JP2017113031A - ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ - Google Patents
ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017113031A JP2017113031A JP2017055763A JP2017055763A JP2017113031A JP 2017113031 A JP2017113031 A JP 2017113031A JP 2017055763 A JP2017055763 A JP 2017055763A JP 2017055763 A JP2017055763 A JP 2017055763A JP 2017113031 A JP2017113031 A JP 2017113031A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sequence
- dna
- complementary
- grna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 title abstract description 190
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 title abstract 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 660
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 586
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 586
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 263
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 242
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 239
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 137
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 48
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 178
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 153
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 153
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 135
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 124
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 98
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 96
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 96
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 82
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 74
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 74
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 72
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 72
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 69
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 68
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 67
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 62
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 57
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 57
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 57
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 57
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 54
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 40
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 38
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 38
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 35
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 32
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 25
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 25
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 23
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 22
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 18
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 18
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 18
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 17
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 14
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 13
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 10
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 9
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 9
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 8
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- -1 tracrRNA Proteins 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 5
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 4
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 4
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 4
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 108010026638 endodeoxyribonuclease FokI Proteins 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 3
- 101100385413 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) csm-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 3
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[3,4,5-trihydroxy-6-[[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxyhexanal Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001495183 Arthrospira sp. Species 0.000 description 2
- 101710201279 Biotin carboxyl carrier protein Proteins 0.000 description 2
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 2
- 241000579895 Chlorostilbon Species 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 2
- 241000192016 Finegoldia magna Species 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 241000187191 Streptomyces viridochromogenes Species 0.000 description 2
- 241000203587 Streptosporangium roseum Species 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 108010067022 Type III Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 102000021178 chitin binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091011157 chitin binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 229940119743 dextran 70 Drugs 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000010976 emerald Substances 0.000 description 2
- 229910052876 emerald Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010050663 endodeoxyribonuclease CreI Proteins 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108010055863 gene b exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 125000000371 nucleobase group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010381 tandem affinity purification Methods 0.000 description 2
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-azido-2-nitroanilino)methyl]-5-(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CNC=2C(=CC(=CC=2)N=[N+]=[N-])[N+]([O-])=O)=C1O KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000007910 Acaryochloris marina Species 0.000 description 1
- 241001135192 Acetohalobium arabaticum Species 0.000 description 1
- 241001464929 Acidithiobacillus caldus Species 0.000 description 1
- 241000605222 Acidithiobacillus ferrooxidans Species 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000640374 Alicyclobacillus acidocaldarius Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000190857 Allochromatium vinosum Species 0.000 description 1
- 241000147155 Ammonifex degensii Species 0.000 description 1
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 1
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000906059 Bacillus pseudomycoides Species 0.000 description 1
- 108010045123 Blasticidin-S deaminase Proteins 0.000 description 1
- 241001600148 Burkholderiales Species 0.000 description 1
- 101150018129 CSF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150069031 CSN2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241001496650 Candidatus Desulforudis Species 0.000 description 1
- 108091005944 Cerulean Proteins 0.000 description 1
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091005960 Citrine Proteins 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241000907165 Coleofasciculus chthonoplastes Species 0.000 description 1
- 241000065716 Crocosphaera watsonii Species 0.000 description 1
- 101150074775 Csf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005943 CyPet Proteins 0.000 description 1
- 241000159506 Cyanothece Species 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101100162704 Emericella nidulans I-AniI gene Proteins 0.000 description 1
- 101000889905 Enterobacteria phage RB3 Intron-associated endonuclease 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000889904 Enterobacteria phage T4 Defective intron-associated endonuclease 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000889900 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000889899 Enterobacteria phage T4 Intron-associated endonuclease 2 Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000326311 Exiguobacterium sibiricum Species 0.000 description 1
- 101710185850 Exodeoxyribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010009832 Exodeoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000009788 Exodeoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101150106478 GPS1 gene Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N His-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 102000008157 Histone Demethylases Human genes 0.000 description 1
- 108010074870 Histone Demethylases Proteins 0.000 description 1
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 1
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 1
- 101000744174 Homo sapiens DNA-3-methyladenine glycosylase Proteins 0.000 description 1
- 101001111984 Homo sapiens N-acylneuraminate-9-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241001430080 Ktedonobacter racemifer Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241001134698 Lyngbya Species 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000501784 Marinobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000204637 Methanohalobium evestigatum Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000192710 Microcystis aeruginosa Species 0.000 description 1
- 101100219625 Mus musculus Casd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023906 N-acylneuraminate-9-phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 241000167285 Natranaerobius thermophilus Species 0.000 description 1
- 241000919925 Nitrosococcus halophilus Species 0.000 description 1
- 241001515112 Nitrosococcus watsonii Species 0.000 description 1
- 241001223105 Nodularia spumigena Species 0.000 description 1
- 241000192673 Nostoc sp. Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000192520 Oscillatoria sp. Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010088535 Pep-1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000983938 Petrotoga mobilis Species 0.000 description 1
- 241001599925 Polaromonas naphthalenivorans Species 0.000 description 1
- 241001472610 Polaromonas sp. Species 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- 229920000604 Polyethylene Glycol 200 Polymers 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101100047461 Rattus norvegicus Trpm8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 241001518258 Streptomyces pristinaespiralis Species 0.000 description 1
- 241000192560 Synechococcus sp. Species 0.000 description 1
- 101150049604 T5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 101710192266 Tegument protein VP22 Proteins 0.000 description 1
- 241000206213 Thermosipho africanus Species 0.000 description 1
- 101000803944 Thermus filiformis DNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000078013 Trichormus variabilis Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001673106 [Bacillus] selenitireducens Species 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940011019 arthrospira platensis Drugs 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011035 citrine Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 101150055601 cops2 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002616 endonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000025608 mitochondrion localization Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000003541 multi-stage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 102220235118 rs1131691530 Human genes 0.000 description 1
