JP2018507905A

JP2018507905A - ＢＥＴ阻害剤及びαアミノ酸エステルの共有結合コンジュゲート

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Publication number: JP2018507905A
Application number: JP2017548946A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，ジョン，アレキサンダー; ルイーズジョーンズ，キャサリン; クマープリンジャ，ラビンダー; ウィザーリントン，ジェイソン
Original assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Current assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Priority date: 2015-03-19
Filing date: 2016-03-17
Publication date: 2018-03-22
Also published as: EP3270974A1; GB201504694D0; WO2016146755A1; US20190142949A1; US20180117165A1

Abstract

本発明は、BET阻害剤及びαアミノ酸エステルの共有結合コンジュゲート、それらの調製のための方法、それらを含有する組成物、並びに様々な障害、特に、炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ等;及び癌の治療におけるそれらの使用に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、BET阻害剤及びαアミノ酸エステルの共有結合コンジュゲート(covalent conjugate)、それらの調製のための方法、それらを含有する組成物、並びに様々な障害、特に、炎症性疾患及び自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ;及び癌の治療におけるそれらの使用に関する。

真核生物のゲノムは、細胞の核内で高度に組織される。二重鎖DNAの長鎖は、ヒストンタンパク質(ヒストンH2A、H2B、H3及びH4の2つのコピーを最も一般的に含む)の八量体の周りに巻き付いて、ヌクレオソームを形成する。次いで、この基本単位は、ヌクレオソームの凝集及び折りたたみにより更に圧縮されて、高度に凝縮されたクロマチン構造を形成する。ある範囲の異なる状態の凝縮が可能であり、この構造の堅固さは、細胞周期の間に変わり、細胞分裂のプロセス中最もコンパクトである。クロマチン構造は、遺伝子転写を制御する上で決定的に重要な役割を果たしており、これは、高度に凝縮されたクロマチンから効率的に行うことができない。クロマチン構造は、ヒストンタンパク質、特に、ヒストンH3及びH4への、最も一般的には、コアヌクレオソーム構造を超えて伸長するヒストン尾部内の、一連の翻訳後修飾によって制御される。これらの修飾には、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、SUMO化が含まれる。これらのエピジェネティックなマークは、特異的な酵素によって書き込まれ、消去され、ヒストン尾部内の特異的な残基にタグを置き、それによって、エピジェネティックなコードを形成し、次いで、細胞によって解釈されて、遺伝子発現の調節を可能にする。

ヒストンアセチル化は、遺伝子転写の活性化を伴うことが最も多く、これは、この修飾が静電気を変化させることによりDNA及びヒストン八量体の相互作用を緩和するためである。この物理的な変化に加え、特異的タンパク質は、ヒストン内でアセチル化リジン残基を認識し、結合して、エピジェネティックなコードを読み取る。ブロモドメインは、ヒストンに関連して、一般的であるが限定されることなく、アセチル化リジン残基に結合するタンパク質内の小型(約110個のアミノ酸)の異なるドメインである。ブロモドメインを含有することが知られた約50種のタンパク質からなるファミリーがあり、これらは、細胞内で、ある範囲の機能がある。

ブロモドメイン含有タンパク質のBETファミリーは、極めて接近した2つのアセチル化リジン残基に結合し、相互作用の特異性を高めることが可能なタンデムブロモドメインを含有する、4種のタンパク質(BRD2、BRD3、BRD4及びBRDT)を含む。各BETタンパク質のN-末端から番号を付けて、タンデムブロモドメインは、結合ドメイン1(BD1)及び結合ドメイン2(BD2)を、通常、標識化する(Chungら、J Med.Chem,.2011年、54巻、3827〜3838頁)。

BETタンパク質のアセチル化リジン残基への結合を阻害すると、癌(Dawson M.A.ら、Nature、2011年:478巻(7370号):529〜33; Wyce, A.ら、Oncotarget. 2013年:4巻(12号):2419〜29)、敗血症(Nicodeme E.ら、Nature、2010年:468巻(7327号):1119〜23)、関節リウマチ及び多発性硬化症等の自己免疫疾患及び炎症性疾患(Mele D.A.ら、Journal of Experimental Medicine、2013年:210巻(11号):2181〜90)、心不全(Anand P.ら、Cell、2013年:154巻(3号):569〜82)、及び肺線維症(Tang X.ら、Molecular Pharmacology、2013年:83巻(1号):.283〜293)を含むが限定されない、いくつかの疾患の進行を寛解させる可能性がある。

BETタンパク質のアセチル化リジン残基への結合を阻害することが可能であり、したがって、例えば、自己免疫疾患及び炎症性疾患、及び癌の治療において効用がある、更なる化合物の必要性が存在する。特に、既存のBET阻害剤を超える改善された特性、例えば、改善された効力、安全性、忍容性、薬物動態及び/又は薬力学を有する更なるBET阻害剤を生成するための新たなアプローチの必要性が存在する。

最も広範な態様では、本発明は、BET阻害剤及びαアミノ酸エステルの共有結合コンジュゲートであって、αアミノ酸エステルのエステル基は、1種以上の細胞内カルボキシエステラーゼにより対応するカルボン酸に加水分解可能である、共有結合コンジュゲートを提供する。

本発明は、BET阻害剤の治療プロファイルを改善する(すなわち、効力、作用持続時間を改善し、且つ/又はその全身曝露を低減する)ために、細胞内カルボキシエステラーゼ酵素を利用する。特に、本発明は、単球、マクロファージ及び樹状細胞等のhCE-1を発現する細胞にBET阻害剤を選択的に標的化するための新たな方法を提供し、したがって、多数の自己免疫疾患及び炎症性疾患の発症及び進行の中心であるこれらの細胞へのBET阻害剤の送達を可能にする。

本発明の共有結合コンジュゲートの加水分解を示す概要図である。

定義
本明細書で使用される場合、用語「ブロモドメイン」とは、ヒストンのN-末端尾部上のもの等、アセチル化リジン残基に結合する進化的及び構造的に保存されたモジュール(長さがおよそ110個のアミノ酸)を指す。これらは、より大型のブロモドメイン含有タンパク質(BCPs)の一部として見出されるタンパク質ドメインであり、その多くは、遺伝子転写及び/又はクロマチンリモデリングを制御する上で役割がある。ヒトゲノムは、少なくとも57個のブロモドメインをコードする。

本明細書で使用される場合、用語「BET」とは、BRD2、BRD3、BRD4及びBRDTを含む、ブロモドメイン含有タンパク質のブロモドメイン及び末端外ドメインファミリーを指す。

本明細書で使用される場合、語句「BET阻害剤」とは、1つ以上のBETファミリーブロモドメイン含有タンパク質(例えば、BRD2、BRD3、BRD4又はBRDT)の、例えば、アセチル化リジン残基への結合を阻害することが可能である化合物を指す。多数のBET阻害剤は、例えば、WO2009/084693、WO2011/054841、WO2011/054843、WO2011/054844、WO2011/054845、WO2011/054553、WO2011/054846、WO2011/054848、WO2011/054851、WO2011/143669、WO2011/161031、WO2012/075456、WO2012/075383、WO2012/143413、WO2012/143416、WO2012/150234、WO2012/151512、WO2012/174487、WO2013/024104、WO2013/027168、WO2013/033268、WO2013/030150、WO2013/097052、WO2013/097601、WO2013/156869、WO2013/186612、WO2013/158952、WO2013/184878、WO2013/184876、WO2013/185284、WO2013/188381、WO2014/026997、WO2014/028547、WO2014/048945、WO2014/076237、WO2014/078257、WO2014/080290、WO2014/080291、WO2014/095774、WO2014/095775、WO2014/096965、WO2014/128067、WO2014/128070、WO2014/128111、WO2014/128655、WO2014/134232、WO2014/134267、US2014256706、WO2014/139324、WO2014/140076、WO2014/140077、WO2014/145051、WO2014/143768、WO2014/152029、WO2014/159837、WO2014/159392、WO2014/160873、WO2014/164596、WO2014/170350、WO2014/173241、WO2014/18929、WO2014/191894、WO2014/191896、WO2014/191906、WO2014/191911、WO2014/202578、WO2014/206345、WO2015/002754、WO2015/004533、WO2015/004534、WO2015/004075、WO2015/011084、WO2015/015318、WO2015022332、及びWO2015031824に開示されているもの等、当技術分野で開示されており、一般的な及び特異的なBET阻害剤の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、語句「非コンジュゲート型(unconjugated)BET阻害剤」とは、リンカー分子によって直接又は間接的にαアミノ酸エステルに結合される前のBET阻害剤分子を指す。

