CN107810416A - 用于检测生物标志物的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

讨论了用于检测样品中的生物标志物的装置和用于检测这类生物标志物的方法。生物标志物可以与特定疾病诸如乳腺癌或另外的健康状况有关。装置可包括盘，所述盘包括在盘的径向延伸的多个微流体通道，所述微流体通道预先装载有对至少一种生物标志物特异性的多种捕获分子。方法可包括将流体样品引入到盘的至少一个微流体通道中；转动盘以便所述流体样品经至少一个微流体通道径向向外流动，从而与对至少一种生物标志物特异性的捕获分子结合；和检测来自盘的、指示所述流体样品中包含的所述至少一种生物标志物的存在的信号。

Description

用于检测生物标志物的装置和方法
本申请要求美国临时申请号62/157,878(2015年5月6日提交)、美国临时申请号62/183,294(2015年6月23日提交)和美国临时申请号62/202,353(2015年8月7日提交)的优先权的益处，每一篇申请通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开一般涉及与健康状况有关的生物标志物的检测,以例如帮助医学筛查和/或诊断。
背景技术
生物标志物可以是潜在的医学状况的有用指标。然而，疾病可牵涉许多生物化学种类和反应。例如，乳腺癌是一种复杂的疾病，其可以有多种途径来产生患者的具有类似症状的相同疾病分期。虽然研究人员已经寻找到新的生物标志物，但筛查各种疾病的能力仍然有限。已经报道了癌症抗原125(CA 125)和癌胚抗原(CEA)分别作为卵巢癌和结直肠癌的生物标志物，而对于乳腺癌仍待鉴定单一的生物标志物。过去十年的研究集中在发现新的生物标志物，以提供疾病的准确诊断、指导治疗决策制定和预测未来的疾病模式。然而，一些疾病如乳腺癌可能不是单一的疾病，而是一组遗传异质性疾病。对于这样的情况，可能难以或不可能用单一的生物标志物进行诊断。
发明概述
本公开包括包含盘的装置，所述盘包括在所述盘的径向延伸的多个微流体通道，所述微流体通道包括对至少一种生物标志物特异性的多种捕获分子，其中所述多种捕获分子中的每一个捕获分子与粒子连接。所述盘可包括，例如1至100个微流体通道，诸如12至60个微流体通道。在一些方面，所述多个微流体通道可包括含有对第一生物标志物特异性的多个第一捕获分子的第一通道和含有对不同于所述第一生物标志物的第二生物标志物特异性的多个第二捕获分子的第二通道。进一步地，例如，所述多个微流体通道可包括第一微流体通道，其含有对第一生物标志物特异性的第一集合的捕获分子；第二微流体通道，其含有对不同于所述第一生物标志物的第二生物标志物特异性的第二集合的捕获分子；和第三微流体通道，其含有对不同于所述第一生物标志物和所述第二生物标志物中的每一种的第三生物标志物特异性的第三集合的捕获分子。另外或可选地，所述盘可包括至少一个样品入口，其被配置成将原始样品分成一种或更多种组分，诸如例如，从全血分离血浆。
根据本公开的一些方面，每一个捕获分子可与微珠连接，所述微珠的平均直径范围为100nm至10μm，诸如例如，平均直径为大约1μm。所述多种捕获分子中的每一个捕获分子可包含例如对至少一种生物标志物特异性的抗体。在至少一个实施例中，每一个捕获分子可包含仅对一种生物标志物特异性的抗体。在一些方面，所述多种捕获分子可包括对选自以下的生物标志物特异性的捕获分子：人雌激素受体2(Her-2)、基质金属肽酶-2(MMP-2)、癌症抗原15-3(CA 15-3)、血管内皮生长因子(VEGF)或骨桥蛋白(OPN)。例如，所述多种捕获分子可包括对Her-2、MMP-2、CA 15-3和OPN特异性的捕获分子。在一些方面，所述多种捕获分子可包括对选自以下的生物标志物特异性的捕获分子：人雌激素受体2(Her-2)、基质金属肽酶-2(MMP-2)、癌症抗原15-3(CA 15-3)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、肿瘤蛋白p53(p53)、癌症抗原125(CA 125)、癌胚抗原(CEA)或血清雌激素受体(SER)。例如，所述多种捕获分子可包括选自以下的至少一种抗体：抗体克隆191924、抗体克隆36006.211、抗体克隆M8071022或抗体克隆190312。所述多种捕获分子可包括被封阻剂阻断的至少一种捕获分子或多种捕获分子。
根据本公开的一些方面，所述多个微流体通道可包括多种检测分子，每个检测分子包含可检测标记。在一些实施例中，所述装置还可包括电源和/或检测器，用于例如检测至少一种生物标志物。例如，所述检测可被配置成检测荧光和/或化学发光。
本公开进一步包括使用具有上述特征的任意组合的装置检测生物标志物的方法。所述方法可包括，例如将流体样品引入到所述盘的至少一个微流体通道中；转动盘，以便所述流体样品经所述至少一个微流体通道径向向外流动，从而与所述多种捕获分子中的至少一个捕获分子结合；和检测来自所述盘的、指示所述流体样品的至少一种生物标志物的存在的信号。所述流体样品可包括与健康状况有关的多种生物标志物。在至少一些实施例中，所述健康状况可以是癌症例如乳腺癌。
根据本公开的一些方面，被引入到所述盘的所述微流体通道(一个或多个)中的所述流体样品可包括选自以下的至少一种生物标志物：人雌激素受体2(Her-2)、基质金属肽酶-2(MMP-2)、癌症抗原15-3(CA 15-3)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、肿瘤蛋白p53(p53)、癌症抗原125(CA 125)、癌胚抗原(CEA)或血清雌激素受体(SER)。例如，所述多种捕获分子可包括对与乳腺癌有关的生物标志物特异性的捕获分子，诸如例如，对选自以下的至少一种生物标志物特异性的捕获分子：人雌激素受体2(Her-2)、基质金属肽酶-2(MMP-2)、癌症抗原15-3(CA 15-3)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、肿瘤蛋白p53(p53)、癌症抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)或血清雌激素受体(SER)。
在一些方面，所述流体样品可包括血液或可从血液获得。例如，所述流体样品可包括人血液、人血浆或人血清。在本公开的一些示例性方法中，检测来自盘的所述信号可包括检测与所述流体样品中的所述至少一种生物标志物连接的检测分子的荧光信号。另外或可选地，检测来自盘的所述信号可包括检测化学发光。进一步地，例如，检测来自盘的所述信号可包括用光学读取器分析所述流体样品，以确定所述流体样品中所述至少一种生物标志物的存在或不存在。所述至少一种生物标志物的存在可指示疾病的医学诊断。例如，所述至少一种生物标志物可包括与乳腺癌有关的多种生物标志物。在一些方面，所述方法可包括比较从受试者获得的第一流体样品中所述多种生物标志物中的每种生物标志物的水平与从受试者获得的第二流体样品中所述多种生物标志物中的每种生物标志物的水平。所述第一流体样品和第二流体样品可在过去诸如一周或更多周或者一个月或更多个月的一段时间后从所述受试者获得。例如，在从受试者获得所述第二流体样品之前至少一周从所述受试者获得所述第一流体样品。所述生物标志物中的一种或更多种的水平的差异可指示疾病的医学诊断和/或指示疾病随着时间的进展。
附图说明
并入本文中并构成说明书一部分的附图阐释了各种示例性实施方案，并且，所述附图结合说明书用于解释公开的实施方案的原理。本文描述的实施方案(例如，组合物、医疗装置、治疗方法等)的任何特征可以与任何其它实施方案组合，并且包含在本公开中。
图1显示根据本公开的一些方面的示例性微流体盘。
图2显示根据本公开的一些方面的示例性微流体盘。
图3是示意图，其阐释根据本公开的一些方面的、与微珠连接的捕获分子。
图4是根据本公开的一些方面的、使用微流体盘的示例性测定的示意图。
图5显示根据本公开的一些方面的装置的示例性组件。
图6显示根据本公开的一些方面的装置的示例性容器。
图7是显示癌症抗原15-3(CA15-3)的荧光测量结果的图。
图8是显示基质金属肽酶-2(MMP-2)的荧光测量结果的图。
图9是显示人雌激素受体2(Her-2)的荧光测量结果的图。
图10是显示骨桥蛋白(OPN)的荧光测量结果的图。
图11是显示血管内皮生长因子(VEGF)的荧光测量结果的图。
发明详述
本公开的实施方案可通过提供多种相互补充的生物标志物用于敏感性诊断测定来满足对可替代筛查和诊断选择的需要。本公开的方面在筛查患者(包括大群体)的乳腺癌和其它疾病和健康状况方面可提供某些优势。
