JP2016523898A - 温州ミカン未熟果抽出物、又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、温州ミカン未熟果抽出物及び／又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患の治療若しくは予防用組成物に関する。本発明の組成物は、ＳＴＡＴ６の活性阻害、エオタキシン−１の発現抑制、好酸球の凝集作用を阻害することにより炎症反応を防いで、アレルギー性炎症疾患、アトピー性皮膚炎、皮膚湿疹、乾癬などに対する予防及び治療効果を示す。なお、細胞毒性及び皮膚副作用がないことから、医薬品及び化粧料に安全に適用可能である。【選択図】図１

Description

本発明は、大韓民国保健福祉部のグローバルコスメチック研究開発事業の炎症性皮膚疾患改善素材に関する研究課題（課題番号Ａ１０３０１７）の結果物であり、具体的には温州ミカン未熟果抽出物、又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物に関する。

アトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）は、持続的な掻痒症及び皮膚の急慢性湿疹病変を特徴とする慢性炎症性皮膚疾患であり、皮膚病変に加えて、喘息、アレルギー性鼻炎などを伴う。アトピー性皮膚炎の原因としては、大きく、遺伝的な要因、免疫学的な要因及び環境的な要因が挙げられ、これらに加えて、最近、皮膚バリア異常などが主な原因として取り上げられている。また、アトピー性皮膚炎については、脂質中のガンマリノレン酸の欠乏及びサイトカインやケモカインの分泌によるアトピー性皮膚炎の発生が報告されている。

ケモカインは、皮膚に炎症細胞が浸潤するのに重要な役割を果たすが、Ｃ−Ｃケモカインであるエオタキシン−１は、このような皮膚炎病変において特に増加し、これは、Ｃ−Ｃケモカイン受容体３（ＣＣＲ３）を有する好酸球及びヘルパー−Ｔ細胞２型（Ｔｈ２）の化学走化性と密接な関係がある。

エオタキシン−１は、好酸球、リンパ球、大食細胞、腺維芽細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞など各種多用な細胞において発現するが、好酸球を皮膚炎病変に引き寄せるのに重要な役割を果たす。好酸球は、毒性が非常に強いタンパク質基及び自由ラジカルを分泌するため微生物及び寄生虫を殺すが、不適切に活性化する場合に宿主に深刻な組織損傷を与えるため非常に厳しく調節される。これらの好酸球が循環血液から組織に移動するときに鍵となる物質がエオタキシン−１であり、炎症部位の組織から分泌されたエオタキシン−１が好酸球の表面のＣＣＲ３受容体に結合することにより、炎症病変への好酸球の移動が行われる。したがって、エオタキシン−１及びＣＣＲ３の発現を効果的に調節することにより皮膚炎症反応が防がれる。

アトピーは、１９７０年代後に先進国を中心として発病される重要疾病の一つであり、全世界的に増加しつつある傾向にあり、有病率が人口の２０％を占めるという報告がある。米国では、１，５００万名の人々がアトピーに悩んでおり、韓国でも小学生、中学生、高校生の１６．３％がアトピーに悩んでいる（Ａｈｎ Ｓ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｓｋｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｒｅｓ．， ８，１４７−５１， ２００６）。現在、アトピー性皮膚炎治療剤としては、ステロイド製剤、局所免疫抑制剤及び抗ヒスタミンなどが用いられているが、前記薬物製剤を長期に亘って用いる場合、皮膚の薄肉化、皮膚色の変色、骨多孔症、動脈硬化、発癌可能性及び耐性による症状悪化などの問題があるため、天然物から由来して安全でありながらも、抗炎症効果に優れた組成物の開発が行われている。

一方、温州ミカン（ウンシュウミカン）は、芸香科温州ミカン属の常緑喬木であり、韓国では済州島において自生し、日本、中国、中南米、黒海等地に分布されていると知られている。

温州ミカン木の果実は、食用として利用されるだけではなく、ジュース、缶詰めなどの
加工製品として２０％以上が消費されており、他の果実に比べて豊富な果汁、ユニークな香味及び高機能性成分を有している。例えば、温州ミカンは、製油成分であるｄ−リモネン、リナロール、酢酸リナリル、フラボノイドであるヘスペリジン、ナリンギン、ポンシリン、ノビレチン、アルカロイドであるシネフリン、ペクチン、アスコルビン酸、ベータクリプトキサンチン、クマリンなどの物質を含有しており、これらは、消火器の刺激、肥満、せき、血圧上昇、抗アレルギー、抗菌作用などをすると知られている。

