JP2016517266A5 - - Google Patents
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Claims (24)
- 長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び/又は胆管細胞系細胞を製造する方法であって、
(a)長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、FGFアゴニスト及びBMP4アゴニスト及び/又はその活性コンジュゲート及び/又は断片を含む特定化培地と接触させることによって、長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化して、肝細胞及び/又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
(b)細胞集団の肝細胞及び/又は胆管細胞前駆細胞の成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び/又は増殖を誘導して、肝芽細胞、肝細胞及び/又は胆管細胞などの肝細胞系細胞を含む集団を得るステップであって、成熟を誘導するステップは、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む方法。 - 長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団が、胚葉体(EB)において内胚葉細胞を誘導するステップによって、又は単層中にある内胚葉細胞を誘導するステップによって得られ、ここで誘導された内胚葉集団が、nodalアゴニスト、例えばアクチビンの存在下で長期間培養されて、長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団が製造され、及び/又は
成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び/又は増殖が、1つ又は複数のさらなるステップを含んでいてもよく、任意選択で、肝細胞及び/又は胆管細胞前駆細胞及び/又は凝集体を含む細胞集団が、肝細胞増殖因子(HGF)、デキサメタゾン(DEX)及び/又はオンコスタチンM(OSM)及び/又はその活性コンジュゲート及び/又は断片の存在下で培養される、
請求項1に記載の方法。 - 多能性幹細胞集団から肝細胞及び/又は胆管細胞を製造する方法であって、
A.
a)単層として培養された多能性幹細胞を、ActAなどのnodalアゴニストと、任意選択で、i)Wnt3a及び/又はii)CHIR−99021などのGSK−3選択的阻害剤などのwnt/β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
b)誘導された内胚葉細胞集団を、nodalアゴニストと接触させて、長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
c)請求項1に記載のステップa)に従って、長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化するステップと、
d)任意選択で、肝細胞及び/又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、HGF、デキサメタゾン及び/又はオンコスタチンM及び/又はその活性コンジュゲート及び/又は断片を含む成熟培地と接触させるステップと、
e)細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び/又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び/又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導するステップが、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む方法。 - 多能性幹細胞集団から肝細胞及び/又は胆管細胞を製造する方法であって、
a)任意選択で、多能性幹細胞を、BMP4アゴニストと接触させることによって、多能性幹細胞の胚葉体(EB)を形成するステップと、
b)EBを、ActAなどのnodalアゴニストと、任意選択で、i)Wnt3a及び/又はii)CHIR−99021などのGSK−3選択的阻害剤などのwnt/β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと
c)誘導された内胚葉細胞集団を解離して、解離された誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
d)解離された誘導された内胚葉細胞集団を、nodalアゴニストと接触させて、長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
e)請求項1に記載のステップa)に従って、長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化するステップと、
f)任意選択で、肝細胞及び/又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、HGF、デキサメタゾン及び/又はオンコスタチンM及び/又はその活性コンジュゲート及び/又は断片を含む成熟培地と接触させるステップと、
g)細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の増殖された肝芽細胞集団及び/又は肝細胞及び/又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び/又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導するステップが、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む方法。 - 長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団が、少なくとも80%、85%、90%、95%のCXCR4+及びcKIT+陽性細胞、並びに/又は少なくとも70%、75%、80%のSOX17+細胞を含み;
特定化するステップが、長期nodalアゴニスト処理され(例えば、アクチビン処理され)誘導された内胚葉集団を、FGF及びBMP4を含む特定化培地と接触させるステップを含み、任意選択で、FGFが、FGF10、FGF2又はFGF4又はそれらの組合せであり;
凝集体が、少なくとも70%、80%、85%又は90%のアルブミン陽性細胞を含む細胞集団から作製され;そして/又は
成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び/又は増殖を誘導するステップが、凝集体の細胞内のcAMP経路を活性化して、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び/又は胆管細胞への成熟を誘導するステップをさらに含み、任意選択で、cAMP経路を活性化するステップが、凝集体を8−ブロモアデノシン−3’5”−環状一リン酸などのcAMP類似体と接触させるステップを含む、
請求項1から4までのいずれか一項に記載の方法。 - 胚幹細胞(ESC)又は誘導された多能性幹細胞(iPSC)などの多能性幹細胞(PSC)から、肝細胞及び/又は胆管細胞を製造する方法であって、
A.