本公开包括使用多种生物标志物的组，以例如提高检测各种健康状况发作的概率。同时检测两种或更多种生物标志物的组可提供联合作用，其中预测值大于由单一生物标志物提供的预测值。在本文中，生物标志物的组可以用合适的分析平台测试。在一些情况下，可仅仅需要来自患者的少量样品，诸如例如，血液、血浆或其它合适的流体或组织样品。合适的装置的实例可包括但不限于：微流体装置，诸如Pandora CDx装置(POC医疗系统公司(POC Medical Systems))和其它微流体平台。图1和2显示根据本公开的一些方面以及下面讨论的示例性盘，所述盘包括微流体通道。在至少一个实施例中，用于乳腺癌的阵列包括适于在微流体装置上分析的多种生物标志物。
单数形式“一个/一种(a，an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另有说明。
术语“近似地(approximately)”和“大约(about)”指与参考数字或参考数值几乎相同。如本文使用的，术语“近似地”和“大约”通常应该被理解为包括指定数量或指定数值的±5％。
本公开的方面包括测试来自受试者的生物样品中与健康状况诸如疾病有关的一种或多种生物标志物。进一步地，根据一些方面，可分析关于各种生物标志物的存在或不存在的数据和关于样品中存在的每种生物标志物的量或水平的数据，以获得受试者的诊断信息。数据可允许确定诊断是正确的概率。
样品可获自或源自感兴趣的任何受试者，包括哺乳动物受试者，诸如例如人受试者，例如患者。哺乳动物受试者包括人类和非人哺乳动物两者。可根据本文所述的方法对其进行样品分析的示例性哺乳动物包括但不限于人类、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪类动物。
样品可包括生物来源的血液和/或其它液体样品、实体组织样品诸如活检样本、组织培养物、或从其衍生的细胞及其后代。样品可包括单细胞或比单细胞多，例如多个细胞。样品可包括临床样品、培养中的细胞、细胞上清液和/或细胞裂解物。在一些方面，样品可以是癌症来源的，例如获自癌组织。例如，样品可获自患癌的乳腺组织。
在一些方面，在从受试者获得样品后，所述样品可经一个或更多个程序或处理步骤被操作或处理。例如，样品可经一种或更多种试剂处理、溶解和/或针对某些组分被富集。样品的富集可包括，例如，浓缩样品的一种或更多种成分以帮助检测、分析和/或鉴别这些成分。在至少一个实施例中，在将样品暴露于捕获分子以结合和检测靶标(一个或多个)之前，可针对一种或更多种靶蛋白和/或多核苷酸富集样品。
术语“生物标志物”通常是指与一种或更多种健康状况有关的化学或生物化学指标。生物标志物可包括但不限于待被检测和/或分析的感兴趣的分子或感兴趣的分子的一部分。示例性生物标志物包括，例如肽、蛋白质、DNA序列和RNA序列。术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，来表示可包括化学修饰或可不包括化学修饰的任何长度氨基酸的聚合物。这样的聚合物可以是线性的或分支的、可包括修饰的氨基酸和/或可以被非氨基酸中断。氨基酸聚合物可被天然修饰或可通过干预被修饰。例如，根据本公开的氨基酸聚合物可通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰(诸如与标记组分缀合)而被修饰。氨基酸聚合物可包括多肽，所述多肽包含一个或更多个氨基酸(包括，例如非天然氨基酸)类似物以及本领域中已知的其它化学/生物化学修饰。
根据本公开的生物标志物包括遗传标志物，例如生物体的可用于鉴定该生物体特征的DNA序列。例如，相比与疾病或其它健康状况不相关的DNA序列，与疾病或其它健康状况有关的遗传标志物可包含DNA序列中的一个或更多个变化、变异和/或突变。生物标志物或生物标志物的组合可以与特定身体状况或健康状况(例如疾病或疾病状态)有关。例如，生物标志物(一种或多种)可以与乳腺癌(例如晚期乳腺癌)有关。
可根据本公开被检测和/或分析的生物标志物包括但不限于：人雌激素受体2(Her-2)、基质金属肽酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、癌症抗原15-3(CA 15-3)、癌症抗原125(CA 125)、癌症抗原27.29(CA27.29)、癌胚抗原(CEA)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤特异性生长因子(TSGF)、肿瘤特异性生长因子(TSGF)、骨桥蛋白(OPN)、肿瘤蛋白p53(p53)、血清雌激素受体(SER)、血清孕酮受体(SPR)、BRCA 1蛋白质、BRCA2蛋白质、前列腺特异性抗原(PSA)、肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、C-反应蛋白(CRP)、高半胱氨酸、肌红蛋白、肌酸激酶、促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲胎蛋白(AFP)、前梯度3(AGR3)、载脂蛋白A1(Apo-A1)、D-二聚体(DD)、皮离蛋白、高分子量激肽原(HMWK)、瘦蛋白、髓过氧化物酶(MPO)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、黏蛋白样癌相关抗原(MCA)、纤溶酶原活化因子抑制剂-1(PAI-1)、促乳素、可溶CD40配体(sCD40L)、可溶表皮生长因子受体(sEGFR)、可溶血管细胞粘附分子1(sVCAM-1)、可溶血管内皮生长因子受体1(sVEGFR1)、可溶血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2)、组织多肽抗原(TPA)、胸苷酸合成酶(TS)、尿激酶纤溶酶原活化因子(uPA)、维生素D结合蛋白(VDBP)和玻连蛋白(VN)。这些生物标志物可包括片段、剪接变体和/或全长肽或任意其它变异。应该理解，本公开不限于列出的生物标志物，而且本文的系统、装置和方法包括和考虑另外的生物标志物。
术语“捕获分子”通常是指可与靶标(例如，靶标分子，诸如生物标志物)结合的分子。例如，捕获分子可具有一个结合位点或两个或更多个的多个结合位点。根据本公开的捕获分子可能够结合至仅一个靶标(例如，捕获分子对于一个特定靶标是特异性的)、结合至选定数目的靶标(例如，捕获分子对于两个或更多个靶标是特异性的)或结合至多个靶标和非靶标种类。
在本公开的一些方面，生物标志物可与捕获分子结合。如果相比与可选的物质(例如，其它靶标或非靶标种类)的反应或结合，分子或其它化学种类/生物化学种类更频繁、更快速、以更久的持续时间和/或以更大的亲和力与一种或多种特定靶标反应或结合，则认为其展示“结合”。例如，如果相比捕获分子与其它物质的连接，该捕获分子以更大的亲和力(affinity)、亲合力(avidity)、更容易地和/或以更久的持续时间与靶标连接，则该捕获分子可与靶标“结合”。在至少一个实施例中，捕获分子可以是这样的抗体：相比该抗体与其它物质(例如，非靶标肽或蛋白质)的结合，所述抗体以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更久的持续时间特异性地或至少优先与靶标(例如，对抗体特异性的抗原)结合。特异性地或优先结合至第一靶标的捕获分子可以特异性地或优先结合至第二靶标或可以不这样做。在一些方面，例如捕获分子可结合至两个或更多个靶标，其中与每个靶标结合的性质可以是大约相同的或可以是不同的(例如，与一种靶标相比，捕获分子对于另一种靶标具有更大亲和力)。因此，“结合”并不一定要求(尽管其可包括)排它性结合。在一些方面，提及“结合”可指优先结合，例如，相比其它种类或物质优先与一种或更多种标靶反应或结合。“结合”的概念还应理解为包括特异性的概念，例如两个种类(例如，捕获分子和靶标)之间的选择性连接。特异性结合可被生物化学表征为饱和的(非特异性结合是非饱和的)。进一步地，根据本公开的一些方面，靶标可竞争结合捕获分子的一个或更多个特异性结合位点。竞争性结合可经生物化学手段证明。
捕获分子(一种或多种)可包括，例如一种或更多种抗体、肽、蛋白质或其组合。适于本公开的示例性捕获分子包括但不限于RNA、DNA、肽、抗体、适体和基于蛋白质的适体。在至少一个实施方案中，捕获分子是抗体。在本公开的一些方面，可使用封阻剂阻断捕获分子，所述封阻剂诸如例如，血清、在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释的血清和本领域中已知的其它封阻剂。
根据本公开的捕获分子可包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fe等)、嵌合抗体、单链可变片段(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白和/或包含具有需要的特异性的抗原识别位点的任何其它多肽(包括，例如抗体模拟物)。
