JP2008543966A - トウダイグサ科植物乳液からの極性溶媒抽出物の活性画分 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般にトウダイグサ科に属する植物の乳液の極性溶媒抽出物の活性画分並びにそれに含有される化合物の１つ以上、並びに該画分および／または該化合物の使用（特に癌の治療における）に関する。本発明はまた、該活性画分および／または該化合物を含む組成物、並びに細胞増殖／血管新生（特に癌）に関する疾患の治療のためのそれらの使用に関する。

Description

本発明は、一般にトウダイグサ科（Euphorabiaceae）に属する植物の乳液の極性溶媒抽出物の活性画分並びにそれに含有される化合物の１つ以上、並びに該画分および／または該化合物の使用（特に癌の治療における）に関する。本発明はまた、該活性画分および／または該化合物を含む組成物、並びに細胞増殖／血管新生（特に癌）に関連する疾患の治療のためのそれらの使用に関する。

特に、本発明の活性画分は、ユーフォルビア・ティルカリ（Euphorbia tirucalli Linnaneus）植物の乳液のブタノール抽出物から得られる。

特に、本発明は、細胞増殖に関する疾患の治療または細胞増殖に関する疾患の治療に有用な組成物または医薬を得るための３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）−インゲノールおよび３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル）−インゲノールの使用に関する。

望ましくない細胞増殖または血管新生を含む疾患の具体例の中で、癌は、その除去に関する研究がますます重要性を増している。多くの代替治療法が研究されてきたが、その中には、本発明のように、植物薬の使用がある。

ユーフォルビア・ティルカリは、東アフリカおよびアジアを起源とするトウダイグサ科の植物であり、一般にａｖｅｌｏｚもしくはペンシルツリー（ｐｅｎｃｉｌ ｔｒｅｅ）、ミルクブッシュ（ｍｉｌｋｂｕｓｈ）、ｅｓｑｕｅｌｅｔｏ、ｇｒａｖｅｔｏ ｄｏ ｃａｏ、ｆｉｇｕｅｉｒａ ｄｏ ｄｉａｂｏ、ｄｅｄｏ ｄｏ ｄｉａｂｏ、ｐａｕ−ｐｅｌａｄｏ、Ｓａｏ Ｓｅｂａｓｔｉａｏ ｔｒｅｅ、ｅｓｐｉｎｈｏ−ｄｅ−ｃｒｉｓｔｏ、ｃｏｒｏａ−ｄｅ−ｃｒｉｓｔｏ、ｅｓｐｉｎｈｏ−ｄｅ−ｊｕｄｅｕ、ｅｓｐｉｎｈｏ ｉｔａｌｉａｎｏ、ｐａｕ−ｓｏｂｒｅ−ｐａｕ、ａｒｖｏｒｅ ｄｅ ｃｏｒａｌとして知られている。この植物の一部（例えば、葉およびさや）は、大衆薬において使われている。

しかしながら、トウダイグサ科植物の多く、特にユーフォルビア・ティルカリは、有毒で、刺激性があり、腐食性の乳液を浸出する。その乳状の液は、皮膚および粘膜への損傷および浮腫、刺激、流涙、まぶたの浮腫の原因となり、視覚困難さえ引き起こす。乳液の摂取は、吐き気、嘔吐、下痢の原因ともなり、大量の場合、致死的でさえある。実際、ａｖｅｌｏｚの乳液は、例えばホルボールエステルおよびインゲノールエステル等のテルペンを多く含む。ホルボールエステルは刺激性が強く、腫瘍の出現を促進する（Ｋｈａｎ， Ａ． Ｑ． ｅｔ ａｌ， Ｅｕｐｈｏｒｃｉｎｏｌ： ａ Ｎｅｗ Ｐｅｎｔａｃｙｃｌｉｃ Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｔｉｒｕｃａｌｌｉ， Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ， １９８９； ５５： ２９０−２９１）。特定のａｖｅｌｏｚホルボール（４−デオキシホルボールエステル）は、一般に、臨床的に、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）の感染を増加させ、免疫細胞のＤＮＡ阻害をもたらし、免疫系の抑制をもたらすことが報告されている（ＭａｃＮｅｉｌ， Ａ． ｅｔ ａｌ， Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｌｙｔｉｃ Ｃｙｃｌｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｌａｔｅｘ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｔｉｒｕｃａｌｌｉ， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ２００３； ８８（１０）： １５６６−９）。この化学化合物以外にも、ａｖｅｌｏｚ抽出物は、ＥＢＶを排除する特定の免疫細胞（Ｔ細胞）の能力を低下させたことが報告されている。ＥＢＶは、最も一般的なヒトウイルスの１つであるヘルペスウイルス科に属する。初感染の後に、ＥＢＶは、Ｂ細胞内に終生潜伏感染を樹立する。ＥＢＶ感染は、単核球症の原因となり、一部のＥＢＶ媒介物は、バーキットリンパ腫または上咽頭癌などの癌を発症する。要約すれば、該乳液は人体に対して攻撃的であり、従ってどのような接触も避けるべきものとして推奨されている。

