JP6533875B2

JP6533875B2 - Ｐｄｅ１阻害剤

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Publication number: JP6533875B2
Application number: JP2018539268A
Authority: JP
Inventors: ダーシニジェスデーソン，シンシア; デイビッドレクター，マーク
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー
Priority date: 2016-02-12
Filing date: 2017-02-03
Publication date: 2019-06-19
Anticipated expiration: 2037-02-03
Also published as: TW201736372A; ES2879645T3; AR107456A1; EP3414249A1; EP3414249B1; US9868741B2; TWI609870B; JP2019503389A; MA44006A; US20180099973A1; US20170233396A1; CN108602835A; US10112951B2; WO2017139186A1

Description

本発明は、特定のＰＤＥ１阻害剤、化合物を含む医薬組成物、生理障害を治療するための化合物を使用する方法、および中間体、並びに化合物の合成に有用な方法に関する。

ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、これらの環状ヌクレオチドが加水分解される速度を制御することにより、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの細胞レベルを調節する酵素である。ＰＤＥ１（カルシウムおよびカルモジュリン依存性ＰＤＥ）は、少なくとも１１の既知のＰＤＥファミリーのうちの１つである。ＰＤＥ１は、脳、心臓、肺、腎臓、および平滑筋を含む多くの組織で発現される。さらに、ＰＤＥ１は、ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１ＢおよびＰＤＥ１Ｃの３つの既知のアイソフォームのファミリーで構成される。

糖尿病に罹患している患者は、しばしば、糖尿病性腎疾患（または糖尿病性腎症）と呼ばれる慢性腎疾患の一形態を発症する。糖尿病性腎疾患は、糖尿病患者の４０％にも影響を及ぼし得ると推定されている。糖尿病性腎疾患の治療の選択肢は限られており、血圧を下げる薬物の使用、血糖値の管理、食事、および体重、並びに定期的な身体活動の実施が挙げられる。従って、慢性腎疾患、特に糖尿病性腎疾患を患っている患者のためのさらなる治療の選択肢が必要である。

米国特許第９，１７５，０１０号は、神経疾患、心血管疾患、および腎疾患を含む様々な生理障害を治療するために有用であるとして、ＰＤＥ１、より詳細にはＰＤＥ１Ｂの阻害剤である特定のチオフェン−、フラン−およびピリジン−融合アゾロピリミジン−５−（６Ｈ）−オンを開示している。さらに、欧州特許第００４０４０１号は、抗高血圧活性を有する特定の置換トリアゾロキノキサリン−４−オンを開示している。

本発明は、ＰＤＥ１の阻害剤である特定の新規な化合物を提供する。さらに、本発明は、ＰＤＥ２Ａ、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ６ＡＢ、ＰＤＥ７Ｂ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＥ１０Ａ、およびＰＤＥ１１Ａなどの、他のＰＤＥと比較してＰＤＥ１Ｂの選択的阻害剤である特定の新規な化合物を提供する。さらに、本発明は、抗高血圧効果を有し、また腎血流を改善し得る特定の新規な化合物を提供する。さらに、本発明の化合物は、腎線維症を減少させることができる。

従って、本発明は、式：

の化合物を提供する。

また、本発明は、患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、有効量の式Ｉの化合物を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。

また、本発明は、患者における糖尿病性腎疾患を治療する方法であって、有効量の式Ｉの化合物を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。

また、本発明は、患者における高血圧症を治療する方法であって、有効量の式Ｉの化合物を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。

また、本発明は、療法に使用するための式Ｉの化合物を提供する。さらに、本発明は、慢性腎疾患の治療に使用するための式Ｉの化合物を提供する。また、本発明は、糖尿病性腎疾患の治療に使用するための式Ｉの化合物を提供する。また、本発明は、高血圧症の治療に使用するための式Ｉの化合物を提供する。さらに、本発明は、慢性腎疾患の治療のための薬物の製造のための式Ｉの化合物の使用を提供する。さらに、本発明は、糖尿病性腎疾患の治療のための薬物の製造のための式Ｉの化合物の使用を提供する。本発明は、さらに、高血圧症の治療のための薬物の製造のための式Ｉの化合物の使用を提供する。

本発明は、さらに、式Ｉの化合物と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明は、さらに、式Ｉの化合物を、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するための方法を提供する。本発明は、また、式Ｉの化合物を合成するための方法および新規な中間体を包含する。

本明細書中で使用される場合、用語「治療すること」、「治療」または「治療するための」は、既存の症状または障害の重症度または進行の防止、抑止、減速、停止または逆転を含む。

本明細書で使用する「患者」という用語は、マウス、モルモット、ラット、イヌ、またはヒトなどの哺乳動物を指す。好ましい患者はヒトであることが理解される。

本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、患者への単回投与または複数回投与時に、診断または治療下の患者に所望の効果を提供する、本発明の化合物の量または用量を指す。

有効量は、既知の技術の使用によって、および類似の状況下で得られた結果を観察することにより、当業者としての在籍診断医によって容易に決定され得る。患者にとっての有効量を決定する際には、哺乳動物の種；そのサイズ、年齢、および一般的な健康状態；関与する特定の疾患または障害；疾患または障害の程度または関与または重症度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与の様式；投与された製剤のバイオアベイラビリティ特性；選択された投与計画；付随する投薬の使用；その他の関連する状況を含むが、これらに限定されない、多数の要因が在籍診断医によって考慮される。

式Ｉの化合物は、一般に、広い投与量範囲にわたって有効である。例えば、１日当たりの投与量は、通常、体重１ｋｇあたり約０．０１〜約２０ｍｇの範囲内である。いくつかの例では、上記範囲の下限を下回る投与量レベルがより適切である場合があり、一方、他の場合には、許容可能な副作用を有するより大きな投与量が使用され得、いずれにしても、上記投与量範囲は本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本発明の化合物は、好ましくは、経口および非経口経路を含む、化合物を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される医薬組成物として処方される。最も好ましくは、そのような組成物は経口投与用である。そのような医薬組成物およびこれを調製するための方法は、当技術分野で周知である。（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006を参照されたい。）