“抗体”通常是指能够与至少一种靶标(例如，对抗体特异性的抗原)特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可具有至少一个抗原识别位点或抗原结合位点，所述抗原识别位点或抗原结合位点可位于抗体的可变区中。根据本公开的抗体通过抗体的至少一个抗原识别位点可能够特异性结合至靶标，诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽或其它靶标。抗体可以是小鼠、大鼠、兔子、鸡、人来源的或任何其它来源的，包括人源化抗体。捕获分子，诸如抗体，可经重组制备并使用合适的方法表达。进一步地，在一些方面，抗体可通过噬菌体展示技术经重组制备。表达和生产方法的实例可见于美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号和第6,265,150号；和Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12:433-455(1994)。本公开不限于任何具体的抗体源或制备抗体的方式。例如，抗体可由杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物或其它方法制备。
如本文使用的，术语“抗体”不仅包括完整的多克隆抗体和单克隆抗体，而且还包括其片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链可变片段(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白质和免疫球蛋白分子的包含具有需要的特异性的抗原识别位点的、任何其它修饰的结构。抗体可以是任何类别的抗体，包括但不限于IgG、IgA或IgM(包括其任何亚类)和不属于任何具体类别的抗体。根据抗体重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分为不同的类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的一些可以进一步被分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。每类免疫球蛋白均可具有独特的亚基结构和三维结构。
术语“Fv”通常是指包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。在双链Fv种类中，该区域可包含紧密非共价缔合的一个重链可变结构域(VH)和一个轻链可变结构域(VL)的二聚体。在单链Fv种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性多肽接头共价连结，以便轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的结构的二聚体结构缔合。在该结构中，每个可变结构域的三个互补决定区(CDR)可以相互作用，以在VH-VL二聚体的表面上提供抗原结合特异性。然而，在一些方面，单个可变结构域(或仅包含对抗原特异性的三个CDR的Fv的一半)可具有识别并结合抗原的能力，尽管与整个结合位点的亲和力相比，该单个可变结构域对抗原可具有较低的亲和力。
“单克隆抗体”通常是指同质性抗体群，单克隆抗体包含参与抗原的选择性结合的氨基酸。适于本公开的单克隆抗体包含天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。从它们通常针对单抗原位点(与多克隆抗体相反)的角度来讲，单克隆抗体群可以是至少部分特异性的或高度特异性的。本文涵盖的单克隆抗体包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体及其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白质和免疫球蛋白分子的包含具有结合至抗原的特异性和能力的抗原识别位点的、任何其它修饰的结构(参见上文对抗体的讨论)。
根据本公开的一些方面，捕获分子可以结合具有两个或更多个连续的(即，顺序的)氨基酸的肽表位。形成靶标表位的氨基酸(一个或多个)可以是线性的或分支的，并且可以包括经天然修饰或通过干预被修饰的一个或更多个氨基酸。例如，氨基酸可以通过二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰(诸如与标记组分缀合)而被修饰。在一些方面，形成靶标表位的氨基酸(一个或多个)可包括一个或更多个氨基酸的类似物(包括，例如非天然氨基酸)以及其它修饰。在一些方面，靶标是本文所述的蛋白质生物标志物。
在一些实施方案中，捕获分子可以以至少大约10-7M、至少10-8M或至少大约10-9M的结合反应的亲和力或以更紧密的结合来结合其同源靶标表位。在一些实施方案中，结合相互作用可通过至少两倍、至少五倍或至少10倍至至少100倍或更多的范围辨别反应中的偶然结合相互作用。
在本公开的一些方面，一种或更多种捕获分子可被连接至表面，例如被固定在表面上。如本文使用的，术语“被固定的(immobilized)”包括被固定、结合和/或连结至表面(诸如例如微珠)。在至少一些实施例中，捕获分子可以被连接至微珠表面或固定在微珠表面上。微珠可以是具有大致弯曲形状的粒子。在至少一个实施例中，微珠可以是球形的，具有一致的直径。根据本公开的微珠可以是刚性的，并且可以具有光滑或多孔的表面，或者具有包括光滑部分和多孔部分两者的表面。微珠可包括一种材料或可包括多种材料的组合。在一些实施方案中，微珠可以具有磁性，例如包括磁性材料或包括多种材料的组合的微珠。
根据本公开的一些方面，微珠的平均直径可以在大约10nm和大约100μm之间，诸如从大约50nm至大约50μm、从大约100nm至大约10μm、从大约100nm至大约5μm、从大约500nm至大约5μm、从大约100nm至大约1μm、从大约1μm至大约50μm、从大约5μm至大约10μm或从大约10μm至大约50μm。例如，微珠的平均直径可以为大约10nm、大约100nm、大约500nm、大约1μm、大约5μm、大约10μm、大约50μm或大约100μm。
捕获分子与表面的连结可以是共价的或非共价的。连结捕获分子与微珠可通过任何合适的方法(一种或多种)来实现。例如，微珠表面可通过一个或更多个化学官能团官能化，以例如与捕获分子缀合。示例性官能团包括但不限于胺、巯基、磷酸酯、烷基、烯烃、炔烃、芳烃、醇、酮、醛、羧基和烷氧基基团。在至少一个实施例中，微珠可与抗体或如下所述的任何其它捕获实体缀合。
图3是显示在本公开的一些方面使用的微珠300的示意图。如所显示的，两种不同类型的捕获分子305、306可连接至微珠300的表面。每一个捕获分子305、306均可经任何合适的化学连接基团或捕获分子305、306的实体和/或微珠300的表面的实体共价结合至表面，以便各个捕获分子305、306的结合位点307、308可用于与靶标的结合。当与包含多种生物标志物313、314的样品结合时，捕获分子305可选择性地结合至生物标志物313，而不结合至生物标志物314。进一步地，捕获分子306对于生物标志物314可以不是特异性的，以便其不与生物标志物314结合。因此，生物标志物313可通过其与微珠和捕获分子305的结合而被检测到，而生物标志物314可以不被检测到。
虽然图3阐释了其中不同类型的捕获分子被连接至单微珠(例如，用于不同靶标的捕获和检测)的实施例，但多个微珠或微珠的集合可仅包括一种类型的捕获分子，以便微珠对于一种靶标是特异性的。例如，对于特定生物标志物特异性的一种或更多种捕获分子可被连接至多个微珠中的每一个微珠。所述多个微珠中的每一个微珠可与其它微珠具有相同的尺寸、形状和化学组成，或所述多个微珠可包括具有不同于所述多个微珠中的至少一种其它微珠的尺寸、形状和/或化学组成的至少一种微珠。
在一些实施例中，捕获分子(一种或多种)可被标记，例如，包含至少一种可检测标记(例如，化学标签或探针分子)。例如，捕获分子(一种或多种)可包括通过分析技术(诸如光学检测，例如荧光、化学发光或电化学发光)可检测的标记。在一些方面，捕获分子(一种或多种)可包括荧光标记的抗体或荧光标记的蛋白质。
