヒンジの一部を意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのＮ末端の柔軟なヒンジを意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間の下側ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、付番は、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスに従う。一部の実施形態では、後により十分に記載されるように、アミノ酸修飾は、例えば１つ以上のＦｃγＲ受容体またはＦｃＲｎ受容体への結合を改変するため、Ｆｃ領域に対してなされる。

本明細書中の「重定常領域」は、抗体のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を意味する。

本明細書中の「Ｆｃ融合タンパク質」または「イムノアドヘシン」は、本明細書に記載の通り、標的タンパク質に対する結合部分など、一般に異なるタンパク質に（本明細書に記載の通り、任意選択でリンカー部分を介して）連結されたＦｃ領域を含むタンパク質を意味する。場合により、ヘテロ二量体抗体の一方の単量体は抗体重鎖を含み（ｓｃＦｖを含むかまたはさらに軽鎖を含むかのいずれか）、他方の単量体は変異体Ｆｃドメインおよびリガンドを含むＦｃ融合物である。一部の実施形態では、これらの「半分抗体−半分融合タンパク質」は「融合体（Ｆｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ）」と称される。

「位置」は、本明細書で用いられるとき、タンパク質の配列における位置を意味する。位置は、順に番号付けされてもよいか、確立された形式、例えば抗体を付番する場合のＥＵインデックスに従ってもよい。

「標的抗原」は、本明細書で用いられるとき、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。極めて多数の好適な標的抗原が以下に記載される。

「鎖状態（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、本明細書における本発明のヘテロ二量体抗体の単量体との関連では、「一致する」ＤＮＡの２本の鎖と同様、ヘテロ二量体化変異体が、ヘテロ二量体を形成するための「一致する」能力を保存するように、各単量体中に組み込まれることを意味する。例えば、一部のｐＩ変異体が単量体Ａ（例えば、ｐＩを高める）を改変される場合、同様に利用可能である「電荷対」である立体変異体は、ｐＩ変異体に干渉しない、例えばｐＩを高める荷電変異体は、同じ「鎖」または「単量体」上に置かれることで両方の機能性を保存する。同様に、後により十分に概説されるような対のセット中に存在する「歪曲」変異体の場合、当業者は、その対の１セットが組み込まれるいずれの鎖または単量体であるかで、ｐＩ分離が歪曲のｐＩを用いて同様に最大化されるかを判定する点でｐＩを検討することになる。

「標的細胞」は、本明細書で用いられるとき、標的抗原を発現させる細胞を意味する。

「可変領域」は、本明細書で用いられるとき、それぞれ、κ遺伝子座、λ遺伝子座、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶｋ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる、１つ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。

本明細書中の「野生型またはＷＴ」は、対立遺伝子バリエーションを含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。

本発明の抗体は、一般に単離されるかまたは組み換えられる。「単離された」は、本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために用いられる場合、特定および分離され、かつ／またはそれが発現された細胞もしくは細胞培養物から回収されている、ポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組換え」は、抗体が外来性宿主細胞内で組換え核酸技術を用いて作製されることを意味する。

特定の抗原またはエピトープに対する「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」とは、非特異的な相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない類似する構造の分子である対照分子の結合と比べて分子の結合を確認することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似する対照分子との競合によって確認することができる。

特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替として、少なくも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれよりも高い、抗原またはエピトープに対するＫＤ（ＫＤは特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す）を有する抗体によって示され得る。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープに対する対照分子より２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて高いＫＤを有することになる。

また、特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照と比較してエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて高い抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａを有する抗体により示され得る（ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す）。結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを使用して一般に測定される。

ＩＩ．概要
ＣＤ３および腫瘍抗原標的に共会合する二重特異性抗体は、Ｔ細胞が標的化腫瘍細胞を攻撃し、溶解するように再誘導するように設計され、用いられている。例として、ＣＤ３および腫瘍抗原に一価的に会合する、ＢｉＴＥおよびＤＡＲＴ形式が挙げられる。ＣＤ３を標的化する手法がかなり有望であることを示している一方、かかる治療法に共通の副作用は、有毒なサイトカイン放出症候群をもたらすことが多い、それに関連するサイトカイン産生である。二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインがすべてのＴ細胞に会合することから、高いサイトカイン産生性のＣＤ４ Ｔ細胞サブセットが動員される。さらに、ＣＤ４ Ｔ細胞サブセットは、動員および増殖が潜在的には免疫抑制をもたらし、長期腫瘍抑制に対する負の影響を有し得るような制御性Ｔ細胞を含む。さらに、これらの形式は、Ｆｃドメインを有することなく、患者における極めて短い血清半減期を示す。

ＣＤ３を標的化する手法がかなり有望であることを示している一方、かかる治療法に共通の副作用は、有毒なサイトカイン放出症候群をもたらすことが多い、それに関連するサイトカイン産生である。二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインがすべてのＴ細胞に会合することから、高いサイトカイン産生性のＣＤ４ Ｔ細胞サブセットが動員される。さらに、ＣＤ４ Ｔ細胞サブセットは、動員および増殖が潜在的には免疫抑制をもたらし、長期腫瘍抑制に対する負の影響を有し得るような制御性Ｔ細胞を含む。サイトカイン産生を低下させ、おそらくはＣＤ４ Ｔ細胞の活性化を低下させる可能性がある１つのかかる方法は、ＣＤ３に対する抗ＣＤ３ドメインの親和性を低下させることによる。

したがって、一部の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する「強力な」または「高親和性の」結合剤であり（例えば、一例がＨ１．３０＿Ｌ１．４７として表される重および軽可変ドメインである（任意選択で、必要に応じて荷電リンカーを含む））、かつＣＤ３８にも結合する、抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。他の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する「軽い」または「親和性がより低い」結合剤である抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。さらなる実施形態は、ＣＤ３８にも結合する、ＣＤ３に対する中間のまたは「中程度の」親和性を有する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを使用して一般に測定される。

本発明の「高い、中程度の、低い」抗ＣＤ３配列が種々のヘテロ二量体化形式で使用可能であることは理解されるべきである。本明細書中の開示の大半でヘテロ二量体の「ボトルオープナー」形式が用いられる一方、これらの可変重および可変軽配列、ならびにｓｃＦｖ配列（ならびにこれらの可変重および可変軽配列を含むＦａｂ配列）は、他の形式、例えば国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットの図２に表されるもの（それらの図面、形式および説明文は参照により本明細書中に明示的に援用される）において用いることができる。

したがって、本発明は、２つの異なる抗原に結合するヘテロ二量体抗体を提供し、例えば、抗体は、下記のように、２つの異なる標的抗原、一般に標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合する点で「二重特異性」である。これらのヘテロ二量体抗体は、これらの標的抗原に、一価（例えば、可変重鎖および可変軽鎖ドメイン対などの単一の抗原結合ドメインが存在する）または二価（各々独立して抗原に結合する２つの抗原結合ドメインが存在する）のいずれかで結合し得る。本発明のヘテロ二量体抗体は、下記に同様に概説されるようなヘテロ二量体のホモ二量体からの単純な精製を可能にする「ｐＩ変異体」と共役される、下記により十分に概説されるようなホモ二量体にわたるヘテロ二量体の形成を「歪曲させる（ｓｋｅｗ）」アミノ酸置換を有する異なる単量体の使用に基づく。本発明のヘテロ二量体の二重特異性抗体の場合、本発明は、一般に、ヘテロ二量体タンパク質を産生するための、産生細胞内で自己組織化可能である改変されるまたは変異体としてのＦｃドメインの使用、およびかかるヘテロ二量体タンパク質を作成しかつ精製するための方法に依存している。

ＩＩＩ．抗体
本発明は、２つの異なる抗原、例えば、ＣＤ３および標的腫瘍抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ１２３に結合し、また一般に治療抗体である二重特異性抗体の作製に関する。下記に考察されるように、用語「抗体」が一般に用いられる。本発明において用途が見出される抗体は、従来の抗体、ならびに本明細書に記載の抗体誘導体、断片および模倣物を含む、本明細書に記載のような幾つかの形式を取り得る。

従来の抗体の構造単位は、典型的には四量体を含む。各四量体は、典型的には２対の同一なポリペプチド鎖で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）と、１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）とを有する。ヒトの軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖に分類される。本発明は、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む幾つかのサブクラスを有するＩｇＧクラスを対象とする。ＩｇＧ１が３５６（ＤまたはＥ）および３５８（ＬまたはＭ）に多型を有する異なるアロタイプを有することに注目されたい。本明細書に表される配列は、３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプが本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプの代わりに３５６Ｅ／３５８Ｌを有することができる。

加えて、本明細書における配列の多くは、セリンと交換された２２０位の少なくとも１つのシステインを有し、一般に、これは、本明細書に表される配列のほとんどについて「ｓｃＦｖ単量体」側にあるが、それは、ジスルフィド形成を低下させるために「Ｆａｂ単量体」側またはその両方にあるものとすることもできる。交換されたこれらのシステイン（Ｃ２２０Ｓ）の一方または両方が本明細書における配列内に特に含まれる。

したがって、「アイソタイプ」は、本明細書で用いられるとき、それらの定常領域の化学的および抗原的な特徴によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのうちのいずれかを意味する。治療抗体がまた、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドを含み得ることは理解されるべきである。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号明細書（参照により援用される）に示されるように、本発明は、ＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩの改変を包含する。

各鎖のアミノ末端部分は、一般に当該技術分野および本明細書において「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」と称される、主として抗原認識に関与する約１００〜１１０個もしくはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。可変領域では、抗原結合部位を形成するため、重鎖および軽鎖のＶドメインの各々に３つのループが集まる。ループの各々は、相補性決定領域（以降、「ＣＤＲ」と称される）と称され、そこではアミノ酸配列における変動が最も顕著である。「可変」とは、可変領域のある特定のセグメントが、抗体間で配列が広範囲に異なるという事実を指す。可変領域内の可変性は、均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変の一続きの領域からなり、それらは、各々９〜１５アミノ酸長またはそれより長い「超可変領域」と称される極端な可変性のより短い領域によって分離される。

各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順に整列した、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）と４つのＦＲとからなる。

超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域内のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１：「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）あたりと、重鎖可変領域内の３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１：「Ｈ」は重鎖を示す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）あたりのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、ならびに／または超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域内の残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と、重鎖可変領域内の２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６〜１０１（ＨＣＤＲ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７を包含する。本発明の特定のＣＤＲについては後に記載される。

当業者によって理解されるように、ＣＤＲの厳密なナンバリングおよび配置は、異なるナンバリング方式によって異なり得る。しかしながら、可変重配列および／または可変軽配列についての本開示が、関連するＣＤＲの開示を含むことが理解されるであろう。したがって、それぞれの可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、それぞれの可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。

本明細書を通して、Ｋａｂａｔの付番システムが可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７、および重鎖可変領域の残基１〜１１３）に言及する場合、またＥＵ付番システムがＦｃ領域の場合、一般に用いられる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上記（１９９１））。

本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽ＣＤＲおよび３つの可変重ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３を含む。これらは各々、より大きい可変軽鎖ドメインまたは可変重鎖ドメインの一部であり得る。さらに、本明細書でより十分に概説されるように、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、重鎖および軽鎖が用いられる場合（例えば、Ｆａｂが用いられる場合）、別々のポリペプチド鎖上、またはｓｃＦｖ配列の場合、単一のポリペプチド鎖上に存在し得る。

ＣＤＲは、抗原結合、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとしてとして知られる、抗体分子の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集団であり、通常、特定の構造特性とともに特定の電荷特性を有する。単一の抗原が２つ以上のエピトープを有する場合がある。

エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優勢成分とも称される）と、結合に直接関与していない他のアミノ酸残基、例えば、特異的な抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基とを含んでもよい。換言すると、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内に存在する。

エピトープは、立体構造的または線状のいずれであってもよい。立体構造的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって生成されるエピトープである。立体構造的または非立体構造的エピトープは、変性溶媒の存在下で、前者との結合は失われるが、後者との結合は失われないという点において区別してもよい。

エピトープは、特有の空間的配置において、典型的には少なくとも３つ、より一般的には少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が、別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力を示す単純な免疫測定法（例えば、「ビニング」）において確認され得る。

各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の極めて多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づいて、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲとフレームワークとに分類し、そのリストを作成した（ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（全体として参照により援用される）を参照）。

免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖において幾つかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書中の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、明確な三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味深いのは、定常重（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体に関連して、ＩｇＧアイソタイプは各々、３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧに関連する「ＣＨ」ドメインは以下の通りである：「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスによる１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスによる２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスによる３４１〜４４７位を指す。本明細書に示され、また後述されるように、ｐＩ変異体は、後に考察される、ＣＨ領域およびヒンジ領域のうちの１つ以上に存在し得る。

本明細書に示される配列がＣＨ１領域、すなわち１１８位で開始し、指定がある場合を除いて可変領域が含まれないことは注目されるべきである。例えば、配列番号２の最初アミノ酸は、配列表では「１」位と表されていても、ＥＵ付番に従うとＣＨ１領域の１１８位に対応する。

重鎖の別の種類のＩｇドメインは、ヒンジ領域である。本明細書中の「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間にアミノ酸を含む柔軟なポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧのＣＨ１ドメインはＥＵ位置２２０で終端し、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは残基のＥＵ位置２３７で開始する。したがって、ＩｇＧの場合、抗体ヒンジは、２２１位（ＩｇＧ１のＤ２２１）〜２３６（ＩｇＧ１のＧ２３６）を含むものと本明細書で定義され、付番は、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスに基づくものとする。一部の実施形態では、例えば、Ｆｃ領域に関連して、下側のヒンジが含まれ、この「下側のヒンジ」は、一般に、２２６位または２３０位を指す。本明細書に記載されるように、ｐＩ変異体は、ヒンジ領域において作製することもできる。

軽鎖は、一般に、可変軽鎖ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、可変重鎖ドメインと一緒になってＦｖ領域を形成する）と、定常軽鎖領域（ＣＬまたはＣκと称されることが多い）の２つのドメインを含む。

後に概説される、さらなる置換の対象となる別の領域はＦｃ領域である。

したがって、本発明は、異なる抗体ドメインを提供する。本明細書に記載され、当該技術分野で公知の通り、本発明のヘテロ二量体抗体は、重鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、それらは同様に重複している可能性がある。これらのドメインは、限定はされないが、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、軽定常ドメイン、ＦＡｂドメインおよびｓｃＦｖドメインを含む。

したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、任意選択でヒンジドメインを含む。本明細書における実施形態では、ｓｃＦｖがＦｃドメインに付着している場合、Ｆｃドメインのヒンジに付着しているのはｓｃＦｖ構築物のＣ末端であり、例えば、それは、一般にヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳに付着されている。重鎖は、可変重鎖ドメインおよび定常ドメインを含み、それはＣＨ１−任意選択のＣＨ２−ＣＨ３を含むヒンジ−Ｆｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽定常ドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー、および可変軽鎖ドメインを含む。本明細書で概説されるほとんどの構築物および配列において、可変軽鎖のＣ末端は、ｓｃＦｖリンカーのＮ末端に付着され、そのＣ末端は、可変重鎖のＮ末端に付着される（Ｎ−ｖｈ−リンカー−ｖｌ−Ｃ）が、それは切り替えることができる（Ｎ−ｖｌ−リンカー−ｖｈ−Ｃ）。

本発明の一部の実施形態は、少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含み、それは天然に存在しないが、一般にｓｃＦｖリンカーによって一緒に連結された可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む。本明細書で示されるように、組換え技術によって作製される、従来のペプチド結合を含む、使用可能な幾つかの好適なｓｃＦｖリンカーが存在する。

リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、２つの分子を、それらが所望される活性を保持するように、互いに関して正確な立体構造を想定するような方法で連結するのに十分な長さを有する必要がある。一実施形態では、リンカーは、約１〜５０アミノ酸長、好ましくは約１〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、１〜２０アミノ酸長のリンカーを用いてもよく、一部の実施形態では約５〜約１０個のアミノ酸の使用が認められる。有用なリンカーとして、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含む（ｎは少なくとも１の整数（また一般には３〜４）である）グリシン−セリンポリマー、、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および他の柔軟なリンカーが挙げられる。あるいは、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体を含む種々の非タンパク質性ポリマーは、リンカーとしての用途が見出され得る、すなわちリンカーとしての使用が見出され得る。

他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の長さの任意の配列を含んでもよいが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのすべての残基ではない（例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基）。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えばＣκまたはＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質などの他のタンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来の配列、および他のタンパク質由来の他の天然配列に由来してもよい。

一部の実施形態では、リンカーは、任意の２つのドメイン（本明細書で一緒に概説されるもの）を連結するのに用いられる「ドメインリンカー」である。任意の好適なリンカーが使用可能である一方、多数の実施形態では、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎは少なくとも１の整数（また一般には３〜４〜５）である）を含むグリシン−セリンポリマーとともに、２つのドメインの、各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にする十分な長さおよび柔軟性を伴った組換え付着を可能にする任意のペプチド配列が用いられる。場合により、また「鎖状態」に注目すると、後に概説される通り、荷電ドメインリンカーは、ｓｃＦｖリンカーの一部の実施形態で用いられるとき、用いることができる。

一部の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは荷電ｓｃＦｖリンカーであり、その多数が図３３に示される。したがって、本発明は、第１および第２の単量体間でのｐＩにおける分離を促進するため、荷電ｓｃＦｖリンカーをさらに提供する。すなわち、正または負のいずれか（または異なる単量体上でｓｃＦｖを用いるスキャフォールドの場合には両方）の荷電ｓｃＦｖリンカーを組み込むことにより、荷電リンカーを含む単量体がＦｃドメイン内でさらなる変化を生じさせることなくｐＩを変更することが可能である。これらの荷電リンカーは、標準のリンカーを有する任意のｓｃＦｖ中に置換され得る。さらに、当業者によって理解されるように、荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｐＩにおける所望される変化に基づき、正確な「鎖」または単量体に対して用いられる。例えば、本明細書で考察されるように、三重Ｆ形式ヘテロ二量体抗体を作製するため、所望される抗原結合ドメインの各々におけるＦｖ領域の最初のｐＩが算出され、ｓｃＦｖを作製するために１つが選択され、またｐＩに応じて、正または負リンカーのいずれかが選択される。

同様に本発明の単量体のｐＩ分離を高めるため、荷電ドメインリンカーも用いることができ、したがって、リンカーが用いられる場合の本明細書中の任意の実施形態では、図３３に含まれるものを用いることができる。

一部の実施形態では、抗体は全長である。本明細書中の「全長抗体」は、ヘテロ二量体化の形成またはホモ二量体からのヘテロ二量体の精製のいずれかを可能にするための、特にＦｃドメインにおける、本明細書で概説されるような１つ以上の修飾を含む可変領域および定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。全長抗体は、一般に、ＦａｂおよびＦｃドメインを含み、また加えて、一般に図面で示されるように、ｓｃＦｖなどの余分な抗原結合ドメインを有し得る。

一実施形態では、ｐＩを改変するなど、ヘテロ二量体を産生するように改変することができる少なくとも１つの定常ドメインを含む限り、抗体は、抗体断片である。使用することができる他の抗体断片は、ｐＩを改変している本発明のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ、およびＣＬドメインのうちの１つ以上を有する断片を含む。例えば、Ｆｃ融合物は、別のタンパク質に融合されたＦｃ領域（ＣＨ２およびＣＨ３、任意選択でヒンジ領域を含む）の融合物である。多くのＦｃ融合体が当該技術分野で公知であり、本発明のヘテロ二量体化変異体の付加によって改善され得る。本発明の場合、ＣＨ１；ＣＨ１，ＣＨ２およびＣＨ３；ＣＨ２；ＣＨ３；ＣＨ２およびＣＨ３；ＣＨ１およびＣＨ３を含む抗体融合物を作製することができ、これらのいずれかまたはすべては、本明細書に記載されるヘテロ二量体化変異体の任意の組み合わせを用いて、任意選択でヒンジ領域を用いて作製することができる。

特に、図１に示される形式は、通常「ヘテロ二量体抗体」と称される抗体であり、タンパク質がヘテロ二量体Ｆｃドメインに自己組織化された少なくとも２つの関連するＦｃ配列を有することを意味する。

キメラおよびヒト化抗体
一部の実施形態では、抗体は、異なる種からの混合体、例えばキメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。一般に、「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種に由来する領域を組み合わせた抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、従来、マウス（または場合によりラット）由来の可変領域と、ヒト由来の定常領域とを含む。「ヒト化抗体」は、一般に、可変ドメインフレームワーク領域を、ヒト抗体に見出される配列と交換された非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体では、ＣＤＲを除く全抗体が、ヒト由来のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いて、かかる抗体と同一である。非ヒト生物に由来する核酸によって一部または全部がコードされるＣＤＲが、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワーク内に移植されて抗体が作出され、移植されたＣＤＲによってその特異性が決定される。かかる抗体の作出は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（すべてが全体として参照により援用される）に記載されている。最初の移植構築物において失われた親和性を回復するため、選択されたアクセプターフレームワーク残基の対応するドナー残基への「逆変異」が必要であることが多い（米国特許第５５３０１０１号明細書、米国特許第５５８５０８９号明細書、米国特許第５６９３７６１号明細書、米国特許第５６９３７６２号明細書、米国特許第６１８０３７０号明細書、米国特許第５８５９２０５号明細書、米国特許第５８２１３３７号明細書、米国特許第６０５４２９７号明細書、米国特許第６４０７２１３号（すべてが全体として参照により援用される））。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリンの定常領域（典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部を含むことになり、したがって、典型的にはヒトＦｃ領域を含むことになる。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを用いて作製され得る。Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４（全体として参照により援用される）。非ヒト抗体をヒト化および再形成するための様々な技術および方法が当該技術分野で周知である（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ＆Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、およびその中に引用される参考文献（すべてが全体として参照により援用される）を参照）。ヒト化方法は、限定はされないが、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８６：１００２９−３３；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９；Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４１８１−４１８５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１：３２１−８（すべてが全体として参照により援用される）に記載される方法を含む。ヒト化方法、または非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低下させる他の方法は、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９６９−９７３（全体として参照により援用される）に記載のような表面再処理方法を含んでもよい。

ある実施形態では、本発明の抗体が、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物である」または「それに由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含んでいてもよくまたはそれからなってもよい。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン「の産物である」または「それに由来する」ヒト抗体は、そのため、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列に配列が最も近い（すなわち、最も大きい同一性％）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を選択することによって同定することができる。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物である」または「それに由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な導入により、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸差異を含有してもよい。しかしながら、ヒト化抗体は、典型的に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較した場合、ヒト配列に由来するとして抗体を同定するアミノ酸残基を含有する。ある場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であってもよい。典型的に、特定のヒト生殖細胞系列配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、わずか１０〜２０以下のアミノ酸差異を表すであろう（本明細書におけるいかなる歪曲、ｐＩ、および切断変異体の導入前；すなわち、変異体の数は、本発明の変異体の導入前には一般に低い）。ある場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と５つ以下またはさらに４、３、２、もしくは１つ以下のアミノ酸差異のみを表し得る（なおまた本明細書におけるいかなる歪曲、ｐＩ、および切断変異体の導入前；すなわち、変異体の数は、本発明の変異体の導入前には一般に低い）。

一実施形態では、親抗体は、当該技術分野で公知のように親和性成熟されている。ヒト化および親和性成熟には、例えば米国特許出願第１１／００４，５９０号明細書に記載されるような構造に基づく方法を用いてもよい。抗体可変領域をヒト化および／または親和性成熟させるため、限定はされないが、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４；Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８９１０−８９１５；Ｋｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（１０）：７５３−７５９（すべてが全体として参照により援用される）に記載される方法を含む、選択に基づく方法を用いてもよい。限定はされないが、米国特許出願第０９／８１０，５１０号明細書；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５；Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４（すべてが全体として参照により援用される）に記載される方法を含む、他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部分のみの移植を伴う場合がある。

ＩＶ．ヘテロ二量体抗体
したがって、一部の実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインおよびヘテロ二量体抗体を形成するために自己組織化することになる、２つの異なる重鎖変異体のＦｃ配列の使用に依存するヘテロ二量体抗体を提供する。

本発明は、２つ以上の抗原またはリガンドへの結合を可能にする、例えば二重特異性結合を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するための新規な構築物を対象とする。ヘテロ二量体抗体構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば集合して「二量体」を構築する２つの「単量体」の自己集合特性に基づく。下記により十分に考察される通り、ヘテロ二量体抗体は、各単量体のアミノ酸配列を改変することによって作製される。したがって、本発明は、一般に、ヘテロ二量体の形成を促進し、かつ／またはホモ二量体に対するヘテロ二量体の精製の簡易化を可能にするため、各鎖に対する異なる定常領域におけるアミノ酸変異体に依存する幾つかの方法で抗原に共会合可能なヘテロ二量体抗体の作出を対象とする。

このようにして、本発明は、二重特異性抗体を提供する。抗体技術における継続的な問題は、一般に、２つの異なる抗原に同時に結合して、異なる抗原を近接させ、新しい機能性および新しい治療薬をもたらす「二重特異性」抗体への要望である。一般に、これらの抗体は、各々の重鎖および軽鎖における遺伝子を宿主細胞に含めることによって作製される。これにより、一般に、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）ならびに２つのホモ二量体（Ａ−ＡおよびＢ−Ｂ（軽鎖ヘテロ二量体上の課題を含まない））が形成される。しかしながら、二重特異性抗体の形成における大きい障害は、ホモ二量体抗体からヘテロ二量体抗体を精製し、かつ／またはヘテロ二量体の形成をホモ二量体の形成に対してバイアスをかける際の困難性である。

本発明のヘテロ二量体を作製するのに利用可能な幾つかの機構が存在する。さらに、当業者によって理解されるように、これらの機構を組み合わせるで、高度なヘテロ二量体化を確保することができる。したがって、ヘテロ二量体の産生をもたらすアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と称される。後に考察されるように、ヘテロ二量体化変異体は、立体変異体（例えば、下記の「ノブとホール（ｋｎｏｂｓ ａｎｄ ｈｏｌｅｓ）」または「歪曲」変異体および下記の「電荷対」変異体）ならびにヘテロ二量体からのホモ二量体の精製を可能にする「ｐＩ変異体」を含み得る。国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレット（その全体が、また「ヘテロ二量体化変異体」に関する考察については以下のように具体的に、本明細書で参照により援用される）では、ヘテロ二量体化にとって有用な機構は、「ノブとホール」（「ＫＩＨ」；ときとして本明細書で「歪曲」変異体（国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレット中の考察を参照）、国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットに記載の「静電的操縦」または「電荷対」、国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットに記載のｐＩ変異体、および国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレットおよび下記に概説されるような一般的なさらなるＦｃ変異体を含む。

本発明では、ヘテロ二量体抗体の精製を容易化し得る幾つかの基本的機構が存在する一方、各単量体が異なるｐＩを有することで、ｐＩ変異体の使用に依存することから、Ａ−Ａ、Ａ−ＢおよびＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製が可能になる。あるいは、一部のスキャフォールド形式、例えば「三重Ｆ」形式もサイズに基づく分離を可能にする。後にさらに概説される通り、ヘテロ二量体の形成をホモ二量体に対して「歪曲させる」ことも可能である。したがって、立体的なヘテロ二量体化変異体とｐＩまたは電荷対変異体との組み合わせから、本発明における特定用途が見出される。

一般に、本発明における特定用途の実施形態は、２つの単量体間のｐＩ差を増加させるようにｐＩ変異体と共役させた、ホモ二量体化形成よりもヘテロ二量体化形成を促進する、歪曲変異体を含む変異体のセットに依存する。

加えて、後により十分に概説されるように、ヘテロ二量体抗体の形式に依存して、ｐＩ変異体が単量体の定常および／もしくはＦｃドメイン内部に含まれ得るか、または荷電リンカー（ドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれか）を用いることができる。すなわち、三重Ｆ形式などのｓｃＦｖを利用するスキャフォールドは、精製目的で、さらなるｐＩブーストを与える荷電ｓｃＦｖリンカー（正または負のいずれか）を含み得る。当業者によって理解されるように、荷電ｓｃＦｖリンカーのみを伴い、さらなるｐＩ調節を伴わない幾つかの三重Ｆ形式が有用であるが、本発明は特に、単量体の一方もしくは両方へのｐＩ変異体、および／または同様に荷電ドメインリンカーを提供する。さらに、他の機能性を意図してさらなるアミノ酸の改変を行うことにより、ｐＩの変化、例えばＦｃ、ＦｃＲｎおよびＫＯ変異体も得られる場合がある。

ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にする分離機構としてｐＩを利用する本発明では、アミノ酸変異体は、単量体ポリペプチドの一方もしくは両方に導入され得る；すなわち、単量体の一方（本明細書では単純に「単量体Ａ」と称される）のｐＩを単量体Ｂから離れるように改変することができるか、または単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを低下させて、単量体ＡおよびＢの両方が改変され得る。後により十分に概説されるように、いずれかまたは両方の単量体のｐＩの変化は、荷電残基を除去もしくは付加することによって（例えば、中性アミノ酸が正または負に荷電するアミノ酸残基に、例えばグリシンからグルタミン酸に置き換えられる）、荷電残基を正電荷もしくは負電荷から反対の電荷に変更することによって（アスパラギン酸からリジンに）、または荷電残基を中性残基に変更することによって（例えば、電荷の損失：リジンからセリンに）行うことができる。幾つかのこれらの変異体は図面に示される。

したがって、本発明のこの実施形態は、ホモ二量体からヘテロ二量体を分離することができるように、単量体のうちの少なくとも１つに十分なｐＩの変化をもたらすことを提供する。当業者には理解されるように、また後にさらに考察されるように、これは、「野生型」重鎖定常領域と、ｐＩを増加または低下させるように改変されている変異体領域（ｗｔＡ−＋ＢもしくはｗｔＡ−−Ｂ）とを用いることにより、あるいは一方の領域を増加させ、他方の領域を低下させることにより（Ａ＋−Ｂ−またはＡ−Ｂ＋）行うことができる。

このように、一般に、本発明の一部の実施形態の成分は、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」または「ｐＩ置換」）を一方または両方の単量体に組み込むことにより、二量体タンパク質の（両方ではないにせよ）少なくとも一方の単量体の等電点（ｐＩ）を変化させて「ｐＩ抗体」）を形成することを対象とする、抗体の定常領域内のアミノ酸変異体である。本明細書に示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが最低ｐＨ０．１単位だけ異なる場合に達成することができ、０．２、０．３、０．４、および０．５またはそれを超える場合にすべて本発明に用途が見出される。

当業者によって理解されるように、良好な分離を得るため、各々または両方の単量体に含まれるｐＩ変異体の数は、一部には、例えば三重Ｆ形式における成分の開始ｐＩ、目的のｓｃＦｖおよびＦａｂの開始ｐＩに依存することになる。すなわち、いずれの単量体を改変するか、または「方向」（例えば、より正かまたは負か）を決定するため、２つの標的抗原のＦｖ配列が算出され、そこから決定がなされる。当該技術分野で公知であるように、異なるＦｖは、本発明において用いられる異なる開始ｐＩを有することになる。一般に、本明細書で概説されるように、ｐＩは、各単量体の全ｐＩ差が少なくとも約０．１ｌｏｇ（本明細書で概説される通り、０．２〜０．５が好ましい）になるように設計される。

さらに、当業者によって理解され、また本明細書で概説されるように、一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、サイズに基づいてホモ二量体から分離され得る。例えば図１に示されるように、幾つかの形式が、サイズに基づいて、ヘテロ二量体とホモ二量体の分離を可能にする。

ヘテロ二量体化を達成するため、重鎖の定常領域を用いることによりｐＩ変異体が用いられる場合、抗体を含む二重特異性タンパク質を設計し、精製するためのよりモジュール的な手法が提供される。したがって、一部の実施形態では、ヘテロ二量体化変異体（歪曲および精製ヘテロ二量体化変異体を含む）が可変領域内に含まれないことから、個々の抗体は各々改変される必要がある。さらに、一部の実施形態では、ｐＩ変異体に起因して免疫原性が生じる可能性は、有意な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、ｐＩ変異体を異なるＩｇＧアイソタイプから輸入することによって有意に低下する。したがって、さらなる解決すべき課題は、高いヒト配列含量、例えば任意の特定の位置での非ヒト残基の最小化または回避を伴う、低いｐＩの定常ドメインの解明である。

このｐＩを改変することで生じ得る副効用として、血清半減期の延長およびＦｃＲｎ結合の増強もある。すなわち、米国特許出願第１３／１９４，９０４号明細書（その全体が参照により援用される）に記載のように、（抗体およびＦｃの融合物中に見出されるものを含む）抗体定常ドメインのｐＩを低下させることにより、インビボでの血清保持の延長がもたらされ得る。血清半減期を延長するためのこれらのｐＩ変異体はまた、精製のためのｐＩの変化を促進する。

加えて、ホモ二量体が存在する場合に除去、最小化、および区別のいずれかを行う能力が重要であることから、ヘテロ二量体化変異体のｐＩ変異体が、二重特異性抗体の分析および品質管理プロセスにおいてさらなる利益をもたらすことは注目されるべきである。同様に、ヘテロ二量体抗体産生の再現性を確実に試験する能力が重要である。

ヘテロ二量体化変異体
本発明は、ヘテロ二量体の形成および／またはホモ二量体からの精製を可能にするヘテロ二量体変異体を利用する、種々の形式でのヘテロ二量体抗体を含むヘテロ二量体タンパク質を提供する。

好適な対のヘテロ二量体化歪曲変異体セットが幾つか存在する。これらの変異体は、「対」の「セット」で存在する。すなわち、対の一方のセットは第１の単量体中に組み込まれ、対のもう一方のセットは第２の単量体中に組み込まれる。これらのセットが必ずしも「ノブインホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎ ｈｏｌｅｓ）」変異体として振る舞うことなく、一方の単量体上の残基と他方の単量体上の残基との間で１対１の対応がある、すなわち、これらの対のセットがヘテロ二量体の形成を促進し、ホモ二量体の形成を防止する２つの単量体間の界面を形成することで、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体の百分率が、予想された５０％（２５％のホモ二量体Ａ／Ａ：５０％のヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％のホモ二量体Ｂ／Ｂ）ではなく９０％を超えることが可能になることは注目されるべきである。

立体変異体
一部の実施形態では、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の付加により促進され得る。すなわち、各重鎖内のアミノ酸を改変することにより、異なる重鎖が会合し、同じＦｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりもヘテロ二量体構造を形成する可能性が高い。好適な立体変異体は図２９に含まれる。

１つの機構は、一般に、ヘテロ二量体の形成を支持し、ホモ二量体の形成に対抗するように立体的影響を創出するようなアミノ酸の改変を指して、当該技術分野で「ノブとホール」と称され、任意選択で用いることができる一方、これは、ときとして米国特許出願第６１／５９６，８４６号明細書、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：６１７（１９９６）；Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７ ２７０：２６；米国特許第８，２１６，８０５号明細書（これらのすべては、その全体が本明細書で参照により援用される）に記載のように「ノブとホール」と称される。同図では、「ノブとホール」に依存する幾つかの「単量体Ａ−単量体Ｂ」対が同定されている。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載のように、これらの「ノブとホール」突然変異は、ヘテロ二量体化への形成を歪曲させるため、ジスルフィド結合と組み合わせることができる。

ヘテロ二量体の作製において用途が見出されるさらなる機構が、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）（本明細書でその全体が参照により援用される）に記載のように「静電的操縦」と称される場合がある。これは本明細書中で「電荷対」と称される場合がある。この実施形態では、ヘテロ二量体化への形成を歪曲させるため、静電気が用いられる。当業者が理解するように、これらはまた、ｐＩに対して、したがって精製に対して影響を有する可能性があり、したがって場合によりｐＩ変異体とも考えることができる。しかし、これらがヘテロ二量体化を推進するように作製され、精製ツールとして用いられなかったことから、それらは「立体変異体」に分類される。これらは、限定はされないが、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒ（例えば、これらは「単量体対応セットである）と対のＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８ＥおよびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対のＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅを含む。

さらなる単量体Ａ変異体および単量体Ｂ変異体は、任意選択でかつ独立して任意の量で、他の変異体、例えば本明細書で概説されるｐＩ変異体または米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号明細書の図３７に示される他の立体変異体（その図面および説明文および配列番号は参照により本明細書中に明示的に援用される）と組み合わせることができる。

一部の実施形態では、本明細書で概説される立体変異体は、任意選択でかつ独立して、任意のｐＩ変異体（または他の変異体、例えばＦｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体など）とともに一方または両方の単量体に組み込むことができ、また独立して任意選択で含めるかまたは本発明のタンパク質から除外することができる。

好適な歪曲変異体のリストが図２９に見出され、図３４は多数の実施形態において特に有用な対を幾つか示す。多数の実施形態では、限定はされないが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む対のセットが特に用いられる。命名法の観点で、「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」の対は、単量体の一方が二重変異体セットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、かつ他方が二重変異体セットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味する。

ヘテロ二量体におけるｐＩ（等電点）変異体
一般に、当業者によって理解されるように、ｐＩ変異体には２つの一般的なカテゴリー、すなわちタンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）およびタンパク質のｐＩを低下させるもの（酸性変化）がある。本明細書に記載のように、これらの変異体のあらゆる組み合わせを設けることができ、一方の単量体は、野生型、または野生型と有意に異なるｐＩを呈しない変異体であってもよく、また他方は、より塩基性またはより酸性のいずれかであり得る。あるいは、各単量体は変化を受け、より塩基性になるものと、より酸性になるものがある。

ｐＩ変異体の好ましい組み合わせが図３０に示される。本明細書で概説され、図面に示されるように、これらの変化はＩｇＧ１に対して示されるが、すべてのアイソタイプ、ならびにアイソタイプハイブリッドがこのように改変され得る。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４である場合、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑも使用可能である。

一実施形態では、例えば、ボトルオープナー形式において、ｐＩ変異体の好ましい組み合わせが、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体を含む１つの単量体（負のＦａｂ側）（ヒトＩｇＧ１と比較した場合、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）ならびに（ＧＫＰＧＳ）_４を含む正荷電ｓｃＦｖリンカーを含む第２の単量体（正のｓｃＦｖ側）を有する。しかしながら、当業者によって理解されるように、第１の単量体は、２０８位を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まない構築物において（例えば、例として二重ｓｃＦｖ形式において、ドメインの一方にＣＨ１ドメインを利用しないヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質について）、好ましい負ｐＩ変異体Ｆｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体（ヒトＩｇＧ１と比較した場合、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。

抗体ヘテロ二量体の軽鎖変異体
抗体に基づくヘテロ二量体の場合、例えば少なくとも１つの単量体が重鎖ドメインに加えて軽鎖を含む場合、ｐＩ変異体はまた、軽鎖内で作製され得る。軽鎖のｐＩを低下させるためのアミノ酸置換として、限定はされないが、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４５Ｑ、Ｎ１５２Ｄ、Ｓ１５６Ｅ、Ｋ１６９Ｅ、Ｓ２０２Ｅ、Ｋ２０７Ｅおよび軽鎖のＣ末端でのペプチドＤＥＤＥの付加が挙げられる。定常λ軽鎖に基づくこのカテゴリーにおける変化は、Ｒ１０８Ｑ、Ｑ１２４Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｎ１３８Ｄ、Ｋ１４５ＴおよびＱ１９９Ｅでの１つ以上の置換を含む。さらに、軽鎖のｐＩを増加させることもできる。

アイソタイプ変異体
加えて、本発明の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの、特定の位置でのｐＩアミノ酸の「組み込み」に依存しており、そうすることで、不要な免疫原性が変異体に導入される可能性を減少させるかまたは排除する。これらの幾つかが米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号明細書（本明細書で参照により援用される）の図２１に示される。すなわち、高いエフェクター機能を含む様々な理由のために、ＩｇＧ１は、治療抗体のための一般的なアイソタイプである。しかし、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２の重定常領域よりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。ＩｇＧ１骨格の特定の位置にＩｇＧ２残基を導入することにより、結果として得られる単量体のｐＩが低下し（または増加し）、加えて血清半減期の延長を呈する。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有する。グルタミン酸を組み込むことは、結果として得られるタンパク質のｐＩに影響を与えることになる。後述するように、幾つかのアミノ酸置換が一般に、変異体抗体のｐＩに著しい影響を与えることが要求される。しかし、後に考察されるように、たとえＩｇＧ２分子における変化であっても血清半減期の延長を可能にすることは注目されるべきである。

他の実施形態では、結果として得られるタンパク質の全体的な荷電状態を減少させるために（例えば、より高いｐＩのアミノ酸をより低いｐＩのアミノ酸に変更することにより）、または後にさらに説明されるように、安定性などのための構造に適応できるように、非アイソタイプのアミノ酸変化を生じさせる。

加えて、重定常ドメインおよび軽定常ドメインの両方のｐＩを改変することにより、ヘテロ二量体の各単量体に著しい変化を見ることができる。本明細書で考察されるように、２つの単量体のｐＩを少なくとも０．５異ならせることにより、イオン交換クロマトグラフィーまたは等電点電気泳動、または等電点に対して感受性がある他の方法による分離が可能となり得る。

ｐＩの計算
各単量体のｐＩは、変異体重鎖定常ドメインのｐＩと、変異体重鎖定常ドメインおよび融合パートナーを含む全単量体のｐＩとに依存し得る。したがって、一部の実施形態では、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号明細書の図１９におけるチャートを用いて、変異体重鎖定常ドメインに基づいて計算される。本明細書で考察されるように、いずれの単量体を改変するかは、一般にＦｖおよびスキャフォールド領域に特有のｐＩによって決定される。あるいは、各単量体のｐＩを比較することもできる。

より良好なＦｃＲｎインビボ結合ももたらすｐＩ変異体
ｐＩ変異体が単量体のｐＩを低下させる場合、それらはインビボでの血清保持を改善するというさらなる利益を有し得る。