特定の略語は以下のように定義される：「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し、「ＡｃＯＨ」は氷酢酸を指し、「ＤＢＵ」は１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデカ−７−エンを指し、「ＤＣＥ」は１，２−ジクロロエタンを指し、「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンまたは塩化メチレンを指し、「ＤＩＰＥＡ」は、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを指し、「ＤＭＦ」は、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＥＤＣＩ」は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「Ｅｔ_２Ｏ」はジエチルエーテルを意味を指し、「ＥｔＯＨ」はエタノールを指し、「ＨＡＴＵ」はＮ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ−［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシドを指し、「ＨＭＤＳ」はヘキサメチルジシラザンを指し、「ＨＯＡＴ」は１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールを指し、「ＨＯＢｔ」はヒドロキシベンゾトリアゾールを指し、「ｈｒ」は時間（単数）または時間（複数）を指し、「ＩＣ_５０」は、その薬剤について可能な最大阻害応答の５０％を生成する薬剤の濃度を指し、「ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ」は、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析法を指し、「ＬＨＭＤＳ」はリチウムビス（トリメチルシリル）アミドを指し、「μｍｏｌ」は、マイクロモル（単数）またはマイクロモル（複数）を指し、「分」は分（単数）または分（複数）を指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールまたはメチルアルコールを指し、「ＭＴＢＥ」は、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルを指し、「ＮｉＮＴＡ」は、キレート剤としてニトリロトリ酢酸を用いて官能化されたアガロース固定相を用いたクロマトグラフィーを指し、「ＰＯＣｌ３」は、オキシ塩化リンを指し、「ＲＴ」は室温を指し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し、「ＴＭＡ」はトリメチルアミンを指し、「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を指し、「ＴＦＡＡ」はトリフルオロ酢酸無水物を指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、「Ｕ／ｍｌ」はミリリットル当たりの単位を指す。

本発明の化合物は、当業者に知られている様々な手順によって調製することができ、そのいくつかは、以下のスキーム、調製物および実施例に例示されている。当業者は、記載された経路のそれぞれについての特定の合成工程を、異なる方法で、または異なるスキームからの工程と組み合わせて、本発明の化合物を調製することができることを認識する。以下のスキームにおける各工程の生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、粉砕、および結晶化を含む、当技術分野で周知の従来の方法によって回収することができる。以下のスキームにおいて、他に示さない限り、すべての置換基は、先に定義した通りである。試薬および出発物質は、当業者に容易に入手可能である。本発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに説明するために、以下のスキーム、調製物および実施例を提供する。
スキーム１

スキーム１は、式Ｉの化合物の合成を示す。スキーム１の工程Ａにおいて、エチル−２−（アリルアミノ）−２−オキソ−アセテート約１当量を、約１．１当量の適切な非求核性有機塩基、例えば、ＥｔＯＡｃなどの極性有機溶媒中のＴＥＡの存在下で、加熱しながら約１．０５当量の２−アミノシクロヘキサノールと濃縮させる。生成物は、ろ過のような当技術分野で周知の標準的な技術を利用して単離することができる。例えば、反応混合物を冷却し、得られた沈殿物を濾過により回収し、続いてＥｔＯＡｃまたはＥｔ_２Ｏなどの適切な有機溶媒で洗浄し、真空下で乾燥させて、Ｎ−アリル−Ｎ’−（２−ヒドロキシシクロヘキシル）オキサミド、スキーム１の工程Ａの生成物を、後の使用のために十分な純度のシスおよびトランス異性体の混合物として、追加の精製なしで提供することができる。

スキーム１の工程Ｂにおいて、スキーム１の工程Ａの生成物であるＮ−アリル−Ｎ’−（２−ヒドロキシシクロヘキシル）オキサミドは、当該技術分野において周知の条件下で酸化され得る。例えば、約１当量のＮ−アリル−Ｎ’−（２−ヒドロキシシクロヘキシル）オキサミドを適切な有機溶媒混合物、例えばＴＨＦおよびＤＣＭに溶解し、０℃で過剰の適切な無機塩基、例えばＮａＨＣＯ_３の存在下で約１．１当量のＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナンで処理する。周囲温度に加温した後、クロマトグラフィー法による抽出および精製のような当該分野で周知の標準的な技術を用いて生成物を単離することができる。より具体的には、反応混合物をチオ硫酸ナトリウム水溶液および飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液でクエンチする。反応混合物をＤＣＭなどの適切な有機溶媒で抽出し、合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４などの適切な乾燥剤で乾燥し、濾過し、濃縮乾固する。粗生成物を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃなどの適切な有機溶媒混合物を用いてシリカで精製して、スキーム１の工程Ｂの生成物をＮ−アリル−Ｎ’−（２−オキソシクロヘキシル）オキサミドを提供する。

スキーム１の工程Ｃにおいて、スキーム１の工程Ｂの生成物であるＮ−アリル−Ｎ’−（２−オキソシクロヘキシル）オキサミド約１当量を、適切な酸性溶媒、例えば氷酢酸中で、約１．１当量ＴＦＡおよび１．１当量トリフルオロ酢酸無水物の混合物の存在下で熱脱水条件下で環化する。生成物は、クロマトグラフィー法による蒸発および精製のような、当技術分野で周知の標準的な技術を利用して単離することができる。より具体的には、反応混合物を周囲温度に冷却し、減圧下で蒸発させる。粗生成物を、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃなどの適切な有機溶媒混合物を用いてシリカで精製して、スキーム１の工程Ｃの生成物、４−アリル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−キノキサリン−２，３−ジオンを提供する。

スキーム１の工程Ｄにおいて、スキーム１の工程Ｃの生成物である約１当量の４−アリル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−キノキサリン−２，３−ジオンを、適切な塩素化剤、例えばＰＯＣｌ_３で処理し、ＤＣＥのような適切な有機溶媒中で加熱に供する。周囲温度に冷却後、反応混合物を減圧下で濃縮して、それ以上精製することなく次の使用に適している、スキーム１の工程Ｄの生成物１−アリル−３−クロロ−３，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロキサキサリン−２−オンを提供する。

