JP2016512557A - 活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞およびウイルス感染した細胞が発現する抗原に対して免疫反応性である二重特異性分子ならびにその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞をウイルス感染した細胞に局在させることができ、それによりウイルス感染した細胞の死滅を促進することができる二重特異性分子に関する。好適な実施形態において、そのような局在化は、免疫エフェクター細胞の活性化受容体およびウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープの両方に対して免疫反応性である二重特異性分子を用いて達成され、この場合、抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する。本発明は、潜在性ウイルス感染症の治療におけるそのような二重特異性分子の使用にも関する。【選択図】図１Ｂ

Description

関連出願の相互参照：
本出願は、米国特許出願第６１／７８３，１９５号明細書（２０１３年３月１４日出願、係属中）（特許文献１）の優先権を主張し、この出願はその全体において本明細書中に参照として援用される。
配列表の参照：
本出願は、連邦規則第３７部門１．８２１以下に準じて１つまたは複数の配列表を含み、配列表は紙面およびコンピューターで読み取り可能な媒体の両方で開示され、これら紙面およびコンピューターで読み取り可能な開示は、その全体において本明細書中に参照として援用される。
発明の分野：
本発明は、ウイルス感染した細胞に対する活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞を局在させることができ、それによりウイルス感染した細胞の死滅を促進することができる二重特異性分子に関する。好適な実施形態において、そのような局在化は、免疫エフェクター細胞の活性化受容体およびウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープの両方に対して免疫反応性である二重特異性分子を用いて達成される。本発明はさらに、潜在性ウイルス感染、持続性ウイルス感染、および不活性ウイルス感染の治療におけるそのような二重特異性分子の使用、ならびにウイルスゲノムを保有する細胞またはウイルスタンパク質を発現する細胞を死滅させる方法におけるそのような二重特異性分子の使用に関する。本発明は、詳細には、（１）免疫エフェクター細胞の活性化受容体のエピトープおよび（２）ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと結合する二重特異性分子に関し、この場合の抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在し、ならびに活性化した免疫エフェクター細胞がウイルス感染した細胞を死滅させるように、免疫エフェクター細胞の活性化およびウイルス感染した細胞に対する標的指向化を、仲介し、より好ましくは向上させることができるそのような二重特異性分子に関する。
Ｉ．ウイルス感染症
ここ数十年、抗体が持つ治療的可能性に対する関心が復活しており、抗体は、バイオテクノロジーを応用した薬の主要なクラスの１つとなっている（Ｃｈａｎ， Ｃ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００９） “Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，” Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｍｅｄ． Ｊ． ５０（７）：６６３−６６６）（非特許文献１）。２００種近い抗体系薬が、使用を認められている、または開発中である。
そのような薬は、感染症の治療に、そして何よりもウイルス感染症の治療に、非常に有望である。多くの病原体が、従来の抗菌薬に対して耐性を獲得する顕著な能力を持つことを示してきている（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、超多剤耐性結核菌、および抗菌剤耐性熱帯熱マラリア原虫）。他の病原体（ＨＩＶ、インフルエンザウイルスなど）は、現在のところ、従来薬を用いて満足に治療することができない（Ｂｅｉｇｅｌ， Ｊ．ｅｔ ａｌ． （２００８）“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｓｅｖｅｒｅ Ｓｅａｓｏｎａｌ Ａｎｄ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，” Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ７８（１）：９１−１０２を参照）（非特許文献２）。そのうえ、そのような薬は顕著な副作用を示す。従来薬とは対称的に、抗体は、それらを治療薬として非常的に魅力的にする２つの性質を有する。第一に、抗体は身体にとって自然な内在性タンパク質であるので、それらは低い毒性しか示さない。第二に、抗体は高い特異性を示し、これにより感染細胞を標的として指向させることができる。
しかしながら、現在の免疫療法は、ある欠点を有する（Ｃｈａｎ， Ｃ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００９） “Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，” Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｍｅｄ． Ｊ． ５０（７）：６６３−６６６）（非特許文献１）。ウイルス感染の排除は、通常、Ｔ細胞性獲得免疫と関連する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞を死滅させることで作用し、こうしてウイルス複製を防いで、ウイルス量を低下させる。また、抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を通じて、ウイルスタンパク質を細胞表面で発現する感染細胞の死滅を促進することができ、（ＮＫ）細胞は、ウイルスを中和する性質だけでなくＡＤＣＣを仲介する。抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏで多くのウイルス病原体を中和することができることを示してきたものの、抗体性免疫がｉｎ ｖｉｖｏで達成できるウイルス排除の程度は、不明である。したがって、中和治療用抗体は、典型的には、排除を仲介するためにではなく、ウイルス複製およびウイルス血症を抑制するためにならびにウイルス排除に有効な反応を発現させる時間を宿主免疫系に与えるために、投与される。これに関して、複数の研究が、抗体が持つウイルス量を低下させる能力は、投与された抗体の血清残留性と相関したこと、および治療停止後いったん血清中の抗体レベルが低下してしまうとウイルス抗原レベルは最終的に回復したことを示している（Ｇａｌｕｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００２） “Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ （Ｐｈａｓｅ Ｉ） Ｏｆ Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｗｏ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｏ ＨＢＶ： Ｓａｆｅｔｙ Ａｎｄ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，” Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３５：６７３−６７９； Ｈｅｉｊｔｉｎｋ， Ｒ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００１） “Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｈｙｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＴＵＶＩＲＵＭＡＢ） Ｔｏ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｐａｔｉｎｅｔｓ Ｐｒｅ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ： Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｏｆ Ｓｅｒｕｍ ＴＵＶＩＲＵＭＡＢ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，” Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ６４：４２７−４３４）（非特許文献３および４）。さらに、ＨＩＶでの研究は、治療用抗体の定期的投与が、エスケープ変異体の発生を導く可能性があることを示している（Ｃｈａｎ， Ｃ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００９） “Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，” Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｍｅｄ． Ｊ． ５０（７）：６６３−６６６）（非特許文献１）。１つの研究では、１２週間の期間にわたって投与された、３種の広対象中和ＨＩＶ抗体の組み合わせが、抗ウイルス治療停止後のウイルスリバウンドを、対照と比較して遅らせるのに成功した。しかしながら、ウイルスレベルは、３種の抗体全ての投与を続けたにもかかわらず、最終的に回復し、投与された３種の抗体のうち１種に対する耐性が上昇していた（Ｔｒｋｏｌａ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００５） “Ｄｅｌａｙ Ｏｆ ＨＩＶ−１ Ｒｅｂｏｕｎｄ Ａｆｔｅｒ Ｃｅｓｓａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １１：６１５−６２２）（非特許文献５）。
ＩＩ．免疫系活性化
ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、大部分の哺乳類免疫および自己免疫応答の必須のまとめ役である（Ｄｏｎｇ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （２００３） “Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ． Ｒｅｓ． ２８（１）：３９−４８）（非特許文献６）。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化は、抗原提示細胞と天然ＣＤ４＋Ｔリンパ球との同時刺激相互作用を通じて仲介されることがわかっている。２つの相互作用が必要とされる（Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． （２００７） “Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，” Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ４：６６６−６７５； Ｋｏｒｍａｎ， Ａ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００７） “Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，” Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９０：２９７−３３９）（非特許文献７および８）。第一の相互作用において、抗原提示細胞は、細胞が天然ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）と結合できるように、細胞の主要組織適合遺伝子複合体と結合した関連標的抗原を提示しなければならない。第二の相互作用において、抗原提示細胞のリガンドは、ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＣＤ２８受容体と結合しなければならない（Ｄｏｎｇ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （２００３） “Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ． Ｒｅｓ． ２８（１）：３９−４８（非特許文献６）； Ｌｉｎｄｌｅｙ， Ｐ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （２００９） “Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｔｉｌｉｔｙ Ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＣＤ２８−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，” Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ２２９：３０７−３２１）（非特許文献９）。すると、両方の刺激シグナルを経験したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、サイトカイン（インターロイキン２およびインターロイキン１２など）に反応してＴｈ１細胞に発達することができるようになる。そのような細胞は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）を産生し、これらが、標的抗原を発現する標的細胞に炎症性反応をもたらす。Ｂ細胞活性化および増殖も起こり、標的抗原に特異的な抗体産生をもたらす（Ｂｅｒｎａｒｄ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００５） “Ｔ ａｎｄ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ： Ａ Ｄａｎｃｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｄｅａｔｈ，” Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７９：Ｓ８−Ｓ１１）（非特許文献１０）。ＴＣＲ会合の間に両方の同時刺激シグナルがないと、Ｔ細胞は、機能的無反応期に入り、この状態はクローン麻痺と称される（Ｋｈａｗｌｉ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００８） “Ｃｙｔｏｋｉｎｅ， Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ， ａｎｄ Ｃｏ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ，” Ｅｘｐｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １８１：２９１−３２８）（非特許文献１１）。病的状態では、Ｔｈ１細胞は、様々な臓器特異的自己免疫疾患（Ｉ型糖尿病、リウマチ様関節炎、および多発性硬化症など）の中心的存在である（Ｄｏｎｇ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （２００３） “Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ． Ｒｅｓ． ２８（１）：３９−４８）（非特許文献６）。
ＩＩＩ．治療用抗体
抗体は、既知の診断用途だけでなく、治療薬としても有用であることが示されてきた。例えば、免疫療法、すなわち治療目的での抗体の使用は、近年、感染症の治療に利用されてきた。受動免疫療法として、感染症治療のためのモノクローナル抗体の使用がある（例えば、Ｉａｎ Ｇｕｓｔ， Ａ．Ｏ． （Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｆｅｂ ２１） “Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｉｎ Ｍａｎａｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｏｕｔｂｒｅａｋｓ，” Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４０（３）：１９６−１９９； Ｗａｎｇ， Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１１） “Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ Ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） Ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ Ｉｎ Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ Ｉｎｆａｎｔｓ Ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ： Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ Ａｎｄ Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ Ｏｆ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ａｎａｌｙｓｅｓ，” Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｓｓｅｓｓ． １５（５）：ｉｉｉ−ｉｖ， １−１２４； Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｈ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （２０１２） “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｔｏ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，” Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９（１０）：１４２４−１４３１を参照）（非特許文献１２〜１４）。こうした抗体は、感染作用体（例えば、ウイルス、細菌、真菌など）と直接結合することにより、およびそのような作用体に感染して作用体特異的抗原を細胞表面で発現している宿主細胞に結合することができる能力によりの両方で、生来の治療的生物活性を有する可能性がある。こうした作用剤は、単独でも、他の抗感染剤（例えば、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤など）と組み合わせても投与することができる。パリビズマブ（Palivizumab）（呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）細気管支炎の治療用、承認済）、およびテフィバズマブ（Tefibazumab）（黄色ブドウ球菌感染症治療用、臨床試験中）は、そのような治療薬の例である。あるいは、抗体を用いて、抗体と毒性作用剤が連結しており、腫瘍に特異的に結合することにより作用剤が腫瘍に向けられている抗体結合体を作ることができる。ゲムツズマブオゾガマイシン（Gemtuzumab ozogamicin）は、ヒト患者で白血病治療に用いられる承認抗体結合体の例である。
ウイルス感染細胞と結合し、診断および治療に利用できる可能性があるモノクローナル抗体が、開示されてきている（例えば、米国特許第８，３１３，７４６号明細書；同第７，５０７，７９７号明細書；米国特許出願第２０１２／０２８３４３８号明細書；同第２０１２／０１２８６６９号明細書；同第２０１２／００９３８３４号明細書；同第２０１１／０３１９８７１号明細書；同第２０１１／０２１２０７６号明細書；同第２０１１／００７６２６８号明細書；同第２０１１／００３３３８９号明細書；同第２０１０／００４０６３５号明細書；同第２０１０／００４０６０１号明細書；同第２００９／０１６２３５３号明細書；欧州特許第１６７０８２６号明細書；国際公開第２０１１／０８５２８９号パンフレット（特許文献２〜１５）； Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ， Ｍ．Ｂ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｊｕｎ １３） “Ａｎｔｉ−Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＭＯｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｂａｃｋ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ？” Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ５２６（２）：１２４−１３１； Ｈｕａｎｇ， Ｊ．Ｘ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｊｕｎ ４） “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ， ｖｉｒｕｓｅｓ， Ａｎｄ Ｐａｒａｓｉｔｅｓ，” Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５６（９）：４５６９−４５８２； Ｉａｎ Ｇｕｓｔ， Ａ．Ｏ． （Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｆｅｂ ２１） “Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｉｎ Ｍａｎａｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｏｕｔｂｒｅａｋｓ，” Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４０（３）：１９６−１９９（非特許文献１２）； Ｇｅｅｖａｒｇｈｅｓｅ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｆｅｂ ３） “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，” Ａｎｔｉｖｉｒ． Ｔｈｅｒ． １７（１ Ｐｔ Ｂ）：２０１−２１１； Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｈ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （２０１２） “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｔｏ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，” Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９（１０）：１４２４−１４３１（非特許文献１４）； Ｎｏｓｓａｌ， Ｇ．Ｊ． （２０１１） “Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ，” Ｖａｃｃｉｎｅ ２９ Ｓｕｐｐｌ ４：Ｄ１１１−１１５； Ｆｒｏｕｄｅ， Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ，” ＭＡｂｓ ３（６）：５１７−５２７； Ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ， Ｊ． （２０１１） “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｉｎ ２０１１，” Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍ． ２５（４）：７８９−８０２； Ｙａｍａｄａ， Ｔ． （２０１１） “Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” Ｋｅｉｏ Ｊ． Ｍｅｄ． ６０（２）：３７−４６； Ｂｅｒｒｙ， Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌｓ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ Ａｎｄ Ｎｉｃｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８（５）：４８９−５０１； Ｗｈａｌｅｙ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） “Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａｎｄ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，” Ｈｕｍ． Ｖａｃｃｉｎ． ７（３）：３４９−３５６； Ｂｅａｓｌｅｙ， Ｄ．Ｗ． （２０１１） “Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ，” Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ３（２）：２６９−２８５； Ｗａｎｇ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） “Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ Ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） Ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ Ｉｎ Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ Ｉｎｆａｎｔｓ Ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ： Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ Ａｎｄ Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ Ｏｆ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ａｎａｌｙｓｅｓ，” Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｓｓｅｓｓ． １５（５）：ｉｉｉ−ｉｖ， １−１２４（非特許文献１３）； Ｌｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２０１０） “Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｆｏｒ Ｐｒｉｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ Ａｎｄ Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ，” Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２（２）：２６９−２８２； Ｎｉｅｂｅｃｋｅｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２０１０） “Ｓａｆｅｔｙ Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” Ｃｕｒｒ． Ｄｒｕｇ． Ｓａｆ． ５（４）：２７５−２８６； Ｈａｎｓｅｌ， Ｔ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２０１０） “Ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ Ａｎｄ Ｓｉｄｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｏｆ ＭＯｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ９（４）：３２５−３３８； Ｃｈａｎ， Ｃ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００９） “Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，” Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｍｅｄ． Ｊ． ５０（７）：６６３−６７３（非特許文献１）； Ｂｅｉｇｅｌ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００８） “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｓｅｖｅｒｅ Ｓｅａｓｏｎａｌ Ａｎｄ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，” Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ７８（１）：９１−１０２（非特許文献２）； Ｈｕｂｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００８） “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ ＨＩＶ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ： Ｗｉｎｄｏｗ Ｏｆ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ？” Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１７：３９−６６； ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ， Ｊ． （２００７） “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，” Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｅｍｅｒｇ． Ｄｒｕｇｓ． １２（４）：５２５−５４０を参照）（非特許文献１５〜２９）。
理想の治療用および／または診断用抗体とは、感染細胞上には存在するが、任意の正常組織上には存在しないか存在しても低レベルでしかない抗原に対して特異的であるだろう。感染症、詳細にはウイルス性疾患と特異的に関連する感染細胞上に存在する抗原と結合することができる新規抗体の発見、特性決定、および単離は、多くの点で有用であるだろう。第一に、そのような抗体は、そのような細胞に対して生物活性を有し、免疫系反応を動員することができ、それにより疾患を治療することができるだろう。そのような抗体は、治療薬として単独でも、または現行の治療と組み合わせても投与することができ、または毒性作用剤と連結した免疫結合体を調製するのに使用することができる。同じ特異性を持つが生物活性は低いまたはない抗体も、放射性同位体、毒素、または化学療法薬もしくは化学療法薬含有リポソームとの免疫結合体を調製するのに使用することができる点で、単独で投与される場合に有用となる可能性があり、この場合結合体は、抗体が毒素を抗原含有細胞に向かわせるおかげで、生物学的に活性である。
理想の治療用および／または診断用抗体に望まれる１つの態様は、様々なウイルス性疾患のいずれかに関連する感染細胞に対する（および特にはウイルス感染した細胞に対する）免疫系の活性化を仲介し、詳細には向上させることができる、新規抗体の発見および特性決定である。
これまでの全ての進歩にも関わらず、依然として、ウイルス感染した細胞と結合することができ、ウイルス感染細胞に対する免疫応答を促進または仲介することができる改良組成物が必要とされている。また、依然として、そのようなウイルス感染細胞を検出することができる改良組成物が必要とされている。本発明の目的は、そのような組成物を同定することである。別の目的は、ウイルス感染細胞の表面で発現する抗原の検出に使用される新規化合物を提供することである。
以下に詳細に記載されるとおり、本発明は、１）免疫エフェクター細胞の活性化受容体のエピトープ、および２）ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープに結合する二重特異性分子に関連し、そのような二重特異性分子は、活性化した免疫エフェクター細胞がウイルス感染細胞を死滅させるように、免疫エフェクター細胞の活性化およびエピトープを発現するウイルス感染細胞に対する標的指向化を仲介し、およびより好ましくは向上させることができる。
米国特許出願第６１／７８３，１９５号明細書 米国特許第８，３１３，７４６号明細書 米国特許第７，５０７，７９７号明細書 米国特許出願第２０１２／０２８３４３８号明細書 米国特許出願第２０１２／０１２８６６９号明細書 米国特許出願第２０１２／００９３８３４号明細書 米国特許出願第２０１１／０３１９８７１号明細書 米国特許出願第２０１１／０２１２０７６号明細書 米国特許出願第２０１１／００７６２６８号明細書 米国特許出願第２０１１／００３３３８９号明細書 米国特許出願第２０１０／００４０６３５号明細書 米国特許出願第２０１０／００４０６０１号明細書 米国特許出願第２００９／０１６２３５３号明細書 欧州特許第１６７０８２６号明細書 国際公開第２０１１／０８５２８９号パンフレット 国際公開第０５／０６１５４７号パンフレット 国際公開第２００６／１１３６６５号パンフレット 国際公開第２００８／１５７３７９号パンフレット 国際公開第２０１０／０８０５３８号パンフレット 米国特許第４，８１６，５６７号明細書 米国特許第５，８０７，７１５号明細書 米国特許第５，８６６，６９２号明細書 米国特許第６，３３１，４１５号明細書 米国特許第４，１０５，６０３号明細書 米国特許第３，９７２，８５９号明細書 米国特許第３，８４２，０６７号明細書 米国特許第３，８６２，９２５号明細書 米国特許第５，５６５，３３２号明細書 米国特許第５，５８０，７１７号明細書 米国特許第５，７３３，７４３号明細書 米国特許第６，２６５，１５０号明細書 米国特許公開第２０１０／０１７４０５３号明細書 米国特許公開第２００９／００６０９１０号明細書 米国特許公開第２００７／０００４９０９号明細書 米国特許第６，２１８，１４９号明細書 欧州特許第０３５９０９６号明細書 米国特許公開第２００２／００２８４８６号明細書 国際公開第０３／０３５８３５号パンプレット 米国特許公開第２００３／０１１５６１４号明細書 米国特許第６，４７２，５１１号明細書 米国特許第５，７３１，１６８号明細書 米国特許第５，８０７，７０６号明細書 米国特許第５，８２１，３３３号明細書 米国特許第７，４２９，６５２号明細書 米国特許第７，６４２，２２８号明細書 米国特許第７，６９５，９３６号明細書 米国特許第８，２１６，８０号明細書 米国特許第５，６２４，８２１号明細書 国際公開第２０１２／１６２０６８号パンフレット ；米国特許第７，３５１，８０３号明細書