本公开的一些方面包括在诊断测定中分析样品以确定一种或更多种生物标志物的存在或不存在，和/或测量一种或更多种生物标志物在所述样品中的量。在至少一个实施方案中，所述测定可包括一种或更多种捕获分子。例如，所述测定可包括多种捕获分子或捕获分子的集合。在一些实施方案中，所述集合可包括至少两种独特的捕获分子，其中每种独特的捕获分子可识别不同的靶标(例如，生物标志物，诸如肽)。捕获分子的集合的范围可为2至80种捕获分子。在一些实施方案中，捕获分子的集合可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80种或更多种独特的捕获分子。在至少一个实施例中，捕获分子的集合包括5、6或7种独特的捕获分子，每一种捕获分子对于与特定健康状况(例如癌症)有关的不同生物标志物有特异性。在另外的实施例中，捕获分子的集合包括12种独特的捕获分子，每一种捕获分子对于与特定健康状况有关的不同生物标志物有特异性。在再另外的实施例中，捕获分子的集合包括20种和60种之间的独特的捕获分子，每一种捕获分子对于与特定健康状况有关的不同生物标志物有特异性。在一些实施例中，除了本文所述的捕获分子和捕获分子集合之外，还可以使用一种或更多种其它靶结合剂。
捕获分子的选择可取决于期望的应用和/或在样品中待被检测的生物标志物。捕获分子(一种或多种)可以对生物标志物的集合(例如生物标志物组)中的一种或更多种生物标志物有特异性。如上所述，捕获分子可包括对于与特定健康状况相关的生物标志物有特异性的抗体。在一些方面，每一种捕获分子对于组中的一种生物标志物可以是特异性的。
示例性组可包括1至80种生物标志物，例如1至60种生物标志物、1至40种生物标志物、1至30种生物标志物、1至20种生物标志物、1至15种生物标志物、1至12种生物标志物、2至60种生物标志物、2至15种生物标志物、2至12种生物标志物、3至60种生物标志物、3至20种生物标志物、3至12种生物标志物、4至60种生物标志物、4至12种生物标志物、4至8种生物标志物、5至60种生物标志物、5至40种生物标志物、5至20种生物标志物、5至12种生物标志物、5至7种生物标志物、6至20种生物标志物或6至12种生物标志物，但是本文也包括具有大于20种生物标志物的组。例如、组可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80或更多种生物标志物。
组中的所有生物标志物或生物标志物亚组可以与疾病或其它健康状况相关。例如，组中的一种或更多种生物标志物可以与疾病，诸如例如癌症(包括乳腺癌、前列腺癌或卵巢癌)、呼吸疾病和/或心脏病有关。与呼吸疾病有关的生物标志物可包括，例如与甲型流感、乙型流感、炭疽病、瘟疫和/或各种变应原有关的生物标志物。在至少一个实施例中，生物标志物组包括与特定健康状况(例如癌症)有关的5、6或7种生物标志物。
在一些实施方案中，待被检测的生物标志物可以与乳腺癌有关。在本公开的一些示例性方法中，乳腺癌组的生物标志物可包括但不限于：Her-2、MMP-2、CA 15-3、VEGF、OPN、p53、CA 125、CEA和/或SER。例如，可用于乳腺癌的诊断信息的生物标志物组可包括选自以下的至少一种生物标志物：Her-2、MMP-2、CA 15-3、VEGF、OPN、p53、CA 125、CEA或SER。在一些方面，生物标志物组可包括Her-2、MMP-2、CA 15-3、VEGF、OPN、p53、CA 125、CEA和SER中的每一种。根据本公开的一些方面，生物标志物组可包括选自以下的至少两种生物标志物：CA15-3、OPN、Her-2、MMP-2和VEGF。例如，生物标志物组可包括CA 15-3、OPN、Her-2、MMP-2和VEGF。人类基因组组织基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee)在线数据库中对于这类标志物的序列标识符的实例包括Her-2(X03363)、MMP-2(NM_004530)、CA 15-3(NM_002456)、VEGF(MGC70609)、OPN(NM_001040058)、p53(NM_000546)、CA 125(Q8WX17)和SER(NP 000116.2)。
根据本公开的一些方面，捕获分子可包括对乳腺癌生物标志物特异性的抗体。在一些实施方案中，捕获分子对于Her-2、MMP-2、CA 15-3、VEGF、OPN、p53、CA 125和SER可以是特异性的。在一些实施方案中，捕获分子对于Her-2、MMP-2、CA 15-3和OPN可以是特异性的。对于乳腺癌标志物特异性的示例性捕获抗体可包括但不限于：(1)抗-Her-2(例如，单克隆抗-人ErbB2抗体，目录号MAB1129，克隆号191924，由安迪生物科技公司(R&D systems)供应)、(2)抗-基质金属肽酶2(MMP-2)(例如，单克隆抗-人MMP-2抗体，目录号MAB902，克隆号36006.211，由安迪生物科技公司供应)、(3)抗-CA 15-3(例如，单克隆抗-人CA 15-3抗体，目录号10-C03，克隆号M8071022，由菲茨杰拉德工业公司(Fitzgerald Industries)供应)、(4)抗-骨桥蛋白(OPN)(例如，单克隆抗-人骨桥蛋白抗体，目录号MAB1433，克隆号190312，由安迪生物科技公司供应)和(5)抗-血管内皮生长因子(VEGF)(例如，VEGF纯化小鼠抗-人，目录号AHGO114，克隆号A183C 13G8，由赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)供应)。在一些实施方案中，捕获分子可以是克隆191924、克隆36006.211、克隆M8071022和克隆190312。
前列腺癌组的示例性生物标志物(例如，可用于获得关于前列腺癌的诊断信息的生物标志物)可包括但不限于PSA。卵巢癌组的示例性生物标志物(例如，可用于获得关于卵巢癌的诊断信息的生物标志物)可包括但不限于CA 125。心脏病组的示例性生物标志物(例如，可用于获得关于心脏病的诊断信息的生物标志物)可包括但不限于：肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、CRP、高半胱氨酸、肌红蛋白和/或肌酸激酶。用于以上生物标志物组的检测的捕获分子(一种或多种)对于所述组的一种或更多种生物标志物可以是特异性的。例如，捕获分子可包括对于与每种个别的疾病或健康状况有关的生物标志物有特异性的抗体。
捕获分子的集合中的捕获分子的数目可取决于以下参数中的一个或更多个：捕获分子的集合的预期用途和应用、样品的复杂程度、样品中蛋白质的平均尺寸、样品中同源靶标表位存在或预期存在的频率、捕获分子的结合亲和力和/或特异性、关于靶蛋白(一种或多种)的知识和/或捕获分子的稳定性。
根据本公开的一些方面，“检测”可以指鉴定待检测的靶标或其它种类的存在、不存在和/或量。检测可以通过目测进行和/或使用任何合适的装置进行，所述装置诸如例如扫描仪和/或检测器。进一步地，任何合适的分析技术(包括但不限于光学技术)都可以用于检测。可用于根据本公开的检测的技术的非限制性实例包括吸光度、荧光、化学发光和电化学发光。
与捕获分子结合的靶标(例如，生物标志物)的检测可使用可检测标记来进行。例如，对于靶标特异性的检测分子可结合至靶标(例如，靶标还与捕获分子结合)，用于靶标的检测。在一些实施例中，检测分子可包括检测抗体。这类检测抗体对于生物标志物靶标可以是特异性的，例如，类似于如上讨论的一些捕获抗体对生物标志物靶标的特异性。适于本公开的示例性检测分子可包括但不限于：(1)抗-Her-2(例如，多克隆山羊抗-人ErbB2抗体，目录号AF-1129，由安迪生物科技公司供应)、(2)抗-MMP-2(例如，多克隆山羊抗-人MMP-2抗体，目录号AF-902，由安迪生物科技公司供应)、(3)抗-CA 15-3(例如，单克隆抗-人CA 15-3抗体，目录号10-C03B，克隆号M8071021，由菲茨杰拉德工业公司供应)、(4)抗-骨桥蛋白(例如，多克隆山羊抗-人骨桥蛋白抗体，目录号AF-1433，安迪生物科技公司)和(5)抗-VEGF(例如，多克隆兔子抗-人VEGF生物素缀合的抗体，目录号AHG9119，由赛默飞世尔科技公司供应)。
检测分子可使用任何合适的方法(一种或多种)来标记。在一些实施例中，检测分子可包含通过分析技术可检测的至少一种可检测标记(例如，化学标签或探针分子)，所述分析技术诸如光学检测(例如，吸光度、荧光、化学发光或电化学发光)。例如，可检测标记可包括荧光剂、比色剂(colorimetric agent)、磁化剂或电学试剂(electrical agent)或其任何组合。荧光剂包括但不限于量子点和荧光团，例如，包括赛默飞世尔科技公司生产的Alexa546染料分子和Alexa488染料分子、藻红素(PE)和别藻青素(allophycynin，APC)。在本公开的一些方面，在结合至靶标之前检测分子可包含一种或更多种可检测标记(参见例如下面图4)。在其它方面，一种或更多种可检测标记可在检测分子结合至靶标之后添加。例如，在靶标与捕获分子结合(例如，捕获分子与微珠连接)并与检测分子结合以形成捕获分子/靶标/检测分子复合体后，该复合体可以与一种或更多种可检测标记混合，以便该可检测标记与该复合体反应并连接至该复合体。可检测标记(一种或多种)的添加可在单独的反应室中进行。例如，在形成捕获分子/靶标/检测分子复合体之后，在与可检测标记(一种或多种)反应之前，复合体可通过密度介质从任何未结合的/未反应的试剂分离。