スキーム１の工程Ｅにおいて、スキーム１の工程Ｄの生成物である約１当量の１−アリル−３−クロロ−３，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロキノキサリン−２−オンをＥｔＯＨなどの適切な極性有機溶媒中、約５当量のヒドラジンとともに加熱する。生成物は、抽出のような当技術分野で周知の標準的な技術を利用して単離することができる。より具体的には、反応混合物を冷却し、減圧下で濃縮し、水とＤＣＭなどの適切な有機溶媒とに分配し、相を分離する。有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、それ以上精製することなく次の使用に適している、スキーム１の工程Ｅの生成物、１−アリル−３−ヒドラジノ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オンを得る。

スキーム１の工程Ｆにおいて、スキーム１の工程Ｅの生成物は、当該技術分野において周知の様々なアミドカップリング技術を用いて酸にカップリングされ得る。例えば、約１当量の１−アリル−３−ヒドラジノ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オン、工程Ｅの生成物をＤＭＦなどの適切な有機溶媒に溶解し、ＴＥＡまたはＤＩＰＥＡのような適切な非求核性有機塩基の３．５〜５当量の存在下で、約１．７当量のＨＡＴＵまたはＴＢＴＵなどの適切なアミドカップリング試薬、および１．７当量の１−シクロプロピルシクロプロパンカルボン酸などの適切なカルボン酸とともに処理する。（Eur. J. Org Chem., 2010, pp 3295-3301を参照されたい。）生成物は、抽出のような当技術分野で周知の標準的な技術を利用して単離することができる。より具体的には、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液および飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、スキーム１の工程Ｆの生成物、Ｎ’−（４−アリル−３−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−イル）−１−シクロプロピル−シクロプロパンカルボヒドラジドであり、それ以上精製することなく次の工程で使用するために持ち越すことができる。

スキーム１の工程Ｇにおいて、スキーム１の工程Ｆの生成物であるＮ’−（４−アリル−３−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−イル）−１−シクロプロピル−シクロプロパンカルボヒドラジドを、当該分野で周知の熱的またはマイクロ波条件下で環化してもよい。例えば、Ｎ’−（４−アリル−３−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−イル）−１−シクロプロピル−シクロプロパンカルボヒドラジドを適切な有機酸、例えばＡｃＯＨに溶解し、マイクロ波反応器で加熱する。生成物は、当技術分野で周知の標準技術、例えばクロマトグラフィー法を利用して単離することができる。より具体的には、反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃのような適切な有機溶媒混合物を用いてシリカクロマトグラフィーに供して、スキーム１の工程Ｇの生成物、５−アリル−１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オンを得る。

スキーム１の工程Ｈにおいて、スキーム１の工程Ｇの生成物、５−アリル−１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オンは、当該技術分野において周知の様々な条件下で脱アリル化され得る。例えば、約１当量の５−アリル−１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オンを、適切な脱気した有機溶媒、例えばＤＣＭ中で溶解する。この溶液を約３当量のＮ、Ｎ−ジメチルバルビツール酸および約０．２当量のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウムで加熱して処理する。生成物は、当技術分野で周知の標準技術、例えばクロマトグラフィー法を利用して単離することができる。より具体的には、反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を、約０．１％のＴＦＡを含有するＡＣＮおよび約０．１％のＴＦＡを含有する水などの緩衝化水および有機移動相の適切な混合物を用いて逆相カラムクロマトグラフィーに供し、スキーム１の工程Ｈの生成物である１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オンを得る。

スキーム１の工程Ｉにおいて、スキーム１の工程Ｈの生成物は、当該技術分野において周知の様々な標準的なアルキル化条件下でアルキル化され得る。例えば、約１当量の１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オン、工程Ｈの生成物を、適切な有機溶媒、例えばＤＭＦに溶解させ、約３当量の適切な強有機塩基、例えばＬＨＭＤＳで、周囲温度以下にて処理する。次の反応混合物を、約１当量の適切なアルキル化剤、例えばブロモメチルシクロプロパンおよび触媒量のハロゲン移動剤、例えばＫＩの混合物で処理する。生成物は、当技術分野で周知の標準的な技術、例えば希釈、続いてクロマトグラフィー法を利用して単離することができる。より具体的には、反応混合物をＥｔＯＡｃなどの適切な有機溶媒で希釈し、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。粗生成物を、ＥｔＯＡｃなどの適切な極性有機溶媒を使用してシリカクロマトグラフィーにより精製して、式Ｉの化合物である、スキーム１の工程Ｉの生成物、１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−５−（シクロプロピルメチル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オンを得る。
スキーム２

スキーム２は、式Ｉの化合物への別の合成を示す。スキーム２の工程Ａにおいて、ＤＣＭなどの典型的な有機溶媒中の約１当量のシクロプロピルメタンアミンを、約‐２０〜０℃で、約１．１当量のトリメチルアミンのような非求核性有機塩基の存在下で、約１当量のエチル２−クロロ−２−オキソ−アセテートでアシル化する。生成物は、抽出のような当技術分野で周知の標準的な技術を利用して単離することができる。より具体的には、反応混合物を水に注ぎ、１ＭＨＣｌなどの適切な水性鉱酸でｐＨを約６〜７に調整し、酸性化した水性混合物をＤＣＭなどの適切な有機溶媒で抽出する。合わせた有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ_３、続いて飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、それ以上精製することなく次の工程で使用するのに適している、スキーム２の工程Ａの生成物である、エチル２−（シクロプロピルメチルアミノ）−２−オキソ−アセテートを得る。