依然として検討中であるが、エンドソーム内、ｐＨ６でのＦｃＲｎへの結合によりＦｃが隔離されることから、Ｆｃ領域はインビボでより長い半減期を有すると考えられる（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，１９９７ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８，全体として参照により援用される）。次に、エンドソーム区画は、細胞表面にＦｃを再利用する。その区画が細胞外空間へ開かれると、約７．４のより高いｐＨにより、Ｆｃの血液への逆放出が誘導される。マウスでは、Ｄａｌｌ’ Ａｃｑｕａらが、ｐＨ６およびｐＨ７．４でＦｃＲｎへの結合が増強されたＦｃ突然変異体が血清濃度および野生型Ｆｃと同じ半減期を実際に低下させていることを示した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０、全体として参照により援用される）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＦｃの親和性の増加は、Ｆｃの血液への逆放出を禁止すると考えられる。したがって、インビボでＦｃの半減期を延長することになるＦｃ突然変異は、理想的にはより低いｐＨでＦｃＲｎへの結合を増強する一方、Ｆｃのより高いｐＨでの放出までも可能にする。アミノ酸ヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲内でその荷電状態を変化させる。したがって、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体中の重要な位置にＨｉｓ残基を見出すことは意外なことではない。

近年、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体がまた、より長い血清半減期を有し得ることが示唆されている（Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５−３９２、全体として参照により援用される）。しかし、この機構に対する理解は依然として乏しい。さらに、可変領域は抗体と抗体との間で異なる。低下したｐＩおよび延長した半減期を有する定常領域変異体であれば、本明細書に記載の通り、抗体の薬物動態特性を改善するためのよりモジュール的な手法を提供することになる。

さらなる機能性のためのさらなるＦｃ変異体
ｐＩアミノ酸変異体に加えて、限定はされないが、１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合性の改変、ＦｃＲｎ受容体への結合性の改変などを含む、種々の理由から作製され得る有用なＦｃアミノ酸修飾が幾つか存在する。

したがって、本発明のタンパク質は、ｐＩ変異体および立体変異体を含む、本明細書で概説される二量体化変異体を含む、アミノ酸修飾を含み得る。変異体の各セットは、独立してかつ任意選択で含まれ得るかまたは任意の特定のヘテロ二量体タンパク質から除外され得る。

ＦｃγＲ変異体
したがって、ＦｃγＲ受容体の１つ以上への結合を改変するために作製され得る有用なＦｃ置換が幾つか存在する。結合の増強および結合の低下をもたらす置換は有用であり得る。例えば、Ｆｃ ＲＩＩＩａへの結合の増強が一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害；ＦｃγＲを発現する非特異的な細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応）の増加をもたらすことは知られている。同様に、ＦｃγＲＩＩｂ（阻害性受容体）への結合の低下は、一部の環境下で同様に有利であり得る。本発明において用途が見出されるアミノ酸置換は、米国特許出願第１１／１２４，６２０号明細書（特に図４１）、米国特許出願第１１／１７４，２８７号明細書、米国特許出願第１１／３９６，４９５号明細書、米国特許出願第１１／５３８，４０６号明細書（これらのすべては、その全体において、また特にその中で開示された変異体について、参照により本明細書中に明示的に援用される）において列挙されるものを含む。用途が見出される特定の変異体として、限定はされないが、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖおよび２９９Ｔが挙げられる。

加えて、米国特許出願第１２／３４１，７６９号明細書（本明細書でその全体が参照により援用される）で具体的に開示される通り、限定はされないが、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩもしくはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌおよび２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含む、ＦｃＲｎ受容体への結合の増強および血清半減期の延長において用途が見出されるさらなるＦｃ置換が存在する。

切断変異体
同様に、機能的変異体の別のカテゴリーが、「ＦｃγＲ切断変異体」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）」変異体である。これらの実施形態では、一部の治療用途において、追加的な作用機序を回避するため、１つ以上もしくはすべてのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低下させるかまたは除去することが望ましい。すなわち、例えば多数の実施形態では、特にＣＤ３に一価的に結合する二重特異性抗体の使用において、ＡＤＣＣ活性を除去するかまたは有意に低下させるため、ＦｃγＲＩＩＩａの結合を切断することが一般に望ましく、ここでＦｃドメインの１つは１つ以上のＦｃγ受容体切断変異体を含む。これらの切断変異体は図３１に示され、各々は独立してかつ任意選択で含められ得るかまたは除外され得、好ましい態様では、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７ＧおよびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される切断変異体が用いられる。本明細書で参照される切断変異体がＦｃγＲ結合を切断するが、一般にＦｃＲｎ結合を切断しないことは注目されるべきである。

ヘテロ二量体およびＦｃ変異体の組み合わせ
当業者によって理解されるように、列挙された（歪曲および／またはｐＩ変異体を含む）ヘテロ二量体化変異体のすべては、それらの「鎖状態」または「単量体区画」を保持する限り、任意の方法により任意選択でかつ独立して組み合わせることができる。さらに、これらの変異体のすべては、ヘテロ二量体化形式のいずれかに組み合わせることができる。

ｐＩ変異体の場合、特定用途が見出される実施形態が図面で示される一方、精製を促進するため、他の組み合わせが、２つの単量体間のｐＩ差を改変する基本的規則に従って作製され得る。

加えて、ヘテロ二量体化変異体（歪曲およびｐＩ）のいずれかは、一般に本明細書で概説されるように、Ｆｃ切断変異体、Ｆｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体とも独立してかつ任意選択で組み合わされる。

本発明の有用な形式
当業者によって理解され、後により十分に考察されるように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、一般に図１で示されるように、多種多様な立体配置を取り得る。一部の図面は「シングルエンド」立体配置を表し、ここでは、分子の一方の「アーム」に対して１種の特異性が存在し、他方の「アーム」に対して異なる特異性が存在する。他の図面は「デュアルエンド」立体配置を表し、ここでは分子の「最上部」に少なくとも１種の特異性が存在し、分子の「底部」に１つ以上の異なる特異性が存在する。したがって、本発明は、異なる第１の抗原および第２の抗原と共会合する新規な免疫グロブリン組成物を対象とする。

当業者によって理解されるように、本発明のヘテロ二量体形式は、異なる結合価および二重特異性を有し得る。すなわち、本発明のヘテロ二量体抗体は、二価および二重特異性であり得、ここで一方の標的腫瘍抗原（例えば、ＣＤ３）は第１の結合ドメインによって結合され、他方の標的腫瘍抗原（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３など）は第２の結合ドメインによって結合される。ヘテロ二量体抗体はまた、三価および二重特異性であり得、ここで第１の抗原は２つの結合ドメインによって結合され、第２の抗原は第２の結合ドメインによって結合される。本明細書で概説されるように、潜在的な副作用を低下させるため、ＣＤ３が標的抗原の１つである場合、ＣＤ３は専ら一価的に結合されることが好ましい。

本発明では、抗標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）抗原結合ドメインと組み合わせた抗ＣＤ３抗原結合ドメインが用いられる。当業者によって理解されるように、図面（特に図２〜７、および図６８を参照）のいずれかに示されるような抗ＣＤ３ ＣＤＲ、抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメイン、ＦａｂおよびｓｃＦｖのいずれかの収集物を用いることができる。同様に、抗ＴＴＡ抗原結合ドメインのいずれか、例えば、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ１２３抗原結合ドメインは、図面のいずれかに示されるようなＣＤＲ、可変軽鎖および可変重鎖ドメイン、ＦａｂおよびｓｃＦｖが任意の組み合わせにおいて任意選択でかつ独立して組み合わせて使用できるか否かにかかわらず、用いることができる。

ボトルオープナー形式
本発明に特定用途が見出される１つのヘテロ二量体スキャフォールドは、図１Ａ、ＡおよびＢに示されるような「三重Ｆ」または「ボトルオープナー」スキャフォールド形式である。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は一本鎖Ｆｖ（後に定義されるような「ｓｃＦｖ」）を有し、他方の重鎖は可変重鎖および軽鎖を含む「標準的な」ＦＡｂ形式である。この構造は、ボトルオープナーとのおおまかな視覚的類似性があることから、本明細書で「三重Ｆ」形式（ｓｃＦｖ−ＦＡｂ−Ｆｃ）または「ボトルオープナー」形式と称される場合がある（図１を参照）。２つの鎖は、後により十分に説明されるように、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域）におけるアミノ酸変異体の使用により結合される。

本発明の「三重Ｆ」形式には幾つかの明らかな利点がある。当該技術分野で公知のように、２つのｓｃＦｖ構築物に依存する抗体類似体は、安定性および凝集の問題を有することが多く、それらは本発明において「標準的な」重鎖および軽鎖対合の付加によって軽減され得る。さらに、２つの重鎖および２つの軽鎖に依存する形式に対して、重鎖および軽鎖の不正確な対合（例えば、重鎖１と軽鎖２との対合など）の場合、課題は存在しない。

本明細書で概説される実施形態の多くは、一般に、（すべてでないが多くの場合に荷電した）ｓｃＦｖリンカーを用いて共有結合された、可変重鎖および可変軽鎖ドメインを含むｓｃＦｖを含む、第１の単量体を含むボトルオープナー形式に依存し、この場合、ｓｃＦｖは第１のＦｃドメインのＮ末端に、通常は（本明細書で概説されるように、非荷電または荷電のいずれかであり得る）ドメインリンカーを介して共有結合される。ボトルオープナー形式の第２の単量体は重鎖であり、組成物は軽鎖をさらに含む。

一般に、多数の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖはＣＤ３に結合するドメインであり、重鎖および軽鎖のＦａｂは他方のＴＴＡに結合する。

加えて、本発明のＦｃドメインは、一般に、歪曲変異体（例えば、特に有用な歪曲変異体がＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択される場合の、図２９および図３４に示されるようなアミノ酸置換のセット）、任意選択で切断変異体（図３１に示されるものを含む）、任意選択で荷電ｓｃＦｖリンカー（図３３に示されるものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異体（図３０に示されるものを含む）を含む。

幾つかの実施形態では、本明細書に表されるｖｈ配列およびｖｌ配列のいずれも（ＣＤ２０、ＣＤ３８、およびＣＤ１２３に特異的なものを含む、図において表されるすべてのｖｈ配列およびｖｌ配列を含む）、図に示される抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列のいずれかを使用して、「Ｆａｂ側」として図１６２のボトルオープナー骨格形式に追加することができる。これらの実施形態で特定用途が見出される抗ＣＤ３配列は、図１６２に示される骨格のｓｃＦｖ側として付着される抗ＣＤ３ Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３ Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７である。

本発明は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列が図２〜図７および図６８に示される通りであり、図１６２の骨格形式との任意の組み合わせを含むボトルオープナー形式を提供する。加えて、図２〜図７および図６８に示される抗ＣＤ３ ｖｈ配列およびｖｌ配列のいずれもＦａｂ側として使用することができる。

本発明は、抗ＣＤ３８配列が図８〜１０を含む図面に示されるような場合のＣＤ３８抗原結合ドメインを有するボトルオープナー形式を提供する。上記のように、それぞれのｖｈおよびｖｌ抗ＣＤ３８配列は、Ｆａｂ側またはｓｃＦｖ側のいずれかとすることができ、図１６２のものを含むボトルオープナー形式の抗原結合ドメインの１つとして連結することができる。抗ＣＤ３８配列がＦａｂ側である場合、図のいずれの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列も使用することができ、特に、図１６２に示される骨格のｓｃＦｖ側として付着される抗ＣＤ３ Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３ Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７を含む。

本発明は、抗ＣＤ２０配列が図面に示されるような場合のＣＤ２０抗原結合ドメインを有するボトルオープナー形式を提供する。上記のように、それぞれのｖｈおよびｖｌ抗ＣＤ２０配列は、Ｆａｂ側またはｓｃＦｖ側のいずれかとすることができ、図１６２のものを含むボトルオープナー形式の抗原結合ドメインの１つとして連結することができる。抗ＣＤ２０配列がＦａｂ側である場合、図のいずれの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列も使用することができ、特に、図１６２に示される骨格のｓｃＦｖ側として付着される抗ＣＤ３ Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３ Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７を含む。

本発明は、抗ＣＤ１２３配列が図面に示されるような場合のＣＤ１２３抗原結合ドメインを有するボトルオープナー形式を提供する。上記のように、それぞれのｖｈおよびｖｌ抗ＣＤ１２３配列は、Ｆａｂ側またはｓｃＦｖ側のいずれかとすることができ、図１６２のものを含むボトルオープナー形式の抗原結合ドメインの１つとして連結することができる。抗ＣＤ１２３配列がＦａｂ側である場合、図のいずれの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列も使用することができ、特に、図１６２に示される骨格のｓｃＦｖ側として付着される抗ＣＤ３ Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３ Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３ Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７を含む。

ｍＡｂ−Ｆｖ形式
本発明に特定用途が見出される１つのヘテロ二量体スキャフォールドは、図１に示されるｍＡｂ−Ｆｖ形式である。この実施形態では、この形式は、「余分な」可変重鎖ドメインの一方の単量体へのＣ末端付着および「余分な」可変軽鎖ドメインの他方の単量体へのＣ末端付着の使用に依存することにより、第３の抗原結合ドメインを形成し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分はＴＴＡに結合し、また「余分な」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。

この実施形態では、第１の単量体は、第１の可変軽鎖ドメインがドメインリンカーを用いて第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合された、第１の可変重鎖ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメインを含む、第１の重鎖を含む（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のリンカー］−ｖｌ２）。第２の単量体は、第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメインの第２の可変重鎖ドメインおよびドメインリンカーを用いて第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合された第３の可変重鎖ドメインを含む（ｖｊ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のリンカー］−ｖｈ２。２つのＣ末端に付着された可変ドメインは、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖを形成する（ただし、二価のＣＤ３結合を有することはそれほど好ましくない）。この実施形態では、ＴＴＡに結合する２つの同一のＦａｂを形成するため、重鎖と会合する、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖がさらに用いられる。本明細書中の実施形態の多くに関して、これらの構築物は、本明細書で所望され、記載されるように、歪曲変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加的なＦｃ変異体などを含む。

本発明は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列が図２〜図７および図６８に示されるような場合のｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ３８配列が図８〜１０に示されるようなｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ２０配列が図面で示されるようなＣＤ２０抗原結合ドメインを有するｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１９配列が図面で示されるようなＣＤ１９抗原結合ドメインを有するｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１２３配列が図面で示されるようなＣＤ１２３抗原結合ドメインを有するｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、図３１で示されるような切断変異体を含むｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、図２９および３４で示されるような歪曲変異体を含むｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

