EA036156B1 - Гетеродимерные антитела, которые связывают cd3 и опухолевые антигены - Google Patents

Гетеродимерные антитела, которые связывают cd3 и опухолевые антигены Download PDF

Info

Publication number
EA036156B1
EA036156B1 EA201792467A EA201792467A EA036156B1 EA 036156 B1 EA036156 B1 EA 036156B1 EA 201792467 A EA201792467 A EA 201792467A EA 201792467 A EA201792467 A EA 201792467A EA 036156 B1 EA036156 B1 EA 036156B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
scfv
antibody
domain
sequences
variants
Prior art date
Application number
EA201792467A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201792467A1 (ru
Inventor
Грегори Мур
Джон Десларле
Мэттью Бернетт
Сеунг Чу
Румана Рашид
Умеш Мучхал
Сунг-Хиунг Ли
Original Assignee
Ксенкор, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2015/062772 external-priority patent/WO2016086189A2/en
Application filed by Ксенкор, Инк. filed Critical Ксенкор, Инк.
Publication of EA201792467A1 publication Critical patent/EA201792467A1/ru
Publication of EA036156B1 publication Critical patent/EA036156B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/528—CH4 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

Изобретение относится к новым гетеродимерным антителам.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Заявка испрашивает приоритет согласно 35 U.S.C. 119(e) и 120 предварительной заявки на патент США № 62/159111, поданной 8 мая 2015 года, предварительной заявки на патент США № 62/251005, поданной 4 ноября 2015 года, и предварительной заявки на патент США № 62/250971, поданной 4 ноября 2015 года, U.S.S.N. 14/952714, поданной 11 ноября 2015 года и PCT/US2015/062772, поданной 25 ноября 2015 года, все из которых явным образом включены в данный документ посредством ссылки в их полном объеме с конкретной привязкой к фигурам, пояснениям обозначений и пунктам формулы изобретения.
Предпосылки изобретения
Терапевтические средства на основе антител успешно применялись для лечения целого ряда заболеваний, включая рак и аутоиммунные/воспалительные нарушения. Тем не менее усовершенствование этого класса лекарственных средств все еще необходимо, особенно в отношении повышения их клинической эффективности. Один перспективный аспект заключается в конструировании дополнительных и новых антигенсвязывающих участков в лекарственных средствах на основе антител, так что одна молекула иммуноглобулина одновременно контактирует с двумя разными антигенами. Такие ненативные или альтернативные форматы антител, которые контактируют с двумя разными антигенами, часто называют биспецифическими. Поскольку значительное разнообразие вариабельной области (Fv) антитела позволяет получить Fv, которая распознает практически любую молекулу, типичным подходом к созданию биспецифического антитела является введение новых вариабельных областей в антитело.
Ряд альтернативных форматов антител был исследован в отношении биспецифического целенаправленного воздействия (Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136; Kontermann, mAbs 4(2):182 (2012), все из которых явным образом включены в данный документ посредством ссылки). Первоначально биспецифические антитела получали путем слияния двух клеточных линий, каждая из которых вырабатывала одно моноклональное антитело (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-540). Хотя полученная гибридная гибридома, или квадрома, действительно вырабатывала биспецифические антитела, они представляли собой только незначительную популяцию, и для выделения желаемого антитела требовалась длительная очистка. Техническим решением для этого было применение фрагментов антител для получения биспецифических антител. Поскольку у таких фрагментов отсутствует сложная четвертичная структура, характерная для полноразмерного антитела, вариабельные области легких и тяжелых цепей могут быть связаны в единых генетических конструкциях. Были получены фрагменты антител многих различных форм, включая диатела, одноцепочечные диатела, тандемные scFv и биспецифические Fab2 (Chames & Baty, 2009, mAbs 1[6]:1-9; Holliger & Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23[9]:1126-1136; явным образом включена в данный документ посредством ссылки). Хотя эти форматы могут экспрессироваться на высоких уровнях в бактериях и могут иметь благоприятные преимущества в отношении проникновения благодаря их небольшому размеру, они быстро устраняются in vivo и могут представлять сложности при производстве, связанные с их получением и стабильностью. Основной причиной этих недостатков является то, что фрагменты антител обычно не имеют константной области антитела с соответствующими функциональными свойствами, включая большой размер, высокую стабильность и связывание с различными Fc-рецепторами и лигандами, которые сохраняют длительный период полужизни в сыворотке (т.е. неонатальный Fc-рецептор FcRn) или служат в качестве участков связывания для очистки (т.е. белок A и белок G).
В более поздней работе были предприняты попытки устранить недостатки биспецифических антител на основе фрагментов путем конструирования двойного связывания в подобных полноразмерному антителу форматах (Wu et al., 2007, Nature Biotechnology 25[11]:1290-1297; USSN12/477,711; Michaelson et al., 2009, mAbs 1[2]:128-141; PCT/US2008/074693; Zuo et al., 2000, Protein Engineering 13[5]:361-367; USSN09/865, 198; Shen et al., 2006, J Biol Chem 281[16]:10706-10714; Lu et al., 2005, J Biol Chem 280[20]:19665-19672; PCT/US2005/025472; явным образом включены в данный документ посредством ссылки). Эти форматы обеспечивают устранение некоторых из сложностей, связанных с биспецифическими фрагментами антител, главным образом в следствие того, что они содержат Fc-область. Одним из существенных недостатков этих форматов является то, что поскольку они создают новые антигенсвязывающие участки сверху гомодимерных константных цепей, связывание с новым антигеном всегда является бивалентным.
Для многих антигенов, которые являются привлекательными в качестве совместных мишеней в терапевтическом биспецифическом формате, желаемое связывание является моновалентным, а не бивалентным. Для многих иммунных рецепторов клеточная активация осуществляется путем перекрестного связывания моновалентного связывающего взаимодействия. Механизм перекрестного связывания, как правило, опосредуется иммунными комплексами антитело/антиген или через эффекторную клетку с вовлечением клетки-мишени. Например, низкоаффинные Fc-гамма-рецепторы (FcyR), такие как FcYRIIa, FcYRIIb и FcYRIIIa, моновалентно связываются с Fc-областью антитела. Моновалентное связывание не активирует клетки, экспрессирующие эти FcyR; однако при образовании иммунных комплексов или межклеточном контакте рецепторы перекрестно связываются и кластеризуются на поверхности клетки, что приводит к активации. Для рецепторов, ответственных за опосредование уничтожения клеток, на
- 1 036156 пример, FcYRIIIa на естественных клетках-киллерах (NK), перекрестное связывание рецепторов и клеточная активация имеют место, когда эффекторная клетка контактирует с клеткой-мишенью в высоко авидном формате (Bowles & Weiner, 2005, J Immunol Methods 304:88-99, явным образом включена посредством ссылки). Аналогичным образом, на B-клетках ингибиторный рецептор FcYRIIb подавляет активацию B-клетки только в том случае, когда она вовлечена в иммунный комплекс с рецептором Bклеток (BCR) на клеточной поверхности, механизм, который опосредуется образованием комплексов растворимых IgG с тем же антигеном, который распознается BCR (Heyman 2003, Immunol Lett 88[2]:157161; Smith and Clatworthy, 2010, Nature Reviews Immunology 10:328-343; явным образом включена посредством ссылки). В качестве другого примера, активация T-клеток с помощью CD3 происходит только в случае, когда ассоциированный с ними T-клеточный рецептор (TCR) вовлечен в нагруженный антигеном МНС на антигенпрезентирующих клетках в высоко авидном межклеточном синапсе (Kuhns et al., 2006, Immunity 24:133-139).
Действительно, неспецифическое бивалентное перекрестное связывание CD3 с использованием антитела к CD3 вызывает цитокиновую бурю и токсичность (Perruche et al., 2009, J Immunol 183[2]:953-61; Chatenoud & Bluestone, 2007, Nature Reviews Immunology 7:622-632; явным образом включена посредством ссылки). Таким образом, для практического клинического применения предпочтительной формой совместного контакта с CD3 для перенаправленного уничтожения клеток-мишеней является моновалентное связывание, которое приводит к активации только при контакте с совместно вовлеченной мишенью.
CD38, также известный как гидролаза циклической ADP-рибозы, представляет собой трансмембранный гликопротеин II типа с длинным C-концевым внеклеточным доменом и коротким N-концевым цитоплазматическим доменом. Среди гемопоэтических клеток к CD38-опосредованной передаче сигналов был отнесен ряд функциональных эффектов, включая пролиферацию лимфоцитов, высвобождение цитокинов, регуляцию развития и выживаемости B-клеток и миелоидных клеток, а также индукцию созревания дендритных клеток. Регуляция CD38 нарушена при многих злокачественных новообразованиях гемопоэтической системы и в клеточных линиях, полученных из различных злокачественных новообразований гемопоэтической системы, включая неходжкинскую лимфому (NHL), лимфому Беркитта (BL), множественную миелому (ММ), B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (B-CLL), B- и Tклеточный острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), T-клеточную лимфому (TCL), острый миелоидный лейкоз (AML), волосатоклеточный лейкоз (HCL), лимфому Ходжкина (HL) и хронический миелоидный лейкоз (CML). С другой стороны, большинство примитивных плюрипотентных стволовых клеток гемопоэтической системы являются CD38-. Несмотря на недавний прогресс в обнаружении и разработке противораковых средств, многие формы рака, включая CD38-экспрессирующие опухоли, все еще имеют неблагоприятный прогноз. Таким образом, существует потребность в улучшенных способах лечения таких форм рака.
B-клеточный антиген CD19 (CD19, также известный как B-клеточный поверхностный антиген В4, Leu-12) является поверхностным маркером всех B-клеток человека, который экспрессируется с ранних стадий развития пре-Б-клеток до терминальной дифференцировки в плазматические клетки. CD19 способствует пролиферации и выживанию зрелых B-клеток. Он объединяется в комплекс с CD21 на поверхности клетки. Он также объединяется с CD81 и Leu-13 и потенцирует передачу сигнала B-клеточного рецептора (BCR). CD19 вместе с BCR модулирует контрольные точки передачи внутренних и индуцированных рецептором к антигену сигналов, критичных для клонального размножения B-клеток и гуморального иммунитета. Совместно с CD21 он связывает адаптивную и врожденную иммунную систему. После активации цитоплазматический хвост CD19 становится фосфорилированным, что приводит к связыванию киназами семейства Src и привлечению PI-3-киназы. Он представляет собой привлекательную мишень для иммунотерапии рака лимфоидного происхождения, поскольку экспрессируется и на подавляющем большинстве клеток NHL, а также при некоторых формах лейкоза.
Ряд антител или конъюгатов антител, которые нацелены на CD19, были оценены в доклинических исследованиях или в клинических испытаниях для лечения форм рака. Эти антитела или конъюгаты антител к CD19 включают в себя без ограничения MT-103 (одноцепочечное биспецифическое антитело к CD19/CD3; Hoffman et al., 2005 Int. J. Cancer 115:98-104; Schlereth et al., 2006 Cancer Immunol. Immunother. 55:503-514), диатело к CD19/CD16 (Schlenzka et al., 2004 Anti-cancer Drugs 15:915-919; Kipriyanov et al., 2002 J Immunol. 169:137-144), В1Л2-сапорин (Flavell et al., 1995 Br. J. Cancer 72:1373-1379) и конъюгат антитела к CD19 и идарубицина (Rowland et al, 1993 Cancer Immunol. Immunother. 55:503-514); все явным образом включены посредством ссылки.
CD123, также известный как рецептор интерлейкина-3 альфа (IL-3Ra), экспрессируется на дендритных клетках, моноцитах, эозинофилах и базофилах. CD123 также конститутивно экспрессируется коммитированными гемопоэтическими стволовыми клетками/клетками-предшественниками, большинством миелоидных линий (CD13+, CD14+, CD33+, CD151ow) и некоторыми CD19+ клетками. Он отсутствует на клетках CD3+.
Таким образом, в то время как биспецифические антитела, полученные из фрагментов антител, ис- 2 036156 пытывают недостатки в отношении биофизических и фармакокинетических свойств, недостатком антител, созданных в форматах, подобных полноразмерному антителу, является то, что они контактируют с общими антигенами-мишенями поливалентно в отсутствие первичного антигена-мишени, приводя к неспецифической активации и потенциальной токсичности. Настоящее изобретение позволяет решить эту проблему путем введения новых биспецифических антител, направленных на CD3 и CD38.
Краткое описание изобретения
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие: a) первый мономер, содержащий: i) первую тяжелую цепь, содержащую: 1) первый вариабельный домен тяжелой цепи; 2) первый константный домен тяжелой цепи, содержащий первый Fcдомен; 3) scFv, содержащий вариабельный домен scFv легкой цепи, линкер scFv и вариабельный домен scFv тяжелой цепи; где указанный scFv ковалентно соединен с C-концом указанного Fc-домена с помощью междоменного линкера; b) второй мономер, содержащий вторую тяжелую цепь, содержащую второй вариабельный домен тяжелой цепи и второй константный домен тяжелой цепи, содержащий второй Fc-домен; и c) общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие: a) первый мономер, содержащий: i) первую тяжелую цепь, содержащую: 1) первый вариабельный домен тяжелой цепи; 2) первый константный домен тяжелой цепи, содержащий первый Fcдомен; и 3) первый вариабельный домен легкой цепи, где указанный первый вариабельный домен легкой цепи ковалентно соединен с C-концом указанного первого Fc-домена с помощью междоменного линкера; b) второй мономер, содержащий: i) второй вариабельный домен тяжелой цепи; ii) второй константный домен тяжелой цепи, содержащий второй Fc-домен; и iii) третий вариабельный домен тяжелой цепи, где указанный второй вариабельный домен тяжелой цепи ковалентно соединен с C-концом указанного второго Fc-домена с помощью междоменного линкера; c) общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие: a) первый мономер, содержащий: i) первую тяжелую цепь, содержащую: 1) первый вариабельный домен тяжелой цепи; 2) первый константный домен тяжелой цепи, содержащий первый CHIдомен и первый Fc-домен; 3) scFv, содержащий вариабельный домен scFv легкой цепи, линкер scFv и вариабельный домен scFv тяжелой цепи; где указанный scFv ковалентно присоединен между C-концом указанного CHI-домена и N-концом указанного первого Fc-домена с помощью междоменных линкеров; b) второй мономер, содержащий вторую тяжелую цепь, содержащую второй вариабельный домен тяжелой цепи и второй константный домен тяжелой цепи, содержащий второй Fc-домен; и c) общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие: a) первый мономер, содержащий: i) первую тяжелую цепь, содержащую: 1) первый вариабельный домен тяжелой цепи; 2) первый константный домен тяжелой цепи, содержащий первый Fcдомен; и 3) первый вариабельный домен легкой цепи, где указанный второй вариабельный домен легкой цепи ковалентно присоединен между C-концом ОШ-домена указанного первого константного домена тяжелой цепи и N-концом указанного первого Fc-домена с помощью междоменных линкеров; b) второй мономер, содержащий: i) второй вариабельный домен тяжелой цепи; ii) второй константный домен тяжелой цепи, содержащий второй Fc-домен; и iii) третий вариабельный домен тяжелой цепи, где указанный второй вариабельный домен тяжелой цепи ковалентно соединен с C-концом указанного второго Fcдомена с помощью междоменного линкера; c) общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие: a) первый мономер, содержащий: i) первую тяжелую цепь, содержащую: 1) первый вариабельный домен тяжелой цепи; 2) первый константный домен тяжелой цепи, содержащий первый CH1домен и первый Fc-домен; 3) scFv, содержащий вариабельный домен scFv легкой цепи, линкер scFv и вариабельный домен scFv тяжелой цепи; где указанный scFv ковалентно присоединен между C-концом указанного CHI-домена и N-концом указанного первого Fc-домена с помощью междоменных линкеров; b) второй мономер, содержащий второй Fc-домен; и c) легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи.
В некоторых аспектах первый и второй Fc-домены предусматривают набор аминокислотных замен, выбранный из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q. Кроме того, вариабельный домен(домены) тяжелой цепи и вариабельный домен(домены) легкой цепи связывают первый опухолевый антиген-мишень (TTA), scFv связывает второй TTA или CD3 человека. В некоторых вариантах осуществления TTA выбиран из группы, состоящей из CD19, CD20 и CD123.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает антигенсвязывающие домены антитела к CD3, содержащие последовательности CDR и/или вариабельных доменов и/или scFv, изображенные на фигурах для H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L.1.47 и H1.31_L1.47. Настоящее
- 3 036156 изобретение дополнительно предусматривает композиции нуклеиновых кислот, композиции векторов экспрессии и клетки-хозяева.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие a) первый мономер, содержащий: i) первый Fc-домен; ii) scFv к CD3, содержащий вариабельный домен scFv легкой цепи, линкер scFv и вариабельный домен scFv тяжелой цепи; где указанный scFv ковалентно соединен с N-концом указанного Fc-домена с помощью междоменного линкера; b) второй мономер, содержащий тяжелую цепь, содержащую: i) вариабельный домен тяжелой цепи и ii) константный домен тяжелой цепи, содержащий второй Fc-домен; и c) легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и вариабельный константный домен легкой цепи; где scFv к CD3 выбран из группы, состоящей из H1.32_L1.47, связывающейся с CD3, H1.89_L1.47, связывающейся с CD3, H1.90_L1.47, связывающейся с CD3 и H1.33_L1.47, связывающейся с CD3 (SEQ ID NO:XX). Вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи связывают TTA (включая без ограничения CD19, CD20, CD38 и CD123).
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает связывающие домены антитела к CD20, содержащие a) вариабельный домен легкой цепи, содержащий vlCDR1, имеющий последовательность RASWSVSYIH (SEQ ID NO:XX), vlCDR2, имеющий последовательность ATSNLAS (SEQ ID NO:XX), и vlCDR3, имеющий последовательность QQWTHNPPT (SEQ ID NO:XX); и b) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий vhCDR1, имеющий последовательность SYNMH (SEQ ID NO:XX), vhCDR2, имеющий последовательность AIYPGNGATSYSQKFQG (SEQ ID NO:XX), и vhCDR3, имеющий последовательность SYYMGGDWYFDV (SEQ ID NO:XX). В некоторых вариантах осуществления связывающие домены антитела к CD20 имеют последовательности C2B8 H1.202_L1.113.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает связывающие домены антитела к CD20, содержащие: a) вариабельный домен легкой цепи, содержащий vlCDR1, имеющий последовательность RASSSVSYIH (SEQ ID NO:XX), vlCDR2, имеющий последовательность ATSNLAS (SEQ ID NO:XX), и vlCDR3, имеющий последовательность QQWTSNPPT (SEQ ID NO:XX); и b) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий vhCDR1, имеющий последовательность SYNMH (SEQ ID NO:XX), vhCDR2, имеющий последовательность AIYPGNGDTSYNQKFQG (SEQ ID NO:XX), и vhCDR3, имеющий последовательность STYYGGDWYFNV (SEQ ID NO:XX).
В некоторых вариантах осуществления связывающие домены антитела к CD20 имеют последовательности C2B8_H1L1.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие a) первый мономер, содержащий: i) первый Fc-домен; ii) scFv к CD3, содержащий вариабельный домен scFv легкой цепи, линкер scFv и вариабельный домен scFv тяжелой цепи; где указанный scFv ковалентно соединен с N-концом указанного Fc-домена с помощью междоменного линкера; b) второй мономер, содержащий тяжелую цепь, содержащую: i) вариабельный домен тяжелой цепи и ii) константный домен тяжелой цепи, содержащий второй Fc-домен; и c) легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и вариабельный константный домен легкой цепи, где вариабельные домены тяжелой и легкой цепей образуют связывающий домен C2B8 H1.202_L1.113 или C2B8_H1L1.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие a) первый мономер, содержащий: i) первый Fc-домен; ii) scFv к CD3, содержащий вариабельный домен scFv легкой цепи, линкер scFv и вариабельный домен scFv тяжелой цепи; где указанный scFv ковалентно соединен с N-концом указанного Fc-домена с помощью междоменного линкера; b) второй мономер, содержащий тяжелую цепь, содержащую: i) вариабельный домен тяжелой цепи и ii) константный домен тяжелой цепи, содержащий второй Fc-домен; и c) легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и вариабельный константный домен легкой цепи. В данном варианте осуществления вариабельные домены связывают CD123 и могут иметь последовательности 7G3_H1.109_L1.47.
В дополнительных аспектах настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, выбранные из группы, состоящей из XENP15049, XENP15051; XENP15050, XENP13676, XENP14696, XENP15629, XENP15053, XENP15630, XENP15631, XENP15632, XENP15633, XENP15634, XENP15635, XENP15636, XENP15638, XENP15639, XENP13677, XENP14388, XENP14389, XENP14390, XENP14391, XENP14392, XENP14393, XENP16366, XENP16367, XENP16368, XENP16369, XENP16370, XENP16371, XENP16372, XENP16373, XENP16375, XENP16376, XENP16377, XENP14045 и XENP13928. Нуклеиновые кислоты, векторы экспрессии и клетки-хозяева также предусматриваются в дополнение к способам получения этих белков и лечения пациентов с их помощью.
В дополнительных аспектах настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие набор из 6 CDR (vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3) из вариабельных областей одного из антигенсвязывающих доменов гетеродимерного антитела, выбранного из группы, состоящей из XENP15049, XENP15051; XENP15050, XENP13676, XENP14696, XENP15629, XENP15053, XENP15630, XENP15631, XENP15632, XENP15633, XENP15634, XENP15635, XENP15636, XENP15638, XENP15639, XENP13677, XENP14388, XENP14389, XENP14390, XENP14391, XENP14392, XENP14393, XENP16366, XENP16367, XENP16368, XENP16369, XENP16370, XENP16371, XENP16372, XENP16373, XENP16375, XENP16376, XENP16377, XENP14045 и XENP13928. Нуклеиновые кислоты, векторы экс- 4 036156 прессии и клетки-хозяева также предусматриваются в дополнение к способам получения этих белков и лечения пациентов с их помощью.
В дополнительных аспектах настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие два набора CDR, при этом первый набор состоит из каждой из 6 CDR (vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3) из вариабельных областей одного из антигенсвязывающих доменов, а второй набор происходит из вариабельных областей другого, при этом второй антигенсвязывающий домен гетеродимерного антитела выбран из группы, состоящей из XENP15049, XENP15051; XENP15050, XENP13676, XENP14696, XENP15629, XENP15053, XENP15630, XENP15631, XENP15632, XENP15633, XENP15634, XENP15635, XENP15636, XENP15638, XENP15639, XENP13677, XENP14388, XENP14389, XENP14390, XENP14391, XENP14392, XENP14393, XENP16366, XENP16367, XENP16368, XENP16369, XENP16370, XENP16371, XENP16372, XENP16373, XENP16375, XENP16376, XENP16377, XENP14045 и XENP13928. Нуклеиновые кислоты, векторы экспрессии и клетки-хозяева также предусматриваются в дополнение к способам получения этих белков и лечения пациентов с их помощью.
В дополнительных аспектах настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, содержащие два набора vh- и vl-доменов, при этом первый набор состоит из вариабельных областей одного из антигенсвязывающих доменов, а второй набор состоит из вариабельных областей другого, причем второй антигенсвязывающий домен гетеродимерного антитела выбран из группы, состоящей из XENP15049, XENP15051; XENP15050, XENP13676, XENP14696, XENP15629, XENP15053, XENP15630, XENP15631, XENP15632, XENP15633, XENP15634, XENP15635, XENP15636, XENP15638, XENP15639, XENP13677, XENP14388, XENP14389, XENP14390, XENP14391, XENP14392, XENP14393, XENP16366, XENP16367, XENP16368, XENP16369, XENP16370, XENP16371, XENP16372, XENP16373, XENP16375, XENP16376, XENP16377, XENP14045 и XENP13928. Нуклеиновые кислоты, векторы экспрессии и клетки-хозяева также предусматриваются в дополнение к способам получения этих белков и лечения пациентов с их помощью.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1A, 1B и 1C изображены некоторые форматы по настоящему изобретению. Представлены две формы формата открывалка, одна с антигенсвязывающим доменом антитела к CD3, содержащим scFv, и доменом, связывающимся с TTA, содержащим Fab, и другая с этими компонентами, поменянными местами. Показаны все форматы mAb-Fv, mAb-scFv, с центральным scFv и центральным Fv. Хотя они представлены как имеющие домен антитела к CD3 в виде scFv, как обсуждается в данном документе, любые последовательности Fv могут быть отсоединены и присоединены; так что домены антитела к CD3 и антитела к TTA из mAb-Fv, mAb-scFv, центрального scFv и центрального Fv могут быть поменяны местами. Кроме того, показаны неполные форматы, где только один мономер содержит Fc-домен, как с неполным центральным scFv, так и с неполным центральным Fv. Формат с двойным scFv также показан.