しかしながら、最近、頻繁な雨、湿度及び温度などの環境の変化により未熟果及び低品質の温州ミカンの出荷、ハウスなどの施設の栽培を通した量産及び輸入温州ミカンの選好などにより温州ミカンの値段が暴落してしまった。そこで、温州ミカンの生産量の減縮及び品質の高級化のために、未熟果を予め収穫して処理、徹底した選別及び品質管理、並びに未熟果を用いた機能性組成物の開発などの対策が講じられている。例えば、予め収穫した未熟果の生理活性物質の分離若しくはこれらを用いた用途開発のための多くの研究が行われている。

これに関する技術として、大韓民国登録特許第１２５９７９１号公報は、未塾温州ミカン類に含有されているシトルスフラボノイドを用いた健康補助食品の製造方法及びこれを用いた健康補助食品について開示しており、大韓民国登録特許第１１６２７６１号公報は、未熟温州ミカン抽出物を含む肥満予防若しくは治療用組成物について開示しており、大韓民国登録特許第０１３１５２１２号公報は、温州ミカンの木の未熟果皮から分離した抽出物を含むうつ病治療剤について開示している。

韓国登録特許第１２５９７９１号公報 韓国登録特許第１１６２７６１号公報

そこで、本発明者らは、温州ミカン未熟果の活用方案について研究したところ、温州ミカン未熟果抽出物及びシネフリンが炎症性皮膚疾患の治療に優れた効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、温州ミカン未熟果抽出物及び／又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患の治療若しくは予防用薬剤学的組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、温州ミカン未熟果抽出物及び／又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患の改善若しくは予防用化粧料組成物を提供することである。

一つの態様として、本発明は、温州ミカン未熟果抽出物を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患の治療若しくは予防用組成物に関する。

本発明において、前記温州ミカンは、芸香科温州ミカン属の常緑喬木であり、前記温州ミカン未熟果とは、果実の形成後３〜４ヶ月目の未熟な果実のことをいう。

未熟な果実は、果実の形成後に、期間により含有成分の変化があるが、本発明の温州ミカン未熟果は、特に、シネフリンを含有することを特徴とする。具体的な実験において、
本発明者らは、果実の形成後３〜４ヶ月目の未熟な果実の抽出物は、他の温州ミカン未熟果の抽出物とは異なり、シネフリンを含有することを最初に見出した。

このため、本発明の温州ミカン未熟果抽出物は、シネフリンを含有することを特徴とする。

本発明の温州ミカン未熟果抽出物は、温州ミカン未熟果の果皮、果肉及び果実よりなる群から選ばれるいずれか一種以上を用いた抽出、分画若しくは精製の各段階において得られる全ての抽出液、分画及び精製物、これらの希釈液、濃縮液若しくは乾燥物を網羅する。

本発明において、前記抽出物は、当業界における公知の抽出方法及び抽出溶媒を用いて得る。好ましくは、水、炭素数１〜４の無水若しくは含水の低級アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなど）、前記低級アルコールと水との混合溶媒、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム若しくは１，３−ブチレングリコールを抽出溶媒として得られる。

また、前記温州ミカン未熟果抽出物は、前記抽出溶媒により抽出される方法に加えて、通常の精製過程により得られる。例えば、所定の分子量のカットオフ値を有する限外ろ過膜を用いた分離、様々なクロマトグラフィー（大きさ、電荷、疎水性若しくは親和性による分離のために製作されたもの）による分離など追加的に行われる様々な精製方法により得られる分画により温州ミカン未熟果抽出物が得られる。

本発明において、炎症性皮膚疾患とは、アレルギー性炎症疾患、アトピー性皮膚炎、皮膚湿疹若しくは乾癬など様々な経路を経て発生する皮膚トラブル若しくは皮膚疾患のことをいう。

一つの具体的な実施において、正常腺維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）にインターロイキン−４（ＩＬ−４）を処理してエオタキシン−１を誘導した後、温州ミカン未熟果抽出物の濃度によるエオタキシン−１のｍＲＮＡ及び細胞内外の発現を調べてみたところ、温州ミカン未熟果抽出物の濃度が増加するにつれて、ｍＲＮＡ及び細胞内外の発現が減少する傾向にあった。また、温州ミカン未熟果抽出物を含有するクリームを用いてアトピー炎症改善効果を試験したところ、人体の皮膚に安全であり、使用期間が長くなるにつれてアトピー炎症が改善されることが確認された。