- 102200006537 rs121913529 Human genes 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
- C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
本出願は、2014年6月23日に出願された米国仮特許出願第62/015,809号、2014年6月24日に出願された米国仮特許出願第62/016,400号、及び2014年8月13日に出願された米国仮特許出願第62/036,983号の利益を主張し、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の公式コピーは、461002SEQLIST.TXTという名の、2015年6月23日に作製された、66KBのサイズを有するファイルで、ASCII形式の配列表としてEFS−Webを介して電子的に提出され、本明細書と同時に出願される。このASCII形式文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
少なくとも2つの核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を第1のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第1のヌクレアーゼ剤が、第1の標的部位で前記第1の核酸を切断して、第1のダイジェストされた核酸を、前記第1のダイジェストされた核酸と第2の核酸との間におけるオーバーラップ末端配列を伴って産生する、接触させることと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸をエキソヌクレアーゼと接触させて、前記第1のダイジェストされた核酸と前記第2の核酸との間の相補的配列を曝露することと、
(c)工程(b)から生成された2つの核酸断片をアセンブルすることと、を含む、方法。
(項目2)
工程(c)が、
(i)前記曝露された相補的配列をアニーリングすることと、
(ii)前記アニーリングした相補的配列の3’末端を伸長することと、
(iii)前記第1及び前記第2の核酸をライゲーションすることと、を更に含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
工程(a)が、前記第2の核酸を第2のヌクレアーゼ剤と接触させることを更に含み、前記第2の核酸が、前記オーバーラップ末端配列を含まず、前記第2のヌクレアーゼ剤が、第2の標的部位で前記第2の核酸を切断して、第2のダイジェストされた核酸を、前記第1のダイジェストされた核酸と前記第2のダイジェストされた核酸との間における前記オーバーラップ末端配列を伴って産生し、かつ
工程(b)の前記第2の核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸である、項目1又は2に記載の方法。
(項目4)
前記第1のヌクレアーゼ剤及び前記第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、前記第1の標的部位又は前記第2の標的部位を標的とする、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記第1のヌクレアーゼ剤及び前記第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含み、
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質であり、前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含み、前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記オーバーラップ末端配列が、20bp〜200bpの長さの範囲である、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記細菌人工染色体が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、ヒトポリヌクレオチド配列、又はこれらの組み合わせを含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
少なくとも2つの核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を、第1のヌクレアーゼ剤及び第2のヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を産生することであって、前記第1のヌクレアーゼ剤が、第1の標的部位で前記第1の核酸の第1の鎖上に切れ目を生成し、前記第2のヌクレアーゼ剤が、第2の標的部位で前記第1の核酸の第2の鎖上に切れ目を生成して、その両端のうちの1つに5’又は3’オーバーハング配列を含む前記第1のダイジェストされた核酸を産生する、産生することと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記5’又は3’オーバーハング配列に対する相補的配列を含む第2の核酸をアニーリングすることと、
(c)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸をライゲーションすることと、を含む、方法。
(項目11)
工程(b)が、前記第2の鎖を鋳型として使用して前記第1の鎖の3’末端を伸長することと、前記第1の鎖を鋳型として使用して前記第2の鎖の3’末端を伸長することと、を更に含む、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記第1のヌクレアーゼ剤及び前記第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、前記第1の標的部位又は前記第2の標的部位を標的とする、Cas9タンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含む、項目10又は11に記載の方法。
(項目13)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記第1の標的部位が、前記第2の標的部位から少なくとも4bp離れている、項目10〜13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含み、前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目10〜14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
2つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を少なくとも1つのヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を生成することと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸を第2の核酸、結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
(i)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)スペーサーと、
(iii)前記第2の核酸に相補的である第2の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第1及び第2の相補的配列を曝露する、接触させることと、
(c)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
(項目17)
工程(c)におけるアセンブルが、
(i)前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列を前記第1のダイジェストされた核酸に、及び前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列を前記第2の核酸にアニーリングすることと、
(ii)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸にライゲーションすることと、を含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列が、15〜120の相補的塩基を含む、項目16又は17に記載の方法。
(項目19)
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、非相補的核酸を含む、項目16〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2の核酸にシームレスにアセンブルされる、項目16〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記少なくとも1つのヌクレアーゼ剤が、前記第1の核酸の末端から少なくとも20bpの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも20bpの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第1の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第2の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、
したがって、前記第1の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第2の核酸とのアセンブリが、前記少なくとも20bpの断片を再構築し、前記第1の核酸及び前記第2の核酸をシームレスにアセンブルする、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記少なくとも1つのヌクレアーゼ剤が、前記第2の核酸の末端から少なくとも20bpの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも20bpの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第1の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第2の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、
したがって、前記第1の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第2の核酸とのアセンブリが、前記少なくとも20bpの断片を再構築し、前記第1の核酸及び前記第2の核酸をシームレスにアセンブルする、項目20に記載の方法。
(項目23)
前記スペーサーが、約20bp〜約120bpから構成される、項目21又は22に記載の方法。
(項目24)
工程(a)が、前記第2の核酸を、第2のヌクレアーゼ剤及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記第2のヌクレアーゼ剤が、前記第2の核酸を切断して、前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第2のダイジェストされた核酸を産生し、前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目16〜23のいずれか一項に記載の方法。(項目25)
工程(a)が、前記第2の核酸を、制限酵素又はメガヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記制限酵素又はメガヌクレアーゼが、前記第2の核酸を切断して、前記結合体オリゴにおける前記第2の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第2のダイジェストされた核酸を産生し、前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目16〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
工程(b)が、前記第1のダイジェストされた核酸及び/又は前記第2のダイジェストされた核酸の3’末端を伸長することを更に含む、項目24又は25に記載の方法。
(項目27)
前記結合体オリゴが、同じ反応において、前記第1の核酸及び前記第2の核酸にアセンブルされる、項目16〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記結合体オリゴが、連続的に前記第1の核酸及び前記第2の核酸にアセンブルされる、項目16〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記少なくとも1つの前記第1のヌクレアーゼ剤及び/又は前記第2のヌクレアーゼ剤が、前記第1又は前記第2の標的部位を標的とする、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む、項目24〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記第1のヌクレアーゼ剤及び前記第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含み、
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質であり、前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含み、前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目10〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、又はこれらの組み合わせを含む、項目10〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記第1の核酸、前記第2の核酸、又は両方の核酸が、少なくとも10kbである、項目10〜33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記結合体オリゴが、直鎖状2本鎖DNA断片を含む、項目16〜34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記直鎖状2本鎖DNA断片が、選択カセットを含まない、項目35に記載の方法。
(項目37)
2つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を少なくとも1つのヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を生成することと、
(b)第2の核酸を第2のヌクレアーゼ剤と接触させて第2のダイジェストされた核酸を生成することと、
(c)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2のダイジェストされた核酸を、結合体オリゴ及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
(i)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)スペーサーと、
(iii)前記第2のダイジェストされた核酸に相補的である第2の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第1及び第2の相補的配列を曝露する、接触させることと、
(d)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2のダイジェストされた核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、コード化された、及びコード化されないアミノ酸、並びに化学的に若しくは生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。本用語はまた、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなど、修飾されたポリマーも含む。
for Unix(登録商標),Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)を使用して(デフォルト設定を使用、これは、Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482〜489)のアルゴリズムを使用する)、慣用的に決定され得る。
核酸をアセンブルする従来の方法は、制限酵素を用いた従来の酵素ダイジェスト、核酸のクローニング、及び核酸を一緒にライゲーションする、時間を要する工程を採用する(従来の方法及び時系列の例示については図3及び図4を参照されたい)。これらの方法は、大きい断片又はベクターが一緒にアセンブルされるとき、より困難となる。本明細書に提供される方法は、核酸を、迅速なアセンブリ反応において使用するのに適した形態に変換するために、ヌクレアーゼ(例えば、ガイドRNA及びCas9ヌクレアーゼ)の柔軟な標的特異性を利用する。
本方法は、ポリヌクレオチドの部位指向性切断に、ヌクレアーゼ剤を用いる。具体的に、特定された標的部位でのポリヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ切断は、後に第2のポリヌクレオチドに結合されて、部位特異的様式で2つ以上のポリヌクレオチドをアセンブルすることができる末端を伴ってダイジェストされたポリヌクレオチドを産生する。
A1号、同第2005/0064474 A1号、同第2006/0188987 A1号、及び同第2006/0063231 A1号に開示されている(それぞれ参照により本明細書に組み込まれる)。様々な実施形態では、TALエフェクターヌクレアーゼ、例えば、関心のゲノム遺伝子座の標的核酸配列又はその付近で切り離されるように操作され、この標的核酸配列は標的ベクターにより修飾される配列又はその付近にある。本明細書に提供される様々な方法及び組成物と共に使用するのに好適なTALヌクレアーゼは、本明細書に記載される、標的ベクターにより修飾される標的核酸配列又はその付近で結合するように具体的に設計されるものを含む。
本方法は、核酸の部位指向性切断に、CRISPR/Cas系(例えば、gRNA−Cas複合体)を採用し得る。具体的には、特定された標的部位にgRNAにより指向された核酸のCas切断は、後に、部位特異的様式で2つ以上の核酸をアセンブルするために第2の核酸に結合され得る末端を伴ってダイジェストされた核酸を産生する。
Casタンパク質は一般的に、少なくとも1つのRNA認識又は結合ドメインを含む。このようなドメインは、ガイドRNA(gRNA、以下により詳細に記載される)と相互作用し得る。Casタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン(例えば、DNase又はRNaseドメイン)、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインも含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断のための触媒活性を有する。切断は、核酸分子の共有結合の破断を含む。切断は、平滑末端又はねじれ末端を産生することができ、1本鎖又は2本鎖であり得る。
ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)、スト
レプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)、ストレプ
トスポランギウム・ロセウム(Streptosporangium roseum)、ストレプトスポランギウ
ム・ロセウム(Streptosporangium roseum)、アリシクロバチルス・アシドカルダリウ
ス(AlicyclobacHlus acidocaldarius)、バチルス・シュードマイコイデス(Bacillus
pseudomycoides)、バチルス・セレニティレドセンス(Bacillus selenitireducens)、エクシグオバクテリウム・シビリカム(Exiguobacterium sibiricum)、ラクトバチルス・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・サリヴァリゥス(Lactobacillus salivarius)、ミクロシラ・マリナ(Microscilla marina)、バークホルデリア・バクテリウム(Burkholderiales bacterium)、ポラロモナス・ナフタレニボランス(Polaromonas naphthalenivorans)、ポラロモナス種(Polaromonas sp.)、クロコスファエラ・ワトソニイ(Crocosphaera watsonii)、シアノセイス種(Cyanothece sp.)、ミクロキスティス・エルギノーサ(Microcystis aeruginosa)、シネココッカス種(Synechococcus sp.)、アセトハロビウム・アラビティカム(Acetohalobium arabaticum)、アンモニフェックス・デゲンシイ(Ammonifex degensii)、カルディセルロシルプター・ベシイ(Caldicelulosiruptor becscii)、カンジデイタス・デサルホルディス(Candidatus Desulforudis)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、フィネゴルディア・マグナ(Finegoldia magna)、ナトロアナエロビウス・サーモフィルス(Natranaerobius thermophilus)、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム(Pelotomaculum thermopropionicum)、アシディチオバチルス・カルダス(Acidithiobacillus caldus)、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス(Acidithiobacillus ferrooxidans)、
アロクロマチウム・ビノスム(Allochromatium vinosum)、マリノバクター種(Marinobacter sp.)、ニトロソコッカス・ハロフィルス(Nitrosococcus halophilus)、ニト
ロソコッカス・ワトソニイ(Nitrosococcus watsoni)、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス(Pseudoalteromonas haloplanktis)、クテドノバクター・ラセミファ
ー(Ktedonobacter racemifer)、メタノハロビウム・エベスチガータム(Methanohalobium evestigatum)、アナベナ・バリアビリス(Anabaena variabilis)、ノジュラリア・スプミゲナ(Nodularia spumigena)、ノストック種(Nostoc sp.)、アルスロスピ
ラ・マキシマ(Arthrospira maxima)、アルスロスピラ・プラテンシス(Arthrospira platensis)、アルスロスピラ種(Arthrospira sp.)、リングビア種(Lyngbya sp.)