スキーム２の工程Ｂにおいて、エチル２−（シクロプロピルメチルアミノ）−２−オキソ−アセテートのアミド化は、当技術分野で周知の様々な条件下で実施することができる。例えば、スキーム２の工程Ａの生成物である約１当量のエチル２−（シクロプロピルメチルアミノ）−２−オキソ−アセテートをＤＣＭなどの適切な有機溶媒に溶解し、約１当量のアミノシクロヘキサノールおよび約１当量の適切な非求核性有機塩基、例えばＴＥＡで連続的に処理した。周囲温度で１６〜２４時間撹拌した後、生成物は、濾過などの当該技術分野において周知の技術を用いて単離され得る。例えば、得られた反応混合物中の沈殿を濾過により回収し、最小量のＤＣＭで洗浄し、風乾して、さらなる精製をすることなくその後の使用のために十分な純度のシスおよびトランス異性体の混合物として、スキーム２、工程Ｂの生成物である、Ｎ−（シクロプロピルメチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシシクロヘキシル）オキサミドを得る。

スキーム２の工程Ｃにおいて、スキーム２の工程Ｂの生成物であるＮ−（シクロプロピルメチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシシクロヘキシル）オキサミドは、当該技術分野において周知の条件によって酸化され得る。例えば、約１当量のＮ−（シクロプロピルメチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシシクロヘキシル）オキサミドを、ＤＣＭなどの適切な有機溶媒に溶解し、０℃に冷却し、約２．５当量の三酸化硫黄−ピリジン錯体でゆっくりと処理した。周囲温度に加温した後、抽出などの当該技術分野において周知の技術を用いて生成物を単離することができる。例えば、反応混合物を水に注ぎ、１ＭＨＣｌ水溶液などの適切な水性鉱酸でｐＨ約７に中和し、ＤＣＭで抽出する。合わせた有機抽出物をＨ_２Ｏ、続いて飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、さらなる精製をすることなく次の使用に適している、スキーム２、工程Ｃの生成物である、Ｎ−（シクロプロピルメチル）−Ｎ’−（２−オキソシクロヘキシル）オキサミドを得る。

スキーム２の工程Ｄにおいて、スキーム２の工程Ｃの生成物であるＮ−（シクロプロピルメチル）−Ｎ’−（２−オキソシクロヘキシル）オキサミドの環化は、スキーム１の工程Ｃに記載されたものと同様の方法で行うことができ、スキーム２、工程Ｄの生成物である、４−（シクロプロピルメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−キノキサリン−２，３−ジオンを得る。

スキーム２の工程Ｅにおいて、スキーム２の工程Ｄの場合の生成物である４−（シクロプロピルメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−キノキサリン−２，３−ジオンの塩素化は、スキーム１の工程Ｄに記載のようにして、スキーム２、工程Ｅの生成物である、３−クロロ−１−（シクロプロピルメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オンを得る。

スキーム２の工程Ｆにおいて、スキーム２の工程Ｅの生成物である、３−クロロ−１−（シクロプロピルメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オンを、スキーム１の工程Ｅに類似の条件下でヒドラジンで処理して、スキーム２の工程Ｆの生成物、１−（シクロプロピルメチル）−３−ヒドラジノ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オンを得る。

スキーム２の工程Ｇにおいて、スキーム２の工程Ｆの生成物である、１−（シクロプロピルメチル）−３−ヒドラジノ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オン、は、当技術分野で周知の種々のアミドカップリング技術を用いて酸にカップリングさせることができる。例えば、約１当量の１−（シクロプロピルメチル）−３−ヒドラジノ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オンをＤＭＦのような適当な有機溶媒に溶解し、約１．５当量の１−シクロプロピルシクロプロパンカルボン酸（Eur. J. Org Chem., 2010, pp 3295-3301を参照されたい）、１．６当量のＥＤＣＩ、約１．７当量のＨＯＡＴ、および約３当量の適切な非求核性有機塩基、例えばＴＥＡで順次処理した。周囲温度で約１６時間撹拌した後、抽出などの当該技術分野で周知の技術を用いて生成物を単離することができる。例えば、反応混合物をＨ_２ＯとＭＴＢＥとに分配し、相を分離し、水相を０．５ＭＨＣｌのような適切な水性鉱酸で酸性化する。酸性化した水溶液をＤＣＭなどの適切な有機溶媒で抽出し、層を分離し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、さらなる精製を行わずに続く使用に適している、スキーム２の工程Ｇの生成物である、１−シクロプロピル−Ｎ’−［４−（シクロプロピルメチル）３−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−イル］シクロプロパンカルボヒドラジドを得る。

スキーム２の工程Ｈにおいて、スキーム２の工程Ｇの生成物である、約１当量の１−シクロプロピル−Ｎ’−［４−（シクロプロピルメチル）−３−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−イル］シクロプロパンカルボヒドラジドは、ＤＢＵなどの適切な非求核性有機塩基を０．２当量含む、ＨＭＤＳのような有機溶媒中、熱条件下で環化される。約１６時間の加熱後、生成物は、濾過、抽出、および摩砕のような当技術分野で周知の技術を利用することによって単離され得る。例えば、冷却した反応混合物を濾過し、回収した固体をＤＣＭなどの適切な有機溶媒に溶解する。有機溶液を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。粗生成物を最小量のＡＣＮで粉砕し、固体を濾過によって集め、最小量のＥｔＯＡｃに再溶解し、減圧下で濃縮して、さらなる精製なしに十分な純度のスキーム２の工程Ｈの生成物、１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−５−（シクロプロピルメチル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オンを得る。

調製物１
Ｎ−アリル−Ｎ’−（２−ヒドロキシシクロヘキシル）オキサミド

スキーム１の工程Ａ：ＥｔＯＡｃ（１２７．３ｍＬ）中の２−アミノシクロヘキサノール（７．７ｇ、６６．８ｍｍｏｌ）、エチル−２−（アリルアミノ）−２−オキソ−アセテート（１０．０ｇ、６３．６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（９．８ｍＬ、７０．０ｍｍｏｌ）を合わせ、混合物を８０℃で４時間加熱する。混合物を周囲温度に冷却し、一晩撹拌する。得られた沈殿物を真空濾過により単離し、ＥｔＯＡｃで濾過ケーキを洗浄し、４時間乾燥させて、白色の結晶性固体として表題化合物（７．２ｇ、５０％）を得る。濾液を減圧下で濃縮し、得られた固体をＥｔ_２Ｏ中で超音波処理する。真空濾過により固体を単離し、Ｅｔ２Ｏでフィルターケーキを洗浄し、１．５時間乾燥させて、追加のロットの表題化合物（２．８ｇ、１９％）を白色の結晶性固体として得た。この生成物は、シスおよびトランス異性体の混合物である。LC-ES/MS(m/z):227.0(M+H)。

