JP2006518212A - 抗体を生成し抗体レパートリーをスクリーニングするための方法とコンパウンド - Google Patents
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Abstract
Description
1)選択した抗原とマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソーム、を調製すること;
2)工程1の前記小胞を抗体レパートリーと接触させる、または懸濁させること;および
3)前記小胞と反応している単一の抗体産生粒子を同定および単離すること;
を含む方法に関する。
1)抗体産生細胞を提供すること;
2)前記抗原およびマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
3)工程1の抗体産生細胞を、工程2の小胞と懸濁させること;および
3)前記小胞と反応している単一の抗体産生細胞を同定および単離すること;
を含む方法に関する。
好ましくは、前記抗体産生細胞はリンパ球である。ある実施態様においては、前記リンパ球を前記抗原によって免疫化されたヒト以外の動物から収集する。
1)少なくとも1つの抗原またはそのエピト−プを表示している免疫原性の小胞、好ましくはエキソソームを提供すること;
2)ヒト以外の動物を前記免疫原性小胞で免疫化することによって抗体反応を生起させること;
3)免疫化した動物からリンパ球を収集すること;
4)工程1の前記抗原またはそのエピトープとマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
5)工程3のリンパ球を工程4の小胞と共に懸濁すること;および、
6)工程4の小胞と反応している単一の抗体産生細胞を同定および単離すること;
を含む方法を開示する。
1)前記変異抗原とマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソーム、の第1の集団を調製すること;
2)自然抗原を表示しているが前記マーカーは表示していない小胞、好ましくはエキソソーム、の第2の集団を調製すること;
3)前記抗体レパートリーを小胞の第1および第2の集団と共に、第2集団は過剰に、懸濁すること;
4)工程1の小胞と反応している単一の抗体産生粒子を同定および単離すること;
を含む方法に関する。
1)抗体産生細胞を提供すること;
2)動物の免疫化に用いた前記変異抗原とマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソーム、を調製すること;
3)自然抗原を表示し、前記マーカーを表示していない小胞、好ましくはエキソソーム、を調製すること;
4)工程1の抗体産生細胞を、工程2の前記変異抗原とマーカーを表示している小胞および工程3の前記自然抗原を表示している過剰量の小胞、と共に懸濁すること;および、
5)工程2の小胞と反応している単一の抗体産生細胞を同定および単離すること;
を含む方法に関する。
好ましくは、前記抗体産生細胞はリンパ球である。ある実施態様においては、前記リンパ球は前記抗原で免疫化したヒト以外の動物から収集される。
1)変異抗原を表示している免疫原性小胞、好ましくはエキソソーム、を提供すること;
2)ヒト以外の動物を前記免疫原性小胞によって免疫化することにより、抗体反応を生起すること;
3)免疫化した動物からリンパ球を収集すること;
4)工程1の前記変異抗原およびマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
5)自然抗原を表示し、前記マーカーを表示していない小胞、好ましくはエキソソーム、を調製すること;
6)工程3のリンパ球を、工程4の前記変異抗原とマーカーを表示している小胞および工程5の前記自然抗原を表示している過剰量の小胞と懸濁すること;および、
7)工程4の小胞と反応している抗原変異体に特異的な単一の抗体を産生している細胞を同定および単離すること;
を含む方法を開示する。
a)前記抗原をコードする遺伝子コンストラクトを提供すること;
b)場合によっては、前記マーカーをコードするコンストラクトを提供すること;
c)前記コンストラクトをエキソソーム産生細胞に導入して、組換えエキソソームを生成すること;および、
d)前記組換えエキソソームを収集すること。ここで、前記エキソソームは、その表面に前記遺伝子コンストラクトによりコードされる抗原および場合によっては前記マーカーを所持する。
a)エキソソームターゲティングポリペプチドに融合された前記抗原を含む分子を提供すること;
b)場合によっては、エキソソームターゲティングポリペプチドに融合された前記マーカーを含む分子を提供すること;および
c)前記抗原を含む前記分子、および場合によっては前記マーカーを含む前記分子を、フォスファチジルセリンまたはエキソソームに自然に含まれる他の脂質を含む脂質小胞と接触させて、表面に前記抗原および場合によっては前記マーカーを提示している機能化された脂質小胞を生成すること。
1)前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部をコードする遺伝子コンストラクトを提供すること;
2)エキソソーム産生細胞に前記コンストラクトを導入して、前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部をエキソソーム産生細胞中に過剰発現させ、組換えエキソソームを生成すること;および、
3)前記組換えエキソソームを収集すること(ここで前記エキソソームは、その表面に前記遺伝子コンストラクトによりコードされるポリペプチドを所持している);
方法に関する。
a)前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部をコードする遺伝子コンストラクトを提供すること;
b)エキソソーム産生細胞中に、前記コンストラクトを導入し、前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部をエキソソーム産生細胞中に過剰発現させ、前記ポリペプチドまたはそのエピトープを表面に提示している組換えエキソソームを生成すること:
c)前記組換えエキソソームを収集し、前記エキソソームまたはその一部を、ヒト以外の哺乳動物に注入して、前記ポリペプチドまたはそのエピトープを結合する抗体を生成すること;および、