На фиг. 2 изображены последовательности конструкции с высокой аффинностью к CD3 antiCD3_H1.30_L1.47, включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (CDR подчеркнуты), а также отдельных vl и vhCDR, а также конструкции scFv с заряженным линкером (двойное подчеркивание). Как справедливо для всех последовательностей, изображенных на фигурах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, если это необходимо.
На фиг. 3 изображены последовательности конструкции с аффинностью от высокой до средней №1Anti-CD3_H1.32_L1.47, включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (CDR подчеркнуты), а также отдельных vl и vhCDR, а также конструкции scFv с заряженным линкером (двойное подчеркивание). Как справедливо для всех последовательностей, изображенных на фигурах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, если это необходимо.
На фиг. 4 изображены последовательности конструкции с аффинностью от высокой до средней №2Anti-CD3_H1.89_L1.47, включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (CDR подчеркнуты), а также отдельных vl и vhCDR, а также конструкции scFv с заряженным линкером (двойное подчеркивание). Как справедливо для всех последовательностей, изображенных на фигурах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, если это необходимо.
На фиг. 5 изображены последовательности конструкции с аффинностью от высокой до средней №3Anti-CD3_H1.90_L1.47, включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (CDR подчеркнуты), а также отдельных vl и vhCDR, а также конструкции scFv с заряженным линкером (двойное подчеркивание). Как справедливо для всех последовательностей, изображенных на фигурах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, если это необходимо.
На фиг. 6 изображены последовательности конструкции со средней аффинностью^^CD3_H1.90_L1.47, включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (CDR подчеркнуты), а также отдельных vl и vhCDR, а также конструкции scFv с заряженным линкером (двойное подчеркивание). Как справедливо для всех последовательностей, изображенных на фигурах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, если это необходимо.
- 5 036156
На фиг. 7 изображены последовательности конструкции с низкой аффинностьюАпйCD3_H1.31_L1.47, включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (CDR подчеркнуты), а также отдельных vl и vhCDR, а также конструкции scFv с заряженным линкером (двойное подчеркивание). Как справедливо для всех последовательностей, изображенных на фигурах, этот заряженный линкер может быть заменен незаряженным линкером или другим заряженным линкером, если это необходимо.
На фиг. 8 изображены последовательности конструкции с высокой аффинностью к CD38: OKT10_H1.77_L1.24, включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (CDR подчеркнуты), а также отдельных vl и vhCDR, а также конструкции scFv с заряженным линкером (двойное подчеркивание).
На фиг. 9 изображены последовательности конструкции со средней аффинностью к CD38: OKT10_H1L1.24, включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (CDR подчеркнуты), а также отдельных vl и vhCDR, а также конструкции scFv с заряженным линкером (двойное подчеркивание).
На фиг. 10 изображены последовательности конструкции с низкой аффинностью к CD38: OKT10_H1L1, включая вариабельные домены тяжелой и легкой цепей (CDR подчеркнуты), а также отдельных vl и vhCDR, а также конструкции scFv с заряженным линкером (двойное подчеркивание).
На фиг. 11 изображены последовательности XENP15331.
На фиг. 12 изображены последовательности XENP13243.
На фиг. 13 изображены последовательности XENP14702.
На фиг. 14 изображены последовательности XENP15426.
На фиг. 15 изображены последовательности XENP14701.
На фиг. 16 изображена последовательность XENP14703.
На фиг. 17 изображена последовательность XENP13243.
На фиг. 18 изображены последовательности XENP18967.
На фиг. 19 изображены последовательности XENP18971.
На фиг. 20 изображены последовательности XENP18969.
На фиг. 21 изображены последовательности XENP18970.
На фиг. 22 изображены последовательности XENP18972.
На фиг. 23 изображены последовательности XENP18973.
На фиг. 24 изображены последовательности XENP15055.
На фиг. 25 изображены последовательности XENP13544.
На фиг. 26 изображены последовательности XENP13694.
На фиг. 27 изображена последовательность человеческого CD3 ε.
На фиг. 28 изображен полноразмерный (SEQ ID NO:130) и внеклеточный домены (ECD; SEQ ID NO:131) белка CD38 человека.
На фиг. 29A-29E изображены пригодные пары наборов вариантов гетеродимеризации (включая асимметричные и варианты с измененной pI). На фиг. 29E представлены варианты, для которых не существует соответствующих вариантов мономера 2; это варианты с измененной pI, которые могут применяться сами по себе на любом мономере или быть включенными в сторону Fab открывалки, например, а соответствующим образом заряженный линкер scFv может применяться на втором мономере, в котором scFv используется в качестве второго антигенсвязывающего домена. Подходящие заряженные линкеры показаны на фиг. 33.
На фиг. 30 изображен перечень константных областей изостерических вариантов антител и их соответствующие замены, pI_(-) обозначает варианты с более низкой pI, тогда как pI_(+) обозначает варианты с более высокой pI. Их можно необязательно и независимо комбинировать с другими вариантами гетеродимеризации по настоящему изобретению (а также другими типами вариантов, как описано в данном документе).
На фиг. 31 изображены пригодные варианты с нарушением, у которых нарушено связывание с FcyR (иногда называемые нокаутными или KO вариантами).
На фиг. 32 показаны два особенно пригодных варианта осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 33 изображен ряд заряженных линкеров scFv, которые находят применение в повышении или снижении pI гетеродимерных антител, в которых в качестве компонента применяют один или несколько scFv. (+Н) положительный линкер находит особое применение в данном документе, в частности, для последовательностей vl и vh антитела к CD3, показанных в данном документе. Один линкер scFv из уровня техники с одиночным зарядом упоминается как Whitlow из Whitlow et al., Protein Engineering 6(8):989-995 (1993). Следует отметить, что этот линкер применяли для уменьшения агрегации и повышения протеолитической стабильности scFv.
На фиг. 34 изображен перечень сконструированных с асимметрией гетеродимерных Fc-вариантов со значениями выхода гетеродимера (определенным с помощью HPLC-CIEX) и термостабильности (определенной с помощью DSC). Не определенная термостабильность обозначена как n.d..
Фиг. 35. Значения выхода экспрессии биспецифических антител после аффинной очистки с применением белка A.
Фиг. 36. Хроматограммы катионообменной очистки.
- 6 036156
Фиг. 37. Анализ перенаправленной T-клеточной цитотоксичности, 24 ч. инкубации, 10 тысяч клеток
RPMI8226, 400 тысяч T-клеток. Тестируемые препараты представляют собой биспецифические антитела к CD38 х CD3. Обнаружение проводили с помощью LDH.
Фиг. 38. Анализ перенаправленной T-клеточной цитотоксичности, 24 ч. инкубации, 10 тысяч клеток RPMI8226, 500 тысяч РВМС человека. Тестируемые препараты представляют собой биспецифические антитела к CD38 х CD3. Обнаружение проводили с помощью LDH.
На фиг. 39 изображены последовательности XENP14419.
На фиг. 40 изображены последовательности XENP14420.
На фиг. 41 изображены последовательности XENP14421.
На фиг. 42 изображены последовательности XENP14422.
На фиг. 43 изображены последовательности XENP14423.
Фиг. 44. Анализ перенаправленной T-клеточной цитотоксичности, 96 ч. инкубации, 40 тысяч клеток RPMI8226, 400 тысяч РВМС человека. Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFv-Fc к CD38 х CD3. Обнаружение проводили методом проточной цитометрии, в частности, в отношении исчезновения CD38+ клеток.
Фиг. 45. Дополнительное исследование результатов анализа перенаправленной T-клеточной цитотоксичности, описанного на фиг. 1. В первом ряду показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) маркера активации CD69 на CD4+ и CD8+ T-клетках, определяемая с помощью проточной цитометрии. Во втором ряду показана процентная доля CD4+ и CD8+ T-клеток, которые являются Ki-67+, что является критерием клеточной пролиферации. В третьем ряду показана внутриклеточная средняя интенсивность флуоресценции (MFI) ингибитора гранзима В PI-9 на CD4+ и CD8+ T-клетках, определяемая с помощью проточной цитометрии.
Фиг. 46. Дизайн исследования на мышах для изучения противоопухолевой активности биспецифических антител Fab-scFv-Fc к CD38 х CD3.
Фиг. 47. Размер опухоли, измеренный с помощью IVIS®, в зависимости от времени и лечения.
Фиг. 48. Биолюминесцентные изображения IVIS® (день 10)
Фиг. 49. Истощение популяции CD38+ клеток у яванских макаков после однократных доз указанных препаратов.
Фиг. 50. Активация T-клеток, измеренная по средней интенсивности флуоресценции (MFI) CD69 у яванских макаков, цветная маркировка, как на фиг. 49.
Фиг. 51. Уровни IL-6 в сыворотке после однократных доз указанных тестируемых препаратов.
На фиг. 52 изображены последовательности XENP15427.
На фиг. 53 изображены последовательности XENP15428.
На фиг. 54 изображены последовательности XENP15429.
На фиг. 55 изображены последовательности XENP15430.
На фиг. 56 изображены последовательности XENP15431.
На фиг. 57 изображены последовательности XENP15432.
На фиг. 58 изображены последовательности XENP15433.
На фиг. 59 изображены последовательности XENP15434.
На фиг. 60 изображены последовательности XENP15435.
На фиг. 61 изображены последовательности XENP15436.
На фиг. 62 изображены последовательности XENP15437.
На фиг. 63 изображены последовательности XENP15438.
На фиг. 64 показаны значения аффинности связывания в анализе Biacore.
На фиг. 65 показана чистота гетеродимера при генерации стабильного пула с применением различных соотношений легкой цепи, Fab-Fc и scFv-Fc.
Фиг. 66. Истощение IgM и IgG2 человека биспецифическими антителами к CD38 х CD3 на мышиной модели с huPBMC.
На фиг. 67 изображен оптимизированный по стабильности гуманизированный вариант scFv к CD3. Замены даны относительно последовательности scFv H1_L1.4. Нумерация аминокислот представляет собой нумерацию по Kabat.
Фиг. 68. Аминокислотные последовательности оптимизированного по стабильности гуманизированного варианта scFv к CD3. CDR подчеркнуты. Для каждой комбинации тяжелой цепи/легкой цепи перечислены четыре последовательности: (i) scFv с C-концевой 6xHis-меткой, (ii) только scFv, (iii) только VH, (iv) только VL.
Фиг. 69. Анализ перенаправленной T-клеточной цитотоксичности, 24 ч инкубации, 10 тысяч клеток RPMI8226, 500 тысяч РВМС. Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFv-Fc к CD38 (OKT10_H1L1, OKT10_H1.77_L1.24) х CD3. Обнаружение проводили с помощью LDH.
Фиг. 70. Исследование Ig-истощения huPBL-SCID.
Тестируемые препараты вводили через 8 дней после прививания РВМС в дозе 0,03, 0,3 или 3 мг/кг. Путь введения был внутрибрюшинным. Образцы крови брали через 14 дней после прививания РВМС,
- 7 036156 обрабатывали с получением сыворотки и анализировали на предмет IgM и IgG2 человека.
На фиг. 71 изображены последовательности XENP15049.
На фиг. 72 изображены последовательности XENP15051.
На фиг. 73 изображены последовательности XENP15050.
На фиг. 74 изображены последовательности XENP13676.
На фиг. 75 изображены последовательности XENP14696.
На фиг. 76 изображены последовательности XENP15629.
На фиг. 77 изображены последовательности XENP15053.
На фиг. 78 изображены последовательности XENP15630.
На фиг. 79 изображены последовательности XENP15631.
На фиг. 80 изображены последовательности XENP15632.
На фиг. 81 изображены последовательности XENP15633.
На фиг. 82 изображены последовательности XENP15634.
На фиг. 83 изображены последовательности XENP15635.
На фиг. 84 изображены последовательности XENP15636.
На фиг. 85 изображены последовательности XENP15638.
На фиг. 86 изображены последовательности XENP15639.
На фиг. 87 изображены последовательности XENP13677.
На фиг. 88 изображены последовательности XENP14388.
На фиг. 89 изображены последовательности XENP14389.
На фиг. 90 изображены последовательности XENP14390.
На фиг. 91 изображены последовательности XENP14391.
На фиг. 92 изображены последовательности XENP14392.
На фиг. 93 изображены последовательности XENP14393.
На фиг. 94 изображены последовательности XENP16366.
На фиг. 95 изображены последовательности XENP16367
На фиг. 96 изображены последовательности XENP16368.
На фиг. 97 изображены последовательности XENP16369.
На фиг. 98 изображены последовательности XENP16370.
На фиг. 99 изображены последовательности XENP16371.
На фиг. 100 изображены последовательности XENP16372.
На фиг. 101 изображены последовательности XENP16373.
На фиг. 102 изображены последовательности XENP16374.
На фиг. 103 изображены последовательности XENP16375.
На фиг. 104 изображены последовательности XENP16376. CDR, последовательности vh и vl плеча Fab антитела к CD20 показаны на фиг. 121.
На фиг. 105 изображены последовательности XENP16377.
На фиг. 106 изображены последовательности антигенов CD20 и CD123.
Фиг. 107. Определение аффинности к CD3 с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFv-Fc к CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) х CD3. CD3δε-Fc человека (Sino Biological) ковалентно связывали с поверхностью чипа. Тестируемые препараты пропускали при 3,125, 12,5, 50 и 200 нМ.
Фиг. 108. Определение аффинности к CD3 с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFv-Fc к CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) х CD3. CD3δε-Fc яванского макака (Sino Biological) ковалентно связывали с поверхностью чипа. Тестируемые препараты пропускали при 3,125, 12,5, 50 и 200 нМ.
Фиг. 109. Определение аффинности к CD3 с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFv-Fc к CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) х CD3. CD3δε-Fc человека (Sino Biological) ковалентно связывали с поверхностью чипа. Тестируемые препараты пропускали при 31,25, 125, 500 и 2000 нМ.
Фиг. 110. Определение аффинности к CD3 с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFv-Fc к CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) х CD3. CD3δε-Fc яванского макака (Sino Biological) ковалентно связывали с поверхностью чипа. Тестируемые препараты пропускали при 31,25, 125, 500 и 2000 нМ.
Фиг. 111. Определение аффинности к CD3 с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFv-Fc к CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) х CD3. CD3δε-Fc яванского макака (Sino Biological) ковалентно связывали с поверхностью чипа. Тестируемые препараты пропускали при 31,25, 125, 500 и 2000 нМ.
Фиг. 112. Анализ перенаправленной T-клеточной цитотоксичности, 24 ч. инкубации, 10 тысяч клеток Ramos, 250 тысяч РВМС. Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFv-Fc к CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) х CD3. Обнаружение проводили с помощью LDH.
- 8 036156
Фиг. 113. Анализ перенаправленной T-клеточной цитотоксичности, 24 ч. инкубации, 20 тысяч клеток Jeko, 200 тысяч РВМС (CD19-истощенные). Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFvFc к CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) х CD3. Обнаружение проводили с помощью проточной цитометрии, в частности, в отношении исчезновения CD19' клеток.
Фиг. 114. Продукция IL-6 через 24 ч. для эксперимента, описанного на фиг. 113.
Фиг. 115. Анализ перенаправленной T-клеточной цитотоксичности, 5 ч. инкубации, 20 тысяч клеток Jeko, 500 тысяч РВМС (CD19-истощенные). Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFv-Fc к CD20 (C2B8_H1L1) х CD3. Обнаружение проводили с помощью проточной цитометрии, в частности, в отношении исчезновения CD19+ клеток.
Фиг. 116. Анализ перенаправленной T-клеточной цитотоксичности, 24 ч. инкубации, 20 тысяч клеток Jeko, 500 тысяч РВМС (CD19-истощенные). Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFvFc к CD20 (C2B8_H1.202_L1.113) х CD3. Обнаружение проводили с помощью проточной цитометрии, в частности, в отношении исчезновения CD19+ клеток.
Фиг. 117. Продукция IL-6 через 24 ч. для эксперимента, описанного на фиг. 113.
Фиг. 118. Анализ перенаправленной T-клеточной цитотоксичности, 24 ч. инкубации, 10 тысяч клеток RPMI8226, 500 тысяч РВМС. Тестируемые препараты представляют собой Fab-scFv-Fc к CD38 (OKT10_H1L1, OKT10_H1.77_L1.24) х CD3. Обнаружение проводили с помощью LDH.
Фиг. 119. Исследование Ig-истощения huPBL-SCID.
Тестируемые препараты вводили через 1 и 8 дней после прививания РВМС в дозе 5 мг/кг. Путь введения был внутрибрюшинным. Образцы крови брали через 14 дней после прививания РВМС, обрабатывали с получением сыворотки и анализировали на предмет IgM и IgG2 человека.
Фиг. 120. Исследование Ig-истощения huPBL-SCID.
Тестируемые препараты вводили через 8 дней после прививания РВМС в дозе 0,03, 0,3 или 3 мг/кг. Путь введения был внутрибрюшинным. Образцы крови брали через 14 дней после прививания РВМС, обрабатывали с получением сыворотки и анализировали на предмет IgM и IgG2 человека.
На фиг. 121 изображены последовательности с высокой аффинностью к CD20 C2B8_H1.202_L1.113. Заряженный линкер представляет собой (+H), хотя можно применять другие заряженные или незаряженные линкеры, как например таковые, изображенные на фиг. 33.
На фиг. 122 изображены последовательности с низкой аффинностью к CD20 C2B8_H1L1. Заряженный линкер представляет собой (+H), хотя можно применять другие заряженные или незаряженные линкеры, как например таковые, изображенные на фиг. 33.
На фиг. 123 изображены последовательности к CD123 7G3_H1.109_L1.57. Заряженный линкер представляет собой (+H), хотя можно применять другие заряженные или незаряженные линкеры, как например таковые, изображенные на фиг. 33.
На фиг. 124 показана матрица возможных комбинаций для настоящего изобретения. A означает, что CDR упомянутых последовательностей к CD3 можно комбинировать с CDR к TTA с правой стороны. То есть vhCDR из последовательности H1.30 вариабельного домена тяжелой цепи, связывающейся с CD3, и vlCDR из последовательности L1.57 вариабельного домена легкой цепи, связывающейся с CD3, можно комбинировать с vhCDR из последовательности OKT10 H1.77, связывающейся с CD38, и vlCDR из последовательности OKT10L1.24. B означает, что CDR из связывающихся с CD3 конструкций можно комбинировать с вариабельными доменами тяжелой и легкой цепей из связывающихся с TTA конструкций. То есть vhCDR из последовательности H1.30 вариабельного домена тяжелой цепи, связывающейся с CD3, и vlCDR из последовательности L1.57 вариабельного домена легкой цепи, связывающейся с CD3, можно комбинировать с последовательностью OKT10 H1.77 вариабельного домена тяжелой цепи, связывающейся с CD38, и последовательностью OKT10L1.24. C представляет собой обратную ситуацию, так что вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи из последовательностей, связывающихся с CD3, применяют с CDR из конструкций, связывающихся с TTA. D представляет собой ситуацию, когда комбинируются вариабельные домены тяжелой цепи и вариабельные домены легкой цепи из каждой конструкции. E представляет собой ситуацию, когда scFv из последовательности, связывающейся с CD3, применяют с CDR из конструкций, связывающихся с TTA, и в случае F scFv из последовательности, связывающейся с CD3, применяют с вариабельными доменами тяжелой цепи и вариабельными доменами легкой цепи из антигенсвязывающего домена антитела к TTA. Все из этих комбинаций можно выполнять в форматах открывалки, например, с любым из форматов основной цепи, показанных на фиг. 162, или в альтернативных форматах, таких как mAb-Fv, mAb-scFv, центральный scFv, центральный-Fv, или форматах с двойным scFv из фигуры 1, включая основные цепи форматов, показанных на фигурах 131 и 132). В целом, однако, форматы, которые будут включать бивалентное связывание CD3, являются невыгодными. То есть, A (CD3 CDR х TTA CDR) могут быть добавлены к последовательностям открывалки (включая таковые из фигуры 162 или с учетом разных вариантов гетеродимеризации) или в основную цепь mAb-scFv согласно фиг. 132, центральный scFv, формат mAb-Fv или формат центрального Fv.
Фиг. 125. Схематическое изображение биспецифических Fab-scFv-Fc к CD123 х CD3.
- 9 036156
Фиг. 126. В таблице показаны варианты, сконструированные для повышения аффинности и стабильности 7G3_H1L1.
Фиг. 127. В таблице показаны свойства конечной аффинности и стабильности оптимизированных гуманизированных вариантов 7G3.
Фиг. 128. Связывание XENP14045 (антитело к CD123 х CD3), которое биспецифически связывается с CD123-положительной клеточной линией AML KG-1a.
Фиг. 129. Перенаправленная T-клеточная цитотоксичность (RTCC) XENP14045, уничтожающих клетки KG-1a.
Фиг. 130. RTCC XENP14045 с клетками KG-1a с применением разных соотношений эффекторных клеток и клеток-мишеней (E:T), демонстрирующих серийное уничтожение полученными T-клетками XENP14045.
Фиг. 131. Уровни лекарственного средства в сыворотке крови после IV введения 2 мг/кг XENP14045 мышам C57BL/6. Период полужизни биспецифического антитела составлял 6,2 дня.
Фиг. 132. Уничтожение базофилами и плазмацитоидными дендритными клетками (PDC) крови CD123+ у яванских макаков после введения IV однократной дозы XENP14045, составляющей 0,01, 0,1 или 1 мг/кг.
Фиг. 133. Уничтожение базофилами и плазмацитоидными дендритными клетками (PDC) CD123+ в костном мозге яванских макаков после введения IV однократной дозы XENP14045, составляющей 0,01, 0,1 или 1 мг/кг.
Фиг. 134. Перераспределение T-клеток у яванских макаков после введения IV однократной дозы XENP14045.
Фиг. 135. Индукция CD69 T-клетками у яванских макаков после введения IV однократной дозы XENP14045.
Фиг. 136A-136C. Последовательности согласно настоящему изобретению. Области CDR являются подчеркнутыми.
Фиг. 137. Чистота гетеродимера при генерации стабильного пула с применением разных соотношений легкой цепи, Fab-Fc и scFv-Fc (сверху). Чистота гетеродимера при различных состояниях F2 пула (снизу).
Фиг. 138. SEC, что показывает высокую чистоту материала, представляющего собой клеточную линию XENP14045, после двухстадийной очистки.
На фиг. 139 изображено уничтожение T-клетками клеток CD123+.
На фиг. 140 изображен биспецифический механизм привлечения цитотоксических T-клеток к уничтожению стволовых клеток и бластных клеток AML.
На фиг. 141 изображена эффективность выработки биспецифического XENP14045.
На фиг. 142 показано, что биспецифическое антитело XENP14045 связывается с AML человека и характеризуется KD, составляющей 8,1 нМ, в отношении CD3 человека.
На фиг. 143 показано, что биспецифическое антитело XENP14045 является перекрестнореагирующим с клетками приматов и характеризуется KD, составляющей 5,7 нМ, в отношении CD3 яванского макака.
На фиг. 144 показано, что антитело к CD123 х CD3 уничтожает клеточные линии AML человека.
На фиг. 145 показано, что антитело к CD123 х CD3 уничтожает клеточные линии AML человека.
На фиг. 146 показана длительность периода полужизни биспецифического антитела у мышей.
На фиг. 147 показана однократная доза у обезьян.
На фиг. 148 показано истощение клеток CD123+ у обезьян в базофилах крови. Гейт для базофилов, проточная цитометрия представляет собой CD20- CD16+ CD14- CD4- CD8- FceR1+.