、ミクロコレウス・クソノプラステス(Microcoleus chthonoplastes)、オスキラトリ
ア種(Oscillatoria sp.)、ペトロトガ・モビリス(Petrotoga mobilis)、サーモシ
フォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)、又はアカリオクロリス・マリナ(Acaryochloris marina)に由来し得る。Cas9ファミリーメンバーの更なる例は、国際公
開第WO2014/131833号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。S.ピオゲネス由来又はそこから誘導されたCas9タンパク質が、好ましい酵素である。S.ピオゲネス由来のCas9タンパク質には、SwissProt受入番号Q99ZW2が割当てられている。
「ガイドRNA」又は「gRNA」は、Casタンパク質に結合し、Casタンパク質を標的DNA内の特定の位置に誘導する、RNA分子を含む。ガイドRNA(gRNA)は、「DNA標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」の2つのセグメントを含み得る。「セグメント」は、RNAにおけるヌクレオチドの連続的ストレッチなど、分子のセグメント、部分、又は領域を含む。いくつかのgRNAは、2つの別個のRNA分子:「活性化因子RNA」及び「標的因子(targeter)RNA」を含む。他のgRNAは、単一RNA分子(単一RNAポリヌクレオチド)であり、これは、「単一分子gRNA」、「単一ガイドRNA」、又は「sgRNA」と呼ばれる場合もある。例えば、国際公開第WO/2013/176772A1号、第WO/2014/065596A1号、第WO/2014/089290A1号、第WO/2014/093622A2号、第WO/2014/099750A2号、第WO/2013142578A1号、及び第WO2014/131833A1号を参照されたい(これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる)。用語「ガイドRNA」及び「gRNA」は、2重分子gRNA及び単一分子gRNAの両方を含む。
を形成する配列)、RNAを細胞内位置(例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など)に誘導する修飾又は配列、追跡を提供する修飾又は配列(例えば、蛍光分子への直接抱合、蛍光検出を容易にする部分への抱合、蛍光検出を可能にする配列など)、タンパク質に結合部位を提供する修飾又は配列(例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含むDNAに作用するタンパク質)、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
用語「CRISPR RNA認識配列」は、gRNAのDNA標的化セグメントが結合する標的DNAに存在する核酸配列を含むが、但し、結合のための十分な条件が存在することを条件とする。例えば、CRISPR RNA認識配列は、ガイドRNAが相補性を有するように設計される配列を含み、CRISPR RNA認識配列とDNA標的化配列との間のハイブリダイズは、CRISPR複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではないが、但し、ハイブリダイゼーションをもたらし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在することを条件とする。CRISPR RNA認識配列は、以下により詳細に記載される、Casタンパク質の切断部位も含む。CRISPR RNA認識配列は、例えば、ミトコンドリア又は葉緑体など、細胞の核若しくは細胞質に、又は細胞の細胞小器官内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含み得る。
RNA認識配列の直ぐ5’である)であろう。いくつかの場合では、N1及びN2は相補的であり、N1−N2塩基対は、任意の塩基対(例えば、N1=C及びN2=G、N1=G及びN2=C、N1=A及びN2=T、N1=T及びN2=A)であり得る。
本明細書に開示される方法は、DNA分子を結合して実質的に無傷若しくはシームレスな2本鎖DNA分子を形成するのに十分な条件下で、少なくとも2つの核酸をアセンブルすることができる。オーバーラップ配列を有する関心の任意の核酸は、本明細書に開示される方法に従いアセンブルされ得る。例えば、自然に生じるDNA、クローン化DNA分子、合成的に生成されたDNAなどを含む、オーバーラップ配列を有する関心の任意のDNA分子をアセンブルすることができる。結合されたDNA分子は、所望する場合、本発明の方法を使用して、ベクターにクローン化される(例えば、挿入される)。2つの核酸のアセンブルは、2つの核酸の鎖を結合する任意の方法を含む。例えば、アセンブリは、各核酸からの鎖が他方とアニーリングするように、ダイジェストされた核酸を結合すること、及び伸長を含み、ここで、各鎖は、他方の伸長のための鋳型として機能する。
人工crRNA及び人工tracrRNAを、3kb PCR産物(UB−HYG)とのアセンブリのために、MAID 6177(116kb LTVEC)において特定の配列を標的とするように設計した。PCR産物は、ベクターとの50bpのオーバーラップを含有していた。最初に、crRNA及びtracrRNAをDuplex緩衝液(30mM HEPES、pH7.5、100mM酢酸カリウム)中100uMに溶解する。RNAをアニーリングするために、10ulの100uM crRNA及び10ulの100uM tracrRNAを80ulのアニーリング緩衝液に添加した。90℃の温度のブロックにおいてRNAを加熱し、次に、ヒーターからブロックを取り出し、ベンチ上で冷却する。RNAの最終濃度は約10uMである。
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(配列番号9)である。このCRISPR RNA(crRNA)は、(1)標的配列に相補的なRNAの約20のヌクレオチド、及び(2)tracrRNAにアニーリングされるテイル配列(GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号10))を含有する。
人工crRNA及び人工tracrRNAを、ヒト化HLA−DR BACとのアセンブリのために、ヒト化HLA−DQ BACにおいて特定の配列を標的とするように設計した。ベクターは、各ベクター上の2つの部位でCas9切断により作製された、互いに約70bpのオーバーラップを含有していた(図2を参照)。crRNA及びtracrRNAをHybe緩衝液中100uMに溶解する。RNAをアニーリングするために、10ulの100uM crRNA及び10ulの100uM tracrRNAを80ulのアニーリング緩衝液に添加した。90℃の加熱ブロックにRNAを設置し、次に、ヒーターからブロックを取り出し、ベンチ上で冷却する。RNAの最終濃度は約10uMである。
標的化ベクターを構築するために、pMJ8502xを、2つの同一のcrRNAで切断して、400bp断片及び2283bp Amp骨格を取り出した。(図7)。全反応物の精製には、Qiagenカラムを使用した。次に、R6KZenUbiNeoを、2つの異なるcrRNAで切断して、Neo耐性(1086bp)及び骨格(5390bp)に分離した。全反応物の精製には、Qiagenカラムを使用した。(図7)。切断反応:1170ngのDNA、30ulの緩衝液、4ulのアニーリングしたRNA(100uM)、1.7ulのCas9(0.89ng/ul)、60ulまでのH2O。混合物を37℃で1時間インキュベートし、30ulの溶出緩衝液において溶出する前に、Qiagenカラムで精製した。
ノックアウトマウス標的化ベクターを構築するために、40kbのBAC標的化ベクターを、組換え認識部位に隣接する選択カセットに置き換えた。(図8)。mBACから関心の領域を除去し、選択カセットを挿入するように2つのリンカー(1つは5’用、そして1つは3’用)を設計した。リンカーは、mBACに対する40bpのオーバーラップ、及び選択カセットに対する40bpのオーバーラップを有していた。最初に、以下の反応により、206kbの標的化ベクター(mBAC)のうちの39.5kbを切断した。500ulの反応物(H2Oで増やす):1ulのCas9(0.89ug/ul)、各RNA2本鎖を2ulずつ(50uM)、250ulの緩衝液、220ul(12.5ng)のBAC maxi prepを添加し、37℃で1時間インキュベートする。ダイジェストしたDNAを、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(PCI)抽出を介して精製し、次に、55ulのTE緩衝液に再懸濁した。mBAC切断のPCIクリーンアップ後、50℃で1時間アセンブリを行い、10ulの反応物をDH10B細胞内に電気穿孔した。(図9)。接合部にわたる配列決定により正しいアセンブリが確認された。(図10)。リンカー1(結合体オリゴ1)は、mBAC配列からカセット配列までシームレスである(配列番号12)。リンカー2(結合体オリゴ2)は、カセット配列からmBAC配列までシームレスである(配列番号13)。
BACライゲーションによりヒト遺伝子を挿入するための、マウスゲノム領域に対する相同性アームと制限部位を含有する標的化ベクターを作製するために、Cas9/等温アセンブリにより2つのmBACを縫い合わせることを利用した。この標的化ベクターを、BACライゲーションに用いてヒト化標的化ベクターを作製した。mBACを、以下の反応により切断した:12.5ugのDNA、各アニーリングされたRNAを2ulずつ(50uM)、10ulのCas9(0.89ug/ul)、250ulの緩衝液、500ulまでのH2O。混合物を37℃で1時間インキュベートし、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(PCI)抽出で洗浄し、20ulのTEに再懸濁した。次に、以下の反応により、リンカーを用いて2つのマウスBACを一緒にアセンブルした(図11):6ul(2ug)のbMQ−208A16切断、5.6ul(2ug)のbMQ−50F19切断、各リンカーを0.25ulずつ(50uM)、4.3ul(100ng)の選択カセット(Ubi−Hyg)カセット、12ulの高濃度アセンブリマスターミックス、11.35ulのH2O。反応混合物を50℃で1時間インキュベートし、30℃のH2Oに対して透析した。10ul又は30ulの透析した反応物を使用してDH10B細胞を形質転換した。サンガー配列決定により全ての接合部を確認した。イルミナ配列決定により全ての接合部を確認した(図12及び配列番号17)。リンカー1は、mBACからカセット(配列番号14)までシームレスである。リンカー2は、カセットからmBACまでシームレスではない。プロジェクト設計の通り、ヒトスペーサー配列を組み込んでいる。リンカー3は、mB2からmB3までシームレスではない。PCR検証に使用された固有の配列を組み込んでいる。この領域は、ES電気穿孔のために直線化されたときに除去された(配列番号15)。
Crispr RNA(crRNA)(ssRNAとして注文)は、(1)切断のための標的領域に相補的であるRNAの20ヌクレオチド、及び(2)tracr RNA:<20nt crisprRNA>GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号10)にアニーリングするテイルを含有する。
2X切断緩衝液は、40mM HEPES pH7.5(最終=20mM)、300mM KCl(最終=150mM)、1mM DTT(最終=0.5mM)、0.2mM EDTA(最終=0.1mM)、20mM MgCl2(最終=10mM)を含有する。
ヒト化標的化ベクターを構築するために、MAID 6236を、gRNA−Cas複合体で切断してオーバーラップ配列を伴う切断された断片を生成した。VI568もgRNA−Cas複合体で切断して、MAID6236の断片とオーバーラップする配列を生成した。Cas9/等温アセンブリを、上述のように行い、結果としてヒト化遺伝子座がベクター(VI599)内に挿入された。このプロセスは図14に概説される。
Cas9ダイジェスト及びアセンブリは、選択なしで、例えば、gBlock DNA断片を利用することにより行うこともできる。選択カセットなしで2本鎖DNAを遺伝子座内に追加する可能性を試験するために、gBlock DNA断片を合成し、構築物内に挿入した。図15A及びBに概説するように、Cas9/gRNAを、4.4kbの断片を除去するために、TCRベータ遺伝子座内の2つの部位を標的とするように設計した。gBlockを、メガヌクレアーゼ認識部位を構築物内に導入するように設計した。gBlockは、選択マーカーを使用することなく、構築物内に挿入することができた。図15Aは、PISceI gBlockの挿入を示し、図15Bは、MauBI gBlockの挿入を示す。
図16は、Cas9/等温アセンブリ及び結合体オリゴを使用した直接ヒト化の例を提供する。ヒト断片及びマウス欠失を、Cas9により取り出す(各BACは2つのcrispr RNAを使用する)。ヒト断片及びマウス骨格を、3つのリンカー(結合体オリゴ)及び選択カセットを用いてギブソンアセンブリ反応において一緒に連結させる。
図18は、点変異を導入するためにCas9/等温アセンブリを利用する例を提供する。ドナーは、従来のクローニングにより作製される。選択カセットを、リンカーオーバーラップ及び点変異を含有する合成DNA断片内に挿入する。mBACをCas9で切断し、配列をmBACから除去し、mBACをドナーにギブソンアセンブルし、点変異及び選択カセットを含む構築物(LTVEC)を得る。
図19は、Cas9/等温アセンブリ法を使用したBACトリミングの例を提供する。LTVECから除去する必要がある領域を、Cas9を使用してトリミングする。この例では、BACトリミングによりOri配列を除去する。2つのリンカー(結合体オリゴ)を使用してギブソンアセンブリ反応において、Oriを置き換えられる。