本明細書で使用される場合、語句「αアミノ酸」とは、一般式NH₂-CH(R)-COOH[式中、Rは、天然αアミノ酸又は非天然αアミノ酸の側鎖を表す]のアミノ酸を指す。

本明細書で使用される場合、語句「天然αアミノ酸」とは、アミノ酸アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシスチン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンの各形態(可能な場合、すなわち、L-及びD-)を意味する。

本明細書で使用される場合、語句「非天然αアミノ酸」とは、式NH₂-CH(R)-COOH[式中、「R」置換基は、天然αアミノ酸中に存在するものでない]のαアミノ酸を指す。

本明細書で使用される場合、用語「アルキル」とは、指定された数の炭素原子を有する、直鎖又は分枝状の飽和炭化水素鎖を指す。例えば、C_1〜6アルキルは、1から6個の炭素原子を有するアルキル基を指す。別段の記載がない限り、アルキル基は、非置換である。用語「アルキル」には、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル(n-プロピル及びイソプロピル)、ブチル(n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル及びtert-ブチル)、ペンチル、及びヘキシルが含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「アルコキシ」とは、-O-アルキル基を指し、「アルキル」は、上記で定義した通りである。

本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキル」とは、3個(シクロプロピル)、4個(シクロブチル)、5個(シクロペンチル)、6個(シクロヘキシル)又は7個(シクロヘプチル)の炭素原子を有する、飽和の単環式炭化水素環を指す。

本明細書で使用される場合、用語「ヘテロシクロアルキル」とは、飽和又は不飽和の3から7員単環式環を指し、これは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される1若しくは2個の非炭素原子を必ず含有する。ヘテロシクロアルキル基は、1個以上のC(O)、S(O)又はSO₂基を含有していてもよい。しかしながら、ヘテロシクロアルキル基は、芳香族ではない。1個を超えるヘテロ原子を含有するヘテロシクロアルキル基は、異なるヘテロ原子を含有していてもよい。「5又は6員のヘテロシクロアルキル」とは、飽和若しくは不飽和の5又は6員単環式環を指し、これは、窒素、酸素、及び硫黄から選択される、1若しくは2個の非炭素原子を含まなければならない。ヘテロシクロアルキルには、限定はされないが、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、オキセタン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロ-2H-ピラン、モルホリン、モルホリン-3-オン、ピペリジン-2-オン、ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン、チオモルホリン、及びチオモルホリン1,1-ジオキシドが含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、動物又はヒトの身体を指す。

本明細書で使用される場合、用語「治療」とは、状態の予防、特定の状態を寛解させる又は安定させること、状態の症状を軽減する又は除去すること、状態の進行を遅くする又は除去すること、及び以前に罹患した患者又は対象において状態の再発を予防する又は遅延させることを指す。

本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」とは、動物又はヒトの身体において所望の生物学的応答を誘発する共有結合コンジュゲートの量を指す。

本発明の説明
第1の態様では、本発明は、BET阻害剤及びαアミノ酸エステルの共有結合コンジュゲートであって、αアミノ酸エステルのエステル基は、1種以上の細胞内カルボキシエステラーゼにより対応するカルボン酸に加水分解可能である、共有結合コンジュゲートを提供する。

本発明は、αアミノ酸エステルとの共有結合性のコンジュゲーション(conjugation)によって、そのような阻害剤の修飾によるBET阻害剤の効力又は作用持続時間を改善する一般的な方法を提供する。

本発明の共有結合コンジュゲートは、細胞膜を通って、容易に浸入し、これは、ブロモドメインのBETファミリーが、細胞内タンパク質である場合必須である。細胞内ですぐに、共有結合コンジュゲートのαアミノ酸エステルモチーフは、カルボキシエステラーゼ酵素により加水分解されて、対応するカルボン酸(カルボン酸コンジュゲート)をもたらす。得られたカルボン酸コンジュゲートは荷電しており、その結果として細胞外に浸透する能力が低減する。したがって、これは、カルボン酸コンジュゲートの細胞の濃度、滞留時間、効力又は作用持続時間を増加させ得る。図1中の概要図は、本方法の単純な図を示している。αアミノ酸エステルを含む本発明の化合物が、細胞内エステラーゼにより、これらの対応するカルボン酸に変換されても、エステル及びこれらの対応する酸はいずれも、タンパク質を含有するブロモドメインのBETファミリーの阻害剤として機能する。

BET阻害剤のその標的BETタンパク質との細胞内結合活性が著しく低減されないように、αアミノ酸エステルは、BET阻害剤に共有結合される。一般に、結合は、標的との相互作用がほとんどない又は全くないことが公知である分子上の位置、すなわち、X線結晶学等の当技術分野で公知の技法により決定することができる結合モードの1つの一部とみなされない分子上の位置となるべきである。更に、αアミノ酸エステルは、そのアミノ基又はα炭素基を介してBET阻害剤に直接結合してもよく、リンカー、例えば、-(CH₂)_n-又は-(CH₂)_n-O-[式中、nは1から6である]等の使用によって結合してもよい。

一実施形態では、本発明は、in vitro結合アッセイにおける共有結合コンジュゲートの効力が、同じアッセイにおける非コンジュゲート型BET阻害剤の効力の50%以上になるように、αアミノ酸エステルがBET阻害剤に結合されている、共有結合コンジュゲートを提供する。適当なin vitro結合アッセイは、以下の本明細書で提供される、TR-FRETアッセイである。

更なる実施形態では、本発明は、in vitro結合アッセイにおける共有結合コンジュゲートの効力が、同じアッセイにおける非コンジュゲート型BET阻害剤の効力の90%以上になるように、αアミノ酸エステルがBET阻害剤に結合されている、共有結合コンジュゲートを提供する。適当なin vitro結合アッセイは、以下の本明細書で提供される、TR-FRETアッセイである。

更なる実施形態では、本発明は、in vitro結合アッセイにおける共有結合コンジュゲートの効力が、同じアッセイにおける非コンジュゲート型BET阻害剤の効力以上になるように、αアミノ酸エステルがBET阻害剤に結合されている、共有結合コンジュゲートを提供する。適当なin vitro結合アッセイは、以下の本明細書で提供される、TR-FRETアッセイである。

αアミノ酸エステルは、αアミノ酸エステルのアミノ基を介してBET阻害剤に共有結合することができる。或いは、α炭素を介して共有結合することができる。上記の通り、この結合を容易にするために、リンカー基は、αアミノ酸エステル及びBET阻害剤の間に存在することができる。一実施形態では、リンカーは、「Q」基によって示される。

一実施形態では、αアミノ酸エステルは、アミノ酸エステルのアミノ基を介してBET阻害剤に結合されており、式(I):

[式中、
Qは、-(CH₂)_a(O)_b-を表し;
R₁は、天然又は非天然αアミノ酸の側鎖を表し、R₂は、1種以上の細胞内カルボキシエステラーゼ酵素により対応するカルボン酸に加水分解可能であるエステル基を表し;
aは、0、1、2又は3を表し;
bは、0又は1を表し、ただし、bが1である場合、aは、2又は3である]
を有する。

更なる実施形態では、αアミノ酸エステルは、アミノ酸エステルのアミノ基を介してBET阻害剤に結合されており、式(I):