調製物２
Ｎ−アリル−Ｎ’−（２−オキソシクロヘキシル）オキサミド

スキーム１の工程Ｂ：ＤＣＭ（１１０．５ｍＬ）およびＴＨＦ（３６．８ｍＬ）の混合物中のＮ’−アリル−Ｎ−（２−ヒドロキシシクロヘキシル）オキサミド（５．０ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ_３（２５．０ｇ、２９７．６ｍｍｏｌ）を合わせ、得られた懸濁液を０℃に冷却する。この懸濁液に３，３，３−トリアセトキシ−３−ヨードフタリド（１０．３ｇ、２４．３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を周囲温度までゆっくりと温める。周囲温度で一晩撹拌した後、飽和Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３（５０ｍＬのＨ_２Ｏ中に７．０ｇ）および飽和ＮａＨＣＯ_３を添加して混合物をクエンチする。２相混合物を周囲温度で２時間撹拌し、層を分離する。水層をＤＣＭで抽出する。有機抽出物を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して残渣を得る。ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：１）で溶出するシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより残留物を精製して、表題化合物（３．４ｇ、６９％）をオフホワイトの固体として得る。LC-ES/MS(m/z):225.0(M+H)。

調製物３
４−アリル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−キノキサリン−２，３−ジオン

スキーム１の工程Ｃ：ＡｃＯＨ（１５．２ｍＬ、２６４．６ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（１．３ｍＬ、１６．７ｍｍｏｌ）およびＴＦＡＡ（３．５ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）の混合物に、Ｎ−アリル−Ｎ’−（２−オキソシクロヘキシル）オキサミド（３．４ｇ、１５．２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１００℃で一晩加熱する。混合物を周囲温度に冷却し、減圧下で溶媒を除去して黒色油状物を得る。ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ（０：１から１：４の勾配）で溶出するシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより残留物を精製して、表題化合物（２．６ｇ、８３％）を黄褐色固体として得た。LC-ES/MS(m/z):207.0(M+H)。

調製物４
１−アリル−３−クロロ−３，４，５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オン

スキーム１の工程Ｄ：４−アリル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−キノキサリン−２，３−ジオン（２．６ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＯＣｌ_３（２．０ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）を加え、ＤＣＥ（６２．６ｍＬ）に溶解し、混合物を７５℃で４．５時間加熱する。追加のＰＯＣｌ_３（１．０ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を混合物に加え、７５℃で３．５時間加熱を続ける。混合物を周囲温度に冷却し、一晩撹拌する。減圧下で溶媒を除去し、得られた残渣をトルエンに溶解する。トルエンを減圧下で除去して、表題化合物（２．８１ｇ、１００％）を暗赤色油状物として得る。LC-ES/MS(m/z):225.0(M+H)。

調製物５
１−アリル−３−ヒドラジノ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オン

スキーム１の工程Ｅ：ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）における１−アリル−３−クロロ−３，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロキノキサリン−２−オン（２．８ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ヒドラジン（２．０ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩加熱還流する。混合物を周囲温度に冷却し、減圧下で溶媒を除去する。得られた残渣をＨ_２ＯとＤＣＭとの間で分配する。有機層を分離し、水をＤＣＭで抽出する。有機抽出物を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（２．６ｇ、９５％）をオレンジ色の油状物として得る。LC-ES/MS(m/z):221.0(M+H)。

調製物６
Ｎ’−（４−アリル−３−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−イル）−１−シクロプロピル−シクロプロパンカルボヒドラジド

スキーム１の工程Ｆ：１−シクロプロピルシクロプロパンカルボン酸（２．３ｇ、１８．３ｍｍｏl、Eur. J. Org Chem., 2010, pp 3295-3301を参照されたい。）、ＨＡＴＵ（７．０ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６．６ｍＬ、３７．７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４０ｍＬ）中の１−アリル−３−ヒドラジノ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オン（２．４ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）の溶液に加え、混合物を周囲温度で一晩撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３および飽和ＮａＣｌ水溶液で順次洗浄する。有機混合物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（３．５ｇ、１００％）を褐色油状物として得る。LC-ES/MS(m/z):329.2(M+H)。

調製物７
５−アリル−１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オン

スキーム１の工程Ｇ：ＡｃＯＨ（１０．０ｍＬ、１７４．５ｍｍｏｌ）中にＮ’−（４−アリル−３−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−イル）−１−シクロプロピル−シクロプロパンカルボヒドラジド（３．５ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）を溶解し、溶液をマイクロ波で１３０℃で３．５時間加熱する。ＡｃＯＨを減圧下で除去し、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（４：１〜１：０の勾配）で溶離するシリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーにより得られた残渣を精製して、表題化合物（１．２ｇ、３５％）を褐色の油状物として得る。LC-ES/MS(m/z):311.2(M+H)。

調製物８
１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オン

スキーム１の工程Ｈ：ＤＣＭ（３０ｍＬ）中の５−アリル−１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オン（８７７．４ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）溶液に、Ｎ、Ｎ−ジメチルバルビツール酸（１．３ｇ、８．５ｍｍｏｌ）を加え、窒素で１０分間パージした。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（６５３．３ｍｇ、５６５．３μｍｏｌ）を添加し、混合物を３５℃で一晩加熱する。混合物を周囲温度に冷却し、減圧下で溶媒を除去して残渣を得る。残渣を逆相フラッシュクロマトグラフィー（REDISEP（商標）Gold C-18,415g；２２．９分間にわたる、０．１％ＴＦＡ入りＨ_２Ｏ混合液における０．１％ＴＦＡ入りＡＣＮ混合物の２０〜４８％の勾配）で精製して、表題化合物（３９２．７ｍｇ、５１％）を黄褐色の固体として得る。LC-ES/MS(m/z):271.0(M+H)。