このため、本発明の温州ミカン未熟果抽出物は、アレルギー性炎症疾患、アトピー性皮膚炎、皮膚湿疹若しくは乾癬などの炎症性皮膚疾患の治療及び予防のために好適に使用可能である。なお、温州ミカン未熟果は食用として利用されるが、この抽出物の人体に対する確認実験を通して安全性を確認したところ、人体に安全に使用可能である。

本発明の温州ミカン未熟果抽出物は、組成物の総重量に対して０．０００１〜１０重量％、好ましくは、０．０００１〜５重量％で前記組成物に含有される。温州ミカン未熟果抽出物の含量が０．０００１重量％未満である場合には抗炎症活性の効能があまり得られず、１０重量％を超える場合には温州ミカン未熟果抽出物の含量の増加による効果の増加が僅かであるため剤形上の安定性が確保されないという問題がある。

他の態様として、本発明は、シネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患の治療若しくは予防用組成物に関する。

本発明において、前記シネフリンは、４−［１−ヒドロキシ−２−（メチルアミノ）エ
チル］フェノールのＩＵＲＡＣ名を有する物質であり、その構造は、下記一般式１の通りである。

…一般式１

前記シネフリンは、抗癌、うつ病及び肥満に効能があることが知られており、温州ミカン類に属する温州ミカン属、金柑属及びカラタチ属、好ましくは、温州ミカン属の温州ミカン、より好ましくは、温州ミカンの未熟果から抽出、分離及び精製されるか、天然、雑種、変種植物の様々な器官、根、茎、葉、果実、花だけではなく、出芽酵母などの微生物の培養により得られるか、化学的に合成されて製造された商品（例えば、シグマ社製の（±）−ｓｙｎｅｐｈｒｉｎｅ）である。

本発明において、前記シネフリンの塩は、遊離酸により形成される酸付加塩若しくは塩基により形成される金属塩であることが好ましい。例えば、遊離酸としては、無機酸及び有機酸が使用可能であり、無機酸としては、塩酸、硫酸、臭素酸、亜硫酸若しくは燐酸などが使用可能であり、有機酸としては、クエン酸、酢酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸などが使用可能である。また、金属塩としては、アルカリ金属塩若しくはアルカリ土金属塩、ナトリウム、カリウム若しくはカルシウム塩が使用可能である。しかし、必ずしもこれらに限定されるとは限らない。

一つの具体的な実施において、正常腺維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）にインターロイキン−４（ＩＬ−４）を処理してエオタキシン−１を誘導した後、シネフリンの濃度によるエオタキシン−１のｍＲＮＡ及び細胞内外の発現を調べてみたところ、シネフリンの濃度が増加するにつれて、ｍＲＮＡ及び細胞内外の発現が減少する傾向にあった。また、シネフリンを含有するクリームを用いてアトピー炎症改善効果を試験したところ、人体の皮膚に安全であり、使用期間が長くなるにつれてアトピー炎症が改善されることが確認された。

このため、本発明のシネフリン若しくはこの塩は、アレルギー性炎症疾患、アトピー性皮膚炎、皮膚湿疹若しくは乾癬などの炎症性皮膚疾患の治療及び予防に好適に使用可能である。なお、シネフリン若しくはこの塩の人体に対する確認実験を通して安全性を確認したところ、人体に安全に使用可能である。

前記シネフリン若しくはこの塩は、組成物の総重量に対して０．０００１〜１０重量％、好ましくは、０．０００１〜５重量％で前記組成物に含有される。シネフリン若しくはこの塩の含量が０．０００１重量％未満である場合には炎症性皮膚疾患に対する治療及び予防の効能があまり得られず、１０重量％を超える場合にはシネフリン若しくはこの塩の含量の増加による効果の増加が僅かであるため剤形上の安定性が確保されないという問題がある。

一方、本発明の前記温州ミカン未熟果抽出物を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物及び／又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物は、薬剤学的組成物として使用可能である。

前記薬剤学的組成物は、前記温州ミカン未熟果抽出物を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物及び／又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物に加えて、薬剤学的に許容される担体、賦形剤及び希釈剤を含む。本発明の薬剤学的組成物は、一般的に用いられる成分を含む。例えば、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤及び担体を含む。