На фиг. 149 показано истощение в базофилах костного мозга с применением того самого гейтирования.
На фиг. 150 показано повторное дозирование, в результате которого происходит истощение клеток CD123+ у обезьян.
На фиг. 151 показано истощение клеток CD123+ у обезьян. Гейт для базофилов, проточная цитометрия представляет собой CD20- CD16+ CD14- CD4- CD8- FceR1+. Гейтирование плазмоцитоидных дендритных клеток, проточная цитометрия: CD20- CD16- CD14- Cd4-CD8- CD303+.
На фиг. 152 показано истощение в костном мозге у обезьян. Гейтирование как на фиг. 151.
На фиг. 153 показано истощение клеток CD123+, что коррелирует с перераспределением и активацией T-клеток; на фиг. 153 показано перераспределение T-клеток.
На фиг. 154 показано истощение клеток CD123+, что коррелирует с перераспределением и активацией T-клеток; на фиг. 154 показана активация T-клеток.
На фиг. 155 показано истощение клеток CD123+, что коррелирует с перераспределением и активацией T-клеток; на фиг. 155 показано высвобождение цитокинов.
На фиг. 156A-156D изображены материалы, ассоциированные со сложностью гуманизации последовательностей антител мыши к CD123, как описано в примере 3. На фиг. 125A-C показана потеря аф- 10 036156 финности вследствие гуманизации (главным образом из-за vH), при этом 13760 представляет собой Fab исходного антитела мыши H0L0, 13763 является первым гуманизированным vH-кандидатом, а 13761 обладает как тяжелой, так и легкой гуманизированными цепями Fab. На фиг. 125D показана ~10-кратная потеря активности RTCC в результате гуманизации.
На фиг. 157 изображены результаты первого раунда гуманизации (библиотека 1) с получением 108 вариантов, в том числе LDA, целенаправленные и реверсивные замены, которые подвергали скринингу на аффинность в формате Fab на чипе Biacore CD123, при этом варианты с нейтральной и более высокой аффинностью подвергали скринингу на стабильность на DSF.
На фиг. 158A и 158B показано повышение значений Тт, как обсуждается в примере 3.
На фиг. 159A и 159B показаны результаты поворота Fab в формат открывалки, с применением scFv к CD3 и Fab, которые разработали. На фиг. 159A показан анализ на связывание, а на фиг. 159B показан анализ на RTCC.
На фиг. 160A-160E показаны результаты раунда 2 гуманизации, как описано в примере 3. Следует отметить, что XENP13967 является эквивалентом XENP14045 на стороне CD123; 13967 имеет разный scFv CD3, как показано в последовательностях.
На фиг. 161 показаны результаты анализа Tm раунда 2 согласно примеру 3.
На фиг. 162A-162D показаны последовательности нескольких пригодных основных цепей формата открывалки без последовательностей Fv (например, scFv и vh и vl для стороны Fab). Как будет понятно специалистам в данной области и описано ниже по тексту, такие последовательности могут быть использованы с любой из пар vh и vl, описанных в данном документе, с одним мономером, в том числе scFv (необязательно включая заряженный линкер scFv), и другим мономером, в том числе последовательностями Fab (например, vh, присоединенный к тяжелой цепи стороны Fab, и vl, присоединенный к константному домену легкой цепи). scFv может быть антителом к CD3 или антителом к TTA, при этом Fab должен быть другим. То есть, любые последовательности Fv, описанные в настоящем документе для CD3, CD123, CD38, CD19 или CD20, могут быть включены в данные основные цепи фигуры 162 в любой комбинации.
Следует отметить, что такие основные цепи открывалки нашли применение в формате с центральным scFv из фиг. 1B, где дополнительный второй Fab (vh-CH1 и vl-константный домен легкой цепи) с таким же связыванием антигена, что и у первого Fab, добавили к N-концу scFv на стороне открывалки.
На фиг. 163 показана последовательность основной цепи mAb-scFv, применяемой в настоящем изобретении, к которой добавлены последовательности Fv по настоящему изобретению. Как будет понятно специалистам в данной области и описано ниже по тексту, такие последовательности могут быть использованы с любой из пар vh и vl, описанных в данном документе, с одним мономером, в том числе как Fab, так и scFv (необязательно включая заряженный линкер scFv), и другим мономером, в том числе последовательностью Fab (например, vh, присоединенный к тяжелой цепи стороны Fab, и vl, присоединенный к константному домену легкой цепи). Сторона мономера 1 представляет собой сторону отрицательного Fab-scFv с измененной pI и включает варианты гетеродимеризации L368D/K370S, изостерические варианты с измененной pI N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, варианты с нарушением E233P/L234V/L235A/G236del/S267K (все относительно IgG1). Сторона мономера 2 представляет собой сторону положительного scFv с измененной pI и включает варианты гетеродимеризации 364K/E357Q. Однако могут быть заменены другие пары асимметричных вариантов, в частности, [S364K/E357Q: L368D/K370S]; [L368D/K370S: S364K]; [L368E/K370S: S364K]; [T411T/E360E/Q362E: D401K]; [L368D/K370S: S364K/E357L] и [K370S: S364K/E357Q].
Подробное описание изобретения
I. Определения.
Для того, чтобы настоящая заявка была более понятной, ниже изложены некоторые определения. Подразумевается, что такие определения охватывают грамматические эквиваленты.
Под термином нарушение в данном документе подразумевается снижение или устранение активности. Так, например, выражение нарушение связывания с FcyR означает, что аминокислотный вариант Fc-области характеризуется менее чем 50% связыванием от исходного уровня по сравнению с Fcобластью, не содержащей этот конкретный вариант, с менее чем 70-80-90-95-98% потерей активности, являющейся предпочтительной, и в целом с активностью, которая ниже уровня обнаруживаемого связывания в анализе Biacore. Особенно пригодными в нарушении связывания с FcyR являются те, которые показаны на фиг. 16.
Под используемым в данном документе термином ADCC или антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность подразумевается клеточноопосредованная реакция, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR, распознают связанное антитело на клеткемишени и затем вызывают лизис этой клетки-мишени. ADCC коррелирует со связыванием с FcYRIIIa; повышенная степень связывания с FcYRIIIa приводит к повышению ADCC-активности.
Под используемым в данном документе термином ADCP или антителозависимый клеточноопос- 11 036156 редованный фагоцитоз подразумевается клеточноопосредованная реакция, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR, распознают связанное антитело на клеткемишени и затем вызывают фагоцитоз этой клетки-мишени.
Под модификацией в данном документе подразумевается аминокислотная замена, вставка и/или делеция в полипептидной последовательности или изменение фрагмента, химически связанного с белком. Например, модификация может представлять собой измененный углевод или структуру PEG, присоединенную к белку. Под аминокислотной модификацией в данном документе подразумевается аминокислотная замена, вставка и/или делеция в полипептидной последовательности. Для ясности, если не указано иное, аминокислотная модификация всегда соответствует аминокислоте, кодируемой ДНК, например, 20 аминокислотам, которые имеют кодоны в ДНК и РНК.
Под аминокислотной заменой или заменой в данном документе подразумевается замещение аминокислоты в конкретном положении в исходной полипептидной последовательности другой аминокислотой. В частности, в некоторых вариантах осуществления замена касается аминокислоты, которая не встречается в естественных условиях в конкретном положении, либо не встречается в естественных условиях в данном организме, или в любом организме. Например, замена E272Y относится к варианту полипептида, в данном случае к Fc-варианту, в котором глутаминовая кислота в положении 272 замещена тирозином. Для ясности, белок, который был сконструирован с изменением кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты, но без изменения исходной аминокислоты (например, замена CGG (кодирующий аргинин) на CGA (по-прежнему кодирующий аргинин), с целью повышения уровней экспрессии в организме-хозяине), не предусматривает аминокислотную замену; то есть, несмотря на создание нового гена, кодирующего тот же белок, если белок содержит такую же аминокислоту в том конкретном положении, с которого он начинался, это не является аминокислотной заменой.
Под аминокислотной вставкой или вставкой в данном документе подразумевается добавление аминокислотной последовательности в конкретном положении в исходной полипептидной последовательности. Например, -233E или 233E обозначает вставку глутаминовой кислоты после положения 233 и перед положением 234. Дополнительно, -233ADE или A233ADE обозначает вставку AlaAspGlu после положения 233 и перед положением 234.
Под делецией аминокислоты или делецией в данном документе подразумевается удаление аминокислотной последовательности в конкретном положении в исходной полипептидной последовательности. Например, E233- или E233# или E233() обозначает делецию глутаминовой кислоты в положении 233. Дополнительно, EDA233- или EDA233# обозначает делецию последовательности GluAspAla, которая начинается в положении 233.
Под вариантным белком, или белковым вариантом, или вариантом, используемым в данном документе, подразумевается белок, который отличается от исходного белка благодаря по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Белковый вариант может относиться к самому белку, композиции, содержащей белок, или к аминокислотной последовательности, которая его кодирует. Предпочтительно белковый вариант предусматривает по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с исходным белком, например, от приблизительно одной до приблизительно семидесяти аминокислотных модификаций и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти аминокислотных модификаций по сравнению с исходным белком. Как описано ниже, в некоторых вариантах осуществления исходный полипептид, например исходный Fc-полипептид, представляет собой последовательность дикого типа человека, такую как Fc-область из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, хотя последовательности человека с вариантами также могут служить в качестве исходных полипептидов, например, гибрид IgG1/2 из фиг. 19. Последовательность белкового варианта в данном документе предпочтительно будет обладать по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с исходной последовательностью белка и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95-98-99% идентичностью. Вариантный белок может относиться к самому вариантному белку, композициям, содержащим белковый вариант, или к последовательности ДНК, которая его кодирует. Соответственно, под вариантом антитела или вариантным антителом, используемым в данном документе, подразумевается антитело, которое отличается от исходного благодаря по меньшей мере одной аминокислотной модификации, вариант IgG или вариантный IgG, используемый в данном документе, означает антитело, которое отличается от исходного IgG (опять-таки во многих случаях от последовательности IgG человека) благодаря по меньшей мере одной аминокислотной модификации, и вариант иммуноглобулина или вариантный иммуноглобулин, используемый в данном документе, означает последовательность иммуноглобулина, которая отличается от последовательности исходного иммуноглобулина благодаря по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Термин Fc-вариант или вариантный Fc, используемый в данном документе, означает белок, предусматривающий аминокислотную модификацию в Fc-домене. Fc-варианты по настоящему изобретению определены в соответствии с аминокислотными модификациями, которые их образуют. Таким образом, например, N434S или 434S представляет собой Fc-вариант с заменяющим серином в положении 434 относительно исходного Fc-полипептида, где нумерация соответствует EU-индексу. Аналогично, M428L/N434S определяет Fc-вариант с заменами M428L и N434S относительно исходного Fc- 12 036156 полипептида. Идентичность аминокислоты WT (дикого типа) может быть не определена, и в этом случае указанный выше вариант упоминается как 428L/434S. Отмечается, что порядок, в котором предусматриваются замены, является произвольным, то есть, например, 428L/434S представляет собой тот же Fcвариант, что и M428L/N434S, и так далее. Для всех положений, обсуждаемых в настоящем изобретении, которые относятся к антителам, если не указано иное, нумерация аминокислотных положений соответствует EU-индексу. EU-индекс, или EU-индекс по Kabat, или схема нумерации согласно EU относится к нумерации антитела согласно EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85, полностью включена в данный документ посредством ссылки). Модификация может представлять собой добавление, делецию или замену. Замены могут включать аминокислоты, встречающиеся в естественных условиях, и, в некоторых случаях, синтетические аминокислоты. Примеры включают патент США № 6586207; WO 98/48032; WO 03/073238; US2004-0214988A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524А2; J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem. BioChem. 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024; и L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10, все полностью включены посредством ссылки.
Используемый в данном документе термин белок означает по меньшей мере две ковалентно соединенные аминокислоты, при этом термин в себя белки, полипептиды, олигопептиды и пептиды. Пептидильная группа может содержать встречающиеся в естественных условиях аминокислоты и пептидные связи или синтетические пептидомиметические структуры, т.е. аналоги, такие как пептоиды (см. Simon et al., PNAS USA 89(20):9367 (1992), полностью включенную посредством ссылки). Аминокислоты могут быть либо встречающимися в естественных условиях, либо синтетическими (например, не являющимися аминокислотами, которые кодируются ДНК), как будет понятно специалистам в данной области. Например, гомофенилаланин, цитруллин, орнитин и норлейцин считаются синтетическими аминокислотами для целей настоящего изобретения, и могут использоваться аминокислоты как D-, так и L- (R или S) конфигурации. Варианты настоящего изобретения могут предусматривать модификации, которые включают применение синтетических аминокислот, включая применение, например, технологий, разработанных Schultz и его коллегами, включая без ограничения способы, описанные Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20 (12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303 (5656):371-3 и Chin et al., 2003, Science 301 (5635): 964-7, все полностью включены посредством ссылки. Кроме того, полипептиды могут включать синтетическую дериватизацию одной или нескольких боковых цепей или концов, гликозилирование, пэгилирование, циклическую перестановку, циклизацию, линкеры с другими молекулами, слияние с белками или белковыми доменами и добавление пептидных меток или меток.
Под термином остаток, используемым в данном документе, подразумевается положение в белке и ассоциированная с ним аминокислотная идентичность. Например, аспарагин 297 (также называемый Asn297 или N297) представляет собой остаток в положении 297 в антителе IgG1 человека.
Под термином Fab или Fab-область, используемым в данном документе, подразумевается полипептид, который содержит VH-, CH1-, VL- и CL-домены иммуноглобулина. Fab может относиться к этой области самой по себе или к этой области в контексте полноразмерного антитела, фрагмента антитела или белка слияния на основе Fab. Под термином Fv, или Fv-фрагмент, или Fv-область, используемым в данном документе, подразумевается полипептид, который содержит VL- и VH-домены одного антитела. Как будет понятно специалистам в данной области, они обычно состоят из двух цепей.
Под выражением модификация подкласса IgG или модификация изотипа, используемым в данном документе, подразумевается аминокислотная модификация, которая обеспечивает превращение одной аминокислоты одного изотипа IgG в соответствующую аминокислоту другого выровненного изотипа IgG. Например, поскольку IgG1 содержит тирозин, a IgG2 содержит фенилаланин в положении 296 согласно EU, замена F296Y в IgG2 считается модификацией подкласса IgG.
Под выражением не встречающаяся в естественных условиях модификация, используемым в данном документе, подразумевается аминокислотная модификация, которая не является изотипической. Например, поскольку ни один из IgG не содержит серии в положении 434, замена 434S в IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (или их гибридах) считается не встречающейся в естественных условиях модификацией.
Под термином аминокислота и аминокислотная идентичность, используемым в данном документе, подразумевается одна из 20 встречающихся в естественных условиях аминокислот, которые кодируются ДНК и РНК.
Под термином эффекторная функция, используемым в данном документе, подразумевается биохимическое событие, которое возникает в результате взаимодействия Fc-области антитела с Fcрецептором или лигандом. Эффекторные функции включают без ограничения ADCC, ADCP и CDC.
Под термином лиганд Fc IgG, используемым в данном документе, подразумевается молекула, предпочтительно полипептид, из любого организма, которая связывается с Fc-областью IgG-антитела с образованием комплекса Fc/лиганд Fc. Лиганды Fc включают без ограничения FcyRI, FcyRII, FcyRIII, FcRn, C1q, C3, маннан-связывающий лектин, маннозный рецептор, стафилококковый белок A, стрептококковый белок G и вирусный FcyR. Лиганды Fc также включают гомологи Fc-рецептора (FcRH), кото
- 13 036156 рые представляют собой семейство Fc-рецепторов, гомологичных FcyR (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136, полностью включена посредством ссылки). Лиганды Fc могут включать неизвестные молекулы, которые связывают Fc. Конкретными лигандами Fc IgG являются FcRn и Fc-гаммарецепторы. Под термином лиганд Fc, используемым в данном документе, подразумевается молекула, предпочтительно полипептид, из любого организма, которая связывается с Fc-областью антитела с образованием комплекса Fc/лиганд Fc.
Под термином Fc-гамма-рецептор, FcyR или Fc-гамма R, используемым в данном документе, подразумевается любой представитель семейства белков, который связывает Fc-область IgG-антитела и кодируется геном FcyR. У человека это семейство включает без ограничения FcyRI (CD64), в том числе изоформы FcYRIa, FcYRIb и FcyRIc; FcyRII (CD32), в том числе изоформы FcYRIIa (включая аллотипы H131 и R131), FcYRIIb (включая FcYRIIb-1 и FcYRIIb-2) и FcyRIIc; и FcyRIII (CD16), в том числе изоформы FcYRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcYRIIIb (включая аллотипы FcYRIIb-NA1 и FcYRIIbNA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, полностью включенная посредством ссылки), а также любые неизвестные FcyR или изоформы или аллотипы FcyR человека. FcyR может происходить из любого организма, включая без ограничения людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян. FcyR мыши включают без ограничения FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) и FcyRIII-2 (CD16-2), а также любые неизвестные FcyR мыши или изоформы или аллотипы FcyR.
Под термином FcRn или неонатальный Fc-рецептор, используемым в данном документе, подразумевается белок, который связывается с Fc-областью IgG-антитела и кодируется, по меньшей мере частично, геном FcRn. FcRn может происходить из любого организма, включая без ограничения людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян. Как известно из уровня техники, функциональный белок FcRn содержит два полипептида, часто называемых тяжелой цепью и легкой цепью. Легкая цепь представляет собой бета-2-микроглобулин, и тяжелая цепь кодируется геном FcRn. Если в данном документе не указано иное, FcRn или белок FcRn относятся к комплексу тяжелой цепи FcRn с бета-2-микроглобулином. Различные варианты FcRn, применяемые для повышения степени связывания с рецептором FcRn и, в некоторых случаях, для увеличения периода полужизни в сыворотке, показаны в пояснениях к фиг., относящейся к фиг. 83.
Под термином исходный полипептид, используемым в данном документе, подразумевается начальный полипептид, который затем модифицируют с получением варианта. Исходный полипептид может представлять собой встречающийся в естественных условиях полипептид, или вариант, или сконструированную версию встречающегося в естественных условиях полипептида. Исходный полипептид может относиться к самому полипептиду, композициям, содержащим исходный полипептид, или к аминокислотной последовательности, которая его кодирует. Соответственно, под термином исходный иммуноглобулин, используемым в данном документе, подразумевается немодифицированный полипептид иммуноглобулина, который модифицируют с получением варианта, и под термином исходное антитело, используемым в данном документе, подразумевается немодифицированное антитело, которое модифицируют с получением вариантного антитела. Следует отметить, что исходное антитело включает в себя известные полученные рекомбинантным путем коммерческие антитела, описанные ниже.
Под Fc или Fc-областью или Fc-доменом, используемыми в данном документе, подразумевается полипептид, содержащий константную область антитела кроме первого домена константной области иммуноглобулина и, в некоторых случаях, части шарнира. Таким образом, Fc относится к последним двум доменам константной области иммуноглобулинов IgA, IgD и IgG, последним трем доменам константной области иммуноглобулинов IgE и IgM и гибкому шарниру с N-конца от этих доменов. В случае IgA и IgM Fc может включать J-цепь. В случае IgG Fc-домен содержит домены иммуноглобулинов Cy2 и Cy3 (Cy2 и Cy3) и нижнюю область шарнира между Cy1 (Cy1) и Cy2 (Cy2). Несмотря на то, что границы Fc-участка могут варьировать, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно определяется как содержащая остатки C226 или Р230 на его карбоксильном конце, где нумерация приведена согласно EUиндексу по Kabat. В некоторых вариантах осуществления, как более подробно описано ниже, аминокислотные модификации производят в Fc-области, например, для изменения связывания с одним или несколькими рецепторами FcyR или с рецептором FcRn.
Под термином константная область тяжелой цепи в данном документе подразумевается часть антитела CH1-шарнир-CH2-CH3.
Под термином белок слияния на основе Fc или иммуноадгезин в данном документе подразумевается белок, содержащий Fc-область, как правило соединенную (необязательно посредством линкерного фрагмента, как описано в данном документе) с другим белком, таким как фрагмент связывания с белком-мишенью, описываемым в данном документе. В некоторых случаях один мономер гетеродимерного антитела содержит тяжелую цепь антитела (включающую scFv или дополнительно включающую легкую цепь), а другой мономер представляет собой Fc-гибрид, содержащий вариантный Fc-домен и лиганд. В некоторых вариантах осуществления эти наполовину антитела-наполовину белки слияния упоминаются как антитела слияния.
Под термином положение, используемым в данном документе, подразумевается местоположение
- 14 036156 в последовательности белка. Положения могут быть пронумерованы последовательно или в соответствии с установленным форматом, например EU-индексом для нумерации антител.
Под термином антиген-мишень, используемым в данном документе, подразумевается молекула, которая специфически связывается вариабельной областью данного антитела. Антигеном-мишенью может быть белок, углевод, липид или другое химическое соединение. Ниже описано большое количество подходящих антигенов-мишеней.
Под термином нитевая структура в контексте мономеров гетеродимерных антител по настоящему изобретению в данном документе подразумевается, что подобно двум нитям ДНК, которые соответствуют, варианты гетеродимеризации включены в каждый мономер таким образом, чтобы сохранить способность соответствовать с образованием гетеродимеров. Например, если некоторые варианты с измененной pI сконструированы с образованием мономера A (например, с обеспечением более высокой pI), тогда стерические варианты, являющиеся парами по заряду, которые также могут использоваться, не нарушают функцию вариантов с измененной pI, например, заряженные варианты, которые делают pI выше, помещают в одну и ту же нить или мономер для сохранения обеих функциональных возможностей. Аналогичным образом, для асимметричных вариантов, которые входят в пары набора, как более подробно описано ниже, специалист в данной области примет во внимание pI при принятии решения о том, в какую нить или мономер будет включен один набор из пары так, что разделение по pI максимизируется также с помощью pI структур асимметрии.
Под термином клетка-мишень, используемым в данном документе, подразумевается клетка, которая экспрессирует антиген-мишень.
Под термином вариабельная область, используемым в данном документе, подразумевается область в иммуноглобулине, которая содержит один или несколько доменов Ig, главным образом кодируемых любым из генов V.kappa., V.lamda. и/или VH, которые составляют генетические локусы каппа, лямбда и тяжелой цепи иммуноглобулина соответственно.
Термин дикий тип или WT в данном документе означает аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая обнаруживается в естественных условиях, включая аллельные варианты. Белок WT имеет аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая не была преднамеренно модифицирована.
Антитела по настоящему изобретению являются, как правило, выделенными или рекомбинантными. Выделенный при использовании для описания различных полипептидов, раскрытых в данном документе, означает полипептид, который был идентифицирован и выделен и/или извлечен из клетки или клеточной культуры, в которой он был экспрессирован. Обычно выделенный полипептид будут получать с помощью по меньшей мере одной стадии очистки. Выделенное антитело относится к антителу, которое практически не содержит других антител, обладающих отличающейся антигенной специфичностью. Рекомбинантный означает, что антитела получают с помощью методов рекомбинантных нуклеиновых кислот в экзогенных клетках-хозяевах.
Специфическое связывание или специфически связывается с или является специфическим для в отношении конкретного антигена или эпитопа означает связывание, которое заметно отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание можно измерить, например, путем определения связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу с аналогичной структурой, которая не обладает активностью связывания. Например, специфическое связывание можно определить по конкуренции с контрольной молекулой, которая аналогична мишени.
Специфическое связывание для конкретного антигена или эпитопа может быть продемонстрировано, например, антителом, характеризующимся KD для антигена или эпитопа по меньшей мере приблизительно 10-4 M, по меньшей мере приблизительно 10-5 M, по меньшей мере приблизительно 10-6 M, по меньшей мере приблизительно 10-7 M, по меньшей мере приблизительно 10-8 M, по меньшей мере приблизительно 10-9 M, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 10-10 M, по меньшей мере приблизительно 10-11 M, по меньшей мере приблизительно 10-12 M или больше, где KD означает скорость диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитело, которое специфически связывает антиген, будет характеризоваться KD, которая в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или более раз выше для контрольной молекулы по сравнению с антигеном или эпитопом.