このようにして、全ての技術的偏見に対して、本出願者は、該乳液の抽出物の特定の活性画分並びにそれを構成する１つ以上の化合物が、以下に説明するように、有効な抗癌作用を有することを証明した。

一つの態様において、本発明の目的は、トウダイグサ科植物の乳液の抽出物の活性画分である。その調製方法は本発明の態様の１つである。

適切な極性溶媒は、高または中程度の極性を有するものであり、特に双極子モーメント約１．６０から約１．８０および誘電率約１５から約１８を有するものである。ブタノールなどのアルコールは特に適切である。

本発明に特に有用なトウダイグサ科植物は、ユーフォルビア属（Euphorbia）に属するものであり、より詳細には、活性画分を得るために用いられる乳液は、植物ユーフォルビア・ティルカリ起源のものである。

該活性画分は、以下の試験によって示されるように抗癌活性を示すが、この試験は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって決められる。

ユーフォルビア・ティルカリのブタノール抽出物の活性画分の取得
ユーフォルビア・ティルカリの乳液（新鮮であることが好ましい。）とヘキサンとの混合物を、例えば１：１（重量比）で調製する。沈殿が生じる。傾瀉した固形画分（その液体画分との混合物をも含む）をｎ−ブタノールと混合する（より極性の高い物質はブタノールにより親和性を示し、他方より極性の低い物質はヘキサンにより親和性を示すので、好ましくは、成分の効果的な抽出を可能にするために十分な撹拌下で行う）。

ブタノール画分の分離（ＨＰＬＣ、液体−液体クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィーまたは同等な手段による）により、その画分に存在する化合物を、主に分子量によりグループ分けすることが可能となる。ヘキサン：酢酸エチル（０％から１００％）の混合物を用いる、シリカゲルＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５によるカラムクロマトグラフィー分離において、乳液抽出物のブタノール画分から８つの画分が分離される。

分子量により分画することを特徴とするこの分離において、得られた画分は、ヘキサン：酢酸エチル８：２混合物（重量比）を用いるシリカゲル薄層クロマトグラフィーにかけられた。得られたクロマトグラムを図１に示す。

画分７は、明確であり、より高い極性を有し、基質との溶解性および親和性特性を有する成分の確かな存在を示している。当業者に周知のとおり、分離法それ自身の性質によって、画分６および８はまた画分７に存在する成分の少量を含有し得る。

下記に示すように、該画分７は、その抗癌作用を証明するために試験にかけられた。

スルホロダミンＢアッセイの使用による、ヒト腫瘍細胞系増殖抑制活性を評価するためのインビトロモデル
試験を実施するために、癌細胞株ＭＣＦ−７、ＮＣＩ−ＡＤＲ、ＯＶＣＡＲ−０３、ＰＣ０３、７８６−０およびＨＴ−２９を選択し、５％ＳＦＢを含有するＲＰＭＩ／ＳＦＢ（ＲＰＭＩは、Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ． １９６９； １（２）； １５３−６６のとおり、ＲＰＭＩ １６４０−Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 培地を指し；ＳＢＦは不活性化したウシ胎児血清を指す）で培養した。言及した細胞株は、米国立癌研究所ＮＣＩ（米国）により提供された（表２）。

細胞を、ＲＰＭＩ／ＳＦＢ５ｍｌを含む２５ｃｍ^２フラスコ中、３７℃、湿度１００％、ＣＯ_２ ５％の雰囲気下で維持し、形成されたカーペットが約８０％のコンフルエンスに達したときは反復される。

試験物質の増殖抑制活性を測定するためのアッセイ
ＲＰＭＩ／ＳＦＢ／ゲンタマイシン中の細胞１００μｌを、９６−ウェルプレートに、それぞれの対応する播種密度（増殖曲線によりあらかじめ設定する）で播種する。