[式中、
Qは、-(CH₂)_a(O)_b-を表し;
R₁は、水素、C_1〜6アルキル、-(CH₂)_cシクロアルキル、-(CH₂)_cヘテロシクロアルキル、又は-CR₄R₅R₆を表し、更に、R₄は、水素、ヒドロキシル、-CH₂OH、CH₂C_1〜3アルキル、ハロ、-COOH、-CONH₂、1H-イミダゾール-4-イル、-SH、-SeH、C_1〜3アルキル、C_1〜3アルコキシ、フェニル、又は4-ヒドロキシフェニルであり、前記C_1〜3アルキル又はC_1〜3アルコキシは、ハロ、ヒドロキシル、-NHC(=NH₂)NH₂、-NH₂、-COOH、-CONH₂、又は-SCH₃で場合によって置換されていてもよく、R₅及びR₆は、それぞれ独立に、水素又はC_1〜3アルキルであり;
R₂は、1種以上の細胞内カルボキシエステラーゼ酵素により対応するカルボン酸に加水分解可能であるエステル基を表し;
aは、0、1、2又は3を表し;
bは、0又は1を表し、ただし、bが1である場合、aは、2又は3であり;
cは、0、1又は2である]
を有する。

更なる実施形態では、αアミノ酸エステルは、アミノ酸エステルのα炭素を介してBET阻害剤に結合されており、式(II):

[式中、
Qは、-(CH₂)_a(O)_b-を表し;
R₂は、1種以上の細胞内カルボキシエステラーゼ酵素により対応するカルボン酸に加水分解可能であるエステル基を表し;
R₃は、水素、C_1〜6アルキル又はシクロアルキルを表し;
aは、0、1、2又は3を表し;
bは、0又は1を表し、ただし、bが1である場合、aは、2又は3である]
を有する。

更なる実施形態では、上記の式(I)の化合物又は式(II)の化合物中のR₂は、-C(O)OCHR₇R₈[式中、R₇は、C_1〜3アルキル又は水素であり、R₈は、C_1〜6アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルであり、更に、C_1〜6アルキルは、C_1〜3アルコキシで場合によっては置換されていてもよい]を表す。

更なる実施形態では、上記の式(I)の化合物又は式(II)の化合物中のR₂は、-C(O)OR₉[式中、R₉は、イソプロピル、イソブチル又はシクロペンチルを表す]を表す。

本発明の更なる実施形態では、αアミノ酸エステルのα炭素は、S立体配置であり、したがって、式(I)又は式(II)の場合、

として表示することができる。

一実施形態では、αアミノ酸エステルに結合されない場合、in vitro結合アッセイにおいて、BET阻害剤は、BETタンパク質(BRD2、BRD3、BRD4又はBRDT)のいずれか1つに対して7.0を超えるpIC50を有する。in vitro結合アッセイにおける一例は、以下の本明細書で提供されるTR-FRETアッセイである。

3つの公知の細胞内ヒトカルボキシエステラーゼ(hCE-1、hCE-2及びhCE-3)がある。カルボキシエステラーゼhCE-2及びhCE-3は、遍在的な発現パターンを有し、hCE-1は、肝臓、肺及び骨髄において高度に発現し、重要なことに、単球、マクロファージ及び樹状細胞中で見出される。一実施形態では、本発明の共有結合コンジュゲートは、hCE-1、hCE-2及びhCE-3のそれぞれによって加水分解することができる。他の実施形態では、本発明の共有結合コンジュゲートは、hCE-1によってのみ加水分解され、hCE-2又はhCE-3によって加水分解されず、したがって、hCE-1を発現する細胞、例えば、マクロファージ、単球及び/又は樹状細胞等を選択的に標的にする。αアミノ酸エステルのアミノ基の窒素が、a)カルボニル基に直接連結されない、又はb)非置換でない場合、hCE-1による選択的な加水分解(したがって、hCE-1を発現する細胞への選択的な標的化)が達成される。

更なる実施形態では、本発明は、BET阻害剤及びαアミノ酸エステルの共有結合コンジュゲートであって、αアミノ酸エステルは、hCE-1を含有する細胞により加水分解可能であり、カルボキシエステラーゼhCE-2及び/又はhCE-3を含有するがhCE-1を含有しない細胞によっては加水分解可能ではない共有結合コンジュゲートを提供する。

選択的に標的化する特異的な細胞型、例えば、hCE-1を発現するマクロファージ及び単球は、BET阻害剤の全身曝露を減少させ、安全性及び忍容性を改善させる可能性を有する。更に、細胞内の(カルボン酸コンジュゲートの形態の)BET阻害剤の保持が、効力又は作用持続時間を改善させる場合、これによって、低用量の投与を可能にすることも投与頻度を減らすこともでき、更に全身曝露を減少させ、BET阻害剤の治療指数を増加させることも可能となり得る。

抱合のためのある特定のαアミノ酸エステルの選択はまた、その加水分解速度に基づくことができる。αアミノ酸エステルは、選択されたエステル基に応じて異なる加水分解速度を有し、N-結合αアミノ酸エステルの場合では、α炭素置換基が選択される。更に、所望の加水分解速度は、共有結合コンジュゲートのために選ばれた投与の方法に応じて異なる可能性がある。任意の特定のαアミノ酸エステル、又はαアミノ酸エステルを含む本発明の共有結合コンジュゲートの加水分解速度は、以下の生物学データセクションにおいて概説した「hCE-1による加水分解」アッセイを用いて決定することができる。更に、同等のアッセイは、異なるヒトカルボキシエステラーゼ酵素(すなわち、hCE-2又はhCE-3)による、任意の所与のαアミノ酸エステル、又はそのようなαアミノ酸エステルを含む共有結合コンジュゲートの加水分解を評価するために、当業者により慣例的に調整することができる。

本発明者らは、経口投与される化合物の場合、加水分解速度がより遅いエステル基、例えば、0.05から5.0の間、又は0.05から1.0の間、又は0.05から0.5の間、又は0.1から0.5の間、又は0.2から0.4 μM/分/μM(共有結合コンジュゲートのμM/分/hCE-1のμM)のものが望ましいことを見出している。対象の細胞(例えば、標的疾患又は状態に応じた単球、マクロファージ及び樹状細胞)中に存在するのと同様に、hCE-1は、肝細胞中にも存在し、したがって、十分な量の化合物を確実に血液循環に入らせるためには、より遅い加水分解速度を有するエステルが望ましい。特に、本発明者らは、加水分解速度が0.2から0.5μM/分/μMの間であるαアミノ酸エステルを有する共有結合コンジュゲートが、初回通過代謝と、細胞内でのαアミノ酸エステルの加水分解に由来する特性の向上(効力、作用持続時間、全身曝露の減少、及び/又は治療指数の増加)とを釣り合わせる、望ましい治療プロファイルを有することを見出している。

本発明の一実施形態では、αアミノ酸エステルが、式(I):

[式中、
R₁は、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル又は-CR₄R₅R₆(式中、R₄は、水素、ヒドロキシル、-CH₂OH、-CH₂C_1〜3アルキル、ハロ、C_1〜3アルキル、C_1〜3アルコキシであり、前記C_1〜3アルキル又はC_1〜3アルコキシは、ハロ又はヒドロキシルで場合によっては置換されていてもよく、R₅及びR₆は、独立に、水素又はC_1〜3アルキルであり、ただし、R₄、R₅及びR₆の少なくとも2つは、水素でない)を表し;更に、R₂は、-C(O)OCHR₇R₈(式中、R₇は、C_1〜3アルキルであり、R₈は、C_1〜6アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルであり、更に、C_1〜6アルキルは、C_1〜3アルコキシで場合によっては置換されていてもよく、又はR₇及びR₈は一緒になって、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキル基を形成している)を表す]
である場合、経口投与される化合物についての所望の加水分解速度を、得ることができる。

本発明の更なる実施形態では、αアミノ酸エステルが、式(I):

[式中、
R₁は、イソプロピル、sec-ブチル、又は-CH(CH₃)OHを表し、R₂は、-C(O)OR₉(式中、R₉は、イソプロピル、sec-ブチル、sec-ペンチル、3-ペンチル、又はシクロアルキルである)を表す]
である場合、経口投与される化合物についての所望の加水分解速度を得ることができる。