Кроме того, специфическое связывание конкретного антигена или эпитопа может быть продемонстрировано, например, антителом, характеризующимся KA или Ka для антигена или эпитопа по меньшей мере в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или более раз выше для эпитопа по сравнению с контролем, где KA или Ka означает скорость ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Аффинность связывания, как правило, измеряют с применением анализа Biacore.
II. Краткий обзор.
Биспецифические антитела, которые совместно контактируют с CD3 и опухолевым антигеноммишенью, были сконструированы и применялись для перенаправления T-клеток для атаки и лизиса целевых опухолевых клеток. Примеры включают форматы BiTE и DART, которые моновалентно контактируют с CD3 и опухолевым антигеном. Несмотря на то, что подход целенаправленного воздействия на
- 15 036156
CD3 показал значительные перспективы, распространенный побочный эффект таких методов терапии связан с выработкой цитокинов, что часто приводит к токсическому синдрому высвобождения цитокинов. Поскольку связывающий домен биспецифического антитела к CD3 контактирует со всеми Tклетками, привлекается субпопуляция CD4 T-клеток, продуцирующих цитокины на высоком уровне. Более того, субпопуляция CD4 T-клеток включает регуляторные T-клетки, привлечение и размножение которых потенциально может привести к подавлению иммунитета и оказать негативное влияние на долгосрочное подавление опухоли. Кроме того, эти форматы не содержат Fc-домены и характеризуются очень короткими периодами полужизни в сыворотке пациентов.
Несмотря на то, что подход целенаправленного воздействия на CD3 показал значительные перспективы, распространенный побочный эффект таких методов терапии связан с выработкой цитокинов, что часто приводит к токсическому синдрому высвобождения цитокинов. Поскольку связывающий домен биспецифического антитела к CD3 контактирует со всеми T-клетками, привлекается субпопуляция CD4 T-клеток, продуцирующих цитокины на высоком уровне. Более того, субпопуляция CD4 T-клеток включает регуляторные T-клетки, привлечение и размножение которых потенциально может привести к подавлению иммунитета и оказать негативное влияние на долгосрочное подавление опухоли. Одним из таких возможных путей снижения выработки цитокинов и, возможно, снижения активации CD4 T-клеток является снижение аффинности домена, связывающегося с CD3, по отношению к CD3.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает конструкции антител, содержащие антигенсвязывающие домены антитела к CD3, которые являются сильными или высокоаффинными связующими CD3 (например, один из примеров представляет собой вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, изображенные как H1.30_L1.47 (необязательно, включая соответствующий заряженный линкер)), а также связываются с CD38. В других вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает конструкции антител, содержащие антигенсвязывающие домены антитела к CD3, которые являются слабыми или с более низкой аффинностью связующими CD3. Дополнительные варианты осуществления предусматривают конструкции антител, содержащие антигенсвязывающие домены антитела к CD3, которые характеризуются средней или промежуточной аффинностью к CD3, которые также связываются с CD38. Аффинность, как правило, измеряют с применением анализа Biacore.
Следует понимать, что последовательности с высокой, промежуточной, низкой аффинностью к CD3 по настоящему изобретению можно применять в различных форматах гетеродимеризации. Хотя в большей части раскрытия в данном документе применяется формат гетеродимеров в виде открывалки, эти вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепей, а также последовательности scFv (и последовательности Fab, содержащие эти вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепей) можно применять в других форматах, таких как показанные на фиг. 2 из публикации WO 2014/145806, фигуры, форматы и пояснения обозначений которых явным образом включены в данный документ посредством ссылки.
Соответственно, настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, которые связываются с двумя различными антигенами, например, антитела, которые являются биспецифическими в том смысле, что они связывают два разных антигена-мишени, как правило, опухолевые антигенымишени (TTA), описываемые ниже. Данные гетеродимерные антитела могут связывать эти антигенымишени либо моновалентно (например, имеется один антигенсвязывающий домен, такой как пара вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи), либо бивалентно (имеются два антигенсвязывающих домена, каждый из которых независимо связывает антиген). Структура гетеродимерных антител по настоящему изобретению основана на применении разных мономеров, предусматривающих аминокислотные замены, которые смещают образование гетеродимеров по сравнению с гомодимерами, как это более подробно описано ниже, в сочетании с вариантами с измененной pI, что упрощает очистку гетеродимеров от гомодимеров, что также описано ниже. Что касается гетеродимерных биспецифических антител по настоящему изобретению, настоящее изобретение в целом основывается на применении сконструированных или вариантных Fc-доменов, которые могут подвергаться самосборке в вырабатывающих клетках с получением гетеродимерных белков, а также способах получения и очистки таких гетеродимерных белков.
III. Антитела.
Настоящее изобретение относится к получению биспецифических антител, которые связывают два разных антигена, например, CD3 и опухолевый антиген-мишень, такой как CD19, CD20, CD38 и CD123, и представляют собой, как правило, терапевтические антитела. Как обсуждается ниже, термин антитело используется в общем смысле. Антитела, которые находят применение в настоящем изобретении, могут принимать ряд форматов, описанных в данном документе, включая традиционные антитела, а также производные антител, фрагменты и миметики, описанные в данном документе.
Традиционные структурные единицы антитела обычно включают в себя тетрамер. Каждый тетрамер, как правило, состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара имеет одну легкую (как правило, с молекулярной массой приблизительно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (как правило, с молекулярной массой приблизительно 50-70 кДа) Легкие цепи человека классифицируются как легкие
- 16 036156 каппа- и лямбда-цепи. Настоящее изобретение относится к классу IgG, который имеет несколько подклассов, включая без ограничения IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Следует отметить, что IgG1 обладает разными аллотипами с полиморфизмами в 356 (D или Е) и 358 (L или М). В последовательностях, представленных в данном документе, используется аллотип 356D/358M, хотя в документ включен другой аллотип. То есть, любая последовательность, включая Fc-домен IgG1, включенный в данный документ, может иметь 356E/358L, заменяющий аллотип 356D/358M.
Кроме того, многие из последовательностей в данном документе имеют по меньшей мере один цистеин в положении 220, замененный серином; в большинстве последовательностей, представленных в данном документе, он находится, как правило, со стороны мономера scFv, хотя он может также находиться со стороны мономера Fab, или с обоих сторон, с уменьшенным образованием дисульфида. Специфически включенными в последовательности данного документа являются один или оба из этих замененных цистеинов (C220S).
Таким образом, используемый в данном документе термин изотип означает любой из подклассов иммуноглобулинов, определяемых химическими и антигенными характеристиками их константных областей. Следует понимать, что терапевтические антитела также могут предусматривать гибриды изотипов и/или подклассов. Например, как показано в публикации US 2009/0163699, включенной посредством ссылки, настоящее изобретение охватывает конструирование гибридов IgG1/G2 с учетом pI.
Аминоконцевая часть каждой цепи включает в себя вариабельную область из от приблизительно 100 до 110 или больше аминокислот, которые в первую очередь отвечают за распознавание антигена, обычно упоминаемую в данной области техники и в данном документе как Fv-домен или Fv-область. В вариабельной области три петли собраны для каждого из V-доменов тяжелой цепи и легкой цепи с образованием антигенсвязывающего участка. Каждая из петель упоминается как определяющая комплементарность область (в дальнейшем называемая CDR), в котором изменение аминокислотной последовательности является наиболее значимым. Изменение относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельной области сильно различаются по последовательности между антителами. Вариабельность в пределах вариабельной области распределена неравномерно. В отличие от этого, V-области состоят из относительно инвариантных отрезков, называемых каркасными областями (FR), из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями исключительной вариабельности, называемыми гипервариабельными областями, каждая из которых длиной 9-15 аминокислот или длиннее.
Каждый VH и VL состоит из трех гипервариабельных областей (определяющих комплементарность областей, CDR) и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
Гипервариабельная область обычно охватывает аминокислотные остатки приблизительно из аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1; L обозначает легкую цепь), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и поблизости приблизительно 31-35В (HCDR1; Н обозначает тяжелую цепь), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд. (1991) и/или те остатки, которые образуют гипервариабельную петлю (например, остатки 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) и 96-101 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917. Конкретные CDR по настоящему изобретению описаны ниже.
Как будет понятно специалистам в данной области, точная нумерация и размещение CDR могут отличаться среди разных систем нумерации. Однако следует понимать, что раскрытие последовательности вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи включает раскрытие ассоциированных CDR. Соответственно, раскрытие каждой вариабельной области тяжелой цепи представляет собой раскрытие vhCDR (например, vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3), и раскрытие каждой вариабельной области легкой цепи представляет собой раскрытие vlCDR (например, vlCDR1, vlCDR2 и vlCDR3).
В настоящем описании обычно применяется система нумерации по Kabat при упоминании остатка в вариабельном домене (примерно остатки 1-107 вариабельной области легкой цепи и остатки 1-113 вариабельной области тяжелой цепи), и система нумерации согласно EU для Fc-областей (например, Kabat et al., supra (1991)).
Настоящее изобретение предусматривает большое число различных наборов CDR. В этом случае полный набор CDR включает в себя три CDR вариабельной области легкой цепи и три CDR вариабельной области тяжелой цепи, например, vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 и vhCDR3. Они могут быть частью более крупного вариабельного домена легкой цепи или вариабельного домена тяжелой цепи соответственно. Кроме того, как более подробно описано в данном документе, вариабельные домены тяжелой цепи и вариабельные домены легкой цепи могут находиться в отдельных полипептидных цепях, в случае применения тяжелой и легкой цепей (например, когда используют Fab), или в одной полипептидной цепи в случае последовательностей scFv.
CDR участвуют в образовании антигенсвязывающего или, более конкретно, эпитопсвязывающего участка антител. Эпитоп относится к детерминанте, которая взаимодействует с конкретным антигенсвязывающим участком в вариабельной области молекулы антитела, известным как паратоп. Эпитопы
- 17 036156 представляют собой группы молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно обладают определенными структурными характеристиками, а также определенными характеристиками заряда. Один антиген может иметь более чем один эпитоп.
Эпитоп может включать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании (также называемые иммунодоминантным компонентом эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не участвуют в связывании, такие как аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфически связывающим антиген пептидом; другими словами, аминокислотный остаток находится в пределах области распознавания специфически связывающего антиген пептида.
Эпитопы могут быть либо конформационными, либо линейными. Конформационный эпитоп образуется пространственно расположенными рядом аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, образуемый соседними аминокислотными остатками в полипептидной цепи. Конформационные и неконформационные эпитопы можно отличить по тому, что связывание с первым, но не с последним, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей.
Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3 и, чаще, по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Антитела, которые распознают один и тот же эпитоп, могут быть установлены в простом иммунологическом анализе, показывающем способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью, например, в сортировке.
Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область, в первую очередь отвечающую за эффекторную функцию. Kabat et al. получили множество первичных последовательностей вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей. Основываясь на степени консервативности последовательностей, они классифицировали отдельные первичные последовательности на CDR и каркасы и составили их перечень (см. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5-е изд., публикация NIH, No. 91-3242, Е.А. Kabat et al., полностью включенную посредством ссылки).
В подклассе иммуноглобулинов IgG в тяжелой цепи имеется несколько иммуноглобулиновых доменов. Домен иммуноглобулина (Ig) в данном документе означает область иммуноглобулина, имеющую определенную третичную структуру. В настоящем изобретении представляют интерес домены тяжелой цепи, включая константные домены тяжелой цепи (CH) и шарнирные домены. Что касается IgGантител, изотипы IgG имеют по три CH-области. Соответственно, CH''-домены применительно к IgG представляют собой следующее: CH1 относится к положениям 118-220 согласно EU-индексу по Kabat. CH2 относится к положениям 237-340 согласно EU-индексу по Kabat и CH3 относится к положениям 341-447 согласно EU-индексу по Kabat. Как показано в данном документе и описано ниже, варианты с измененной pI могут быть в одной или нескольких CH-областях, а также в шарнирной области, обсуждаемой ниже.
Следует отметить, что последовательности, представленные в данном документе, начинаются с СН1-области в положении 118; вариабельные области не включены, если не указано иное. Например, первая аминокислота SEQ ID NO: 2, обозначенная как положение 1 в перечне последовательностей, соответствует положению 118 СН1-области согласно нумерации EU.
Другим типом домена Ig тяжелой цепи является шарнирная область. Под термином шарнир или шарнирная область или шарнирная область антитела или шарнирная область иммуноглобулина в данном документе подразумевается гибкий полипептид, включающий в себя аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно СН1-домен IgG заканчивается в положении 220 по EU, а СН2-домен IgG начинается с положения остатка 237 по EU. Таким образом, для IgG шарнир антитела определен в данном документе как включающий положения с 221 (D221 в IgG1) по 236 (G236 в IgG1), где нумерация соответствует EU-индексу по Kabat. В некоторых вариантах осуществления, например в отношении Fc-области, включается нижний шарнир, причем нижний шарнир, как правило, относится к положениям 226 или 230. Как отмечено в данном документе, варианты с измененной pI могут быть выполнены также в шарнирной области.
Легкая цепь обычно содержит два домена, вариабельный домен легкой цепи (содержащий CDR легкой цепи и, вместе с вариабельными доменами тяжелой цепи, образующий Fv-область) и константную область легкой цепи (часто обозначаемую как CL или Ск).
Другой областью, представляющей интерес для дополнительных замен, описанных ниже, является Fc-область.
Таким образом, настоящее изобретение предусматривает различные домены антитела. Как описано в данном документе и известно из уровня техники, гетеродимерные антитела по настоящему изобретению содержат разные домены в пределах тяжелой и легкой цепей, которые также могут перекрываться. Эти домены включают без ограничения Fc-домен, СН1-домен, СН2-домен, СН3-домен, шарнирный домен, константный домен тяжелой цепи (СН1-шарнир-Бс-домен или СН1-шарнир-СН2-СН3), вариабельный домен тяжелой цепи, вариабельный домен легкой цепи, константный домен легкой цепи, FAbдомены и scFv-домены.
Таким образом, Fc-домен включает в себя -СН2-СН3-домен и необязательно шарнирный домен. В вариантах осуществления в данном документе, если scFv присоединен к Fc-домену, то он представляет
- 18 036156 собой C-конец конструкции scFv, которая присоединена к шарниру Fc-домена; например, как правило, он присоединен к последовательности EPKS, что является началом шарнира. Тяжелая цепь включает вариабельный домен тяжелой цепи и константный домен, который включает не обязательно содержащий CH1 домен шарнир-Fc, содержащий CH2-CH3. Легкая цепь включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. scFv содержит вариабельную область тяжелой цепи, линкер scFv и вариабельный домен легкой цепи. В большинстве конструкций и последовательностей, описанных в данном документе, C-конец вариабельной области легкой цепи присоединен к N-концу линкера scFv, Cконец которого присоединен к N-концу вариабельной области тяжелой цепи (N-vh-линкер-vl-C), хотя они могут быть поменяны местами ^-тГлинкер-т^О).
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают по меньшей мере один scFv-домен, который, хотя и не встречается в естественных условиях, обычно включает вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, соединенные вместе линкером scFv. Как показано в данном документе, существует ряд подходящих линкеров scFv, которые можно применять, включая традиционные пептидные связи, получаемые с применением рекомбинантных методик.
Линкерный пептид может преимущественно включать следующие аминокислотные остатки: Gly, Ser, Ala или Thr. Линкерный пептид должен иметь длину, достаточную для связывания двух молекул таким образом, что они принимают правильную конформацию относительно друг друга, так что они сохраняют желаемую активность. В одном варианте осуществления линкер составляет от приблизительно 1 до 50 аминокислот в длину, предпочтительно от приблизительно 1 до 30 аминокислот в длину. В одном варианте осуществления можно применять линкеры длиной от 1 до 20 аминокислот, причем в некоторых вариантах осуществления находят применение от приблизительно 5 до приблизительно 10 аминокислот. Пригодные линкеры включают в себя глицин-сериновые полимеры, в том числе, например (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n и (GGGS)n, где n представляет собой целое число, равное по меньшей мере единице (и обычно от 3 до 4), глицин-аланиновые полимеры, аланин-сериновые полимеры и другие гибкие линкеры. Альтернативно, в качестве линкеров можно применять различные небелковые полимеры, включая без ограничения полиэтиленгликоль (PEG), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, то есть они могут найти применение в качестве линкеров.
Другие линкерные последовательности могут включать любую последовательность любой длины домена CL/CH1, но не все остатки домена CL/CH1; например, первые 5-12 аминокислотных остатков доменов CL/CH1. Линкеры можно получить из легкой цепи иммуноглобулина, например Ск или CZ. Линкеры можно получить из тяжелых цепей иммуноглобулина любого изотипа, включая, например, Ογ1, C','2. Суз. CM. Cal, Ca2, Οδ, Οε и Ομ. Линкерные последовательности могут быть также получены из других белков, таких как Ig-подобные белки (например, TCR, FcR, KIR), последовательности, производные от шарнирной области, и другие природные последовательности из других белков.
В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой междоменный линкер, применяемый для связывания любых двух доменов, как дополнительно описано в данном документе. Хотя можно применять любой подходящий линкер, во многих вариантах осуществления используют глицинсериновый полимер, включая, например, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n и (GGGS)n, где n представляет собой целое число, равное по меньшей мере единице (и обычно от 3 до 4 до 5), а также любую пептидную последовательность, которая обеспечивает возможность рекомбинантного соединения двух доменов с достаточной длиной и гибкостью, чтобы обеспечить для каждого домена сохранение его биологической функции. В некоторых случаях, и с уделением особого внимания нитевой структуре, как описано ниже, можно применять заряженные междоменные линкеры, применяемые в некоторых вариантах осуществления линкеров scFv.
В некоторых вариантах осуществления линкер scFv представляет собой заряженный линкер scFv, ряд которых показан на фиг. 33. Соответственно, настоящее изобретение дополнительно предусматривает заряженные линкеры scFv для облегчения разделения в отношении pI первого и второго мономеров. То есть путем включения заряженного линкера scFv, как положительного, так и отрицательного (или обоих, в случае каркасов, в которых применяют scFv в разных мономерах), это позволяет мономеру, содержащему заряженный линкер, изменять pI без внесения дополнительных изменений в Fc-домены. Эти заряженные линкеры могут быть заменены в любом scFv, содержащем стандартные линкеры. Кроме того, как будет понятно специалистам в данной области, заряженные линкеры scFv применяют в соответствующей нити или мономере согласно желаемым изменениями в отношении pI. Например, как обсуждается в данном документе, для получения гетеродимерного антитела в тройном F-формате рассчитывают исходную pI Fv-области для каждого из желаемых антигенсвязывающих доменов и один выбирают для получения scFv, и в зависимости от pI выбирают либо положительно, либо отрицательно заряженные линкеры.
Заряженные междоменные линкеры также можно применять для увеличения разделения в отношении pI мономеров по настоящему изобретению, и, таким образом, те, которые включены на фиг. 33, можно применить в любом варианте осуществления в данном документе, где используется линкер.
- 19 036156
В некоторых вариантах осуществления антитела являются полноразмерными. Под термином полноразмерное антитело в данном документе подразумевается структура, которая представляет собой природную биологическую форму антитела, том числе вариабельные и константные области, включая одну или несколько модификаций, описанных в данном документе, в частности, в Fc-доменах, с обеспечением либо возникновения гетеродимеризации, либо очистки гетеродимеров от гомодимеров. Полноразмерные антитела обычно включают Fab- и Fc-домены и могут дополнительно содержать добавочные антигенсвязывающие домены, такие как scFv, как это в целом показано на фигурах.
В одном варианте осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела в случае, когда он содержит по меньшей мере один константный домен, который может быть сконструирован с получением гетеродимеров, таких как сконструированные с учетом pI. Другие фрагменты антител, которые можно применять, включают фрагменты, которые содержат один или несколько из CH1-, CH2-, CH3-, шарнирного и CL-доменов по настоящему изобретению, которые были сконструированы с учетом pI. Например, Fc-гибриды представляют собой гибриды Fc-области (CH2 и CH3, необязательно с шарнирной областью), соединенной с другим белком. Ряд Fc-гибридов известен из уровня техники и может быть улучшен путем добавления вариантов гетеродимеризации по настоящему изобретению. В данном случае могут быть получены антитела слияния, содержащие CH1; CH1, CH2 и CH3; CH2; CH3; CH2 и CH3; CH1 и CH3, любой или все из которых могут быть получены необязательно с шарнирной областью, с использованием любой комбинации вариантов гетеродимеризации, описанных в данном документе.
В частности, форматы, изображенные на фиг. 1, представляют собой антитела, обычно называемые гетеродимерными антителами, что означает, что белок имеет по меньшей мере две ассоциированные Fc-последовательности, подвергающиеся самосборке в гетеродимерный Fc-домен.
Химерные и гуманизированные антитела
В некоторых вариантах осуществления антитело может представлять собой комбинацию от разных видов, например, химерное антитело и/или гуманизированное антитело. Как правило, как химерные антитела, так и гуманизированные антитела относятся к антителам, в которых объединены области из более чем одного вида. Например, химерные антитела традиционно содержат вариабельную область(вариабельные области) от мыши (или в некоторых случаях крысы) и константную область(константные области) от человека. Гуманизированные антитела обычно относятся к антителам, не являющимся человеческими, в которых каркасные области вариабельного домена заменены последовательностями, обнаруживаемыми в антителах человека. Как правило в случае гуманизированного антитела все антитело, за исключением CDR, кодируется полинуклеотидом человеческого происхождения или идентично такому антителу, за исключением его CDR. CDR, некоторые или все из которых кодируются нуклеиновыми кислотами, происходящими из организма, не являющимся человеческим, прививают в каркас бета-листа вариабельной области антитела человека с созданием антитела, специфичность которого определяется привитыми CDR. Создание таких антител описано, например, в WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536, все полностью включены посредством ссылки. Обратная мутация выбранных акцепторных остатков каркаса к соответствующим донорным остаткам часто требуется для восстановления аффинности, которая утрачивается в исходной привитой конструкции (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, все полностью включены посредством ссылки). Гуманизированное антитело в оптимальном случае также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека, и, таким образом, как правило, будет содержать Fc-область человека. Гуманизированные антитела могут быть также получены с использованием мышей с генетически сконструированными клетками иммунной системы. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654, полностью включена посредством ссылки. Различные методики и способы гуманизации и реконструирования антител, не являющихся человеческими, хорошо известны в данной области (см. Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of В Cells, 533-545, Elsevier Science (USA) и ссылки, цитируемые в данном документе, все полностью включены посредством ссылки). Способы гуманизации включают без ограничения способы, описанные в Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160:1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8, все полностью включены посредством ссылки. Гуманизация или другие способы снижения иммуногенности вариабельных областей антитела, не являющегося человеческим, могут включать в себя способы изменения поверхности, как описано, например, в Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973, полностью включенной посредством ссылки.
В конкретных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи от гена, кодирующего тяжелую цепь иммуноглобулина конкретной зародышевой линии, и/или вариабельную область легкой цепи от гена, кодирующего легкую цепь иммуноглобулина конкретной зародышевой линии. Например, такие антитела могут содержать или состоять из антитела человека, содержащего вариабельные области тяжелой или легкой цепи, которые представля
- 20 036156 ют собой продукт или получены из последовательности конкретной зародышевой линии. Антитело человека, которое представляет собой продукт или получено из последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, может быть идентифицировано как таковое посредством сравнения аминокислотной последовательности антитела человека с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека и отбора последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, которая является самой близкой (т.е. имеет самый большой % идентичности) к последовательности антитела человека. Антитело человека, которое представляет собой продукт или получено из последовательности иммуноглобулина конкретной зародышевой линии человека может содержать аминокислотные отличия в сравнении с последовательностью зародышевой линии, возникшие вследствие, например, естественных соматических мутаций или преднамеренного введения сайтнаправленной мутации. Однако аминокислотная последовательность гуманизированного антитела обычно по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека, и содержит аминокислотные остатки, по которым идентифицируют антитело как полученное из последовательностей человека при сравнении с аминокислотными последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии других видов (например, последовательностями зародышевой линии мышей). В некоторых случаях аминокислотная последовательность гуманизированного антитела может быть по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99%, или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, гуманизированное антитело, полученное из конкретной последовательности зародышевой линии человека будет демонстрировать не более 10-20 аминокислотных отличий по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека (перед введением туда каких-либо асимметричных вариантов, вариантов с измененной pI и вариантов с нарушением; то есть, количество вариантов перед введением вариантов по настоящему изобретению, как правило, является низким). В некоторых случаях гуманизированное антитело может демонстрировать не более 5 или даже не более 4, 3, 2 аминокислотных отличий или не более 1 аминокислотного отличия по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека (опять-таки, перед введением туда каких-либо асимметричных вариантов, вариантов с измененной pI и вариантов с нарушением; то есть, количество вариантов перед введением вариантов по настоящему изобретению, как правило, является низким).
