JP2017113031A - ヌクレアーゼ媒介ｄｎａアセンブリ - Google Patents

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Abstract

【課題】ヌクレアーゼ媒介ＤＮＡアセンブリを提供すること。
【解決手段】配列特異的ヌクレアーゼ剤（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を使用して少なくとも２つの核酸をアセンブルして相補性を有する末端配列を作製し、続いてオーバーラップ相補的配列をアセンブルするための方法が本明細書において提供される。ヌクレアーゼ剤（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）は、オーバーラップ末端配列を作製するためにｄｓＤＮＡにおいて２本鎖破断を作製することができるか、又は各鎖上に切れ目を作製して相補的なオーバーハング末端配列を生成することができる。本明細書に記載される方法を使用するアセンブリは、オーバーラップ配列を有する任意の核酸をアセンブルすることができ、又は結合体（joiner）オリゴを使用して、相補的末端を伴わない配列をアセンブルすることができる。
【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年６月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／０１５，８０９号、２０１４年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０１６，４００号、及び２０１４年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／０３６，９８３号の利益を主張し、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ ＷＥＢを介したテキストファイルとして
配列表の公式コピーは、４６１００２ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴという名の、２０１５年６月２３日に作製された、６６ＫＢのサイズを有するファイルで、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩ形式文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
歴史的に、オーバーラップ伸長が、オーバーラップ合成オリゴヌクレオチドからより大きい２本鎖ＤＮＡ分子、特に遺伝子を合成する手段として使用され得た。しかしながら、これらの方法では、大きいＤＮＡ分子を速やかかつ効果的に組み合わせることができなかった。更に、オーバーラップ配列を使用する大きい核酸の部位特異的組み合わせは、組み合わされる核酸の所望の位置におけるオーバーラップ配列の利用可能性により制限されることが多い。特定のＤＮＡ配列を標的とするように設計された操作されたヌクレアーゼ酵素が、標的遺伝子の欠失、置換、及び修復、並びに外因性配列の挿入を可能にする遺伝子操作の強力なツールとして関心を集めてきた。しかしながら、既存の技術は、予測できないオフターゲット効果及び時間のかかる多工程反応につながる可能性がある、限られた精度に悩まされている。
本明細書において、オーバーラップ配列を有する核酸をアセンブルするための方法が提供される。このような方法は、（ａ）第１の核酸を第１のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、第１のヌクレアーゼ剤が、第１の標的部位で第１の核酸を切断して、第１のダイジェストされた核酸を、第１のダイジェストされた核酸と第２の核酸との間におけるオーバーラップ末端配列を伴って産生する、接触させることと、（ｂ）第１のダイジェストされた核酸及び第２の核酸をエキソヌクレアーゼと接触させて、第１のダイジェストされた核酸と第２の核酸との間の相補的配列を曝露することと、（ｃ）工程（ｂ）から生成された２つの核酸断片をアセンブルすることと、を含む、少なくとも２つの核酸をアセンブルするための方法を含む。いくつかのこのような方法において、工程（ｃ）は、（ｉ）曝露された相補的配列をアニーリングすることと、（ｉｉ）アニーリングした相補的配列の３’末端を伸長することと、（ｉｉｉ）第１及び第２の核酸をライゲーションすることと、を更に含む。
本方法のいくつかにおいて、工程（ａ）は、第２の核酸を第２のヌクレアーゼ剤と接触させることを更に含み、該第２の核酸は、オーバーラップ末端配列を含まず、該第２のヌクレアーゼ剤は、第２の標的部位で第２の核酸を切断して、第２のダイジェストされた核酸を、第１のダイジェストされた核酸と第２のダイジェストされた核酸との間におけるオーバーラップ末端配列を伴って産生し、かつ工程（ｂ）の第２の核酸は、第２のダイジェストされた核酸である。本方法のいくつかにおいて、オーバーラップ末端配列は、２０ｂｐ〜２００ｂｐの長さの範囲である。
本方法のいくつかにおいて、第１又は第２のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも１つは、第１又は第２の標的部位を標的とするＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み得、これらのうちの少なくとも１つは、エンドヌクレアーゼ活性を欠く。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む。第１の標的部位及び／又は第２の標的部位は、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接していてもよい。本方法のいくつかにおいて、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。
本方法のいくつかにおいて、第１、第２、又は両方の核酸は、細菌人工染色体に由来する。細菌人工染色体は、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含み得る。細菌人工染色体はヒト配列を含み得る。
本明細書に開示される方法は、（ａ）第１の核酸を、第１のヌクレアーゼ剤及び第２のヌクレアーゼ剤と接触させて、第１のダイジェストされた核酸を産生することであって、第１のヌクレアーゼ剤が、第１の標的部位で第１の核酸の第１の鎖上に切れ目を生成し、第２のヌクレアーゼ剤が、第２の標的部位で第１の核酸の第２の鎖上に切れ目を生成して、その両端のうちの１つに５’又は３’オーバーハング配列を含む第１のダイジェストされた核酸を産生する、産生することと、（ｂ）第１のダイジェストされた核酸及び５’又は３’オーバーハング配列に対する相補的配列を含む第２の核酸をアニーリングすることと、（ｃ）第１のダイジェストされた核酸及び第２の核酸をライゲーションすることと、を含む、少なくとも２つの核酸をアセンブルするための方法を含む。本方法のいくつかにおいて、工程（ｂ）は、第２の鎖を鋳型として使用して第１の鎖の３’末端を伸長することと、第１の鎖を鋳型として使用して第２の鎖系の３’末端を伸長することと、を更に含む。本方法のいくつかにおいて、第１の標的部位は、第２の標的部位から少なくとも４ｂｐ離れている。
本方法のいくつかにおいて、第１又は第２のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも１つは、第１又は第２の標的部位を標的とするＣａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を含む。ｇＲＮＡは、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列を含み得る。本方法のいくつかにおいて、第１の標的部位及び第２の標的部位のうちの少なくとも１つは、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接している。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み得、これらのうちの１つは、エンドヌクレアーゼ活性を欠く。
本方法のいくつかにおいて、第２の核酸は、第１のダイジェストされた核酸の５’又は３’オーバーハング配列に対する相補的配列を含まず、工程（ａ）は、第１のダイジェストされた核酸及び第２のダイジェストされた核酸を結合体オリゴと接触させることを更に含み、該結合体オリゴは、（ｉ）第１のダイジェストされた核酸の５’又は３’オーバーハング配列に対する第１の相補的配列、及び（ｉｉ）第２のダイジェストされた核酸の５’又は３’オーバーハング配列に対する第２の相補的配列を含む。いくつかの方法では、第１、第２、又は両方の核酸は、細菌人工染色体に由来する。細菌人工染色体は、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含み得る。細菌人工染色体は、ヒトポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの方法では、第２の核酸は、細菌人工染色体を含む。
提供される方法はまた、（ａ）第１の核酸を少なくとも１つのヌクレアーゼ剤と接触させて第１のダイジェストされた核酸を生成することと、（ｂ）第１のダイジェストされた核酸を第２の核酸、結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、該結合体オリゴが、（ｉ）第１のダイジェストされた核酸に相補的である第１の相補的配列と、（ｉｉ）スペーサーと、（ｉｉｉ）第２の核酸に相補的である第２の相補的配列と、を含み、該エキソヌクレアーゼが、第１及び第２の相補的配列を曝露する、接触させることと、（ｃ）結合体オリゴを第１のダイジェストされた核酸及び第２の核酸とアセンブルすることと、を含む、２つ以上の核酸断片をアセンブルするための方法も含む。いくつかのこのような方法では、工程（ｃ）におけるアセンブルは、（ｉ）結合体オリゴの第１の相補的配列を第１のダイジェストされた核酸に、及び結合体オリゴの第２の相補的配列を第２の核酸にアニーリングすることと、（ｉｉ）結合体オリゴを、第１のダイジェストされた核酸及び第２の核酸にライゲーションすることと、を含む。
いくつかの方法では、結合体オリゴの第１の相補的配列及び第２の相補的配列は、１５〜１２０の相補的塩基を含む。いくつかの方法では、結合体オリゴのスペーサーは、非相補的核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のダイジェストされた核酸は、第２の核酸にシームレスにアセンブルされる。
いくつかの方法では、ヌクレアーゼ剤は、シームレスアセンブリが生じる第１の核酸の末端から少なくとも２０ｂｐの断片を切断するように設計され、結合体オリゴのスペーサーは、該少なくとも２０ｂｐの断片と同一である配列を含み、核酸塩基は、第１の相補的配列と少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、核酸塩基は、第２の相補的配列と少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、したがって、第１の核酸の、該結合体オリゴ及び該第２核酸とのアセンブリは、少なくとも２０ｂｐの断片を再構築し、第１及び第２の核酸をシームレスにアセンブルする。いくつかの方法では、同じ方法が、第２の核酸由来の少なくとも２０ｂｐの断片をスペーサー配列として用いて行われる。いくつかの方法では、スペーサーは、約２０ｂｐ〜約１２０ｂｐから構成される。いくつかの方法では、第２の核酸は、第２のヌクレアーゼ剤及びエキソヌクレアーゼと接触させられ、該第２のヌクレアーゼ剤は、第２の核酸を切断して、結合体オリゴの第２の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生し、該第１のダイジェストされた核酸は、第２のダイジェストされた核酸にアセンブルされる。いくつかの方法では、第２の核酸は、制限酵素又はメガヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼと接触させられ、該制限酵素又はメガヌクレアーゼは、第２の核酸を切断して、結合体オリゴにおける第２の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生し、該第１のダイジェストされた核酸は、第２のダイジェストされた核酸にアセンブルされる。いくつかの方法では、第１及び／又は第２のダイジェストされた核酸の３’末端は、工程（ｂ）において伸長される。結合体オリゴは、同じ反応において、又は連続的に該第１の核酸及び該第２の核酸にアセンブルされ得る。いくつかの方法では、第１、第２、又は両方の核酸は、少なくとも１０ｋｂ細菌人工染色体に由来し、かつ／又はヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む。
本方法のいくつかにおいて、少なくとも１つのヌクレアーゼ剤又は第２のヌクレアーゼ剤は、第１又は第２の標的部位を標的とするＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり得る。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み得、これらのうちの少なくとも１つは、エンドヌクレアーゼ活性を欠く。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む。第１の標的部位及び／又は第２の標的部位は、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接していてもよい。本方法のいくつかにおいて、少なくとも１つのヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。
いくつかの実施形態では、結合体オリゴはｇＢｌｏｃｋを含む。いくつかのこのような方法では、ｇＢｌｏｃｋは、選択カセットを含まない。
２つ以上の核酸をアセンブルするための方法が更に提供され、この方法は、（ａ）第１の核酸を少なくとも１つのヌクレアーゼ剤と接触させて第１のダイジェストされた核酸を生成することと、（ｂ）第２の核酸を第２のヌクレアーゼ剤と接触させて第２のダイジェストされた核酸を生成することと、（ｃ）第１のダイジェストされた核酸及び第２のダイジェストされた核酸を、結合体オリゴ及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、該結合体オリゴが、（ｉ）第１のダイジェストされた核酸に相補的である第１の相補的配列と、（ｉｉ）スペーサーと、（ｉｉｉ）第２のダイジェストされた核酸に相補的である第２の相補的配列と、を含み、該エキソヌクレアーゼが、第１及び第２の相補的配列を曝露する、接触させることと、（ｄ）結合体オリゴを第１のダイジェストされた核酸及び第２の核酸とアセンブルすることと、を含む。
本明細書において、オーバーラップ配列を有する核酸をアセンブルするための方法が提供される。このような方法は、（ａ）オーバーラップ配列を含む第１及び第２の核酸を、少なくとも１つのｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体及びエキソヌクレアーゼと接触させ、それによりそれらの末端のうちの１つに相補的配列を含む２つのダイジェストされた核酸断片を生成する、接触させることと、（ｂ）工程（ａ）から生成された２つの核酸断片をアセンブルすることと、を含む、少なくとも２つの核酸断片をアセンブルするための方法を含む。いくつかの方法では、少なくとも１つのｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体は、第１の標的部位で第１の核酸を切断して、第１のダイジェストされた核酸と第２の核酸との間における相補的末端配列を含む第１のダイジェストされた核酸を産生する。ある特定の方法では、工程（ｂ）は、（ｉ）曝露された相補的配列をアニーリングすることと、（ｉｉ）アニーリングした相補的配列の３’末端を伸長することと、（ｉｉｉ）第１及び第２の核酸をライゲーションすることと、を更に含む。いくつかの方法では、工程（ａ）は、第２の核酸を第２のｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体と接触させることを更に含み、第２の核酸は、オーバーラップ末端配列を含まず、第２のｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体は、第２の核酸を切断して、第１のダイジェストされた核酸と第２のダイジェストされた核酸との間におけるオーバーラップ末端配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生する。例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み得、これらのうちの少なくとも１つは、エンドヌクレアーゼ活性を欠く。いくつかの方法では、オーバーラップ配列は、２０ｂｐ〜２００ｂｐの長さの範囲である。第１、第２、又は両方の核酸は、細菌人工染色体に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。いくつかの方法では、細菌人工染色体は、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む。細菌人工染色体はヒト配列を含み得る。
提供される方法は、（ａ）第１及び第２の核酸を、少なくとも１つのｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体に曝露して、それらの末端のうちの１つに５’又は３’オーバーハング配列を含む第１及び第２のダイジェストされた核酸を生成することと、（ｂ）工程（ａ）から生成された２つの核酸断片をアセンブルすることと、を含む、２つ以上の核酸断片をアセンブルするための方法も含む。いくつかの方法では、アセンブル工程（ｂ）は、（ｉ）５’又は３’オーバーハング配列をアニーリングすることと、（ｉｉ）第１のダイジェストされた核酸及び第２のダイジェストされた核酸をライゲーションすることと、を含む。いくつかの方法では、５’及び／又は３’オーバーハング配列は、少なくとも４つの相補的塩基を含む。いくつかの方法では、工程（ｂ）は、第１及び第２のダイジェストされた核酸の３’末端を伸長することを更に含む。いくつかの方法では、第２の核酸は、第１のダイジェストされた核酸の５’又は３’オーバーハング配列に対する相補的配列を含まず、工程（ａ）は、第１のダイジェストされた核酸及び第２のダイジェストされた核酸を結合体オリゴと接触させることを更に含み、該結合体オリゴは、（ｉ）第１のダイジェストされた核酸の５’又は３’オーバーハング配列に対する第１の相補的配列と、（ｉｉ）第２のダイジェストされた核酸の５’又は３’オーバーハング配列に対する第２の相補的配列と、を含む。いくつかの方法では、ｇＲＮＡ−Ｃａｓタンパク質複合体は、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインを含み、これらのうちの少なくとも１つがエンドヌクレアーゼ活性を欠く、Ｃａｓ９タンパク質を含む。いくつかの方法では、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質として別個に提供される。いくつかの方法では、第１及び第２の核酸は、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。いくつかの方法では、第１、第２、又は両方の核酸は、細菌人工染色体に由来する。いくつかの方法では、細菌人工染色体は、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む。例えば、細菌人工染色体は、ヒトポリヌクレオチド配列を含み得る。
２つ以上の核酸をアセンブルするための方法が更に提供され、この方法は、（ａ）第１の核酸を少なくとも１つのｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体と接触させて第１のダイジェストされた核酸を生成することと、（ｂ）第１のダイジェストされた核酸を第２の核酸、結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、該結合体オリゴが、（ｉ）第１のダイジェストされた核酸に相補的である第１の相補的配列と、（ｉｉ）スペーサーと、（ｉｉｉ）第２の核酸に相補的である第２の相補的配列と、を含み、該エキソヌクレアーゼが、第１及び第２の相補的配列を曝露する、接触させることと、（ｃ）結合体オリゴを第１のダイジェストされた核酸及び第２の核酸とアセンブルすることと、を含む。いくつかの方法では、アセンブル工程（ｃ）は、（ｉ）結合体オリゴの第１の相補的配列を第１のダイジェストされた核酸に、及び結合体オリゴの第２の相補的配列を第２の核酸にアニーリングすることと、（ｉｉ）結合体オリゴを、第１のダイジェストされた核酸及び第２の核酸にライゲーションすることと、を含む。いくつかの方法では、結合体オリゴの第１の相補的配列及び第２の相補的配列は、１５〜１２０の相補的塩基を含む。いくつかの方法では、結合体オリゴのスペーサーは、非相補的核酸を含む。
結合体オリゴを使用して、第１のダイジェストされた核酸は、第２の核酸にシームレスにアセンブルされ得る。いくつかの方法では、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体は、シームレスアセンブリが生じる第１の核酸の末端から少なくとも２０ｂｐの断片を切断するように設計され、結合体オリゴのスペーサーは、該少なくとも２０ｂｐの断片と同一である配列を含み、核酸塩基は、第１の相補的配列と少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、核酸塩基は、第２の相補的配列と少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、したがって、第１の核酸の、該結合体オリゴ及び該第２核酸とのアセンブリは、少なくとも２０ｂｐの断片を再構築し、第１及び第２の核酸をシームレスにアセンブルする。いくつかの方法では、同じ方法が、第２の核酸由来の少なくとも２０ｂｐの断片をスペーサー配列として用いて行われる。いくつかの方法では、スペーサーは、約２０ｂｐ〜約１２０ｂｐから構成される。いくつかの方法では、第２の核酸は、第２のｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体及びエキソヌクレアーゼと接触させられ、第２のｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体は、第２の核酸を切断して、結合体オリゴの第２の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生し、該第１のダイジェストされた核酸は、第２のダイジェストされた核酸にアセンブルされる。いくつかの方法では、第２の核酸は、制限酵素又はメガヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼと接触させられ、該制限酵素又はメガヌクレアーゼは、第２の核酸を切断して、結合体オリゴにおける第２の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生し、該第１のダイジェストされた核酸は、第２のダイジェストされた核酸にアセンブルされる。いくつかの方法では、第１及び／又は第２のダイジェストされた核酸の３’末端は、工程（ｂ）において伸長される。結合体オリゴは、同じ反応において、又は連続的に該第１の核酸及び該第２の核酸にアセンブルされ得る。いくつかの方法では、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体は、Ｃａｓ９タンパク質を含む。いくつかの方法では、第１、第２、又は両方の核酸は、少なくとも１０ｋｂ細菌人工染色体に由来し、かつ／又はヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
少なくとも２つの核酸をアセンブルするための方法であって、
（ａ）第１の核酸を第１のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第１のヌクレアーゼ剤が、第１の標的部位で前記第１の核酸を切断して、第１のダイジェストされた核酸を、前記第１のダイジェストされた核酸と第２の核酸との間におけるオーバーラップ末端配列を伴って産生する、接触させることと、
（ｂ）前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸をエキソヌクレアーゼと接触させて、前記第１のダイジェストされた核酸と前記第２の核酸との間の相補的配列を曝露することと、
（ｃ）工程（ｂ）から生成された２つの核酸断片をアセンブルすることと、を含む、方法。
（項目２）
工程（ｃ）が、
（ｉ）前記曝露された相補的配列をアニーリングすることと、
（ｉｉ）前記アニーリングした相補的配列の３’末端を伸長することと、
（ｉｉｉ）前記第１及び前記第２の核酸をライゲーションすることと、を更に含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
工程（ａ）が、前記第２の核酸を第２のヌクレアーゼ剤と接触させることを更に含み、前記第２の核酸が、前記オーバーラップ末端配列を含まず、前記第２のヌクレアーゼ剤が、第２の標的部位で前記第２の核酸を切断して、第２のダイジェストされた核酸を、前記第１のダイジェストされた核酸と前記第２のダイジェストされた核酸との間における前記オーバーラップ末端配列を伴って産生し、かつ
工程（ｂ）の前記第２の核酸が、前記第２のダイジェストされた核酸である、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記第１のヌクレアーゼ剤及び前記第２のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも１つが、前記第１の標的部位又は前記第２の標的部位を標的とする、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記第１のヌクレアーゼ剤及び前記第２のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも１つが、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質であり、前記ｇＲＮＡが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列を含み、前記第１の標的部位及び前記第２の標的部位のうちの少なくとも１つが、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直ぐ隣接している、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記オーバーラップ末端配列が、２０ｂｐ〜２００ｂｐの長さの範囲である、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記第１の核酸、前記第２の核酸、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記細菌人工染色体が、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ヒトポリヌクレオチド配列、又はこれらの組み合わせを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
少なくとも２つの核酸をアセンブルするための方法であって、
（ａ）第１の核酸を、第１のヌクレアーゼ剤及び第２のヌクレアーゼ剤と接触させて第１のダイジェストされた核酸を産生することであって、前記第１のヌクレアーゼ剤が、第１の標的部位で前記第１の核酸の第１の鎖上に切れ目を生成し、前記第２のヌクレアーゼ剤が、第２の標的部位で前記第１の核酸の第２の鎖上に切れ目を生成して、その両端のうちの１つに５’又は３’オーバーハング配列を含む前記第１のダイジェストされた核酸を産生する、産生することと、
（ｂ）前記第１のダイジェストされた核酸及び前記５’又は３’オーバーハング配列に対する相補的配列を含む第２の核酸をアニーリングすることと、
（ｃ）前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸をライゲーションすることと、を含む、方法。
（項目１１）
工程（ｂ）が、前記第２の鎖を鋳型として使用して前記第１の鎖の３’末端を伸長することと、前記第１の鎖を鋳型として使用して前記第２の鎖の３’末端を伸長することと、を更に含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第１のヌクレアーゼ剤及び前記第２のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも１つが、前記第１の標的部位又は前記第２の標的部位を標的とする、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を含む、項目１０又は１１に記載の方法。
（項目１３）
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み、これらのうちの１つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記第１の標的部位が、前記第２の標的部位から少なくとも４ｂｐ離れている、項目１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ｇＲＮＡが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列を含み、前記第１の標的部位及び前記第２の標的部位のうちの少なくとも１つが、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直ぐ隣接している、項目１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
２つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
（ａ）第１の核酸を少なくとも１つのヌクレアーゼ剤と接触させて第１のダイジェストされた核酸を生成することと、
（ｂ）前記第１のダイジェストされた核酸を第２の核酸、結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
（ｉ）前記第１のダイジェストされた核酸に相補的である第１の相補的配列と、
（ｉｉ）スペーサーと、
（ｉｉｉ）前記第２の核酸に相補的である第２の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第１及び第２の相補的配列を曝露する、接触させることと、
（ｃ）前記結合体オリゴを前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
（項目１７）