前記薬剤学的組成物として好適に使用可能な担体としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油などが挙げられるが、これらに限定されない。薬剤学的に許容される担体及び製剤の好適な例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ
ｅｄ．， １９９５）に詳細に記載されている。

前記薬剤学的組成物は、経口的に若しくは非経口的に投与され、好ましくは、非経口的に投与され、より好ましくは、塗布による局所投与方式により投与される。

前記薬剤学的組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、薬剤学的に有効な量とは、医学的な治療若しくは予防に適用可能な合理的な恩恵／リスクの割合で疾患を治療若しくは予防するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、疾患の種類及びその重症度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康及び性別、患者の薬物への敏感度、用いられた特定の抽出物の投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、用いられた特定の抽出物と配合若しくは併用される薬物を含む要素及びその他の医学分野において公知の要素により決定される。一般に、成人に一日につき０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１０〜１００ｍｇ／ｋｇの容量を、一日につき一回又は数回投与する。また、外用剤である場合には、成人を基準として１．０〜３．０ｍｌの量で一日につき一回乃至５回塗布して一ヶ月以上用い続けることが好ましい。但し、前記投与量による本発明の範囲を限定しようとするものではない。

前記薬剤学的組成物は、当該発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に実施可能な方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化させることにより、単位容量の形で製造されるか、又は大量容器内に納められて製造される。このとき、剤形は、治療目的に応じて、薬剤学分野における通常の製剤に剤形化されるが、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、乳濁剤、硬膏剤、軟膏剤、スプレイ剤、オイル剤、ゲル剤、酒精剤、チンキ剤、浴剤、擦剤、ローション剤、貼付剤、パッド剤、クリーム剤などに剤形化される。また、患部に直接的に塗布する局所投与を目的とする皮膚外用剤として好適に使用可能であるが、この場合、軟膏剤、ローション剤、スプレイ剤、ゲルなどの剤形であることが好ましい。また、これらの皮膚外用剤は、治療部位に直接的に適用可能な支持基材若しくは基質などに含まれ、支持基材の例としては、ガーゼ若しくは包帯が挙げられる。

本発明の前記温州ミカン未熟果抽出物を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物及び／又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物は、化粧料組成物として利用可能である。

前記化粧料組成物は、温州ミカン未熟果抽出物を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物及び／又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物に加えて、化粧料組成物に汎用される成分
を含む。例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料などの通常の補助剤及び担体を含む。

前記化粧料組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤入りクレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション、スプレイ、栄養クリーム、収斂化粧水、柔軟化粧水、ローション、エッセンス、栄養ゲル又はマッサージクリームなどに剤形化されるが、これらに限定されない。

前記化粧料組成物の剤形がペースト、クリーム又はゲルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、タラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛などが使用可能である。

前記化粧料組成物の剤形がパウダー又はスプレイである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート又はポリアミドパウダーが使用可能であり、特に、前記化粧料組成物の剤形がスプレイである場合には、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルなどの推進体を更に含む。

前記化粧料組成物の剤形が溶液又は乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤若しくは乳濁化剤が使用可能であるが、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾアート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール若しくはソルビタンの脂肪酸エステルなどが使用可能である。

前記化粧料組成物の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノール若しくはプロピレングリコールなどの液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁剤、微細結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天若しくはタラカントなどが使用可能である。

前記化粧料組成物の剤形が界面活性材入りクレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールスルファート、脂肪族アルコールエーテルスルファート、スルホこはく酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルファート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体若しくはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが使用可能である。

他の態様によれば、本発明は、温州ミカン未熟果抽出物及び／又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する組成物を個体に投与して個体の炎症性皮膚疾患を治療、改善若しくは予防する方法に関する。

本発明の個体に投与する組成物は、上述したように、個体の炎症性皮膚疾患、例えば、アレルギー性炎症疾患、アトピー性皮膚炎、皮膚湿疹、乾癬などを治療、改善若しくは予防する効果がある。

本発明において、用語「個体」とは、本発明の前記組成物を投与して症状が好転される疾患を有する人間をはじめとする猿、牛、馬、豚、洋、犬、猫、ラット、マウス、チンパ
ンジーなどの哺乳動物を意味する。