本明細書に提供される方法において以下を含む他の方法が使用され得る。合成又はインビトロ転写tracrRNA及びcrRNAを、95℃に加熱し、室温にゆっくり冷却することにより反応前に予備アニーリングした。10mM MgCl2を含む又は含まないCas9プラスミド切断緩衝液(20mM HEPES(pH7.5)、150mM KCl、0.5mM DTT、0.1mM EDTA)中の精製したCas9タンパク質(50〜500nM)及びtracrRNA:crRNA2本鎖(50〜500nM、1:1)と共に、未変性の又は直線化されたプラスミドDNA(300ng(約8nM))を37℃で60分間インキュベートした。250mM EDTAを含有する5倍DNAローディング緩衝液で反応を停止させ、0.8又は1%アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。Cas9突然変異切断アッセイに関しては、アガロースゲルに充填する前に反応を5倍SDSローティング緩衝液(30%グリセロール、1.2% SDS、250mM EDTA)で停止させた。
NAD、0.02U/μl T5エキソヌクレアーゼ、4U/μl Taq DNAリガーゼ、及び0.03U/μlのPHUSION DNAポリメラーゼの最終濃度が得られた。
本明細書に提供される方法において以下を含む他の方法が使用され得る。合成又はインビトロ転写tracrRNA及びcrRNAを、95℃に加熱し、室温にゆっくり冷却することにより反応前に予備アニーリングした。10mM MgCl2を含む又は含まないCas9プラスミド切断緩衝液(20mM HEPES(pH7.5)、150mM KCl、0.5mM DTT、0.1mM EDTA)中の精製したCas9タンパク質(50〜500nM)及びtracrRNA:crRNA2本鎖(50〜500nM、1:1)と共に、未変性の又は直線化されたプラスミドDNA(300ng(約8nM))を37℃で60分間インキュベートした。250mM EDTAを含有する5倍DNAローディング緩衝液で反応を停止させ、0.8又は1%アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。Cas9突然変異切断アッセイに関しては、アガロースゲルに充填する前に反応を5倍SDSローティング緩衝液(30%グリセロール、1.2% SDS、250mM EDTA)で停止させた。
本明細書に提供される方法において以下を含む他の方法が使用され得る。crRNA及びtracrRNAを、Hybe緩衝液(10X緩衝液:20mMトリス(7.5)、100〜150mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM EDTA、100ug/ml BSA)中100uMに溶解する。RNAをアニーリングするために、10ulの100uM crRNA及び10ulの100uM tracrRNAを80ulのアニーリング緩衝液に添加した。90℃の温度ブロックにおいてRNAを加熱し、次に、ヒーターからブロックを取り出し、ベンチ上で冷却する。RNAの最終濃度は約10uMである。
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(配列番号9)である。このCRISPR RNA(crRNA)は、(1)標的配列に相補的なRNAの約20ヌクレオチド、及び(2)tracrRNAにアニーリングされるテイル配列(GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(配列番号10))を含有する。
(項目1)
少なくとも2つの核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を第1のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第1のヌクレアーゼ剤が、第1の標的部位で前記第1の核酸を切断して、第1のダイジェストされた核酸を、前記第1のダイジェストされた核酸と第2の核酸との間におけるオーバーラップ末端配列を伴って産生する、接触させることと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸をエキソヌクレアーゼと接触させて、前記第1のダイジェストされた核酸と前記第2の核酸との間の相補的配列を曝露することと、
(c)工程(b)から生成された2つの核酸断片をアセンブルすることと、を含む、方法。
(項目2)
工程(c)が、
(i)前記曝露された相補的配列をアニーリングすることと、
(ii)前記アニーリングした相補的配列の3’末端を伸長することと、
(iii)前記第1及び前記第2の核酸をライゲーションすることと、を更に含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
工程(a)が、前記第2の核酸を第2のヌクレアーゼ剤と接触させることを更に含み、前記第2の核酸が、前記オーバーラップ末端配列を含まず、前記第2のヌクレアーゼ剤が、第2の標的部位で前記第2の核酸を切断して、第2のダイジェストされた核酸を、前記第1のダイジェストされた核酸と前記第2のダイジェストされた核酸との間における前記オーバーラップ末端配列を伴って産生し、かつ
工程(b)の前記第2の核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸である、項目1又は2に記載の方法。
(項目4)
前記第1又は第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、前記第1又は前記第2の標的部位を標的とする、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含む、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記オーバーラップ末端配列が、20bp〜200bpの長さの範囲である、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含む、項目4〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記第1の標的部位及び第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目4〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記第1、前記第2、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目1〜10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記細菌人工染色体が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、又はこれらの組み合わせを含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記細菌人工染色体が、ヒト配列を含む、項目11又は12に記載の方法。
(項目14)
少なくとも2つの核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を、第1のヌクレアーゼ剤及び第2のヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を産生することであって、前記第1のヌクレアーゼ剤が、第1の標的部位で前記第1の核酸の第1の鎖上に切れ目を生成し、前記第2のヌクレアーゼ剤が、第2の標的部位で前記第1の核酸の第2の鎖上に切れ目を生成して、その両端のうちの1つに5’又は3’オーバーハング配列を含む第1のダイジェストされた核酸を産生する、産生することと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記5’又は3’オーバーハング配列に対する相補的配列を含む第2の核酸をアニーリングすることと、
(c)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸をライゲーションすることと、を含む、方法。
(項目15)
工程(b)が、前記第2の鎖を鋳型として使用して前記第1の鎖の3’末端を伸長することと、前記第1の鎖を鋳型として使用して前記第2の鎖の3’末端を伸長することと、を更に含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記第1又は第2のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも1つが、前記第1又は前記第2の標的部位を標的とする、Cas9タンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含む、項目13又は14に記載の方法。
(項目17)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記第1の標的部位が、前記第2の標的部位から少なくとも4bp離れている、項目14〜17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含む、項目14〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記第1の標的部位及び第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目14〜19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
2つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を少なくとも1つのヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を生成することと、
(b)前記第1のダイジェストされた核酸を第2の核酸、結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
(i)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)スペーサーと、
(iii)前記第2の核酸に相補的である第2の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第1及び第2の相補的配列を曝露する、接触させることと、
(c)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
(項目22)
工程(c)におけるアセンブルが、
(i)前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列を前記第1のダイジェストされた核酸に、及び前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列を前記第2の核酸にアニーリングすることと、
(ii)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸にライゲーションすることと、を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記結合体オリゴの前記第1の相補的配列及び前記第2の相補的配列が、15〜120の相補的塩基を含む、項目21又は22に記載の方法。
(項目24)
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、非相補的核酸を含む、項目21〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2の核酸にシームレスにアセンブルされる、項目21〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記ヌクレアーゼ剤が、前記第1の核酸の末端から少なくとも20bpの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも20bpの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第1の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第2の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、
したがって、前記第1の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第2核酸とのアセンブリが、前記少なくとも20bpの断片を再構築し、前記第1及び第2の核酸をシームレスにアセンブルする、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記ヌクレアーゼ剤が、前記第2の核酸の末端から少なくとも20bpの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも20bpの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第1の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第2の相補的配列と前記少なくとも20bpの断片との間に存在せず、
したがって、前記第1の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第2の核酸とのアセンブリが、前記少なくとも20bpの断片を再構築し、前記第1及び第2の核酸をシームレスにアセンブルする、項目25に記載の方法。
(項目28)
前記スペーサーが、約20bp〜約120bpから構成される、項目26又は27に記載の方法。
(項目29)
工程(a)が、前記第2の核酸を、第2のヌクレアーゼ剤及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記第2のgRNA−Cas複合体が、前記第2の核酸を切断して、前記結合体オリゴの前記第2の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第2のダイジェストされた核酸を産生し、前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目21〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