d)抗体または抗体産生細胞を前記哺乳動物から収集すること;
を含む方法に関する。
a)前記抗原または少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するその一部をコードする遺伝子コンストラクトを提供すること;
b)前記コンストラクトをエキソソーム産生細胞中に導入し、前記抗原または少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するその一部をエキソソーム産生細胞中に過剰発現させて、前記抗原または前記その一部を表面に提示している組換えエキソソームを生成すること;
c)前記組換えエキソソームを収集し、前記エキソソームまたはその一部を、前記対象に注入すること;
を含む方法に関する。この方法の好ましい実施態様において、前記抗原はレセプターである。より好ましくは、前記レセプターはSSTR2、CCR7、CXCR4、およびCCR5などのGPCR(Gタンパク質共役レセプター)である。好ましくは、前記エキソソームはさらに、突然変異したCD40Lを表示し、前記突然変異は可溶性CD40Lの切断と放出を阻害する。
a)前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部をコードする遺伝子コンストラクトを提供すること;
b)前記コンストラクトをエキソソーム産生細胞中に導入し、前記抗原または少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部をエキソソーム産生細胞中に過剰発現させて、前記抗原または前記その一部を表面に提示している組換えエキソソームを生成すること;
c)前記組換えエキソソームを収集し、前記エキソソームまたはその一部を、前記対象に注入すること;
を含む方法に関する。この方法の好ましい実施態様において、前記抗原はレセプターである。より好ましくは、前記レセプターはSSTR2、CCR7、CXCR4、およびCCR5などのGPCR(Gタンパク質共役レセプター)である。好ましくは、前記エキソソームはさらに、突然変異CD40Lを提示し、前記突然変異は可溶性CD40Lの切断と放出を阻害する。
本発明は、抗体を生成し抗体レパートリーをスクリーニングする新しい方法を開示する。本発明は、より詳細には標的抗原、共刺激分子および/またはマーカーを表示している自然または合成した膜小胞、好ましくはエキソソームを用いる。本発明を、実験、研究、治療、予防または診断の分野において用いることができる。
この方法では、少なくとも1つの標的抗原を発現している免疫原性小胞、好ましくはエキソソーム、を動物に導入したときに、抗体が生成される。抗体産生は、免疫化された動物の血清を標準的な方法によってテストすることにより評価できる。抗体の調製は、ポリクローナル抗体に対しては血清から抗体をアフィニティー精製することにより、またモノクローナル抗体に対しては抗原特異的な抗体産生細胞を単離することにより、達成できる。後者は好ましくは、下記の抗体レパートリーをスクリーニングするための方法を用いて実施できる。あるいは、モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ・スクリーニングおよびSLAMなどの、様々な既知の免疫された動物からのモノクローナル抗体の調製方法を用いて、調製することができる。
抗原を提示している免疫原性小胞は、一般に抗原配列を、エキソソームターゲティングドメイン、好ましくはラクトアドヘリンのC1C2ドメイン、と融合させることにより調製する。免疫原性小胞は、エキソソームやリポソームなどの、自然のまたは合成された小胞である。エキソソームターゲティングドメインを含むキメラタンパク質を保持する小胞の調製方法およびその使用が、WO03/016522に記載されている。
− 候補ポリペプチド、好ましくは候補の膜貫通ポリペプチドをコードする第1の遺伝子コンストラクトを提供すること;
− 第1の遺伝子コンストラクトをエキソソーム産生細胞中に導入し、候補ポリペプチドのエキソソームにおける発現をテストすること;
− エキソソームで発現された候補ポリペプチドを選択し、標的ポリペプチドに融合した前記選択されたポリペプチドをコードする第2の遺伝子コンストラクトを調製すること;
− 第2の遺伝子コンストラクトをエキソソーム産生細胞中に導入し、融合ポリペプチドのエキソソームにおける発現をテストすること;および、
− 標的ポリペプチドをエキソソーム中に効率的に発現させるポリペプチドを選択すること。
1)前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部をコードする遺伝子コンストラクトを提供すること;
2)エキソソーム産生細胞中に前記コンストラクトを導入し、前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部を過剰発現させて、組換えエキソソームを生成すること;および、
3)その表面に前記遺伝子コンストラクトによりコードされるポリペプチドを保持する前記組換えエキソソームを収集すること;
を含む方法に関する。
キメラのポリペプチドまたは複合物を、遺伝的または化学的融合により調製することができる。
本発明は上記のようなキメラの遺伝子コンストラクトまたはベクターを含む組換え細胞はもちろん、さらに、上記のようなキメラの遺伝子コンストラクトを含むベクターも含む。ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、人工染色体などである。代表的な例には、商業的に購入できるプラスミド、特にpUC、pcDNA、pBRなどに由来するプラスミドが挙げられる。他の好ましいベクターが、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、バキュロウイルスまたはワクシニアウイルスなどのウイルスに由来する。ベクターの選択は、前記ベクターを使用するべき組換え宿主細胞に従って当業者が決定できる。これに関しては、哺乳動物細胞にトランスフェクションまたは感染させることができるベクターを用いるのが好ましい。実際、好ましい組換え宿主細胞は、哺乳動物細胞である。これは初代細胞、または確立した細胞系統でよい。代表例には、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞、免疫細胞など、およびそれらの祖先または前駆細胞が含まれる。最も好ましい哺乳動物細胞が、エキソソーム産生哺乳動物細胞である。これらには、例えば腫瘍細胞、樹状細胞、BおよびTリンパ球または肥満細胞が含まれる。