ｍＡｂ−ｓｃＦｖ
本発明に特定用途が見出される１つのヘテロ二量体スキャフォールドは、図１に示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、同形式は、単量体の一方へのｓｃＦｖのＣ末端付着の使用に依存することにより、第３の抗原結合ドメインを形成し、ここで２つの単量体のＦａｂ部分はＴＴＡに結合し、また「余分な」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。したがって、第１の単量体は、いずれかの方向でｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むＣ末端に共有結合されたｓｃＦｖを有する、第１の重鎖（可変重鎖ドメインおよび定常ドメインを含む）を含む（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２またはｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２）。この実施形態では、ＴＴＡに結合する２つの同一のＦａｂを形成するため、重鎖と会合する、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖がさらに用いられる。本明細書中の実施形態の多くに関して、これらの構築物は、本明細書で所望され、記載されるように、歪曲変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加的なＦｃ変異体などを含む。

本発明は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列が図２〜図７および図６８に示されるような場合のｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ３８配列が図８〜１０に示されるようなｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ２０配列が図面で示されるようなＣＤ２０抗原結合ドメインを有するｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１９配列が図面で示されるようなＣＤ１９抗原結合ドメインを有するｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１２３配列が図面で示されるようなＣＤ１２３抗原結合ドメインを有するｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、図３１で示されるような切断変異体を含むｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、図２９および３４で示されるような歪曲変異体を含むｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。

Ｃｅｎｔｒａｌ ｓｃＦｖ
本発明に特定用途が見出される１つのヘテロ二量体スキャフォールドは、図１に示されるＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、同形式は、挿入されたｓｃＦｖドメインの使用に依存することにより、第３の抗原結合ドメインを形成し、ここで２つの単量体のＦａｂ部分はＴＴＡに結合し、また「余分な」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。ｓｃＦｖドメインがＦｃドメインと単量体の一方のＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入されることで、第３の抗原結合ドメインが提供される。

この実施形態では、一方の単量体は、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖとともに、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン（および任意選択のヒンジ）ならびにＦｃドメインを含む第１の重鎖を含む。ｓｃＦｖは、重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間で任意選択のドメインリンカーを用いて共有結合される（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２−［ヒンジを含む任意選択のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３またはｓｃＦｖについて反対方向、ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２−［ヒンジを含む任意選択のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）。他方の単量体は標準的なＦａｂ側である。この実施形態では、ＴＴＡに結合する２つの同一のＦａｂを形成するため、重鎖と会合する、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖がさらに用いられる。本明細書中の実施形態の多くに関して、これらの構築物は、本明細書で所望され、記載されるように、歪曲変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加的なＦｃ変異体などを含む。

本発明は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列が図２〜図７および図６８に示されるような場合のＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ３８配列が図８〜１０に示されるようなＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ２０配列が図面で示されるようなＣＤ２０抗原結合ドメインを有するＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１９配列が図面で示されるようなＣＤ１９抗原結合ドメインを有するＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１２３配列が図面で示されるようなＣＤ１２３抗原結合ドメインを有するＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、図３１で示されるような切断変異体を含むＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、図２９および３４で示されるような歪曲変異体を含むＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

Ｃｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式
本発明に特定用途が見出される１つのヘテロ二量体スキャフォールドは、図１に示されるＣｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式である。この実施形態では、同形式は、挿入されたｓｃＦｖドメインの使用に依存することにより、第３の抗原結合ドメインを形成し、ここで２つの単量体のＦａｂ部分はＴＴＡに結合し、また「余分な」ｓｃＦｖドメインはＣＤ３に結合する。ｓｃＦｖドメインは、Ｆｃドメインと単量体のＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入されることで、第３の抗原結合ドメインが提供され、ここで各単量体はｓｃＦｖの成分を有する（例えば、一方の単量体は可変重鎖ドメインを含み、他方は可変軽鎖ドメインを含む）。

この実施形態では、一方の単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む第１の重鎖ならびに追加的な可変軽鎖ドメインを含む。軽鎖ドメインは、重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間でドメインリンカーを用いて共有結合される（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択のリンカー］−ｖｈ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。他方の単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む第１の重鎖ならびに追加的な可変重鎖ドメインを含む（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択のリンカー］−ｖｈ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。軽鎖ドメインは、重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間でドメインリンカーを用いて共有結合される。

この実施形態では、ＴＴＡに結合する２つの同一のＦａｂを形成するため、重鎖と会合する、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖がさらに用いられる。本明細書中の実施形態の多くに関して、これらの構築物は、本明細書で所望され、記載されるように、歪曲変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加的なＦｃ変異体などを含む。

本発明は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列が図２〜図７および図６８に示されるような場合のＣｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ３８配列が図８〜１０に示されるようなＣｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ２０配列が図面で示されるようなＣＤ２０抗原結合ドメインを有するＣｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１９配列が図面で示されるようなＣＤ１９抗原結合ドメインを有するＣｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１２３配列が図面で示されるようなＣＤ１２３抗原結合ドメインを有するＣｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、図３１で示されるような切断変異体を含むＣｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式を提供する。

本発明は、図２９および３４で示されるような歪曲変異体を含むＣｅｎｔｒａｌ−Ｆｖ形式を提供する。

単一アームＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ
本発明に特定用途が見出される１つのヘテロ二量体スキャフォールドは、図１に示される単一アームＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、一方の単量体がＦｃドメインのみを含む一方、他方の単量体では挿入されたｓｃＦｖドメインが用いられることにより、第２の抗原結合ドメインを形成する。この形式では、Ｆａｂ部分がＴＴＡに結合しかつｓｃＦｖがＣＤ３に結合するかまたはその逆のいずれかである。ｓｃＦｖドメインは、Ｆｃドメインと単量体の一方のＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入される。

この実施形態では、一方の単量体は、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖとともに、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む第１の重鎖を含む。ｓｃＦｖは、重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間でドメインリンカーを用いて共有結合される。第２の単量体はＦｃドメインを含む。この実施形態では、Ｆａｂを形成するため、重鎖と会合する、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖がさらに用いられる。本明細書中の実施形態の多くに関して、これらの構築物は、本明細書で所望され、記載されるように、歪曲変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加的なＦｃ変異体などを含む。

本発明は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列が図２〜図７および図６８に示されるような場合の単一アームｃｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ３８配列が図８〜１０に示されるような単一アームＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ２０配列が図面で示されるようなＣＤ２０抗原結合ドメインを有する単一アームＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１９配列が図面で示されるようなＣＤ１９抗原結合ドメインを有する単一アームＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１２３配列が図面で示されるようなＣＤ１２３抗原結合ドメインを有する単一アームＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、図３１で示されるような切断変異体を含む単一アームＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、図２９および３４で示されるような歪曲変異体を含む単一アームＣｅｎｔｒａｌ−ｓｃＦｖ形式を提供する。

二重ｓｃＦｖ形式
本発明はまた、当該技術分野で公知でありかつ図１に示されるような二重ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ配列が図２〜図７および図６８に示されるような場合の二重ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ３８配列が図８〜１０に示されるような二重ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ２０配列が図面で示されるようなＣＤ２０抗原結合ドメインを有する二重ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１９配列が図面で示されるようなＣＤ１９抗原結合ドメインを有する二重ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、抗ＣＤ１２３配列が図面で示されるようなＣＤ１２３抗原結合ドメインを有する二重ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、図３１で示されるような切断変異体を含む二重ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、図２９および３４で示されるような歪曲変異体を含む二重ｓｃＦｖ形式を提供する。

本発明は、ｐＩ変異体および／または荷電ｓｃＦｖリンカーを含む二重ｓｃＦｖ形式を提供する（一般に、いずれか一方の単量体がＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含み、他方が正荷電ｓｃＦｖリンカーを含むか、またはそれらは両方とも反対に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む）。

標的抗原
本発明の二重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合ドメイン、すなわちＣＤ３に結合するもの（一般に一価的）、および標的腫瘍抗原に結合するもの（本明細書中で「ＴＴＡ」と称される場合がある）を有する。好適な標的腫瘍抗原として、限定はされないが、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３；ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＢＣＭＡ；ＰＳＭＡ；ＳＳＴＲ２；ＳＳＴＲ５、ＣＤ１９、ＦＬＴ３、ＣＤ３３、ＰＳＣＡ、ＡＤＡＭ１７、ＣＥＡ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ−ｖＩＩＩ、ＣＤ３０、ＦＯＬＲ１、ＧＤ−２、ＣＡ−ＩＸ、Ｔｒｏｐ−２、ＣＤ７０、ＣＤ３８、メソセリン、ＥｐｈＡ２、ＣＤ２２、ＣＤ７９ｂ、ＧＰＮＭＢ、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＲＯＮ、ＥＲＢＢ２、およびＥＧＦＲが挙げられる。

「三重Ｆ」形式は、２つ（もしくは３つ以上）の異なる抗原を標的化する場合に特に有利である（本明細書で概説されるように、この標的化は、形式に応じて、一価および二価結合の任意の組み合わせであり得る）。したがって、本明細書中の免疫グロブリンは、好ましくは、２つの標的抗原に共会合する。各単量体の特異性は、本明細書中のリストから選択され得る。抗ＣＤ３結合ドメインを伴う用途としてさらに有用な二重特異性形式が図１に示される。

本明細書中のヘテロ二量体抗体の特に好適な適用は、各標的抗原に一価的に会合することが有利または重要である場合の共標的対である。かかる抗原は、例えば、免疫複合体形成時に活性化される免疫受容体であってもよい。多数の免疫受容体の細胞活性化は単に、典型的には抗体／抗原免疫複合体によって得られる架橋により、または標的細胞の会合に対するエフェクター細胞を介して生じる。一部の免疫受容体、例えばＴ細胞上のＣＤ３シグナル伝達受容体では、共会合される標的との会合時のみの活性化は、臨床状況下での非特異的架橋がサイトカインストームおよび毒性を誘発し得ることから重要である。かかる活性化は、本明細書中の免疫グロブリンを用いて、治療的にかかる抗原と多価的でなく一価的に会合することにより、一次標的抗原の微小環境下に限り、単に架橋に応答して生じる。異なる結合価を有する２つの異なる抗原を標的化する能力は、本発明の新規かつ有用な態様である。一価的に共会合することが治療的に有利または必要であり得る場合の標的抗原の例として、限定はされないが、免疫活性化受容体、例えばＣＤ３、ＦｃγＲ、ＴＬＲ４およびＴＬＲ９などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、およびケモカイン受容体が挙げられる。多数の実施形態では、抗原結合部位の１つがＣＤ３に結合し、また一部の実施形態では、それはｓｃＦｖ含有単量体である。

限定はされないが、サイトカインおよび膜結合因子（膜貫通受容体を含む）などの両方の可溶性因子を含む、標的抗原の以下のリスト：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ケト−ＰＧＦ１ａ、８−イソ−ＰＧＦ２ａ、８−オキソ−ｄＧ、Ａ１アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡ ＡＬＫ−２、アクチビンＲＩＢ ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレシン、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、α−１−抗トリプシン、α−Ｖ／β−１拮抗剤、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン、抗Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房性ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘｌ、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂリンパ球刺激物質（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃｌ、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２ ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３オステオゲニン、ＢＭＰ−４ ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、がん関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣ、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶ ＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、崩壊促進因子、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、デオキシリボヌクレアーゼ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、第ＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩｃ因子、第ＩＸ因子、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−α１、ＧＦＲ−α２、ＧＦＲ−α３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ ４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐまたはＮＩＰ−ｃａｐ）、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶ ｇＢエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ）ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ ＵＬ、造血成長因子（ＨＧＦ）、Ｈｅｐ Ｂ ｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶ ｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１２０ Ｖ３ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＦＧ ＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、インスリン様成長因子１、インテグリンα２、インテグリンα３、インテグリンα４、インテグリンα４／β１、インテグリンα４／β７、インテグリンα５（αＶ）、インテグリンα５／β１、インテグリンα５／β３、インテグリンα６、インテグリンβ１、インテグリンβ２、インターフェロンγ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在型ＴＧＦ−１、潜在型ＴＧＦ−１ ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、Ｌｅｆｔｙ、ルイスＹ抗原、ルイスＹ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺界面活性剤、黄体形成ホルモン、リンホトキシンβ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、ＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＡＳＥＳ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−α、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー管抑制因子、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡ９０、ＮＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリライシン、ニューロトロフィン−３、−４、もしくは−６、ニュールツリン、神経細胞成長因子（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−β、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−カドヘリン、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰｌＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインＣ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶ Ｆｇｐ、Ｒｅｔ、リウマトイド因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、ＳＥＲＩＮＥ、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体α／β）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、精巣ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β Ｐａｎ特異的、ＴＧＦ−β ＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−β ＲＩＩ、ＴＧＦ−β ＲＩＩｂ、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＴＧＦ−β５、トロンビン、胸腺Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−αβ、ＴＮＦ−β２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ Ｒ１ Ａｐｏ−２、ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、ＴＲＩＣＫ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ Ｒ３ ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ Ｒ４ ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ ＯＤＦ Ｒ、ＴＲＡＮＣＥＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ｒ ＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、



ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ ＲＩ ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ ＲＩＩ ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ ＴＮＦ ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣＲ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０ ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０ ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３ Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢ ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３ Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンドＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンドＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａコネクチン、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンドｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド ＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓリガンドＡｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド ＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド ＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリング受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、腫瘍関連抗原発現ルイスＹ関連炭水化物、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、ヴォン・ヴィレブランド因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ、ならびにホルモンおよび成長因子に対する受容体に属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフ、および／またはエピトープを含む実質的に任意の抗原は、本明細書中の免疫グロブリンによって標的化してもよい。

本発明の免疫グロブリンによって特異的に標的化され得る例示的な抗原として、限定はされないが、ＣＤ２０、ＣＤ１９、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＴＬＲ４およびＴＬＲ９などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、およびＴＮＦαなどのサイトカイン、ＩＬ−２Ｒなどのサイトカイン受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、ＶＥＧＦおよびＨＧＦなどの成長因子などが挙げられる。本発明の二重特異性抗体を形成するため、これらの抗原の任意の組み合わせに対する抗体を作製可能である、すなわち、これらの抗原の各々は、本発明に従う二重特異性抗体から任意選択でかつ独立して含めるかまたは除外することができる。

二重特異性抗体における特に好ましい組み合わせは、ＣＤ３に対する抗原結合ドメイン、ならびにＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ１２３に結合するドメインから選択される抗原結合ドメインであり、それらの配列は図面で示される。