[式中、
R₁は、イソプロピル、sec-ブチル、又は-CH(CH₃)OHを表し、R₂は、-C(O)OR₉(式中、R₉は、イソプロピル又はシクロペンチルである)を表す]
である場合、経口投与される化合物についての所望の加水分解速度を得ることができる。

本発明の他の態様では、hCE-1を含有する細胞にBET阻害剤を選択的に標的化するための方法であって、この方法は、hCE-1により加水分解可能であるαアミノ酸エステルに、前記BET阻害剤を共有結合するステップを含む、方法を提供する。

本発明の他の態様では、BET阻害剤の細胞内の効力を高めるための方法が提供され、この方法は、1種以上のカルボキシエステラーゼ酵素により加水分解可能であるαアミノ酸エステルに、前記BET阻害剤を共有結合するステップを含む。

本発明の更なる態様では、BET阻害剤の全身曝露を減少させるための方法であって、この方法は、1種以上の細胞内カルボキシエステラーゼ酵素により加水分解可能であるαアミノ酸エステルに、前記BET阻害剤を共有結合するステップを含む、方法を提供する。

使用の記載
αアミノ酸エステルのBET阻害剤への共有結合は、全身曝露を減少させること、効力を改善すること及び/又は作用持続時間を改善することにより、BET阻害剤の治療プロファイルを改善させる可能性を有する。

更に、hCE-1を発現する細胞、例えば、単球、マクロファージ及び/又は樹状細胞への共有結合コンジュゲートの選択的な標的化は、自己免疫疾患又は炎症性疾患若しくはそれらの状態の治療において治療上の効用を有し得る。

BET阻害剤は、広範囲の急性若しくは慢性の自己免疫性又は炎症性の状態の治療、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、急性痛風、乾癬、全身性エリテマトーデス、肺動脈性肺高血圧症(PAH)、多発性硬化症、炎症性腸疾患(クローン病及び潰瘍性大腸炎)、喘息、慢性閉塞性気道疾患、間質性肺炎、心筋炎、心膜炎、筋炎、湿疹、(アトピー性皮膚炎を含めた)皮膚炎、脱毛症、白斑、水疱性皮膚症、腎炎、血管炎、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、うつ病、シェーグレン症候群、唾液腺炎、網膜中心静脈閉塞症、分枝状網膜静脈閉塞症、アーヴァイン-ガス症候群(白内障後及び術後)、網膜色素変性症、周辺部ぶどう膜炎、バードショット脈絡網膜症(birdshot retinochoroidopathy)、網膜上膜、嚢胞性黄斑浮腫、傍中心窩毛細血管拡張症(parafoveal telengiectasis)、牽引性黄斑症、硝子体黄斑牽引症候群、網膜剥離、視神経網膜炎、特発性黄斑浮腫、網膜炎、ドライアイ(乾性角結膜炎)、春期角結膜炎、萎縮性角結膜炎、ぶどう膜炎(例えば、前部ぶどう膜炎、汎ぶどう膜炎、後部ぶどう膜炎、ぶどう膜炎関連黄斑浮腫等)、強膜炎、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、加齢黄斑ジストロフィー、肝炎、膵炎、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、アジソン病、下垂体炎、甲状腺炎、I型糖尿病、巨細胞性動脈炎、ループス腎炎を含めた腎炎、臓器の関与を伴う血管炎、例えば、糸球体腎炎、巨細胞性動脈炎を含めた血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、川崎病、高安動脈炎、壊疽性膿皮症、臓器の関与を伴う血管炎及び移植臓器の急性拒絶の治療に有用となり得る。関節リウマチの治療のためのBET阻害剤の使用を、特に対象とする。

一実施形態では、急性若しくは慢性の自己免疫性又は炎症性の状態は、APO-A1の調節による脂質代謝の障害、例えば、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症及びアルツハイマー病である。

他の実施形態では、急性若しくは慢性の自己免疫性又は炎症性の状態は、呼吸障害、例えば、喘息又は慢性閉塞性気道疾患である。

他の実施形態では、急性若しくは慢性の自己免疫性又は炎症性の状態は、全身性炎症性障害、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、急性痛風、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症又は炎症性腸疾患(クローン病及び潰瘍性大腸炎)である。

他の実施形態では、急性若しくは慢性の自己免疫性又は炎症性の状態は、多発性硬化症である。

更なる実施形態では、急性若しくは慢性の自己免疫性又は炎症性の状態は、I型糖尿病である。

BET阻害剤は、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物若しくはこれらの毒素による感染への炎症応答を伴う疾患又は状態の治療、例えば、敗血症、急性敗血症、敗血症症候群、敗血性ショック、内毒血症、全身性炎症反応症候群(SIRS)、多臓器機能障害症候群、毒素ショック症候群、急性肺損傷、ARDS(成人呼吸促迫症候群)、急性腎不全、劇症肝炎、熱傷、急性膵炎、術後症候群、サルコイドーシス、ヘルクスハイマー反応、脳炎、脊髄炎、髄膜炎、マラリア及びウイルス感染症、例えば、インフルエンザ、帯状疱疹、単純ヘルペス及びコロナウイルスを伴うSIRSの治療に有用となり得る。一実施形態では、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物若しくはこれらの毒素による感染への炎症応答を伴う疾患又は状態は、急性敗血症である。

BET阻害剤は、虚血再灌流障害を伴う状態、例えば、心筋梗塞、脳血管虚血(脳卒中)、急性冠症候群、腎臓再灌流障害、臓器移植、冠動脈バイパス移植術、心肺バイパス法、肺、腎臓、肝臓、胃腸管系又は四肢末梢(peripheral limb)の塞栓症の治療に有用となり得る。

BET阻害剤は、線維性状態、例えば、特発性肺線維症、腎線維症、術後狭窄、ケロイド瘢痕形成、(モルフェアを含めた)強皮症、心線維症及び嚢胞性線維症等の治療に有用となり得る。

BET阻害剤は、ウイルス感染症、例えば、単純ヘルペス感染症及び再活性化、口唇ヘルペス、帯状疱疹感染症及び再活性化、水痘、帯状疱疹(shingles)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、頸部新形成、急性呼吸器疾患を含めたアデノウイルス感染症、ポックスウイルス感染症、例えば、牛痘及び天然痘及びアフリカブタコレラウイルス等の治療に有用となり得る。一実施形態では、ウイルス感染症は、皮膚又は頸部上皮のHPV感染症である。他の実施形態では、ウイルス感染症は、HIV潜伏感染である。

BET阻害剤は、血液学的(例えば、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫等)、肺がん、乳がん及び結腸がんを含めた上皮、正中線がん(midline carcinoma)、間葉性腫瘍、肝腫瘍、腎腫瘍及び神経腫瘍を含めた、癌の治療に有用となり得る。

BET阻害剤は、脳癌(神経膠腫)、グリア芽腫、バナヤン-ゾナナ症候群(Bannayan-Zonana syndrome)、カウデン病、レルミット-デュクロ病、乳癌、炎症性乳癌、結腸直腸癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、脳室上衣腫、髄芽腫、結腸癌、頭頸部癌、腎癌、肺癌、肝臓癌、黒色腫、有棘細胞がん、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、肉腫癌、骨肉腫、骨巨細胞腫、甲状腺癌、リンパ芽球性T細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性T細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞型白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫、巨核芽球性白血病、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、混合系統白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性T細胞白血病、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽細胞腫、膀胱癌、尿路上皮癌、外陰癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、腎癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、上咽頭癌、頬癌、口の癌、GIST(消化管間質腫瘍)、NUT-正中線がん及び精巣癌から選択される、1種以上の癌の治療に有用となり得る。

一実施形態では、癌は、白血病、例えば、急性単球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病及び混合系統白血病(MLL)から選択される白血病である。他の実施形態では、癌は、NUT-正中線がんである。他の実施形態では、癌は、多発性骨髄腫である。他の実施形態では、癌は、肺癌、例えば、小細胞肺癌(SCLC)等である。他の実施形態では、癌は、神経芽細胞腫である。他の実施形態では、癌は、バーキットリンパ腫である。他の実施形態では、癌は、子宮頚癌である。他の実施形態では、癌は、食道癌である。他の実施形態では、癌は、卵巣癌である。他の実施形態では、癌は、乳癌である。他の実施形態では、癌は、結腸直腸癌である。