工程(a)が、前記第2の核酸を、制限酵素又はメガヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記制限酵素又はメガヌクレアーゼが、前記第2の核酸を切断して、前記結合体オリゴにおける前記第2の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第2のダイジェストされた核酸を産生し、前記第1のダイジェストされた核酸が、前記第2のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目21〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
工程(b)が、前記第1及び/又は前記第2のダイジェストされた核酸の3’末端を伸長することを更に含む、項目21〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記結合体オリゴが、同じ反応において、前記第1の核酸及び前記第2の核酸にアセンブルされる、項目21〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記結合体オリゴが、前記第1の核酸及び前記第2の核酸に連続してアセンブルされる、項目21〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記少なくとも1つのヌクレアーゼ剤及び/又は前記第2のヌクレアーゼ剤が、前記第1又は前記第2の標的部位を標的とする、Casタンパク質及びガイドRNA(gRNA)(gRNA−Cas複合体)を含む、項目21〜33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記Cas9タンパク質が、RuvCドメインと、HNHドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも1つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記gRNAが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復(CRISPR)RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)をコードする核酸配列を含む、項目34〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記第1の標的部位及び第2の標的部位のうちの少なくとも1つが、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)配列に直ぐ隣接している、項目34〜37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記少なくとも1つのヌクレアーゼ剤及び/又は前記第2のヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を含む、項目21〜33のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記第1、前記第2、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目14〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記細菌人工染色体が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、又はこれらの組み合わせを含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記細菌人工染色体が、ヒトポリヌクレオチド配列を含む、項目40又は41に記載の方法。
(項目43)
前記第1、前記第2、又は両方の核酸が、ヒトDNA、ゲッ歯類DNA、合成DNA、又はこれらの組み合わせを含む、項目14〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記第1、前記第2、又は両方の核酸が、少なくとも10kbである、項目21〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記結合体オリゴが、gBlockを含む、項目21〜44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記gBlockが、選択カセットを含まない、項目45に記載の方法。
(項目47)
2つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
(a)第1の核酸を少なくとも1つのヌクレアーゼ剤と接触させて第1のダイジェストされた核酸を生成することと、
(b)第2の核酸を第2のヌクレアーゼ剤と接触させて第2のダイジェストされた核酸を生成することと、
(c)前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2のダイジェストされた核酸を、結合体オリゴ及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
(i)前記第1のダイジェストされた核酸に相補的である第1の相補的配列と、
(ii)スペーサーと、
(iii)前記第2のダイジェストされた核酸に相補的である第2の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第1及び第2の相補的配列を曝露する、接触させることと、
(d)前記結合体オリゴを前記第1のダイジェストされた核酸及び前記第2の核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
Claims (1)
- 本明細書に記載の発明。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462015809P | 2014-06-23 | 2014-06-23 | |
US62/015,809 | 2014-06-23 | ||
US201462016400P | 2014-06-24 | 2014-06-24 | |
US62/016,400 | 2014-06-24 | ||
US201462036983P | 2014-08-13 | 2014-08-13 | |
US62/036,983 | 2014-08-13 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016575030A Division JP6336140B2 (ja) | 2014-06-23 | 2015-06-23 | ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020057300A Division JP6737974B1 (ja) | 2014-06-23 | 2020-03-27 | ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017113031A true JP2017113031A (ja) | 2017-06-29 |
JP2017113031A5 JP2017113031A5 (ja) | 2018-07-26 |
JP6684241B2 JP6684241B2 (ja) | 2020-04-22 |
Family
ID=53525285
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016575030A Active JP6336140B2 (ja) | 2014-06-23 | 2015-06-23 | ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ |
JP2017055763A Active JP6684241B2 (ja) | 2014-06-23 | 2017-03-22 | ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ |
JP2020057300A Active JP6737974B1 (ja) | 2014-06-23 | 2020-03-27 | ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ |
JP2020121876A Active JP7058306B2 (ja) | 2014-06-23 | 2020-07-16 | ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016575030A Active JP6336140B2 (ja) | 2014-06-23 | 2015-06-23 | ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020057300A Active JP6737974B1 (ja) | 2014-06-23 | 2020-03-27 | ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ |
JP2020121876A Active JP7058306B2 (ja) | 2014-06-23 | 2020-07-16 | ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US9738897B2 (ja) |
EP (3) | EP3155099B1 (ja) |
JP (4) | JP6336140B2 (ja) |
KR (2) | KR101822902B1 (ja) |
CN (2) | CN106715694B (ja) |
AU (3) | AU2015280120B2 (ja) |
BR (1) | BR112016030145A8 (ja) |
CA (1) | CA2953499C (ja) |
CY (2) | CY1120520T1 (ja) |
DK (2) | DK3155099T3 (ja) |
ES (2) | ES2666179T3 (ja) |
HK (1) | HK1256688A1 (ja) |
HR (1) | HRP20200523T1 (ja) |
HU (1) | HUE049405T2 (ja) |
IL (1) | IL249612B (ja) |
LT (1) | LT3354732T (ja) |
MX (2) | MX2016016905A (ja) |
NZ (1) | NZ765591A (ja) |
PL (2) | PL3354732T3 (ja) |
PT (2) | PT3155099T (ja) |
RS (1) | RS60366B1 (ja) |
RU (1) | RU2707911C2 (ja) |
SG (2) | SG11201610481YA (ja) |
SI (1) | SI3354732T1 (ja) |
WO (1) | WO2015200334A1 (ja) |
Families Citing this family (94)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
US9068179B1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-30 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting presenilin point mutations |
SI3354732T1 (sl) | 2014-06-23 | 2020-07-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Z nukleazo posredovan DNA sklop |
US20170198268A1 (en) * | 2014-07-09 | 2017-07-13 | Gen9, Inc. | Compositions and Methods for Site-Directed DNA Nicking and Cleaving |
AU2015298571B2 (en) | 2014-07-30 | 2020-09-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
JP7068821B2 (ja) | 2014-12-03 | 2022-05-17 | アジレント・テクノロジーズ・インク | 化学修飾を有するガイドrna |
WO2016109255A1 (en) * | 2014-12-30 | 2016-07-07 | University Of South Florida | Methods and compositions for cloning into large vectors |
AU2016246450B2 (en) | 2015-04-06 | 2022-03-17 | Agilent Technologies, Inc. | Chemically modified guide RNAs for CRISPR/Cas-mediated gene regulation |
BR112017025507A2 (pt) | 2015-05-29 | 2018-08-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | roedor, célula isolada de roedor ou tecido isolado de roedor, célula-tronco embrionária de roedor, embrião de roedor, e, métodos para preparação de um roedor e para identificação de um candidato terapêutico. |
CN108513575A (zh) | 2015-10-23 | 2018-09-07 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器及其用途 |
BR112018011503A2 (pt) | 2015-12-07 | 2018-12-04 | Zymergen Inc | promotores da corynebacterium glutamicum |