本発明において、用語「治療」若しくは「改善」とは、個体における（ａ）疾患若しくは疾病の発展の抑制、（ｂ）疾患若しくは疾病の軽減及び（ｃ）疾患若しくは疾患の除去を意味する。本発明において、用語「予防」とは、疾患若しくは疾病を保有していると診断されたことはないが、このような疾患若しくは疾病にかかり易い傾向にある個体における疾患若しくは疾病の発生を抑えることを意味する。

本発明の炎症性皮膚疾患治療若しくは予防用組成物は、ＳＴＡＴ６の活性阻害、エオタキシン−１の発現の抑制、好酸球の凝集作用を阻害することにより、炎症反応を防いでアレルギー性炎症疾患、アトピー性皮膚炎、皮膚湿疹、乾癬などに対する予防及び治療効果を示す。したがって、温州ミカン未熟果抽出物及び／又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する組成物を医薬品及び化粧料に安全に適用することができる。

図１は、温州ミカン未熟果抽出物若しくはこれから分離したシネフリンの濃度によるエオタキシン−１の細胞内発現の抑制効果を測定した結果である。 図２は、温州ミカン未熟果抽出物若しくはこれから分離したシネフリンの濃度によるエオタキシン−１の細胞外発現の抑制効果を測定した結果である。 図３は、温州ミカン未熟果抽出物若しくはこれから分離したシネフリンの濃度によるエオタキシン−１ｍＲＮＡの発現抑制効果を測定した結果である。 図４は、温州ミカン未熟果抽出物から分離したシネフリンの濃度によるＳＴＡＴ６のリン酸化の抑制効果を測定した結果である。 図５は、温州ミカン未熟果抽出物から分離したシネフリンの濃度によるＳＴＡＴ６の核内への転座を遮断する効果を観察した結果である。 図６は、温州ミカン未熟果抽出物から分離したシネフリンの濃度による好酸球の凝集作用の抑制効果を測定した結果である。

以下、実施例を挙げて本発明を詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例により限定されないということは本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：温州ミカン未熟果の抽出物の製造
未熟な温州ミカンを洗浄及び粉砕した後、エタノールに５日間浸漬して抽出した。次いで、ろ過及び濃縮を行った後、凍結乾燥して温州ミカン未熟果抽出物粉末を製造した。

実施例２：温州ミカン未熟果からのシネフリンの分離及び分析
前記実施例１において得られた温州ミカン未熟果抽出物粉末をＢｕｌｋ Ｃ１８クロマトグラフィを用いて精製して１１個の分画抽出物に分け、これらの分画のうち２番目の分画からＰｒｅｐ−ＨＰＬＣを用いてＣ１８カラムクロマトグラフィにより新規な活性成分物質を単離した。前記活性成分物質に対する構造は、ＮＭＲ、ＩＲ、ＵＶなどの機器を用いて４−［１−ヒドロキシ−２−（メチルアミノ）エチル］フェノール（分子量：１６７．２１）であることが確認され、一般化学名は、シネフリンであることが確認された。

実施例３：温州ミカン未熟果抽出物若しくはこれから分離したシネフリンのエオタキシン−１の細胞内分泌抑制効果の測定
ヒトの正常腺維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３、亜洲大学皮膚科）にエオタキシン−１レポー
タ遺伝子をスーパーフェクト（キアゲン社製）を用いて挿入して形質変換させた後、５％濃度のＣＯ_２培養器において３７℃の条件で２４時間培養した。次いで、前記形質転換された腺維芽細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）入り２４ウェルマイクロプレートに１ウェル当たりに約２×１０^５個の細胞になるように接種し、１、１０及び１００ｐｐｍの未熟温州ミカン抽出物、又は１０、１００及び２００μＭのシネフリンをそれぞれ処理した後、エオタキシン−１を誘導すると知られているインターロイキン−４（Ｒ＆Ｄ、ミネアポリスＭＮ、ＩＬ−４）５０ｎｇ／ｍｌを更に処理して２４時間培養した後に細胞を収集した。次いで、前記収集した細胞を破砕してルシフェラーゼの基質と反応させて発光を測定してエオタキシン−１のプロモーター活性を測定した。その結果を図１に示す。

実験の結果、ＩＬ−４により誘導されたエオタキシン−１のプロモーター活性を温州ミカン未熟果抽出物及びこれから分離したシネフリンが減少させることが分かり、温州ミカン未熟果抽出物及びこれから分離したシネフリンの濃度が増加するにつれてエオタキシン−１のプロモーター活性が減少することから、濃度依存的な傾向があることが分かる。

