JP2015535344A - 目的タンパク質を分泌する細胞の検出 - Google Patents

目的タンパク質を分泌する細胞の検出 Download PDF

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Abstract

【課題】抗原特異的抗体などの目的タンパク質を産生する細胞を検出するためのシステム及び方法を提供する。【解決手段】記載のシステム及び方法は、複数の抗体産生細胞を含有する細胞標本を得ることを含む場合がある。そのような場合、細胞は、抗体産生細胞上のマーカに結合するよう構成された第１部分と目的の抗原に結合するよう構成された第２部分とを有する架橋試薬で標識され得る。場合によっては、標識された抗体産生細胞は、抗原が細胞に結合されるように目的の抗原に曝露される。そのような場合、抗体産生細胞は、抗体産生細胞の一部が目的の抗原に結合する抗原特異的抗体を産生するように抗体を産生可能である。抗原特異的抗体を産生する細胞を同定するため、標識された細胞が、抗原特異的抗体に結合するよう構成された標識化二次抗体に曝露されてもよい。他の実施態様も記載する。【選択図】図１

Description

[0001] 免疫グロブリンとしても知られる抗体は、Ｂ細胞により産生されるタンパク質であって、生物の免疫系はこれを用いて細菌、ウィルス、及び他の抗原といった異物を同定し中和する。一般に、抗体は、２本の大きな重鎖と２本の小さな軽鎖とを有するＹ字型タンパク質を含む。また、抗体の一般的な構造は概して類似しているが、そのようなタンパク質の先端の小さな領域は極めて可変的であり得るもので、僅かに異なる先端構造又は抗原結合部位を有する数百万もの抗体を可能にしている。Ｙ字型抗体タンパク質の抗原結合部位を含む領域は、ＦＡＢ（すなわち断片抗原結合）領域と称されることもある。このＦＡＢ領域は、抗体の各重鎖及び軽鎖の（複数の種類の抗体にわたって定常のままである）定常ドメインと、（ある抗体と別の抗体とで異なる）１つ以上の可変領域又は超可変領域とを順に含んでいる。抗体の可変領域（すなわちＶ領域）の一部である重鎖の可変ドメイン（「ＶＨ」）及び軽鎖の可変ドメイン（「ＶＬ」）は、抗体の最も重要な部分であり得るもので、抗体と特定の抗原との結合を担っている。
[0002] 抗体は、生物の自然免疫反応において重要な役割を果たすことが周知である一方で、多種多様な他の目的に有用であることが証明されている。実際、抗体は、様々な形態の医療診断において（例えば妊娠検査、ループス診断検査などにおいて）、多くの研究用途において（例えば細胞内タンパク質及び細胞外タンパク質を同定し位置付けるために）、さらには多種多様な疾病（例えば関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、癌など）の治療のためにさえ、有用であることがわかっている。
[0003] 疾病の治療的処置として用いることができる抗体を見つけようとする探求においては、多種多様な疾病及び疾患と関連する抗原を効果的に同定及び／又は中和することのできる特定の抗体を同定する必要がある。また、そのような抗体を同定するための従来の方法は、多くが有効な抗体の同定に際して比較的非効率的且つ非効果的であり得ることから、現在の技術を他の技術によって増補し、あるいは置換さえすることは、当該術分野の進歩となるであろう。
[0004] 本開示は、抗原特異的抗体などの目的タンパク質を産生する細胞を検出するためのシステム及び方法に係る。記載の方法は任意の適切な要素を備え得るものであるが、いくつかの非限定的な実施態様においては、記載の方法は、タンパク質産生細胞を含む細胞標本を得ることを含む。場合によっては、タンパク質産生細胞は、タンパク質産生細胞に特異的な細胞表面マーカに結合するよう適合された第１部分と、目的の抗原又は目的タンパク質に特異的な抗原であるタンパク質特異的抗体に結合されるよう構成された第２部分と、を有する架橋試薬で標識される。そのような場合においては、記載の方法はさらに、タンパク質産生細胞が架橋試薬を介して目的の抗原又はタンパク質特異的抗体と連結されるように、タンパク質産生細胞を目的の抗原又はタンパク質特異的抗体に曝露することを含むことがある。記載の方法はさらに、タンパク質産生細胞が目的の抗原又はタンパク質特異的抗体と選択的に結合するよう適合された目的タンパク質を産生できるようにすることを含んでもよい。場合によっては、これらの方法は、タンパク質産生細胞を目的タンパク質に結合するよう適合された標識化抗体に曝露することによって目的タンパク質を産生する細胞を同定することを含む。
[0005] いくつかの他の非制限的な実施態様においては、記載の方法は、複数の抗体産生細胞を含む細胞標本を得ることを含む。そのような場合においては、抗体産生細胞は、抗体産生細胞に特異的なマーカに結合するよう構成された第１部分と、目的の抗原に結合するよう構成された第２部分と、を有する架橋試薬で標識されてもよい。場合によっては、標識された抗体産生細胞は、目的の抗原が架橋試薬を介してその細胞に結合されるように、その抗原に曝露される。また、抗体産生細胞は、抗体産生細胞の一部が目的の抗原に結合する抗原特異的抗体を産生するように、抗体を産生することもできる。抗原特異的抗体を産生する細胞を同定するために、標識された細胞が、抗原特異的抗体に結合するよう構成された標識化二次抗体に曝露されてもよい。
[0006] さらに別の非制限的な実施態様においては、記載の方法は、タンパク質産生細胞を包含する細胞標本を得ることを含む。場合によっては、タンパク質産生細胞は、タンパク質産生細胞に特異的な細胞表面マーカに結合するよう適合された第１部分と、タンパク質特異的抗体又は目的タンパク質に特異的な抗体に結合されるよう構成された第２部分と、を有する架橋試薬で標識される。場合によっては、記載の方法はさらに、タンパク質産生細胞が架橋試薬を介してタンパク質特異的抗体に連結されるように、タンパク質産生細胞をタンパク質特異的抗体に曝露することを含む。そのような場合においては、タンパク質産生細胞が目的タンパク質を産生できることもある。また、目的タンパク質を産生する細胞を同定するために、タンパク質産生細胞は、目的タンパク質に結合するよう適合された標識化抗体に曝露される。
[0007] 記載のシステム及び方法のこれら及び他の特徴及び利点は、以下の説明及び添付の請求項において記載され、あるいはより十分に明らかになるであろう。そうした特徴及び利点は、添付の請求項において特に注目されている器具及び組み合わせを用いて実現され且つ得られてもよい。また、記載のシステム及び方法の特徴及び利点は、実施により知得され、あるいは以下に記載する説明から明らかになってもよい。
[0008] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの実施形態を表すフローチャートである。 [0009] 架橋試薬のいくつかの実施例を示す図である。 架橋試薬のいくつかの実施例を示す図である。 [0010] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの実施例を表す図である。 [0010] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの実施例を表す図である。 [0010] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの実施例を表す図である。 [0010] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの実施例を表す図である。 [0010] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの実施例を表す図である。 [0010] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの実施例を表す図である。 [0010] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの実施例を表す図である。 [0011] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0011] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0011] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0011] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0011] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0011] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0011] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0012] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0012] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0012] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0012] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0012] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0012] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表す図である。 [0013] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの代替的な実施例を表すフローチャート。 [0014] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの追加的な実施例を表す図である。 [0014] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの追加的な実施例を表す図である。 [0014] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの追加的な実施例を表す図である。 [0014] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの追加的な実施例を表す図である。 [0014] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの追加的な実施例を表す図である。 [0014] 目的タンパク質を産生する細胞の検出方法のいくつかの追加的な実施例を表す図である。
[0015] これらの図面は、目的タンパク質を分泌する細胞を検出するための記載のシステム及び方法の特定の態様を図示するものである。これらの図面は、以下の説明と併せて、構造及び方法の原理、ならびに本明細書に記載された原理を実証及び説明する。図面において、要素の厚さ、大きさ及び比は、明確にするために誇張され、あるいは変更されていてもよい。また、明確にするため、図面は、記載の方法ならびにそれに関連する構成要素及び試薬の簡易図又は部分図を示していてもよい。
[0016] 以下の説明は、完全な理解をもたらすために特定の詳細を提供するものである。ただし、目的タンパク質を分泌する細胞を検出するための記載のシステム及び方法の態様を分かりにくくすることを避けるため、周知の構造、物質、工程、技術及び操作は、詳細には図示又は記載しない。また、当業者であれば、記載のシステム及び方法が、これらの特定の詳細を用いることなく実施及び使用可能であることを理解するであろう。実際、記載のシステム及び方法は、例示された方法及び試薬を変更することにより実践可能であり、産業上従来用いられてきた他のどんな装置及び技術とも併用することができる。例えば、以下の説明は架橋試薬、標識化二次抗体、標識化抗体、ビーズ及び／又は表面上に目的の抗原（又は抗体又は他のタンパク質）を有する細胞の使用を含む方法、ならびに他の装置及び工程に焦点を合わせているが、記載のシステム及び方法（又はその一部）は、任意の他の適切な試薬、装置、又は技術とともに用いることができる。例えば、記載のシステム及び方法は、抗原特異的抗体を産生する細胞を検出するために用いられる代わりに（あるいはそれに加えて）、任意の他の適切な目的タンパク質を産生する細胞の検出を可能とするよう変形されてもよい。
[0017] 上述のように、記載のシステム及び方法のいくつかの実施例は、抗原特異的抗体などの目的タンパク質を産生する細胞を検出するシステム及び方法に関する。記載の方法は、任意の適切な要素を備えてもよいが、場合によっては、複数の抗体産生細胞を含有する細胞標本を得ることを含む。そのような場合には、抗体産生細胞は、抗体産生細胞に特異的なマーカに結合するよう構成された第１部分と、目的の抗原に結合するよう構成された第２部分と、を有する架橋試薬で標識されてもよい。場合によっては、標識された抗体産生細胞は、目的の抗原が架橋試薬を介してその細胞に結合されるように、その抗原に曝露される。そのような場合においては、抗体産生細胞が、抗体産生細胞の一部が目的の抗原に結合する抗原特異的抗体を産生するように、抗体を産生できることもある。抗原特異的抗体を産生する細胞を同定するために、標識された細胞が、抗原特異的抗体に結合するよう構成された標識化二次抗体に曝露されてもよい。
[0018] このように、記載のシステム及び方法は概して、目的の抗原に結合する抗体（又は抗原特異的抗体）などの目的タンパク質を産生する細胞を検出するための技術を提供する。このようにして、記載のシステム及び方法を用いて、所望の特性を有するタンパク質（例えば抗体）を産生する細胞を同定すること、及び／又は目的タンパク質を産生しない細胞から分離することができる。したがって、記載のシステム及び方法のいくつかの実施例を用いて、治療的処置、疾病の診断、及び／又は任意の他の適切な用途に使用可能な抗原特異的抗体を産生する細胞を同定することができる。
[0019] 記載の方法は任意の適切な手法で使用及び実現することができるが、図１及び３Ａ乃至７Ｆは、目的タンパク質（例えば抗原特異的抗体及び／又は別の所望のタンパク質）を分泌する細胞を検出する適切な方法のいくつかの実施例を示している。この点について、図１及び６は記載の方法のいくつかの実施例の概観を提示し、図３Ａ乃至５Ｆ及び図７Ａ乃至７Ｆは記載の方法のいくつかのより具体的な実施例の描写を提示している。記載の方法のより良い理解をもたらすため、まず図１の方法１００を説明し、その後に図３Ａ乃至７Ｆの方法を記載する。
[0020] 本明細書に記載の方法の各々（該方法の様々な部分を再構成すること、これらに追加を行うこと、除去すること、置換すること、及びその他の変更をすることを含む）は、任意の適切な手法で変更可能である。また、実施例によっては、方法中の適切な箇所で、光電気技術の使用により細胞が選択され、移動され、分類され、及び／又は類似のことが行われてもよい。この技術は、例えば米国特許第６，９５８，１３２号明細書に開示されている光電気ウェッティング（「ＯＥＷ」）；例えば米国特許第７，６１２，３５５号明細書に開示されている光電子ピンセット（「ＯＥＴ」）；細胞撮影；及び／又は細胞を選択し、移動し、分類し、濾過し、又は操作するのに用いられ得る任意の他の適切な技術である。この点において、細胞撮影装置の一例が、２０１２年５月３０日に提出された代理人整理番号ＢＬ１−ＰＲＶを有する米国仮特許出願第６１／６５３，３２２号明細書（以下、「’３２２出願」と称する）に開示されている。該文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実際のところ、例えば’３２２出願の処理／出力装置１００における細胞の分類、選択、移動、及び／又は類似のことは、’３２２出願の図面に示される装置１００において細胞１２０が分類され、選択され、移動され、及び／又は類似のことが行われるのと同様に行われ得る。また、すると、’３２２出願の図７Ａ乃至１１に関して例示され議論されているように細胞１２０は液滴７０６の形で表されるので、細胞のうち１つ以上を培地の液滴の形で表すことができる。したがって、実施例によっては、細胞がこのようにして、概ね’３２２出願の図１２乃至１５に図示されているように、本願に記載のステップのうち１つ以上の期間中に１つの装置から別の装置へと移動されてもよい。
[0021] 次に図１を参照すると、同図は（１０５において）方法１００のいくつかの実施例がタンパク質産生細胞の標本を得ることによって開始することを示している。この点において、タンパク質産生細胞という用語は、ホルモン、酵素、機能タンパク質、構造タンパク質、及び／又は抗体などのタンパク質を、分泌し、膜上に表示し、又は産生することのできる任意の細胞を参照してよい。もっとも、単純にするため、図１の方法１００は抗体を産生するタンパク質産生細胞（又は抗体産生細胞）に焦点を絞っている。そのような抗体産生細胞の例としてはＢリンパ球、形質細胞、形質芽球、ハイブリドーマ、活性化Ｂ細胞、記憶細胞、形質転換細胞、免疫グロブリン遺伝子又はその一部を発現する哺乳動物細胞、及び／又は抗体を産生することのできる任意の他の細胞などがあるが、これらに限られない。
[0022] 抗体産生細胞の標本は任意の適切な手法で任意の適切な部位から採集可能であるが、実施例によっては、Ｂ細胞系列の細胞が、動物の脾臓、リンパ組織、骨髄、血液、及び／又は他の適切な組織又は体液から外科的に抽出（もしくは除去）される。その際、任意の適切な数の細胞を採集することが可能である。
[0023] 引き続き図１を参照すると（１０５において）、実施例によっては、抗体産生細胞の標本中の細胞のうち少なくともいくつかが免疫反応に関与している。この免疫反応は任意の適切な手法で誘発され得るが、実施例によっては、動物（例えばヒト、ウサギ、ネズミ、ハツカネズミ、ヤギ、ウシ、チンパンジー、サル、又は他の生物）；組織；又は細胞集団が、（例えば予防接種、病原体感染、病因、自己免疫反応、及び／又は類似の方法を介して）目的の抗原に曝露されるか、あるいは目的の疾病又は病態を既に患っている。この点において、ならびに本明細書の全体を通じて用いられるように、抗原という用語は、任意の適切なタンパク質、糖タンパク質、及び／又は炭水化物を含むがこれらに限定されない抗体により認識可能な任意の既知又は未知の物質を参照し得る。一例においては、抗原は、１つ以上のホルモン、サイトカイン、及びこれらの細胞受容体；細菌細胞膜又は寄生性細胞膜あるいはこれらの精製された成分；及び／又はウィルス成分といった、生物学的に活性なタンパク質である。また、抗原は任意の適切な形態をとり得るものであるが、場合によっては、抗原は、天然源からの直接精製により、あるいは組換え発現及びそのような抗原の精製により得られる純粋形態で利用可能である。他の場合には、抗原は、自然に又は組換え的に細胞の表面上に発現される。そのような場合、抗原発現は、哺乳動物細胞、免疫調節細胞、リンパ球、単球、多形体、Ｔ細胞、腫瘍細胞、酵母細胞、細菌性細胞、感染性因子、寄生生物、植物細胞、トランスフェクト細胞（例えばＮＳＯ，ＣＨＯ，ＣＯＳ，２９３細胞など）、特定の疾病又は疾患と関連のある細胞、及び／又は任意の他の適切な細胞又は細胞の集団において発生し得るが、これらに限定されない。
[0024] 方法１００を続けると、図１は（１１０において）、実施例によっては方法１００が１つ以上の架橋試薬の調製（又は取得）を含むことを示している。そのような架橋試薬は、任意の適切な成分を含み得るものであるとともに、該架橋試薬の第１部分が抗体産生細胞の細胞表面マーカに結合し、該試薬の第２部分が目的の抗原に結合することを可能にする任意の適切な手法で調製することができる。実例として、図２Ａ及び２Ｂは、架橋試薬１０が第１部分１５と、架橋部２０と、第２部分２５と、を備えるいくつかの実施例を示す。
[0025] 架橋試薬１０の第１部分１５に関して、この第１部分は、所望の細胞種類に特異的な細胞表面マーカに結合することを可能にする任意の適切な成分を含み得る。この点において、細胞表面マーカという用語は、そのタンパク質を発現する細胞を同じタンパク質を発現しない別の細胞と区別するために用いられることが可能なタンパク質産生細胞（例えば抗体産生細胞）の表面上に発現された任意のタンパク質を参照して用いられ得る。例えば、形質細胞表面マーカの例としては、ＣＤ１３８，ＣＤ３８，ＣＤ７８及びインターロイキン−６受容体などがあるが、これらに限られない。
[0026] 架橋試薬１０の第１部分１５は任意の適切な手法で作られ得るが、実施例によっては、所望のタンパク質産生細胞（例えば、あるいは形質細胞などの抗体産生細胞）の表面上に発現された細胞表面マーカ（例えばＣＤ１３８）に特異的な抗体が得られる。実施例によっては、その際、その抗体のＦＡＢ断片（これは本明細書においてはＦＡＢ断片、ＦＡＢ’断片、及び／又はＦ（ＡＢ’）Ｘ断片を参照して用いられ得る）が調製され精製される。この点において、抗体のＦＡＢ断片は、１つ以上の酵素（例えばパパイン、ペプシン、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来の免疫グロブリン分解酵素、タンパク質分解酵素など）を用いて抗体を切断して１つ以上のＦＡＢ断片を産生することを含む、任意の適切な手法で調製することができる。いくつかの任意選択的な実施例においては、架橋試薬の第１部分を作るために、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域が融合されて、対応するＦＡＢ断片の約半分の大きさであり親抗体の元々の特異性を保持する一本鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）を形成する。
[0027] 架橋部２０に関して、架橋部は、官能基（例えば１級アミン、カルボキシル、カルボニル、及び／又はスルフヒドリル）と反応する少なくとも２つの反応性末端基を有する任意の適切な化学的及び／又は生物学的架橋剤を含み得る。そのような架橋剤のいくつかの例には、１つ以上のヘテロ二官能性試薬、ホモ二官能性試薬、アビジン−ビオチン架橋剤、及びストレプトアビジン−ビオチン架橋剤などがあるが、これらに限定されない。もっとも、図２Ｂは、いくつかの実施例によれば、架橋部２０はストレプトアビジン−ビオチン架橋部３０から成ることを示している（ここで、ＳＡはストレプトアビジンの略であり、Ｂはビオチンの略である）。
[0028] 一方、架橋試薬１０の第２部分２５については、この第２部分は、目的の抗原に、及び／又は外表面上に目的の抗原（あるいは抗体又は他のタンパク質）を含有する細胞又はビーズに結合することを可能にする任意の適切な成分から成っていてもよい。架橋試薬の第２部分として用いることのできる適切な成分の例としては、目的の抗原に特異的なＦＡＢ断片（例えば抗原特異的抗体から作られたＦＡＢ）、別の目的タンパク質（例えば抗体又は他のタンパク質）に特異的なＦＡＢ断片、目的の抗原に特異的なｓｃＦｖ（例えば抗原特異的抗体から作られるｓｃＦｖ）、細胞の膜表面上に目的の抗原を発現する細胞に特異的な細胞表面マーカに結合するＦＡＢ断片、目的の抗原（例えば図２Ｂに示す抗原（又はＡｇ）４０）に結合することのできる架橋部（例えば架橋部３０）、及び／又は目的のタンパク質（例えば抗体）を含有する細胞及び／又はビーズに結合することのできる架橋部などがあるが、これらに限られない。実例として、図２Ａは、架橋試薬１０の第２部分２５が目的の抗原に特異的なＦＡＢ断片から成るいくつかの実施例を示す。対照的に、図２Ｂは、いくつかの実施例においては、架橋試薬１０の第２部分２５と架橋部２０とが同一物であることを示す。したがって、図２Ｂは、架橋部２０自体が第２部分２５の機能を果たし、目的の抗原４０に結合されることを示している。
[0029] 架橋試薬１０は、タンパク質の誘導体化（例えばアミン誘導体化、ジスルフィド形成、カルボン酸誘導体化など）、活性エステル系カップリング、ビオチン化、及び／又は任意の他の適切な方法を含む任意の適切な手法で作られ得るが、これらに限られない。もっとも、実施例によっては、架橋試薬の第１部分１５（例えば第１のＦＡＢ断片）及び第２部分２５（例えば第２のＦＡＢ断片）がビオチン化され、およそ１：１の比で混合され、ストレプトアビジンと架橋される。そのような実施例においては、第１部分及び第２部分（例えばＦＡＢ断片）の統計的混合物を有する四量体が作られる。
[0030] 方法１００を続けて図１に戻ると、同図は（１１５において）、この方法のいくつかの実施例が、溶液中に遊離している抗体を除去するために抗体産生細胞の標本を洗浄することを含むことを示している。この点において、細胞は、１つ以上の槽（例えば水槽、細胞支持培地槽など）において濯がれ及び／又は配置されること、濾過（例えば光濾過、マイクロ流体濾過など）、ＯＥＴ、ＯＥＷ、及び／又は遊離抗体を洗い流すこと、を可能にしつつ抗体産生細胞を保持できる任意の他の適切な方法を含む、任意の適切な手法で洗い流されてもよい。
[0031] １２０において、図１は、抗体産生細胞が、該細胞がその架橋試薬で標識され得る任意の適切な量の（例えば過剰な）架橋試薬１０で処理されることを示す。このようにして、架橋試薬の第１部分１５は、抗体産生細胞の細胞表面マーカ（例えばＣＤ１３８）に結合することができ、その一方で所望の細胞表面マーカを欠く細胞（例えば非抗体産生細胞）を実質的に標識されないままにする。
[0032] １２５において、図１は、方法１００のいくつかの実施例は、細胞（架橋試薬１０で標識された抗体産生細胞など）の標本が目的の抗原４０で処理されながら続行することを示す。これは任意の適切な手法で行われ得るが、実施例によっては、目的の抗原が、標識された抗体産生細胞に過度に曝露された細胞の表面に結合される（又は該表面上に発現する）。他の実施例においては、目的の抗原が（例えば塩素クロムカップリング法、水溶性カルボジイミドカップリング法、又は他の適切な方法を介して）ビーズの表面に結合され、標識された抗体産生細胞に過度に曝露される。さらに他の実施例においては、遊離型の目的の抗原（例えば、精製された形態の抗原のように、目的の抗原が細胞又はビーズに結合されていない形態）が標識された抗体産生細胞に加えられる。また他の実施例においては、抗体産生細胞が試薬により標識される時には、目的の抗原が（図２Ｂに示すように）既に架橋試薬１０に結合されている。いずれの場合であっても、標識された抗体産生細胞を過剰な目的の抗原で処理することによって、これらの抗体産生細胞は、架橋試薬を通じて、（例えば抗原被覆された細胞、抗原被覆されたビーズ、遊離型の抗原、及び／又は目的の抗原を含む架橋部を介して）目的の抗原に結合される。
[0033] １３０において、図１は、実施例によっては、余分な目的の抗原（又は架橋試薬１０を介して標識された抗体産生細胞に結合されていない抗原）が除去されることを示す。この点において、余分な抗原（例えば余分な抗原被覆された細胞、抗原被覆されたビーズ、遊離型の抗原、及び／又は目的の抗原を含む架橋試薬）は、ＯＥＴを用いた濾過、光濾過、及び／又は別のマイクロ流体濾過技術を含む任意の適切な手法で除去することができるが、これらに限られない。一例においては、ＯＥＴを用いて、大きな物質（例えば架橋試薬１０を介して目的の抗原、遊離型の抗原などを表示する細胞／ビーズと複合化された抗体産生細胞）を保持し、その一方で小さな物質（例えば余分な抗原被覆された細胞／ビーズ、遊離型の抗原、架橋試薬など）が流体の流れによって運び去られ得るように構成された幅を有する歯を備えた光コーム（light comb）が作り出される。
[0034] １３５において、図１は、実施例によっては、架橋試薬１０を通じて目的の抗原（例えば抗原被覆された細胞、抗原被覆されたビーズ、遊離型の抗原、及び／又は目的の抗原を含む架橋試薬）に結合されている標識された抗体産生細胞がインキュベートされて細胞に抗体を産生させることを示している。この点において、目的の抗原に特異的な抗体（又は抗原特異的抗体）は、目的の抗原（例えば、架橋試薬と、抗原を含むビーズ、抗原を含む細胞、遊離型の抗原、及び／又は架橋試薬に含まれた抗原と、を通じて抗体産生細胞に結合された抗原）に優先的に結合するであろう。より詳細には、抗原特異的抗体は、その抗体を分泌した抗体産生細胞を囲む抗原に優先的に結合するであろう。
[0035] 図１は、１４０において、方法１００のいくつかの実施例は、目的の抗原に結合された抗原特異的抗体がマークされ又は標識化されながら続行することを示す。この点において、標識（label）という用語及びその変化したものは、抗体と連結可能で且つその標識に結合された構造を結合されていない構造と区別するために用いられ得る任意の適切なプローブ、マーカ又は標識を参照し得る。この点において、適切な標識の例には発光性標識、放射性標識、及び蛍光標識（例えばＡｑｕａ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＦＩＴＣ、ローダミン、ローダミン誘導体、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、カスケードブルー、Ｃｙ５、フィコエリトリンなど）があるが、これらに限定されない。
[0036] 標識化二次抗体は任意の適切な手法で用いられ得るが、実施例によっては、標識化二次抗体は、（例えば架橋試薬１０を介して）目的の抗原に結合された、標識された細胞を含む溶液に過剰に加えられる。また、標識化二次抗体は（全体として、あるいは部分的に（例えばＦＣ領域、ＦＡＢ領域など））いずれかの又はすべての抗体に対する異方性を有し得るが、実施例によっては、標識化二次抗体は、抗体の重鎖のＦＣ部分に特異的である。その結果、そのような実施例においては、標識化二次抗体は（目的の抗原に結合された抗原特異的抗体や目的の抗原に結合しない抗体など）標本中の任意の抗体に結合することができる。したがって、抗原特異的抗体を産生する細胞は、（例えば架橋試薬１０を介して）目的の抗原に結合され、それが順に抗原特異的抗体に結合され、そしてそれが順に標識化二次抗体に結合される。
[0037] 図１を続けると、同図は（１４５において）、いくつかの実施例においては、標識化二次抗体が一旦抗原特異的抗体（及び／又は任意の他の抗体）と結合されると、余分な標識化二次抗体及び／又は非抗原特異的抗体は任意選択的に洗い流されることを示す。この点において、（例えば、目的の抗原に結合されるとともに架橋試薬１０を通じて抗体産生細胞に結合された抗原特異的抗体を介して）抗体産生細胞に結合しない余分な標識化二次抗体は、任意選択的に洗い流されるか、又は任意の適切な手法で抗体産生細胞から分離される。その結果、潜在的な背景ノイズもまた、全部ではないにしてもいくらかは洗い流される。
[0038] １５０において、図１は、いくつかの実施例においては、抗原特異的抗体を産生する（したがって標識化二次抗体で標識された）抗体産生細胞が、抗原特異的抗体を産生しない（したがって、仮に標識されていたとしても同様に標識されてはいない）残りの細胞から分離されることを示す。この点において、抗原特異的抗体を産生する細胞は、抗原特異的抗体を産生する細胞（又は標識された細胞）が同定されるとともに標識されていない（又は所望の範囲で標識されていない）細胞から分離されることを可能にする任意の適切な手法で、残りの細胞から分離されてもよい。
[0039] 標識された細胞を標識されていない細胞から分離する適切な方法の例には、ＯＥＴの使用、他のＯＥＴベースの方法、ＯＥＷ、マイクロマニピュレーション、レーザ捕獲、マイクロピペッティング、フローサイトメトリなどがあるが、これらに限定されない。また、いくつかの非制限的な実施例においては、標識された細胞は保持ペン内に配置される。これは例えば、２０１２年１０月３１日に提出された代理人整理番号ＢＬ６−ＰＲＶを有する米国仮特許出願第６１／７２０，９５６号（以下「’９５６出願」という）の図７Ｃ及び他の図面を通じて例示されている装置１００の仮想保持ペン７１４，７１６，７１８及び７２０などである。同文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。その後、細胞の、目的の抗体を産生する能力に基づいて、細胞をさらに同定及び選択するべく、’９５６出願の図１１の工程１１００が任意選択的に実施されてもよい。’９５６出願において述べられているように、ペン７１４，７１６，７１８及び７２０は、仮想的なペンであっても、又は物理的なペンであってもよい。また、仮想的なペンであれば、’９５６出願の装置１００内で、例えば’９５６出願の図２に概ね示されているようなＯＥＴ技術又は類似のそのような技術を用いて、こうした仮想的なペンが作り出され、移動され、及び／又は操作されて、細胞が選択され、移動され、及び／又は操作されてもよい。
[0040] 標識された細胞が標識されていない細胞から一旦分離されると、図１は（１５５において）、いくつかの実施例においては、目的の抗原が、抗原特異的抗体を産生するものとして同定された細胞から遊離されてもよいことを示す。したがって、目的の抗原がビーズ又は細胞に結合されている場合には、そのようなビーズ及び／又は細胞が、抗原特異的抗体を産生する集積された細胞（又は採集された細胞）から遊離されてもよい。同様に、目的の抗原が（図２Ｂに示すように）架橋部２０に直接結合されている場合には、その抗原が遊離されてもよい。目的の抗原は採集された細胞から任意の適切な手法で除去され得るが、実施例によっては、採集された細胞は、タンパク質分解酵素（例えばトリプシン及び／又は任意の他の適切なタンパク質分解酵素）で処理され、加熱され、架橋部２０を切断又は除去する薬品で処理され、及び／又は架橋試薬及び／又は抗原の任意の適切な部分を除去／切断するよう処理される。
[0041] 抗原特異的抗体を産生する細胞が一旦同定され、抗原特異的抗体を産生しない他の細胞（又はその所望の量）から分離されると、図１は、１６０において、抗原特異的抗体を産生する細胞及び／又は対応する抗原特異的抗体自体が任意選択的に検査され、抗原特異的抗体が１つ以上の所望の特性（例えば生化学的活性、抗原特異性、抗体に対する結合親和性、所望の量で産生される、所望の濃度で産生される、など）を有するかどうかが判断されることを示す。この点において、採集された細胞及び／又はそれらが産生する抗原特異的抗体は、１つ以上の生化学的試験（例えば、候補抗体の、目的の生化学的経路を増大又は中断させる能力を検査すること）、抗体に対する結合親和性の試験、抗原特異性の試験などを含む任意の適切な手法で検査され得るが、これらに限定されない。また、抗原特異的抗体を産生する採集された細胞はまとめて検査可能であるが、いくつかの好適な実施例においては、そのような細胞及び／又はそれらが産生する抗体が個々の細胞を基準として検査される。
[0042] 実施例によっては、抗原特異的抗体を産生する採集された細胞は、それぞれ物理的チャンバにおいて１つ以上の所望の特性について検査される。これらのチャンバは任意の適切な構成要素又は特性を有し得るが、いくつかの実施例においては、チャンバは、２０１２年６月２６日に提出され代理人整理番号ＢＬ３−ＰＲＶを有する米国仮特許出願第６１／６６４，４２１号（以下、「’４２１出願」という）の図面に例示され該出願において述べられている細胞取り調べ装置１００，１００’，４００，８００及び８００’ならびに細胞装置１０００のいずれかと同一または類似である。同文献はその全体がここに組み込まれる。この文献において述べられているように、そして’４２１出願の図２及び３を参照すると、そのような装置１００，１００’は、細胞２０４を培地２０２中に保持するためのチャンバ１１４及び／又は１１４’を備えていてもよい。新たな培地２０２が注入口１１０を通じて導入可能でありとともに、細胞２０４からの分泌物を含む培地２０２が排出口１１２を通じて抽出され分析され得る。
[0043] 本願の図１のステップ１６０において検査のために単数又は複数の細胞が任意選択的に内部に置かれる物理的チャンバの別の例には、２０１２年１０月４日に提出され代理人整理番号ＢＬ５−ＰＲＶを有する米国仮特許出願第６１／７０９，４０８号（以下、「’４０８出願」という）の図面に例示され該出願において述べられている細胞分泌物検出装置１００及び１００’がある。同文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。この文献において述べられているように、そして’４０８出願の図１Ａ乃至３を参照すると、そのような装置は、細胞１２８を培地１３０中に保持するためのチャンバ１２０及び／又は１２０’と、１つ以上の結合領域１４２乃至１４８を含むセンサ１４０と、を備えていてもよい。’４０８出願の図５Ａ乃至６に例示されるように、培地１３０は、細胞１２８により分泌される目的の検体５０８に結合する放射標識５０２を含んでいてもよい。分泌された検体５０８が結合領域１４２乃至１４８に結合する際にこれらの結合領域１４２乃至１４８の放射線を検出器１６０（’４０８出願の図１Ｄを参照）で監視することによって、検体５０８の分泌物を測定及び／又は分析することができる。
[0044] 前述のように、ステップ１６０において細胞が任意選択的に内部に置かれるチャンバは、上記の’４２１出願又は’４０８出願の装置と同一又は類似のものであってもよい。’４２１出願の装置であれば、本願のステップ１６０は、少なくとも部分的には、概ね’４２１出願において述べられているように（’４２１出願の図２及び３を参照）、排出口１１２を通じて培地２０２を抽出するとともに抽出された培地２０２中の細胞２０４からの分泌物を分析することによって実行可能である。’４０８出願の装置であれば、本願のステップ１６０は、少なくとも部分的には、上記で端的に述べたように、ならびに’４０８出願におけるより詳細な議論に従って、センサ１４０の結合領域１４２乃至１４８からの放射線を検出及び分析することにより実行可能である。
[0045] 別の例として、本願の図１のステップ１６０においては、標識された細胞が細胞取り調べ装置の内部に置かれてもよく、該装置においては細胞が培地中に保持されており、所望の抗体の存在に関してさらに検査されてもよい。そのような細胞取り調べ装置の例には、’４２１出願の図面に例示され該出願において述べられている細胞取り調べ装置１００，１００’，４００，８００及び８００’ならびに細胞装置１０００がある。そのような細胞取り調べ装置の他の例は、’４０８出願の図面に例示され該出願において述べられている細胞分泌物検出装置１００及び１００’を含む。前述した’４２１出願及び’４０８出願の細胞取り調べ装置は、概ね’４２１出願又は’４０８出願において述べられている任意の手法で、目的の抗体の細胞による分泌物を検出するよう操作可能である。
[0046] １６５において、図１は、いくつかの実施例においては、採集された細胞により産生される抗原特異的抗体の所望の生化学的活性及び／又は他の特性（例えば抗体に対する結合親和性、抗原特異性、濃度など）が測定された後、１つ以上の所望の特性を有する抗原特異的抗体（又は他の目的タンパク質）を産生する採集された細胞からのＤＮＡ配列の一部（例えばＶ領域ＤＮＡ配列の複製）を含む細胞株が任意選択的に作り出されることを示す。この点において、そのような細胞株は任意の適切な手法で産生され得る。実際のところ、実施例によっては、１つ以上の所望の特性を有する抗原特異的抗体（又は他の目的タンパク質）を産生する採集された細胞からのＤＮＡ配列の一部（例えばＶ領域ＤＮＡ配列の複製）が、任意選択的にプラスミド（例えば免疫グロブリン定常領域をコードするプラスミド）中に置かれ、これが所望の抗原特異的抗体（又は他のタンパク質）を産生するであろう細胞株内にトランスフェクトされてもよい。実施例によっては、採集された細胞のうち１つ以上からの抗体（又はタンパク質）遺伝子全体がクローン化され、及び／又は配列決定される。他の好適な実施例においては、抗体の所望の特異性を与える可変領域又はその一部（例えばＶＬ及び／又はＶＨ）がクローン化及び／又は配列決定され、その後任意の従来の技術を通じて合成されて組換え抗体を産生する。この点において、組換え抗体は、無傷の免疫グロブリン、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗原結合断片（例えばＦＣ，ＦＡＢ，ＦＡＢ’，及びＦ（ＡＢ’）Ｘ断片、及びｓｃＦｖ断片など、その誘導体）を含むいくつかの形をとり得るが、これらに限定されない。
[0047] 選択された細胞からのＤＮＡの可変領域がプラスミドにクローン化される場合、そのクローン化工程は任意の適切な手法で達成され得る。しかしながら、実施例によっては、クローン化工程は、採集された細胞のうち１つ（例えば１つ以上の所望の特性を有する抗原特異的抗体７５を産生する細胞）を溶解させること、溶解した細胞から（例えばポリ（Ｔ）テールと共役なビーズを介して）ｍＲＮＡを抽出すること；ＶＨ領域及びＶＬ領域の増幅に特異的なＰＣＲプライマを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によりｍＲＮＡからｃＤＮＡを作り出すこと；ＶＨ領域及びＶＬ領域を免疫グロブリン定常領域を含むプラスミドにクローン化すること；及びプラスミドを細胞株（例えば大腸菌（e. coli）、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳＯ、又は他の適切な真核又は哺乳動物細胞株）内にトランスフェクトして安定した抗体分泌株（又は他のタンパク質産生細胞株）を作ることを含む。
[0048] さらに、いくつかの代替的な実施例においては、選択された細胞により産生された抗体（又は他のタンパク質）の一次配列が決定される。より詳細には、いくつかの実施例においては、選択された細胞からのＶ領域ＤＮＡ配列が決定され、合成され、プラスミドにクローン化される。この点において、配列の決定、合成、及びクローン化の工程は、当該技術分野において一般に知られている技術を含む任意の適切な手法で達成され得るが、これらに限定されない。
[0049] さらに他の実施例においては、目的タンパク質（例えば抗原特異的抗体）を産生するものとして同定された細胞は、（例えば細胞培養培地において）増殖され、それから任意の他の適切な種類の細胞（例えば骨髄腫細胞）と融合されて、１つ以上のハイブリドーマを形成してもよい。いくつかのそのような実施例においては、目的タンパク質を生成するものとして同定された細胞と別の細胞との融合は、目的のタンパク質（例えば抗体）を産生する細胞株を作り出すことを可能にする決定論的融合である。
[0050] ２０１２年７月１３日に提出され代理人整理番号ＢＬ４−ＰＲＶを有する米国仮特許出願第６１／６７１，４９９号（以下「’４９９出願」という）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものであるが、同出願は、中に抗体産生細胞２１０のＤＮＡ配列の一部（例えばＶ領域ＤＮＡ配列）が置かれたプラスミドを生成される細胞株の細胞と組み合わせるために用いられ得る技術及び装置の例を説明している。すなわち、中に細胞２１０のＤＮＡ配列が置かれたプラスミドは’４９９出願の図面における微小物体１ １２０であってもよく、生成される細胞株の細胞は微小物体２ １２２であってもよい。したがって、実施例によっては、中に細胞２１０のＤＮＡ配列が置かれたプラスミドは、微小物体１ １２０を微小物体２ １２２と組み合わせて結合された微小物体１２４を産生する’４９９出願の図面に例示され同出願において議論されている任意の工程及び／又は装置を用いて、生成される細胞株の細胞と組み合わせられてもよい。また、実施例によっては、本願の図１のステップ１３５で参照されている細胞株は、概ね’９５６出願の図６の工程６００又は図１１の工程１１００に従って生成され得る。
[0051] 次に図３Ａ乃至３Ｇを参照すると、これらの図面は、目的の抗原４０を表示するビーズ又は細胞３５を用いて抗原特異的抗体を産生する細胞を検出する、記載の方法のいくつかの実施例を示す。図３Ａ乃至３Ｇの方法は任意の適切な手法で変形可能であるが、図３Ａは、いくつかの実施例においては、方法２００が、抗体産生細胞４５の洗浄された標本を、抗体産生細胞４５に特異的な細胞表面マーカ５５（例えば抗体産生細胞が形質細胞を含むいくつかの実施例におけるＣＤ１３８）に特異的な第１のＦＡＢ断片５０と、目的の抗原４０に特異的な第２のＦＡＢ断片６０とを有する架橋試薬１０に曝露することを含むことを示す。
[0052] 図３Ｂは、標識された細胞６５が次に、表面上に目的の抗原４０を表示する細胞及び／又はビーズ３５に曝露されることを示す。それに応じて、図３Ｃは、抗原被覆された細胞及び／又はビーズ３５が（例えば架橋試薬１０を介して）抗体産生細胞４５に結合されることを示す。上述のように、余分な細胞／ビーズ３５はこのとき（例えば潜在的な背景を低減させるために）任意選択的に洗い流される。
[0053] 図３Ｄは、抗体産生細胞４５がインキュベートされて抗体７０を産生可能であるとき、抗原特異的抗体７５は、（例えばビーズ／細胞３５及び架橋試薬１０を介して）抗原特異的抗体７５を産生する抗体産生細胞８０に結合された目的の抗原４０に結合するであろうことを示す。対照的に、図３Ｅは、非抗原特異的抗体９０を産生する細胞８５がインキュベートされて非抗原特異的抗体９０を産生可能であるとき、そのような抗体は目的の抗原４０には有意に結合しないことを示す。
[0054] したがって、実施例によっては、標識化二次抗体９５（例えば図３Ｄ及び３Ｅに示されるような蛍光標識された抗ＦＣ抗体）が加えられると、この二次抗体は抗体産生細胞により産生された抗体７０と結合することができ、目的の抗原に結合されていない抗体は任意選択的に洗い流される。結果として、図３Ｆ及び３Ｇは、抗原特異的抗体７５を産生する細胞８０が標識化二次抗体９５で標識されるため、（３Ｆに示す）標識された抗原特異性の抗体産生細胞が（３Ｇに示す）抗原特異的抗体を産生しない細胞８５から（例えば蛍光顕微鏡法及び／又は任意の他の適切な方法を介して）容易に区別可能であることを例示する。
[0055] 次に図４Ａ乃至４Ｇを参照すると、これらの図面は、遊離型抗原９８を用いて抗原特異的抗体７５を産生する細胞を検出する、記載の方法のいくつかの実施例を示す。図４Ａ乃至４Ｇの方法は任意の適切な手法で変更可能であるが、図４Ａは、実施例によっては、方法３００は、抗体産生細胞４５の洗浄された標本を、抗体産生細胞４５上の細胞表面マーカ５５に特異的な第１のＦＡＢ断片５０と、目的の抗原４０（例えば遊離型抗原９８）に特異的な第２のＦＡＢ断片６０とを有する架橋試薬１０に曝露することを含むことを示す。
[0056] 図４Ｂは、標識された細胞６５が次いで遊離型抗原９８に曝露されることを示す。それに応じて、図４Ｃは、遊離型抗原９８が（例えば架橋試薬１０を介して）抗体産生細胞４５に結合されることを示す。上述のように、一旦遊離型抗原が標識された細胞に結合されると、余分な遊離型抗原は任意選択的に洗い流される。
[0057] 図４Ｄは、抗体産生細胞４５がインキュベートされて抗体７０を産生可能であるとき、抗原特異的抗体７５は、（例えば架橋試薬１０を介して）抗原特異的抗体７５を産生する抗体産生細胞８０に結合された目的の抗原４０（例えば遊離型抗原９８）に結合するであろうことを示す。対照的に、図４Ｅは、非抗原特異的抗体９０を産生する細胞８５がインキュベートされて抗体７０を産生可能であるとき、そのような非抗原特異的抗体９０は目的の抗原４０（例えば抗原９８）には有意に結合しないことを示す。
[0058] 実施例によっては、標識化二次抗体９５が抗体産生細胞４５に加えられると（例えば図４Ｄ及び４Ｅに示されるような蛍光標識された抗ＦＣ抗体）、この二次抗体は抗体産生細胞により産生された抗体７０と結合することができ、目的の抗原４０（例えば抗原９８）に結合されていない抗体（例えば非抗原特異的抗体９０及びこれに結合された標識化二次抗体９５）は任意選択的に洗い流される。結果として、図４Ｆ及び４Ｇは、抗原特異的抗体７５を産生する細胞８０が標識化二次抗体９５で標識されるため、（図４Ｆに示す）標識された細胞が（図４Ｇに示す）非抗原特異的抗体を産生する細胞８５から（例えば蛍光顕微鏡法及び／又は任意の他の適切な検出方法を介して）容易に区別可能であることを例示する。
[0059] 次に図５Ａ乃至５Ｆに関して、これらの図面は、目的の抗原４０を含む架橋試薬１０を用いて抗原特異的抗体７５を産生する細胞を検出する、記載の方法のいくつかの実施例を示す。図５Ａ乃至５Ｆの方法は任意の適切な手法で変更可能であるが、図５Ａは、実施例によっては、方法４００は、抗体産生細胞４５の洗浄された標本を、抗体産生細胞４５上の細胞表面マーカ５５に特異的な第１のＦＡＢ断片５０を有する架橋試薬１０に、目的の抗原４０が架橋部２０を介して第１のＦＡＢ断片５０に結合された状態で、曝露することを含むことを示す。
[0060] 図５Ｂは、一旦抗体産生細胞４５が架橋試薬１０で標識されると、標識された細胞６５も目的の抗原４０に結合されることを示す。（例えば図１の１３０において）前述したように、このとき余分な架橋試薬１０は任意選択的に洗い流される。
[0061] 図５Ｃは、標識された抗体産生細胞６５がインキュベートされて抗体７０を産生可能であるとき、抗原特異的抗体７５は、（例えば架橋試薬１０を介して）抗原特異的抗体７５を産生する抗体産生細胞８０に結合された目的の抗原４０に結合するであろうことを示す。対照的に、図５Ｄは、非抗原特異的抗体９０を産生する細胞８５がインキュベートされて抗体７０を産生可能であるとき、そのような非抗原特異的抗体９０は、かなりの数が、目的の抗原４０には結合しないことを示す。
[0062] 上述の標識化の結果、標識化二次抗体９５が細胞４５に加えられると（例えば図５Ｃ及び５Ｄに示されるような蛍光標識された抗ＦＣ抗体）、この二次抗体は抗体産生細胞により産生された抗体７０と結合することができ、余分な抗体（例えば非抗原特異的抗体９０及びこれに結合された二次抗体９５）は任意選択的に洗い流される。それに応じて、図５Ｅ及び５Ｆは、抗原特異的抗体７５を産生する細胞８０が標識化二次抗体９５で標識されるため、（図５Ｅに示す）標識された細胞が（図５Ｆに示す）非抗原特異的抗体を産生する細胞８５から（例えば蛍光顕微鏡法及び／又は任意の他の適切な検出方法を介して）区別可能であることを例示する。
[0063] 前述のように、記載の方法は、任意の適切な手法で変更してもよい。一例においては（前述したように）、記載の方法は、単に抗原特異的抗体７５を産生する細胞を同定するために用いられるだけでなく、任意の他の適切な目的タンパク質を産生する細胞を同定するよう変更可能である。
[0064] 記載のシステム及び方法は、それらを用いて任意の適切な目的タンパク質を同定することを可能にする任意の適切な手法で変更可能であるが、図６は、そのような方法５００のいくつかの実施例を示す。この点において、図６は、少なくともいくつかの実施態様においては、方法５００は、タンパク質産生細胞を含む標本を得ることから始まることを示す。その際、この標本は、（例えば外科的又はその他の）任意の適切な手法で、任意の適切な部位から（例えば動物の脾臓、リンパ組織、骨髄、血液、及び／又は目的タンパク質を産生する細胞を含み得る任意の他の適切な組織又は体液から）得ることができる。また、この標本は任意の適切な数の細胞を含んでいてもよく、そうした細胞は（例えば本願の図１のステップ１１５に関して上述したものと類似の手法で）任意選択的に洗浄されてもよい。
[0065] ５１０において、図６は、方法５００が１つ以上の架橋試薬２０を製造／獲得することをさらに含むことを示す。この点において、架橋試薬は、該架橋試薬が目的タンパク質を同定するために用いられることを可能にする任意の適切な特性（例えば本願の図１のステップ１１０に関して上述された任意の適切な特性を含むがこれに限られない）を有していてもよい。実際のところ、実施例によっては、架橋試薬１０は、タンパク質（例えば目的タンパク質、特定の種類のタンパク質など）を産生する細胞（例えば特定の種類の細胞）上の細胞表面マーカに結合するよう構成された第１部分１５（例えばＦＡＢ断片）を備える。また、実施例によっては、架橋試薬は、目的タンパク質に特異的な抗体（又はタンパク質特異的抗体）を含有する細胞、ビーズ、及び／又は他の基質に（例えば直接的又は間接的に）結合するよう構成された第２部分２５（例えば架橋部２０、ＦＡＢ断片など）を備える。さらに他の実施例においては、架橋試薬の第２部分（例えば架橋部）は、目的タンパク質に特異的な抗体に直接結合するよう構成されている。
[0066] 図６を続けると、同図は５１５において、方法５００のいくつかの実施例は、タンパク質産生細胞を、該細胞がその架橋試薬で標識され得る任意の適切な量の（例えば過剰な）架橋試薬１０で処理することを含むことを示す。このようにして、架橋試薬の第１部分１５は、タンパク質産生細胞の細胞表面マーカ５５（例えばある種のタンパク質産生細胞）に結合することができ、その一方で所望の細胞表面マーカを含まない細胞を実質的に標識されないままにする。
[0067] ５２０において、図６は、方法５００のいくつかの実施例は、架橋試薬１０に、目的タンパク質に特異的な抗体を含有する１つ以上の細胞、ビーズ、及び／又は他の基質と交差反応させることをさらに含むことを示す。この結合は任意の適切な手法で（例えば、架橋試薬を、架橋試薬の第２部分２５でＦＡＢ断片を介して、架橋部２０自体を介して、又は任意の他の適切な手法で、細胞／ビーズ／基質に結合することにより）達成することができるが、実施例によっては、架橋部は、ビオチン／ストレプトアビジン結合の利用を通じて、目的タンパク質に特異的な抗体を含有する細胞／ビーズ／基質に結合される。
[0068] ５２５において、図６は、いくつかの実施例においては、標識されたタンパク質産生細胞６５が（例えばインキュベートされて）タンパク質を産生できることを示す。結果として、目的タンパク質を産生する細胞は、ビーズ／細胞／基質上の抗体と結合するであろうタンパク質を産生するであろう。
[0069] 目的タンパク質を産生する細胞は任意の適切な手法で同定可能であるが、図６は（５３０において）、いくつかの実施例においては、方法５００は、細胞／ビーズ／基質に結合された標識された細胞６５を、目的タンパク質に特異的で且つ細胞／ビーズ／基質上の抗体のものとは異なるエピトープに結合する標識化抗体（例えば過剰量）で処理することを含むことを示す。この点において、標識化抗体は、任意の適切な標識（例えば１つ以上の発光性標識、放射性標識、及び／又は例えばＡｑｕａ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＦＩＴＣ，ローダミン、ローダミン誘導体、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、カスケードブルー、Ｃｙ５、フィコエリトリンなどの蛍光標識）を備えていてもよい。もっとも、実施例によっては、標識化抗体は１つ以上の蛍光分子で標識される。
[0070] ５３５において、図６は、方法５００のいくつかの実施例は、余分な標識化抗体の除去を任意選択的に含むことを示す。この除去は任意の適切な手法で達成され得るが、実施例によっては、余分な標識化抗体は（例えば本願の図１のステップ１４５に関して上述したように）単純に洗い流される。
[0071] また、図１のステップ１５０，１５５，１６０及び１６５に関してそれぞれ上述したものと類似の技術により、図６のステップ５４０，５４５，５５０及び５５５は、いくつかの実施例においては、標識された細胞が標識されていない細胞から分離され、架橋試薬１０がタンパク質産生細胞から除去され、個々の細胞により産生された目的タンパク質の特性が任意選択的に検査され、目的タンパク質を産生する細胞株が任意選択的に作り出されることを示す。
[0072] 図６に記載の方法５００のより良い理解をもたらすため、図７Ａ乃至７Ｆは、目的タンパク質を産生する細胞を同定する方法６００のいくつかの実施例を示す。具体的には、図７Ａは、実施態様によっては、方法６００は、タンパク質産生細胞４７を、タンパク質（例えばタンパク質一般、ある種のタンパク質、目的タンパク質など）を分泌する細胞上の細胞表面マーカ５５に対する特異性を有する第１部分５０と、（例えばビオチン／ストレプトアビジン架橋部２０を介して）目的タンパク質９９に特異的な抗体７７を含有するビーズ／細胞３８に反応するよう構成された第２部分２０と、を有する架橋試薬１０に曝露することを含むことを示す。それに応じて、図７Ｂは、タンパク質産生細胞４７が、（架橋試薬１０を介して）目的タンパク質９９に特異的な抗体７７を含有する細胞／ビーズ３８で標識され得ることを示す。
[0073] タンパク質産生細胞４７がタンパク質を分泌できることから、図７Ｃは、目的タンパク質９９を産生する細胞４８が、少なくとも（例えば図７Ｄに示す）目的タンパク質を産生しない細胞４９と比較した場合、比較的大量の目的タンパク質９９を、細胞／ビーズ３８に結合された抗体７７に結合させることを示す。その際、（例えば図７Ｄに示す）目的タンパク質を産生しない細胞４９に結合された抗体７７は依然としてすぐ近くの細胞から遊離された目的タンパク質９９に結合し得るが、目的タンパク質を産生する細胞４８に繋留された抗体７７は、目的の抗原を産生しない細胞４９に繋留された抗体が結合するであろうよりもはるかに大量の目的タンパク質と結合するであろうと考えられる。
[0074] したがって、図７Ｅ及び７Ｆは、目的タンパク質９９に特異的な標識化抗体９６が標識された細胞６５に加えられると、（例えば図７Ｅに示す）目的タンパク質を産生する細胞４８は、（例えば図７Ｆに示す）目的タンパク質を産生しない細胞４９よりも良好に標識されることを示す。この標識化の結果、目的タンパク質を産生する細胞が優先的に標識され、標識が弱いか又は無い他の細胞から分離されることができる。この点において、分離は、ＯＥＴの使用、光電子ベースの方法、マイクロマニピュレーション、マイクロ濾過などの任意の適切な方法で達成され得るが、これらに限定されない。
[0075] 前述のように、目的タンパク質を産生する細胞を検出する記載の方法はいくつかの特徴を有し得る。一例として、記載のシステム及び方法のいくつかの実施例は、目的タンパク質（例えば抗原特異的抗体）を産生する個々の細胞が同定され、目的タンパク質を産生しない細胞から分離されることを可能にする。別の一例においては、記載の方法のいくつかの実施例は、より多量の目的タンパク質を産生する細胞が（例えば標識化の度合いを増すことによって）より少量の目的タンパク質を産生するか又は産生しない細胞と区別されることを可能にする。
[0076] さらに別の一例においては、記載の方法のいくつかの実施例は、膜表面上に目的タンパク質を発現する細胞とは対照的に、目的タンパク質を分泌する細胞の同定を可能にする。この点において、目的タンパク質を発現する細胞を同定する従来の方法には、目的の細胞表面タンパク質の染色に依存するものがある。したがって、いくつかのそのような従来の方法は、細胞膜に結合されるように翻訳後に変化された目的タンパク質を選択するのであって、（本明細書に記載のいくつかの実施例を通じて達成され得るように）分泌された目的タンパク質を同定するのではない。
[0077] 先に示した変更に加え、多数の他の変化及び代替的な構成が、本明細書の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者によって考え出され得るものであり、また添付の請求項は、そのような変更及び構成を網羅することを意図されている。したがって、上記では、現在最も実用的且つ好適な態様であると認められているものとの関連で特殊性をもって且つ詳細に情報を記載したが、当該技術分野における通常の技能を持つ人物には、形状、機能、操作の手法、及び使用を含むがこれらに限定されない多数の変化が、本明細書に記載された理念及び概念から逸脱することなく、なされ得ることが明らかであろう。また、本明細書において用いられている例及び実施例は、あらゆる点において、説明に役立つことのみを意図されているものであり、いかなるようにも限定を加えるものと解釈されてはならない。さらに、本明細書において要素の一覧（例えば要素ａ，ｂ，ｃ）を参照する場合、そのような参照は、列挙された要素のうちいずれか１つのみ、列挙された要素のすべてよりも少ない任意の組み合わせ、及び／又は列挙された要素のすべての組合せを含むことを意図されている。また、本明細書において用いられている「１つの（a, an, one）」という用語はそれぞれ「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」という用語と置換可能である。また、本明細書においてはステップという用語が用いられているが、この用語は単に記載の方法の異なる部分に注意を引き付けるためにのみ用いられ得るものであって、方法のいずれかの部分の開始点又は停止点を表したり、あるいはいかなるようにも限定を加えたりすることを意図してはいないことにも注意しなければならない。

Claims (20)

  1. 目的タンパク質を産生する細胞を同定する方法であって、
    タンパク質産生細胞を含む標本を得ることと、
    前記タンパク質産生細胞に特異的な細胞表面マーカに結合するよう適合された第１部分と、目的の抗原又は前記目的タンパク質に特異的なタンパク質特異的抗体に結合されるよう構成された第２部分と、を備えた架橋試薬で前記タンパク質産生細胞を標識することと、
    前記タンパク質産生細胞が前記架橋試薬を介して前記目的の抗原又は前記タンパク質特異的抗体に結合されるように、前記タンパク質産生細胞を前記目的の抗原又は前記タンパク質特異的抗体に曝露することと、
    前記タンパク質産生細胞に前記目的の抗原又は前記タンパク質特異的抗体と選択的に結合するよう適合された前記目的タンパク質を産生させることと、
    前記タンパク質産生細胞を前記目的タンパク質に結合するよう適合された標識化抗体に曝露することと、
    を備える方法。
  2. 前記目的タンパク質は、前記目的の抗原と特異的に結合する抗体を備える、請求項１の方法。
  3. 前記架橋試薬の前記第１部分は、前記タンパク質産生細胞に特異的な前記マーカに結合するよう構成された第１のＦＡＢ断片を備える、請求項１の方法。
  4. 前記架橋試薬の前記第２部分は、前記目的の抗原に結合するよう構成された第２のＦＡＢ断片を備える、請求項１の方法。
  5. 前記架橋試薬の前記第２部分は、前記タンパク質産生細胞が前記架橋試薬で標識されたときに前記タンパク質産生細胞が前記目的の抗原に曝露されるように、前記目的の抗原を備える、請求項１の方法。
  6. 前記タンパク質産生細胞を前記目的の抗原又は前記タンパク質特異的抗体に曝露することは、前記タンパク質産生細胞を遊離型の前記目的の抗原に曝露することを含む、請求項１の方法。
  7. 前記タンパク質産生細胞を前記目的の抗原又は前記タンパク質特異的抗体に曝露することは、前記タンパク質産生細胞をビーズと細胞とから選択された物体に付随する前記タンパク質特異的抗体に曝露することを含む、請求項１の方法。
  8. 前記タンパク質産生細胞を前記目的の抗原又は前記タンパク質特異的抗体に曝露することは、前記タンパク質産生細胞を細胞とビーズとから選択された物体に結合された前記目的の抗原に曝露することを含む、請求項１の方法。
  9. 前記目的タンパク質は、前記目的の抗原に特異的な抗体を備え、前記標識化抗体は、前記目的タンパク質に特異的な標識された二次抗体を備える、請求項１の方法。
  10. 抗原特異的抗体を産生する細胞を検出する方法であって、
    抗体産生細胞を含む標本を得ることと、
    前記抗体産生細胞に特異的なマーカに結合するよう構成された第１部分と、目的の抗原に結合するよう構成された第２部分と、を有する架橋試薬で前記抗体産生細胞を標識することと、
    前記抗体産生細胞が前記架橋試薬を介して前記目的の抗原に結合されるように、前記抗体産生細胞を前記目的の抗原に曝露することと、
    前記抗体産生細胞の一部が前記目的の抗原に結合する前記抗原特異的抗体を産生するように、前記抗体産生細胞に抗体を産生させることと、
    前記抗体産生細胞を前記抗原特異的抗体に結合するよう構成された標識化二次抗体に曝露することと、
    前記標識化二次抗体により標識された細胞を同定することと、
    を備える方法。
  11. 前記架橋試薬の前記第１部分は、前記抗体産生細胞に特異的な前記マーカに結合するよう構成された第１のＦＡＢ断片を備える、請求項１０の方法。
  12. 前記架橋試薬の前記第２部分は、前記目的の抗原に結合するよう構成された第２のＦＡＢ断片を備える、請求項１０の方法。
  13. 前記架橋試薬の前記第２部分は、前記抗体産生細胞が前記架橋試薬で標識されたときに前記抗体産生細胞が前記目的の抗原に曝露されるように、前記目的の抗原を備える、請求項１０の方法。
  14. 前記抗体産生細胞を前記目的の抗原に曝露することは、前記抗体産生細胞を、前記目的の抗原を結合されている基質に曝露することを含む、請求項１０の方法。
  15. 前記基質は、ビーズと、細胞と、前記ビーズと前記細胞との組み合わせと、からなる群から選択される、請求項１４の方法。
  16. 前記抗体産生細胞を前記目的の抗原に曝露することは、前記抗体産生細胞を遊離型の前記目的の抗原に曝露することを含む、請求項１０の方法。
  17. 目的タンパク質を産生する細胞を同定する方法であって、
    タンパク質産生細胞を含む標本を得ることと、
    前記タンパク質産生細胞に特異的な細胞表面マーカに結合するよう適合された第１部分と、前記目的タンパク質に特異的なタンパク質特異的抗体に結合されるよう構成された第２部分と、を備えた架橋試薬で前記タンパク質産生細胞を標識することと、
    前記タンパク質産生細胞が前記架橋試薬を介して前記タンパク質特異的抗体に結合されるように、前記タンパク質産生細胞を前記タンパク質特異的抗体に曝露することと、
    前記タンパク質産生細胞に前記目的タンパク質を産生させることと、
    前記タンパク質産生細胞を前記目的タンパク質に結合するよう適合された標識化抗体に曝露することと、
    前記標識化抗体により標識された細胞を同定することと、
    を備える方法。
  18. 前記架橋試薬の前記第１部分は、前記タンパク質産生細胞に特異的な前記マーカに結合するよう構成された第１のＦＡＢ断片を備える、請求項１７の方法。
  19. 前記タンパク質産生細胞を前記タンパク質特異的抗体に曝露する前記ステップは、前記タンパク質産生細胞を、前記タンパク質特異的抗体を結合されている基質に曝露することを含む、請求項１７の方法。
  20. 前記基質は、ビオチン／ストレプトアビジン結合を介して前記架橋試薬の前記第１部分に結合される、請求項１９の方法。
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