エキソソーム産生細胞には任意の、好ましくは哺乳動物起源の、後期エンドソーム多胞体が原形質膜と融合して生ずるエンドソーム起源の膜小胞を生成し分泌する細胞が含まれる(6)。様々なタイプの組織から得られた細胞、例えば樹状細胞、Bリンパ球、腫瘍細胞、Tリンパ球および肥満細胞などが、エキソソームを分泌することが示されている。治療目的で、または研究用具としてエキソソームを生成し、精製しまたは使用する方法が、例えばWO99/03499、WO00/44389、WO97/05900中に記載されており、参照によりここに取り入れる。本発明の好ましいエキソソーム産生細胞は、哺乳動物腫瘍細胞、哺乳動物BおよびTリンパ球、および哺乳動物樹状細胞であり、一般にはマウスまたはヒト起源のものである。これに関して、細胞は、好ましくは不死化した樹状細胞(WO94/28113)、未成熟樹状細、または腫瘍細胞(WO99/03499)である。さらに、抗体産生のためには、Bリンパ球をエキソソーム産生細胞として用いるのが有利である。何故ならば、その結果得られるエキソソームが、抗体産生を促進するMHCクラスII分子などの、補助的な機能および分子を含むからである。さらに、B細胞由来のエキソソームが、濾胞樹状細胞と結合できることが示された。これは抗体誘導のための、もう1つの重要な特徴である(14)。
抗原を、好ましくは上記のように調製した組換えエキソソームの形で、動物へ接種すると、抗体が生成される。あるいは、抗原をDNAの形で、または組換えタンパク質の形で投与してもよい。さらに別の可能性は、組換えエキソソーム産生細胞全体を投与することである。
本発明は、抗体レパートリーをスクリーニングする方法であって:1)標的抗原とマーカーを保持する追跡可能な組換えエキソソームを抗体レパートリーと接触させること、および2)抗原特異的な抗体を、抗原を保持するエキソソームを介した前記マーカーとの結合に基づき単離すること、を含む方法をここで開示する。抗体レパートリーの細胞ベースのライブラリー由来の所望の特異性を有する抗体を、組換えDNAとハイブリドーマを含む標準の抗体調製方法により調製することができる。この方法は、上記の抗体生成法に従って免疫化した動物からの抗体の調製に最も適している。
追跡可能な小胞は、上記のように合成のまたは自然の小胞であって、好ましくはエキソソームである。それらは標的抗原を表示し、また例えばタグ、ビオチン、酵素マーカーまたは蛍光団などを介して標準の免疫学的、生化学的、または物理化学的方法によって検出することができる。
1)エキソソーム産生細胞を、蛍光団結合脂質とインキュベーションすること;および、
2)前記蛍光団結合脂質を取り込んだ前記細胞からエキソソームを生成させ単離すること;
を含む方法に関する。
抗原特異的なモノクローナル抗体の単離を、抗体レパートリーのスクリーニングにより実行する。実行に際しては、抗体産生細胞により発現される細胞表面抗体を、上記のように調製した前記抗原およびマーカーを保持する追跡可能なエキソソームに接触させる。抗体産生細胞は、好ましくは一次のまたは不死化したBリンパ球である。不死化は、Bリンパ球をウイルスおよび癌遺伝子を含む形質転換物質により形質転換するか、または不死化された細胞と融合させてハイブリドーマを作ることにより達成される。抗体産生細胞はまた抗体、好ましくはヒト抗体を発現している原核または真核の組換え細胞のライブラリーでもよい。Bリンパ球は、免疫化した動物、好ましくはヒト免疫グロブリンを発現しているトランスジェニック動物に由来するものでよい。免疫化した動物は、上記の抗体生成のための本発明を用いて、または抗原を表示している組換えエキソソームとは異なる免疫原により調製できる。これらには、アジュバント中の精製された組換え抗原、ヌクレオチド・ベースの免疫原(裸のDNA、ウイルスDNA)および抗原を含む細胞または細胞分画などの、普通に用いられる抗原製剤が含まれる。
次に、上記のようにして単離された抗体産生細胞により産生された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の少なくとも可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、組換え抗体の全長または断片として産生させるために、発現ベクター中にクローニングすることができる。これを行うために、選択した1個またはプール(2個以上)の抗体産生細胞からRNAを抽出し、抗体をコードしているヌクレオチド配列を、標準のRT-PCR法により適当なプライマーを用いて増幅する。PCR産物を次に発現ベクター中にクローニングする。免疫グロブリンの可変ドメインのみを増幅するときは、クローニングは、好ましくはヒト由来の免疫グロブリンの適合するリーダー配列ならびに重鎖および軽鎖の定常ドメインの全長または一部を既に含む受入れベクターに行われる。次に組換え抗体またはその断片の生成が、適合する免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードするDNAプラスミドの混合物を細胞にトランスフェクションすることにより実行される。あるいは、両鎖を、2つの遺伝子転写物を同時に発現できる独特のプラスミド中にクローニングしてもよい。重鎖および軽鎖のPCR産物が2個以上の抗体産生細胞から得られるときには、重鎖および軽鎖DNAプラスミドの種々の組合せのマトリックスができるため、適切な抗原特異性を有する免疫グロブリンを再構成することができる。組換え抗体を発現させるための受容細胞は、CHO、293または骨髄細胞系統などの、組換えタンパク質を生成できる任意の細胞系統でよい。組換え免疫グロブリンの発現を、ELISAなどの標準的方法によって測定することができる。組換え免疫グロブリンの抗原特異性もまた、標的抗原の性質と利用可能性に従う標準の免疫学的方法により確認される。例えば、ELIZAを上記の抗原を発現している組換えエキソソームを用いて実施することができる。抗体配列をさらに組換えDNA技術により操作して、標的抗原に対する抗体の親和性を増すことや(抗体熟成として知られる過程)、医療適用のために抗体をヒト化することもできる。
1)前記リーダー配列、II型制限酵素により認識される2つの制限部位を備え、制限酵素切断後に制限部位が前記ベクターから除去されるように構成されたクローニングカセット、および前記定常ドメイン、を順番に含むベクターを提供すること;