実施例４：温州ミカン未熟果抽出物若しくはこれから分離したシネフリンのエオタキシン−１細胞外分泌抑制効果の測定
ヒトの正常腺維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３、亜洲大学皮膚科）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）入り２４ウェルマイクロプレートに１ウェル当たりに約２×１０^５個の細胞になるように接種し、５％濃度のＣＯ_２培養器において３７℃の条件で２４時間培養した。次いで、１、１０及び１００ｐｐｍの未熟温州ミカン抽出物、若しくは１０、１００及び２００μＭのシネフリンをそれぞれ処理した後、インターロイキン−４（Ｒ＆Ｄ、ミネアポリスＭＮ、ＩＬ−４）５０ｎｇ／ｍｌを更に処理して２４時間培養した後に細胞培養液を収集した。ＥＬＩＳＡキットを用いてエオタキシン−１の分泌度を測定した。その結果を図２に示す。

実験の結果、ＩＬ−４により誘導されたエオタキシン−１の細胞外分泌を温州ミカン未熟果抽出物及びこれから分離したシネフリンが減少させることが分かり、温州ミカン未熟果抽出物及びこれから分離したシネフリンの濃度が増加するにつれてエオタキシン−１の細胞外分泌が減少することから、濃度依存的な傾向があることが分かる。

実施例５：温州ミカン未熟果抽出物若しくはこれから分離したシネフリンのエオタキシン−１ｍＲＮＡ発現阻害効果の測定
ヒトの正常腺維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３、亜洲大学皮膚科）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）入り２４ウェルマイクロプレートに１ウェル当たりに約２×１０^５個の細胞になるように接種し、５％濃度のＣＯ_２培養器において３７℃の条件で２４時間培養した。次いで、１、１０及び１００ｐｐｍの未熟温州ミカン抽出物、又は１０、１００及び２００μＭのシネフリンをそれぞれ処理した後、インターロイキン−４（Ｒ＆Ｄ、ミネアポリスＭＮ、ＩＬ−４）５０ｎｇ／ｍｌを更に処理して２４時間培養した後に細胞培養液を収集した。前記収集した細胞からｔＲＮＡを抽出した後、抽出したｔＲＮＡに基づいて相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した後、合成した相補性ＤＮＡを鋳型としてリアルタイム重合酵素連鎖定量検査を行ってエオタキシン−１のｍＲＮＡの発現度を測定した。その結果を図３に示す。

実験の結果、ＩＬ−４により誘導されたエオタキシン−１のｍＲＮＡの発現を温州ミカン未熟果抽出物及びこれから分離したシネフリンが減少させることが分かり、温州ミカン未熟果抽出物及びこれから分離したシネフリンの濃度が増加するにつれてエオタキシン−１のｍＲＮＡの発現が減少することから、濃度依存的な傾向があることが分かる。

実施例６：温州ミカン未熟果抽出物から分離したシネフリンのＳＴＡＴ６のリン酸化抑制効果の測定
ヒトの正常腺維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３、亜洲大学皮膚科）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）入り２４ウェルマイクロプレートに１ウェル当たりに約２×１０^５個の細胞になるように接種し、５％濃度のＣＯ_２培養器において３７℃の条件で２４時間培養した。次いで、１０、１００及び２００μＭのシネフリンを６０分間それぞれ処理した後、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を処理して２０分間培養した。次いで、細胞を回収して溶解させた後、ウェスターンブロット方法を用いてＳＴＡＴ６のリン酸化阻害度を測定した。その結果を図４に示す。

実験の結果、シネフリンは、ＩＬ−４により誘導されたＳＴＡＴ６のリン酸化を効果的に遮断することが分かる。

実施例７：温州ミカン未熟果抽出物から分離したシネフリンのＳＴＡＴ６の核内への転座抑制効果の測定
ヒトの正常腺維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３、亜洲大学皮膚科）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）入り２４ウェルマイクロプレートに１ウェル当たりに約２×１０^５個の細胞になるように接種し、５％濃度のＣＯ_２培養器において３７℃の条件で２４時間培養した。次いで、２００μＭのシネフリンを６０分間処理した後、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を処理して２０分間培養した。次いで、前記細胞をパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ；ＰＦＡ）で固定した後、ＳＴＡＴ６と特異的に反応する１次抗体を処理した。次いで、ＦＩＴＣ付き２次抗体を処理してＳＴＡＴ６と反応する個所に蛍光物質で標識し、ヘキストを用いて核を染色した後、共焦点顕微鏡を用いてＳＴＡＴ６の核内への転座有無を観察した。その結果を図５に示す。