В одном варианте осуществления исходное антитело имело созревшую аффинность, как известно из уровня техники. Способы на основе структуры можно использовать для гуманизации и обеспечения созревания аффинности, например, как описано в USSN 11/004590. Способы на основе отбора можно использовать для гуманизации и/или обеспечения созревания аффинности вариабельных областей антител, включая без ограничения способы, описанные в Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10): 753-759, все полностью включенные посредством ссылки. Другие способы гуманизации могут включать прививание только части CDR, включая без ограничения способы, описанные в USSN 09/810,510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084, все полностью включенные посредством ссылки.
IV. Гетеродимерные антитела.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные антитела, которые основаны на применении двух различных последовательностей вариантных Fc тяжелой цепи, которые будут подвергаться самосборке с образованием гетеродимерных Fcдоменов и гетеродимерных антител.
Настоящее изобретение относится к новым конструкциям для получения гетеродимерных антител, которые обеспечивают связывание с более чем одним антигеном или лигандом, например, обеспечивают биспецифическое связывание. Конструкции гетеродимерных антител основаны на самоорганизующейся природе двух Fc-доменов тяжелых цепей антител, например, двух мономеров, которые собираются в димер. Гетеродимерные антитела получают путем изменения аминокислотной последовательности каждого мономера, как более подробно описано ниже. Таким образом, настоящее изобретение в целом относится к созданию гетеродимерных антител, которые могут совместно контактировать с антигенами несколькими путями, что обусловлено аминокислотными вариантами в константных областях, которые различаются в каждой цепи, с целью содействия образованию гетеродимера и/или обеспечения возможности легкой очистки гетеродимеров от гомодимеров.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает биспецифические антитела. Текущей проблемой в технологиях антител является стремление получить биспецифические антитела, которые связываются с двумя разными антигенами одновременно, что в целом позволяет приблизить различные антигены и приводит к получению новых функциональных характеристик и новых методов терапии. В целом, эти антитела получают путем включения генов для каждой тяжелой и легкой цепи в клетки-хозяева. Это обычно приводит к образованию желаемого гетеродимера (A-B), а также двух гомодимеров (A-A и B-B (не считая выхода гетеродимеров легкой цепи)). Однако основным препятствием при образовании бис- 21 036156 пецифических антител является сложность очистки гетеродимерных антител от гомодимерных антител и/или смещения в сторону образования гетеродимера относительно образования гомодимеров.
Существует ряд механизмов, которые можно применять для получения гетеродимеров по настоящему изобретению. Кроме того, как будет понятно специалистам в данной области, эти механизмы можно комбинировать для обеспечения высокой степени гетеродимеризации. Таким образом, аминокислотные варианты, которые приводят к получению гетеродимеров, упоминаются как варианты гетеродимеризации''. Как обсуждается ниже, варианты гетеродимеризации могут включать в себя стерические варианты (например, описанные ниже варианты выступы и впадины или асимметричные, и варианты пар по заряду, описанные ниже), а также варианты с измененной pI, которые позволяют очистить гетеродимеры от гомодимеров. Как в целом описано в WO2014/145806, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, и, в частности, для обсуждения вариантов гетеродимеризации ниже, пригодные механизмы гетеродимеризации включают в себя выступы и впадины (KIH; иногда в данном документе асимметричные варианты (см. обсуждение в WO2014/145806), электростатическое наведение или пары по заряду, описываемые в WO2014/145806, варианты с измененной pI, описанные в WO2014/145806, и общие дополнительные варианты Fc, описанные в WO2014/145806 и ниже.
В настоящем изобретении существует несколько основных механизмов, которые могут обеспечивать легкую очистку гетеродимерных антител; один основан на применении вариантов с измененной pI, так что каждый мономер характеризуется отличной pI, что позволяет проводить очистку на основе изоэлектрической точки димерных белков A-A, A-B и B-B. Альтернативно, некоторые форматы каркасов, такие как тройной F-формат, позволяют также проводить разделение по размеру. Как дополнительно описано ниже, можно также сместить образование гетеродимеров относительно гомодимеров. Таким образом, комбинация вариантов стерической гетеродимеризации и вариантов pI или пар по заряду находит особое применение в настоящем изобретении.
В целом, варианты осуществления конкретного применения в настоящем изобретении основаны на наборах вариантов, которые включают в себя асимметричные варианты, которые вызывают гетеродимеризацию вместо гомодимеризации, в сочетании с вариантами с измененной pI, которые увеличивают разность pI между двумя мономерами.
Кроме того, как более подробно описано ниже, в зависимости от формата гетеродимерного антитела варианты с измененной pI могут содержаться либо в константных и/или Fc-доменах мономера или заряженных линкерах, либо можно применять междоменные линкеры или линкеры scFv. To есть каркасы, в которых используются scFv, такие как тройной F-формат, могут включать заряженные линкеры scFv (положительно или отрицательно), которые обеспечивают дополнительное повышение pI для целей очистки. Как будет понятно специалистам в данной области, некоторые тройные F-форматы пригодны только лишь с заряженными линкерами scFv и без дополнительных регулировок pI, хотя настоящее изобретение в действительности предусматривает варианты с измененной pI, которые находятся в одном или обоих мономерах и/или также заряженных междоменных линкерах. Кроме того, дополнительное аминокислотное конструирование для получения альтернативных функциональных характеристик может также обеспечивать изменения pI, например, в случае Fc-, FcRn- и KO-вариантов.
В настоящем изобретении, в котором используют pI в качестве механизма разделения для обеспечения очистки гетеродимерных белков, аминокислотные варианты можно вводить в один или оба мономерных полипептида; то есть pI одного из мономеров (обозначаемых в данном документе для простоты как мономер A) можно сконструировать отдельно от мономера B или изменить оба сдвига мономеров A и B с увеличением pI мономера A и уменьшением pI мономера B. Как более подробно описано ниже, изменения pI любого или обоих мономеров можно выполнить путем удаления или добавления заряженного остатка (например, нейтральную аминокислоту заменяют положительно или отрицательно заряженным аминокислотным остатком, например глицин на глутаминовую кислоту), замены заряженного остатка с положительного или отрицательного на противоположный заряд (аспарагиновой кислоты на лизин) или замены заряженного остатка на нейтральный остаток (например, потеря заряда; лизин на серии). Ряд этих вариантов показан на фигурах.
Соответственно, этот вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает создание достаточного изменения pI по меньшей мере одного из мономеров, так что гетеродимеры можно отделить от гомодимеров. Как будет понятно специалистам в данной области и как обсуждается ниже, это можно выполнить с применением константной области тяжелой цепи дикого типа и вариабельной области, которая была сконструирована с увеличением или уменьшением ее pI_(wt A- +B или wt A- -B), или путем увеличения одной области и уменьшения другой области (A+ -B- или A-B+).
Таким образом, в целом, компонентом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения являются аминокислотные варианты в константных областях антител, которые направлены на изменение изоэлектрической точки (pI) по меньшей мере одного, если не обоих, из мономеров димерного белка с образованием антител с измененной pI путем включения аминокислотных замен (варианты с измененной pI или замены с изменением pI) в один или оба мономера. Как показано в данном документе, отделение гетеродимеров от двух гомодимеров может быть достигнуто, если pI двух мономеров отличаются всего на 0,1 единицы pH, при этом каждый из 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 или выше находят примене- 22 036156 ние в настоящем изобретении.
Как будет понятно специалистам в данной области, количество вариантов с измененной pI, которые должны быть включены в каждый или оба мономера с целью получения хорошего разделения, будет частично зависеть от исходной pI компонентов, например, в тройном F-формате, исходной pI scFv и Fab, представляющих интерес. То есть чтобы определить, какой мономер необходимо сконструировать или в каком направлении (например, более положительный или более отрицательный), вычисляют последовательности Fv для двух антигенов-мишеней и исходя из этого принимают решение. Как известно из уровня техники, разные Fv будут иметь разные исходные pI, которые используются в настоящем изобретении. В целом, как описано в данном документе, pI подстраивают таким образом, чтобы получить общую разность pI для каждого мономера по меньшей мере приблизительно 0,1 log, при этом предпочтительным является 0,2-0,5, как описано в данном документе.
Кроме того, как будет понятно специалистам в данной области и как описано в данном документе, в некоторых вариантах осуществления гетеродимеры можно отделить от гомодимеров на основе размера. Как показано, например, на фиг. 1, некоторые из форматов позволяют разделять гетеродимеры и гомодимеры на основе размера.
В случае, когда варианты с измененной pI применяют для достижения гетеродимеризации, при применении константной области(константных областей) тяжелой цепи(тяжелых цепей) обеспечивается более модульный подход к конструированию и очистке биспецифических белков, включая антитела. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления варианты гетеродимеризации (включая варианты гетеродимеризации с асимметрией и очисткой) не включены в вариабельные области, так что должно быть сконструировано каждое отдельное антитело. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления вероятность иммуногенности как результата применения вариантов с измененной pI значительно снижается при внесении вариантов с измененной pI из разных изотипов IgG, так что pI изменяется без привнесения значительной иммуногенности. Таким образом, дополнительной проблемой, которая должна быть решена, является выявление константных доменов с низкой pI и высоким содержанием последовательностей человека, например, сведение к минимуму или устранение не являющихся человеческими остатков в любом конкретном положении.
Дополнительным преимуществом, которое может возникнуть при данном подстраивании pI, является также увеличение периода полужизни в сыворотке и повышение связывания FcRn. To есть как описано в USSN 13/194904 (включенном посредством ссылки во всей своей полноте), снижение pI константных доменов антитела (включая домены, обнаруженные в антителах слияния и Fc-гибридах) может приводить к более длительному удерживанию в сыворотке in vivo. Эти варианты с измененной pI для увеличения периода полужизни в сыворотке также способствуют изменению pI для очистки.
Кроме того, следует отметить, что варианты с измененной pI вариантов гетеродимеризации дают дополнительное преимущество для аналитических методов и процесса контроля качества биспецифических антител, так как способность устранять, минимизировать и распознавать присутствие гомодимеров является существенной. Аналогично, важной является способность достоверно тестировать воспроизводимость получения гетеродимерных антител.
Варианты гетеродимеризации
Настоящее изобретение предусматривает гетеродимерные белки, в том числе гетеродимерные антитела во множестве форматов, для которых применяются гетеродимерные варианты, обеспечивающие образование гетеродимера и/или очистку от гомодимеров.
Существует ряд подходящих пар наборов асимметричных вариантов гетеродимеризации. Эти варианты входят в пары наборов. То есть один набор из пары включается в первый мономер, а другой набор из пары включается во второй мономер. Следует отметить, что эти наборы не обязательно ведут себя как варианты выступы и впадины с взаимным соответствием между остатком в одном мономере и остатком в другом; то есть эти пары наборов образуют поверхность контакта между двумя мономерами, которая содействует образованию гетеродимера и препятствует образованию гомодимера, обеспечивая процент гетеродимеров, которые самопроизвольно образуются в биологических условиях, превышающий 90%, а не ожидаемые 50% (25% гомодимер A/A: 50% гетеродимер A/B: 25% гомодимер B/B).
Стерические варианты
В некоторых вариантах осуществления образование гетеродимеров можно облегчить путем добавления стерических вариантов. То есть при изменении аминокислот в каждой тяжелой цепи разные тяжелые цепи с большей вероятностью связываются с образованием гетеродимерной структуры, чем с образованием гомодимеров с теми же аминокислотными последовательностями Fc. Подходящие стерические варианты представлены на фиг. 29.
Также необязательно можно применять один из механизмов, обычно упоминаемый в данной области техники как выступы и впадины и относящийся к конструированию в отношении аминокислот, который обеспечивает создание стерических воздействий для предпочтительного образования гетеродимера и невыгодного образования гомодимера; его иногда называют выступы и впадины, как описано в USSN 61/596846, Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26; в патенте США № 8216805, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей
- 23 036156 своей полноте. На Фиг. х определен ряд пар мономер A - мономер B, которые относятся к выступам и впадинам. Кроме того, как описано в Merchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998), эти полученные в результате мутаций выступы и впадины можно комбинировать с дисульфидными связями с образованием асимметрии при гетеродимеризации.
Дополнительный механизм, который находит применение при получении гетеродимеров, иногда называют электростатическим наведением, как описано в Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010), включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Это иногда упоминается в данном документе как пары по заряду. В данном варианте осуществления применяют явление электростатики для сдвига образования в сторону гетеродимеризации. Как будет понятно специалистам в данной области, они могут также оказывать влияние на pI и, следовательно, на очистку, и поэтому в некоторых случаях также могут рассматриваться в качестве вариантов с измененной pI. Однако поскольку их создавали для усиления гетеродимеризации и не применяли в качестве инструмента для очистки, их классифицируют как стерические варианты. Они включают без ограничения D221E/P228E/L368E в паре с D221R/P228R/K409R (т.е. они представляют собой соответствующие мономерам наборы) и С22ОЕ/Р228Е/368Е в паре с C220R/E224R/P228R/K409R.
Дополнительные варианты мономера A и мономера B, которые можно комбинировать с другими вариантами, необязательно и независимо в любом количестве, такими как варианты с измененной pI, описанные в данном документе, или другими стерическими вариантами, показаны на фиг. 37 в US 2012/0149876, фигура и пояснение и SEQ ID NO которых специально включены в данный документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления стерические варианты, описанные в данном документе, могут быть необязательно и независимо включены с любым вариантом с измененной pI (или другими вариантами, такими как Fc-варианты, FcRn-варианты и т.д.) в один или оба мономера и могут быть независимо и необязательно включены в белки по настоящему изобретению или исключены из них.
Список подходящих асимметричных вариантов представлен на фиг. 29, а на фиг. 34 показаны некоторые пары, особенно применимые во многих вариантах осуществления. Особенно пригодными во многих вариантах осуществления являются пары наборов, включающие без ограничения S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q. В отношении номенклатуры пара S364K/E357Q: L368D/K370S означает, что один из мономеров имеет двойной набор вариантов S364K/E357Q, а другой имеет двойной набор вариантов L368D/K370S.
Варианты на основе pI (изоэлектрическая точка) для гетеродимеров
В целом, как будет понятно специалистам в данной области, существуют две общие категории вариантов на основе pI: те, которые увеличивают pI белка (щелочные изменения) и те, которые уменьшают pI белка (кислотные изменения). Как описано в данном документе, могут быть выполнены все комбинации этих вариантов: один мономер может быть дикого типа или вариантом, который не демонстрирует существенных отличий pI по сравнению с диким типом, а другой может быть либо более щелочным, либо более кислым. Альтернативно, изменяют каждый мономер, один на более щелочной, а другой на более кислый.
Предпочтительные комбинации вариантов с измененной pI показаны на фиг. 30. Как указано в данном документе и показано на фигурах, эти изменения показаны относительно IgG1, но все изотипы можно изменить таким образом, а также гибриды изотипов. В случае, когда константный домен тяжелой цепи происходит из IgG2-4, можно также применять R133E и R133Q.
В одном варианте осуществления, например, в формате открывалки, предпочтительная комбинация вариантов с измененной pI имеет один мономер (сторона отрицательного Fab), содержащий варианты 208D/295E/384D/418E/421D (N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, если относительно IgG1 человека), и второй мономер (сторона положительного scFv), содержащий положительно заряженный линкер scFv, в том числе (GKPGS)4. Однако, как будет понятно специалистам в данной области, первый мономер включает CH1-домен, в том числе положение 208. Соответственно, в конструкциях, которые не включают CH1-домен (например, для гетеродимерных Fc-гибридных белков, в которых не используется CH1домен при одном из доменов, например, в формате с двойным scFv), предпочтительный набор отрицательных Fc-вариантов с измененной pI включает варианты 295E/384D/418E/421D (Q295E/N384D/Q418E/ N421D, если относительно IgG1 человека).
Варианты легкой цепи антител-гетеродимеров
В случае гетеродимеров на основе антител, например, где по меньшей мере один из мономеров содержит легкую цепь в дополнение к домену тяжелой цепи, варианты с измененной pI также могут быть выполнены в легкой цепи. Аминокислотные замены для снижения pI легкой цепи включают без ограничения K126E, K126Q, K145E, K145Q, N152D, S156E, K169E, S202E, K207E и добавление пептида DEDE на C-конце легкой цепи. Изменения в этой категории на основе константного домена легкой лямбда-цепи включают одну или несколько замен по R108Q, Q124E, K126Q, N138D, K145T и Q199E. Кроме того, можно также увеличить pI легких цепей.
- 24 036156
Изотипические варианты
Кроме того, многие варианты осуществления настоящего изобретения основаны на импорте влияющих на pI аминокислот в определенных положениях из одного изотипа IgG в другой, тем самым снижая или исключая вероятности введения нежелательной иммуногенности в варианты. Некоторые из них показаны на фиг. 21 из публикации заявки на патент США 2014/0370013, включенной в данный документ посредством ссылки. То есть IgG1 является распространенным изотипом для терапевтических антител по целому ряду причин, включая высокую эффекторную функцию. Однако константная область тяжелой цепи IgG1 имеет более высокую pI, чем у IgG2 (8,10 по сравнению с 7,31). Путем введения остатков IgG2 в определенные положения в основную цепь IgG1, pI полученного мономера понижается (или повышается) и дополнительно он характеризуется более продолжительным периодом полужизни в сыворотке. Например, IgG1 содержит глицин (pI 5,97) в положении 137, a IgG2 содержит глутаминовую кислоту (pI 3,22); введение глутаминовой кислоты будет влиять на pI полученного белка. Как описано ниже, обычно требуется ряд аминокислотных замен, чтобы существенно повлиять на pI вариантного антитела. Однако следует отметить, как обсуждается ниже, что даже изменения в молекулах IgG2 позволяют увеличить период полужизни в сыворотке.
В других вариантах осуществления выполняют неизотипические аминокислотные изменения либо для снижения общего зарядового состояния получаемого белка (например, путем замены аминокислоты с более высокой pI на аминокислоту с более низкой pI), либо для обеспечения адаптации структуры в отношении стабильности и т.д., как более подробно описано ниже.
Кроме того, при конструировании с учетом pI константных доменов как тяжелых, так и легких цепей можно наблюдать значительные изменения в каждом мономере гетеродимера. Как обсуждается в данном документе, pI двух мономеров, отличающиеся по меньшей мере на 0,5, могут обеспечить возможность разделения с помощью ионообменной хроматографии или изоэлектрического фокусирования или других способов, чувствительных к изоэлектрической точке.
Расчет pI
Значение pI каждого мономера может зависеть от pI константного домена тяжелой цепи варианта и pI всего мономера, включая константный домен тяжелой цепи варианта и партнера по слиянию. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изменение pI рассчитывают по константному домену тяжелой цепи варианта с применением таблицы, приведенной на фиг. 19 публикации заявки на патент США 2014/0370013. Как обсуждается в данном документе, выбор мономера для конструирования обычно определяется по pI, свойственной для областей Fv и каркаса. Альтернативно, можно сравнить pI каждого мономера.
Варианты с измененной pI, которые также обеспечивают лучшее связывание FcRn in vivo
В случае, когда вариант с измененной pI уменьшает pI мономера, тот может получить дополнительное преимущество в виде улучшения в отношении удержания в сыворотке in vivo.
Несмотря на то, что Fc-области все еще исследуются, считается, что они характеризуются более продолжительным периодом полужизни in vivo, поскольку связывание с FcRn при pH 6 в эндосоме изолирует Fc (Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598, полностью включена посредством ссылки). Затем эндосомальный компартмент возвращает Fc на поверхность клетки. Как только компартмент открывается во внеклеточное пространство, более высокий pH, ~ 7,4, вызывает высвобождение Fc обратно в кровь. Dall' Acqua и соавторы показали, что у мышей Fc-мутанты с повышенной степенью связывания FcRn при pH 6 и pH 7,4 в действительности наблюдались в пониженных концентрациях в сыворотке и характеризовались таким же периодом полужизни, как Fc дикого типа (Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180, полностью включена посредством ссылки). Считается, что повышенная аффинность Fc к FcRn при pH 7,4 препятствует высвобождению Fc обратно в кровь. Следовательно, мутации Fc, которые будут увеличивать период полужизни Fc in vivo, в идеальном случае будут увеличивать степень связывания FcRn при более низком pH, в то же время обеспечивая высвобождение Fc при более высоком pH. Аминокислота гистидин изменяет свое зарядовое состояние в диапазоне pH от 6,0 до 7,4. Поэтому неудивительно, что остатки His можно найти в важных положениях в комплексе Fc/FcRn.
Недавно было высказано предположение, что антитела с вариабельными областями, которые характеризуются более низкими изоэлектрическими точками, также могут характеризоваться более длительным периодом полужизни в сыворотке (Igawa et al., 2010 PEDS. 23(5): 385-392, полностью включена посредством ссылки). Однако механизм этого явления еще слабо изучен. Более того, вариабельные области отличаются от антитела к антителу. Варианты константной области со сниженной pI и увеличенным периодом полужизни обеспечили бы более модульный подход к улучшению фармакокинетических свойств антител, описанных в данном документе.
Дополнительные Fc-варианты для дополнительной функциональной характеристики
В дополнение к аминокислотным вариантам с измененной pI существует ряд пригодных аминокислотных модификаций Fc, которые можно выполнить по ряду причин, включая без ограничения изменение связывания с одним или несколькими рецепторами FcyR, измененное связывание с рецепторами FcRn и т.д.
Соответственно, белки по настоящему изобретению могут включать аминокислотные модифика- 25 036156 ции, в том числе, варианты гетеродимеризации, описанные в данном документе, которые включают в себя варианты с измененной pI и стерические варианты. Каждый набор вариантов может быть независимо и необязательно включен в любой конкретный гетеродимерный белок или исключен из него.
F CYR-варианты
Соответственно, существует ряд пригодных замен в Fc, которые можно выполнить для изменения связывания с одним или несколькими FcyR-рецепторами. Могут быть пригодными замены, которые приводят к повышению степени связывания, а также к снижению степени связывания. Например, известно, что повышенная степень связывания с FcyRIIIa обычно приводит к повышению ADCC (антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, клеточноопосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют FcyR, распознают связанное антитело на клетке-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени). Аналогичным образом, в некоторых случаях также может быть полезным снижение степени связывания с FcyRIIb (ингибиторный рецептор). Аминокислотные замены, которые находят применение в настоящем изобретении, включают замены, перечисленные в USSN 11/124620 (в частности, фигура 41), 11/174287, 11/396,495, 11/538406, все из которых явным образом включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте и, в частности, для раскрытых в данном документе вариантов. Конкретные варианты, которые находят применение, включают без ограничения 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L, 243A, 243L, 264A, 264V и 299T.
Кроме того, имеют место дополнительные замены в Fc, которые находят применение для повышения степени связывания с рецептором FcRn и увеличения времени полужизни в сыворотке, как, в частности, раскрыто в USSN 12/341769, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, в том числе без ограничения 434S, 434A, 428L, 308F, 2591, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 4361 или V/434S, 436V/428L и 259I/308F/428L.