2)前記可変配列を提供すること;
3)前記ベクターを前記制限酵素とインキュベーションすること;
4)前記可変配列と工程3で得られた前記ベクターをライゲーションすること;
5)前記リーダー配列と前記定常配列の間に前記可変配列を含む前記ベクターを単離すること;
を含む方法に関する。
1)II型制限酵素により認識される2つの制限部位を備え、制限酵素切断後に制限部位が前記ベクターから除去されるように構成されたクローニングカセットを提供すること;
2)適合する末端を有する前記配列を提供すること;
3)前記ベクターを前記制限酵素とインキュベートすること;
4)前記配列と工程3で得られた前記ベクターをライゲーションすること;
5)前記配列を含む前記ベクターを単離すること;
を含む方法に関する。
抗ラクトアドヘリン抗体が、ヒトラクトアドヘリンで覆われたマウスエキソソームを用いて免疫化したマウスの血清中で検出され、一方ヒトラクトアドヘリンを単独で、またはフロイントアジュバント中の乳濁液として与えた場合は、抗体応答が生成されなかった。フロイントアジュバントを用いた場合は、4回の接種材料注入後でさえも抗体が検出されなかったが、一方でラクトアドヘリンを保持するエキソソームを与えられたマウスの血清中の抗体力価は、以降の注入により増加した(データを示さず)。
抗原を保持するエキソソームは、アジュバント無しで高度に免疫原性であり、極めて少量であってフロイントアジュバントなどの古くから知られた強力なアジュバントでは効果がない程度の量の抗原を用いて、抗体応答を誘導することができる。したがって、抗原を表示している組換えエキソソームは、前記抗原に対する抗体を生成するための強力な手段である。
図2が、抗−HA抗体が、HApcDNA3.1/SSTR2をトランスフェクションされたEL4およびB3Zの両方の表面において、HAタグを含む組換えタンパク質を特異的に検出したが、一方でこの抗体は親のEL4およびB3Z細胞には結合しなかったことを明らかにしている。HA-タグを含むタンパク質はまたウエスタンブロットによって、安定にトランスフェクションされたEL-4細胞由来のエキソソーム中に検出することができた(図3A、レーン1)。これは、エキソソー指向ドメインとの融合を必要とせずに、組換えSSTR2がエキソソーム上に発現され得ることを裏付けている。対照的に、同じ分析によって、安定にトランスフェクションされたB3Z細胞由来のエキソソーム中にHA-SSTR2を検出することができなかった(図3A,レーン2)。両細胞系統によってエキソソームが生成されることが、エキソソームの恒常的成分であるアクチンに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析によって証明された(図3B、レーン1および2)。類似の結果が、細胞上とエキソソーム上のHA-SSTR2発現を検出するために、抗−SSTR2抗体を用いた時にも得られた(データを示さず)。
自然にはエキソソームに存在しないGPCRを含む膜貫通タンパク質を、膜タンパク質をコードするDNAで細胞がトランスフェクションされた後にエキソソーム上に検出できる。この現象は、膜貫通タンパク質配列のエキソソームを標的とする配列との融合を必要とせず、受容細胞に依存するように見える。これは組換え膜貫通タンパク質の過剰発現による可能性があり、過剰のレセプターの分泌の別の経路として働く可能性がある。トランスフェクションされた細胞によって産生される組換えタンパク質のわずかな一部が、エキソソーム上に発現され、大部分のタンパク質が細胞表面に向けられていることに注意すべきである。それにも関わらず、この方法が、検出できる量の全長のレセプターをエキソソーム上に発現させ、したがって、そうでなければエキソソーム上に見出されない膜貫通タンパク質をエキソソームに表示させるために、または既知のエキソソーム膜貫通タンパク質をさらに豊富にするために、この方法を利用することができる。
293細胞を、HLA-A2をコードしているプラスミドでトランスフェクションした結果、トランスフェクションされた細胞が生成したエキソソームに組換えA2が発現した(図6)。期待通りに、親の293由来のエキソソームもまた、293がヒトHLA-A2+細胞系統であるので、内在性のHLA-A2を含んでいた。しかし、正規化した試料を用いた分析が、組換えエキソソームが、親のエキソソームに比べて〜5倍多くHLA-A2を含んでいたことを示す。対照的に、組換え293細胞によるβ2Mの全発現は有意に増加したけれども(データを示さず)、β2Mの量は、親のエキソソームと組換えエキソソームで同程度であった。MHCクラスI複合体のβ鎖は可溶性タンパク質であるため、そのエキソソームへの結合は、そのα鎖との相互作用のみに仲介される。したがって、われわれの結果は、エキソソーム上のαβ鎖複合体の総量は一定のままであるが、α鎖のサブタイプは組換えHLA-A2サブタイプの方へシフトするということを示唆している。図7に示すように、A2特異的標準ペプチドを組換えエキソソーム上には検出できたが、親のエキソソームを用いた場合は、測定値はバックグラウンドよりわずかに上に過ぎなかった。この定量におけるペプチド検出のバックグラウンドレベルを、A2-のドナー由来のDCが生成するエキソソームを用いて測定した(図7の、A2陰性Dex)。このデータは、直接ロード法を用いて組換えHLA-A2にA2特異的ペプチドを負荷できることを示している。
エキソソーム産生細胞にMHCクラスIをコードするプラスミドをトランスフェクションすると、組換えMHCクラスI分子がエキソソームに発現される。この方法が、独特のMHCクラスIサブタイプを保持するエキソソームの調製を可能にする。直接ロード法と組み合わせることにより、それが、サブタイプ特異的なMHCクラスI/ペプチド複合体が豊富なエキソソームを生成する強力な手段を提供する。これらのエキソソームは、特異的なMHCクラスI/ペプチド複合体に限定された抗体を調製するための有力な媒体である。
組換えエキソソームのウエスタンブロット分析が、293細胞をpcDNA6-CD40LおよびpcDNA6-mutCD40Lでトランスフェクションすると、CD40Lがエキソソームに発現されたことを明らかにした(図8)。CD40Lを発現している293細胞由来のエキソソームは、全長のCD40L(レーン2のFL)を、CD40Lの可溶性型(レーン2のSF)およびCD40Lの膜貫通ドメインを含む残存N端末端部(レーン2のTM)から成るそのタンパク切断質分解産物と共に、含んでいた。対照的に、mutCD50Lを発現している293細胞由来のエキソソームは、全長型(レーン3のFL)のみを含んでいた。親の293細胞由来のエキソソームでは、タンパク質が検出されなかった(レーン1)。