実験の結果、シネフリンは、ＩＬ−４により誘導されたＳＴＡＴ６の核内への転座を遮断することが分かる。

実施例８：温州ミカン未熟果抽出物から分離したシネフリンの好酸球凝集作用抑制効果の測定
ヒトの正常腺維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３、亜洲大学皮膚科）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）入り２４ウェル共同培養プレートに１ウェル当たりに約２×１０^５個の細胞になるように接種し、５％濃度のＣＯ_２培養器において３７℃の条件で２４時間培養した。次いで、１０、１００及び２００μＭのシネフリンを６０分間それぞれ処理した後、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を処理してエオタキシン−１の発現を誘導した。これと同時に、好酸球を接種し、２４時間培養した。培養後に、膜を通過してプレートの下端に移動した好酸球の移住度を測定した。測定は、ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ２４ウェル細胞移動分析キット（セルバイオラボ社製、米国）を用いた蛍光染色により測定した。その結果を図６に示す。

実験の結果、シネフリンは、ＩＬ−４処理により発現されたエオタキシン−１により誘導される好酸球の移住を阻害することが確認された。

実施例９：温州ミカン未熟果抽出物若しくはこれから分離したシネフリンの人体皮膚に対する安全性の確認実験
温州ミカン未熟果抽出物若しくは温州ミカン未熟果から分離したシネフリンが人体皮膚に安全であるか否かを確認するために、スクワレンを基本として実施例１において製造した温州ミカン未熟果抽出物を１、１０及び１００ｐｐｍ添加した皮膚外用剤を製造し、実施例２のシネフリンを１０、１５０及び３００ｐｐｍ添加した皮膚外用剤をそれぞれ製造した。

次いで、前記皮膚外用剤を健勝な３０名の成人を対象として上腕部位に一日おきに合計で９回の２４時間累積貼布を行って温州ミカン未熟果抽出物及びシネフリンが皮膚に刺激を与えるか否かを測定した。対照群としては、スクワレンを基本として、未熟温州ミカン抽出物若しくはシネフリンが含有されていない皮膚外用剤を用いた。

貼布は、フィンチャンバー（エピテスト社製、フィンランド）を用いて行い、チャンバーに前記において製造した皮膚外用剤をそれぞれ１５μｌずつ滴下した後、貼布を行った。毎回皮膚に現れた反応度を下記の実験式１を用いて点数化させた。その結果を表１に示す。

平均反応度＝［｛（反応指数×反応度）／（総被検者数×最高点数（４点）｝×１００］／検査回数…実験式１
このとき、反応度において、±は１点、＋は２点、そして＋＋は４点の点数を与え、平均反応度が３未満であるとき、安全な組成物であると認められる。

実験の結果、対照群の場合、±、＋、＋＋に相当する被検者の数が２週目の３次貼布においてそれぞれ１名、０名、０名であり、残りの期間に対する貼布においては皮膚に反応が現れなかった。実施例１の温州ミカン未熟果抽出物の場合、１００ｐｐｍ入り皮膚外用剤の３週目の１次貼布においてそれぞれ０名、１名、０名であり、残りの濃度及び期間に対する貼布においては皮膚に反応が現れず、実施例２のシネフリンの場合、全ての試験群においては皮膚に反応が現れなかった。前記表１の結果を前記実験式１に従い計算したところ、対照群の平均反応度は０．０９であり、未熟温州ミカン抽出物の平均反応度はそれ
ぞれ０．００、０．００及び０．０９であり、シネフリンの平均反応度はそれぞれ０．００、０．００及び０．００であることから、温州ミカン未熟果抽出物及びこれから分離したシネフリンが安全な物質であることが認められた。