工程（ｃ）におけるアセンブルが、
（ｉ）前記結合体オリゴの前記第１の相補的配列を前記第１のダイジェストされた核酸に、及び前記結合体オリゴの前記第２の相補的配列を前記第２の核酸にアニーリングすることと、
（ｉｉ）前記結合体オリゴを前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸にライゲーションすることと、を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記結合体オリゴの前記第１の相補的配列及び前記第２の相補的配列が、１５〜１２０の相補的塩基を含む、項目１６又は１７に記載の方法。
（項目１９）
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、非相補的核酸を含む、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記第１のダイジェストされた核酸が、前記第２の核酸にシームレスにアセンブルされる、項目１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記少なくとも１つのヌクレアーゼ剤が、前記第１の核酸の末端から少なくとも２０ｂｐの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも２０ｂｐの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第１の相補的配列と前記少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第２の相補的配列と前記少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、
したがって、前記第１の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第２の核酸とのアセンブリが、前記少なくとも２０ｂｐの断片を再構築し、前記第１の核酸及び前記第２の核酸をシームレスにアセンブルする、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記少なくとも１つのヌクレアーゼ剤が、前記第２の核酸の末端から少なくとも２０ｂｐの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも２０ｂｐの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第１の相補的配列と前記少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第２の相補的配列と前記少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、
したがって、前記第１の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第２の核酸とのアセンブリが、前記少なくとも２０ｂｐの断片を再構築し、前記第１の核酸及び前記第２の核酸をシームレスにアセンブルする、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記スペーサーが、約２０ｂｐ〜約１２０ｂｐから構成される、項目２１又は２２に記載の方法。
（項目２４）
工程（ａ）が、前記第２の核酸を、第２のヌクレアーゼ剤及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記第２のヌクレアーゼ剤が、前記第２の核酸を切断して、前記結合体オリゴの前記第２の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生し、前記第１のダイジェストされた核酸が、前記第２のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。（項目２５）
工程（ａ）が、前記第２の核酸を、制限酵素又はメガヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記制限酵素又はメガヌクレアーゼが、前記第２の核酸を切断して、前記結合体オリゴにおける前記第２の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生し、前記第１のダイジェストされた核酸が、前記第２のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
工程（ｂ）が、前記第１のダイジェストされた核酸及び／又は前記第２のダイジェストされた核酸の３’末端を伸長することを更に含む、項目２４又は２５に記載の方法。
（項目２７）
前記結合体オリゴが、同じ反応において、前記第１の核酸及び前記第２の核酸にアセンブルされる、項目１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記結合体オリゴが、連続的に前記第１の核酸及び前記第２の核酸にアセンブルされる、項目１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記少なくとも１つの前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、前記第１又は前記第２の標的部位を標的とする、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、項目２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記第１のヌクレアーゼ剤及び前記第２のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも１つが、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質であり、前記ｇＲＮＡが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列を含み、前記第１の標的部位及び前記第２の標的部位のうちの少なくとも１つが、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直ぐ隣接している、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第１の核酸、前記第２の核酸、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目１０〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記第１の核酸、前記第２の核酸、又は両方の核酸が、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む、項目１０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の核酸、前記第２の核酸、又は両方の核酸が、少なくとも１０ｋｂである、項目１０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記結合体オリゴが、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片を含む、項目１６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片が、選択カセットを含まない、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
２つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
（ａ）第１の核酸を少なくとも１つのヌクレアーゼ剤と接触させて第１のダイジェストされた核酸を生成することと、
（ｂ）第２の核酸を第２のヌクレアーゼ剤と接触させて第２のダイジェストされた核酸を生成することと、
（ｃ）前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２のダイジェストされた核酸を、結合体オリゴ及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
（ｉ）前記第１のダイジェストされた核酸に相補的である第１の相補的配列と、
（ｉｉ）スペーサーと、
（ｉｉｉ）前記第２のダイジェストされた核酸に相補的である第２の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第１及び第２の相補的配列を曝露する、接触させることと、
（ｄ）前記結合体オリゴを前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２のダイジェストされた核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
ＢＡＣに特異的であるように設計されたオーバーラップを有するＰＣＲ産物へのＢＡＣのアセンブリを示す。５０ｂｐのオーバーラップがＰＣＲによってＨＹＧカセットに付加された。 各ＢＡＣ上の２つのＣａｓ９標的部位を使用した、オーバーラップ配列を有する２つのＢＡＣのアセンブリを示す。本明細書に開示される方法を用いたアセンブリのプロセスは２日かかった。 従来の方法を用いたオーバーラップ配列を有する２つのＢＡＣのアセンブリを示す。従来の方法を用いたアセンブリのプロセスは４週間かかった。 Ｃａｓ９／等温アセンブリ法のクローニング効率及びＢＡＣクローニング工程に必要な時間を示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系及び等温アセンブリを使用した大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の構築を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で切断されたＤＮＡ断片は、１つ以上の結合体オリゴ及び等温アセンブリを使用してシームレスにアセンブルされた。 Ｃａｓ９切断後に核酸をシームレスにアセンブルするためにリンカー（結合体オリゴ）を使用する戦略を示す。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、関心の領域（矢印）の５’上流に位置する標的部位を切断して、第１のＣａｓ９でダイジェストされたＤＮＡ断片（５’ＤＮＡ）を生成するように設計される。次に、５’ＤＮＡの欠失部分（斜線の入ったボックス）は、結合体オリゴにおいて５’と３’とのオーバーラップ配列間のスペーサーとして使用される。３つの構成成分：（ａ）第１のＣａｓ９でダイジェストされたＤＮＡ断片（５’ＤＮＡ）、（ｂ）結合体オリゴ、及び（ｃ）第２のＤＮＡ断片（３’ＤＮＡ）が等温アセンブリ反応においてアセンブルされる。結合体オリゴは、５’から３’に、（１）５’ＤＮＡとのオーバーラップ配列、（２）第１のダイジェストされた断片の欠失部分を含有するスペーサー、及び（３）３’ＤＮＡとのオーバーラップ配列を含む。５’ＤＮＡの欠失部分は、アセンブリ工程中に再構築される。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系及び等温アセンブリを使用したＤＮＡベクターの構築を示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系及び等温アセンブリを使用した大きい標的化ベクターの構築を示す。 等温アセンブリ及び２つのリンカー（結合体オリゴ）を使用した、ＢＡＣベクターの一部をカセットに置き換えるための標的化ベクターの構築を示す。ｍＢＡＣ対断片又はリンカーの様々な比率の結果を、パネル番号１、番号２、番号３、及び番号４に示す。 ２つのリンカーを使用したｍＢＡＣ（ＢＡＣ ＩＤ：ＲＰ２３−３９９Ｍ１９）とカセットとのアセンブリ反応の両接合部にわたるシームレスアセンブリの配列の確認を示す。 Ｃａｓ９及び等温アセンブリを使用した２つのｍＢＡＣのアセンブリを示す。ヒグロマイシン耐性遺伝子ユビキチンプロモーターを含む、ｂＭＱ５０ｆ１９ベクターとカセットとのアセンブリはシームレスであった。 リンカー１でのシームレスアセンブリの配列の確認、並びにリンカー２及びリンカー３での意図的にシームレスにしなかったアセンブリの配列の確認を示す。 ４つのリンカー及び等温アセンブリを使用した大きいヒト遺伝子断片のｍＢＡＣ上への挿入を示す。Ｃａｓ９は、ｈＧｅｎｅ断片ＡをｈＢＡＣ１から、ｈＧｅｎｅ断片ＢをｈＢＡＣ２から、そしてｍＧｅｎｅ断片を除去するためにｍＢＡＣを切断する。 Ｃａｓ９及び等温アセンブリを使用したヒト配列のＢＡＣベクター内への挿入を示す。 Ｃａｓ９及び等温アセンブリを使用したメガヌクレアーゼ部位を含むｇＢｌｏｃｋの挿入を示す。図１５Ａは、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位を含むｇＢｌｏｃｋの挿入を示し、図１５Ｂは、ＭａｕＢＩ部位を含むｇＢｌｏｃｋの挿入を示す。 ３つの結合体オリゴ、Ｃａｓ９、及び等温アセンブリを使用した、標的化ベクターの直接ヒト化の例を図示する。 上流及び下流の結合体オリゴを有するドナー、Ｃａｓ９、並びに等温アセンブリを使用した、標的化ベクターの間接的ヒト化の例を図示する。 Ｃａｓ９及び等温アセンブリを使用した、点変異の導入の例を図示する。 Ｃａｓ９及び等温アセンブリによるＢＡＣトリミングの例を図示する。この例では、トリミングはＯｒｉ配列を除去する。Ｏｒｉ配列は、２つの結合体オリゴ及び等温アセンブリを使用してベクターに再挿入される。
Ｉ．定義
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、コード化された、及びコード化されないアミノ酸、並びに化学的に若しくは生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。本用語はまた、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなど、修飾されたポリマーも含む。
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はそれらの類似体若しくは修飾型を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらは、１本鎖、２本鎖、及び多重鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びにプリン塩基、ピリミジン塩基、又は他の天然の、化学修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
「コドン最適化」は一般的に、未変性アミノ酸配列を維持しながら、未変性配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子ではより頻繁又は最も頻繁に使用されるコドンに置き換えることにより、特定の宿主細胞における発現の強化ために核酸配列を修飾するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に生じる核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、ゲッ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、又は他の宿主細胞を含む所与の原核生物細胞若しくは真核生物細胞においてより高い頻度で使用されるコドンで置換するように修飾することができる。コドン使用表は、例えば、「コドン使用データベース」で容易に入手可能である。これらの表はいくつかの方法に適応され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２９２を参照されたい。特定の配列を特定の宿主における発現のためにコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照）。
「操作可能な連結」又は「操作可能に連結された」は、両構成要素が正常に機能し、かつこれらの構成要素のうちの少なくとも１つがその他の構成要素のうちの少なくとも１つに影響を及ぼす機能を媒介することができる可能性がもたらされるように、２つ以上の構成要素（例えば、プロモーター及び別の配列要素）を並置することを含む。例えば、プロモーターは、このプロモーターが１つ以上の転写制御因子の存在又は不在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、このコード配列に操作可能に連結されていると言える。
核酸の「相補性」は、核酸のうちの１本の鎖におけるヌクレオチド配列が、その核酸塩基の基の配向により、対向する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡにおける相補的塩基は、典型的には、ＡとＴ及びＣとＧである。ＲＮＡにおいては、それらは、典型的には、ＣとＧ及びＵとＡである。相補性は、完璧であるか、又は実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完璧な相補性は、２つの核酸が、２本鎖の各塩基がワトソン−クリック対合により相補的塩基に結合された２本鎖を形成できることを意味する。「実質的」又は「十分」な相補性は、１本の鎖における配列が、対向する鎖における配列に対して完全にかつ／又は完璧に相補的であるわけではないが、一連のハイブリダイゼーション条件下で（例えば、塩濃度及び温度）安定したハイブリッド複合体を形成するのに十分な結合が２本の鎖上の塩基間に生じることを意味する。このような条件は、シーケンス及び標準的な数学的計算を使用してハイブリダイズされた鎖のＴｍを予想することにより、又は慣用的方法を使用することによるＴｍの経験的決定により予想することができる。Ｔｍは、２本の核酸鎖間に形成されたハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性される温度を含む。Ｔｍを下回る温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成の方が起こり、一方で、Ｔｍを上回る温度では、ハイブリダイゼーション複合体における鎖の融解又は分離の方が起こる。Ｔｍは、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含量を有する核酸に関して、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％ Ｇ＋Ｃ）を使用して推定され得るが、他の既知のＴｍ計算は核酸の構造特徴を考慮する。
「ハイブリダイゼーション条件」は、１本の核酸鎖が相補鎖の相互作用及び水素結合により第２の核酸鎖に結合してハイブリダイゼーション複合体を産生する累積環境を含む。このような条件は、核酸を含有する水溶液若しくは有機溶液中の化学構成要素及びそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、並びに混合物の温度を含む。インキュベーション時間の長さ又は反応チャンバの寸法などの他の要因が、環境に寄与し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．１．９０〜１．９１，９．４７〜９．５１，１ １．４７〜１１．５７（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照されたい。
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、塩基間のミスマッチが可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値が大きくなる。相補性のストレッチが短い（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、又は１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）核酸間のハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置は重要になる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記、１１．７〜１１．８を参照されたい）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小長さは、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び少なくとも約３０ヌクレオチドを含む。更に、温度及び洗浄溶液の塩濃度は、相補性の領域の長さ及び相補性の程度などの要因により必要に応じて調整され得る。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的核酸に対して１００％相補的である必要はない。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は近接セグメントがハイブリダイゼーション事象（例えばループ構造又はヘアピン構造）に関与しないように１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相補性を有し得る。例えば、２０ヌクレオチドのうちの１８が標的領域に相補的であり、したがって、特異的にハイブリダイズするであろうｇＲＮＡは、９０％の相補性を示すだろう。この例において、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化されるか、又は相補的ヌクレオチドに散在してもよく、互いに、又は相補的ヌクレオチドに連続的である必要はない。
核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性パーセントは、当該技術分野において既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９〜６５６）を使用して、又はＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８
ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用して（デフォルト設定を使用、これは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２〜４８９）のアルゴリズムを使用する）、慣用的に決定され得る。
本明細書に提供される方法及び組成物は、様々な異なる構成要素を採用する。いくつかの構成要素が活性バリアント及び断片を有し得ることは本明細書全体を通して認識される。このような構成要素には、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びガイドＲＮＡが含まれる。これらの構成要素のそれぞれの生物学的活性は、本明細書の別の箇所に記載される。
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈において、「配列同一性」又は「同一性」は、指定された比較窓に対する最大対応に対して整合されたときに同じである２つの配列における残基に言及する。配列同一性の百分率がタンパク質に関して使用されるとき、同一ではない残基位置は、アミノ酸残基が類似する化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、したがって、分子の機能特性を変化させない保存的アミノ酸置換により異なっていることが多いと認識される。配列が保存的置換において異なるとき、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するために、上方に調整され得る。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。典型的には、これは、完全なミスマッチではなく、むしろ部分的なミスマッチとして保存的置換をスコア評価することを伴い、それにより、配列同一性の百分率が上昇する。よって、例えば、同一のアミノ酸にスコア１が与えられ、非保存的置換にスコア０が与えられる場合、保存的置換に０〜１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア評価は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実施されるように計算される。
「配列同一性の百分率」は、比較窓にわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較することにより決定された値を含み、比較窓におけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントに関して参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較したとき、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両配列に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を、比較窓の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることにより計算される。
特に明記しない限り、配列同一性／類似性の値は、ＧＡＰバージョン１０を使用して、次のパラメータ：ＧＡＰ重み５０及び長さ重み３、並びにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア評価マトリックスを用いたヌクレオチド配列の同一性％及び類似性％；ＧＡＰ重み８及び長さ重み２、並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコア評価マトリックスを用いたアミノ酸配列の同一性％及び類似性％；又はこれらの任意の同等のプログラムを使用して得た値を含む。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列に関して、ＧＡＰバージョン１０により生成された対応するアライメントと比較したとき、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の一致を有するアライメント及び同一の配列同一性パーセントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
１つ以上の列挙される要素を「備える」又は「含む」組成物又は方法は、具体的に列挙されない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「備える」又は「含む」組成物は、タンパク質を単独で、又は他の成分との組み合わせで含有し得る。
値の範囲の指定は、その範囲内又はその範囲を定義する全ての整数、及びその範囲内の整数により定義される全ての小範囲を含む。
文脈から明らかでない限り、用語「約」は、記載される値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
単数形の冠詞「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈に明確に示されない限り、複数参照を含む。例えば、用語「Ｃａｓタンパク質」又は「少なくとも１つのＣａｓタンパク質」は、それらの混合物を含む、複数のＣａｓタンパク質を含み得る。
ＩＩ．全般
核酸をアセンブルする従来の方法は、制限酵素を用いた従来の酵素ダイジェスト、核酸のクローニング、及び核酸を一緒にライゲーションする、時間を要する工程を採用する（従来の方法及び時系列の例示については図３及び図４を参照されたい）。これらの方法は、大きい断片又はベクターが一緒にアセンブルされるとき、より困難となる。本明細書に提供される方法は、核酸を、迅速なアセンブリ反応において使用するのに適した形態に変換するために、ヌクレアーゼ（例えば、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）の柔軟な標的特異性を利用する。
本明細書において、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などにより、特定の標的部位に指向されるヌクレアーゼ剤（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）により特定の標的部位に指向されるＣａｓタンパク質）を使用して、少なくとも２つの核酸をアセンブルするための方法が提供される。部位指向性ヌクレアーゼ剤、例えば、ガイドＲＮＡ指向性Ｃａｓタンパク質は、それらのエンドヌクレアーゼ活性により生成された末端配列を選択及び操作することにより、核酸の迅速かつ効率的な組み合わせを可能にする。本明細書に提供される方法は、第１のポリヌクレオチドを、所望の標的部位に特異的なヌクレアーゼ剤（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）及びエキソヌクレアーゼと組み合わせる。標的部位は、ヌクレアーゼが核酸を切断するとき、結果として得られる切断により作製された末端が第２の核酸の末端に相補的な領域（例えばオーバーラップ末端）を有するように選択され得る。次に、これらの相補的末端をアセンブルして単一のアセンブルされた核酸を得ることができる。ヌクレアーゼ剤（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）は、個々の標的部位に特異的であるため、本方法は、正確な部位指向性様式で核酸の修飾を可能にする。本方法は、ヌクレアーゼ切断により生成されたオーバーラップ核酸末端を組み合わせるために特別に設計された、又はアセンブリ反応のために設計及び合成された迅速かつ効率的なアセンブリ方法を利用することにより、ヌクレアーゼ剤、例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体の特異性を更に利用する。例えば、切断時に、第２の核酸に相補的な末端配列が産生されるように、標的部位に特異的なヌクレアーゼ剤（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を選択することにより、等温アセンブリをも用いて、ダイジェストされた核酸をアセンブルすることができる。よって、オーバーラップ末端配列をもたらす核酸及びヌクレアーゼ剤（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を選択することにより、核酸は、迅速なコンビナトリアル法によりアセンブルされて、速くかつ効率的な様式で最終的なアセンブルされた核酸を産生することができる。あるいは、相補的末端を有しない核酸は、各核酸に対して相補的末端を有するように設計された結合体オリゴとアセンブルすることができる。結合体オリゴを使用することにより、２つ以上の核酸がシームレスにアセンブルされ、それにより、得られたアセンブルされた核酸における不要な配列を減少させることができる。
ＩＩＩ．ヌクレアーゼ剤