CD40Lが、他の膜貫通タンパク質(実施例2および3)と同様に、トランスフェクションされた細胞の過剰発現に続いて、エキソソームを標的とするドメインへの融合の必要なく、エキソソーム上に発現される。CD40Lを発現している組換えエキソソームはまた、CD40L活性を示す。したがって、本発明を、エキソソームの免疫能力を増強するために使用できる。CD40Lのタンパク質分解切断部位の突然変異が、エキソソームの免疫能力をさらに増大させる結果になった。この性質の可能な説明は、エキソソーム上の野生型CD40Lは、CD40Lの残りの膜貫通ドメインはもちろん、全長のCD40Lと可溶性型のCD40Lの混合物から成り、これが機能的なCD40Lの3量体の効果的な形成を妨げている可能性がある、ということである。このようにして、CD40Lが断片に切断されることを妨げると、その結果、より高度な特異的活性を示す強化エキソソームが生成されることになる。これが、組換えエキソソームを用いるワクチンおよび他の研究への応用に必要である。何故なら、エキソソーム注入のすぐ後で循環しているタンパク質分解酵素がCD40Lを切断して、エキソソームを不活性化する可能性があるからである。
蛍光が、pcDNA6-LS-GFP-Cl/C2-Myc/Hisをトランスフェクションした細胞由来のエキソソームで検出された一方で、バックグラウンドレベルがpcDNA6-LS-GFP-Myc/Hisをトランスフェクションした細胞が産生したエキソソームで測定された(図10)。ウエスタンブロット分析が、予想通り後者が、可溶性タンパク質として培養上清液に放出される組換えGFPを産生することを明らかにした(データは示さず)。
これらのデータがさらに、可溶性タンパク質をコードする配列をエキソソームターゲティングドメインに融合させると、タンパク質がエキソソーム上に発現することを確認する。エキソソームに結びついたGFPの発現を、抗原特異的抗体産生細胞の選別を含む様々な応用ができる、追跡可能な手段を調製するために使用できる(下の実施例7参照)。
Rh-DOPE脂質にさらした細胞によるエキソソーム産生(図11のRh/Exo)が、強い蛍光性のエキソソームをもたらした。対照的に、エキソソームを直接蛍光脂質とインキュベートした場合(図11のExo+Rh)、またはエキソソームが蛍光脂質無しで生成された場合(図11のExo)にはバックグラウンドレベルに近く低い蛍光が検出された。測定した蛍光は、直接エキソソームに結合していた。なぜなら、Rh-DOPEを含む培地のみをウエルに加えた定量(図11のRh)においては、バックグラウンド蛍光のみが検出されたからである。1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(カルボキシフルオレセイン)(Fl-DOPE)などの、他の蛍光脂質にさらした細胞によるエキソソーム産生もまた、強い蛍光性のエキソソームをもたらした(データを示さず)。
ここに記載した方法が、追跡可能なエキソソームの産生をもたらす。これらのエキソソームに結合した蛍光の強度は、蛍光脂質により直接にラベルされたエキソソームの強度より、はるかに上である。それらを利用することにより、多くの研究とスクリーニングへの応用において、増大した感度で読み取りができることになるはずである。蛍光脂質を含む追跡可能なエキソソームは、例えば、抗原特異的な抗体産生細胞を選別単離するための極めて強力な手段である(下の実施例7参照)。
免疫化された細胞由来のPLNC集団中のGFP陽性細胞の百分率が、細胞をGFP/CCR7-293エキソソームとインキュベートしたときは、対照のGFP-293エキソソームとインキュベートしたときよりも、有意に高かった(図12、パネルA:0.13%陽性細胞 対 パネルB:0.36%陽性細胞)。この百分率は低いが、類似の傾向が、CXCR4、CCR5、およびSSTR2などの他のGPCRを発現しているエキソソームにより免疫化したマウスから得られたPLNCと適合する追跡可能な組換えエキソソームを用いた場合に観察された(データを示さず)。
追跡可能なエキソソームは、抗原特異的抗体産生細胞を同定する便利な手段である。FACS分析と選別を組み合わせると、応答する細胞の頻度が極めて低い場合にさえも、所定の抗原特異性を有する個々の細胞を単離することができるに違いない。
マウスのA2/MART1エキソソームで免疫化した側由来の、左のPLNC集団中のGFT-陽性細胞の百分率が、細胞をGFP/A2/MART1-293エキソソームとインキュベートした時には、GFP/A2-293エキソソームとインキュベートした時よりも有意に高かった(図13、パネルA:0.83%陽性細胞 対 パネルB:0.33%陽性細胞)。対照的に、右のPLNCについて、GFP/A2/MART1-293およびGFP/A2-293とのインキュベートを比較したときには、有意な差は検出されなかった(図13、パネルC:0.49%陽性細胞 対 パネルD:0.39%陽性細胞)。
ここで述べた追跡可能なエキソソームを用いる減算的方法は、エピトープ特異的な抗体産生細胞を同定するための強力な手法である。FACS分析および選別と組み合わせると、所定のエピトープ特異性を有する個々の細胞の単離同定を可能にする。減算的選別は、例えば、MHC/ペプチド複合体と反応する制限抗体を産生するB細胞の単離に適切である。
2回のPCRにより、いくつかの単一細胞cDNAに由来する検出可能な量のPCR産物が生成された(図14, レーン 2、5、6、8、および13)。これらのPCR産物の配列決定により、PCR産物が免疫グロブリンの可変ドメインをコードすることが確認された。いくつかの可能性により、図14の空白のレーンにPCR産物を欠くことを説明できる。1つの可能性が、PCRのサイクリング条件およびここで用いたプライマー対が、元のウエルの単一細胞により発現される免疫グロブリンの可変配列を効率的に増幅するために最適ではないことである。実際、各可変ドメインが独特で、増幅のために異なるPCR条件を必要とする可能性がある。他のプライマーの組み合わせおよびサイクリング条件を、最適の結果を得るために、各cDNAに試すのがよい。元のウエルに選別した細胞が、非B細胞または休止B細胞であったという別の可能性がある。追跡可能なエキソソームとPLNCとの非特異的な相互作用(実施例7と8のバックグラウンド染色を参照のこと)のために選別されたこれらの細胞は、RT-PCRによって検出するための免疫グロブリンをコードするRNAを含んでいないか、低すぎるレベルしか含んでいない。このことは、ここで提案する免疫グロブリンの可変ドメインを取り出すための方法の感度によって、非抗体産生細胞からのcDNAのさらなる持ち越しが回避できる可能性があることを際立たせる。
追跡可能なエキソソームと抗原特異的態様で相互作用できる能力に基づいて単離された単一細胞から得られた免疫グロブリンの可変配列を、古典的PT-PCRにより首尾よく取り出すことができる。次にPCR産物を、下の実施例10に記載する通り、発現ベクターにクローニングできる。
組換え免疫グロブリンが、トランスフェクションされたCHO細胞の上清に首尾よく検出された(図15)。さらに、抗体の軽鎖と重鎖の両方をコードする発現ベクターをトランスフェクションした場合の方が、各鎖を別々にコードするプラスミドを共にトランスフェクションした場合より優れていた。
ここで述べた、全長の免疫グロブリンをコードするプラスミドを構成するためのクローニング戦略が、産生される抗体の可変ドメイン中に挿入または突然変異を導入することなく、大量の組換え免疫グロブリンを産生する発現ベクターをもたらす。全体として、実施例7〜10によって、所定の特異性を有する抗体を産生する個々の細胞に由来する抗体配列を、本発明に記載された方法を用いて取り出し、クローニングし、そして組換えタンパク質として発現させることができることが、裏付けられる。次に、産生された組換え抗体の抗原特異性を結合実験により、好ましくは抗原源として組換えエキソソームを用いて評価できる。
ビオチン化エキソソームをAbTrap-細胞とインキュベートすると、これらの細胞に結合した蛍光はバックグラウンドのみであった(図16、パネル1)。対照的に、完全なAbTrapを有する場合は、〜25%の細胞が陽性であった(図16、パネル2)。
ここで設計した抗体トラップが、首尾よくハイブリドーマが分泌する抗体を捕獲した。これによって、FACSによるハイブリドーマの単離が可能となる。さらに、この結果は、ビオチン化エキソソームが、抗体産生細胞を抗原特異的な方法で単離するための、適切な追跡可能エキソソームであることを示している。
Claims (59)
- 選択した抗原に対して特異性を有する単一の抗体産生粒子を単離する方法であって:
1)選択した抗原およびマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
2)工程1の前記小胞を抗体レパートリーと接触させること;および
3)前記小胞と反応している単一の抗体産生粒子を同定および単離すること;
を含む方法。 - 前記抗体産生粒子が抗体産生細胞であり、前記抗体レパートリーが抗体産生細胞のレパートリーである、請求項1記載の方法。
- 前記抗体産生細胞がプラズマ細胞、ハイブリドーマ、またはリンパ球から成る群より選択される、請求項2記載の方法。
- 請求項2または3記載の方法であって:
1)抗体産生細胞を提供すること;
2)前記抗原およびマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
3)工程1のリンパ球を、工程2の小胞と懸濁すること;および
4)前記小胞と反応している単一の抗体産生細胞を同定および単離すること;
を含む方法。 - 前記抗体産生細胞が、前記抗原により免疫化されたヒト以外の動物から収集したリンパ球である、請求項4記載の方法。
- 請求項4記載の方法であって、前記抗体産生細胞が抗体分泌細胞であり、さらに、抗体分泌細胞を小胞と懸濁する工程の前に、抗体分泌細胞を、遍在する細胞表面マーカーに対する第1のビオチン化抗体、ストレプトアビジンおよび前記抗体分泌細胞の免疫グロブリンに向けられた第2のビオチン化抗体とインキュベーションする工程を含む方法。
- 請求項5記載の方法であって:
1)少なくとも1つの抗原またはそのエピト−プを表示している免疫原性の小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
2)ヒト以外の動物を前記免疫原性小胞で免疫化することにより、抗体反応を生起させること;
3)免疫化した動物からリンパ球を収集すること;
4)工程1の前記抗原またはそのエピトープおよびマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
5)工程3のリンパ球を工程4の小胞と懸濁すること;および、
6)工程4の小胞と反応している単一の抗体産生細胞を同定および単離すること;
を含む方法。 - 変異抗原に特異的な単一抗体を産生している粒子を抗体レパートリーから単離する方法であって:
1)前記変異抗原およびマーカーを表示している第1集団の小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
2)自然抗原を表示し、前記マーカーを表示していない第2集団の小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
3)前記抗体レパートリーを第1および第2集団の小胞と、第2集団を過剰にして、懸濁すること;および、
4)工程1の小胞と反応している単一の抗体産生粒子を同定および単離すること;
を含む方法。 - 請求項8記載の方法であって:
1)前記変異抗原によって免疫化されたヒト以外の動物からリンパ球を収集すること;
2)動物の免疫化に用いた前記変異抗原およびマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
3)自然抗原を表示し、前記マーカーを表示していない小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
4)工程1のリンパ球を、工程2の前記変異抗原およびマーカーを表示している小胞ならびに工程3の前記自然抗原を表示している過剰量の小胞と共に懸濁すること;および、
5)工程2の小胞と反応している単一の抗体産生細胞を同定および単離すること;
を含む方法。 - 請求項9の方法であって:
1)変異抗原を表示している免疫原性の小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