実施例１０：温州ミカン未熟果抽出物若しくはこれから分離したシネフリンを含有するクリームのアトピー改善効果の測定
１０−１．温州ミカン未熟果抽出物若しくはこれから分離したシネフリンを含有するクリームの製造
下記表２に示す成分及び含量を有する未熟温州ミカン抽出物若しくはシネフリンを含有するクリームを製造した。具体的に、水相である精製水、トリエタノールアミン及びプロピレングリコールを７０℃に加熱して溶解させた後、油相である脂肪酸、油性成分、乳化剤及び防腐剤を７０℃に加熱して溶解させた液を添加してホモミキサー（日本の特殊機化工業株式会社製）を用いて攪拌して乳化させた。乳化が終わった後、前記溶液を４５℃まで冷却させ、未熟温州ミカン抽出物若しくはシネフリンを組成物の総重量に対して０．０３若しくは０．０１重量％添加して分散させた後、３０℃まで冷却させた。

１０−２．温州ミカン未熟果抽出物若しくはこれから分離したシネフリンを含有するクリームのアトピー改善効果の測定
前記１０−１の方法を用いて製造した温州ミカン未熟果抽出物若しくはシネフリンが０．０３若しくは０．０１重量％含有されているクリームを３０名の小児アトピー患者を対象として一日につき２回、４週間使用させた。対照群としては、温州ミカン未熟果抽出物若しくはシネフリンの代わりに、精製水入りクリームを用いた。

アトピー改善効果は、湿疹面積・重症度指数スコア（ＥＡＳＩ）を用いて測定し、判定
基準は、アトピーの改善がない場合を５、多い場合を０にして相対的な値を比較した。その結果を表３に示す。

実験の結果、温州ミカン未熟果抽出物若しくはシネフリンが含有されているクリームを用いた場合、対照群に比べて湿疹面積・重症度指数スコア（ＥＡＳＩ）が減少され、使用期間が長くなるにつれて湿疹面積・重症度指数スコア（ＥＡＳＩ）が期間に比例して減少することから、アトピー炎症に効能があることが確認された。

製造例１：化粧料の製造
１−１．クリームの製造
下記表４に示すように、温州ミカン未熟果抽出物若しくはシネフリンを有効成分として含有するクリームを通常の方法を用いて製造した。

１−２．トナーの製造
下記表５に示すように、温州ミカン未熟果抽出物若しくはシネフリンを有効成分として含有するトナーを通常の方法を用いて製造した。

１−３．ローションの製造
下記表６に示すように、温州ミカン未熟果抽出物若しくはシネフリンを有効成分として含有するローションを通常の方法を用いて製造した。

製造例２：薬学的製剤の製造
２−１．錠剤の製造
温州ミカン未熟果抽出物若しくはシネフリンを有効成分として含有する錠剤を製造するために、下記表７の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法を用いて打錠して錠剤を製造した。

２−２．カプセル剤の製造
温州ミカン未熟果抽出物若しくはシネフリンを有効成分として含有するカプセル剤を製造するために、下記表８の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法を用いてゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。

２−３．軟膏剤の製造
温州ミカン未熟果抽出物若しくはシネフリンを有効成分として含有する錠剤を製造するために、下記表９の成分を混合した後、通常の軟膏剤の製造方法を用いて軟膏剤を製造した。

Claims (8)

1. 温州ミカン未熟果抽出物、又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患の治療若しくは予防用薬剤学的組成物。
2. 前記温州ミカン未熟果抽出物は、果実の形成後３〜４ヶ月目の温州ミカン未熟果から抽出されたものであり、シネフリンを含有することを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
3. 前記炎症性皮膚疾患は、アレルギー性炎症疾患、アトピー性皮膚炎、皮膚湿疹若しくは乾癬のうちのいずれか一種以上であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
4. 前記温州ミカン未熟果抽出物、又はシネフリン若しくはこの塩は、組成物の総重量を基準として０．０００１〜１０．０重量％含有されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
5. 温州ミカン未熟果抽出物、又はシネフリン若しくはこの塩を有効成分として含有する炎症性皮膚疾患の改善若しくは予防用化粧料組成物。
6. 前記温州ミカン未熟果抽出物は、果実の形成後３〜４ヶ月目の温州ミカン未熟果から抽出されたものであり、シネフリンを含有することを特徴とする請求項５に記載の化粧料組成物。
7. 前記炎症性皮膚疾患は、アレルギー性炎症疾患、アトピー性皮膚炎、皮膚湿疹若しくは乾癬のうちのいずれか一種以上であることを特徴とする請求項５に記載の化粧料組成物。
8. 前記温州ミカン未熟果抽出物、又はシネフリン若しくはこの塩は、組成物の総重量を基準として０．０００１〜１０．０重量％含有されることを特徴とする請求項５に記載の化粧料組成物。

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