本方法は、ポリヌクレオチドの部位指向性切断に、ヌクレアーゼ剤を用いる。具体的に、特定された標的部位でのポリヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ切断は、後に第２のポリヌクレオチドに結合されて、部位特異的様式で２つ以上のポリヌクレオチドをアセンブルすることができる末端を伴ってダイジェストされたポリヌクレオチドを産生する。
「ヌクレアーゼ剤」は、ＤＮＡ切断の活性を有する分子を含む。本明細書に開示される方法に使用するためのヌクレアーゼ剤の特定の例としては、ＲＮＡ先導型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系、ジンクフィンガータンパク質、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬドメイン、ＴＡＬＥＮ、酵母アセンブリ、リコンビナーゼ、ロイシンジッパー、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、エンドヌクレアーゼ、及び当業者に既知の他のヌクレアーゼ剤が挙げられる。ヌクレアーゼ剤は、所与の標的部位での切断における特異性に関して選択及び設計され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤は、切断されたポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドとの間にオーバーラップ末端を作製する標的部位での切断に関して選択され得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のように、タンパク質及びＲＮＡ要素の両方を有するヌクレアーゼ剤は、両物質がヌクレアーゼ剤として既に複合されて供給され得るか、又はタンパク質とＲＮＡ要素とが別個に供給され得るが、後者の場合、それらは本明細書に記載される反応混合物において複合されてヌクレアーゼ剤を形成する。
用語「ヌクレアーゼ剤の認識部位」は、切れ目又は２本鎖破断がヌクレアーゼ剤によって誘導されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤の認識部位は細胞に内因性（若しくは未変性）であってもよく、又は認識部位は細胞に外因性でありってもよい。特定の実施形態では、認識部位は、細胞に外因性であり、そのため、細胞のゲノムにおいて自然に生じない。また更なる実施形態では、認識部位は、細胞、及び標的遺伝子座に位置付けられることを所望する関心のポリヌクレオチドに外因性である。更なる実施形態では、外因性又は内因性認識部位は、宿主細胞のゲノムにおいて１回のみ存在する。特定の実施形態では、ゲノム内に１回のみ生じる内因性又は未変性部位が特定される。次に、このような部位は、内因性認識部位で切れ目又は２本鎖破断を産生するヌクレアーゼ剤を設計するために使用され得る。
認識部位の長さは変動し得、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対については約３０〜３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮに対して約１５〜１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）については約３６ｂｐ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡについては約２０ｂｐである認識部位を含む。
例示される認識部位の活性バリアント及び断片も提供される。このような活性バリアントは、所与の認識部位に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得、活性バリアントは、生物学的活性を維持し、よって配列特異的様式で、ヌクレアーゼ剤によって認識及び切断されることが可能である。ヌクレアーゼ剤による認識部位の２本鎖破断を測定するためのアッセイは、当該技術分野において既知である（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲ ａｓｓａｙ，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０１０，４７６：２９５〜３０７、参照によその全体が本明細書に組み込まれる）。
特定の実施形態では、認識部位は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内に位置する。このような位置は、選択マーカーのコード領域内、又は選択マーカーの発現に影響を及ぼす調節領域内に位置し得る。よって、ヌクレアーゼ剤の認識部位は、選択マーカーのイントロン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、又は選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの任意の非タンパク質コード領域に位置し得る。特定の実施形態では、認識部位での切れ目又は２本鎖破断は、選択マーカーの活性を破壊する。機能性選択マーカーの存在又は不在をアッセイするための方法は既知である。
切れ目又は２本鎖破断を所望の認識部位に誘導する任意のヌクレアーゼ剤が、本明細書に開示される方法及び組成物において使用され得る。自然に生じる又は未変性のヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤が所望の認識部位で切れ目又は２本鎖破断を誘導する限り、採用することができる。あるいは、修飾又は操作されたヌクレアーゼ剤を採用してもよい。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、その未変性形態から、所望の認識部位において切れ目又は２本鎖破断を特異的に認識及び誘導するように操作された（修飾された又は導かれた）ヌクレアーゼを含む。よって、操作されたヌクレアーゼ剤は、未変性の自然に生じるヌクレアーゼ剤に由来し得るか、又は人工的に作製若しくは合成され得る。ヌクレアーゼ剤の修飾は、タンパク質切断剤におけるわずか１個のアミノ酸、又は核酸切断剤における１つのヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、認識部位で切れ目又は２本鎖破断を誘導するが、この認識部位は、未変性（操作されない、又は未修飾）ヌクレアーゼ剤により認識されたであろう配列ではなかった。認識部位又は他のＤＮＡにおける切れ目又は２本鎖破断の産生は、本明細書において、認識部位又は他のＤＮＡの「切り離し」又は「切断」と称され得る。
次に、これらの破断は、２つの方法：非相同末端結合及び相同指向性修復（相同組換え）のうちの１つで細胞により修復され得る。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）では、２本鎖破断は、破断末端を互いに直接ライゲーションすることにより修復される。そのため、新しい核酸材料はその部位に挿入されないが、一部の核酸材料が損失する可能性があり、欠失をもたらす。相同指向性修復では、切断された標的ＤＮＡ配列に相同性を有するドナーポリヌクレオチドは切断された標的ＤＮＡ配列の修復用の鋳型として使用することができ、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝子情報の伝達をもたらす。したがって、新しい核酸材料がその部位に挿入／コピーされ得る。ＮＨＥＪ及び／又は相同指向性修復による標的ＤＮＡの修飾は、遺伝子補正、遺伝子置き換え、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、遺伝子突然変異などに使用され得る。
一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物又は真核生物のゲノムにおいて、特定の標的配列で２本鎖破断を形成するために使用され得る配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、未変性若しくは操作された転写活性化様（ＴＡＬ）エフェクター又はその機能性部分を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合することにより作製される。独特なモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、潜在的に任意の所与のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計を可能にする。よって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように操作され、よって、所望の標的配列で２本鎖破断を形成するために使用され得る。例えば、国際公開第ＷＯ２０１０／０７９４３０号、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ＆Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８〜４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７〜７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３〜１４８を参照されたい（これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる）。
好適なＴＡＬヌクレアーゼの例、及び好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、米国特許出願第２０１１／０２３９３１５ Ａ１号、同第２０１１／０２６９２３４ Ａ１号、同第２０１１／０１４５９４０ Ａ１号、同第２００３／０２３２４１０ Ａ１号、同第２００５／０２０８４８９ Ａ１号、同第２００５／００２６１５７
Ａ１号、同第２００５／００６４４７４ Ａ１号、同第２００６／０１８８９８７ Ａ１号、及び同第２００６／００６３２３１ Ａ１号に開示されている（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。様々な実施形態では、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、例えば、関心のゲノム遺伝子座の標的核酸配列又はその付近で切り離されるように操作され、この標的核酸配列は標的ベクターにより修飾される配列又はその付近にある。本明細書に提供される様々な方法及び組成物と共に使用するのに好適なＴＡＬヌクレアーゼは、本明細書に記載される、標的ベクターにより修飾される標的核酸配列又はその付近で結合するように具体的に設計されるものを含む。
一実施形態では、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変残基を介して単一の塩基を認識する３３〜３５のＴＡＬ反復を含む。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、独立したヌクレアーゼに操作可能に連結されたＴＡＬ反復に基づくＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一実施形態では、独立したヌクレアーゼはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬ反復に基づくＤＮＡ結合ドメインと、第２のＴＡＬ反復に基づくＤＮＡ結合ドメインと、を含み、第１及び第２のＴＡＬ反復に基づくＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブ単位に操作可能に連結され、第１及び第２のＴＡＬ反復に基づくＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２〜２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖において、２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブ単位は、二量体化して、標的配列で２本鎖破断を形成する活性ヌクレアーゼを作製する。
本明細書に開示される様々な方法及び組成物に採用されるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を更に含み得る。一実施形態では、ＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガーに基づくＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーに基づくＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐのサブサイトに結合する。他の実施形態では、ＺＦＮは、独立したヌクレアーゼに操作可能に連結されたジンクフィンガーに基づくＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一実施形態では、独立したエンドヌクレアーゼはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮと、第２のＺＦＮと、を含み、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブ単位に操作可能に連結され、第１及び第２のＺＦＮは、約５〜７ｂｐのスペーサーによって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖において、２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブ単位は、二量体化して、２本鎖破断を形成する活性ヌクレアーゼを作製する。例えば、米国公開第ＵＳ２００６０２４６５６７号、同第ＵＳ２００８０１８２３３２号、同第ＵＳ２００２００８１６１４号、同第ＵＳ２００３００２１７７６号、国際公開第ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２号、米国公開第ＵＳ２０１３０１２３４８４号、同第ＵＳ２０１００２９１０４８号、国際公開第ＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２号、及びＧａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（７）：３９７〜４０５を参照されたい（これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書に提供される方法の一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、（ａ）ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに融合されるジンクフィンガーに基づくＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質、又は（ｂ）ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに融合される転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含むキメラタンパク質を含む。
また別の実施形態では、ヌクレアーゼ剤はメガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存的配列モチーフに基づき４つのファミリーに分類されており、そのファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１６）、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、及びＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。ＨＥａｓｅｓは、それらの長い認識部位において、及びそれらのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型に耐容性を示すことにおいて知られる。メガヌクレアーゼのドメイン、構造、及び機能は既知であり、例えば、Ｇｕｈａｎ ａｎｄ Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：１９９〜２４８、Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：９６０〜９、Ｊｕｒｉｃａ ａｎｄ Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：１３０４〜２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３８：４９〜９５、及びＭｏｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：７６４を参照されたい。いくつかの例では、自然に生じるバリアント及び／又は操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適な条件、及び／又は認識部位の特異性を修飾するため、並びに活性をスクリーニングするための方法が既知であり、例えば、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２９５２〜６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：８９５〜９０５、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４：９９３〜１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：３８７０〜９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２：３１〜４１、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：４７９１〜８００、Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１５４、国際公開第ＷＯ２００５１０５９８９号、第ＷＯ２００３０７８６１９号、第ＷＯ２００６０９７８５４号、第ＷＯ２００６０９７８５３号、第ＷＯ２００６０９７７８４号、及び第ＷＯ２００４０３１３４６号を参照されたい。
Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃＩＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、又はこれらの任意の活性バリアント又は断片を含むが、これらに限定されない任意のメガヌクレアーゼが本明細書において使用され得る。
一実施形態では、メガヌクレアーゼは、１２〜４０塩基対の２本鎖ＤＮＡ配列を認識する。一実施形態では、メガヌクレアーゼは、ゲノムにおいて、１つの完全に一致した標的配列を認識する。一実施形態では、メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、ホーミングヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１６）ファミリーである。一実施形態では、ホーミングヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１６）ファミリーは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、及びＩ−Ｄｍｏｌから選択される。
ヌクレアーゼ剤は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含む、制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）を更に含み得る。Ｉ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特定の認識部位を認識するが、典型的には、ヌクレアーゼ結合部位から様々な位置で切断され、これは切断部位（認識部位）から数百塩基対離れている場合がある。ＩＩ型系では、制限活性は、いずれのメチラーゼ活性とも無関係であり、切断は、典型的には、結合部位内又はその付近の特定の部位で生じる。大半のＩＩ型酵素は、回文配列を切り離すが、ＩＩａ型酵素は、非回文認識部位を認識し、認識部位の外側で切断し、ＩＩｂ型酵素は、認識部位の外側の両部位で配列を２回切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称認識部位を認識し、片側でかつ認識部位から約１〜２０ヌクレオチドの定義された距離で切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：４１８〜２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：１８０５〜１２、及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ，ｐｐ．７６１〜７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）に更に記載され、分類されている。特定の実施形態では、少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ酵素が、ヌクレアーゼ剤として選択され得、酵素は、適合性のある又は相補的な付着末端を作製する。
様々な方法及び組成物に採用されるヌクレアーゼ剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系も含み得る。このような系は、いくつかの場合において、発現される所望の細胞型のためにコドン最適化されたＣａｓ９ヌクレアーゼを採用し得る。系は、コドン最適化Ｃａｓ９と機能する融合ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物を更に採用する。この単一ＲＮＡは、多くの場合、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡと称される。ｇＲＮＡ内で、ｃｒＲＮＡ部分は、所与の認識部位の「標的配列」として特定され、ｔｒａｃｒＲＮＡは、多くの場合、「足場」と称される。この系は、様々な真核細胞及び原核細胞において機能することが示されている。簡潔には、標的配列を含有する短いＤＮＡ断片がガイドＲＮＡ発現プラスミド内に挿入される。ｇＲＮＡ発現プラスミドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の形態（足場）の標的配列（いくつかの実施形態では約２０ヌクレオチド）、並びに細胞において活性である好適なプロモーター、及び真核細胞において適切な処理に必要な要素を含む。系の多くは、アニーリングされて２本鎖ＤＮＡを形成し、その後、ｇＲＮＡ発現プラスミドにクローン化される、特注の相補的オリゴに依存する。ｇＲＮＡ発現カセット及びＣａｓ９発現カセットは、次に、細胞内に導入される。例えば、Ｍａｌｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３〜６、Ｊｉｎｅｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６〜２１、Ｈｗａｎｇ ＷＹ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２２７〜９、Ｊｉａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２３３〜９、及びＣｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９〜２３を参照されたい（これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書に開示される方法及び組成物は、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ会合（Ｃａｓ）系又はこのような系の構成要素を利用して、細胞内のゲノムを修飾することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ遺伝子の発現又はその活性の指向に関与する転写及び他の要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型系であり得る。本明細書に開示される方法及び組成物は、核酸の部位指向性切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を採用する。
本明細書に開示される方法に使用されるいくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、自然には生じない。「自然には生じない」系は、系の１つ以上の構成要素がそれらの自然に生じる状態から変更若しくは変異されている、それらが自然界において自然に会合される少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まない、又はそれらが自然に会合されない少なくとも１つの他の構成要素と会合しているなど、ヒトの手の関与を示すあらゆるものを含む。例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、自然には一緒に生じないｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む自然に生じないＣＲＩＳＰＲ複合体を採用する。
ヌクレアーゼ剤の活性バリアント及び断片（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）も提供される。このような活性バリアントは、未変性ヌクレアーゼ剤に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得、活性バリアントは、所望の認識部位で切断する能力を維持し、よって、切れ目又は２本鎖破断誘導活性を維持する。例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ剤のいずれも未変性エンドヌクレアーゼ配列から修飾され、未変性ヌクレアーゼ剤によって認識されなかった認識部位を認識し、切れ目又は２本鎖破断を誘導するように設計され得る。よって、いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、対応する未変性ヌクレアーゼ剤の認識部位とは異なる認識部位で、切れ目又は２本鎖破断を誘導するための特異性を有する。切れ目又は２本鎖破断誘導活性のためのアッセイは既知であり、一般的に、認識部位を含有するＤＮＡ基質に対するエンドヌクレアーゼの全体的な活性及び特異性を測定する。
ＩＶ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）
本方法は、核酸の部位指向性切断に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を採用し得る。具体的には、特定された標的部位にｇＲＮＡにより指向された核酸のＣａｓ切断は、後に、部位特異的様式で２つ以上の核酸をアセンブルするために第２の核酸に結合され得る末端を伴ってダイジェストされた核酸を産生する。
「ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体」は、Ｃａｓタンパク質のｇＲＮＡとの複合体を含む。ｇＲＮＡは、切断された核酸と異なる核酸との間におけるオーバーラップ末端を作製する標的部位にＣａｓ切断を指向するように設計又は選択され得る。ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体は、両物質が既に複合されて供給され得るか、又はタンパク質及びＲＮＡ要素が別個に供給され得るが、後者の場合、それらは本明細書に記載される方法及び反応混合物において複合されてｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体を形成する。
Ａ．Ｃａｓ ＲＮＡ先導型エンドヌクレアーゼ
Ｃａｓタンパク質は一般的に、少なくとも１つのＲＮＡ認識又は結合ドメインを含む。このようなドメインは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、以下により詳細に記載される）と相互作用し得る。Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインも含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断のための触媒活性を有する。切断は、核酸分子の共有結合の破断を含む。切断は、平滑末端又はねじれ末端を産生することができ、１本鎖又は２本鎖であり得る。
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１又はＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、並びにこれらの相同体又は修飾型が挙げられる。
切れ目又は２本鎖破断を所望の認識部位に誘導する任意のＣａｓタンパク質が、本明細書に開示される方法及び組成物において使用され得る。自然に生じる又は未変性Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質が所望の認識部位に２本鎖破断を誘導する限り採用することができる。あるいは、修飾又は操作されたＣａｓタンパク質を採用してもよい。「操作されたＣａｓタンパク質」は、その未変性形態から、所望の認識部位において切れ目又は２本鎖破断を特異的に認識及び誘導するように操作された（修飾された又は導かれた）Ｃａｓタンパク質を含む。よって、操作されたＣａｓタンパク質は、未変性の自然に生じるＣａｓタンパク質に由来し得るか、又は人工的に作製若しくは合成され得る。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、構造が保存された４つの主なモチーフを共有する。モチーフ１、２、及び４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡを切断して２本鎖破断を産生する。次に、これらの破断は、２つの方法：非相同末端結合及び相同指向性修復（相同組換え）のうちの１つで細胞により修復され得る。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）では、２本鎖破断は、破断末端を互いに直接ライゲーションすることにより修復される。そのため、新しい核酸材料はその部位に挿入されないが、一部の核酸材料が損失する可能性があり、欠失をもたらす。相同指向性修復では、切断された標的ＤＮＡ配列に相同性を有するドナーポリヌクレオチドは切断された標的ＤＮＡ配列の修復用の鋳型として使用することができ、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝子情報の伝達をもたらす。したがって、新しい核酸材料がその部位に挿入／コピーされ得る。ＮＨＥＪ及び／又は相同指向性修復による標的ＤＮＡの修飾は、遺伝子補正、遺伝子置き換え、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、遺伝子突然変異などに使用され得る。
Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するものであり得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質又はＣａｓ９タンパク質に由来し得る。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、構造が保存された４つの主なモチーフを共有する。モチーフ１、２、及び４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス種（Streptococcus sp.）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ノカルジオプシス・ダソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス・プリスチナスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、
ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、スト
レプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプ
トスポランギウム・ロセウム（Streptosporangium roseum）、ストレプトスポランギウ
ム・ロセウム（Streptosporangium roseum）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウ
ス（AlicyclobacHlus acidocaldarius）、バチルス・シュードマイコイデス（Bacillus
pseudomycoides）、バチルス・セレニティレドセンス（Bacillus selenitireducens）、エクシグオバクテリウム・シビリカム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・サリヴァリゥス（Lactobacillus salivarius）、ミクロシラ・マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリア・バクテリウム（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス種（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス種（Cyanothece sp.）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス種（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラビティカム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェックス・デゲンシイ（Ammonifex degensii）、カルディセルロシルプター・ベシイ（Caldicelulosiruptor becscii）、カンジデイタス・デサルホルディス（Candidatus Desulforudis）、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトロアナエロビウス・サーモフィルス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、アシディチオバチルス・カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、
アロクロマチウム・ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター種（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニト
ロソコッカス・ワトソニイ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクター・ラセミファ
ー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノジュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック種（Nostoc sp.）、アルスロスピ
ラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アルスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アルスロスピラ種（Arthrospira sp.）、リングビア種（Lyngbya sp.）
、ミクロコレウス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オスキラトリ
ア種（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシ
フォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、又はアカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）に由来し得る。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの更なる例は、国際公
開第ＷＯ２０１４／１３１８３３号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｓ．ピオゲネス由来又はそこから誘導されたＣａｓ９タンパク質が、好ましい酵素である。Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９タンパク質には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号Ｑ９９ＺＷ２が割当てられている。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、自然界において生じるもの）、修飾されたＣａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、又は野生型若しくは修飾されたＣａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型又は修飾されたＣａｓタンパク質の活性バリアント又は断片であってもよい。活性バリアント又は断片は、野生型又は修飾されたＣａｓタンパク質又はその一部に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得、活性バリアントは、所望の切断部位で切り離す能力を維持し、よって、切れ目誘導又は２本鎖破断誘導活性を維持する。切れ目誘導又は２本鎖破断誘導活性のためのアッセイは既知であり、一般的に、切断部位を含有するＤＮＡ基質に対するＣａｓタンパク質の全体的な活性及び特異性を測定する。
Ｃａｓタンパク質は、核酸の結合親和性、核酸の結合特異性、及び／又は酵素活性を増加又は減少させるように修飾され得る。Ｃａｓタンパク質は、安定性などの、タンパク質の任意の他の活性又は特性を変更するようにも修飾され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインは、修飾、欠失、若しくは不活性化され得るか、又はＣａｓタンパク質は、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するように、若しくはＣａｓタンパク質の活性を最適化する（例えば、強化若しくは低下させる）ように、切断され得る。
いくつかのＣａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなど、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインはそれぞれ、ＤＮＡに２本鎖破断を形成するよう２本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切り離すことができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６〜８２１を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ヌクレアーゼドメインのうちの１つ又は両方は、これらがもはや機能性ではないか、又は減少したヌクレアーゼ活性を有するように欠失又は変異され得る。ヌクレアーゼドメインのうちの１つが欠失又は変異される場合、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ニッカーゼと称される場合があり、２本鎖ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列で１本鎖破断を生成することができるが、２本鎖破断を生成することはできない（すなわち、相補鎖又は非相補鎖を切断できるが、両方はできない）。ヌクレアーゼドメインの両方が欠失又は変異される場合、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、２本鎖ＤＮＡの両鎖を切断する能力が減少する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の例は、Ｓ．ピオゲネス由来Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位でアスパラギン酸塩からアラニンへの）突然変異である。同様に、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位でヒスチジンからアラニンへの）又はＨ８４０Ａ（アミノ酸８４０位でヒスチジンからアラニンへの）により、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の他の例としては、Ｓ．サーモフィルス由来のＣａｓ９への対応する突然変異が挙げられる。例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：９２７５〜９２８２及び国際公開第ＷＯ２０１３／１４１６８０号を参照されたい（これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。このような突然変異は、部位指向性突然変異誘発、ＰＣＲ媒介突然変異誘発、又は全遺伝子合成などの方法を使用して生成され得る。ニッカーゼを作製する他の突然変異の例は、例えば、国際公開第ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１号及び第ＷＯ／２０１３／１４２５７８Ａ１号に見出すことができ、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓタンパク質は融合タンパク質でもあり得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、又は転写抑制因子ドメインに融合され得る。国際公開第ＷＯ ２０１４／０８９２９０号を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｃａｓタンパク質は、増加又は減少した安定性を提供する異種ポリペプチドにも融合され得る。融合ドメイン又は異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端に、又はＣａｓタンパク質の内部に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在を提供する異種ポリペプチドに融合され得る。このような異種ペプチドは、例えば、核を標的とするＳＶ４０ ＮＬＳなどの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保留シグナルなどを含む。例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１〜５１０５を参照されたい。このような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこかに位置し得る。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸のストレッチを含み得、単一分節（monopartite）配列又は二分節（bipartite）配列であり得る。
Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ドメインにも連結され得る。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、国際公開第ＷＯ２０１４／０８９２９０号を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこかに位置し得る。
Ｃａｓタンパク質は、蛍光タンパク質、精製タグ、又はエピトープタグなどの追跡又は精製を容易にするための異種ポリペプチドも含み得る。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、モノマーＡｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−モノマー、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、得られるヌクレアーゼ活性が変更されるように修飾され得る。Ｃａｓにおけるある特定の突然変異は、ヌクレアーゼが標的ＤＮＡの相補及び非相補鎖の両方を切断する能力を減少させ得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性が相補鎖又は非相補鎖のいずれかの切断に限定されるように、既知の位置で変異され得る。具体的には、Ｄ１０Ａ（Ｃａｓ９のアミノ酸１０位でのアスパラギ酸塩からアラニンへの）突然変異を有するＣａｓ９は、標的ＤＮＡの相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が減少する。いくつかの実施形態では、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位でのヒスチジンからアラニンへの）突然変異を有するＣａｓ９は、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力が減少する。Ｄ１０Ａ又はＨ８４０Ａのいずれかの突然変異を有するＣａｓ９のヌクレアーゼ活性は、ＤＳＢではなく１本鎖破断（ＳＳＢ）をもたらすだろう。他の残基が同じ作用（すなわち、一方又は他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する）を達成するように変異されてもよい。非限定的な例としては、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／又はＡ９８７である（すなわち、置換される）。更に、アラニン以外の置換アミノ酸が好適な場合がある。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼが減少した活性を有するとき（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がＤ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／又はＤ９８６ＡなどのＤ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／又はＡ９８７突然変異を有するとき）、ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡと相互作用する能力を維持する限り、ｇＲＮＡによって尚も標的ＤＮＡ配列に先導されるため、部位特異的様式で尚も標的ＤＮＡに結合することができる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、ヌクレアーゼが標的ＤＮＡの相補又は非相補鎖のいずれかを切断しないように変更される。例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ突然変異の両方を有するＣａｓ９は、標的ＤＮＡの相補及び非相補鎖の両方を切断する能力が減少する。他の残基が同じ作用（すなわち、一方又は他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する）を達成するように変異されてもよい。非限定的な例としては、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／又が、ヌクレアーゼ活性を実質的に排除するために置換され得る。更に、アラニン置換以外の突然変異が好適な場合がある。
用語「標的部位」又は「標的配列」は、互換的に使用され得、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列を含むが、但し、結合のための十分な条件が存在することを条件とする。例えば、標的ＤＮＡ内の標的部位（又は標的配列）は、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡの標的となる（又はそれにより結合される、又はそれとハイブリダイズする、又はそれに相補的である）。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件は、細胞に通常存在する生理学的条件を含む。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は当該技術分野において既知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたい）。Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的であり、それとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と称され、「相補鎖」に相補的である標的ＤＮＡの鎖（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡには相補的ではない）は、「非相補鎖」又は「鋳型鎖」と称される。
Ｃａｓタンパク質は、標的配列内又は標的配列の外側の部位で核酸を切断し得る。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が１本鎖破断又は２本鎖破断を産生する核酸の位置を含む。Ｃａｓタンパク質が２本鎖破断を産生する場合、切断部位は核酸の両鎖上の同じ位置であるか（平滑末端を産生する）、又は各鎖上の異なる部位であり得る（付着又は貼着性末端を産生する）。付着末端は、各鎖上の切断部位で１本鎖破断を産生する２つのＣａｓタンパク質を使用することによっても産生され得る。Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの部位特異的切断は、標的ＤＮＡにおいて、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対相補性、及び（ｉｉ）プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフの両方により決定される位置で生じ得る。例えば、Ｃａｓ９の切断部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０又は約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）上流であり得る。いくつかの実施形態では（例えば、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９又は密接に関係のあるＣａｓ９が使用されるとき）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＸＧＧ−３’（ここで、Ｘは、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、Ｘは、標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列の直ぐ３’である）であり得る。このため、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＹ−３’（ここで、Ｙは、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、Ｙは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の直ぐ５’である）であろう。いくつかのこのような実施形態では、Ｘ及びＹは相補的であってもよく、Ｘ−Ｙ塩基対は、任意の塩基対（例えば、Ｘ＝Ｃ及びＹ＝Ｇ、Ｘ＝Ｇ及びＹ＝Ｃ、Ｘ＝Ａ及びＹ＝Ｔ、Ｘ＝Ｔ及びＹ＝Ａ）であり得る。
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合されるＣａｓタンパク質など、タンパク質の形態で提供され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））又はＤＮＡなど、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供され得る。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞又は生物においてタンパク質を効率的に翻訳するためにコドン最適化され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、自然に生じるポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、ゲッ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、又は任意の他の関心の宿主細胞においてより高い頻度で使用されるコドンを置換するように修飾され得る。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞内に導入されるとき、Ｃａｓタンパク質は、細胞において一時的に、条件に応じて、又は構成的に、発現され得る。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞の活性プロモーターに操作可能に連結され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物のプロモーターに操作可能に連結され得る。発現構築物は、関心の遺伝子又は他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指向することが可能であり、このような関心の核酸配列を標的細胞に伝達することができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核酸インサートを含む標的化ベクター及び／若しくはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターに存在し得るか、又は核酸インサートを含む標的化ベクターから分離される、及び／若しくはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターから分離されるベクター又はプラスミドに存在し得る。発現構築物において使用され得るプロモーターは、例えば、多能性ラット、真核、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、ゲッ歯類、マウス、又はハムスター細胞における活性プロモーターを含む。このようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであり得る。他のプロモーターの例は、本明細書の別の箇所に記載される。
Ｂ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に誘導する、ＲＮＡ分子を含む。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、「ＤＮＡ標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントを含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡにおけるヌクレオチドの連続的ストレッチなど、分子のセグメント、部分、又は領域を含む。いくつかのｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子：「活性化因子ＲＮＡ」及び「標的因子（targeter）ＲＮＡ」を含む。他のｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、これは、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる場合もある。例えば、国際公開第ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１号、第ＷＯ／２０１４／０６５５９６Ａ１号、第ＷＯ／２０１４／０８９２９０Ａ１号、第ＷＯ／２０１４／０９３６２２Ａ２号、第ＷＯ／２０１４／０９９７５０Ａ２号、第ＷＯ／２０１３１４２５７８Ａ１号、及び第ＷＯ２０１４／１３１８３３Ａ１号を参照されたい（これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）。用語「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」は、２重分子ｇＲＮＡ及び単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な２重分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」若しくは「標的因子ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」若しくは「ｃｒＲＮＡ反復」）分子、及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」若しくは「活性化因子ＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」若しくは「足場」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメンチ（１本鎖）、及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ２本鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチの両方を含む。対応するｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ２本鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチに相補的であり、それとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ２本鎖を形成する。このため、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言うことができる。ｃｒＲＮＡは加えて、１本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。したがって、ｇＲＮＡは、標的配列にハイブリダイズする配列及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（対応する対として）はハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡは加えて、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする１本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。細胞内の修飾のために使用される場合、所与のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的であるように設計され得る。例えば、Ｍａｌｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３〜６、Ｊｉｎｅｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６〜２１、Ｈｗａｎｇ ＷＹ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２２７〜９、Ｊｉａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２３３〜９、及びＣｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９〜２３を参照されたい（これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基の対合）を介して、配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。このため、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変動し得、ｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。対象ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾され得る。自然に生じるｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９系及び生物により異なるが、２１〜７２ヌクレオチドの長さの標的化セグメントを含有することが多く、２１〜４６のヌクレオチドの長さの２つの直接反復（ＤＲ）に隣接する（例えば、国際公開第ＷＯ２０１４／１３１８３３号を参照されたい）。Ｓ．ピオゲネスの場合、ＤＲは３６ヌクレオチドの長さであり、標的化セグメントは３０ヌクレオチドの長さである。３’に位置するＤＲは、同時にＣａｓ９タンパク質に結合する、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、それとハイブリダイズする。
ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、又は約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有し得る。あるいは、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有し得る。