Варианты с нарушением
Аналогичным образом, другую категорию функциональных вариантов представляют собой варианты с нарушением связывания с FcyR или Fc-нокаутные (FcKO или KO) варианты. В этих вариантах осуществления для некоторых терапевтических применений желательно снизить степень нормального связывания Fc-домена с одним или несколькими или всеми из Fcy-рецепторов (например, FcyR1, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa и т.д.), или устранить его, чтобы избежать дополнительных механизмов действия. То есть например, во многих вариантах осуществления, особенно при применении биспецифических антител, которые моновалентно связывают CD3, обычно желательно нарушать связывание FcyRIIIa для устранения или значительного снижения ADCC-активности, где один из Fc-доменов содержит один или несколько вариантов с нарушением связывания с Fcy-рецептором. Эти варианты с нарушением показаны на фиг. 31, и каждый из них может быть независимо и необязательно включен или исключен, причем в предпочтительных аспектах используют варианты с нарушением, выбранные из группы, состоящей из G236R/L328R, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, E233P/L234V/ L235A/G236del/S23 9K/A32 7G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A32 7G и E233P/L234V/L235A/ G236del. Следует отметить, что варианты с нарушением, упоминаемые в данном документе, обеспечивают нарушение связывания FcyR, но, как правило, не связывание FcRn.
Комбинация гетеродимерных и Fc-вариантов
Как будет понятно специалистам в данной области, все перечисленные варианты гетеродимеризации (включая асимметричные и/или варианты с измененной pI) можно необязательно и независимо комбинировать любым способом, при условии, что они сохраняют свою нитевую структуру или разделение на мономеры. Кроме того, все эти варианты можно комбинировать в любом из форматов гетеродимеризации.
В случае вариантов с измененной pI, хотя варианты осуществления, находящие конкретное применение, показаны на фигурах, можно создать другие комбинации, следуя основному правилу изменения разности pI между двумя мономерами для облегчения очистки.
Кроме того, любые из вариантов гетеродимеризации, асимметричные и с измененной pI, также независимо и необязательно комбинируют с вариантами с удалением Fc, Fc-вариантами, FcRn-вариантами, как в целом изложено в данном документе.
Пригодные форматы по настоящему изобретению
Как будет понятно специалистам в данной области и более подробно рассмотрено ниже, гетеродимерные белки слияния по настоящему изобретению могут принимать самые разнообразные конфигурации, как в целом показано на фиг. 1. На некоторых фигурах изображены односторонние конфигурации, когда один тип специфичности обусловлен одним плечом молекулы, а отличающаяся специфичность обусловлена другим плечом. На других фигурах изображены двусторонние конфигурации, когда имеет место по меньшей мере один тип специфичности, обусловленный верхней частью молекулы и одна или несколько других видов специфичности обусловлена нижней частью молекулы. Таким образом, настоящее изобретение относится к новым композициям иммуноглобулинов, которые контактируют с различными первым и вторым антигеном.
- 26 036156
Как будет понятно специалистам в данной области, гетеродимерные форматы по настоящему изобретению могут иметь различные валентности, а также быть биспецифическими. То есть, гетеродимерные антитела по настоящему изобретению могут быть бивалентными и биспецифическими, где один опухолевый антиген-мишень (например, CD3) связывается одним связывающим доменом, а другой опухолевый антиген-мишень (например, CD20, CD38, CD123 и т.д.) связывается вторым связывающим доменом. Гетеродимерные антитела также могут быть трехвалентными и биспецифическими, где первый антиген связывается двумя связывающими доменами, а второй антиген связывается вторым связывающим доменом. Как описано в данном документе, когда CD3 является одним из антигенов-мишеней, предпочтительно, чтобы CD3 связывался только моновалентно, чтобы уменьшить возможные побочные эффекты.
В настоящем изобретении используют антигенсвязывающие домены антитела к CD3, в комбинации с доменами, связывающимися с опухолевым антигеном-мишенью (TTA). Как будет понятно специалистам в данной области, можно применять любое множество CDR, связывающихся с CD3, вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей, Fab и scFv, связывающихся с CD3, как показано на любой из фигур (см., в частности, фигуры 2-7 и фигуру 68). Аналогичным образом, можно применять любой из антигенсвязывающих доменов антитела к TTA, например, домены, связывающиеся с антигенами CD38, CD20, CD19 и CD123, при этом можно применять любое из CDR, вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей, Fab и scFv, изображенных на любой из фигур, необязательно и независимо объединенных в любой комбинации.
Формат открывалки
Один гетеродимерный каркас, который находит особое применение в настоящем изобретении, представляет собой тройной F или открывалки формат каркаса, как показано на фиг. 1A, A и B. В этом варианте осуществления одна тяжелая цепь антитела содержит одноцепочечный Fv (scFv, как определено ниже), а другая тяжелая цепь представляет собой обычный FAb-формат, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи и легкую цепь. Эта структура иногда упоминается в данном документе как тройной F''-формат (scFv-FAb-Fc) или формат открывалки в связи с приблизительным визуальным сходством с открывалкой для бутылок (см. фигуры 1). Две цепи объединяют путем применения аминокислотных вариантов в константных областях (например, Fc-домен, CHI-домен и/или шарнирная область), которые способствуют образованию гетеродимерных антител, как более подробно описано ниже.
Существует несколько очевидных преимуществ тройного F-формата по настоящему изобретению. Как известно из уровня техники, аналоги антител на основе двух конструкций scFv часто имеют проблемы со стабильностью и агрегацией, которые можно уменьшить согласно настоящему изобретению путем добавления обычного спаривания тяжелой и легкой цепей. Кроме того, в отличие от форматов на основе двух тяжелых цепей и двух легких цепей, проблема, связанная с неправильным спариванием тяжелых и легких цепей (например, спаривание тяжелой цепи 1 с легкой цепью 2 и т.д.) отсутствует.
Многие из вариантов осуществления, изложенных в данном документе, в целом основаны на формате открывалки, который содержит первый мономер, содержащий scFv, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, ковалентно соединенные с помощью линкера scFv (заряженного во многих, но не во всех случаях), где scFv ковалентно присоединен к N-концу первого Fc-домена обычно через междоменный линкер (который, как описано в данном документе, может быть незаряженным или заряженным). Второй мономер формата открывалки представляет собой тяжелую цепь, и композиция дополнительно содержит легкую цепь.
В целом, во многих предпочтительных вариантах осуществления scFv представляет собой домен, который связывается с CD3, при этом Fab тяжелой и легкой цепей связывается с другим TTA.
Кроме того, Fc-домены по настоящему изобретению обычно содержат асимметричные варианты (например, набор аминокислотных замен, как показано на фиг. 29 и фиг. 34, причем особенно пригодные асимметричные варианты выбраны из группы, состоящей из S364K/E357Q: L368D/K370S; L368D/K370S: S364K; L368E/K370S: S364K; T411T/E360E/Q362E: D401K; L368D/K370S: S364K/E357L и K370S: S364K/E357Q), необязательно, варианты с нарушением (включая показанные на фиг. 31), необязательно, заряженные линкеры scFv (включая показанные на фиг. 33), и тяжелая цепь содержит варианты с измененной р1_(включая показанные на фиг. 30).
В некоторых вариантах осуществления любая из последовательностей vh и vl, представленных в данном документе (включая все последовательности vh и vl, представленные на фигурах, в том числе те, что направлены на CD20, CD38 и CD123), может быть добавлена к форматам основной цепи открывалки из фигуры 162, как сторона Fab, с применением любой из последовательностей scFv к CD3, показанных на фигурах. Последовательности антител к CD3, нашедшие конкретное применение в данных вариантах осуществления, представляют собой антитело к CD3_H1.30_L1.47, антитело к CD3_H1.32_L1.47, антитело к CD3_H1.89_L1.47, антитело к CD3_H1.90_L1.47, антитело к CD3_H1.33_L1.47 и антитело к CD3_H1.31_L1.47, присоединенное как сторона scFv основных цепей, показанных на фиг. 162.
Настоящее изобретение предусматривает форматы открывалки, где последовательности scFv к CD3 являются такими, как показано на фиг. 2-7 и фиг. 68, включая любую комбинацию с форматами ос- 27 036156 новной цепи из фиг. 162. Кроме того, любая из последовательностей vh и vl к CD3, как показано на фиг.
2-7 и фиг. 68, может применяться как сторона Fab.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы открывалки с антигенсвязывающими доменами антитела к CD38, где последовательности, связывающиеся с CD38, являются такими, как показано на фигурах, включая фиг. 8-10. Как указано выше, каждая из последовательностей vh и vl к CD38 может быть либо стороной Fab, либо стороной scFv, и может быть связана как один из антигенсвязывающих доменов формата открывалки, включая те, что представлены на фиг. 162. Если последовательности антител к CD38 представляют собой сторону Fab, то может применяться любая из последовательностей scFv к CD3 из данных фигур, особенно включая антитело к CD3_H1.30_L1.47, антитело к CD3_H1.32_L1.47, антитело к CD3_H1.89_L1.47, антитело к CD3_H1.90_L1.47, антитело к CD3_H1.33_L1.47 и антитело к CD3_H1.31_L1.47, прикрепленное как сторона scFv основных цепей, показанных на фиг. 162.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы открывалки с антигенсвязывающими доменами антитела к CD20, где последовательности, связывающиеся с CD20, являются такими, как показано на фигурах. Как указано выше, каждая из последовательностей vh и vl к CD20 может быть либо стороной Fab, либо стороной scFv, и может быть связана как один из антигенсвязывающих доменов формата открывалки, включая те, что представлены на фиг. 162. Если последовательности антител к CD20 представляют собой сторону Fab, то может применяться любая из последовательностей scFv к CD3 из данных фигур, особенно включая антитело к CD3_H1.30_L1.47, антитело к CD3_H1.32_L1.47, антитело к CD3_H1.89 L1.47, антитело к CD3_H1.90_L1.47, антитело к CD3_H1.33_L1.47 и антитело к CD3_H1.31_L1.47, прикрепленное как сторона scFv основных цепей, показанных на фиг. 162.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы открывалки с антигенсвязывающими доменами антитела к CD123, где последовательности, связывающиеся с CD123, являются такими, как показано на фигурах. Как указано выше, каждая из последовательностей vh и vl к CD123 может быть либо стороной Fab, либо стороной scFv, и может быть связана как один из антигенсвязывающих доменов формата открывалки, включая те, что представлены на фиг. 162. Если последовательности антител к CD123 представляют собой сторону Fab, то может применяться любая из последовательностей scFv к CD3 из данных фигур, особенно включая антитело к CD3_H1.30_L1.47, антитело к CD3_H1.32_L1.47, антитело к CD3_H1.89 L1.47, антитело к CD3_H1.90_L1.47, антитело к CD3_H1.33_L1.47 и антитело к CD3_H1.31_L1.47, прикрепленное как сторона scFv основных цепей, показанных на фиг. 162.
Формат mAb-Fv
Один гетеродимерный каркас, который находит особое применение в настоящем изобретении, представляет собой формат mAb-Fv, показанный на фиг. 1. В этом варианте осуществления указанный формат основан на применении C-концевого присоединения дополнительного вариабельного домена тяжелой цепи к одному мономеру и C-концевого присоединения дополнительного вариабельного домена легкой цепи к другому мономеру, с образованием таким образом третьего антигенсвязывающего домена, где Fab-фрагменты двух мономеров связывают TTA, а дополнительный scFv-домен связывает CD3.
В данном варианте осуществления первый мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи и первый константный домен тяжелой цепи, содержащий первый Fc-домен, с первым вариабельным доменом легкой цепи, ковалентно присоединенным к C-концу первого Fc-домена с использованием междоменного линкера (vh1-CH1-шарнuр-CH2-CH3[необязательный линкер|-у12). Второй мономер содержит второй вариабельный домен тяжелой цепи, второй константный домен тяжелой цепи, содержащий второй Fc-домен, и третий вариабельный домен тяжелой цепи, ковалентно присоединенный к C-концу второго Fc-домена с применением междоменного линкера (yj1-CH1-шарнuр-CH2-CH3-[необязательный линкер|-уИ2). Два присоединенных к C-концу вариабельных домена составляют scFv, который связывает CD3 (поскольку менее предпочтительно иметь бивалентное CD3-связывание). В этом варианте осуществления дополнительно используют общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, которая соединяется с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают TTA. Что касается множества вариантов осуществления в данном документе, эти конструкции включают в себя асимметричные варианты, варианты с измененной pI, варианты с нарушением, варианты с дополнительным Fc и т.д., что является желательным и описано в данном документе.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv, в которых последовательности scFv к CD3 являются такими, как показано на фиг. 2-7 и фиг. 68.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv, в которых последовательности, связывающиеся с CD38, являются такими, как показано на фиг. 8-10.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD20, где последовательности, связывающиеся с CD20, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD19, где последовательности, связывающиеся с CD19, являются такими, как показано на фи- 28 036156 гурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD123, где последовательности, связывающиеся с CD123, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv, содержащие варианты с нарушением, как показано на фиг. 31.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv, содержащие асимметричные варианты, как показано на фигурах 29 и 34.
mAb-scFv
Один гетеродимерный каркас, который находит особое применение в настоящем изобретении, представляет собой формат mAb-scFv, показанный на фиг. 1. В этом варианте осуществления указанный формат основан на применении C-концевого присоединения scFv к одному из мономеров, с образованием таким образом третьего антигенсвязывающего домена, где Fab-фрагменты двух мономеров связывают TTA и дополнительный scFv-домен связывает CD3. Таким образом, первый мономер содержит первую тяжелую цепь (содержащую вариабельный домен тяжелой цепи и константный домен) с ковалентно присоединенным к C-концу scFv, содержащим вариабельный домен легкой цепи scFv, линкер scFv и вариабельный домен тяжелой цепи scFv в любой ориентации (vh1-CШ-шарнир-CH2-CH3-[необязательный линкер|-у!12-линкер scFv-v12 или vh1-CH1-шарнир-CH2-CH3-[необязательный линкер|-у12-линкер scFvvh2). В этом варианте осуществления дополнительно используют общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, которая соединяется с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают TTA. Что касается множества вариантов осуществления в данном документе, эти конструкции включают в себя асимметричные варианты, варианты с измененной pI, варианты с нарушением, варианты с дополнительным Fc и т.д., что является желательным и описано в данном документе.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv, в которых последовательности scFv к CD3 являются такими, как показано на фиг. 2-7 и фиг. 68.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv, в которых последовательности, связывающиеся с CD38, являются такими, как показано на фиг. 8-10.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD20, где последовательности, связывающиеся с CD20, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD19, где последовательности, связывающиеся с CD19, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD123, где последовательности, связывающиеся с CD123, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv, содержащие варианты с нарушением, как показано на фиг. 31.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы mAb-Fv, содержащие асимметричные варианты, как показано на фиг. 29 и 34.
Центральный scFv
Один гетеродимерный каркас, который находит особое применение в настоящем изобретении, представляет собой формат с центральным scFv, показанный на фиг. 1. В данном варианте осуществления указанный формат основан на применении вставленного scFv-домена, с образованием таким образом третьего антигенсвязывающего домена, где Fab-фрагменты двух мономеров связывают TTA, и дополнительный scFv-домен связывает CD3. scFv-домен вставляют между Fc-доменом и областью CH1-Fv одного из мономеров, с обеспечением таким образом третьего антигенсвязывающего домена.
В данном варианте осуществления один мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи, СН1-домен (и необязательный шарнир) и Fc-домен, с scFv, содержащим вариабельный домен легкой цепи scFv, линкер scFv и вариабельный домен тяжелой цепи scFv. scFv ковалентно присоединяют между С-концом СН1-домена константного домена тяжелой цепи и N-концом первого Fc-домена с применением необязательных междоменных линкеров (vh1-CH1[необязательный линкер|-у!12-линкер scFv-v12-[необязательный линкер, включающий шарнир^О^CH3, или с противоположной ориентацией относительно scFv, vh1-CH1-[необязательный линкер|-у12линкер scFv-vh2-[необязательный линкер, включающий шарнир]-CH2-CH3). Другой мономер представляет собой стандартную сторону Fab. В этом варианте осуществления дополнительно используют общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, которая соединяется с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают TTA. Что касается множества вариантов осуществления в данном документе, эти конструкции включают в себя асимметричные варианты, варианты с измененной pI, варианты с нарушением, варианты с дополнительным Fc и т.д., что является желательным и описано в данном документе.
- 29 036156
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным scFv, в которых последовательности scFv к CD3 являются такими, как показано на фиг. 2-7 и фиг. 68.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным scFv, в которых последовательности, связывающиеся с CD38, являются такими, как показано на фиг. 8-10.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным scFv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD20, где последовательности, связывающиеся с CD20, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным scFv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD19, где последовательности, связывающиеся с CD19, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным scFv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD123, где последовательности, связывающиеся с CD123, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным scFv, содержащие варианты с нарушением, как показано на фиг. 31.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным scFv, содержащие асимметричные варианты, как показано на фиг. 29 и 34.
Формат с центральным Fv
Один гетеродимерный каркас, который находит особое применение в настоящем изобретении, представляет собой формат с центральным Fv, показанный на фиг. 1. В данном варианте осуществления указанный формат основан на применении вставленного scFv-домена, с образованием таким образом третьего антигенсвязывающего домена, где Fab-фрагменты двух мономеров связывают TTA, и дополнительный scFv-домен связывает CD3. scFv-домен вставляют между Fc-доменом и областью CH1-Fv одного из мономеров, обеспечивая таким образом третий антигенсвязывающий домен, где каждый мономер содержит компонент scFv (например, один мономер содержит вариабельный домен тяжелой цепи, а другой содержит вариабельный домен легкой цепи).
В данном варианте осуществления один мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи, ОШ-домен, и Fc-домен, и дополнительный вариабельный домен легкой цепи. Домен легкой цепи ковалентно присоединяют между C-концом CHI-домена константного домена тяжелой цепи и N-концом первого Fc-домена с применением междоменных линкеров (у111-СН1-|необязательный линкер|-у12-шарнир-СН2-СН3). Другой мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи, CHI-домен, и Fc-домен, и дополнительный вариабельный домен тяжелой цепи (vh1-CH1-[необязательный линкер]-vh2-шарнир-CH2-CH3). Домен легкой цепи ковалентно присоединяют между C-концом CHI-домена константного домена тяжелой цепи и N-концом первого Fc-домена с помощью междоменных линкеров.
В этом варианте осуществления дополнительно используют общую легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, которая соединяется с тяжелыми цепями с образованием двух идентичных Fab, которые связывают TTA. Что касается множества вариантов осуществления в данном документе, эти конструкции включают в себя асимметричные варианты, варианты с измененной pI, варианты с нарушением, варианты с дополнительным Fc и т.д., что является желательным и описано в данном документе.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным Fv, в которых последовательности scFv, связывающиеся с CD3, являются такими, как показано на фиг. 2-7 и фиг. 68.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным Fv, в которых последовательности, связывающиеся с CD38, являются такими, как показано на фиг.8-10.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным Fv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD20, где последовательности, связывающиеся с CD20, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным Fv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD19, где последовательности, связывающиеся с CD19, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным Fv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD123, где последовательности, связывающиеся с CD123, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным Fv, содержащие варианты с нарушением, как показано на фиг. 31.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с центральным Fv, содержащие асимметричные варианты, как показано на фиг. 29 и 34.
Неполный центральный scFv
Один гетеродимерный каркас, который находит особое применение в настоящем изобретении, представляет собой формат с неполным центральным scFv, показанный на фиг. 1. В данном варианте осуществления один мономер содержит только Fc-домен, тогда как в другом мономере применяют
- 30 036156 вставленный scFv-домен, с образованием таким образом второго антигенсвязывающего домена. В этом формате либо Fab-фрагмент связывает TTA и scFv связывает CD3, или наоборот. scFv-домен вставляют между Fc-доменом и областью CH1-Fv одного из мономеров.
В данном варианте осуществления один мономер содержит первую тяжелую цепь, содержащую первый вариабельный домен тяжелой цепи, СШ-домен и Fc-домен, при этом scFv содержит вариабельный домен scFv легкой цепи, линкер scFv и вариабельный домен scFv тяжелой цепи. scFv ковалентно присоединяют между C-концом СШ-домена константного домена тяжелой цепи и N-концом первого Fcдомена с помощью междоменных линкеров. Второй мономер содержит Fc-домен. В этом варианте осуществления дополнительно используют легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, которая соединяется с тяжелой цепью с образованием Fab. Что касается множества вариантов осуществления в данном документе, эти конструкции включают в себя асимметричные варианты, варианты с измененной pI, варианты с нарушением, варианты с дополнительным Fc и т.д., что является желательным и описано в данном документе.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с неполным центральным scFv, где последовательности scFv, связывающиеся с CD3, являются такими, как показано на фиг. 2-7 и фиг. 68.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с неполным центральным scFv, в которых последовательности, связывающиеся с CD38, являются такими, как показано на фиг. 8-10.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с неполным центральным scFv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD20, где последовательности, связывающиеся с CD20, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с неполным центральным scFv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD19, где последовательности, связывающиеся с CD19, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с неполным центральным scFv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD123, где последовательности, связывающиеся с CD123, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с неполным центральным scFv, содержащие варианты с нарушением, как показано на фиг. 31.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с неполным центральным scFv, содержащие асимметричные варианты, как показано на фиг. 29 и 34.
Форматы с двойным scFv
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с двойным scFv, известные из уровня техники и показанные на фиг. 1.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с двойным scFv, в которых последовательности scFv к CD3 являются такими, как показано на фиг. 2-7 и фиг. 68.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с двойным scFv, в которых последовательности, связывающиеся с CD38, являются такими, как показано на фиг. 8-10.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с двойным scFv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD20, где последовательности, связывающиеся с CD20, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с двойным scFv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD19, где последовательности, связывающиеся с CD19, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с двойным scFv с антигенсвязывающими доменами антитела к CD123, где последовательности, связывающиеся с CD123, являются такими, как показано на фигурах.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с двойным scFv, содержащие варианты с нарушением, как показано на фиг. 31.
В настоящем изобретении предусмотрены форматы с двойным scFv, содержащие асимметричные варианты, как показано на фиг. 29 и 34.
Настоящее изобретение предусматривает форматы с двойным scFv, содержащие варианты с измененной pI и/или заряженные линкеры scFv (в целом либо один мономер содержит Q295E/N384D/Q418E/N481D, а другой - положительно заряженный scFv линкер, либо они оба содержат противоположно заряженные линкеры scFv).
Антигены-мишени
Биспецифические антитела по настоящему изобретению имеют два разных антигенсвязывающих домена: один, который связывается с CD3 (обычно моновалентно), и другой, который связывается с опухолевым антигеном-мишенью (иногда называемым в данном документе как TTA). Подходящие опухолевые антигены-мишени включают без ограничения CD20, CD38, CD123; ROR1, ROR2, ВСМА; PSMA; SSTR2; SSTR5, CD19, FLT3, CD33, PSCA, ADAM 17, CEA, Her2, EGFR, EGFR-vIII, CD30, FOLR1, GD-2, CA-IX, Trop-2, CD70, CD38, мезотелин, EphA2, CD22, CD79b, GPNMB, CD56, CD138, CD52, CD74, CD30, CD123, RON, ERBB2 и EGFR.
- 31 036156
Тройной F''-формат является особенно полезным при целенаправленном воздействии на два (или более) различных антигена. (Как описано в данном документе, это целенаправленное воздействие может представлять собой любую комбинацию моновалентного и бивалентного связывания в зависимости от формата). Таким образом, иммуноглобулины в данном документе предпочтительно контактируют с двумя антигенами-мишенями. Специфичность каждого мономера можно выбрать из приведенных в данном документе перечней. Дополнительные пригодные биспецифические форматы для применения со связывающим доменом антитела к CD3 показаны на фиг. 1.
Конкретные подходящие применения гетеродимерных антител в данном документе представляют собой совместно нацеленные пары, для которых выгодно или крайне важно контактировать с каждым антигеном-мишенью моновалентно. Такими антигенами могут быть, например, иммунные рецепторы, которые активируются при образовании иммунного комплекса. Клеточная активация многих иммунных рецепторов происходит исключительно путем перекрестного связывания, обычно осуществляемого с помощью иммунных комплексов антитело/антиген, или через эффекторную клетку с вовлечением клеток-мишеней. Для некоторых иммунных рецепторов, например сигнального рецептора CD3 на Tклетках, активация исключительно при контакте с совместно вовлеченной мишенью является крайне важной, так как неспецифическое перекрестное связывание в клинических условиях может вызвать цитокиновую бурю и токсичность. С терапевтической точки зрения, посредством контакта с такими антигенами моновалентно, а не поливалентно, при применении иммуноглобулинов, описанных в данном документе, такая активация происходит только в ответ на перекрестное связывание только в микроокружении первичного антигена-мишени. Способность нацеливаться на два различных антигена с различными валентностями является новым и полезным аспектом настоящего изобретения. Примеры антигеновмишеней, для которых может быть терапевтически полезным или необходимым моновалентное совместное контактирование, включают без ограничения иммуноактивируемые рецепторы, такие как CD3, FcyR, толл-подобные рецепторы (TLR), такие как TLR4 и TLR9, цитокины, хемокины, рецепторы цитокинов и рецепторы хемокинов. Во многих вариантах осуществления один из антигенсвязывающих сайтов связывается с CD3, и в некоторых вариантах осуществления он представляет собой scFv-содержащий мономер.