Ｃｈａｎ， Ｃ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００９） "Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，" Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｍｅｄ． Ｊ． ５０（７）：６６３−６６６ Ｂｅｉｇｅｌ， Ｊ．ｅｔ ａｌ． （２００８）"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｓｅｖｅｒｅ Ｓｅａｓｏｎａｌ Ａｎｄ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，" Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ７８（１）：９１−１０２ Ｇａｌｕｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００２） "Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ （Ｐｈａｓｅ Ｉ） Ｏｆ Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｗｏ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｏ ＨＢＶ： Ｓａｆｅｔｙ Ａｎｄ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，" Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３５：６７３−６７９ Ｈｅｉｊｔｉｎｋ， Ｒ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００１） "Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｈｙｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＴＵＶＩＲＵＭＡＢ） Ｔｏ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｐａｔｉｎｅｔｓ Ｐｒｅ−Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ： Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｏｆ Ｓｅｒｕｍ ＴＵＶＩＲＵＭＡＢ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，" Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｉｒｏｌ． ６４：４２７−４３４ Ｔｒｋｏｌａ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００５） "Ｄｅｌａｙ Ｏｆ ＨＩＶ−１ Ｒｅｂｏｕｎｄ Ａｆｔｅｒ Ｃｅｓｓａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，" Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １１：６１５−６２２ Ｄｏｎｇ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （２００３） "Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，" Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ． Ｒｅｓ． ２８（１）：３９−４８ Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． （２００７） "Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，" Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ４：６６６−６７５ Ｋｏｒｍａｎ， Ａ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００７） "Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，" Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９０：２９７−３３９ Ｌｉｎｄｌｅｙ， Ｐ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （２００９） "Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｔｉｌｉｔｙ Ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＣＤ２８−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，" Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ２２９：３０７−３２１ Ｂｅｒｎａｒｄ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００５） "Ｔ ａｎｄ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ： Ａ Ｄａｎｃｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｄｅａｔｈ，" Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７９：Ｓ８−Ｓ１１ Ｋｈａｗｌｉ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００８） "Ｃｙｔｏｋｉｎｅ， Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ， ａｎｄ Ｃｏ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ，" Ｅｘｐｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １８１：２９１−３２８ Ｉａｎ Ｇｕｓｔ， Ａ．Ｏ． （Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｆｅｂ ２１） "Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｉｎ Ｍａｎａｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｏｕｔｂｒｅａｋｓ，" Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４０（３）：１９６−１９９ Ｗａｎｇ， Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１１） "Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ Ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） Ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ Ｉｎ Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ Ｉｎｆａｎｔｓ Ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ： Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ Ａｎｄ Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ Ｏｆ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ａｎａｌｙｓｅｓ，" Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｓｓｅｓｓ． １５（５）：ｉｉｉ−ｉｖ， １−１２４ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｈ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （２０１２） "Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｔｏ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，" Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９（１０）：１４２４−１４３１ Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ， Ｍ．Ｂ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｊｕｎ １３） "Ａｎｔｉ−Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＭＯｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｂａｃｋ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ？" Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ５２６（２）：１２４−１３１ Ｈｕａｎｇ， Ｊ．Ｘ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｊｕｎ ４） "Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ， ｖｉｒｕｓｅｓ， Ａｎｄ Ｐａｒａｓｉｔｅｓ，" Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５６（９）：４５６９−４５８２ Ｇｅｅｖａｒｇｈｅｓｅ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｆｅｂ ３） "Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，" Ａｎｔｉｖｉｒ． Ｔｈｅｒ． １７（１ Ｐｔ Ｂ）：２０１−２１１ Ｎｏｓｓａｌ， Ｇ．Ｊ． （２０１１） "Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ，" Ｖａｃｃｉｎｅ ２９ Ｓｕｐｐｌ ４：Ｄ１１１−１１５ Ｆｒｏｕｄｅ， Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） "Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ，" ＭＡｂｓ ３（６）：５１７−５２７ Ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ， Ｊ． （２０１１） "Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｉｎ ２０１１，" Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍ． ２５（４）：７８９−８０２ Ｙａｍａｄａ， Ｔ． （２０１１） "Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，" Ｋｅｉｏ Ｊ． Ｍｅｄ． ６０（２）：３７−４６ Ｂｅｒｒｙ， Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） "Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌｓ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ Ａｎｄ Ｎｉｃｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，" Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８（５）：４８９−５０１ Ｗｈａｌｅｙ， Ｋ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） "Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ａｎｄ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，" Ｈｕｍ． Ｖａｃｃｉｎ． ７（３）：３４９−３５６ Ｂｅａｓｌｅｙ， Ｄ．Ｗ． （２０１１） "Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ，" Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ３（２）：２６９−２８５ Ｌｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２０１０） "Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｆｏｒ Ｐｒｉｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ Ａｎｄ Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ，" Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２（２）：２６９−２８２ Ｎｉｅｂｅｃｋｅｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２０１０） "Ｓａｆｅｔｙ Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，" Ｃｕｒｒ． Ｄｒｕｇ． Ｓａｆ． ５（４）：２７５−２８６ Ｈａｎｓｅｌ， Ｔ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２０１０） "Ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ Ａｎｄ Ｓｉｄｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｏｆ ＭＯｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，" Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ９（４）：３２５−３３８ Ｈｕｂｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００８） "Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ ＨＩＶ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ： Ｗｉｎｄｏｗ Ｏｆ Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ？" Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１７：３９−６６ ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ， Ｊ． （２００７） "Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，" Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｅｍｅｒｇ． Ｄｒｕｇｓ． １２（４）：５２５−５４０ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， ２００１） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）， Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ， Ｐ．， Ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ （Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．， Ｅｄ．， １９８４） ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＮＯＴＥＢＯＯＫ （Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．， Ｅｄ．， １９９８） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ （Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．， Ｅｄ．， １９８７） ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＯ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ （Ｍａｔｈｅｒ， Ｊ．Ｐ． ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｐ．Ｅ．， Ｅｄｓ．， １９９８） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ： ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ （Ｄｏｙｌｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， １９９３−８） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．） Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； ＷＥＩＲ’ Ｓ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ （Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． １９９７） Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ （Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， １９８７） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， １９８７） Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ＰＣＲ： ＴＨＥ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＣＨＡＩＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮ， （Ｍｕｌｌｉｓ， Ｋ． ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， １９９４） Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ （Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ．， １９９１） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９９） Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ ＩＭＭＵＮＯＢＩＯＬＯＧＹ ７ （Ｊａｎｅｗａｙ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ． ２００７） Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （Ｐ． Ｆｉｎｃｈ， １９９７） Ｓｔｒｉｄｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｄｅｖｏｒａｎ， ＵＫ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （Ｄ． Ｃａｔｔｙ．， ｅｄ．， １９８９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳＡ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ） ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （Ｓｈｅｐｈｅｒｄ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， ２０００） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳＡ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ （Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， １９９８） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ＴＨＥ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ （Ｚａｎｅｔｔｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． １９９５） Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ） ＤＥＶＩＴＡ， ＨＥＬＬＭＡＮ， ＡＮＤ ＲＯＳＥＮＢＥＲＧ’Ｓ ＣＡＮＣＥＲ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＆ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ， ＥＩＧＨＴＨ ＥＤＩＴＩＯＮ， ＤｅＶｉｔａ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． ２００８， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２ ＬｏＢｕｇｌｉｏ， Ａ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） "Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｍａｎ：Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，" Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８６：４２２０−４２２４ Ｓａｔｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：８５１−８５６ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） "Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ" Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７ Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） "Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ａｎ Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，" Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９： １５３４−１５３６ Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ， Ｃ． Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） "Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｙ ＣＤＲ−Ｇｒａｆｔｉｎｇ： Ｔｈｅ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ Ｏｆ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｏｎ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ" Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３−３７８３ Ｍａｅｄａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） "Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｓｈａｐｅｄ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ ＨＩＶ−Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，" Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２： １２４−１３４ Ｇｏｒｍａｎ， Ｓ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） "Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＣＤ４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，" Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８：４１８１−４１８５ Ｔｅｍｐｅｓｔ， Ｐ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） "Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ａ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ，" Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６−２７１ Ｃｏ， Ｍ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） "Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，" Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８：２８６９−２８７３ Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） "Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎ Ａｎｔｉ−ｐｌ８５ｈｅｒ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，" Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８９：４２８５−４２８９ Ｃｏ， Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） "Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｆｏｒ Ｔｈｅ ＣＤ３３ Ａｎｔｉｇｅｎ，" Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： １１４９−１１５４ Ｂａｅｕｅｒｌｅ， Ｐ ｅｔ ａｌ． （２００８） "ＢｉＴＥ： Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ Ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｃｒｕｉｔ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，" Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ３３： １３７−１４７ Ｂａｒｇｏｕ， ｅｔ ａｌ．２００８） "Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ Ｔ Ｃｅｌｌ−Ｅｎｇａｇｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，" Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９７４−９７７ Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９７５） "Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｏｆ Ｆｕｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｏｆ Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，" Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７ Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） "Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，" Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６ Ｋｅｌｌｅｙ， Ｒ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｉｎ： ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ， Ｓｅｔｌｏｗ， Ｊ．Ｋ． Ｅｄ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌ．１２， ｐｐ １−１９ Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｊ．Ｍｅｔ ａｌ．（１９８４） ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｂ． （１９８６） "Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，" Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２ （４７４８）：３４１−３４７ Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ．Ａ． （１９８５） "Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｎｕｍｂｅｒｓ Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｔ Ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌ Ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，" Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８２（１５）：５１３１−５１３５ Ｇａｎｅｓａｎ， Ａ．（２００６） "Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｗｅｎｔｙ−Ｆｉｒｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ，" Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６（１）：３−１０ Ｐｅｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） "Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，" Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２７５６ Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） "Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ，" Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５−９３ Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９９） "Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｌｋ Ａｓ Ａ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，" Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７−１５７ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） "Ｍａｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｂｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，" Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２．４３３−４５５ Ａｒｕｆｆｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９８７） "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｏｆ Ａ ＣＤ２８ ｃＤＮＡ Ｂｙ Ａ Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＣＯＳ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，" Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８４：８５７３−８５７７ Ｓｔｅｐｈａｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） "Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ Ｉｎ Ｏｒｇａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ Ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，" Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １４０：５８４１−５８５４ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ （Ｊ．Ｐ． Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｄ． Ｂａｒｎｅｓ， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｖｏｌ． ５７， Ｃｈ．１８ ａｎｄ １９， ｐｐ． ３１４−３５０， １９９８） ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｍｉｒｒｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＵＫ； Ｍａｎｇｈａｍ， Ｄ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） "Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｉｎｇ Ｍｉｒｒｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＭＩＣＡ），" Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５（２）：１２９−３３ Ｓｔｅｐｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） "Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＢＥＮ Ｄｕｒｉｎｇ Ｒａｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，" Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２１２：２６４−２７７ Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ） Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８５） Ｌｏｗｅ， "Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ"， ｉｎ Ｗｏｒｋ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ） ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＩＮ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． ７， Ｐａｒｔ ＩＩ， Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ （１９７９） Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．， "Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ"， ｉｎ Ｎｅｕｒａｔｈ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）， ＴＨＥ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｖｏｌ． １， ｐｐ． ９５−１７８ （１９７５） Ｓｃｈｏｔｔ， Ｈ． ＡＦＦＩＮＩＴＹ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．ＮＹ（１９８４） Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） "‘Ｋｎｏｂｓ−Ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ’ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｆｏｒ Ｈｅａｂｙ Ｃｈａｉｎ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，" Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｒ． ９：６１７−６２１ Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） "Ｓｔａｂｌｅ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ Ｆｒｏｍ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｔｈｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｏｆ Ａ Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ，" Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７０： ２６−３５ Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ． （２００５） "Ａ Ｎｅｗ Ｆｏｒｍａｔ Ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｕｍｏｒｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ，" Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９６：９５−１０１ Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ， Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ． （２００７） "Ｆｃ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ａｂｉｌｉｔｙ Ｔｏ Ｋｉｌｌ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｔｕｍｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｖｉａ Ｌｏｗ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆｃｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，" Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７（１８）：８８８２−８８９０ Ｅｌｋａｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ． （２００５） "Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ Ｉｎ ＣＨ１ Ｕｎｄｅｒｌｉｅ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｏｆ Ｕｎａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｉｇ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎｓ，" Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０：１４４０２−１４４１２ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００２） "Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，" Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ． １：１−１１ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００１） "Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ Ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，" Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９２：４９８−５００ ｖａｎ Ｈｅｓｔ ｅｔ ａｌ． （２００１） "Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｔｏｗａｒｄ Ａ Ｎｅｗ Ｌｅｖｅｌ Ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ，" Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ． １９：１８９７−１９０４ Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１） "Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｏｆ Ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｉｎ Ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｈｏｓｔ，" Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２３（４４）： １１０８９−１１０９０ Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （２００１） "Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｓｅｔ Ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，" ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５０２（１−２）：２５−３０ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ： ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ、２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ （２００５） Ｍａｈａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７） "Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄ−Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ： Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，" Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １４：８５３−８５９ Ｆａｎｇ， Ｃ．