標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列）に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化配列（例えば、標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列に相補的であるＤＮＡ標的化セグメント内の配列）は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、又は少なくとも約４０ｎｔの長さを有し得る。あるいは、標的ＤＮＡの標的配列に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有し得る。標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的化配列）は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有し得る。いくつかの場合では、ＤＮＡ標的化配列は、少なくとも約２０ｎｔの長さを有し得る。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び様々な長さのものであり得る。それらは、一次転写産物又は加工形態を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、又は２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全て若しくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５以上又は約それ以上のヌクレオチド）を含むか、又はそれらからなり得る。Ｓ．ピオゲネス由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、及び６５ヌクレオチド型が挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２〜６０７、国際公開第ＷＯ ２０１４／０９３６６１号を参照されたい（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、及び＋８５型内に見られるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。米国特許第ＵＳ８，６９７，３５９号を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の最も５’の７つの連続するヌクレオチドに対して１００％である。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性パーセントは、約２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも６０％であり得る。例として、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の最も５’末端の１４の連続するヌクレオチドに対して１００％であり、残部に対しては限りなく０％である。このような場合では、ＤＮＡ標的化配列は、長さが１４ヌクレオチドであると考えられ得る。別の例として、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の最も５’末端の７つの連続するヌクレオチドに対して１００％であり、残部に対しては限りなく０％である。このような場合では、ＤＮＡ標的化配列は、長さが７ヌクレオチドであると考えられ得る。
核酸の相補性は、核酸の１鎖におけるヌクレオチド配列が、その核酸塩基の基の配向により、対向する核酸鎖上の別の配列に水素結合することを意味する。相補的塩基は典型的には、ＤＮＡにおいては、ＡとＴ、及びＣとＧである、ＲＮＡにおいては、ＣとＧ、及びＵとＡである。相補性は、完璧であるか、又は実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完璧な相補性は、２つの核酸が、２本鎖の各塩基がワトソン−クリック対合により相補的塩基に結合された２本鎖を形成できることを意味する。「実質的」又は「十分」な相補性は、１本の鎖における配列が、対向する鎖における配列に対して完全にかつ／又は完璧に相補的であるわけではないが、一連のハイブリダイゼーション条件下で（例えば、塩濃度及び温度）安定したハイブリッド複合体を形成するのに十分な結合が２本の鎖上の塩基間に生じることを意味する。このような条件は、シーケンス及び標準的な数学的計算を使用してハイブリダイズされた鎖のＴｍを予想することにより、又は慣用的方法を使用することによるＴｍの経験的決定により予想することができる。Ｔｍは、２本の核酸鎖間に形成されたハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性される温度を指す。Ｔｍを下回る温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成の方が起こり、一方で、Ｔｍを上回る温度では、ハイブリダイゼーション複合体における鎖の融解又は分離の方が起こる。Ｔｍは、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含量を有する核酸に関して、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％ Ｇ＋Ｃ）を使用して推定され得るが、他の既知のＴｍ計算は核酸の構造特徴を考慮する。
「ハイブリダイゼーション条件」は、１本の核酸鎖が相補鎖の相互作用及び水素結合により第２の核酸鎖に結合してハイブリダイゼーション複合体を産生する累積環境を指す。このような条件は、核酸を含有する水溶液若しくは有機溶液の化学構成要素及びそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、並びに混合物の温度を含む。インキュベーション時間の長さ又は反応チャンバの寸法などの他の要因が環境に寄与し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．１．９０〜１．９１，９．４７〜９．５１，１ １．４７〜１１．５７（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９））。
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、塩基間のミスマッチが可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値が大きくなる。相補性のストレッチが短い（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、又は１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）核酸間のハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置は重要になる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記、１１．７〜１１．８を参照されたい）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小長さは、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び少なくとも約３０ヌクレオチド）である。更に、温度及び洗浄溶液の塩濃度は、相補性の領域の長さ及び相補性の程度などの要因により必要に応じて調整され得る。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的核酸に対して１００％相補的である必要はない。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は近接セグメントがハイブリダイゼーション事象（例えばループ構造又はヘアピン構造）に関与しないように１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相補性を有し得る。例えば、ｇＲＮＡの２０ヌクレオチドのうちの１８が標的領域に相補的であり、したがって、特異的にハイブリダイズするであろうｇＲＮＡは、９０パーセントの相補性を示すだろう。この例において、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化されるか、又は相補的ヌクレオチドに散在してもよく、互いに、又は相補的ヌクレオチドに連続的である必要はない。核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性パーセントは、当該技術分野において既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３〜４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９〜６５６）を使用して、又はＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用して（デフォルト設定を使用、これは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２〜４８９）のアルゴリズムを使用する）、慣用的に決定され得る。
対象ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓタンパク質と相互作用する。対象ｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントを介して、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に指向する。対象ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つのストレッチを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして２本鎖ＲＮＡ２本鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントを介して、結合したＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に指向する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む。対象ｇＲＮＡの２つのＲＮＡ分子のそれぞれは、２つのＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチドがハイブリダイズして、タンパク質結合セグメントの２本鎖ＲＮＡ２本鎖（例えば、ヘアピン）を形成するように、互いに相補的であるヌクレオチドのストレッチを含む。対象ｇＲＮＡは、任意の対応するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ対を含み得る。本明細書に記載される方法において、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの複合体（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）として使用されてもよいか、又はｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡは別個に送達されてもよい。例えば、複数のｇＲＮＡが切断反応に使用される場合、各標的部位に特異的な個々のｃｒＲＮＡは、各ｃｒＲＮＡと複合され得る標準的なｔｒａｃｒＲＮＡから別個に送達され得る。このような方法では、ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を標的部位に指向するために、標準的なｔｒａｃｒＲＮＡと複合することができる。
ガイドＲＮＡは、追加の望ましい特徴（例えば、修飾又は調節された安定性、細胞内標的化、蛍光標識による追跡、タンパク質又はタンパク質複合体用の結合部位など）をもたらす修飾又は配列を含み得る。このような修飾の非限定的な例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テイル（すなわち、３’ポリ（Ａ）テイル）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による調節された安定性及び／又は調節された到達性（accessibility）を可能にするため）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ２本鎖（すなわち、ヘアピン）
を形成する配列）、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に誘導する修飾又は配列、追跡を提供する修飾又は配列（例えば、蛍光分子への直接抱合、蛍光検出を容易にする部分への抱合、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質に結合部位を提供する修飾又は配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含むＤＮＡに作用するタンパク質）、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
ガイドＲＮＡは任意の形態で提供され得る。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子として（別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）又は１つの分子として（ｓｇＲＮＡ）のいずれかのＲＮＡの形態で、及び任意選択で、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態で提供され得る。ｇＲＮＡはまた、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供されてもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）又は別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードすることができる。後者の場合において、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、それぞれ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別個のＤＮＡ分子として提供され得る。
ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞の活性プロモーターに操作可能に連結され得る。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物においてプロモーターに操作可能に連結されてもよい。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、核酸インサートを含む標的化ベクター及び／若しくはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターに存在し得るか、又は核酸インサートを含む標的化ベクターから分離される、及び／若しくはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターから分離されるベクター又はプラスミドに存在し得る。このようなプロモーターは、多能性ラット、真核、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、ゲッ歯類、マウス、又はハムスター細胞において活性であり得る。このようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであり得る。いくつかの場合では、プロモーターは、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又はマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。他のプロモーターの例は、本明細書の別の箇所に記載される。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡが細胞内に導入されるとき、ｇＲＮＡは、細胞において一時的に、条件に応じて、又は構成的、に発現され得る。
あるいは、ｇＲＮＡは、様々な他の方法により調製されてもよい。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロ転写により調製され得る（例えば、国際公開第ＷＯ ２０１４／０８９２９０号及び第ＷＯ ２０１４／０６５５９６号を参照されたい）。ガイドＲＮＡはまた、化学合成により調製された合成的に産生された分子であってもよい。
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列
用語「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列」は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列を含むが、但し、結合のための十分な条件が存在することを条件とする。例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計される配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とＤＮＡ標的化配列との間のハイブリダイズは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではないが、但し、ハイブリダイゼーションをもたらし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在することを条件とする。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、以下により詳細に記載される、Ｃａｓタンパク質の切断部位も含む。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、例えば、ミトコンドリア又は葉緑体など、細胞の核若しくは細胞質に、又は細胞の細胞小器官内に位置し得る任意のポリヌクレオチドを含み得る。
標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡの標的となり得る（すなわち、それにより結合されるか、又はそれとハイブリダイズされるか、又はそれに相補的であり得る）。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件は、細胞に通常存在する生理学的条件を含む。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１を参照されたい））。Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的であり、それとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と称される場合があり、「相補鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」又は「鋳型鎖」と称される場合がある。
Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列内又は外側で核酸を切断することができる。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が１本鎖破断又は２本鎖破断を産生する核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズされ、Ｃａｓタンパク質と複合されるｇＲＮＡを含む）の形成は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡに存在する核酸配列の、又はその付近（例えば、その核酸配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０以上の塩基対内）のうちの１つ又は両方の鎖の切断をもたらすことができる。切断部位がｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する核酸配列の外側である場合、切断部位は、尚も「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列」内にあると考えられる。切断部位は、核酸のうちの１本の鎖上のみか、又は両鎖上にあり得る。切断部位は、核酸の両鎖上の同じ位置にあるか（平滑末端を産生する）、又は核鎖上の異なる部位にあり得る（ねじれ末端を産生する）。ねじれ末端は、例えば、２つのＣａｓタンパク質を使用することにより産生され得、これらのそれぞれは、各鎖上の異なる切断部位に１本鎖破断を産生し、それにより２本鎖破断を産生する。例えば、第１のニッカーゼは、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に１本鎖破断を作製することができ、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が作製されるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に１本鎖破断を作製することができる。いくつかの場合では、第１の鎖上のニッカーゼのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、第２の鎖上のニッカーゼのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、又は１，０００塩基対分離される。
Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの部位特異的切断は、標的ＤＮＡにおいて、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対相補性、及び（ｉｉ）プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフの両方により決定される位置で生じ得る。ＰＡＭはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列に隣接し得る。任意選択で、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列はＰＡＭに隣接している場合がある。例えば、Ｃａｓ９の切断部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０又は約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）上流又は下流であり得る。いくつかの場合では（例えば、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９又は密接に関係のあるＣａｓ９が使用されるとき）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−Ｎ１ＧＧ−３’（ここで、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の直ぐ３’である）であり得る。このため、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣ Ｎ２−３’（ここで、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの相補鎖のＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡ認識配列の直ぐ５’である）であろう。いくつかの場合では、Ｎ１及びＮ２は相補的であり、Ｎ１−Ｎ２塩基対は、任意の塩基対（例えば、Ｎ１＝Ｃ及びＮ２＝Ｇ、Ｎ１＝Ｇ及びＮ２＝Ｃ、Ｎ１＝Ａ及びＮ２＝Ｔ、Ｎ１＝Ｔ及びＮ２＝Ａ）であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の例としては、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントに相補的なＤＮＡ配列、又はＰＡＭ配列に加えてこのようなＤＮＡ配列が挙げられる。例えば、標的モチーフは、Ｃａｓタンパク質により認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドＤＮＡ配列、例えばＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号８）又はＮ２０ＮＧＧ（配列番号２４）であり得る（例えば、国際公開第ＷＯ ２０１４／１６５８２５号を参照されたい）。５’末端のグアニンは、細胞のＲＮＡポリメラーゼによる転写を容易にすることができる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の他の例は、インビトロでＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を容易にするために、５’末端に２つのグアニンヌクレオチドを含み得る（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号２５）。例えば、国際公開第ＷＯ ２０１４／０６５５９６号を参照されたい。他のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、５’Ｇ又はＧＧ及び３’ＧＧ又はＮＧＧを含む、配列番号８、２４、及び２５の、４〜２２ヌクレオチド長を有し得る。また他のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、配列番号８、２４、及び２５の、長さが１４〜２０のヌクレオチドを有し得る。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、細胞に内因性又は外因性の任意の核酸配列であり得る。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、若しくは非コード配列（例えば、調節配列）であり得るか、又は両方を含み得る。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型Ｃａｓタンパク質である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。一実施形態では、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。一実施形態では、第１の核酸配列は、ヒトコドン最適化Ｃａｓタンパク質をコードする。
一実施形態では、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、（ａ）核酸配列５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号１）のキメラＲＮＡ、又は（ｂ）核酸配列５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’（配列番号２）のキメラＲＮＡを含む。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ−３’（配列番号３）、５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧ（配列番号４）、又は５’−ＧＡＧＵＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＵＵＵＵＡ−３’（配列番号５）を含む。また他の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ−３’（配列番号６）又は５’−ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵ ＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ−３’（配列番号７）を含む。
Ｖ．ポリヌクレオチドのアセンブリ
本明細書に開示される方法は、ＤＮＡ分子を結合して実質的に無傷若しくはシームレスな２本鎖ＤＮＡ分子を形成するのに十分な条件下で、少なくとも２つの核酸をアセンブルすることができる。オーバーラップ配列を有する関心の任意の核酸は、本明細書に開示される方法に従いアセンブルされ得る。例えば、自然に生じるＤＮＡ、クローン化ＤＮＡ分子、合成的に生成されたＤＮＡなどを含む、オーバーラップ配列を有する関心の任意のＤＮＡ分子をアセンブルすることができる。結合されたＤＮＡ分子は、所望する場合、本発明の方法を使用して、ベクターにクローン化される（例えば、挿入される）。２つの核酸のアセンブルは、２つの核酸の鎖を結合する任意の方法を含む。例えば、アセンブリは、各核酸からの鎖が他方とアニーリングするように、ダイジェストされた核酸を結合すること、及び伸長を含み、ここで、各鎖は、他方の伸長のための鋳型として機能する。
いくつかの実施形態では、核酸は、各核酸が一緒に直接アセンブルされる代わりに、結合体オリゴにアセンブルされるように、結合体オリゴとアセンブルされる。結合体オリゴとのアセンブリは、アセンブルされる核酸の一部ではなく結合体オリゴの一部である核酸塩基を、アセンブルされる核酸間に位置付けることができる。よって、核酸は、余分な塩基が核酸間に残っている場合でも良好にアセンブルされ得る。あるいは、結合体オリゴは、シームレスアセンブリに使用され得、その場合には余分な塩基がアセンブルされる核酸間に残らない。
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｃａｓタンパク質、制限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）（例えば、本明細書の別の箇所で提供される様々な制限エンドヌクレアーゼのいずれか）、メガヌクレアーゼ（例えば、本明細書の別の箇所で提供される様々なメガヌクレアーゼのいずれか）、又はこれらの任意の組み合わせを用いた切断によるアセンブリのために調製され得る。例えば、アセンブルされる核酸のうちの１つは、Ｃａｓタンパク質で切断され得、アセンブルされるもう１つの核酸は、Ｃａｓタンパク質、制限酵素、メガヌクレアーゼ、又はこれらの任意の組み合わせで切断され得る。ヌクレアーゼでの切断後、ダイジェストされた核酸は、オーバーラップ末端配列を有するもう１つのダイジェストされた核酸に直接アセンブルされ得るか、又はダイジェストされていないがオーバーラップ末端配列を有する核酸にアセンブルされ得る。ダイジェストされた核酸はまた、結合体オリゴを使用してもう１つの核酸にアセンブルされてもよい。