３７℃、ＣＯ_２ ５％、湿度１００％の雰囲気下で２４時間培養した後、試験物質（０．２５〜２５０μｇ／ｍｌ）の１００μｇ／ｍｌ溶液を加える。その時点で、試験物質の添加の時点における吸光度（Ｔ_０値−添付のグラフ中、ゼロ点における実線により表される）を測定するために対照プレートを固定する。４８時間培養した後、タンパク質含有量を測定するために他のプレートを固定する。

サンプルの希釈
原液を調製するために、サンプルをナトリウムジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に希釈する（濃度１００ｍｇ／ｍｌ）。実験プレートに添加するために、それらの溶液をＲＰＭＩ／ＳＦＢ／ゲンタマイシン中に４００倍希釈する。

スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）を用いる比色アッセイ
本アッセイを、Ｓｋｅｈａｎ ｅｔ ａｌ，− Ｎｅｗ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ−Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８２： １１０７−１１１２（１９９０）に従って行う。

４８時間培養した後、４℃で５０％トリクロロ酢酸（ＴＣ）５０μｌを加えて細胞を固定する。細胞固定を完了するために、プレートを４℃で１時間培養する。

トリクロロ酢酸で固定後、プレートを蒸留水で４回洗浄し、ＴＣＡ残留物、培地、ウシ胎児血清および２次代謝物を除き、ついで完全に乾燥するまで室温に保つ。

ついで、１％酢酸に０．４％（重量／容量）溶解したスルホロダミン（ＳＲＢ）５０μｌを添加することにより、プレートを発色させ、４℃で３０分間培養する。ついでこれらを１％酢酸で４回連続洗浄する。洗浄液の残渣を取り除き、プレートを再度室温で乾燥する。細胞タンパク質に結合した着色剤を、濃度、１０μｍＭ、ｐＨ１０．５のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ（商標）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国）製）を用い、超音波を用いて５分間可溶化する。ＥＬＩＳＡリーダーを用い、５６０ｎｍにおける吸光度を読み取る。

結果の分析
それぞれの対応する対照から差し引いた平均吸光度を算出し、以下の式に従って各試験サンプルの増殖阻害（ＧＩ）を決定する。得られる結果は、以下を考慮して分析される：
Ｔ＞Ｃの場合、細胞増殖が刺激された；
Ｔ＜Ｔ_０かつ＜Ｃの場合、細胞分裂阻止活性（増殖阻害）が認められた（式１００Ｘ［（Ｔ−Ｔ_０）／（Ｃ−Ｔ_０）］が用いられる）；
Ｔ＜Ｔ_０の場合、殺細胞活性（細胞死）が認められた（式１００Ｘ［（Ｔ−Ｔ_０）／（Ｃ−Ｔ_０）］が用いられる）；
（式中、Ｔは処理細胞の平均吸光値であり、Ｃは細胞対照であり、Ｔ_０は、添加の日の細胞対照である）。

最後に、得られた結果を１００％から差し引くことにより、増殖阻害（ＧＩ）百分率を得ることも可能である。

図２および３のグラフは、それぞれ、試験した活性画分およびドキソルビシン（異なる濃度（２５０〜０．２５μｇ／ｍｌ）で細胞の陽性対照として用いる化学療法剤）の、細胞増殖の百分率および用いた抽出物の濃度に関する、濃度／活性曲線を表す。

濃度依存的に５０％を超す増殖阻害（グラフ中、５０ポイントの線により表される）を示し、好ましくは、細胞選択性（細胞株間で異なる活性または細胞株の１つに対して特異的な活性）を示す場合、サンプルを活性とみなす。

ＩＣ５０値（増殖を５０％阻害する濃度）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて分析を行い、シグモイド型非線形回帰により決定した。ドキソルビシンは陽性対照である。

図２は、トウダイグサ科植物の乳液の極性溶媒（この場合、ｎ−ブタノール）抽出物の活性画分の抗癌活性における、それ自体、および陽性対照と比較しての有効性を立証している。

本発明の他の態様内において、該活性画分の成分として具体的に検出された、分子量約５００から約６００のいくつかの特定の化合物、それら自体が抗癌活性を有する。

本発明はまた、増殖性細胞（特に癌）に関連する疾患の治療のための、単独またはそれらの間のもしくは他との組み合わせでの該化合物およびそれらの使用、ならびに該疾患を治療するために用いる組成物および医薬を得るためのそれらの使用、に関する。

以下に、分子量約５００から約６００の前記化合物の中で特に有用なものを、対応する空間的構造をつけて示す：
化合物１：３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）−インゲノール（分子量５２４）