Ｙ． ｅｔ ａｌ． （２００４） "Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｏ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １，" Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８７（１−２）：２１−３０ Ｆｒｕｅｈｌｉｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） "Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２Ａ （ＬＭＰ２Ａ） Ｄｏｍａｉｎｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆｏｒ Ｔｈｅ ＬＭＰ２Ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｎ Ｂ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，" Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７０：６２１６−６２２６ Ｆｒｕｅｈｌｉｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） "Ｔｙｒｏｓｉｎｅ １１２ Ｏｆ Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２Ａ Ｉｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｌａｔｅｎｃｙ，" Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７７９６−７８０６ Ｂａｂｃｏｃｋ， Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． "Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｒｅｓｔｉｎｇ Ｍｅｍｏｒｙ Ｂ Ｃｅｌｌｓ， Ｎｏｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ， Ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔｓ，" Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９０（４）：５６７−５７６ Ｐｈａｅｔｏｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２０１０） "Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｗｉｔｈ Ａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ Ｔｈｅ ＨＰＶ１６ Ｅ６ Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｌｏｗ Ｌｅｖｅｌｓ Ｏｆ Ｅ６，" Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． １０（１０）：１０４１−１０４７ Ｌａｇｒａｎｇｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００５） "Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ １６ Ｅ６ Ｔｏ Ｐ５３ Ａｎｄ Ｅ６ＡＰ Ｉｓ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｚｉｎｃ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｏｆ Ｅ６，" Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８６（Ｐｔ４）：１００１−１００７ Ｗｌａｚｌｏ， Ａ．Ｐ． ｅｔ ａｌ． （２００１） "Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｈｅ Ｅ６ Ａｎｄ Ｅ７ Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｏｆ ＨＰＶ，" Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２０（４）：２５７−２６３ Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） "Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ−１ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ； Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ，" ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １０（４）：３５９−３６９ Ｓｈｅｎ， Ｒ． （２０１０） "ＧＰ４１−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｌｏｃｋｓ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ ＨＩＶ Ｔｙｐｅ １ Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｔａｌ Ｍｕｃｏｓａ Ａｎｄ Ｍｏｄｅｌ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，" Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８４（７）：３６４８−３６５５ Ｇｒｕｂｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９９４） "Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂｙ Ａ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，" Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２（１１）：５３６８−５３７４ Ｂｅｄｚｙｋ， Ｗ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．（１９８９） "Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏｆ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｇｅｉｏｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｗｉｔｈｉｎ Ａｎ Ａｎｔｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ｆａｍｉｌｙ，" Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４（３）：１５６５−１５６９ Ｍｕｎｒｏ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） "Ｕｓｅ Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｆｒｏｍ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ： Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈｓｐ ７０，" ＥＭＢＯ Ｊ． ３（１３）：３０８７−３０９３ Ｈａｒｒｉｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） "Ｔｒｉｍｅｒｉｃ ＨＩＶ−１ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｐ１４０ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ Ａｎｄ Ｎａｔｉｖｅ ＨＩＶ−１ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｈｅ Ｓａｍｅ Ｃｌｏｓｅｄ Ａｎｄ Ｏｐｅｎ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ，" Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） １０８（２８）：１１４４０−１１４４５ Ｆｅｒｒａｒｉ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） "Ａｎ ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈａｔ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ａ Ｃ１ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ （ＡＤＣＣ） Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｄｅｆｉｎｅｓ ａ Ｃｏｍｍｏｎ ＡＤＣＣ Ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ＨＩＶ−１ Ｓｅｒｕｍ，" Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８５（１４）：７０２９−７０３６ Ｂｅｅｌｅｒ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） "Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｆ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ： Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｕｐｏｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，" Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３（７）：２９４１−２９５０ Ａｒｂｉｚａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） "Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｗｏ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｓｉｔｅｓ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ｂｙ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｈｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ，" Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７３（９）：２２２５−２２３４ Ｓｈａｄｍａｎ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） "Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ Ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｆｏｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ，" Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． １１（１１）：１４５５−１４６７
本発明は、活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞をウイルス感染した細胞に局在させることができ、それによりウイルス感染した細胞の死滅を促進することができる二重特異性分子に関する。好適な実施形態において、そのような局在化は、免疫エフェクター細胞の活性化受容体およびウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープの両方に対して免疫反応性である二重特異性分子を用いて達成される。本発明はさらに、潜在性ウイルス感染、持続性ウイルス感染、および不活性ウイルス感染の治療におけるそのような二重特異性分子の使用、ならびにウイルスゲノムを保有する細胞またはウイルスタンパク質を発現する細胞を死滅させる方法におけるそのような二重特異性分子の使用に関する。本発明は、特には、（１）免疫エフェクター細胞の活性化受容体のエピトープ、および（２）ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープに結合する二重特異性分子に関連し、この場合の抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在し、ならびに活性化した免疫エフェクター細胞がウイルス感染した細胞を死滅させるように、免疫エフェクター細胞の活性化およびウイルス感染した細胞に対する標的指向化を、仲介し、より好ましくは向上させることができるそのような二重特異性分子に関する。
詳細には、本発明は、以下を含む二重特異性分子に関する：
（Ａ）第一エピトープ結合ドメインであって、免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができ、この場合の免疫エフェクター細胞は活性化受容体を発現する、および
（Ｂ）第二エピトープ結合ドメインであって、ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができ；この場合の抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する。
本発明はさらに、第一エピトープ結合ドメインがエフェクター細胞の活性化受容体と結合する、そのような二重特異性分子の実施形態に関する。
本発明はさらに、エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、顆粒球、または樹状細胞である、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、ウイルスが、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、またはインフルエンザウイルスである、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、細胞が、ウイルスに潜在的に感染している、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、ウイルス感染した細胞が発現する抗原が、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、インフルエンザＭ２タンパク質、ＨＩＶｅｎｖタンパク質、ＨＰＶＥ６、およびＨＰＶＥ７からなる群より選択される、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、ウイルス感染した細胞が発現する抗原が、細胞上には検出可能に存在するが、ウイルス上では二重特異性分子により検出されない、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、エフェクター細胞上のエピトープが、ＣＤ３エピトープ、ＣＤ４エピトープ、ＣＤ８エピトープ、ＣＤ２エピトープ、ＣＤ１６エピトープ、またはＮＫＧ２Ｄエピトープである、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、第一エピトープ結合ドメインが、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ２抗体、ＣＤ１６抗体、またはＮＫＧ２Ｄ抗体からの抗原結合ドメインである、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、ウイルス感染した細胞が発現する抗原が、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原（存在する場合）のレベルよりも少なくとも２倍高いレベルで、細胞上に検出可能に存在する、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、ウイルス感染した細胞が発現する抗原が、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原（存在する場合）のレベルよりも少なくとも５倍高いレベルで、細胞上に検出可能に存在する、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、ウイルス感染した細胞が発現する抗原が、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原（存在する場合）のレベルよりも少なくとも１０倍高いレベルで、細胞上に検出可能に存在する、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、ウイルス感染した細胞が発現する抗原が、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原（存在する場合）のレベルよりも少なくとも１００倍高いレベルで、細胞上に検出可能に存在する、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、抗原が、ウイルスに感染していない細胞上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、抗原が、ウイルスに感染していない細胞上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも少なくとも２倍高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、抗原が、ウイルスに感染していない細胞上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも少なくとも５倍高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、抗原が、ウイルスに感染していない細胞上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも少なくとも１０倍高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、抗原が、ウイルスに感染していない細胞上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも少なくとも１００倍高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、ウイルス感染した細胞が発現する抗原が、細胞上に検出可能に存在し、かつ感染していない細胞上では二重特異性分子で検出されない、上記の二重特異性分子のいずれかに関する。
本発明はさらに、二重特異性分子および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物に関し；この二重特異性分子は、以下を含む：
（Ａ）第一エピトープ結合ドメインであって、免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができ、この場合の免疫エフェクター細胞はエフェクター細胞の活性化受容体を発現する、および
（Ｂ）第二エピトープ結合ドメインであって、ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができ；この場合の抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する。
本発明はさらに、第一エピトープ結合ドメインがエフェクター細胞の活性化受容体と結合する、そのような薬学的組成物の実施形態に関する。
本発明はさらに、潜在性ウイルス感染症の治療を必要としている個体における潜在性ウイルス感染症の治療方法に関し、この方法は、個体に二重特異性分子を治療上有効量で投与する工程を含み、この二重特異性分子は、以下を含む：
（Ａ）第一エピトープ結合ドメインであって、免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができ、この場合の免疫エフェクター細胞はエフェクター細胞の活性化受容体を発現する第一エピトープ結合ドメイン、および
（Ｂ）第二エピトープ結合ドメインであって、ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができ；この場合の抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン。
本発明はさらに、二重特異性分子の第一エピトープ結合ドメインがエフェクター細胞の活性化受容体と結合する、そのような方法の実施形態に関する。
本発明はさらに、持続性ウイルス感染症の治療を必要としている個体における持続性ウイルス感染症の治療方法に関し、この方法は、個体に二重特異性分子を治療上有効量で投与する工程を含み、この二重特異性分子は、以下を含む：
（Ａ）第一エピトープ結合ドメインであって、免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができ、この場合の免疫エフェクター細胞はエフェクター細胞の活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
（Ｂ）第二エピトープ結合ドメインであって、ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができ；この場合の抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン。
本発明はさらに、二重特異性分子の第一エピトープ結合ドメインがエフェクター細胞の活性化受容体と結合する、そのような方法の実施形態に関する。
本発明はさらに、不活性ウイルス感染症の治療を必要としている個体における不活性ウイルス感染症の治療方法に関し、この方法は、個体に二重特異性分子を治療上有効量で投与する工程を含み、この二重特異性分子は、以下を含む：
（Ａ）第一エピトープ結合ドメインであって、免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができ、この場合の免疫エフェクター細胞はエフェクター細胞の活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
（Ｂ）第二エピトープ結合ドメインであって、ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができ；この場合の抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン。
本発明はさらに、二重特異性分子の第一エピトープ結合ドメインがエフェクター細胞の活性化受容体と結合する、そのような方法の実施形態に関する。
本発明はさらに、ウイルスゲノムを保有する細胞を死滅させる方法に関し、この方法は、細胞を二重特異性分子と接触させる工程を含み、この二重特異性分子は、以下を含む：
（Ａ）第一エピトープ結合ドメインであって、免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができ、この場合の免疫エフェクター細胞はエフェクター細胞の活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
（Ｂ）第二エピトープ結合ドメインであって、ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができ；この場合の抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン。
本発明はさらに、二重特異性分子の第一エピトープ結合ドメインがエフェクター細胞の活性化受容体と結合する、そのような方法の実施形態に関する。
本発明はさらに、ウイルスタンパク質を発現する細胞を死滅させる方法に関し、この方法は、細胞を二重特異性分子と接触させる工程を含み、この二重特異性分子は、以下を含む：
（Ａ）第一エピトープ結合ドメインであって、免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができ、この場合の免疫エフェクター細胞はエフェクター細胞の活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
（Ｂ）第二エピトープ結合ドメインであって、ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができ；この場合の抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン。
本発明はさらに、二重特異性分子の第一エピトープ結合ドメインがエフェクター細胞の活性化受容体と結合する、そのような方法の実施形態に関する。
は、本発明の二重特異性分子の構造およびドメインを図示する。図１Ａは、エピトープ結合ドメインＡ−Ｄならびに追加ドメインＥおよびＦを有する二本鎖ポリペプチド二重特異性ダイアボディを図示する。 は、本発明の二重特異性分子の構造およびドメインを図示する。図１Ｂは、ＥコイルおよびＫコイルドメインを有する二本鎖ポリペプチド二重特異性ダイアボディを図示する。 は、本発明の二重特異性分子の構造およびドメインを図示する。図１Ｃは、２つのＣＨ２−ＣＨ３ドメインの会合を通じて形成されるＦｃドメインを有する三本鎖ポリペプチド二重特異性ダイアボディを図示する。 は、５：１のエフェクター：標的比で、ナチュラルキラー（ＮＫ）の存在下、２４時間インキュベーション後の、ｇｐ１４０発現ＨＥＫ２９３Ｄ３７５細胞（９２Ｔｈ０２３、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）における、抗体ｈ３Ｇ８の抗ＣＤ１６エピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディにより仲介される細胞傷害性リンパ球活性を示す。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、陽性選択（Ｄ５６６７８（ＬＤＨ））により精製した。抗体４−４−２０の抗フルオレセインエピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディを対照として用いた。 は、５：１のエフェクター：標的比で、ナチュラルキラー（ＮＫ）の存在下、２４時間インキュベーション後の、ｇｐ１４０発現ＨＥＫ２９３Ｄ３７５細胞（９２Ｔｈ０２３、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）における、抗体ｈ３Ｇ８の抗ＣＤ１６エピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディにより仲介される細胞傷害性リンパ球活性を示す。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、陰性選択（Ｄ５５３８６（ＬＤＨ））により精製した。予想どおり（ＮＫ細胞はＣＤ３が欠けているため）、抗体ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２の抗ＣＤ３エピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディは、細胞傷害性リンパ球活性を示すことができなかった。抗体４−４−２０の抗フルオレセインエピトープ結合ドメインおよび抗体ｈ３Ｇ８の抗ＣＤ１６エピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディを対照として用いた。 は、５：１のエフェクター：標的比で、ナチュラルキラー（ＮＫ）の存在下、２４時間インキュベーション後の、ＨＩＶｇｐ１４０発現ＨＥＫ２９３Ｄ３７５細胞（ＣＭ２４４、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）における、抗体ｈ３Ｇ８の抗ＣＤ１６エピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディにより仲介される細胞傷害性リンパ球活性を示す。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、陰性選択（Ｄ５５３８６（ＬＤＨ））により精製した。予想どおり（ＮＫ細胞はＣＤ３が欠けているため）、抗体ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２の抗ＣＤ３エピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディは、細胞傷害性リンパ球活性を示すことができなかった。抗体４−４−２０の抗フルオレセインエピトープ結合ドメインおよび抗体ｈ３Ｇ８の抗ＣＤ１６エピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディを対照として用いた。 は、抗体ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２の抗ＣＤ３エピトープ結合ドメインと、抗体Ａ３２の抗ＨＩＶｇｐ１２０エピトープ結合ドメインまたは抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインいずれかとを有する二重特異性ダイアボディが持つ、汎Ｔ細胞（Ｄ５４６７０）の存在下におけるＨＩＶｅｎｖ発現Ｊｕｒｋａｔ５２２ＦＹ細胞のＣＤ８を仲介した再指向性死滅を促進する能力を示す。細胞を２４時間インキュベートした。エフェクター：標的比は５：１であった。パリビズマブの抗ＲＳＶＦタンパク質エピトープ結合ドメインおよび抗体ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２の抗ＣＤ３エピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディを対照として用いた。 は、１０：１のエフェクター：標的比で、汎Ｔ細胞（Ｄ４７２３９）の存在下、２４時間インキュベーション後の、抗体ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２の抗ＣＤ３エピトープ結合ドメインと、抗体Ａ３２の抗ＨＩＶｇｐ１２０エピトープ結合ドメインまたは抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインいずれかとを有する二重特異性ダイアボディが持つ、ＨＩＶｇｐ１４０発現ＨＥＫ２９３Ｄ３７５細胞（９２Ｔｈ０２３ｇｐ１４０）のＣＤ８を仲介した再指向性死滅を促進する能力を示す。抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインおよび抗体４−４−２０の抗フルオレセインエピトープ結合ドメイン含む二重特異性ダイアボディを対照として用いた。 は、抗体ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２の抗ＣＤ３エピトープ結合ドメインと、抗体Ａ３２の抗ＨＩＶｇｐ１２０エピトープ結合ドメインまたは抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインいずれかとを有する二重特異性ダイアボディが持つ、汎Ｔ細胞（Ｄ４７２３９）の存在下におけるＨＩＶｇｐ１４０−発現ＨＥＫ２９３Ｄ３７１細胞（ＣＭ２４４、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）のＣＤ８を仲介した再指向性死滅を促進する能力を示す。エフェクター：標的比は１０：１であった。抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインおよび抗体４−４−２０の抗フルオレセインエピトープ結合ドメイン含む二重特異性ダイアボディを対照として用いた。
本発明は、活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞をウイルス感染した細胞に局在させることができ、それによりウイルス感染した細胞の死滅を促進することができる二重特異性分子に関する。好適な実施形態において、そのような局在化は、免疫エフェクター細胞の活性化受容体およびウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープの両方に対して免疫反応性である二重特異性分子を用いて達成される。本発明はさらに、潜在性ウイルス感染、持続性ウイルス感染、および不活性ウイルス感染の治療におけるそのような二重特異性分子の使用、ならびにウイルスゲノムを保有する細胞またはウイルスタンパク質を発現する細胞を死滅させる方法におけるそのような二重特異性分子の使用に関する。本発明は、特には、（１）免疫エフェクター細胞の活性化受容体のエピトープ、および（２）ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープに結合する二重特異性分子に関連し、この場合の抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在し、ならびに活性化した免疫エフェクター細胞がウイルス感染した細胞を死滅させるように、免疫エフェクター細胞の活性化およびウイルス感染した細胞に対する標的指向化を、仲介し、より好ましくは向上させることができるそのような二重特異性分子に関する。
そのような二重特異性分子が持つ、免疫エフェクター細胞の活性化受容体およびウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープ両方と結合する能力により、そのような二重特異性分子は、活性ウイルス感染、潜在性ウイルス感染、持続性ウイルス感染、および不活性ウイルス感染の治療に利用することができる。
Ｉ．全般的な技法
本発明の実施では、特に記載がないかぎり、分子生物学（遺伝子組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を採用し、それらは当業者の技能の範囲内である。そのような技法は、文献に詳しく説明されており、文献として例えば、以下がある：ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， ２００１） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）， Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ， Ｐ．， Ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ； ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ （Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．， Ｅｄ．， １９８４）； ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ； ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＮＯＴＥＢＯＯＫ （Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ．Ｅ．， Ｅｄ．， １９９８） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ （Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．， Ｅｄ．， １９８７）； ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＯ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ （Ｍａｔｈｅｒ， Ｊ．Ｐ． ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｐ．Ｅ．， Ｅｄｓ．， １９９８） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ： ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ （Ｄｏｙｌｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， １９９３−８） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ； ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．） Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； ＷＥＩＲ’ Ｓ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ （Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． １９９７） Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ （Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， １９８７） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， １９８７） Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； ＰＣＲ： ＴＨＥ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＣＨＡＩＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮ， （Ｍｕｌｌｉｓ， Ｋ． ｅｔ ａｌ， Ｅｄｓ．， １９９４） Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ； ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ （Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ．， １９９１） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ； ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９９） Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ； ＩＭＭＵＮＯＢＩＯＬＯＧＹ ７ （Ｊａｎｅｗａｙ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ． ２００７） Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （Ｐ． Ｆｉｎｃｈ， １９９７） Ｓｔｒｉｄｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｄｅｖｏｒａｎ， ＵＫ； ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （Ｄ． Ｃａｔｔｙ．， ｅｄ．， １９８９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳＡ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）； ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （Ｓｈｅｐｈｅｒｄ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， ２０００） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳＡ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ； ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ （Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， １９９８） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； ＴＨＥ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ （Ｚａｎｅｔｔｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． １９９５） Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ）； および ＤＥＶＩＴＡ， ＨＥＬＬＭＡＮ， ＡＮＤ ＲＯＳＥＮＢＥＲＧ’Ｓ ＣＡＮＣＥＲ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＆ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ， ＥＩＧＨＴＨ ＥＤＩＴＩＯＮ， ＤｅＶｉｔａ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ． ２００８， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ（非特許文献３０〜５０）。