２つの核酸分子間にオーバーラップ末端配列を産生するためにヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）を採用する実施形態では、ダイジェストされた核酸をアセンブルするために、迅速なコンビナトリアル法が使用され得る。例えば、オーバーラップ末端を有する第１及び第２の核酸は、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びヌクレオチドと組み合わされ、５０℃などの一定温度でインキュベートされ得る。具体的には、Ｔ５エキソヌクレアーゼが、相補的オーバーハングを産生するｄｓＤＮＡの５’末端からヌクレオチドを除去するために使用され得る。次に、相補的１本鎖ＤＮＡオーバーハングがアニーリングされ、ギャップを埋めるためにＤＮＡポリメラーゼが使用され、得られた切れ目を５０℃で封止するためにＴａｑ ＤＮＡリガーゼが使用され得る。よって、オーバーラップ末端配列を共有する２つの核酸は、１工程の等温反応で分子に結合されて共有結合的に封止され得る。例えば、Ｇｉｂｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（５）：３４３〜３４５を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、プロテイナーゼＫ又はフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）精製が、反応混合物からヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）を除去するために使用される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）は、シリカゲル系カラム精製により反応混合物から除去され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ベクターを直鎖状ポリヌクレオチドとアセンブルする。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、２つのＢＡＣベクターなど、少なくとも２つのベクターをアセンブルする。用語「ＢＡＣベクター」は、任意の細菌人工染色体を含む。特定の実施形態では、ＢＡＣは、直鎖状核酸の領域のヌクレオチド配列とオーバーラップするヌクレオチド配列、又は別のベクター、例えば別のＢＡＣを伴う領域を含有するように修飾される。
第１及び第２の１本鎖核酸は、それぞれの末端が互いに相補的であるとき、オーバーラップ末端を有する。第１及び第２の２本鎖核酸は、第１の核酸の鎖の５’末端が第２の核酸の鎖の３’末端に相補的であるときにオーバーラップ末端を有し、逆もまた同様である。例えば、２本鎖オーバーラップ末端配列に関して、一方の核酸の鎖は、他方の核酸の対応する鎖に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有し得る。本明細書に開示される方法において、アセンブルされるｄｓＤＮＡ分子の鎖の５’末端は、他方のｄｓＤＮＡ分子の鎖の３’末端とオーバーラップ末端配列を共有する。用語「オーバーラップ末端配列」は、ｄｓＤＮＡ分子の両鎖を含む。よって、オーバーラップ領域からの１本の鎖は、オーバーラップ配列の相補的領域が、アセンブルされる２つのポリヌクレオチドの５’及び３’末端からの１本鎖オーバーハングで提示されるとき、その相補鎖に特異的にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼは、５’又は３’末端からヌクレオチドを除去してオーバーハング末端配列を作製するために使用される。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の核酸のオーバーラップ領域は、Ｃａｓタンパク質によるダイジェストの後まで５’又は３’末端上に存在しない。つまり、オーバーラップ領域は、Ｃａｓタンパク質による内部オーバーラップ領域を含有する核酸（複数可）のダイジェスト後、オーバーラップ末端配列に後に変換される内部領域であり得る。Ｃａｓタンパク質は、オーバーラップ領域内又はオーバーラップ領域の外側の標的部位（例えば、切断部位）で切断することができる。
オーバーラップ領域の長さは、好ましくは、領域が、アセンブルされる核酸のいずれか内で１回のみ生じるように、十分な長さのものである。この様式では、他のポリヌクレオチドは末端配列とアニーリングすることが妨げられ、アセンブリは標的核酸に特異的であり得る。オーバーラップ領域の長さは、最小約１０塩基対（ｂｐ）から約３００ｂｐ以上まで変動し得る。一般に、オーバーラップの長さは、ほぼ組み合わされるポリヌクレオチドのサイズ以下であるが、約１０ｂｐ以上かつ約１０００ｂｐ以下であることが好ましい。２つ又は３つのポリヌクレオチドの結合に関しては、約２０〜３０ｂｐのオーバーラップが十分であり得る。１０を超える断片に関しては、好ましいオーバーラップは、約８０ｂｐ〜約３００ｂｐである。一実施形態では、オーバーラップ領域は、合成方法により容易に生成されることを可能にする長さのもの、例えば、約Ｉ４０ｂｐである。特定の実施形態では、オーバーラップ領域の長さは、約２０〜２００ｂｐであり得る。オーバーラップは、長さが約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１，０００ｂｐであり得る。いくつかの実施形態では、オーバーラップ領域の長さは、２０〜２００ｂｐである。本明細書に開示される方法の特定の実施形態では、少なくとも２つのポリヌクレオチドがアセンブルされ得、これらのポリヌクレオチドのうちの少なくとも一方のオーバーラップ領域は、ヌクレアーゼ剤（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）との接触により生成される。例えば、第１のポリヌクレオチドのエンドヌクレアーゼダイジェストにより、第２のポリヌクレオチドの末端配列とオーバーラップする配列を作製することができ、このオーバーラップ末端配列が、次いでアセンブルされる。
本明細書に開示される方法において、オーバーラップ配列を、エキソヌクレアーゼと接触させて、オーバーラップ配列間の相補的配列（例えば、相補的１本鎖配列）を曝露することができる。エキソヌクレアーゼダイジェストは、相補性の曝露された１本鎖領域の特定のアニーリングを可能にするために十分な数のヌクレオチドを除去する（「噛み切る（chew back）」）のに効果的な条件下で実行される。一般に、オーバーラップの領域の一部又はオーバーラップの全領域が噛み切られ、オーバーラップの領域の一部又はオーバーラップの全領域を含むオーバーハングを残す。いくつかの方法では、エキソヌクレアーゼダイジェストは、ｄＮＴＰの不在下で、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ）により実行され得るが、他の方法では、エキソヌクレアーゼダイジェストは、ポリメラーゼ活性を欠くｄＮＴＰの存在下で、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）により実行され得る。
様々な５’から３’の２本鎖特異的エキソデオキシリボヌクレアーゼのいずれかが、本明細書に開示される方法において核酸の末端を噛み切るために使用され得る。用語「５’エキソヌクレアーゼ」は、時折、５’〜３エキソデオキシリボヌクレアーゼを指すように本明細書において使用される。本明細書で使用されるとき、「非加工性」エキソヌクレアーゼは、各ＤＮＡ結合事象中に限られた数（例えば、たった数個）のヌクレオチドを分解するエキソヌクレアーゼである。５’エキソヌクレアーゼによるダイジェストは、ＤＮＡ分子において、１本鎖３’オーバーハングを産生する。他の特性の中でも、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くもの、５’ホスフェート末端を生成するもの、５’−リン酸化及び非リン酸化末端の両方から分解を開始するものが、５’エキソヌクレアーゼに望ましい。平滑末端であるか、又は小さい５’若しくは３’陥凹末端を有するかにかかわらず、分子の５’末端からダイジェストを開始することができる酵素も望ましい。好適なエキソヌクレアーゼは当業者には明らかである。これらは、例えば、ファージＴ５エキソヌクレアーゼ（ファージＴ５遺伝子Ｄ１５産物）、ファージラムダエキソヌクレアーゼ、ＲａｃプロファージのＲｅｃＥ、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、ファージＴ７エキソヌクレアーゼ（ファージＴ７遺伝子６産物）、又は相同組換え反応に関与する様々な５’エキソヌクレアーゼのいずれかを含む。本発明の一実施形態では、エキソヌクレアーゼは、Ｔ５エキソヌクレアーゼ又はラムダエキソヌクレアーゼである。別の実施形態では、エキソヌクレアーゼは、Ｔ５エキソヌクレアーゼである。別の実施形態では、エキソヌクレアーゼは、ファージＴ７エキソヌクレアーゼではない。本発明の方法に採用されるエキソヌクレアーゼ及び他の酵素を調製及び使用するための方法は、慣習的であり、多くは、ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２６１１１ Ｍｉｌｅｓ Ｒｏａｄ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ ４４１２８又はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），２４０ Ｃｏｕｎｔｙ Ｒｏａｄ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．０１９３８〜２７２３などの商業的供給源から入手可能である。
特に、オーバーラップの領域が非常に長い実施形態では、その領域の一部（例えば、オーバーラップの領域の半分以上）を噛み切る必要があるだけだが、但し、このようにして生成された１本鎖オーバーハングが反応の条件下で特異的にアニーリングするのに十分な長さ及び塩基含量のものであることを条件とする。用語「特異的にアニーリングする」は、１本鎖オーバーハングの特定の対が、反応混合物中に存在する他の１本鎖オーバーハング（例えば、非相補的オーバーハング）ではなく、互いに優先的に（又は排他的に）アニーリングする状況を含む。「優先的に」とは、少なくとも約９５％のオーバーハングが相補的オーバーハングにアニーリングすることを意味する。当業者は、所与の一連の反応条件下で、関心の配列の特定のアニーリングを達成するための最適な長さを容易に決定することができる。一般に、オーバーラップの相同領域（１本鎖オーバーハング又はそれらの補体）は同一の配列を含有する。しかしながら、部分的に同一の配列も使用され得るが、但し、１本鎖オーバーハングがその反応の条件下で特異的にアニーリングできることを条件とする。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）は、ｄｓＤＮＡの両鎖を切り離すことなく、標的部位に１本鎖破断（すなわち、切れ目）を作製することができる。「ニッカーゼ」は、ｄｓＤＮＡに切れ目を作製するヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）を含む。この様式では、ｄｓＤＮＡの各鎖上の標的部位に特異的な２つの別個のヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）（例えばニッカーゼ）は、別の核酸上のオーバーハング配列又は同じ核酸上の別個の領域に相補的なオーバーハング配列を作製することができる。核酸を、ｄｓＤＮＡの両鎖上の標的部位に特異的な２つのニッカーゼと接触させることにより作製されたオーバーハング末端は、５’又は３’のいずれかのオーバーハング末端であり得る。例えば、オーバーハング配列が作製されるように、第１のニッカーゼは、ｄｓＤＮＡの第１の鎖上に１本鎖破断を作製することができ、一方で、第２のニッカーゼは、ｄｓＤＮＡの第２の鎖上に１本鎖破断を作製することができる。１本鎖破断を作製する各ニッカーゼの標的部位は、作製されたオーバーハング末端配列が第２の核酸上のオーバーハング末端配列に相補的であるように選択され得る。したがって、第１及び第２の核酸の相補的オーバーハング末端は、本明細書に開示される方法によりアニーリングされ得る。いくつかの実施形態では、第１の鎖上のニッカーゼの標的部位は、第２の鎖上のニッカーゼの標的部位とは異なる。ｄｓＤＮＡの別個の鎖上の異なる標的部位は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、又は１，０００塩基対離れている１本鎖破断をもたらす。
ある特定の実施形態では、第２の核酸も、第２の核酸上の第１の標的部位に切れ目を作製する第１のニッカーゼ、及び第２の核酸分子上の第２の標的部位に切れ目を作製するニッカーゼと接触させる。第２の核酸上の２つの異なる部位の切れ目により作製されたオーバーハング末端配列は、相補的オーバーハング末端配列がアニーリングするように、第１の核酸上の２つの異なる部位の切れ目により作製されたオーバーハング末端配列に相補的であり得る。
いくつかの実施形態では、関心の遺伝子の核酸配列は、２つ以上のＢＡＣに及ぶ。このような場合では、本明細書に提供される方法を使用して、具体的に設計されたヌクレアーゼは、所望の位置で２つ以上のＢＡＣを切り離すことができ、得られた核酸断片が一緒に結合されて関心の遺伝子の配列を形成する。
いくつかの実施形態では、第１の核酸の両鎖上の異なる標的部位の切れ目により作製されたオーバーハング末端は、第２の核酸の両鎖上の異なる標的部位の切れ目により作製されたオーバーハング末端に相補的ではない。他の実施形態では、アセンブルされる核酸は、相補的末端を有さず、そのため、非相補的末端をアセンブルするためには別個の核酸が必要である。結合体オリゴは、２つの核酸の非相補的末端を結合するために使用され得る。「結合体オリゴ」には、異なるポリヌクレオチド又は核酸の末端に対する相補的配列を有するポリヌクレオチド又は核酸を含む相補的アームが含まれる。いくつかの実施形態では、結合体オリゴは、５’末端に第１の核酸に相補的なアーム、中央部分（スペーサー）、及び３’末端に第２の核酸に相補的なアームを有する。よって、互いに対して非相補的な末端配列を有する核酸は、エキソヌクレアーゼ処理後に各核酸を同じ結合体オリゴにアニーリングすることによりアセンブルすることができる。特定の実施形態では、結合体オリゴは、第１のダイジェストされた核酸の５’又は３’末端配列に相補的な第１のアーム、及び第２のダイジェストされた核酸の５’又は３’配列に相補的な第２のアームを有する。結合体オリゴは、平滑であるか又は５’若しくは３’オーバーハング配列を有する、非相補的末端配列を結合することができる。
結合体オリゴの相補的アーム配列の長さは、エキソヌクレアーゼ処理後にアセンブルされる核酸にアニーリングするのに十分であるべきである。例えば、結合体オリゴの相補的アーム配列の長さは、少なくとも約１０、２０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ｂｐ以上であり得る。特定の実施形態では、相補的アームは、１５〜１２０ｂｐ、２０〜１００ｂｐ、３０〜９０ｂｐ、３０〜６０ｂｐ、又は２０〜８０ｂｐである。特定の一実施形態では、結合体オリゴの相補的アーム配列の長さは４０ｂｐである。結合体オリゴの各相補的アームは異なる長さのものであってもよい。アセンブルされる核酸に相補的な末端配列の間の結合体オリゴのスペーサーは、少なくとも約２０ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、８０００ｂｐ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ以上であり得る。例えば、結合体オリゴのスペーサーは、ＢＡＣベクター又はＬＴＶＥＣを含み得る。いくつかの実施形態では、結合体オリゴのスペーサーは、アセンブリの成功を確認するために、検出に特化した配列又はＰＣＲに好適な配列を有するように設計され得る。いくつかの実施形態では、結合体オリゴのスペーサーは、１つ以上の制限酵素部位を導入するように設計され得る。いくつかの実施形態では、結合体オリゴのスペースは、薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子を導入するように設計され得る。他の実施形態では、スペーサーは、核酸をシームレスにアセンブルするために、アセンブルされる核酸の末端部分から少なくとも２０ｂｐを含有する。例えば、シームレスアセンブリに関しては、スペーサーは、約４５ｂｐであり得る。
いくつかの実施形態では、核酸対結合体オリゴ（複数可）のモル比は、約１：１〜約１：２００であり得る。いくつかの実施形態では、核酸対結合体オリゴ（複数可）のモル比は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１２０、１：１４０、１：１６０、１：１８０、又は１：２００である。特定の実施形態では、核酸対結合体オリゴ（複数可）のモル比は、約１：６〜約１：２０であり得る。一実施形態では、モル比は約１：６である。別の実施形態では、モル比は約１：２０である。
特定の実施形態では、結合体オリゴは、少なくとも２つの核酸をシームレスにアセンブルするために使用される。「シームレス」アセンブリは、アセンブルされる核酸の近接末端間に介在核酸塩基が存在しない、２つの核酸のアセンブリを指す。例えば、シームレスにアセンブルされた核酸は、アセンブルされる核酸の一部ではない核酸塩基が存在しない。２つの核酸をシームレスにアセンブルするために、結合体オリゴのスペーサーは、アセンブルされる第１又は第２の核酸のいずれかの末端部分と同一の核酸配列を含むべきである。この末端部分は、結合体オリゴとアセンブルする前に核酸から除去されるべきである。例えば、末端部分は、核酸の末端から少なくとも４０ｂｐ又は少なくとも４５ｂｐなど、核酸の末端から少なくとも２０ｂｐがヌクレアーゼ剤（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）により切断され得る。あるいは、末端部分は、アセンブルされる核酸の末端から少なくとも２、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも３７、少なくとも４０、少なくとも４２、少なくとも４５、少なくとも４８、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０ｂｐがヌクレアーゼ剤（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）により切断され得る。
一実施形態では、結合体オリゴは、５’末端から３’末端までに、５’核酸に対する約１５〜１２０ｂｐのオーバーラップ、約２０〜５０ｂｐの５’核酸の３’末端領域、及び３’核酸に対する約１５〜１２０ｂｐのオーバーラップを含み得る。一実施形態では、結合体オリゴは、５’末端から３’末端までに、５’核酸に対する約１５〜１２０ｂｐのオーバーラップ、約２０〜５０ｂｐの３’核酸の５’末端領域、及び３’核酸に対する約１５〜１２０ｂｐのオーバーラップを含み得る。よって、結合体オリゴが第１及び第２の核酸にアセンブルされるとき、結合体オリゴのスペーサーは、アセンブリ前に核酸から除去された部分を再構築する。図５及び図６を参照されたい。用語「再構築」は、結合体オリゴにアセンブルされたときに完全にアセンブルされた核酸を提供するために、切断された核酸の末端部分を置き換えることを含む。例えば、切断された核酸の再構築により、核酸の切断された部分が、切断された部分と同一の配列を有する結合体オリゴのスペーサーに含まれる核酸で置き換えられる。
結合体オリゴは、第１及び第２の核酸分子に同時に又は連続的にアセンブルされ得る。同時にアセンブルされるとき、結果として得られるアセンブルされた核酸が、第１の核酸、結合体オリゴ、及び第２の核酸を含むように、結合体オリゴを、同じ反応混合物において第１及び第２の核酸と接触させることができる。連続的にアセンブルされるときは、結合体オリゴにアセンブルされた第１の核酸を含むが、第２の核酸を含まないアセンブルされた核酸を産生するアセンブリ反応において、結合体オリゴを第１の核酸と接触させる。このようなアセンブルされた核酸を、次に、第１の核酸、結合体オリゴ、及び第２の核酸を含むアセンブルされた核酸を産生する別個のアセンブリ反応において、第２の核酸と接触させることができる。他の実施形態では、結合体オリゴにアセンブルされた第２の核酸を含むが、第１の核酸を含まないアセンブルされた核酸を産生するアセンブリ反応において、結合体オリゴを第２の核酸と接触させる。このようなアセンブルされた核酸を、次に、第１の核酸、結合体オリゴ、及び第２の核酸を含むアセンブルされた核酸を産生する別個のアセンブリ反応において、第１の核酸と接触させることができる。
核酸分子をアセンブルするために、任意の数の結合体オリゴが本明細書の方法において使用され得る。例えば、１つの結合体オリゴが２つの核酸分子をアセンブルするために使用され得る、２つの結合体が３つの核酸分子をアセンブルするために使用され得る、３つの結合体オリゴが４つの核酸分子をアセンブルするために使用され得る、４つの結合体オリゴが５つの核酸分子をアセンブルするために使用され得る、又は５つの結合体オリゴが６つの核酸分子をアセンブルするために使用され得る。結合体オリゴの数は、アセンブルされる核酸分子の数により、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上であり得る。
いくつかの実施形態では、結合体オリゴはｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡを含む。「ｇＢｌｏｃｋ」は、直鎖状２本鎖ＤＮＡ断片である。ｇＢｌｏｃｋは、約５０ｂｐ〜約２０００ｂｐであり得る。ｇＢｌｏｃｋは、約５０ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約１０００ｂｐ〜約１２５０ｂｐ、約１２５０ｂｐ〜約１５００ｂｐ、約１５００ｂｐ〜約１７５０ｂｐ、又は約１７５０ｂｐ〜約２０００ｂｐであり得る。
ｇＢｌｏｃｋによる２つ以上の核酸のアセンブリは、例えば、本明細書の別の箇所（例えば、実施例１０）に記載されるＰＣＲアッセイによりスクリーニングされ得る。いくつかの場合では、ｇＢｌｏｃｋは、選択カセットを含まない。このような方法は、簡単なＰＣＲアッセイによりスクリーニングすることができる２つ以上の核酸分子の迅速な結合を可能にする。ｇＢｌｏｃｋは、関心の任意の核酸配列を含み得る。いくつかの場合では、ｇＢｌｏｃｋは、ヌクレアーゼ剤の標的部位、又は本明細書に提供される様々なメガヌクレアーゼ若しくは制限酵素のいずれかの標的部位を含み得る。他の実施形態では、ｇＢｌｏｃｋは選択カセットを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＢｌｏｃｋは関心のＤＮＡ配列を含む。一実施形態では、ｇＢｌｏｃｋはヒトＤＮＡ配列を含む。
アセンブルされる核酸又は様々な結合体オリゴのいずれかは、選択カセット又はレポーター遺伝子も含み得る。選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み得、該核酸配列はプロモーターに操作可能に連結される。プロモーターは、関心の原核細胞において活性であり、かつ／又は関心の真核細胞において活性であり得る。このようなプロモーターは、誘導性プロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞に内因性のプロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞とは異種のプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発達段階特異的プロモーターであり得る。一実施形態では、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、並びにこれらの組み合わせから選択される。標的ベクターの選択マーカーは、上流若しくは下流の相同性アームに隣接するか、又は相同性アームに対して５’若しくは３’のいずれかに見出すことができる。
一実施形態では、アセンブルされる核酸又は様々な結合体オリゴのいずれかは、プロモーターに操作可能に連結されるレポーター遺伝子を含み、該レポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、強化された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたレポータータンパク質をコードする。このようなレポーター遺伝子は、細胞において活性プロモーターに操作可能に連結され得る。このようなプロモーターは、誘導性プロモーター、レポート遺伝子若しくは細胞に内因性のプロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞とは異種のプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター様式、又は発達段階特異的プロモーターであり得る。
１本鎖ＤＮＡ（例えば、結合されるＤＮＡ分子が、各鎖上の異なる標的部位で切れ目を作製することにより産生されたｄｓＤＮＡ又はオーバーハングであるとき、エキソヌクレアーゼの作用により産生されたオーバーハング）のアニーリング後、エキソヌクレアーゼによって残された１本鎖ギャップは、好適な非鎖置換ＤＮＡポリメラーゼで充填され、これによりリガーゼで封止された切れ目が形成される。本明細書で使用されるとき、「非鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ」は、ｄｓＤＮＡ分子のコピーを進めていくときにその経路に存在するＤＮＡ鎖に遭遇したときにＤＮＡの合成を終わらせる、又はこれにより作製されたギャップを同時に充填し、それにより「移動切れ目」（切れ目翻訳）を生成しながら進んでいくときに遭遇したＤＮＡ鎖を分解するＤＮＡポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、オーバーラップ末端配列は、各ポリヌクレオチドの１本鎖相補的末端をアニーリングするために十分な相補性を、オーバーラップ領域間に有する。第１のポリヌクレオチドの１本鎖を第２のポリヌクレオチドの相補鎖にアニーリングした後、第１のポリヌクレオチドの３’末端は、第２のポリヌクレオチド鎖の鋳型に基づいて伸長され得、第２のポリヌクレオチド鎖の３’末端は、第１のポリヌクレオチド鎖の鋳型に基づいて伸長され得る。各ポリヌクレオチドの相補的３’末端を伸長することにより、ポリヌクレオチドがアセンブルされ得る。アセンブリ後、一方の断片からの鎖の伸長した３’末端と他方の断片からの鎖の近接する５’末端との間の切れ目は、ライゲーションにより封止され得る。より具体的には、第１のポリヌクレオチドの伸長した３’末端のヒドロキシル基を第２のポリヌクレオチドの５’末端のリン酸基に、及び第２のポリヌクレオチドの伸長した３’末端のヒドロキシル基を第１のポリヌクレオチドの５’末端のリン酸基にライゲーションする。
ライゲーション反応は、様々な好適な熱安定性ＤＮＡリガーゼのいずれかにより行うことができる。中でも、例えば、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ熱安定性ＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国特許第６，５７６，４５３号に開示される熱安定性リガーゼ、熱安定性Ｔｆｉ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｉｎｃ．，）が好適なリガーゼである。
反応混合物におけるＰＥＧなどの好適な量のクラウディング剤は、分子クラウディングを強化又は容易にすることを可能にする。いかなる特定の理論に束縛されることを望むわけではないが、分子クラウディングを可能にし、溶液中の水に結合及びそれを結び付けるクラウディング剤は、溶液の構成要素を互いに密接に接触させることが示唆されている。例えば、組換えられるＤＮＡ分子が、密接に近位になることができ、これにより１本鎖オーバーハングのアニーリングが容易になる。また、酵素が、それらのＤＮＡ基質と密接に接触することができ、水分子の除去により安定化され得ることが示唆される。様々な好適なクラウディング剤が当業者には明らかであろう。これらは、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な周知の巨大分子、Ｆｉｃｏｌｌ ７０などのＦｉｃｏｌｌ、デキストラン７０などのデキストランなどを含む。本出願における考察の多くはＰＥＧを対象とする。しかしながら、考察は、他の好適なクラウディング剤にも当てはまることが意図される。当業者は、他のクラウディング剤の使用を調整するために、本方法において日常的な変更をどのように実施するかを認識するだろう。
反応混合物におけるＰＥＧなどの好適な量のクラウディング剤は、分子クラウディングを強化又は容易にすることを可能にする。例えば、クラウディング剤は、組換えられるＤＮＡ分子が、密接に近位になり得るのを助けることができ、よって、これにより、１本鎖オーバーハングのアニーリングが容易になる。また、酵素が、それらのＤＮＡ基質と密接に接触することができ、水分子の除去により安定化され得ることが示唆される。様々な好適なクラウディング剤が当業者には明らかであろう。これらは、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な周知の巨大分子、Ｆｉｃｏｌｌ ７０などのＦｉｃｏｌｌ、デキストラン７０などのデキストランなどを含む。一般に、ＰＥＧが使用されるとき、約５％（重量／体積）の濃度が最適である。しかしながら、ＰＥＧの量は、例えば、約３〜約７％の範囲であり得る。例えば、約ＰＥＧ−２００（例えば、ＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００、又はＰＥＧ−８０００）〜約ＰＥＧ−２０，０００、又は更にはそれ以上の範囲の任意の好適なサイズのＰＥＧを使用することができる。本明細書の実施例において、ＰＥＧ−８０００が使用された。クラウディング剤は、アニーリング反応の強化に加えて、ライゲーションを強化する。
アセンブリ反応混合物中に存在する反応構成要素（塩、緩衝液、好適なエネルギー源（ＡＴＰ又はＮＡＤなど）、反応混合物のｐＨなど）は、個々の酵素（エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼ）に最適ではない場合があるが、むしろそれらは、一連の反応全体に効果的である妥協点として機能する。例えば、発明者により特定された１つの好適な緩衝系は、本明細書において、時折、ＩＳＯ（ＩＳＯｔｈｅｒｍａｌ）と称される。緩衝液は典型的には、０．１Ｍのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ．ｓｕｂ．２、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ（それぞれ）、１０ｍＭのＤＴＴ、５％ ＰＥＧ−８０００、並びに１ｍＭのＮＡＤを含む。