調製物９
エチル２−（シクロプロピルメチルアミノ）−２−オキソ−アセテート

スキーム２の工程Ａ：ＤＣＭ（１．５Ｌ）中のエチル２−クロロ−２−オキソ−アセテート（１０９ｇ、０．８ｍｏｌ）の−１０℃溶液にＴＭＡ（９０ｇ、０．９ｍｏｌ）を加える。シクロプロピルメタンアミン（６０ｇ、０．８ｍｏｌ）を−１０℃で２０分かけて滴下し、−１０℃で３時間、混合物を撹拌する。混合物をＨ_２Ｏ（１．５Ｌ）に注ぎ、１ＭＨＣｌでｐＨ約５〜６に調整する。層を分離し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３（５００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（５００ｍＬ）で順次洗浄する。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で濃縮して黄色の油状物として表題化合物（１２９ｇ、９４％）を得る。LC-ES/MS(m/z):172.2(M+H)。

調製物１０
Ｎ−（シクロプロピルメチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシシクロヘキシル）オキサミド

スキーム２の工程Ｂ：周囲温度でＤＣＭ（１．６Ｌ）中のエチル２−（シクロプロピルメチルアミノ）−２−オキソ−アセテート（１２８．５ｇ、０．７５ｍｏｌ）の溶液にＴＥＡ（１１５ｍＬ、０．８ｍｏｌ）を加える。この混合物に２−アミノシクロヘキサノール（９１ｇ、０．８ｍｏｌ）を加え、周囲温度で１６時間撹拌した。得られた沈殿物を濾過し、風乾して、シスおよびトランス異性体の白色固体混合物として表題化合物（１４７ｇ、８０％）を得る。LC-ES/MS(m/z)241.1(M+H)。

調製物１１
Ｎ−（シクロプロピルメチル）−Ｎ’−（２−オキソシクロヘキシル）オキサミド

スキーム２の工程Ｃ：ＤＣＭ（１．４Ｌ）中のＮ−（シクロプロピルメチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシシクロヘキシル）オキサミド（１３７ｇ、０．６ｍｏｌ）のスラリーに、０℃で、１時間かけてＴＥＡ（３２０ｍＬ、２．３ｍｏｌ）を加える。三酸化硫黄−ピリジン錯体（３６５ｇ、２．３ｍｏｌ）をＤＭＳＯ（７３０ｍＬ）に溶解し、溶液を０℃で反応混合物に滴下する。混合物を周囲温度まで温め、１６時間撹拌する。反応混合物をＨ_２Ｏ（８００ｍＬ）に注ぎ、１ＭＨＣｌを用いてｐＨ約７に調整する。層を分離し、Ｈ_２Ｏ（３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（２００ｍＬ）で順次有機層を洗浄する。有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、表題化合物（１１４ｇ、８３％）を白色固体として得る。LC-ES/MS (m/z) 239.1 (M+H)。

調製物１２
４−（シクロプロピルメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−キノキサリン−２，３−ジオン

スキーム２の工程Ｄ：Ｎ−（シクロプロピルメチル）−Ｎ’−（２−オキソシクロヘキシル）オキサミド（１１４ｇ、０．５ｍｏｌ）入りＡｃＯＨ（５７４ｍＬ）溶液にＴＦＡ（６０ｇ、０．５ｍｏｌ）およびＴＦＡＡ（１１１ｇ、０．５ｍｏｌ）を追加し、混合物を１００℃で１８時間加熱する。ＡｃＯＨを減圧下で除去し、得られた残渣にＨ_２Ｏ（５００ｍＬ）およびＤＣＭ（４００ｍＬ）を加える。ＮａＨＣＯ_３水溶液を用いてｐＨを約７に調整し、層を分離する。Ｈ_２Ｏ（２００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（２００ｍＬ）で順次有機層を洗浄する。有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗生成物を固体として得る。固体をＡＣＮ（３ｍＬ／ｇ）で粉砕し、真空濾過によって単離し、白色固体として表題化合物（４２ｇ、３８％）を得る。LC-ES/MS(m/z)221.1(M+H)。

調製物１３
３−クロロ−１−（シクロプロピルメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オン

スキーム２、工程Ｅ：ＤＣＥ中の４−（シクロプロピルメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−キノキサリン−２，３−ジオン（４１．５ｇ、０．１９ｍｏｌ）とＰＯＣｌ_３（３７．７ｇ、０．３ｍｏｌ）入りＤＣＥ（４１５ｍＬ）とを合わせて、混合物を７５℃で５時間加熱する。混合物を周囲温度に冷却し、飽和ＫＨ_２ＰＯ_４溶液（１Ｌ）に注いだ。層を分離し、Ｈ_２Ｏ（３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（３００ｍＬ）で順次有機層を洗浄する。有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、表題化合物（３８．３ｇ、８５％）を褐色固体として得る。LC-ES/MS(m/z):239.1(M+H)。

調製物１４
１−（シクロプロピルメチル）−３−ヒドラジノ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オン

スキーム２の工程Ｆ：３−クロロ−１−（シクロプロピルメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−オン（３８．３ｇ、０．１６ｍｏｌ）入りＥｔＯＨ（１５３ｍＬ）の溶液に、ヒドラジン（８０．６ｇ、１．６ｍｏｌ）を加え、混合物を７５℃で４時間加熱する。混合物を周囲温度に冷却し、Ｈ_２Ｏ（３００ｍＬ）に注ぐ。得られた黄色沈殿物を真空濾過により単離する。フィルターケーキをＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解する。有機溶液をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、表題化合物（２８．７ｇ、７６％）をオフホワイトの固体として得る。LC-ES/MS(m/z):235.2(M+H)。

調製物１５
１−シクロプロピル−Ｎ’−［４−（シクロプロピルメチル）−３−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−イル］シクロプロパンカルボヒドラジド
SP-0010427-181-A