a)単層として培養されたか又は胚葉体に形成された多能性幹細胞を、ActAなどのnodalアゴニストと、任意選択で、i)Wnt3a及び/又はii)CHIR−99021などのGSK−3選択的阻害剤などのwnt/β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
b)誘導された内胚葉細胞集団を、nodalアゴニストと接触させて、長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
c)長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、請求項1に記載のステップa)に従って特定化するステップと、
d)肝細胞及び/又は胆管細胞前駆細胞の、肝芽細胞、肝細胞及び/又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び/又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び/又は増殖を誘導するステップは、
(i)肝細胞及び/又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、HGF、OSM及びDEXを含む成熟培地を用いて培養するサブステップと、
(ii)任意選択で、細胞集団が、少なくとも70%、80%、85%若しくは90%のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約20〜約40日培養した後、例えば、約24〜約28日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと、
(iii)凝集細胞成熟培地中で凝集細胞を培養するサブステップと、
(iv)任意選択で、凝集の約1〜約10日内に、例えば、凝集の6日内に、任意選択で、約27〜約36日培養した後に凝集細胞においてcAMP経路を任意選択で活性化するサブステップと
を含む、ステップ;
或いは
B.
a)単層として培養されたか又は胚葉体に形成された多能性幹細胞を、ActAなどのnodalアゴニストと、任意選択で、i)Wnt3a及び/又はii)CHIR−99021などのGSK−3選択的阻害剤などのwnt/β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と、任意選択で、約4〜約8日間接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
b)誘導された内胚葉細胞集団を、nodalアゴニストと、任意選択で、約1、2、3又は約4日間接触させて、長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
c)請求項1に記載のステップa)に従って、長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を任意選択で、約4〜約10日間特定化し、肝細胞及び/又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
d)肝細胞又は胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び/又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び/又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び/又は増殖を誘導するステップは、
(i)肝細胞及び/又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、HGF、Dex及び/又はOSMを含む成熟培地を用いて、任意選択で、約10〜14日間培養するサブステップと、
(ii)任意選択で、細胞集団が、少なくとも70%、80%、85%若しくは90%のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約20〜約40日培養した後、例えば、約24〜約28日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと、
(iii)Dexを含む成熟培地中で約1〜10日間凝集体を培養するサブステップと、
(iv)a)Dex及び任意選択で、cAMPアゴニスト、任意選択で、cAMP類似体を含む肝細胞成熟培地中で約6日〜約10日凝集体を培養し、任意選択で、凝集体を作製するステップの約1〜約10日内に、例えば、凝集体を作製するステップの6日内に、任意選択で、約27〜約36日培養した後に、cAMPアゴニストを添加するサブステップ、又は