本明細書に開示される方法において、核酸をアセンブルするのに効果的な条件下で、少なくとも２つの核酸をＣａｓタンパク質及び他の酵素と接触させて、オーバーラップ領域の単一コピーが維持されるアセンブルされた２本鎖ＤＮＡ分子を形成する。記載の方法は、自然に生じるＤＮＡ、クローン化ＤＮＡ分子、合成的に生成されたＤＮＡなどを含む、関心の任意のＤＮＡ分子を結合するために使用され得る。結合されたＤＮＡ分子は、所望する場合、ベクターにクローン化されてもよい（例えば、本発明の方法を使用して）。いくつかの実施形態では、アセンブルされる核酸は、関心の細胞（例えば、ゲッ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、哺乳類細胞、微生物細胞、酵母細胞など）における導入及び発現のためにコドン最適化される。
任意の長さのＤＮＡ分子は、本明細書に開示される方法により結合され得る。例えば、約１００ｂｐ〜約７５０又は１，０００以上を有する核酸が結合され得る。本明細書に記載される方法に従う１つ又はいくつかのアセンブリ段階においてアセンブルされ得る核酸の数は、少なくとも約２、３、４、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、１，０００、５，０００、又は１０，０００のＤＮＡ分子、例えば約２〜約３０の核酸の範囲であり得る。アセンブリ段階の数は、約２、４、６、８、１０以上であり得る。単一段階でアセンブルされる分子の数は、約２〜約１０分子の範囲であり得る。本発明の方法は、ＤＮＡ分子又はカセットを一緒に結合するために使用され得、これらのそれぞれは、少なくとも約４０ｂｐ、６０ｂｐ、８０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、３ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、１０ｋｂ、１８ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３２ｋｂ、５０ｋｂ、６５ｋｂ、７５ｋｂ、１５０ｋｂ、３００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、１Ｍｂ以上、又はこれらを超えない開始サイズを有する。アセンブルされた末端産物は、少なくとも約５００ｂｐ、１ｋｂ、３ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、１０ｋｂ、１８ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３２ｋｂ、５０ｋｂ、６５ｋｂ、７５ｋｂ、１５０ｋｂ、３００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、１Ｍｂ以上、例えば３０ｋｂ〜１Ｍｂの範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、アセンブルされた核酸は、環を形成し、かつ／又はベクターにライゲーションされて環を形成する。環状化するためのｄｓＤＮＡの下限サイズは、約２００塩基対である。したがって、結合された断片の全長（いくつかの場合では、ベクターの長さを含む）は、長さが少なくとも約２００ｂｐである。特定の上限サイズはなく、数百キロ塩基対以上の結合されたＤＮＡが本明細書に開示される方法により生成され得る。結合された核酸は、環又は直鎖状分子のいずれかの形態を取ることができる。
本明細書に記載される方法は、直鎖状断片と別の直鎖状断片、直鎖状断片と環状核酸分子、環状核酸分子と別の環状核酸分子、又は直鎖状及び環状核酸の任意の組み合わせをアセンブルするために使用され得る。「ベクター」は、任意の環状核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法によりアセンブルされたベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。ベクター（例えば、ＢＡＣ）は、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。例えば、ＢＡＣは、ヒトポリヌクレオチド配列を含み得る。ＤＮＡ分子の混合物を結合するとき、ほぼ等モル量でＤＮＡが存在することが好ましい。
本明細書に開示される方法でアセンブリするために使用される核酸は、大きい標的化ベクターであり得る。用語「大きい標的化ベクター」又は「ＬＴＶＥＣ」には、細胞において相同性標的化に使用される核酸配列に対応及び由来する相同アームを含む、並びに／又は細胞において相同性組換え標的化を行うことが意図される核酸配列を含むインサート核酸を含む、ベクターが含まれる例えば、ＬＴＶＥＣは、それらのサイズ制限のため、従来のプラスミド系標的化ベクターで対処することができない大きい遺伝子座の修飾を可能にする。特定の実施形態では、ＬＴＶＥＣの相同アーム及び／又はインサート核酸は、真核細胞のゲノム配列を含む。ＬＴＶＥＣのサイズは、従来のアッセイ、例えば、サザンブロッティング及びロングレンジ（例えば、１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲで標的化事象のスクリーニンを可能にするには大きすぎる。ＬＴＶＥＣの例としては、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）に由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ＬＴＶＥＣ及びこれらを作製するための非限定的な例は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号、同第７，１０５，３４８号、及び国際公開第ＷＯ ２００２／０３６７８９号（ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５）、並びに米国公開第ＵＳ ２０１３／０１３７１０１号に記載されており、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、後に除去され得るカセットがベクター内に挿入され得る。様々な形態のカセットが、特定の発達段階で又は誘導時に、特定の細胞又は組織型において欠失を可能にするように構築され得る。このようなカセットは、カセットが両側でリコンビナーゼ認識部位に隣接し、所望の発達段階で発現される、又は誘導時に発現若しくは活性化される所望の細胞型において発現されるリコンビナーゼを使用して除去され得る、リコンビナーゼ系を採用することができる。このようなカセットは、米国公開第ＵＳ ２０１１／０１０４７９９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、ヌル、条件付き、又は条件付き／ヌルの組み合わせの対立遺伝子が生成されるように配置される多くの異なるリコンビナーゼ認識部位の対を含むように更に構築されてもよい。リコンビナーゼ遺伝子の調節は、リコンビナーゼ遺伝子を、細胞特異的、組織特異的、若しくは発達的に調節されたプロモーター（又は他の調節要素）に操作可能に連結することによる、又はリコンビナーゼ遺伝子を、特定の細胞型、組織型、若しくは発達段階でのみ転写されるｍｉＲＮＡの認識部位を含む３’−ＵＴＲに操作可能に連結することなどによる、様々な方法で制御され得る。リコンビナーゼは、例えば、エフェクター若しくは代謝産物（例えば、ＣｒｅＥＲＴ２、その活性はタモキシフェンにより正に制御される）の制御下にリコンビナーゼを配置する融合タンパク質を採用することにより、又は誘導性プロモーター（例えば、その活性がドキシサイクリン及びＴｅｔＲ又はＴｅｔＲバリアントにより制御されるもの）の制御下にリコンビナーゼ遺伝子を配置することにより調節することもできる。カセットの様々な形態及びリコンビナーゼ遺伝子を調節するための手段の例は、例えば、米国特許第ＵＳ ８，５１８，３９２号、同第ＵＳ ８，３５４，３８９号、及び同第ＵＳ ８，６９７，８５１号に提供されており、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示される、アセンブルに使用されるベクター（例えば、ＬＴＶＥＣ）は、約２０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂ、約３５０ｋｂ〜約５５０ｋｂを含むが、これらに限定されない任意の長さのものであり得る。一実施形態では、ＬＴＶＥＣは約１００ｋｂである。
核酸をアセンブルするための、本明細書に提供される方法は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂの欠失を可能にするように設計され得る。
他の場合では、本明細書に提供される方法は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲の外因性核酸配列の挿入を可能にするように設計される。一実施形態では、インサートポリヌクレオチドは約１３０ｋｂ又は約１５５ｋｂである。
直鎖状核酸は、本明細書に開示される方法により、互いにアセンブルされ得るか、又はベクターにアセンブルされ得る。直鎖状分子は、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓタンパク質）、又は任意の合成、人工、若しくは自然に生じる直鎖状核酸によりダイジェストされたベクターであり得る。ある特定の実施形態では、直鎖状核酸は、末端配列が別の核酸の領域とオーバーラップするように作製される。直鎖状核酸のオーバーラップ末端配列は、カスタマイズした核酸配列を生成するために、当該技術分野に既知の任意の方法により導入され得る。例えば、末端配列は、合成的に産生された分子の一部であり得る、ＰＣＲにより導入され得る、又は従来のクローニング技術により導入され得る。
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製し、使用するかの完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、発明者が彼らの発明と見なすものの範囲を制限することを意図するものでも、以下の実験が、行われた全て又は唯一の実験であると示すことを意図するものでもない。使用された数字（例えば、量、温度など）に対する精度を確保する努力がなされたが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気又はほぼ大気である。
実施例１：ＣＡＳ９によるＢＡＣダイジェスト、続いて選択カセットによるアセンブリ
人工ｃｒＲＮＡ及び人工ｔｒａｃｒＲＮＡを、３ｋｂ ＰＣＲ産物（ＵＢ−ＨＹＧ）とのアセンブリのために、ＭＡＩＤ ６１７７（１１６ｋｂ ＬＴＶＥＣ）において特定の配列を標的とするように設計した。ＰＣＲ産物は、ベクターとの５０ｂｐのオーバーラップを含有していた。最初に、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをＤｕｐｌｅｘ緩衝液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ酢酸カリウム）中１００ｕＭに溶解する。ＲＮＡをアニーリングするために、１０ｕｌの１００ｕＭ ｃｒＲＮＡ及び１０ｕｌの１００ｕＭ ｔｒａｃｒＲＮＡを８０ｕｌのアニーリング緩衝液に添加した。９０℃の温度のブロックにおいてＲＮＡを加熱し、次に、ヒーターからブロックを取り出し、ベンチ上で冷却する。ＲＮＡの最終濃度は約１０ｕＭである。
ＢＡＣをダイジェストするために、清浄なｍａｘｉｐｒｅｐ ＢＡＣ ＤＮＡを使用し、以下の混合物によりＢＡＣをダイジェストする。
３７°で１時間ダイジェストし、次に３０分間脱塩する。最終反応緩衝液は、１５ｕｌの最終体積に関して、２０ｍＭトリス（７．５）、１００〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｕｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する。
ＢＡＣ及びインサートをアセンブルするために、プラスミドをダイジェストするか、又はＰＣＲを行い、インサートを作製する。ＰＣＲ反応に関して、少量のアリコートをゲル上で走らせ、単一産物を探し、産物が単一バンドを有する場合、ゲル抽出の代わりにＰＣＲクリーンアップを行う。ＢＡＣ：インサートに関して、１：１〜１：６のモル比が望ましい。通常、５０ｎｇの精製されたインサートが用をなす。以下の反応ミックスを使用することができる：
氷上で、又は５０℃のＰＣＲ機械に直接、ＤＮＡ及びミックスを添加する。５０℃で１時間インキュベートする。０．５ｕＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、５０℃で１時間インキュベートする。３０分間脱塩し、ＤＨ１０Ｂ細胞内に８ｕｌの反応物を電気穿孔する。ダイジェスト効率をチェックするために、１０ｕｌのＢＡＣダイジェストをパルスフィールドゲル上で走らせることができる。ＲＮａｓｅを含まない水及び緩衝液を使用する。
アセンブリ反応は以下のように実行される：等温緩衝液：３ｍＬの１Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、１５０ｕｌの２Ｍ ＭｇＣｌ２、それぞれ６０ｕｌの１００ｍＭ：ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、３００ｕｌの１Ｍ ＤＴＴ、１．５ｇのＰＥＧ８０００、３００ｕｌの１００ｍＭ ＮＡＤ。等温緩衝液は、−２０℃で３２０ｕｌのアリコートに保存される。マスターミックスは以下のように調製される：３２０ｕｌの等温緩衝液、０．６４ｕｌのＴ５エキソヌクレアーゼ（ストック濃度＝１０Ｕ／ｕｌ）、２０ｕｌのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ストック濃度＝２Ｕ／ｕｌ）、１６０ｕｌのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ストック濃度＝４０Ｕ／ｕｌ）、６９９．３６ｕｌのＨ２Ｏを一緒に混合し、１５ｕｌ又は３０ｕｌのアリコートにし、−２０℃で保存する。総体積２０ｕｌの反応において、１５ｕｌのマスターミックス（ＭＭ）を使用する。
実施例において使用されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列は、
ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（配列番号９）である。このＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、（１）標的配列に相補的なＲＮＡの約２０のヌクレオチド、及び（２）ｔｒａｃｒＲＮＡにアニーリングされるテイル配列（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１０））を含有する。
これらの工程は、図１に概説される。
実施例２：２つのオーバーラップするＢＡＣを一緒に縫合する：マウスＭＨＣ ＩＩ遺伝子座におけるヒト化ＨＬＡ−ＤＱ＋ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ（Ｈ２−Ａ／Ｈ２−Ｅ）
人工ｃｒＲＮＡ及び人工ｔｒａｃｒＲＮＡを、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ ＢＡＣとのアセンブリのために、ヒト化ＨＬＡ−ＤＱ ＢＡＣにおいて特定の配列を標的とするように設計した。ベクターは、各ベクター上の２つの部位でＣａｓ９切断により作製された、互いに約７０ｂｐのオーバーラップを含有していた（図２を参照）。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをＨｙｂｅ緩衝液中１００ｕＭに溶解する。ＲＮＡをアニーリングするために、１０ｕｌの１００ｕＭ ｃｒＲＮＡ及び１０ｕｌの１００ｕＭ ｔｒａｃｒＲＮＡを８０ｕｌのアニーリング緩衝液に添加した。９０℃の加熱ブロックにＲＮＡを設置し、次に、ヒーターからブロックを取り出し、ベンチ上で冷却する。ＲＮＡの最終濃度は約１０ｕＭである。
ＢＡＣをダイジェストするために、清浄なｍａｘｉｐｒｅｐ ＢＡＣ ＤＮＡを使用した。各ＢＡＣは以下の混合物により個別にダイジェストされ得る。
ＢＡＣベクターを、３７℃で１時間ダイジェストし、次に、６５℃で２０分間、熱不活性化するべきである。３０分間脱塩する。ダイジェストされたＤＮＡを、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）抽出を介して精製し、次に３５ｕｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
ベクターをアセンブルするために、２．５ｕＬのＢＡＣを、以下のように、アセンブリ反応に使用する。
氷上で、又は５０℃のＰＣＲ機械に直接、ＤＮＡ及びミックスを添加する。５０℃で１時間インキュベートする。３０分間脱塩し、ＤＨ１０Ｂ細胞内に８ｕｌのアセンブルしたＤＮＡを電気穿孔する。ＲＮａｓｅを含まない水及び緩衝液を使用する。
実施例において使用されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列は、ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（配列番号９）である。このＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、（１）標的配列に相補的なＲＮＡの約２０ヌクレオチド、及び（２）ｔｒａｃｒＲＮＡにアニーリングされるテイル配列（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１０））を含有する。
これらの工程は、図２に概説される。
実施例３：リンカーを使用して２つの異なるプラスミドから２つのＣａｓ９で切断した断片をアセンブルする
標的化ベクターを構築するために、ｐＭＪ８５０２ｘを、２つの同一のｃｒＲＮＡで切断して、４００ｂｐ断片及び２２８３ｂｐ Ａｍｐ骨格を取り出した。（図７）。全反応物の精製には、Ｑｉａｇｅｎカラムを使用した。次に、Ｒ６ＫＺｅｎＵｂｉＮｅｏを、２つの異なるｃｒＲＮＡで切断して、Ｎｅｏ耐性（１０８６ｂｐ）及び骨格（５３９０ｂｐ）に分離した。全反応物の精製には、Ｑｉａｇｅｎカラムを使用した。（図７）。切断反応：１１７０ｎｇのＤＮＡ、３０ｕｌの緩衝液、４ｕｌのアニーリングしたＲＮＡ（１００ｕＭ）、１．７ｕｌのＣａｓ９（０．８９ｎｇ／ｕｌ）、６０ｕｌまでのＨ２Ｏ。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、３０ｕｌの溶出緩衝液において溶出する前に、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。
次に、切断した断片を２つのリンカーでアセンブルして、以下の反応混合物により、シームレスアセンブリを得た：０．５ｕｌのリンカー１（５ｎｇ）、０．５ｕｌのリンカー２（５ｎｇ）、２ｕｌのＮｅｏ切断部（約６０ｎｇ）、２ｕｌのＡｍｐ切断部（約６０ｎｇ）、１５ｕｌのアセンブリマスターミックス。混合物を５０℃で１時間インキュベートし、反応物をＨ２Ｏに対して透析した。Ｃａｒｂ／Ｋａｎプレート上で平板培養する前に、１０ｕｌの反応物をエレクトロコンピテントＰｉｒ細胞内に電気穿孔した。接合部にわたるＰＣＲは、選択されたコロニーの６／８が正しいものであったことを示し、スクリーニングにより確認した。
実施例４：リンカーを使用してＢＡＣの一部をカセットに置き換える
ノックアウトマウス標的化ベクターを構築するために、４０ｋｂのＢＡＣ標的化ベクターを、組換え認識部位に隣接する選択カセットに置き換えた。（図８）。ｍＢＡＣから関心の領域を除去し、選択カセットを挿入するように２つのリンカー（１つは５’用、そして１つは３’用）を設計した。リンカーは、ｍＢＡＣに対する４０ｂｐのオーバーラップ、及び選択カセットに対する４０ｂｐのオーバーラップを有していた。最初に、以下の反応により、２０６ｋｂの標的化ベクター（ｍＢＡＣ）のうちの３９．５ｋｂを切断した。５００ｕｌの反応物（Ｈ２Ｏで増やす）：１ｕｌのＣａｓ９（０．８９ｕｇ／ｕｌ）、各ＲＮＡ２本鎖を２ｕｌずつ（５０ｕＭ）、２５０ｕｌの緩衝液、２２０ｕｌ（１２．５ｎｇ）のＢＡＣ ｍａｘｉ ｐｒｅｐを添加し、３７℃で１時間インキュベートする。ダイジェストしたＤＮＡを、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）抽出を介して精製し、次に、５５ｕｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。ｍＢＡＣ切断のＰＣＩクリーンアップ後、５０℃で１時間アセンブリを行い、１０ｕｌの反応物をＤＨ１０Ｂ細胞内に電気穿孔した。（図９）。接合部にわたる配列決定により正しいアセンブリが確認された。（図１０）。リンカー１（結合体オリゴ１）は、ｍＢＡＣ配列からカセット配列までシームレスである（配列番号１２）。リンカー２（結合体オリゴ２）は、カセット配列からｍＢＡＣ配列までシームレスである（配列番号１３）。
実施例５：リンカー（結合体オリゴ）を使用して２つのＢＡＣベクターをアセンブルする
ＢＡＣライゲーションによりヒト遺伝子を挿入するための、マウスゲノム領域に対する相同性アームと制限部位を含有する標的化ベクターを作製するために、Ｃａｓ９／等温アセンブリにより２つのｍＢＡＣを縫い合わせることを利用した。この標的化ベクターを、ＢＡＣライゲーションに用いてヒト化標的化ベクターを作製した。ｍＢＡＣを、以下の反応により切断した：１２．５ｕｇのＤＮＡ、各アニーリングされたＲＮＡを２ｕｌずつ（５０ｕＭ）、１０ｕｌのＣａｓ９（０．８９ｕｇ／ｕｌ）、２５０ｕｌの緩衝液、５００ｕｌまでのＨ２Ｏ。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）抽出で洗浄し、２０ｕｌのＴＥに再懸濁した。次に、以下の反応により、リンカーを用いて２つのマウスＢＡＣを一緒にアセンブルした（図１１）：６ｕｌ（２ｕｇ）のｂＭＱ−２０８Ａ１６切断、５．６ｕｌ（２ｕｇ）のｂＭＱ−５０Ｆ１９切断、各リンカーを０．２５ｕｌずつ（５０ｕＭ）、４．３ｕｌ（１００ｎｇ）の選択カセット（Ｕｂｉ−Ｈｙｇ）カセット、１２ｕｌの高濃度アセンブリマスターミックス、１１．３５ｕｌのＨ２Ｏ。反応混合物を５０℃で１時間インキュベートし、３０℃のＨ２Ｏに対して透析した。１０ｕｌ又は３０ｕｌの透析した反応物を使用してＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。サンガー配列決定により全ての接合部を確認した。イルミナ配列決定により全ての接合部を確認した（図１２及び配列番号１７）。リンカー１は、ｍＢＡＣからカセット（配列番号１４）までシームレスである。リンカー２は、カセットからｍＢＡＣまでシームレスではない。プロジェクト設計の通り、ヒトスペーサー配列を組み込んでいる。リンカー３は、ｍＢ２からｍＢ３までシームレスではない。ＰＣＲ検証に使用された固有の配列を組み込んでいる。この領域は、ＥＳ電気穿孔のために直線化されたときに除去された（配列番号１５）。
図１３は、４つのリンカー及び等温アセンブリを使用して大きいヒト遺伝子断片をｍＢＡＣ上に挿入するために４つの結合体オリゴ（リンカー）を使用する例を図示する。
実施例６：切断及びアセンブリ用の試薬及び反応混合物
Ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）（ｓｓＲＮＡとして注文）は、（１）切断のための標的領域に相補的であるＲＮＡの２０ヌクレオチド、及び（２）ｔｒａｃｒ ＲＮＡ：＜２０ｎｔ ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ＞ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１０）にアニーリングするテイルを含有する。
Ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡとして注文）：ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１１）。
全てのＲＮＡを、Ｈ２Ｏ中１００ｕＭに再懸濁する。それぞれ２．５ｕｌのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを、５ｕｌのアニーリング緩衝液と混合する（最終濃度：１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５〜８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）。次に、混合物を９５℃で５分間インキュベートし、１時間かけてゆっくり室温に冷却する。Ｃａｓ９
２Ｘ切断緩衝液は、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５（最終＝２０ｍＭ）、３００ｍＭ ＫＣｌ（最終＝１５０ｍＭ）、１ｍＭ ＤＴＴ（最終＝０．５ｍＭ）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（最終＝０．１ｍＭ）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２（最終＝１０ｍＭ）を含有する。
大規模なＣａｓ９切断反応：室温で、５００ｕｌまでＨ２Ｏ、２５０ｕｌの切断緩衝液（２倍）、１２．５ｕｇのＤＮＡ、各ＲＮＡを２ｕｌずつ（５０ｕＭ濃度）、１０ｕｌのＣａｓ９（０．８９ｍｇ／ｍｌ濃度）を順に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。
この反応は、必要に応じて、例えば、５０ｕｌまでＨ２Ｏ、２５ｕｌの切断緩衝液、１２５ｎｇのＤＮＡ、各ＲＮＡを２ｕｌずつ（５ｕＭ濃度）、１ｕｌのＣａｓ９（０．８９ｍｇ／ｍｌ濃度）に縮小し、３７℃で１時間インキュベートすることができる。
アセンブリ反応は以下のように実行される：等温緩衝液：３ｍＬの１Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、１５０ｕｌの２Ｍ ＭｇＣｌ２、それぞれ６０ｕｌの１００ｍＭ：ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、３００ｕｌの１Ｍ ＤＴＴ、１．５ｇのＰＥＧ８０００、３００ｕｌの１００ｍＭ ＮＡＤ。等温緩衝液は、−２０℃で３２０ｕｌのアリコートに保存される。マスターミックスは以下のように調製される：３２０ｕｌの等温緩衝液、０．６４ｕｌのＴ５エキソヌクレアーゼ（ストック濃度＝１０Ｕ／ｕｌ）、２０ｕｌのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ストック濃度＝２Ｕ／ｕｌ）、１６０ｕｌのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ストック濃度＝４０Ｕ／ｕｌ）、６９９．３６ｕｌのＨ２Ｏを一緒に混合し、１５ｕｌ又は３０ｕｌのアリコートにし、−２０℃で保存する。総容量２０ｕｌの反応物において、１５ｕｌのマスターミックス（ＭＭ）を使用する。
あるいは、高濃度のマスターミックス（ＧＡ ＭＭ ＨＣ）を以下のように作製することができる：３２０ｕｌのｉｓｏ−ｔｈｅｒｍａｌ緩衝液、０．６４ｕｌのＴ５エキソヌクレアーゼ（ストック濃度＝１０Ｕ／ｕｌ）、２０ｕｌのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ストック濃度＝２Ｕ／ｕｌ）、１６０ｕｌのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ストック濃度＝４０Ｕ／ｕｌ）を一緒に混合し、６ｕｌ又は１２ｕｌのアリコートにし、−２０℃で保存する。総容量２０ｕｌの反応物において、６ｕｌのマスターミックスを使用する。
全てのアセンブリ反応に関して、ＤＮＡの濃度が決定されるべきであり（例えば、Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐにより）、１：６のモル比（ベクター対インサート（複数可））が使用される。標準的な濃度に関しては、１５ｕｌのアセンブリマスターミックスが使用される。ＤＮＡ及び水は、２００ｕｌのＰＣＲチューブにおいて、最終体積が２０ｕｌになるまで添加される。反応は、５０℃で１時間、熱サイクラーにおいて実行される。次に、反応物は−２０℃で保存され得る。高濃度に関しては、６ｕｌの高濃度アセンブリマスターミックスが使用される。ＤＮＡ及び水は、２００ｕｌのＰＣＲチューブにおいて、最終体積が２０ｕｌになるまで添加される。反応は、５０℃で１時間、熱サイクラーにおいて実行される。次に、反応物は−２０℃で保存され得る。反応の完了時に、１０ｕｌを３０分間水に対して透析し、適切なエレクトロコンピテント細胞（例えば、ＤＨ１０Ｂ又はＰｉｒ＋細胞）内に電気穿孔する。
Ｃａｓ９／等温アセンブリ反応：Ｃａｓ９ダイジェストに関して、各ＤＮＡを２．５ｕｇずつ（例えば、ＢＡＣ ＤＮＡ）、それぞれ４ｕｌの１０ｕＭガイド／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ、及び５ｕｌのＣａｓ９タンパク質（０．８９ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で２時間ダイジェストする。反応物を、６５℃で２０分間熱不活性化し、フェノールクロロホルム抽出し（例えば、Ｃａｓ９タンパク質を除去するために）、７０％エタノールで１回洗浄し、ＤＮＡを３５ｕｌの水に再懸濁する。等温アセンブリを、本明細書の別の箇所に記載されるように、１５ｕｌのマスターミックス（ＭＭ）と一緒に混合された５ｕｌのＤＮＡを用いて行い、５０℃で１時間インキュベートする。反応物を３０分間脱塩し、８ｕｌの反応物は細胞内に電気穿孔され得る。
実施例７：ヒト配列をＢＡＣベクター内に挿入するためのＣａｓ９／等温アセンブリ
ヒト化標的化ベクターを構築するために、ＭＡＩＤ ６２３６を、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体で切断してオーバーラップ配列を伴う切断された断片を生成した。ＶＩ５６８もｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体で切断して、ＭＡＩＤ６２３６の断片とオーバーラップする配列を生成した。Ｃａｓ９／等温アセンブリを、上述のように行い、結果としてヒト化遺伝子座がベクター（ＶＩ５９９）内に挿入された。このプロセスは図１４に概説される。
実施例８：選択なしでｇＢｌｏｃｋを使用するＣａｓ９／等温アセンブリ
Ｃａｓ９ダイジェスト及びアセンブリは、選択なしで、例えば、ｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡ断片を利用することにより行うこともできる。選択カセットなしで２本鎖ＤＮＡを遺伝子座内に追加する可能性を試験するために、ｇＢｌｏｃｋ ＤＮＡ断片を合成し、構築物内に挿入した。図１５Ａ及びＢに概説するように、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを、４．４ｋｂの断片を除去するために、ＴＣＲベータ遺伝子座内の２つの部位を標的とするように設計した。ｇＢｌｏｃｋを、メガヌクレアーゼ認識部位を構築物内に導入するように設計した。ｇＢｌｏｃｋは、選択マーカーを使用することなく、構築物内に挿入することができた。図１５Ａは、ＰＩＳｃｅＩ ｇＢｌｏｃｋの挿入を示し、図１５Ｂは、ＭａｕＢＩ ｇＢｌｏｃｋの挿入を示す。