一実施形態では、BET阻害剤が指示される疾患又は状態は、全身性炎症反応症候群を伴う疾患、例えば、敗血症、熱傷、膵炎、重度外傷(major trauma)、出血及び虚血から選択される。本実施形態では、BET阻害剤は、診断の時点で、SIRSの発生率、ショックの発生、急性肺損傷、ARDS、急性腎臓、肝臓、心臓又は胃腸管系の損傷の発生を含む多臓器機能障害症候群、及び死亡率を減少させるために投与されるはずである。他の実施形態では、BET阻害剤は、高リスクの敗血症、出血、広範な組織損傷、SIRS又はMODS(多臓器不全症候群)に伴う外科的な若しくは他の手順の前に投与されるはずである。詳細な実施形態では、BET阻害剤が指示される疾患又は状態は、敗血症、敗血症症候群、敗血性ショック及び内毒血症である。他の実施形態では、BET阻害剤は、急性若しくは慢性膵炎の治療のために指示される。他の実施形態では、BET阻害剤は、熱傷の治療のために指示される。

更なる態様では、療法に用いるための本発明の共有結合コンジュゲートも提供される。

更なる態様では、上記で列挙した徴候のそれぞれ及び全てを含めた、ブロモドメイン阻害剤、特に、BET阻害剤が適当となる疾患又は状態の治療において用いるための本発明の共有結合コンジュゲートも提供される。

更なる態様では、自己免疫疾患及び炎症性疾患、及び癌の治療において用いるための本発明の共有結合コンジュゲートも提供される。

更なる態様では、関節リウマチの治療に用いるための本発明の共有結合コンジュゲートも提供される。

更なる態様では、本発明の共有結合コンジュゲートの治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患又は癌の治療の方法も提供される。

更なる態様では、本発明は、本発明の共有結合コンジュゲートの治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、関節リウマチを治療する方法を対象とする。

更なる態様では、自己免疫疾患又は炎症性疾患、又は癌の治療に用いるための医薬品の製造における本発明の共有結合コンジュゲートの使用が提供される。

更なる態様では、関節リウマチの治療に用いるための医薬品の製造における本発明の共有結合コンジュゲートの使用が提供される。

医薬組成物/投与経路/投与量
療法に用いる場合、本発明の共有結合コンジュゲートが、そのままの化学物質として投与され得るということが可能であるが、有効成分を医薬組成物として存在させることが一般的である。

更なる態様では、本発明の共有結合コンジュゲート及び1種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。

医薬組成物は、任意の適切な経路により、例えば、(頬又は舌下を含めた)経口、直腸、吸入、鼻腔内、(頬、舌下又は経皮を含めた)局所、(局所、眼内、結膜下、強膜上、テノン嚢下を含めた)眼、経膣又は(皮下、筋肉内、静脈内若しくは皮内を含めた)非経口経路により、投与に適合され得る。そのような組成物は、薬学の分野で公知の任意の方法により、例えば、賦形剤と有効成分を会合させることにより調製することができる。

一態様では、本医薬組成物は、経口投与に適合される。

本発明の共有結合コンジュゲートの治療有効量は、例えば、対象の年齢及び体重、治療を要する正確な状態及びその重症度、配合物の性質、並びに投与経路を含めた、多くの因子に依存し、最終的に、担当医又は獣医師の判断である。医薬組成物中で、経口投与のための各投与単位は、好ましくは、遊離塩基として算出された共有結合コンジュゲート0.01から1000mg、より好ましくは0.5から100mgを含有する。

以下の例の共有結合コンジュゲート(官能基化されていないBET阻害剤である実施例10を除く)は、限定はされないが、本発明を例示するために挙げられている。

上記実施例1から10は、以下の一般的な反応スキームにしたがって調製することができる。

実施例1から10の調製のための方法が提供され、本方法は、式(III):

[式中、R₁及びR₂は、上記の表中の実施例1から10のいずれかにおいて上記にみられる通りである]
の化合物の環化を含む。例えば、式(III)の化合物を溶媒混合物、例えば、エタノール/水に溶解し、次いで、亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で、式(VI)(式中、R_aは、水素又はメチルである)のアルデヒドで処理し、適当な温度で適切な時間加熱して、精製後、実施例1から10を得ることができた。

式(III)の化合物の調製のための方法が提供され、本方法は、式(V):

[式中、R₂は、上記の表中、実施例1から8のいずれかに示される通りである]
の化合物の求核官能基化を含む。例えば、式(V)の化合物を溶媒、例えば、テトラヒドロフラン等に溶解し、次いで、適当な塩基、例えば、トリエチルアミン等の存在下で、上記の表中の実施例1から10のいずれかに示される通り、R₁を含有する適当なアミンで処理することができ得る。次いで、混合物を適当な温度で適切な時間加熱して、精製後、式(III)の化合物が得られる。

式(V)の化合物の調製のための方法が提供され、本方法は、式(VI):

の化合物の還元的アミノ化を含む。

式(VI)の化合物を、適当な溶媒、例えば、ジクロロメタン(dicloromethane)等に溶解し、そこに、適切に官能基化されたアミン及び添加物、例えば、酢酸等を加える。混合物を、特定の時間、適切な温度で撹拌した後、還元剤、例えば、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド等を加える。混合物を、適切な時間撹拌して、精製後、式(V)の化合物(式中、R₂は、上記の表中の実施例1から10のいずれかに示される通りである)が得られる。

以下の例(実施例11)で、αアミノ酸エステルとBET阻害剤の間の追加の共有結合コンジュゲートの調製を詳述し、このBET阻害剤は、実施例1から10のものと異なる化学種である。

[実施例11]
(S)-シクロペンチル2-((4-((2S,4R)-1-アセチル-4-((5-シアノピリジン-2-イル)アミノ)-2-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-6-イル)ベンジル)アミノ)-4-メチルペンタノアート

丸底フラスコに、6-(((2S,4R)-1-アセチル-6-ブロモ-2-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-4-イル)アミノ)ニコチノニトリル(調製について、中間体3を参照のこと。220mg、0.571mmol)、(S)-(4-(((1-(シクロペンチルオキシ)-4-メチル-1-オキソペンタン-2-イル)アミノ)メチル)フェニル)ボロン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸塩、(調製について、中間体1を参照のこと。318mg、0.629mmol)、炭酸カリウム(395mg、2.86mmol)、トルエン(5mL)及びエタノール(5.00mL)を充てんした。撹拌した混合物に、パラジウムテトラキス(33.0mg、0.029mmol)を加え、この系を窒素で脱気した。この容器を、窒素のブランケット下で3時間加熱還流した。混合物を室温まで冷却し、終夜放置した。揮発分を真空中で除去して、橙色の固形物を得た。この固形物を、EtOAc/水1:1の混合物に溶解した。これらの層を混合し、分離して、有機物を、食塩水で洗浄し、疎水性フリットに通し、真空中で濃縮して、橙色の油を得た。サンプルを、ジクロロメタンに添加し、20CVに対して酢酸エチル-シクロヘキサン0〜60%の勾配を用いて、Biotage SP4 SNAP 25gシリカ(Si)により精製した。適切な画分を合わせ、真空中で蒸発させた後、窒素気流下で乾燥させ、オフホワイト色の固形物として、必要とされる生成物(S)-シクロペンチル2-((4-((2S,4R)-1-アセチル-4-((5-シアノピリジン-2-イル)アミノ)-2-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-6-イル)ベンジル)アミノ)-4-メチルペンタノアート(266mg、0.448mmol、収率78%)を得た。A系、0.94分でMH+=594。