本発明の核酸
本発明は、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸組成物をさらに提供する。当業者によって理解されるように、核酸組成物は、ヘテロ二量体タンパク質の形式およびスキャフォールドに依存することになる。したがって、例えば形式が、例えば三重Ｆ形式（例えば、ＦｃドメインおよびｓｃＦｖを含む第１のアミノ酸単量体、重鎖および軽鎖を含む第２のアミノ酸単量体）として３つのアミノ酸配列を必要とする場合、発現のため、３つの核酸配列が１つ以上の発現ベクターに組み込まれ得る。同様に、一部の形式（例えば、図１に開示されるような二重ｓｃＦｖ形式）では２つの核酸のみが必要であり、さらにそれらは１つもしくは２つの発現ベクターに挿入され得る。

当該技術分野で公知であるように、本発明の成分をコードする核酸は、当該技術分野で公知の、本発明のヘテロ二量体抗体を産生するために用いられる宿主細胞に応じた発現ベクターに組み込まれ得る。一般に、核酸は、幾つもの調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能なマーカー、リボソーム結合部位、誘導因子など）に作動可能に連結される。発現ベクターは、染色体外または組み込みベクターであり得る。

次に、本発明の核酸および／または発現ベクターは、多数の実施形態で用途が見出される、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）とともに、哺乳類、細菌、酵母、昆虫および／または真菌細胞を含む、当該技術分野で周知であるような幾つもの異なるタイプの宿主細胞に形質転換される。

一部の実施形態では、各単量体をコードする核酸および軽鎖をコードする任意選択の核酸は各々、形式に応じて適用可能である場合、一般に異なるまたは同じプロモーターの制御下で単一の発現ベクター内に含まれる。本発明における特定用途の実施形態では、これらの２つもしくは３つの核酸の各々は、異なる発現ベクター上に含まれる。本明細書および米国特許出願６２／０２５，９３１号明細書（本明細書で参照により援用される）に示されるように、ヘテロ二量体の形成を駆動するため、異なるベクター比を用いることができる。すなわち、意外にも、タンパク質が第１の単量体：第２の単量体：軽鎖（ヘテロ二量体抗体を含む３つのポリペプチドを有する本明細書中の多数の実施形態の場合）を１：１：２の比で含む一方、これらは最良の結果をもたらす比ではない。エラー！参照元が見出されないを参照のこと。

本発明のヘテロ二量体抗体は、当該技術分野で周知のように、発現ベクターを含む宿主細胞を培養することにより作製される。産生されると、イオン交換クロマトグラフィーステップを含む従来の抗体精製ステップが実施される。本明細書で考察のように、少なくとも０．５異なる２つの単量体のｐＩを有することで、イオン交換クロモトグラフィーまたは等電点電気泳動、または等電点に感受性がある他の方法による分離が可能であり得る。すなわち、各単量体の等電点（ｐＩ）を、各単量体が異なるｐＩを有し、かつヘテロ二量体も異なるｐＩを有するように変更するｐＩ置換を含めることにより、「三重Ｆ」ヘテロ二量体の等電点精製が容易になる（例えば、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム）。これらの置換はまた、精製後の任意の汚染性の二重ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｍＡｂホモ二量体の測定および監視を援助する（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、および分析用ＩＥＸカラム）。

治療
本発明の組成物は、作製されると、幾つかの適用において用途が見出される。ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ１２３はすべて、多数の造血器腫瘍および様々な造血器腫瘍由来の細胞株において制御されず、そのため、本発明のヘテロ二量体抗体は、がん、例えば限定はされないがすべてのＢ細胞リンパ腫および白血病、例えば限定はされないが、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、ＢおよびＴ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に用途が見出される。

したがって、本発明のヘテロ二量体組成物は、これらのがんの治療において用途が見出される。

インビボ投与用の抗体組成物
本発明に従って用いられる抗体の製剤は、貯蔵のため、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望される純度を有する抗体を任意選択の薬学的に許容できる担体、賦形剤もしくは安定剤と混合することによって調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および他の糖類、例えばグルコース、マンノース、もしくはデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはツイーン（商標）、プルロニック（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

本明細書中の製剤はまた、治療中の特定の徴候に対して必要に応じて２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに有害作用を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、他の特異性を有する抗体を提供することが望ましい場合がある。あるいは、またはさらに、本組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン、成長阻害剤および／または小分子拮抗剤を含んでもよい。かかる分子は、意図される目的に対して有効な量で好適に共存する。

活性成分はまた、コロイド状薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションで、例えばコアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば各々、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリル酸）マイクロカプセルに封入してもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

インビボ投与として用いられるべき製剤は、滅菌またはほぼ滅菌されるべきである。これは滅菌濾過膜を介する濾過により、容易に達成される。

徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適例として抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、マトリックスは、成型物、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、もしくはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばリュープロンデポー（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドからなる注射用マイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーが１００日超にわたる分子の放出を可能にする一方、特定のハイドロゲルはタンパク質をより短い期間放出する。

被包された抗体は、体内で長期間残存するとき、３７℃で水分に曝される結果として変性または凝集し得、生物学的活性の低下および免疫原性におけるあり得る変化をもたらす。安定化のため、関与する機構に依存した合理的戦略が考案され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−−Ｓ結合の形成であることが発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥化し、水分含量を制御し、適切な添加剤を用い、また特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、達成され得る。

投与様式
本発明の抗体および化学療法剤は、公知の方法、例えばボーラスとしての静脈内投与に従い、または長期間にわたる持続注入により、筋肉内、腹腔内、大脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路により、被験者に投与される。抗体の静脈内または皮下投与が好ましい。

治療様式
本発明の方法では、疾患もしくは状態に対して正の治療応答を提供するような治療法が用いられる。「正の治療応答」は、疾患もしくは状態における改善、および／または疾患もしくは状態に関連した症状における改善が意図される。例えば、正の治療応答であれば、疾患における以下の改善、すなわち、（１）腫瘍性細胞数の減少；（２）腫瘍性細胞死の増加；（３）腫瘍性細胞生存の阻害；（５）腫瘍成長の阻害（すなわち、ある程度の緩徐化、好ましくは停止）；（６）患者生存率の増加；および（７）疾患もしくは状態に関連した１つ以上の症状からの部分的緩和のうちの１つ以上を指すことになる。

任意の所与の疾患もしくは状態における正の治療応答は、その疾患もしくは状態に特異的な標準化された応答判定基準によって判定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャンイメージング、内視鏡検査、ならびに骨髄吸引（ＢＭＡ）を含む腫瘍生検サンプリングおよび循環中の腫瘍細胞の計数などのスクリーニング技術を用いて、腫瘍形態学上の変化（すなわち、全腫瘍負荷量、腫瘍サイズなど）について評価され得る。

これらの正の治療応答に加えて、治療を受けている被験者は、疾患に関連した症状における改善の有益な効果を経験し得る。

疾患における改善は、完全寛解として特徴付けてもよい。「完全寛解」は、骨髄腫の症例における、任意の過去の異常なＸ線撮影試験、骨髄、および脳脊髄液（ＣＳＦ）または異常なモノクローナルタンパク質の正常化とともに、臨床的に検出可能な疾患が存在しないことが意図される。

かかる応答は、本発明の方法に従う治療後、少なくとも４〜８週間、またはときとして６〜８週間持続し得る。あるいは、疾患における改善は、部分寛解であるものとして分類してもよい。「部分寛解」は、４〜８週間、または６〜８週間持続し得る、新しい病変の不在下での、あらゆる測定可能な腫瘍負荷量（すなわち、被験者中に存在する悪性細胞の数、または測定される大量の腫瘤または異常なモノクローナルタンパク質の量）における少なくとも約５０％の低下が意図される。

本発明に従う治療は、用いられる薬剤の「治療有効量」を含む。「治療有効量」は、所望される治療結果を得るための用量および必要な期間での有効な量を指す。

治療有効量は、個人の病態、年齢、性別、および体重などの要素、ならびに薬剤が個人において所望される応答を誘起する能力に従って変化し得る。治療有効量はまた、抗体または抗体部分の任意の有毒または有害な効果を治療的に有益な効果が上回る場合のものである。

腫瘍治療における「治療有効量」はまた、疾患の進行を安定化させるその能力により測定してもよい。がんを阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してもよい。

あるいは、組成物のこの特性は、細胞成長を阻害するかまたはアポトーシスを誘導する化合物の能力を熟練施術者に公知のインビトロアッセイにより試験することによって評価してもよい。治療化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを減少させ得るか、または代わりに被験者における症状を寛解させ得る。当業者であれば、被験者のサイズ、被験者の症状の重症度、および選択される特定組成物または投与経路などの要素に基づいてかかる量を決定できることになる。

投与計画は、所望される最適応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、治療状況の緊急事態で示されるように、単回ボーラスを投与してもよく、数回の分割用量を経時的に投与してもよく、またはその用量は比例的に減少または増加させてもよい。非経口組成物は、投与の容易性および用量の均一性のため、用量単位形態で調合してもよい。用量単位形態は、本明細書で用いられるとき、治療されるべき被験者に対して単位用量として適した物理的に分かれた単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体との関連で所望される治療効果をもたらすように算出される所定量の活性化合物を含有する。

本発明の用量単位形態に対する仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のため、かかる活性化合物を調合するうえでの当該技術分野での固有の制限によって指定され、それらに直接的に依存する。

本発明で用いられる二重特異性抗体における効果的用量および投与計画は、治療されるべき疾患または状態に依存し、当業者によって決定してもよい。

本発明で用いられる二重特異性抗体の治療有効量における例示的な非限定的範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５、例えば約０．３、約１、または約３ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、抗体は、１ｍｇ／ｋｇ以上の用量、例えば１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。

当該技術分野における通常の技能を有する医療従事者は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師であれば、医薬組成物中に用いられる薬剤の投与を所望される治療効果を得るために必要とされるレベルより低いレベルで開始し、所望される効果が得られるまで用量を漸増させることができる。

一実施形態では、二重特異性抗体は、１０〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば２００〜４００ｍｇ／ｋｇの週用量で注入により投与される。かかる投与は、例えば１〜８回、例えば３〜５回、反復してもよい。投与は、２〜２４時間、例えば２〜１２時間の期間にわたり、持続注入により実施してもよい。

一実施形態では、二重特異性抗体は、毒性を含む副作用の低減が必要である場合、例えば２４時間を超えるような長期間にわたっての緩徐な持続注入により投与される。

一実施形態では、二重特異性抗体は、２５０ｍｇ〜２０００ｍｇ、例えば３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇもしくは２０００ｍｇなどの週用量で最大で８回、例えば４〜６回投与される。投与は、２〜２４時間、例えば２〜１２時間の期間にわたる持続注入により実施してもよい。かかるレジメンは、例えば６か月もしくは１２か月後、必要に応じて１回以上反復してもよい。用量は、投与時、血液中の本発明の化合物の量を、例えば生物学的試料を採取し、二重特異性抗体の抗原結合領域を標的化する抗イディオタイプ抗体を用いることにより測定することによって決定または調節してもよい。

さらなる実施形態では、二重特異性抗体は、２〜１２週間、例えば３〜１０週間、例えば４〜８週間、毎週１回投与される。

一実施形態では、二重特異性抗体は、例えば６か月以上の期間にわたって週に１回のような維持治療により投与される。

一実施形態では、二重特異性抗体は、二重特異性抗体の１回の注入と、その後の放射性同位元素に複合させた二重特異性抗体の注入とを含むレジメンにより投与される。レジメンは、例えば７〜９日後、反復してもよい。

非限定例として、本発明に従う治療は、単回または２４、１２、８、６、４、もしくは２時間ごとの分割用量、または任意の組み合わせを用いて、１日あたり約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｍｇ／ｋｇの量での抗体の一日量として、治療の開始後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０日目に少なくとも１回、または代わりに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０週目に少なくとも１回、またはそれらの任意の組み合わせとして提供してもよい。

一部の実施形態では、その二重特異性抗体分子は、１つ以上の追加的な治療薬、例えば化学療法剤と併用される。ＤＮＡ損傷化学療法剤の非限定例として、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシンおよびそれらの類似体もしくは代謝産物、およびドキソルビシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、およびダウノルビシン）；アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、およびシクロホスファミド）；ＤＮＡ干渉物質（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン）；ＤＮＡ干渉物質および遊離ラジカル発生剤、例えばブレオマイシン；およびヌクレオシドミメティック（例えば、５−フルオロウラシル、カペシチビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、およびヒドロキシ尿素）が挙げられる。

細胞複製を破壊する化学療法剤として、パクリタキセル、ドセタキセル、および関連類似体；ビンクリスチン、ビンブラスチン、および関連類似体；サリドマイド、レナリドミド、および関連類似体（例えば、ＣＣ−５０１３およびＣＣ−４０４７）；タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブおよびゲフィチニブ）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）；ＩκＢキナーゼの阻害剤を含むＮＦ−κＢ阻害剤；がんにおいて過剰発現されるタンパク質に結合し、それにより細胞複製を下方制御する抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、およびベバシズマブ）；およびがんにおいて上方制御、過剰発現または活性化されることが公知のタンパク質または酵素の他の阻害剤（それらの阻害により細胞複製が下方制御される）が挙げられる。

一部の実施形態では、本発明の抗体は、ベルケイド（登録商標）（ボルテゾミブ）での治療前、治療と同時、または治療後に用いることができる。

すべての引用される参考文献は、それらの全体が参照により本明細書中に明示的に援用される。

本発明の特定の実施形態が例示目的で説明されているが、詳細の極めて多数の変形形態が、添付の特許請求の範囲に記載されるような本発明から逸脱することなくなされ得ることは当業者によって理解されるであろう。

本発明を例示するため、実施例が以下に提供される。これらの実施例は、本発明を任意の特定の適用または動作理論に限定することを意味しない。本発明で考察されるあらゆる定常領域位置についての付番は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、全体として参照により援用される）。抗体に関する当業者は、この慣習が免疫グロブリン配列の特定領域内での非連続的な付番からなり、免疫グロブリンファミリー中の保存された位置に対する規準化された参照を可能にすることを理解するであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義されるような任意の所与の免疫グロブリンの位置は、その連続的配列に必ずしも対応しないことになる。

一般および特定の科学技術は、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２９号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０２８８２７５号明細書および国際公開第２０１４／１４５８０６号パンフレット（これらのすべては、その全体および特にその中に概説される技術が、参照により明示的に援用される）に概説されている。