b)凝集体を、notchアゴニスト、任意選択で、OP−9細胞などのnotchシグナル伝達ドナー及び任意選択で、cAMPアゴニスト、任意選択で、EGF、TGFb1、HGF及びEGF並びに/又はEGF、TGFb1及びHGFを含む胆管細胞成熟/特定化培地中で、約5日〜約90日間培養し、任意選択で、凝集体を作製するステップの約1〜約10日内に、例えば、凝集体を作製するステップの6日内に、任意選択で、約20〜40日培養した後に、notchアゴニストを添加するステップ並びに/又はnotchアゴニストがnotchシグナル伝達ドナー細胞である場合には、凝集体を共培養するサブステップと
を含む、ステップ;
とを含む方法。 - 凝集細胞成熟培地が、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び/又は増殖を促進する1種又は複数の因子、任意選択で、
a.任意選択で、アルブミン+/HNF4+前駆体集団の増殖を促進するSB431542などのTGFβアンタゴニストと組み合わせたCIHR99021などのwntアゴニスト、又は
b.cAMP活性化ステップの間に添加され、CYP酵素の発現を増強し、肝細胞前駆体の成熟を促進する、XAV939及び/又はMek/Erkアンタゴニスト、例えば、PD0325901などのWntアンタゴニスト;好ましくはここで凝集細胞はWntアンタゴニスト及び任意選択でTGFβアンタゴニスト(SB431542など)で約6日から約12日、好ましくは約8日から約10日、任意選択で約9日間処理される;
を含む、選択Aを含む請求項6に記載の方法。 - 凝集細胞成熟培地が、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び/又は増殖を促進する1種又は複数の因子、任意選択で、
a.胆管細胞系統特定化を促進するNotchアゴニスト、
b.肝細胞系統特定化を促進するγ−セクレターゼ阻害剤(GSI)L695,458などのNotchアンタゴニスト
を含む、選択Aを含む請求項6に記載の方法。 - 成熟培地及び/又は凝集体特定化培地が、notchアゴニストを含み、cAMP活性化が除かれている、請求項8に記載の方法。
- 凝集細胞成熟培地が、notchアゴニストを含み、そして製造された肝細胞が、機能的肝細胞であり;
好ましくは、機能的肝細胞が、肝細胞及び/又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の細胞と比較して、
ALB、CPS1、G6P、TDO、CYP7A1、CYP3A7、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、NAT2及びUGT1A1からなる群から選択される少なくとも1種のタンパク質の発現及び/又は活性;及び/又は
ALB、CPS1、G6P、TDO、CYP7A1、CYP3A7、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、NAT2及びUGT1A1からなる群から選択される少なくとも1種の遺伝子の発現
が増大している、ことを含む;
請求項8に記載の方法。 - 機能的肝細胞の少なくとも40、50、60、70、80又は90%が、ASGPR−1+細胞である、請求項10に記載の方法。
- 成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び/又は増殖を誘導するステップ中に、notchアゴニストを用いて細胞集団の凝集体を処理することによって、胆管細胞の運命が特定化され;
好ましくはnotchアゴニストが、細胞、プラスチック、ECM又はビーズなどの表面と結合しているnotchリガンドを含み;
より好ましくはnotchアゴニストが、OP9、OP9δ及び/又はOP9Jagged1細胞などのnotchシグナル伝達ドナーを含む;
請求項8又は9に記載の方法。 - notchアゴニストが、notchリガンドδ、Jagged−1、Jagged1ペプチド、又はPref−1/DLK−1/FA1から選択されるnotchリガンドを含む、請求項8又は9に記載の方法。
- 胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、notchアゴニストと、少なくとも5日間又は約5〜約14日間接触させて、胆管細胞前駆細胞の、胆管細胞、任意選択で、機能的胆管細胞へのさらなる系統特定化及び/又は成熟を誘導するステップを含む、請求項8、9、12又は13のいずれか一項に記載の方法。
- 製造された胆管細胞の集団が、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の細胞と比較して、及び/又はnotchアゴニストで処理されていない凝集体から製造された集団細胞と比較して、
Sox9、CK19及びCFTR(嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子)から選択される少なくとも1種、少なくとも2若しくは3種のタンパク質の発現が増大している、及び/又は