中間体1:(S)-(4-(((1-(シクロペンチルオキシ)-4-メチル-1-オキソペンタン-2-イル)アミノ)メチル)フェニル)ボロン酸、4-メチルベンゼンスルホン酸塩
丸底フラスコに、(4-ホルミルフェニル)ボロン酸(Aldrich社、300mg、2.001mmol)、ジクロロメタン(DCM)(10mL)及び(S)-シクロペンチル2-アミノ-4-メチルペンタノアート4-メチルベンゼンスルホナート(調製について、中間体2を参照のこと、751mg、2.021mmol)を充てんした。窒素のブランケット下の撹拌された混合物に、20分間にわたって少量ずつナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(1.27g、5.99mmol)を加えた。混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物をDCMで希釈し、1M HClに注いだ。これらの層を混合し、分離した後、固体のNaHCO₃を加えることにより、この水溶液を慎重に中和した(pH7)。水溶液を、DCMで抽出し(×2)、有機物を合わせ、疎水性フリットに通し、真空中で濃縮して、白色フォームとして未精製の表題化合物を得た。この純度でその後の反応に用いた。A系、0.74分でMH+=334。

中間体2:(S)-シクロペンチル2-アミノ-4-メチルペンタノアート4-メチルベンゼンスルホナート
丸底フラスコに、(S)-2-アミノ-4-メチルペンタン酸(5g、38.1mmol)、シクロヘキサン(100 mL)、トシル酸一水和物(9.43g、49.6mmol)及びシクロペンタノール(35mL、386mmol)を充てんした。ディーン-スタークコンデンサーを取り付け、混合物を、130℃まで加温して、完全な溶解を行った。混合物を、週末にわたってこの温度で撹拌した後、室温で7日間放置した。沈殿させた固形物を、ろ過により単離し、シクロヘキサン及び酢酸エチルで順次洗浄した。固形物を、真空中で乾燥して、白色固形物として表題化合物を得た。¹H NMR(400MHz、メタノール-d₄)δ7.62〜7.79(m、2H)、7.25(d、J=7.83 Hz、2H)、5.15〜5.42(m、1H)、3.97(t、J=6.97 Hz、1H)、2.39(s、3H)、1.42〜2.10(m、11H)、1.02(d、J=7.09 Hz、6H)。

中間体3:6-(((2S,4R)-1-アセチル-6-ブロモ-2-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-4-イル)アミノ)ニコチノニトリル
1-((2S,4R)-4-アミノ-6-ブロモ-2-メチル-3,4-ジヒドロキノリン-1(2H)-イル)エタノン(調製について、中間体4を参照のこと、5.74g、20.27mmol)を、3等分に分け、それぞれをNMP10mlに溶解した。各溶液に、6-クロロニコチノニトリル1.86g及びDIPEA3.5mlを加えた後、反応混合物を、マイクロウェーブバイアル20ml中で200℃で2時間それぞれ加熱した。

反応混合物を、室温まで冷却して合わせて、酢酸エチル(200ml)及び水(100ml)で希釈した。有機層を抽出し、水溶液を、追加量の酢酸エチル(3×50ml)で更に抽出した。合わせた有機層を、乾燥し(MgSO₄)、濃縮して、(NMPを含有する)未精製の褐色の油20.27gを得た。これを、SiO₂(10 CVsに対して10〜100%酢酸エチル/シクロヘキサンで溶出する、RediSep 3300gカートリッジ)のクロマトグラフィーにより精製して、泡沫状の黄色の固形物として6-(((2S,4R)-1-アセチル-6-ブロモ-2-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-4-イル)アミノ)ニコチノニトリル(7.47g、16.48mmol、収率81%)を得た。A系、RT=0.98分でのMH+=385/387。

中間体4:1-((2S,4R)-4-アミノ-6-ブロモ-2-メチル-3,4-ジヒドロキノリン-1(2H)-イル)エタノン
イソプロピル((2S,4R)-1-アセチル-6-ブロモ-2-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-4-イル)カルバマート(調製について、WO2012/143415A1を参照のこと、25.0g、67.7mmol)を、塩化アルミニウム(34.3g)のDCM(450ml)冷(氷/水浴)懸濁液に加えた。懸濁液、次いで、溶液を、約0℃で30分間撹拌した後、メタノール(60ml)中のトリエチルアミン(113ml)を加えた。混合物を、DCMで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(約500ml)を加え、混合物を、ロッシェル塩(113g)の水(約2l)溶液で処理した。2相性の懸濁液を、約30分の間隔で、手動で撹拌し、固体の大部分を溶解させた。これらの相を分離し、水溶液を、DCM(×3)で抽出し、合わせた有機相を、水で洗浄し、次いで、食塩水で洗浄した。溶液を、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、真空中で乾燥状態にして減らし、ベージュ色のゴム(約20g)を得た。ゴムを、ジエチルエーテルですりつぶし、固体を、ろ過により単離し、エーテルで洗浄し、真空中で乾燥して、白色固形物(6.11g)を得た。合わせたろ液及び洗液を、減圧下で乾燥状態にして減らし、次いで、真空中で更に乾燥した。残留ゴムを、ジエチルエーテルで再度すりつぶして、白色固形物を得た。固体を、ろ過により単離し、ジエチルエーテルで洗浄して、白色固形物(1.95g)を得た。合わせたろ液及び洗液を、真空中で乾燥状態にして減らし、ゴム状の残留物を、熱シクロヘキサンに溶解した。溶液を、周囲温度まで放冷し、この温度で約2時間にわたって放置した。形成された固体を、ろ過により単離し、シクロヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥して、白色固形物N18680-88-4(5.89g)を得た。バッチを合わせて、白色固形物(13.95g、収率72.8%)として表題化合物を得た。A系、RT=0.49分で(MH⁺-NH₃)=267。

器具の詳細
NMR
¹H NMRスペクトルを、Bruker DPX 400又はBruker Avance DRX、Varian Unity 400分光計又はJEOL DeltaにおいてCDCl₃、DMSO-d₆又はMeOD-d₄で記録し、全て、400MHzで操作した。用いた内部標準は、テトラメチルシラン又は残留するプロトン化された溶媒であり、CDCl₃の場合7.25ppm、又はDMSO-d₆の場合2.50ppm、又はMeOD-d₄の場合3.31であった。
LCMS
A系
カラム:50mm×2.1mm ID、1.7μm Acquity UPLC BEH C₁₈
流量:1mL/分
温度:40℃
UV検出範囲:210から350nm
質量スペクトル:代替スキャン正負モードエレクトロスプレーイオン化を用いた質量分析計で記録。
溶媒:A:水中の0.1%v/vギ酸
B:0.1%v/vギ酸アセトニトリル
勾配:時間(分) A% B%
0 97 3
1.5 0 100
1.9 0 100
2.0 97 3
B系
カラム:50mm×2.1mm ID、1.7μm Acquity UPLC BEH C₁₈
流量:1mL/分
温度:40℃
UV検出範囲:210から350nm
質量スペクトル:代替スキャン正負モードエレクトロスプレーイオン化を用いた質量分析計で記録。
溶媒:A:アンモニア溶液でpH10に調整した水中の10mM炭酸水素アンモニウム
B:アセトニトリル
勾配:時間(分) A% B%
0 99 1
1.5 3 97
1.9 3 97
2.0 0 100
C系
カラム:50mm×2.1mm ID、1.7μm Acquity UPLC CSH C₁₈
流量:1mL/分
温度:40℃
UV検出範囲:210から350nm
質量スペクトル:代替スキャン正負モードエレクトロスプレーイオン化を用いた質量分析計で記録
使用した溶媒は、
A=トリフルオロ酢酸の水0.1%v/v溶液。
B=トリフルオロ酢酸のアセトニトリル0.1%v/v溶液であった。
勾配:時間(分) A% B%
0 95 5
1.5 5 95
1.9 5 95
2.0 95 5

生物学データ
時間分解型蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)アッセイ
結合を、時間分解型蛍光共鳴エネルギー移動結合アッセイを用いて評価した。これは、ユーロピウムキレート(PerkinElmer AD0111)で標識された抗-6His抗体についてのエピトープとしてのタンパク質のN-末端での6His精製タグを利用し、ドナーフルオロフォアとして働くタンパク質にユーロピウムを結合させる。ブロモドメインBRD4の小分子、高親和性結合剤は、Alexa Fluor647(参照化合物X)で標識されており、これは、FRET対においてアクセプターとして働く。