スキーム２の工程Ｇ：ＥＤＣＩ（３６．４ｇ、０．１９ｍｏｌ）、ＨＯＡＴ（２６．９ｇ、０．２ｍｏｌ）、ＴＥＡ（３８．５ｇ、０．４ｍｏｌ）および１−（シクロプロピルメチル）−３−ヒドラジノ−５，６，７８−テトラヒドロキノキサリン−２−オン（２８．７ｇ、０．１２ｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４３０ｍＬ）中の１−シクロプロピルシクロプロパンカルボン酸（２３．２ｇ、０．１８ｍｏｌ、例えば、Eur. J. Org Chem., 2010, pp 3295-3301を参照されたい。）の溶液に、０℃で加える。反応混合物を周囲温度に温め、１６時間撹拌し、次いでＨ_２Ｏ（８００ｍＬ）とＭＴＢＥ（７００ｍＬ）との混合物に注ぐ。層を分離し、０．５ＭＨＣｌ（３００ｍＬ）で有機層を抽出する。有機層を捨て、飽和ＮａＨＣＯ_３で水層をｐＨ約８に調整する。水層をＤＣＭで抽出し、層を分離し、有機抽出物を減圧下で濃縮して、表題化合物（３８ｇ、９１％）をオフホワイトの固体として得る。LC-ES/MS(m/z): 343.2(M+H)。

実施例１
１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−５−（シクロプロピルメチル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オン

スキーム１の工程Ｉ：１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オン（１６４．２ｍｇ、６０７．４μｍｏｌ）入りＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、ＬＨＭＤＳ（１．６ｇ，、１．８ｍｍｏｌ）を加える。混合物を周囲温度で１時間撹拌した後、ＫＩ（１０ｍｇ、６０．７μｍｏｌ）およびブロモメチルシクロプロパン（２４６．０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で２日間撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄する。Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して油状物を得る。ＥｔＯＡｃ（１００％）で溶離するシリカのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物（１０８．２ｍｇ、５５％）を黄褐色固体として得る。LC-ES/MS(m/z):325.2(M+H)。

実施例１の代替手順
１−（１−シクロプロピルシクロプロピル）−５−（シクロプロピルメチル）−６，７，８，９−テトラヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］キノキサリン−４−オン

スキーム２の工程Ｈ：１−シクロプロピル−Ｎ’−［４−（シクロプロピルメチル）−３−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロキノキサリン−２−イル］シクロプロパンカルボヒドラジド（３５．７ｇ、０．１ｍｏｌ）、ＨＭＤＳ（３５７ｍＬ）およびＤＢＵ（２．９ｇ、０．０２ｍｏｌ）を合わせ、混合物を１２５℃で１６時間加熱する。混合物を周囲温度に冷却し、Ｈ_２Ｏ（２６０ｍＬ）に注いだ。真空濾過により沈殿物を回収し、固体をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解する。有機溶液を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、層を分離し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で濃縮して固体を得る。固体をＡＣＮ（２ｍＬ／ｇ）で粉砕し、真空濾過により集める。集めた固体をＥｔＯＡｃに溶解し、減圧下で濃縮して、表題化合物（２０ｇ、５９％）を淡黄色固体として得る。LC-ES/MS(m/z):325.2(M+H)。

ＰＤＥタンパク質の生成
全長ヒトPDE1A（NP_001003683.1）、PDE1C (NP_005011.1)、PDE5A (NP_001074.2)、PDE7B (NP_061818.1)、およびPDE9A (NP_002597.1)をコードするヌクレオチド配列を、Ｎ末端ＨＩＳタグを有するpFastBac1（Invitrogen）ベクターに挿入する。PDE3A（NP_000912.3）の完全長ヒトPDE4D（NP_006194.2）および触媒ドメイン（残基641-1141）をコードするヌクレオチド配列を、Ｃ末端ＨＩＳタグを有するpFastBac1（Invitrogen）ベクターに挿入する。全長ヒトPDE8A（NP_002596.1）およびPDE11A（AAI12394.1）をコードするヌクレオチド配列を、Ｎ末端Ｆｌａｇタグを有するpFastBac1（Invitrogen）ベクターに挿入する。全長ヒトPDE10A（AAD32595.1）をコードするヌクレオチド配列を、Ｃ末端Ｆｌａｇ−Ｈｉｓタグを有するpFastBac1（Invitrogen）ベクターに挿入する。完全長ヒトPDE6A（NP_000431.2）およびPDE6B（AAH00249.1）をコードするヌクレオチド配列を、PDE6A/6B二量体の産生のために、それぞれ、Ｎ末端ＨＩＳタグおよびＮ末端Ｆｌａｇタグを有するpFastBacDual（Invitrogen）ベクターに挿入する。Bac-to-Bacバキュロウイルス発現系（Invitrogen）のプロトコルに従って、Ｓａｃ９細胞におけるバキュロウイルスの生成およびタンパク質発現を実施する。完全長ヒトPDE1B（NP_000915.1）およびPDE2A（NP_002590.1）をコードするヌクレオチド配列を、Ｃ末端ＨＩＳタグを有するpIEX4（Novagen）に挿入し、Ｓｆ９細胞における両方のタンパク質産物を、ベンダーのプロトコール（Novagen）に従って実施する。Ｈｉｓタグ付きＰＤＥタンパク質を、Ni-NTAアガロース（Qiagen）を用いて精製し、続いて保存バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール）中のSUPERDEX（登録商標）200カラム（GE Healthcare）でサイズ排除クロマトグラフィーを行う。ＮｉＥＴＡカラムクロマトグラフィーによる精製および保存バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌＦｌａｇペプチド）中で溶出した後、ＰＤＥ６Ａ／６Ｂを含むＦｌａｇタグＰＤＥタンパク質を抗ＦｌａｇＭ２−アガロース（Sigma）を用いて精製する。すべての精製されたタンパク質は、少量のアリコートで−８０℃で保存される。