実施例
実施例１：代替形式
二重特異体の産生
抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異体の模式図を図１に示す。抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異体の代替形式としてのアミノ酸配列を図３９〜図４３に列挙する。二重特異性の発現にとって必要とされる３本の鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子合成（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）により作製し、標準の分子生物学技術を用いて発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。部位特異的変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ Ｃｒｅｅｋ，Ｔｅｘ．）または追加的な遺伝子合成およびサブクローニングのいずれかを用いて置換を導入した。発現のため、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞にＤＮＡを遺伝子導入し、得られたタンパク質を、プロテインＡ親和性（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて上清から精製した。プロテインＡアフィニティー精製後の収率を図３５に示す。陽イオン交換クロマトグラフィー精製を、５０ｍＭ ＭＥＳの洗浄／平衡化緩衝液（ｐＨ６．０）および５０ｍＭ ＭＥＳの溶出緩衝液（ｐＨ６．０＋１Ｍ ＮａＣｌ直線勾配）を有するＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した（クロマトグラムについては図３６を参照）。

再誘導されたＴ細胞細胞傷害性
抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異体を、ＣＤ３８^＋ＲＰＭＩ８２６６骨髄腫細胞株の再誘導されたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）についてインビトロで特徴付けた。１０ｋのＲＰＭＩ８２６６細胞を、５００ｋのヒトＰＢＭＣとともに２４時間インキュベートした。ＲＴＣＣを、図示のようにＬＤＨ蛍光により測定した（図３７を参照）。

実施例２
再誘導されたＴ細胞細胞傷害性
抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異体を、ＣＤ３８＋ＲＰＭＩ８２６６骨髄腫細胞株の再誘導されたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）についてインビトロで特徴付けた。４０ｋのＲＰＭＩ８２６６細胞を、４００ｋのヒトＰＢＭＣとともに９６時間インキュベートした。ＲＴＣＣを、図示のようにフローサイトメトリーにより測定した（図４４を参照）。ＣＤ６９、Ｋｉ−６７、およびＰＩ−９のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞発現についてもフローサイトメトリーにより特徴付けたが、それを図４５に示す。

抗腫瘍活性のマウスモデル
−２３日目、ＮＯＤ重症複合免疫不全γ（ＮＳＧ）マウス５匹からなる４つの群の各々に、５×１０^６のＲＰＭＩ８２２６ＴｒＳ腫瘍細胞（多発性骨髄腫、ルシフェラーゼを発現する）を静脈内尾静脈注射により移植した。０日目、マウスの腹腔内に１０×１０^６のヒトＰＢＭＣを移植した。０日目のＰＢＭＣの移植後、被験物を毎週（０、７日目）、図４に表示される用量レベルで腹腔内注射により投与する。試験設計を図４６にさらにまとめる。腫瘍成長を、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ（登録商標））を用いて全フラックス／マウスを測定することにより監視した。ＸｍＡｂ１３５５１およびＸｍＡｂ１５４２６の両方は、実質的な抗腫瘍効果を示した（図４７および図４８を参照）。

カニクイザルにおける試験
カニクイザルに抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異体を単回用量で与えた。抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３二重特異性対照も含めた。用量レベルは、（３つの独立試験において）２０μｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１３５５１（ｎ＝２）、０．５ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１５４２６（ｎ＝３）、３ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１４７０２（ｎ＝３）、または３ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１３２４５（抗ＲＳＶ×抗ＣＤ３対照、ｎ＝３）であった。抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異体は、末梢血中のＣＤ３８＋細胞を迅速に枯渇させた（図４９を参照）。抗ＣＤ３８×抗ＣＤ３二重特異体は、ＣＤ６９の発現による測定の通り、Ｔ細胞活性化をもたらした（図５０を参照）。ＩＬ−６の血清レベルも測定した（図５１を参照）。ＸｍＡｂ１３５５１と比べて、ＸｍＡｂ１５４２６がＣＤ３８＋細胞の枯渇の持続時間延長とＴ細胞活性化およびＩＬ−６産生のレベル低下とを有したことは注目すべきである。

ＸｍＡｂ１５４２６およびＸｍＡｂ１４７０２は各々、０．５ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの単回用量で試験した。両方の抗体は、これらのより高用量で良好な耐容性を示し、治療したサル由来の血清中で認められた中等度レベルのＩＬ６に一致した。さらに、中程度のＣＤ３親和性を有するＸｍＡｂ１５４２６は、０．５ｍｇ／ｋｇでＣＤ３８＋細胞を、２、５もしくは２０μｇ／ｋｇで投与した元の高親和性のＸｍＡｂ１３５５１と比べてより効果的に枯渇させた。ＸｍＡｂ１５４２６による枯渇は、先行試験における最高用量のＸｍＡｂ１３５５１と比べてより持続的であった（各々、７日対２日）。特に、標的細胞の枯渇はＸｍＡｂ１５４２６においてより著しかったが、Ｔ細胞活性化（ＣＤ６９、ＣＤ２５およびＰＤ１誘導）は、２０μｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１３５５１群よりもさらに２５倍高く投与したＸｍＡｂ１５４２６で治療したサルにおいて大幅により低かった。極めて低いＣＤ３親和性を有するＸｍＡｂ１４７０２は、ＣＤ３８＋細胞およびＴ細胞活性化に対する効果をほとんど有しなかった。

これらの結果によると、ＣＤ３親和性を減弱させることによりＴ細胞活性化を調節することは、Ｔ細胞に会合する二重特異性抗体の治療ウインドウを改善するための有望な方法であることが示される。この方法は、ＣＤ３８などの標的との抗原のシンククリアランス（ｓｉｎｋ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を克服するため、耐容性を改善し、より高用量の投与を可能にすることにより、標的化されたＴ細胞免疫療法に適している抗原のセットを拡大する可能性を有する。我々は、ＣＤ３に対する親和性を低減することにより、ＸｍＡｂ１５４２６がＣＤ３８＋細胞を効果的に枯渇させる一方、その高親和性対応物であるＸｍＡｂ１３５５１と同等の用量で認められるＣＲＳ効果を最小化することを示した。

実施例３
ＣＤ１２３に対するＣＤＲの開発
ヒト化抗体ＦａｂヒトＣＤ１２３に向けたＣＤＲ開発の出発点は、ＡＴＣＣ ＨＢ−１２００９からの「７Ｇ３ Ｈ０Ｌ０」と本明細書で呼ばれる７Ｇ３マウス抗体の可変および軽鎖の領域とした。しかしながら、最初のヒト化（Ｈ１＿Ｌ１；図１３６に示される配列）は、親和性のかなりの損失をもたらした（図１５６ＢおよびＣに示されるように５〜１０倍の親和性）。親和性のこの損失は、Ｈ１＿Ｌ０構築物について示されるように、大部分が重鎖ヒト化によるものであり（例えば、マウス軽鎖を有する第１のヒト化重鎖）、Ｈ１＿Ｌ１構築物は１０倍のかなりの損失を示した。これは、ＣＤ１２３を発現するＫＧ１ａ細胞に対して試験した場合、図１５６Ｄに示されるように、ＲＴＣＣ（Ｔ細胞細胞傷害性の再誘導）効力の１０倍の損失と一致した。

したがって、親和性／安定性最適化を２ラウンド実行した。第１ラウンド（図１５７に示される「ライブラリー１」）は、ＬＤＡ、標的、および復帰置換を含む１０８の変異体の生成であり、これらを次にＣＤ１２３チップ上でＦａｂ形式（ＩｇＧ１からのヒトＣＨ１に融合されたヒト化可変重鎖ドメイン）で親和性スクリーニングし、中性（neutral）およびより高い親和性の変異体の安定性をＤＳＦでスクリーニングした。

図１５８に示されるように、最初のＨ１Ｌ１変異体のＴｍは、出発Ｈ０Ｌ０と比較して増加し、Ｈ１Ｌ１親のさらなる変異体の結果を図１５８に示す。

ラウンド１変異体を、次に、本明細書でさらに概説されるように、ＣＤ３に対するｓｃＦｖおよび開発したＦａｂを使用してボトルオープナー形式に組み込み、次に、図１５９に示されるようにＫＧ−１ａ結合アッセイおよびＲＴＣＣアッセイにおいて試験した。最適化の第１ラウンドは変異体の親和性および有効性を改善したが、さらなる最適化が必要とされた。

図１６０に示される第２ラウンド、「ラウンド２」は、Ｈ０Ｌ０のマウスレベルまでの結合親和性の回復およびＲＴＣＣ活性の回復をもたらした。最適な変異体、ＸＥＮＰ１４０４５は、第１のヒト化配列と比較して親和性が改善し（Ｈ１Ｌ１；Ｈ１Ｌ１に対して＋２１倍の改善を示す）、親マウス抗体（７Ｇ３；Ｈ０Ｌ０）に対して活性も２倍増加した。ＸＥＮＰ１３９６７は、ＣＤ１２３側でＸＥＮＰ１４０４５と均等物であることに注目されたい。１３９６７は配列中に示されるように異なるＣＤ３ ｓｃＦｖを有する。

ラウンド２最適化はまた、Ｔｍによって測定されるように安定性の増加をもたらした。図１６１は、Ｔｍアッセイの結果を示し、ＸＥＮＰ１３９６７（同様にＸＥＮＰ１４０４５）は、最初のキメラ（例えば、可変重鎖および軽鎖マウス配列）に対して＋５Ｃ、最初のＨ１Ｌ１変異体と比較して＋４Ｃ改善した。１３９６７／１４０４５は、最初のＨ１Ｌ１配列と比較して１１の置換を有する）。加えて、第２ラウンド中、可能性として考えられる脱アミド部位（−ＮＳモチーフ）を軽鎖ＣＤＲ１から除去した。

実施例４
ＣＤ２０に対するＣＤＲの開発
２つの抗ＣＤ２０ Ｆａｂを、結合親和性および有効性についてＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性形式の構成で調査した。ＸＥＮＰ１３６７７およびＸＥＮＰ１３６７６の両方はリツキシマブをベースとする。１３６７７変異体は、１３６７６変異体に比べて有意に増強された効力を表し、このＣＤ２０親和性は、親のリツキシマブ抗体に近い。両方の二重特異性抗体を、それらのインビボ特性を比較するためにカニクイザル研究において投与した。しかしながら、１３６７７変異体のより高い効力のために、１３６７７変異体は、効力がより低い１３６７６について投与した０．３ｍｇ／ｋｇに対して、０．０３ｍｇ／ｋｇの１０倍低い用量で投与した。これらの用量で、両方の抗体はサルＢ細胞を有意に枯渇させた。しかしながら、驚くべきことに、有意により効力のある１３６７７は、実際には、そのより低い用量でＢ細胞のより迅速な回復を示した。他方で、両方の抗体は、ほぼ同じ量のＩＬ６放出を引き起こした。結論として、親和性がより低い変異体１３６７６は、予想外にも、より好都合な治療プロファイルを表し、同様のレベルのＩＬ６を維持しながらＢ細胞のより長期の枯渇を引き起こす。

Claims (72)