在本公开的一些方面，测定可包括竞争性结合。例如，预先装载到微流体盘中的捕获分子-微珠试剂可包括具有可检测标记的检测分子。当包含靶标的样品与试剂混合时，靶标可与检测分子竞争结合至捕获分子-微珠。可选择试剂的量，以便在不存在任何靶标的情况下，检测到高信号，从而提供参照信号。信号的量相对于参照信号的降低可指示存在靶标(例如，已经替代检测分子与捕获分子-微珠结合)。信号相对于参照信号的降低可用于测定靶标的浓度。这种类型的测定可用于具有有限尺寸或表位数的靶标，包括例如仅具有一个表位的小蛋白质。
示例性装置
适于本公开的各种实施方案的装置可提供定点照护(point-of-care)测试，以例如在患者照护的时间和位置处或附近获得患者的诊断信息。例如，装置可以是便携式的和/或独立的。进一步地，根据本公开的装置可用于在多重测定中同时测量多种靶标(例如，生物标志物)。
在一些方面，装置可以包括用于执行多重测定的微流体通道。在微流体平台上，例如，相对少量的样品(例如，数量级为微升(μL))可能足以测量多种生物标志物的水平。例如，装置可以是基于微流体的免疫测定检测装置，其包括微流体盘、控制盘的旋转速率的电动机以及诸如光学读取器的检测器，以例如测量生物标志物。在一些实施方案中，微流体盘可以包括与特异性捕获抗体缀合的微珠以及用于结合、检测和分离过程的合适的试剂集合。根据本公开的微流体装置可以包括美国临时申请号62/202,353中公开的任何特征，其通过引用并入本文。
本公开的微流体盘可以包括一个或多更个通道，所述一个或更多个通道包括一系列相互连接的室，其中试剂和样品可以通过施加离心力而在室之间混合和/或移动。因此，例如，微流体盘可以提供流体流过的通道(一个或多个)和试剂存储和/或与在诊断测定中添加到盘中的样品混合的室。
微流体盘的通道或多个通道可以是任何合适的形状，包括例如圆形、梯形、三角形或其它几何形状。例如，取决于通道的应用和功能，通道可以是直的、弯曲的、之字形的、U形的或其它的结构。可以基于一个或更多个因素来选择通道尺寸，所述因素例如样品中待分析的靶标(例如，生物标志物)的类型(一种或多种)和/或数目、存储在盘中的用于与靶标(一种或多种)结合的捕获分子的类型(一种或多种)和/或数目、靶标与捕获分子之间的结合性质以及其它因素。在一些示例性盘中，通道可以为大约0.01微米到5毫米深和0.01微米到大约5毫米宽。例如，通道深度的范围可以为约0.05微米至约5毫米，并且直径范围可以为约0.01微米至约1厘米或更大。根据应用，通道的流体容量范围可以为约1纳升至约1毫升或更大。
微流体盘可以由适用于测定的任何材料或材料的组合制成。例如，微流体盘可以包含一种或更多种聚合物或共聚物。适用于本文的微流体盘的示例性材料包括但不限于聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、丙烯酸酯诸如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丙烯酰胺及其组合。
图1示出包括一个微流体通道的示例性微流体盘100，所述微流体通道包括在测定期间流体可以流过的一系列相互连接的室。室的数目和设计可以针对被检测的具体靶标和使用的试剂进行调整。如所示，例如，通道可以包括样品入口102、样品制备室104、计量反应室106、分离室108和检测室110。盘100可以包括中心孔105，例如，用于在测定过程中将盘100与上电组件(powered component)耦合从而驱动盘100的转动。在示例性程序中，将样品(例如包含感兴趣的生物标志物的血液样品)添加到微流体盘100的样品入口102。通常，可以将从约1μL至约300μL或更多(大约一滴到几滴)范围的原始样品(例如全血或其它生物流体)的小份添加到入口，所述范围诸如从大约1μL至大约280μL、从大约1μL至大约250μL、从大约1μL至大约220μL、从大约1μL至大约200μL、从大约1μL至大约180μL、从大约1μL至大约150μL、从大约1μL至大约120μL、从大约1μL至大约100μL、从大约1μL至大约80μL、1μL至大约80μL、从大约1μL至大约40μL、从大约1μL至大约20μL、从大约1μL至大约6μL、从大约20μL至大约250μL、从大约20μL至大约200μL、从大约50μL至大约100μL、从大约50μL至大约250μL、从大约100μL至大约200μL、从大约5μL至大约80μL或从大约2μL至大约5μL。例如，可使用的样品小份为大约1μL、大约2μL、大约3μL、大约4μL、大约5μL、大约6μL、大约20μL、大约40μL、大约60μL、大约80μL、大约100μL、大约120μL、大约150μL、大约180μL、大约200μL、大约220μL、大约240μL、大约250μL、大约280μL或大约300μL。随着盘转动，样品可以径向向外流过通道。
在一些实施方案中，微流体盘可以包括具有相对狭窄的通道的阀系统，以例如调节流体流动。例如，图1的微流体盘100可以包括在样品制备室104与计量反应室106之间和/或在计量反应室106与分离室108之间的阀111。阀可以提供对通过通道的流体流动的阻力，直到足够的力被提供来克服这种阻力。克服这种阻力的力的实例可以包括通过以阈速度旋转盘施加的离心力。每个阀可被设计或调整，从而对应于特定的转动速度或多种转动速度，以便例如可以根据装置的操作选择性地进入不同的室，从而在合乎期望的时间使流体移动。
样品制备室104可以在与储存在盘100中的试剂混合之前提供样品的任何预处理。例如，样品的各种组分可以例如经由过滤器分离，以便仅初始样品的一部分可以流经通道用于分析。例如，样品入口102可以被配置成将全血分离成血浆、血清和细胞组分。在一些实施例中，与试剂混合用于分析的样品组分(例如血浆)的量通常可在约1μL至约6μL的范围。例如，足以用于根据本公开的多重测定的样品或样品组分的量可以在约2μL至约5μL的范围，例如样品小份为约1μL、约2μL、约3μL、约4μL、约5μL或约6μL。可将未用于分析的过量样品和/或原始样品的任何组分分离到例如与计量反应室106连通的废物室中。
计量反应室106可结合样品与捕获分子(例如用于将靶标与捕获分子结合)，并为后续测定步骤确定合适的体积。因此，例如，包含连接于微珠的捕获分子的试剂(参见例如图3)可以在测定之前被预先装载并储存在盘中。在一些实施例中，盘100可以包括与反应室分离的计量室，其用于量出用于分析的样品的合适体积，试剂可以储存在所述反应室中以在样品进入反应室时与样品混合。除了捕获分子-微珠以外的试剂可以以液体、凝胶或冻干形式存在，以便捕获分子/微珠悬浮在液体、凝胶或冻干物质(一种或多种)中。当部分试剂被冻干时，引入到计量反应室106中用于分析的样品或样品组分(例如血浆)可以重构冻干物质(一种或多种)。
分离室108和检测室110(其可以包括微流体通道的末端)可以提供用于靶标检测的结合的捕获分子-微珠/靶标复合体的收集。例如，通道可以包含例如密度小于微珠的密度并且大于未结合的试剂的密度的密度介质，例如Ficoll。在与样品反应之后，可以使微珠移动通过分离室108中的密度介质，以将它们与其它试剂分离，并且允许在检测室110中以小球形式收集珠粒。然后可以通过检测器分析小球，以确定并分析靶标的存在和/或浓度。
图2示出了根据本公开的一些方面的、包括多个微流体通道的示例性盘200。每个通道可以包括(或连通于)至少一个样品入口202、至少一个样品制备室204、至少一个计量室206、至少一个反应室207、至少一个分离室208以及至少一个检测室210。例如，通道可以以规则的空间间隔径向向外延伸。在一些方面，分离室208和检测室210(用于检测靶标)的数目可以大于样品入口202的数目。如所示，例如，盘200包括12个样品入口202，每个样品入口202通向样品制备室204。12个样品制备室204中的每一个与5个计量室206连通。每个计量室206通入到反应室207(例如，在这里可以将试剂预先装载到盘200中)、分离室208和检测室210中。因此，盘200可具有总共60个通道，提供针对12种不同样品以及每种样品5种不同生物标志物(例如，如果每个反应室207包括对不同生物标志物特异性的试剂)的分析。每个通道可以包括类似于图1的阀111的一个或更多个阀。微流体盘200可以包括类似于图1中盘100的孔105的中心孔205。