ＩＩ．定義
本明細書中使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、標的（炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど）と特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中使用される場合、この用語は、未変化のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その突然変異体、天然に生じる変異体、必要とされる特異性の抗原認識部位を持つ抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、およびキメラ抗体、ならびに必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置も包含する。この明細書全体を通じて、抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸残基の番号は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（非特許文献５１）にあるとおりのＥＵインデックスによるものである。本明細書中使用される場合、「抗体の抗原結合断片」は、少なくとも１つの抗原認識部位を保有する、抗体の一部分である。本明細書中使用される場合、この用語は、断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２Ｆｖなど）、および一本鎖（ｓｃＦｖ）を包含する。
「モノクローナル抗体」という用語は、均一な抗体集団を示し、集団において、モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関与するアミノ酸（天然に生じるものおよび天然には生じないものを含む）からなる。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単独の抗原部位に向かっていく。「モノクローナル抗体」という用語は、未変化のモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけでなく、それらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、それらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性の抗原認識部位および抗原結合能力を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置も包含する。抗体源または抗体が作られる様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、遺伝子組換え動物などによる）に関して、制限を設ける意図はない。この用語は、全免疫グロブリンならびに「抗体」の定義において上記で記載された断片などを含む。
「キメラ抗体」という用語は、一般に遺伝子組換え技法で調製された、非ヒト種の免疫グロブリンに由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子残部の免疫グロブリン構造を有するキメラ分子を示す。
「ヒト化抗体」という用語は、一般に遺伝子組換え技法で調製された、非ヒト種の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位、およびヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子残部の免疫グロブリン構造を有する分子を示す。抗原結合部位は、完全可変ドメインと定常ドメインが融合したものを含んでもよいし、相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが可変ドメインの適切なフレームワーク領域に移植されているものを含んでもよい。抗原結合部位は、野生型でもよいし、１つまたは複数のアミノ酸置換により修飾されてもよい。これにより、ヒト個体における免疫原としての定常領域を排除し、しかし外来可変領域に対する免疫応答の可能性は残す（ＬｏＢｕｇｌｉｏ， Ａ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） “Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｍａｎ：Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８６：４２２０−４２２４）（非特許文献５２）。別のアプローチは、ヒト化抗体を可能な限りヒトの形に近づけて再造形するために、ヒト由来定常領域を提供することだけでなく、可変領域を修飾することにも注目する。既知であるのは、重鎖および軽鎖両方の可変領域が、問題の抗原に反応して変化し結合能力を決定づける３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、ＣＤＲは４つのフレームワーク領域（ＦＲ）と隣接していて、ＦＲは所定の種において比較的保存されており、ＣＤＲの足場を提供していると推定されることである。特定の抗原に関する非ヒト抗体を調製する場合、非ヒト抗体に由来するＣＤＲをヒト抗体に存在するＦＲに移植して修飾することにより、可変領域を「再造形」または「ヒト化」することができる。このアプローチの様々な抗体への応用が、以下に報告されている：Ｓａｔｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：８５１−８５６； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） “Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ” Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） “Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ａｎ Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９： １５３４−１５３６； Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ， Ｃ． Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） “Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｙ ＣＤＲ−Ｇｒａｆｔｉｎｇ： Ｔｈｅ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ Ｏｆ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｏｎ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３−３７８３； Ｍａｅｄａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｓｈａｐｅｄ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ ＨＩＶ−Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，” Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２： １２４−１３４； Ｇｏｒｍａｎ， Ｓ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） “Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＣＤ４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８：４１８１−４１８５； Ｔｅｍｐｅｓｔ， Ｐ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） “Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ Ａ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ，” Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６−２７１； Ｃｏ， Ｍ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） “Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８：２８６９−２８７３； Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） “Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎ Ａｎｔｉ−ｐｌ８５ｈｅｒ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８９：４２８５−４２８９； および Ｃｏ， Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） “Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｗｉｔｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｆｏｒ Ｔｈｅ ＣＤ３３ Ａｎｔｉｇｅｎ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： １１４９−１１５４（非特許文献５３〜６２）。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ＣＤＲ配列全てを保存している（例えば、マウス抗体の６つのＣＤＲ全てを有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態において、ヒト化抗体は、本来の抗体に対して改変されている１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）を有し、これまたはこれらのＣＤＲは、本来の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。
「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体）という用語は、２つの抗原結合ドメインを有する一本鎖ポリペプチド分子を示し、抗原結合ドメインの一方はＴ細胞抗原と結合し、抗原結合ドメインの他方は標的細胞の表面に存在する抗原と結合する（国際公開第０５／０６１５４７号パンフレット；Ｂａｅｕｅｒｌｅ， Ｐ ｅｔ ａｌ． （２００８） “ＢｉＴＥ： Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ Ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｃｒｕｉｔ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，” Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ３３： １３７−１４７； Ｂａｒｇｏｕ， ｅｔ ａｌ．２００８） “Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ Ｔ Ｃｅｌｌ−Ｅｎｇａｇｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９７４−９７７）（特許文献１６および非特許文献６３および６４）。
「ダイアボディ」という用語は、少なくとも二本のポリペプチド鎖を含み、その二本のポリペプチド鎖が、好ましくは、共有結合相互作用を通じて会合して少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成し、エピトープ結合部位は、同一または異なるエピトープを認識することができる分子を示す。ダイアボディのポリペプチド鎖はそれぞれ、免疫グロブリン軽鎖可変領域および免疫グロブリン重鎖可変領域を含むが、これらの領域が相互作用してエピトープ結合部位を形成することはない。そうではなくて、ダイアボディの１つの（例えば第一の）ポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域が、ダイアボディの他の（例えば第二の）ポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域と相互作用してエピトープ結合部位を形成する。同様に、ダイアボディの１つの（例えば第一の）ポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ダイアボディの他の（例えば第二の）ポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域と相互作用してエピトープ結合部位を形成する。ダイアボディは、一特異性でも、二重特異性でも、三特異性などでも可能であり、したがって、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の異なるエピトープ（それらは同一または異なる抗原のものでもよい）と同時に結合することができる。ダイアボディは、さらに、一価、二価、三価、四価、五価、六価などでも可能であり、したがって、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の分子と同時に結合することができる。ダイアボディのこれら２つの特質（すなわち、特異性および価数の程度）を組み合わせて、例えば、二重特異性（すなわち、２種のエピトープと結合することができる）であり四価（すなわち、４組のエピトープと結合することができる）の抗体などを作り出すことができる。ダイアボディ分子は、ＰＣＴ公報の国際公開第２００６／１１３６６５号パンフレット、同第２００８／１５７３７９号パンフレット、および同第２０１０／０８０５３８号パンフレット（特許文献１７〜１９）に開示される。
本明細書中使用される場合、抗体またはポリペプチドが、別の分子のある領域（すなわち、エピトープ）に対して、他のエピトープよりも高頻度、高速、かつ長期間および／または高親和性で反応または会合するならば、その抗体またはポリペプチドは、そのあるエピトープに「特異的に」結合すると言われる。例えば、あるウイルスエピトープに特異的に結合する抗体は、他のウイルスエピトープまたは非ウイルスエピトープに結合するよりも高親和性、高結合力、高速、および／または長期間で、このウイルスエピトープに結合する抗体である。この定義を読めば当然のことながら、例えば、第一の標的と特異的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第二の標的に対して特異的または優先的に結合するかもしれないし、しないかもしれない。そうであるので、「特異的に結合する」は、必ずしも排他的な結合を必要としない（含む可能性はあるかもしれないが）。必ずしもそうではないが、一般的に、結合すると言う場合は「特異的に」結合する。
本明細書中使用される場合、エピトープという存在に関しての「免疫学的に活性な」または「免疫学的に活性なままである」という用語は、抗体（例えば、抗ウイルス抗体、または免疫細胞の活性化受容体と結合する抗体、またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質）が持つ、異なる条件下、例えば、エピトープが還元および変性条件を受けた後での、エピトープと結合する能力を示す。
様々な生物学的機能が、抗ウイルス抗体、免疫細胞の活性化受容体と結合する抗体、またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質と結合する抗体に関連しており、そのような機能として以下が挙げられるが、それらに限定されない：そのようなウイルスエピトープまたはそのような活性化受容体（および詳細には、ヒト細胞または非ヒト哺乳類の細胞の表面で発現されるそのような分子）と特異的に結合する能力；本来の抗体が優先的に結合するのと同じエピトープに対して優先的に結合する能力を含む、既知の抗ウイルス抗体または免疫細胞の活性化受容体と結合することができる既知の抗体の優先結合を競合的に阻害する能力；ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、そのようなエピトープを含むウイルスタンパク質の部分と、または生細胞の表面に露出した免疫細胞のそのような活性化受容体の部分と、結合する能力；そのようなエピトープを含むウイルスタンパク質の部分と、または生細胞（そのようなエピトープを含むウイルスタンパク質を発現する細胞など、しかしこれらに限定されない）の表面に露出した免疫細胞のそのような活性化受容体の部分と、またはそれらの表面上のそのような活性化受容体と、結合する能力；および／または、治療薬または検出可能なマーカーを、表面でそのような分子を発現する細胞に送達する能力。本明細書中記載されるとおり、本発明のポリペプチド（抗体を含む）は、これらの特徴の任意の１種または複数を有することができるが、ただしポリペプチドは、活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞またはウイルス感染した細胞に関して活性を示すものとする。
本明細書中使用される場合、「作用剤」という用語は、生物学的、薬学的、または化学的化合物を示す。制限ではなく例として、単純または複雑な、有機または無機の、分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体断片、ビタミン誘導体、炭水化物、毒素、または化学療法用化合物が挙げられる。様々な核構造に基づいて、様々な化合物、例えば、小分子およびオリゴマー（例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、および合成有機化合物を合成することができる。また、様々な天然原料、植物および動物抽出物などから、スクリーニング対象化合物を得ることができる。
本発明の方法で採用される作用剤は、無作為選択も可能であるし、合理的選択または設計も可能である。本明細書中使用される場合、分子とその生来の結合相手または既知抗体との会合に関与する特定のアミノ酸または他の化学部分について事前の考察も知識もない状態で、作用剤が選択される場合、その作用剤は無作為選択されると言われる。無作為選択された作用剤の例として、化学ライブラリーまたはペプチドコンビナトリアルライブラリーの使用およびスクリーニングを通じて同定された作用剤がある。
本明細書中使用される場合、標的部位の配列および／または作用剤の作用と関連したその立体配座を考慮した無作為ではない基準に基づいて、作用剤が選択される場合、その作用剤は合理的選択または設計されると言われる。本発明は、そのような活性化受容体とその生来の結合相手との相互作用部位で作用する作用剤も包含するが、もっとも、他のリガンドおよびそれらの相互作用部位も、現在既知であるか将来同定されるかに関わらず、本発明の範囲内に含まれる。作用剤は、受容体／リガンドおよび／または受容体抗体複合体の接触部位を作るペプチド配列を利用して、合理的選択することも可能であるし、合理的設計することも可能である。例えば、合理的選択されたペプチド作用剤は、ウイルスタンパク質に現れる、または生細胞の天然の環境において生細胞の表面に露出するとおりの免疫細胞の活性化受容体に現れるエピトープと同一であるアミノ酸配列を持つペプチドが可能である。そのような作用剤は、抗体または生来のリガンドと結合することにより、ウイルスタンパク質または活性化受容体と抗体の会合、あるいはそのようなウイルスタンパク質または活性化受容体とその生来のリガンドとの会合を、望みどおりに減少または遮断するだろう。
本明細書中使用される場合、「標識された」という用語は、抗体に関しては、検出可能な物質、例えば放射活性作用剤またはフルオロフォア（例えばフィコエリトリン（ＰＥ）またはフルオレセインイソチオシアネート（フルオロイソチオシアネートまたはＦＩＴＣとも知られる））などを抗体とカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことにより抗体を直接標識すること、ならびに検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識化を包含するものとする。
本明細書中使用される場合、「会合」という用語は、抗体に関しては、作用剤（例えば、化学療法薬）と抗体との共有結合性または非共有結合性付着を含む。抗体は、作用剤（例えば、化学療法薬）と、直接結合するまたは共通の土台への付着を介して間接的に結合することにより会合することができ、間接的結合とは、抗体が、作用剤を、抗体が結合する感染細胞に局在化するように仕向けるが、抗体が結合するのと同じ間感染細胞をその作用剤が標的として指向しないよう、または作用剤の効力が低下しないよう、その感染細胞において、生理学的条件下、抗体と作用剤は実質的に解離しているものである。
「生物試料」という用語は、診断または監視アッセイで使用することができる、伴侶動物から得られる様々な型の試料を包含する。この定義は、唾液、血液、および生物起原の他の液体試料、固形組織試料、例えば生検標本または組織培養物あるいはそれら由来の細胞およびそれらの子孫、例えば、ウイルス感染していると疑われる個体の組織試料から得られる細胞を包含する。この定義は、獲得後に何らかの方法で操作されている、例えば試薬処理、溶解、または特定成分（タンパク質またはポリヌクレオチドなど）の濃縮、あるいは切片にする目的で半固体もしくは固体マトリクスに包埋されている試料も含む。「生物試料」という用語は、臨床試料を包含し、同じく培養細胞、細胞上清、細胞溶解液、血清、血漿、生体液、および組織試料も含む。
「宿主細胞」という用語は、ポリヌクレオチド挿入物を組み込むためのベクターを受け取ることができる、またはすでに受け取っている個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、この子孫は、自然突然変異、偶発突然変異、または計画的突然変異のため、必ずしも元々の親細胞と完全に同一（形態学的に、またはゲノムＤＮＡ補体おいて）ではない可能性がある。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドがｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子導入された細胞を含む。
本明細書中使用される場合、「感染症の発生を遅らせる」という用語は、そのような感染症の発生を、保留する、邪魔する、遅くする、遅らせる、一定に留める、および／または延期することを意味する。この遅れは、感染症の履歴および／または治療される個体によって、様々な長さの時間になる可能性がある。当業者には当然のことながら、十分なまたは顕著な遅れは、個体が感染症を発生しないという点で、事実上、予防を含めることができる。
本明細書中使用される場合、薬学的組成物の「有効量」は、一実施形態において、有益なまたは所望の結果を実現するのに十分な量であり、そのような結果として、特に制限なく、疾患が感染症の症候（例えば、ウイルス量、熱、疼痛、敗血症など）を減弱したことによる症候の減少などの臨床結果、疾患を患っている個体の生活の質の向上、疾患の治療に必要とされる他の医薬の用量の減少、標的指向化および／または内部移行を介してなど別の薬物療法の効果の向上、疾患の進行を遅らせること、および／または個体の生存時間を延ばすことが挙げられる。有効量は、１回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的の場合、薬剤、化合物、または薬学的組成物の有効量とは、直接または間接いずれかで、存在するウイルスの増殖（または効果）を低下させるのに、およびウイルス疾患の発症を低下および／または遅らせるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、薬剤、化合物、または薬学的組成物の有効量は、別の薬剤、化合物、または薬学的組成物と併用して達成されてもされなくてもよい。したがって、「有効量」は、１種または複数の化学療法薬を投与する文脈で考慮される可能性があり、１種類の作用剤が、１種または複数の他の作用剤との併用において、所望の結果を達成できるまたは達成する場合の有効量で与えられるように考慮される可能性がある。個体によって必要とする量は様々であるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。抗体投与の典型的な投薬量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／体重の１つまたは複数の単位用量を含む。好適な投薬量は、１〜１００ｍｇ／ｋｇ／体重を含む。特に好適な投薬量は、１０ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。二重特異性分子（例えば、ダイアボディおよびＢｉＴＥ）投与の典型的な用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の１つまたは複数の単位用量を含む．好ましくは、投与される投薬量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重、または０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．７５ｍｇ／ｋｇ／体重である。
本明細書中使用される場合、核酸分子または作用剤、抗体、組成物、または細胞などは、核酸分子、作用剤、抗体、組成物、または細胞などが、生来の起原において自然に存在する混入核酸分子、抗体、作用剤、組成物、または細胞などから実質的に分離されている場合に、「単離されている」と言われる。
「個体」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳類を示す。哺乳類として、ヒト、家畜動物、競技用動物、ペット、霊長類、マウス、およびラットが挙げられるが、これらに限定されない。特に好適な実施形態において、「個体」という用語は、ヒトを示す。
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書中相互に交換可能に用いられて、任意の長さの、しかし特には５、１０、１５、２０、または２５アミノ酸残基より長い、アミノ酸重合体を示す。重合体は、直鎖でも分岐鎖でもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、また途中に非アミノ酸が入っていてもよい。この用語は、自然にまたは介入により修飾されたアミノ酸重合体も包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾（標識成分との結合など）。同じく定義に含まれるものとして、例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ならびに当該分野で既知の他の修飾を有するポリペプチドがある。当然のことながら、本発明のポリペプチドは抗体に基づいており、ポリペプチドは、一本鎖としてまたは会合した鎖として生じる可能性がある。
同じく本発明の範囲に包含されるものとして、本明細書中記載される二重特異性分子のペプチド模倣物がある。そのようなペプチド模倣物として、少なくとも１つのアミノ酸残基が、天然には通常見られないアミノ酸残基（アミノ酸のＤ異性体またはアミノ酸をＮ−アルキル化した種など）で置換されているペプチドが挙げられる。他の実施形態において、ペプチド模倣物は、ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト、またはモジュレーターの少なくとも１本のアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）をアミドアイソスターで置換することにより構築される。適切なアミドアイソスターとして以下が挙げられる：−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−、−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＥまたはＺ型）、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−。ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト、またはモジュレーターにおける、アミドアイソスターで置換する候補として適切なアミド結合として、ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト、またはモジュレーター治療を予定している対象の内在性エステラーゼまたはプロテアーゼで加水分解され得る結合が挙げられる。
本明細書中使用される場合、「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも５０％の純度（すなわち、混入物を含まないこと）、より好ましくは少なくとも９０％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、より好ましくは少なくとも９８％の純度、より好ましくは少なくとも９９％純度、および特に好ましくは９９％超の純度の物質を示す。
本明細書中使用される場合、「毒素」という用語は、細胞内で不都合な反応をもたらす任意の物質を示す。例えば、感染細胞に向けられた毒素は、感染細胞で、不都合な、場合によっては有害な効果を有する。毒素の例として、放射性同位体、カリチアマイシン、およびマイタンシノイドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果を含む、および好ましくはそのような臨床結果である、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを示す。そのような有益なまたは所望の臨床結果として、以下の１種または複数が挙げられるが、それらに限定されない：感染細胞または他の患部細胞の増殖の減少（または破壊）、疾患による症候の低下、疾患を患っている個体の生活の質の向上、疾患を治療するのに必要な他の薬物療法の用量の低下、疾患の進行を遅らせること、および／または治療を受ける伴侶動物の生存期間を延ばすこと。
本明細書中使用される場合、「ウイルス感染した」という用語は、ウイルス、特に以下のウイルスに感染してしまった細胞を示す：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、Ｂウイルス（ＭａｃａｃｉｎｅヘルペスウイルスＩ）、ＢＫウイルス、ブニヤウイルス、チクングニアウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ハンタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトヘルペスウイルス３型、ヒトヘルペスウイルス５型、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス７型、ＨＩＶ、ヒトパピローマウイルス、ヒトβリンパ球向性ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型、インフルエンザウイルス、ＪＣウイルス、ＪＥＶ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ニパーウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、オルトレオウイルス、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、大痘瘡ウイルス、小痘瘡ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、または黄熱病ウイルス。
ＩＩＩ．抗体およびポリペプチドの作成方法
モノクローナル抗体の作成方法は当該分野で既知である。利用できる方法の１つは、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９７５） “Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｏｆ Ｆｕｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｏｆ Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，” Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（非特許文献６５）の方法、またはそれを修飾した方法である。典型的には、モノクローナル抗体を、マウス、ラット、またはウサギで発生させる。抗体は、マウス、ラット、またはウサギを、免疫原量の細胞、細胞抽出物、またはタンパク質調製物で免疫化することにより産生され、タンパク質調製物は、所望のウイルスエピトープまたは免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、およびＮＫＧ２Ｄなど）または目的の免疫細胞のそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質を含有するものである。免疫原として、初代細胞、培養細胞株、癌性細胞、核酸、または組織が可能であるが、これらに限定されない。免疫化に使用される細胞は、それらを免疫源として使用する前に、ある長さの時間（例えば、少なくとも２４時間）培養してもよい。細胞は、そのまま、または無変性アジュバント（Ｒｉｂｉなど）と組み合わせて、免疫原として使用することができる。一般に、細胞は免疫源として使用されるときに、無傷を保っておりかつ好ましくは生きていなければならない。無傷の細胞は破壊された細胞よりも良好に、免疫化される動物により抗原を検出させることができる。変性または粗いアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）の使用は、細胞を破壊する可能性があり、したがって使用できない。免疫原は、周期的に間隔を空けて（例えば、隔週または毎週）複数回投与してもよいし、動物の生存能力を維持する（例えば、組織遺伝子組換え体において）やり方で投与されてもよい。
一実施形態において、所望のウイルスエピトープ、または所望の免疫エフェクター細胞の活性化受容体、またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質と結合するモノクローナル抗体は、そのような分子を過剰発現する宿主細胞を用いて得ることができる。
抗体反応を監視するため、少量の生物試料（例えば、血液）を、ヒト患者または、より好ましくは、非ヒト哺乳類から得て、免疫原に対する抗体力価を検査してもよい。そのような非ヒト哺乳類の脾臓および／または複数の大きいリンパ節を取り出して解離させ単独細胞にすることができる。所望であれば、抗原で被覆したプレートまたはウェルに細胞懸濁液を塗布して、脾臓細胞をスクリーニングしてもよい（非特異的付着細胞の除去後に）。抗原特異的な膜結合免疫グロブリンを発現しているＢ細胞は、プレートに結合するので、残りの懸濁液で洗い流されることはない。得られるＢ細胞、すなわち解離した脾臓細胞全てを、次いで、骨髄腫細胞（例えば、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、およびソーク研究所細胞配給センター、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡが提供するもの）と融合させることができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、脾臓またはリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成させることができる。次いで、ハイブリドーマを選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、他にも「ＨＡＴ培地」として既知）で培養する。次いで、得られるハイブリドーマを限界希釈法で播種し、例えば、ＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）または免疫組織化学（ＩＨＣ）スクリーニング法を用いて、免疫源と特異的に結合する抗体の産生について試験する。次いで、選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、組織培養ボトルまたは中空繊維反応器中で）、またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、マウスの腹水として）いずれかで培養する。
細胞融合技法の別の代替法として、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）不死化Ｂ細胞を用いて、本発明のモノクローナル抗体を産生させることができる。ハイブリドーマを、所望であれば、増加およびサブクローニングし、そして従来の試験手順（例えば、ＦＡＣＳ、ＩＨＣ、放射免疫アッセイ、酵素免疫測定、蛍光免疫測定など）により、上清を抗免疫原活性について試験する。
別の代替法において、所望のウイルスエピトープ、または免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体、またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質に対して免疫特異的である既存のモノクローナル抗体および任意の他の等価抗体を配列決定して、当該分野で既知の任意の技法により遺伝子組換えで産生させることができる。一実施形態において、そのような抗体を配列決定し、次いで発現または増殖用にポリヌクレオチド配列をベクターにクローン導入する。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中でベクター内に維持されていてもよく、次いで宿主細胞を増殖させて将来の使用に備えて凍結させることができる。
そのような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の二重特異性分子、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体、またはｃａｎｏｎｉｚｅｄ抗体を作りだし、抗体の親和性または他の特徴を改善するための遺伝子操作に使用することができる。抗体のヒト化またはイヌ化の一般原則は、抗体の抗原結合部分の基本配列を保持しつつ、非ヒトまたは非イヌの抗体残部をヒト抗体配列またはイヌ抗体配列と交換するすることを含む。モノクローナル抗体のヒト化またはイヌ化は一般的な４工程がある。それらは以下のとおりである：（１）出発抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列を決定する工程、（２）ヒト化抗体またはｃａｎｏｎｉｚｅｄ抗体を設計する工程、すなわち、ヒト化またはｃａｎｏｎｉｚｉｎｇプロセスの間、どの抗体フレームワーク領域を用いるかを決定する工程、（３）実際のヒト化またはｃａｎｏｎｉｚｉｎｇ方法／技法の工程、および（４）ヒト化抗体の遺伝子導入および発現の工程。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第５，８０７，７１５号明細書；同第５，８６６，６９２号明細書；および同第６，３３１，４１５号明細書（特許文献２０〜２３）を参照。
単鎖可変領域断片（「ｓｃＦｖ」）は、短い連結ペプチドを用いて軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することにより作られる。Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） （“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）（非特許文献６６）は、連結ペプチドの例を記載しているが、例示されるペプチドは、一方の可変領域のカルボキシ末端から他方の可変領域のアミノ末端までが約３．５ｎｍに渡る。他の配列のリンカーも設計されて使用されている（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） “Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）（非特許文献６６）。リンカーは、続いて、機能を追加する（薬剤の付加または固体支持体への付着など）ために修飾することができる。単鎖変異体は、遺伝子組換えによるか合成によるかのいずれかで製造することができる。ｓｃＦｖを合成で製造する場合、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖを遺伝子組換えで製造する場合、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、真核生物（酵母菌、植物、昆虫、または哺乳類細胞など）または原核生物（大腸菌など）いずれかの適切な宿主細胞に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド核酸連結などの定常操作により作ることができる。得られるｓｃＦｖは、当該分野で既知の標準タンパク質精製技法を用いて単離することができる。