化合物２：３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル）−インゲノール（分子量５５０）

本発明の他の態様において、本発明は、トウダイグサ科植物（特にユーフォルビア・ティルカリ）の乳液の極性溶媒（特にｎ−ブタン）抽出物画分の薬学的に活性な量および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を包含する。

本発明の組成物は、前記のようにして得たトウダイグサ科乳液抽出物の活性画分の約０．００１％から約９５％を含有することができる。

本発明の他の態様において、前記のように得られるトウダイグサ科乳液抽出物活性画分に含有される分子量約５００から約６００の１つ以上の化合物の有効量、および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物が考慮される。

本発明の他の態様において、本発明はまた、上記化合物１および２の１つ以上の有効量ならびに薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物も包含する。

本発明の組成物を調製するための薬学的に許容できる賦形剤は、ラクトース、デンプン、ショ糖、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、第２リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール、エタノール、グリセロール、水および他の賦形剤などの、当該技術分野で公知のものをすべて含むことができる。該医薬製剤の配合のための参考資料は、米国出版社Ｍａｃｋ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇからのＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓがある。

前記の分子量約５００から約６００の化合物の他を除外しないで１つ以上（特に本発明の組成物中の化合物１および２の１つ以上）の適切量は、約０．１ｍｇから２０００ｍｇであり、特に約１０ｍｇから約１００ｍｇである。

本発明の組成物は、経口（即時放出および／または徐放性剤形を含む）、非経口（筋肉内；静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、皮下または真皮および皮内）、経粘膜（肺内、舌下、鼻腔内、結膜内、直腸内、膣内）および局所で投与できる。

本発明の組成物の適切な剤形には、限定するものではないが、溶液、シロップ、エリキシル剤、懸濁液、エマルジョン、ローション、軟膏、クリーム、ペースト、ゲル、エアゾール、粉末、ペレット、錠剤、キャプレット、座剤、小卵剤または点眼剤がある。

本発明の組成物はまた、トウダイグサ科乳液の極性溶媒抽出物の活性画分および／またはそれに含まれる分子量約５００から約６００の化合物の１つ以上および／または上記化合物１および２の１つ以上以外にも、除去することが望ましい増殖性細胞のタイプに対して有用な他の活性成分を含有することができる。他の公知の活性成分の追加を如何に決定するかは、当業者には明らかである。

本発明の他の実施形態内において、増殖性細胞（特に癌）に関連する疾患の治療方法であり、該治療を必要とする患者が、
（１）トウダイグサ科植物の乳液の極性溶媒抽出物の活性画分、および／または
（２）該活性画分中に含有される分子量約５００から約６００の化合物の１つ以上、および／または
（３）上記化合物１および２の１つ以上、または
（４）該のいずれかまたはそれらの組み合わせを含有する組成物
の有効量の投与を受ける該方法がある。

本発明のさらに１つの態様において、トウダイグサ科植物の乳液の活性画分（特にユーフォルビア・ティルカリの極性溶媒（特にブタノール）抽出物）の使用であり、増殖性細胞（特に癌）に関連する疾患の治療のために有用な組成物、または医薬の調製に用いることを特徴とする該使用がある。本発明はまた、該活性画分に含有される分子量約５００から約６００の化合物の１つ以上の使用であり、増殖性細胞（特に癌）に関連する疾患の治療のために有用な組成物、または医薬の調製に用いることを特徴とする該使用を含む。本発明はまた、上記化合物１および２の１つ以上の使用であり、増殖性細胞（特に癌）に関連する疾患の治療のために有用な組成物、または医薬の調製に用いることを特徴とする該使用を含む。

本発明は、任意の動物（特にヒト）の増殖性細胞に関する。

当業者は、更に以下に開示した請求項に定めた限度を超えない範囲で、本文書の教示および実施例から本発明を実施するための他の均等な手段を見いだすことができる。

乳液抽出物ブタノール画分の薄層クロマトグラフを表す。 活性成分の増殖抑制活性を表す。 ドキソルビシンの増殖抑制活性を表す。

Claims (23)