图4示出使用根据本公开的一些方面的微流体盘400的示例性测定的示意图，所述微流体盘400可以包括上面讨论的微流体盘100和/或200的任何特征。盘400可以包括多个通道，每个通道包括计量室406和反应室407、分离室408和检测室410。当盘400转动时，流体可以径向向外流经通道。如所示，两个样品入口402可以在两个通道之间(例如在室406处)分开。因此，添加到每个样品入口402的流体样品(例如全血)的小份可以在两个通道之间分开。通道的尺寸和结构可以允许指定体积的样品前进通过通道，从而与试剂混合。在一些方面，例如室406可用于计量合适量的样品到每个反应室407。虽然图4没有显示，但如上所述，样品入口402可以通入到样品制备室中，以例如在计量待与试剂混合用于分析的适当体积的样品之前分离样品的各种组分。
每个反应室407可以包括预先装载在微流体盘400中的试剂。试剂可以包含表面共价连接捕获分子421的多个微珠420，以便每个捕获分子421的游离末端处的结合位点可用于与样品的靶标结合。图4示出了表面连接四个捕获分子421的示例性微珠420，然而可以使用每个微珠420多于或少于四个捕获分子421。试剂还可以包含多种检测分子425，每个检测分子包含用于结合至靶标的结合位点425a和检测标记425b，诸如荧光剂。捕获分子421和检测分子425对待检测的相同靶标(一个或多个)可以具有特异性。
在一些方面，每个反应室407可以包括捕获分子421和/或检测分子425，所述捕获分子421和/或检测分子425对与盘400的其它反应室407相同的靶标(一种或多种)是特异性的。在其它实施例中，至少一个通道可以包括捕获分子421和/或检测分子425，所述捕获分子421和/或检测分子425对与盘400的至少另一个通道相比不同的靶标(一种或多种)是特异性的。在其它实施例中，微流体盘400的每个通道可以包括不同捕获分子421和/或检测分子425，以便可以在每个通道或每个分离室408中捕获和检测不同的靶标。进一步地，盘400可包括预先装载在相同反应室407中且对不同靶标特异性的捕获分子421和/或检测分子425。例如，单个反应室407可以包括对第一靶标特异性的第一多种捕获分子421(例如连接到微珠420)和对不同于第一靶标的第二靶标特异性的多种捕获分子421(例如连接到微珠420)。
被引入样品入口402中的样品可以包括一种或更多种靶标，例如生物标志物415。例如，样品中待检测的生物标志物415可以是抗体，并且捕获分子421可以是捕获抗体。因此，例如，每个捕获分子421可以结合至生物标志物415，以便每个微珠420结合四个生物标志物415，如图4中示意性所示。进一步地，每个检测分子425可以结合至连接于微珠420的生物标志物415中的一个，从而形成检测复合体430。
检测复合体430可以流到分离室408。在一些方面，如上所述的密度介质可以用于在分离室408中将检测复合体430与任何未结合的样品和/或试剂(例如，未结合的检测分子425)分离，如图4中示意性所示(分离室408的图示，左)。在由于盘400的转动而施加足够的离心力时，检测复合体(completes)430可以从分离室408移动到检测室410，以将检测室410的基部处的小球409收集在一起，如图4中示意性所示(分离室408的图示，右)。盘400的分离室408和/或检测室410可以具有相同的形状或不同的形状。例如，如图所示，盘400包括其中检测室410具有大致锥形的V形基部的13个通道以及其中检测室411具有扁平形基部的3个通道。
当检测方法是化学发光或电化学发光时，盘400可以包括预先装载到检测室410和/或411中的合适的底物/试剂，以便捕获分子-微珠/靶复合体可以与底物/试剂反应，从而产生用于检测的光(例如，紫外光、可见光或红外光)。在一些方面，底物/试剂可以存在于分开的储存室中，并且可以在产生小球的相同室(例如检测室410)中或者在结合小球409和底物/试剂的单独的室中添加至小球409。
如上所述，本公开的一些方面包括与特定疾病或其它健康状况相关的生物标志物。例如，微流体盘(其可以基本上类似于图4的盘400)可以包括对于与乳腺癌相关的一组生物标志物特异性的捕获分子的集合。捕获分子可以被固定在储存在微流体盘中的微珠上。生物标志物可以包括选自以下的两种或更多种生物标志物：Her-2、MMP-2、CA 15-3、OPN、p53、VEGF、CA 125、CEA和SER。例如，该装置可以包括对CA-15-3和OPN特异性的捕获分子，或对Her-2、MMP-2、CA 15-3和OPN特异性的捕获分子。
因此，例如，多种捕获分子可包括对与乳腺癌有关的生物标志物特异性的多种捕获抗体。在一些方面，所述多种捕获抗体可包括以下捕获抗体中的至少两种：(1)抗-Her-2(例如，单克隆抗-人ErbB2抗体，目录号MAB1129，克隆号191924，由安迪生物科技公司供应)、(2)抗-基质金属肽酶2(MMP-2)(例如，单克隆抗-人MMP-2抗体，目录号MAB902，克隆号36006.211，由安迪生物科技公司供应)、(3)抗-CA 15-3(例如，单克隆抗-人CA 15-3抗体，目录号10-C03，克隆号M8071022，由菲茨杰拉德工业公司供应)、(4)抗-骨桥蛋白(OPN)(例如，单克隆抗-人骨桥蛋白抗体，目录号MAB1433，克隆号190312，由安迪生物科技公司供应)和(5)抗-血管内皮生长因子(VEGF)(例如，VEGF纯化小鼠抗-人，目录号AHGO114，克隆号A183C 13G8，由赛默飞世尔科技公司供应)。在至少一个实施例中，捕获分子组包括(1)抗-Her-2(例如，单克隆抗-人ErbB2抗体，目录号MAB1129，克隆号191924，由安迪生物科技公司供应)、(2)抗-基质金属肽酶2(MMP-2)(例如，单克隆抗-人MMP-2抗体，目录号MAB902，克隆号36006.211，由安迪生物科技公司供应)、(3)抗-CA 15-3(例如，单克隆抗-人CA 15-3抗体，目录号10-C03，克隆号M8071022，由菲茨杰拉德工业公司供应)和(4)抗-骨桥蛋白(OPN)(例如，单克隆抗-人骨桥蛋白抗体，目录号MAB1433，克隆号190312，由安迪生物科技公司供应)。每个通道可以对应于单一生物标志物(例如，包括对单一生物标志物特异性的捕获分子)或多种生物标志物(例如，包括对两种或更多种生物标志物特异性的捕获分子或对不同生物标志物各自特异性的多种捕获分子)的测试。
根据本公开的装置可以包括用于检测如上所述经由捕获分子与微珠结合的靶标(例如，生物标志物)的检测组件。图5示出了示例性装置，其包括微流体盘500、电源诸如电动机550和检测组件560。盘500可以包括上面讨论的盘100、200和/或400的任何特征，所述特征包括例如多个通道503和中心孔径505。通道503可以与顺序标记为A-P的多个检测室连通，如图所示。盘可以经由轴540可操作地耦联到电动机550，以便电动机550可以经由轴540驱动盘500的转动。电动机可以以预定速度或一系列预定速度逆时针方向(以图5中所示箭头的方向)控制盘500的转动和/或顺时针方向控制盘500的转动。
检测组件560可以被配置为通过测量来自检测分子的信号来检测靶标的存在，所述检测分子结合至靶标并且被收集在位于盘500的边缘处或附近的各个检测室A-P中。例如，检测组件560可以检测来自盘500的可检测标记的吸光度、荧光、化学发光或电化学发光或任何其它类型的信号。可以基于检测到的信号、A-P每个检测室相对于其它检测室的位置以及盘500的转动特性，来确定A-P每个检测室中的靶标的量(从而确定原始样品中的靶标的浓度)。例如，如果信号的收集在检测组件560与检测室A对齐时准时开始，那么当盘500转动时，基于检测室A的转动速度和位置，可将从检测室A发出的信号量与从检测室B-P发出的信号量区分开来。因此，对于盘500的每次完整的转动，检测组件560可以收集检测室A-P中每一个的信号。当检测室A-P含有不同的靶标时(例如，由于使用不同的捕获分子来结合至靶标，如上所述)，可以同时或基本上同时测定样品中存在的多种靶标的浓度。
在一些方面，检测组件560可以是光学检测器，其包括用于产生光的光源565、检测器567以及光学器件562(例如，反射镜和/或透镜)，所述光学器件562将来自光源565的光引导至盘500并且将从盘500发射的光重定向到检测器567。在至少一个实施方案中，检测组件包括在可见光区域中以及在可见光区域外的各种波长的光激发(包括但不限于激光激发或LED激发)以及用于检测特定波长CMOS传感器，其中使用一个或多个合适的滤波器和/或分色光束分离器。