2)ヒト以外の動物を前記免疫原性小胞で免疫化すことにより抗体反応を生起させること;
3)免疫化した動物からリンパ球を収集すること;
4)工程1の前記変異抗原およびマーカーを表示している小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
5)自然抗原を表示し前記マーカーを表示していない小胞、好ましくはエキソソームを調製すること;
6)工程3のリンパ球を、工程4の前記変異抗原およびマーカーを表示している小胞、ならびに工程5の前記自然抗原を表示している過剰量の小胞と懸濁すること;および
7)工程4の小胞と反応している、抗原変異体に特異的な単一抗体を産生している細胞を同定および単離すること;
を含む方法。 - 前記抗体産生粒子が抗体を産生しているファージまたは酵母であり、前記抗体レパートリーが抗体を産生するファージまたは酵母のレパートリーである、請求項1または8記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載の方法であって、前記方法がさらに次の工程:
a)前記の選択された抗体産生粒子からDNAまたはRNAを回収すること、b)免疫グロブリン配列またはその一部をコードする核酸配列を増幅すること、c)増幅した核酸配列を発現ベクターへクローニングして、所望の抗原特異性を有するタンパク質を産生すること、を含む方法。 - 前記免疫原性小胞がさらにアジュバントポリペプチドなどの免疫アクセサリー分子を表示する、請求項7または10のいずれかに記載の方法。
- 前記アジュバントポリペプチドが、GM-CSF、IL-2およびCD40Lなどのサイトカインから、特に突然変異CD40Lから選択され、前記突然変異が可溶性CD40Lの切断と放出を阻害する、請求項13記載の方法。
- 前記免疫アクセサリー分子がエキソソームターゲティングポリペプチドに融合または架橋している、請求項13記載の方法。
- 前記免疫アクセサリー分子が少なくとも1つの膜貫通ドメインを有し、エキソソーム産生細胞中への過剰発現により免疫原性小胞に取り込まれる、請求項13記載の方法。
- 前記変異抗原が突然変異抗原であり、前記自然抗原が野生型抗原である、請求項8〜10のいずれか1項記載の方法。
- 前記変異抗原が、ポリペプチド、脂質、DNA、または小分子から成る群より選択される分子と接触している抗原であり、前記自然抗原がフリーの抗原である、請求項8〜10のいずれか1項記載の方法。
- 前記変異抗原がMHC/ペプチド複合体であり、前記自然抗原が負荷されていないMHCであるかまたは別のペプチドを負荷されているMHCである、請求項18記載の方法。
- 前記変異抗原がリガンド-レセプター複合体であり、前記自然抗原がフリーのリガンドまたはフリーのレセプターである、請求項19記載の方法。
- 前記変異抗原および前記自然抗原が、酵素を含む任意の異なる立体構造状態のタンパク質である、請求項8〜10のいずれか1項記載の方法。
- 前記小胞により表示されている前記抗原がエキソソームターゲティングポリペプチドに融合している、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 前記小胞によって表示されている前記抗原がエキソソームターゲティングポリペプチドに架橋されている、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 前記マーカーが、タグ、ビオチン、酵素、蛍光分子などの検出可能な分子である、請求項1〜23のいずれか1項記載の方法。
- 前記マーカーがエキソソームターゲティングポリペプチドに融合または架橋されている、請求項24記載の方法。
- 前記マーカーが、エキソソーム産生細胞中への過剰発現により免疫原性小胞に取り込まれる膜貫通ドメインを有している、請求項24記載の方法。
- 前記マーカーが優先的に小胞へ、好ましくはエキソソームへ取り込まれるラベルされた脂質である、請求項24記載の方法。
- 前記ラベルされた脂質がRh-DOPEまたはフルオレセイン-DOPEなどの蛍光団結合脂質である、請求項27記載の方法。
- 前記抗原が少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するポリペプチドであり、前記抗原がエキソソーム産生細胞中に過剰発現され、それにより前記抗原を表示している前記小胞を生成することができる、請求項1〜21のいずれか1項記載の方法。
- 少なくとも1つの膜貫通ドメインを有する前記ポリペプチドがレセプターである、請求項29記載の方法。
- 前記レセプターがGPCR(Gタンパク質共役レセプター)である、請求項30記載の方法。
- 前記抗原が、例えばレセプターまたは酵素などの任意のタンパク質、あるいは糖脂質、多糖類、薬物および有機化学物質などのポリペプチド以外の化合物である、請求項1〜31のいずれか1項記載の方法。
- 前記エキソソームターゲティングポリペプチドが、ラクトアドヘリンあるいは機能的なC1および/またはC2ドメインを含有するその一部を含む、請求項15、22、23または25のいずれか1項記載の方法。
- 前記ラクトアドヘリンまたはその一部が、ヒト以外の哺乳動物のラクトアドヘリンまたはその一部である、請求項33記載の方法。
- 前記ヒト以外の哺乳動物のラクトアドヘリンまたはその一部が、(i)マウスラクトアドヘリン、(ii)機能的なC1および/またはC2ドメインを含有するマウスラクトアドヘリンの断片、および(iii)(i)または(ii)のポリペプチドと少なくとも50%の一次構造同一性を有するポリペプチド、から選択される、請求項34記載の方法。
- 前記ラクトアドヘリンが、配列番号1を含むアミノ酸配列あるいは機能的なC1および/またはC2ドメインを含有するその断片を有する、請求項35記載の方法。
- 前記ラクトアドヘリンが、配列番号1の機能的C1/C2ドメインを含むアミノ酸配列を有する、請求項36記載の方法。
- 前記ラクトアドヘリンが、配列番号1のアミノ酸残基111〜266、109〜266、271〜426、111〜426、または109〜426を含むアミノ酸配列を有する、請求項36記載の方法。
- 前記エキソソームターゲティングポリペプチドが、Del-1、ニューロピリン-1、凝固因子5または凝固因子8の機能的なC1および/またはC2ドメインを含む、請求項15、22、23,または25のいずれか1項記載の方法。