参照化合物X:4-((Z)-3-(6-((5-(2-((4S)-6-(4-クロロフェニル)-8-メトキシ-1-メチル-4H-ベンゾ[f][1,2,4]トリアゾロ[4,3-a][1,4]ジアゼピン-4-イル)アセトアミド)ペンチル)アミノ)-6-オキソヘキシル)-2-((2E,4E)-5-(3,3-ジメチル-5-スルホ-1-(4-スルホブチル)-3H-インドル-1-イウム-2-イル)ペンタ-2,4-ジエン-1-イリデン)-3-メチル-5-スルホインドリン-1-イル)ブタン-1-スルホナート)

N-(5-アミノペンチル)-2-((4S)-6-(4-クロロフェニル)-8-メトキシ-1-メチル-4H-ベンゾ[f][1,2,4]トリアゾロ[4,3-a][1,4]ジアゼピン-4-イル)アセトアミド(調製について、参照化合物J、WO2011/054848A1を参照のこと、1.7mg、3.53μmol)のDMF(40μl)溶液に、AlexaFluor647-ONSu(2.16mg、1.966μmol)のやはりDMF(100μl)溶液を加えた。混合物を、DIPEA(1μl、5.73μmol)で塩基性にし、ボルテックスミキサーで終夜振り混ぜた。反応混合物を、蒸発乾固した。固体を、ろ過したアセトニトリル/水/酢酸(5/4/1、<1ml)に溶解し、Phenomenex Jupiter C18分取カラムにアプライし、以下の勾配(A=水中の0.1%トリフルオロ酢酸、B=0.1%TFA/90%アセトニトリル/10%水)で溶離した。流量=10ml/分、AU=20/10(214nm):5〜35%、t=0分:B=5%;t=10分:B=5%;t=100分:B=35%;t=115分:B=100%(Sep. grad:0.33%/分)

主な構成成分を、B26〜28%の範囲で溶離させるが、2つのピークから構成されると思われる。「両方の」構成成分を含有するはずである中間の画分(F1.26)を、分析HPLC(Spherisorb ODS2、60分にわたって1から35%)により分析した。単一の構成成分は、B28%で溶離する。

画分F1.25/26及び27を合わせ、蒸発乾固した。DMFで移動させ、蒸発乾固し、乾燥エーテルですりつぶし、青色の固形物を、<0.2mbarで終夜乾燥した。1.54mg。

分析HPLC(Sphersisorb ODS2、60分にわたってB1から35%):MSM10520-1:M-29と対応する[M+H]⁺(obs):661.8/-。これは、M-29である、算出された質量1320.984の場合[(M+2H)/2]⁺に等しい。これは、Alexa Fluor 647染料を用いた標準的な出現であり、質量分析計の条件下で2つのメチレン基の理論的な喪失を表す。

アッセイの原理:競合する化合物の非存在下で、ユーロピウムを励起すると、λ618nmでドナーが放射され、これによって、λ647nMで測定可能であるエネルギー移動の増加をもたらすAlexaによって標識化されたブロモドメイン結合化合物が励起される。これらのタンパク質に結合することができる化合物の十分な濃度の存在下で、相互作用は妨害され、蛍光共鳴エネルギー移動において定量化可能なドロップをもたらす。

実施例1から11のブロモドメインBRD4への結合を、ブロモドメインにおける結合ドメイン1(BD1)への差次的な結合を検出するために、変異タンパク質を用いて評価した。アセチルリジン結合ポケットにおけるこれらの単一残基の突然変異は、突然変異ドメイン(非突然変異ドメインについて>1000倍選択的)についてのフルオロリガンド(参照化合物X)の親和性を大いに低下させる。したがって、最終のアッセイ条件では、フルオロリガンドの突然変異ドメインへの結合は、検出することができず、続いて、アッセイは、単一の非突然変異ブロモドメインへの化合物の結合を決定するのに適している。

タンパク質産生:組換え型ヒトブロモドメイン[BRD4(Y390A)]は、N-末端に6-Hisタグを伴い、大腸菌(E.coli)細胞(pET15bベクター)中で発現した。His-タグ付けしたブロモドメインペレットを、50mM HEPES(pH7.5)、300mM NaCl、10mMイミダゾール及び1μl/mlプロテアーゼ阻害剤のカクテルに再懸濁し、超音波処理を用いて大腸菌細胞から抽出し、ニッケルセファロース高速カラムを用いて精製し、タンパク質を、洗浄し、次いで、20カラム体積に対して緩衝液50mM HEPES(pH7.5)、150mM NaCl、500mMイミダゾールにより、0〜500mMイミダゾールの直線の勾配で溶離した。最終精製を、Superdex 200プレップグレードのサイズ排除カラムにより終了した。精製したタンパク質を、20mM HEPES(pH 7.5)及び100mM NaCl中で-80℃で貯蔵した。タンパク質の同一性が、ペプチド質量フィンガープリンティングによって確認され、予測される分子量が、質量分析により確認された。

ブロモドメインBRD4、BD1突然変異アッセイについてのプロトコール:全てのアッセイ構成成分を、50mM HEPES(pH7.4)、50mM NaCl、5%グリセロール、1mM DTT及び1mM CHAPSの緩衝液組成物に溶解した。ブロモドメインタンパク質の最終濃度は、10nMであり、Alexa Fluor647リガンドは、Kdであった。これらの構成成分を、予め混合し、この反応混合物5μlを、Greiner 384ウェルの黒色の低体積マイクロタイタープレート中で、様々な濃度の試験化合物又はDMSOビヒクル50nl(0.5% DMSO最終)を含有する全てのウェルに加え、30分間室温で暗所でインキュベートした。最終濃度1.5nM抗6Hisユーロピウムキレートを含有する検出混合物5μlを、全てのウェルに加え、少なくとも30分間、更に暗所でインキュベーションを行った。次いで、プレートを、Envisionプレートリーダーで読み取った(λex=317nm、ドナーλem=615nm;アクセプターλem=665nm;Dichroic LANCE dual)。時間分解型蛍光強度測定を、両方の発光波長で行い、アクセプター/ドナー比を算出し、データ分析のために用いた。全てのデータを、各プレートで16個の高値(対照阻害剤- WO 2011/054846A1の実施例11)及び16個の低値(DMSO)の対照ウェルの平均に正規化した。次いで、以下の形態の4つのパラメーター曲線の当てはめを適用した。
y=a+((b-a)/(1+(10^×/10^c)^d)
「a」が最大値の場合、「b」は、ヒルスロープであり、「c」は、pIC₅₀であり、「d」は最大値である。

結果:実施例1から11の全てを、上記BRD4アッセイで試験したところ、それらは、BRD4 BD1アッセイにおいてpIC₅₀が5.8から7.3の範囲であることが判明した。実施例3及び実施例10は、pIC50が、それぞれ6.1及び6.4であった。