US9988624B2 (en) | 2015-12-07 | 2018-06-05 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform |
US11208649B2 (en) | 2015-12-07 | 2021-12-28 | Zymergen Inc. | HTP genomic engineering platform |
KR20230006929A (ko) | 2016-01-13 | 2023-01-11 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 조작된 중쇄 다양성 영역을 갖는 설치류 |
CN116458475A (zh) | 2016-06-03 | 2023-07-21 | 瑞泽恩制药公司 | 表达外源末端脱氧核苷酸转移酶的非人动物 |
US10767175B2 (en) | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
WO2018005655A2 (en) | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Zymergen Inc. | Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof |
JP2019519241A (ja) | 2016-06-30 | 2019-07-11 | ザイマージェン インコーポレイテッド | グルコース透過酵素ライブラリーを生成するための方法およびその使用 |
US20190330659A1 (en) * | 2016-07-15 | 2019-10-31 | Zymergen Inc. | Scarless dna assembly and genome editing using crispr/cpf1 and dna ligase |
CN109803530A (zh) | 2016-07-29 | 2019-05-24 | 瑞泽恩制药公司 | 包含引起c-截短的原纤维蛋白-1表达的突变的小鼠 |
WO2018027078A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
CA3033327A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
US20180105806A1 (en) * | 2016-09-07 | 2018-04-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for rna-guided endonuclease-based dna assembly |
US10704082B2 (en) | 2016-09-15 | 2020-07-07 | ArcherDX, Inc. | Methods of nucleic acid sample preparation |
US10683531B2 (en) | 2016-09-15 | 2020-06-16 | ArcherDX, Inc. | Methods of nucleic acid sample preparation for analysis of cell-free DNA |
RU2760877C2 (ru) | 2016-09-30 | 2021-12-01 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Животные, отличные от человека, характеризующиеся экспансией гексануклеотидных повторов в локусе c9orf72 |
KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
EP4198140A1 (en) | 2016-11-02 | 2023-06-21 | ArcherDX, LLC | Methods of nucleic acid sample preparation for immune repertoire sequencing |
HRP20220888T1 (hr) | 2016-11-04 | 2022-10-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Ne-humane životinje koje imaju konstruirani lokus imunoglobulinskog lamba lakog lanca |
CN110291198A (zh) * | 2016-12-08 | 2019-09-27 | 因特利亚治疗公司 | 经修饰的指导rna |
US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
TW201839136A (zh) | 2017-02-06 | 2018-11-01 | 瑞士商諾華公司 | 治療血色素異常症之組合物及方法 |
KR20190116282A (ko) | 2017-02-10 | 2019-10-14 | 지머젠 인코포레이티드 | 복수의 숙주를 위한 다중 dna 구조체의 조립 및 편집을 위한 모듈식 범용 플라스미드 디자인 전략 |
EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
SG11201908658TA (en) | 2017-03-23 | 2019-10-30 | Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
CA3062334A1 (en) * | 2017-06-01 | 2018-12-06 | Myriad Women's Health, Inc. | Preparation of concatenated polynucleotides |
KR20240013290A (ko) * | 2017-06-12 | 2024-01-30 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 심리스 핵산 어셈블리를 위한 방법 |
US10081829B1 (en) * | 2017-06-13 | 2018-09-25 | Genetics Research, Llc | Detection of targeted sequence regions |
EP3652320A4 (en) * | 2017-07-12 | 2021-04-14 | Mayo Foundation for Medical Education and Research | MATERIALS AND PROCEDURES FOR EFFICIENT TARGETED KNOCK-IN OR GENERAL REPLACEMENT |
US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
MX2020001177A (es) | 2017-07-31 | 2020-09-25 | Regeneron Pharma | Animales no humanos reporteros de crispr y usos de los mismos. |
SG11201912235PA (en) | 2017-07-31 | 2020-01-30 | Regeneron Pharma | Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof |
BR112020003439A2 (pt) * | 2017-08-21 | 2020-08-25 | Tokushima University | tecnologia de alteração específica de sequência alvo usando o reconhecimento alvo nucleotídico |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
MX2020003589A (es) | 2017-09-29 | 2020-07-22 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que comprenden un locus ttr humanizado y metodos de uso. |
CN111757937A (zh) | 2017-10-16 | 2020-10-09 | 布罗德研究所股份有限公司 | 腺苷碱基编辑器的用途 |
SG11202002456WA (en) | 2017-11-30 | 2020-04-29 | Regeneron Pharma | Non-human animals comprising a humanized trkb locus |
HUE060608T2 (hu) | 2017-12-05 | 2023-03-28 | Regeneron Pharma | Genetikailag módosított immunglobulin lambda könnyûlánccal rendelkezõ egerek és azok alkalmazása |
CA3089331A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems |
JP7328243B2 (ja) | 2018-03-26 | 2023-08-16 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類 |
CA3097742A1 (en) * | 2018-04-18 | 2019-10-24 | Ligandal, Inc. | Methods and compositions for genome editing |
WO2019217785A1 (en) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | High-throughput method for characterizing the genome-wide activity of editing nucleases in vitro |
WO2019213910A1 (en) * | 2018-05-10 | 2019-11-14 | Syngenta Participations Ag | Methods and compositions for targeted editing of polynucleotides |
US20190380316A1 (en) | 2018-06-14 | 2019-12-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals capable of engineered dh-dh rearrangement and uses thereof |
CN112703250A (zh) * | 2018-08-15 | 2021-04-23 | 齐默尔根公司 | CRISPRi在高通量代谢工程中的应用 |
AU2019403015B2 (en) | 2018-12-20 | 2024-01-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease-mediated repeat expansion |
DE112020001342T5 (de) | 2019-03-19 | 2022-01-13 | President and Fellows of Harvard College | Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen |
CA3133360A1 (en) | 2019-04-04 | 2020-10-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus |
WO2020206134A1 (en) | 2019-04-04 | 2020-10-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors |
GB201905651D0 (en) * | 2019-04-24 | 2019-06-05 | Lightbio Ltd | Nucleic acid constructs and methods for their manufacture |
EP3966324A1 (en) * | 2019-05-06 | 2022-03-16 | DSM IP Assets B.V. | Multipartite crispr donor |
US11891618B2 (en) | 2019-06-04 | 2024-02-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use |
MX2021014893A (es) | 2019-06-05 | 2022-03-11 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que tienen un repertorio de cadena ligera lambda limitado expresado a partir del locus kappa y usos de estos. |
AU2020289581A1 (en) | 2019-06-07 | 2021-11-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized albumin locus |
EP3990633A1 (en) | 2019-06-25 | 2022-05-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Improved homology dependent repair genome editing |
CN112175939A (zh) * | 2019-07-03 | 2021-01-05 | 华大青兰生物科技(无锡)有限公司 | 一种基于同源序列的核酸拼接方法及其应用 |
GB201913898D0 (en) * | 2019-09-26 | 2019-11-13 | Lightbio Ltd | Nucleic acid construct |
WO2021108363A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele |
EP4085145A4 (en) * | 2019-12-30 | 2024-02-21 | The Broad Institute Inc. | GUIDED EXCISION-TRANSPOSITION SYSTEMS |
EP4096396A1 (en) | 2020-01-28 | 2022-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use |
EP4099821A1 (en) | 2020-02-07 | 2022-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | <smallcaps/>? ? ?klkb1? ? ? ? ?non-human animals comprising a humanizedlocus and methods of use |
CN111334523A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-06-26 | 天津大学 | 一种大尺度dna的体内多轮迭代组装方法 |
WO2021195079A1 (en) | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
EP4146804A1 (en) | 2020-05-08 | 2023-03-15 | The Broad Institute Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
US20220195014A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof |
US20240141399A1 (en) * | 2021-03-01 | 2024-05-02 | The Regents Of The University Of California | Methods for generating a crispr array |
WO2023039586A1 (en) | 2021-09-10 | 2023-03-16 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rnas with chemical modification for prime editing |
CN113782103B (zh) * | 2021-10-26 | 2024-07-09 | 大连大学 | 一种基于组合式酶切机制的dna矩阵处理方法 |
CN118251491A (zh) | 2021-10-28 | 2024-06-25 | 瑞泽恩制药公司 | 用于敲除C5的CRISPR/Cas相关方法及组合物 |
WO2023108047A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mutant myocilin disease model and uses thereof |
US20230257790A1 (en) * | 2022-01-31 | 2023-08-17 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Recombination-based dna assembly methods and compositions |
WO2023150798A1 (en) | 2022-02-07 | 2023-08-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease |
WO2023154861A1 (en) | 2022-02-11 | 2023-08-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents |
WO2023235725A2 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease |
WO2024073679A1 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes |
CN117987436B (zh) * | 2024-04-03 | 2024-06-25 | 南京鸿明生物科技有限公司 | 一种双链靶dna序列的制备方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011512140A (ja) * | 2008-02-15 | 2011-04-21 | シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド | 核酸分子のインビトロでの連結および組み合わせアセンブリのための方法 |
WO2013142578A1 (en) * | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
Family Cites Families (60)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6312892B1 (en) | 1996-07-19 | 2001-11-06 | Cornell Research Foundation, Inc. | High fidelity detection of nucleic acid differences by ligase detection reaction |
US6599692B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
US20030104526A1 (en) | 1999-03-24 | 2003-06-05 | Qiang Liu | Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers |
US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US7105348B2 (en) | 2000-10-31 | 2006-09-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
AU2884102A (en) | 2000-12-07 | 2002-06-18 | Sangamo Biosciences Inc | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
US7273923B2 (en) | 2001-01-22 | 2007-09-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
AU2002225187A1 (en) | 2001-01-22 | 2002-07-30 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger polypeptides and their use |
BRPI0307383B1 (pt) | 2002-01-23 | 2019-12-31 | The Univ Of Utah Research Foundation | método de recombinação genética direcionada em célula de planta hospedeira |
DE60316124T3 (de) | 2002-03-15 | 2018-03-22 | Cellectis | Hybride and einzelkettige meganukleasen und deren anwendungen |
WO2003080809A2 (en) | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
WO2004037977A2 (en) | 2002-09-05 | 2004-05-06 | California Institute Of Thechnology | Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting |
AU2003290518A1 (en) | 2002-09-06 | 2004-04-23 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins |
US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
EP1591521A1 (en) | 2004-04-30 | 2005-11-02 | Cellectis | I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof |
WO2006033859A2 (en) | 2004-09-16 | 2006-03-30 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for protein production |
WO2006097784A1 (en) | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
US20110158974A1 (en) | 2005-03-15 | 2011-06-30 | Cellectis | Heterodimeric Meganucleases and Use Thereof |
BRPI0720048A8 (pt) | 2006-12-14 | 2023-02-07 | Dow Agrosciences Llc | Proteínas de dedo de zinco não-canônicas otimizadas |
EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
AU2010226313B2 (en) | 2009-03-20 | 2014-10-09 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Modification of CXCR4 using engineered zinc finger proteins |
US8772008B2 (en) | 2009-05-18 | 2014-07-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for increasing nuclease activity |
US20120178647A1 (en) | 2009-08-03 | 2012-07-12 | The General Hospital Corporation | Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly |
US8518392B2 (en) | 2009-08-14 | 2013-08-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette |
CA2779858C (en) | 2009-10-29 | 2019-10-29 | Aris N. Economides | Multifunctional alleles |
CN102770539B (zh) | 2009-12-10 | 2016-08-03 | 明尼苏达大学董事会 | Tal效应子介导的dna修饰 |
WO2011101696A1 (en) | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Cellectis | Improved meganuclease recombination system |
GB201009732D0 (en) | 2010-06-10 | 2010-07-21 | Gene Bridges Gmbh | Direct cloning |
WO2012051327A2 (en) | 2010-10-12 | 2012-04-19 | Cornell University | Method of dual-adapter recombination for efficient concatenation of multiple dna fragments in shuffled or specified arrangements |
WO2013141680A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
DK3401400T3 (da) | 2012-05-25 | 2019-06-03 | Univ California | Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-styret mål-dna-modifikation og til rna-styret transskriptionsmodulering |
CN110643600A (zh) | 2012-10-23 | 2020-01-03 | 基因工具股份有限公司 | 用于切割靶dna的系统及其用途 |
JP6620018B2 (ja) * | 2012-12-06 | 2019-12-11 | シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーSigma−Aldrich Co., LLC | Crisprに基づくゲノム修飾および制御 |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
MX2015007550A (es) | 2012-12-12 | 2017-02-02 | Broad Inst Inc | Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas. |
EP3553174A1 (en) | 2012-12-17 | 2019-10-16 | President and Fellows of Harvard College | Rna-guided human genome engineering |
EP2922393B2 (en) | 2013-02-27 | 2022-12-28 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases |
WO2014143381A1 (en) | 2013-03-09 | 2014-09-18 | Agilent Technologies, Inc. | Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple crispr/cas selections of recombineering events |
CN105518146B (zh) | 2013-04-04 | 2022-07-15 | 哈佛学院校长同事会 | 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途 |
US10421957B2 (en) | 2013-07-29 | 2019-09-24 | Agilent Technologies, Inc. | DNA assembly using an RNA-programmable nickase |
ES2681622T3 (es) | 2013-09-18 | 2018-09-14 | Kymab Limited | Métodos, células y organismos |
KR102274445B1 (ko) | 2013-12-19 | 2021-07-08 | 아미리스 인코퍼레이티드 | 게놈 삽입을 위한 방법 |
WO2015116686A1 (en) | 2014-01-29 | 2015-08-06 | Agilent Technologies, Inc. | Cas9-based isothermal method of detection of specific dna sequence |
JP2016006930A (ja) | 2014-06-20 | 2016-01-14 | ソニー株式会社 | 撮像装置および撮像方法 |
SI3354732T1 (sl) | 2014-06-23 | 2020-07-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Z nukleazo posredovan DNA sklop |
US20170198268A1 (en) | 2014-07-09 | 2017-07-13 | Gen9, Inc. | Compositions and Methods for Site-Directed DNA Nicking and Cleaving |
US20160053272A1 (en) | 2014-07-18 | 2016-02-25 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR |
WO2016025759A1 (en) | 2014-08-14 | 2016-02-18 | Shen Yuelei | Dna knock-in system |
AU2015306704A1 (en) | 2014-08-25 | 2017-03-09 | Curza Global, Llc | Method of producing N-alkyl polyamines |
US9447445B2 (en) | 2014-08-27 | 2016-09-20 | New England Biolabs, Inc. | Synthon formation |
CN104357438B (zh) * | 2014-09-23 | 2020-04-24 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种dna组装和克隆的方法 |
CN113215115B (zh) | 2014-12-16 | 2024-07-02 | C3J治疗公司 | 用于体外病毒基因组工程的组合物和方法 |
WO2016109255A1 (en) | 2014-12-30 | 2016-07-07 | University Of South Florida | Methods and compositions for cloning into large vectors |
WO2016130697A1 (en) | 2015-02-11 | 2016-08-18 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Methods and kits for generating vectors that co-express multiple target molecules |
US20190330659A1 (en) | 2016-07-15 | 2019-10-31 | Zymergen Inc. | Scarless dna assembly and genome editing using crispr/cpf1 and dna ligase |
US20180105806A1 (en) | 2016-09-07 | 2018-04-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for rna-guided endonuclease-based dna assembly |
-
2015
- 2015-06-23 SI SI201531144T patent/SI3354732T1/sl unknown
- 2015-06-23 PT PT157358078T patent/PT3155099T/pt unknown
- 2015-06-23 HU HUE18162656A patent/HUE049405T2/hu unknown
- 2015-06-23 US US14/747,461 patent/US9738897B2/en active Active
- 2015-06-23 JP JP2016575030A patent/JP6336140B2/ja active Active
- 2015-06-23 CN CN201580045198.8A patent/CN106715694B/zh active Active
- 2015-06-23 KR KR1020177001792A patent/KR101822902B1/ko active IP Right Grant
- 2015-06-23 DK DK15735807.8T patent/DK3155099T3/en active
- 2015-06-23 PT PT181626565T patent/PT3354732T/pt unknown
- 2015-06-23 AU AU2015280120A patent/AU2015280120B2/en active Active
- 2015-06-23 DK DK18162656.5T patent/DK3354732T3/da active
- 2015-06-23 RS RS20200351A patent/RS60366B1/sr unknown
- 2015-06-23 ES ES15735807.8T patent/ES2666179T3/es active Active
- 2015-06-23 MX MX2016016905A patent/MX2016016905A/es unknown
- 2015-06-23 EP EP15735807.8A patent/EP3155099B1/en active Active
- 2015-06-23 LT LTEP18162656.5T patent/LT3354732T/lt unknown
- 2015-06-23 EP EP18162656.5A patent/EP3354732B1/en active Active
- 2015-06-23 BR BR112016030145A patent/BR112016030145A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-06-23 CA CA2953499A patent/CA2953499C/en active Active
- 2015-06-23 WO PCT/US2015/037199 patent/WO2015200334A1/en active Application Filing
- 2015-06-23 RU RU2017101329A patent/RU2707911C2/ru active
- 2015-06-23 MX MX2021000857A patent/MX2021000857A/es unknown
- 2015-06-23 EP EP19218837.3A patent/EP3708663A1/en active Pending
- 2015-06-23 CN CN202010960987.7A patent/CN112029787A/zh active Pending
- 2015-06-23 SG SG11201610481YA patent/SG11201610481YA/en unknown
- 2015-06-23 PL PL18162656T patent/PL3354732T3/pl unknown
- 2015-06-23 NZ NZ765591A patent/NZ765591A/en unknown
- 2015-06-23 SG SG10201803444YA patent/SG10201803444YA/en unknown
- 2015-06-23 ES ES18162656T patent/ES2781323T3/es active Active
- 2015-06-23 KR KR1020187002009A patent/KR102237151B1/ko active IP Right Grant
- 2015-06-23 PL PL15735807T patent/PL3155099T3/pl unknown
- 2015-10-29 US US14/926,720 patent/US9580715B2/en active Active
-
2016
- 2016-12-18 IL IL249612A patent/IL249612B/en active IP Right Grant
-
2017
- 2017-03-22 JP JP2017055763A patent/JP6684241B2/ja active Active
- 2017-06-30 US US15/638,832 patent/US10273488B2/en active Active
- 2017-08-11 AU AU2017213564A patent/AU2017213564B2/en active Active
-
2018
- 2018-04-17 CY CY20181100409T patent/CY1120520T1/el unknown
- 2018-12-06 HK HK18115673.2A patent/HK1256688A1/zh unknown
-
2019
- 2019-01-08 AU AU2019200094A patent/AU2019200094B2/en active Active
- 2019-03-07 US US16/296,003 patent/US10626402B2/en active Active
-
2020
- 2020-03-11 US US16/815,194 patent/US11932859B2/en active Active
- 2020-03-27 CY CY20201100288T patent/CY1122962T1/el unknown
- 2020-03-27 JP JP2020057300A patent/JP6737974B1/ja active Active
- 2020-03-30 HR HRP20200523TT patent/HRP20200523T1/hr unknown
- 2020-07-16 JP JP2020121876A patent/JP7058306B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011512140A (ja) * | 2008-02-15 | 2011-04-21 | シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド | 核酸分子のインビトロでの連結および組み合わせアセンブリのための方法 |
WO2013142578A1 (en) * | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MOL. CELLS (2013) VOL.35, ISSUE 5, P.359-370, JPN6017020131, ISSN: 0004073813 * |
NAT. METHODS (2009) VOL.6, NO.5, P343-345, ONLINE METHODS, JPN6019026612, ISSN: 0004073812 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6737974B1 (ja) | ヌクレアーゼ媒介dnaアセンブリ | |
US11499164B2 (en) | Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors | |
US20240229048A1 (en) | Nuclease-mediated dna assembly | |
NZ727952B2 (en) | Nuclease-mediated dna assembly |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180614 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180614 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190710 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191009 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200227 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200327 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6684241 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |