TW202402793A - 對抗體分泌細胞映射抗原特異性之方法 - Google Patents

對抗體分泌細胞映射抗原特異性之方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供抗體捕獲複合物以及捕獲由抗體分泌細胞所分泌之目標抗體的方法。

Description

對抗體分泌細胞映射抗原特異性之方法
序列表的引用
本件申請案包括以XML檔案電子申請的序列表，名為381203742SEQ，創建於2023年3月10日，大小為824個千位元組。序列表以引用的方式併入本文。
本發明部分涉及抗體捕獲複合物以及對抗體分泌細胞映射抗原特異性的方法。
B細胞在其表面上表現B細胞受體(BCR)，從而可以確定抗原特異性B細胞圖譜剖析(repertoire profiling)。雖然有多個平台可用於從表現細胞表面BCR的B細胞中發現抗體，但經分離抗體從低親和力到高親和力不等。在受到同源抗原活化後，B細胞對其BCR進行微調，並可能最終分化為抗體分泌細胞(ASC)。抗體分泌細胞是一種特化的細胞類型，代表B細胞分化程式的末期，且包含漿母細胞、短壽命漿細胞和長壽命漿細胞(或更常見簡稱為「漿細胞」(PC)；Tellier and Nutt, Eur. J. Immunol., 2019, 49, 30-37)。這些ASC可以產生具有治療或預防潛力的高親和力抗體。然而，ASC也可能是抗體媒介的病理學的起源。
雖然在流式細胞分析分離後，可以很容易地選殖並定序來自在其細胞表面上表現BCR的B細胞的抗原特異性抗體，但目前無法以高通量方式輕鬆剖析PC (不表現細胞表面BCR的ASC)。而且儘管PC可能是極高親和力抗體的來源，但無法快速確定任何給定分泌抗體的特異性。由於當前平台對PC的應用有局限性，長期以來有效地將給定抗體與分泌它的BCR -PC配對，以及有效地確定該抗體的抗原特異性的需求一直存在著且未獲得解決。
本發明提供一種抗體捕獲複合物，其包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分；其中結合對的第一組分能夠與結合對的第二組分進行結合；其中抗體捕獲分子能夠結合至目標抗體，其中目標抗體是由抗體分泌細胞所分泌。在一些具體例中，當結合對的第二組分是生物素而結合對的第一組分是鏈球菌親生物素蛋白(streptavidin)時，抗體捕獲分子不結合至目標抗體的κ輕鏈。
本發明還提供捕獲由抗體分泌細胞所分泌之目標抗體的方法，該方法包含：使一群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸以允許結合對的第二組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞；使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含結合至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，由此結合對的第一組分結合至抗體分泌細胞的細胞表面上的結合對的第二組分，且由此抗體捕獲分子捕獲抗體分泌細胞所分泌的目標抗體；以及使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原。
本發明還提供捕獲由抗體分泌細胞所分泌之目標抗體的方法，該方法包含：使一群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，其中抗體捕獲複合物包含結合至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞表面上的結合對的第二組分，且藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原。
本發明還提供捕獲由抗體分泌細胞所分泌之IgE抗體的方法，其中IgE抗體是針對過敏原，該方法包含：使一群抗體分泌細胞與NHS-生物素接觸以允許生物素結合至細胞表面，其中該群抗體分泌細胞包含分泌IgE抗體的抗體分泌細胞；使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至高親和力IgE受體的胞外域(FcεRIa)的鏈球菌親生物素蛋白，藉此抗體捕獲分子結合至由抗體分泌細胞所分泌的IgE抗體細胞；以及使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，其中抗原是過敏原的抗原部分或多個抗原部分的混合物，藉此被抗體捕獲複合物捕獲的IgE抗體結合至抗原。
在本文揭示之方法的一些具體例中，該等方法進一步包含，在該群抗體分泌細胞與抗原接觸後，分選抗體分泌細胞以收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的抗體分泌細胞各自分泌被抗體捕獲分子捕獲並被抗原結合的抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包括分泌目標抗體的抗體分泌細胞。在本文揭示之方法的一些具體例中，該等方法進一步包含將收集的抗體分泌細胞庫分離成單細胞並分離出分泌目標抗體的抗體分泌細胞。在一些具體例中，從分泌目標抗體的抗體分泌細胞分離編碼抗體的核酸。
在本文揭示之方法的一些具體例中，使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟包含：(a)使該群抗體分泌細胞與抗原的第一標記形式接觸以允許抗原結合至在該群抗體分泌細胞的細胞表面上所捕獲的抗體，該等抗體包括在抗體分泌細胞的細胞表面上所捕獲的目標抗體，其中抗原的第一標記形式結合至第一可偵測標記；(b)洗滌該群抗體分泌細胞以去除未結合的抗原；(c)使該群抗體分泌細胞與(i)抗原的未標記形式、(ii)抗原的第二標記形式，或(iii)抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式接觸；(d)洗滌該群抗體分泌細胞以去除未結合的抗原，以及(e)收集維持著結合至抗原的第一標記形式的抗體分泌細胞庫，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，且其中由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體維持著結合至抗原的第一標記形式。
在本文揭示之方法的一些具體例中，在收集維持著結合至抗原的第一標記形式的抗體分泌細胞庫後，該等方法進一步包含將收集的抗體分泌細胞庫分離成單細胞並分離分泌目標抗體的抗體分泌細胞。在一些具體例中，編碼抗體的核酸分離自分泌目標抗體的抗體分泌細胞。
本發明還提供鑑定編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由包含經修飾細胞表面的細胞分泌，且其中目標抗體隨後被捕獲在經修飾細胞表面上，該等方法包含：a)提供包含經修飾細胞表面的抗體分泌細胞，其中抗體分泌細胞分泌目標抗體，其中目標抗體隨後被捕獲在經修飾細胞表面上，其中被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體結合至抗原，其中抗原連接至條碼核酸分子，且其中抗體分泌細胞進一步包含核酸分子，該核酸分子包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之目標抗體的抗原結合片段的基因區；b)使條碼核酸分子的一部分與附接於固體表面的第一核酸分子的一部分雜交；c)使包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接於固體表面的第二核酸分子的一部分雜交；d)製備抗體分泌細胞的基因表現之第一擴增子庫，抗體分泌細胞可變區、多樣性區和接合區(VDJ)之第二擴增子庫，以及抗原條碼核酸分子之第三擴增子庫；e)對三個擴增子庫中的各者進行定序；以及f)鑑定編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區。
本發明還提供鑑定編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由抗體分泌細胞所分泌，該等方法包含：a)使一群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸，以允許結合對的第二組分結合至細胞表面，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞；b)使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面上的結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲由抗體分泌細胞所分泌的目標抗體；c)使該群抗體分泌細胞與二級抗-Ig抗體接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合二級抗-Ig抗體；d)使該群抗體分泌細胞與包含條碼核酸分子的抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原；e)收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的每個細胞分泌一種被抗體捕獲複合物捕獲、被二級抗-Ig抗體且被包含條碼核酸分子的抗原所結合的抗體，且其中抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞；f)將抗體分泌細胞庫分離成單抗體分泌細胞，並且針對各個單抗體分泌細胞：1)使條碼核酸分子的一部分與附接於固體表面的第一核酸分子的一部分雜交，其中固體表面和附接其上的第一核酸分子對於各個單抗體分泌細胞是獨特的；2)使包含編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接於固體表面的第二核酸分子的一部分雜交；3)製備基因表現之第一擴增子庫、可變區、多樣性區和接合區(VDJ)之第二擴增子庫，和抗原條碼核酸分子之第三擴增子庫；及4)對三個擴增子庫中的各者進行定序；以及g)鑑定編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區。
本發明還提供鑑定編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由抗體分泌細胞所分泌，該等方法包含：a)使一群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面上的結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲由抗體分泌細胞所分泌的目標抗體；b)使該群抗體分泌細胞與二級抗-Ig抗體接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合二級抗-Ig抗體；c)使該群抗體分泌細胞與包含條碼核酸分子的抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原；d)收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的各個細胞分泌一種被抗體捕獲複合物捕獲、被二級抗-Ig抗體和包含條碼核酸分子的抗原結合的抗體，且其中抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞；e)將抗體分泌細胞庫分離成單抗體分泌細胞，並且針對各個單抗體分泌細胞：1)使條碼核酸分子的一部分與附接於固體表面的第一核酸分子的一部分雜交，其中固體表面和附接其上的第一核酸分子對於各個單抗體分泌細胞都是獨特的；2)使編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接於固體表面的第二核酸分子的一部分雜交；3)製備基因表現之第一擴增子庫，可變區、多樣性區和接合區(VDJ)之第二擴增子庫，和抗原條碼核酸分子之第三擴增子庫；及4)對三個擴增子庫中的每一者進行定序；以及f)鑑定編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區。
此處使用的術語僅用於描述特定具體例為目的，並不希望具有限制性。
在通篇說明書和申請專利範圍中使用了與本發明態樣有關的各種術語。除非另有說明，否則這些術語將被賦予它們在本領域中的普通含義。其他具體定義的術語將以與本文提供的定義一致的方式來解釋。
除非另有明確說明，否則不希望本文闡述的任何方法或態樣解釋為其步驟需要以特定順序執行。因此，如果方法請求項沒有在申請專利範圍或說明中具體說明步驟限於特定順序，則在任何態樣中都無意推斷出順序。這適用於任何可能的未表述的解釋基礎，包括與步驟或操作流程的安排有關的邏輯問題、從語法組織或標點符號中得出的簡單含義，或者說明書中所述態樣的數量或類型。
如本文所用，單數形式「一(a、an)」和「該(the)」包括複數對象，除非上下文另有明確指定。
如本文所用，術語「約」表示所列舉的數值是近似值並且少許變化不會明顯影響到所揭示之具體例的實施。在使用數值的情況下，除非上下文另有說明，否則術語「約」表示數值可以變化達±10%並且維持在所揭示之具體例的範圍內。
如本文所用，術語「包含」可根據需要在特定具體例中替換為「由…組成」或「基本上由…組成」。
如本文所用，術語「核酸」、「核酸分子」、「核酸序列」、「多核苷酸」或「寡核苷酸」可包含任何長度的聚合形式的核苷酸，可包含DNA及/或RNA，並且可以是單股的、雙股的或多股的。核酸的一股也指其互補股。
如本文所用，術語「抗體」可包含完整的免疫球蛋白分子、包含抗原結合片段的斷裂免疫球蛋白分子、沒有免疫球蛋白分子的任何其他片段的抗原結合片段。
本發明提供抗體捕獲複合物，其包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分；其中結合對的第一組分能夠與結合對的第二組分進行結合；其中抗體捕獲分子能夠結合至目標抗體，其中目標抗體由抗體分泌細胞所分泌。在一些具體例中，當結合對的第二組分是生物素而結合對的第一組分是鏈球菌親生物素蛋白時，抗體捕獲分子不結合至目標抗體的κ輕鏈。
在一些具體例中，結合對的第一組分包含第一試劑而第二組分包含第二試劑，其中第一試劑和第二試劑形成鍵。
在一些具體例中，結合對的第一組分包含抗生物素蛋白、鏈球菌親生物素蛋白或抗生物素，而結合對的第二組分包含生物素。在一些具體例中，結合對的第一組分包含生物素而結合對的第二組分包含抗生物素蛋白及/或鏈球菌親生物素蛋白。在一些具體例中，結合對的第一組分包含生物素而結合對的第二組分包含抗生物素。在一些具體例中，結合對的第一組分包含jun和fos中的一者，而結合對的第二組分包含jun和fos中的另一者。在一些具體例中，結合對的第一組分包含mad和max中的一者，而結合對的第二組分包含mad和max中的另一者。在一些具體例中，結合對的第一組分包含myc和max中的一者，而結合對的第二組分包含myc和max中的另一者。在一些具體例中，結合對的第一組分包含疊氮化物和炔烴中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和炔烴中的另一者。在一些具體例中，結合對的第一組分包含疊氮化物和膦中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和膦中的另一者。
在一些具體例中，結合對的第二組分包含抗體分泌細胞的表面標記，而結合對的第一組分包含結合至表面標記的抗體。在一些具體例中，細胞表面標記包含CD27、CD38、CD45、CD138、CD98、CD78、CD319、CXCR4、BCMA、GPRC5D、FCRL5、CD19、Ly6D、CD52或跨膜活化因子鈣調節因子和親環蛋白配體交互作用因子(TACI)。在一些具體例中，細胞表面標記包含CD27。在一些具體例中，細胞表面標記包含CD38。在一些具體例中，細胞表面標記包括CD45。在一些具體例中，細胞表面標記包含CD138。在一些具體例中，細胞表面標記包含CD98。在一些具體例中，細胞表面標記包含CD78。在一些具體例中，細胞表面標記包含CD319。在一些具體例中，細胞表面標記包含CXCR4。在一些具體例中，細胞表面標記包含BCMA。在一些具體例中，細胞表面標記包含GPRC5D。在一些具體例中，細胞表面標記包含FCRL5。在一些具體例中，細胞表面標記包含CD19。在一些具體例中，細胞表面標記包含Ly6D。在一些具體例中，細胞表面標記包含CD52。在一些具體例中，細胞表面標記包含TACI。
在一些具體例中，結合對的第二組分包含介白素6受體(IL-6R)，而結合對的第一組分包含抗IL-6R抗體、介白素6 (IL-6)，及/或能夠結合至IL-6R的IL-6片段。在一些具體例中，結合對的第二組分包含CD27，而結合對的第一組分包含抗CD27抗體、CD70及/或能夠結合至CD27的CD70片段。
在一些具體例中，結合對的第二組分包含異硫氰酸螢光素(FITC)，而結合對的第一組分包含抗FITC抗體。在一些具體例中，結合對的第二組分包含螢光素，而結合對的第一組分包含抗螢光素抗體。在一些具體例中，結合對的第二組分包含藻紅素(PE)，而結合對的第一組分包含抗PE抗體。在一些具體例中，結合對的第二組分包含APC，而結合對的第一組分包含抗APC抗體。在一些具體例中，結合對的第二組分包含BV421，而結合對的第一組分包含抗BV421抗體。在一些具體例中，結合對的第二組分包含BV510，而結合對的第一組分包含抗BV510抗體。在一些具體例中，結合對的第二組分包含BV605，而結合對的第一組分包含抗BV605抗體。在一些具體例中，結合對的第二組分包含BV650，而結合對的第一組分包含抗BV650抗體。在一些具體例中，結合對的第二組分包含BV711，而結合對的第一組分包含抗BV711抗體。在一些具體例中，結合對的第二組分包含BV786，而結合對的第一組分包含抗BV786抗體。
在一些具體例中，抗體捕獲分子包含捕獲抗體。
在一些具體例中，捕獲抗體包含抗Fc抗體。在一些具體例中，捕獲抗體包含抗Fcγ抗體、抗Fcα抗體或抗Fcε抗體。在一些具體例中，捕獲抗體包含抗Fcγ抗體。在一些具體例中，捕獲抗體包含抗Fcα抗體。在一些具體例中，捕獲抗體包含抗Fcε抗體。在一些具體例中，抗Fcγ抗體包含抗FcγRI抗體、抗FcγRIIA抗體、抗FcγRIIB抗體、抗FcγRIIB1抗體、抗FcγRIIB2抗體、抗FcγRIIIA抗體及/或FcγRIIIB抗體。在一些具體例中，抗Fcγ抗體包含抗FcγRI抗體。在一些具體例中，抗Fcγ抗體包含抗FcγRIIA抗體。在一些具體例中，抗Fcγ抗體包含抗FcγRIIB抗體。在一些具體例中，抗Fcγ抗體包含抗FcγRIIB1抗體。在一些具體例中，抗Fcγ抗體包含抗FcγRIIB2抗體。在一些具體例中，抗Fcγ抗體包含抗FcγRIIIA抗體。在一些具體例中，抗Fcγ抗體包含抗FcγRIIIB抗體。在一些具體例中，抗Fcα抗體包含抗FcαRI抗體。在一些具體例中，抗Fcε抗體包含抗FcεRI抗體或抗FcεRII抗體。在一些具體例中，抗Fcε抗體包含抗FcεRI抗體。在一些具體例中，抗Fcε抗體包含抗FcεRII抗體。
在一些具體例中，捕獲抗體包含抗輕鏈κ抗體及/或抗輕鏈λ抗體。在一些具體例中，捕獲抗體包含抗輕鏈κ抗體。在一些具體例中，捕獲抗體包含抗輕鏈λ抗體。
在一些具體例中，捕獲抗體包含抗Ig抗體。
在一些具體例中，捕獲抗體包含抗IgM抗體。
在一些具體例中，捕獲抗體包含抗IgG抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含抗IgG1抗體、抗IgG2抗體、抗IgG2a抗體、抗IgG2b抗體、抗IgG3抗體及/或抗IgG4抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含抗IgG1抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含抗IgG2抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含抗IgG2a抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含抗IgG2b抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含抗IgG3抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含抗IgG4抗體。
在一些具體例中，捕獲抗體包含抗IgA抗體。在一些具體例中，抗IgA抗體包含抗IgA1抗體、抗IgA2抗體、抗分泌型IgA抗體或聚合抗IgA抗體。在一些具體例中，抗IgA抗體包含抗IgA1抗體。在一些具體例中，抗IgA抗體包含抗IgA2抗體。在一些具體例中，抗IgA抗體包含抗分泌型IgA抗體。在一些具體例中，抗IgA抗體包含聚合抗IgA抗體。
在一些具體例中，捕獲抗體包含抗IgE抗體。
在一些具體例中，抗體捕獲分子包含Fc受體或Fc受體的胞外域。在一些具體例中，Fc受體包含Fcγ受體、Fcα受體及/或Fcε受體。在一些具體例中，Fc受體包含Fcγ受體。在一些具體例中，Fc受體包含Fcα受體。在一些具體例中，Fc受體包含Fcε受體。在一些具體例中，Fcγ受體包含FcγRI受體、FcγRIIA受體、FcγRIIB受體、FcγRIIB1受體、FcγRIIB2受體、FcγRIIIA受體、FcγRIIIB受體及/或FcRn受體。在一些具體例中，Fcγ受體包含FcγRI受體。在一些具體例中，Fcγ受體包含FcγRIIA受體。在一些具體例中，Fcγ受體包含FcγRIIB受體。在一些具體例中，Fcγ受體包含FcγRIIB1受體。在一些具體例中，Fcγ受體包含FcγRIIB2受體。在一些具體例中，Fcγ受體包含FcγRIIIA受體。在一些具體例中，Fcγ受體包含FcγRIIIB受體。在一些具體例中，Fcγ受體包含FcRn受體。在一些具體例中，Fcα受體包含FcαRI受體及/或Fcα/μR受體。在一些具體例中，Fcα受體包含FcαRI受體。在一些具體例中，Fcα受體包含Fcα/μR受體。在一些具體例中，Fcε受體包含FcεRI受體及/或FcεRII受體。在一些具體例中，Fcε受體包含FcεRI受體。在一些具體例中，Fcε受體包含FcεRII受體。在一些具體例中，Fc受體包含能夠結合Fc的Fc受體片段。
在一些具體例中，抗體捕獲分子包含蛋白A、能夠結合至Fc區的一部分的蛋白A片段、蛋白G及/或能夠結合至Fc區的一部分的蛋白G片段。在一些具體例中，抗體捕獲分子包含蛋白A。在一些具體例中，抗體捕獲分子包含能夠結合至Fc區的一部分的蛋白A片段。在一些具體例中，抗體捕獲分子包含蛋白G。在一些具體例中，抗體捕獲分子包含能夠結合至Fc區的一部分的蛋白G片段。在一些具體例中，抗體捕獲分子包含蛋白L及/或能夠結合至輕鏈的一部分的蛋白L片段。在一些具體例中，抗體捕獲分子包含蛋白L。在一些具體例中，抗體捕獲分子包含能夠結合至輕鏈的一部分的蛋白L片段。
在一些具體例中，抗體捕獲複合物包含連接至高親和力IgE受體(FcεRIa)的胞外域的抗生物素蛋白或鏈球菌親生物素蛋白。在一些具體例中，抗體捕獲複合物包含連接至FcεRIa的抗生物素蛋白。
在一些具體例中，抗體捕獲複合物包含連接至FcεRIa的鏈球菌親生物素蛋白。 目標抗體
在一些具體例中，目標抗體包含IgM抗體。
在一些具體例中，目標抗體包含IgG抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含IgG1抗體、IgG2抗體、IgG2a抗體、IgG2b抗體、IgG3抗體及/或IgG4抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含IgG1抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含IgG2抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含IgG2a抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含IgG2b抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含IgG3抗體。在一些具體例中，抗IgG抗體包含IgG4抗體。
在一些具體例中，目標抗體包含IgA抗體。在一些具體例中，IgA抗體包含IgA1抗體、IgA2抗體、分泌型IgA抗體或聚合IgA抗體。在一些具體例中，IgA抗體包含IgA1抗體。在一些具體例中，IgA抗體包含IgA2抗體。在一些具體例中，IgA抗體包含分泌型IgA抗體。在一些具體例中，IgA抗體包含聚合IgA抗體。
在一些具體例中，目標抗體包含IgE抗體。 目標抗原
在一些具體例中，目標抗體的目標，即目標抗體結合的抗原，是過敏原。在一些具體例中，過敏原包括動物產品的成分、藥物、食品、存在於毒液中的物質、存在於叮咬昆蟲的唾液中的物質、黴菌孢子、化妝品、金屬、乳膠、木頭，及/或植物花粉。在一些具體例中，過敏原包含動物產品的成分。在一些具體例中，過敏原包含藥物。在一些具體例中，過敏原包含食品。在一些具體例中，過敏原包含存在於毒液中的物質。在一些具體例中，過敏原包含存在於叮咬昆蟲的唾液中的物質。在一些具體例中，過敏原包含黴菌孢子。在一些具體例中，過敏原包含化妝品。在一些具體例中，過敏原包含金屬。在一些具體例中，過敏原包含乳膠。在一些具體例中，過敏原包含木頭。在一些具體例中，過敏原包含植物花粉。
在一些具體例中，動物產品包含Bla g、Bla g 1、Bla g 2、Bla g 3、Bla g 3、Bla g 4、Bla g 5、Bla g 6、Bla g 7、Bla g 8、Bla g 9、Bla g 11、Per a、Per a 1、Per a 2、Per a 3、Per a 6、Per a 7、Per a 9、Per a 10、Per a 11、Per a 12、Der p 1、Der p 2、Der f 1、Eur m 1、Pso o 1、Equ c 1、Fel d 1、Fel d 4、Mus m 1、Rat n 1、塵蟎肌旋蛋白，貝類肌旋蛋白及/或蟑螂肌旋蛋白。在一些具體例中，動物產品包含Bla g。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 1。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 2。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 3。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 3。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 4。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 5。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 6。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 7。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 8。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 9。在一些具體例中，動物產品包含Bla g 11。在一些具體例中，動物產品包含Per a。在一些具體例中，動物產品包含Per a 1。在一些具體例中，動物產品包含Per a 2。在一些具體例中，動物產品包含Per a 3。在一些具體例中，動物產品包含Per a 6。在一些具體例中，動物產品包含Per a 7。在一些具體例中，動物產品包含Per a 9。在一些具體例中，動物產品包含Per a 10。在一些具體例中，動物產品包含Per a 11。在一些具體例中，動物產品包含Per a 12。在一些具體例中，動物產品包含Der p 1。在一些具體例中，動物產品包含Der p 2。在一些具體例中，動物產品包含Der f 1。在一些具體例中，動物產品包含Eur m 1。在一些具體例中，動物產品包含Pso o 1。在一些具體例中，動物產品包含Equ c 1。在一些具體例中，動物產品包含Fel d 1。在一些具體例中，動物產品包含Fel d 4。在一些具體例中，動物產品包含Mus m 1。在一些具體例中，動物產品包含Rat n 1。在一些具體例中，動物產品包含塵蟎肌旋蛋白。在一些具體例中，動物產品包含貝類肌旋蛋白。在一些具體例中，動物產品包含蟑螂肌旋蛋白。
在一些具體例中，動物產品包含動物毛皮、動物皮屑、蟑螂萼(calyx)、羊毛及/或塵蟎分泌物。在一些具體例中，動物產品包含動物毛皮。在一些具體例中，動物產品包含動物皮屑。在一些具體例中，動物產品包含蟑螂萼。在一些具體例中，動物產品包含羊毛。在一些具體例中，動物產品包含塵蟎分泌物。
在一些具體例中，藥物包括青黴素、磺胺劑、水楊酸鹽及/或新黴素。在一些具體例中，藥物包含青黴素。在一些具體例中，藥物包含磺胺劑。在一些具體例中，藥物包含水楊酸鹽。在一些具體例中，藥物包含新黴素。
在一些具體例中，食品包括芹菜、根芹菜、玉米(corn)、玉米(maize)、蛋、水果、南瓜、茄子、豆類、奶、海鮮、芝麻、大豆、核果、小麥及/或秘魯香脂。在一些具體例中，食品包含芹菜。在一些具體例中，食品包含根芹菜。在一些具體例中，食品包含玉米。在一些具體例中，食品包含玉米。在一些具體例中，食品包含蛋。在一些具體例中，食品包含水果。在一些具體例中，食品包含南瓜。在一些具體例中，食品包含茄子。在一些具體例中，食品包含豆類。在一些具體例中，食品包含奶。在一些具體例中，食品包含海鮮。在一些具體例中，食品包含芝麻。在一些具體例中，食品包含大豆。在一些具體例中，食品包含核果。在一些具體例中，食品包含小麥。在一些具體例中，食品包含秘魯香脂。在一些具體例中，豆類包含豆、豌豆、花生或大豆。在一些具體例中，豆類包含豆。在一些具體例中，豆類包含豌豆。在一些具體例中，豆類包含花生。在一些具體例中，豆類包含大豆。在一些具體例中，核果包括胡桃及/或杏仁。在一些具體例中，核果包括胡桃。在一些具體例中，核果包含杏仁。
在一些具體例中，存在於毒液中的物質包含存在於蜂蜇毒液中的物質及/或存在於胡蜂蜇毒液中的物質。在一些具體例中，存在於毒液中的物質包含存在於蜂蜇毒液中的物質。在一些具體例中，存在於毒液中的物質包括存在於胡蜂蜇毒液中的物質。
在一些具體例中，叮咬昆蟲是蚊子或蜱。在一些具體例中，叮咬昆蟲是蚊子。在一些具體例中，叮咬昆蟲是蜱。在一些具體例中，叮咬昆蟲中的過敏原存在於唾液中。在一些具體例中，過敏原包含寡糖。在一些具體例中，過敏原包含半乳糖-α-1,3-半乳糖或半乳糖-α-1,3-半乳糖-β-1,4-N-乙醯葡萄糖胺。
在一些具體例中，化妝品包含香料及/或四級銨鹽-15。在一些具體例中，化妝品包含香料。在一些具體例中，化妝品包含四級銨鹽-15。
在一些具體例中，金屬包含鎳及/或鉻。在一些具體例中，金屬包含鎳。在一些具體例中，金屬包含鉻。
在一些具體例中，植物花粉包含草花粉、雜草花粉及/或樹花粉。在一些具體例中，植物花粉包含草花粉。在一些具體例中，植物花粉包含雜草花粉。在一些具體例中，植物花粉包含樹花粉。在一些具體例中，草花粉包含黑麥草花粉及/或貓尾草花粉。在一些具體例中，草花粉包含黑麥草花粉。在一些具體例中，草花粉包含貓尾草花粉。在一些具體例中，雜草花粉包含豬草花粉、車前子花粉、蕁麻花粉、艾蒿物種的花粉、藜物種的花粉或蓼花粉。在一些具體例中，雜草花粉包含豬草花粉。在一些具體例中，雜草花粉包含車前子花粉。在一些具體例中，雜草花粉包含蕁麻花粉。在一些具體例中，雜草花粉包含艾蒿物種的花粉。在一些具體例中，雜草花粉包含藜物種的花粉。在一些具體例中，雜草花粉包含蓼花粉。在一些具體例中，樹花粉包含樺樹花粉、赤楊花粉、榛樹花粉、千金榆花粉、七葉樹屬花粉、柳樹花粉、楊樹花粉、法國梧桐屬花粉、椴樹屬花粉、洋橄欖屬花粉、刺柏(Ashe juniper)的花粉，或黑板樹(Alstonia scholaris)物種的花粉。在一些具體例中，樹花粉包含樺樹花粉。在一些具體例中，樹花粉包含赤楊花粉。在一些具體例中，樹花粉包含榛樹花粉。在一些具體例中，樹花粉包含千金榆花粉。在一些具體例中，樹花粉包含七葉樹屬的花粉。在一些具體例中，樹花粉包含柳樹花粉。在一些具體例中，樹花粉包含楊樹花粉。在一些具體例中，樹木花粉包含法國梧桐屬的花粉。在一些具體例中，樹木花粉包含椴樹屬的花粉。在一些具體例中，樹花粉包含洋橄欖屬的花粉。在一些具體例中，樹花粉包含刺柏的花粉。在一些具體例中，樹花粉包含黑板樹物種的花粉。在一些具體例中，植物花粉包含橄欖樹花粉。在一些具體例中，過敏原包含Ole e 1。
在一些具體例中，過敏原包含來自橡樹( Quercus albus)、日本柳杉樹( Cryptomeria japonica)或來自榆樹或山核桃樹的過敏原。
在一些具體例中，過敏原包含狗過敏原，諸如Can f蛋白。在一些具體例中，過敏原包含牛奶過敏原或牛肉蛋白，諸如Bos d 2-13。在一些具體例中，過敏原包含雞過敏原(例如Gal d蛋白)、豬過敏原(即Sus s蛋白)或血清白蛋白。在一些具體例中，過敏原包含魚類過敏原(例如Gad c/Gad m/Pan h/Sals s蛋白)。在一些具體例中，過敏原包含小白蛋白。
在本文所述的任何具體例中，過敏原可以用非過敏原化合物(諸如例如外來抗原)替代。在一些具體例中，外來抗原包含冠狀病毒的刺突蛋白。在一些具體例中，外來抗原包含來自宿主的突變肽。在一些具體例中，外來抗原包含來自另一個物種的蛋白質。在一些具體例中，外來抗原包含來自傳染病的化合物，諸如SARS-CoV-2或流感病毒。
在一些具體例中，抗體分泌細胞是漿細胞。在一些具體例中，抗體分泌細胞是漿母細胞。在一些具體例中，漿細胞是短壽命漿細胞。在一些具體例中，漿細胞是長壽命漿細胞。 捕獲抗體分泌細胞所分泌之目標抗體的方法
本發明還提供捕獲抗體分泌細胞所分泌之目標抗體的方法，該等方法包含：使一群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸以允許結合對的第二組分結合至細胞表面，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞；使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至抗體分泌細胞細胞表面上之結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲抗體分泌細胞所分泌的目標抗體；以及使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，以允許由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原。在一些具體例中，該方法進一步包含，在使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸之後，使該群抗體分泌細胞與二級抗Ig抗體接觸。可以在使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟之前、同時或之後進行與二級抗Ig抗體接觸的步驟。
本發明還提供捕獲由抗體分泌細胞所分泌之目標抗體的方法，該方法包含：使一群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞細胞表面上的結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲抗體分泌細胞所分泌的目標抗體；以及使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原。在一些具體例中，該方法進一步包含，在使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸之後，使該群抗體分泌細胞與二級抗Ig抗體接觸。可以在使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟之前、同時或之後進行與二級抗Ig抗體接觸的步驟。
在一些具體例中，在該群抗體分泌細胞與抗原接觸後，該方法進一步包含對該群抗體分泌細胞進行分選以收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的抗體分泌細胞各自分泌被抗體捕獲分子捕獲並被抗原結合的抗體，其中收集的該抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗原分泌細胞；且在一些這樣的具體例中，該方法可以進一步包含將收集的抗體分泌細胞庫分離成單個細胞並分離出分泌目標抗體的抗原分泌細胞。
在一些具體例中，抗原是條碼抗原。在一些具體例中，抗原包含過敏原。在一些具體例中，條碼抗原包含條碼核酸分子。在一些具體例中，條碼核酸分子的核苷酸序列的一部分對抗原是獨特的。在一些具體例中，條碼核酸分子的一部分包含定序引子。在一些具體例中，定序引子在對抗原獨特的條碼核酸分子的一部分核苷酸序列的上游。在一些具體例中，條碼核酸分子的一部分與模板轉換寡核苷酸(TSO)互補。在一些具體例中，條碼核酸分子的一部分核苷酸序列對抗原是獨特的，在條碼核酸分子的該部分上游，並且與TSO互補。在一些具體例中，條碼核酸分子的3'端包含三個連續的胞苷或核糖胞苷殘基。在一些具體例中，條碼核酸分子包含DNA。在一些具體例中，條碼核酸分子包含RNA。
在一些具體例中，該群抗體分泌細胞與多個條碼抗原接觸，其中多個條碼抗原中的各個條碼抗原包含連接至獨特核酸分子的獨特抗原。在一些具體例中，獨特抗原包含過敏原。在一些具體例中，獨特核酸分子包含條碼核酸分子。
在一些具體例中，多個條碼抗原中的各個條碼抗原被可偵測地標記。在一些具體例中，多個條碼抗原中的各個條碼抗原用放射性化合物、螢光化合物或酶標記。在一些具體例中，多個條碼抗原中的各個條碼抗原用放射性化合物標記。在一些具體例中，多個條碼抗原中的各個條碼抗原用螢光化合物標記。在一些具體例中，多個條碼抗原中的各個條碼抗原用酶標記。在一些具體例中，放射性化合物包含 3H、 14C、 19F、 35S、 125I、 131I、 111In或 99Tc。在一些具體例中，放射性化合物包含 3H。在一些具體例中，放射性化合物包含 14C。在一些具體例中，放射性化合物包含 19F。在一些具體例中，放射性化合物包含 35S。在一些具體例中，放射性化合物包含 125I。在一些具體例中，放射性化合物包含 131I。在一些具體例中，放射性化合物包含 111In。在一些具體例中，放射性化合物包含 99Tc。在一些具體例中，螢光化合物包含螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素或螢光蛋白。在一些具體例中，螢光化合物包含螢光素。在一些具體例中，螢光化合物包含異硫氰酸螢光素。在一些具體例中，螢光化合物包含羅丹明。在一些具體例中，螢光化合物包含5-二甲胺-1-萘磺醯氯。在一些具體例中，螢光化合物包含藻紅素。在一些具體例中，螢光化合物包含螢光蛋白。在一些具體例中，酶包含鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或葡萄糖氧化酶。在一些具體例中，酶包含鹼性磷酸酶。在一些具體例中，酶包含辣根過氧化物酶。在一些具體例中，酶包含螢光素酶。在一些具體例中，酶包含葡萄糖氧化酶。
在採用二級抗Ig抗體的具體例中，在一些這樣的具體例中，二級抗Ig抗體包含抗IgM抗體、抗IgG抗體、抗IgA抗體及/或抗IgE抗體。在一些具體例中，二級抗Ig抗體包含抗IgM抗體。在一些具體例中，二級抗Ig抗體包含抗IgG抗體。在一些具體例中，二級抗Ig抗體包含抗IgA抗體。在一些具體例中，二級抗Ig抗體包含抗IgE抗體。
在一些具體例中，二級抗Ig抗體被可偵測地標記。在一些具體例中，二級抗Ig抗體用放射性化合物、螢光化合物或酶標記。在一些具體例中，二級抗Ig抗體用放射性化合物標記。在一些具體例中，二級抗Ig抗體用螢光化合物標記。在一些具體例中，二級抗Ig抗體用酶標記。在一些具體例中，放射性化合物包含 3H、 14C、 19F、 35S、 125I、 131I、 111In或 99Tc。在一些具體例中，放射性化合物包含 3H。在一些具體例中，放射性化合物包含 14C。在一些具體例中，放射性化合物包含 19F。在一些具體例中，放射性化合物包含 35S。在一些具體例中，放射性化合物包含 125I。在一些具體例中，放射性化合物包含 131I。在一些具體例中，放射性化合物包含 111In。在一些具體例中，放射性化合物包含 99Tc。在一些具體例中，螢光化合物包含螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素或螢光蛋白。在一些具體例中，螢光化合物包含螢光素。在一些具體例中，螢光化合物包含異硫氰酸螢光素。在一些具體例中，螢光化合物包含羅丹明。在一些具體例中，螢光化合物包含5-二甲胺-1-萘磺醯氯。在一些具體例中，螢光化合物包含藻紅素。在一些具體例中，螢光化合物包含螢光蛋白。在一些具體例中，酶包含鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或葡萄糖氧化酶。在一些具體例中，酶包含鹼性磷酸酶。在一些具體例中，酶包含辣根過氧化物酶。在一些具體例中，酶包含螢光素酶。在一些具體例中，酶包含葡萄糖氧化酶。
在一些具體例中，該群抗體分泌細胞是藉由從人類獲得的細胞群富集免疫細胞而獲得。在一些具體例中，從人類獲得的該群細胞富集漿細胞或漿母細胞。
在一些具體例中，該群抗體分泌細胞獲自人類的淋巴結、肺臟、骨髓及/或血液。在一些具體例中，該群抗體分泌細胞獲自淋巴結。在一些具體例中，該群抗體分泌細胞獲自肺臟。在一些具體例中，該群抗體分泌細胞獲自骨髓。在一些具體例中，該群抗體分泌細胞獲自血液。
在一些具體例中，偵測抗原及/或二級抗Ig抗體。在一些具體例中，分選抗體分泌細胞以收集被抗原及/或被二抗Ig抗體所結合的抗體分泌細胞庫，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞。
在一些具體例中，在使該群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸之前，使抗體分泌細胞與Fc block接觸。
本發明還提供捕獲由抗體分泌細胞所分泌之IgE抗體的方法，其中IgE抗體是針對過敏原，該方法包含：使一群抗體分泌細胞與NHS-生物素接觸以允許生物素結合至細胞表面，其中該群抗體分泌細胞包含分泌IgE抗體的抗體分泌細胞；使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至FcεRIa胞外域的鏈球菌親生物素蛋白，藉此抗體捕獲分子結合至抗體分泌細胞所分泌的IgE抗體；以及使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，其中抗原是過敏原的抗原部分或多個抗原部分的混合物，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的IgE抗體結合至抗原。在一些具體例中，抗原包含多個條碼抗原，其中多個條碼抗原中的各者是過敏原的不同抗原部分。在一些具體例中，該方法進一步包含分選該群抗體分泌細胞以收集抗體分泌細胞庫，其中該庫中的抗體分泌細胞各自分泌一種被抗體捕獲複合物捕獲並被抗原結合的IgE抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌IgE抗體的抗原分泌細胞。
在一些具體例中，該方法進一步包含使該群抗體分泌細胞與抗IgE抗體接觸，以允許由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的IgE抗體結合至抗IgE抗體。在一些具體例中，該方法可進一步包含對該群抗體分泌細胞進行分選以收集抗體分泌細胞庫，其中該庫中的抗體分泌細胞各自分泌一種被抗體捕獲複合物捕獲並被抗原和抗IgE抗體結合的IgE抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌IgE抗體的抗原分泌細胞。
在一些具體例中，該方法進一步包含將收集的抗體分泌細胞庫分離成單細胞並分離出分泌IgE抗體的抗原分泌細胞。 抗原追踪 (antigen chase)
一群抗體分泌細胞可包含多個抗體分泌細胞，各自分泌被抗體捕獲複合物捕獲的抗體，其中多個抗體分泌細胞包括分泌目標抗體的抗體分泌細胞。由多個抗體分泌細胞所分泌的一些抗體結合目標抗體所結合的抗原，儘管抗體可能對抗原具有不等的親和力。可以採用抗原追踪來獲得富含抗體分泌細胞的細胞群，該等抗體分泌細胞分泌對抗原具有高親和力的抗體，這允許分離出分泌具有高親和力的目標抗體的抗體分泌細胞。因此，在本文揭示之方法的一些具體例中，使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟包括抗原追踪。在這些具體例中，作為初始結合步驟，該群抗體分泌細胞與抗原的第一標記形式接觸，以允許抗原結合至抗體(包括捕獲在抗體分泌細胞表面處的目標抗體)，並形成抗原-抗體複合物，然後是「追踪」步驟，其中細胞與幾種形式之一的抗原接觸：(i)抗原的未標記形式(「冷追踪」)、(ii)抗原的第二標記形式(「熱追踪」)，或抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式的組合(「組合追踪」)。在追踪後仍然與抗原的第一標記形式維持著結合的細胞代表分泌具有高結合親和力的抗體的細胞。因此，抗原追踪允許在分泌具有不同親和力的抗體的細胞中進行挑選，以富集分泌具有高親和力的抗體的細胞，並隨後分離出分泌具有高親和力目標抗體的抗體分泌細胞。
術語「富集」表示在細胞群中增加所需細胞的頻率或百分比，例如在抗體分泌細胞群中增加分泌高親和力抗體的抗體分泌細胞的百分比，該抗體分泌細胞群包含分泌不等親和力(例如高親和力、中等親和力和低親和力)的抗體的細胞。因此，富含分泌高親和力抗體之細胞的抗體分泌細胞群含括因為富集過程而具有更高頻率及/或更高百分比的分泌高親和力抗體的抗體分泌細胞的細胞群。在上下文中，富集過程是包括抗原追踪的一個過程，藉而由分泌對抗原具有各種親和力的抗體的細胞群中針對抗原挑選出分泌高親和力抗體的細胞，並將分泌高親和力抗體的細胞與分泌親和力不高的抗體的細胞加以分離。
因為追踪而獲得的細胞群富含抗體分泌細胞，這些細胞分泌對感興趣抗原具有高結合親和力的抗體。換言之，與追踪前或未追踪的細胞群相比，經富集的細胞群含有更大百分比的分泌抗體的細胞，該抗體以高結合親和力結合至抗原。在一些具體例中，收集的至少40%細胞分泌高親和力抗體，例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體。在一些具體例中，富集的細胞群可能是群體中至少50%細胞分泌以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體，例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體。在一些具體例中，富集的細胞群可以是群體中至少60%細胞分泌以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體，例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體。在一些具體例中，富集的細胞群可以是群體中至少70%細胞分泌以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體，例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體。在一些具體例中，富集的細胞群可以是群體中至少80%細胞分泌以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體，例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體。在一些具體例中，富集的細胞群可以是群體中至少90%細胞分泌以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體，例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體。在一些具體例中，富集的細胞群可以是群體中至少95%的細胞分泌以高結合親和力結合至感興趣抗原的抗體，例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪之後細胞群中細胞分泌高親和力抗體(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體)的頻率增加至少30%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪之後細胞群中細胞分泌高親和力抗體(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體)的頻率增加至少40%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪之後細胞群中細胞分泌高親和力抗體(例如具有0.1pM至25nM的KD的抗體)的頻率增加至少50%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪之後細胞群中細胞分泌高親和力抗體(例如0.1pM至25nM的KD的抗體)的頻率增加至少75%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪之後細胞群中細胞分泌高親和力抗體(例如0.1pM至25nM的KD的抗體)的頻率增加至少100%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪之後細胞群中細胞分泌高親和力抗體(例如0.1pM至25nM的KD的抗體)的頻率增加至少200%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，在追踪後細胞群中分泌具有小於1nM的KD的高親和力抗體(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體)的頻率增加至少40%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，在追踪後細胞群中分泌具有小於1nM的KD的高親和力抗體(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體)的頻率增加至少50%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，在追踪後細胞群中分泌具有小於1nM的KD的高親和力抗體(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體)的頻率增加至少75%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，在追踪後細胞群中分泌具有小於1nM的KD的高親和力抗體(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體)的頻率增加至少100%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，在追踪後細胞群中分泌具有小於1nM的KD的高親和力抗體(例如具有0.1pM至1nM的KD的抗體)的頻率增加至少200%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪後細胞群中分泌具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體(例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體)的頻率增加至少40%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪後細胞群中分泌具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體(例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體)的頻率增加至少50%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪後細胞群中分泌具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體(例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體)的頻率增加至少75%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪後細胞群中分泌具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體(例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體)的頻率增加至少100%。在一些具體例中，與追踪之前或沒有追踪細胞群的頻率相比，追踪後細胞群中分泌具有小於0.1nM的KD的高親和力抗體(例如具有0.1pM至0.1nM的KD的抗體)的頻率增加至少200%。
「結合親和力」，如該術語在本領域中已知，通常是指分子(例如抗體)的單個結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間的非共價交互作用的總和強度。除非另有說明，否則如本文所用，「結合親和力」是指反映結合對成員(例如抗體和抗原)之間1：1交互作用的內在結合親和力。分子對其結合配偶體的親和力通常可以用解離平衡常數(KD或K D)表示。K D(莫耳)值與結合親和力呈反向關係，因此K D值(M)越小，親和力越高。因而「親和力更高」是指通常結合抗原更強及/或更快及/或維持結合時間更長的抗體。通常，由於結合交互作用更強，需要較低濃度(M)的抗原就能達到期望效果。
術語「kd」(sec-1或1/s)是指特定抗體-抗原交互作用的解離速率常數，或抗體、Ig、抗體結合片段或分子交互作用的解離速率常數。該值也稱為k off值。
術語「ka」(M-1 × sec-1或1/M)是指特定抗體-抗原交互作用的締合速率常數，或抗體、Ig、抗體結合片段或分子交互作用的締合速率常數。
術語「KD」或「K D」 (M)是指特定抗體-抗原交互作用的平衡解離常數，或抗體、Ig、抗體結合片段或分子交互作用的平衡解離常數。藉由將ka除以kd獲得平衡解離常數。
多種測量結合親和力的方法是本領域已知的，其中任何一種都可用於本發明之目的。使用該方法獲得的結合親和力通常在約0.1pM至約25nM的範圍內，如藉由表面電漿共振測定的。在一些具體例中，結合親和力小於約10nM，如藉由表面電漿共振測定的。
術語「高親和力」抗體是指那些具有(表示為KD)25nM或更低的結合親和力的抗體，例如具有約0.1pM至約25nM的數值。為此，高親和力抗體可具有約25 × 10 -9M (25nM)或更小、約10 × 10 -9M (10nM)或更小、約1 x× 10 -9M (1nM)或更小、約1 × 10 -10M (0.1nM)或更少、約0.5 × 10 -10M (0.05nM)或更少，約0.05 × 10 -10M (5pM)或更少、約1pM或更少，或約0.5 pM或更少的測量KD，如藉由表面電漿共振(例如BIACORETM)或溶液親和力ELISA測定的。那些習於技藝者將認知到，抗體的KD值可以按數字表示為nE -z或n × 10 -z，例如3.2E -12相當於3.2 × 10 -12並且指示KD圍3.2皮莫耳(pM)。在一些具體例中，高親和力抗體具有在約0.1pM至約25nM範圍內的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有在約0.1pM至約20nM範圍內的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有在約0.1pM至約15nM範圍內的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有在約0.1pM至約10nM範圍內的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有在約0.1pM至約5nM範圍內的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有在約0.1pM至約1nM範圍內的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有在約0.1pM至約0.5nM範圍內的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有在約0.1pM至約0.1nM範圍內的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有小於約20nM的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有小於約15nM的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有小於約10nM的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有小於約5nM的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有小於約1nM的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有小於約0.1nM的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有小於約0.5nM的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有小於約0.01nM的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有小於約0.001nM (或1pM)的測量KD。在一些具體例中，高親和力抗體具有小於約0.5pM的測量KD。
在一些具體例中，抗原是以單體形式存在的蛋白質。以單體存在的蛋白質的實例包括介白素分子，諸如IL-13。在一些具體例中，抗原是以多聚體形式存在的蛋白質，包括同聚體和異聚體。在一些具體例中，抗原是以單體和多聚體形式存在的蛋白質，在這種情況下，蛋白質單體和多聚體的混合物可用於本文所述的方法。
無論抗原是以單體形式、多聚體形式或其混合物存在的蛋白質，抗原都可以按單價形式或多價形式用於本文所述的方法中。術語「單價」和「多價」用於指抗原單位被呈遞，以及區別於抗原本身是單體形式、多聚體形式或其混合物的蛋白質的數量。因此，抗原的單價形式是指抗原的單一單位形式，其中抗原本身可能是呈單體形式、多聚體形式或其混合物的蛋白質。抗原的多價形式是指被呈遞的抗原的多個單位，通常是透過與抗原結合或連接的多價分子。多價分子可以是二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體與類似者，或其混合物。在一些具體例中，多價分子是鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)，其可以與生物素複合，然後生物素連接至抗原，從而提供多價(例如四價形式)抗原。在一些具體例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體包括四聚體並且可額外包括三聚體及/或二聚體。在一些具體例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體與諸如藻紅素的螢光團接合。在一些具體例中，多價分子是免疫球蛋白Fc片段的二聚體，抗原可與其連接以提供二價形式的抗原。在一些具體例中，多價分子是三聚化分子的三聚體，諸如折疊子，抗原可與其連接以提供三價形式的抗原。
在一些具體例中，使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟包含：(a)使該群抗體分泌細胞與抗原的第一標記形式接觸，以允許抗原結合至抗體(包括捕獲在細胞表面上的目標抗體)，其中抗原的第一標記形式接合至第一可偵測標記；(b)洗滌細胞以去除未結合的抗原；(c)使細胞與(i)抗原的未標記形式、(ii)抗原的第二標記形式，或(iii)抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式接觸；(d)洗滌細胞以去除未結合的抗原；(e)收集與抗原的第一標記形式維持著結合的抗體分泌細胞庫，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，其中由抗體分泌細胞所分泌且被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體與抗原的第一標記形式維持著結合。
在一些具體例中，抗原的第一標記形式濃度在0.001nM和1uM之間。在一些具體例中，抗原的第一標記形式濃度在0.01nM和100nM之間。在一些具體例中，抗原的第一標記形式濃度在0.05nM至10nM之間。在一些具體例中，抗原的第一標記形式濃度在0.05nM至9nM、0.05nM至8nM、0.05nM至7nM、0.05nM至6nM、0.05nM至5nM、0.05nM至4nM、0.05nM至3nM、0.05nM至2nM，或0.05nM至1nM之間。在一些具體例中，抗原的第一標記形式濃度在0.1nM至7.5nM之間。在一些具體例中，抗原的第一標記形式濃度在0.1nM至7nM、0.1nM至6nM、0.1nM至5nM、0.1nM至4nM、0.1nM至3nM、0.1nM至2nM，或0.1nM至1nM之間。在一些具體例中，抗原的第一標記形式濃度在0.2nM至7.5nM之間。在一些具體例中，抗原的第一標記形式濃度在0.2nM至7nM、0.2nM至6nM、0.2nM至5nM、0.2nM至4nM、0.2nM至3nM、0.2nM至2nM、0.2nM至1nM、0.3nM至7nM、0.3nM至6nM、0.3nM至5nM、0.3nM至4nM、0.3nM至3nM、0.3nM至2nM、0.3nM至1nM、0.5nM至7nM、0.5nM至6nM、0.5nM至5nM、0.5nM至4nM、0.5nM至3nM、0.5nM至2nM、0.5nM至1nM之間。在一些具體例中，抗原的第一標記形式濃度在1.0nM至10nM、1.0nM至9nM、1.0nM至8.0nM、1.0nM至7nM、1.0nM至6nM、1.0nM至5nM、1.0nM至4nM、1.0nM至3nM、1.0nM至2nM、2.0nM至10.0nM，或5.0nM至10.0nM之間。在特定具體例中，抗體分泌細胞可以與抗原的第一標記形式接觸，其中抗原的第一標記形式濃度為0.2nM。在特定具體例中，抗體分泌細胞可以與抗原的第一標記形式接觸，其中抗原的第一標記形式濃度為5.0nM。在特定具體例中，抗體分泌細胞可以與抗原的第一標記形式接觸，其中抗原的第一標記形式濃度為7.5nM。在特定具體例中，抗體分泌細胞可以與抗原的第一標記形式接觸，其中抗原的第一標記形式濃度為10nM。在特定具體例中，抗體分泌細胞可以與抗原的第一標記形式接觸，其中抗原的第一標記形式濃度為0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM或更高。
在一些具體例中，抗體分泌細胞與抗原的第一標記形式的接觸發生約5至約60分鐘，例如約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘或約50分鐘。
在一些具體例中，抗原的第一標記形式是抗原的單價形式。在一些具體例中，抗原的第一標記形式是抗原的多價形式。在一些具體例中，抗原的第一標記形式是單價和抗原的多價形式的混合物。無論是單價形式、多價形式或其混合物，抗原本身可以是單體、多聚體或單體和多聚體的混合物的蛋白質。
在一些具體例中，抗原的第一標記形式是結合至第一可偵測標記的抗原。抗原可以用小分子、放射性同位素、酶蛋白和螢光染料標記。在一些具體例中，可偵測標記是小分子。可偵測的小分子標記允許容易地標記蛋白質並且可以用於本領域已知的許多定期部署的偵測分析中。
在一些具體例中，可偵測標記是酶報導分子。酶標記比生物素大，但它們很少破壞抗體功能。常用的酶標記有辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶。為了使用酶標記抗體，將樣品與酶特異性受質一起培育，該受質被酶催化產生有色產物(顯色分析)或光(化學發光分析)。每種酶都有一組可以採用的受質和偵測方法。例如，HRP可與二胺基聯苯胺反應生成棕色產物，或與發光胺(lunimol)反應生成光。相反，AP可與對硝基苯磷酸鹽(pNPP)反應生成黃色產物(其可被分光光度計偵測到)，或與5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)和硝基藍四唑(NBT)反應生成紫色沉澱。
在一些具體例中，可偵測標記是螢光標記。螢光標記直接接合至抗體，偵測不需要酶/受質或結合交互作用。因此，偵測到的螢光信號量與樣品中目標蛋白的量成正比。螢光標籤可以透過一級胺或硫醇共價附接到抗體上。
在該群抗體分泌細胞與抗原的第一標記形式培育(初始結合步驟)後，可以從初級抗體產生細胞去除任何未結合的抗原。在一些具體例中，未結合的抗原是藉由洗滌去除。正如本領域已知的，洗滌是一種使用洗滌緩衝液去除不需要組分(包括未結合抗原)的技術。洗滌緩衝液是本領域已知的。在一些具體例中，洗滌緩衝液是基於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的洗滌緩衝液。在一些具體例中，洗滌緩衝液是Tris緩衝鹽水(TBS)洗滌緩衝液。在一些具體例中，洗滌緩衝液包含去污劑。在一些具體例中，去污劑是Tween-20。細胞用洗滌緩衝液洗滌一段指定的時間以去除未結合抗原。該段指定的時間量將是足以去除未結合抗原的時間量。在一些具體例中，這個指定時間可為約10分鐘至約60分鐘以去除未結合抗原；可以使用總計10至60分鐘的多次洗滌，例如3次10分鐘的洗滌或一次30分鐘的洗滌；2-4次洗滌，每次5-15分鐘等。洗滌並吸出包含洗滌緩衝液和未結合抗原的上清液後，包含與抗原結合的細胞的小粒可用於後續步驟。在一些具體例中，包含結合抗原的小粒可重新懸浮於緩衝液中並用於後續步驟。在一些具體例中，用於重新懸浮小粒的緩衝液可以是相同的洗滌緩衝液。在一些具體例中，用於重新懸浮小粒的緩衝液可以是與洗滌緩衝液不同的緩衝液。
在一群抗體分泌細胞與抗原的第一標記形式接觸(初始結合/接觸步驟)後，且在未結合的抗原的第一標記形式被去除後，細胞就會進行抗原追踪，即再次接觸或「追踪」抗原，以選擇性地富集分泌對抗原具有高親和力的抗體的細胞。可以使用幾種形式的抗原中的任一者進行這種追踪：(i)抗原的未標記形式(「冷」追踪)、(ii)抗原的第二標記形式(「熱」追踪)；或(iii)抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式(「組合追踪」)。追踪允許追踪抗原結合至一開始被抗原的第一標記形式結合的抗體，從而追踪到抗原的第一標記形式脫離抗體，除非抗體對抗原具有高親和力並在追踪後與抗原的第一標記形式維持著結合。
在一些具體例中，使用抗原的未標記形式進行追踪(冷追踪)。在一些具體例中，抗原的未標記形式是抗原的單價形式，也就是說，雖然抗原本身可以是單體形式、多聚體形式，或單體和多聚體形式的混合物的蛋白質，但抗原的單價形式本身就是抗原，沒有進一步的二次多聚化。在一些具體例中，抗原的未標記形式是抗原的多價形式，其中抗原本身可以是單體形式、多聚體形式，或單體和多聚體形式的混合物的蛋白質。在一些具體例中，抗原的未標記形式是單價形式和抗原的多價形式的混合物。在使用抗原的多價形式的具體例中，這種形式可以由抗原結合或連接的多價分子提供。在一些具體例中，多價分子是鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)，其可以與生物素複合，然後生物素與抗原連接，從而提供多價(例如，四價)形式的抗原。在一些具體例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體除了四聚體之外還可能包括三聚體及/或二聚體。在一些具體例中，多價分子是免疫球蛋白Fc片段的二聚體，抗原可與其連接以提供二價形式的抗原。在一些具體例中，多價分子是三聚化分子的三聚體，例如折疊子，抗原可與其連接以提供三價形式的抗原。
在一些具體例中，使用抗原的第二標記形式進行追踪(熱追踪)。在此類具體例中，在一開始結合和洗滌步驟之後，抗體分泌細胞被抗原的第二標記形式追踪。抗原的第二標記形式具有提供與第一標記形式抗原上的標記不同的可偵測信號的標記。標記的合適選擇已在本文中描述，只要第二標記形式抗原上的標記不同於第一標記形式抗原上的標記即可。此類標記包括小分子、放射性同位素、酶蛋白和螢光染料。在一些具體例中，第一標記是AlexaFluor647，第二標記是藻紅素。
在一些具體例中，抗原的第二標記形式是抗原的單價形式。在一些具體例中，抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。在一些具體例中，抗原的第二標記形式包含單價和抗原的多價形式的混合物。在使用抗原的多價形式的具體例中，這種形式可以由抗原結合或連接的多價分子提供。在一些具體例中，多價分子是鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)，其可以與生物素複合，然後生物素與抗原連接，從而提供多價(例如四價)形式的抗原。在一些具體例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體除了四聚體之外還可能包含三聚體及/或二聚體。在一些具體例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體與諸如藻紅素的螢光團接合。在一些具體例中，多價分子是免疫球蛋白Fc片段的二聚體，抗原可與其連接以提供二價形式的抗原。在一些具體例中，多價分子是三聚化分子的三聚體，諸如折疊子，抗原可與其連接以提供三價形式的抗原。
抗原的第一標記形式和抗原的第二標記形式可以是相同或不同的抗原價數形式，但必須具有發出彼此不同可偵測信號的標記。在一些具體例中，抗原的第一標記形式是抗原的單價形式而抗原的第二標記形式也是單價形式。在一些具體例中，抗原的第一標記形式是抗原的單價形式，而抗原的第二標記形式是多價形式。
在一些具體例中，追踪是用抗原的未標記形式(冷)和抗原的第二標記形式(熱)進行的，在本文中也稱為組合追踪。在此類具體例中，於一開始結合和洗滌步驟之後，抗體分泌細胞被抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式追踪。兩種形式的追踪抗原：抗原的未標記形式(「冷追踪抗原」)和抗原的第二標記形式(「熱追踪抗原」)可以同時或依次與細胞接觸(例如先加入冷追踪抗原，然後加入熱追踪抗原，反之亦然)。在一些具體例中，抗原的未標記形式是單價形式。在一些具體例中，抗原的未標記形式是多價形式。在一些具體例中，抗原的未標記形式是單價形式和多價形式的混合物。在一些具體例中，抗原的第二標記形式是單價形式。在一些具體例中，抗原的第二標記形式是多價形式。在一些具體例中，抗原的第二標記形式包含單價形式和多價形式的混合物。在組合追踪中使用抗原的多價形式的具體例中，這種形式可以由抗原結合或連接的多價分子提供。在一些具體例中，多價分子是鏈球菌親生物素蛋白多聚體(例如四聚體)，其可以與生物素複合，然後生物素與抗原連接，藉此提供多價(例如，四價)形式的抗原。在一些具體例中，鏈球菌親生物素蛋白多聚體除了四聚體之外還可以包括三聚體及/或二聚體。在一些具體例中，多價分子是免疫球蛋白Fc片段的二聚體，抗原可與其連接以提供二價形式的抗原。在一些具體例中，多價分子是三聚化分子的三聚體，諸如折疊子，抗原可與其連接以提供三價形式的抗原。
關於任何形式的追踪，所用的追踪抗原濃度與抗原的第一標記形式濃度相比是過量的，無論用於追踪的抗原形式是什麼(即未標記形式、第二標記形式，或未標記形式和第二標記形式)。在使用抗原的未標記形式的具體例中(在冷追踪或組合追踪中)，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式在莫耳比為至少2倍，即2倍至多達例如2500倍，的比率。在一些具體例中，抗原的未標記形式相對於第一標記形的式抗原的莫耳比為2倍。在一些具體例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為3倍。在一些具體例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為4倍。在一些具體例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為5倍。在一些具體例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為6倍、7倍、8倍或9倍。在一些具體例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為10倍、15倍、20倍或25倍。在一些具體例中，抗原的未標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍或更多。在一些具體例中，取決於抗原的第一標記形式濃度，抗原的未標記形式可以呈0.4nM至1uM，或10至600nM之間的濃度。在一些具體例中，取決於抗原的第一標記形式濃度，抗原的未標記形式濃度在10nM至600nM、10nM至500nM、10nM至400nM、10nM至300nM、10nM至200nM、10nM至150nM、10nM至100nM、10nM至75nM、10nM至65nM、10nM至50nM、10nM至40nM、10nM至30nM、10nM至25nM，或10nM至20nM之間。在使用抗原的第二標記形式的具體例中(在熱追踪或組合追踪中)，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為至少2倍，即2倍至多達例如2500倍。在一些具體例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為2倍。在一些具體例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為3倍。在一些具體例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為4倍。在一些具體例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為5倍。在一些具體例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為6倍、7倍、8倍或9倍。在一些具體例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為10倍、15倍、20倍或25倍。在一些具體例中，抗原的第二標記形式相對於抗原的第一標記形式的莫耳比為30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍或更高。在一些具體例中，取決於抗原的第一標記形式濃度，抗原的第二標記形式可以呈0.4nM至1uM，或10nM至600nM之間的濃度。在一些具體例中，取決於抗原的第一標記形式濃度，抗原的第二標記形式可以是10nM至600nM、10nM至500nM、10nM至400nM、10nM至300nM、10nM至200nM、10nM至150nM、10nM至100nM、10nM至75nM、10nM至65nM、10nM至50nM、10nM至40nM、10nM至30nM、10nM至25nM，或10nM至20nM之間的濃度。
在進行組合追踪的一些具體例中，冷追踪抗原和熱追踪抗原可以呈相同濃度或呈不同濃度。
在組合追踪的一些具體例中，細胞依序與冷追踪抗原和熱追踪抗原接觸；並且在一些這樣的具體例中，可以在兩種追踪抗原之間納入洗滌步驟。在這樣的具體例中，細胞用洗滌緩衝液洗滌一段足夠的指定時間以去除未結合的抗原。在一些具體例中，在一次或多次洗滌中洗滌細胞一段約10分鐘至約60分鐘的時間。
追踪進行一段足以允許追踪抗原結合至抗體的時間。在一些具體例中，跟踪是用未標記形式或抗原的第二標記形式進行約5至約60分鐘的時間，例如約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約45分鐘，或約50分鐘。在組合追踪的一些具體例中，追踪用抗原的未標記形式進行約5至約60分鐘的時間，隨後與抗原的第二標記形式培育約5至約60分鐘的時間。與抗原的未標記形式和與抗原的第二標記形式培育的時間可能相同或不同。作為一個非限制性實例，抗原的未標記形式可能接觸細胞約30分鐘，而抗原的第二標記形式隨後可以接觸細胞約45分鐘，反之亦然。在組合追踪的一些具體例中，追踪用抗原的第二標記形式進行約5至約60分鐘的時間。在組合追踪的一些具體例中，追踪用抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式同時進行約5至約60分鐘的時間。
在一些具體例中，執行追踪超過一次。在一些具體例中，執行冷追踪超過一次。在一些具體例中，執行熱追踪超過一次。在一些具體例中，執行冷追踪一次，隨後執行熱追踪超過一次。在一些具體例中，執行冷追踪超過一次，隨後執行熱追踪一次。在一些具體例中，執行冷追踪超過一次，隨後執行熱追踪超過一次。在一些具體例中，執行組合追踪超過一次。在一些具體例中，在每個追踪步驟之後納入洗滌步驟。在一些具體例中，在每個追踪步驟之後納入超過一個洗滌步驟，例如2次洗滌或3次洗滌。
追踪完成後，再次透過洗滌去除未結合的抗原，並收集仍與抗原的第一標記形式維持著結合的細胞。
在第一可偵測標記是第一螢光標記的一些具體例中，可以利用螢光活化細胞分選(FACS)來收集與抗原的第一標記形式維持結合的細胞。在第一可偵測標記是第一螢光標記且第二可偵測標記是有別於第一螢光標記的第二螢光標記的一些具體例中，二維FACS用於收集與抗原的第一標記形式維持著結合的細胞。在特定具體例中，第一可偵測標記是A647而第二可偵測標記是藻紅素。 分離編碼抗體的核酸
可以將抗體分泌細胞庫分選或分離成單細胞。藉由流式細胞術分離單細胞的方案是眾所周知的(Huang, J. et al, 2013，上文)。可以藉由本領域已知的替代方法來分選並收集單細胞，包括但不限於手動單細胞挑選、有限稀釋、微流體、雷射捕獲顯微切割和凝膠珠粒乳液(GEM)，這些都是本領域眾所周知的。參見例如Rolink et al., J Exp Med (1996)183:187-194；Lightwood, D. et al, J. Immunol. Methods (2006) 316(1-2):133-43；Gross et al., Int. J. Mol. Sci. (2015) 16: 16897-16919；以及Zheng et al., Nature Communications (2017) 8: 14049。凝膠珠粒乳液(GEM)也可商購(例如10x Genomics, Pleasanton, CA的10X Chromium System)。
在獲得之後，單抗體分泌細胞可以藉由一般細胞培養技術繁殖，用於隨後的DNA製備。或者，抗體基因可以直接從單個抗體產生細胞擴增，然後選殖到DNA載體中。
編碼抗體或其片段的核酸可以從本文獲得的單抗體分泌細胞分離而來。例如，編碼免疫球蛋白可變重鏈和可變輕鏈(即VH、VL、VL可以是Vκ或Vλ)的基因或核酸可以使用RT-PCR方案從抗體分泌細胞分離而來的核酸進行回收。例如，編碼抗體片段的核酸首先被逆轉錄(RT)為互補DNA(cDNA)。隨後使用對抗體基因序列(例如抗體鏈的恆定區)具特異性的引子在PCR反應中擴增cDNA。所有鏈都可以使用鏈特異性引子進行多重或單獨擴增。然後對擴增子進行定序以獲得編碼抗體片段的核酸序列。這些RT-PCR方案是眾所周知的常規技術，就像例如Wang et al., J. Immunol. Methods (2000) 244:217-225和本文所述。
在一些具體例中，核酸編碼抗體的片段(諸如可變結構域、恆定結構域或其組合)。在某些具體例中，從抗體產生細胞分離的核酸編碼抗體的可變結構域。在一些具體例中，核酸編碼抗體重鏈或其片段。在其他具體例中，核酸編碼抗體輕鏈或其片段。
在回收後，抗體編碼基因或核酸可以被選殖到IgG重鏈和輕鏈表現載體中，並經由轉染宿主細胞來表現。例如，可以將抗體編碼基因或核酸插入可複製載體中，以進一步在細胞中選殖(DNA擴增)或表現(穩定或瞬時)。許多載體(特別是表現載體)是可用的或可以被改造以包含調控抗體編碼基因或核酸表現所需的適當調節元件。
本發明上下文中的表現載體可以是任何合適的載體，包括如本文所述的染色體、非染色體和合成核酸載體(包含一組合適表現控制元件的核酸序列)。此類載體的實例包括SV40的衍生物、細菌質體、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質體、衍生自質體和噬菌體DNA的組合的載體，以及病毒核酸(RNA或DNA)載體。
在一些具體例中，核酸分子被納入在裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表現元件(如例如Sykes and Johnston, Nat Biotech (1997) 12:355-59中所述)、壓縮的核酸載體(如例如US 6,077,835中所述)或質體載體(諸如pBR322或pUC 19/18)。這樣的核酸載體及其用途是本領域眾所周知的。參見例如US 5,589,466和US 5,973,972。
在某些具體例中，表現載體可以是適合在酵母系統中表現的載體。可以採用適合在酵母系統中表現的任何載體。合適的載體包括，例如包含組成型或誘導型啟動子(諸如酵母α因子、醇氧化酶和PGH)的載體。參見F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)；以及Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)。
在一些具體例中，攜帶分離自抗體分泌細胞並編碼抗體或其片段的核酸的表現載體被引入宿主細胞以表現抗體或其片段。宿主細胞包括例如哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞或昆蟲細胞。在一些具體例中，宿主細胞培養在表現核酸的條件下，然後可以產生抗體或其部分並分離以供進一步使用。在一些具體例中，包含一或多種上述核酸的宿主細胞培養在表現全長抗體的條件下，然後可以產生抗體並分離以供進一步使用。在某些具體例中，宿主細胞包含編碼抗體可變結構域的核酸，且細胞培養在表現可變結構域的條件下。在其他具體例中，宿主細胞包含編碼抗體可變重鏈(VH)結構域的核酸，且細胞培養在表現VH結構域的條件下。在另一個具體例中，宿主細胞包含編碼抗體可變輕鏈(VL)結構域的核酸，且細胞培養在表現VL結構域的條件下。在特定具體例中，宿主細胞包含編碼抗體VH結構域的核酸和編碼抗體VL結構域的核酸，且細胞培養在表現VH結構域和VL結構域的條件下。
在一些具體例中，宿主細胞是細菌或酵母細胞。在一些具體例中，宿主細胞是哺乳動物細胞。在其他具體例中，宿主細胞可以是例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，諸如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO細胞；COS(例如COS-7)；幹細胞；視網膜細胞；Vero細胞；CV1細胞；腎細胞，諸如例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、aHaK、BHK21細胞；HeLa細胞；HepG2細胞；WI38；MRC 5；Colo25；HB 8065；HL-60；Jurkat或Daudi細胞；A431(表皮)細胞；CV-1、U937、3T3或L細胞；C127細胞、SP2/0、NS-0或MMT細胞、腫瘤細胞和源自任何上述細胞的細胞株。在特定的具體例中，宿主細胞是CHO細胞。在特定具體例中，宿主細胞是CHO K1細胞。
本發明還提供鑑定編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由包含經修飾細胞表面的抗體分泌細胞所分泌，並且其中目標抗體隨後被捕獲在經修飾細胞表面上，該方法包含：a)提供包含經修飾細胞表面的抗體分泌細胞，其中細胞分泌目標抗體，其中目標抗體隨後被捕獲在經修飾細胞表面上，其中被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體結合至抗原，其中抗原連接至條碼核酸分子，且其中抗體分泌細胞進一步包含核酸分子，該核酸分子包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之目標抗體的抗原結合片段的基因區；b)使條碼核酸分子的一部分與附接於固體表面的第一核酸分子的一部分雜交；c)使包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接於固體表面的第二核酸分子的一部分雜交；d)製備抗體分泌細胞的基因表現之第一擴增子庫、抗體分泌細胞的可變區、多樣性區和接合區(VDJ)之第二擴增子庫，以及抗原條碼核酸分子之第三擴增子庫；e)對三個擴增子庫中的每一者進行定序；以及f)鑑定編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區。
在上述方法中，關於步驟b)，在分區(例如小滴)中使條碼核酸分子的一部分與附接於固體表面的第一核酸分子的一部分雜交，分區(例如珠粒)溶解且細胞條碼核酸分子/TSO寡聚物是自由漂浮的。
在上述方法中，關於步驟c)，使編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接於固體表面上的第二核酸分子的一部分雜交，包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子(例如，BCR mRNA)不直接雜交。相反，它首先被製成第一股cDNA，然後逆轉錄酶將CCC添加到cDNA的末端。接著CCC與TSO的rGrGrG部分雜交。此外，關於附接至固體表面的第二核酸分子，在分區(例如小滴)中，分區(例如珠粒)溶解且第二核酸分子是自由漂浮的。
在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包括抗生物素蛋白、鏈球菌親生物素蛋白、抗生物素、生物素、jun蛋白或其部分、fos蛋白或其部分、mad蛋白或其部分、max蛋白或其部分、myc蛋白或其部分、疊氮化物、炔烴及/或膦。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含抗生物素蛋白。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含鏈球菌親生物素蛋白。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含生物素。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含jun蛋白或其部分。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含fos蛋白或其部分。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含mad蛋白或其部分。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含max蛋白或其部分。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含myc蛋白或其部分。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含疊氮化物。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含炔烴。在一些具體例中，經修飾細胞表面的修飾包含膦。
在一些具體例中，條碼核酸分子的部分與第一模板轉換寡核苷酸(TSO)互補。在一些具體例中，條碼核酸分子的部分可接合至第一TSO。在一些具體例中，可以使用3'條碼系統。在這種情況下，抗原條碼將具有聚A。VDJ富集和定序的執行方式可能有所不同。
在一些具體例中，附接至固體表面的第一核酸分子的部分包含第一模板轉換寡核苷酸(TSO)。在一些具體例中，附接至固體表面的第一核酸分子的3'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第一序列。在一些具體例中，附接至固體表面的第一核酸分子進一步包含第一獨特分子識別符(UMI)。在一些具體例中，附接至固體表面的第一核酸分子進一步包含第一表面條碼。在一些具體例中，附接至固體表面的第一核酸分子進一步包含第一定序引子。在一些具體例中，附接至固體表面的第一核酸分子從3'到5'包含三個核糖鳥苷殘基的第一序列、第一TSO、第一UMI、第一表面條碼以及第一定序引子。在一些具體例中，附接至固體表面的第一核酸分子藉由附接至固體表面的第一核酸分子的5'端附接。
在一些具體例中，附接至固體表面的第一核酸分子包含附接至固體表面的第一DNA分子。在一些具體例中，附接至固體表面的第一DNA分子包含附接至固體表面的第一單股DNA分子。在一些具體例中，附接至固體表面的第一單股DNA分子的部分包含第一TSO，且從與第一TSO互補之條碼核酸分子的部分的3'端開始逆轉錄附接至固體表面的第一單股DNA分子。逆轉錄也發生在另一股中，其中抗原條碼核酸從其3'端延伸且附接至固體表面的第一核酸分子也從其3'端延伸。
在一些具體例中，條碼核酸分子是單股DNA條碼核酸分子，其中附接至固體表面的第一核酸分子的部分包含第一TSO，而從第一TSO的3'端開始逆轉錄單股DNA條碼核酸分子。
在一些具體例中，條碼核酸分子的部分的3'端包含三個連續的胞苷或核糖胞苷殘基。
在一些具體例中，逆轉錄編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子，藉此產生編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子。實際的化學反應發生在分區(例如小滴)的溶液中。
在一些具體例中，編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的核苷酸序列與編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子的互補序列不同，因為被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的3'端包含三個額外的連續胞苷或核糖胞苷殘基。在一些具體例中，編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子的3'端包含多個連續的腺嘌呤殘基。在一些具體例中，編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的5'端包含多個連續的胸腺嘧啶殘基。在一些具體例中，附接至固體表面的第二核酸分子的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列。
在一些具體例中，附接至固體表面的第二核酸分子進一步包含第二UMI。在一些具體例中，附接於固體表面的第二核酸分子進一步包含第二表面條碼。在一些具體例中，第二表面條碼是與第一核酸分子相同的表面(細胞)條碼，以使得抗原與BCR匹配。在一些具體例中，附接於固體表面的第二核酸分子進一步包含第二定序引子。在一些具體例中，附接於固體表面的第二核酸分子從3'到5'包含三個核糖鳥苷殘基的第二序列、第二TSO、第二UMI、第二表面條碼，以及第二定序引子。在使用10X基因組學系統的一些具體例中，同一表面上的每個核酸分子，只有UMI不同。只要細胞條碼相同，其他組分(例如TSO和定序引子)就可以不同。在一些具體例中，附接至固體表面的第二核酸分子藉由附接至固體表面的第二核酸分子的5'端附接。
在一些具體例中，附接至固體表面的第二核酸分子包含附接至固體表面的第二DNA分子。在一些具體例中，附接至固體表面的第二DNA分子包含附接至固體表面的第二單股DNA分子。在一些具體例中，附接至固體表面的第二單股DNA分子的部分的3'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列。在一些具體例中，編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的部分的3'端包含三個連續的胞苷殘基。在一些具體例中，從三個連續胞苷殘基的3'端開始逆轉錄附接於固體表面的第二單股DNA分子。
在一些具體例中，編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之抗體的抗原結合片段的基因區的第二單股DNA分子。在一些具體例中，編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的部分的3'端包含三個連續胞苷或核糖胞苷殘基，且其中附接至固體表面的第二單股DNA分子的部分的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列。在一些具體例中，從編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的部分的3'端開始逆轉錄附接至固體表面的第二單股DNA分子。在一些具體例中，從附接於固體表面的第二單股DNA分子的3'端開始逆轉錄編碼基因區的單股DNA分子。
在一些具體例中，抗體分泌細胞佈置在具有固體表面的分區內。在一些具體例中，分區含有單抗體分泌細胞。在一些具體例中，分區含有單個漿細胞或漿母細胞。在一些具體例中，固體表面包含珠粒。在一些具體例中，分區內的抗體分泌細胞被溶解。在一些具體例中，固體表面(例如珠粒)在分區時溶解並且其表面附接的DNA分子被釋放到分區內的溶液中。在一些具體例中，分區是油。在一些具體例中，分區是呈液滴的形式。
在一些具體例中，條碼核酸分子進一步包含第三定序引子。
在一些具體例中，每個擴增子由第一擴增子庫產生，該第一擴增子庫包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因。
在一些具體例中，第一擴增子庫的樣品被分離、比對、過濾和UMI計數。在一些具體例中，第一擴增子庫的定序包括次世代定序。
在一些具體例中，第一擴增子庫的各個擴增子被映射至標準參考基因組並進行比對。在一些具體例中，標準參考基因組包含人類標準參考基因組。在一些具體例中，人類標準參考基因組是GRCh38。在一些具體例中，標準參考基因組包含鼠類標準參考基因組。在一些具體例中，鼠類標準參考基因組是mm10。
在一些具體例中，第一擴增子庫的各個擴增子是利用單細胞比對軟體(諸如STAR或kallisto) (Bray et al., Nat. Biotechnol., 2016, 34, 525-527；Erratum in: Nat. Biotechnol., 2016, 34, 888)被映射到標準參考基因組，其中第一擴增子庫的各個擴增子包含一個獨特的分子識別符，其中映射到標準參考基因組的註釋基因的第一擴增子庫的所有擴增子經過分箱(binned)，其中針對每個獨特分子識別符(UMI)計數經分箱的擴增子，從而生成單細胞計數矩陣，該矩陣包含每個註釋基因的映射計數和每個UMI的計數。
在一些具體例中，藉由計算註釋基因總數被除以計數的UMI總數的log 10的比率，針對高品質細胞和廣泛分析的基因來過濾單細胞計數矩陣。在一些具體例中，過濾掉基因與UMI之比低於約0.1的細胞。在一些具體例中，過濾掉計數的UMI總數的四分位數間距超過約四倍的細胞。在一些具體例中，過濾掉超過約80%的讀段映射到粒線體基因的細胞。在一些具體例中，過濾掉基因與UMI之比低於約0.1的細胞、計數的UMI總數的四分位數間距超過約四倍的細胞，以及超過約80%的讀段映射到粒線體基因的細胞。在一些具體例中，可以為基因與UMI比和粒線體閾值設定任何閾值。這些值在很大程度上取決於所使用的組織。組織(諸如血液和淋巴結)越穩定，就需要不那麼嚴苛的閾值，而諸如腸、肺臟或皮膚的組織將有更高的死細胞/垂死細胞數，粒線體污染高。
在一些具體例中，單細胞計數矩陣被標準化，使得計數的UMI總數為約1,000、5,000、10,000、20,000、50,000或100,000。在一些具體例中，單細胞計數矩陣被標準化，使得計數的UMI總數約為10,000。在一些具體例中，單細胞計數矩陣被標準化，使得計數的UMI總數為約5,000。在一些具體例中，單細胞計數矩陣被標準化，使得計數的UMI總數為約20,000。
在一些具體例中，單細胞計數矩陣的主成分嵌入是藉由主成分分析(PCA)計算，並用作計算均勻流形近似和投影(uniform manifold approximation and projection, UMAP)的輸入。或者，也可以從PCA嵌入計算tSNE投影(van der Maaten et al., J. Mach. Learning Res., 2008, 9, 2579-2605)。可以對主要細胞類型進行額外的迭代分群，以鑑別批次之間的相似性。在一些具體例中，UMAP是使用Korsunsky et al., Nat. Methods, 2019, 16, 1289-1296中揭示的方法生成。
在一些具體例中，集群特異性的中心(cluster-specific centroid)被用來確定每個細胞的線性調整函數，將每個細胞的線性調整函數應用於校正批次的差異，從而生成經批次校正嵌入，並使用經批次校正嵌入來生成均勻流形二維近似和投影(UMAP)。該方法稱為調和(Korsunsky et al., Nat. Methods, 2019, 16, 1289-1296)，但是，存在幾種替代方法，包括計算來自Seurat的整合錨點(Hao et al., Cell, 2021, 184, 3573-3587)。
在一些具體例中，確定加權k-近鄰圖並且將萊頓演算法(Leiden algorithm)應用於具有約0.1、約0.2、約0.5和約1.0的分辨率值的加權k-近鄰圖，以便按照非監督方式確定細胞類型集群。在一些具體例中，確定加權k-近鄰圖並且將萊頓演算法應用於具有大約0.1的分辨率值的加權k-近鄰圖以便按照非監督方式確定細胞類型集群。在一些具體例中，確定加權k-近鄰圖並且將萊頓演算法應用於具有大約0.2的分辨率值的加權k-近鄰圖以便按照非監督方式確定細胞類型集群。在一些具體例中，確定加權k-近鄰圖並且將萊頓演算法應用於具有大約0.5的分辨率值的加權k-近鄰圖以便按照非監督方式確定細胞類型集群。在一些具體例中，確定加權k-近鄰圖並且將萊頓演算法應用於具有大約1.0的分辨率值的加權k-近鄰圖以便按照非監督方式確定細胞類型集群。萊頓是一種社群偵測演算法(community-detection algorithm)，它藉由拆分相似細胞的節點來迭代地執行分群，以生成連接良好的集群(Traag et al., Scientific Reports, 2019, 9, 5233)。替代演算法包括魯汶(Louvain)、K-平均值(K-means)和NMF分群。
在一些具體例中，對一個集群中的所有細胞進行成對Wilcox檢定並比較第一個成對Wilcox檢定的結果，而對每隔一個集群中的所有細胞進行另一個成對Wilcox檢定，以量化每個集群中每個基因的p-值和變化倍數。在一些具體例中，當基因具有低p值和高變化倍數時，細胞由抗體分泌細胞的共同標記所標記，且細胞按照差異表現結果中排名靠前的基因命名的分群亞型予以標記。對各個同型(主要是IgE)中具有和不具有抗原特異性的細胞，可以重複這一過程。在一些具體例中，諸如DESeq2的測試可用於差異表現。
在一些具體例中，進行樣品分離，讀段對從頭組裝成片段重疊群(contig)，並且針對生殖系區段V(D)J參考序列的片段重疊群相對第二擴增子家族進行比對和註釋。
在一些具體例中，片段重疊群與生殖系區段V(D)J參考序列的比對包含使用軟體IgBlast與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫進行比對(Ye et al., Nuc. Acids Res., 2013, 41, W34-W40)。在一些具體例中，人類生殖系參考數據庫包含人類生殖系免疫球蛋白序列的IMGT數據庫(全球資訊網在「imgt.org/IMGTrepertoire/LocusGenes/」)。在一些具體例中，鼠類生殖系參考數據庫包含IMGT生殖系參考數據庫。
在一些具體例中，將VDJ序列與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫中的序列進行比較，從而藉由檢查框內比對、CDR3的長度，及/或在可變區序列中不存在終止密碼子來標記VDJ序列，與基於標記所過濾VDJ序列以進行品質比對。在一些具體例中，將VDJ序列與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫中的序列進行比較，從而藉由檢查框內比對來標記VDJ序列以進行品質比對。在一些具體例中，將VDJ序列與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫中的序列進行比較，從而標記VDJ序列的CDR3長度。在一些具體例中，將VDJ序列與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫中的序列進行比較，從而標記VDJ序列的可變區序列中不存在終止密碼子。或者，可以省略這個步驟以保留所有可能的VDJ序列，這些序列可以與IgBlast比對以確認符合人類或小鼠可變區框架的高品質序列。
如果生殖系VDJ序列數據庫不可用，則對於研究較少的生物體來說，這個步驟可能無法實現。
在一些具體例中，VDJ序列被映射到免疫球蛋白鏈的參考數據庫(例如IMGT)。
在一些具體例中，免疫球蛋白同型、可變區映射、接合區映射、多樣性區映射、每個細胞的重鏈和輕鏈序列的全長可變區的準確性是藉由比對進行確認。在一些具體例中，免疫球蛋白同型是藉由比對進行確認。在一些具體例中，可變區映射是藉由比對進行確認。在一些具體例中，接合區映射是藉由比對進行確認。在一些具體例中，多樣性區映射是藉由比對進行確認。在一些具體例中，每個細胞的重鏈和輕鏈序列的全長可變區的準確性是藉由比對進行確認。在一些具體例中，VDJ序列是透過IgBlast映射並註釋到生殖系。
在一些具體例中，第三個擴增子庫經樣品分離、比對、過濾和UMI計數。在一些具體例中，可以使用單細胞比對軟體，諸如STAR或kallisto。
在一些具體例中，將第三擴增子庫映射到訂製的短讀段參考品，其包含與每個抗原相關的條碼核酸分子參考品。在一些具體例中，針對條碼抗原單細胞矩陣中的每個細胞對每個獨特映射的條碼核酸分子的計數求和。
在一些具體例中，藉由取得每次樣品捕獲中多個條碼核酸分子的各個條碼核酸分子的中心對數比，對所有細胞中的條碼核酸分子進行量化和標準化。或者，可以使用中心對數比或背景降噪和縮放(DSB) (Mulè et al., bioRxiv, 2020.02.24.963603)。
在一些具體例中，背景抗原信號是藉由DSB針對多個條碼核酸分子中的各個條碼核酸分子予以去除。或者，可以使用中心對數比。
在一些具體例中，確定抗原信號分佈，其中當在抗原信號分佈中有充分分離的雙峰分佈時，使用z轉換值來計算抗原特異性，並且其中當在抗原信號分佈中沒有充分分離的雙峰分佈時使用分位數值。在一些具體例中，可以使用排序而不是分位數值。
在一些具體例中，第一擴增子庫、第二擴增子庫和第三擴增子庫的分析是同時進行的，以獲得經修飾細胞表面上所捕獲之抗原陽性目標抗體的至少一個候選序列。
在一些具體例中，具有有效抗體恆定區的抗體分泌細胞是使用第一擴增子庫分析結果和第二擴增子庫分析結果進行子集化。在一些具體例中，抗體恆定區包含IgE恆定區。在一些具體例中，子集抗體分泌細胞包含可偵測程度的IgE重鏈和CD79a，但缺乏可偵測程度的Ms4a1和CD19，其中子集抗體分泌細胞是IgE +漿細胞或漿母細胞。
在一些具體例中，針對IgA分泌細胞同型、IgG分泌細胞同型及/或IgM分泌細胞同型評估IgE +抗體分泌細胞的差異表現。在一些具體例中，差異表現的評估進一步特徵鑑定IgE +抗體分泌細胞的獨特轉錄特徵。
在一些具體例中，評估IgE +抗體分泌細胞的抗原特異性。在一些具體例中，評估包含比較IgE +抗體分泌細胞對多種抗原和對照抗原的抗原特異性，且其中多種抗原包含目標抗原。在一些具體例中，比較包含藉由從與對照抗原相關的信號的分位數值(qC)和懲罰因數(x)扣除與抗原相關的信號的分位數值(qT)，來計算多個抗原中的每個抗原和對照抗原的經驗分數，以確定抗原特異性分數，其中抗原特異性分數 = qT - qC x。在一些具體例中，懲罰因數對所有抗原都是相同的。在一些具體例中，懲罰因數對不同的抗體同型是不同的。在一些具體例中，懲罰因數在使用其他抗原時是不同的。
在一些具體例中，確定多種抗原和對照抗原中每一者的抗原特異性分數。在一些具體例中，計算對照抗原特異性分數，其中當抗原特異性分數高且對照抗原特異性分數低時，挑選細胞。在一些具體例中，VDJ區鑑別抗原特異性抗體。
在一些具體例中，使用細胞的成對V H：V L抗體序列從抗原信號的排序表中挑選候選抗體。
在一些具體例中，確定同型、條件及/或抗原特異性之間的差異表現，其中確定同型之間的差異表現包含對一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定，並且對另一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定，從而量化每個集群的各個基因的p值和變化倍數；以及其中確定抗原特異性之間的差異表現包含對一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定並對另一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定，從而量化每個集群的各個基因的p值和變化倍數。
有許多用於差異表現分析的模型/統計學。一些實例包括：1)「wilcox」，它使用Wilcoxon秩和檢定(如本文所述)在兩群細胞之間鑑定出差異表現的基因；2)「bimod」，這是一種單細胞基因表現的似然比檢定，(McDavid et al., Bioinformatics, 2013)；3)「roc」，使用ROC分析鑑定基因表現的「標記」；針對每個基因，評估(使用AUC)單獨建立在該基因上的分類器，以在兩群細胞之間進行分類；AUC值為1表示僅僅這個基因的表現值就可以完美地對兩個分組進行分類(即，cells.1中的每個細胞都比cells.2中的每個細胞展現出更高程度)；AUC值為0也表示有完美分類，但方向相反；0.5的值表示基因沒有對兩組進行分類的預測能力；它返回假定差異表現基因的「預測能力」(abs(AUC-0.5)*2)排序矩陣；4)「t」，其使用司徒頓t檢定鑑定兩群細胞之間差異表現的基因；5)「negbinom」，其使用負二項式廣義線性模型鑑定兩群細胞之間差異表現的基因；6)「poisson」，其使用泊松廣義線性模型鑑定兩群細胞之間差異表現的基因；7)「LR」，其使用邏輯回歸框架來確定差異表現的基因；構建邏輯回歸模型，根據每個特徵單獨預測群資格，並將其與具有似然比檢定的空模型進行比較；8)「MAST」，其使用針對scRNA-seq數據訂製的柵欄模型鑑定出兩群細胞之間差異表現的基因；利用R中的MAST程式包運行DE測試；9)「DESeq2」，其基於使用負二項分佈之使用DESeq2模型鑑定出兩群細胞之間差異表現的基因(Love et al., Genome Biol., 2014)；10)「偵測率」，根據細胞群間的偵測率百分比，鑑定出兩群細胞間差異表現的基因。
在一些具體例中，對抗原陽性目標細胞中的VDJ序列相似性進行分群，其中分群VDJ序列相似性包含基於序列的比對，按照胺基酸序列對相似可變區進行分組。
在一些具體例中，抗原陽性目標細胞是IgE +。
在一些具體例中，修整冗餘序列。
本發明還提供鑑定編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由抗體分泌細胞所分泌，該方法包含：a)使一群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸，以允許結合對的第二組分結合至細胞表面，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞；b)使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面上之結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲由抗體分泌細胞所分泌的目標抗體；c)使該群抗體分泌細胞與二級抗Ig抗體接觸，其中由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合二級抗Ig抗體；d)使該群抗體分泌細胞與包含條碼核酸分子的抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原；e)收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的每個細胞分泌一種被抗體捕獲複合物捕獲、被二級抗Ig抗體和被包含條碼核酸分子的抗原結合的抗體，並且其中抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞；f)將抗體分泌細胞庫分離成單抗體分泌細胞，並且對每個單抗體分泌細胞：1)使條碼核酸分子的一部分與附接至固體表面的第一核酸分子的一部分雜交，其中固體表面和附接至其上的第一核酸分子對於每個單抗體分泌細胞是獨特的；2)使包含編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接至固體表面的第二核酸分子的一部分雜交；3)製備基因表現之第一擴增子庫，可變區、多樣性區和接合區(VDJ)之第二擴增子庫，與抗原條碼核酸分子之第三擴增子庫；以及4)對三個擴增子庫中的每一者進行定序；及g)鑑定編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區。
為了可以更有效地理解本文揭示之標的，下面提供實例。應當理解，這些實例僅用於說明目的，不應被解釋為以任何方式限制請求之標的。除非另有說明，否則在這些實例中，分子選殖反應和其他標準重組DNA技術是根據Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989)中描述的方法使用市售試劑進行的。 實例 材料與方法 使用的試劑 小鼠流式抗體 ( 螢光偶聯 )
抗體 AbPID 或純系 # 供應商 REGN# 或目錄 # 批號 #
Fc Block (CD16/32) 2.4G2 Tonbo Biosciences 70-0161-M001 P0161032315705
B220 RA3-6B2 BD 563793 121784
CD138 281-2 BD 563193 9309295
IgG1 A85-1 BD 740121 0030366
IgE R35-72 BD 564207以及744281 44493以及1082998
IgM II/41 Invitrogen 47-5790-82 2297386
IgD 11-26c.2a BD 565348 9023728
TCRβ H57-597 Biolegend 109220 B249533
Ly6G 1A8-Ly6g Biolegend 127624 B264760
CD49b DX5 Biolegend 108920 B241908
CD11b M1/70 Biolegend 101226 B259668
TACI 8F10 BD 742840 1260588
CD98 4F2 Biolegend 128214 B347216
CD200R3 Ba13 Biolegend 142208 B301161
CD19 1D3 BD 560143 1022418
IgG2a SB84a Southern Biotech 1155-02 F1320-WE90
CD3 17A2 Biolegend 100214 B316738
人類流式抗體 ( 螢光偶聯 )
抗體 AbPID 或純系 # 供應商 REGN# 或目錄 # 批號 #
人類 FC Block 多株 eBioscience 14-9161-73 2235896
CD20 2H7 BD 560631 6273736
CD38 HB7 BD 562666 8004645
IgE G7-26 BD 566324 7339778
IgD IA6-2 BD 555778 357891
IgM MHM88 BioLegend 314534 B276950
CD3 UHT1 BD 555916 8066963
CD11b ICRF44 BD 562793 8067863
CD14 M5E2 BioLegend 301804 B309751
CD16 3G8 BioLegend 302006 B256873
CD123 7G3 BD 558663 8032894
使用的試劑以及批號
試劑 品牌 目錄 / 批號
人類塵蟎(HDM)萃取物 Greer XPB70D3A25/348717
鹽水 Sigma S8776/RNBF2733
Microtainer®試管 BD Biosciences 365967
OptEIA®小鼠 IgE ELISA套組 BD Biosciences 555248/1138318
EasySep®人類 泛-B細胞分離套組 StemCell 19554/1000042494
EasySep®小鼠 泛-B細胞分離套組 StemCell 19844A/10000054035
鏈球菌親生物素蛋白接合套組 - Lightning-Link® ABCAM ab102921/GR3353137-1以及GR3394825
生物素接合套組 - Lightning-Link® ABCAM Ab201795/GR3406889
牛血清白蛋白(BSA) Sigma A9576/SLCH0670
正常大鼠血清 StemCell 13551/1000039221
Ficoll®密度梯度介質 GE Healthcare 17-1440-03/10292123
硫酸葡聚醣(Dextran Sulfate) NA NA
NHS-生物素 Sigma 20311/3526395
ELISA盤 Thermo Scientific 80040LE/0910
碳酸鹽-碳酸氫鹽塗覆緩衝液 Sigma C3041-100/SLBW0243
蒸餾水 Gibco 15230-170/2337487
Tween® 20 Sigma P1379/SLBS6187
OptEIA® 分析稀釋液 BD Biosciences, 555213/0301707
杜貝可氏磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS) Gibco 14190/2276658
OptEIA® TMB受質 BD Biosciences 555214/9273407
終止溶液 BDH VWR Analytical BDH7500-1/21A1956065
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) ThermoFisher 62247/VG3030411
Der p1抗原 IndoorBiotech NA-DP1-1/44098
Der p 2抗原 IndoorBiotech NA-DP2-1/41384
Der f 1抗原 IndoorBiotech NA-DF1-1/44001
Ole e 1抗原 IndoorBiotech RP-OE1-1/43138
TotalSeq® C0956 BioLegend 405283/B325046
TotalSeq® C0957 BioLegend 405285/B327470
TotalSeq® C0958 BioLegend 405293/B320055
TotalSeq® C0959 BioLegend 405159/B323806
TotalSeq® C0951 Biolegend 405261/B313967
TotalSeq® C0952 Biolegend 405263/B322438
細胞表面的生物素化
洗滌細胞並重新懸浮於含有5%w/v BSA的PBS中。表面Fc用經1：10稀釋的Fc Block (eBioscience)阻斷，同時在4℃下偵測表面BCR (用於細胞株測定)歷時十五分鐘。細胞用PBS再洗滌兩次，以500g離心10分鐘，重新懸浮於1mL新鮮製備的NHS-生物素(Sigma，0.5 mg/mL於PBS)中，並在37℃下培育十五分鐘。經生物素化細胞在含有5% w/v BSA的冷PBS中洗滌三次，每次洗滌步驟更換試管。 分泌型 IgE 捕獲試劑的製備
EctoFcεRIα是使用Lightning-Link®鏈球菌親生物素蛋白接合套組與鏈球菌親生物素蛋白接合，形成分泌型IgE捕獲試劑。簡而言之，製備含有1 mg/mL鏈球菌親生物素蛋白的0.5 mg/mL ectoFcεRIα溶液。將一百微升Modifier試劑添加到溶液中並輕輕混合。取下Streptavidin Conjugation Mix小瓶的蓋子，將包括Modifier試劑的混合物直接添加到凍乾材料上。藉由使用移液管抽出並重新分配添加的懸浮液一次或兩次，將材料輕輕地重新懸浮。蓋上小瓶的蓋子，小瓶在20-25℃下暗處放置三個小時。此後，加入100 µL的Quencher試劑並輕輕混合。因此，產生了分泌型IgE捕獲試劑。 用分泌型 IgE 捕獲試劑培育具有經生物素化細胞表面的細胞
經洗滌的生物素化細胞以1-3 × 10 6個細胞/mL重新懸浮於含有5% w/v BSA和30 µg/mL經純化的分泌型IgE捕獲試劑的1 mL PBS中，並置於六孔盤中。在一些具體例中，在六孔盤中可以使用至多3 mL的體積。將細胞在旋轉平台上於37℃下培育一小時，以捕獲分泌型IgE。然後將細胞在含有5%w/v BSA的PBS中洗滌兩次。 肺臟細胞製備
在獲得肺臟樣品之前準備試管和試劑。將十毫升無菌水加入到50 mg的Liberase® TH中，使最終濃度為26膠原酶Wunsch單位/mL或5.0 mg/mL膠原酶。將一毫升等分試樣放至單獨試管中並儲存在-20℃下。視需要製備Liberase®混合物(消化緩衝液)：
試劑 起始濃度 最終濃度 添加的體積
Liberase TH研究級 26 U/mL 0.7 U/mL 1.0 mL
DNase (在20 mM Tris、 1 mM MgCl 2、50%甘油中) 10 mg/mL 20 µg/mL 74.4 µL
HBSS具有Ca和Mg --- --- 36.1 mL
針對每隻小鼠，將1.5 mL的Liberase®混合物移液到單獨5 mL流式細胞術試管中。將試管保存在冰上或冰涼的試管架上，直到需要消化。
就每隻小鼠來說，將右肺的最大葉或整個肺置於裝有1 mL Liberase®混合物的單獨2 mL Eppendorf®試管中。在彼等試管中，肺臟材料被切成小塊，通常是約2-3 mm的立方體。在37℃下培育這個材料歷時二十分鐘。將經消化的材料添加到gentleMACS TMC試管中，並藉由添加0.5 M EDTA至終濃度為10 mM來終止消化。還添加了兩毫升MACS ®緩衝液。將蓋子拴緊並使用預加載程式m_lung_02_01在gentleMACS™ Octo Dissociator上運行加蓋試管。將所得細胞以400 g離心四分鐘，並倒出收集上清液。在環境溫度下，用1 mL Red-Blood Cell Lysing Buffer溶解小粒中的紅血球歷時三分鐘。此後，加入10 mL DPBS以使得溶解緩衝液不活化。將細胞以400 g離心四分鐘，倒出收集上清液，並將小粒重新懸浮於1 mL DPBS中。懸浮液通過100 µm Millipore®盤過濾器過濾到2 mL深孔盤中。將細胞以400 g離心四分鐘，然後重新懸浮於500 µL DPBS中。每個樣品的五十微升與其他樣品的100 μL匯集，並將150 μL匯集樣品添加到圓底96孔盤中。 引流淋巴結細胞製備
向十二孔70 µm細胞濾網盤中加入1-2mL RPMI培養基。收集引流淋巴結並添加到盤中。準備PCR盤，用20 G針頭在每孔中打孔，然後放置在2 mL深孔盤上。
使用3 mL注射器的後端，在2mL RPMI培養基中的74 µm細胞濾網上搗碎引流淋巴結。通過100 µm Millipore®盤式過濾器將製備物過濾到2 mL深孔盤中，並將過濾後的細胞以400 × g離心四分鐘。將小粒重新懸浮在500 µL DPBS中，並轉移到96孔深底盤中。將該盤以400 × g離心四分鐘。將細胞重新懸浮在200 µL PBS中。在96孔圓底管中加入200 µL懸浮液。將盤以400 x g離心四分鐘，然後甩掉上清液。一週三次鼻內投予50 µg HDM萃取物(稀釋於20 µl鹽水)持續十五週的小鼠的典型細胞計數為230 × 10 6個細胞。 骨髓細胞製備
向48孔盤中添加200 μL的RPMI培養基。準備PCR盤，用20 G針頭在每個孔中打孔，然後放置在2 mL深孔盤上。
取出小鼠的股骨並清潔骨骼。切割每根骨骼的兩端並放置在帶孔的PCR盤中。將PCR盤置於2 mL深孔收集盤的頂部，並以500 × g離心四分鐘。如果骨骼中殘留任何BM，則重複離心步驟。將小粒重新懸浮於添加500 µL紅血球溶解緩衝液中。懸浮液在環境溫度下培育三分鐘，之後加入1-2 mL PBS以使得溶解緩衝液不活化。將所得細胞以400 × g離心四分鐘，並將小粒重新懸浮於1 mL DPBS中。懸浮液通過100 µm Millipore盤過濾器過濾到2 mL深孔盤中。從每個樣本取出約100-200 µL用於螢光減一(fluorescence minus one , FMO)，其中樣本庫用於FMO。將等分的合併樣品放入12個用於FMO的孔中。將剩餘樣品以400 × g離心四分鐘。
將骨髓樣品重新懸浮於200 µL PBS中。將一半的骨髓樣品置於96孔圓底盤中。將盤以400 × g離心四分鐘，然後甩掉上清液。一週3次鼻內投予50 µg HDM萃取物(稀釋於20 µl鹽水)持續十五週的小鼠的典型細胞計數為116 × 10 6個細胞。 脾臟細胞製備
從小鼠萃取脾臟，並使用預加載程式TBA在gentleMACS™試管中的5mL DPBS中進行勻質化。勻質化的脾臟以400 × g離心四分鐘，丟棄上清液。然後將脾臟重新懸浮在4 mL紅血球溶解緩衝液中，並在室溫下培育5分鐘，之後加入10 mL DPBS以中和溶解緩衝液。然後將脾臟以400 × g離心四分鐘並丟棄上清液。接著將脾臟重新懸浮在10 mL DPBS中，並通過70 µM過濾器過濾以獲得單細胞懸浮液。確定細胞計數和活力，然後對脾臟進行抗原+B細胞染色。 泛 B 細胞分離
使用EasySep®小鼠泛-B細胞分離套組分離B細胞。簡言之，在含有S%w/v BSA的0.5-8 mL PBS中以1 × 10 8個細胞製備樣品。每mL樣品加入五十微升大鼠血清。將樣品添加到14 mL聚苯乙烯圓底管(目錄#35205，批號00421123)中。將細胞混合並在環境溫度下培育五分鐘。每毫升樣品中加入五十微升已渦旋三十秒的RapidSpheres®，混合物培育2.5分鐘。將含有5% w/v BSA的磷酸鹽緩衝鹽水添加至5 mL體積，並將試管置於Big Easy EasySep®磁體(StemCell目錄#18001)中，在環境溫度下歷時2.5分鐘。將富集的細胞懸浮液倒入新試管中並計數。該程序的概述如下：
50 µL 樣品
細胞 類型 細胞 計數 重新懸浮至 10 8 個細胞 /mL 添加的大鼠血清 添加的混合物 RapidSpheres® 回收的泛 -B 細胞
HDM攻毒後的BM 116 × 10 6 1160 µL 58 58 58 68 x 10 6
HDM攻毒後的DLN 230 × 10 6 2300 µL 115 115 115 30 x 10 6
實例 1 ：開發捕獲複合物
為了將分泌型抗體與分泌它們的ASC進行配對，衍生出可以局部捕獲ASC表面上的分泌型抗體的免疫球蛋白捕獲複合物(圖1)。為實現這一個目標，使用NHS-生物素對細胞表面進行生物素化，NHS-生物素具有可結合至細胞表面一級胺(-NH2)的親水性活性基團。然後使用偶聯至Fc結合試劑(IgG的αIgk和IgE的FcεRIα胞外域)的鏈球菌親生物素蛋白在細胞周圍組裝親和力基質，以捕獲ASC的分泌型免疫球蛋白(圖1)。為了標記PC的抗原特異性，這個方法與條碼抗原及/或螢光標記抗原染色相結合(圖1)。使用10X Genomics試劑生成單細胞轉錄組(scRNA-seq)、條碼抗原信號和VH：VL抗體序列。
為了確定IgG和IgE捕獲複合物的功能性、靈敏度和特異性，ARH77 (一種IgG (κ輕鏈)分泌細胞株)和U266 (一種IgE (λ輕鏈)分泌骨髓瘤細胞株)用於原理實驗證明(圖4A、4B、4D和4E)。首先證實了兩個細胞株均缺乏BCR表面表現(圖16A和16B)。使用NHS-生物素對ARH77和U266細胞進行生物素化，並針對IgG使用偶聯至抗人類Igk的鏈球菌親生物素蛋白(StAv-algk)，且針對IgE使用偶聯至高親和力IgE受體的胞外域FcεRIα (StAv-FcεRIα)組裝捕獲複合物。捕獲的靈敏度是藉由IgG和IgE染色來確定(圖4A和4B)。雖然缺少親和力基質的任何部分的ARH77和U266細胞在其表面缺乏IgG與IgE，但分泌物捕獲複合物的所有組分的成功組裝允許特異性偵測分泌它們的細胞表面的分泌型IgG與IgE(圖4A和4B)。為了進一步確定結合分泌型抗體所需的StAv-αIgk和StAv-FcεRIα的最低濃度，對捕獲複合物進行了劑量滴定，發現到StAv-αIgk在3.75μg/mL飽和，而StAv-FcεRIα在15-30μg/mL之間飽和(圖4D和4E)。
為了測試捕獲複合物的特異性，將表現IgM的Ramos細胞與U266細胞按1：1 (圖4F)或100：1 (圖16C)混合，並在混合群體上組裝IgE分泌物捕獲複合物。在Ramos細胞表面沒有觀察到分泌型IgE的結合，這表明在測試的稀釋度和培養條件下與鄰近細胞的串擾很少或沒有串擾(圖4F；圖16C)。 實例 2 ：分泌型 IgE 捕獲的概念驗證 分泌型 IgE 的捕獲：實驗程序
一種方法是將給定的分泌型IgE抗體與分泌該抗體的PC配對。圖2(步驟1)顯示已用NHS-生物素進行生物素化的PC表面，因為NHS-生物素的N-羥基琥珀醯亞胺基團具有親水性活性基團，可與細胞表面一級胺(-NH 2)非特異性地反應。步驟2顯示與生物素化PC結合的分泌型IgE捕獲試劑。圖2(步驟2)還顯示了分泌型IgE捕獲試劑的ectoFceRIa捕獲PC分泌的IgE。圖2(步驟3)顯示結合至條碼抗原以及被抗IgE抗體結合的捕獲IgE。 分泌型 IgE 捕獲試劑成功捕獲 U266 細胞表面上的分泌型 IgE
分泌IgE的U266細胞的表面如本文所述進行生物素化，在含有5% w/v BSA的冷PBS中洗滌三次，每次洗滌步驟更換試管，並如本文所述與分泌型IgE捕獲試劑一起培育。之後，洗滌細胞並在4℃下於含有5% w/v BSA、10 mg/mL硫酸葡聚醣和1：50 Fc block的PBS中，用Brilliant TMViolet 711標記的抗IgE (BD)染色三十分鐘。然後用10 × Brilliant TMViolet緩衝液洗滌細胞。此後，將細胞在PBS中洗滌兩次並用BD Cytofix TM固定。隨後，獲得流式細胞測量術數據。
發現分泌型IgE捕獲試劑可特異性地捕獲U266細胞表面的分泌型IgE抗體(圖4B)。重要的是，在未生物素化、與分泌型IgE捕獲試劑培育或與Brilliant TMViolet 711標記的抗IgE接觸的對照細胞中未偵測到細胞表面IgE抗體。這證實了每個步驟都是偵測捕獲的分泌型IgE所必需。此外，在U266細胞上未偵測到作為BCR的IgE。這證實在U266細胞表面偵測到捕獲的分泌型IgE抗體，而不是作為BCR一部分的IgE(圖4C)。為了測試IgE分泌捕獲試劑的特異性，將U266細胞與分泌人類IgM的Ramos細胞以1：1的比例混合。與單獨的U266細胞一樣，將混合細胞與分泌型IgE捕獲試劑一起培育。然後將細胞在PBS中洗滌並用Cytofix TM固定，與單獨的U266細胞一樣。再次擷取流式細胞測量術數據。發現分泌型IgE捕獲試劑可以捕獲U266細胞表面的分泌型IgE抗體，但不能捕獲Ramos細胞分泌的IgM。這表明分泌型IgE捕獲試劑的特異性(圖4C)。 實例 3 ：在初代漿細胞表面上捕獲分泌型 IgE
IgE Venus和Blimp-1 mCherry報導小鼠被用來確定分泌型IgE捕獲試劑是否可以在產生IgE的初代漿細胞表面捕獲分泌型IgE。具體來說，已被插入膜IgE基因座下游的Venus報導子會辨識分泌IgE的細胞，而插入Blimp-1下游的mCherry報導子則辨識PC(Asrat et al., Sci. Immunol., 2020, 10, eaav8402)。用稀釋於20 µl鹽水溶液中的50 µg HDM萃取物對小鼠進行攻毒，一週3次鼻內投予持續十五週。如本文所述將小鼠麻醉並犧牲。如本文所述製備BM細胞並且如本文所述製備LDLN。來自小鼠的BM被匯集在一起，並且分別將來自小鼠的dLN匯集在一起。分離泛-B細胞並用包含Brilliant TMViolet 711標記的抗IgE (BD)的抗體混合物染色，以便在4℃下在含有5% w/v BSA的PBS中偵測分泌型IgE持續三十分鐘。標記的細胞在含有5% w/v BSA的PBS中洗滌，用Cytofix TM固定，並用BD FACSymphony® S6流式細胞儀分選(圖7A和7B)。漿細胞按以下順序圈選：細胞、單細胞、活細胞、DUMP -細胞、CD138 +Blimp-1 +細胞(圖7A和7B)。Dump是同一通道中標記的集合，包括CD3、CD11b、IgD、IgM、Ly6g等。排除任何表現這些標記的細胞。使用抗CD138抗體偵測CD138，並將漿細胞圈選為Blimp1 +CD138 +細胞。分泌IgE的PC被分選為IgE Venus+細胞(圖7C)。 實例 4 ：抗原特異性、表現 IgE 的漿細胞的單細胞庫製備與定序
圖7A顯示實例3到5的步驟的代表性概述，而圖9顯示了從條碼抗原結合至PC表面所捕獲的分泌型IgE到庫選擇和定序的步驟。
如實例3中所述製備漿細胞。將單PC懸浮於具有0.04% w/v BSA的PBS中，並以每道15,000個細胞加載到Chromium® Controller裝置(10x Genomics)上。在條碼珠粒中形成PC的分區並溶解PC。進行逆轉錄，然後分解分區。使用Chromium® Next GEM Single Cell 5' Kit, v.2 (10x Genomics)製備RNA-seq、Feature Barcode和V(D)J庫。庫擴增後，cDNA被分成單獨的RNA-seq、特徵條碼和V(D)J等分試樣。為了富集BCR序列的V(D)J等分試樣，使用Chromium® Automated Single Cell Mouse and Human BCR Amplification & Library Construction Kit (10x Genomics)。使用Chromium® 5' Feature Barcode Library Construction套組(10x Genomics)製備DNA條碼抗原或DNA條碼細胞表面蛋白的Feature Barcode庫。RNA-seq庫的成對末端定序在Illumina NovaSeq® 6000定序系統上進行，read 1為26 bp用於獨特分子識別符(UMI)和細胞條碼，而read 2為80 bp用於轉錄本讀段，10 bp i7和10 bp i5讀段。還對特徵條碼庫進行了成對末端定序，read 1為26 bp用於UMI和細胞條碼，read 2為35 bp用於特徵條碼讀段，以及10 bp i7和10 bp i5讀段。還對V(D)J庫進行成對末端定序，read 1為150 bp，i7為10 bp，i5為10 bp，且read 2為150 bp。關於RNA-seq和Feature Barcode庫，Cell Ranger Single-Cell Software Suite 6.1.1版(10x Genomics)用於執行樣本分離、比對、過濾和UMI計數。人類GRCh38和小鼠mm10基因組組裝以及人類和小鼠的RefSeq基因模型分別用於比對。關於V(D)J庫，Cell Ranger軟體用於執行樣本分離、將讀段對從頭組裝成片段重疊群、比對，並且相對於來自生殖系小鼠IMGT參考數據庫的所有V(D)J生殖系參考序列註釋片段重疊群。 實例 5 ：抗原特異性、表現 IgE 的漿細胞的單細胞分析
圖10顯示此實例中所述的步驟的代表性流程圖。定序後，對單細胞基因表現庫、分泌型抗體V(D)J區庫和條碼抗原庫同時進行分析，得到候選抗原陽性的分泌型IgE抗體序列。
單細胞基因表現庫被映射並與標準小鼠參考基因組Mm10並比對。隨後，每個基因的獨特映射計數是藉由CellRanger軟體確定。使用單細胞比對軟體STAR將讀段映射到標準參考基因組，其中每個讀段都包含一個獨特的分子識別符，該識別符映射到標準Mm10參考基因組的註釋基因。針對每個獨特分子識別符(UMI)對映射讀段進行分箱和計數，從而生成單細胞計數矩陣，其包含每個註釋基因的映射計數和每個UMI的計數。然後藉由計算註釋基因總數除以計數的UMI總數的log 10的比率來過濾單細胞計數矩陣。過濾掉基因與UMI之比低於約0.1的細胞。過濾掉UMI總數的四分位數間距超過四倍的細胞。過濾掉具有超過約80%的讀段映射到粒線體基因的細胞。留下了基因與UMI之比高於約0.1、計數的UMI總數的四分位數間距小於約四倍、映射到粒線體基因的讀段少於80%的高品質細胞。來自每個單獨樣品捕獲的計數矩陣被標準化為10,000的總計數，並使用調和演算法進行批次校正以生成組合均勻流形近似和投影(UMAP)。然後使用萊頓演算法的非監督分群來確定細胞類型集群，並使用Wilcox檢定來鑑定特定細胞類型和集群標記基因。
IgBlast序列分析工具(Ye et al., Nucleic Acids Res., 2013, 41,W34-W40)用於將V(D)J序列與生殖系小鼠IMGT參考數據庫進行比對。然後藉由有效的框內比對、全長CDR3和序列中沒有終止密碼子來過濾有效的V(D)J序列。IgBlast工具還確認了免疫球蛋白同型、可變區、多樣性區和接合區的基因映射，以及每個細胞重鏈和輕鏈序列的準確全長可變區。
條碼抗原庫由CellRanger軟體映射到訂製的短讀段參考品，其含有四種條碼抗原的DNA標籤序列，即Der p 1、Der p 2、Der f 1和Ole e 1。這些標籤序列在所有細胞中進行量化，並藉由在每個樣本捕獲中對每個條碼抗原取中心對數比(CLR)進行標準化。此外，每個條碼抗原的背景抗原信號被DSB(背景降噪和縮放)去除。CLR和DSB標準化值都用於相對對照信號(即Ole e 1的信號)量化目標抗原信號(即Der p 1、Der p 2和Der f 1的信號)。
IgG的抗原特異性分數(AgSS)是藉由從hIL-6Rα條碼UMI計數的分位數扣除hIL-4Rα條碼UMI計數的分位數乘以懲罰因數(x)來計算的，AgSS = Q hIL-4Rα- Q hIL-6Rα x。IgE的AgSS是使用與小鼠和人類單細胞數據類似的公式計算。關於IgE分數，目標抗原是Der p1、Der p2或Der f1，而對照始終是Ole e1。
Ig BCR序列是使用scirpy v0.10，使用基於胺基酸序列的函數scirpy.pp.ir_dist分群，漢明距離(hamming distance)小於4。基於漢明距離小於4的先前標準，集群BCR以函數scirpy.tl.define_clonotypes根據重鏈CDR3胺基酸序列被收集到選殖型中。Scirpy文檔可以在全球資訊網上於「scverse.org/scirpy/latest/api.html」被引用。
在處理三個單細胞庫後，基因表現和V(D)J區定序數據用於對具有有效IgE恆定區和可偵測IgE和CD79a表現但缺乏非PC B細胞中通常發現的Ms4a1和CD19表現的PC進行子集化。然後評估表現IgE的PC與其他IgA、IgG和IgM漿細胞同型的差異表現，以進一步特徵鑑定分泌IgE的PC的獨特轉錄特徵。然後透過比較目標抗原(即Der p 1、Der p 2或Der f 1)的標準化含量與對照抗原Ole e 1的標準化含量來評估分泌IgE的PC的抗原特異性。這是藉由計算每個目標抗原的經驗分數，並將對照抗原的分位數等級與懲罰因數扣除目標抗原的分位數等級來進行。用於進行的公式如下： 抗原特異性 = qT - qC x其中qT是指目標信號的分位數，qC是指對照信號的分位數，而x是懲罰因數。
針對三種目標抗原中的每一者確定每個細胞的抗原特異性分數(AgSS)，並用於確定具有最強目標抗原信號的細胞的優先性，同時最小化對照抗原的信號。使用來自所討論細胞的成對VH：VL抗體序列，從目標抗原信號的排序表中挑出候選抗體。圖11顯示了抗原特異性的可視化。 實例 6 ： IgE 結合 ELISA
挑選出過敏原特異性抗體後，藉由ELISA量化與Der p 1、Der p 2和Der f 1的相對結合。圖12顯示基於抗原信號的IgE候選表。擷取了1,069個IgE +細胞的數據。具體而言，結合微量滴定板在4℃下用100 µL PBS中的2 µg/mL天然Der p 1、Der p 2、Der f 1和Ole e 1塗覆過夜。以1 µg/mL的濃度製備IgE抗體，並在含有0.5% w/v BSA的PBS中連續稀釋三倍。在用PBS中的0.05% v/v Tween® 20洗滌並在含0.5% w/v BSA的PBS中阻斷後，將100 µL經稀釋的IgE抗體轉移到盤並在環境溫度下培育一小時。隨後，加入100 µL以1：5000稀釋的偶聯至辣根過氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgE抗體。然後將盤在環境溫度下培育一小時，並在PBS中的0.05% v/v/Tween® 20中洗滌。隨後，添加HRP受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)。終止反應(使用100 µL硫酸2.0 N)並使用讀盤器在450 nm下測定光密度值。發現IgE mAb1、mAb3和mAb6有效結合至Der p 1和Der f 1 (圖13A)。然而，這些抗體不結合至陰性對照過敏原Ole e 1 (圖13B)。與IgE mAb1、mAb4和mAb6相比，其他IgE mAb與Der p 1和Der f 1的結合效率較低。總的來說，這些數據證明，三種IgE抗體(被分泌型IgE捕獲試劑捕獲並確定了V(D)J區)特異性地結合至Der p 1和Der f 1。 實例 7 ： IgE 漿細胞在活體內的捕獲以及概況
為了驗證活體內IgE捕獲，先前描述的IgE Venus和Blimp-1 mCherry報導小鼠(圖7A)暴露於室塵蟎(HDM)萃取物歷時15週，並使用StAv-FcεRIα胞外域捕獲分泌型IgE，如圖1中所述。細胞用含PC標記的抗體混合物、分泌型IgE的αIgE和寡核苷酸條碼HDM過敏原(包括Der p1、Der p2、Der f1和Olive過敏原(Ole e1)作為陰性對照)染色。使用Blimp-1信號(圖7B和7C)對PC進行圈選，並分選IgE PC(圖7B和7C)與非IgE PC(圖7B和7C)以進行比較。與U266和Ramos的觀察結果一致(圖4F)，僅在IgE PC上偵測到分泌型IgE，而在其他同型(非IgE PC)上則否，證實了混合細胞群中捕捉的特異性(圖7B和7C)。 實例 8 ：由暴露於 HDM 的小鼠的骨髓和淋巴結定序的 IgE 漿細胞
為了闡明組織駐留IgE PC的生物學，合併了肺臟dLN和BM的單細胞轉錄組學概況，並進行細胞分群以比較IgE和非IgE PC。獲得了12,646個IgG+細胞、17,524個IgA+細胞、3,503個IgM+細胞和1,703個IgE+細胞(圖7D)。從單細胞轉錄組中，確認了免疫球蛋白表現，並鑑定每種同型的特定基因表現程式。IgE PC表現高含量的 Ighe、 Slpi、 Sdf2l1和 Pdia4 。IgG PC表現 Ighg1和略高的 Cd74與 B2m ，而IgA PC表現 Igha和更高量的 Cd79a與 Cd69 。IgM PC表現 Ighm和更高的 Slc3a2、 Ctss與 Ghg(圖7E)。
使用條碼HDM過敏原，可以直接將IgE PC映射到它們對Der p1、Der p2、Der f1(HDM過敏原)和Ole e1(橄欖過敏原，陰性對照)的特異性，並比較其AgSS，其如實例4中所述進行計算。抗原是Der p1、Der p2和Der f1，所有的對照都是Ole e1 (橄欖抗原) (圖7F)。
基於反應性概況(參見表3)挑選一些過敏原特異性IgE抗體，並藉由ELISA測試了其與Der p1、Der p2和Der f1以及橄欖過敏原Ole e1的相對結合。2個IgE抗體(IgE mAb12_2和mAb 3_1)結合到Der p1 (圖6F，圖19A)，3個IgE結合到Der p2 (IgE mAb12_2，mAb8_2和mAb21_2)，而6個IgE結合到Der f1 (IgE mAb12_2、mAb1_2、mAb 1_1、mAb3_1、mAb4_1和mAb 6_1)。除了Der p1、Der p2和Der f1以外，Ab12_2還結合到Ole e1 (圖7G)，但與Fel d1未顯示任何結合(圖19B)。
為了確定顯示HDM-過敏原結合的IgE是否具有過敏潛力，進行了被動皮膚過敏(PCA)分析。小鼠在其左耳中用Der p1或Der p2特異性IgE (圖7G和圖19A)的混合物進行皮內致敏，在右耳中用不相干的DNP-IgE作為陰性對照。24小時後，小鼠用含有Der p1 (A組)或Der p2 (B組)的伊凡氏藍(Evans blue)進行靜脈內攻毒(圖7H)。肥大細胞去顆粒僅在用Der p1或Der p2特異性IgE致敏的耳朵(左耳)中觀察到，如藉由伊凡氏藍染料滲漏所測量(圖7H)，證實所使用的IgE抗體混合物誘導FcεRIα和肥大細胞去顆粒的串擾。 實例 9 ：人類初代細胞：從過敏捐贈者的骨髓中鑑定和剖析 IgE PC
為了確定IgE分泌捕獲是否可以擴展到人類初代細胞，吾人對自身回報過敏捐贈者的BM進行了IgE分泌捕獲。富含B譜系的細胞塗覆有NHS-生物素，並使用StAv-FcεRIα胞外域捕獲分泌型IgE，如先前圖1中所述。PC圈選為CD38高/CD20低(圖20A)，而StAv-FcεRIα分泌捕獲的特異性和功能性在具有完整生物素-StAv-FcεRIα組裝的非過敏性BM (圖8A)以及缺乏StAv-FcεRIα的過敏性BM (圖8A)中得到證實。為了對人類IgE分泌捕獲進行全面驗證，挑選血清中已確認的貓、貓尾草和HDM反應性IgE的捐贈者(圖8B、圖20B)，進行了IgE分泌捕獲，並且分選BM的所有IgE PC和非IgE PC數據進行比較。
分選後，scRNA-seq從貓、貓尾草和灰塵過敏個體的5,559個骨髓PC回收完整的轉錄組和BCR序列。PC捕獲的特異性是基於各種免疫球蛋白基因和PC標記(諸如 XBP1、 SLAMF7和 CD74)的豐富表現而得到證實，但未觀察到B細胞標記(諸如 MS4A1和 CD19) (圖8C)。藉由VH：VL定序和利用IgBlast與人類生殖系數據庫的比對，鑑定出十個IgE PC。這些IgE PC與 IGHE轉錄本表現以及來自IgA和IgG同型的一小部分細胞(也表現 IGHE)的相關性非常強，可能反映出這些同型之間的連續類別轉換或一些IgA和IgG細胞中的無效(sterile) IGHE轉錄(圖8C和8D)。這表明儘管IgE PC在人類骨髓中很少見，但本發明的捕獲方法能夠分離並剖析IgE PC。
為了研究純系演化，基於重鏈CDR3區的胺基酸序列(允許至多3個胺基酸錯配、缺失或插入)將所有5,559個細胞的VH序列進行分群。10個IgE PC被獨特地分成5個純系型(clonotype)，它們被定義為一群具有高度相似的重鏈胺基酸CDR3的PC (見表4)。兩個純系型，表示為753 (n=4個細胞)和696 (n=3個細胞)，完全由IgE細胞組成，且每個純系型分別展現出相同的CDR3序列(圖8E)。表示為1330和576的兩個其他純系型是來自個別IgE細胞的單細胞純系(圖8E)。有趣的是，純系型21含有14個IgG細胞和單一個IgE (圖8E)。對純系型21的CDR3核苷酸序列的仔細檢查揭示，單獨IgE序列在CDR3區內含有3個點突變，而純系型21的所有IgG成員都攜帶相同的CDR3區(圖8F)。此外，與IgG純系型成員相比，IgE序列在上游V基因座(圖8F)中帶有體細胞超突變，表明存在額外的親和力成熟輪次。
挑出IgE純系後，吾人藉由ELISA測試經純化IgE和對照(DNP-IgE)與捐贈者過敏的相關過敏原的結合(Fel d1為貓，Der p1為灰塵或Can e1作為對照為狗) (圖8G)。一種結合至Fel d1，但不結合Can e1或Der p1的經純化IgE mAb (圖8G)，表明可以使用本發明IgE捕獲方法成功地從過敏BM中分離人類IgE抗體。 實例 10 ：分泌型 IgG 捕獲的概念證明 分泌型 IgG 捕獲試劑的製備
抗小鼠IgK抗體是使用Lightning-Link®鏈球菌親生物素蛋白接合套組與鏈球菌親生物素蛋白接合，形成分泌型IgG捕獲試劑。簡言之，製備含有1 mg/mL鏈球菌親生物素蛋白的抗小鼠IgK抗體溶液。將一百微升Modifier試劑添加到溶液中並輕輕混合。取下Streptavidin Conjugation Mix小瓶的蓋子，並將包括Modifier試劑的混合物直接添加到凍乾材料上。藉由使用移液管抽出並重新分配添加的懸浮液一次或兩次，將材料輕輕地重新懸浮。蓋上小瓶的蓋子，小瓶在20-25℃下暗處放置三個小時。之後，加入100 µL的Quencher試劑並輕輕混合。因此，生成分泌型IgK捕獲試劑。 分泌型 IgG 的捕獲：實驗程序
圖3 (步驟1)顯示了已用NHS-生物素進行生物素化的PC表面。圖3 (步驟2)顯示了結合至經生物素化PC的分泌型IgG捕獲試劑。圖3 (步驟2)還顯示了分泌型IgG捕獲試劑的抗小鼠IgK抗體捕獲PC所分泌的IgG。圖3 (步驟3)顯示捕獲的IgG結合至條碼抗原並且被抗IgG抗體結合。 在初代漿細胞表面上捕獲分泌型 IgG
為了偵測分泌抗原特異性IgG的PC，將VI3/VelocImmune小鼠的足墊一週兩次用免疫原進行免疫，持續四週。小鼠休息一個月，然後在麻醉、犧牲和取得BM、脾臟和引流淋巴結前四天用免疫原進行追加免疫。如本文所述製備骨髓、脾臟和引流淋巴結的細胞。匯集脾臟和淋巴結的單細胞製劑，並在4℃下用1：10稀釋的Fc Block阻斷表面Fc受體歷時十五分鐘。然後使用抗體混合物對匯集的製劑進行染色，以圈選出抗原特異性IgG +B細胞(圖14A)。脾臟和淋巴結的抗體混合物包括針對鼠類IgG1、IgG2a、CD19、IgM、IgD和CD3的抗體。BM的抗體混合物包括針對鼠類B220、CD138、TACI、CD98、TCRB、CD200R3、Ly6G、CD49b、CD11b、IgM、CD19、IgG1、IgG2a和IgD的抗體。所有抗體均為市售。PC表面如本文所述進行生物素化，在含有5% w/v BSA的冷PBS中洗滌三次，每次洗滌步驟更換試管，並如本文所述在分泌型IgG捕獲試劑存在而分泌型IgE捕獲試劑不存在的情況下和分泌型IgG捕獲試劑一起培育。將細胞在旋轉平台上於37℃下培育一小時，以捕獲分泌型Ig抗體，並用含有異硫氰酸螢光素標記的抗IgG (BD Biosciences和Southern Biotech)的抗體混合物染色，以供偵測捕獲的IgG和條碼、藻紅素標記的免疫原(在含有5% BSA的PBS中，在4℃下歷時三十分鐘)。標記的PC在BD FACSSymphony® S6流式細胞儀上進行分選，並鑑定出其上已捕獲到分泌型IgG的PC (圖14B)。對照用來偵測在其細胞表面上捕獲分泌型IgG的抗原特異性群(圖14C)。 實例 11 ：在其表面捕獲分泌型 IgG 的漿細胞的單細胞庫製備和定序
對於已捕獲IgG的分泌IgG的PC，以實例3中所述方式製備和定序基因表現庫、分泌型IgG的V(D)J區和條碼抗原。以實例4中所述方式進行映射、量化、標準化和處理個別庫。由於VelocImmune®小鼠的V(D)J區的人源化性質，V(D)J庫被映射到標準人類生殖系IMGT參考品。在處理三個單細胞庫後，基因表現和V(D)J區定序數據被用來對具有有效IgG恆定區和可偵測到IgG和CD79a表現但缺乏通常在非PC B細胞中發現的Ms4a1和CD19表現的PC進行子集化。為了挑出抗原特異性、表現IgG的PC，如實例4中所述針對對照抗原(hIL-6Rα)計算目標免疫原的抗原特異性分數。結果如圖15中所示，骨髓的UMAP在圖15A和15B中，而脾臟的UMAP在圖15C和15D中。圖15B和圖15D中的x軸表示免疫原抗原信號的中心對數比，而y軸表示hIL-6Rα抗原信號的中心對數比。圖15D僅顯示了依據CD79A但缺少CD19和MS4A1表現所確定的漿細胞。如VDJ庫定序確定的漿細胞同型對細胞進行著色。 實例 12 ： IgG 和 Ag+ ELISA
為了測試IgG分泌捕捉的BCR序列的抗原特異性和IgG表現，hIL-4Rα抗原或抗人類IgG (Jackson Labs)分別以1ug/mL或2ug/mL在+4℃下舖盤過夜。次日，將盤在補充有0.05% Tween20的PBS (PBS-T)中洗滌三次，並在室溫下用含有0.5% BSA的PBS阻斷1小時。隨後用PBS-T洗滌盤三次，並將經BMPC、PB/PC樣或脾臟B細胞部分的個別BCR轉染的Expi293F細胞的稀釋上清液在室溫下舖盤1小時。然後用PBS-T洗滌盤三次，且在室溫下以1：10,000與抗人類IgG-HRP抗體(Jackson Labs)培育1小時。盤在PBS-T中洗滌三次，使用TMB受質顯影，使用1N硫酸終止，並在450nm下讀取。 實例 13 ：鑑定和分離來自經免疫小鼠的抗原特異性 IgG 抗體分泌細胞
如圖1中所述，αIgk抗體接合至鏈球菌親生物素蛋白，以使用κ輕鏈捕獲分泌型抗體。然後將StAv-αIgk捕獲複合物用於經NHS-生物素塗覆的ASC，這些ASC來自經人類IL-4Rα (hIL-4Rα)免疫的VelocImmune®小鼠。Ag +/IgG +分泌漿細胞的偵測是藉由用抗小鼠IgG和條碼hIL-4Rα抗原對細胞進行染色來實現的。條碼hIL-6Rα用作為陰性對照(圖5A)。
如圖5和17中所示，為了偵測Ag +/IgG +ASC，小鼠經由足墊用hIL-4Rα單體蛋白免疫(圖5A和圖17A)。生成了BM細胞的單細胞懸浮液，並藉著負向選擇富集B譜系細胞(圖5A)。如本文所述，細胞用NHS-生物素塗覆並用StAv-algk捕獲分泌型IgG (圖1)。在表面組裝生物素-StAv-algk複合物後，用含有PC特異性標記的抗體混合物對經富集的B細胞/ASC進行染色，αIgG用於偵測分泌型IgG，條碼hIL-4Rα用於偵測Ag+細胞而條碼的hIL-6Rα作為陰性對照。同一隻小鼠的脾臟和引流淋巴結(dLN)被匯集並使用類似的抗體混合物染色，用於比較來自Ag+ B細胞和漿母細胞(PB)與BMPC的VH：VL序列(圖17B和17C)。BM的Ag +/IgG +PC使用染色對照與脾臟/dLN的表現表面BCR (PB/PC)的B細胞和ASC一起進行分選(圖5B和圖17B、17C與17D)。
對分選的BMPC、脾臟/dLN B細胞，以及PB/PC進行scRNA-seq，以確定轉錄差異、鑑定VH：VL圖譜變化並且在單細胞層次上量化抗原特異性。從hIL-4Rα和陰性對照抗原hIL-6Rα的條碼抗原計數，驗證了Ag +/IgG +細胞(圖5C)。為了優先考慮特異性並儘量減少多反應性，確定了抗原特異性分數(AgSS)以挑出對hIL-4Rα具有強烈特異性和hIL-6Rα結合最低的細胞。具有高AgSS的細胞被優先用於hIL-4Rα而具有最少條碼UMI計數用於對照抗原hIL-6Rα (圖5C)。組合轉錄分析和無偏分群表明來自脾臟或BM的漿細胞被分在一起並表現經典PC標記，諸如 Slamf7、 Xbp1、 Sdc1、 Prdm1和 Slc3a2(圖5D，圖18A)。然而，脾臟B細胞以與漿細胞非常不同的方式分群，並表現典型的B細胞標記，諸如 Ms4a1和 Cd79a(圖18A)。此外，BM和脾臟的具有高AgSS (＞0.5)的Ag+細胞通常被分在一起(圖5D)。特別是在BM PC中，具有高AgSS的細胞集群在UMAP底部(圖5D)。 實例 14 ：從骨髓和脾臟 /dLN B 細胞中分離的抗原特異性 IgG 漿細胞的親和力
scRNA-seq產生了三群不同的細胞：骨髓漿細胞(BMPC)、脾臟/dLN漿母細胞/漿細胞樣(Sp/dLN PB/PC)和脾臟/dLN B細胞(Sp/dLN B細胞)。從這些細胞群的每一者中，由具有最高hIL-4Rα條碼信號的細胞挑出20個獨特的VH：VL序列用於選殖和表現分析(圖18B和18C)。20個重鏈和輕鏈可變序列已從BMPC、19個從Sp/dLN B細胞和19個從Sp/dLN PB/PC成功選殖到表現人類IgG4和人類Igk恆定的載體中(參見表1)。
在所有三群中觀察到一致的IgG表現，但在80% (16/20)的BMPC中觀察到抗hIL-4Rα活性，相較於Sp/dLN PB/PC與Sp/dLN B細胞分別為32% (6/19)和53% (10/19) (圖5E；表1)。當考慮上清液中的IgG含量不一時，BMPC的hIL-4Rα：總IgG結合的中值比也更高，這表明這些序列將具有更高的親和力(圖5E)。上清液和純化抗體的Biacore分析證實了這一點，來自BMPC的抗體具有最高親和力抗體，如結合Kd的負log10所測量(圖5F和圖18D)。 實例 15 ：捕獲的 IgG 細胞的 scRNA-seq
在驗證Ag +細胞後，吾人研究了藉由VDJ區的scRNA-seq獲得的獨特BCR序列，以將Ag +BMPC與脾臟/dLN的B和PB/PC進行比較。所有細胞的BCR序列被IgBlast映射到特定的V、D和J基因區段，而體細胞超突變的程度是藉由與生殖系V區的相似性百分比來衡量。所有三個區室中的Ag +細胞與生殖系V區的相似性百分比較低，因此突變頻率高於非Ag+細胞(圖6A)。透過鑑定出共有相同重鏈和輕鏈V基因區段並且在重鏈和輕鏈中均具有相同CDR3胺基酸序列的細胞中的BCR純系型，進一步研究了Ag+細胞的BCR序列(表2)。10個獨特的CDR3序列對在所有3個區室之間皆為純系共享，而每個BCR圖譜的大部分對每個區室都具有特異性(表2)。
除了BCR序列分析外，還比較了三個區室的每一者中Ag+和非Ag+細胞的轉錄組，以鑑定出與hIL-4Rα特異性相關的基因特徵。在BMPC中，幾個基因表現程式因hIL-4Ra特異性而異(圖6C和6D)。 Tmsbx4、 Cd24a、 Tmsb10和 Fkbp11在hIL-4Rα特異性BMPC中均證實有顯著上調。非Ag+細胞顯示 Ly6d、 Prg2、 Tmem176a和 Tmem176b增加(圖6C和6D)。BMPC的次分群表明 Cd24a、 Ppib、 Fkbp11和 Ssr2轉錄本都在UMAP投影的底部高度表現(圖6E)，而由 Tmem176a、 Tmem176b、 Ly6d和 Cd74表現集群標記的基因程式在UMAP投影的中間和頂部區域(圖6E)。然而，儘管有顯著的轉錄差異，但從任一轉錄不同區選殖而來的BCR序列產生高親和力hIL-4Rα特異性抗體，如結合Kd的負log10所測量(圖6F)。 實例 16 ：將 Trap-N-Seq 擴展到人類骨髓以特徵鑑定短壽命和長壽命的疫苗特異性 IgG 漿細胞。
在這個實例中，TRAPnSeq被用來從人類骨髓分離疫苗特異性IgG+漿細胞(PC)。在B細胞和抗體分泌細胞(ABC)富集後，用NHS-生物素對細胞進行生物素化，並使用與抗人類Igk偶聯的鏈球菌親生物素蛋白(StAv-αIgk)組裝親和力基質以捕獲分泌型IgG。在表面組裝生物素-StAv-αIgk複合物後，富集的B細胞/ASC用含有PC特異性標記的抗體混合物染色，αIgG用於偵測分泌型IgG，而螢光標記的抗原(列於下表)用於偵測Ag+細胞。
在以CD20-CD38++對PC進行圈選後(圖21A)，驗證了分泌捕捉從人類骨髓中分離疫苗特異性IgG+ PC的用途。必要的組件展示在圖21B中，用於偵測PC表面的分泌型IgG，而在圖21C中展示用於偵測抗原特異性IgG。分泌捕捉所有組件的完整組裝允許偵測分泌型IgG抗體(圖21D，左)，以及偵測那些疫苗特異性抗體(圖21D，右)。 抗原列表
供應商 目錄 批號
1 天然VZV Creative Diagnostics DAG219 VZ030066A1
2 H1N1 ANTIGEN (A/New Caledonia/20/99) Creative Diagnostics DAG3690 C1035
3 NATIVE IBV (B/Jiangsu/10/03) Creative Diagnostics DAGC081 V2971
4 MUV GRADE 2 Creative Diagnostics DAG-H10369 MU060020A3
5 2級麻疹 Creative Diagnostics DAG-H10368 ME040037A4
6 德國麻疹病毒株HPV-77 Creative Diagnostics DAGA-545 C1664
7 白喉毒素 Abcam ab188505 GR3400744-7
8 破傷風類毒素 EMD Millipore 582231-25ug 3845630
實例 17 ：結合抗原追踪的分泌捕捉
圖22中說明了分泌捕捉組合以抗原追踪的工作流程。
生物素化人類IL-4受體α (hIL-4Rα)胞外域在4℃下與經PE標記的鏈球菌親生物素蛋白(「SA-PE」)四聚體接合過夜。單獨使用市售套組(abcam目錄#ab102921)將捕捉抗體(小鼠抗人類IgG (BD目錄#555784，純系#G18-145))與鏈黴抗生物素接合過夜。
在DPBS/FBS中以0.5mg/mL的最終濃度，在37℃下將A25細胞懸浮在NHS-生物素(Sigma目錄#203112)中歷時15分鐘。A25細胞是藉由基因剔除內源性表面BCR從市售A20細胞株衍生而來的。因此，A25細胞是沒有表面或分泌型BCR的小鼠B細胞。
培育後，細胞在DPBS/FBS中洗滌3次，每次洗滌後轉移到新的錐形管中以去除殘留的生物素。
在有或沒有鏈黴抗生物素接合的捕捉抗體(或「SA-抗-huIgG」，以1：100稀釋進行)存在下，於DPBS/FBS中以1000萬個細胞/mL在4℃下培育生物素化細胞約15分鐘。1：100的細胞與捕捉抗體比率確保捕捉試劑在下一步摻入抗體之前與所有生物素化細胞結合。培育後，將細胞在DPBS/FBS中洗滌兩次，然後重新懸浮於DPBS/FBS中。
使用以下四種親和力有別的抗體。每個個別抗體以每200萬個細胞約1mg的抗體摻入細胞懸浮液中。培育後，將細胞在DPBS/FBS中洗滌兩次。
KD t1/2 pH7.4
ab_1 1.68E-09 ＞115.5
ab_2 3.26E-09 21.7
ab_3 1.42E-08 10.6
ab_4 陰性對照
細胞與標記有AlexaFluor 647(「AF647」)的5nM hIL-4Rα在室溫(RT)下於DPBS/FBS中一起培育30分鐘。培育後，將細胞在DPBS/FBS中洗滌兩次。
之後，將細胞與預接合的hIL-4Rα生物素-StAv-PE在DPBS/FBS中於RT下培育45分鐘兩次(或2x45分鐘)。抗原hIL-4Rα的濃度為20 nM。培育後，在DPBS/FBS中洗滌細胞兩次，並藉由流式細胞術進行分析。如圖23C中所示，四種抗體依據親和力顯示出明顯的分離。
作為對照，在追踪抗原培育(hIL-4Rα-生物素-StAv-PE)後，細胞在DPBS/FBS中洗滌兩次，然後用抗huIgK-PE-Cy7抗體染色以偵測細胞表面的抗體。Ab 4/陰性對照沒有染上抗原，但對IgK呈陽性，表明抗體仍被捕獲在細胞表面上。 表1：從骨髓漿細胞以及脾臟漿細胞與B細胞分離的抗原特異性IgG將細胞序列
株 # 細胞條碼 重序列
1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2
2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
3 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
4 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8
5 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
6 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12
7 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14
8 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16
9 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
10 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20
11 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22
12 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24
13 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26
14 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28
15 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30
16 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32
17 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34
18 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36
19 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38
20 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40
21 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42
22 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44
23 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46
24 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48
25 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50
26 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52
27 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 54
28 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 56
29 SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 58
30 SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 60
31 SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 62
32 SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 64
33 SEQ ID NO: 65 SEQ ID NO: 66
34 SEQ ID NO: 67 SEQ ID NO: 68
35 SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 70
36 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 72
37 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 74
38 SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 76
39 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 78
40 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: 80
41 SEQ ID NO: 81 SEQ ID NO: 82
42 SEQ ID NO: 83 SEQ ID NO: 84
43 SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 86
44 SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 88
45 SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90
46 SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 92
47 SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 94
48 SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 96
49 SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 98
50 SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 100
51 SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO: 102
52 SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104
53 SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 106
54 SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 108
表1(續)
株 # 輕序列 v_ 同一性 IR_VJ_1_ 基因座 IR_VDJ_1_ 基因座
1 SEQ ID NO: 109 IGK IGH
2 SEQ ID NO: 110 0.95973 IGK IGH
3 SEQ ID NO: 111 0.97987 IGK IGH
4 SEQ ID NO: 112 0.98658 IGK IGH
5 SEQ ID NO: 113 0.9726 IGK IGH
6 SEQ ID NO: 114 0.95302 IGK IGH
7 SEQ ID NO: 115 0.9697 IGK IGH
8 SEQ ID NO: 116 0.95638 IGK IGH
9 SEQ ID NO: 117 0.99317 IGK IGH
10 SEQ ID NO: 118 0.95302 IGK IGH
11 SEQ ID NO: 119 0.98653 IGK IGH
12 SEQ ID NO: 120 0.98649 IGK IGH
13 SEQ ID NO: 121 0.95946 IGK IGH
14 SEQ ID NO: 122 0.97987 IGK IGH
15 SEQ ID NO: 123 0.95623 IGK IGH
16 SEQ ID NO: 124 0.97651 IGK IGH
17 SEQ ID NO: 125 0.98311 IGK IGH
18 SEQ ID NO: 126 0.94898 IGK IGH
19 SEQ ID NO: 127 0.97306 IGK IGH
20 SEQ ID NO: 128 0.97973 IGK IGH
21 SEQ ID NO: 129 0.98986 IGK IGH
22 SEQ ID NO: 130 0.9698 IGK IGH
23 SEQ ID NO: 131 0.97635 IGK IGH
24 SEQ ID NO: 132 0.94631 IGK IGH
25 SEQ ID NO: 133 0.93919 IGK IGH
26 SEQ ID NO: 134 0.98355 IGK IGH
27 SEQ ID NO: 135 0.98316 IGK IGH
28 SEQ ID NO: 136 0.99324 IGK IGH
29 SEQ ID NO: 137 0.99658 IGK IGH
30 SEQ ID NO: 138 0.95638 IGK IGH
31 SEQ ID NO: 139 0.99327 IGK IGH
32 SEQ ID NO: 140 0.97651 IGK IGH
33 SEQ ID NO: 141 0.96949 IGK IGH
34 SEQ ID NO: 142 0.93581 IGK IGH
35 SEQ ID NO: 143 1 IGK IGH
36 SEQ ID NO: 144 0.95973 IGK IGH
37 SEQ ID NO: 145 0.96207 IGK IGH
38 SEQ ID NO: 146 0.94595 IGK IGH
39 SEQ ID NO: 147 0.95973 IGK IGH
40 SEQ ID NO: 148 0.97611 IGK IGH
41 SEQ ID NO: 149 0.96309 IGK IGH
42 SEQ ID NO: 150 0.95946 IGK IGH
43 SEQ ID NO: 151 0.95302 IGK IGH
44 SEQ ID NO: 152 0.97987 IGK IGH
45 SEQ ID NO: 153 0.9798 IGK IGH
46 SEQ ID NO: 154 0.94595 IGK IGH
47 SEQ ID NO: 155 0.93266 IGK IGH
48 SEQ ID NO: 156 0.97651 IGK IGH
49 SEQ ID NO: 157 0.92568 IGK IGH
50 SEQ ID NO: 158 0.96959 IGK IGH
51 SEQ ID NO: 159 0.98635 IGK IGH
52 SEQ ID NO: 160 0.95638 IGK IGH
53 SEQ ID NO: 161 0.9698 IGK IGH
54 SEQ ID NO: 162 0.98635 IGK IGH
表1(續)
株 # IR_VJ_1_cdr3 IR_VDJ_1_cdr3 IR_VJ_1_cdr3_nt
1 SEQ ID NO: 163 SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 165
2 SEQ ID NO: 166 SEQ ID NO: 167 SEQ ID NO: 168
3 SEQ ID NO: 169 SEQ ID NO: 170 SEQ ID NO: 171
4 SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 173 SEQ ID NO: 174
5 SEQ ID NO: 175 SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO: 177
6 SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO: 179 SEQ ID NO: 180
7 SEQ ID NO: 181 SEQ ID NO: 182 SEQ ID NO: 183
8 SEQ ID NO: 184 SEQ ID NO: 185 SEQ ID NO: 186
9 SEQ ID NO: 187 SEQ ID NO: 188 SEQ ID NO: 189
10 SEQ ID NO: 190 SEQ ID NO: 191 SEQ ID NO: 192
11 SEQ ID NO: 193 SEQ ID NO: 194 SEQ ID NO: 195
12 SEQ ID NO: 196 SEQ ID NO: 197 SEQ ID NO: 198
13 SEQ ID NO: 199 SEQ ID NO: 200 SEQ ID NO: 201
14 SEQ ID NO: 202 SEQ ID NO: 203 SEQ ID NO: 204
15 SEQ ID NO: 205 SEQ ID NO: 206 SEQ ID NO: 207
16 SEQ ID NO: 208 SEQ ID NO: 209 SEQ ID NO: 210
17 SEQ ID NO: 211 SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO: 213
18 SEQ ID NO: 214 SEQ ID NO: 215 SEQ ID NO: 216
19 SEQ ID NO: 217 SEQ ID NO: 218 SEQ ID NO: 219
20 SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO: 221 SEQ ID NO: 222
21 SEQ ID NO: 223 SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 225
22 SEQ ID NO: 226 SEQ ID NO: 227 SEQ ID NO: 228
23 SEQ ID NO: 229 SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO: 231
24 SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 233 SEQ ID NO: 234
25 SEQ ID NO: 235 SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 237
26 SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO: 239 SEQ ID NO: 240
27 SEQ ID NO: 241 SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 243
28 SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 245 SEQ ID NO: 246
29 SEQ ID NO: 247 SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 249
30 SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 251 SEQ ID NO: 252
31 SEQ ID NO: 253 SEQ ID NO: 254 SEQ ID NO: 255
32 SEQ ID NO: 256 SEQ ID NO: 257 SEQ ID NO: 258
33 SEQ ID NO: 259 SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO: 261
34 SEQ ID NO: 262 SEQ ID NO: 263 SEQ ID NO: 264
35 SEQ ID NO: 265 SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 267
36 SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO: 269 SEQ ID NO: 270
37 SEQ ID NO: 271 SEQ ID NO: 272 SEQ ID NO: 273
38 SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO: 275 SEQ ID NO: 276
39 SEQ ID NO: 277 SEQ ID NO: 278 SEQ ID NO: 279
40 SEQ ID NO: 280 SEQ ID NO: 281 SEQ ID NO: 282
41 SEQ ID NO: 283 SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 285
42 SEQ ID NO: 286 SEQ ID NO: 287 SEQ ID NO: 288
43 SEQ ID NO: 289 SEQ ID NO: 290 SEQ ID NO: 291
44 SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO: 293 SEQ ID NO: 294
45 SEQ ID NO: 295 SEQ ID NO: 296 SEQ ID NO: 297
46 SEQ ID NO: 298 SEQ ID NO: 299 SEQ ID NO: 300
47 SEQ ID NO: 301 SEQ ID NO: 302 SEQ ID NO: 303
48 SEQ ID NO: 304 SEQ ID NO: 305 SEQ ID NO: 306
49 SEQ ID NO: 307 SEQ ID NO: 308 SEQ ID NO: 309
50 SEQ ID NO: 310 SEQ ID NO: 311 SEQ ID NO: 312
51 SEQ ID NO: 313 SEQ ID NO: 314 SEQ ID NO: 315
52 SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 317 SEQ ID NO: 318
53 SEQ ID NO: 319 SEQ ID NO: 320 SEQ ID NO: 321
54 SEQ ID NO: 322 SEQ ID NO: 323 SEQ ID NO: 324
表1(續)
株 # IR_VDJ_1_cdr3_nt IR_VJ_1_v_ 基因
1 SEQ ID NO: 325 IGKV1-12*01
2 SEQ ID NO: 326 IGKV1-17*01
3 SEQ ID NO: 327 IGKV1-5*03
4 SEQ ID NO: 328 IGKV1-5*03
5 SEQ ID NO: 329 IGKV2-28*01,IGKV2D-28*01
6 SEQ ID NO: 330 IGKV1-17*01
7 SEQ ID NO: 331 IGKV1-27*01
8 SEQ ID NO: 332 IGKV1-17*01
9 SEQ ID NO: 333 IGKV2-28*01,IGKV2D-28*01
10 SEQ ID  NO: 334 IGKV1-17*01
11 SEQ ID NO: 335 IGKV1-27*01
12 SEQ ID NO: 336 IGKV1-27*01
13 SEQ ID NO: 337 IGKV1-27*01
14 SEQ ID NO: 338 IGKV1-17*01
15 SEQ ID NO: 339 IGKV1-27*01
16 SEQ ID NO: 340 IGKV1-27*01
17 SEQ ID NO: 341 IGKV1-33*01,IGKV1D-33*01
18 SEQ ID NO: 342 IGKV3-20*01
19 SEQ ID NO: 343 IGKV1-5*03
20 SEQ ID NO: 344 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01
21 SEQ ID NO: 345 IGKV1-27*01
22 SEQ ID NO: 346 IGKV3-20*01
23 SEQ ID NO: 347 IGKV1-12*01,IGKV1-12*02,IGKV1D-12*02
24 SEQ ID NO: 348 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01
25 SEQ ID NO: 349 IGKV1-27*01
26 SEQ ID NO: 350 IGKV3-15*01
27 SEQ ID NO: 351 IGKV1-17*01
28 SEQ ID NO: 352 IGKV1-12*01,IGKV1-12*02,IGKV1D-12*02
29 SEQ ID NO: 353 IGKV1-12*01,IGKV1-12*02,IGKV1D-12*02
30 SEQ ID NO: 354 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01
31 SEQ ID NO: 355 IGKV1-5*03
32 SEQ ID NO: 356 IGKV1-17*01
33 SEQ ID NO: 357 IGKV3-15*01
34 SEQ ID NO: 358 IGKV1-27*01
35 SEQ ID NO: 359 IGKV1-12*01,IGKV1-12*02,IGKV1D-12*02
36 SEQ ID NO: 360 IGKV1-6*01
37 SEQ ID NO: 361 IGKV1-9*01
38 SEQ ID NO: 362 IGKV1-6*01,IGKV1-6*02
39 SEQ ID NO: 363 IGKV3-20*01
40 SEQ ID NO: 364 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01
41 SEQ ID NO: 365 IGKV1-17*01
42 SEQ ID NO: 366 IGKV2-24*01
43 SEQ ID NO: 367 IGKV1-17*01
44 SEQ ID NO: 368 IGKV1-17*01
45 SEQ ID NO: 369 IGKV3-20*01
46 SEQ ID NO: 370 IGKV1-27*01
47 SEQ ID NO: 371 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01
48 SEQ ID NO: 372 IGKV1-17*01
49 SEQ ID NO: 373 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01
50 SEQ ID NO: 374 IGKV1-12*01,IGKV1-12*02,IGKV1D-12*02
51 SEQ ID NO: 375 IGKV3-20*01
52 SEQ ID NO: 376 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01
53 SEQ ID NO: 377 IGKV1-17*01
54 SEQ ID NO: 378 IGKV1-17*01
表1(續)
株 # IR_VDJ_1_v_ 基因 IR_VDJ_1_d_ 基因
1 IGHV3-21*01 IGHD6-6*01
2 IGHV3-9*01 IGHD6-13*01,IGHD6-25*01,IGHD6-6*01
3 IGHV3-9*01 IGHD6-13*01
4 IGHV3-9*01 IGHD6-13*01
5 IGHV1-2*02 IGHD1-14*01,IGHD6-25*01
6 IGHV3-9*01 IGHD1-26*01
7 IGHV3-9*01 IGHD6-19*01
8 IGHV3-9*01 IGHD6-13*01
9 IGHV1-8*01 IGHD1-1*01,IGHD4-11*01,IGHD4-4*01
10 IGHV3-9*01 IGHD3-16*02
11 IGHV3-9*01 IGHD6-19*01
12 IGHV3-30*18,IGHV3-30-5*01 IGHD7-27*01
13 IGHV3-20*01 IGHD6-13*01
14 IGHV3-9*01 IGHD1-26*01
15 IGHV3-9*01 IGHD6-19*01
16 IGHV3-9*01 IGHD6-13*01
17 IGHV3-48*03 IGHD3-10*01
18 IGHV5-51*01
19 IGHV3-9*01 IGHD6-19*01
20 IGHV3-21*01 IGHD6-6*01
21 IGHV3-20*01 IGHD6-13*01
22 IGHV3-9*01 IGHD1-26*01
23 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01 IGHD6-6*01
24 IGHV3-9*01 IGHD1-26*01
25 IGHV3-20*04 IGHD6-13*01,IGHD6-19*01
26 IGHV6-1*01 IGHD1-7*01
27 IGHV3-9*01 IGHD6-13*01
28 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01 IGHD3-10*01,IGHD3-10*02
29 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01 IGHD1-7*01
30 IGHV3-9*01 IGHD3-16*01,IGHD3-16*02
31 IGHV3-9*01 IGHD6-19*01
32 IGHV3-9*01 IGHD1-26*01
33 IGHV3-48*03 IGHD1-7*01
34 IGHV3-9*01 IGHD6-13*01
35 IGHV3-21*01 IGHD6-13*01
36 IGHV3-9*01 IGHD6-19*01
37 IGHV3-33*01,IGHV3-33*06 IGHD1-7*01
38 IGHV3-21*06 IGHD4-17*01
39 IGHV3-9*01 IGHD1-26*01
40 IGHV4-59*08 IGHD3-16*01
41 IGHV3-9*01 IGHD2-15*01,IGHD6-13*01,IGHD6-19*01
42 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01 IGHD1-26*01
43 IGHV3-9*01 IGHD2-15*01,IGHD6-13*01,IGHD6-19*01
44 IGHV3-9*01 IGHD1-26*01
45 IGHV3-9*01 IGHD1-26*01
46 IGHV3-9*01 IGHD6-13*01
47 IGHV3-9*01 IGHD1-26*01
48 IGHV3-9*01 IGHD6-13*01
49 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01 IGHD1-26*01
50 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01
51 IGHV3-64*07 IGHD6-13*01
52 IGHV3-9*01 IGHD1-26*01
53 IGHV3-9*01 IGHD6-13*01
54 IGHV1-18*01 IGHD1-7*01
表1(續)
株 # IR_VJ_1_j_ 基因 IR_VDJ_1_j_ 基因 IR_VJ_1_c_ 基因 IR_VDJ_1_c_ 基因
1 IGKJ4*01 IGHJ3*01,IGHJ3*02 IGKC IGHG1
2 IGKJ4*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
3 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC IGHG2C
4 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC IGHG2C
5 IGKJ4*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
6 IGKJ4*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
7 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG1
8 IGKJ3*01 IGHJ5*02 IGKC IGHG1
9 IGKJ3*01 IGHJ2*01 IGKC IGHG1
10 IGKJ4*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
11 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
12 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
13 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
14 IGKJ4*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
15 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
16 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC IGHG1
17 IGKJ3*01 IGHJ3*02 IGKC IGHG2C
18 IGKJ5*01 IGHJ5*02 IGKC IGHG2C
19 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
20 IGKJ5*01 IGHJ3*02 IGKC IGHG2C
21 IGKJ1*01 IGHJ1*01 IGKC IGHG2C
22 IGKJ2*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
23 IGKJ1*01 IGHJ3*02 IGKC IGHG2C
24 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
25 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG1
26 IGKJ2*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
27 IGKJ5*01 IGHJ3*01 IGKC IGHG2C
28 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
29 IGKJ4*01 IGHJ4*02,IGHJ5*02 IGKC IGHG1
30 IGKJ3*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
31 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG1
32 IGKJ4*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
33 IGKJ3*01 IGHJ3*02 IGKC IGHG1
34 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC IGHG2C
35 IGKJ5*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
36 IGKJ1*01 IGHJ5*02 IGKC IGHG1
37 IGKJ2*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
38 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
39 IGKJ2*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
40 IGKJ4*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
41 IGKJ4*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
42 IGKJ4*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
43 IGKJ4*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
44 IGKJ4*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
45 IGKJ2*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
46 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC IGHG2C
47 IGKJ3*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
48 IGKJ2*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
49 IGKJ5*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
50 IGKJ3*01 IGHJ3*02 IGKC IGHG2C
51 IGKJ2*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
52 IGKJ3*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
53 IGKJ2*01 IGHJ6*02 IGKC IGHG2C
54 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC IGHG2C
表1(續)
株 # REGN560.L15_ab_ 原始 REGN78.L15_ab_ 原始 組織 組織 CT
1 11214 271 BM BM_漿_細胞
2 6538 26 BM BM_漿_細胞
3 6317 236 BM BM_漿_細胞
4 5046 95 BM BM_漿_細胞
5 4411 214 BM BM_漿_細胞
6 4144 18 BM BM_漿_細胞
7 4142 224 BM BM_漿_細胞
8 3780 524 BM BM_漿_細胞
9 3568 890 BM BM_漿_細胞
10 3476 16 BM BM_漿_細胞
11 3212 115 BM BM_漿_細胞
12 3180 348 BM BM_漿_細胞
13 2931 33 BM BM_漿_細胞
14 2828 50 BM BM_漿_細胞
15 2585 158 BM BM_漿_細胞
16 2366 69 BM BM_漿_細胞
17 2299 881 BM BM_漿_細胞
18 2174 55 BM BM_漿_細胞
19 2063 50 BM BM_漿_細胞
20 2058 681 BM BM_漿_細胞
21 17383 236 SP SP_B_細胞
22 13995 5 SP SP_B_細胞
23 10971 152 SP SP_B_細胞
24 10811 11 SP SP_B_細胞
25 10605 16 SP SP_B_細胞
26 10355 167 SP SP_B_細胞
27 9506 149 SP SP_B_細胞
28 9446 129 SP SP_B_細胞
29 9188 93 SP SP_B_細胞
30 9182 179 SP SP_B_細胞
31 8515 57 SP SP_B_細胞
32 7912 32 SP SP_B_細胞
33 7344 106 SP SP_B_細胞
34 6888 34 SP SP_B_細胞
35 6710 33 SP SP_B_細胞
36 6345 75 SP SP_B_細胞
37 6230 60 SP SP_B_細胞
38 6051 66 SP SP_B_細胞
39 3560 17 SP SP_B_細胞
40 5520 1 SP SP_漿_細胞
41 2457 227 SP SP_漿_細胞
42 2084 5 SP SP_漿_細胞
43 1980 2 SP SP_漿_細胞
44 1845 26 SP SP_漿_細胞
45 1775 25 SP SP_漿_細胞
46 1525 2 SP SP_漿_細胞
47 1522 6 SP SP_漿_細胞
48 1239 17 SP SP_漿_細胞
49 1199 2 SP SP_漿_細胞
50 924 0 SP SP_漿_細胞
51 897 3 SP SP_漿_細胞
52 819 19 SP SP_漿_細胞
53 818 5 SP SP_漿_細胞
54 815 26 SP SP_漿_細胞
表1(續)
株 # Kd 負 Log10Kd
1 4.16E-07 6.380906669
2 1.61E-07 6.793174124
3 5.37E-07 6.270025714
4 1.58E-07 6.801342913
5 2.38E-08 7.623423043
6 1.36E-07 6.866461092
7 1.55E-08 7.809668302
8 0 NA
9 0 NA
10 0 NA
11 2.75E-08 7.560667306
12 3.45E-08 7.462180905
13 5.82E-08 7.235077015
14 0 NA
15 1.99E-08 7.701146924
16 8.04E-09 8.094743951
17 0 NA
18 4.14E-08 7.382999659
19 1.21E-08 7.91721463
20 0 NA
21 1.77E-07 6.752026734
22 0 NA
23 0 NA
24 2.07E-07 6.684029655
25 9.76E-08 7.010550182
26 1.12E-07 6.950781977
27 0 NA
28 1.46E-07 6.835647144
29 5.48E-08 7.261219442
30 0 NA
31 1.33E-07 6.876148359
32 5.81E-08 7.235823868
33 0 NA
34 3.42E-08 7.465973894
35 2.93E-08 7.53313238
36 0 NA
37 1.97E-07 6.705533774
38 0 NA
39 0 NA
40 1.18E-07 6.928117993
41 1.50E-07 6.823908741
42 1.27E-07 6.896196279
43 0 NA
44 0 NA
45 0 NA
46 4.92E-08 7.308034897
47 0 NA
48 0 NA
49 1.32E-07 6.879426069
50 0 NA
51 0 NA
52 0 NA
53 2.47E-07 6.607303047
54 1.35E-08 7.869666232
表2：骨髓漿細胞、脾臟B細胞與漿細胞共有的hIL-Ra IgG特異性BCR序列
株 # 細胞 _ 條碼 重 _ 序列
1 純系型#1 (n=10個細胞)
2 SEQ ID NO: 379 SEQ ID NO: 380
3 SEQ ID NO: 381 SEQ ID NO: 382
4 SEQ ID NO: 383 SEQ ID NO: 384
5 SEQ ID NO: 385 SEQ ID NO: 386
6 SEQ ID NO: 387 SEQ ID NO: 388
7 SEQ ID NO: 389 SEQ ID NO: 390
8 SEQ ID NO: 391 SEQ ID NO: 392
9 SEQ ID NO: 393 SEQ ID NO: 394
10 SEQ ID NO: 395 SEQ ID NO: 396
11 SEQ ID NO: 397 SEQ ID NO: 398
12 純系型#2 (n=9個細胞)
13 SEQ ID NO: 399 SEQ ID NO: 400
14 SEQ ID NO: 401 SEQ ID NO: 402
15 SEQ ID NO: 403 SEQ ID NO: 404
16 SEQ ID NO: 405 SEQ ID NO: 406
17 SEQ ID NO: 407 SEQ ID NO: 408
18 SEQ ID NO: 409 SEQ ID NO: 410
19 SEQ ID NO: 411 SEQ ID NO: 412
20 SEQ ID NO: 413 SEQ ID NO: 414
21 SEQ ID NO: 415 SEQ ID NO: 416
22 純系型#3 (n=9個細胞)
23 SEQ ID NO: 417 SEQ ID NO: 418
24 SEQ ID NO: 419 SEQ ID NO: 420
25 SEQ ID NO: 421 SEQ ID NO: 422
26 SEQ ID NO: 423 SEQ ID NO: 424
27 SEQ ID NO: 425 SEQ ID NO: 426
28 SEQ ID NO: 427 SEQ ID NO: 428
29 SEQ ID NO: 429 SEQ ID NO: 430
30 SEQ ID NO: 431 SEQ ID NO: 432
31 SEQ ID NO: 433 SEQ ID NO: 434
32 純系型#4 (n=9個細胞)
33 SEQ ID NO: 435 SEQ ID NO: 436
34 SEQ ID NO: 437 SEQ ID NO: 438
35 SEQ ID NO: 439 SEQ ID NO: 440
36 SEQ ID NO: 441 SEQ ID NO: 442
37 SEQ ID NO: 443 SEQ ID NO: 444
38 SEQ ID NO: 445 SEQ ID NO: 446
39 SEQ ID NO: 447 SEQ ID NO: 448
40 SEQ ID NO: 449 SEQ ID NO: 450
41 SEQ ID NO: 451 SEQ ID NO: 452
42 純系型#5 (n=6個細胞)
43 SEQ ID NO: 453 SEQ ID NO: 454
44 SEQ ID NO: 455 SEQ ID NO: 456
45 SEQ ID NO: 457 SEQ ID NO: 458
46 SEQ ID NO: 459 SEQ ID NO: 460
47 SEQ ID NO: 461 SEQ ID NO: 462
48 SEQ ID NO: 463 SEQ ID NO: 464
49 純系型#6 (n=6個細胞)
50 SEQ ID NO: 465 SEQ ID NO: 466
51 SEQ ID NO: 467 SEQ ID NO: 468
52 SEQ ID NO: 469 SEQ ID NO: 470
53 SEQ ID NO: 471 SEQ ID NO: 472
54 SEQ ID NO: 473 SEQ ID NO: 474
55 SEQ ID NO: 475 SEQ ID NO: 476
56 純系型#7 (n=5個細胞)
57 SEQ ID NO: 477 SEQ ID NO: 478
58 SEQ ID NO: 479 SEQ ID NO: 480
59 SEQ ID NO: 481 SEQ ID NO: 482
60 SEQ ID NO: 483 SEQ ID NO: 484
61 SEQ ID NO: 485 SEQ ID NO: 486
62 純系型#8 (n=5個細胞)
63 SEQ ID NO: 487 SEQ ID NO: 488
64 SEQ ID NO: 489 SEQ ID NO: 490
65 SEQ ID NO: 491 SEQ ID NO: 492
66 SEQ ID NO: 493 SEQ ID NO: 494
67 SEQ ID NO: 495 SEQ ID NO: 496
68 純系型#9 (n=4個細胞)
69 SEQ ID NO: 497 SEQ ID NO: 498
70 SEQ ID NO: 499 SEQ ID NO: 500
71 SEQ ID NO: 501 SEQ ID NO: 502
72 SEQ ID NO: 503 SEQ ID NO: 504
73 純系型#10 (n=3個細胞)
74 SEQ ID NO: 505 SEQ ID NO: 506
75 SEQ ID NO: 507 SEQ ID NO: 508
76 SEQ ID NO: 509 SEQ ID NO: 510
表2(續)
株 # 輕 _ 序列 v_ 同一性
2 SEQ ID NO: 511 0.95066
3 SEQ ID NO: 512 0.9375
4 SEQ ID NO: 513 0.96711
5 SEQ ID NO: 514 0.96382
6 SEQ ID NO: 515 0.95066
7 SEQ ID NO: 516 0.95066
8 SEQ ID NO: 517 0.95066
9 SEQ ID NO: 518 0.95724
10 SEQ ID NO: 519 0.95395
11 SEQ ID NO: 520 0.95724
13 SEQ ID NO: 521 0.95987
14 EQ ID NO: 522 0.95987
15 SEQ ID NO: 523 0.96321
16 SEQ ID NO: 524 0.95318
17 SEQ ID NO: 525 0.95652
18 SEQ ID NO: 526 0.95652
19 SEQ ID NO: 527 0.95318
20 SEQ ID NO: 528 0.95652
21 SEQ ID NO: 529 0.95987
23 SEQ ID NO: 530 0.92491
24 SEQ ID NO: 531 0.95222
25 SEQ ID NO: 532 0.94198
26 SEQ ID NO: 533 0.94198
27 SEQ ID NO: 534 0.92491
28 SEQ ID NO: 535 0.92833
29 SEQ ID NO: 536 0.94881
30 SEQ ID NO: 537 0.94198
31 SEQ ID NO: 538 0.94539
33 SEQ ID NO: 539 0.95563
34 SEQ ID NO: 540 0.95222
35 SEQ ID NO: 541 0.94539
36 SEQ ID NO: 542 0.95904
37 SEQ ID NO: 543 0.94198
38 SEQ ID NO: 544 0.95222
39 SEQ ID NO: 545 0.93515
40 SEQ ID NO: 546 0.94198
41 SEQ ID NO: 547 0.94539
43 SEQ ID NO: 548 0.91156
44 SEQ ID NO: 549 0.93532
45 SEQ ID NO: 550 0.92177
46 SEQ ID NO: 551 0.93197
47 SEQ ID NO: 552 0.93537
48 SEQ ID NO: 553 0.93197
50 SEQ ID NO: 554 0.95638
51 SEQ ID NO: 555 0.95302
52 SEQ ID NO: 556 0.96309
53 SEQ ID NO: 557 0.96309
54 SEQ ID NO: 558 0.94595
55 SEQ ID NO: 559 0.95302
57 SEQ ID NO: 560 0.92282
58 SEQ ID NO: 561 0.93289
59 SEQ ID NO: 562 0.93289
60 SEQ ID NO: 563 0.93289
61 SEQ ID NO: 564 0.92953
63 SEQ ID NO: 565 0.9215
64 SEQ ID NO: 566 0.94539
65 SEQ ID NO: 567 0.92491
66 SEQ ID NO: 568 0.91126
67 SEQ ID NO: 569 0.91126
69 SEQ ID NO: 570 0.96246
70 SEQ ID NO: 571 0.96587
71 SEQ ID NO: 572 0.96587
72 SEQ ID NO: 573 0.96246
74 SEQ ID NO: 574 0.95066
75 SEQ ID NO: 575 0.96053
76 SEQ ID NO: 576 0.96053
表2(續)
株 # IR_VJ_1_ 基因座 IR_VDJ_1_ 基因座 IR_VJ_1_cdr3 IR_VDJ_1_cdr3
2 IGK IGH SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO: 578
3 IGK IGH SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO: 578
4 IGK IGH SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO: 578
5 IGK IGH SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO: 578
6 IGK IGH SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO: 578
7 IGK IGH SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO: 578
8 IGK IGH SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO: 578
9 IGK IGH SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO: 578
10 IGK IGH SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO: 578
11 IGK IGH SEQ ID NO: 577 SEQ ID NO: 578
13 IGK IGH SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 579
14 IGK IGH SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 579
15 IGK IGH SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 579
16 IGK IGH SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 579
17 IGK IGH SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 579
18 IGK IGH SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 579
19 IGK IGH SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 579
20 IGK IGH SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 579
21 IGK IGH SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 579
23 IGK IGH SEQ ID NO: 580 SEQ ID NO: 581
24 IGK IGH SEQ ID NO: 580 SEQ ID NO: 581
25 IGK IGH SEQ ID NO: 580 SEQ ID NO: 581
26 IGK IGH SEQ ID NO: 580 SEQ ID NO: 581
27 IGK IGH SEQ ID NO: 580 SEQ ID NO: 581
28 IGK IGH SEQ ID NO: 580 SEQ ID NO: 581
29 IGK IGH SEQ ID NO: 580 SEQ ID NO: 581
30 IGK IGH SEQ ID NO: 580 SEQ ID NO: 581
31 IGK IGH SEQ ID NO: 580 SEQ ID NO: 581
33 IGK IGH SEQ ID NO: 582 SEQ ID NO: 583
34 IGK IGH SEQ ID NO: 582 SEQ ID NO: 583
35 IGK IGH SEQ ID NO: 582 SEQ ID NO: 583
36 IGK IGH SEQ ID NO: 582 SEQ ID NO: 583
37 IGK IGH SEQ ID NO: 582 SEQ ID NO: 583
38 IGK IGH SEQ ID NO: 582 SEQ ID NO: 583
39 IGK IGH SEQ ID NO: 582 SEQ ID NO: 583
40 IGK IGH SEQ ID NO: 582 SEQ ID NO: 583
41 IGK IGH SEQ ID NO: 582 SEQ ID NO: 583
43 IGK IGH SEQ ID NO: 584 SEQ ID NO: 585
44 IGK IGH SEQ ID NO: 584 SEQ ID NO: 585
45 IGK IGH SEQ ID NO: 584 SEQ ID NO: 585
46 IGK IGH SEQ ID NO: 584 SEQ ID NO: 585
47 IGK IGH SEQ ID NO: 584 SEQ ID NO: 585
48 IGK IGH SEQ ID NO: 584 SEQ ID NO: 585
50 IGK IGH SEQ ID NO: 586 SEQ ID NO: 587
51 IGK IGH SEQ ID NO: 586 SEQ ID NO: 587
52 IGK IGH SEQ ID NO: 586 SEQ ID NO: 587
53 IGK IGH SEQ ID NO: 586 SEQ ID NO: 587
54 IGK IGH SEQ ID NO: 586 SEQ ID NO: 587
55 IGK IGH SEQ ID NO: 586 SEQ ID NO: 587
57 IGK IGH SEQ ID NO: 169 SEQ ID NO: 588
58 IGK IGH SEQ ID NO: 169 SEQ ID NO: 588
59 IGK IGH SEQ ID NO: 169 SEQ ID NO: 588
60 IGK IGH SEQ ID NO: 169 SEQ ID NO: 588
61 IGK IGH SEQ ID NO: 169 SEQ ID NO: 588
63 IGK IGH SEQ ID NO: 589 SEQ ID NO: 590
64 IGK IGH SEQ ID NO: 589 SEQ ID NO: 590
65 IGK IGH SEQ ID NO: 589 SEQ ID NO: 590
66 IGK IGH SEQ ID NO: 589 SEQ ID NO: 590
67 IGK IGH SEQ ID NO: 589 SEQ ID NO: 590
69 IGK IGH SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 281
70 IGK IGH SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 281
71 IGK IGH SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 281
72 IGK IGH SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 281
74 IGK IGH SEQ ID NO: 591 SEQ ID NO: 592
75 IGK IGH SEQ ID NO: 591 SEQ ID NO: 592
76 IGK IGH SEQ ID NO: 591 SEQ ID NO: 592
表2(續)
株 # IR_VJ_1_cdr3_nt IR_VDJ_1_cdr3_nt IR_VJ_1_v_ 基因 IR_VDJ_1_v_ 基因
2 SEQ ID NO: 593 SEQ ID NO: 594 IGKV3-15*01 IGHV6-1*01
3 SEQ ID NO: 601 SEQ ID NO: 594 IGKV3-15*01 IGHV6-1*01
4 SEQ ID NO: 593 SEQ ID NO: 594 IGKV3-15*01 IGHV6-1*01
5 SEQ ID NO: 593 SEQ ID NO: 594 IGKV3-15*01 IGHV6-1*01
6 SEQ ID NO: 593 SEQ ID NO: 594 IGKV3-15*01 IGHV6-1*01
7 SEQ ID NO: 593 SEQ ID NO: 594 IGKV3-15*01 IGHV6-1*01
8 SEQ ID NO: 593 SEQ ID NO: 594 IGKV3-15*01 IGHV6-1*01
9 SEQ ID NO: 593 SEQ ID NO: 594 IGKV3-15*01 IGHV6-1*01
10 SEQ ID NO: 593 SEQ ID NO: 594 IGKV3-15*01 IGHV6-1*01
11 SEQ ID NO: 593 SEQ ID NO: 594 IGKV3-15*01 IGHV6-1*01
13 SEQ ID NO: 595 SEQ ID NO: 596 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-39*01
14 SEQ ID NO: 595 SEQ ID NO: 596 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-39*01
15 SEQ ID NO: 595 SEQ ID NO: 596 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-39*01
16 SEQ ID NO: 595 SEQ ID NO: 596 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-39*01
17 SEQ ID NO: 597 SEQ ID NO: 596 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-39*01
18 SEQ ID NO: 595 SEQ ID NO: 596 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-39*01
19 SEQ ID NO: 595 SEQ ID NO: 596 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-39*01
20 SEQ ID NO: 595 SEQ ID NO: 596 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-39*01
21 SEQ ID NO: 595 SEQ ID NO: 596 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-39*01
23 SEQ ID NO: 598 SEQ ID NO: 599 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
24 SEQ ID NO: 598 SEQ ID NO: 600 IGKV1-16*01 IGHV4-34*01
25 SEQ ID NO: 598 SEQ ID NO: 602 IGKV1-16*01 IGHV4-34*01
26 SEQ ID NO: 598 SEQ ID NO: 600 IGKV1-16*01 IGHV4-34*01
27 SEQ ID NO: 598 SEQ ID NO: 603 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
28 SEQ ID NO: 598 SEQ ID NO: 603 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
29 SEQ ID NO: 598 SEQ ID NO: 600 IGKV1-16*01 IGHV4-34*01
30 SEQ ID NO: 598 SEQ ID NO: 600 IGKV1-16*01 IGHV4-34*01
31 SEQ ID NO: 598 SEQ ID NO: 600 IGKV1-16*01 IGHV4-34*01
33 SEQ ID NO: 604 SEQ ID NO: 605 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
34 SEQ ID NO: 604 SEQ ID NO: 605 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
35 SEQ ID NO: 604 SEQ ID NO: 606 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
36 SEQ ID NO: 604 SEQ ID NO: 605 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
37 SEQ ID NO: 604 SEQ ID NO: 606 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
38 SEQ ID NO: 604 SEQ ID NO: 605 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
39 SEQ ID NO: 604 SEQ ID NO: 606 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
40 SEQ ID NO: 604 SEQ ID NO: 605 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
41 SEQ ID NO: 607 SEQ ID NO: 606 IGKV1-16*02 IGHV4-34*01
43 SEQ ID NO: 608 SEQ ID NO: 609 IGKV1-17*01 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01
44 SEQ ID NO: 610 SEQ ID NO: 609 IGKV1-17*01 IGHV3-23*01,IGHV3-23*04,IGHV3-23D*01
45 SEQ ID NO: 611 SEQ ID NO: 609 IGKV1-17*01 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01
46 SEQ ID NO: 611 SEQ ID NO: 609 IGKV1-17*01 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01
47 SEQ ID NO: 611 SEQ ID NO: 609 IGKV1-17*01 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01
48 SEQ ID NO: 611 SEQ ID NO: 609 IGKV1-17*01 IGHV3-23*01,IGHV3-23D*01
50 SEQ ID NO: 612 SEQ ID NO: 613 IGKV1-27*01 IGHV3-9*01
51 SEQ ID NO: 612 SEQ ID NO: 613 IGKV1-27*01 IGHV3-9*01
52 SEQ ID NO: 612 SEQ ID NO: 613 IGKV1-27*01 IGHV3-9*01
53 SEQ ID NO: 612 SEQ ID NO: 614 IGKV1-27*01 IGHV3-9*01
54 SEQ ID NO: 612 SEQ ID NO: 615 IGKV1-27*01 IGHV3-9*01
55 SEQ ID NO: 612 SEQ ID NO: 613 IGKV1-27*01 IGHV3-9*01
57 SEQ ID NO: 171 SEQ ID NO: 616 IGKV1-5*03 IGHV3-9*01
58 SEQ ID NO: 171 SEQ ID NO: 617 IGKV1-5*03 IGHV3-9*01
59 SEQ ID NO: 171 SEQ ID NO: 617 IGKV1-5*03 IGHV3-9*01
60 SEQ ID NO: 171 SEQ ID NO: 618 IGKV1-5*03 IGHV3-9*01
61 SEQ ID NO: 171 SEQ ID NO: 618 IGKV1-5*03 IGHV3-9*01
63 SEQ ID NO: 619 SEQ ID NO: 620 IGKV6-21*01,IGKV6D-21*01 IGHV3-21*02
64 SEQ ID NO: 619 SEQ ID NO: 620 IGKV6-21*01,IGKV6D-21*01 IGHV3-21*02
65 SEQ ID NO: 619 SEQ ID NO: 620 IGKV6-21*01,IGKV6D-21*01 IGHV3-21*02
66 SEQ ID NO: 619 SEQ ID NO: 620 IGKV6-21*01,IGKV6D-21*01 IGHV3-21*02
67 SEQ ID NO: 619 SEQ ID NO: 620 IGKV6-21*01,IGKV6D-21*01 IGHV3-21*02
69 SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 621 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-59*08
70 SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 621 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-59*08
71 SEQ ID NO: 622 SEQ ID NO: 621 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-59*08
72 SEQ ID NO: 623 SEQ ID NO: 621 IGKV1-39*01,IGKV1D-39*01 IGHV4-59*08
74 SEQ ID NO: 624 SEQ ID NO: 625 IGKV1-12*01,IGKV1-12*02,IGKV1D-12*02 IGHV6-1*01
75 SEQ ID NO: 624 SEQ ID NO: 626 IGKV1-12*01,IGKV1-12*02,IGKV1D-12*02 IGHV6-1*01
76 SEQ ID NO: 624 SEQ ID NO: 626 IGKV1-12*01,IGKV1-12*02,IGKV1D-12*02 IGHV6-1*01
表2(續)
株 # IR_VDJ_1_d_ 基因 IR_VJ_1_j_ 基因 IR_VDJ_1_j_ 基因 IR_VJ_1_c_ 基因
2 IGHD7-27*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
3 IGHD7-27*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
4 IGHD7-27*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
5 IGHD7-27*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
6 IGHD7-27*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
7 IGHD7-27*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
8 IGHD7-27*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
9 IGHD7-27*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
10 IGHD7-27*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
11 IGHD7-27*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
13 IGHD3-10*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
14 IGHD3-10*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
15 IGHD3-10*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
16 IGHD3-10*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
17 IGHD3-10*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
18 IGHD3-10*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
19 IGHD3-10*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
20 IGHD3-10*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
21 IGHD3-10*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
23 IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
24 IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
25 IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
26 IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
27 IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
28 IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
29 IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
30 IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
31 IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
33 IGHD2-21*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
34 IGHD2-21*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
35 IGHD2-21*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
36 IGHD2-21*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
37 IGHD2-21*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
38 IGHD2-21*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
39 IGHD2-21*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
40 IGHD2-21*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
41 IGHD2-21*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
43 IGHD3-16*02 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
44 IGHD3-16*02 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
45 IGHD3-16*02 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
46 IGHD3-16*02 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
47 IGHD3-16*02 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
48 IGHD3-16*02 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
50 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC
51 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC
52 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC
53 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC
54 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC
55 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ2*01 IGKC
57 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
58 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
59 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
60 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
61 IGHD6-13*01 IGKJ1*01 IGHJ4*02 IGKC
63 IGHD6-6*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
64 IGHD6-6*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
65 IGHD6-6*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
66 IGHD6-6*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
67 IGHD6-6*01 IGKJ3*01 IGHJ4*02 IGKC
69 IGHD1-26*01 IGKJ3*01 IGHJ6*02 IGKC
70 IGHD1-26*01 IGKJ3*01 IGHJ6*02 IGKC
71 IGHD1-26*01 IGKJ3*01 IGHJ6*02 IGKC
72 IGHD1-26*01 IGKJ3*01 IGHJ6*02 IGKC
74 IGHD1-20*01,IGHD1-7*01,IGHD1/OR15-1a*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
75 IGHD1-7*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
76 IGHD1-7*01 IGKJ4*01 IGHJ5*02 IGKC
表2(續)
株 # IR_VDJ_1_c_ 基因 組織 CT CDR3L_CDR3H
2 IgG2C BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578
3 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578
4 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578
5 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578
6 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578
7 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578
8 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578
9 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578
10 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578
11 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 577 - SEQ ID NO: 578
13 IgG2C BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 250 - SEQ ID NO: 579
14 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 250 - SEQ ID NO: 579
15 IgG2B SP_B細胞 SEQ ID NO: 250 - SEQ ID NO: 579
16 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 250 - SEQ ID NO: 579
17 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 250 - SEQ ID NO: 579
18 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 250 - SEQ ID NO: 579
19 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 250 - SEQ ID NO: 579
20 IgG2B SP_B細胞 SEQ ID NO: 250 - SEQ ID NO: 579
21 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 250 - SEQ ID NO: 579
23 IgG1 BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581
24 IgG1 BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581
25 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581
26 IgG1 SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581
27 IgG1 SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581
28 IgG1 SP_B細胞 SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581
29 IgG1 SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581
30 IgG1 SP_B細胞 SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581
31 SEQ ID NO: 580 - SEQ ID NO: 581
33 IgG1 BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583
34 IgG1 SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583
35 IgG1 SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583
36 IgG1 SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583
37 IgG1 SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583
38 IgG1 SP_B細胞 SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583
39 IgG1 SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583
40 IgG1 SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583
41 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 582 - SEQ ID NO: 583
43 IgG2C BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 584 - SEQ ID NO: 585
44 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 584 - SEQ ID NO: 585
45 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 584 - SEQ ID NO: 585
46 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 584 - SEQ ID NO: 585
47 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 584 - SEQ ID NO: 585
48 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 584 - SEQ ID NO: 585
50 IgG2C BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 586 - SEQ ID NO: 587
51 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 586 - SEQ ID NO: 587
52 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 586 - SEQ ID NO: 587
53 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 586 - SEQ ID NO: 587
54 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 586 - SEQ ID NO: 587
55 IgA SP_B細胞 SEQ ID NO: 586 - SEQ ID NO: 587
57 IgG2C BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 169 - SEQ ID NO: 588
58 IgG2C BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 169 - SEQ ID NO: 588
59 IgG2C BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 169 - SEQ ID NO: 588
60 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 169 - SEQ ID NO: 588
61 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 169 - SEQ ID NO: 588
63 IgG1 BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 589 - SEQ ID NO: 590
64 IgG1 BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 589 - SEQ ID NO: 590
65 IgG1 SP_B細胞 SEQ ID NO: 589 - SEQ ID NO: 590
66 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 589 - SEQ ID NO: 590
67 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 589 - SEQ ID NO: 590
69 IgG2C BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 232 - SEQ ID NO: 281
70 IgG2C SP_B細胞 SEQ ID NO: 232 - SEQ ID NO: 281
71 IgG1 SP_B細胞 SEQ ID NO: 232 - SEQ ID NO: 281
72 IgG1 SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 232 - SEQ ID NO: 281
74 IgG1 BM_漿_細胞 SEQ ID NO: 591 - SEQ ID NO: 592
75 IgG1 SP_B細胞 SEQ ID NO: 591 - SEQ ID NO: 592
76 IgG2C SP_漿_細胞 SEQ ID NO: 591 - SEQ ID NO: 592
表3：IgE HDM特異性BCR序列元數據(metadata)
株 # 細胞 _ 條碼 Ab_ 名稱 元 _ 組織
1 SEQ ID NO: 627 IgE mAb 1_2 骨髓
2 SEQ ID NO: 628 IgE mAb 8_2 骨髓
3 SEQ ID NO: 629 IgE mAb 12_2 骨髓
4 SEQ ID NO: 630 IgE mAb 13_2 淋巴結
5 SEQ ID NO: 631 IgE mAb 17_2 淋巴結
6 SEQ ID NO: 632 IgE mAb 21_2 淋巴結
表3(續)
株 # 重 _ 序列 輕 _ 序列
1 SEQ ID NO: 633 SEQ ID NO: 634
2 SEQ ID NO: 635 SEQ ID NO: 636
3 SEQ ID NO: 637 SEQ ID NO: 638
4 SEQ ID NO: 639 SEQ ID NO: 640
5 SEQ ID NO: 641 SEQ ID NO: 642
6 SEQ ID NO: 643 SEQ ID NO: 644
表3(續)
株 # v_ 同一性 IR_VJ_1_ 基因座 IR_VDJ_1_ 基因座 IR_VJ_1_cdr3
1 0.9966 IGK IGH SEQ ID NO: 645
2 0.97578 IGK IGH SEQ ID NO: 646
3 0.9932 IGK IGH SEQ ID NO: 647
4 1 IGK IGH SEQ ID NO: 648
5 0.89796 IGK IGH SEQ ID NO: 649
6 0.95918 IGK IGH SEQ ID NO: 650
表3(續)
株 # IR_VDJ_1_cdr3 IR_VJ_1_cdr3_nt IR_VDJ_1_cdr3_nt
1 SEQ ID NO: 651 SEQ ID NO: 652 SEQ ID NO: 653
2 SEQ ID NO: 654 SEQ ID NO: 655 SEQ ID NO: 656
3 SEQ ID NO: 657 SEQ ID NO: 658 SEQ ID NO: 659
4 SEQ ID NO: 660 SEQ ID NO: 661 SEQ ID NO: 662
5 SEQ ID NO: 663 SEQ ID NO: 664 SEQ ID NO: 665
6 SEQ ID NO: 666 SEQ ID NO: 667 SEQ ID NO: 668
表3(續)
株 # IR_VJ_1_v_ 基因 IR_VDJ_1_v_ 基因 IR_VDJ_1_d_ 基因 IR_VJ_1_j_ 基因 IR_VDJ_1_j_ 基因
1 IGKV3-10*01 IGHV9-3*01 IGHD1-1*01 IGKJ2*01 IGHJ1*03
2 IGKV1-117*01 IGHV2-3*01 IGHD1-1*01 IGKJ4*01 IGHJ3*01
3 IGKV12-46*01 IGHV1-12*01 IGHD1-1*01,IGHD1-1*02 IGKJ1*01 IGHJ3*01
4 IGKV3-12*01 IGHV1-26*01 IGHD1-1*01 IGKJ1*01 IGHJ3*01
5 IGKV6-32*01 IGHV1-42*01 IGHD3-3*01 IGKJ1*01 IGHJ2*01
6 IGKV8-24*01 IGHV1-82*01 IGHD4-1*01,IGHD4-1*02 IGKJ5*01 IGHJ1*03
表3(續)
株 # IR_VJ_1_c_ 基因 IR_VDJ_1_c_ 基因 Derp1_ab_ 原始 Derp2_ab_ 原始 Derf1_ab_ 原始
1 IGKC IGHE 158 60 37
2 IGKC IGHE 29 22 32
3 IGKC IGHE 15 11 57
4 IGKC IGHE 16 46 15
5 IGKC IGHE 10 6 184
6 IGKC IGHE 2 215 1
表3(續)
株 # Olee1_ab_ 原始 Derp1_ab_clr Derp2_ab_clr Derf1_ab_clr
1 0 2.615831 1.6454458 1.3217044
2 0 0.8618727 0.65546227 1.1766725
3 1 0.23326397 0.004874706 1.7406077
4 1 0.98130155 1.6244271 0.8201184
5 3 0.901677 0.5801703 3.7320528
6 4 -0.39760602 4.0095387 -0.7951561
表3(續)
株 # Olee1_ab_clr Derp1_ab_ 排序 Derp2_ab_ 排序 Derf1_ab_ 排序
1 -1.1156448 1.006892564 1.002825161 0.982488148
2 -1.1272509 0.889548671 0.836672436 0.969734609
3 -0.43410373 0.636937195 0.45274196 0.972788444
4 0.028710008 0.775289528 0.858380754 0.76541155
5 0.6026533 0.434538481 0.33633976 0.544358354
6 0.8257969 -0.245443457 0.411732604 -0.386059378
表4：來自人類骨髓之含有HDM-特異性分群BCR序列的IgE純系
株 # 細胞 _ 條碼 重 _ 序列
1 SEQ ID NO: 669 SEQ ID NO: 670
2 SEQ ID NO: 671 SEQ ID NO: 672
3 SEQ ID NO: 673 SEQ ID NO: 674
4 SEQ ID NO: 675 SEQ ID NO: 676
5 SEQ ID NO: 677 SEQ ID NO: 678
6 SEQ ID NO: 679 SEQ ID NO: 680
7 SEQ ID NO: 681 SEQ ID NO: 682
8 SEQ ID NO: 683 SEQ ID NO: 684
9 SEQ ID NO: 685 SEQ ID NO: 686
10 SEQ ID NO: 687 SEQ ID NO: 688
11 SEQ ID NO: 689 SEQ ID NO: 690
12 SEQ ID NO: 691 SEQ ID NO: 692
13 SEQ ID NO: 693 SEQ ID NO: 694
14 SEQ ID NO: 695 SEQ ID NO: 696
15 SEQ ID NO: 697 SEQ ID NO: 698
16 SEQ ID NO: 699 SEQ ID NO: 700
17 SEQ ID NO: 701 SEQ ID NO: 702
18 SEQ ID NO: 703 SEQ ID NO: 704
19 SEQ ID NO: 705 SEQ ID NO: 706
20 SEQ ID NO: 707 SEQ ID NO: 708
21 SEQ ID NO: 709 SEQ ID NO: 710
22 SEQ ID NO: 711 SEQ ID NO: 712
23 SEQ ID NO: 713 SEQ ID NO: 714
24 SEQ ID NO: 715 SEQ ID NO: 716
表4(續)
株 # 輕 _ 序列 v_ 同一性
1 SEQ ID NO: 717 0.89492
2 Nan 0.92982
3 SEQ ID NO: 718 0.92982
4 SEQ ID NO: 719 0.92857
5 Nan 0.925
6 SEQ ID NO: 720 0.89153
7 Nan 0.89855
8 SEQ ID NO: 721 0.93103
9 SEQ ID NO: 722 0.87854
10 Nan 0.93103
11 Nan 0.92453
12 SEQ ID NO: 723 0.93333
13 nan 0.90625
14 nan 0.93103
15 nan 0.93103
16 nan 0.88889
17 nan 0.90722
18 SEQ ID NO: 724 0.90102
19 SEQ ID NO: 725 0.90722
20 nan 0.924
21 nan 0.94643
22 nan 0.91818
23 SEQ ID NO: 726 0.925
24 Nan 0.88618
表4(續)
株 # IR_VJ_1_ 基因座 IR_VDJ_1_ 基因座 IR_VJ_1_cdr3 IR_VDJ_1_cdr3
1 IGL IGH SEQ ID NO: 727 SEQ ID NO: 728
2 IGH 無 SEQ ID NO: 729
3 IGK IGH SEQ ID NO: 730 SEQ ID NO: 729
4 IGL IGH SEQ ID NO: 731 SEQ ID NO: 729
5 IGH 無 SEQ ID NO: 729
6 IGL IGH SEQ ID NO: 732 SEQ ID NO: 729
7 IGH 無 SEQ ID NO: 729
8 IGL IGH SEQ ID NO: 733 SEQ ID NO: 729
9 IGK IGH SEQ ID NO: 734 SEQ ID NO: 729
10 IGH 無 SEQ ID NO: 729
11 IGH 無 SEQ ID NO: 729
12 IGL IGH CAIWHDSETGWVF (SEQ ID NO: 735) SEQ ID NO: 729
13 IGH 無 SEQ ID NO: 729
14 IGH 無 SEQ ID NO: 729
15 IGH 無 SEQ ID NO: 729
16 IGH 無 SEQ ID NO: 736
17 IGH 無 SEQ ID NO: 737
18 IGL IGH CAAWDDRLNGWVF (SEQ ID NO: 738) SEQ ID NO: 737
19 IGL IGH CAAWDDRLNGWVF (SEQ ID NO: 738) SEQ ID NO: 737
20 IGH 無 SEQ ID NO: 739
21 IGH 無 SEQ ID NO: 739
22 IGH 無 SEQ ID NO: 739
23 IGK IGH CQQYDKWLITF (SEQ ID NO: 740) SEQ ID NO: 739
24 IGH 無 SEQ ID NO: 741
表4(續)
株 # IR_VJ_1_cdr3_nt IR_VDJ_1_cdr3_nt IR_VJ_1_v_ 基因 IR_VDJ_1_v_ 基因
1 SEQ ID NO: 742 SEQ ID NO: 743 IGLV2-14*01 IGHV3-9*01
2 無 SEQ ID NO: 744 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
3 SEQ ID NO: 745 SEQ ID NO: 744 IGKV3-20*01 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
4 SEQ ID NO: 746 SEQ ID NO: 744 IGLV3-21*02,IGLV3-21*03,IGLV3-21*04 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
5 無 SEQ ID NO: 744 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
6 SEQ ID NO: 747 SEQ ID NO: 744 IGLV2-14*01 IGHV3-9*01
7 無 SEQ ID NO: 744 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
8 SEQ ID NO: 748 SEQ ID NO: 744 IGLV3-21*03 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
9 SEQ ID NO: 749 SEQ ID NO: 744 IGKV3-11*01,IGKV3D-11*02 IGHV3-9*01
10 無 SEQ ID NO: 744 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
11 無 SEQ ID NO: 744 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
12 SEQ ID NO: 750 SEQ ID NO: 744 IGLV1-47*01 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
13 無 SEQ ID NO: 744 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
14 無 SEQ ID NO: 744 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
15 無 SEQ ID NO: 744 IGHV3-9*01,IGHV3-9*02
16 無 SEQ ID NO: 751 IGHV4-59*10
17 無 SEQ ID NO: 752 IGHV4-59*01,IGHV4-59*02,IGHV4-59*11
18 SEQ ID NO: 753 SEQ ID NO: 752 IGLV1-44*01 IGHV4-59*01
19 SEQ ID NO: 753 SEQ ID NO: 752 IGLV1-44*01 IGHV4-59*01,IGHV4-59*02,IGHV4-59*11
20 無 SEQ ID NO: 754 IGHV3-7*01
21 無 SEQ ID NO: 754 IGHV3-21*01,IGHV3-21*02,IGHV3-21*05
22 無 SEQ ID NO: 754 IGHV3-7*01
23 SEQ ID NO: 755 SEQ ID NO: 754 IGKV1D-8*02,IGKV1D-8*03 IGHV3-7*01
24 無 SEQ ID NO: 756 IGHV3-23*05
表4(續)
株 # IR_VDJ_1_d_ 基因 IR_VJ_1_j_ 基因 IR_VDJ_1_j_ 基因 IR_VJ_1_c_ 基因
1 IGHD3-10*02,IGHD4/OR15-4a*01,IGHD4/OR15-4b*01 IGLJ1*01 IGHJ6*02 IGLC1
2 IGHD4-17*01 IGHJ6*01
3 IGHD4-17*01 IGKJ3*01 IGHJ6*01 IGKC
4 IGHD4-17*01 IGLJ3*02 IGHJ6*01 IGLC2
5 IGHD4-17*01 IGHJ6*01
6 IGHD4-17*01 IGLJ1*01 IGHJ6*01 IGLC1
7 IGHD4-17*01 IGHJ6*01
8 IGHD4-17*01 IGLJ3*02 IGHJ6*01 IGLC2
9 IGHD4-17*01 IGKJ4*01 IGHJ6*01 IGKC
10 IGHD4-17*01 IGHJ6*01
11 IGHD4-17*01 IGHJ6*01
12 IGHD4-17*01 IGLJ3*02 IGHJ6*01 IGLC2
13 IGHD4-17*01 IGHJ6*01
14 IGHD4-17*01 IGHJ6*01
15 IGHD4-17*01 IGHJ6*01
16 IGHD5-24*01 IGHJ6*02
17 IGHD2-15*01,IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGHJ3*01
18 IGHD2-15*01,IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGLJ3*02 IGHJ3*01 IGLC2
19 IGHD2-15*01,IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGLJ3*02 IGHJ3*01 IGLC2
20 IGHD2-2*02 IGHJ2*01
21 IGHD2-2*02 IGHJ2*01
22 IGHD2-2*02 IGHJ2*01
23 IGHD2-2*02 IGKJ5*01 IGHJ2*01 IGKC
24 IGHD2-21*01,IGHD2-21*02 IGHJ5*02
表4(續)
株 # IR_VDJ_1_c_ 基因 Ig_ 鏈 cc_aa_ 漢明 cc_aa_ 漢明 _ 大小
1 IGHE IgE 21 15
2 IGHG4 IgG 21 15
3 IGHG4 IgG 21 15
4 IGHG4 IgG 21 15
5 IGHG2 IgG 21 15
6 IGHG4 IgG 21 15
7 IGHG4 IgG 21 15
8 IGHG4 IgG 21 15
9 IGHG3 IgG 21 15
10 IGHG4 IgG 21 15
11 IGHG3 IgG 21 15
12 IGHG4 IgG 21 15
13 IGHG4 IgG 21 15
14 IGHG4 IgG 21 15
15 IGHG4 IgG 21 15
16 IGHE IgE 576 1
17 IGHE IgE 696 3
18 IGHE IgE 696 3
19 IGHE IgE 696 3
20 IGHE IgE 753 4
21 IGHE IgE 753 4
22 IGHE IgE 753 4
23 IGHE IgE 753 4
24 IGHE IgE 1330 1
本發明提供以下說明具體例： 1.    一種抗體捕獲複合物，其包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分； 其中結合對的第一組分能夠與結合對的第二組分進行結合； 其中抗體捕獲分子能夠結合至目標抗體，其中目標抗體由抗體分泌細胞所分泌； 其中當結合對的第二組分是生物素而結合對的第一組分是鏈球菌親生物素蛋白時，抗體捕獲分子不結合至目標抗體的κ輕鏈。 2.    如具體例1之抗體捕獲複合物，其中： 結合對的第一組分包含抗生物素蛋白、鏈球菌親生物素蛋白或抗生物素，而結合對的第二組分包含生物素； 結合對的第一組分包含jun和fos中的一者，而結合對的第二組分包含jun和fos中的另一者； 結合對的第一組分包含mad和max中的一者，而結合對的第二組分包含mad和max中的另一者； 結合對的第一組分包含myc和max中的一者，而結合對的第二組分包含myc和max中的另一者； 結合對的第一組分包含疊氮化物和炔烴中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和炔烴中的另一者；或 結合對的第一組分包含疊氮化物和膦中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和膦中的另一者。 3.    如具體例1之抗體捕獲複合物，其中結合對的第一組分包含抗生物素蛋白或鏈球菌親生物素蛋白，而結合對的第二組分包含生物素。 4.    如具體例1之抗體捕獲複合物，其中結合對的第二組分包含抗體分泌細胞的表面標記，而結合對的第一組分包含結合至表面標記的抗體。 5.    如具體例4之抗體捕獲複合物，其中細胞表面標記包含CD27、CD38、CD45、CD138、CD98、CD78、CD319、CXCR4、BCMA、GPRC5D、FCRL5、CD19、Ly6D、CD52或跨膜活化因子鈣調節因子，以及親環蛋白配體交互作用因子(TACI)。 6.    如具體例1之抗體捕獲複合物，其中結合對的第二組分包含介白素6受體(IL-6R)，而結合對的第一組分包含抗IL-6R抗體或介白素6 (IL-6)。 7.    如具體例1之抗體捕獲複合物，其中結合對的第二組分包含CD27，而結合對的第一組分包含抗CD27抗體或CD70。 8.    如具體例1之抗體捕獲複合物，其中： 結合對的第二組分包含異硫氰酸螢光素(FITC)，而結合對的第一組分包含抗FITC抗體； 結合對的第二組分包含藻紅素(PE)，而結合對的第一組分包含抗PE抗體； 結合對的第二組分包含APC，而結合對的第一組分包含抗APC抗體； 結合對的第二組分包含BV421，而結合對的第一組分包含抗BV421抗體； 結合對的第二組分包含BV510，而結合對的第一組分包含抗BV510抗體； 結合對的第二組分包含BV605，而結合對的第一組分包含抗BV605抗體； 結合對的第二組分包含BV650，而結合對的第一組分包含抗BV650抗體； 結合對的第二組分包含BV711，而結合對的第一組分包含抗BV711抗體；或 結合對的第二組分包含BV786，而結合對的第一組分包含抗BV786抗體。 9.    如具體例1至8中任一項之抗體捕獲複合物，其中抗體捕獲分子包含捕獲抗體。 10.  如具體例9之抗體捕獲複合物，其中捕獲抗體包含抗Fc抗體、抗輕鏈κ抗體或抗輕鏈λ抗體。 11.  如具體例10之抗體捕獲複合物，其中抗Fc抗體包含抗Fcγ抗體、抗Fcα抗體或抗Fcε抗體。 12.  如具體例11之抗體捕獲複合物，其中抗Fcγ抗體包含抗FcγRI抗體、抗FcγRIIA抗體、抗FcγRIIB抗體、抗FcγRIIB1抗體、抗FcγRIIB2抗體、抗FcγRIIIA抗體或抗FcγRIIIB抗體。 13.  如具體例11之抗體捕獲複合物，其中抗Fcα抗體包含抗FcαRI抗體。 14.  如具體例11之抗體捕獲複合物，其中抗Fcε抗體包含抗FcεRI抗體或抗FcεRII抗體。 15.  如具體例9之抗體捕獲複合物，其中捕獲抗體包含抗IgM抗體。 16.  如具體例9之抗體捕獲複合物，其中捕獲抗體包含抗IgG抗體。 17.  如具體例16之抗體捕獲複合物，其中抗IgG抗體包含抗IgGl抗體、抗IgG2抗體、抗IgG2a抗體、抗IgG2b抗體、抗IgG3抗體或抗IgG4抗體。 18.  如具體例9之抗體捕獲複合物，其中捕獲抗體包含抗IgA抗體。 19.  如具體例18之抗體捕獲複合物，其中抗IgA抗體包含抗IgA1抗體、抗IgA2抗體、抗分泌型IgA抗體或聚合抗IgA抗體。 20.  如具體例9之抗體捕獲複合物，其中捕獲抗體包含抗IgE抗體。 21.  如具體例1至8中任一項之抗體捕獲複合物，其中抗體捕獲分子包含Fc受體或Fc受體的胞外域。 22.  如具體例21之抗體捕獲複合物，其中Fc受體包含Fcγ受體、Fcα受體或Fcε受體。 23.  如具體例22之抗體捕獲複合物，其中Fcγ受體包含FcγRI受體、FcγRIIA受體、FcγRIIB受體、FcγRIIB1受體、FcγRIIB2受體、FcγRIIIA受體、FcγRIIIB受體或FcRn受體。 24.  如具體例22之抗體捕獲複合物，其中Fcα受體包含FcαRI受體或Fcα/μR受體。 25.  如具體例22之抗體捕獲複合物，其中Fcε受體包含FcεRI受體或FcεRII受體。 26.  如具體例1至8中任一項之抗體捕獲複合物，其中抗體捕獲分子包含蛋白A或蛋白G。 27.  如具體例1至8中任一項之抗體捕獲複合物，其中抗體捕獲分子包含蛋白L。 28.  如具體例1之抗體捕獲複合物，其中抗體捕獲複合物包含連接至高親和力IgE受體(FcεRIa)的胞外域的抗生物素蛋白或鏈球菌親生物素蛋白。 29.  一種捕獲抗體分泌細胞所分泌之目標抗體的方法，該方法包含： 使一群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸以允許結合對的第二組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞； 使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至抗體分泌細胞細胞表面上之結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲抗體分泌細胞所分泌的目標抗體；以及 使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原。 30.  如具體例29之方法，其中： 結合對的第一組分包含抗生物素蛋白、鏈球菌親生物素蛋白或抗生物素，而結合對的第二組分包含生物素； 結合對的第一組分包含jun和fos中的一者，而結合對的第二組分包含jun和fos中的另一者； 結合對的第一組分包含mad和max中的一者，而結合對的第二組分包含mad和max中的另一者； 結合對的第一組分包含myc和max中的一者，而結合對的第二組分包含myc和max中的另一者； 結合對的第一組分包含疊氮化物和炔烴中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和炔烴中的另一者；或 結合對的第一組分包含疊氮化物和膦中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和膦中的另一者。 31.  如具體例29之方法，其中結合對的第一組分包含抗生物素蛋白或鏈球菌親生物素蛋白，而結合對的第二組分包含生物素。 32.  如具體例29之方法，其中： 結合對的第二組分包含異硫氰酸螢光素(FITC)，而結合對的第一組分包含抗FITC抗體； 結合對的第二組分包含藻紅素(PE)，而結合對的第一組分包含抗PE抗體； 結合對的第二組分包含APC，而結合對的第一組分包含抗APC抗體； 結合對的第二組分包含BV421，而結合對的第一組分包含抗BV421抗體； 結合對的第二組分包含BV510，而結合對的第一組分包含抗BV510抗體； 結合對的第二組分包含BV605，而結合對的第一組分包含抗BV605抗體； 結合對的第二組分包含BV650，而結合對的第一組分包含抗BV650抗體； 結合對的第二組分包含BV711，而結合對的第一組分包含抗BV711抗體；或 結合對的第二組分包含BV786，而結合對的第一組分包含抗BV786抗體。 33.  一種捕獲由抗體分泌細胞所分泌之目標抗體的方法，該方法包含： 使一群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞細胞表面上的結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲抗體分泌細胞所分泌的目標抗體；以及 使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原。 34.  如具體例33之方法，其中結合對的第二組分包含該群抗體分泌細胞的表面標記，而結合對的第一組分包含結合至表面標記的抗體。 35.  如具體例34之方法，其中細胞表面標記包含CD27、CD38、CD45、CD138、CD98、CD78、CD319、CXCR4、BCMA、GPRC5D、FCRL5、CD19、Ly6D、CD52或跨膜活化因子鈣調節因子，以及親環蛋白配體交互作用因子(TACI)。 36.  如具體例33之方法，其中結合對的第二組分包含介白素6受體(IL-6R)，而結合對的第一組分包含抗IL-6R抗體或介白素6 (IL-6)。 37.  如具體例33之方法，其中結合對的第二組分包含CD27，而結合對的第一組分包含抗CD27抗體或CD70。 38.  如具體例29至37中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含捕獲抗體。 39.  如具體例38之方法，其中捕獲抗體包含抗Fc抗體、抗輕鏈κ抗體或抗輕鏈λ抗體。 40.  如具體例39之方法，其中抗Fc抗體包含抗Fcγ抗體、抗Fcα抗體或抗Fcε抗體。 41.  如具體例40之方法，其中抗Fcγ抗體包含抗FcγRI抗體、抗FcγRIIA抗體、抗FcγRIIB抗體、抗FcγRIIB1抗體、抗FcγRIIB2抗體、抗FcγRIIIA抗體或抗FcγRIIIB抗體。 42.  如具體例40之方法，其中抗Fcα抗體包含抗FcαRI抗體。 43.  如具體例40之方法，其中抗Fcε抗體包含抗FcεRI抗體或抗FcεRII抗體。 44.  如具體例38之方法，其中捕獲抗體包含抗IgM抗體。 45.  如具體例38之方法，其中捕獲抗體包含抗IgG抗體。 46.  如具體例45之方法，其中抗IgG抗體包含抗IgGl抗體、抗IgG2抗體、抗IgG2a抗體、抗IgG2b抗體、抗IgG3抗體或抗IgG4抗體。 47.  如具體例38之方法，其中捕獲抗體包含抗IgA抗體。 48.  如具體例47之方法，其中抗IgA抗體包含抗IgA1抗體、抗IgA2抗體、抗分泌型IgA抗體或聚合抗IgA抗體。 49.  如具體例38之方法，其中捕獲抗體包含抗IgE抗體。 50.  如具體例29至37中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含Fc受體或Fc受體的胞外域。 51.  如具體例50之方法，其中Fc受體包含Fcγ受體、Fcα受體或Fcε受體。 52.  如具體例51之方法，其中Fcγ受體包含FcγRI受體、FcγRIIA受體、FcγRIIB受體、FcγRIIB1受體、FcγRIIB2受體、FcγRIIIA受體、FcγRIIIB受體或FcRn受體。 53.  如具體例51之方法，其中Fcα受體包含FcαRI受體或Fcα/μR受體。 54.  如具體例51之方法，其中Fcε受體包含FcεRI受體或FcεRII受體。 55.  如具體例29至37中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含蛋白A或蛋白G。 56.  如具體例29至37中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含蛋白L。 57.  如具體例29至56中任一項之方法，其進一步包含使該群抗體分泌細胞與二級抗Ig抗體接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合二級抗Ig抗體。 58.  如具體例57之方法，其中二級抗Ig抗體是抗IgE或抗IgG。 59.  如具體例57或58之方法，其中二級抗Ig抗體被可偵測地標記。 60.  如具體例59之方法，其中二級抗Ig抗體用放射性化合物、螢光化合物或酶標記。 61.  如具體例60之方法，其中放射性化合物包含 3H、 14C、 19F、 35S、 125I、 131I、 111In或 99Tc。 62.  如具體例60之方法，其中螢光化合物包含螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素或螢光蛋白。 63.  如具體例60之方法，其中酶包含鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或葡萄糖氧化酶。 64.  如具體例29至63中任一項之方法，其中在使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟中，抗原是條碼抗原。 65.  如具體例29至64中任一項之方法，其中在使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟中，使該群抗體分泌細胞與多個條碼抗原接觸，其中多個條碼抗原的各個條碼抗原包含連接至獨特核酸分子的獨特抗原。 66.  如具體例65之方法，其中獨特核酸分子包含DNA。 67.  如具體例65之方法，其中獨特核酸分子包含RNA。 68.  如具體例65至67中任一項之方法，其中每個獨特核酸分子包含約10個核苷酸至約500個核苷酸。 69.  如具體例65至68中任一項之方法，其中每個條碼抗原被可偵測地標記。 70.  如具體例69之方法，其中每個條碼抗原用放射性化合物、螢光化合物或酶標記。 71.  如具體例70之方法，其中放射性化合物包含 3H、 14C、 19F、 35S、 125I、 131I、 111In或 99Tc。 72.  如具體例70之方法，其中螢光化合物包含螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素或螢光蛋白。 73.  如具體例70之方法，其中酶包含鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或葡萄糖氧化酶。 74.  如具體例64至73中任一項之方法，其中條碼抗原包含過敏原。 75.  如具體例29至74中任一項之方法，其中抗體分泌細胞是漿細胞或漿母細胞。 76.  如具體例29至75中任一項之方法，其中該群抗體分泌細胞是藉由從人類獲得的細胞群富集免疫細胞而獲得。 77.  如具體例76之方法，其中從人類獲得的該群細胞富集漿細胞或漿母細胞。 78.  如具體例77之方法，其中該經富集免疫細胞群係使用泛B細胞富集來富集漿細胞或漿母細胞。 79.  如具體例29至78中任一項之方法，其中該群抗體分泌細胞獲自人類的淋巴結、肺臟、骨髓或血液。 80.  如具體例29至79中任一項之方法，進一步包含偵測目標抗體所結合的抗原。 81.  如具體例29至80中任一項之方法，進一步包含分選該群抗體分泌細胞以收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的抗體分泌細胞各自分泌被抗體捕獲分子捕獲並被抗原結合的抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞。 82.  如具體例81之方法，其中將收集的抗體分泌細胞庫分離成單個細胞並分離出分泌目標抗體的抗體分泌細胞。 83.  如具體例57至80中任一項之方法，進一步包含偵測二級抗Ig抗體。 84.  如具體例83之方法，進一步包含分選該群抗體分泌細胞以收集抗體分泌細胞庫，其中該庫中的抗體分泌細胞各自分泌被抗體捕獲分子捕獲並被抗原和二級抗Ig抗體結合的抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌被抗原和二級抗Ig抗體結合的目標抗體的抗體分泌細胞。 85.  如具體例84之方法，進一步包含將收集的抗體分泌細胞庫分離成單個細胞並分離出分泌目標抗體的抗體分泌細胞。 86.  如具體例29至85中任一項之方法，進一步包含在使該群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸之前，使該群抗體分泌細胞與Fc block接觸。 87.  一種捕獲由抗體分泌細胞所分泌之IgE抗體的方法，其中IgE抗體是針對過敏原，該方法包含： 使一群抗體分泌細胞與NHS-生物素接觸以允許生物素結合至細胞表面，其中該群抗體分泌細胞包含分泌IgE抗體的抗體分泌細胞； 使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至高親和力IgE受體(FcεRIa)胞外域的鏈球菌親生物素蛋白，藉此抗體捕獲分子結合至抗體分泌細胞所分泌的IgE抗體；以及 使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，其中抗原是過敏原的抗原部分或多個抗原部分的混合物，藉此被抗體捕獲複合物捕獲的IgE抗體結合至抗原。 88.  如具體例87之方法，其中抗原包含多個條碼抗原，其中多個條碼抗原中的各者是過敏原的不同抗原部分。 89.  如具體例87或88之方法，進一步包含分選該群抗體分泌細胞以收集抗體分泌細胞庫，其中該庫中的抗體分泌細胞各自分泌被抗體捕獲複合物捕獲並被抗原結合的IgE抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌IgE抗體的抗體分泌細胞。 90.  如具體例87或88之方法，進一步包含使該群抗體分泌細胞與抗IgE抗體接觸，以允許由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的IgE抗體結合至抗IgE抗體。 91.  如具體例90之方法，進一步包含分選該群抗體分泌細胞以收集抗體分泌細胞庫，其中該庫中的抗體分泌細胞各自分泌被抗體捕獲複合物捕獲並被抗原和抗IgE抗體結合的IgE抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌IgE抗體的抗體分泌細胞。 92.  如具體例89或91之方法，進一步包含將收集的抗體分泌細胞庫分離成單個細胞並分離出分泌IgE抗體的抗體分泌細胞。 93.  如具體例29至92中任一項之方法，其中使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟包含： (a)使該群抗體分泌細胞與抗原的第一標記形式接觸以允許抗原結合至在該群抗體分泌細胞的細胞表面上所捕獲之包括目標抗體的抗體，其中抗原的第一標記形式接合至第一可偵測標記； (b)洗滌該群抗體分泌細胞以去除未結合的抗原； (c)使該群抗體分泌細胞與 (i)抗原的未標記形式、 (ii)抗原的第二標記形式，或 (iii)抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式接觸； (d)洗滌該群抗體分泌細胞以去除未結合的抗原，以及 (e)收集維持著結合至抗原的第一標記形式的抗體分泌細胞庫，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，其中由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體維持著結合至抗原的第一標記形式。 94.  如具體例93之方法，其中抗原的第一標記形式濃度在0.001nM和1uM之間。 95.  如具體例93之方法，其中抗原的第一標記形式濃度在0.1和7.5nM之間。 96.  如具體例93至95中任一項之方法，其中第一可偵測標記是第一螢光標記。 97.  如具體例93至96中任一項之方法，其中抗原是單體形式的蛋白質。 98.  如具體例93至96中任一項之方法，其中抗原是多聚體形式的蛋白質。 99.  如具體例93至96中任一項之方法，其中抗原是以單體和多聚體形式存在的蛋白質。 100.      如具體例97至99中任一項之方法，其中抗原的第一標記形式是抗原的單價形式。 101.      如具體例97至100中任一項之方法，其中抗原的未標記形式是抗原的單價形式。 102.      如具體例97至100中任一項之方法，其中抗原的未標記形式是抗原的多價形式。 103.      如具體例102之方法，其中抗原的多價形式由抗原結合的多價分子提供。 104.      如具體例103之方法，其中多價分子選自鏈球菌親生物素蛋白多聚體(諸如四聚體)、免疫球蛋白Fc片段的二聚體，或三聚化分子的三聚體(諸如折疊子)。 105.      如具體例97至104中任一項之方法，其中抗原的第二標記形式是抗原的單價形式。 106.      如具體例99至104中任一項之方法，其中抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。 107.      如具體例106之方法，其中抗原的多價形式由抗原結合或連接的多價分子提供。 108.      如具體例107之方法，其中多價分子為鏈球菌親生物素蛋白多聚體(諸如四聚體)、免疫球蛋白Fc片段的二聚體，或三聚化分子的三聚體(諸如折疊子)。 109.      如具體例106至108中任一項之方法，其中抗原的多價形式用第二可偵測標記標記。 110.       如具體例109之方法，其中第二可偵測標記是第二螢光標記。 111.       如具體例100之方法，其中在步驟(c)中該群抗體分泌細胞與抗原的未標記形式接觸。 112.       如具體例111之方法，其中抗原的未標記形式是抗原的單價形式。 113.       如具體例111或112之方法，其中相對於步驟(a)中使用的抗原的第一標記形式，抗原的未標記形式的莫耳比為至少2至4倍。 114.       如具體例100之方法，其中在步驟(c)中該群抗體分泌細胞與抗原的第二標記形式接觸。 115.       如具體例114之方法，其中抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。 116.       如具體例114或115之方法，其中相對於步驟(a)中使用的抗原的第一標記形式，抗原的第二標記形式的莫耳比為至少2至4倍。 117.       如具體例111至116之方法，其中在步驟(e)中收集細胞之前重複步驟(c)中的接觸和步驟(d)中的洗滌至少一次。 118.       如具體例100之方法，其中在步驟(c)中該群抗體分泌細胞與抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式接觸。 119.       如具體例118之方法，其中未標記形式是抗原的單價形式，而抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。 120.      如具體例118之方法，其中抗原是單體蛋白，未標記形式是抗原的單價形式，而抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。 121.      如具體例118之方法，其中抗原是多聚體蛋白，未標記形式是抗原的單價形式，而抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。 122.      如具體例118之方法，其中抗原是以單體和多聚體形式存在的蛋白質，未標記形式是抗原的單價形式，而抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。 123.      如具體例118至122中任一項之方法，其中使細胞同時接觸抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式。 124.      如具體例118至123中任一項之方法，其中相對於步驟(a)中使用的抗原的第一標記形式，抗原的未標記形式的莫耳比為至少2至4倍。 125.      如具體例93至124中任一項之方法，其中第一可偵測標記是螢光標記，且其中使用螢光活化細胞分選來收集與抗原的第一標記形式維持著結合的細胞。 126.      如具體例111至124中任一項之方法，其中第一可偵測標記是第一螢光標記，而第二可偵測標記是不同於第一螢光標記的第二螢光標記，其中進行二維螢光活化細胞分選以收集與抗原的第一標記形式維持著結合的抗體分泌細胞庫，並且其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌與抗原的第一標記形式維持著結合的目標抗體的抗體分泌細胞。 127.      如具體例93至126之方法，其中目標抗體具有約0.1pM至約25nM(KD)範圍內的親和力。 128.      如具體例127之方法，其中親和力小於約10nM(KD)。 129.      如具體例93至128中任一項之方法，進一步包含將步驟(e)中收集的抗體分泌細胞庫分離成單個細胞並分離出分泌目標抗體的抗體分泌細胞。 130.      如具體例82、85、92或129之方法，進一步包含從分泌目標抗體之經分離抗體分泌細胞分離出抗體編碼核酸。 131.      一種鑑定編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由包含經修飾細胞表面的細胞所分泌，並且其中目標抗體隨後被捕獲在經修飾細胞表面上，該方法包含： a)提供包含經修飾細胞表面的抗體分泌細胞，其中抗體分泌細胞分泌目標抗體，其中目標抗體隨後被捕獲在經修飾細胞表面上，其中被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體結合至抗原，其中抗原連接至條碼核酸分子，且其中抗體分泌細胞進一步包含核酸分子，該核酸分子包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之目標抗體的抗原結合片段的基因區； b)使條碼核酸分子的一部分與附接於固體表面的第一核酸分子的一部分雜交； c)使包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接於固體表面的第二核酸分子的一部分雜交； d)製備抗體分泌細胞的基因表現之第一擴增子庫、抗體分泌細胞的可變區、多樣性區和接合區(VDJ)之第二擴增子庫，以及抗原條碼核酸分子之第三擴增子庫； e)對三個擴增子庫中的每一者進行定序；以及 f)鑑定編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區。 132.      如具體例131之方法，其中條碼核酸分子的一部分與第一模板轉換寡核苷酸(TSO)互補，其中條碼核酸分子的該部分終止於條碼核酸分子的3'端。 133.      如具體例131或如具體例132之方法，其中第一核酸分子附接於固體表面的該部分包含第一模板轉換寡核苷酸(TSO)。 134.      如具體例131至133中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子的5'端包含三個連續的核糖鳥苷殘基的第一序列。 135.      如具體例131至134中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子進一步包含第一獨特分子識別符(UMI)。 136.      如具體例131至135中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子進一步包含第一表面條碼。 137.      如具體例131至136中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子進一步包含第一定序引子。 138.      如具體例131至137中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子從5'至3'包含三個核糖鳥苷殘基的第一序列、第一TSO、第一UMI、第一表面條碼和第一定序引子。 139.      如具體例131至138中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子藉由附接於固體表面的第一核酸分子的3'端附接。 140.      如具體例131至139中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子包含附接於固體表面的第一DNA分子。 141.      如具體例140之方法，其中附接於固體表面的第一DNA分子包含附接於固體表面的第一單股DNA分子。 142.      如具體例141之方法，其中附接至固體表面的第一單股DNA分子的部分包含第一TSO，其中與第一單股DNA分子雜交的條碼核酸分子的部分與第一TSO互補，且其中該方法進一步包含從與第一TSO互補之條碼核酸分子的部分的3'端開始逆轉錄附接至固體表面的第一單股DNA分子。 143.      如具體例131至142中任一項之方法，其中條碼核酸分子是單股DNA條碼核酸分子，且其中附接至固體表面的第一核酸分子的部分包含第一TSO，且該方法進一步包含從第一TSO的5'端開始逆轉錄第一單股DNA條碼核酸分子。 144.      如具體例131至143中任一項之方法，其中條碼核酸分子的部分的3'端包含三個連續的胞苷或核糖胞苷殘基。 145.      如具體例144之方法，進一步包含逆轉錄編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子，藉此產生編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股cDNA分子，其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股cDNA分子的核苷酸序列與編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子的DNA互補序列不同，因為被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的3'端包含三個額外的連續胞苷或核糖胞苷殘基。 146.      如具體例145之方法，其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子的3'端包含多個連續的腺嘌呤殘基。 147.      如具體例145或具體例146之方法，其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的5'端包含多個連續的胸腺嘧啶殘基。 148.      如具體例131至147中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列。 149.      如具體例131至148中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子進一步包含第二UMI。 150.      如具體例131至149中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子進一步包含第二表面條碼，其中第一和第二表面條碼核酸分子的核苷酸序列相同。 151.      如具體例131至150中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子進一步包含第二定序引子。 152.      如具體例131至151中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子從5'到3'包含三個核糖鳥苷殘基的第二序列、第二TSO、第二UMI、第二表面條碼，以及第二定序引子，其中第一與第二表面條碼核酸分子的核苷酸序列是相同的。 153.      如具體例131至152中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子藉由附接至固體表面的第二核酸分子的3'端附接。 154.      如具體例131至153中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子包含附接至固體表面的第二DNA分子。 155.      如具體例154之方法，其中附接至固體表面的第二DNA分子包含附接至固體表面的第二單股DNA分子。 156.      如具體例155之方法，其中附接至固體表面的第二單股DNA分子的部分的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列，且其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的部分的3'端包含三個連續的胞苷或核糖胞苷殘基，其中該方法進一步包含從三個連續胞苷或核糖胞苷殘基的3'端開始逆轉錄附接於固體表面的第二單股DNA分子。 157.      如具體例131至156中任一項之方法，其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之目標抗體的抗原結合片段的基因區的第二單股DNA分子。 158.      如具體例156之方法，其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的部分的3'端包含三個連續胞苷或核糖胞苷殘基，且其中附接至固體表面的第二單股DNA分子的部分的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列，其中該方法進一步包含從編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的部分的3'端開始逆轉錄附接於固體表面的第二單股DNA分子。 159.      如具體例131至158中任一項之方法，其中抗體分泌細胞佈置在具有固體表面的分區內。 160.      如具體例131至159中任一項之方法，其中固體表面包含珠粒。 161.      如具體例159或160之方法，進一步包含溶解分區內的抗體分泌細胞。 162.      如具體例131至161中任一項之方法，其中條碼核酸分子進一步包含第三定序引子。其中第三定序引子始於條碼核酸分子的5'端。 163.      如具體例131至162中任一項之方法，其中該第一擴增子庫的各個擴增子包含基因，其中各個擴增子不包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子。 164.      如具體例163之方法，該方法進一步包含對第一擴增子庫進行樣品分離、比對、過濾和UMI計數。 165.      如具體例131至164中任一項之方法，其中第一擴增子庫的定序包含次世代定序。 166.      如具體例131至165中任一項之方法，該方法進一步包含將第一擴增子庫的各個擴增子映射至標準參考基因組並進行比對。 167.      如具體例166之方法，其中標準參考基因組包含人類標準參考基因組。 168.      如具體例167之方法，其中人類標準參考基因組是GRCh38。 169.      如具體例166之方法，其中標準參考基因組包含鼠類標準參考基因組。 170.      如具體例169之方法，其中鼠類標準參考基因組是mm10。 171.      如具體例166至170中任一項之方法，其中映射與比對包含將第一擴增子庫的各個擴增子利用剪接感知比對器(STAR)映射到標準參考基因組，其中第一擴增子庫的各個擴增子包含一個獨特的分子識別符，其中映射到標準參考基因組的註釋基因的第一擴增子庫的所有擴增子經過分箱，且其中針對每個獨特分子識別符(UMI)計數經分箱的擴增子，從而生成單細胞計數矩陣，該矩陣包含每個註釋基因的映射計數和每個UMI的計數。 172.      如具體例171之方法，該方法進一步包含藉由計算註釋基因總數被除以計數的UMI總數的log 10的比率，針對高品質細胞和廣泛分析的基因來過濾單細胞計數矩陣，其中過濾掉比率低於約0.1的細胞，其中過濾掉計數的UMI總數的四分位數間距超過約四倍的細胞，以及過濾掉超過約80%的讀段映射到粒線體基因的細胞。 173.      如具體例172之方法，該方法進一步包含標準化單細胞計數矩陣，使得計數的UMI總數為約10,000。 174.      如具體例172或173之方法，該方法進一步包含計算單細胞計數矩陣的PCA嵌入，並執行主要細胞類型的迭代分群以鑑別批次之間的相似性，從而生成均勻流形近似和投影(UMAP)。 175.      如具體例172至174中任一項之方法，該方法進一步包含使用集群特異性的中心來確定每個細胞的線性調整函數，且將每個細胞的線性調整函數應用於校正批次的差異，從而生成經批次校正嵌入，並使用經批次校正嵌入來生成均勻流形二維近似和投影(UMAP)。 176.      如具體例174或175之方法，該方法進一步包含確定加權k-近鄰圖並且將萊頓演算法應用於具有約0.1、約0.2、約0.5和約1.0的分辨率值的加權k-近鄰圖，以便按照非監督方式確定細胞類型集群。 177.      如具體例176之方法，該方法進一步包含對一個集群中的所有細胞進行成對Wilcox檢定並比較第一個成對Wilcox檢定的結果，而對每隔一個集群中的所有細胞進行另一個成對Wilcox檢定，以量化每個集群中每個基因的p-值和變化倍數，其中當基因具有低p值和高變化倍數時，細胞由抗體分泌細胞的共同標記所標記，且細胞按照差異表現結果中排名靠前的基因命名的分群亞型予以標記。 178.      如具體例131至177中任一項之方法，該方法進一步包含進行樣品分離，讀段對從頭組裝成片段重疊群，並且針對生殖系區段V(D)J參考序列的片段重疊群相對第二擴增子家族進行比對和註釋。 179.      如具體例178之方法，其中片段重疊群與生殖系區段V(D)J參考序列的比對包含與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫進行比對。 180.      如具體例179之方法，其中人類生殖系參考數據庫包含人類生殖系免疫球蛋白序列的IMGT數據庫。 181.      如具體例179之方法，其中鼠類生殖系參考數據庫包含IMGT生殖系參考數據庫。 182.      如具體例179至181中任一項之方法，該方法進一步包含將VDJ序列與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫中的序列進行比較，從而藉由檢查框內比對、CDR3的長度，及在可變區序列中不存在終止密碼子來標記VDJ序列以進行品質比對，與基於標記過濾VDJ序列。 183.      如具體例182之方法，該方法進一步包含將VDJ序列映射到免疫球蛋白鏈的參考數據庫。 184.      如具體例179之方法，其中免疫球蛋白同型、可變區映射、接合區映射、多樣性區映射、每個細胞的重鏈和輕鏈序列的全長可變區的準確性是藉由比對進行確認。 185.      如具體例131至184中任一項之方法，該方法進一步包含對第三個擴增子庫進行樣品分離、比對、過濾和UMI計數。 186.      如具體例131至185中任一項之方法，該方法進一步包含將第三擴增子庫映射到訂製的短讀段參考品，其包含與每個抗原相關的條碼核酸分子參考品，其中針對條碼抗原單細胞矩陣中的每個細胞對每個獨特映射的條碼核酸分子的計數求和。 187.      如具體例186之方法，該方法進一步包含藉由取得每次樣品捕獲中多個條碼核酸分子的各個條碼核酸分子的中心對數比，對所有細胞中的條碼核酸分子進行量化和標準化。 188.      如具體例187之方法，該方法進一步包含藉由背景降噪和縮放(DSB)針對多個條碼核酸分子中的各個條碼核酸分子去除背景抗原信號。 189.      如具體例188之方法，該方法進一步包含確定抗原信號分佈，其中當在抗原信號分佈中有充分分離的雙峰分佈時，使用z轉換值來計算抗原特異性，並且其中當在抗原信號分佈中沒有充分分離的雙峰分佈時使用分位數值。 190.      如具體例189之方法，該方法進一步包含對目標抗原和陰性對照抗原分佈進行統計建模。 191.      如具體例131至190中任一項之方法，其中第一擴增子庫、第二擴增子庫和第三擴增子庫的分析是同時進行的，以獲得經修飾細胞表面上所捕獲之抗原陽性目標抗體的至少一個候選序列。 192.      如具體例191之方法，該方法進一步包含使用第一擴增子庫分析結果和第二擴增子庫分析結果對具有有效抗體恆定區的抗體分泌細胞進行子集化。 193.      如具體例192之方法，其中抗體恆定區包含IgE恆定區。 194.      如具體例192或193之方法，其中子集抗體分泌細胞包含可偵測程度的IgE重鏈和CD79a，但缺乏可偵測程度的Ms4a1和CD19，其中子集抗體分泌細胞是IgE +抗體分泌細胞。 195.      如具體例194之方法，該方法進一步包含針對IgA分泌細胞同型、IgG分泌細胞同型及/或IgM分泌細胞同型評估IgE +抗體分泌細胞的差異表現。 196.      如具體例195之方法，其中差異表現的評估進一步特徵鑑定IgE +抗體分泌細胞的獨特轉錄特徵。 197.      如具體例196的方法，該方法進一步包含評估IgE +抗體分泌細胞的抗原特異性。 198.      如具體例197之方法，其中評估包含比較IgE +抗體分泌細胞對多種抗原和對照抗原的抗原特異性，且其中多種抗原包含目標抗原。 199.      如具體例198之方法，其中比較包含藉由從與對照抗原相關的信號的分位數值(qC)和懲罰因數(x)扣除與抗原相關的信號的分位數值(qT)，來計算多個抗原中的每個抗原和對照抗原的經驗分數，以確定抗原特異性分數，其中抗原特異性分數 = qT - qC x。 200.      如具體例199之方法，其中懲罰因數對所有抗原都是相同的。 201.      如具體例199之方法，其中懲罰因數對不同的抗體同型是不同的。 202.      如具體例199之方法，其中懲罰因數在使用其他抗原時是不同的。 203.      如具體例199之方法，該方法進一步包含確定多種抗原和對照抗原中每一者的抗原特異性分數。 204.      如具體例203之方法，該方法進一步包含計算對照抗原特異性分數，其中當抗原特異性分數高且對照抗原特異性分數低時，挑選細胞。 205.      如具體例204之方法，其中VDJ區鑑別抗原特異性抗體。 206.      如具體例204之方法，該方法進一步包含使用細胞的成對V H：V L抗體序列從抗原信號的排序表中挑出候選抗體。 207.      如具體例191至206中任一項之方法，該方法進一步包含確定同型、條件及/或抗原特異性之間的差異表現，其中確定同型之間的差異表現包含對一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定，並且對另一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定，從而量化每個集群的各個基因的p值和變化倍數；以及其中確定抗原特異性之間的差異表現包含對一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定並對另一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定，從而量化每個集群的各個基因的p值和變化倍數。 208.      如具體例191至207中任一項之方法，該方法進一步包含對抗原陽性目標細胞中的VDJ序列相似性進行分群，其中分群VDJ序列相似性包含基於序列的比對，按照胺基酸序列對相似可變區進行分組。 209.      如具體例191至208中任一項之方法，其中抗原陽性目標細胞是IgE +。 210.      如具體例191至209中任一項之方法，該方法進一步包含修整冗餘序列。 211.       一種鑑定編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由抗體分泌細胞所分泌，該方法包含： a)使一群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，從而結合對的第二組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面； b)使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面上之結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲由抗體分泌細胞所分泌的目標抗體； c)使該群抗體分泌細胞與二級抗Ig抗體接觸，以允許由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合二級抗Ig抗體； d)使該群抗體分泌細胞與包含條碼核酸分子的抗原接觸，以允許由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原； e)收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的每個細胞分泌被抗體捕獲複合物捕獲、被二級抗Ig抗體和被包含條碼核酸分子的抗原結合的抗體，並且其中抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞； f)將抗體分泌細胞庫分離成單抗體分泌細胞，並且對每個單抗體分泌細胞： 1)使條碼核酸分子的一部分與附接至固體表面的第一核酸分子的一部分雜交，其中固體表面和附接至其上的第一核酸分子對於每個單抗體分泌細胞是獨特的； 2)使包含編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接至固體表面的第二核酸分子的一部分雜交； 3)製備基因表現之第一擴增子庫，可變區、多樣性區和接合區(VDJ)之第二擴增子庫，與抗原條碼核酸分子之第三擴增子庫；以及 4)對三個擴增子庫中的每一者進行定序；及 g)鑑定編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區。 212.      如具體例211之方法，其中： 結合對的第一組分包含抗生物素蛋白、鏈球菌親生物素蛋白或抗生物素，而結合對的第二組分包含生物素； 結合對的第一組分包含jun和fos中的一者，而結合對的第二組分包含jun和fos中的另一者； 結合對的第一組分包含mad和max中的一者，而結合對的第二組分包含mad和max中的另一者； 結合對的第一組分包含myc和max中的一者，而結合對的第二組分包含myc和max中的另一者； 結合對的第一組分包含疊氮化物和炔烴中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和炔烴中的另一者；或 結合對的第一組分包含疊氮化物和膦中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和膦中的另一者。 213.      如具體例211之方法，其中結合對的第一組分包含抗生物素蛋白或鏈球菌親生物素蛋白，而結合對的第二組分包含生物素。 214.      如具體例211之方法，其中： 結合對的第二組分包含異硫氰酸螢光素(FITC)，而結合對的第一組分包含抗FITC抗體； 結合對的第二組分包含藻紅素(PE)，而結合對的第一組分包含抗PE抗體； 結合對的第二組分包含APC，而結合對的第一組分包含抗APC抗體； 結合對的第二組分包含BV421，而結合對的第一組分包含抗BV421抗體； 結合對的第二組分包含BV510，而結合對的第一組分包含抗BV510抗體； 結合對的第二組分包含BV605，而結合對的第一組分包含抗BV605抗體； 結合對的第二組分包含BV650，而結合對的第一組分包含抗BV650抗體； 結合對的第二組分包含BV711，而結合對的第一組分包含抗BV711抗體；或 結合對的第二組分包含BV786，而結合對的第一組分包含抗BV786抗體。 215.      一種鑑定編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由抗體分泌細胞所分泌，該方法包含： a)使一群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面上的結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲由抗體分泌細胞所分泌的目標抗體； b)使該群抗體分泌細胞與二級抗-Ig抗體接觸，以允許由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合二級抗-Ig抗體； c)使該群抗體分泌細胞與包含條碼核酸分子的抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原； d)收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的各個細胞分泌被抗體捕獲複合物捕獲、被二級抗-Ig抗體和包含條碼核酸分子的抗原結合的抗體，且其中抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞； e)將抗體分泌細胞庫分離成單抗體分泌細胞，並且針對各個單抗體分泌細胞： 1)使條碼核酸分子的一部分與附接於固體表面的第一核酸分子的一部分雜交，其中固體表面和附接其上的第一核酸分子對於各個單抗體分泌細胞都是獨特的； 2)使編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接於固體表面的第二核酸分子的一部分雜交； 3)製備抗體分泌細胞的基因表現之第一擴增子庫，抗體分泌細胞可變區、多樣性區和接合區(VDJ)之第二擴增子庫，和抗原條碼核酸分子之第三擴增子庫；及 4)對三個擴增子庫中的每一者進行定序；以及 f)鑑定編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區。 216.      如具體例215之方法，其中結合對的第二組分包含抗體分泌細胞的表面標記，而結合對的第一組分是結合至表面標記的抗體。 217.      如具體例216之方法，其中表面標記包含CD27、CD38、CD45、CD138、CD98、CD78、CD319、CXCR4、BCMA、GPRC5D、FCRL5、CD19、Ly6D、CD52或跨膜活化因子鈣調節因子，以及親環蛋白配體交互作用因子(TACI)。 218.      如具體例215之方法，其中結合對的第二組分包含介白素6受體(IL-6R)，而結合對的第一組分包含抗IL-6R抗體或介白素6 (IL-6)。 219.      如具體例215之方法，其中結合對的第二組分包含CD27，而結合對的第一組分包含抗CD27抗體或CD70。 220.      如具體例211至219中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含捕獲抗體。 221.      如具體例220之方法，其中捕獲抗體包含抗Fc抗體、抗輕鏈κ抗體或抗輕鏈λ抗體。 222.      如具體例221之方法，其中抗Fc抗體包含抗Fcγ抗體、抗Fcα抗體或抗Fcε抗體。 223.      如具體例222之方法，其中抗Fcγ抗體包含抗FcγRI抗體、抗FcγRIIA抗體、抗FcγRIIB抗體、抗FcγRIIB1抗體、抗FcγRIIB2抗體、抗FcγRIIIA抗體或抗FcγRIIIB抗體。 224.      如具體例222之方法，其中抗Fcα抗體包含抗FcαRI抗體。 225.      如具體例222之方法，其中抗Fcε抗體包含抗FcεRI抗體或抗FcεRII抗體。 226.      如具體例220之方法，其中捕獲抗體包含抗IgM抗體。 227.      如具體例220之方法，其中捕獲抗體包含抗IgG抗體。 228.      如具體例227之方法，其中抗IgG抗體包含抗IgGl抗體、抗IgG2抗體、抗IgG2a抗體、抗IgG2b抗體、抗IgG3抗體或抗IgG4抗體。 229.      如具體例220之方法，其中捕獲抗體包含抗IgA抗體。 230.      如具體例229之方法，其中抗IgA抗體包含抗IgA1抗體、抗IgA2抗體、抗分泌型IgA抗體或聚合抗IgA抗體。 231.      如具體例220之方法，其中捕獲抗體包含抗IgE抗體。 232.      如具體例211至219中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含Fc受體或Fc受體的胞外域。 233.      如具體例232之方法，其中Fc受體包含Fcγ受體、Fcα受體或Fcε受體。 234.      如具體例233之方法，其中Fcγ受體包含FcγRI受體、FcγRIIA受體、FcγRIIB受體、FcγRIIB1受體、FcγRIIB2受體、FcγRIIIA受體、FcγRIIIB受體或FcRn受體。 235.      如具體例233之方法，其中Fcα受體包含FcαRI受體或Fcα/μR受體。 236.      如具體例233之方法，其中Fcε受體包含FcεRI受體或FcεRII受體。 237.      如具體例211至219中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含蛋白A或蛋白G。 238.      如具體例211至219中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含蛋白L。 239.      如具體例211至238中任一項之方法，其中二級抗Ig抗體是抗IgE或抗IgG。 240.      如具體例211至239中任一項之方法，其中二級抗Ig抗體被可偵測地標記。 241.      如具體例240之方法，其中二級抗Ig抗體用放射性化合物、螢光化合物或酶標記。 242.      如具體例241之方法，其中放射性化合物包含 3H、 14C、 19F、 35S、 125I、 131I、 111In或 99Tc。 243.      如具體例241之方法，其中螢光化合物包含螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素或螢光蛋白。 244.      如具體例241之方法，其中酶包含鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或葡萄糖氧化酶。 245.      如具體例211至244中任一項之方法，其中抗體分泌細胞與多個條碼抗原接觸，其中多個條碼抗原的各個條碼抗原包含連接至獨特核酸分子的獨特抗原。 246.      如具體例245之方法，其中獨特核酸分子包含DNA。 247.      如具體例245之方法，其中獨特核酸分子包含RNA。 248.      如具體例245至247中任一項之方法，其中每個獨特的核酸分子包含約10個核苷酸至約500個核苷酸。 249.      如具體例245至248中任一項之方法，其中每個條碼抗原被可偵測地標記。 250.      如具體例249之方法，其中每個條碼抗原用放射性化合物、螢光化合物或酶標記。 251.      如具體例250之方法，其中放射性化合物包含 3H、 14C、 19F、 35S、 125I、 131I、 111In或 99Tc。 252.      如具體例250之方法，其中螢光化合物包含螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素或螢光蛋白。 253.      如具體例250之方法，其中酶包含鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或葡萄糖氧化酶。 254.      如具體例211至253中任一項之方法，其中條碼抗原包含過敏原。 255.      如具體例211至254中任一項之方法，其中抗體分泌細胞是漿細胞或漿母細胞。 256.      如具體例211至255中任一項之方法，該方法進一步包含在使該群抗體分泌細胞的表面與結合對的第二組分接觸之前，或在該群抗體分泌細胞的表面與抗體捕獲複合物接觸之前從人類獲得的細胞群富集免疫細胞。 257.      如具體例256之方法，其中從人類獲得的該群細胞富集漿細胞或漿母細胞。 258.      如具體例257之方法，其中該經富集免疫細胞群係使用泛B細胞富集來富集漿細胞或漿母細胞。 259.      如具體例211至258中任一項之方法，其中該群抗體分泌細胞獲自人類的淋巴結、肺臟、骨髓或血液。 260.      如具體例211至259中任一項之方法，該方法進一步包含偵測二級抗Ig抗體及/或一或多種條碼抗原。 261.      如具體例211至260中任一項之方法，該方法進一步分選該群抗體分泌細胞以獲得被二抗Ig抗體及/或一或多個條碼抗原所結合的抗體分泌細胞庫。 262.      如具體例211至261中任一項之方法，該方法進一步包含在使該群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸之前，使該群抗體分泌細胞與Fc block接觸。 263.      如具體例211至262中任一項之方法，其中條碼核酸分子的部分與第一模板轉換寡核苷酸(TSO)互補。 264.      如具體例211至263中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子的部分包含第一模板轉換寡核苷酸(TSO)。 265.      如具體例211至264中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第一序列。 266.      如具體例211至265中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子進一步包含第一獨特分子識別符(UMI)。 267.      如具體例211至266中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子進一步包含第一表面條碼。 268.      如具體例211至267中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子進一步包含第一定序引子。 269. 270.      如具體例211至269中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子藉由附接至固體表面的第一核酸分子的3'端附接。 271.      如具體例211至270中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子包含附接至固體表面的第一DNA分子。 272.      如具體例271之方法，其中附接至固體表面的第一DNA分子包含附接至固體表面的第一單股DNA分子。 273.      如具體例272之方法，其中附接至固體表面的第一單股DNA分子的部分包含第一TSO，且該方法進一步包含從與第一TSO互補之條碼核酸分子的部分的3'端開始逆轉錄附接至固體表面的第一單股DNA分子。 274.      如具體例211至273中任一項之方法，其中條碼核酸分子是單股DNA條碼核酸分子，其中附接至固體表面的第一核酸分子的部分包含第一TSO，而該方法進一步包含從第一TSO的3'端開始逆轉錄單股DNA條碼核酸分子。 275.      如具體例211至274中任一項之方法，其中條碼核酸分子的部分的3'端包含三個連續的胞苷殘基。 276.      如具體例275之方法，進一步包含逆轉錄編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的mRNA分子，藉此生成編碼目標抗體之抗原結合片段之基因區的單股DNA分子，且其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的核苷酸序列與編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子的互補序列不同，因為編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的3'端包含三個額外的連續胞苷殘基。 277.      如具體例276之方法，其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子的3'端包含多個連續的腺嘌呤殘基。 278.      如具體例276或具體例277之方法，其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的5'端包含多個連續的胸腺嘧啶殘基。 279.      如具體例211至278中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列。 280.      如具體例211至279中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子進一步包含第二UMI。 281.      如具體例211至280中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子進一步包含第二表面條碼。 282.      如具體例211至281中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子進一步包含第二定序引子。 283.      如具體例211至282中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子從5'到3'包含三個核糖鳥苷殘基的第二序列、第二TSO、第二UMI、第二表面條碼，以及第二定序引子。 284.      如具體例211至283中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子藉由附接至固體表面的第二核酸分子的3'端附接。 285.      如具體例211至284中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子包含附接至固體表面的第二DNA分子。 286.      如具體例285之方法，其中附接至固體表面的第二DNA分子包含附接至固體表面的第二單股DNA分子。 287.      如具體例286之方法，其中附接至固體表面的第二單股DNA分子的部分的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列，且其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的部分的3'端包含三個連續的胞苷殘基，其中該方法進一步包含從三個連續胞苷殘基的3'端開始逆轉錄附接於固體表面的第二單股DNA分子。 288.      如具體例211至287中任一項之方法，其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子包含編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的第二單股DNA分子。 289.      如具體例287之方法，其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的部分的3'端包含三個連續胞苷殘基，且其中附接至固體表面的第二單股DNA分子的部分的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列，其中該方法進一步包含從編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的部分的3'端開始逆轉錄附接至固體表面的第二單股DNA分子。 290.      如具體例211至289中任一項之方法，其中單抗體分泌細胞各自佈置在具有固體表面的分區內。 291.      如具體例211至290中任一項之方法，其中固體表面包含珠粒。 292.      如具體例290或具體例291之方法，進一步包含溶解分區內的單抗體分泌細胞。 293.      如具體例211至292中任一項之方法，其中條碼核酸分子進一步包含第三定序引子。 294.      如具體例211至293中任一項之方法，其中該第一擴增子庫的各個擴增子包含基因，其中各個擴增子不包含含有編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子。 295.      如具體例294之方法，該方法進一步包含對第一擴增子庫進行樣品分離、比對、過濾和UMI計數。 296.      如具體例211至295中任一項之方法，其中第一擴增子庫的定序包含次世代定序。 297.      如具體例211至296中任一項之方法，該方法進一步包含將第三擴增子庫的各個擴增子映射至標準參考基因組並進行比對。 298.      如具體例297之方法，其中標準參考基因組包含人類標準參考基因組。 299.      如具體例298之方法，其中人類標準參考基因組是GRCh38。 300.      如具體例297之方法，其中標準參考基因組包含鼠類標準參考基因組。 301.      如具體例300之方法，其中鼠類標準參考基因組是mm10。 302.      如具體例297至301中任一項之方法，其中映射與比對包含將第一擴增子庫的各個擴增子利用剪接感知比對器(STAR)映射到標準參考基因組，其中第一擴增子庫的各個擴增子包含一個獨特的分子識別符，其中映射到標準參考基因組的註釋基因的第一擴增子庫的所有擴增子經過分箱，且其中針對每個獨特分子識別符(UMI)計數經分箱的擴增子，從而生成單細胞計數矩陣，該矩陣包含每個註釋基因的映射計數和每個UMI的計數。 303.      如具體例302之方法，該方法進一步包含藉由計算註釋基因總數被除以計數的UMI總數的log 10的比率，針對高品質單抗體分泌細胞和廣泛分析的基因來過濾單細胞計數矩陣，其中過濾掉比率低於約0.1的單抗體分泌細胞，其中過濾掉計數的UMI總數的四分位數間距超過約四倍的單抗體分泌細胞，以及過濾掉超過約80%的讀段映射到粒線體基因的單抗體分泌細胞。 304.      如具體例303之方法，該方法進一步包含標準化單細胞計數矩陣，使得計數的UMI總數為約10,000。 305.      如具體例303或具體例304之方法，該方法進一步包含計算單細胞計數矩陣的PCA嵌入，執行主要細胞類型的迭代分群以鑑別批次之間的相似性，從而生成均勻流形近似和投影(UMAP)。 306.      如具體例303至305中任一項之方法，該方法進一步包含使用集群特異性的中心來確定每個細胞的線性調整函數，將每個細胞的線性調整函數應用於校正批次的差異，從而生成經批次校正嵌入，並使用經批次校正嵌入來生成均勻流形二維近似和投影(UMAP)。 307.      如具體例305或具體例306之方法，該方法進一步包含確定加權k-近鄰圖並且將萊頓演算法應用於具有0.1、0.2、0.5和1.0的分辨率值的加權k-近鄰圖，以便按照非監督方式確定細胞類型集群。 308.      如具體例305之方法，該方法進一步包含對一個集群中的所有單抗體分泌細胞進行成對Wilcox檢定並比較第一個成對Wilcox檢定的結果，而對每隔一個集群中的所有單抗體分泌細胞進行另一個成對Wilcox檢定，以量化每個集群中每個基因的p-值和變化倍數，其中當基因具有低p值和高變化倍數時，單抗體分泌細胞由漿細胞、漿母細胞或B細胞的共同標記所標記，且單抗體分泌細胞按照差異表現結果中排名靠前的基因命名的分群亞型予以標記。 309.      如具體例211至308中任一項之方法，該方法進一步包含進行樣品分離，讀段對從頭組裝成片段重疊群，並且針對生殖系區段V(D)J參考序列的片段重疊群相對第二擴增子家族進行比對和註釋。 310.      如具體例309之方法，其中片段重疊群與生殖系區段V(D)J參考序列的比對包含與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫進行比對。 311.       如具體例310之方法，其中人類生殖系參考數據庫包含人類生殖系免疫球蛋白序列的IMGT數據庫。 312.      如具體例310之方法，其中鼠類生殖系參考數據庫包含IMGT生殖系參考數據庫。 313.      如具體例310至312中任一項之方法，該方法進一步包含將VDJ序列與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫中的序列進行比較，從而藉由檢查框內比對、CDR3的長度，及在可變區序列中不存在終止密碼子來標記VDJ序列以進行品質比對，與基於標記過濾VDJ序列。 314.      如具體例313之方法，該方法進一步包含將VDJ序列映射到免疫球蛋白鏈的參考數據庫。 315.      如具體例310之方法，其中免疫球蛋白同型、可變區映射、接合區映射、多樣性區映射、每個細胞的重鏈和輕鏈序列的全長可變區的準確性是藉由比對進行確認。 316.      如具體例211至315中任一項之方法，該方法進一步包含對第三個擴增子庫進行樣品分離、比對、過濾和UMI計數。 317.      如具體例211至316中任一項之方法，該方法進一步包含將第三擴增子庫映射到訂製的短讀段參考品，其包含與每個抗原相關的條碼核酸分子參考品，其中針對條碼抗原單細胞矩陣中的每個細胞對每個獨特映射的條碼核酸分子的計數求和。 318.      如具體例317之方法，該方法進一步包含藉由取得每次樣品捕獲中多個條碼核酸分子的各個條碼核酸分子的中心對數比，對所有單抗體分泌細胞中的條碼核酸分子進行量化和標準化。 319.      如具體例318之方法，該方法進一步包含藉由背景降噪和縮放(DSB)針對多個條碼核酸分子中的各個條碼核酸分子去除背景抗原信號。 320.      如具體例319之方法，該方法進一步包含確定抗原信號分佈，其中當在抗原信號分佈中有充分分離的雙峰分佈時，使用z轉換值來計算抗原特異性，並且其中當在抗原信號分佈中沒有充分分離的雙峰分佈時使用分位數值。 321.      如具體例320之方法，該方法進一步包含對目標抗原和陰性對照抗原分佈進行統計建模。 322.      如具體例211至321中任一項之方法，其中第一擴增子庫、第二擴增子庫和第三擴增子庫的分析是同時進行的，以獲得抗原陽性目標抗體的至少一個候選序列。 323.      如具體例322之方法，該方法進一步包含使用第一擴增子庫分析結果和第二擴增子庫分析結果對具有有效抗體恆定區的漿細胞或漿母細胞進行子集化。 324.      如具體例323之方法，其中抗體恆定區包含IgE恆定區。 325.      如具體例323或具體例324之方法，其中子集漿細胞或漿母細胞包含可偵測程度的IgE重鏈和CD79a，但缺乏可偵測程度的Ms4a1和CD19，其中子集漿細胞或漿母細胞是IgE +漿細胞或漿母細胞。 326.      如具體例325之方法，該方法進一步包含針對IgA分泌漿細胞或漿母細胞同型、IgG分泌漿細胞或漿母細胞同型及/或IgM分泌漿細胞或漿母細胞同型評估IgE +漿細胞或漿母細胞的差異表現。 327.      如具體例326之方法，其中差異表現的評估進一步特徵鑑定IgE +漿細胞或漿母細胞的獨特轉錄特徵。 328.      如具體例327之方法，該方法進一步包含評估IgE +漿細胞或漿母細胞的抗原特異性。 329.      如具體例328之方法，評估包含比較IgE +漿細胞或漿母細胞對多種抗原和對照抗原的抗原特異性，且其中多種抗原包含目標抗原。 330.      如具體例329之方法，其中比較包含藉由從與對照抗原相關的信號的分位數值(qC)和懲罰因數(x)扣除與抗原相關的信號的分位數值(qT)，來計算多個抗原中的每個抗原和對照抗原的經驗分數，以確定抗原特異性分數，其中抗原特異性分數 = qT - qC x。 331.      如具體例330之方法，其中懲罰因數對所有抗原都是相同的。 332.      如具體例330之方法，其中懲罰因數對不同的抗體同型是不同的。 333.      如具體例330之方法，其中懲罰因數在使用其他抗原時是不同的。 334.      如具體例331之方法，該方法進一步包含確定多種抗原和對照抗原中每一者的抗原特異性分數。 335.      如具體例334之方法，該方法進一步包含計算對照抗原特異性分數，其中當抗原特異性分數高且對照抗原特異性分數低時，挑選細胞。 336.      如具體例335之方法，其中VDJ區鑑別抗原特異性抗體。 337.      如具體例335之方法，該方法進一步包含使用細胞的成對V H：V L抗體序列從抗原信號的排序表中挑出候選抗體。 338.      如具體例322至337中任一項之方法，該方法進一步包含確定同型、條件及/或抗原特異性之間的差異表現，其中確定同型之間的差異表現包含對一種同型中的所有單抗體分泌細胞進行成對Wilcox檢定，並且對另一種同型中的所有單抗體分泌細胞進行成對Wilcox檢定，從而量化每個集群的各個基因的p值和變化倍數；以及其中確定抗原特異性之間的差異表現包含對一種同型中的所有單抗體分泌細胞進行成對Wilcox檢定並對另一種同型中的所有單抗體分泌細胞進行成對Wilcox檢定，從而量化每個集群的各個基因的p值和變化倍數。 339.      如具體例320至338中任一項之方法，該方法進一步包含對抗原陽性目標細胞中的VDJ序列相似性進行分群，其中分群VDJ序列相似性包含基於序列的比對，按照胺基酸序列對相似可變區進行分組。 340.      如具體例320至339中任一項之方法，其中抗原陽性目標細胞是IgE +。 341.      如具體例320至340中任一項之方法，該方法進一步包含修整冗餘序列。
根據前面的說明，除了本文描述的那些之外，所述標的之各種修改對習於技藝者來說將是顯而易見的。此類修改也意欲在落入隨附申請專利範圍的範疇內。
無
專利或申請文件至少包含一張彩色圖式。本件專利或專利申請公開的副本將連同彩色圖式在請求和支付必要費用後由專責機關提供。
圖1顯示Ig分泌捕獲方法的代表性工作流程。步驟1顯示用N-羥基琥珀醯亞胺基生物素(NHS-生物素)對細胞進行生物素化。步驟2顯示包含與抗Fc的鏈球菌親生物素蛋白偶聯的Ig分泌捕獲試劑。αIgK用於表現κ輕鏈或FcεRIα胞外域的抗體，以供特異性IgE捕獲。步驟3顯示結合至被抗IgG或抗IgE抗體結合之寡聚條碼和螢光標記抗原的分泌型αIgE或αIgG抗體。
圖2顯示IgE分泌捕獲方法的代表性工作流程。步驟1顯示使用NHS-生物素對PC進行生物素化。步驟2顯示包含接合至鏈球菌親生物素蛋白(「分泌型IgE捕獲試劑」)和結合至PC上之生物素的鏈球菌親生物素蛋白的高親和力IgE受體胞外域(ectoFcεRIα)的試劑。步驟2還顯示捕獲PC已分泌的IgE的分泌型IgE捕獲試劑的ectoFcεRIα。步驟3顯示結合至條碼抗原並被抗IgE抗體結合的捕獲IgE。
圖3顯示IgG分泌捕獲方法的代表性工作流程。步驟1顯示用NHS-生物素對細胞進行生物素化。步驟2顯示IgG分泌捕獲試劑，包含在生物素化細胞上組裝的接合鏈球菌親生物素蛋白的抗小鼠IgK。步驟3顯示結合至條碼抗原並被抗IgG抗體結合的分泌型IgG抗體。
圖4A-4F顯示，在圖4A中，偵測被捕獲在ARH77細胞表面的分泌型IgG。圖4B顯示偵測被捕獲在U266細胞表面的分泌型IgE。圖4C顯示，雖然偵測到被捕獲在U266細胞表面的分泌型IgE，但未偵測到作為B細胞受體的表面IgE。圖4D顯示鏈球菌親生物素蛋白-αIgk (StAv-αIgk)在ARH77細胞上的滴度。圖4E顯示鏈球菌親生物素蛋白-FceRIα (StAv-FcεRIα)在U266細胞上的滴度。圖4F顯示偵測被捕獲在U266細胞表面的分泌型IgE，而不是Ramos細胞分泌的IgM的高特異性。
圖5A-5G顯示，在圖5A中，程序的代表性工作流程，用於確定對條碼抗原具有特異性的抗體的V(D)J區序列和條碼序列，然後藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)確認抗體的抗原特異性。圖5B顯示被捕獲在經hIL-4Rα免疫小鼠的PC表面的抗原特異性IgG的流式細胞術。圖5C顯示基於骨髓(BM)PC和脾臟引流淋巴結(dLN)B細胞與PC中hIL-6Rα(非特異性)和hIL-4Rα(特異性)條碼信號，使抗原特異性可視化。圖5D顯示從受攻毒小鼠的脾臟/dLN和骨髓中分離出的B細胞與PC的UMAP。圖5E顯示指明BM-PC、SP-PC和SP-B細胞中總IgG、抗hIL-4Rα的ELISA抗體含量，以及抗hIL-4Rα與總IgG的比率的圖。圖5F和圖5G顯示兩個獨立實驗的圖，說明了從BM-PC、SP-PC和SP-B細胞選殖而來的抗體的結合親和力。
圖6A-6F顯示，在圖6A中，說明從受攻毒小鼠的BM-PC、脾臟/dLN-PC和脾臟/dLN-B細胞分離而來的hIL-4Rα特異性及hIL-4Rα非特異性細胞之間的生殖系V區相似性百分比的圖。圖6B顯示，說明基於從BM-PC、脾臟/dLN-PC和脾臟/dLN-B細胞分離的純系的重鏈和輕鏈的CDR3核苷酸序列的純系重疊的文式圖(Venn diagram)。圖6C顯示hIL-4Rα特異性和非抗原特異性BM-PC之間差異基因表現的火山圖比較。圖6D顯示熱圖，說明在hIL-4Rα特異性和非抗原特異性BM-PC中表現的差異表現基因的轉錄譜。圖6E顯示UMAP，說明BM-PC的hIL-4Rα特異性抗體在總BM-PC上的位置和結合親和力(Kd)。圖6F顯示UMAP，說明BM-PC中Cd24a、Ppob、Fkbp11、Ssr2、Tmem176a、Tmem176b、Ly6d和CD74的按比例基因表現。
圖7A-7H顯示，在圖7A中，程序的代表性工作流程，用於確定對條碼抗原具有特異性的抗體的V(D)J區序列以及條碼的序列，然後藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)確認抗體的抗原特異性。圖7B從左到右顯示圈選PC為細胞、單細胞、活細胞、DUMP -細胞和CD138 +Blimp-1 +細胞。圖7C顯示分泌IgE的IgE Venus+PC，這些PC衍生自已用室塵蟎(HDM)萃取物攻毒小鼠的BM和LDLN。圖7D顯示基於VDJ-BCR表現，IgE +PC更甚於非IgE PC的UMAP。圖7E顯示IgE、IgG、IgA和IgM PC的部分以及在來自dLN和BM的不同同型中表現的前4個基因的平均表現。圖7F顯示基於Der p1、Der p2、Der f1與陰性對照Ole e1的條碼表現，抗原特異性的可視化。圖7G顯示IgE抗體與Der p 1、Der p 2、Der f 1和陰性對照抗原Ole e 1的代表性結合曲線。圖7H顯示藉由ELISA驗證的抗原特異性，用於IgE分泌細胞生成的IgE抗體子集。
圖8A-8G顯示，在圖8A中，來自過敏骨髓捐贈者的BM、來自非過敏骨髓對照捐贈者的BM和非鏈球菌親生物素蛋白FcεR1α捕獲對照的流動圖。圖8B顯示對血清進行測試的結果，以偵測對貓皮屑e1、狗皮屑e5、常見垂枝樺t3、歐洲室塵蟎d1、貓尾草g6和鏈隔孢菌m6具有特異性的IgE含量。圖8C顯示表現點圖，說明免疫球蛋白基因的按比例表現，以及總PC中的PC與B細胞標記。圖8D顯示說明IGHE轉錄本在IgE、IgG、IgA和IgM PC中按比例表現的圖。圖8E顯示分群BCR純系型的表，指明5個IgE純系型、其純系大小以及每個純系型中IgE與非IgE細胞的數量。圖8F顯示比較圖，提供來自IgE PC的IgE序列與純系型21中的IgG序列之間的比較結果。圖8G顯示藉由ELISA測試，從過敏BM分離之針對被本發明IgE捕獲複合物分離的人類IgE抗體的抗原特異性。顯示人類IgE抗體與Fel d1、Can e1、Der p1和DNP-IgE的代表性結合曲線。
圖9顯示單細胞捕獲以及mRNA、V(D)J區和抗原條碼的庫製備。在圖9的下方行：(i)淺藍色矩形代表模板轉換寡核苷酸；(ii)米色矩形代表三個連續核糖鳥苷殘基的序列；(iii)橙色矩形代表獨特分子識別符(UMI)；(iv)紫色矩形代表表面條碼；及(iv)緊靠紫色矩形右側的黑色方塊代表定序引子。
圖10顯示單細胞mRNA、V(D)J區和抗原條碼庫分析的代表性流程圖。
圖11顯示抗原特異性的可視化。具有較高抗原特異性分數的細胞，即目標抗原信號強且對照抗原信號低，被優先挑選候選抗體。目標抗原是HDM過敏原Der p 1、Der p 2和Der f 1，而陰性對照是橄欖抗原Ole e 1。透過從目標抗原的分位數等級(qT)扣除提高到x次方之對照抗原的分位數等級(qC)確定每個目標抗原的抗原特異性分數，即qT-qC x。挑出具有最高抗原特異性分數的細胞作為抗原特異性候選物。
圖12顯示基於抗原特異性分數的IgE候選物表。對於每個候選物，該表記錄了從中獲得細胞的樣品、每個目標抗原的原始抗原條碼計數、標準化抗原條碼計數和抗原特異性分數。採集了1,069個IgE +細胞的數據。
圖13A-13B顯示用分泌型IgE捕獲試劑捕獲之衍生自PC分泌的IgE的IgE抗體的結合，其中PC衍生自用HDM萃取物攻毒的小鼠。圖13A顯示IgE抗體與Der p 1(左圖)、Der p 2(中圖)和Der f 1(右圖)的代表性結合曲線。圖13B顯示IgE抗體與陰性對照抗原Ole e 1的代表性結合曲線。
圖14A-14C顯示，抗原特異性分泌型IgG可被捕獲在衍生自經攻毒VelocImmune®小鼠的PC表面。圖14A顯示用於偵測抗原特異性IgG +脾臟B細胞的連續流式細胞術圈選策略。圖14B顯示用於鑑別BM衍生的PC的連續流式細胞術圈選策略，在其上捕獲了抗原特異性分泌型IgG。圖14C從左到右顯示了四個用於準確定義衍生自BM的抗原特異性PC群的對照，以及脾臟陽性對照。
圖15A-15D顯示y軸上目標抗原條碼計數的標準化值與衍生自免疫小鼠並按同型上色的所有PC中對照抗原條碼計數的標準化條碼計數。圖15A和圖15B顯示了來自骨髓的細胞的數據，而圖15C和圖15D顯示脾臟細胞的數據。
圖16A-16C顯示，在圖16A中用αIgG染色的ARH77細胞的流式細胞術圖。圖16B顯示用αIgE染色的U266細胞的流式細胞術圖。圖16C顯示在StAv-FceRIα捕獲複合物的具體例存在下，Ramos、U266或這些細胞的100：1混合物的流式細胞術分析。
圖17A-17D顯示，在圖17A中，在組織收集用於透過抗體分泌TRAP和Sequencing工作進行下游抗體特異性映射之前，小鼠經歷的免疫方案。圖17B顯示分泌IgG的PC圈選為活細胞、淋巴細胞、單細胞、DUMP-細胞(TCRβ、CD200R3、Ly6G、CD49b、CD11b和IgM)、CD98+TACI+，和IgG+Ag+細胞。圖17C顯示來自脾臟和dLN的Ag+IgG+細胞圈選為活細胞、淋巴細胞、單細胞、CD19+CD3-、IgD-IgM-，和IgG+Ag+細胞。圖17D顯示用於鑑別Ag+IgG+ BMPC的圈選對照。
圖18A-18D顯示，在圖18A中，脾臟漿細胞、BM漿細胞和脾臟B細胞的組合轉錄分析和無偏分群分析。圖18B和圖18C顯示依據scRNA-seq產生的三群不同細胞：骨髓漿細胞(BMPC)、脾臟/dLN漿母細胞/漿細胞樣(Sp/dLN PB/PC)和脾臟/dLN B細胞(Sp/dLN B細胞)。圖18D顯示本發明的上清液和經純化抗體的Biacore分析，顯示BMPC、Sp/dLN PB/PC和Sp/dLN B細胞的親和力，如藉由結合Kd的負log10測量的。
圖19A-19B顯示，在圖19A中，IgE抗體對Der p1、Der p2、Der f1和陰性對照Ole e1的代表性結合曲線。圖19B顯示Fel d1特異性ELISA，用於測試人類IgE mAb 12_2的結合及其與Fel d1的交叉反應性。
圖20A-20B顯示，在圖20A中，使用CD38染色分選來自人類骨髓的漿細胞的圈選策略。圖20B顯示過敏捐贈者的例示性血清ImmunoCAP®測試的結果。
圖21A-21D顯示，本文揭示的抗體分泌TRAP和定序方法允許偵測來自骨髓捐贈者的疫苗特異性IgG分泌漿細胞。圖21A，確定PC圈選為細胞、單細胞、活細胞、DUMP-細胞，和CD20-CD38++細胞的程序的代表性工作流程。圖21B顯示在IgG分泌細胞內發現的IgG分泌細胞和抗原陽性細胞。圖21C顯示沒有偵測到無NHS-生物素組分或StAv-Igκ或抗IgG抗體的IgG分泌PC。圖21D顯示在沒有抗原染色的情況下未偵測到抗原特異性IgG分泌細胞。
圖22描繪了結合抗原追踪的分泌捕捉(STAC)的工作流程。步驟1：用胺反應性NHS-生物素對抗體分泌細胞進行生物素化。步驟2：使用偶聯有抗hIgG的鏈球菌親生物素蛋白將分泌型抗體捕獲至抗體分泌細胞表面。這裡使用了抗hIgG，因為所有抗體都具有人類恆定區。步驟3：將細胞與接合至AlexaFluor647的單體hIL-4Rα在RT下培育30分鐘。洗滌細胞，然後在RT下與用StAv-PE預培育的hIL-4Rα抗原培育2x45分鐘。
圖23A-23D顯示經歷STAC方案的細胞的流式細胞術分析。圖23A顯示實驗中使用的抗體的表。抗體1-3以不同親和力(KD)對hIL-4Rα具有特異性，而抗體4對不同目標具有特異性並作為實驗的陰性對照。圖23B顯示沒有表面BCR的模型B細胞株(A25細胞株)與NHS-生物素和抗hIgG捕捉試劑一起培育(圖22的步驟1和2)。然後將這些細胞與圖23A表中的抗體一起培育，接著進行抗原追踪培育(圖22的步驟3)。圖23C顯示經歷STAC方案的細胞的流式細胞術分析，證明抗體分泌細胞可以基於親和力予以分離。根據圖23A中的顏色，抗體1-4在流式細胞術圖上進行了顏色編碼。親和力較高的抗體(ab_1、ab_2)偏向單體hIL-4Rα-AlexaFluor647 (y軸)，親和力較低的抗體(ab_3)偏向四聚體hIL-4Rα-生物素-StAv-PE (x軸)，而陰性對照抗體(ab_4)對兩種抗原均呈陰性。圖23D顯示經歷STAC方案的細胞的流式細胞術分析。所有細胞都是hIgK+，表明所有抗體，包括陰性對照 (ab_4)，都藉由分泌捕捉而結合到表面。抗hIgK FMO以灰色顯示，所有其他顏色與圖23A中的顏色相配合。
無
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Claims (341)

  1. 一種抗體捕獲複合物，其包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分； 其中結合對的第一組分能夠與結合對的第二組分進行結合； 其中抗體捕獲分子能夠結合至目標抗體，其中該目標抗體由抗體分泌細胞所分泌； 其中當結合對的第二組分是生物素而結合對的第一組分是鏈球菌親生物素蛋白(streptavidin)時，抗體捕獲分子不結合至目標抗體的κ輕鏈。
  2. 如請求項1之抗體捕獲複合物，其中： 結合對的第一組分包含抗生物素蛋白(avidin)、鏈球菌親生物素蛋白或抗生物素(anti-biotin)，而結合對的第二組分包含生物素； 結合對的第一組分包含jun和fos中的一者，而結合對的第二組分包含jun和fos中的另一者； 結合對的第一組分包含mad和max中的一者，而結合對的第二組分包含mad和max中的另一者； 結合對的第一組分包含myc和max中的一者，而結合對的第二組分包含myc和max中的另一者； 結合對的第一組分包含疊氮化物和炔烴中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和炔烴中的另一者；或 結合對的第一組分包含疊氮化物和膦中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和膦中的另一者。
  3. 如請求項1之抗體捕獲複合物，其中結合對的第一組分包含抗生物素蛋白或鏈球菌親生物素蛋白，而結合對的第二組分包含生物素。
  4. 如請求項1之抗體捕獲複合物，其中結合對的第二組分包含抗體分泌細胞的表面標記，而結合對的第一組分包含結合至該表面標記的抗體。
  5. 如請求項4之抗體捕獲複合物，其中細胞表面標記包含CD27、CD38、CD45、CD138、CD98、CD78、CD319、CXCR4、BCMA、GPRC5D、FCRL5、CD19、Ly6D、CD52或跨膜活化因子鈣調節因子，以及親環蛋白配體交互作用因子(cyclophilin ligand interactor，TACI)。
  6. 如請求項1之抗體捕獲複合物，其中結合對的第二組分包含介白素6受體(IL-6R)，而結合對的第一組分包含抗IL-6R抗體或介白素6 (IL-6)。
  7. 如請求項1之抗體捕獲複合物，其中結合對的第二組分包含CD27，而結合對的第一組分包含抗CD27抗體或CD70。
  8. 如請求項1之抗體捕獲複合物，其中： 結合對的第二組分包含異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)，而結合對的第一組分包含抗FITC抗體； 結合對的第二組分包含藻紅素(phycoerythrin，PE)，而結合對的第一組分包含抗PE抗體； 結合對的第二組分包含APC，而結合對的第一組分包含抗APC抗體； 結合對的第二組分包含BV421，而結合對的第一組分包含抗BV421抗體； 結合對的第二組分包含BV510，而結合對的第一組分包含抗BV510抗體； 結合對的第二組分包含BV605，而結合對的第一組分包含抗BV605抗體； 結合對的第二組分包含BV650，而結合對的第一組分包含抗BV650抗體； 結合對的第二組分包含BV711，而結合對的第一組分包含抗BV711抗體；或 結合對的第二組分包含BV786，而結合對的第一組分包含抗BV786抗體。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體捕獲複合物，其中抗體捕獲分子包含捕獲抗體。
  10. 如請求項9之抗體捕獲複合物，其中捕獲抗體包含抗Fc抗體、抗輕鏈κ抗體或抗輕鏈λ抗體。
  11. 如請求項10之抗體捕獲複合物，其中抗Fc抗體包含抗Fcγ抗體、抗Fcα抗體或抗Fcε抗體。
  12. 如請求項11之抗體捕獲複合物，其中抗Fcγ抗體包含抗FcγRI抗體、抗FcγRIIA抗體、抗FcγRIIB抗體、抗FcγRIIB1抗體、抗FcγRIIB2抗體、抗FcγRIIIA抗體或抗FcγRIIIB抗體。
  13. 如請求項11之抗體捕獲複合物，其中抗Fcα抗體包含抗FcαRI抗體。
  14. 如請求項11之抗體捕獲複合物，其中抗Fcε抗體包含抗FcεRI抗體或抗FcεRII抗體。
  15. 如請求項9之抗體捕獲複合物，其中捕獲抗體包含抗IgM抗體。
  16. 如請求項9之抗體捕獲複合物，其中捕獲抗體包含抗IgG抗體。
  17. 如請求項16之抗體捕獲複合物，其中抗IgG抗體包含抗IgGl抗體、抗IgG2抗體、抗IgG2a抗體、抗IgG2b抗體、抗IgG3抗體或抗IgG4抗體。
  18. 如請求項9之抗體捕獲複合物，其中捕獲抗體包含抗IgA抗體。
  19. 如請求項18之抗體捕獲複合物，其中抗IgA抗體包含抗IgA1抗體、抗IgA2抗體、抗分泌型IgA抗體或聚合抗IgA抗體。
  20. 如請求項9之抗體捕獲複合物，其中捕獲抗體包含抗IgE抗體。
  21. 如請求項1至8中任一項之抗體捕獲複合物，其中抗體捕獲分子包含Fc受體或Fc受體的胞外域。
  22. 如請求項21之抗體捕獲複合物，其中Fc受體包含Fcγ受體、Fcα受體或Fcε受體。
  23. 如請求項22之抗體捕獲複合物，其中Fcγ受體包含FcγRI受體、FcγRIIA受體、FcγRIIB受體、FcγRIIB1受體、FcγRIIB2受體、FcγRIIIA受體、FcγRIIIB受體或FcRn受體。
  24. 如請求項22之抗體捕獲複合物，其中Fcα受體包含FcαRI受體或Fcα/μR受體。
  25. 如請求項22之抗體捕獲複合物，其中Fcε受體包含FcεRI受體或FcεRII受體。
  26. 如請求項1至8中任一項之抗體捕獲複合物，其中抗體捕獲分子包含蛋白A或蛋白G。
  27. 如請求項1至8中任一項之抗體捕獲複合物，其中抗體捕獲分子包含蛋白L。
  28. 如請求項1之抗體捕獲複合物，其中抗體捕獲複合物包含連接至高親和力IgE受體(FcεRIa)的胞外域的抗生物素蛋白或鏈球菌親生物素蛋白。
  29. 一種捕獲抗體分泌細胞所分泌之目標抗體的方法，該方法包含： 使一群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸以允許結合對的第二組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞； 使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至抗體分泌細胞細胞表面上之結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲抗體分泌細胞所分泌的目標抗體；以及 使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體係與抗原結合。
  30. 請求項29之方法，其中： 結合對的第一組分包含抗生物素蛋白、鏈球菌親生物素蛋白或抗生物素，而結合對的第二組分包含生物素； 結合對的第一組分包含jun和fos中的一者，而結合對的第二組分包含jun和fos中的另一者； 結合對的第一組分包含mad和max中的一者，而結合對的第二組分包含mad和max中的另一者； 結合對的第一組分包含myc和max中的一者，而結合對的第二組分包含myc和max中的另一者； 結合對的第一組分包含疊氮化物和炔烴中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和炔烴中的另一者；或 結合對的第一組分包含疊氮化物和膦中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和膦中的另一者。
  31. 如請求項29之方法，其中結合對的第一組分包含抗生物素蛋白或鏈球菌親生物素蛋白，而結合對的第二組分包含生物素。
  32. 如請求項29之方法，其中： 結合對的第二組分包含異硫氰酸螢光素(FITC)，而結合對的第一組分包含抗FITC抗體； 結合對的第二組分包含藻紅素(PE)，而結合對的第一組分包含抗PE抗體； 結合對的第二組分包含APC，而結合對的第一組分包含抗APC抗體； 結合對的第二組分包含BV421，而結合對的第一組分包含抗BV421抗體； 結合對的第二組分包含BV510，而結合對的第一組分包含抗BV510抗體； 結合對的第二組分包含BV605，而結合對的第一組分包含抗BV605抗體； 結合對的第二組分包含BV650，而結合對的第一組分包含抗BV650抗體； 結合對的第二組分包含BV711，而結合對的第一組分包含抗BV711抗體；或 結合對的第二組分包含BV786，而結合對的第一組分包含抗BV786抗體。
  33. 一種捕獲由抗體分泌細胞所分泌之目標抗體的方法，該方法包含： 使一群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞細胞表面上的結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲抗體分泌細胞所分泌的目標抗體；以及 使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體係與抗原結合。
  34. 如請求項33之方法，其中結合對的第二組分包含該群抗體分泌細胞的表面標記，而結合對的第一組分包含結合至該表面標記的抗體。
  35. 如請求項34之方法，其中細胞表面標記包含CD27、CD38、CD45、CD138、CD98、CD78、CD319、CXCR4、BCMA、GPRC5D、FCRL5、CD19、Ly6D、CD52或跨膜活化因子鈣調節因子，以及親環蛋白配體交互作用因子(TACI)。
  36. 如請求項33之方法，其中結合對的第二組分包含介白素6受體(IL-6R)，而結合對的第一組分包含抗IL-6R抗體或介白素6 (IL-6)。
  37. 如請求項33之方法，其中結合對的第二組分包含CD27，而結合對的第一組分包含抗CD27抗體或CD70。
  38. 如請求項29至37中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含捕獲抗體。
  39. 如請求項38之方法，其中捕獲抗體包含抗Fc抗體、抗輕鏈κ抗體或抗輕鏈λ抗體。
  40. 如請求項39之方法，其中抗Fc抗體包含抗Fcγ抗體、抗Fcα抗體或抗Fcε抗體。
  41. 如請求項40之方法，其中抗Fcγ抗體包含抗FcγRI抗體、抗FcγRIIA抗體、抗FcγRIIB抗體、抗FcγRIIB1抗體、抗FcγRIIB2抗體、抗FcγRIIIA抗體或抗FcγRIIIB抗體。
  42. 如請求項40之方法，其中抗Fcα抗體包含抗FcαRI抗體。
  43. 如請求項40之方法，其中抗Fcε抗體包含抗FcεRI抗體或抗FcεRII抗體。
  44. 如請求項38之方法，其中捕獲抗體包含抗IgM抗體。
  45. 如請求項38之方法，其中捕獲抗體包含抗IgG抗體。
  46. 如請求項45之方法，其中抗IgG抗體包含抗IgGl抗體、抗IgG2抗體、抗IgG2a抗體、抗IgG2b抗體、抗IgG3抗體或抗IgG4抗體。
  47. 如請求項38之方法，其中捕獲抗體包含抗IgA抗體。
  48. 如請求項47之方法，其中抗IgA抗體包含抗IgA1抗體、抗IgA2抗體、抗分泌型IgA抗體或聚合抗IgA抗體。
  49. 如請求項38之方法，其中捕獲抗體包含抗IgE抗體。
  50. 如請求項29至37中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含Fc受體或Fc受體的胞外域。
  51. 如請求項50之方法，其中Fc受體包含Fcγ受體、Fcα受體或Fcε受體。
  52. 如請求項51之方法，其中Fcγ受體包含FcγRI受體、FcγRIIA受體、FcγRIIB受體、FcγRIIB1受體、FcγRIIB2受體、FcγRIIIA受體、FcγRIIIB受體或FcRn受體。
  53. 如請求項51之方法，其中Fcα受體包含FcαRI受體或Fcα/μR受體。
  54. 如請求項51之方法，其中Fcε受體包含FcεRI受體或FcεRII受體。
  55. 如請求項29至37中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含蛋白A或蛋白G。
  56. 如請求項29至37中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含蛋白L。
  57. 如請求項29至56中任一項之方法，其進一步包含使該群抗體分泌細胞與二級抗Ig抗體接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體係與二級抗Ig抗體結合。
  58. 如請求項57之方法，其中二級抗Ig抗體是抗IgE或抗IgG。
  59. 如請求項57或58之方法，其中二級抗Ig抗體被可偵測地標記。
  60. 如請求項59之方法，其中二級抗Ig抗體係以放射性化合物、螢光化合物或酶進行標記。
  61. 如請求項60之方法，其中放射性化合物包含 3H、 14C、 19F、 35S、 125I、 131I、 111In或 99Tc。
  62. 如請求項60之方法，其中螢光化合物包含螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素或螢光蛋白。
  63. 如請求項60之方法，其中該酶包含鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或葡萄糖氧化酶。
  64. 如請求項29至63中任一項之方法，其中在使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟中，抗原是條碼抗原。
  65. 如請求項29至64中任一項之方法，其中在使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟中，使該群抗體分泌細胞與多個條碼抗原接觸，其中多個條碼抗原的各個條碼抗原包含連接至獨特核酸分子的獨特抗原。
  66. 如請求項65之方法，其中獨特核酸分子包含DNA。
  67. 如請求項65之方法，其中獨特核酸分子包含RNA。
  68. 如請求項65至67中任一項之方法，其中每個獨特核酸分子包含約10個核苷酸至約500個核苷酸。
  69. 如請求項65至68中任一項之方法，其中每個條碼抗原被可偵測地標記。
  70. 如請求項69之方法，其中每個條碼抗原係以放射性化合物、螢光化合物或酶進行標記。
  71. 如請求項70之方法，其中放射性化合物包含 3H、 14C、 19F、 35S、 125I、 131I、 111In或 99Tc。
  72. 如請求項70之方法，其中螢光化合物包含螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素或螢光蛋白。
  73. 如請求項70之方法，其中酶包含鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或葡萄糖氧化酶。
  74. 如請求項64至73中任一項之方法，其中條碼抗原包含過敏原。
  75. 如請求項29至74中任一項之方法，其中抗體分泌細胞是漿細胞或漿母細胞。
  76. 如請求項29至75中任一項之方法，其中該群抗體分泌細胞是藉由從人類獲得的細胞群富集免疫細胞而獲得。
  77. 如請求項76之方法，其中從人類獲得的該群細胞富集漿細胞或漿母細胞。
  78. 如請求項77之方法，其中該經富集免疫細胞群係使用泛B細胞富集來富集漿細胞或漿母細胞。
  79. 如請求項29至78中任一項之方法，其中該群抗體分泌細胞獲自人類的淋巴結、肺臟、骨髓或血液。
  80. 如請求項29至79中任一項之方法，進一步包含偵測目標抗體所結合的抗原。
  81. 如請求項29至80中任一項之方法，進一步包含分選該群抗體分泌細胞以收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的抗體分泌細胞各自分泌被抗體捕獲分子捕獲並被抗原結合的抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞。
  82. 如請求項81之方法，其中將收集的抗體分泌細胞庫分離成單個細胞並分離出分泌目標抗體的抗體分泌細胞。
  83. 如請求項57至80中任一項之方法，進一步包含偵測二級抗Ig抗體。
  84. 如請求項83之方法，進一步包含分選該群抗體分泌細胞以收集抗體分泌細胞庫，其中該庫中的抗體分泌細胞各自分泌被抗體捕獲分子捕獲並被抗原和二級抗Ig抗體結合的抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌被抗原和二級抗Ig抗體結合的目標抗體的抗體分泌細胞。
  85. 如請求項84之方法，進一步包含將收集的抗體分泌細胞庫分離成單個細胞並分離出分泌目標抗體的抗體分泌細胞。
  86. 如請求項29至85中任一項之方法，進一步包含在使該群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸之前，使該群抗體分泌細胞與Fc block接觸。
  87. 一種捕獲由抗體分泌細胞所分泌之IgE抗體的方法，其中IgE抗體是針對過敏原，該方法包含： 使一群抗體分泌細胞與NHS-生物素接觸以允許生物素結合至細胞表面，其中該群抗體分泌細胞包含分泌IgE抗體的抗體分泌細胞； 使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至高親和力IgE受體(FcεRIa)胞外域的鏈球菌親生物素蛋白，藉此抗體捕獲分子結合至抗體分泌細胞所分泌的IgE抗體；以及 使該群抗體分泌細胞與抗原接觸，其中抗原是過敏原的抗原部分或多個抗原部分的混合物，藉此被抗體捕獲複合物捕獲的IgE抗體結合至抗原。
  88. 如請求項87之方法，其中抗原包含多個條碼抗原，其中多個條碼抗原中的各者是過敏原的不同抗原部分。
  89. 如請求項87或88之方法，進一步包含分選該群抗體分泌細胞以收集抗體分泌細胞庫，其中該庫中的抗體分泌細胞各自分泌被抗體捕獲複合物捕獲並被抗原結合的IgE抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌IgE抗體的抗體分泌細胞。
  90. 如請求項87或88之方法，進一步包含使該群抗體分泌細胞與抗IgE抗體接觸，以允許由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的IgE抗體結合至抗IgE抗體。
  91. 如請求項90之方法，進一步包含分選該群抗體分泌細胞以收集抗體分泌細胞庫，其中該庫中的抗體分泌細胞各自分泌被抗體捕獲複合物捕獲並被抗原和抗IgE抗體結合的IgE抗體，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌IgE抗體的抗體分泌細胞。
  92. 如請求項89或91之方法，進一步包含將收集的抗體分泌細胞庫分離成單個細胞並分離出分泌IgE抗體的抗體分泌細胞。
  93. 如請求項29至92中任一項之方法，其中使該群抗體分泌細胞與抗原接觸的步驟包含： (a)使該群抗體分泌細胞與抗原的第一標記形式接觸以允許抗原結合至在該群抗體分泌細胞的細胞表面上所捕獲之包括目標抗體的抗體，其中抗原的第一標記形式接合至第一可偵測標記； (b)洗滌該群抗體分泌細胞以去除未結合的抗原； (c)使該群抗體分泌細胞與 (i)抗原的未標記形式、 (ii)抗原的第二標記形式，或 (iii)抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式接觸； (d)洗滌該群抗體分泌細胞以去除未結合的抗原，以及 (e)收集維持著結合至抗原的第一標記形式的抗體分泌細胞庫，其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，其中由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體維持著結合至抗原的第一標記形式。
  94. 如請求項93之方法，其中抗原的第一標記形式濃度在0.001nM和1uM之間。
  95. 如請求項93之方法，其中抗原的第一標記形式濃度在0.1和7.5nM之間。
  96. 如請求項93至95中任一項之方法，其中第一可偵測標記是第一螢光標記。
  97. 如請求項93至96中任一項之方法，其中抗原是單體形式的蛋白質。
  98. 如請求項93至96中任一項之方法，其中抗原是多聚體形式的蛋白質。
  99. 如請求項93至96中任一項之方法，其中抗原是以單體和多聚體形式存在的蛋白質。
  100. 如請求項97至99中任一項之方法，其中抗原的第一標記形式是抗原的單價形式。
  101. 如請求項97至100中任一項之方法，其中抗原的未標記形式是抗原的單價形式。
  102. 如請求項97至100中任一項之方法，其中抗原的未標記形式是抗原的多價形式。
  103. 如請求項102之方法，其中抗原的多價形式由抗原結合的多價分子提供。
  104. 如請求項103之方法，其中多價分子選自鏈球菌親生物素蛋白多聚體(諸如四聚體)、免疫球蛋白Fc片段的二聚體，或三聚化分子的三聚體(諸如折疊子)。
  105. 如請求項97至104中任一項之方法，其中抗原的第二標記形式是抗原的單價形式。
  106. 如請求項99至104中任一項之方法，其中抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。
  107. 如請求項106之方法，其中抗原的多價形式由抗原結合或連接的多價分子提供。
  108. 如請求項107之方法，其中多價分子為鏈球菌親生物素蛋白多聚體(諸如四聚體)、免疫球蛋白Fc片段的二聚體，或三聚化分子的三聚體(諸如折疊子)。
  109. 如請求項106至108中任一項之方法，其中抗原的多價形式用第二可偵測標記進行標記。
  110. 如請求項109之方法，其中第二可偵測標記是第二螢光標記。
  111. 如請求項100之方法，其中在步驟(c)中該群抗體分泌細胞與抗原的未標記形式接觸。
  112. 如請求項111之方法，其中抗原的未標記形式是抗原的單價形式。
  113. 如請求項111或112之方法，其中抗原的未標記形式與相對於步驟(a)中使用的抗原的第一標記形式之莫耳比為至少2至4倍。
  114. 如請求項100之方法，其中在步驟(c)中該群抗體分泌細胞與抗原的第二標記形式接觸。
  115. 如請求項114之方法，其中抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。
  116. 如請求項114或115之方法，其中抗原的第二標記形式相對於步驟(a)中使用的抗原的第一標記形式之莫耳比為至少2至4倍。
  117. 如請求項111至116之方法，其中在步驟(e)中收集細胞之前重複步驟(c)中的接觸和步驟(d)中的洗滌至少一次。
  118. 如請求項100之方法，其中在步驟(c)中該群抗體分泌細胞與抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式接觸。
  119. 如請求項118之方法，其中未標記形式是抗原的單價形式，而抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。
  120. 如請求項118之方法，其中抗原是單體蛋白，未標記形式是抗原的單價形式，而抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。
  121. 如請求項118之方法，其中抗原是多聚體蛋白，未標記形式是抗原的單價形式，而抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。
  122. 如請求項118之方法，其中抗原是以單體和多聚體形式存在的蛋白質，未標記形式是抗原的單價形式，而抗原的第二標記形式是抗原的多價形式。
  123. 如請求項118至122中任一項之方法，其中使細胞同時接觸抗原的未標記形式和抗原的第二標記形式。
  124. 如請求項118至123中任一項之方法，其中抗原的未標記形式相對於步驟(a)中使用的抗原的第一標記形式之莫耳比為至少2至4倍。
  125. 如請求項93至124中任一項之方法，其中第一可偵測標記是螢光標記，且其中使用螢光活化細胞分選來收集與抗原的第一標記形式維持著結合的細胞。
  126. 如請求項111至124中任一項之方法，其中第一可偵測標記是第一螢光標記，而第二可偵測標記是不同於第一螢光標記的第二螢光標記，其中進行二維螢光活化細胞分選以收集與抗原的第一標記形式維持著結合的抗體分泌細胞庫，並且其中收集的抗體分泌細胞庫包含分泌與抗原的第一標記形式維持著結合的目標抗體的抗體分泌細胞。
  127. 如請求項93至126之方法，其中目標抗體具有約0.1pM至約25nM(KD)範圍內的親和力。
  128. 如請求項127之方法，其中親和力小於約10nM(KD)。
  129. 如請求項93至128中任一項之方法，進一步包含將步驟(e)中收集的抗體分泌細胞庫分離成單個細胞並分離出分泌目標抗體的抗體分泌細胞。
  130. 如請求項82、85、92或129之方法，進一步包含從分泌目標抗體之經分離抗體分泌細胞中分離出抗體編碼核酸。
  131. 一種鑑定編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由包含經修飾細胞表面的細胞所分泌，並且其中目標抗體隨後被捕獲在經修飾細胞表面上，該方法包含： a)提供包含經修飾細胞表面的抗體分泌細胞，其中抗體分泌細胞分泌目標抗體，其中目標抗體隨後被捕獲在經修飾細胞表面上，其中被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體結合至抗原，其中抗原連接至條碼核酸分子，且其中抗體分泌細胞進一步包含核酸分子，該核酸分子包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之目標抗體的抗原結合片段的基因區； b)使條碼核酸分子的一部分與附接於固體表面的第一核酸分子的一部分雜交； c)使包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接於固體表面的第二核酸分子的一部分雜交； d)製備抗體分泌細胞之基因表現之第一擴增子庫、抗體分泌細胞的可變區、多樣性區和接合區(VDJ)之第二擴增子庫，以及抗原條碼核酸分子之第三擴增子庫； e)對三個擴增子庫中的每一者進行定序；以及 f)鑑定編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區。
  132. 如請求項131之方法，其中條碼核酸分子的一部分與第一模板轉換寡核苷酸(template switch oligonucleotide，TSO)互補，其中條碼核酸分子的該部分終止於條碼核酸分子的3'端。
  133. 如請求項131或如請求項132之方法，其中第一核酸分子附接於固體表面的該部分包含第一模板轉換寡核苷酸(TSO)。
  134. 如請求項131至133中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子的5'端包含三個連續的核糖鳥苷殘基的第一序列。
  135. 如請求項131至134中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子進一步包含第一獨特分子識別符(unique molecular identifier，UMI)。
  136. 如請求項131至135中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子進一步包含第一表面條碼。
  137. 如請求項131至136中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子進一步包含第一定序引子。
  138. 如請求項131至137中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子從5'至3'包含三個核糖鳥苷殘基的第一序列、第一TSO、第一UMI、第一表面條碼和第一定序引子。
  139. 如請求項131至138中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子藉由附接於固體表面的第一核酸分子的3'端附接。
  140. 如請求項131至139中任一項之方法，其中附接於固體表面的第一核酸分子包含附接於固體表面的第一DNA分子。
  141. 如請求項140之方法，其中附接於固體表面的第一DNA分子包含附接於固體表面的第一單股DNA分子。
  142. 如請求項141之方法，其中附接至固體表面的第一單股DNA分子的部分包含第一TSO，其中與第一單股DNA分子雜交的條碼核酸分子的部分與第一TSO互補，且其中該方法進一步包含從與第一TSO互補之條碼核酸分子的部分的3'端開始逆轉錄附接至固體表面的第一單股DNA分子。
  143. 如請求項131至142中任一項之方法，其中條碼核酸分子是單股DNA條碼核酸分子，且其中附接至固體表面的第一核酸分子的部分包含第一TSO，且該方法進一步包含從第一TSO的5'端開始逆轉錄第一單股DNA條碼核酸分子。
  144. 如請求項131至143中任一項之方法，其中條碼核酸分子的部分的3'端包含三個連續的胞苷或核糖胞苷殘基。
  145. 如請求項144之方法，進一步包含逆轉錄編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子，藉此產生編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股cDNA分子，其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股cDNA分子的核苷酸序列與編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子的DNA互補序列不同，因為被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的3'端包含三個額外的連續胞苷或核糖胞苷殘基。
  146. 如請求項145之方法，其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子的3'端包含多個連續的腺嘌呤殘基。
  147. 如請求項145或請求項146之方法，其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的5'端包含多個連續的胸腺嘧啶殘基。
  148. 如請求項131至147中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列。
  149. 如請求項131至148中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子進一步包含第二UMI。
  150. 如請求項131至149中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子進一步包含第二表面條碼，其中第一和第二表面條碼核酸分子的核苷酸序列相同。
  151. 如請求項131至150中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子進一步包含第二定序引子。
  152. 如請求項131至151中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子從5'到3'包含三個核糖鳥苷殘基的第二序列、第二TSO、第二UMI、第二表面條碼，以及第二定序引子，其中第一與第二表面條碼核酸分子的核苷酸序列是相同的。
  153. 如請求項131至152中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子藉由附接至固體表面的第二核酸分子的3'端附接。
  154. 如請求項131至153中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子包含附接至固體表面的第二DNA分子。
  155. 如請求項154之方法，其中附接至固體表面的第二DNA分子包含附接至固體表面的第二單股DNA分子。
  156. 如請求項155之方法，其中附接至固體表面的第二單股DNA分子的部分的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列，且其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的部分的3'端包含三個連續的胞苷或核糖胞苷殘基，其中該方法進一步包含從三個連續胞苷或核糖胞苷殘基的3'端開始逆轉錄附接於固體表面的第二單股DNA分子。
  157. 如請求項131至156中任一項之方法，其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上之目標抗體的抗原結合片段的基因區的第二單股DNA分子。
  158. 如請求項156之方法，其中編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的部分的3'端包含三個連續胞苷或核糖胞苷殘基，且其中附接至固體表面的第二單股DNA分子的部分的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列，其中該方法進一步包含從編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的部分的3'端開始逆轉錄附接於固體表面的第二單股DNA分子。
  159. 如請求項131至158中任一項之方法，其中抗體分泌細胞佈置在具有固體表面的分區內。
  160. 如請求項131至159中任一項之方法，其中固體表面包含珠粒。
  161. 如請求項159或160之方法，進一步包含溶解分區內的抗體分泌細胞。
  162. 如請求項131至161中任一項之方法，其中條碼核酸分子進一步包含第三定序引子。其中第三定序引子始於條碼核酸分子的5'端。
  163. 如請求項131至162中任一項之方法，其中該第一擴增子庫的各個擴增子包含基因，其中各個擴增子不包含編碼被捕獲在經修飾細胞表面上的目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子。
  164. 如請求項163之方法，該方法進一步包含對第一擴增子庫進行樣品分離(sample de-multiplexing)、比對、過濾和UMI計數。
  165. 如請求項131至164中任一項之方法，其中第一擴增子庫的定序包含次世代定序(next-generation sequencing)。
  166. 如請求項131至165中任一項之方法，該方法進一步包含將第一擴增子庫的各個擴增子映射至標準參考基因組並進行比對。
  167. 如請求項166之方法，其中標準參考基因組包含人類標準參考基因組。
  168. 如請求項167之方法，其中人類標準參考基因組是GRCh38。
  169. 如請求項166之方法，其中標準參考基因組包含鼠類標準參考基因組。
  170. 如請求項169之方法，其中鼠類標準參考基因組是mm10。
  171. 如請求項166至170中任一項之方法，其中映射與比對包含將第一擴增子庫的各個擴增子利用剪接感知比對器(splice aware aligner，STAR)映射到標準參考基因組，其中第一擴增子庫的各個擴增子包含一個獨特的分子識別符，其中映射到標準參考基因組的註釋基因的第一擴增子庫的所有擴增子經過分箱，且其中針對每個獨特分子識別符(UMI)計數經分箱的擴增子，從而生成單細胞計數矩陣，該矩陣包含每個註釋基因的映射計數和每個UMI的計數。
  172. 如請求項171之方法，該方法進一步包含藉由計算註釋基因總數被除以計數的UMI總數的log 10的比率，針對高品質細胞和廣泛分析的基因來過濾單細胞計數矩陣，其中過濾掉比率低於約0.1的細胞，其中過濾掉計數的UMI總數的四分位數間距(interquartile range)超過約四倍的細胞，以及過濾掉超過約80%的讀段映射到粒線體基因的細胞。
  173. 如請求項172之方法，該方法進一步包含標準化單細胞計數矩陣，使得計數的UMI總數為約10,000。
  174. 如請求項172或173之方法，該方法進一步包含計算單細胞計數矩陣的PCA嵌入，並執行主要細胞類型的迭代分群以鑑別批次之間的相似性，從而生成均勻流形近似和投影(UMAP)。
  175. 如請求項172至174中任一項之方法，該方法進一步包含使用集群特異性的中心來確定每個細胞的線性調整函數，且將每個細胞的線性調整函數應用於校正批次的差異，從而生成經批次校正嵌入，並使用經批次校正嵌入來生成均勻流形二維近似和投影(uniform manifold approximation and projection，UMAP)。
  176. 如請求項174或175之方法，該方法進一步包含確定加權k-近鄰圖並且將萊頓演算法應用於具有約0.1、約0.2、約0.5和約1.0的分辨率值的加權k-近鄰圖，以便按照非監督方式確定細胞類型集群。
  177. 如請求項176之方法，該方法進一步包含對一個集群中的所有細胞進行成對Wilcox檢定並比較第一個成對Wilcox檢定的結果，而對每隔一個集群中的所有細胞進行另一個成對Wilcox檢定，以量化每個集群中每個基因的p-值和變化倍數，其中當基因具有低p值和高變化倍數時，細胞由抗體分泌細胞的共同標記所標記，且細胞按照差異表現結果中排名靠前的基因命名的分群亞型予以標記。
  178. 如請求項131至177中任一項之方法，該方法進一步包含進行樣品分離(sample de-multiplexing)，讀段對從頭組裝成片段重疊群，並且針對生殖系區段V(D)J參考序列的片段重疊群相對第二擴增子家族進行比對和註釋。
  179. 如請求項178之方法，其中片段重疊群與生殖系區段V(D)J參考序列的比對包含與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫進行比對。
  180. 如請求項179之方法，其中人類生殖系參考數據庫包含人類生殖系免疫球蛋白序列的IMGT數據庫。
  181. 如請求項179之方法，其中鼠類生殖系參考數據庫包含IMGT生殖系參考數據庫。
  182. 如請求項179至181中任一項之方法，該方法進一步包含將VDJ序列與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫中的序列進行比較，從而藉由檢查框內比對、CDR3的長度，及在可變區序列中不存在終止密碼子來標記VDJ序列以進行品質比對，與基於標記過濾VDJ序列。
  183. 如請求項182之方法，該方法進一步包含將VDJ序列映射到免疫球蛋白鏈的參考數據庫。
  184. 如請求項179之方法，其中免疫球蛋白同型、可變區映射、接合區映射、多樣性區映射、每個細胞的重鏈和輕鏈序列的全長可變區的準確性是藉由比對進行確認。
  185. 如請求項131至184中任一項之方法，該方法進一步包含對第三個擴增子庫進行樣品分離、比對、過濾和UMI計數。
  186. 如請求項131至185中任一項之方法，該方法進一步包含將第三擴增子庫映射到訂製的短讀段參考品，其包含與每個抗原相關的條碼核酸分子參考品，其中針對條碼抗原單細胞矩陣中的每個細胞對每個獨特映射的條碼核酸分子的計數求和。
  187. 如請求項186之方法，該方法進一步包含對所有細胞中的條碼核酸分子進行定量，並藉由取得每次樣品捕獲中多個條碼核酸分子的各個條碼核酸分子的中心對數比將該定量進行標準化。
  188. 如請求項187之方法，該方法進一步包含藉由背景降噪和縮放(denoising and scaling by background，DSB)針對多個條碼核酸分子中的各個條碼核酸分子去除背景抗原信號。
  189. 如請求項188之方法，該方法進一步包含確定抗原信號分佈，其中當在抗原信號分佈中有充分分離的雙峰分佈時，使用z轉換值來計算抗原特異性，並且其中當在抗原信號分佈中沒有充分分離的雙峰分佈時使用分位數值。
  190. 如請求項189之方法，該方法進一步包含對目標抗原和陰性對照抗原分佈進行統計建模。
  191. 如請求項131至190中任一項之方法，其中第一擴增子庫、第二擴增子庫和第三擴增子庫的分析是同時進行的，以獲得經修飾細胞表面上所捕獲之抗原陽性目標抗體的至少一個候選序列。
  192. 如請求項191之方法，該方法進一步包含使用第一擴增子庫分析結果和第二擴增子庫分析結果對具有有效抗體恆定區的抗體分泌細胞進行子集化。
  193. 如請求項192之方法，其中抗體恆定區包含IgE恆定區。
  194. 如請求項192或193之方法，其中子集抗體分泌細胞包含可偵測程度的IgE重鏈和CD79a，但缺乏可偵測程度的Ms4a1和CD19，其中子集抗體分泌細胞是IgE +抗體分泌細胞。
  195. 如請求項194之方法，該方法進一步包含針對IgA分泌細胞同型、IgG分泌細胞同型及/或IgM分泌細胞同型評估IgE +抗體分泌細胞的差異表現。
  196. 如請求項195之方法，其中差異表現的評估進一步特徵鑑定IgE +抗體分泌細胞的獨特轉錄特徵。
  197. 如請求項196的方法，該方法進一步包含評估IgE +抗體分泌細胞的抗原特異性。
  198. 如請求項197之方法，其中評估包含比較IgE +抗體分泌細胞對多種抗原和對照抗原的抗原特異性，且其中多種抗原包含目標抗原。
  199. 如請求項198之方法，其中比較包含藉由從與對照抗原相關的信號的分位數值(qC)和懲罰因數(x)扣除與抗原相關的信號的分位數值(qT)，來計算多個抗原中的每個抗原和對照抗原的經驗分數，以確定抗原特異性分數，其中抗原特異性分數 = qT - qC x。
  200. 如請求項199之方法，其中懲罰因數對所有抗原都是相同的。
  201. 如請求項199之方法，其中懲罰因數對不同的抗體同型是不同的。
  202. 如請求項199之方法，其中懲罰因數在使用其他抗原時是不同的。
  203. 如請求項199之方法，該方法進一步包含確定多種抗原和對照抗原中每一者的抗原特異性分數。
  204. 如請求項203之方法，該方法進一步包含計算對照抗原特異性分數，其中當抗原特異性分數高且對照抗原特異性分數低時，挑選細胞。
  205. 如請求項204之方法，其中VDJ區鑑別抗原特異性抗體。
  206. 如請求項204之方法，該方法進一步包含使用細胞的成對V H：V L抗體序列從抗原信號的排序表中挑出候選抗體。
  207. 如請求項191至206中任一項之方法，該方法進一步包含確定同型、條件及/或抗原特異性之間的差異表現，其中確定同型之間的差異表現包含對一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定，並且對另一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定，從而量化每個集群的各個基因的p值和變化倍數；以及其中確定抗原特異性之間的差異表現包含對一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定並對另一種同型中的所有細胞進行成對Wilcox檢定，從而量化每個集群的各個基因的p值和變化倍數。
  208. 如請求項191至207中任一項之方法，該方法進一步包含對抗原陽性目標細胞中的VDJ序列相似性進行分群，其中分群VDJ序列相似性包含基於序列的比對，按照胺基酸序列對相似可變區進行分組。
  209. 如請求項191至208中任一項之方法，其中抗原陽性目標細胞是IgE +。
  210. 如請求項191至209中任一項之方法，該方法進一步包含修整冗餘序列。
  211. 一種鑑定編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由抗體分泌細胞所分泌，該方法包含： a)使一群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，從而結合對的第二組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面； b)使該群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面上之結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲由抗體分泌細胞所分泌的目標抗體； c)使該群抗體分泌細胞與二級抗Ig抗體接觸，以允許由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合二級抗Ig抗體； d)使該群抗體分泌細胞與包含條碼核酸分子的抗原接觸，以允許由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原； e)收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的每個細胞分泌被抗體捕獲複合物捕獲、被二級抗Ig抗體和被包含條碼核酸分子的抗原結合的抗體，並且其中抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞； f)將抗體分泌細胞庫分離成單抗體分泌細胞，並且對每個單抗體分泌細胞： 1)使條碼核酸分子的一部分與附接至固體表面的第一核酸分子的一部分雜交，其中固體表面和附接至其上的第一核酸分子對於每個單抗體分泌細胞是獨特的； 2)使包含編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接至固體表面的第二核酸分子的一部分雜交； 3)製備基因表現的第一擴增子庫，可變區、多樣性區和接合區(VDJ)的第二擴增子庫，與抗原條碼核酸分子的第三擴增子庫；以及 4)對三個擴增子庫中的每一者進行定序；及 g)鑑定編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區。
  212. 如請求項211之方法，其中： 結合對的第一組分包含抗生物素蛋白、鏈球菌親生物素蛋白或抗生物素，而結合對的第二組分包含生物素； 結合對的第一組分包含jun和fos中的一者，而結合對的第二組分包含jun和fos中的另一者； 結合對的第一組分包含mad和max中的一者，而結合對的第二組分包含mad和max中的另一者； 結合對的第一組分包含myc和max中的一者，而結合對的第二組分包含myc和max中的另一者； 結合對的第一組分包含疊氮化物和炔烴中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和炔烴中的另一者；或 結合對的第一組分包含疊氮化物和膦中的一者，而結合對的第二組分包含疊氮化物和膦中的另一者。
  213. 如請求項211之方法，其中結合對的第一組分包含抗生物素蛋白或鏈球菌親生物素蛋白，而結合對的第二組分包含生物素。
  214. 如請求項211之方法，其中： 結合對的第二組分包含異硫氰酸螢光素(FITC)，而結合對的第一組分包含抗FITC抗體； 結合對的第二組分包含藻紅素(PE)，而結合對的第一組分包含抗PE抗體； 結合對的第二組分包含APC，而結合對的第一組分包含抗APC抗體； 結合對的第二組分包含BV421，而結合對的第一組分包含抗BV421抗體； 結合對的第二組分包含BV510，而結合對的第一組分包含抗BV510抗體； 結合對的第二組分包含BV605，而結合對的第一組分包含抗BV605抗體； 結合對的第二組分包含BV650，而結合對的第一組分包含抗BV650抗體； 結合對的第二組分包含BV711，而結合對的第一組分包含抗BV711抗體；或 結合對的第二組分包含BV786，而結合對的第一組分包含抗BV786抗體。
  215. 一種鑑定編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的方法，其中目標抗體由抗體分泌細胞所分泌，該方法包含： a)使一群抗體分泌細胞與抗體捕獲複合物接觸，其中該群抗體分泌細胞包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞，其中抗體捕獲複合物包含連接至抗體捕獲分子的結合對的第一組分，藉此結合對的第一組分結合至該群抗體分泌細胞的細胞表面上的結合對的第二組分，且藉此抗體捕獲分子捕獲由抗體分泌細胞所分泌的目標抗體； b)使該群抗體分泌細胞與二級抗-Ig抗體接觸，以允許由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合二級抗-Ig抗體； c)使該群抗體分泌細胞與包含條碼核酸分子的抗原接觸，藉此由抗體分泌細胞所分泌並被抗體捕獲複合物捕獲的目標抗體結合抗原； d)收集抗體分泌細胞庫，其中庫中的各個細胞分泌被抗體捕獲複合物捕獲、被二級抗-Ig抗體和包含條碼核酸分子的抗原結合的抗體，且其中抗體分泌細胞庫包含分泌目標抗體的抗體分泌細胞； e)將抗體分泌細胞庫分離成單抗體分泌細胞，並且針對各個單抗體分泌細胞： 1)使條碼核酸分子的一部分與附接於固體表面的第一核酸分子的一部分雜交，其中固體表面和附接其上的第一核酸分子對於各個單抗體分泌細胞都是獨特的； 2)使編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的一部分與附接於固體表面的第二核酸分子的一部分雜交； 3)製備抗體分泌細胞的基因表現之第一擴增子庫，抗體分泌細胞可變區、多樣性區和接合區(VDJ)之第二擴增子庫，和抗原條碼核酸分子之第三擴增子庫；及 4)對三個擴增子庫中的每一者進行定序；以及 f)鑑定編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區。
  216. 如請求項215之方法，其中結合對的第二組分包含抗體分泌細胞的表面標記，而結合對的第一組分是結合至表面標記的抗體。
  217. 如請求項216之方法，其中表面標記包含CD27、CD38、CD45、CD138、CD98、CD78、CD319、CXCR4、BCMA、GPRC5D、FCRL5、CD19、Ly6D、CD52或跨膜活化因子鈣調節因子，以及親環蛋白配體交互作用因子(TACI)。
  218. 如請求項215之方法，其中結合對的第二組分包含介白素6受體(IL-6R)，而結合對的第一組分包含抗IL-6R抗體或介白素6 (IL-6)。
  219. 如請求項215之方法，其中結合對的第二組分包含CD27，而結合對的第一組分包含抗CD27抗體或CD70。
  220. 如請求項211至219中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含捕獲抗體。
  221. 如請求項220之方法，其中捕獲抗體包含抗Fc抗體、抗輕鏈κ抗體或抗輕鏈λ抗體。
  222. 如請求項221之方法，其中抗Fc抗體包含抗Fcγ抗體、抗Fcα抗體或抗Fcε抗體。
  223. 如請求項222之方法，其中抗Fcγ抗體包含抗FcγRI抗體、抗FcγRIIA抗體、抗FcγRIIB抗體、抗FcγRIIB1抗體、抗FcγRIIB2抗體、抗FcγRIIIA抗體或抗FcγRIIIB抗體。
  224. 如請求項222之方法，其中抗Fcα抗體包含抗FcαRI抗體。
  225. 如請求項222之方法，其中抗Fcε抗體包含抗FcεRI抗體或抗FcεRII抗體。
  226. 如請求項220之方法，其中捕獲抗體包含抗IgM抗體。
  227. 如請求項220之方法，其中捕獲抗體包含抗IgG抗體。
  228. 如請求項227之方法，其中抗IgG抗體包含抗IgGl抗體、抗IgG2抗體、抗IgG2a抗體、抗IgG2b抗體、抗IgG3抗體或抗IgG4抗體。
  229. 如請求項220之方法，其中捕獲抗體包含抗IgA抗體。
  230. 如請求項229之方法，其中抗IgA抗體包含抗IgA1抗體、抗IgA2抗體、抗分泌型IgA抗體或聚合抗IgA抗體。
  231. 如請求項220之方法，其中捕獲抗體包含抗IgE抗體。
  232. 如請求項211至219中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含Fc受體或Fc受體的胞外域。
  233. 如請求項232之方法，其中Fc受體包含Fcγ受體、Fcα受體或Fcε受體。
  234. 如請求項233之方法，其中Fcγ受體包含FcγRI受體、FcγRIIA受體、FcγRIIB受體、FcγRIIB1受體、FcγRIIB2受體、FcγRIIIA受體、FcγRIIIB受體或FcRn受體。
  235. 如請求項233之方法，其中Fcα受體包含FcαRI受體或Fcα/μR受體。
  236. 如請求項233之方法，其中Fcε受體包含FcεRI受體或FcεRII受體。
  237. 如請求項211至219中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含蛋白A或蛋白G。
  238. 如請求項211至219中任一項之方法，其中抗體捕獲分子包含蛋白L。
  239. 如請求項211至238中任一項之方法，其中二級抗Ig抗體是抗IgE或抗IgG。
  240. 如請求項211至239中任一項之方法，其中二級抗Ig抗體被可偵測地標記。
  241. 如請求項240之方法，其中二級抗Ig抗體係以放射性化合物、螢光化合物或酶進行標記。
  242. 如請求項241之方法，其中放射性化合物包含 3H、 14C、 19F、 35S、 125I、 131I、 111In或 99Tc。
  243. 如請求項241之方法，其中螢光化合物包含螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素或螢光蛋白。
  244. 如請求項241之方法，其中酶包含鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或葡萄糖氧化酶。
  245. 如請求項211至244中任一項之方法，其中抗體分泌細胞與多個條碼抗原接觸，其中多個條碼抗原的各個條碼抗原包含連接至獨特核酸分子的獨特抗原。
  246. 如請求項245之方法，其中獨特核酸分子包含DNA。
  247. 如請求項245之方法，其中獨特核酸分子包含RNA。
  248. 如請求項245至247中任一項之方法，其中每個獨特的核酸分子包含約10個核苷酸至約500個核苷酸。
  249. 如請求項245至248中任一項之方法，其中每個條碼抗原被可偵測地標記。
  250. 如請求項249之方法，其中每個條碼抗原係以放射性化合物、螢光化合物或酶進行標記。
  251. 如請求項250之方法，其中放射性化合物包含 3H、 14C、 19F、 35S、 125I、 131I、 111In或 99Tc。
  252. 如請求項250之方法，其中螢光化合物包含螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素或螢光蛋白。
  253. 如請求項250之方法，其中酶包含鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或葡萄糖氧化酶。
  254. 如請求項211至253中任一項之方法，其中條碼抗原包含過敏原。
  255. 如請求項211至254中任一項之方法，其中抗體分泌細胞是漿細胞或漿母細胞。
  256. 如請求項211至255中任一項之方法，該方法進一步包含在使該群抗體分泌細胞的表面與結合對的第二組分接觸之前，或在該群抗體分泌細胞的表面與抗體捕獲複合物接觸之前從人類獲得的細胞群來富集免疫細胞。
  257. 如請求項256之方法，其中從人類獲得的該群細胞富集漿細胞或漿母細胞。
  258. 如請求項257之方法，其中該經富集免疫細胞群係使用泛B細胞富集來富集漿細胞或漿母細胞。
  259. 如請求項211至258中任一項之方法，其中該群抗體分泌細胞獲自人類的淋巴結、肺臟、骨髓或血液。
  260. 如請求項211至259中任一項之方法，該方法進一步包含偵測二級抗Ig抗體及/或一或多種條碼抗原。
  261. 如請求項211至260中任一項之方法，該方法進一步分選該群抗體分泌細胞以獲得被二抗Ig抗體及/或一或多個條碼抗原所結合的抗體分泌細胞庫。
  262. 如請求項211至261中任一項之方法，該方法進一步包含在使該群抗體分泌細胞與結合對的第二組分接觸之前，使該群抗體分泌細胞與Fc block接觸。
  263. 如請求項211至262中任一項之方法，其中條碼核酸分子的部分與第一模板轉換寡核苷酸(TSO)互補。
  264. 如請求項211至263中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子的部分包含第一模板轉換寡核苷酸(TSO)。
  265. 如請求項211至264中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第一序列。
  266. 如請求項211至265中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子進一步包含第一獨特分子識別符(UMI)。
  267. 如請求項211至266中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子進一步包含第一表面條碼。
  268. 如請求項211至267中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子進一步包含第一定序引子。
  269. 如請求項211至268中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子從5'到3'包含三個核糖鳥苷殘基的第一序列、第一TSO、第一UMI、第一表面條碼以及第一定序引子。
  270. 如請求項211至269中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子藉由附接至固體表面的第一核酸分子的3'端附接。
  271. 如請求項211至270中任一項之方法，其中附接至固體表面的第一核酸分子包含附接至固體表面的第一DNA分子。
  272. 如請求項271之方法，其中附接至固體表面的第一DNA分子包含附接至固體表面的第一單股DNA分子。
  273. 如請求項272之方法，其中附接至固體表面的第一單股DNA分子的部分包含第一TSO，且該方法進一步包含從與第一TSO互補之條碼核酸分子的部分的3'端開始逆轉錄附接至固體表面的第一單股DNA分子。
  274. 如請求項211至273中任一項之方法，其中條碼核酸分子是單股DNA條碼核酸分子，其中附接至固體表面的第一核酸分子的部分包含第一TSO，而該方法進一步包含從第一TSO的3'端開始逆轉錄單股DNA條碼核酸分子。
  275. 如請求項211至274中任一項之方法，其中條碼核酸分子的部分的3'端包含三個連續的胞苷殘基。
  276. 如請求項275之方法，進一步包含逆轉錄編碼目標抗體之抗原結合片段的基因區的mRNA分子，藉此生成編碼目標抗體之抗原結合片段之基因區的單股DNA分子，且其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的核苷酸序列與編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子的互補序列不同，因為編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的3'端包含三個額外的連續胞苷殘基。
  277. 如請求項276之方法，其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的mRNA分子的3'端包含多個連續的腺嘌呤殘基。
  278. 如請求項276或請求項277之方法，其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的5'端包含多個連續的胸腺嘧啶殘基。
  279. 如請求項211至278中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列。
  280. 如請求項211至279中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子進一步包含第二UMI。
  281. 如請求項211至280中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子進一步包含第二表面條碼。
  282. 如請求項211至281中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子進一步包含第二定序引子。
  283. 如請求項211至282中任一項之方法，其中附接於固體表面的第二核酸分子從5'到3'包含三個核糖鳥苷殘基的第二序列、第二TSO、第二UMI、第二表面條碼，以及第二定序引子。
  284. 如請求項211至283中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子藉由附接至固體表面的第二核酸分子的3'端附接。
  285. 如請求項211至284中任一項之方法，其中附接至固體表面的第二核酸分子包含附接至固體表面的第二DNA分子。
  286. 如請求項285之方法，其中附接至固體表面的第二DNA分子包含附接至固體表面的第二單股DNA分子。
  287. 如請求項286之方法，其中附接至固體表面的第二單股DNA分子的部分的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列，且其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子的部分的3'端包含三個連續的胞苷殘基，其中該方法進一步包含從三個連續胞苷殘基的3'端開始逆轉錄附接於固體表面的第二單股DNA分子。
  288. 如請求項211至287中任一項之方法，其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子包含編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的第二單股DNA分子。
  289. 如請求項287之方法，其中編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的部分的3'端包含三個連續胞苷殘基，且其中附接至固體表面的第二單股DNA分子的部分的5'端包含三個連續核糖鳥苷殘基的第二序列，其中該方法進一步包含從編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的單股DNA分子的部分的3'端開始逆轉錄附接至固體表面的第二單股DNA分子。
  290. 如請求項211至289中任一項之方法，其中單抗體分泌細胞各自佈置在具有固體表面的分區內。
  291. 如請求項211至290中任一項之方法，其中固體表面包含珠粒。
  292. 如請求項290或請求項291之方法，進一步包含溶解分區內的單抗體分泌細胞。
  293. 如請求項211至292中任一項之方法，其中條碼核酸分子進一步包含第三定序引子。
  294. 如請求項211至293中任一項之方法，其中該第一擴增子庫的各個擴增子包含基因，其中各個擴增子不包含含有編碼目標抗體的抗原結合片段的基因區的核酸分子。
  295. 如請求項294之方法，該方法進一步包含對第一擴增子庫進行樣品分離、比對、過濾和UMI計數。
  296. 如請求項211至295中任一項之方法，其中第一擴增子庫的定序包含次世代定序。
  297. 如請求項211至296中任一項之方法，該方法進一步包含將第三擴增子庫的各個擴增子映射至標準參考基因組並進行比對。
  298. 如請求項297之方法，其中標準參考基因組包含人類標準參考基因組。
  299. 如請求項298之方法，其中人類標準參考基因組是GRCh38。
  300. 如請求項297之方法，其中標準參考基因組包含鼠類標準參考基因組。
  301. 如請求項300之方法，其中鼠類標準參考基因組是mm10。
  302. 如請求項297至301中任一項之方法，其中映射與比對包含將第一擴增子庫的各個擴增子利用剪接感知比對器(STAR)映射到標準參考基因組，其中第一擴增子庫的各個擴增子包含一個獨特的分子識別符，其中映射到標準參考基因組的註釋基因的第一擴增子庫的所有擴增子經過分箱(binned)，且其中針對每個獨特分子識別符(UMI)計數經分箱的擴增子，從而生成單細胞計數矩陣，該矩陣包含每個註釋基因的映射計數和每個UMI的計數。
  303. 如請求項302之方法，該方法進一步包含藉由計算註釋基因總數被除以計數的UMI總數的log 10的比率，針對高品質單抗體分泌細胞和廣泛分析的基因來過濾單細胞計數矩陣，其中過濾掉比率低於約0.1的單抗體分泌細胞，其中過濾掉計數的UMI總數的四分位數間距超過約四倍的單抗體分泌細胞，以及過濾掉超過約80%的讀段映射到粒線體基因的單抗體分泌細胞。
  304. 如請求項303之方法，該方法進一步包含標準化單細胞計數矩陣，使得計數的UMI總數為約10,000。
  305. 如請求項303或請求項304之方法，該方法進一步包含計算單細胞計數矩陣的PCA嵌入，執行主要細胞類型的迭代分群以鑑別批次之間的相似性，從而生成均勻流形近似和投影(uniform manifold approximation and projection，UMAP)。
  306. 如請求項303至305中任一項之方法，該方法進一步包含使用集群特異性的中心來確定每個細胞的線性調整函數，將每個細胞的線性調整函數應用於校正批次的差異，從而生成經批次校正嵌入，並使用經批次校正嵌入來生成均勻流形二維近似和投影(UMAP)。
  307. 如請求項305或請求項306之方法，該方法進一步包含確定加權k-近鄰圖並且將萊頓演算法應用於具有0.1、0.2、0.5和1.0的分辨率值的加權k-近鄰圖，以便按照非監督方式確定細胞類型集群。
  308. 如請求項305之方法，該方法進一步包含對一個集群中的所有單抗體分泌細胞進行成對Wilcox檢定並比較第一個成對Wilcox檢定的結果，而對每隔一個集群中的所有單抗體分泌細胞進行另一個成對Wilcox檢定，以量化每個集群中每個基因的p-值和變化倍數，其中當基因具有低p值和高變化倍數時，單抗體分泌細胞由漿細胞、漿母細胞或B細胞的共同標記所標記，且單抗體分泌細胞按照差異表現結果中排名靠前的基因命名的分群亞型予以標記。
  309. 如請求項211至308中任一項之方法，該方法進一步包含進行樣品分離，讀段對從頭組裝成片段重疊群，並且針對生殖系區段V(D)J參考序列的片段重疊群相對第二擴增子家族進行比對和註釋。
  310. 如請求項309之方法，其中片段重疊群與生殖系區段V(D)J參考序列的比對包含與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫進行比對。
  311. 如請求項310之方法，其中人類生殖系參考數據庫包含人類生殖系免疫球蛋白序列的IMGT數據庫。
  312. 如請求項310之方法，其中鼠類生殖系參考數據庫包含IMGT生殖系參考數據庫。
  313. 如請求項310至312中任一項之方法，該方法進一步包含將VDJ序列與人類生殖系參考數據庫或鼠類生殖系參考數據庫中的序列進行比較，從而藉由檢查框內比對、CDR3的長度，及在可變區序列中不存在終止密碼子來標記VDJ序列以進行品質比對，與基於標記過濾VDJ序列。
  314. 如請求項313之方法，該方法進一步包含將VDJ序列映射到免疫球蛋白鏈的參考數據庫。
  315. 如請求項310之方法，其中免疫球蛋白同型、可變區映射、接合區映射、多樣性區映射、每個細胞的重鏈和輕鏈序列的全長可變區的準確性是藉由比對進行確認。
  316. 如請求項211至315中任一項之方法，該方法進一步包含對第三個擴增子庫進行樣品分離、比對、過濾和UMI計數。
  317. 如請求項211至316中任一項之方法，該方法進一步包含將第三擴增子庫映射到訂製的短讀段參考品，其包含與每個抗原相關的條碼核酸分子參考品，其中針對條碼抗原單細胞矩陣中的每個細胞對每個獨特映射的條碼核酸分子的計數求和。
  318. 如請求項317之方法，該方法進一步包含對所有單抗體分泌細胞中的條碼核酸分子進行定量，並藉由取得每次樣品捕獲中多個條碼核酸分子的各個條碼核酸分子的中心對數比，對該定量進行標準化。
  319. 如請求項318之方法，該方法進一步包含藉由背景降噪和縮放(DSB)針對多個條碼核酸分子中的各個條碼核酸分子去除背景抗原信號。
  320. 如請求項319之方法，該方法進一步包含確定抗原信號分佈，其中當在抗原信號分佈中有充分分離的雙峰分佈時，使用z轉換值來計算抗原特異性，並且其中當在抗原信號分佈中沒有充分分離的雙峰分佈時使用分位數值。
  321. 如請求項320之方法，該方法進一步包含對目標抗原和陰性對照抗原分佈進行統計建模。
  322. 如請求項211至321中任一項之方法，其中第一擴增子庫、第二擴增子庫和第三擴增子庫的分析是同時進行的，以獲得抗原陽性目標抗體的至少一個候選序列。
  323. 如請求項322之方法，該方法進一步包含使用第一擴增子庫分析結果和第二擴增子庫分析結果對具有有效抗體恆定區的漿細胞或漿母細胞進行子集化。
  324. 如請求項323之方法，其中抗體恆定區包含IgE恆定區。
  325. 如請求項323或請求項324之方法，其中子集漿細胞或漿母細胞包含可偵測程度的IgE重鏈和CD79a，但缺乏可偵測程度的Ms4a1和CD19，其中子集漿細胞或漿母細胞是IgE +漿細胞或漿母細胞。
  326. 如請求項325之方法，該方法進一步包含針對IgA分泌漿細胞或漿母細胞同型、IgG分泌漿細胞或漿母細胞同型及/或IgM分泌漿細胞或漿母細胞同型評估IgE +漿細胞或漿母細胞的差異表現。
  327. 如請求項326之方法，其中差異表現的評估進一步特徵鑑定IgE +漿細胞或漿母細胞的獨特轉錄特徵。
  328. 如請求項327之方法，該方法進一步包含評估IgE +漿細胞或漿母細胞的抗原特異性。
  329. 如請求項328之方法，評估包含比較IgE +漿細胞或漿母細胞對多種抗原和對照抗原的抗原特異性，且其中多種抗原包含目標抗原。
  330. 如請求項329之方法，其中比較包含藉由從與對照抗原相關的信號的分位數值(qC)和懲罰因數(x)扣除與抗原相關的信號的分位數值(qT)，來計算多個抗原中的每個抗原和對照抗原的經驗分數，以確定抗原特異性分數，其中抗原特異性分數 = qT - qC x。
  331. 如請求項330之方法，其中懲罰因數對所有抗原都是相同的。
  332. 如請求項330之方法，其中懲罰因數對不同的抗體同型是不同的。
  333. 如請求項330之方法，其中懲罰因數在使用其他抗原時是不同的。
  334. 如請求項331之方法，該方法進一步包含確定多種抗原和對照抗原中每一者的抗原特異性分數。
  335. 如請求項334之方法，該方法進一步包含計算對照抗原特異性分數，其中當抗原特異性分數高且對照抗原特異性分數低時，挑選細胞。
  336. 如請求項335之方法，其中VDJ區鑑別抗原特異性抗體。
  337. 如請求項335之方法，該方法進一步包含使用細胞的成對V H：V L抗體序列從抗原信號的排序表中挑出候選抗體。
  338. 如請求項322至337中任一項之方法，該方法進一步包含確定同型、條件及/或抗原特異性之間的差異表現，其中確定同型之間的差異表現包含對一種同型中的所有單抗體分泌細胞進行成對Wilcox檢定，並且對另一種同型中的所有單抗體分泌細胞進行成對Wilcox檢定，從而量化每個集群的各個基因的p值和變化倍數；以及其中確定抗原特異性之間的差異表現包含對一種同型中的所有單抗體分泌細胞進行成對Wilcox檢定並對另一種同型中的所有單抗體分泌細胞進行成對Wilcox檢定，從而量化每個集群的各個基因的p值和變化倍數。
  339. 如請求項320至338中任一項之方法，該方法進一步包含對抗原陽性目標細胞中的VDJ序列相似性進行分群，其中分群VDJ序列相似性包含基於序列的比對，按照胺基酸序列對相似可變區進行分組。
  340. 如請求項320至339中任一項之方法，其中抗原陽性目標細胞是IgE +。
  341. 如請求項320至340中任一項之方法，該方法進一步包含修整冗餘序列。
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