检测组件560还可以包括用于分析来自检测器567的数据的读取器和用于显示来自读取器的输出的屏幕。读取器可以是光学的。在一些实施方案中，检测组件560可以包括成像系统，例如包括电荷耦合装置(CCD)照相机。成像系统的输出可以显示在计算机屏幕或其它用户界面或观看设备上，所述观看设备包括但不限于例如液晶显示(LCD)装置。在一些方面，来自成像系统的输出可以被传送到远程用户接口，诸如平板电脑或其它计算机控制的装置，诸如笔记本电脑或智能手机。数据可以通过有线或无线通信传输(包括但不限于蓝牙)和/或可以被存储或存档在例如互联网云中的远程服务器上。
图6示出了根据本公开的一些方面的装置的示例性外壳600。例如，外壳可以包含图5的装置。在一些方面，外壳600可以包括盖(例如，通过所示的折叶(hinge)或其它合适的机械装置可以移动)和可以打开和关闭以插入和移除微流体盘的门620。
根据本公开分析样品可以包括通过一个或更多个定量和/或定性测量结果来确定与给定样品相关联的值或值的集合。例如，根据本公开的一些实施方案的“分析”包括测量从受试者获得的样品中的成分表达水平，并将该水平与来自同一受试者(例如，在不同时间收集的样品，以评估潜在健康状况的进展)或其它受试者(一个或多个)(例如，用于与另一受试者中确定的疾病医学诊断或疾病的缺乏相比较)的样品或样品集合中的成分水平进行比较。根据本公开获得的数据可以包括样品中特定生物标志物或多种生物标志物的存在或不存在，或者包括样品中多种生物标志物的存在或不存在。在一些实施方案中，数据可以包括样品中多种生物标志物的浓度，以及与生理水平相比它们的相对存在，以例如确定多种生物标志物的过表达、正常表达或低表达。
在至少一个实施方案中，对样品打分包括分析数据并输出分数。“分数”可以包括但不限于可以被选择和/或用于分析、比较、诊断和/或根据本公开的其它目的的值或值的集合。在一些实施方案中，例如，分数可用于基于例如从受试者获得的样品的一种或更多种成分(例如，靶标诸如生物标志物)的测量量来评估受试者的健康状况或医学状况。
数据的分析可以包括使用预测模型。“预测模型”可以包括但不限于使用用于对数据集进行分组的算法或算法的组合来开发的数学构造(mathematical construct)，以例如允许区分分组数据。可以使用包括但不限于主成分分析(PCA)和/或线性判别分析(LDA)的任何合适的数学和/或统计学方法来开发根据本公开的预测模型。在一些实施例中，分组数据包括生物标志物组的每种生物标志物的数据。
PCA是一种可用于将多维数据集降低为低维数据集以进行分析的技术。在数学上，PCA可以被定义为正交线性变换，其将数据变换为新的坐标系，以便数据的任何投影的最大方差在第一坐标(称为第一主成分)上，第二最大方差在第二坐标上，依此类推。PCA可用作探索性数据分析的工具并用于预测模型。PCA还可以包括计算数据协方差矩阵的特征值分解或者数据矩阵的奇异值分解，例如在针对每个属性对数据进行均值中心化之后。可以根据组件分数和加载量(loading)来讨论PCA的结果。
LDA是可以用来找到最佳分离两个或更多个类别的对象或事件的特征的线性组合的方法。所得到的组合可以用作线性分类器，或者可替代地，用于在之后的分类之前降低维度。
本公开包括用于对来自受试者的样品进行评分的方法，所述方法包括例如使用与多种生物标志物相关的定量数据对人样品进行分类，其中所述生物标志物与特定疾病或其它健康状况例如乳腺癌相关。例如，对样品进行分类的方法可以使用与(与乳腺癌相关的)多种生物标志物相关的数据。在一些方面，与乳腺癌相关的多种生物标志物包括至少CA15-3和OPN。另外的生物标志物可以包括例如Her-2、MMP-2、VEGF、p53、CA 125、CEA和/或SER。例如，所述多种生物标志物可包括CA 15-3、OPN、Her-2和MMP-2，或CA 15-3、OPN、Her-2、p53、CA 125、CEA和SER。在至少一个实施方案中，对样品进行分类的方法使用与以下生物标志物相关的数据：CA 15-3、OPN、Her-2和MMP-2。
根据本公开的一些方法的分析可以包括根据用预测模型产生的分数将样品分类(例如，根据生物标志物组将样品的生物标志物的水平进行分类)成类别。生物标志物的过表达通常可以被理解为疾病的迹象。基于过表达的量，可以分配适当的分数和类别。已经报道了疾病类别和相应的生物标志物水平。参见例如美国申请公开号2008/0200342 A1，其通过引用并入本文。类别可以包括例如健康分类(例如无病)、早期疾病分类和晚期疾病分类。例如，可以从健康分类、早期疾病分类或晚期疾病分类中选择分类。
根据本公开获得的诊断信息可以与针对具有确诊的相同疾病的患者或健康收集物(collection)测量的生物标志物水平的参考数据进行比较。诊断正确的概率可以计算为例如数据的线性回归，以计算组的特异性和敏感性。分类正确的概率可以是模型依赖性的和/或生物标志物依赖性的，并且可以是至少60％、至少70％、至少80％、至少87％、至少90％或至少95％正确的。在一些实施方案中，分类正确的概率可以是至少60％、至少70％、至少80％、至少87％、至少90％或至少95％。在一个实施例中，用于筛查乳腺癌患者的单生物标志物可以提供小于70％的预测值，而同时测试的生物标志物组可以提供将预测值增加到大于90％(例如预测值为91％)的联合作用。
如上所述，随着疾病或其它健康状况随时间发展或进展，生物标志物组中的一些生物标志物或全部生物标志物可被过表达，并继续被过表达。因此，在不同的时间(例如，根据疾病的分期或攻击性在数月和/或数年内)测量生物标志物可以提供关于受试者的疾病进展的信息。例如，生物标志物水平可以每1、2、3或者4周，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，或者每1、2、3、4或5年被测量一次。对于生物标志物组的测量结果的每个集合，可以如上所述确定分数。在一些方面，可以将从受试者获得的第一样品的第一分数(例如，基于在第一时间测量的生物标志物组中的生物标志物水平)与从受试者获得的第二样品确定的第二分数进行比较(例如，基于在稍后的第二时间测量的相同的生物标志物组的水平)。该比较也可用于例如确定疾病的进展或疾病治疗的疗效。第一分数和第二分数之间的差异可以指示疾病分期，诸如乳腺癌的疾病分期。在一些实施方案中，分数可以用于诊断肿瘤性乳房疾病，例如乳腺癌。
以下实施例旨在阐释本公开，然而本质上并不是限制性的。应该理解，本公开包括与前述说明和以下实施例一致的另外的实施方案。
实施例
实施例1
使用微流体盘如下对5种乳腺癌生物标志物的组进行多重测定：
(1)通过扎指尖或静脉穿刺从受试者获得全血样品。
(2)通过计量的一次性移液管将血滴液引入盘的进入室。
(3)将盘放置到包含作为电源的电动机和光学检测器的微流体装置中，并且关闭装置的盖。放置盘，使其与电动机(其控制盘转动的方向和速度)藕连并且在检测器的上方定位，检测器朝着盘的外周被定位。该装置包括用于通过以一系列预定速度转动盘来运行乳腺癌筛查测定的程序，如下步骤(4)-(11)中所述。启动测定程序。
(4)以1000转/分钟(rpm)旋转盘，以使样品从进入室转移到血液分离室。
(5)然后以3000rpm旋转盘，以将血液中的血浆与血细胞分离。
(6)然后以250rpm旋转盘，以将血浆虹吸到与血液分离室连通的各个的计量室中(将5升血浆吸到每个计量室中)。
(7)然后，以750rpm旋转盘，以将额外的血浆排除到与计量室连通的废物室中。
(8)然后，以1000rpm旋转盘，以使血浆从计量室移动到与计量室连通的各个孵育室。每个孵育室含有对组中的一种生物标志物特异性的试剂(连接于微珠的捕获抗体、检测抗体和任何添加剂，诸如控制pH的盐和/或缓冲液)，用于测定生物标志物。试剂包括悬浮在液体、凝胶或冻干物质(一种或多种)中的微珠(连接于捕获分子)。
(9)以300rpm，以单一方向或顺时针和逆时针交替的方向旋转盘，以改善试剂的重构和生物标志物与试剂之间反应的动力学。
(10)然后，以2000rpm旋转盘，以使孵育的样品移动到与各个孵育室连通的分离室中，其中结合至微珠的生物标志物在盘的外周处的各个检测室内形成小球。
(11)当盘以2000rpm保持旋转时，通过位于检测室附近的盘平面下的光学检测器来进行对小球的生物标志物的检测。
(12)记录、放大和分析原始信号(荧光、发光和/或吸收)。记录信号并且将其与每种生物标志物关联，以确定初始血液样品中每种生物标志物的浓度。
实施例2
根据本公开的微流体盘用于测量不同浓度的以下乳腺癌生物标志物的荧光：CA15-3、MMP-2、Her-2、OPN和VEGF。测定的步骤基本上类似于实施例1的步骤。以相对荧光单位(RFU)测量荧光。结果显示在图7-11中。每个盘包括12个入口，每个入口与5个计量室连通，并且每个计量室与反应室、分离室和检测室连通(总共60个通道)。每个样品使用5μL人血浆的小份，其中掺入已知浓度的各种生物标志物。对于每种生物标志物使用一个盘，其中将不同浓度的生物标志物添加到不同的入口。在每种情况下反应的孵育时间是15分钟。