本発明は、本発明の二重特異性分子の性質に実質的に影響を及ぼさない本発明の二重特異性分子の修飾、および活性が向上または低下した変異体を含む。ポリペプチドの修飾は、当該分野の通常業務であり、本明細書中で詳細に記載する必要はない。修飾されたポリペプチドの例として、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性に有害な変化を顕著にもたらさない１つまたは複数のアミノ酸の削除または追加、または化学的類似体の使用が行われたポリペプチドが挙げられる。互いに保存的に置換することができるアミノ酸残基として、以下が挙げられるが、それらに限定されない：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン；リシン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン。修飾されたポリペプチドの例として、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに他の翻訳後修飾（例えば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など）を受けたポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的である、すなわち、置換されたアミノ酸は、本来のアミノ酸のものと同様な化学的性質を有する。そのような保存的置換は当該分野で既知であり、その例は上記で示したとおりである。アミノ酸修飾は、１つまたは複数のアミノ酸を交換または修飾することから、ある領域（可変領域など）を完全に再設計することまで、範囲が渡る可能性がある。可変領域における変化は、結合親和性および／または特性を改変する可能性がある。他の修飾方法として、当該分野で既知のカップリング技法の使用が挙げられ、そのような技法として、酵素の使用、酸化的置換、およびキレート化が挙げられるが、これらに限定されない。修飾は、例えば、免疫アッセイ用標識を結合させる（放射免疫アッセイ用放射活性部分の結合など）ために用いることができる。修飾されたポリペプチドは、当該分野で確立された手順を用いて作られ、当該分野で既知の標準検査を用いてスクリーニングすることができる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドおよび抗体に由来する１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含する。一実施形態において、可変軽鎖領域の少なくとも１０の連続アミノ酸および可変重鎖領域の少なくとも１０のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を保有する。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生される抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を保有する。本発明の目的では、抗体融合タンパク質は１つまたは複数のポリペプチドドメインを含有し、１つまたは複数のポリペプチドドメインは、所望のウイルスエピトープ、または免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体、またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質と特異的に結合するドメイン、および天然の分子においてこのドメインが結合しない別のアミノ酸配列（例えば、異種配列または別の領域からの同種配列）と特異的に結合するドメインである。
抗ウイルスの、抗活性化受容体の、またはそのような活性化受容体ポリペプチドを発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質に対して抗タンパク質の、ならびに他のアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーターは、当該分野で既知の方法により例えば、合成により、または遺伝子組換えにより、作り出すことができる。そのようなペプチドアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーターを製造する１つの方法は、ポリペプチドの化学合成、続いて天然の立体配座、すなわち正しいジスルフィド結合連結を得るのに適切な酸化条件下での処理を含む。これは、当業者に既知である方法論を用いて達成することができる（例えば、Ｋｅｌｌｅｙ， Ｒ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｉｎ： ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ， Ｓｅｔｌｏｗ， Ｊ．Ｋ． Ｅｄ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌ．１２， ｐｐ １−１９； Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｊ．Ｍｅｔ ａｌ．（１９８４） ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬを参照；同じく、米国特許第４，１０５，６０３号明細書；同第３，９７２，８５９号明細書；同第３，８４２，０６７号明細書；および同第３，８６２，９２５号明細書を参照）（非特許文献６７および６８および特許文献２４〜２７）。
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて簡便に調製することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｂ． （１９８６） “Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２ （４７４８）：３４１−３４７； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｒ．Ａ． （１９８５） “Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｎｕｍｂｅｒｓ Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｔ Ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌ Ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８２（１５）：５１３１−５１３５； Ｇａｎｅｓａｎ， Ａ．（２００６） “Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｗｅｎｔｙ−Ｆｉｒｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ，” Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６（１）：３−１０）（非特許文献６９〜７１）。
代替形態では、抗体を、当該分野で既知の任意の方法を用いて、遺伝子組換えで作って発現させることができる。最初に、宿主動物で作られた抗体を単離し、遺伝子配列を得て、この遺伝子配列を用いて宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）で抗体を遺伝子組換えにより発現させることにより、抗体を遺伝子組換えにより作ることができる。採用可能な他の方法は、植物（例えば、タバコ）または遺伝子導入ミルクで抗体配列を発現させるものである。植物またはミルクで、遺伝子組換えで抗体を発現させるのに適切な方法は、開示されている（例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，” Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２７５６； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） “Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ，” Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５−９３；およびＰｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９９） “Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｌｋ Ａｓ Ａ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１４７−１５７を参照）（非特許文献７２〜７４）。抗体誘導体（例えば、ヒト化、単鎖など）を作るのに適した方法は、当該分野で既知である。別の代替形態では、抗体は、ファージディスプレイ技法により遺伝子組換えで作ることができる（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書；同第５，５８０，７１７号明細書；同第５，７３３，７４３号明細書；同第６，２６５，１５０号明細書；およびＷｉｎｔｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） “Ｍａｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｂｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，” Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２．４３３−４５５を参照）（特許文献２８〜３１および非特許文献７５）。
目的の抗体またはタンパク質には、エドマン分解法により配列決定を行うことができ、この方法は当該業者に周知である。質量分析法またはエドマン分解法でもたらされるペプチド情報を用いて、目的のタンパク質をクローニングするのに使用されるプローブまたはプライマーを設計することができる。
目的のタンパク質をクローニングする代替方法は、目的の抗体またはタンパク質を発現する細胞用に精製したタンパク質またはその一部分を用いて「パニング」することにより行われる。「パニング」手順は、第二の細胞型で所望のｃＤＮＡを発現または過剰発現する組織または細胞からｃＤＮＡライブラリーを得ること、および所望のタンパク質に対する特異的結合に関して第二の細胞型の遺伝子導入された細胞をスクリーニングすることにより行われる。「パニング」により細胞表面タンパク質をコードする哺乳類遺伝子をクローニングするのに用いられる方法の詳細な説明は、当該分野で見つけることができる（例えば、Ａｒｕｆｆｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９８７） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｏｆ Ａ ＣＤ２８ ｃＤＮＡ Ｂｙ Ａ Ｈｉｇｈ−Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＣＯＳ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８４：８５７３−８５７７およびＳｔｅｐｈａｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） “Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ Ｉｎ Ｏｒｇａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ Ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，” Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １４０：５８４１−５８５４を参照）（非特許文献７６および７７）。
抗体、ならびに他のペプチドアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーターをコードするｃＤＮＡは、当該分野の標準方法に従って特定の細胞型由来のｍＲＮＡを逆転写することにより得ることができる。具体的には、ｍＲＮＡは、様々な溶解酵素または化学溶液を用いてＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ（既出）に記載の手順に従って単離することができ、または市販されている核酸結合樹脂（例えば、Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて添付の使用説明書に従って抽出することができる。次いで、合成ｃＤＮＡを発現ベクターに導入して、第二の型の細胞で目的の抗体またはタンパク質を産生させる。発現ベクターが、エピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの不可欠な部分としていずれかで、宿主細胞において複製可能でなければならないことは、暗黙の了解である。適切な発現ベクターとして、プラスミド、ウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されず、ウイルスベクターとして、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびコスミドが挙げられる。
目的のポリヌクレオチドを保有するベクターは、数多くの適切な手段のいずれかにより、宿主細胞に導入することができ、そのような手段として、電気穿孔法、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いた遺伝子導入法；微粒子銃；リポフェクション法；および感染法（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染病原体である場合）が挙げられる。ベクターまたはポリヌクレオチドの導入方法の選択は、宿主細胞の特長に依存することが多い。
異種ＤＮＡを過剰発現することができる宿主細胞であればなんでも、目的の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的で使用することができる。適切な哺乳類宿主細胞の制限ではなく例として、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は、もし宿主細胞に目的の抗体またはタンパク質に相当する内在性抗体タンパク質または抗体があった場合には、それらのｃＤＮＡより約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、より好ましくは２０倍高い、より好ましくは５０倍高い、より好ましくは１００倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。所望のタンパク質に対する特異的結合について宿主細胞をスクリーニングするのは、好ましくは免疫アッセイまたはＦＡＣＳで行われる。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞は、こうして単離することができる。
親ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト、またはモジュレーター分子と比べて、得られるタンパク質のアミノ酸配列に付加、削除、または変更があるものをコードする突然変異ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーターを製造するのに現在採用することができる様々な技法も、利用可能である。
本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該分野で既知の手順により作ることができる。ポリペプチドは、タンパク質分解または他の抗体分解法により、上記のとおりの組換え技法により（すなわち、単独または融合ポリペプチド）、または化学合成により、製造することができる。抗体のポリペプチド、特に上限約５０アミノ酸の短いポリペプチドは、化学合成で簡便に作られる。化学合成の方法は当該分野で既知であり、市販されている。例えば、そのようなポリペプチドは、固相方法を用いて、自動ポリペプチド合成機で製造することができる。
ＩＶ．ポリペプチドおよびモノクローナル抗体をスクリーニングする方法
複数の方法を用いて、所望のウイルスエピトープ、または免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体、またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質と結合するポリペプチドおよびモノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。当然のことながら、「結合する」は、生物学的または免疫学的に関連する特異的結合を示し、例えば、非特異的標的に対して非常に高い濃度で免疫グロブリンを用いる場合に起こる可能性がある非特異的結合を示すのではない。一実施形態において、標準のスクリーニング技法を用いて、所望のタンパク質またはエピトープに対する結合について、モノクローナル抗体をスクリーニングする。この様式では、モノクローナル抗体を得ることができる。免疫エフェクター細胞の活性化受容体に向けられた抗体を産生する、本発明の好適なハイブリドーマは、活性化受容体：ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、およびＮＫＧ２Ｄに対する抗体を産生するものである。
免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質に結合するさらなるモノクローナル抗体を同定することができる。この目的で、モノクローナル抗体を、そのようなエピトープまたはタンパク質には結合するが他のエピトープまたはタンパク質には結合しない示差的能力についてスクリーニングする。スクリーニングに採用することができる１つの方法は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）である。標準免疫組織化学技法は、当業者に既知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ （Ｊ．Ｐ． Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｄ． Ｂａｒｎｅｓ， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｖｏｌ． ５７， Ｃｈ．１８ ａｎｄ １９， ｐｐ． ３１４−３５０， １９９８）（非特許文献７８）を参照。生物試料（例えば、組織）は、生検、死体解剖、または検死解剖から得ることができる。エピトープが免疫エフェクター細胞の表面にのみ存在するかどうかを確認するため、潜在的エピトープに結合する抗体を用いて、免疫エフェクター細胞を検出することができる。組織は、凍結中の損傷を防ぐ固体または半固体物質に包埋することができ（例えば、アガロースゲルまたはＯＣＴ）、次いで染色用に切断する。異なる臓器由来の異なる段階にある組織を用いて、モノクローナル抗体をスクリーニングすることができる。スクリーニング目的で使用することができる組織の例として、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、肌、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓が挙げられるが、これらに限定されない。
複数の異なる検出システムのいずれかを利用して、抗体と組織切片の結合を検出することができる。典型的には、免疫組織化学法は、一次抗体と組織を結合させることを含み、次いで、一次抗体由来の種に対して反応性である二次抗体が作られて、検出可能なマーカー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ、またはジアミノベンジジン、ＤＡＢ）と結合させられた。利用可能な１つの代替方法は、ポリクローナル鏡像相補抗体すなわちｐｏｌｙＭＩＣＡ（登録商標）である（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｍｉｒｒｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＵＫ； Ｍａｎｇｈａｍ， Ｄ．Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） “Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｉｎｇ Ｍｉｒｒｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＭＩＣＡ），” Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５（２）：１２９−３３）（非特許文献７９）。ｐｏｌｙＭＩＣＡ（登録商標）技法を用いて、正常組織および感染組織に対する、一次抗体の結合を試験することができる。複数種のｐｏｌｙＭＩＣＡ（登録商標）検出キットが市販されている：製品番号ＨＫ００４．Ｄは、ＤＡＢ色素原を使用するｐｏｌｙＭＩＣＡ（登録商標）検出キットである；製品番号ＨＫ００４．Ａは、ＡＥＣ色素原を使用するｐｏｌｙＭＩＣＡ（登録商標）検出キットである。あるいは、一次抗体を、検出可能なマーカーで直接標識してもよい。
適切な抗体を選択するＩＨＣスクリーニングの第一工程は、マウスで発生させた一次抗体（例えば、抗活性化受容体抗体）と１種または複数の免疫原（例えば、細胞または組織試料）を結合させることである。一実施形態において、組織試料は、異なる臓器から得られた凍結組織の切片である。細胞または組織試料は、感染細胞または非感染細胞いずれかを含むことができる。
当業者に周知の多数の方法のいずれかにより、固定するしないに関わらず、凍結組織を用意し、切断し、ＩＨＣを行うことができる（例えば、Ｓｔｅｐｈａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） “Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＢＥＮ Ｄｕｒｉｎｇ Ｒａｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，” Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２１２：２６４−２７７（非特許文献８０）およびＳｔｅｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９） “Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ Ｉｎ Ｏｒｇａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ Ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ＤＩｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，” Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：５８４１−５８５４（非特許文献７７）を参照）。
Ｖ．本発明の抗体を特性決定する方法
複数の方法のいずれかを用いて、本発明の抗体を特性決定することができる。１つの方法は、抗体が結合するエピトープを同定することである。エピトープマッピングは、様々な供給元、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている。エピトープマッピングを用いて、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープは、直鎖エピトープ、すなわち、一本に伸びるアミノ酸に含まれているものも可能であるし、三次元相互作用しているアミノ酸により形成された立体構造のエピトープも可能であり、この場合のエピトープは必ずしも一本に伸びるアミノ酸に含まれているとは限らない。
長さが様々なペプチド（例えば、好ましくは、少なくとも４〜６アミノ酸長）を、単離または合成（例えば遺伝子組換えにより）して、抗体との結合アッセイに用いることができる。抗体が結合するエピトープは、細胞外配列に由来する重複ペプチドを用いて抗体との結合を決定することによる、系統的スクリーニングで決定することができる。
本発明の抗体を特性決定するのに使用することができるさらに別の方法は、同じ抗原と結合することが既知の他の抗体を用いた競合アッセイを利用すること、すなわち、他の抗体と同じエピトープと結合するかどうかを明らかにすることである。所望のウイルスエピトープ、または免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体、またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質に対する抗体の市販品の例は、入手可能であり、本明細書中に教示される結合アッセイを用いて同定することができる。競合アッセイは、当業者に周知であり、そのような手順および例示データを実施例においてさらに詳細に記載する。抗体は、組織、ウイルスの型、または抗体が結合する免疫細胞の型によってさらに特性決定することができる。
上記のとおり、本発明の抗体の中心的な態様は、抗体が持つ、所望のウイルスエピトープ、または免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体、またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質に結合する能力に関する。そのような抗体は、ヒトエフェクター細胞反応性抗体または所望のウイルス粒子と結合する抗体の中でスクリーニングすることにより、すぐに同定することができる。免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体に結合するそのような抗体の制限ではなく例として、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３、Ｍ２９１、ＹＴＨ１２．５、抗ＣＤ３抗体１および抗ＣＤ３抗体２；抗ＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１；抗ＣＤ８抗体ＴＲＸ２；抗ＣＤ４抗体ＴＲＸ１；抗ＣＤ２抗体Ｌｏ−ＣＤ２ａ（ＡＴＣＣ寄託番号：１１４２３）；抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８およびＡ９；抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ２．０が挙げられる。
ＶＩ．本発明の好適な組成物
本発明は、薬学的組成物をはじめとする組成物を包含し、組成物は、本発明の二重特異性分子、そのような二重特異性分子に由来するポリペプチド、そのような二重特異性分子またはポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、および本明細書中記載されるとおりの他の作用剤を含む。
所望のウイルスエピトープと結合する抗体に関して、好適な抗体として、以下のウイルスのエピトープに結合するものが挙げられる：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、Ｂウイルス（ＭａｃａｃｉｎｅヘルペスウイルスＩ）、ＢＫウイルス、ブニヤウイルス、チクングニアウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（例えば、Ｍタンパク質など）、サイトメガロウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス（例えば、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２など）、ハンタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトヘルペスウイルス３型、ヒトヘルペスウイルス５型、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス７型、ＨＩＶ（例えば、ｅｎｖなど）、ヒトパピローマウイルス（例えば、Ｅ６、Ｅ７など）、ヒトβリンパ球向性ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型、インフルエンザウイルス（例えば、Ｍ２タンパク質など）、ＪＣウイルス、ＪＥＶ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ニパーウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、オルトレオウイルス、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、呼吸器多核体ウイルス（例えば、Ｍタンパク質など）、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、大痘瘡ウイルス、小痘瘡ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、または黄熱病ウイルス。そのような抗体は、多数の供給元から市販されており、そうでなければ、マウスまたは他の動物（モノクローナル抗体の産生用を含む）をそのようなウイルスで免疫化することにより得ることができる。
免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体と結合する抗体に関して、好適な抗体として、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３、Ｍ２９１、ＹＴＨ１２．５、抗ＣＤ３抗体１および抗ＣＤ３抗体２；抗ＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１；抗ＣＤ８抗体ＴＲＸ２；抗ＣＤ４抗体ＴＲＸ１；抗ＣＤ２抗体Ｌｏ−ＣＤ２ａ（ＡＴＣＣ寄託番号：１１４２３）；抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８およびＡ９；抗ＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ２．０が挙げられる。これらの抗体の可変軽鎖および可変重鎖のアミノ酸配列を以下に示す。したがって、当業者は、そのようなＣＤＲを有する二重特異性分子、ならびに抗体および、これらの抗体により認識されるエピトープと結合することができるそれらの誘導体（それらのヒト化誘導体を含む）を構築することができる。
抗ＣＤ３抗体
ＯＫＴ３
ＯＫＴ３軽鎖可変領域（配列番号１）（ＣＤＲは下線で示される）：
ＯＫＴ３重鎖可変領域（配列番号２）（ＣＤＲは下線で示される）：
Ｍ２９１
Ｍ２９１軽鎖可変領域（配列番号３）（ＣＤＲは下線で示される）：
Ｍ２９１重鎖可変領域（配列番号４）（ＣＤＲは下線で示される）：
ＹＴＨ１２．５
ＹＴＨ１２．５軽鎖可変領域（配列番号５）（ＣＤＲは下線で示される）：
ＹＴＨ１２．５重鎖可変領域（配列番号６）（ＣＤＲは下線で示される）：
抗ＣＤ３抗体１
抗ＣＤ３抗体１軽鎖可変領域（配列番号７）（ＣＤＲは下線で示される）：
抗ＣＤ３抗体１重鎖可変領域（配列番号８）（ＣＤＲは下線で示される）：
抗ＣＤ３抗体２
抗ＣＤ３抗体２軽鎖可変領域（配列番号９）（ＣＤＲは下線で示される）：
抗ＣＤ３抗体２重鎖可変領域（配列番号１０）（ＣＤＲは下線で示される）：
抗ＴＣＲ抗体
ＢＭＡ０３１
ＢＭＡ０３１軽鎖可変領域（配列番号１１）（ＣＤＲは下線で示される）：
ＢＭＡ０３１重鎖可変領域（配列番号１２）（ＣＤＲは下線で示される）：
抗ＣＤ８抗体
ＴＲＸ２
ＴＲＸ２軽鎖可変領域（配列番号１３）（ＣＤＲは下線で示される）：
ＴＲＸ２重鎖可変領域（配列番号１４）（ＣＤＲは下線で示される）：
抗ＣＤ４抗体
ＴＲＸ１
ＴＲＸ１軽鎖可変領域（配列番号１５）（ＣＤＲは下線で示される）：
ＴＲＸ１重鎖可変領域（配列番号１６）（ＣＤＲは下線で示される）：
抗ＣＤ２抗体
Ｌｏ−ＣＤ２ａ（ＡＴＣＣ寄託番号：１１４２３）
Ｌｏ−ＣＤ２ａ軽鎖可変領域（配列番号１７）（ＣＤＲは下線で示される）：
Ｌｏ−ＣＤ２ａ重鎖可変領域（配列番号１８）（ＣＤＲは下線で示される）：
抗ＣＤ１６抗体
３Ｇ８
３Ｇ８軽鎖可変領域（配列番号１９）（ＣＤＲは下線で示される）：
３Ｇ８重鎖可変領域（配列番号２０）（ＣＤＲは下線で示される）：
Ａ９
Ａ９軽鎖可変領域（配列番号２１）（ＣＤＲは下線で示される）：
Ａ９重鎖可変領域（配列番号２２）（ＣＤＲは下線で示される）：
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体
ＫＹＫ１．０
ＫＹＫ１．０軽鎖可変領域（配列番号２３）（ＣＤＲは下線で示される）：
ＫＹＫ１．０重鎖可変領域（配列番号２４）（ＣＤＲは下線で示される）：
ＫＹＫ２．０
ＫＹＫ２．０軽鎖可変領域（配列番号２５）（ＣＤＲは下線で示される）：
ＫＹＫ２．０重鎖可変領域（配列番号２６）（ＣＤＲは下線で示される）：
本発明はさらに、所望のウイルスエピトープ、または免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体、またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質と結合する任意の抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストの複合体を提供する。
これらの複合体は、巨大分子（本明細書中記載される診断、スクリーニング、または精製手順で使用される、任意の不溶性、固体支持マトリックスなど）と共有結合したアゴニスト、アンタゴニスト、またはモジュレーターを含む。適切なマトリックス材料として、化学的に不活性で、高多孔質性であり、ペプチドリガンドと共有結合を形成することができる官能基を多数有する任意の物質が挙げられる。マトリックス材料およびマトリックスリガンド複合体の調製手順の例は、Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ） Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８５）； Ｌｏｗｅ， “Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”， ｉｎ Ｗｏｒｋ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ） ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＩＮ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． ７， Ｐａｒｔ ＩＩ， Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ （１９７９）；Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．， “Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”， ｉｎ Ｎｅｕｒａｔｈ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）， ＴＨＥ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｖｏｌ． １， ｐｐ． ９５−１７８ （１９７５）；およびＳｃｈｏｔｔ， Ｈ． ＡＦＦＩＮＩＴＹ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．ＮＹ（１９８４）（非特許文献８１〜８４）に記載されている。
所望のウイルスエピトープ、または免疫エフェクター細胞の所望の活性化受容体、またはそのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質と結合する抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストは、ヒトおよび／または非ヒト伴侶動物細胞の表面で発現する分子と特異的に結合する能力、および任意選択で以下の基準のいずれか（１つまたは複数）により、さらに同定および特性決定することができる：
（ａ）そのようなエピトープまたはタンパク質に対する既知の抗体の優先結合を競合的に阻害する能力、この能力は本来の抗体が優先的に結合するのと同じエピトープに優先的に結合する能力を含む；
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、生きているヒトおよび／または非ヒト哺乳類細胞の表面で発現するそのようなエピトープまたはタンパク質の一部分と結合する能力；
（ｃ）そのようなエピトープまたはタンパク質を表面で発現するヒトおよび／または非ヒト哺乳類細胞に化学療法薬を送達する能力；および／または
（ｆ）そのようなエピトープまたはタンパク質を表面で発現するヒトおよび／または非ヒト哺乳類細胞に治療薬または検出可能なマーカーを送達する能力。
本発明はまた、本発明の抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体の軽鎖および／または重鎖可変領域の１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体の軽鎖および／または重鎖ＣＤＲの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体の軽鎖および／または重鎖の３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、以下のいずれかを有する抗体のアミノ酸配列を含む：本来の抗体の配列の中の少なくとも５つの連続するアミノ酸、少なくとも８つの連続するアミノ酸、少なくとも約１０の連続するアミノ酸、少なくとも約１５の連続するアミノ酸、少なくとも約２０の連続するアミノ酸、少なくとも約２５の連続するアミノ酸、少なくとも約３０の連続するアミノ酸、この場合、アミノ酸のうち少なくとも３つは抗体の可変領域から来るものである。一実施形態において、可変領域は、本来の抗体の軽鎖から来るものである。別の実施形態において、可変領域は、抗体の重鎖から来るものである。別の実施形態において、５つ（以上）の連続するアミノ酸は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）から来るものである。
ＶＩＩ．二重特異性ダイアボディ（二重親和性再標的化試薬）
上記のとおり、本発明はさらに、少なくとも二本のポリペプチド鎖を含む「二重特異性ダイアボディ分子（二重親和性再標的化試薬）」を包含し、この二本のポリペプチド鎖は少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成し、エピトープ結合部位のうち少なくとも１つは免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと結合し、免疫エフェクター細胞はエフェクター細胞の活性化受容体を発現するものであり、かつエピトープ結合部位のうち少なくとも１つはウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと特異的に結合し；抗原は、ウイルス上で二重特異性分子により検出される抗原のレベルよりも高いレベルで、ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する。
好適な実施形態（図１Ａ）において、ダイアボディの第一のポリペプチド鎖は以下を含む：
（ｉ）エピトープ（１）に特異的な第一免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含むドメイン（Ａ）；
（ｉｉ）エピトープ（２）に特異的な第二免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含むドメイン（Ｂ）；および
（ｉｉｉ）ドメイン（Ｃ）。
そのようなダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、以下を含む：
（ｉ）エピトープ（２）に特異的な第二免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含むドメイン（Ｄ）；
（ｉｉ）エピトープ（１）に特異的な第一免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含むドメイン（Ｅ）；および
（ｉｉｉ）ドメイン（Ｆ）。
上記のエピトープ（１）は、ウイルスタンパク質のエピトープを、およびエピトープ（２）は、活性化受容体のエピトープ、または活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープを示すことができる。あるいは、上記のエピトープ（１）は、活性化受容体のエピトープ、または活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープを、およびエピトープ（２）は、ウイルスタンパク質のエピトープを示すことができる。