ヒト全血からの、LPSによって誘導されるMCP-1産生の測定
toll様受容体のアゴニスト、例えば、細菌性リポ多糖類(LPS)により単核球細胞を活性化させると、MCP-1を含めた、最重要な炎症性メディエーターが産生される。そのような経路は、自己免疫障害及び炎症性障害の範囲の病態生理の中心となることが広く考えられる。血液を、ヘパリンナトリウム(Leo Pharmaceuticals社)(血液1mL当たりヘパリン10単位)を含有するチューブに収集する。100%DMSO中に試験試料1μLを含有する96-ウェル化合物プレートを、調製した(ドナー可変性のために2回)。全血130μLを、96-ウェル化合物プレートの各ウェルに分配し、37℃、5% CO₂で30分間インキュベートした。PBS(最終アッセイ濃度200ng/mL)で作製された、(チフス菌(Salmonella typhosa)から得られた;L6386)リポ多糖類10μLを、化合物プレートの各ウェルに加えた。次いで、これらのプレートを、18〜24時間、37℃、5% CO₂で、加湿した初代培養細胞インキュベーターに入れた。PBS 140μLを、血液を含有する化合物プレートの全てのウェルに加えた。次いで、これらのプレートを密封し、2500rpmで10分間遠心した。細胞の上清25μLを、ヒトMCP-1捕捉抗体で予めコーティングされた96-ウェルMSDプレートに入れた。プレートを密封し、600rpmで1時間(室温)振とう器に入れた。MSD SULFO-TAG(商標)試薬で標識した抗ヒトMCP-1抗体25μLを、MSDプレートの各ウェルに加える(原液50×を、希釈剤100で1:50に希釈し、最終アッセイ濃度は、1μg/mLである)。次いで、プレートを再び密封し、更に1時間振とうした後、PBSで洗浄した。次いで、2X MSD Read緩衝液T 150μL(原液4X MSD Read緩衝液Tを、脱イオン水で50:50に希釈した)を各ウェルに加え、プレートを、MSD Sector Imager 6000で読み取る。各化合物についての濃度反応曲線を、データから生成し、IC₅₀値を算出した。

結果:実施例5を除く、実施例1から11を全て、上記アッセイで試験し、pIC₅₀は、5.6から8.2の範囲内であることが判明した。実施例3及び実施例10は、pIC50が、それぞれ7.1及び5.6であった。

hCES-1による加水分解
カルボキシエステラーゼ1(CES1)によるESMを含有するBET阻害剤の加水分解は、標的分子を送達させる一態様である。組換えヒトCES1による実施例1から9及び11の加水分解速度を、HPLCアッセイを用いて決定した。ヒト細胞中で発現し、均質に精製された組換えヒトCES1(Gly18-Glu563、C-末端でポリヒスチジンタグを有する)を、Novoprotein社、Summit、New Jersey、USA(カタログ番号C450)から取得した。384ウェルプレート中で、50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)/100mM NaClの緩衝液中で20℃で反応を行った。アッセイでは試験化合物(50μM)及びCES1(50nM)の固定濃度を使用し、反応の時間経過を、時間が経過するごとにギ酸を加えてpHを下げることにより試料を停止させることにより得た。続いて、停止した試料を、HPLCにより分析して、0.1%ギ酸を含有する水中のアセトニトリルの勾配を用いて、流量1ml/分で、50×2mm C18 5μM逆相カラム(Phenomenex Gemini社)を用いて、加水分解性されていないエステルから生成物酸(product acid)を分離した。クロマトグラフィーを、300nmの波長の吸収度を用いてモニターした。形成された生成物の%を、積分ピーク面積を用いて決定し、反応の初速度を決定するために用いた。反応の初速度をCES1濃度で割ることにより、(μM/分/μMの単位の)これらの条件下の各試験化合物に対するCES1の特異的な活性を得た。

結果:αアミノ酸エステルを有さない実施例10を除く、実施例1から11は全て、上記アッセイにおいて、加水分解速度が、0.1及び5.0の間(加水分解された試験化合物μM/分/CES1のμM)であった。

Claims

BET阻害剤及びαアミノ酸エステルの共有結合コンジュゲートであって、αアミノ酸エステルのエステル基が、1種以上の細胞内カルボキシエステラーゼにより対応するカルボン酸に加水分解可能である、共有結合コンジュゲート。
in vitro結合アッセイにおける共有結合コンジュゲートの効力が、同じアッセイにおける非コンジュゲート型BET阻害剤の効力の50%以上になるように、αアミノ酸エステルがBET阻害剤に結合されている、請求項1に記載の共有結合コンジュゲート。
in vitro結合アッセイにおける共有結合コンジュゲートの効力が、同じアッセイにおける非コンジュゲート型BET阻害剤の効力と少なくとも同じ高さになるように、αアミノ酸エステルがBET阻害剤に結合されている、請求項2に記載の共有結合コンジュゲート。
αアミノ酸エステルが、アミノ酸エステルのアミノ基を介してBET阻害剤に結合されており、式(I):

[式中、Qは、-(CH₂)_a(O)_b-を表し;
R₁は、天然又は非天然αアミノ酸の側鎖を表し;
R₂は、1種以上の細胞内カルボキシエステラーゼ酵素により対応するカルボン酸に加水分解可能であるエステル基を表し;
aは、0、1、2又は3を表し;
bは、0又は1を表し、ただし、bが1である場合、aは、2又は3である]
を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。
R₁が、水素、C_1〜6アルキル、-(CH₂)_cシクロアルキル、-(CH₂)_cヘテロシクロアルキル、又は-CR₄R₅R₆を表し、更に、R₄が、水素、ヒドロキシル、-CH₂OH、-CH₂C_1〜3アルキル、ハロ、-COOH、-CONH₂、1H-イミダゾール-4-イル、-SH、-SeH、C_1〜3アルキル、C_1〜3アルコキシ、フェニル、又は4-ヒドロキシフェニルであり、前記C_1〜3アルキル又はC_1〜3アルコキシはハロ、ヒドロキシル、-NHC(=NH₂)NH₂、-NH₂、-COOH、-CONH₂、又は-SCH₃で置換されていてもよく、R₅及びR₆は、それぞれ独立に、水素又はC_1〜3アルキルであり、cは、0、1又は2である、請求項4に記載の共有結合コンジュゲート。
αアミノ酸エステルが、アミノ酸エステルのα炭素を介してBET阻害剤に結合されており、式(II):

[式中、Qは、-(CH₂)_a(O)_b-を表し;
R₂は、1種以上の細胞内カルボキシエステラーゼ酵素により対応するカルボン酸に加水分解可能であるエステル基を表し;
R₃は、水素、C_1〜6アルキル又はシクロアルキルを表し;
aは、0、1、2又は3を表し;
bは、0又は1を表し、ただし、bが1である場合、aは、2又は3である]
を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。
R₂が、-C(O)OCHR₇R₈[式中、R₇は、C_1〜3アルキル又は水素であり、R₈は、C_1〜6アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルであり、前記C_1〜6アルキルはC_1〜3アルコキシで置換されていてもよく、又はR₇及びR₈は、一緒になってシクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを形成している]を表す、請求項4から6のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。
R₂が、-C(O)OR₉[式中、R₉は、イソプロピル、イソブチル又はシクロペンチルを表す]を表す、請求項4から6のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。
aが1であり、bが0である、請求項4から8のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。
αアミノ酸エステルが、hCE-1を含有する細胞により加水分解可能であり、カルボキシエステラーゼhCE-2及び/又はhCE-3を含有するがhCE-1を含有しない細胞により加水分解可能ではない、請求項1から9のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。
αアミノ酸エステルが、0.2から0.5μM/分/μMの間の加水分解速度を有する、請求項10に記載の共有結合コンジュゲート。
αアミノ酸エステルが、式(I):

[式中、R₁は、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル又は-CR₄R₅R₆(式中、R₄は、水素、ヒドロキシル、-CH₂OH、-CH₂C_1〜3アルキル、ハロ、C_1〜3アルキル、C_1〜3アルコキシであり、前記C_1〜3アルキル又はC_1〜3アルコキシはハロ又はヒドロキシルで置換されていてもよく、R₅及びR₆は、独立に、水素又はC_1〜3アルキルであり、ただし、R₄、R₅及びR₆のうち少なくとも2つは、水素でない)を表し、R₂は、-C(O)OR₉(式中、R₉は、イソプロピル、sec-ブチル、sec-ペンチル、3-ペンチル、又はシクロアルキルである)を表す]
を有する、請求項10に記載の共有結合コンジュゲート。
αアミノ酸エステルのα炭素が、S-立体配置である、請求項1から12のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。
in vitro結合アッセイにおいて、αアミノ酸エステルへの結合前のBET阻害剤が、BETタンパク質のいずれか1つに対して7.0を超えるpIC50を有する、請求項1から12のいずれか一項に記載の共有結合コンジュゲート。
BETタンパク質が、BRD4である、請求項13に記載の共有結合コンジュゲート。