Sox9、CK19及びCFTR(嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子)から選択される少なくとも1種、少なくとも2若しくは3種の遺伝子の発現が増大している
機能的胆管細胞を含み、
任意選択で、胆管細胞の集団の少なくとも40%、50%、60%、70%、80%若しくは90%が、CK19+胆管細胞及び/若しくはCFTR+胆管細胞である、請求項8、9、12、13又は14のいずれか一項に記載の方法。 - EGF、TGFβ1、HGF及びEGF並びに/又はHGF、TGFβ1及びEGFとの存在下で、少なくとも5、8、9、10、11、12、13又は14日間、notchシグナル伝達ドナーが、OP9、OP9δ及び/又はOP9Jagged1細胞を含み、少なくとも1種の肝前駆細胞の、機能的胆管細胞への成熟を誘導する;
請求項12に記載の方法。 - 長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団が、胚幹細胞(ESC)又は誘導された多能性幹細胞(iPSC)などの多能性幹細胞(PSC)から誘導され、多能性幹細胞が、任意選択で、ヒトESC(hESC)又はヒトiPSC(hiPSC)である、請求項1から16までのいずれか一項に記載の方法。
- 機能的肝細胞及び/又は胆管細胞の移植用医薬としての使用のための、
機能的肝細胞及び/又は胆管細胞を含む細胞集団を作製する方法であって、
a.肝芽細胞、任意選択で、25日目段階の肝芽細胞;肝細胞及び/又は胆管細胞を含む細胞の集団を、請求項1から7までのいずれか一項に記載の方法に従って製造するステップと、
b.i.細胞の集団、任意選択で肝芽細胞を含む細胞の集団を、
1.任意選択で、キメラ凝集体で培養された、内皮細胞、任意選択で、CD34+内皮細胞、任意選択で、胚性CD34+内皮細胞と共培養し、任意選択で、凝集体はゲル/マトリックス中に包埋され、機能的肝細胞を含む細胞の集団を製造するステップ又は
2.任意選択で、キメラ凝集体の、notchアゴニスト、任意選択で、notchシグナル伝達ドナー細胞、任意選択で、OP9細胞、OP9−Jagged1細胞及び/又はOP9δ1細胞と共培養し、任意選択で、凝集体は、ゲル/マトリックス中に包埋され、EGF、TGFb1、EGF及びHGF又はEGF、TGFb1及びHGFとともに培養されて、機能的胆管細胞を含む細胞の集団を製造するステップ、及び/又は
ii.a)又はbi)から得た細胞の集団又はそれから機能的肝細胞及び/若しくは胆管細胞が濃縮若しくは単離された集団を、対象に導入するステップと
を含む、方法。 - 細胞の集団が、i)内皮細胞と、少なくとも4日間、6日間、8日間、10日間、12日間、15日間、20日間、30日間、40日間、50日間、60日間若しくは90日間共培養されるか、又はii)notchアゴニスト、任意選択で、OP9細胞、OP9−Jagged1細胞及び/又はOP9δ1細胞と、少なくとも4日間、6日間、8日間、10日間、12日間、90日間又は60日間共培養される、請求項18に記載の方法。
- 凝集体がゲル/マトリックス中に包埋され、3次元培養される、請求項1から19までのいずれか一項に記載の方法。
- 肝細胞及び/又は胆管細胞系統集団の細胞を濃縮又は単離するステップをさらに含み、
好ましくは、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は最大約95%の肝細胞及び/又は胆管細胞、
任意選択で、機能的肝細胞を含む、
請求項1から20までのいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1から21までのいずれか一項に記載の方法で製造された細胞の集団。
- 創薬、薬物代謝分析、バイオ人工肝臓装置の開発のための、並びに/又は肝臓及び/若しくは胆管疾患の治療のための細胞置換療法としての、請求項22に記載の細胞の集団の使用。
- 請求項1から23までに記載の、細胞を増殖させるためのアゴニスト、アンタゴニスト、成熟因子、1種又は複数の培地及び容器の1種又は複数を含む、
長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び/又は胆管細胞系統集団の細胞を増殖及び/若しくは製造するための使用のためのキットであって、
任意選択で長期nodalアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び/又は胆管細胞系統集団の細胞を増殖及び/若しくは製造するための使用のための使用説明書を含む、キット。
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