ダイアボディドメイン（Ａ）および（Ｂ）は、互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはない。同様に、ダイアボディドメイン（Ｄ）および（Ｅ）は、互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはない。そうではなくて、ダイアボディドメイン（Ａ）と（Ｅ）が会合して、エピトープ（１）と結合する結合部位を形成し；上記ダイアボディドメイン（Ｂ）と（Ｄ）が会合して、上記エピトープ（２）と結合する結合部位を形成する。ドメイン（Ｃ）と（Ｆ）は一緒に共有結合で会合する。ダイアボディ分子の形成方法およびダイアボディドメインの特異的指向性は、米国特許公開第２０１０／０１７４０５３号明細書、同第２００９／００６０９１０号明細書、および同第２００７／０００４９０９号明細書（特許文献３２〜３４）に開示される。
ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ＶＬドメインとＶＨドメインは、これらが自己集合できないように共有結合している。２本のポリペプチド鎖の相互作用は、２つのＶＬ−ＶＨ対形成をもたらし、２つのエピトープ結合部位、すなわち、二価分子を形成する。ＶＨドメインおよびＶＬドメインのどちらも、ポリペプチド鎖内のどの位置にも制約されない、すなわち、アミノ（Ｎ）末端にもカルボキシ（Ｃ）末端にも限定されないし、ドメインそれぞれのお互いに対する相対的な位置も限定されない。すなわち、ＶＬドメインは、ＶＨドメインに対してＮ末端にあってもよいし、その逆もまた可能である；しかしながら、ＶＬドメインが、ＶＨドメインに対してＮ末端にあると好適である。唯一の制限は、機能性ダイアボディを形成する目的で、相補ポリペプチド鎖を得ることが可能であることである。ＶＬドメインおよびＶＨドメインが同じ抗体に由来する場合、２本の相補ポリペプチド鎖は同一であってもよい。例えば、結合ドメインがエピトープＡに特異的な抗体に由来する場合（すなわち、結合ドメインがＶＬＡ−ＶＨＡ相互作用で形成される場合）、各ポリペプチドは、ＶＨＡおよびＶＬＡを含む。抗体の二本のポリペプチド鎖のホモ二量体化は、２つのＶＬＡ−ＶＨＡ結合部位の形成をもたらし、二価の一特異性抗体をもたらすだろう（図１Ａ）。ＶＬドメインおよびＶＨドメインが異なる抗体に由来する場合、機能性二重特異性ダイアボディの形成は、２本の異なるポリペプチド鎖の相互作用、すなわちヘテロ二量体の形成を必要とする。例えば、二重特異性ダイアボディについて、１本のポリペプチド鎖が、ＶＬＡおよびＶＬＢを含むとする；このポリペプチド鎖のホモ二量体化は、結合のないまたは予測不可能な結合のいずれかで、２つのＶＬＡ−ＶＨＢ結合部位の形成をもたらす。対照的に２本の異なるポリペプチド鎖が、例えば遺伝子組換え発現系において、自由に相互作用でき、ポリペプチド鎖の一方はＶＬＡおよびＶＨＢを含み、もう一方はＶＬＢおよびＶＨＡを含む場合、２つの異なる結合部位、ＶＬＡ−ＶＨＡおよびＶＬＢ−ＶＨＢが形成されるだろう。全てのダイアボディポリペプチド鎖対について、２本の鎖が誤整列または誤結合する可能性とは、すなわち、ＶＬ−ＶＬまたはＶＨ−ＶＨドメイン相互作用の可能性である；しかしながら、機能性ダイアボディの精製は、当該分野で既知のまたは本明細書中に例示される、親和性を利用した任意の方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）を用いて、適正に二量体化した結合部位の免疫特異性に基づいて、容易に管理することができる。
ダイアボディのポリペプチド鎖のうち１本または複数本は、Ｆｃドメインまたはその一部分（例えば、ＣＨ２ドメイン、またはＣＨ３ドメイン）を任意選択で含むことができる。Ｆｃドメインまたはその一部分は、任意の免疫グロブリンアイソタイプまたはアロタイプに由来するものが可能であり、そのようなタイプとして、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＭが挙げられるがこれらに限定されない。好適な実施形態において、Ｆｃドメイン（またはその一部分）はＩｇＧに由来する。特定の実施形態において、ＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４、あるいはそのアロタイプである。一実施形態において、ダイアボディ分子は、Ｆｃドメインを含み、このＦｃドメインは、任意の免疫グロブリンアイソタイプからそれぞれ独立して選択されたＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む（すなわち、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ由来のＣＨ２ドメインおよびＩｇＥ由来のＣＨ３ドメインを含む、またはＩｇＧ１由来のＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ２由来のＣＨ３ドメインを含む、など。）。Ｆｃドメインは、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖中に、このポリペプチド鎖の他のドメインまたは部分に対して任意の位置に導入操作することができる（例えば、Ｆｃドメインまたはその一部分は、鎖のポリペプチドのＶＬドメインおよびＶＨドメイン両方に対してＣ末端にあってもよいし；ＶＬドメインおよびＶＨドメイン両方に対してＮ末端にあってもよいし；一方のドメインのＮ末端にあり他方のＣ末端（すなわち、ポリペプチド鎖の２つのドメインの間）にあってもよい）。
ダイアボディ分子のポリペプチド鎖中のＦｃドメインは、優先的に二量体化して、免疫グロブリン様性質（例えば、Ｆｃ−ＦｃγＲ、相互作用など）を示すダイアボディ分子の形成をもたらす。Ｆｃ含有ダイアボディは、例えば、二本のポリペプチド鎖からなる二量体であってもよく、各ポリペプチド鎖はＶＨドメイン、ＶＬドメイン、およびＦｃドメインを含む。このようなポリペプチド鎖の二量体化は、未修飾の二価抗体のものとは異なる構造ではあるが、Ｆｃドメインを含む二価のダイアボディをもたらす。そのようなダイアボディ分子は、野生型免疫グロブリンと比べて変化した表現型（例えば、変化した血清半減期、結合性質など）を示すだろう。他の実施形態において、Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子は、四量体であってもよい。そのような四量体は、２本の「重い方の」ポリペプチド鎖、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、およびＦｃドメインを含むポリペプチド鎖、ならびに２本の「軽い方の」ポリペプチド鎖、すなわち、ＶＬおよびＶＨを含むポリペプチド鎖を含む。軽い方および重い方の鎖は、相互作用して単量体を形成し、この単量体が、それらの対形成していないＦｃドメインを介して相互作用して、Ｉｇ様分子を形成する。そのようなＩｇ様ダイアボディは、四価であって、一特異性であることも、二重特異性であることも、四特異性であることも可能である。
上記のとおりの四特異性ダイアボディ分子の形成は、４本の異なるポリペプチド鎖の相互作用を必要とする。そのような相互作用は、様々な形で鎖が誤対形成する可能性があるために、単独の細胞での遺伝子組換え産生系内で有効に達成するのが困難である。誤対形成の可能性の増加に対する１つの解決策は、「対応した凹凸構造（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」の突然変異を所望のポリペプチド鎖対に導入操作することである。そのような突然変異は、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を優先させる。例えば、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用に関して、突然変異を起こしたドメインが、立体的干渉により、同様な突然変異を起こしたドメインとの相互作用できなくなり、相補的または順応突然変異、すなわち「凹（ｈｏｌｅｓ）」が導入されている（例えば、グリシンでの置換）ドメインと対を形成せざるを得ないように、アミノ酸置換（好ましくは、「凸（ｋｎｏｂｓ）」を形成するかさ高い側鎖基を有するアミノ酸、例えば、トリプトファンでの置換）をＣＨ２またはＣＨ３ドメインに導入することができる。そのような突然変異の組は、ダイアボディ分子を構成するポリペプチドの任意の対に導入操作することができ、さらに、その対のポリペプチド鎖の任意の部分に導入操作することができる。ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を優先させるようにタンパク質を操作する方法は、特に免疫グロブリン様分子の操作に関して、当該分野で既知であり、本明細書中に包含される（例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ． （１９９６） “‘Ｋｎｏｂｓ−Ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ’ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｆｏｒ Ｈｅａｂｙ Ｃｈａｉｎ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｒ． ９：６１７−６２１， Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） “Ｓｔａｂｌｅ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ Ｆｒｏｍ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｔｈｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｏｆ Ａ Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ，” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７０： ２６−３５，およびＸｉｅ ｅｔ ａｌ． （２００５） “Ａ Ｎｅｗ Ｆｏｒｍａｔ Ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｕｍｏｒｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９６：９５−１０１を参照；これらはそれぞれ、その全体において、参照として本明細書中援用される）（非特許文献８５〜８７）。
本発明はまた、変異型Ｆｃまたは変異型ヒンジＦｃドメイン（またはその一部分）を含むダイアボディ分子も包含し、変異型Ｆｃドメインは、対応する野生型ＦｃドメインまたはヒンジＦｃドメイン（またはその一部分）と比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば置換、挿入、削除）を含む。変異型ＦｃドメインまたはヒンジＦｃドメイン（またはその一部分）を含む分子（例えば、抗体）は、通常、野生型ＦｃドメインまたはヒンジＦｃドメインまたはその一部分を含む分子と比べて変化した表現型を有する。変異型表現型は、変化した血清半減期として、変化した安定性として、変化した細胞酵素感受性として、またはＮＫ依存性もしくはマクロファージ依存性アッセイで検査した場合に変化したエフェクター機能として発現される可能性がある。エフェクター機能の改変として同定されるＦｃドメイン修飾は、上記で開示される。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインにおける多数の修飾で、活性化受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）との結合を増加させるものおよび抑制性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）との結合を減少させるものは、当該分野で既知であり、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ， Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ． （２００７） “Ｆｃ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ａｂｉｌｉｔｙ Ｔｏ Ｋｉｌｌ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｔｕｍｏｒ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｖｉａ Ｌｏｗ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆｃｇａｍｍａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７（１８）：８８８２−８８９０（非特許文献８８）に記載されている。ＣＤ３２Ｂに対する結合が減少したおよび／またはＣＤ１６Ａに対する結合が増加したヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン変異の例として、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、またはＰ２９６Ｌ置換が挙げられる。これらのアミノ酸置換は、任意の組み合わせでヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインに存在することができる。一実施形態において、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、およびＹ３００Ｌ置換を含む。別の実施形態において、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ２９６Ｌ置換を含む。別の実施形態において、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン変異型は、Ｎ２９７Ｑ置換を含み、この変異はＦｃＲ結合を消失させる。
本発明は、ヒンジドメインを含む分子も包含する。ヒンジドメインは、任意の免疫グロブリンアイソタイプまたはアロタイプに由来するものが可能であり、そのようなタイプとして、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＭが挙げられるがこれらに限定されない。好適な実施形態において、ヒンジドメインは、ＩｇＧに由来し、ＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４、あるいはそれらのアロタイプである。このようなヒンジドメインを、Ｆｃドメインと一緒に、ダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖に導入操作して、ダイアボディ分子がヒンジＦｃドメインを含むようにすることができる。特定の実施形態において、ヒンジおよびＦｃドメインは、当該分野で既知であるか本明細書中例示される免疫グロブリンアイソタイプのいずれかからそれぞれ独立して選択される。他の実施形態において、ヒンジおよびＦｃドメインは、ポリペプチド鎖の少なくとも１つの他のドメイン（例えば、ＶＬドメイン）により隔てられている。ヒンジドメイン、または任意選択でヒンジＦｃドメインは、本発明のポリペプチド中に、このポリペプチド鎖の他のドメインまたは部分に対して任意の位置に導入操作することができる。特定の実施形態において、本発明のポリペプチド鎖はヒンジドメインを含み、このヒンジドメインはポリペプチド鎖のＣ末端にあるが、このポリペプチド鎖はＦｃドメインを含まない。さらに他の実施形態において、本発明のポリペプチド鎖はヒンジＦｃドメインを含み、このヒンジＦｃドメインはポリペプチド鎖のＣ末端にある。さらなる実施形態において、本発明のポリペプチド鎖はヒンジＦｃドメインを含み、このヒンジＦｃドメインはポリペプチド鎖のＮ末端にある。
ダイアボディのポリペプチド鎖の各ドメイン、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、およびＦｃドメインは、ペプチドリンカーによって隔てられていてもよい。ペプチドリンカーは０、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つのアミノ酸が可能である。特定の実施形態において、アミノ酸リンカー配列は、核酸配列ｇｇａｇｇｃｇｇａｔ ｃｃｇｇａｇｇｃｇｇ ａｇｇｃ（配列番号２８）でコードされるＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）である。ダイアボディ分子のポリペプチド鎖は、少なくとも１つのシステイン残基を含むように操作されていてもよく、このシステイン残基がダイアボディの第二のポリペプチド鎖上のカウンターパートシステイン残基と相互作用して鎖間ジスルフィド結合を形成する。そのような鎖間ジスルフィド結合は、ダイアボディ分子を安定させる働きをして、それにより遺伝子組換え系における発現および回復を改善し、安定で一定した配合物をもたらすとともに単離および／または精製された産物のｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を改善する。システイン残基は、単独のアミノ酸としてまたはより大きなアミノ酸配列（例えばヒンジドメイン）の一部として、ポリペプチド鎖の任意の部分に導入することができる。特定の実施形態において、システイン残基は、ポリペプチド鎖のＣ末端に発生するように操作することができる。いくつかの実施形態において、システイン残基は、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列ＬＧＧＣ（配列番号２９）内に導入されている。特定の実施形態において、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、アミノ酸配列ＬＧＧＣ（配列番号２９）を含む。別の実施形態において、システイン残基は、ポリペプチドのヒンジドメインを含むアミノ酸配列、例えばＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号３０）またはＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳ（配列番号３１）内に導入されている。特定の実施形態において、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖のＣ末端は、ＩｇＧヒンジドメインのアミノ酸配列、例えば配列番号２９または配列番号３１を含む。別の実施形態において、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖のＣ末端は、アミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号３２）を含み、この配列はヌクレオチド配列ｇｔｔｇａｇｃｃｃａ ａａｔｃｔｔｇｔ（配列番号３３）でコードすることができる。他の実施形態において、システイン残基は、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ（配列番号３４）内に導入され、この配列はヌクレオチド配列ｃｔｇｇｇａｇｇｃｔ ｇｃｔｔｃａａｃａｇ ｇｇｇａｇａｇｔｇｔ（配列番号３５）でコードすることができる。特定の実施形態において、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、アミノ酸配列ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ（配列番号３４）を含む。さらに他の実施形態において、システイン残基は、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号３６）内に導入され、この配列はヌクレオチド配列ｔｔｃａａｃａｇｇｇ ｇａｇａｇｔｇｔ（配列番号３７）でコードすることができる。特定の実施形態において、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、アミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号３６）を含む。
特定の実施形態において、ダイアボディ分子は少なくとも二本のポリペプチド鎖を含み、各鎖はアミノ酸配列ＬＧＧＣ（配列番号２９）を含んでいて、ＬＧＧＣ（配列番号２９）配列中のシステイン残基間のジルフィド結合により共有結合している。特定の実施形態において、ダイアボディ分子は少なくとも二本のポリペプチド鎖を含み、各鎖はアミノ酸配列ＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）を含んでいて、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）配列中のシステイン残基間のジルフィド結合により共有結合している。別の特定の実施形態において、ダイアボディ分子は少なくとも二本のポリペプチド鎖を含み、鎖の一方は配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号３６）を含むが、他方の鎖はヒンジドメイン（少なくとも１つのシステイン残基を有する）を含み、これらの少なくとも二本のポリペプチド鎖は、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号３６）のシステイン残基とヒンジドメインのシステイン残基の間のジルフィド結合により共有結合している。特定の態様において、ヒンジドメインに位置するジルフィド結合を担うシステイン残基は、Ｃｙｓ−１２８（ＫａｂａｔＥＵに従って番号づけられるとおり；未修飾、無傷のＩｇＧ重鎖のヒンジドメインに位置する）であり、カウンターパートシステイン残基は、Ｃｙｓ−２１４（ＫａｂａｔＥＵに従って番号づけられるとおり；未修飾、無傷のＩｇＧ軽鎖のＣ末端に位置する）である（Ｅｌｋａｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ． （２００５） “Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ Ｉｎ ＣＨ１ Ｕｎｄｅｒｌｉｅ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｏｆ Ｕｎａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｉｇ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎｓ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０：１４４０２−１４４１２）（非特許文献８９）。さらに他の実施形態において、少なくとも１つのシステイン残基は、アミノ酸鎖のＮ末端に発生するように操作されている。さらに他の実施形態において、少なくとも１つのシステイン残基は、ダイアボディ分子のポリペプチド鎖のリンカー部分に発生するように操作されている。さらなる実施形態において、ＶＨまたはＶＬドメインは、親ＶＨまたはＶＬドメインと比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、そのアミノ酸修飾が親アミノ酸をシステインで置換することを含むように操作されている。
この実施形態のさらに別の態様において、第一のポリペプチド鎖のドメイン（Ｃ）は、ヒトＩｇＧのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号３２）を含み、この配列は、ヌクレオチド配列ｇｔｔｇａｇｃｃｃａ ａａｔｃｔｔｇｔ（配列番号３３）でコードすることができる。この実施形態の別の態様において、第二のポリペプチド鎖のドメイン（Ｆ）は、アミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号３２）を含む。この実施形態の特定の態様において、第一のポリペプチド鎖のドメイン（Ｃ）は、ヒトｋａｐｐａ軽鎖のＣ末端の６つのアミノ酸、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号３６）を含み；第二のポリペプチド鎖のドメイン（Ｆ）は、アミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号３２）またはヒンジドメインを含む。この実施形態の他の態様において、第二のポリペプチド鎖のドメイン（Ｆ）は、ヒトｋａｐｐａ軽鎖のＣ末端の６つのアミノ酸、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号３６）を含み；第一のポリペプチド鎖のドメイン（Ｃ）は、アミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号３２）またはヒンジドメインを含む。
上記に照らして理解できるように、二重特異性ダイアボディの個々のポリペプチドは、２種のホモ二量体および１種のヘテロ二量体を形成することができる。本発明の一実施形態において、電荷を帯びたポリペプチドを、ダイアボディポリペプチドの一方、またはより好ましくは両方のＣ末端に付加することができる。二重特異性ダイアボディの個々のポリペプチドについて反対の電荷を帯びたポリペプチドを選択することにより、そのような電荷を帯びたポリペプチドを含むことでヘテロ二量体の形成が優先され、ホモ二量体の形成が減少する。好ましくは、正電荷を帯びたポリペプチドは、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、および／またはリシン（またはそのようなアミノ酸の混合物）の実質的中身を有し、負電荷を帯びたポリペプチドは、アスパラギン酸またはグルタミン酸（またはそのようなアミノ酸の混合物）の実質的中身を有する。リシンの実質的中身を有する正電荷を帯びたポリペプチドおよびグルタミン酸の実質的中身を有する負電荷を帯びたポリペプチドが、特に好適である。そのように反対の電荷を帯びたポリペプチド間の静電引力を最大にする目的で、螺旋構造を自発的に取ることができるポリペプチドを採用することが好適である。
したがって、好適な実施形態において、正電荷を帯びた「Ｅコイル」が、二重特異性ダイアボディを形成するために用いられるポリペプチドの一方に付加され、負電荷を帯びた「Ｋコイル」が、ダイアボディの第二のポリペプチドに付加される（図１Ｂ）。特に好適なＥコイルは、配列：（ＥＶＡＡＬＥＫ）４［すなわち（配列番号３９）ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ］を有するだろう。特に好適なＫコイルは、配列：（ＫＶＡＡＬＫＥ）４［すなわち（配列番号４０）ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ］を有するだろう。
そのようなＥコイルを所有する好適なダイアボディポリペプチドは、一般配列：［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＥＶＡＡＬＥＫ）４］−ＧＧＧＮＳを有し、配列中、ＶＬはダイアボディの可変軽鎖Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号２７のものであり、ＶＨはダイアボディの可変重鎖Ｉｇドメインであり、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４は配列番号３９のものであり、ＧＧＧＮＳは配列番号４１のものである。そのようなＫコイルを所有する好適なダイアボディポリペプチドは、一般配列：［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＫＶＡＡＬＫＥ）４］−ＧＧＧＮＳを有し、配列中、ＶＬはダイアボディの可変軽鎖Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号２５のものであり、ＶＨはダイアボディの可変重鎖Ｉｇドメインであり、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４は配列番号４０のものであり、ＧＧＧＮＳは配列番号４１のものである。
さらなる実施形態において、Ｆｃ領域は、ＥコイルまたはＫコイルダイアボディのＥコイルおよび／またはＫコイルと連結することができる。Ｆｃ含有ダイアボディのＦｃ領域とダイアボディＶＨドメインとの間の隔たりがあまり大きくない配列によりそれらのドメイン間の相互作用が弱くなり、それらの結合リガンドまたはいずれにしろ何かがダイアボディの組立に干渉する場合は、それらのドメインの隔たりをさらに広げることが望ましい。任意のアミノ酸配列のセパレーターを採用することができるものの、Ｆｃドメインを可変ドメインから最大限に離して突き出すために、α螺旋コイルを形成するセパレーターを採用することが好適である。上記の反対の電荷を帯びたコイル状ポリペプチドは、さらに、ヘテロ二量体形成を促進するように機能するので、そのような分子は、特に好適なセパレーターである。そのようなコイル含有Ｆｃダイアボディ分子は、Ｆｃダイアボディのものと同様な利益をもたらし、そのような利益として、改善された血清半減期およびエフェクター機能動員が挙げられる。上記のＥコイルおよびＫコイルポリペプチドは、この目的に特に好適である。したがって、好適な実施形態において、ＥコイルＦｃ含有ダイアボディは、一般配列：［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＥＶＡＡＬＥＫ）４］−ＧＧＧ−Ｄ２３４（Ｋａｂａｔ番号による）から始まるＦｃドメイン、を有し、配列中、ＶＬはダイアボディの可変軽鎖Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号２７のものであり、ＶＨはダイアボディの可変重鎖Ｉｇドメインであり、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４は配列番号３９のものである。同様に、好適な実施形態において、ＫコイルＦｃ含有ダイアボディは、一般配列：［ＶＬドメイン］−［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］−［ＶＨドメイン］−［（ＫＶＡＡＬＫＥ）４］−ＧＧＧ−Ｄ２３４（Ｋａｂａｔ番号による）から始まるＦｃドメイン、を有し、配列中、ＶＬはダイアボディの可変軽鎖Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号２７のものであり、ＶＨはダイアボディの可変重鎖Ｉｇドメインであり、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４は配列番号４０のものである。
上記のとおり、コイル含有ダイアボディ分子またはコイル含有Ｆｃ含有ダイアボディ分子は、そのようなコイルセパレーターを１つだけ含んでいてもよいし、そのようなセパレーターを複数含んでいてもよい（例えば、２つのセパレーター、好ましくは反対の電荷のもので、そのうちの一方はダイアボディのポリペプチドのＶＨドメインのそれぞれと連結している）。Ｆｃ領域とそのようなセパレーター分子を連結することにより、Ｆｃダイアボディ分子が鎖交換により二価体、四価体などを作る能力が向上する。こうして、Ｆｃダイアボディ分子が製造され、このＦｃダイアボディ分子は、ＦｃドメインがダイアボディＶＨドメインの一方または両方と連結しているかどうかによって、単量体または二量体を形成する。
したがって、本発明は、図１Ｃに示される、３本のポリペプチド鎖で構成されるダイアボディを含む。第一のポリペプチド鎖は、以下を含む（Ｎ末端からＣ末端に向かって）：
（ｉ）エピトープ（１）に特異的な第一免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含むドメイン（Ａ）；
（ｉｉ）エピトープ（２）に特異的な第二免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含むドメイン（Ｂ）；および
（ｉｉｉ）ＥコイルまたはＫコイル。
第二のポリペプチド鎖は、以下を含む（Ｎ末端からＣ末端に向かって）：
（ｉ）エピトープ（２）に特異的な第二免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含むドメイン（Ｄ）；
（ｉｉ）エピトープ（１）に特異的な第一免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含むドメイン（Ｅ）；および
（ｉｉｉ）Ｋコイル（第一のポリペプチドがＥコイルを有する場合）またはＥコイル（第一のポリペプチドがＫコイルを有する場合）。
第二のポリペプチド鎖はさらに、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、この領域は、ドメインＤに対してＮ末端にあってもよいし、ドメインＥに対してＣ末端にあってもよい。
第三のポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３領域を含む。
上記のエピトープ（１）は、ウイルスタンパク質のエピトープを示し、エピトープ（２）は、活性化受容体のエピトープまたは活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に発現するタンパク質のエピトープを示す。あるいは、上記のエピトープ（１）は、活性化受容体のエピトープまたは活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞の表面に発現するタンパク質のエピトープを示し、エピトープ（２）は、ウイルスタンパク質のエピトープを示す。
好適な実施形態において、第二のポリペプチド鎖は、２３４位および２３５位に凸（ｋｎｏｂ）変異（Ｔ３６６Ｗ）およびアラニン置換を有する。そのような好適な実施形態において、第三のポリペプチド鎖は、凹（ｈｏｌｅ）変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ）およびタンパク質Ａ結合能力を除去するＨ４３５Ｒ置換を有する。そのような凸および凹変異の存在は、第二および第三ポリペプチド鎖のそれぞれのＣＨ２−ＣＨ３領域間でヘテロ二量体化するのを助長する。
本発明の二重特異性分子は、２つの別々の異なるエピトープに同時に結合することができる。好適な実施形態において、少なくとも１つのエピトープ結合部位は、免疫エフェクター細胞上で発現する決定因子（例えばＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、Ｔ細胞受容体、ＮＫＧ２Ｄなど）に特異的であり、これらの決定因子はＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または他の単核球上で発現する。一実施形態において、ダイアボディ分子は、エフェクター細胞決定因子と結合し、このエフェクター細胞の活性化も行う。これに関して、本発明の二重特異性分子は、Ｆｃドメインをさらに含むかどうかに関係なくＩｇ様機能を発揮する可能性がある（例えば、当該分野で既知のまたは本明細書中例示される任意のエフェクター機能アッセイ（例えば、ＡＤＣＣアッセイ）で検査した場合に）。特定の実施形態において、本発明の二重特異性ダイアボディは、ウイルスエピトープおよびエフェクター細胞決定因子の両方と結合しながら、この細胞を活性化する。
本発明はさらに、本発明のダイアボディを作り出すための非天然アミノ酸の組み込みを含む。そのような方法は、当業者に既知であり、例えば、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むことを可能にする天然の生合成機構などである。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００２） “Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ，” Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ． １：１−１１； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００１） “Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ Ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９２：４９８−５００； ｖａｎ Ｈｅｓｔ ｅｔ ａｌ． （２００１） “Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｔｏｗａｒｄ Ａ Ｎｅｗ Ｌｅｖｅｌ Ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ，” Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ． １９：１８９７−１９０４（非特許文献９０〜９２）を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中に参照として援用される。代替戦略は、アミノアシル−ｔＲＮＡの生合成を担う酵素に注目する。例えば、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１） “Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｏｆ Ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｉｎ Ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｈｏｓｔ，” Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２３（４４）： １１０８９−１１０９０； Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （２００１） “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｓｅｔ Ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，” ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５０２（１−２）：２５−３０；（非特許文献９３および９４）を参照、これらはそれぞれ、その全体が本明細書中に参照として援用される。いくつかの実施形態において、本発明は、グリコシル化部位を付加または削除することにより本発明の分子のＶＬ、ＶＨ、またはＦｃドメインを修飾する方法を包含する。タンパク質の炭水化物を修飾する方法は、当該分野で周知であり、本発明に包含される。例えば、米国特許第６，２１８，１４９号明細書；欧州特許第０３５９０９６号明細書；米国特許公開第２００２／００２８４８６号明細書；国際公開第０３／０３５８３５号パンプレット；米国特許公開第２００３／０１１５６１４号明細書；米国特許第６，４７２，５１１号明細書（特許文献３５〜４０）を参照、これらは全て、その全体が本明細書中に参照として援用される。
ＶＩＩＩ．治療目的での本発明の二重特異性分子の使用方法
本発明の二重特異性分子は、ウイルス疾患を患っているまたはその危険性があるヒトおよび／または非ヒト哺乳動物において治療目的で使用することができる。そのような二重特異性分子を用いた療法は、上記のとおり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で複合体の形成を含むことができる。一実施形態において、そのような二重特異性分子は、そのような疾患と関連したウイルスと結合し、その増殖を低下させることができる。当然ながら、二重特異性分子は、生理学的（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ）条件で結合を促進する濃度で投与される。別の実施形態において、そのような二重特異性分子は、結腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、膵臓、腎臓などの異なる組織のウイルス感染細胞（またはそのような感染の危険性がある細胞）に向けられた免疫療法のために用いることができる。別の実施形態において、そのような二重特異性分子は、単独で、ウイルス感染した細胞と結合してその細胞分裂を減少させることができる。別の実施形態において、そのような二重特異性分子は、ウイルス感染した細胞と結合してその成長を遅らせることができる。さらに別の実施形態において、癌、または感染症の個体に、そのような二重特異性分子を用いた緩和治療を施す。そのような個体の緩和治療は、疾患の進行には直接影響しないが、癌または感染症の有害な症候、または疾患のために施された他の治療に由来する医原性症候を治療することまたは減ずることを含む。これには、疼痛緩和、栄養補助、性的障害、心理的苦悩、抑うつ、疲労、精神障害、悪心、嘔吐などの治療が含まれる。一実施形態において、本発明の分子は、患者（例えば、ＨＩＶ＋患者または癌患者）に治療のためまたは予防のために投与されて、そのような個体で発生するまたは発生する可能性がある続発性ウイルス感染（ＨＩＶまたは癌に対立するものとして）を解決する。