最終構築物は、表１に示されるプライマーを使用したＰＣＲ接合部のスクリーニングにより、ｇＢｌｏｃｋのそれぞれの挿入が成功したことが確認された。接合部のスクリーニングのプロトコルは以下の通りである。ＰＣＲ反応物は、１μＬのＤＮＡ、０．５μＬのプライマー１、０．５μＬのプライマー２、１μＬのＤＭＳＯ、４μＬのｄＮＴＰ、２．５μＬの１０ｘ緩衝液、０．５μＬのＥｘ−Ｔａｑ、及び１５μＬの水を含有していた。反応は、熱サイクラーにおいて、９５℃で３分間、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間を２５サイクル、続いて７２℃で３０秒間、及び７２℃で５分間実行された。接合部の配列を配列決定により確認した。
実施例９：結合体オリゴを使用してヒト配列をＢＡＣベクター内に挿入するためのＣａｓ９／等温アセンブリ
図１６は、Ｃａｓ９／等温アセンブリ及び結合体オリゴを使用した直接ヒト化の例を提供する。ヒト断片及びマウス欠失を、Ｃａｓ９により取り出す（各ＢＡＣは２つのｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡを使用する）。ヒト断片及びマウス骨格を、３つのリンカー（結合体オリゴ）及び選択カセットを用いてギブソンアセンブリ反応において一緒に連結させる。
図１７は、大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）内にアセンブリするために、Ｃａｓ９／等温アセンブリ及び結合体オリゴを使用する間接的ヒト化の例を提供する。ｈＢＡＣ上のヒト断片を、２つのｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡを使用してＣａｓ９により切断する。ドナーは、上流及び下流の結合オリゴ並びに選択カセットを含む。Ｃａｓ９によるｈＢＡＣ切断後、断片を、組み込まれた相補的オーバーハングを伴う合成ドナーを使用して、ギブソンアセンブリにより「捕捉」する。標的化ベクターの構築は、ギブソンアセンブリ又はＢＨＲにより完成する。
実施例１０：Ｃａｓ９／等温アセンブリによる点変異の導入
図１８は、点変異を導入するためにＣａｓ９／等温アセンブリを利用する例を提供する。ドナーは、従来のクローニングにより作製される。選択カセットを、リンカーオーバーラップ及び点変異を含有する合成ＤＮＡ断片内に挿入する。ｍＢＡＣをＣａｓ９で切断し、配列をｍＢＡＣから除去し、ｍＢＡＣをドナーにギブソンアセンブルし、点変異及び選択カセットを含む構築物（ＬＴＶＥＣ）を得る。
実施例１１：Ｃａｓ９／等温アセンブリによるＢＡＣトリミング
図１９は、Ｃａｓ９／等温アセンブリ法を使用したＢＡＣトリミングの例を提供する。ＬＴＶＥＣから除去する必要がある領域を、Ｃａｓ９を使用してトリミングする。この例では、ＢＡＣトリミングによりＯｒｉ配列を除去する。２つのリンカー（結合体オリゴ）を使用してギブソンアセンブリ反応において、Ｏｒｉを置き換えられる。
実施例１２：ＣＡＳ９によるＢＡＣダイジェストの後にアセンブリが続く他の方法
本明細書に提供される方法において以下を含む他の方法が使用され得る。合成又はインビトロ転写ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを、９５℃に加熱し、室温にゆっくり冷却することにより反応前に予備アニーリングした。１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む又は含まないＣａｓ９プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の精製したＣａｓ９タンパク質（５０〜５００ｎＭ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ２本鎖（５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に、未変性の又は直線化されたプラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））を３７℃で６０分間インキュベートした。２５０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５倍ＤＮＡローディング緩衝液で反応を停止させ、０．８又は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。Ｃａｓ９突然変異切断アッセイに関しては、アガロースゲルに充填する前に反応を５倍ＳＤＳローティング緩衝液（３０％グリセロール、１．２％ ＳＤＳ、２５０ｍＭ ＥＤＴＡ）で停止させた。
人工ｃｒＲＮＡ及び人工ｔｒａｃｒＲＮＡを、３ｋｂ ＰＣＲ産物（ＵＢ−ＨＹＧ）とのアセンブリのために、ＭＡＩＤ ６１７７（１１６ｋｂ ＬＴＶＥＣ）において特定の配列を標的とするように設計した。ＰＣＲ産物は、ベクターとの５０ｂｐのオーバーラップを含有していた。等温１工程アセンブリを、以下のように、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された非熱安定性５’〜３’エキソヌクレアーゼの使用に基づいて使用ぢた。反応は以下を含有する設定であった：各１００ｆｍｏｌのｄｓＤＮＡ基質、１６μｌの５倍ＩＳＯ緩衝液、１６μｌ Ｔ５エキソヌクレアーゼ（０．２Ｕ／μｌ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、８．０μｌのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μｌ、ＮＥＢ）、１．０μｌのＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ、ＮＥＢ）、及び８０μｌまでの水。５倍ＩＳＯ（ＩＳＯｔｈｅｒｍａｌ）緩衝液は、２５％ ＰＥＧ−８０００、５００ｍＭトリス−Ｃｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＮＡＤ、及び各１０００μＭ ｄＮＴＰ（ｐＨ７．５）であった。
これにより、アセンブルされた各１．２５ｆｍｏｌ／μｌのｄｓＤＮＡ（又は各４５ｆｍｏｌ／μｌのｓｓＤＮＡ）、５％ ＰＥＧ−８０００、１００ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、２００ＭＭの各ｄＮＴＰ、１ｍＭ
ＮＡＤ、０．０２Ｕ／μｌ Ｔ５エキソヌクレアーゼ、４Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、及び０．０３Ｕ／μｌのＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度が得られた。
方法は、２０〜８０ｂｐオーバーラップする基質に関しては１．６４μｌ（０．２Ｕ／μｌ）のＴ５エキソヌクレアーゼを使用し、より大きいオーバーラップ（例えば、２００ｂｐ）を有する基質に関しては１．６μｌ（１Ｕ／μｌ）のＴ５エキソヌクレアーゼを使用した。Ｔ５エキソヌクレアーゼは、１０Ｕ／μｌのＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）濃縮酵素ストックからの１：５０希釈物（Ｔ５エキソヌクレアーゼ保存緩衝液中）として使用した。次に、反応物を５０℃で１５分間インキュベートした。
実施例１３：２つのオーバーラップするＢＡＣを縫合するための他の方法
本明細書に提供される方法において以下を含む他の方法が使用され得る。合成又はインビトロ転写ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを、９５℃に加熱し、室温にゆっくり冷却することにより反応前に予備アニーリングした。１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む又は含まないＣａｓ９プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の精製したＣａｓ９タンパク質（５０〜５００ｎＭ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ２本鎖（５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に、未変性の又は直線化されたプラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））を３７℃で６０分間インキュベートした。２５０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５倍ＤＮＡローディング緩衝液で反応を停止させ、０．８又は１％アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。Ｃａｓ９突然変異切断アッセイに関しては、アガロースゲルに充填する前に反応を５倍ＳＤＳローティング緩衝液（３０％グリセロール、１．２％ ＳＤＳ、２５０ｍＭ ＥＤＴＡ）で停止させた。
人工ｃｒＲＮＡ及び人工ｔｒａｃｒＲＮＡを、ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ ＢＡＣとのアセンブリのために、ヒト化ＨＬＡ−ＤＱ ＢＡＣにおいて特定の配列を標的とするように設計した。ベクターは、各ベクター上の２つの部位でＣａｓ９切断により作製された、互いに約７０ｂｐのオーバーラップを含有した（図２を参照）。等温１工程アセンブリを、以下のように、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された非熱安定性５’〜３’エキソヌクレアーゼの使用に基づいて使用ぢた。反応はほぼ以下を含有する設定であった：各１００ｆｍｏｌのｄｓＤＮＡ基質、１６μｌの５倍ＩＳＯ緩衝液、１６μｔ Ｔ５エキソヌクレアーゼ（０．２Ｕ／μｌ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、８．０μｌのＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（４０Ｕ／μｌ、ＮＥＢ）、１．０μｌのＰｈｕｓｉｏｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ、ＮＥＢ）、及び８０μｌまでの水。５倍ＩＳＯ（ＩＳＯｔｈｅｒｍａｌ）緩衝液は、２５％ ＰＥＧ−８０００、５００ｍＭトリス−Ｃｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＮＡＤ、及び各１０００μＭ ｄＮＴＰ（ｐＨ７．５）であった。
これにより、アセンブルされた各約１．２５ｆｍｏｌ／μｌのｄｓＤＮＡ（又は各４５ｆｍｏｌ／μｌのｓｓＤＮＡ）、５％ ＰＥＧ−８０００、１００ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、各２００ＭＭ ｄＮＴＰ、１ｍＭ ＮＡＤ、０．０２Ｕ／μｌ Ｔ５エキソヌクレアーゼ、４Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、及び０．０３Ｕ／μｌのＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度が得られた。
方法は、２０〜８０ｂｐオーバーラップする基質に関しては１．６４μｌ（０．２Ｕ／μｌ）のＴ５エキソヌクレアーゼを使用し、より大きいオーバーラップ（例えば、２００ｂｐ）を有する基質に関しては１．６μｌ（１Ｕ／μｌ）のＴ５エキソヌクレアーゼを使用した。Ｔ５エキソヌクレアーゼは、１０Ｕ／μｌのＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）濃縮酵素ストックからの１：５０希釈物（Ｔ５エキソヌクレアーゼ保存緩衝液中）として使用した。次に、反応物を５０℃で１５分間インキュベートした。
実施例１４：インサートをＢＡＣベクターとアセンブルするための他の方法
本明細書に提供される方法において以下を含む他の方法が使用され得る。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを、Ｈｙｂｅ緩衝液（１０Ｘ緩衝液：２０ｍＭトリス（７．５）、１００〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｕｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中１００ｕＭに溶解する。ＲＮＡをアニーリングするために、１０ｕｌの１００ｕＭ ｃｒＲＮＡ及び１０ｕｌの１００ｕＭ ｔｒａｃｒＲＮＡを８０ｕｌのアニーリング緩衝液に添加した。９０℃の温度ブロックにおいてＲＮＡを加熱し、次に、ヒーターからブロックを取り出し、ベンチ上で冷却する。ＲＮＡの最終濃度は約１０ｕＭである。
ＢＡＣをダイジェストするために、清浄なｍａｘｉｐｒｅｐ ＢＡＣ ＤＮＡを使用し、以下の混合物によりＢＡＣをダイジェストした。
３７°で１時間ダイジェストし、次に３０分間脱塩する。
ＢＡＣ及びインサートをアセンブルするために、プラスミドをダイジェストするか、又はＰＣＲを行い、インサートを作製する。ＰＣＲ反応に関して、少量のアリコートをゲル上で走らせ、純粋な産物を探し、産物が純粋でない場合、ゲル抽出の代わりにＰＣＲクリーンアップを行う。ＢＡＣ：インサートに関して、１：１〜１：６のモル比が望ましい。通常、５０ｎｇの精製されたインサートが用をなす。以下の反応ミックスを使用することができる：
氷上で、又は５０℃のＰＣＲ機械に直接、ＤＮＡ及びミックスを添加する。５０℃で１時間インキュベートする。０．５ｕＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、５０℃で１時間インキュベートする。３０分間脱塩し、ＤＨ１０Ｂ細胞内に８ｕｌの反応物を電気穿孔する。ダイジェスト効率をチェックするために、１０ｕｌのＢＡＣダイジェストをパルスフィールドゲル上で走らせることができる。ＲＮａｓｅを含まない水及び緩衝液を使用する。最終反応緩衝液は、１５ｕｌの最終容量に関して、２０ｍＭトリス（７．５）、１００〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｕｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する。
実施例において使用されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列は、
ＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣ（配列番号９）である。このＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、（１）標的配列に相補的なＲＮＡの約２０ヌクレオチド、及び（２）ｔｒａｃｒＲＮＡにアニーリングされるテイル配列（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１０））を含有する。
例えば、本発明の好ましい実施形態では、以下の項目が提供される。
（項目１）
少なくとも２つの核酸をアセンブルするための方法であって、
（ａ）第１の核酸を第１のヌクレアーゼ剤と接触させることであって、前記第１のヌクレアーゼ剤が、第１の標的部位で前記第１の核酸を切断して、第１のダイジェストされた核酸を、前記第１のダイジェストされた核酸と第２の核酸との間におけるオーバーラップ末端配列を伴って産生する、接触させることと、
（ｂ）前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸をエキソヌクレアーゼと接触させて、前記第１のダイジェストされた核酸と前記第２の核酸との間の相補的配列を曝露することと、
（ｃ）工程（ｂ）から生成された２つの核酸断片をアセンブルすることと、を含む、方法。
（項目２）
工程（ｃ）が、
（ｉ）前記曝露された相補的配列をアニーリングすることと、
（ｉｉ）前記アニーリングした相補的配列の３’末端を伸長することと、
（ｉｉｉ）前記第１及び前記第２の核酸をライゲーションすることと、を更に含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
工程（ａ）が、前記第２の核酸を第２のヌクレアーゼ剤と接触させることを更に含み、前記第２の核酸が、前記オーバーラップ末端配列を含まず、前記第２のヌクレアーゼ剤が、第２の標的部位で前記第２の核酸を切断して、第２のダイジェストされた核酸を、前記第１のダイジェストされた核酸と前記第２のダイジェストされた核酸との間における前記オーバーラップ末端配列を伴って産生し、かつ
工程（ｂ）の前記第２の核酸が、前記第２のダイジェストされた核酸である、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記第１又は第２のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも１つが、前記第１又は前記第２の標的部位を標的とする、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記オーバーラップ末端配列が、２０ｂｐ〜２００ｂｐの長さの範囲である、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ｇＲＮＡが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む、項目４〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記第１の標的部位及び第２の標的部位のうちの少なくとも１つが、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直ぐ隣接している、項目４〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記第１、前記第２、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記細菌人工染色体が、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記細菌人工染色体が、ヒト配列を含む、項目１１又は１２に記載の方法。
（項目１４）
少なくとも２つの核酸をアセンブルするための方法であって、
（ａ）第１の核酸を、第１のヌクレアーゼ剤及び第２のヌクレアーゼ剤と接触させて第１のダイジェストされた核酸を産生することであって、前記第１のヌクレアーゼ剤が、第１の標的部位で前記第１の核酸の第１の鎖上に切れ目を生成し、前記第２のヌクレアーゼ剤が、第２の標的部位で前記第１の核酸の第２の鎖上に切れ目を生成して、その両端のうちの１つに５’又は３’オーバーハング配列を含む第１のダイジェストされた核酸を産生する、産生することと、
（ｂ）前記第１のダイジェストされた核酸及び前記５’又は３’オーバーハング配列に対する相補的配列を含む第２の核酸をアニーリングすることと、
（ｃ）前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸をライゲーションすることと、を含む、方法。
（項目１５）
工程（ｂ）が、前記第２の鎖を鋳型として使用して前記第１の鎖の３’末端を伸長することと、前記第１の鎖を鋳型として使用して前記第２の鎖の３’末端を伸長することと、を更に含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記第１又は第２のヌクレアーゼ剤のうちの少なくとも１つが、前記第１又は前記第２の標的部位を標的とする、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を含む、項目１３又は１４に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み、これらのうちの１つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の標的部位が、前記第２の標的部位から少なくとも４ｂｐ離れている、項目１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記ｇＲＮＡが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む、項目１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記第１の標的部位及び第２の標的部位のうちの少なくとも１つが、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直ぐ隣接している、項目１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
２つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
（ａ）第１の核酸を少なくとも１つのヌクレアーゼ剤と接触させて第１のダイジェストされた核酸を生成することと、
（ｂ）前記第１のダイジェストされた核酸を第２の核酸、結合体オリゴ、及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
（ｉ）前記第１のダイジェストされた核酸に相補的である第１の相補的配列と、
（ｉｉ）スペーサーと、
（ｉｉｉ）前記第２の核酸に相補的である第２の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第１及び第２の相補的配列を曝露する、接触させることと、
（ｃ）前記結合体オリゴを前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。
（項目２２）
工程（ｃ）におけるアセンブルが、
（ｉ）前記結合体オリゴの前記第１の相補的配列を前記第１のダイジェストされた核酸に、及び前記結合体オリゴの前記第２の相補的配列を前記第２の核酸にアニーリングすることと、
（ｉｉ）前記結合体オリゴを前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸にライゲーションすることと、を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記結合体オリゴの前記第１の相補的配列及び前記第２の相補的配列が、１５〜１２０の相補的塩基を含む、項目２１又は２２に記載の方法。
（項目２４）
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、非相補的核酸を含む、項目２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記第１のダイジェストされた核酸が、前記第２の核酸にシームレスにアセンブルされる、項目２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ヌクレアーゼ剤が、前記第１の核酸の末端から少なくとも２０ｂｐの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも２０ｂｐの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第１の相補的配列と前記少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第２の相補的配列と前記少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、
したがって、前記第１の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第２核酸とのアセンブリが、前記少なくとも２０ｂｐの断片を再構築し、前記第１及び第２の核酸をシームレスにアセンブルする、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ヌクレアーゼ剤が、前記第２の核酸の末端から少なくとも２０ｂｐの断片を切断するように設計され、そこに前記シームレスアセンブリが生じ、
前記結合体オリゴの前記スペーサーが、前記少なくとも２０ｂｐの断片と同一である配列を含み、核酸塩基が、前記第１の相補的配列と前記少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、核酸塩基が、前記第２の相補的配列と前記少なくとも２０ｂｐの断片との間に存在せず、
したがって、前記第１の核酸の、前記結合体オリゴ及び前記第２の核酸とのアセンブリが、前記少なくとも２０ｂｐの断片を再構築し、前記第１及び第２の核酸をシームレスにアセンブルする、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記スペーサーが、約２０ｂｐ〜約１２０ｂｐから構成される、項目２６又は２７に記載の方法。
（項目２９）
工程（ａ）が、前記第２の核酸を、第２のヌクレアーゼ剤及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記第２のｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体が、前記第２の核酸を切断して、前記結合体オリゴの前記第２の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生し、前記第１のダイジェストされた核酸が、前記第２のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
工程（ａ）が、前記第２の核酸を、制限酵素又はメガヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼと接触させることを更に含み、前記制限酵素又はメガヌクレアーゼが、前記第２の核酸を切断して、前記結合体オリゴにおける前記第２の相補的配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のダイジェストされた核酸を産生し、前記第１のダイジェストされた核酸が、前記第２のダイジェストされた核酸にアセンブルされる、項目２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
工程（ｂ）が、前記第１及び／又は前記第２のダイジェストされた核酸の３’末端を伸長することを更に含む、項目２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記結合体オリゴが、同じ反応において、前記第１の核酸及び前記第２の核酸にアセンブルされる、項目２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記結合体オリゴが、前記第１の核酸及び前記第２の核酸に連続してアセンブルされる、項目２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記少なくとも１つのヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、前記第１又は前記第２の標的部位を標的とする、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｇＲＮＡ−Ｃａｓ複合体）を含む、項目２１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣドメインと、ＨＮＨドメインと、を含み、これらのうちの少なくとも１つが、エンドヌクレアーゼ活性を欠く、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記ｇＲＮＡが、規則的な間隔をもってクラスター化された短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む、項目３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記第１の標的部位及び第２の標的部位のうちの少なくとも１つが、プロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直ぐ隣接している、項目３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記少なくとも１つのヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む、項目２１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記第１、前記第２、又は両方の核酸が、細菌人工染色体に由来する、項目１４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記細菌人工染色体が、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記細菌人工染色体が、ヒトポリヌクレオチド配列を含む、項目４０又は４１に記載の方法。
（項目４３）
前記第１、前記第２、又は両方の核酸が、ヒトＤＮＡ、ゲッ歯類ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む、項目１４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記第１、前記第２、又は両方の核酸が、少なくとも１０ｋｂである、項目２１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記結合体オリゴが、ｇＢｌｏｃｋを含む、項目２１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ｇＢｌｏｃｋが、選択カセットを含まない、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
２つ以上の核酸をアセンブルするための方法であって、
（ａ）第１の核酸を少なくとも１つのヌクレアーゼ剤と接触させて第１のダイジェストされた核酸を生成することと、
（ｂ）第２の核酸を第２のヌクレアーゼ剤と接触させて第２のダイジェストされた核酸を生成することと、
（ｃ）前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２のダイジェストされた核酸を、結合体オリゴ及びエキソヌクレアーゼと接触させることであって、
前記結合体オリゴが、
（ｉ）前記第１のダイジェストされた核酸に相補的である第１の相補的配列と、
（ｉｉ）スペーサーと、
（ｉｉｉ）前記第２のダイジェストされた核酸に相補的である第２の相補的配列と、を含み、
前記エキソヌクレアーゼが、前記第１及び第２の相補的配列を曝露する、接触させることと、
（ｄ）前記結合体オリゴを前記第１のダイジェストされた核酸及び前記第２の核酸とアセンブルすることと、を含む、方法。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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