ホスホジエステラーゼ酵素アッセイ
全ての３’、５’サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）酵素活性は、ＳＰＡ検出システム（シンチレーション近接アッセイ）に基づく放射性酵素アッセイで測定される。試験すべき化合物を、１０点濃度応答曲線を用いて純ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈する。反応混合物中の最大化合物濃度は、１０または１００μＭのいずれかである。適切な濃度の化合物をＰＤＥ酵素のいずれかと３０分間プレインキュベートしてから、反応を基質の添加により開始する。反応を室温で６０分間進行させる。次に、ＳＰＡビーズの添加により反応を停止させる。サンプルは１２時間後にMICROBETA（商標）TRILUX（登録商標）カウンターで読み取る。「ＩＣ_５０」は、その化合物に対して可能な最大の阻害応答の５０％を生成する、化合物の濃度を指す。ＩＣ_５０値は、正規化されたデータ対ｌｏｇ［化合物］をプロットし、４パラメータロジスティック方程式を使用してデータをフィッティングすることによって計算される。

Ｃａ ^２＋ −カルモジュリン依存性ＰＤＥ酵素アッセイ
ＰＤＥ１Ｂ、ＰＤＥ１ＡおよびＰＤＥ１Ｃは、標準的なタンパク質生成手順に従って、インハウスでクローン化および精製される。アッセイ緩衝液は、ｐＨ７．５の水中の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ_２、４ｍＭＣａＣｌ_２、０．１％ウシ血清アルブミンおよび６Ｕ／ｍｌカルモジュリンのアッセイにおける最終濃度を付与するように調製する。ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１ＢおよびＰＤＥ１Ｃについてそれぞれ最終酵素濃度は０．２５、０．０７４および０．００１２ｎＭである。反応は基質［^３Ｈ］ｃＡＭＰの添加により開始し、４７ｎＭの最終濃度を与える。
表１：ＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１ＢおよびＰＤＥ１Ｃに対する実施例１のインビトロでの効力。

表１のデータは、実施例１の化合物がインビトロでＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１ＢおよびＰＤＥ１Ｃ酵素活性を阻害することを実証している。

基質として［ ^３Ｈ］ｃＡＭＰを使用するＰＤＥ酵素アッセイ
以下のホスホジエステラーゼ活性を、反応基質として［^３Ｈ］ｃＡＭＰ：ＰＤＥ３Ａ（触媒ドメイン）、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７ＢおよびＰＤＥ８Ａを用いて測定する。これらの酵素は全て、インハウスで、標準的な手順に従ってクローン化されて精製される。アッセイ緩衝液は、ｐＨ７．５の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、８．３ｍＭＭｇＣｌ_２、１．７ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および０．１％ウシ血清アルブミンのアッセイにおける最終濃度を付与するように調製する。最終酵素濃度は、それぞれＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７ＢおよびＰＤＥ８Ａについて０．００８、０．０２１、０．５、および０．０６ｎＭである。反応は基質［^３Ｈ］ｃＡＭＰを添加することによっても開始され、４７ｎＭの最終濃度が得られる。
表２：ＰＤＥ３Ａ（触媒ドメイン）、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ７ＢおよびＰＤＥ８Ａに対する実施例１のインビトロでの効力。

基質として［ ^３Ｈ］ｃＧＭＰを用いるＰＤＥ酵素アッセイ
ＰＤＥ２Ａ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ６Ａ／６Ｂ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１Ａの反応基質として［^３Ｈ］ｃＧＭＰを用いて以下のホスホジエステラーゼ活性を測定する。ＰＤＥ６の触媒活性形態は、α（ＰＤＥ６Ａ）およびβサブユニット（ＰＤＥ６Ｂ）で構成される二量体である。ＰＤＥ６Ａ／６Ｂの二量体は、２つの精製工程、すなわちＮｉＮＴＡおよび抗ＦＬＡＧセファロースクロマトグラフィーを使用して、発現および精製戦略によって産生される。残りの酵素は、標準的な手順に従ってクローン化し、インハウスで精製する。アッセイ緩衝液は、ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８．３ｍＭＭｇＣｌ_２、１．７ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ウシ血清アルブミンのアッセイにおける最終濃度を与えるように調製される。最終酵素濃度は、それぞれＰＤＥ２Ａ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ６ＡＢ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１Ａについて０．２、０．００２、５、１、０．０３、および０．０３ｎＭである。ＰＤＥ２Ａ、ＰＤＥ１０Ａ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ６ＡＢおよびＰＤＥ１１Ａアッセイの場合、最終濃度が８０ｎＭとなるように基質［^３Ｈ］ｃＧＭＰを添加することにより反応を開始するが、ＰＤＥ９Ａについては２０ｎＭの［^３Ｈ］ｃＧＭＰを用いる。
表３：ＰＤＥ２Ａ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ６ＡＢ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１Ａに対する実施例１のインビトロでの効力。

表２および３のデータは、実施例１の化合物が、インビトロでＰＤＥ２Ａ、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ６ＡＢ、ＰＤＥ７Ｂ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１Ａに対してＰＤＥ１Ａ、ＰＤＥ１ＢおよびＰＤＥ１Ｃの選択的阻害剤であることを実証する。

以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］下記式の化合物。

［２］患者における慢性腎疾患を治療する方法であって、有効量の［１］の化合物を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法。
［３］患者における糖尿病性腎疾患を治療する方法であって、有効量の［１］の化合物を、治療を必要とする患者に投与することを含む方法。
［４］療法に使用するための［１］に記載の化合物。
［５］慢性腎疾患の治療に使用するための［１］に記載の化合物。
［６］糖尿病性腎疾患の治療に使用するための［１］に記載の化合物。
［７］［１］に記載の化合物と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
［８］［１］に記載の化合物を、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するための方法。

Claims

下記式の化合物。
請求項１の化合物を含む、慢性腎疾患を治療するための医薬組成物。
請求項１の化合物を含む、糖尿病性腎疾患を治療するための医薬組成物。
療法に使用するための請求項１に記載の化合物。
慢性腎疾患の治療に使用するための請求項１に記載の化合物。
糖尿病性腎疾患の治療に使用するための請求項１に記載の化合物。
請求項１に記載の化合物と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物。
請求項１に記載の化合物を、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するための方法。