本発明の二重特異性分子は、投与するために様々な配合物として用いることができる。いくつかの実施形態において、二重特異性分子またはその断片は、そのまま投与することができる。本発明の組成物は、薬理学的活性剤の他に、賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に許容可能なキャリアを含むことができ、そのような賦形剤および助剤は、当該分野で周知であって、薬理学的活性物質を投与しやすくする、または作用部位への送達のために活性化合物を薬学的に使用可能な製剤に加工しやすくする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形を与える、または堅牢性を与えることもできるし、あるいは希釈剤として作用することもできる。適切な賦形剤として、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩類、カプセル封入剤、緩衝剤、および肌浸透賦活剤が挙げられるが、これらに限定されない。
非経口投与に適切な配合物として、水溶性型の活性化合物（例えば水溶性塩）の水溶液が挙げられる。また、油性注射用懸濁液に適切な活性化合物懸濁液を投与することもできる。適切な親油性溶媒またはビヒクルとして、油脂（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質を含有することができ、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランを含む。任意選択で、懸濁液は、安定剤も含むことができる。リポソームもまた、細胞に送達するために作用剤をカプセル封入するために用いることができる。
本発明に従う全身投与用の薬学的配合物は、腸内投与、非経口投与、または外用投与用に配合することができる。実際、これら３種の配合物は全て、活性成分の全身投与を達成するために同時に用いることができる。賦形剤ならびに非経口および非経口ではない薬物送達用の配合物は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ： ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ、２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ （２００５）（非特許文献９５）に記載されている。経口投与に適切な配合物として、硬または軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤（被覆錠剤を含む）、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、または吸入剤、およびそれらの放出制御形状のものが挙げられる。一般に、これらの作用剤は、注射による投与（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）用に配合されるが、もっとも他の投与形状（例えば、経口、経粘膜など）を用いることもできる。したがって、二重特異性分子は、好ましくは、薬学的に許容可能なビヒクル（生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖液など）と組み合わされる。
経験上の考慮（生物学的半減期など）が、一般に、投薬量の決定に寄与する。投与の頻度は、治療課程にわたって決定および調整することが可能であり、ウイルス感染した細胞の個数の減少、感染細胞の減少の維持、感染細胞の増殖の減少、または感染の発症を遅らせることに基づいて決まる。あるいは、二重特異性分子を長期に持続して放出する配合物が適切であるかもしれない。持続した放出を達成する様々な配合物および装置が当該分野で既知である。
一実施形態において、二重特異性分子の投薬量は、１回または複数回投与を受けた個体で経験的に決定することができる。個体は、二重特異性分子の投薬量を増やしながら投与を受ける。二重特異性分子の有効性を査定するため、特定のウイルス疾患状態のマーカーを追跡することができる。そのような追跡として、以下が挙げられる：ウイルス量の直接測定、免疫アッセイによるウイルス量の間接的測定、他の画像化技法；そのような測定から査定されるとおりの健康上の改善、間接的ウイルスマーカーの測定、例えば、疼痛または麻痺の低下；感染に関連した発話、視覚、呼吸、または他の困難の改善；食欲の増進；あるいは承認された検査により測定されるとおりの生活の質の向上または生存期間の延長。当業者には当然のことながら、投薬量は、個体、ウイルスの型、疾患の段階、ならびに過去および現在において用いられた治療に依存して変わるだろう。
他の配合物として、当該分野で既知の適切な送達形状が挙げられ、そのような形状として、リポソームなどのキャリアが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｍａｈａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７） “Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄ−Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ： Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，” Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １４：８５３−８５９（非特許文献９６）を参照。リポソーム製剤として、サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）、多重膜小胞、および単層小胞が挙げられるがこれらに限定されない。
ここまで本発明を概して記載してきたが、本発明は、以下の実施例の参照を通じてより容易に理解できるだろう。以下の実施例は、エプスタイン・バーウイルスまたはヒトパピローマウイルスのエピトープと結合する二重特異性分子に関するものである。これらの実施例は、例示として提供されるものであり、特に記載されないかぎり、本発明を制限することを意図しない。
潜在性ＥＢＶ用の二重特異性分子の構築
ヒトＴ細胞およびエプスタイン・バーウイルスに対して特異的な二重特異性分子（ＣＤ３×ＬＭＰ−１およびＴＣＲ×ＬＭＰ−２）を、二重親和性再標的化（ダイアボディ）分子として調製することができる。そのような二重特異性分子は、Ｔ細胞を（そのようなＴ細胞をＣＤ３結合二重特異性分子のＣＤ３部分とまたはＴＣＲ結合二重特異性分子のＴＣＲ部分と結合させることにより）、ＥＢＶに潜在的に感染しておりＬＭＰ−１またはＬＭＰ−２（それぞれ）を発現している細胞の場所に（そのような細胞を二重特異性分子のＬＭＰ−１またはＬＭＰ−２結合部分と結合させることにより）局在させる能力を有する。すると、局在化Ｔ細胞は、「再指向性」死滅（“ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ” ｋｉｌｌｉｎｇ）と呼ばれるプロセスにおいて、ＥＢＶに潜在的に感染している細胞の死滅を仲介することができる。ＬＭＰ−１またはＬＭＰ−２と結合する抗体は、当該分野で既知であり（Ｆａｎｇ， Ｃ．Ｙ． ｅｔ ａｌ． （２００４） “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｏ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８７（１−２）：２１−３０； Ｆｒｕｅｈｌｉｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２Ａ （ＬＭＰ２Ａ） Ｄｏｍａｉｎｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆｏｒ Ｔｈｅ ＬＭＰ２Ａ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｎ Ｂ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７０：６２１６−６２２６； Ｆｒｕｅｈｌｉｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） “Ｔｙｒｏｓｉｎｅ １１２ Ｏｆ Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２Ａ Ｉｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｌａｔｅｎｃｙ，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：７７９６−７８０６）（非特許文献９７〜９９）、また、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＧｅｎＷａｙ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）および他の供給元から入手することができる。
抗ＣＤ３抗体２の抗ＣＤ３可変ドメインおよび抗体ＨＨＶ−４（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の抗ＬＭＰ−１可変ドメインを有するＣＤ３×ＬＭＰ−１二重特異性分子を構築することができる。ＢＭＡ０３１の抗ＴＣＲ可変ドメインおよび抗体１４Ｂ７（ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（ｄｏｔ）ｃｏｍ）の抗ＬＭＰ−２可変ドメインを有するＴＣＲ×ＬＭＰ−２二重特異性分子を構築することができる。
ＬＭＰ−１発現細胞およびＣＤ３陽性Ｔ細胞に対する二重特異性分子の結合は、ＥＬＩＳＡで測定することができる。二重特異性分子が持つ、ＥＢＶ感染細胞の再指向性死滅を仲介する能力を実証する目的で、上記のＣＤ３×ＬＭＰ−１二重特異性分子またはＣＤ２×ＬＭＰ−２二重特異性分子を、標的細胞およびエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）とともに、様々な濃度で、例えば、２０：１のエフェクター対標的比で、インキュベートすることができる。細胞傷害性は、例えば、ＬＤＨアッセイを用いて測定することができる。測定結果は、ＣＤ３×ＬＭＰ−１二重特異性分子およびＣＤ３×ＬＭＰ−２二重特異性分子が持つ、ヒトＰＢＭＣでＥＢＶ感染細胞の再指向性死滅を仲介する能力を実証するだろう。
ＥＢＶ潜在性感染の処置
休止しているメモリーＢ細胞は、体内でＥＢＶが存続している部位である。（Ｂａｂｃｏｃｋ， Ｇ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． “Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｒｅｓｔｉｎｇ Ｍｅｍｏｒｙ Ｂ Ｃｅｌｌｓ， Ｎｏｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ， Ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔｓ，” Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９０（４）：５６７−５７６）（非特許文献１００）。通常のＥＢＶ感染した成人では、循環血液中Ｂ細胞１００万個あたり１〜５０個がＥＢＶに感染しており、個人における潜在性感染細胞の個数は数年にわたって一定したままである。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、複製の間に発現される約１００のウイルス遺伝子のうち、１０だけが、潜在的に感染したＢ細胞で発現し、それにはＬＭＰ−１およびＬＭＰ−２が含まれる。
潜在中のウイルス遺伝子発現を大幅に制限することにより、ＥＢＶは、発現するウイルスタンパク質の個数を減少させ、それにより感染細胞が宿主の細胞障害性Ｔ細胞に「曝される」のを制限する。
潜在性ＥＢＶ感染している患者に、ＣＤ３×ＬＭＰ−１二重特異性分子を投与する。二重特異性分子は、感染細胞の表面で見られるＬＭＰ−１と結合し、Ｔ細胞を感染細胞に動員し、そしてＴ細胞を活性化する。活性化したＴ細胞は、ＥＢＶ感染細胞を死滅させ、それにより患者のＥＢＶ感染を除去する。
ＨＰＶ用の二重特異性分子の構築
ヒトＴ細胞およびヒトパピローマウイルスＥ６に特異的な二重特異性分子（ＣＤ３×ＨＰＶＥ６／ＭＨＣ）を、二重親和性再標的化（ダイアボディ）分子として調製することができる。ヒトパピローマウイルスＥ６に結合する抗体は、当該分野で既知であり（Ｐｈａｅｔｏｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２０１０） “Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｗｉｔｈ Ａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｏ Ｔｈｅ ＨＰＶ１６ Ｅ６ Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｌｏｗ Ｌｅｖｅｌｓ Ｏｆ Ｅ６，” Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． １０（１０）：１０４１−１０４７； Ｌａｇｒａｎｇｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００５） “Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ １６ Ｅ６ Ｔｏ Ｐ５３ Ａｎｄ Ｅ６ＡＰ Ｉｓ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｚｉｎｃ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｏｆ Ｅ６，” Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８６（Ｐｔ４）：１００１−１００７； Ｗｌａｚｌｏ， Ａ．Ｐ． ｅｔ ａｌ． （２００１） “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｈｅ Ｅ６ Ａｎｄ Ｅ７ Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｏｆ ＨＰＶ，” Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２０（４）：２５７−２６３）（非特許文献１０１〜１０３）、また、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＧｅｎＷａｙ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（ｄｏｔ）ｃｏｍおよび他の供給元から入手することができる。
そのような二重特異性分子は、Ｔ細胞を（そのようなＴ細胞をＣＤ３結合二重特異性分子のＣＤ３部分と結合させることにより）、ＨＰＶに感染しており、Ｅ６を発現し、細胞のＭＨＣクラスＩシステムに関してＥ６タンパク質の断片を提示している細胞の位置に（そのような細胞を二重特異性分子のＨＰＶＥ６／ＭＨＣ結合部分と結合させることにより）局在させる能力を有する。すると、局在化Ｔ細胞は「再指向性」死滅と呼ばれるプロセスにおいて、ＨＰＶに潜在的に感染している細胞の死滅を仲介することができる。
例えば、ＯＫＴ３の抗ＣＤ３可変ドメインおよび抗体２９−１０２６７（ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（ｄｏｔ）ｃｏｍ）の抗ＨＰＶＥ６／ＭＨＣ可変ドメインを有するＣＤ３×ＨＰＶＥ６／ＭＨＣ二重特異性分子を構築することができる。
ＨＰＶＥ６／ＭＨＣおよびＣＤ３陽性Ｔ細胞に対する二重特異性分子の結合は、ＥＬＩＳＡで測定することができる。二重特異性分子が持つ、ＨＰＶ感染細胞の再指向性死滅を仲介する能力を実証する目的で、上記のＣＤ３×ＨＰＶＥ６／ＭＨＣ二重特異性分子を、標的細胞およびエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）とともに、様々な濃度で、例えば、２０：１のエフェクター対標的比で、インキュベートすることができる。細胞傷害性は、例えば、ＬＤＨアッセイを用いて測定することができる。測定結果は、ＣＤ３×ＨＰＶＥ６／ＭＨＣ二重特異性分子が持つ、ヒトＰＢＭＣでＨＰＶ感染細胞の再指向性死滅を仲介する能力を実証するだろう。
Ｆｃ領域を含む二重特異性分子は強力なＴ細胞による再指向性死滅を仲介する
抗ＣＤ３可変ドメイン、およびウイルス抗原と結合し、さらにＦｃ領域を含むドメインを有する二重特異性分子を構築することができる。そのような分子は、同一細胞内で３本のポリペプチド鎖を発現させることにより構築することができる。第一のポリペプチド鎖は、例えば、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメイン、短いリンカー、ウイルス抗原に結合する抗体（例えば、ＨＰＶＥ６／ＭＨＣ）用の可変重鎖ドメイン、およびＥコイルドメインを含むだろう。第二のポリペプチド鎖は、例えば、抗ＨＰＶＥ６／ＭＨＣ抗体の軽鎖可変ドメイン、短いリンカー、抗ＣＤ３抗体用の可変重鎖ドメイン、Ｋコイルドメイン、および最後にＩｇＧのＦｃのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むだろう。第三のポリペプチド鎖は、例えば、ＩｇＧのＦｃのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むだろう。
ＥコイルおよびＫコイルは、鎖１が、鎖２とヘテロ二量体を形成することを確実にする。鎖２がＣＨ２およびＣＨ３ドメインでホモ二量体を形成しないことを確実にするため、配列を、３６６位で凸（ｋｎｏｂ）を有するように修飾する（Ｔ３６６Ｗ修飾）（米国特許第５，７３１，１６８号明細書；同第５，８０７，７０６号明細書；同第５，８２１，３３３号明細書；同第７，４２９，６５２号明細書；同第７，６４２，２２８号明細書；同第７，６９５，９３６号明細書；および同第８，２１６，８０号明細書を参照）（特許文献４１〜４７）。Ｆｃ領域を無効にするため、アラニン残基を２３４位および２３５位に組み込む（米国特許第５，６２４，８２１号明細書（特許文献４８）を参照）。鎖２のＦｃ領域に作られた凸（ｋｎｏｂ）を受け入れるため、鎖３に３つの置換をし、凹（ｈｏｌｅ）を作る（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ）。４３５位を置換することにより（Ｈ４３５Ｒ）、鎖３のホモ二量体がタンパク質Ａと結合するのを防ぎ、こうして、二重特異性分子の精製を助ける。鎖３のホモ二量体はどんなものでも、サイズ排除クロマトグラフィーにより生成物から精製除去することができる。
３本の鎖をコードするベクターをＣＨＯ細胞に遺伝子導入する。適切な選択後、細胞を培地で７日間培養する。培地および細胞を収穫する。二重特異性分子を当該分野で既知であるクロマトグラフィー方法を用いて精製すると、その分子は、免疫エフェクター細胞の表面で発現するＣＤ３およびＨＰＶ感染細胞の表面で発現するＨＰＶＥ６／ＭＨＣの両方と同時に結合し、それによりそのようなＨＰＶ感染細胞の死滅を促進することができることが示される。
抗ＣＤ１６×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子の構築
抗フルオレセイン×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子の構築
本発明の二重特異性分子のさらなる例として、ＣＤ１６に特異的な第一のエピトープ結合部位およびＨＩＶｅｎｖタンパク質に特異的な第二のエピトープ結合部位を形成するために、互いに共有結合した二本のポリペプチド鎖で構成された二重特異性ダイアボディ分子を製造した。
二重特異性ダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、好ましくは以下を有する：
（Ｉ）抗ＨＩＶｅｎｖ抗体７Ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＱ３１５０３； Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ−１ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ； Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ，” ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １０（４）：３５９−３６９； Ｓｈｅｎ， Ｒ． （２０１０） “ＧＰ４１−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｌｏｃｋｓ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ ＨＩＶ Ｔｙｐｅ １ Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｔａｌ Ｍｕｃｏｓａ Ａｎｄ Ｍｏｄｅｌ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８４（７）：３６４８−３６５５）（非特許文献１０４〜１０５）または結合について抗体７Ｂ２と競合する抗体、またはＨＩＶのｅｎｖタンパク質と結合する抗体の、軽鎖可変ドメイン；
（ＩＩ）抗体ｈ３Ｇ８（国際公開第２０１２／１６２０６８号パンフレット；米国特許第７，３５１，８０３号明細書）（特許文献４９および５０）、または結合について抗体３Ｇ８と競合する抗体、またはＣＤ１６と結合する抗体（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の、重鎖可変ドメイン；および
（ＩＩＩ）Ｅコイルドメイン（すなわち、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４；ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号３９）またはＫコイルドメイン（すなわち、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４；ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ；配列番号４０）。
そのような二重特異性ダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、好ましくは以下を有する：
（Ｉ）抗体ｈ３Ｇ８（国際公開第２０１２／１６２０６８号パンフレット；米国特許第７，３５１，８０３号明細書）（特許文献４９および５０）、または結合について抗体３Ｇ８と競合する上記のような抗体、またはＣＤ１６と結合する上記のような抗体（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の、軽鎖可変ドメイン；
（ＩＩ）上記のような抗体７Ｂ２、または結合について抗体７Ｂ２と競合する上記のような抗体、またはＨＩＶのｅｎｖタンパク質と結合する上記のような抗体の、重鎖可変ドメイン；および
（ＩＩＩ）Ｋコイルドメイン（すなわち、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４；ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ；配列番号４０）またはＥコイルドメイン（すなわち、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４；ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号３９）。
好適な実施形態において、正電荷を帯びた「Ｅコイル」が、二重特異性ダイアボディを形成するのに用いられるポリペプチドのうちの１本に付加され、負電荷を帯びた「Ｋコイル」が、ダイアボディの第二のポリペプチドに付加されるだろう。
好ましくは、そのようなダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号４２）を有する（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１１３は抗体７Ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＱ３１５０３）の軽鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基には下線が引いてある）、残基１１４−１２１はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１２２−２３９は抗体ｈ３Ｇ８の重鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基２４０−２４５はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２４６−２７７はＥコイル（ＥＶＡＡＬＥＫ）４［すなわち（配列番号３９）ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ］である。
好ましくは、そのようなダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号４３）を有する（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１１１は抗体ｈ３Ｇ８の軽鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基１１２−１１９はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１２０−２４５は抗体７Ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＱ３１５０２）の重鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基２４６−２５１はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２５２−２７９はＫコイル（ＫＶＡＡＬＫＥ）４［すなわち、配列番号４０）ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ］である。
上記抗ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）抗体ｈ３Ｇ８の可変軽鎖および重鎖ドメインおよび抗フルオレセイン抗体４−４−２０（Ｇｒｕｂｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９９４） “Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂｙ Ａ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２（１１）：５３６８−５３７４； Ｂｅｄｚｙｋ， Ｗ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．（１９８９） “Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏｆ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｇｅｉｏｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｗｉｔｈｉｎ Ａｎ Ａｎｔｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ｆａｍｉｌｙ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４（３）：１５６５−１５６９）（非特許文献１０６および１０７）の可変軽鎖および重鎖ドメインを有する二重特異性ダイアボディも製造した。対照抗体の二本のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は以下のとおりである：
配列番号４４（対照ダイアボディの第一のポリペプチド鎖；ＶＬｈ３Ｇ８ＶＨ４−４−２０）（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１１１は抗体ｈ３Ｇ８の軽鎖可変ドメインであり、残基１１２−１１９はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１２０−２３７は抗体４−４−２０の重鎖可変ドメインであり、残基２３８−２４３はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２４４−２７１はＥコイル（ＥＶＡＡＬＥＫ）４［すなわち（配列番号３９）ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ］であり、残基２７２−２７６はリンカーＧＧＧＮＳ（配列番号４１）である；および
配列番号４５（対照ダイアボディの第二のポリペプチド鎖；ＶＬ４−４−２０ＶＨｈ３Ｇ８）（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１１２は抗体４−４−２０の軽鎖可変ドメインであり、残基１１３−１２０はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１２１−２３８は抗体ｈ３Ｇ８の重鎖可変ドメインであり、残基２３９−２４４はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２４５−２７２はＫコイル（ＫＶＡＡＬＫＥ）４［すなわち、配列番号４０）ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ］であり、残基２７３−２７７はリンカーＧＧＧＮＳ（配列番号４１）であり、残基２７８−２９４はＦＬＡＧタグである（Ｍｕｎｒｏ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９８４） “Ｕｓｅ Ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｆｒｏｍ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ： Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈｓｐ ７０，” ＥＭＢＯ Ｊ． ３（１３）：３０８７−３０９３）（非特許文献１０８）。
ＣＤ１６×ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子の細胞傷害性リンパ球活性の査定
ＨＩＶ−１感染の第一段階は、細胞表面ＣＤ４が、膜貫通糖タンパク質（ｇｐ４１）と表面糖タンパク質（ｇｐ１２０）のヘテロ二量体である三量体ＨＩＶ−１外被糖タンパク質（Ｅｎｖ）と結合することで始まる。三量体ＥｎｖとＣＤ４の結合が引き金となって立体配座が変化し、最終的にウイルスと細胞膜の融合を導いて、ウイルス核を感染細胞内に送達する（Ｈａｒｒｉｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） “Ｔｒｉｍｅｒｉｃ ＨＩＶ−１ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｐ１４０ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ Ａｎｄ Ｎａｔｉｖｅ ＨＩＶ−１ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｈｅ Ｓａｍｅ Ｃｌｏｓｅｄ Ａｎｄ Ｏｐｅｎ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） １０８（２８）：１１４４０−１１４４５）（非特許文献１０９）。ｇｐ１２０およびｇｐ４１糖タンパク質は、最初に単独のｇｐ１６０ポリペプチドを合成し、続いてこれを切断することで、非共有結合で会合したｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体を製造する。Ｅｎｖのエクトドメインは、質量が約１４０ｋＤａのヘテロ二量体であり、全ｇｐ１２０構成要素、および約２０ｋＤａのｇｐ４１で構成される（Ｈａｒｒｉｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） “Ｔｒｉｍｅｒｉｃ ＨＩＶ−１ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｐ１４０ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ Ａｎｄ Ｎａｔｉｖｅ ＨＩＶ−１ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｔｈｅ Ｓａｍｅ Ｃｌｏｓｅｄ Ａｎｄ Ｏｐｅｎ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） １０８（２８）：１１４４０−１１４４５）（非特許文献１０９）。
ヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３Ｄ３７５細胞（９２Ｔｈ０２３、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）は、ＨＩＶｇｐ１４０タンパク質を発現する。本発明の二重特異性分子の有用性のさらなる例として、上記抗ＣＤ１６×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性ダイアボディを、このダイアボディが持つ、ナチュラルキラー細胞の存在下でＨＥＫ２９３Ｄ３７５細胞の細胞傷害性リンパ球活性を仲介する能力について評価した。上記抗フルオレセイン×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性ダイアボディを、対照として用いた。
この調査の結果を図２に示す。図２は、５：１のエフェクター：標的比で、ナチュラルキラー（ＮＫ）の存在下、２４時間インキュベーション後の、ｇｐ１４０発現ＨＥＫ２９３Ｄ３７５細胞（９２Ｔｈ０２３、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）における、抗体ｈ３Ｇ８の抗ＣＤ１６エピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディにより仲介される細胞傷害性リンパ球活性を示す。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、陽性選択（Ｄ５６６７８（ＬＤＨ））により精製した。抗体４−４−２０の抗フルオレセインエピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディを対照として用いた。結果は、抗ＣＤ１６×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性ダイアボディは細胞傷害性リンパ球活性を仲介するが、対照ダイアボディは仲介しなかったことを示す。
図３は、５：１のエフェクター：標的比で、ナチュラルキラー（ＮＫ）の存在下、２４時間インキュベーション後の、ｇｐ１４０発現ＨＥＫ２９３Ｄ３７５細胞（９２Ｔｈ０２３、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）における、抗体ｈ３Ｇ８の抗ＣＤ１６エピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディにより仲介される細胞傷害性リンパ球活性を示す。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、陰性選択（Ｄ５５３８６（ＬＤＨ））により精製した。予想どおり（ＮＫ細胞はＣＤ３が欠けているため）、抗体ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２の抗ＣＤ３エピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディは、細胞傷害性リンパ球活性を示すことができなかった。抗体４−４−２０の抗フルオレセインエピトープ結合ドメインおよび抗体ｈ３Ｇ８の抗ＣＤ１６エピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディを対照として用いた。これらの結果も、抗ＣＤ１６×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性ダイアボディは細胞傷害性リンパ球活性を仲介するが、上記対照ダイアボディおよびＣＤ１６×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは仲介しなかったことを示す。
図４は、ＨＩＶｇｐ１４０を発現するＨＥＫ２９３Ｄ３７１（ＣＭ２４４、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）細胞を用いて行われた同様な実験の結果を示す。図４は、５：１のエフェクター：標的比で、ナチュラルキラー（ＮＫ）の存在下、２４時間インキュベーション後の、ＨＩＶｇｐ１４０発現ＨＥＫ２９３Ｄ３７１細胞（ＣＭ２４４、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）における、抗体ｈ３Ｇ８の抗ＣＤ１６エピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディにより仲介される細胞傷害性リンパ球活性を示す。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、陰性選択（Ｄ５５３８６（ＬＤＨ））により精製した。予想どおり（ＮＫ細胞はＣＤ３が欠けているため）、抗体ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２の抗ＣＤ３エピトープ結合ドメインおよび抗体７Ｂ２の抗ＨＩＶｅｎｖエピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディは、細胞傷害性リンパ球活性を示すことができなかった。抗体４−４−２０の抗フルオレセインエピトープ結合ドメインおよび抗体ｈ３Ｇ８の抗ＣＤ１６エピトープ結合ドメインを含む二重特異性ダイアボディを対照として用いた。これらの結果も、抗ＣＤ１６×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性ダイアボディは細胞傷害性リンパ球活性を仲介するが、これらの対照ダイアボディは仲介しなかったことを示す。
抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｇｐ１２０二重特異性分子の構築
抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子の構築
抗ＣＤ３×抗ＲＳＶＦタンパク質二重特異性分子の構築
抗フロレセイン×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子の構築
本発明の二重特異性分子のさらなる例として、ＣＤ３に特異的な第一のエピトープ結合部位、およびＨＩＶｇｐ１２０タンパク質、ＨＩＶｅｎｖタンパク質、またはＲＳＶＦタンパク質のＡ抗原部位いずれかに特異的な第二のエピトープ結合部位を形成するために、互いに共有結合した二本のポリペプチド鎖で構成された二重特異性ダイアボディ分子を製造した。
抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｇｐ１２０二重特異性分子
二重特異性ダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、好ましくは以下を有する：
（Ｉ）抗ＨＩＶｇｐ１２０抗体Ａ３２（Ｆｅｒｒａｒｉ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） “Ａｎ ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈａｔ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ａ Ｃ１ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ （ＡＤＣＣ） Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｄｅｆｉｎｅｓ ａ Ｃｏｍｍｏｎ ＡＤＣＣ Ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ＨＩＶ−１ Ｓｅｒｕｍ，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８５（１４）：７０２９−７０３６）（非特許文献１１０）、または結合について抗体Ａ３２と競合する抗体、またはＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質と結合する抗体の、軽鎖可変ドメイン；
（ＩＩ）ヒト化抗ＣＤ３抗体２（「ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２」）、または結合について抗ＣＤ３抗体２と競合する抗体、またはＣＤ３と結合する抗体の、重鎖可変ドメイン；および
（ＩＩＩ）Ｅコイルドメイン（すなわち、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４；ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号３９）またはＫコイルドメイン（すなわち、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４；ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ；配列番号４０）。
二重特異性ダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、好ましくは以下を有する：
（Ｉ）ヒト化抗ＣＤ３抗体２（「ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２」）、または結合について抗ＣＤ３抗体２と競合するそのような抗体、またはＣＤ３と結合するそのような抗体の、軽鎖可変ドメイン；
（ＩＩ）そのような抗体Ａ３２、または結合について抗体Ａ３２と競合するそのような抗体、またはＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質と結合するそのような抗体の、重鎖可変ドメイン；および
（ＩＩＩ）Ｋコイルドメイン（すなわち、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４；ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ；配列番号４０）またはＥコイルドメイン（すなわち、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４；ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号３９）。
好適な実施形態において、正電荷を帯びた「Ｅコイル」が、二重特異性ダイアボディを形成するのに用いられるポリペプチドのうちの１本に付加され、負電荷を帯びた「Ｋコイル」が、ダイアボディの第二のポリペプチドに付加されるだろう。
好ましくは、そのようなダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号４６）を有する（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１１０は抗体Ａ３２の軽鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基１１１−１１８はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１１９−２４３はヒト化抗ＣＤ３抗体２の重鎖可変ドメインであり（「ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２」；ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基２４７−２５２はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２５３−２８０はＥコイル（ＥＶＡＡＬＥＫ）４［すなわち（配列番号３９）ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ］である。
好ましくは、そのようなダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号４７）を有する（ＣＤＲには下線が引いてある）：
式中、残基１−１１０は抗ＣＤ３抗体２の軽鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基１１１−１１８はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１１９−２４１は抗体Ａ３２の重鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基２４２−２４７はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２４８−２７５はＫコイル（ＫＶＡＡＬＫＥ）４［すなわち、配列番号４０）ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ］である。
抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子
二重特異性ダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、好ましくは以下を有する：
（Ｉ）抗体７Ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＱ３１５０３； Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ−１ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ； Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ，” ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １０（４）：３５９−３６９（非特許文献１０４）； Ｓｈｅｎ， Ｒ． （２０１０） “ＧＰ４１−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｌｏｃｋｓ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ ＨＩＶ Ｔｙｐｅ １ Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｔａｌ Ｍｕｃｏｓａ Ａｎｄ Ｍｏｄｅｌ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８４（７）：３６４８−３６５５）（非特許文献１０５）、または結合について抗体７Ｂ２と競合する抗体、またはＨＩＶのｅｎｖタンパク質と結合する抗体の、軽鎖可変ドメイン；および
（ＩＩ）ヒト化抗ＣＤ３抗体２（「ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２」）、または結合について抗ＣＤ３抗体２と競合する抗体、またはＣＤ３と結合する抗体の、重鎖可変ドメイン；および
（ＩＩＩ）Ｅコイルドメイン（すなわち、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４；ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号３９）またはＫコイルドメイン（すなわち、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４；ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ；配列番号４０）。
そのような二重特異性ダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、好ましくは以下を有する：
（Ｉ）ヒト化抗ＣＤ３抗体２（「ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２」）、または結合について抗ＣＤ３抗体２と競合する上記のような抗体、またはＣＤ３と結合する上記のような抗体の、軽鎖可変ドメイン；
（ＩＩ）上記のような抗体７Ｂ２、または結合について抗体７Ｂ２と競合する上記のような抗体、またはＨＩＶのｅｎｖタンパク質と結合する上記のような抗体の、重鎖可変ドメイン；および
（ＩＩＩ）Ｋコイルドメイン（すなわち、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４；ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ；配列番号４０）またはＥコイルドメイン（すなわち、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４；ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号３９）。
好適な実施形態において、正電荷を帯びた「Ｅコイル」が、二重特異性ダイアボディを形成するのに用いられるポリペプチドのうちの１本に付加され、負電荷を帯びた「Ｋコイル」が、ダイアボディの第二のポリペプチドに付加されるだろう。
好ましくは、そのようなダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号４８）を有する（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１１３は抗体７Ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＱ３１５０３）の軽鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基１１４−１２１はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１２２−２４６はヒト化抗ＣＤ３抗体２の重鎖可変ドメインであり（「ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２」；ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基２４７−２５２はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２５３−２８０はＥコイル（ＥＶＡＡＬＥＫ）４［すなわち（配列番号３９）ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ］である。
好ましくは、そのようなダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号４９）を有する（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１１０は抗体抗ＣＤ３抗体２の軽鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基１１１−１１８はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１１９−２４４は抗体７Ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＱ３１５０２）の重鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基２４５−２５０はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２５１−２７８はＫコイル（ＫＶＡＡＬＫＥ）４［すなわち、配列番号４０）ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ］である。
抗ＣＤ３×抗ＲＳＶＦタンパク質二重特異性分子
二重特異性ダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、好ましくは以下を有する：
（Ｉ）ヒト化抗ＣＤ３抗体２（「ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２」）、または結合について抗ＣＤ３抗体２と競合する抗体、またはＣＤ３と結合する抗体の、軽鎖可変ドメイン；および
（ＩＩ）抗ＲＳＶＦタンパク質抗体、パリビズマブ（Ｂｅｅｌｅｒ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） “Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｆ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ： Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｕｐｏｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３（７）：２９４１−２９５０； Ａｒｂｉｚａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｗｏ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｓｉｔｅｓ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ｂｙ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｈｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ，” Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７３（９）：２２２５−２２３４； Ｓｈａｄｍａｎ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） “Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ Ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｆｏｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ，” Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． １１（１１）：１４５５−１４６７； Ｗａｎｇ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） “Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ Ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ （ＲＳＶ） Ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ Ｉｎ Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ Ｉｎｆａｎｔｓ Ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ： Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ Ａｎｄ Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ Ｏｆ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ａｎａｌｙｓｅｓ，” Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｓｓｅｓｓ． １５（５）：ｉｉｉ−ｉｖ， １−１２４．ｄｏｉ： １０．３３１０／ｈｔａ１５０５０（非特許文献１１１〜１１３および１３））、または結合についてパリビズマブと競合する抗体、またはＲＳＶＦタンパク質のＡ抗原部位と結合する抗体の、重鎖可変ドメイン；
（ＩＩＩ）Ｅコイルドメイン（すなわち、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４；ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号３９）またはＫコイルドメイン（すなわち、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４；ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ；配列番号４０）。
そのような二重特異性ダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、好ましくは以下を有する：
（Ｉ）抗ＲＳＶＦタンパク質抗体、パリビズマブ、または結合についてパリビズマブと競合するそのような抗体、またはＲＳＶＦタンパク質のＡ抗原部位と結合するそのような抗体の、軽鎖可変ドメイン；および
（ＩＩ）ヒト化抗ＣＤ３抗体２（「ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２」）、または結合について抗ＣＤ３抗体２と競合するそのような抗体、またはＣＤ３と結合するそのような抗体の、重鎖可変ドメイン；および
（ＩＩＩ）Ｋコイルドメイン（すなわち、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４；ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ；配列番号４０）またはＥコイルドメイン（すなわち、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４；ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号３９）。
好適な実施形態において、正電荷を帯びた「Ｅコイル」が、二重特異性ダイアボディを形成するのに用いられるポリペプチドのうちの１本に付加され、負電荷を帯びた「Ｋコイル」が、ダイアボディの第二のポリペプチドに付加されるだろう。
好ましくは、そのようなダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号５０）を有する（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１１０は抗ＣＤ３抗体２の軽鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基１１１−１１８はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１１９−２３８は抗ＲＳＶＦタンパク質抗体、パリビズマブの重鎖可変ドメイン（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）であり、残基２３９−２４４はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２４５−２７２はＥコイル（ＥＶＡＡＬＥＫ）４［すなわち（配列番号３９）ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ］である。
好ましくは、そのようなダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号５１）を有する（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１０６は抗ＲＳＶＦタンパク質抗体、パリビズマブの軽鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基１０７−１１４はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１１５−２３９はヒト化抗ＣＤ３抗体２の重鎖可変ドメインであり（「ｈＡｎｔｉｂｏｄｙ２」；ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基２４０−２４５はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２４６−２７３はＫコイル（ＫＶＡＡＬＫＥ）４［すなわち、配列番号４０）ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ］である。
抗フルオレセイン×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子
二重特異性ダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、好ましくは以下を有する：
（Ｉ）抗体７Ｂ２、または結合について抗体７Ｂ２と競合する抗体、またはＨＩＶのｅｎｖタンパク質と結合する抗体の、可変軽鎖ドメイン；
（ＩＩ）抗フルオレセイン抗体４−４−２０、または結合について抗フルオレセイン抗体４−４−２０と競合する抗体、またはフルオレセインと結合する抗体の、重鎖可変ドメイン；および
（ＩＩＩ）Ｅコイルドメイン（すなわち、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４；ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号３９）またはＫコイルドメイン（すなわち、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４；ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ；配列番号４０）。
そのような二重特異性ダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、好ましくは以下を有する：
（Ｉ）抗フルオレセイン抗体４−４−２０、または結合について抗フルオレセイン抗体４−４−２０と競合する上記のような抗体、またはフルオレセインと結合する上記のような抗体の、軽鎖可変ドメイン；
（ＩＩ）上記のような抗体７Ｂ２、または結合について抗体７Ｂ２と競合する上記のような抗体、またはＨＩＶのｅｎｖタンパク質と結合する上記のような抗体の、可変重鎖ドメイン；および
（ＩＩＩ）Ｋコイルドメイン（すなわち、（ＫＶＡＡＬＫＥ）４；ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ；配列番号４０）またはＥコイルドメイン（すなわち、（ＥＶＡＡＬＥＫ）４；ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号３９）。
好適な実施形態において、正電荷を帯びた「Ｅコイル」が、二重特異性ダイアボディを形成するのに用いられるポリペプチドのうちの１本に付加され、負電荷を帯びた「Ｋコイル」が、ダイアボディの第二のポリペプチドに付加されるだろう。
好ましくは、そのようなダイアボディの第一のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号５２）を有する（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１１３は抗体７Ｂ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＱ３１５０３）の軽鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基１１４−１２１はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１２２−２３９は抗体４−４−２０の重鎖可変ドメインであり、残基２４０−２４５はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２４６−２７７はＥコイル（ＥＶＡＡＬＥＫ）４［すなわち（配列番号３９）ＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫＥＶＡＡＬＥＫ］である。
好ましくは、そのようなダイアボディの第二のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（配列番号５３）を有する（ＣＤＲには下線が引いてある）：
配列中、残基１−１１２は抗体４−４−２０の軽鎖可変ドメインであり、残基１１３−１２０はリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７）であり、残基１２１−２４６は抗体７Ｂ２の重鎖可変ドメインであり（ＣＤＲ残基は下線を引いて示す）、残基２４７−２５２はリンカーＧＧＣＧＧＧ（配列番号３８）であり、残基２５３−２８０はＫコイル（ＫＶＡＡＬＫＥ）４［すなわち、配列番号４０）ＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥＫＶＡＡＬＫＥ］である。
ＨＩＶｅｎｖ発現細胞のＣＤ８を仲介した再指向性死滅
本発明の二重特異性分子の有用性のさらなる例として、上記の抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｇｐ１２０二重特異性分子および抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子を、それらが持つ、Ｔ細胞の存在下におけるＨＩＶｅｎｖ発現細胞のＣＤ８を仲介した再指向性死滅を促進する能力について評価する。
上記の抗フルオレセイン×抗ＨＩＶｅｎｖおよび抗ＣＤ３×抗−ＲＳＶＦタンパク質二重特異性分子を対照として用いた。
そのような１つ目試験のにおいて、Ｊｕｒｋａｔ５２２ＦＹ（ＨｘＢ２ｇｐ１６０）細胞のＨＩＶｇｐ１６０の発現を誘導する目的で、Ｊｕｒｋａｔ５２２ＦＹ（ＨｘＢ２ｇｐ１６０）細胞をテトラサイクリンの存在下でインキュベートした。細胞を、汎Ｔ細胞（Ｄ５４６７０）（１０：１のエフェクター：標的比で）、および上記の二重特異性分子のうち１種の存在下、２４時間インキュベートした。二重特異性分子の細胞傷害性を査定した。結果は、抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｇｐ１２０二重特異性分子および抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子が両方ともＣＤ８性細胞傷害性を引き起こすことができたのに対して、抗ＣＤ３×抗ＲＳＶＦタンパク質対照ダイアボディはできなかったことを示す（図５）。
２つ目の試験において、ＨＥＫ２９３Ｄ３７５細胞（９２Ｔｈ０２３、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）のＨＩＶｇｐ１４０の発現を誘導する目的で、ＨＥＫ２９３Ｄ３７５細胞をドキシサイクリンの存在下でインキュベートした。細胞を、汎Ｔ細胞（Ｄ４７２３９）（１０：１のエフェクター：標的比で）、および上記の二重特異性分子のうち１種の存在下、２４時間インキュベートした。二重特異性分子の細胞傷害性を査定した。結果は、抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｇｐ１２０二重特異性分子および抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子が両方ともＣＤ８性細胞傷害性を引き起こすことができたのに対して、抗ＨＩＶｅｎｖ×抗フルオレセイン対照ダイアボディは、抗体飽和条件以外では、できなかったことを示す（図６）。
３つ目の試験において、ＨＥＫ２９３Ｄ３７１細胞（ＣＭ２４４、サブタイプＡＥ、Ｒ５栄養性）のＨＩＶｇｐ１４０の発現を誘導する目的で、ＨＥＫ２９３Ｄ３７１細胞をドキシサイクリンの存在下でインキュベートした。細胞を、汎Ｔ細胞（Ｄ４７２３９）（１０：１のエフェクター：標的比で）、および上記の二重特異性分子のうち１種の存在下、２４時間インキュベートした。二重特異性分子の細胞傷害性を査定した。結果は、抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｇｐ１２０二重特異性分子および抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子が両方ともＣＤ８性細胞傷害性を引き起こすことができたのに対して、抗ＨＩＶｅｎｖ×抗フルオレセイン対照ダイアボディは、抗体飽和条件以外では、できなかったことを示す（図７）。
表１に、抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｇｐ１２０二重特異性分子または抗ＣＤ３×抗ＨＩＶｅｎｖ二重特異性分子を用いて得られるＣＤ８性細胞傷害性について観測されたものをまとめる。
本明細書中に記載される公報および特許は全て、個々の公報または特許が具体的にかつ個別に本明細書中に参照として援用されると記載される場合と同程度に、本明細書中に参照として援用される。本発明は、その具体的な実施形態に関連して説明されてきたものの、当然のことながら、さらに変更することが可能であり、本出願は、総じて、本発明の原則に従う本発明のどのような改変、使用、または応用も包含するものとし、本開示からのそのような逸脱は、本発明が属する分野内での既知のまたは習慣的な実施の範囲内において、および本明細書中上記に記載される本質的な特長が当てはまるならば、本発明に含まれるものとする。

Claims (30)

  1. 二重特異性分子であって、
    （Ａ）免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができる第一エピトープ結合ドメインであり、前記免疫エフェクター細胞は活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
    （Ｂ）ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができる第二エピトープ結合ドメインであり、前記抗原は、前記ウイルス上で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも高いレベルで、前記ウイルス感染した前記細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン
    を含む、二重特異性分子。
  2. 前記第一エピトープ結合ドメインは、免疫エフェクター細胞の活性化受容体と結合する、請求項１に記載の二重特異性分子。
  3. 前記エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、顆粒球、または樹状細胞である、請求項１または２に記載の二重特異性分子。
  4. 前記ウイルスは、ＥＢＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、またはインフルエンザウイルスである、請求項１または２に記載の二重特異性分子。
  5. 前記細胞は、前記ウイルスに潜在的に感染している、請求項１または２に記載の二重特異性分子。
  6. 前記ウイルス感染した前記細胞が発現する前記抗原は、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、ＨＩＶｅｎｖタンパク質、ＨＰＶＥ６、およびＨＰＶＥ７からなる群より選択される、請求項１または２に記載の二重特異性分子。
  7. 前記ウイルス感染した前記細胞が発現する前記抗原は、前記細胞に検出可能に存在するが、前記ウイルス上で前記二重特異性分子により検出されることはない、請求項１または２に記載の二重特異性分子。
  8. 前記エフェクター細胞の前記エピトープは、ＣＤ３エピトープ、ＣＤ４エピトープ、ＣＤ８エピトープ、ＣＤ２エピトープ、ＣＤ１６エピトープ、またはＮＫＧ２Ｄエピトープである、請求項２に記載の二重特異性分子。
  9. 前記第一エピトープ結合ドメインは、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ２抗体、ＣＤ１６抗体、またはＮＫＧ２Ｄ抗体からの抗原結合ドメインである、請求項２に記載の二重特異性分子。
  10. 前記ウイルス感染した前記細胞が発現する前記抗原は、前記ウイルス上で前記二重特異性分子により検出される前記抗原が存在する場合に、そのレベルよりも少なくとも２倍高いレベルで、前記細胞上に検出可能に存在する、請求項１または２に記載の二重特異性分子。
  11. 前記ウイルス感染した前記細胞が発現する前記抗原は、前記二重特異性分子により前記ウイルス上で検出される前記抗原が存在する場合に、そのレベルよりも少なくとも５倍高いレベルで、前記細胞上に検出可能に存在する、請求項１または２に記載の二重特異性分子。
  12. 前記ウイルス感染した前記細胞が発現する前記抗原は、前記二重特異性分子により前記ウイルス上で検出される前記抗原が存在する場合に、そのレベルよりも少なくとも１０倍高いレベルで、前記細胞上に検出可能に存在する、請求項１または２に記載の二重特異性分子。
  13. 前記ウイルス感染した前記細胞が発現する前記抗原は、前記二重特異性分子により前記ウイルス上で検出される前記抗原が存在する場合に、そのレベルよりも少なくとも１００倍高いレベルで、前記細胞上に検出可能に存在する、請求項１または２に記載の二重特異性分子。
  14. 前記抗原は、前記ウイルスに感染していない細胞で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも高いレベルで、前記ウイルス感染した細胞上に検出可能に存在する、請求項１または２に記載の二重特異性分子。
  15. 前記抗原は、前記ウイルスに感染していない細胞で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも少なくとも２倍高いレベルで、前記ウイルス感染した前記細胞上に検出可能に存在する、請求項１４に記載の二重特異性分子。
  16. 前記抗原は、前記ウイルスに感染していない細胞で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも少なくとも５倍高いレベルで、前記ウイルス感染した前記細胞上に検出可能に存在する、請求項１４に記載の二重特異性分子。
  17. 前記抗原は、前記ウイルスに感染していない細胞で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも少なくとも１０倍高いレベルで、前記ウイルス感染した前記細胞上に検出可能に存在する、請求項１４に記載の二重特異性分子。
  18. 前記抗原は、前記ウイルスに感染していない細胞で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも少なくとも１００倍高いレベルで、前記ウイルス感染した前記細胞上に検出可能に存在する、請求項１４に記載の二重特異性分子。
  19. 前記ウイルス感染した前記細胞が発現する前記抗原は、前記細胞に検出可能に存在するが、感染していない細胞では前記二重特異性分子により検出されない、請求項１４に記載の二重特異性分子。
  20. 二重特異性分子および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物であって前記二重特異性分子は、
    （Ａ）免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができる第一エピトープ結合ドメインであり、前記免疫エフェクター細胞は活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
    （Ｂ）ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができる第二エピトープ結合ドメインであり、前記抗原は、前記ウイルス上で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも高いレベルで、前記ウイルス感染した前記細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン
    を含む、薬学的組成物。
  21. 前記二重特異性分子の前記第一エピトープ結合ドメインは、免疫エフェクター細胞の活性化受容体と結合する、請求項２０に記載の薬学的組成物。
  22. 潜在性ウイルス感染症の治療を必要としている個体において潜在性ウイルス感染症を治療する方法であって、前記方法は、前記個体に、二重特異性分子を治療上有効量で投与する工程を含み、前記二重特異性分子は、
    （Ａ）免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができる第一エピトープ結合ドメインであり、前記免疫エフェクター細胞は活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
    （Ｂ）ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができる第二エピトープ結合ドメインであり、前記抗原は、前記ウイルス上で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも高いレベルで、前記ウイルス感染した前記細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン
    を含む、方法。
  23. 持続性ウイルス感染症の治療を必要としている個体において持続性ウイルス感染症を治療する方法であって、前記方法は、前記個体に、二重特異性分子を治療上有効量で投与する工程を含み、前記二重特異性分子は、
    （Ａ）免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができる第一エピトープ結合ドメインであり、前記免疫エフェクター細胞は活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
    （Ｂ）ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができる第二エピトープ結合ドメインであり、前記抗原は、前記ウイルス上で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも高いレベルで、前記ウイルス感染した前記細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン
    を含む、方法。
  24. 不活性ウイルス感染症の治療を必要としている個体において不活性ウイルス感染症を治療する方法であって、前記方法は、前記個体に、二重特異性分子を治療上有効量で投与する工程を含み、前記二重特異性分子は、
    （Ａ）免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができる第一エピトープ結合ドメインであり、前記免疫エフェクター細胞は活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
    （Ｂ）ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができる第二エピトープ結合ドメインであり、前記抗原は、前記ウイルス上で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも高いレベルで、前記ウイルス感染した前記細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン
    を含む、方法。
  25. ウイルスゲノムを保有する細胞を死滅させる方法であって、前記方法は、前記細胞を、二重特異性分子と接触させる工程を含み、前記二重特異性分子は、
    （Ａ）免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができる第一エピトープ結合ドメインであり、前記免疫エフェクター細胞は活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
    （Ｂ）ウイルス感染した細胞が発現する抗原のエピトープと免疫特異的に結合することができる第二エピトープ結合ドメインであり、前記抗原は、前記ウイルス上で前記二重特異性分子により検出される前記抗原のレベルよりも高いレベルで、前記ウイルス感染した前記細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン
    を含み、
    前記ウイルスゲノムを保有する前記細胞を死滅させる、方法。
  26. ウイルスタンパク質を発現する細胞を死滅させる方法であって前記方法は、前記細胞を、二重特異性分子と接触させる工程を含み、前記二重特異性分子は、
    （Ａ）免疫エフェクター細胞の表面で発現するタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができる第一エピトープ結合ドメインであり、前記免疫エフェクター細胞は活性化受容体を発現する、第一エピトープ結合ドメイン、および
    （Ｂ）前記ウイルスタンパク質のエピトープと免疫特異的に結合することができる第二エピトープ結合ドメインであり、前記ウイルスタンパク質は、前記ウイルスタンパク質を発現することができるウイルス上で検出される前記ウイルスタンパク質のレベルよりも高いレベルで、前記ウイルスタンパク質を発現する前記細胞上に検出可能に存在する、第二エピトープ結合ドメイン
    を含み、
    前記ウイルスタンパク質を発現する前記細胞を死滅させる、方法。
  27. 前記二重特異性分子の前記第一エピトープ結合ドメインは、免疫エフェクター細胞の活性化受容体と結合する、請求項２２から２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、顆粒球、または樹状細胞である、請求項２２から２６のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記ウイルスは、ＥＢＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、またはインフルエンザウイルスである、請求項２２から２６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記細胞は、前記ウイルスに潜在的に感染している、請求項２２から２６のいずれか１項に記載の方法。
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