1. ａ）第１の単量体であって、
   ｉ）第１の重鎖であって、
   １）第１の可変重鎖ドメイン；
   ２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖；
   ３）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＣ末端に共有結合されたｓｃＦｖ
   を含む第１の重鎖
   含む第１の単量体と；
   ｂ）第２の可変重鎖ドメイン、および第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む、第２の重鎖を含む第２の単量体と；
   ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と
   を含み、前記第１および前記第２のＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインは第１の標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合し、前記第２の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインは前記第１のＴＴＡに結合し、かつ前記ｓｃＦｖはヒトＣＤ３（配列番号ＸＸ）に結合する、ヘテロ二量体抗体。
2. 前記ｓｃＦｖが、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３５５１）、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１５４２６）、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３４２３）および配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１４７０２）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項１に記載のヘテロ二量体抗体。
3. 前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ１２３からなる群から選択されるＴＴＡに結合する、請求項１または２に記載のヘテロ二量体抗体。
4. ａ）第１の単量体であって、
   ｉ）第１の重鎖であって、
   １）第１の可変重鎖ドメイン；
   ２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメイン；および
   ３）ドメインリンカーを用いて前記第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合された第１の可変軽鎖ドメイン
   を含む第１の重鎖
   を含む第１の単量体と；
   ｂ）第２の単量体であって、
   ｉ）第２の可変重鎖ドメイン；
   ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメイン；および
   ｉｉｉ）前記第２の可変重鎖ドメインがドメインリンカーを用いて前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合されている、第３の可変重鎖ドメイン
   を含む第２の単量体と；
   ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と
   を含み、前記第１および前記第２のＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインは第１のＴＴＡに結合し、前記第２の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインは前記ＴＴＡに結合し、かつ前記第２の可変軽鎖ドメインおよび前記第３の可変重鎖ドメインはＣＤ３に結合する、ヘテロ二量体抗体。
5. 前記ｓｃＦｖが、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３５５１）、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１５４２６）、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３４２３）および配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１４７０２）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項４に記載のヘテロ二量体抗体。
6. 前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ１２３からなる群から選択されるＴＴＡに結合する、請求項４または５に記載のヘテロ二量体抗体。
7. ａ）第１の単量体であって、
   ｉ）第１の重鎖であって、
   １）第１の可変重鎖ドメイン；
   ２）第１のＣＨ１ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖；
   ３）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合されたｓｃＦｖ
   を含む第１の重鎖
   を含む第１の単量体と；
   ｂ）第２の可変重鎖ドメイン、および第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖を含む、第２の重鎖を含む第２の単量体と；
   ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と
   を含み、前記第１および前記第２のＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインは第１のＴＴＡに結合し、前記第２の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインは前記ＴＴＡに結合し、かつ前記ｓｃＦｖはヒトＣＤ３に結合する、ヘテロ二量体抗体。
8. 前記ｓｃＦｖが、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３５５１）、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１５４２６）、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３４２３）および配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１４７０２）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項７に記載のヘテロ二量体抗体。
9. 前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ１２３からなる群から選択されるＴＴＡに結合する、請求項７または８に記載のヘテロ二量体抗体。
10. ａ）第１の単量体であって、
    ｉ）第１の重鎖であって、
    １）第１の可変重鎖ドメイン；
    ２）第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメイン；および
    ３）前記第２の可変軽鎖ドメインがドメインリンカーを用いて前記第１の定常重鎖ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合されている、第１の可変軽鎖ドメイン
    を含む第１の重鎖
    を含む第１の単量体と；
    ｂ）第２の単量体であって、
    ｉ）第２の可変重鎖ドメイン；
    ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメイン；および
    ｉｉｉ）前記第２の可変重鎖ドメインがドメインリンカーを用いて前記第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合されている、第３の可変重鎖ドメイン
    を含む第２の単量体と；
    ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通軽鎖と
    を含み、前記第１および前記第２のＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインは第１のＴＴＡに結合し、前記第２の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインは前記ＴＴＡに結合し、かつ前記第２の可変軽鎖ドメインおよび前記第３の可変重鎖ドメインはヒトＣＤ３に結合する、ヘテロ二量体抗体。
11. 前記ｓｃＦｖが、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３５５１）、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１５４２６）、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３４２３）および配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１４７０２）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項１０に記載のヘテロ二量体抗体。
12. 前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ１２３からなる群から選択されるＴＴＡに結合する、請求項１０または１１に記載のヘテロ二量体抗体。
13. ａ）第１の単量体であって、
    ｉ）第１の重鎖であって、
    １）第１の可変重鎖ドメイン；
    ２）第１のＣＨ１ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖；
    ３）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＣＨ１ドメインのＣ末端と前記第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合されたｓｃＦｖ
    を含む第１の重鎖
    を含む第１の単量体と；
    ｂ）第２のＦｃドメインを含む第２の単量体と；
    ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と
    を含み、前記第１および前記第２のＦｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ；Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ；Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７ＬおよびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されるアミノ酸置換のセットを有し、前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインは第１の抗原に結合し、前記ｓｃＦｖは第２の抗原に結合する、ヘテロ二量体抗体。
14. 前記ｓｃＦｖが、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３５５１）、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１５４２６）、配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１３４２３）および配列番号ＸＸ（ｓｃＦｖ１４７０２）からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する、請求項１３に記載のヘテロ二量体抗体。
15. 前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ１２３からなる群から選択されるＴＴＡに結合する、請求項１３または１４に記載のヘテロ二量体抗体。
16. ａ）配列ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメインと；
    ｂ）配列ＴＹＡＭＮ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＲＩＲＳＫＡＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメインと
    を含む抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
17. ｓｃＦｖである、請求項１６に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
18. 前記可変軽鎖ドメインが配列Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）を有し、かつ前記可変重鎖ドメインが配列Ｈ１．３２（配列番号ＸＸ）を有する、請求項１６または１７に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
19. 前記ｓｃＦｖが配列Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）を有する、請求項１８に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
20. 請求項１９に記載のｓｃＦｖをコードする核酸組成物。
21. 請求項２０に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
22. 請求項２１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
23. ａ）配列ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメインと；
    ｂ）配列ＴＹＡＭＮ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＨＧＮＦＧＤＥＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメインと
    を含む抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
24. ｓｃＦｖである、請求項２３に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
25. 前記可変軽鎖ドメインが配列Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）を有し、かつ前記可変重鎖ドメインが配列Ｈ１．８９（配列番号ＸＸ）を有する、請求項２３または２４に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
26. 前記ｓｃＦｖが配列Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）を有する、請求項２３に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
27. 請求項２６に記載のｓｃＦｖをコードする核酸組成物。
28. 請求項２７に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
29. 請求項２８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
30. ａ）配列ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメインと；
    ｂ）配列ＴＹＡＭＮ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＨＧＮＦＧＤＰＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメインと
    を含む抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
31. ｓｃＦｖである、請求項３０に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
32. 前記可変軽鎖ドメインが配列Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）を有し、かつ前記可変重鎖ドメインが配列Ｈ１．９０（配列番号ＸＸ）を有する、請求項３０または３１に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
33. 前記ｓｃＦｖが配列Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）を有する、請求項３０に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
34. 請求項３３に記載のｓｃＦｖをコードする核酸組成物。
35. 請求項３４に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
36. 請求項３５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
37. ａ）配列ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメインと；
    ｂ）配列ＴＹＡＭＮ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＤＹ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメインと
    を含む抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
38. ｓｃＦｖである、請求項３７に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
39. 前記可変軽鎖ドメインが配列Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）を有し、かつ前記可変重鎖ドメインが配列Ｈ１．３３（配列番号ＸＸ）を有する、請求項３７または３８に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
40. 前記ｓｃＦｖが配列Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）を有する、請求項３８に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
41. 請求項３８に記載のｓｃＦｖをコードする核酸組成物。
42. 請求項４１に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
43. 請求項４２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
44. ａ）配列ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメインと；
    ｂ）配列ＴＹＡＭＳ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメインと
    を含む抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
45. ｓｃＦｖである、請求項４４に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
46. 前記可変軽鎖ドメインが配列Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）を有し、かつ前記可変重鎖ドメインが配列Ｈ１．３１（配列番号ＸＸ）を有する、請求項４４または４５に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
47. 前記ｓｃＦｖが配列Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）を有する、請求項４６に記載の抗ＣＤ３抗体結合ドメイン。
48. 請求項４７に記載のｓｃＦｖをコードする核酸組成物。
49. 請求項４８に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
50. 請求項４９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
51. ａ）第１の単量体であって、
    ｉ）第１のＦｃドメイン；
    ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ
    を含む第１の単量体と；
    ｂ）第２の単量体であって、
    ｉ）重鎖可変ドメイン；および
    ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン
    を含む重鎖を含む第２の単量体と；
    ｃ）可変軽鎖ドメインおよび可変軽定常ドメインを含む軽鎖と
    を含み、前記抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、抗ＣＤ３Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）、抗ＣＤ３Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）、抗ＣＤ３Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）および抗ＣＤ３Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７（配列番号ＸＸ）からなる群から選択され、かつ前記重可変ドメインおよび前記軽可変ドメインはＴＴＡに結合する、ヘテロ二量体抗体。
52. 前記ＴＴＡがＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ１２３からなる群から選択される、請求項５１に記載のヘテロ二量体抗体。
53. ａ）配列ＲＡＳＷＳＶＳＹＩＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＱＱＷＴＨＮＰＰＴ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメインと；
    ｂ）配列ＳＹＮＭＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＡＩＹＰＧＮＧＡＴＳＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＳＹＹＭＧＧＤＷＹＦＤＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメインと
    を含む抗ＣＤ２０抗体結合ドメイン。
54. 前記可変軽鎖ドメインが配列Ｃ２Ｂ８Ｌ１．１１３（配列番号ＸＸ）を有し、かつ前記可変重鎖ドメインが配列Ｃ２Ｂ８Ｈ１．２０２（配列番号ＸＸ）を有する、請求項５３に記載の抗ＣＤ２０抗体結合ドメイン。
55. 請求項５３に記載の結合ドメインをコードする核酸組成物。
56. 請求項５５に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
57. 請求項５６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
58. ａ）配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメインと；
    ｂ）配列ＳＹＮＭＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメインと
    を含む抗ＣＤ２０抗体結合ドメイン。
59. 前記可変軽鎖ドメインが配列Ｃ２Ｂ８Ｌ１（配列番号ＸＸ）を有し、かつ前記可変重鎖ドメインが配列Ｃ２Ｂ８Ｈ１（配列番号ＸＸ）を有する、請求項５８に記載の抗ＣＤ２０抗体結合ドメイン。
60. 請求項５８に記載の結合ドメインをコードする核酸組成物。
61. 請求項６０に記載の核酸組成物を含む発現ベクター。
62. 請求項６１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
63. ａ）第１の単量体であって、
    ｉ）第１のＦｃドメイン；
    ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ
    を含む第１の単量体と；
    ｂ）第２の単量体であって、
    ｉ）重鎖可変ドメイン；および
    ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン
    を含む重鎖を含む第２の単量体と；
    ｃ）可変軽鎖ドメインおよび可変軽定常ドメインを含む軽鎖と
    を含み、前記可変軽鎖ドメインは、配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含み、かつ前記可変重鎖ドメインは、配列ＳＹＮＭＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む、ヘテロ二量体抗体。
64. ａ）第１の単量体であって、
    ｉ）第１のＦｃドメイン；
    ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ
    を含む第１の単量体と；
    ｂ）第２の単量体であって、
    ｉ）重鎖可変ドメイン；および
    ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン
    を含む重鎖を含む第２の単量体と；
    ｃ）可変軽鎖ドメインおよび可変軽定常ドメインを含む軽鎖と
    を含み、前記可変軽鎖ドメインは、配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＡＴＳＮＬＡＳ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含み、かつ前記可変重鎖ドメインは、配列ＳＹＮＭＨ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む、ヘテロ二量体抗体。
65. ａ）第１の単量体であって、
    ｉ）第１のＦｃドメイン；
    ｉｉ）ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含み、ドメインリンカーを用いて前記ＦｃドメインのＮ末端に共有結合された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ
    を含む第１の単量体と；
    ｂ）第２の単量体であって、
    ｉ）重鎖可変ドメイン；および
    ｉｉ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン
    を含む重鎖を含む第２の単量体と；
    ｃ）可変軽鎖ドメインおよび可変軽定常ドメインを含む軽鎖と
    を含み、前記可変軽鎖ドメインは、配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＧＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ１、配列ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ２、および配列ＱＮＤＹＳＹＰＹＴ（配列番号ＸＸ）を有するｖｌＣＤＲ３を含み、かつ前記可変重鎖ドメインは、配列ＤＹＹＭＫ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ１、配列ＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ２、および配列ＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹ（配列番号ＸＸ）を有するｖｈＣＤＲ３を含む、ヘテロ二量体抗体。
66. ＸＥＮＰ１５０４９、ＸＥＮＰ１５０５１；ＸＥＮＰ１５０５０、ＸＥＮＰ１３６７６、ＸＥＮＰ１４６９６、ＸＥＮＰ１５６２９、ＸＥＮＰ１５０５３、ＸＥＮＰ１５６３０、ＸＥＮＰ１５６３１、ＸＥＮＰ１５６３２、ＸＥＮＰ１５６３３、ＸＥＮＰ１５６３４、ＸＥＮＰ１５６３５、ＸＥＮＰ１５６３６、ＸＥＮＰ１５６３８、ＸＥＮＰ１５６３９、ＸＥＮＰ１３６７７、ＸＥＮＰ１４３８８、ＸＥＮＰ１４３８９、ＸＥＮＰ１４３９０、ＸＥＮＰ１４３９１、ＸＥＮＰ１４３９２、ＸＥＮＰ１４３９３、ＸＥＮＰ１６３６６、ＸＥＮＰ１６３６７、ＸＥＮＰ１６３６８、ＸＥＮＰ１６３６９、ＸＥＮＰ１６３７０、ＸＥＮＰ１６３７１、ＸＥＮＰ１６３７２、ＸＥＮＰ１６３７３、ＸＥＮＰ１６３７５、ＸＥＮＰ１６３７６およびＸＥＮＰ１６３７７からなる群から選択されるヘテロ二量体抗体。
67. ＸＥＮＰ１５０４９、ＸＥＮＰ１５０５１；ＸＥＮＰ１５０５０、ＸＥＮＰ１３６７６、ＸＥＮＰ１４６９６、ＸＥＮＰ１５６２９、ＸＥＮＰ１５０５３、ＸＥＮＰ１５６３０、ＸＥＮＰ１５６３１、ＸＥＮＰ１５６３２、ＸＥＮＰ１５６３３、ＸＥＮＰ１５６３４、ＸＥＮＰ１５６３５、ＸＥＮＰ１５６３６、ＸＥＮＰ１５６３８、ＸＥＮＰ１５６３９、ＸＥＮＰ１３６７７、ＸＥＮＰ１４３８８、ＸＥＮＰ１４３８９、ＸＥＮＰ１４３９０、ＸＥＮＰ１４３９１、ＸＥＮＰ１４３９２、ＸＥＮＰ１４３９３、ＸＥＮＰ１６３６６、ＸＥＮＰ１６３６７、ＸＥＮＰ１６３６８、ＸＥＮＰ１６３６９、ＸＥＮＰ１６３７０、ＸＥＮＰ１６３７１、ＸＥＮＰ１６３７２、ＸＥＮＰ１６３７３、ＸＥＮＰ１６３７５、ＸＥＮＰ１６３７６およびＸＥＮＰ１６３７７からなる群から選択されるヘテロ二量体抗体をコードする３つの核酸を含む核酸組成物。
68. 発現ベクター組成物であって、それぞれ核酸を含有する３つの発現ベクターを含み、それにより、前記３つの発現ベクターは、ＸＥＮＰ１５０４９、ＸＥＮＰ１５０５１；ＸＥＮＰ１５０５０、ＸＥＮＰ１３６７６、ＸＥＮＰ１４６９６、ＸＥＮＰ１５６２９、ＸＥＮＰ１５０５３、ＸＥＮＰ１５６３０、ＸＥＮＰ１５６３１、ＸＥＮＰ１５６３２、ＸＥＮＰ１５６３３、ＸＥＮＰ１５６３４、ＸＥＮＰ１５６３５、ＸＥＮＰ１５６３６、ＸＥＮＰ１５６３８、ＸＥＮＰ１５６３９、ＸＥＮＰ１３６７７、ＸＥＮＰ１４３８８、ＸＥＮＰ１４３８９、ＸＥＮＰ１４３９０、ＸＥＮＰ１４３９１、ＸＥＮＰ１４３９２、ＸＥＮＰ１４３９３、ＸＥＮＰ１６３６６、ＸＥＮＰ１６３６７、ＸＥＮＰ１６３６８、ＸＥＮＰ１６３６９、ＸＥＮＰ１６３７０、ＸＥＮＰ１６３７１、ＸＥＮＰ１６３７２、ＸＥＮＰ１６３７３、ＸＥＮＰ１６３７５、ＸＥＮＰ１６３７６およびＸＥＮＰ１６３７７からなる群から選択されるヘテロ二量体抗体をコードする、発現ベクター組成物。
69. 請求項６７に記載の核酸組成物を含む宿主細胞。
70. 請求項６８に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
71. 請求項６６に記載のヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、請求項６９または７０に記載の宿主細胞を前記抗体が発現される条件下で培養するステップと、前記抗体を回収するステップとを含む、方法。
72. がんを治療する方法であって、請求項６６に記載のヘテロ二量体抗体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、方法。

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