1. クロマトグラフィーカラムによる分離によって得られた８つの画分の中で、より高分子量の画分６、７および８を含むことを特徴とする、トウダイグサ科（Euphorabiaceae）植物乳液の極性溶媒抽出物の活性画分。
2. 画分７のみを含むことを特徴とする、請求項１の画分。
3. 前記乳液が、好ましくは新鮮であることを特徴とする、請求項１の画分。
4. 前記極性溶媒が、双極子モーメント約１．６０から約１．８０および誘電率約１５から約１８を有することを特徴とする、請求項１の画分。
5. 前記極性溶媒が、アルコールであることを特徴とする、請求項４の画分。
6. 前記溶媒が、ｎ−ブタノールであることを特徴とする、請求項４の画分。
7. トウダイグサ科植物が、ユーフォルビア属（Euphorbia）に属することを特徴とする、請求項１の画分。
8. 植物がユーフォルビア・ティルカリ（Euphorbia tirucalli L.）であることを特徴とする、請求項７の画分。
9. 分子量約５００から約６００の分子を含有することを特徴とする、請求項１乃至８のいずれかの画分。
10. 化合物３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）−インゲノールおよび３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル）−インゲノールの１つ以上を含有することを特徴とする、請求項１乃至８のいずれかの画分。
11. 細胞増殖に関連する疾患の治療のための有用な組成物または医薬を得ることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれかのトウダイグサ科植物乳液の極性溶媒抽出物の活性画分の使用。
12. 細胞増殖に関する疾患の治療のための有用な組成物または医薬を得ることを特徴とする、３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）−インゲノールおよび３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル）−インゲノールの１つ以上の使用。
13. 請求項１乃至１０のいずれかの前記活性画分または３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）−インゲノールおよび３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル）−インゲノールの１つ以上の有効量、ならびに薬学的に許容できる賦形剤を含有する組成物。
14. 請求項１乃至１１のいずれか一項の前記活性画分を約０．００１％から約９５％含有することを特徴とする、請求項１３の組成物。
15. ３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）−インゲノールおよび３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル）−インゲノールの１つ以上を約０．１ｍｇから２０００ｍｇ、より詳細には約１０ｍｇから約１００ｍｇ含有することを特徴とする、請求項１３の組成物。
16. 細胞増殖に関連する疾患の治療のための有用な組成物または医薬を得ることを特徴とする、請求項１３の組成物の使用。
17. 前記疾患が、癌であることを特徴とする、請求項１１または１２のいずれかの使用。
18. 癌が、肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、卵巣癌または前立腺癌であることを特徴とする、請求項１７の使用。
19. 増殖性細胞に関連する疾患の治療方法であり、前記治療を必要とする患者が、請求項１乃至１０のいずれか一項の活性画分、および／または請求項１乃至１０のいずれかの活性画分に含有される分子量約５００から約６００の化合物の１つ以上、および／または３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）−インゲノールおよび３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル）−インゲノールの１つ以上の有効量、または請求項１乃至１０のいずれかの活性画分、および／または請求項１乃至１０のいずれかの活性画分に含有される分子量約５００から約６００の化合物の１つ以上、および／または３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）−インゲノールおよび３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル）−インゲノールの１つ以上の有効量を含む組成物を受けることを特徴とする、前記治療方法。
20. 前記疾患が、癌であることを特徴とする、請求項１９の方法。
21. 癌が、肺癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、卵巣癌または前立腺癌であることを特徴とする、請求項２０の方法。
22. トウダイグサ科植物乳液の極性溶媒抽出物の活性画分を得る方法であり、
    ａ）トウダイグサ科植物の乳液と実質的に非極性の溶媒とを混合すること；
    ｂ）項目ａ）の混合物または項目ａ）を混合後に傾瀉した固形相に、溶媒とそれらとを効果的に接触させるために十分な撹拌下で、実質的に極性の溶媒を添加すること；
    ｃ）極性相を分離すること；
    ｄ）極性相をクロマトグラフィーカラムで分画すること；
    ｅ）より高い分子量に応じて画分を分離すること
    を含むことを特徴とする、前記方法。
23. 以下の限定：
    −乳液が、新鮮であること；
    −植物が、ユーフォルビア属、特にユーフォルビア・ティルカリであること；
    −実質的に非極性の溶媒が、ヘキサンであること；
    −極性溶媒が、双極子モーメント約１．６０から約１．８０および誘電率約１５および約１８を有すること；
    −クロマトグラフィーカラムの固定相が、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５であり、ヘキサン：酢酸エチルの混合物で溶出を行うこと；
    −極性相が、より高い分子量の活性画分の単離が、画分６、７および８、好ましくは画分７のみにより、より好ましくは分子量５００から６００の分子により行われるように、８つの画分に分画されること；
    の１つ以上が用いられることを特徴とする、請求項２２の方法。

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