- 前記変異抗原がHLA-C/HIVペプチド複合体であり、前記自然抗原が負荷されていないHLA-Cまたは異なるペプチドを負荷されたHLA-Cである、請求項19記載の方法。
- 請求項1〜39のいずれか1項記載の方法により得られる抗体産生細胞。
- 請求項41記載の抗体産生細胞により産生される抗体。
- 請求項41記載の抗体産生細胞および/または請求項42記載の抗体および薬学的に許容できる賦形剤または担体を含む組成物。
- 少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するポリペプチドをエキソソームの表面に発現させる方法であって:
1)前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するその一部をコードする遺伝子コンストラクトを提供すること;
2)エキソソーム産生細胞中に前記コンストラクトを導入し、前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するその一部を過剰発現させて、組換えエキソソームを生成すること;および、
3)前記遺伝子コンストラクトによってコードされるポリペプチドを表面に担持する前記組換えエキソソームを収集すること;
を含む方法。 - 少なくとも1つの膜貫通ドメインを有する前記ポリペプチドがCD40Lである、請求項44記載の方法。
- 前記CD40Lが突然変異CD40Lであって、前記突然変異が可溶性CD40Lの切断と放出を阻害する、請求項45記載の方法。
- 少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するポリペプチドまたはそのエピトープを結合する抗体を産生する方法であって:
1)前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するその一部をコードする遺伝子コンストラクトを提供すること;
2)エキソソーム産生細胞中に前記コンストラクトを導入し、前記ポリペプチドまたは少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するその一部を過剰発現させて、表面に前記ポリペプチドまたはエピトープを提示している組換えエキソソームを生成すること;
3)前記組換えエキソソームを収集し、前記エキソソームまたはその一部をヒト以外の哺乳動物に注入して、前記ポリペプチドまたはエピトープを結合する抗体を生成すること;および、
4)前記哺乳動物から抗体または抗体産生細胞を収集すること;
を含む方法。 - 前記エキソソームがさらに突然変異CD40Lを表示し、前記突然変異が可溶性CD40Lの切断と放出を阻害する、請求項47記載の方法。
- 前記少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するポリペプチドがレセプターである、請求項44または47記載の方法。
- 前記レセプターがGPCR(Gタンパク質共役レセプター)である、請求項49記載の方法。
- 少なくとも1つの膜貫通ドメインを有する抗原、または少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するその一部を、対象に送達する方法であって:
a)前記抗原または少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するその一部をコードする遺伝子コンストラクトを提供すること;
b)エキソソーム産生細胞中に前記コンストラクトを導入し、前記抗原または少なくとも1つの膜貫通ドメインを有するその一部を過剰発現させて、前記抗原または前記その一部を表面に提示している組換えエキソソームを生成すること:
c)前記組換えエキソソームを収集し、前記エキソソームまたはその一部を前記対象に注入すること;
を含む方法。 - 少なくとも1つの膜貫通ドメインを有する特異的な抗原、または少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部に対して、対象中に免疫応答を引き起こす方法であって、:
a)前記抗原または少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部をコードする遺伝子コンストラクトを提供すること;
b)エキソソーム産生細胞中に前記コンストラクトを導入し、前記抗原または少なくとも1つの膜貫通ドメインを含むその一部を過剰発現させて、前記抗原または前記その一部を表面に提示している組換えエキソソームを生成すること;
c)前記組換えエキソソームを収集し、前記エキソソームまたはその一部を、前記対象に注入すること;
を含む方法。 - 前記抗原がレセプターである、請求項51または52に記載の方法。
- 前記レセプターがGPCR(Gタンパク質共役レセプター)である、請求項53記載の方法。
- 追跡可能なエキソソームを調製する方法であって、次の工程:
1)エキソソーム産生細胞を蛍光団結合脂質とインキュベーションすること;および、
2)前記蛍光団結合脂質を取り込んだ前記細胞からエキソソームを産成し単離すること;
を含む方法。 - 前記蛍光団結合脂質が蛍光団結合DOPE(ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン)である、請求項55記載の方法。
- 前記蛍光団結合DOPEがRh-DOPEまたはフルオレセイン-DOPEである、請求項56記載の方法。
- クローニング部位に突然変異を導入することなく、配列をベクター中にクローニングする方法であって、次の工程:
1)II型制限酵素により認識される2つの制限部位を備え、制限酵素切断後に制限部位が前記ベクターから除去されるように構成されたクローニングカセットを含むベクターを提供すること;
2)前記配列に、互換性のある末端を与えること;
3)前記ベクターを前記制限酵素とインキュベーションすること;
4)前記配列と工程3で得られた前記ベクターをライゲーションすること;
5)前記配列を含む前記ベクターを単離すること;
を含む方法。 - 前記配列が免疫グロブリンの可変配列であり、前記ベクターの前記クローニングカセットが、その一端を免疫グロブリンのリーダー配列に、他端を定常ドメインに接している請求項58記載の方法。
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