Практически на любой антиген можно нацелить иммуноглобулины данного документа, включая без ограничения белки, субъединицы, домены, мотивы и/или эпитопы, принадлежащие к следующему списку антигенов-мишеней, который включает как растворимые факторы, такие как цитокины, так и мембраносвязанные факторы, включая трансмембранные рецепторы:17-1А, 4-1BB, 4Dc, б-кето-PGFla, 8-изоPGF2a, 8-оксо-dG, аденозиновый рецептор A1, A33, АСЕ, АСЕ-2, активин, активин A, активин AB, активин B, активин C, активин RIA, активин RIA ALK-2, активин RIB ALK-4, активин RIIA, активин RUB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, аддрессины, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсин, антагонист альфаV/бетаЧ, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемин, анти-Id, ASPARTIC, предсердный натрийуретический фактор, интегрин av/b3, Axl, b2M, В7-1, В7-2, B7-H, стимулятор Bлимфоцитов (BlyS), ВАСЕ, ВАСЕ-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, остеогенин ВМР-3, ВМР-4 BMP-2b, BMP-5, ВМР-6 Vgr-1, ВМР-7 (ОР-1), ВМР-8 (ВМР-8а, ОР-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMPs, b-NGF, ВОК, бомбезин, нейротрофический фактор мозга, BPDE, BPDE-DNA, BTC, фактор комплемента 3 (С3), C3a, C4, C5, C5а, C10, CA125, CAD8, кальцитонин, сАМР, раково-эмбриональный антиген (CEA), карцинома-ассоциированный антиген, катепсин A, катепсин B, катепсин C/DPPI, катепсин D, катепсин E, катепсин H, катепсин L, катепсин O, катепсин S, катепсин V, катепсин X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белки p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, токсин Clostridium botulinum, токсин Clostridium perfringens, CKb8-l, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, цитокератиновый опухолеассоциированный антиген, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, фактор ускорения распада комплемента, des(1-3)-IGF-I (IGF-1 мозга), Dhh, дигоксин, DNAM-1, ДНКаза, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, рецептор эндотелина, энкефалиназа, eNOS, Eot, эотаксин 1, EpCAM, эфрин B2/EphB4, EPO, ERCC, Е-селектин, ET-1, фактор IIa, фактор VII, фактор VIIIc, фактор IX, белок активации фибробластов (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ферритин, FGF, FGF-19, fGf-2, FGF3, fGf-8, FGFR, FGFR-3, фибрин, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующий
- 32 036156 гормон, фракталкин, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа1, GFR-альфа2, GFR-альфа3, GITR, глюкагон, Glut 4, гликопротеин IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, соматолиберин, гаптен (NP-cap или NIP-cap), HB-EGF, HCC, гликопротеин gB оболочки HCMV, гликопротеин gH оболочки HCMV, HCMV UL, гемопоэтический фактор роста (HGF), Hep В gp120, гепараназа, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеин gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеин gD HSV, HGFA, высокомолекулярный меланомаассоциированный антиген (HMW-MAA), HIV gp120, V3-петля gp 120 HIV IIIB, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, кардиальный миозин человека, цитомегаловирус человека (HCMV), гормон роста человека (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептор IgA, IgE, IGF, IGF-связывающие белки, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, интерферон (ЮТ)-альфа, INF-бета, INF-гамма, ингибин, iNOS, A-цепь инсулина, B-цепь инсулина, инсулиноподобный фактор роста 1, интегрин альфа-2, интегрин альфа-3, интегрин альфа-4, интегрин альфа-4/бета-1, интегрин альфа-4/бета-7, интегрин альфа-5 (альфа-V), интегрин альфа-5/бета-1, интегрин альфа-5/бета-3, интегрин альфа-6, интегрин бета-1, интегрин бета-2, интерферон гамма, IP-10, I-TAC, JE, калликреин 2, калликреин 5, калликреин 6, калликреин 11, калликреин 12, калликреин 14, калликреин 15, калликреин L1, калликреин L2, калликреин L3, калликреин L4, KC, KDR, фактор роста кератиноцитов (KGF), ламинин 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентный TGF-1, bp1 латентного TGF-1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, антиген Lewis-Y, Lewis-Y-родственный антиген, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеины, LIX, LKN, Lptn, L-селектин, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, легочный сурфактант, лютеинизирующий гормон, рецептор лимфотоксина бета, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеазы, рецептор MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, ММАС1, ММР, ММР-1, ММР-10, ММР-11, ММР-12, ММР-13, ММР-14, ММР-15, ММР-2, ММР-24, ММР-3, ММР-7, ММР-8, ММР-9, MPIF, Мро, MSK, MSP, муцин (Muc1), MUC18, Мюллерова ингибирующая субстанция, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-кадгерин, NCA 90, NCAM, NCAM, неприлизин, нейротрофин-3, -4 или -6, нейртурин, фактор роста нервов (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, паратиреоидный гормон, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, Р-кадгерин, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, pGe, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, щелочная фосфатаза плаценты (PLAP), P1GF, PLP, PP14, проинсулин, прорелаксин, белок C, PS, PSA, PSCA, простатический специфический мембранный антиген (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, A-цепь релаксина, B-цепь релаксина, ренин, респираторный синтициальный вирус (RSV) F, RSV Fgp, Ret, ревматоидные факторы, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, сывороточный альбумин, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (опухолеассоциированный гликопротеин-72), TARC, TCA-3, T-клеточные рецепторы (например, T-клеточный рецептор альфа/бета), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, tErT, PLAP-подобная щелочная фосфатаза яичек, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, полиспецифический TGF-бета, TGF-бета RI (ALK-5), TGF-бета RII, TGF-бета R11b, TGF-бета RIII, TGF-бета^ TGF-бета2, TGF-бета3, TGF-бета4, TGF-бета5, тромбин, Ck-1 тимуса, тиреотропный гормон, Tie, TIMP, TIQ, тканевой фактор, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа бета, Т№-бета-2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p5560), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2-лиганд, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK-лиганд, ODF, OPG-лиганд), TNFSF12 (TWEAK Apo-3-лиганд, DR3-лиганд), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM-лиганд, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR-лиганд, AITR-лиганд, TL6), TNFSF1A (TNF-a конектин, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ОХ40-лиганд gp34, TXGP1), TNFSF5 ^40-лиганд CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas-лиганд, Apo-1-лиганд, AP^^renT), TNFSF7 ^27-лиганд CD70), TNFSF8 ^30-лиганд CD153), TNFSF9 (4-1BB-лиганд, еПШ-лиганд), ТР-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептор трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, опухолеассоциированный антиген СА 125, опухолеассоциированный Lewis Y-родственный углеводный антиген, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназа, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-кадгерин, УЕ-кадгерин-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI,
- 33 036156
VIM, вирусные антигены, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрин VNR, фактор фон Виллебранда, WIF-1, WNT1,
WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A,
WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1,
XEDAR, XIAP, XPD и рецепторы гормонов и факторов роста.
Иллюстративные антигены, на которые можно специфически нацелить иммуноглобулины по настоящему изобретению, включают без ограничения: CD20, CD19, Her2, EGFR, EpCAM, CD3, FcYRIIIa (CD16), FcYRIIa (CD32a), FcYRIIb (CD32b), FcyRI (CD64), толл-подобные рецепторы (TLR), такие как TLR4 и TLR9, цитокины, такие как IL-2, IL-5, IL-13, IL-12, IL-23 и TNFa, рецепторы цитокинов, такие как IL-2R, хемокины, рецепторы хемокинов, факторы роста, такие как VEGF и HGF и т п. Для получения биспецифических антител по настоящему изобретению можно создать антитела к любой комбинации этих антигенов; то есть каждый из этих антигенов можно необязательно и независимо включить в спектр действия биспецифического антитела в соответствии с настоящим изобретением или исключить из него.
Особенно предпочтительными комбинациями для биспецифических антител являются домен, связывающийся с антигеном CD3, и антигенсвязывающий домен, выбранный из домена, который связывает CD19, CD20, CD38 и CD123, последовательности которых показаны на фигурах.
Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает композиции нуклеиновых кислот, кодирующие биспецифические антитела по настоящему изобретению. Как будет понятно специалистам в данной области, композиции нуклеиновых кислот будут зависеть от формата и каркаса гетеродимерного белка. Так, например, если формат требует три аминокислотные последовательности, например, для тройного F-формата (например, первый аминокислотный мономер, содержащий Fc-домен и scFv, второй аминокислотный мономер, содержащий тяжелую цепь и легкую цепь), то три последовательности нуклеиновых кислот можно включить в один или несколько векторов экспрессии для экспрессии. Аналогичным образом, в некоторых форматах (например, форматах с двойным scFv, таких как раскрытые на фиг. 1) необходимы только две нуклеиновые кислоты; опять же, их можно поместить в один или два вектора экспрессии.
Как известно из уровня техники, нуклеиновые кислоты, кодирующие компоненты по настоящему изобретению, можно включить в векторы экспрессии, известные из уровня техники, и в зависимости от клеток-хозяев, применяемых для получения гетеродимерных антител по настоящему изобретению. Как правило, нуклеиновые кислоты функционально связаны с любым количеством регуляторных элементов (промоторов, точки начала репликации, селектируемых маркеров, сайтов связывания рибосом, индукторов и т.д.). Векторы экспрессии могут быть внехромосомными или интегрирующими векторами.
Затем нуклеиновые кислоты и/или векторы экспрессии по настоящему изобретению трансформируют в любое количество различных типов клеток-хозяев, как хорошо известно из уровня техники, включая клетки млекопитающих, бактерий, дрожжей, насекомых и/или грибов, при этом клетки млекопитающих (например, клетки CHO) находят применение во многих вариантах осуществления.
В некоторых вариантах осуществления каждая из нуклеиновых кислот, кодирующих каждый мономер, и, необязательно, нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь, применяемую в зависимости от формата, содержатся в пределах одного вектора экспрессии, как правило, под контролем разных или одного и того же промотора. В вариантах осуществления, особенно применимых в настоящем изобретении, каждая из этих двух или трех нуклеиновых кислот содержится в отличном векторе экспрессии. Как показано в данном документе и в № 62/025931, включенном в данный документ посредством ссылки, для управления образованием гетеродимера можно применять различные соотношения векторов. То есть, и что удивительно, хотя белки содержат первый мономер:второй мономер:легкие цепи (в случае многих вариантов осуществления в данном документе, где предусматривается содержащее три полипептида гетеродимерное антитело) в соотношении 1:1:2, это не является соотношением, которое дает наилучшие результаты.
Гетеродимерные антитела по настоящему изобретению получают путем культивирования клетокхозяев, содержащих вектор(векторы) экспрессии, как хорошо известно из уровня техники. После получения выполняют традиционные стадии очистки антител, включая стадию ионообменной хроматографии. Как обсуждается в данном документе, pI двух мономеров, отличающиеся по меньшей мере на 0,5, могут обеспечить возможность разделения с помощью ионообменной хроматографии или изоэлектрического фокусирования или других способов, чувствительных к изоэлектрической точке. То есть включение замен с изменением pI, которые обеспечивают изменение изоэлектрической точки (pI) каждого мономера таким образом, что каждый мономер имеет различную pI, и гетеродимер также имеет отличную pI, тем самым обеспечивает облегчение очистки на основе изоэлектрической точки гетеродимера в тройном F''-формате (например, с применением анионообменных колонок, катионообменных колонок). Эти замены также помогают в определении и отслеживании любого загрязнения после очистки гомодимеров с двойным scFv-Fc и mAb (например, с применением IEF-гелей, cIEF и аналитических колонок для IEX).
- 34 036156
Методы лечения
После получения композиции по настоящему изобретению находят применение в ряде вариантов применения. Регуляция CD20, CD38 и CD123 нарушена при многих злокачественных новообразованиях гемопоэтической системы и в линиях клеток, полученных из различных злокачественных новообразований гемопоэтической системы, соответственно, гетеродимерные антитела по настоящему изобретению находят применение при лечении рака, включая без ограничения все B-клеточные лимфомы и лейкозы, включая без ограничения неходжкинскую лимфому (NHL), лимфому Беркитта (BL), множественную миелому (ММ), B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (B-CLL), B- и T-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), T-клеточную лимфому (TCL), острый миелоидный лейкоз (AML), волосатоклеточный лейкоз (HCL), лимфому Ходжкина (HL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), неходжкинскую лимфому и хронический миелоидный лейкоз (CML).
Соответственно, гетеродимерные композиции по настоящему изобретению находят применение в лечении этих форм рака.
Композиции антител для введения In Vivo
Составы с антителами, применяемыми в соответствии с настоящим изобретением, готовят для хранения путем смешивания антитела с требуемой степенью чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.[1980]) в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для пациентов при используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (менее чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).
Состав в данном документе может также содержать более чем одно активное соединение, если это необходимо для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно соединений с взаимодополняющими активностями, которые не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга. Например, может быть необходимо предоставить антитела с другими видами специфичности. Альтернативно или дополнительно, композиция может содержать цитотоксическое средство, цитокин, ингибитор роста и/или низкомолекулярный антагонист. Такие молекулы подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели.
Активные ингредиенты также можно заключать в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методик коацервации или путем межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозы, или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Составы, применяемые для введения in vivo, должны быть стерильными или почти стерильными. Это легко осуществить путем фильтрации через мембраны для стерилизующей фильтрации.
Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем эти матрицы находятся в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают в себя полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил^-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как этиленвинилацетат и сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, обеспечивают высвобождение молекул в течение более 100 дней, определенные гидрогели обеспечивают высвобождение белков в течение более короткого периода времени.
Когда инкапсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегироваться в результате воздействия влаги при 37°C, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. Можно разработать рациональ- 35 036156 ные стратегии для стабилизации в зависимости от задействованного механизма. Например, если было обнаружено, что механизм агрегации представляет собой образование межмолекулярных связей S--S посредством тиодисульфидного обмена, стабилизации можно достичь путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислотных растворов, контроля содержания влаги, применения соответствующих добавок и разработки специфических композиций на основе полимерных матриц.
Способы введения
Антитела и химиотерапевтические средства по настоящему изобретению вводят субъекту в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде болюса или путем непрерывной инфузии в течение некоторого периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным, интратекальным, пероральным, местным или ингаляционным путем. Внутривенное или подкожное введение антитела является предпочтительным.
Способы лечения
В способах по настоящему изобретению терапию применяют для обеспечения положительного терапевтического ответа в отношении заболевания или состояния. Под положительным терапевтическим ответом подразумевается ослабление заболевания или состояния и/или ослабление симптомов, связанных с заболеванием или состоянием. Например, положительный терапевтический ответ будет относиться к одному или нескольким из следующих улучшений при заболевании: (1) уменьшение количества неопластических клеток; (2) повышение уровня гибели неопластических клеток; (3) ингибирование выживаемости неопластических клеток; (5) ингибирование (т.е. замедление до некоторой степени, предпочтительно прекращение) роста опухоли; (6) повышение выживаемости пациентов и (7) некоторое облегчение одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или состоянием.
Положительные терапевтические ответы при любом конкретном заболевании или состоянии можно определить по стандартизованным критериям ответа, специфичным для данного заболевания или состояния. Ответ опухоли можно оценить по изменениям морфологии опухоли (т.е. общая опухолевая нагрузка, размер опухоли и т. п.) с применением скрининговых методик, таких как магнитно-резонансное томографическое (MRI) сканирование, рентгенографическая визуализация, компьютерное томографическое (КТ) сканирование, остеосцинтиграфическая визуализация, эндоскопия и забор материала опухоли на биопсию, включая пункцию костного мозга (ВМА) и подсчет опухолевых клеток в кровотоке.
В дополнение к этим положительным терапевтическим ответам субъект, подвергающийся терапии, может испытывать положительный эффект ослабления симптомов, связанных с заболеванием.
Ослабление заболевания можно охарактеризовать как полный ответ. Под полным ответом подразумевается отсутствие клинически выявляемого заболевания с нормализацией любых аномальных результатов ранее проведенных рентгенологических исследований костного мозга и цереброспинальной жидкости (CSF) или аномального моноклонального белка в случае миеломы.
Такой ответ может сохраняться в течение по меньшей мере 4-8 недель или иногда 6-8 недель после лечения в соответствии со способами по настоящему изобретению. В качестве альтернативы, ослабление заболевания может быть классифицировано как частичный ответ. Под частичным ответом подразумевается по меньшей мере приблизительно 50% уменьшение всей измеряемой опухолевой нагрузки (т.е. количества злокачественных клеток, присутствующих у субъекта, или измеряемого объема опухолевых масс или количества аномального моноклонального белка) в отсутствие новых повреждений, которое может сохраняться в течение 4-8 недель или 6-8 недель.
Лечение в соответствии с настоящим изобретением включает терапевтически эффективное количество применяемых лекарственных препаратов. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периода времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата.
Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как течение заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, а также способность лекарственных препаратов вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой таковое, при котором терапевтически полезные эффекты преобладают над любыми токсическими или вредными эффектами антитела или части антитела.
Терапевтически эффективное количество для лечения опухолей также можно измерить по его способности стабилизировать прогрессирование заболевания. Способность соединения ингибировать рак можно оценить в животной модельной системе, прогнозирующей эффективность в опухолях человека.
В качестве альтернативы это свойство композиции можно оценить путем изучения способности соединения ингибировать рост клеток или индуцировать апоптоз в анализах in vitro, известных практикующему специалисту. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может обеспечивать уменьшение размера опухоли или иным образом облегчать симптомы у субъекта.
Специалист в данной области сможет определить эти количества на основе таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и конкретная композиция или выбранный путь введения.
Схемы дозирования корректируют для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно вводить однократную болюсную дозу, можно вводить не- 36 036156 сколько разделенных доз в течение некоторого периода или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать, что определяется требованиями терапевтической ситуации. Парентеральные композиции могут быть составлены в виде стандартной лекарственной формы для облегчения введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма, применяемая в данном документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.
Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению обусловлена и непосредственно зависит от (a) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и (b) ограничений в данной области техники, связанных с составлением такого активного соединения, для лечения чувствительности у индивидуумов.
Эффективные дозы и схемы дозирования биспецифических антител, применяемых в настоящем изобретении, зависят от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и могут быть определены специалистами в данной области.
Иллюстративный неограничивающий диапазон для терапевтически эффективного количества биспецифического антитела, применяемого в настоящем изобретении, составляет приблизительно 0,1-100 мг/кг, как, например, приблизительно 0,1-50 мг/кг, например, приблизительно 0,1-20 мг/кг, как, например, приблизительно 0,1-10 мг/кг, например, приблизительно 0,5, например, приблизительно 0,3, приблизительно 1 или приблизительно 3 мг/кг. В другом варианте осуществления антитело вводят в дозе 1 мг/кг или больше, например, доза составляет от 1 до 20 мг/кг, например, доза составляет от 5 до 20 мг/кг, например, доза составляет 8 мг/кг.
Медицинский работник, являющийся специалистом в данной области, может легко определить и назначить эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начинать с доз лекарственного препарата, применяемого в фармацевтической композиции, на уровнях ниже, чем требуется для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу до достижения желаемого эффекта.
В одном варианте осуществления биспецифическое антитело вводят путем инфузии в еженедельной дозе от 10 до 500 мг/кг, такой как от 200 до 400 мг/кг. Такое введение можно повторять, например, от 1 до 8 раз, например, от 3 до 5 раз. Введение можно осуществлять путем непрерывной инфузии в течение периода времени от 2 до 24 ч, такого как от 2 до 12 ч.
В одном варианте осуществления биспецифическое антитело вводят путем медленной непрерывной инфузии в течение длительного периода времени, такого как более чем 24 ч, если требуется уменьшить проявления побочных эффектов, включая токсичность.
В одном варианте осуществления биспецифическое антитело вводят в еженедельной дозе от 250 мг до 2000 мг, такой как, например, 300 мг, 500 мг, 700 мг, 1000 мг, 1500 мг или 2000 мг, до 8 раз, например от 4 до 6 раз. Введение можно осуществлять путем непрерывной инфузии в течение периода времени от 2 до 24 ч, такого как от 2 до 12 ч. Такую схему можно повторять один или несколько раз по необходимости, например, через 6 месяцев или 12 месяцев. Дозировку можно определять или скорректировать путем измерения количества соединения по настоящему изобретению в крови после введения, например, путем забора биологического образца и применения антиидиотипических антител, которые нацелены на антигенсвязывающий участок биспецифического антитела.
В дополнительном варианте осуществления биспецифическое антитело вводят один раз в неделю в течение от 2 до 12 недель, например от 3 до 10 недель, например от 4 до 8 недель.
В одном варианте осуществления биспецифическое антитело вводят в качестве поддерживающей терапии, такой как, например, один раз в неделю в течение периода времени от 6 месяцев или больше.
В одном варианте осуществления биспецифическое антитело вводят по схеме, включающей одну инфузию биспецифического антитела с последующей инфузией биспецифического антитела, конъюгированного с радиоактивным изотопом. Схему можно повторить, например, через 7-9 дней.
В качестве неограничивающих примеров лечение согласно настоящему изобретению можно предоставить в виде суточной дозы антитела в количестве приблизительно 0,1-100 мг/кг, таком как 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в день, по меньшей мере раз в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 дней, или, в качестве альтернативы, по меньшей мере раз в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 недель после начала лечения или в любой их комбинации с применением одиночных или разделенных доз каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 ч или в любой их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления молекулу биспецифического антитела применяют в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, например, с химиотерапевтическим средством. Неограничивающие примеры повреждающих ДНК химиотерапевтических средств включают ингибиторы топоизомеразы I (например, иринотекан, топотекан, камптотецин и их аналоги или метаболиты и доксорубицин); ингибиторы топоизомеразы II (например, этопозид, тенипозид
- 37 036156 и даунорубицин); алкилирующие средства (например, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, тиотепа, ифосфамид, кармустин, ломустин, семустин, стрептозоцин, декарбазин, метотрексат, митомицин C и циклофосфамид); интеркаляторы ДНК (например, цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин); интеркаляторы ДНК и генераторы свободных радикалов, такие как блеомицин; и нуклеозидные миметики (например, 5-фторурацил, капецитибин, гемцитабин, флударабин, цитарабин, меркаптопурин, тиогуанин, пентостатин и гидроксимочевина).
Химиотерапевтические средства, которые нарушают размножение клеток, включают паклитаксел, доцетаксел и родственные аналоги; винкристин, винбластин и родственные аналоги; талидомид, леналидомид и родственные аналоги (например, CC-5013 и CC-4047); ингибиторы тирозиновой протеинкиназы (например, иматиниба мезилат и гефитиниб); ингибиторы протеасомы (например, бортезомиб); ингибиторы NF-kB, включая ингибиторы киназы IkB; антитела, которые связываются с белками, сверхэкспрессируемыми при раках, и, следовательно, подавляют размножение клеток (например, трастузумаб, ритуксимаб, цетуксимаб и бевацизумаб); и другие ингибиторы белков или ферментов, которые, как известно, являются стимулированными, сверхэкспрессируемыми или активированными при раках, ингибирование которых приводит к подавлению размножения клеток.
В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно применять до, одновременно с лечением Velcade® (бортезомибом) или после него.
Все цитируемые ссылки явным образом включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В то время как конкретные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны выше в иллюстративных целях, специалистам в данной области будет понятно, что многочисленные варианты деталей можно выполнить без отхода от настоящего изобретения, как описано в прилагаемой формуле изобретения.