使用以下捕获抗体和检测抗体，其中捕获抗体被固定在用羧基官能化的1μm直径二氧化硅珠上，而检测抗体与藻红素(PE)缀合：
■CA 15-3：捕获抗体＝抗-CA 15-3；检测抗体＝抗-CA 15-3。
■MMP-2：捕获抗体＝抗-MMP-2；检测抗体＝抗-MMP-2。
■Her-2：捕获抗体＝抗-Her-2；检测抗体＝抗-Her-2。
■OPN：捕获抗体＝抗-OPN；检测抗体＝抗-OPN。
■VEGF：捕获分子＝抗-VEGF；检测抗体＝抗-VEGF。
通过离心力使样品从样品入口移动到微流体线路的其它室/分隔空间，最后的步骤是在盘的边缘处的检测室内产生与捕获抗体缀合的珠的小球，在此处记录小球的总荧光。
意图认为说明和实施例仅是示例性的，本公开的真实范围和精神由以下权利要求书表示。

Claims (35)

1.一种装置，所述装置包括：
盘，其包括在所述盘的径向延伸的多个微流体通道，所述微流体通道包括对至少一种生物标志物特异性的多种捕获分子，其中所述多种捕获分子中的每一个捕获分子与粒子连接。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述多个微流体通道包括第一通道和第二通道，所述第一通道包括对第一生物标志物特异性的多个第一捕获分子，所述第二通道包括对不同于所述第一生物标志物的第二生物标志物特异性的多个第二捕获分子。
3.如权利要求1或权利要求2所述的装置，其中所述盘包括12至60个微流体通道。
4.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中每一个捕获分子附着于微珠，所述微珠的平均直径范围为100nm至10μm。
5.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中每一个捕获分子附着于微珠，所述微珠的平均直径大约为1μm。
6.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述多种捕获分子中的每一个捕获分子包含抗体。
7.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述多种捕获分子包括对选自以下的生物标志物特异性的捕获分子：人雌激素受体2(Her-2)、基质金属肽酶-2(MMP-2)、癌症抗原15-3(CA 15-3)、血管内皮生长因子(VEGF)或骨桥蛋白(OPN)。
8.如权利要求7所述的装置，其中所述多种捕获分子包括对Her-2、MMP-2、CA 15-3和OPN特异性的捕获分子。
9.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述多种捕获分子包括对选自以下的生物标志物特异性的捕获分子：人雌激素受体2(Her-2)、基质金属肽酶-2(MMP-2)、癌症抗原15-3(CA 15-3)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、肿瘤蛋白p53(p53)、癌症抗原125(CA 125)、癌胚抗原(CEA)或血清雌激素受体(SER)。
10.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述多种捕获分子包括选自以下的至少一种抗体：抗体克隆191924、抗体克隆36006.211、抗体克隆M8071022或抗体克隆190312。
11.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述多种捕获分子包括被封阻剂阻断的捕获分子。
12.如前述权利要求中任一项所述的装置，进一步包括电源和检测器。
13.如权利要求12所述的装置，其中所述检测器被配置成检测荧光或化学发光。
14.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述多个微流体通道包括：第一微流体通道，其包含对第一生物标志物特异性的第一集合的捕获分子；第二微流体通道，其包含对不同于所述第一生物标志物的第二生物标志物特异性的第二集合的捕获分子；和第三微流体通道，其包含对不同于所述第一生物标志物和所述第二生物标志物中的每一种的第三生物标志物特异性的第三集合的捕获分子。
15.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述盘包括被配置成从全血分离血浆的至少一个样品入口。
16.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述多个微流体通道包括多种检测分子，每一个检测分子包含可检测标记。
17.一种使用前述权利要求中任一项所述的装置检测生物标志物的方法。
18.权利要求17所述的方法，所述方法包括：
将流体样品引入到所述盘的至少一个微流体通道中；
转动所述盘，以便所述流体样品经所述至少一个微流体通道径向向外流动，从而与所述多种捕获分子中的至少一种捕获分子结合；和
检测来自所述盘的、指示所述流体样品的至少一种生物标志物的存在的信号。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述流体样品包含与健康状况有关的多种生物标志物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述健康状况是乳腺癌。
21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述流体样品包含选自以下的至少一种生物标志物：人雌激素受体2(Her-2)、基质金属肽酶-2(MMP-2)、癌症抗原15-3(CA 15-3)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、肿瘤蛋白p53(p53)、癌症抗原125(CA 125)、癌胚抗原(CEA)或血清雌激素受体(SER)。
22.如权利要求17-21中任一项所述的方法，其中所述多种捕获分子包括对与乳腺癌有关的生物标志物特异性的捕获分子。
23.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中所述多种捕获分子包括对选自以下的至少一种生物标志物特异性的捕获分子：人雌激素受体2(Her-2)、基质金属肽酶-2(MMP-2)、癌症抗原15-3(CA 15-3)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、肿瘤蛋白p53(p53)、癌症抗原125(CA 125)、癌胚抗原(CEA)或血清雌激素受体(SER)。
24.如权利要求17-23中任一项所述的方法，其中每一个捕获分子与微珠连接，所述微珠的平均直径范围为100nm至10μm。
25.如权利要求17-24中任一项所述的方法，其中每一个捕获分子与微珠连接，所述微珠的平均直径大约为1μm。
26.如权利要求17-25中任一项所述的方法，其中所述多种捕获分子中的每一个捕获分子包含抗体。
27.如权利要求18-26中任一项所述的方法，其中流体样品包括血液或从血液获得。
28.如权利要求18-27中任一项所述的方法，其中所述流体样品包括人血液、人血浆或人血清。
29.如权利要求18-28中任一项所述的方法，其中检测来自所述盘的所述信号包括检测与所述至少一种生物标志物连接的检测分子的荧光信号。
30.如权利要求18-28中任一项所述的方法，其中检测来自所述盘的所述信号包括检测化学发光。
31.如权利要求18-30中任一项所述的方法，其中检测来自所述盘的所述信号包括用光学读取器分析所述流体样品，以确定所述流体样品中所述至少一种生物标志物的存在或不存在。
32.如权利要求17-31中任一项所述的方法，其中所述多种捕获分子包括选自以下的至少一种抗体：抗体克隆191924、抗体克隆36006.211、抗体克隆M8071022或抗体克隆190312。
33.如权利要求18-32中任一项所述的方法，其中所述至少一种生物标志物的存在指示疾病的医学诊断。
34.如权利要求18-33中任一项所述的方法，其中所述至少一种生物标志物包括与乳腺癌有关的多种生物标志物，且所述方法包括比较从受试者获得的第一流体样品中所述多种生物标志物中的每种生物标志物的水平与从受试者获得的第二流体样品中所述多种生物标志物中的每种生物标志物的水平。
35.如权利要求34所述的方法，其中在从所述受试者获得所述第二流体样品之前至少一周从所述受试者获得所述第一流体样品。
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