Примеры
Ниже приводятся примеры для иллюстрации настоящего изобретения. Эти примеры не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо конкретным применением или методикой применения. Для всех положений в константных областях, обсуждаемых в настоящем изобретении, нумерация соответствует EU-индексу по Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, полностью включена посредством ссылки). Специалистам в области антител будет понятно, что это соглашение включает непоследовательную нумерацию в определенных областях последовательности иммуноглобулина, что позволяет стандартизовать ссылку на консервативные положения в семействах иммуноглобулинов. Соответственно, положения для любого данного иммуноглобулина, определенные по EU-индексу, не обязательно будут соответствовать его последовательной последовательности.
Общие и конкретные научные методики изложены в публикациях заявок на патент США 2015/0307629, 2014/0288275 и WO 2014/145806, которые явным образом включены посредством ссылки во всей своей полноте и, в частности, для методик, изложенных в них.
Пример 1. Альтернативные форматы.
Получение биспецифических антител.
Схематические изображения биспецифических антител к CD38 х CD3 показаны на фиг. 1. Аминокислотные последовательности для биспецифических антител к CD38 х CD3 альтернативного формата перечислены на фиг. 39-43. ДНК, кодирующую три цепи, необходимые для экспрессии биспецифического антитела, получали с помощью синтеза генов (Blue Heron Biotechnology, Ботелл, Вашингтон) и субклонировали с применением стандартных методик молекулярной биологии в вектор экспрессии рТТ5. Замены вводили с применением либо сайт-направленного мутагенеза (QuikChange, Stratagene, Сидар Крик, Техас), либо дополнительного синтеза генов и субклонирования. ДНК трансфицировали в клетки HEK293E для экспрессии и полученные белки очищали из супернатанта с применением аффинной хроматографии с использованием белка A (GE Healthcare) и катионообменной хроматографии. Выходы после аффинной очистки с использованием белка A представлены на фиг. 35. Очистку с помощью катионообменной хроматографии проводили с применением колонки HiTrap SP HP (GE Healthcare) с буфером для промывки/уравновешивания 50 мМ MES, pH 6,0 и буфером для элюирования 50 мМ MES, pH 6,0 + 1 M NaCl с линейным градиентом (см. фиг. 36 для хроматограмм).
Перенаправленная T-клеточная цитотоксичность.
Характеристики биспецифических антител к CD38 х CD3 определяли in vitro в отношении перенаправленной T-клеточной цитотоксичности (RTCC) клеточной линии CD38+ RPMI8266 миеломы. 10 тысяч клеток RPMI8266 инкубировали в течение 24 ч с 500 тысячами РВМС человека. RTCC измеряли с помощью флуоресценции LDH, как указано (см. фиг. 37).
Пример 2. Перенаправленная T-клеточная цитотоксичность.
Характеристики биспецифических Fab-scFv-Fc к CD38 х CD3 определяли in vitro в отношении перенаправленной T-клеточной цитотоксичности (RTCC) клеточной линии CD38+ RPMI8266 миеломы. 40 тысяч клеток RPMI8266 инкубировали в течение 96 ч с 400 тысячами РВМС человека. RTCC измеряли с
- 38 036156 помощью проточной цитометрии, как указано (см. фиг. 44). Характеристики экспрессии CD69, Ki-67 и
PI-9 в CD4+ и CD8+ T-клетках также определяли с помощью проточной цитометрии, как показано на фиг. 45.
Мышиная модель противоопухолевой активности.
Четырем группам по пять мышей NOD scid gamma (NSG) в каждой прививали 5х106 опухолевых клеток RPMI8226TrS (множественная миелома, экспрессирующая люциферазу) путем внутривенной инъекции в хвостовую вену в день -23. В день 0 мышам внутрибрюшинно прививали 10х106 РВМС человека. После прививания РВМС в день 0 тестируемые препараты вводили еженедельно (дни 0, 7) с помощью внутрибрюшинной инъекции в дозах, указанных на фиг. 4. Дизайн исследования дополнительно приведен на фиг. 46. За ростом опухоли наблюдали с помощью измерения общего потока на мышь с применением системы визуализации in vivo (IVIS®). Как XmAb13551, так и XmAb15426 продемонстрировали значительные противоопухолевые эффекты (см. фиг. 47 и 48).
Исследования на яванских макаках.
Яванским макакам вводили однократную дозу биспецифических антител к CD38 х CD3. Также включали биспецифическое контрольное антитело к RSV х CD3. Уровни доз составляли: 20 мкг/кг XmAb13551 (n=2), 0,5 мг/кг XmAb15426 (n=3), 3 мг/кг XmAb14702 (n=3) или 3 мг/кг XmAb13245 (контрольное антитело к RSV х CD3, n=3) (в 3 независимых исследованиях). Биспецифические антитела к CD38 х CD3 обеспечивали быстрое истощение CD38+ клеток в периферической крови (см. фигуру 49). Биспецифические антитела к CD38 х CD3 приводили к активации T-клеток, измеренной по экспрессии CD69 (см. фигуру 50). Также измеряли уровни IL-6 в сыворотке (см. фигуру 51). Необходимо отметить, что по сравнению с XmAb13551 XmAb15426 характеризовалось увеличенной продолжительность истощения CD38+ клеток и более низкими уровнями активации T-клеток и продукции IL-6.
XmAb15426 и XmAb14702 тестировали при однократных дозах 0,5 мг/кг и 3 мг/кг соответственно. Оба антитела хорошо переносились при этих более высоких дозах, что согласуется с умеренными уровнями IL6, наблюдаемыми в сыворотке обработанных обезьян. Более того, XmAb15426 со средней аффинностью к CD3 обеспечивало более эффективное истощение CD38+ клеток в дозе 0,5 мг/кг по сравнению с исходным высокоаффинным XmAb13551 в дозе 2, 5 или 20 мкг/кг. Истощение при применении XmAb15426 было более устойчивым по сравнению с XmAb13551 в самой высокой дозе в предыдущем исследовании (7 по сравнению с 2 днями соответственно). Примечательно, что, хотя истощение клетокмишеней было большим в случае XmAb15426, активация T-клеток (индукция CD69, CD25 и PD1) у обезьян, обработанных XmAb15426, была значительно ниже даже в дозе, в 25 раз более высокой, чем в группе с 20 мкг/кг XmAb13551. XmAb14702 с очень низкой аффинностью к CD3 характеризовалось незначительным эффектом в отношении CD38+ клеток и активации T-клеток.
Эти результаты демонстрируют, что модуляция активации T-клеток за счет ослабления аффинности к CD3 является перспективным способом увеличения терапевтического диапазона для биспецифических антител, связывающих T-клетки. Эта стратегия имеет потенциал для расширения набора антигенов, поддающихся целенаправленно воздействующей T-клеточной иммунотерапии, путем улучшения переносимости и обеспечения возможности более высокого дозирования для преодоления антиген-зависимого клиренса с такими мишенями, как CD38. Мы показали, что при снижении аффинности к CD3 XmAb 15426 эффективно истощает CD38+ клетки, минимизируя эффекты CRS, предполагаемые при сопоставимых дозах его высокоаффинного аналога XmAb13551.
Пример 3. Разработка CDR для CD 123.
Отправной точкой в разработке CDR для гуманизированного антитела CD123 Fab человека была вариабельная область легкой цепи антитела мыши 7G3, называемая в данном документе 7G3 H0L0, от ATCC HB-12009. Однако исходная гуманизация (H1_L1; последовательность показана на фиг. 136) приводила к значительной потере аффинности (5-10-кратное снижение аффинности, как показано на фиг. 156B и C). Такая потеря аффинности происходила главным образом из-за гуманизации тяжелой цепи, как показано для конструкции H1_L0 (например, первая гуманизированная тяжелая цепь с легкой цепью мыши), при этом конструкция H1_L1 показала полную 10-кратную потерю аффинности. Это согласовалось с 10-кратной потерей активности RTCC (перенаправленная T-клеточная цитотоксичность), как показано на фиг. 156D, при тестировании по сравнению с клетками KG1a, которые экспрессировали CD123.
Соответственно проводили два раунда оптимизации аффинности/стабилизации. Первый раунд (библиотека 1, как показано на фиг. 157) заключался в получении 108 вариантов, в том числе LDA, целенаправленные и реверсивные замены, которые затем подвергали скринингу на аффинность в формате Fab (гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, слитый с CH1 человека от IgG1) на чипе CD123, при этом варианты с нейтральной и более высокой аффинностью подвергали скринингу на стабильность на DSF.
Как показано на фиг. 158, Tm первоначального варианта H1L1 повышалась по сравнению с исходным H0L0, причем результаты дополнительных вариантов в исходном H1L1 также показаны на фиг. 158.
Варианты раунда 1 затем выстраивали в формат открывалки, как дополнительно описано в дан- 39 036156 ном документе, с применением scFv к CD3 и разработанного Fab, и затем тестировали в анализе связывания KG-1a, а также анализе RTCC, как показано на фиг. 159. Хотя первый раунд оптимизации улучшал аффинность и эффективность вариантов, требовалась дополнительная оптимизация.
Второй раунд, раунд 2, показанный на фиг. 160, приводил к возврату аффинности связывания до уровней H0L0 мыши, а также возврату активности RTCC. Лучший вариант, XENP14045, обладал улучшенной аффинностью по сравнению с первой последовательностью гуманизации (H1L1; показал +21кратное улучшение по сравнению с H1L1), а также двукратное повышение активности по сравнению с исходным антителом мыши (7G3; H0L0). Следует отметить, что XENP13967 является эквивалентом XENP14045 на стороне CD123; 13967 имеет разный scFv CD3, как показано в последовательности.
Оптимизация в раунде 2 также приводила к увеличению стабильности, что измеряли посредством Tm. На фиг. 161 показаны результаты анализа Tm с улучшением +5С XENP13967 (и соответственно XENP14045) по сравнению с исходным химерным антителом (например, вариабельными последовательностями тяжелой и легкой цепи мыши) и +4С по сравнению с исходным вариантом H1L1. 13967/14045 имело 11 замен по сравнению с исходной последовательностью H1L1). Кроме того, в ходе второго раунда потенциальный сайт дезаминирования (-NS-мотив) был удален из легкой цепи CDR1.
Пример 4. Разработка CDR для CD20.
Два Fab антитела к CD20 изучали с точки зрения биспецифического формата CD20 х CD3 в отношении аффинности и эффективности связывания. Как XENP13677, так и XENP13676 основаны на ритуксимабе. Вариант 13677 демонстрировал значительно повышенную активность относительно варианта 13676, аффинность CD20 которого была приблизительно равной аффинности исходного антитела ритуксимаба. Оба биспецифических антитела вводили дозами подверженному исследованию яванскому макаку, чтобы сравнить их свойства in vivo. Однако, поскольку вариант 13677 обладал более высокой активностью, его вводили в 10 раз более низкой дозе, которая составляла 0,03 мг/кг, по сравнению с дозой менее активного 13676, которая составляла 0,3 мг/кг. При таких дозах оба антитела значительно истощали B-клетки обезьяны. Однако, как ни удивительно, значительно более активный 13677 в действительности показал более быстрое восстановление B-клеток при его более низкой дозе. С другой стороны, оба антитела обуславливали высвобождение приблизительно одинакового количества IL6. В заключение необходимо отметить, что вариант 13676 с более низкой аффинностью неожиданно продемонстрировал более подходящий терапевтический профиль, вызывая тем самым более продолжительное истощение B-клеток при поддержании аналогичных уровней IL6.

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Ahtu-CD123 х анти-CD3 гетеродимерное антитело, содержащее тяжелую цепь 1 (анти-CD123 Fab-Fc) с SEQ ID NO: 468;
    тяжелую цепь 2 (анти-CD3 scFv-Fc) с SEQ ID NO: 469; и легкую цепь (анти-CD123) с SEQ ID NO: 470.
  2. 2. Гетеродимерное антитело по п.1, состоящее из тяжелой цепи 1 (анти-CD123 Fab-Fc) с SEQ ID NO: 468;
    тяжелой цепи 2 (анти-CD3 scFv-Fc) с SEQ ID NO: 469; и легкой цепи (анти-CD123) с SEQ ID NO: 470.
  3. 3. Нуклеиновая кислота, кодирующая гетеродимерное антитело по п.1 или 2.
  4. 4. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую гетеродимерное антитело по п.1 или 2.
  5. 5. Клетка-хозяин для получения гетеродимерного антитела по п.1 или 2, содержащая нуклеиновую кислоту по п.3.
  6. 6. Клетка-хозяин для получения гетеродимерного антитела по п.1 или 2, содержащая вектор экспрессии по п.4.
  7. 7. Способ получения гетеродимерного антитела по п.1 или 2, включающий культивирование клетки-хозяина по п.5 или 6 в условиях, при которых экспрессируется антитело, и выделение антитела.
  8. 8. Применение гетеродимерного антитела по п.1 или 2 для лечения злокачественного новообразования, связанного с CD123-позитивными клетками.
  9. 9. Применение гетеродимерного антитела по п.8, где злокачественным новообразованием является гемопоэтическое злокачественное новообразование.
  10. 10. Применение гетеродимерное антитело по п.9, где гематопоэтическое злокачественное новообразование представляет собой B-клеточную лимфому или лейкоз.
  11. 11. Применение гетеродимерного антитела по п.10, где B-клеточная лимфома или лейкоз выбраны из группы, состоящей из неходжкинской лимфомы (NHL), лимфомы Беркитта (BL), множественной миеломы (MM), B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (B-CLL), B- и T-клеточного острого лимфоцитарного лейкоза (ALL), T-клеточной лимфомы (TCL), острого миелоидного лейкоза (AML), волосатоклеточного лейкоза (HCL), лимфомы Ходжкина (HL), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), неходжкинской лимфомы и хронического миелоидного лейкоза (CML).
EA201792467A 2015-05-08 2016-04-28 Гетеродимерные антитела, которые связывают cd3 и опухолевые антигены EA036156B1 (ru)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562159111P 2015-05-08 2015-05-08
US201562251005P 2015-11-04 2015-11-04
US201562250971P 2015-11-04 2015-11-04
PCT/US2015/062772 WO2016086189A2 (en) 2014-11-26 2015-11-25 Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
US14/952,714 US10889653B2 (en) 2014-11-26 2015-11-25 Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
PCT/US2016/029797 WO2016182751A1 (en) 2015-05-08 2016-04-28 Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201792467A1 EA201792467A1 (ru) 2018-04-30
EA036156B1 true EA036156B1 (ru) 2020-10-07

Family

ID=57248331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792467A EA036156B1 (ru) 2015-05-08 2016-04-28 Гетеродимерные антитела, которые связывают cd3 и опухолевые антигены

Country Status (21)

Country Link
EP (2) EP3236996B1 (ru)
JP (3) JP6694446B2 (ru)
KR (1) KR20180018525A (ru)
CN (2) CN115536750A (ru)
AU (3) AU2016262368B2 (ru)
BR (1) BR112017023943A2 (ru)
CA (1) CA2984134A1 (ru)
CL (1) CL2017002752A1 (ru)
CO (1) CO2017011486A2 (ru)
CR (1) CR20170511A (ru)
EA (1) EA036156B1 (ru)
EC (1) ECSP17081420A (ru)
HK (1) HK1244219A1 (ru)
IL (1) IL255221A0 (ru)
MA (1) MA41279A (ru)
MX (1) MX2017014353A (ru)
PE (1) PE20180188A1 (ru)
PH (1) PH12017502019A1 (ru)
SG (1) SG11201708620QA (ru)
TN (1) TN2017000470A1 (ru)
WO (1) WO2016182751A1 (ru)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014205086B2 (en) 2013-01-14 2019-04-18 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3954713A3 (en) 2014-03-28 2022-03-30 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
CA2967426A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
BR112017011166A2 (pt) 2014-11-26 2018-02-27 Xencor, Inc. anticorpos heterodiméricos que se ligam a cd3 e cd38
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
ES2824167T3 (es) 2015-01-23 2021-05-11 Sanofi Sa Anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD123 y anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a CD3 y/o CD123
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
KR20180018525A (ko) 2015-05-08 2018-02-21 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 종양 항원과 결합하는 이종이량체 항체
EP3387013B1 (en) 2015-12-07 2022-06-08 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
US20170349660A1 (en) * 2016-06-01 2017-12-07 Xencor. Inc. Bispecific antibodies that bind cd123 and cd3
MX2018015592A (es) 2016-06-14 2019-04-24 Xencor Inc Anticuerpos inhibidores de puntos de control biespecificos.
CA3029328A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
AU2017342559B2 (en) 2016-10-14 2022-03-24 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ralpha Fc-fusion proteins and PD-1 antibody fragments
US11459394B2 (en) 2017-02-24 2022-10-04 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018223004A1 (en) 2017-06-01 2018-12-06 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind cd20 and cd3
CA3065929A1 (en) 2017-06-01 2018-12-06 Michael Wayne SAVILLE Bispecific antibodies that bind cd123 and cd3
UY37758A (es) 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
JP7433910B2 (ja) 2017-06-22 2024-02-20 ノバルティス アーゲー Ｃｄ７３に対する抗体分子及びその使用
WO2018237173A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag ANTIBODY MOLECULES DIRECTED AGAINST CD73 AND CORRESPONDING USES
JP2020529832A (ja) 2017-06-30 2020-10-15 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαおよび抗原結合ドメインを含む標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3706793A1 (en) 2017-11-08 2020-09-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
KR20200096253A (ko) 2017-11-30 2020-08-11 노파르티스 아게 Bcma-표적화 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도
WO2019125732A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Xencor, Inc. Engineered il-2 fc fusion proteins
US11685781B2 (en) 2018-02-15 2023-06-27 Macrogenics, Inc. Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
AU2019247415A1 (en) * 2018-04-04 2020-10-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
IL278090B1 (en) * 2018-04-18 2024-03-01 Xencor Inc Proteins from heterodimeric il-15/il-15rα ohi-fc and their uses
AU2019256529A1 (en) 2018-04-18 2020-11-26 Xencor, Inc. TIM-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and TIM-3 antigen binding domains
CA3097593A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
EP3784350A1 (en) * 2018-04-27 2021-03-03 Novartis Ag Dosing of a bispecific antibody that bind cd123 and cd3
TW202015726A (zh) 2018-05-30 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
AU2019277029C1 (en) 2018-06-01 2024-01-04 Novartis Ag Binding molecules against BCMA and uses thereof
KR20210016426A (ko) * 2018-06-01 2021-02-15 노파르티스 아게 Cd123 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체의 투약
JP2022503959A (ja) 2018-10-03 2022-01-12 ゼンコア インコーポレイテッド Ｉｌ－１２ヘテロ二量体ｆｃ－融合タンパク質
US20220169728A1 (en) * 2019-01-28 2022-06-02 Ab Therapeutics, Inc. Bispecific antibodies and uses thereof
WO2020180726A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
KR20220010743A (ko) 2019-05-21 2022-01-26 노파르티스 아게 Bcma에 대한 삼중특이적 결합 분자 및 이의 용도
US20230071196A1 (en) 2019-05-21 2023-03-09 Novartis Ag Variant cd58 domains and uses thereof
TW202100559A (zh) 2019-05-21 2021-01-01 瑞士商諾華公司 Cd19 結合分子及其用途
JP2022548881A (ja) 2019-09-18 2022-11-22 ノバルティス アーゲー Ｅｎｔｐｄ２抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法
TW202128757A (zh) 2019-10-11 2021-08-01 美商建南德克公司 具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白
CN115315446A (zh) 2020-03-06 2022-11-08 Go医疗股份有限公司 抗糖-cd44抗体及其用途
US11365239B2 (en) 2020-03-20 2022-06-21 Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. Anti-SARS-COV-2 antibodies and uses thereof
WO2021195513A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 Novartis Ag Bispecific combination therapy for treating proliferative diseases and autoimmune disorders
WO2021231969A1 (en) * 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind msln and cd3
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
AU2021329378A1 (en) 2020-08-19 2023-03-23 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
WO2022097060A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
EP4240494A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
EP4301782A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
EP4305067A1 (en) 2021-03-09 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
WO2022192586A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
WO2023014863A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
CA3230934A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
TW202325733A (zh) 2021-09-03 2023-07-01 美商Ｇｏ治療公司 抗醣化-lamp1抗體及其用途
CN115894701A (zh) * 2021-09-30 2023-04-04 上海君实生物医药科技股份有限公司 结合cd3的抗体及其用途
CA3233696A1 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Joachim Koch Bispecific cd16a binders
WO2023215674A1 (en) * 2022-05-03 2023-11-09 Xencor, Inc. Methods for treating lymphoma
CN116375859A (zh) * 2023-06-05 2023-07-04 北京大学第一医院 一种抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014145806A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US20140294823A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-02 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US20140302064A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 Xencor, Inc. Optimized anti-cd3 variable regions
WO2015149077A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
WO2016086189A2 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US459001A (en) 1891-09-08 Hydrostatic scale
US459007A (en) 1891-09-08 Porte
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
WO1998048032A2 (en) 1997-04-21 1998-10-29 Donlar Corporation POLY-(α-L-ASPARTIC ACID), POLY-(α-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
AU2003248370A1 (en) 2002-02-27 2003-09-09 California Institute Of Technology Computational method for designing enzymes for incorporation of amino acid analogs into proteins
SG143252A1 (en) 2003-10-09 2008-06-27 Ambrx Inc Polymer derivatives
AU2005211362B2 (en) 2004-02-02 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
JPWO2009110132A1 (ja) 2008-03-06 2011-07-14 富士電機株式会社 アクティブ・マトリクス型表示装置
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
EP2776061B1 (en) * 2011-11-07 2019-08-14 MedImmune, LLC Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
JOP20200236A1 (ar) * 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US9701759B2 (en) * 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014205086B2 (en) * 2013-01-14 2019-04-18 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
EP2839842A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
KR20180018525A (ko) 2015-05-08 2018-02-21 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 종양 항원과 결합하는 이종이량체 항체

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140302064A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 Xencor, Inc. Optimized anti-cd3 variable regions
WO2014145806A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US20140294823A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-02 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2015149077A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
WO2016086189A2 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Xencor Provides Data Updates on XmAb Bispecific Antibody Programs and Announces Presentations at Upcoming American Society of Hematology 2014 Annual Meeting", 6 November 2014 (2014-11-06), XP055255549, Retrieved from the Internet: URL:http://files.shareholder.com/downloads/AMDA-2B2V8N/1639829209x0x792404/77590B72-837A-4085-BC55-78FA500638DC/XNCR_News_201411_6_General_Releases.pdf" [retrieved on 2016-03-04], the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016262368A1 (en) 2017-11-16
CO2017011486A2 (es) 2018-03-28
PE20180188A1 (es) 2018-01-23
AU2021203049A1 (en) 2021-06-10
HK1244219A1 (zh) 2018-08-03
CA2984134A1 (en) 2016-11-17
JP2023113868A (ja) 2023-08-16
BR112017023943A2 (pt) 2018-07-31
CL2017002752A1 (es) 2018-03-23
KR20180018525A (ko) 2018-02-21
WO2016182751A1 (en) 2016-11-17
CN108025046B (zh) 2022-04-08
EA201792467A1 (ru) 2018-04-30
AU2016262368B2 (en) 2019-05-16
PH12017502019A1 (en) 2018-04-02
CR20170511A (es) 2018-01-22
MA41279A (fr) 2021-04-28
CN108025046A (zh) 2018-05-11
JP2018519263A (ja) 2018-07-19
JP6694446B2 (ja) 2020-05-13
SG11201708620QA (en) 2017-11-29
EP3236996B1 (en) 2022-03-16
EP3236996A1 (en) 2017-11-01
JP2020125326A (ja) 2020-08-20
AU2019216719A1 (en) 2019-09-05
TN2017000470A1 (en) 2019-04-12
AU2021203049B2 (en) 2023-06-29
EP4059514A1 (en) 2022-09-21
CN115536750A (zh) 2022-12-30
MX2017014353A (es) 2018-03-27
ECSP17081420A (es) 2019-03-29
IL255221A0 (en) 2017-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11945880B2 (en) Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
AU2021203049B2 (en) Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US11859011B2 (en) Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EA044325B1 (ru) ГЕТЕРОДИМЕРНОЕ АНТИ-CD3xCD20 АНТИТЕЛО, ЕГО ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG TJ TM